EA027084B1 - Ферменты - Google Patents

Ферменты Download PDF

Info

Publication number
EA027084B1
EA027084B1 EA201490624A EA201490624A EA027084B1 EA 027084 B1 EA027084 B1 EA 027084B1 EA 201490624 A EA201490624 A EA 201490624A EA 201490624 A EA201490624 A EA 201490624A EA 027084 B1 EA027084 B1 EA 027084B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
composition according
enzyme
beer
wort
enzymes
Prior art date
Application number
EA201490624A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201490624A1 (ru
Inventor
Йенс Фрисбек Серенсен
Лоне Бренн Миллер
Original Assignee
ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС filed Critical ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС
Publication of EA201490624A1 publication Critical patent/EA201490624A1/ru
Publication of EA027084B1 publication Critical patent/EA027084B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12H—PASTEURISATION, STERILISATION, PRESERVATION, PURIFICATION, CLARIFICATION OR AGEING OF ALCOHOLIC BEVERAGES; METHODS FOR ALTERING THE ALCOHOL CONTENT OF FERMENTED SOLUTIONS OR ALCOHOLIC BEVERAGES
    • C12H1/00—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages
    • C12H1/12—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages without precipitation
    • C12H1/14—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages without precipitation with non-precipitating compounds, e.g. sulfiting; Sequestration, e.g. with chelate-producing compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
    • A23L5/25—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification using enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C11/00—Fermentation processes for beer
    • C12C11/003—Fermentation of beerwort
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C12/00—Processes specially adapted for making special kinds of beer
    • C12C12/002—Processes specially adapted for making special kinds of beer using special microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C12N9/242—Fungal source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/244—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01006—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21H—PULP COMPOSITIONS; PREPARATION THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASSES D21C OR D21D; IMPREGNATING OR COATING OF PAPER; TREATMENT OF FINISHED PAPER NOT COVERED BY CLASS B31 OR SUBCLASS D21G; PAPER NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D21H17/00—Non-fibrous material added to the pulp, characterised by its constitution; Paper-impregnating material characterised by its constitution
    • D21H17/005—Microorganisms or enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • General Preparation And Processing Of Foods (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к новым ферментам с улучшенными свойствами и к композициям, содержащим данные ферменты, подходящим для применения при получении пищевого продукта, кормового продукта или солодового продукта-напитка, например, в процессе пивоварения.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к ферментам с улучшенными свойствами и к композициям, содержащим данные ферменты, подходящим для применения при получении пищи, напитка (например, пива), корма или биотоплива, например, в процессе пивоварения.
Предпосылки изобретения
Применение ферментов при получении пива хорошо известно. Применение ферментов на этапе затирания для улучшения фильтруемости затора и увеличения выхода экстракта описано в патентном документе \νϋ 97/42302.
Патентные документы νθ 2005118769 и νθ 2005059084 имеют отношение к этапу затирания и фильтрации в способе для получения пива и к ферментным композициям для применения в данном способе.
Патентный документ νθ 1999057325 имеет отношение к штаммам РешсШшт Гитси1о8ит, к новым ферментным смесям, полученным из них, и их последовательностям нуклеиновой кислоты.
Однако существует потребность в улучшенных ферментах, а также комбинации ферментов, пригодных при получении пищевых продуктов и продуктов-напитков, например, на этапах затирания, разваривания и фильтрации при получении спиртного напитка, такого как пиво или виски.
Цель изобретения
Целью вариантов осуществления настоящего изобретения является обеспечение ферментов, подходящих для получения пищевых продуктов и продуктов-напитков, например, при получении спиртного или безалкогольного напитка, например напитка на основе зерна или на основе солода, например, пива или виски. Представленные ферменты могут иметь улучшенные свойства по отношению к применению в пивоварении. Этот широкий спектр улучшенных свойств включает, например, улучшенные оптимальные значения температуры, улучшенное соотношение активности в отношении растворимых (νΕ-АХ) и нерастворимых (νυ-ΑΧ) арабиноксилановых субстратов, уменьшенный общий подъем давления во время этапов фильтрования пивного сусла и/или фильтрации процесса пивоварения, а также повышенную фильтруемость материала, обработанного ферментом.
Краткое описание изобретения
Автор(ы) настоящего изобретения обнаружили, что данные один или несколько ферментов, а также определенные комбинации ферментов имеют улучшенные свойства по сравнению с известными ферментами и комбинациями ферментов, в особенности, в связи с применением в процессе пивоварения, где крахмалсодержащий материал обрабатывают одним или несколькими ферментами с получением пивного затора.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к ферменту, характеризующемуся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, причем данный фермент содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность с любой последовательностью, выбранной из 8ЕЦ ГО N0: 1, 5ΕΟ ГО N0: 2, 5ΕΟ ГО N0: 3, 5ΕΟ ГО N0: 4, 5ΕΟ ГО N0: 5, 5ΕΟ ГО N0: 6, 5ΕΟ ГО N0: 17 и 8Ε0 ГО N0: 18 или их любого функционального фрагмента.
Используемое в данном документе выражение функциональный фрагмент относится к усеченному варианту фермента практически с такой же или, по меньшей мере, со значительной степенью ферментной активности, что и у эталонного фермента, не являющегося усеченным.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к ферменту, характеризующемуся эндо-1,3(4)β-глюканазной активностью, причем данный фермент содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность с любой последовательностью, выбранной из 8ЕЦ ГО N0: 7, 5ΕΟ ГО N0: 8, 5ΕΟ ГО N0: 9, 5ΕΟ ГО N0: 10 и 5ΕΟ ГО N0: 11, 5ΕΟ ГО N0: 12, 5ΕΟ ГО N0: 13, 5ΕΟ ГО N0: 14, 8Ε0 ГО N0: 15, 8ЕЦ ГО N0: 16 или их любого функционального фрагмента.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к ДНК-конструкту, содержащему последовательность ДНК, кодирующую фермент согласно настоящему изобретению.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору экспрессии, содержащему ДНК-конструкт, содержащий последовательность ДНК, кодирующую фермент согласно настоящему изобретению.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к клетке, которая была трансформирована ДНК-конструктом, содержащим последовательность ДНК, кодирующую фермент согласно настоящему изобретению.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к препарату, содержащему фермент, или ДНК-конструкту, или вектору, или клетке согласно настоящему изобретению.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей фермент, характеризующийся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, согласно настоящему изобретению в комбинации с любой одной или несколькими β-глюканазами.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей фермент, характеризующийся эндо-1,3(4)-в-глюканазной активностью, согласно настоящему изобретению в комбинации с любой одной или несколькими ксиланазами.
- 1 027084
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению фермента согласно настоящему изобретению, или препарата согласно настоящему изобретению, или композиции согласно настоящему изобретению при получении пищевого продукта, кормового продукта или солодового продукта-напитка, например пива или виски.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению фермента согласно настоящему изобретению, или препарата согласно настоящему изобретению, или композиции согласно настоящему изобретению при получении заготовок из теста или выпеченных продуктов.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению фермента согласно настоящему изобретению, или препарата согласно настоящему изобретению, или композиции согласно настоящему изобретению при получении пульпы или бумаги.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению фермента согласно настоящему изобретению, или препарата согласно настоящему изобретению, или композиции согласно настоящему изобретению для получения злаковых компонентов. В некоторых вариантах осуществления злак представляет собой рожь, пшеницу или ячмень.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению фермента согласно настоящему изобретению, или препарата согласно настоящему изобретению, или композиции согласно настоящему изобретению при получении пива или модификации побочных продуктов из процесса пивоварения.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению фермента согласно настоящему изобретению, или препарата согласно настоящему изобретению, или композиции согласно настоящему изобретению при получении вина или сока.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению фермента согласно настоящему изобретению, или препарата согласно настоящему изобретению, или композиции согласно настоящему изобретению при получении биотоплива первого или второго поколения, например биоэтанола.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу изменения фильтруемости крахмалосодержащего материала, причем указанный способ включает этап обработки указанного крахмалосодержащего материала ферментом, или препаратом, или композицией согласно настоящему изобретению.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу уменьшения подъема давления во время фильтрования пивного сусла в пивоварении, причем указанный способ включает этап обработки пивного затора ферментом, или препаратом, или композицией согласно настоящему изобретению.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения пищевого продукта, кормового продукта или продукта-напитка, например спиртного или безалкогольного напитка, например, напитка на основе злака или на основе солода, например пива или виски, причем указанный способ включает этап обработки крахмалосодержащего материала ферментом, или препаратом, или композицией согласно настоящему изобретению.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения пивного затора, причем указанный способ включает этап обработки крахмалосодержащего материала ферментом, или препаратом, или композицией согласно настоящему изобретению.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения биотоплива первого или второго поколения, например биоэтанола, причем указанный способ включает этап обработки крахмалосодержащего материала ферментом, или препаратом, или композицией согласно настоящему изобретению.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к продукту, полученному при помощи способа согласно настоящему изобретению.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей продукт, полученный при помощи способа согласно настоящему изобретению, например, в которой данный продукт присутствует в диапазоне 0,1-99,9%.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 - профиль затирания, используемый при пивоварении в лабораторном масштабе и в полупромышленном масштабе. Затирание начинали с 10 мин периода начала затирания, после чего добавляли фермент.
Фиг. 2 - результаты пивоварения в полупромышленном масштабе исходя из подтверждения скрининга глюканазы и ксиланаз. Глюканазу 8 В. 8иЬ в комбинации с ксиланазами А. 1нЬ тестировали по сравнению с холостой пробой и иИгаИо тах. Собранные данные представляли собой средний поток (л/ч), общий подъем давления на протяжении фильтрования пивного сусла (мм \УС. где 1 мм \УС = 9,80665 Па) и зафиксированное максимальное давление во время фильтрования пивного сусла (мм \УС).
Фиг. 3 - функциональные свойства ксиланазы в пивоварении.
Фиг. 4 - поток - фильтрование пивного сусла с применением различных ксиланазных кандидатов.
Фиг. 5 - фильтрация пива - среднее из повторных фильтраций.
- 2 027084
Фиг. 6 - фильтрация пива - среднее из повторных фильтраций.
Фиг. 7 - диаграмма затирания из примера 3.
Подробное раскрытие изобретения
Традиционно, пивом называют спиртной напиток, полученный из солода, например солода, полученного из ячменного зерна, и необязательно добавки, такой как крахмалсодержащий растительный материал (например, зерна злака), и необязательно с приданным вкусом и запахом, например, при помощи шишек хмеля.
В контексте настоящего изобретения выражение пиво следует понимать как охватывающее любое сброженное сусло, полученное при помощи сбраживания/пивоварения из крахмалсодержащего растительного материала, таким образом, в частности, также пиво, полученное исключительно из добавки или любой комбинации солода и добавки.
Выражение сбраживание в данном контексте означает получение вещества, например этанола, при помощи выращивания микроорганизмов в культуре. Обычно для сбраживания используют микроорганизмы, например дрожжи.
Используемое в данном документе выражение солод следует понимать как охватывающее любое соложеное зерно злака, например соложеный ячмень. Добавка может быть определена как любой крахмалсодержащий растительный материал, который не относится к солоду или ячменному солоду.
Крахмалсодержащий растительный материал, например, может представлять собой один или несколько злаков, например ячмень, пшеница, маис, рожь, сорго, просо или рис и их любую комбинацию. Крахмалсодержащий растительный материал может быть обработанным, например, молотым, соложеным, частично соложеным или несоложеным. Несоложеный злак также называют сырьевое зерно. Примеры крахмалсодержащего растительного материала, не относящегося к злаку, включают, например, клубни, например разновидности картофеля и маниок.
Используемые в данном документе выражения напиток и продукт-напиток (продукты-напитки) охватывают такие пенообразующие сброженные напитки, как солодовое пиво, пиво, сваренное согласно Закону о чистоте пива, эль, сухое пиво, почти пиво, легкое пиво, слабоалкогольное пиво, низкокалорийное пиво, портер, бок-бир, стаут, солодовый напиток, безалкогольное пиво, безалкогольный солодовый напиток и т.п. Выражение напитки или продукты-напитки также охватывает пиво, не относящееся к пенообразующему, и альтернативные солодовые напитки, такие как солодовые напитки со вкусом и запахом фруктов, например вкусом и запахом цитрусовых, например, солодовые напитки со вкусом и запахом лимона, апельсина, лайма или ягод, солодовые напитки со вкусом и запахом спиртного напитка, например солодовый напиток со вкусом и запахом водки, рома или текилы, или солодовые напитки со вкусом и запахом кофе, например солодовый напиток со вкусом и запахом кофеина, и т.п.
Пиво можно получить из разнообразного крахмалсодержащего растительного материала при помощи практически одного и того же процесса, в котором крахмал, главным образом, состоит из гомополимеров глюкозы, в которых остатки глюкозы связаны либо α-1,4-, либо а-1,6-связями, причем первые являются преобладающими.
Процесс получения сброженных напитков, таких как пиво, обычно называется пивоварением. Традиционными сырьевыми материалами, используемыми при получении данных напитков, являются вода, шишки хмеля и солод. Кроме или вместо солода добавки, такие как обычная кукурузная крупа, очищенная кукурузная крупа, измельченные пивные дрожжи, рис, сорго, очищенный кукурузный крахмал, ячмень, ячменный крахмал, ячмень с удаленной мякинной оболочкой, пшеница, пшеничный крахмал, воздушный злак, хлопья злака, рожь, овес, картофель, тапиока и сиропы, такие как кукурузный сироп, сироп из сахарного тростника, инвертный сахарный сироп, ячменный и/или пшеничный сиропы и т.п., можно использовать в качестве источника крахмала. В итоге, под воздействием ферментов крахмал будет превращен в сбраживаемые сахара.
Что касается видов пива, полученных преимущественно из солода (например, с добавкой до 1520%), по ряду причин солод, который в основном получают из выбранных сортов ячменя, оказывает наибольший эффект на общий характер и качество пива. Во-первых, солод представляет собой основное ароматизирующее вещество в пиве. Во-вторых, солод обеспечивает большую часть сбраживаемого сахара. В-третьих, солод обеспечивает белки, которые будут оказывать влияние на тело и характер пены пива. В-четвертых, солод обеспечивает необходимую ферментативную активность во время затирания.
Шишки хмеля также в значительной степени оказывают влияние на качество пива, в том числе придание вкуса и запаха. В частности, при помощи шишек хмеля (или составляющих шишек хмеля) добавляют необходимые горькие вещества к пиву. Кроме того, шишки хмеля выступают в качестве осадителей белка, обеспечивают консервирующие вещества и способствуют образованию и стабилизации пены. Не все виды пива получают с применением шишек хмеля. Также можно использовать другие стабилизирующие вещества, такие как протеазы (например, папаин).
Не желая истолковывать это как ограничение настоящего изобретения, обычный процесс пивоварения можно описать следующим образом.
Процесс получения пива является хорошо известным в данной области техники, но вкратце, он включает пять этапов: (а) затирание и/или разваривание добавки; (Ь) отделение и экстракция сусла; (с)
- 3 027084 кипячение и охмеление сусла; (ά) охлаждение, сбраживание и хранение и (е) созревание, обработка и упаковывание. Типично, на первом этапе молотый или измельченный солод смешивают с водой и выдерживают в течение периода времени при регулируемых температурах для того, чтобы дать возможность ферментам, присутствующим в солоде, превратить крахмал, присутствующий в солоде, в сбраживаемые сахара.
На втором этапе затор перемещают в фильтрационный чан или заторный фильтр, где жидкость отделяют от остатка зерна. Эту сладкую жидкость называют сусло, а остаток зерна называют дробина. Типично, затор подвергают экстракции, которая включает добавление воды к затору для извлечения остаточного растворимого экстракта из дробины.
На третьем этапе сусло энергично кипятят. Это обеспечивает стерилизацию сусла и способствует созданию цвета, вкуса и запаха. Шишки хмеля добавляют в определенный момент во время кипячения.
На четвертом этапе сусло охлаждают и перемещают в бродильный чан, который либо содержит дрожжи, либо в который дрожжи добавляют. Дрожжи превращают сахара путем сбраживания в спирт и углекислый газ; при этом в конце сбраживания бродильный чан охлаждают, или бродильный чан можно охлаждать для прекращения сбраживания. Хлопья дрожжей удаляют.
На последнем этапе пиво охлаждают и хранят в течение периода времени, на протяжении которого пиво становится прозрачным и его вкус улучшается, и любой материал, который может ухудшить внешний вид, вкус и срок хранения пива, выпадает в осадок. Перед упаковыванием пиво насыщают углекислым газом и, необязательно, фильтруют и пастеризуют.
После сбраживания получают напиток, который обычно содержит от приблизительно 2 до приблизительно 10 вес.% спирта. Несбраживаемые углеводы не превращаются во время сбраживания и образуют большую часть растворенных твердых веществ в конечном пиве.
Этот остаток остается из-за неспособности солодовых амилаз гидролизовать а-1,6-связи крахмала. Несбраживаемые углеводы привносят приблизительно 50 калорий на 12 унций пива.
В последнее время проводилась широкая популяризация пивных напитков, которые называют легкими видами пива, видами пива с пониженной калорийностью или низкокалорийными видами пива, в частности, на рынке Соединенных Штатов. Согласно определению, принятому в Соединенных Штатах, эти виды пива содержат на приблизительно 30% меньше калорий, чем нормальное пиво от производителя.
Дополнительную информацию, относящуюся к традиционным процессам пивоварения, а также определения для выражений, используемых в области, связанной с технологией пивоварения, которые применяются для целей настоящего изобретения, можно найти в Тесйпо1оду ВгеМпд αηά МаШпд Ьу Ао1!дапд Кип/е о! Фе Кекеагсй αηά ТеасПпд 1п8Йи1е о! ВгеМпд, Вегйп (УЪВ), 2ηά гсуфсб Εάίίίοη 1999, ΙδΒΝ 3-921690-39-0, 3гй ейШоп (2004): ΙδΒΝ 3-921690-49-8, 4411 нрскИес! ейШоп, 2010 (Ι8ΒΝ 978-3-92169064-2).
Ксиланазы отнесены к ЕС 3.2.1.8, ЕС 3.2.1.32, ЕС 3.2.1.136 и ЕС 3.2.1.156; причем их активность можно измерить, например, как описано в примерах. Ксиланазы, подходящие для применения в комбинации с ферментом, характеризующимся эндо-1,3(4)-в-глюканазной активностью, согласно настоящему изобретению включают любую ксиланазу, отнесенную к ЕС 3.2.1.8, ЕС 3.2.1.32, ЕС 3.2.1.13 6 и ЕС 3.2.1.156, например любую ксиланазу, раскрытую в патентных документах АО 2010072226, АО 2010072225, АО 2010072224, АО 2005059084, АО 2007056321, АО 2008023060А, АО 9421785, АО 2006114095, АО 2006066582, И8 2008233175 и АО 10059424.
Эндо-1,4-в-ксиланаза отнесена к ЕС 3.2.1.8. Фермент вызывает эндогидролиз 1,4-в-О-ксилозидных связей в ксиланах.
Выражения ксиланаза семейства 11, гликозидгидролаза (ОН) семейства 11 или просто ксиланаза ОН 11, используемые в данном документе, относятся к эндо-1,4-в-ксиланазе, отнесенной к ЕС 3.2.1.8, которая вызывает эндогидролиз 1,4-в-О-ксилозидных связей в ксиланах и которая отнесена к ксиланазе семейства 11 согласно В. Неппккай А с1а881йсайоп о! д1усоку1 Ьуйго1а8е8 Ьакей оп атшо асИ кециепсе 81тПагШек. Вюсйет. 1. 280 (1991), рр. 309-316.
Выражения ксиланаза семейства 10, гликозидгидролаза (ОН) семейства 10 или просто ксиланаза ОН 10 охватывают ферменты с рядом известных активностей, например ксиланаза (ЕС:3.2.1.8); эндо1,3-β-ксиланаза (ЕС:3.2.1.32); целлобиогидролаза (ЕС:3.2.1.91). Эти ферменты ранее были известны как целлюлаза семейства Р.
В некоторых вариантах осуществления фермент, характеризующийся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, представляет собой ксиланазу семейства 11. В некоторых вариантах осуществления фермент, характеризующийся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, представляет собой ксиланазу семейства 10.
В одном аспекте ферментная композиция согласно настоящему изобретению имеет эндо-1,4-вксиланазную активность, измеренную при помощи исследования, описанного в примерах.
Исследование для измерения ксиланазной активности можно осуществлять при рН 3,5 или рН 5 и 50°С с использованием ксилана в качестве субстрата, или его можно проводить при различных значениях рН и температуры для дополнительной характеристики и описания ферментов. Ферментную актив- 4 027084 ность рассчитывают исходя из увеличения поглощения, обусловленного ксилозой, при 540 нм за единицу времени.
В некоторых вариантах осуществления ферментная композиция согласно настоящему изобретению содержит ксиланазную активность по меньшей мере приблизительно 5000 ед./г, например по меньшей мере приблизительно 6000 ед./г, например по меньшей мере приблизительно 7000 ед./г, например по меньшей мере приблизительно 8000 ед./г, например по меньшей мере приблизительно 8500 ед./г, измеренную при помощи исследования, описанного в примерах.
Ферментная композиция согласно настоящему изобретению может иметь целлюлолитическую активность. Систематическим названием целлюлозы является 4-(1,3;1,4)-3-О-глюкан-4-глюканогидролаза, и при этом целлюлолитические ферменты или целлюлазы отнесены к ЕС 3.2.1.4. Целлюлаза осуществляет эндогидролиз (1ш-4)-в-Э-глюкозидных связей, например, в целлюлозе, лихенине и β-Ό-глюканах злаков, а также будет гидролизовать 1,4-связи в β-Ό-глюканах, также содержащих 1,3-связи. Целлюлаза также имеет другие названия, например эндо-1,4-в-О-глюканаза, в-1,4-глюканаза, β-1,4эндоглюканогидролаза, целлюлаза А, целлюлозин АР, эндоглюканаза Ό, щелочная целлюлоза, целлюлаза А3, целлюлодекстриназа, целлюлаза 9.5, авицелаза, панцеллаза 88 и 1,4-(1,3;1,4)-в-Э-глюкан-4глюканогидролаза.
В одном аспекте настоящего изобретения целлюлазную активность ферментной композиции согласно настоящему изобретению измеряют при помощи способа для целлюлазной активности, как описано ниже под заглавием Исследования.
В дополнительных аспектах настоящее изобретение относится к ферментам, имеющим эндо-1,3(4)β-глюканазную активность, определенную при помощи исследования, описанного в примерах.
β-глюканаза или бета-глюканаза, как используется в данном документе, относится к эндо-1,3(4)β-глюканазе из ЕС 3.2.1.6. Катализирует эндогидролиз (1ш-3)- или (1ш-4)-связей в β-Ό-глюканах, если остаток глюкозы, восстанавливающая группа которого принимает участие в связи, подлежащей гидролизу, сам замещен по С-3. β-глюканазы, подходящие для применения в комбинации с ферментом, характеризующимся эндо-1,4-β-ксиланазной активностью, согласно настоящему изобретению включают любую β-глюканазу, раскрытую в патентных документах АО 2004087889, АО 2005059084, АО 9414953, АО 2007056321, АО 9531533, АО 08023060, АО 2005100582, АО 9828410, АО 9742301, АО 2006066582, АО 05118769, АО 2005003319 и АО 10059424.
Стандартное исследование осуществляют при рН 5,0, и его можно проводить при различных значениях рН для дополнительной характеристики и описания ферментов.
Одну единицу эндо-1,3(4)-β-глюканазной активности определяют как количество фермента, которое образует 1 мкмоль эквивалентов глюкозы за 1 мин при условиях исследования (рН 5,0 (или как указано) и 50°С).
В некоторых вариантах осуществления ферментная композиция согласно настоящему изобретению содержит β-глюканазную активность по меньшей мере приблизительно 10000 ед./г, например по меньшей мере приблизительно 12000 ед./г, например по меньшей мере приблизительно 14000 ед./г, например по меньшей мере приблизительно 15000 ед./г, например по меньшей мере приблизительно 18000 ед./г, измеренную при помощи исследования, описанного в примерах.
В дополнительных аспектах ферментная композиция согласно настоящему изобретению имеет ламинариназную активность или содержит любой один или несколько дополнительных ферментов, имеющих ламинариназную активность. Ламинариназную активность определяют, как описано в исследовании ламинаразы, описанном в разделе Исследования.
Ламинариназа может представлять собой эндо-1,3(4)-β-глюканазу, отнесенную к Е.С. 3.2.1.6, или глюкан-эндо-1,3-β-^-глюкозидазу, отнесенную к Е.С. 3.2.1.39. Эндо-1,3(4)-β-глюканаза с альтернативными названиями ламинариназа, эндо-1,3-β-глюканаза, эндо-1,4-β-глюканаза отнесена к Е.С. 3.2.1.6. Субстраты включают ламинарин, лихенин и Ό-глюканы злаков, и при этом фермент катализирует эндогидролиз (1ш-3)-или (1ш-4)-связей в β-Ό-глюканах, если остаток глюкозы, восстанавливающая группа которого принимает участие в связи, подлежащей гидролизу, сам замещен по С-3. Глюкан-эндо-1,3-β-^глюкозидаза с альтернативными названиями (1ш3)-β-глюкан-эндогидролаза, эндо-1,3-β-глюканаза и ламинариназа отнесена к Е.С. 3.2.1.39 и гидролизует (1ш3)-β-^-глюкозидные связи в (1^3)-β-Όглюканах в субстратах, таких как, например, ламинарин, парамилон и пахиман.
В некоторых аспектах ферментная композиция согласно настоящему изобретению имеет арабинаназную активность или содержит дополнительный фермент, имеющий арабинаназную активность. Арабинаназа отнесена к ЕС 3.2.1.99. Систематическим названием является 5-а-Е-арабинан-5-а-Ьарабинангидролаза, но она имеет несколько других названий, таких как арабинан-эндо-1,5-а-Ьарабинозидаза и эндо-1,5-а-Ь-арабинаназа, эндо-а-1,5-арабаназа, эндоарабаназа, 1,5-а-Ь-арабинан- и 1,5α-Ь-арабинангидролаза. Арабиназа осуществляет эндогидролиз (1ш-5)-а-арабинофуранозидных связей в (1 ш-5)-арабинанах. Арабинаназа также оказывает действие на арабинан.
В одном аспекте настоящего изобретения арабиназную активность ферментной композиции соглас- 5 027084 но настоящему изобретению измеряют при помощи исследования арабиназы, как описано ниже под заглавием Исследования. Исследование можно осуществлять при рН 3,5 и 50°С с использованием арабинана из сахарной свеклы в качестве субстрата, и его можно проводить при различных значениях рН и температуры для дополнительной характеристики и описания ферментов. Ферментную активность рассчитывают исходя из увеличения поглощения при 540 нм за единицу времени.
Одну единицу арабиназной активности определяют как количество фермента (нормализованное для общего объема исследования), которое дает увеличение ДОИ540нм-мин-1 при условиях исследования (рН 3,5 и 50°С).
В некоторых аспектах ферментная композиция согласно настоящему изобретению имеет β-Όглюкозидглюкогидролазную активность или содержит дополнительный фермент, имеющий β-Όглюкозидглюкогидролазную активность. β-Ό-глюкозидглюкогидролаза относится к ферментам из Е.С 3.2.1.21.
В некоторых аспектах ферментная композиция согласно настоящему изобретению имеет βксилозидазную активность или содержит дополнительный фермент, имеющий β -ксилозидазную активность, β-ксилозидаза или ксилан-1,4-в-ксилозидаза относится к ферментам из Е.С 3.2.1.37. βксилозидаза катализирует гидролиз (1—4)-β-^-ксиланов с удалением последовательных остатков Όксилозы с невосстанавливающего конца.
В некоторых аспектах настоящего изобретения ферментная композиция согласно настоящему изобретению имеет целлобиогидролазную активность или содержит дополнительный фермент, имеющий целлобиогидролазную активность.
Целлобиогидролаза или 1,4-β-целлобиозидаза целлюлозы относится к ферментам из ЕС 3.2.1.91. ^^-целлобиозидаза целлюлозы катализирует гидролиз 1,4-β-^-глюкозидных связей в целлюлозе и целлотетраозе с высвобождением целлобиозы с невосстанавливающих концов цепей.
Целлобиогидролазную активность ферментной композиции согласно настоящему изобретению измеряют при помощи исследования целлобиогидролазы, как описано ниже под заглавием Исследования. Стандартное исследование осуществляют при рН 5,0, и его можно проводить при различных значениях рН для дополнительной характеристики и описания ферментов.
Одну единицу целлобиогидролазной активности определяют как количество фермента, которое образует 1 мкмоль п-нитрофенола из п-нитрофенил-β-^-целлобиопиранозида за минуту при условиях исследования (рН 5,0 (или как указано) и 50°С).
В некоторых аспектах ферментная композиция согласно настоящему изобретению имеет α-Νарабинофуранозидазную активность или содержит дополнительный фермент, имеющий арабинофуранозидазную активность. α-Ν-арабинофуранозидаза или α-Ν-арабинофуранозидаза относится к ферментам из ЕС 3.2.1.55. α-Ν-арабинофуранозидаза катализирует гидролиз концевых невосстанавливающих аЬ-арабинофуранозидных остатков в α-Ь-арабинозидах.
В одном аспекте настоящего изобретения арабинофуранозидазную активность ферментной композиции согласно настоящему изобретению измеряют при помощи исследования арабинофуранозидазы, как описано ниже под заглавием Исследования. Стандартное исследование можно осуществлять при рН 5,0 и 50°С и его можно проводить при различных значениях рН и температуры для дополнительной характеристики и описания ферментов.
Одну единицу α-Ν-арабинофуранозидазной активности определяют как количество фермента, которое образует 1 мкмоль п-нитрофенола из п-нитрофенил-а-Ь-арабинофуранозида за минуту при условиях исследования (рН 5,0 и 50°С (или как указано)).
В некоторых аспектах ферментная композиция согласно настоящему изобретению имеет глюкан^^-глюкозидазную активность или содержит дополнительный фермент, имеющий глюкан-1,4-βглюкозидазную активность. Глюкан-1,4-β-глюкозидаза или глюкан-1,4-β-глюкозидаза относится к ферментам из Е.С3.2.1.74. Глюкаю^^-глюкозидаза катализирует гидролиз (1—4)-связей в (1 ——4)-β-Όглюканах с удалением последовательных глюкозных элементарных звеньев.
В некоторых аспектах ферментная композиция согласно настоящему изобретению имеет ксилоглюкан-специфическую экзо-β-1,4-глюканазную активность или содержит дополнительный фермент, имеющий ксилоглюкан-специфическую экзо-β-1,4-глюканазную активность. Ксилоглюкан-специфическая экзо-β-1,4-глюканаза относится к ферментам из Е.С3.2.1.155. Ксилоглюкан-специфическая экзо-β-1,4глюканаза катализирует экзогидролиз (1— 4)-β-^-глюкозидных связей в ксилоглюканах.
Ферменты и ферментные композиции согласно предыдущим аспектам можно использовать в способе, предусматривающем снижение вязкости водного раствора, содержащего гидролизат крахмала.
Ферменты и ферментные композиции также можно использовать в способе, предусматривающем фильтрацию водного раствора, содержащего гидролизат крахмала. В некоторых вариантах осуществления водный раствор, содержащий гидролизат крахмала, представляет собой затор для получения пива, и в других вариантах осуществления водный раствор, содержащий гидролизат крахмала, представляет собой пищевую композицию.
- 6 027084
В альтернативном случае ферментную композицию согласно настоящему изобретению можно использовать при получении плодово-ягодного сока, вина, обработке зерна, получении топливного спирта, биотоплива первого или второго поколения, например биоэтанола, и пищевого спирта.
В некоторых вариантах осуществления биотопливо первого или второго поколения, например биоэтанол, получают из разновидностей сельскохозяйственного сырья, например сахарного тростника, картофеля, кукурузы, пшеницы, сорго и т.п., или из целлюлозного материала, например кукурузной соломы, проса прутьевидного или другого растительного материала. В обоих случаях сбраживаемые сахара экстрагируют из сырьевого материала и осуществляют сбраживание при помощи микроорганизмов с получением спирта, который подвергают перегонке, и его можно использовать в качестве транспортного топлива. Ферментную композицию согласно настоящему изобретению можно использовать при таком получении биотоплива. Ферментный комплекс можно добавлять для того, чтобы улучшить экстракцию полисахаридов из сырьевого материала, способствовать расщеплению полисахаридов до сбраживаемых сахаров и/или для того, чтобы улучшить параметры обработки, например отделение жидкостей от твердых веществ, характеристики потока и перекачиваемость.
Способ по настоящему изобретению можно применять при затирании любой крупки. Согласно настоящему изобретению крупка может содержать любой растительный материал, содержащий крахмал и/или сахар, получаемый из любого растения и части растения, в том числе клубней, корней, стеблей, листьев и семян.
В некоторых вариантах осуществления крупка содержит зерно, например зерно ячменя, пшеницы, ржи, овса, кукурузы, риса, майла, проса и сорго, и более предпочтительно по меньшей мере 10% или более предпочтительно по меньшей мере 15%, даже более предпочтительно по меньшей мере 25% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 35%, например по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 90% или даже 100% (вес./вес.) крупки для сусла получают из зерна.
В некоторых вариантах осуществления крупка содержит соложеное зерно, например ячменный солод. Предпочтительно по меньшей мере 10% или более предпочтительно по меньшей мере 15%, даже более предпочтительно по меньшей мере 25% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 35%, например по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 90% или даже 100% (вес./вес.) крупки для сусла получают из соложеного зерна.
Выражение затор подразумевает водную крахмальную суспензию, например, содержащую измельченный ячменный солод, измельченный ячмень, и/или другую добавку, или их комбинацию, причем она смешана с водой и в дальнейшем подлежит разделению на сусло + дробину.
Выражение разделение затора подразумевает отделение сусла от дробины, например, при помощи фильтрования пивного сусла или фильтрации затора.
Выражение фильтрация пива подразумевает процесс разделения, при котором удаляют дрожжевые клетки и другие материалы, вызывающие помутнение, которые все еще присутствуют в пиве, например, при помощи микрофильтрации или мембранных процессов.
Ферментный препарат, например, в форме пищевого ингредиента, полученного согласно настоящему изобретению, может находиться в форме раствора или в виде твердого вещества - в зависимости от использования, и/или способа применения, и/или способа введения. Твердая форма может быть либо в виде высушенного ферментного порошка, либо в виде гранулированного фермента.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает препарат на основе ферментной композиции, содержащий фермент или ферментную композицию согласно настоящему изобретению, носитель фермента, и необязательно стабилизатор, и/или консервант.
В еще одном аспекте настоящего изобретения носитель фермента выбран из группы, состоящей из глицерина или воды.
В дополнительном аспекте препарат содержит стабилизатор. В одном аспекте стабилизатор выбран из группы, состоящей из неорганических солей, многоатомных спиртов, сахаров и их комбинаций. В одном аспекте стабилизатор представляет собой неорганическую соль, например хлорид калия. В другом аспекте многоатомный спирт представляет собой глицерин, пропиленгликоль или сорбит. В еще одном аспекте сахар представляет собой низкомолекулярный углевод, в частности любой из нескольких углеводов со сладким вкусом, таких как глюкоза, фруктоза и сахароза.
В еще одном аспекте препарат содержит консервант. В одном аспекте консервант представляет собой метилпарабен, пропилпарабен, бензоат, сорбат или другие консерванты, разрешенные для применения в пищевых продуктах, или их смесь.
Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения
В некоторых вариантах осуществления фермент, характеризующийся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, необязательно в комбинации с любой одной или несколькими β-глюканазами, согласно настоящему изобретению обеспечивает значительно сниженную вязкость в пивоварении, что облегчает улучшенное разделение затора и отделение пива.
Необходимые характеристики ксиланазы для пивоварения могут включать один или несколько из следующих аспектов.
- 7 027084
Субстратная специфичность фермента.
Соотношение \νΕ-ΑΧ/\νυ-ΑΧ оказывает влияние на вязкость. В некоторых вариантах осуществления данное соотношение составляет менее приблизительно 7,0, например менее приблизительно 6,5, например менее приблизительно 6,0, например менее приблизительно 5,5, например менее приблизительно
5,0, например менее приблизительно 4,5.
Избирательность фермента по отношению к субстрату.
Считается, что то, насколько близко к точкам разветвления фермент(ы) осуществляют разрезание, оказывает влияние на функциональные свойства.
Термостабильность фермента.
При длительном растворении АХ во время затирания термостабильность является ключевым свойством. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления фермент, характеризующийся эндо-1,4-вксиланазной активностью, согласно настоящему изобретению является термостабильным в пределах температурного диапазона 65-78°С.
Оптимальное значение рН для фермента. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления фермент, характеризующийся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, имеет оптимальное значение рН в диапазоне рН 5,4-5,6.
Ингибирование фермента (например, известный ключевой фактор для ксиланаз).
Указанную значительно сниженную вязкость в пивоварении можно измерить как сниженную вязкость в пивоварении по сравнению с контролем с известным ферментом или комбинацией ферментных активностей, например иНгаЛо® Мах, используемым при таких же условиях и количествах.
В некоторых вариантах осуществления фермент, характеризующийся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, согласно настоящему изобретению, необязательно в комбинации с любой одной или несколькими β-глюканазами согласно настоящему изобретению, обеспечивает улучшенное разделение затора и отделение пива в пивоварении.
В некоторых вариантах осуществления фермент, характеризующийся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, согласно настоящему изобретению, необязательно в комбинации с любой одной или несколькими β-глюканазами согласно настоящему изобретению, обеспечивает низкую возможность образования постороннего привкуса, например образования постороннего привкуса, связанного с распадом арабиноксиланов.
В некоторых вариантах осуществления фермент, характеризующийся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, согласно настоящему изобретению, необязательно в комбинации с любой одной или несколькими β-глюканазами согласно настоящему изобретению обеспечивает сниженный риск разрушения фильтрующего слоя, например, при фильтровании пивного сусла.
В некоторых вариантах осуществления фермент, характеризующийся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, согласно настоящему изобретению, необязательно в комбинации с любой одной или несколькими β-глюканазами согласно настоящему изобретению обеспечивает снижение возможности постороннего привкуса и/или снижение образования постороннего привкуса. Один аспект настоящего изобретения относится к ферменту, характеризующемуся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, причем данный фермент содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность с любой последовательностью, выбранной из 8ЕО ГО N0: 1, 8ЕО ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 3, 8Е0 ГО N0: 4, 8Е0 ГО N0: 5, 8Е0 ГО N0: 6, 8Е0 ГО N0: 17 и 8Е0 ГО N0: 18 или их любого функционального фрагмента.
Другой аспект относится к ферменту, характеризующемуся эндо-1,3(4)-в-глюканазной активностью, причем данный фермент содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность с любой последовательностью, выбранной из 8Е0 ГО N0: 7, 8Е0 ГО N0: 8, 8Е0 ГО N0: 9, 8ЕО ГО N0: 10 и 8ЕО ГО N0: 11, 8ЕО ГО N0: 12, 8ЕО ГО N0: 13, 8ЕО ГО N0: 14, 8ЕО ГО N0: 15, 8Е0 ГО N0: 16 или их любого функционального фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фермент, характеризующийся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, имеет соотношение активности в отношении растворимого арабиноксиланового субстрата (νΕ-ΑΧ) и нерастворимого арабиноксиланового субстрата (νυ-ΑΧ), которые относятся к арабиноксилановому субстрату, менее приблизительно 7,0, например менее приблизительно 6,5, например менее приблизительно 6,0, например менее приблизительно 5,5, например менее приблизительно 5,0, например менее приблизительно 4,5.
В некоторых вариантах осуществления фермент согласно настоящему изобретению характеризуется оптимальным значением температуры в диапазоне 40-70°С, например в диапазоне 45-65°С, например в диапазоне 50-65°С, например в диапазоне 55-65°С.
В некоторых вариантах осуществления фермент согласно настоящему изобретению имеет по меньшей мере 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из 8Е0 ГО N0: 1-18 или их любого функционального фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления фермент согласно настоящему изобретению имеет общее
- 8 027084 количество аминокислот менее 350, например менее 340, например менее 330, например менее 320, например менее 310, например менее 300 аминокислот, например в диапазоне 200-350, например в диапазоне 220-345 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность указанного фермента согласно настоящему изобретению имеет по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных замен по сравнению с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из ВЕР ГО N0: 1-18 или их любого функционального фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность указанного фермента согласно настоящему изобретению имеет максимум одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных замен по сравнению с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из ВЕР ГО N0: 1-18 или их любого функционального фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления фермент согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, определенную в любой из ВЕС 10 N0: 1-18 или их любом функциональном фрагменте.
В некоторых вариантах осуществления фермент согласно настоящему изобретению состоит из аминокислотной последовательности, определенной в любой из ВЕС 10 N0: 1-18 или их любом функциональном фрагменте.
Дополнительный важный аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей фермент, характеризующийся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, согласно настоящему изобретению в комбинации с любой одной или несколькими β-глюканазами. В некоторых вариантах осуществления данная одна или несколько β-глюканаз является(являются) таковой(таковыми) согласно настоящему изобретению.
Дополнительный важный аспект настоящего изобретения представляет собой композицию, содержащую фермент, характеризующийся эндо-1,3(4)-в-глюканазной активностью, согласно настоящему изобретению в комбинации с любой одной или несколькими ксиланазами. В некоторых вариантах осуществления данная одна или несколько ксиланаз представляет(представляют) собой фермент, характеризующийся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления данная одна или несколько ксиланаз представляет(представляют) собой фермент согласно ВЕР ГО N0: 17, и/или ВЕР ГО N0: 18, или их любому функциональному фрагменту.
В некоторых вариантах осуществления комбинация фермента, характеризующегося эндо-Е4-|!ксиланазной активностью, с ферментом, характеризующимся эндо-1,3(4)-в-глюканазной активностью, представляет собой таковую согласно следующей таблице.
χ-ый фермент (ксйланаза) 2-ой фермент (глюканаза) к. У-1 о Ω Ω н О Ы ω см О Ω Ω н О Ы ω го О Ω Ω н О Ы ω О Ω Ω н О Ы ω Ω О Ω Ω н О Ы ω со О Ω Ω н О Ы ω У-1 О Ω Ω н О Ы ω со У-1 О Ω Ω н О Ы ω
5Е<2 Ю N0:7 X X X X X X X X
5Е<2 Ю N0:8 X X X X X X X X
5Е<2 Ю N0:9 X X X X X X X X
5Е<2 Ю N0:10 X X X X X X X X
5Е<2 Ю N0:11 X X X X X X X X
5Е<2 Ю N0: 12 X X X X X X X X
5Е<2 Ю N0: 13 X X X X X X X X
5Еф Ю N0:14 X X X X X X X X
5Еф Ю N0:15 X X X X X X X X
ЗЕО Ю N0:16 X X X X X X X X
Следует понимать, что в любой приведенной выше комбинации 1-й фермент, который представляет собой фермент, характеризующийся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, может быть в комбинации с одним ферментом, характеризующимся эндо-1,3(4)-в-глюканазной активностью, причем соотношение двух ферментов представляет собой 1:10, 2:10, 3:10, 4:10, 5:10, 6:10, 7:10, 8:10, 9:10, 10:10, 10:9, 10:8, 10:7, 10:6, 10:5, 10:4, 10:3, 10:2 или 10:1, например, в пределах диапазона 1:10-10:1, например, 2:10-10:2, например, 3:10-10:3, например, 4:10-10:4, например, 5:10-10:5, например, 6:10-10:6, например, 7:10-10:7, например, 8:10-10:8 или в пределах 9:10-10:9.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно настоящему изобретению содержит
- 9 027084 комбинацию по меньшей мере из двух ферментов, причем указанные два фермента или два фермента с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 80% идентичность последовательности с соответствующей ВЕС) ГО или ее любым функциональным фрагментом, выбраны из перечня, состоящего из
5Е<2 Ю N0 1 и 5Е<2 Ю N0:7;
5Е£) Ю N0 2 и 5Εζ) Ю N0:7;
5Е<2 Ю ΝΟ 3 и 5Е<2 Ю N0:7;
ЗЕ£) Ю N0 4 и ЗЕ<2 Ю N0:7;
5Е<2 Ю N0 5 и ЗЕ<2 Ю N0:7;
5Е<2 Ю N0 б и ЗЕ<2 Ю N0:7;
5Е<2 Ю N0 17 и 5Е<2 Ю N0:7;
5Е<2 Ю N0 18 и 5Е<2 Ю N0:7;
5Е<2 Ю N0 1 и ЗЕ<2 Ю N0:8;
5Е<2 Ю N0 2 и ЗЕ<2 Ю N0:8;
5Е<2 Ю N0 3 и ЗЕ<2 Ю N0:8;
5Е<2 Ю N0 4 и ЗЕ<2 Ю N0:8;
5Е<2 Ю N0 5 и ЗЕ<2 Ю N0:8;
5Е<2 Ю N0 б и ЗЕ<2 Ю N0:8;
5Е<2 Ю N0 17 и ЗЕ<2 Ю N0:8;
5Е<2 Ю N0 18 и ЗЕ<2 Ю N0:8;
5Е<2 Ю N0 1 и ЗЕ<2 Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 2 и ЗЕ<2 Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 3 и ЗЕ<2 Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 4 и ЗЕ<2 Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 5 и ЗЕ<2 Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 б и ЗЕ<2 Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 17 ' и ЗЕ<2 ' Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 16 : и ЗЕ<2 ' Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 1 и ЗЕ<2 Ю N0:10;
5Е<2 Ю N0 2 и ЗЕ<2 Ю N0:10;
5Е<2 Ю N0 3 и ЗЕ<2 Ю N0:10;
5Е<2 Ю N0 4 и ЗЕ<2 Ю N0:10;
5Е<2 Ю N0 5 и ЗЕ<2 Ю N0:10;
5Е<2 Ю N0 б и ЗЕ<2 Ю N0:10;
5Е<2 Ю N0 17 ' и ЗЕ<2 ' Ю N0:10
5Е<2 Ю N0 16 : и ЗЕ<2 ' Ю N0:10
5Е<2 Ю N0 1 и ЗЕ<2 Ю N0:11;
5Е<2 Ю N0 2 и ЗЕ<2 Ю N0:11;
5Е<2 Ю N0 3 и ЗЕ<2 Ю N0:11;
5Е<2 Ю N0 4 и ЗЕ<2 Ю N0:11;
5Е<2 Ю N0 5 и ЗЕ<2 Ю N0:11;
5Е<2 Ю N0 б и ЗЕ<2 Ю N0:11;
5Е<2 Ю N0 17 ' и ЗЕ<2 ' Ю N0:11
5Е<2 Ю N0 16 : и ЗЕ<2 ' Ю N0:11
5Е£) Ю N0 1 и ЗЕ<2 Ю N0:12;
5Е<2 Ю N0 2 и ЗЕ<2 Ю N0:12;
5Е<2 Ю N0 3 и ЗЕ<2 Ю N0:12;
5Е<2 Ю N0 4 и ЗЕ<2 Ю N0:12;
- 10 027084
ЗЕО Ю N0:5 и ЗЕО Ю N0:12;
ЗЕО Ιϋ N0:6 и ЗЕО Ю N0:12;
ЗЕО Ю N0:17 и ЗЕО Ю N0:12;
ЗЕО Ю N0:18 и ЗЕО Ю N0:12;
ЗЕО Ю N0:1 и ЗЕО Ю N0:13;
ЗЕО Ю N0:2 и ЗЕО Ю N0:13;
ЗЕО Ю N0:3 и ЗЕО Ю N0:13;
ЗЕО Ю N0:4 и ЗЕО Ю N0:13;
ЗЕО Ю N0:5 и ЗЕО Ю N0:13;
ЗЕО Ю N0:6 и ЗЕО Ю N0:13;
ЗЕО Ю N0:17 и ЗЕО Ю N0:13;
ЗЕО Ю N0:18 и ЗЕО Ю N0:13;
ЗЕО Ю N0:1 и ЗЕО Ю N0:14;
ЗЕО Ю N0:2 и ЗЕО Ю N0:14;
ЗЕО Ю N0:3 и ЗЕО Ю N0:14;
ЗЕО Ю N0:4 и ЗЕО Ю N0:14;
ЗЕО Ю N0:5 и ЗЕО Ю N0:14;
ЗЕО Ю N0:6 и ЗЕО Ю N0:14;
ЗЕО Ю N0:17 и ЗЕО Ю N0:14;
ЗЕО Ю N0:18 и ЗЕО Ю N0:14;
ЗЕО Ю N0:1 и ЗЕО Ю N0:15;
ЗЕО Ю N0:2 и ЗЕО Ю N0:15;
ЗЕО Ю N0:3 и ЗЕО Ю N0:15;
ЗЕО Ю N0:4 и ЗЕО Ю N0:15;
ЗЕО Ю N0:5 и ЗЕО Ю N0:15;
ЗЕО Ю N0:6 и ЗЕО Ю N0:15;
ЗЕО Ю N0:17 и ЗЕО Ю N0:15;
ЗЕО Ю N0:18 и ЗЕО Ю N0:15;
ЗЕО Ю N0:1 и ЗЕО Ю N0:16;
ЗЕО Ю N0:2 и ЗЕО Ю N0:16;
ЗЕО Ю N0:3 и ЗЕО Ю N0:16;
ЗЕО Ю N0:4 и ЗЕО Ю N0:16;
ЗЕО Ю N0:5 и ЗЕО Ю N0:16;
ЗЕО Ю N0:6 и ЗЕО Ю N0:16;
ЗЕО Ю N0:17 и ЗЕО ' Ю N0:16; и
ЗЕО Ю N0:18 и ЗЕО ' Ю N0:16.
В некоторых вариантах осуществления эндо-1,3(4)-в-глюканазная активность и эндо-1,4-вксиланазная активность происходят по меньшей мере из двух различных ферментов, например по меньшей мере двух различных ферментов из двух различных видов.
В некоторых вариантах осуществления общий подъем давления уменьшен до значения менее 470 мм ^С, например менее 450 мм ^С, например менее 430 мм ^С, например менее 410 мм ^С, например менее 390 мм ^С, например менее 370 мм ^С, например менее 350 мм ^С, например менее 330 мм ^С, например менее 310 мм ^С, например менее 300 мм ^С, например менее 290 мм ^С, при применении композиции согласно настоящему изобретению перед фильтрованием пивного сусла в пивоварении.
В некоторых вариантах осуществления общий подъем давления уменьшен по меньшей мере на 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 или 95% по сравнению с применением отрицательного контроля без указанной композиции, причем при применении перед фильтрованием пивного сусла в пивоварении.
В некоторых вариантах осуществления фильтруемость сусла, измеренная по объему сусла, собранного через 5 мин фильтрации по сравнению с контролем без ферментов повышена до более 1,5, например более 1,6, например более 1,7, например более 1,8, например более 1,9, например более 2,0, например более 2,1, например более 2,2, например более 2,3, например более 2,4, например более 2,5, при применении композиции согласно настоящему изобретению в пивоварении перед отделением сусла.
- 11 027084
В некоторых вариантах осуществления фильтруемость сусла, измеренная по объему сусла, собранного через 5 мин фильтрации, повышена по меньшей мере на 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,
31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89,
91, 93, 95, 97, 99, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 или 300% по сравнению с применением отрицательного контроля без указанной композиции.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно настоящему изобретению содержит любой один или несколько дополнительных ферментов. В некоторых вариантах осуществления один или несколько дополнительных ферментов выбраны из перечня, состоящего из ксиланазы, отнесенной к ЕС 3.2.1.32, ЕС 3.2.1.136 или ЕС 3.2.1.156, целлюлазы, ламинариназы, эндо-1,5-а-Ь-арабинаназы, β-Όглюкозилглюкогидролазы, β-ксилозидазы, целлобиогидролазы, глюкан-1,4-в-глюкозидазы, ксилоглюкан-специфической экзо-в-1,4-глюканазы и α-Ν-арабинофуранозидазы.
Последовательности и ферменты, определенные при помощи последовательности, упомянутой в данном документе, и применяемые согласно настоящему изобретению отдельно или в комбинациях с другими ферментами или соединениями, могут быть с сигнальным пептидом или без сигнального пептида.
Исследования.
Способ для целлюлазной активности с использованием ΌΝ8 (способ с использованием ΌΝ8 и СМС).
Систематическое название: 1,4-(1,3;1,4)-в-О-глюкан-4-глюканогидролаза.
Номер ΙϋΒ: ЕС 3.2.1.4.
Принцип.
Исследование целлюлазы было основано на ферментативном эндогидролизе 1,4-в-О-глюкозидных связей в карбоксиметилцеллюлозе (СМС), в-1,4-глюкане. Продукты реакции (олигосахариды β-1,4глюкана) определяли колориметрически при помощи измерения, полученного в результате увеличения количества восстанавливающих групп с использованием реактива на основе 3,5-динитросалициловой кислоты. Ферментную активность рассчитывали исходя из зависимости между концентрацией восстанавливающих групп в качестве эквивалентов глюкозы и поглощением при 540 нм.
Исследование осуществляли при рН 5,0, но его можно проводить при различных значениях рН для дополнительной характеристики и описания ферментов.
Определение единицы.
Одну единицу целлюлазной активности определяли как количество фермента, которое образовывало 1 мкмоль эквивалентов глюкозы за минуту при условиях исследования (рН 5, 0 (или как указано) и 50°С).
Материалы.
Карбоксиметилцеллюлоза. Поставщик: Меда/уте Ый. № продукта: СМ-целлюлоза 4М.
Ό-глюкоза 'Апа1аК'. Поставщик: Мегск Ый. (ВИН). № продукта: 10117. М.\У.: 180,16.
Безводный ацетат натрия 'Апа1аК'. Поставщик: Мегск Ый. (ВИН). № продукта: 10236. М.\У.: 82,03.
Уксусная кислота (ледяная) 'Апа1аК'. Поставщик: Мегск Ый. (ВИН). № продукта: 10001. М.\У.: 60,05.
3,5-Динитросалициловая кислота ОРК (3,5-динитро-2-гидроксибензойная кислота). Поставщик: Мегск Ый. (ВИН). № продукта: 28235.
Гранулы гидроксида натрия 'Апа1аК'. Поставщик: Мегск Ый. (ВИН). № продукта: 10252. М.\У.: 40,00.
(+)-Тартрат калия-натрия 'Апа1аК'. Поставщик: Мегск Ый. (ВИН). № продукта: 10219. М.\У.: 282,22.
1,5% (вес./об. раствора) раствор карбоксиметилцеллюлозы (СМС) в 0,1М натрий-ацетатном буфере, рН 5,0 (раствор субстрата).
Раствор 3,5-динитросалициловой кислоты (ΌΝ8). 20 г/л ΌΝ8 в буфере, содержащем 32 г/л гранул гидроксида натрия и 600 г/л (+)-тартрата калия-натрия.
Стандартный раствор глюкозы (0,50 мг/мл).
Методика.
Ферментную композицию разбавляли с получением образцов и калибровочную кривую для глюкозы, как показано на фиг. 2, строили с использованием концентраций глюкозы 0, 0,125, 0,25, 0,375 и 0,5 мг/мл.
0,25 мл ферментного раствора смешивали с 1,75 мл раствора субстрата (1,5% вес./об.) при 50°С и реакцию останавливали через 10 мин при помощи добавления раствора ΌΝ8. За этим следовало нагревание до 95°С в течение 5 мин.
Оптическую плотность измеряли при 540 нм (ОО54<в различных образцах.
Расчет.
Ферментную активность определяли исходя из калибровочной кривой, как показано на фиг. 2.
Активность рассчитывали следующим образом.
- 12 027084
где Т = ΔΟΌ540ημ исследуемого образца = ΟΌ540ημ исследуемого образца - ΟΌ540ημ холостой пробы;
М = градиент калибровочной кривой (приблизительно 1,0);
с = отрезок, отсекаемый калибровочной кривой на оси у (всегда отрицательная величина и приблизительно -0,02);
180,16 = молекулярный вес глюкозы;
103 = для пересчета в мкмоль;
А = объем исследования в мл;
V = объем фермента в мл;
Т = время исследования в мин;
Ό = фактический коэффициент разбавления для фермента (например, для 1,000 г при разбавлении до 1 л Ό = 1000).
Ламинариназа (способ с использованием ΌΝ8 и ламинарина).
Принцип.
Реакция, катализируемая ламинариназой, предполагала эндогидролиз 1,3-глюкозидных связей в 1,3β-Ό-глюканах. Субстраты включали ламинарии, парамилон и пахиман. Продукты реакции (олигосахариды в-1,3-глюкана) определяли колориметрически при помощи измерения полученного в результате увеличения количества восстанавливающих групп с использованием реактива на основе 3,5динитросалициловой кислоты. Ферментную активность рассчитывали исходя из зависимости между концентрацией восстанавливающих групп в качестве эквивалентов глюкозы и поглощением при 540 нм.
Исследование осуществляли при рН 5,0 и 50°С, но его можно проводить при различных значениях рН и температуры для дополнительной характеристики и описания ферментов.
Определение единицы.
Одну единицу ламинариназной активности определяли как количество фермента, которое образовывал 1 мкмоль эквивалентов глюкозы за минуту при условиях исследования (рН 5,0 и 50°С (или как указано)).
Материалы.
См. материалы, приведенные выше, для исследования целлюлазной активности.
Ламинарин (из Баштана όίμίΐαΐα). Поставщик: 81дта-А1бпсЬ Со. I ЛсБ № продукта: Б 9634.
1,00% (вес./об. раствора) раствор ламинарина (раствор субстрата в 0,1М натрий-ацетатном буфере, рН 5,0).
1,75 мл раствора ламинарина смешивали с 0,25 мл разбавленного ферментного раствора при 50°С в течение 10 мин и реакцию останавливали добавлением 2 мл раствора ΌΝ8.
Калибровочную кривую строили с использованием растворов глюкозы с 0, 0,125, 0,25, 0,5 и 0,75 мг/мл.
Оптическую плотность измеряли при 540 нм (ΟΌ540ημ).
Расчет.
Активность рассчитывали следующим образом:
Активность (ед.мл или ед.г-1) = —- χ Α χ —д— х Ю3 ήϊ 130 Дь х-х-хо ν ί где Τ = ΔΟΌ540ημ исследуемого образца = ΟΌ540ημ исследуемого образца - ΟΌ540ημ холостой пробы;
М = градиент калибровочной кривой (приблизительно 1,0);
с = 120, отрезок, отсекаемый калибровочной кривой на оси у (всегда отрицательная величина и приблизительно -0,03);
180,16 = молекулярный вес глюкозы;
103 = для пересчета в мкмоль;
А = объем исследования в мл;
V = объем фермента в мл;
Т = время исследования в мин;
Ό = коэффициент разбавления для фермента (например, для 1 г при разбавлении до 1 л Ό = 1000). Исследование арабиназы.
Принцип.
Исследование арабиназной активности было основано на колориметрическом определении при помощи измерения полученного в результате увеличения количества восстанавливающих групп с исполь- 13 027084 зованием реактива на основе 3,5-динитросалициловой кислоты. Ферментную активность рассчитывали исходя из зависимости между концентрацией восстанавливающих групп в качестве эквивалентов арабинозы и поглощением при 540 нм.
Исследование осуществляли при рН 3,5, но его можно проводить при различных значениях рН для дополнительной характеристики и описания ферментов.
Определение единицы.
Одну единицу арабиназной активности (арабинаназа (эндо-1,5-а-Ь-арабинаназа)) определяли как количество фермента, которое образовывал 1 мкмоль эквивалентов арабинозы за минуту при условиях исследования (рН 3,5 (или как указано) и 50°С).
Материалы.
Арабинан из сахарной свеклы от Меда/уте.
Арабиноза от Мдта, А3131. М.\.: 150,1.
Безводный ацетат натрия 'Апа1аК'. Поставщик: Мегск Ыб. (ВИН). № продукта: 10236. М.\.: 82,03.
Уксусная кислота (ледяная) 'Апа1аК'. Поставщик: Мегск Ыб. (ВИН). № продукта: 10001. М.\.: 60,05.
3,5-Динитросалициловая кислота ОРК (3,5-динитро-2-гидроксибензойная кислота). Поставщик: Мегск Ыб. (ВИН). № продукта: 28235.
Гранулы гидроксида натрия 'Апа1аК'. Поставщик: Мегск Ыб. (ΒΏΗ). № продукта: 10252. М.\.: 40,00.
(+)-Тартрат калия-натрия 'Апа1аК'. Поставщик: Мегск Ыб. (ΒΏΗ). № продукта: 10219. М.\.: 282,22.
1,5% (вес./об. раствора) раствор арабинана в 0,1М натрий-ацетатном буфере, рН 3,5 (раствор субстрата).
Раствор 3,5-динитросалициловой кислоты (ΏΝ8). 20 г/л ΏΝ3 в буфере, содержащем 32 г/л гранул гидроксида натрия и 600 г/л (+)-тартрата калия-натрия.
Стандартный раствор арабиназы (0,50 мг/мл).
Методика.
Ферментную композицию разбавляли с получением образцов и калибровочную кривую для глюкозы строили с использованием концентраций арабиназы 0, 0,125, 0,25, 0,375 и 0,5 мг/мл.
0,25 мл ферментного раствора смешивали с 1,75 мл раствора субстрата (1,5% вес./об.) при 50°С и реакцию останавливали через 10 мин при помощи добавления раствора ΏΝ3. За этим следовало нагревание до 95°С в течение 5 мин.
Оптическую плотность измеряли при 540 нм (ОЭ540нм) в различных образцах.
Расчет.
Ферментную активность определяли исходя из калибровочной кривой.
Активность рассчитывали следующим образом:
— 1 Г—1 3
Активность (ед. мл или ед. г ) = χ А χ — X 10 ΐίϊ 1&0 До х-х-хо ν ί где Т = ΑΟΏ540ημ исследуемого образца = ОЭ540нм исследуемого образца - ОЭ540нм холостой пробы;
М = градиент калибровочной кривой (приблизительно 1,0);
с = отрезок, отсекаемый калибровочной кривой на оси у (всегда отрицательная величина и приблизительно -0,02);
150,13 = молекулярный вес арабиназы;
103 = для пересчета в мкмоль;
А = объем исследования в мл;
V = объем фермента в мл;
Т = время исследования в мин;
О = фактический коэффициент разбавления для фермента (например, для 1,000 г при разбавлении до 1 л О = 1000).
Исследование арабинофуранозидазы.
Реакция, катализируемая α-Ν-арабинофуранозидазой, предполагала гидролиз концевой связи по невосстанавливающему а-Ь-арабинофуранозидному остатку α-Ь-арабинозидов. Фермент действовал на а-Ь-арабинофуранозиды, α-Ь-арабинаны, содержащие (1,3)- и/или (1,5)-связи, арабиноксиланы и арабиногалактаны.
Исследование α-Ν-арабинофуранозидазы было основано на ферментативном гидролизе пнитрофенил-а-Ь-арабинофуранозида. Исследование осуществляли при помощи способа с двумя моментами времени, а не непрерывного наблюдения. Расчет ферментной активности был основан на измерениях, проведенных только в начале и в конце периода инкубации. Продукт реакции, п-нитрофенол, определяли колориметрически (после доведения рН). Ферментную активность рассчитывали исходя из
- 14 027084 зависимости между концентрацией п-нитрофенола и поглощением при 400 нм.
Получение разбавленного ферментного раствора.
Получали все ферментные растворы из порошка или жидких ферментных препаратов при помощи прозрачной дистиллированной воды. Сводили к минимуму ошибки разбавления в исследовании путем устранения этапов с большим разбавлением, которые предполагали небольшие значения объема или веса. При осуществлении разбавлений ферментов, даже для жидкого образца, взвешивание исходного образца фермента являлось более точным. Следовательно, если это выполнено, в случае жидких образцов необходимо измерить относительную плотность жидкости при 20°С.
Так как исследование осуществляли при помощи способа с двумя моментами времени, а не непрерывного наблюдения, важно было обеспечить выполнение линейного закона в пределах периода инкубации с различными ферментными системами и условиями. При стандартных условиях исследования, концентрации субстрата, рН, температуре и времени исследования было показано, что при осуществлении исследования выполнялся линейный закон в диапазоне Л0О540нм исследуемого образца (Т) = 0,201,50. Однако для хорошего практического применения исследование выполняли в пределах определенного диапазона Л0П540нм исследуемого образца (Т) = 0,400-0,800.
Методика.
Каждое исследование образца фермента предполагало три анализа: анализы исследуемого образца в двух повторностях (исследуемый образец) и анализ холостой пробы (холостая проба). Приведенная методика описывала анализ одного образца фермента.
ИССЛЕДУЕМЫЙ ОБРАЗЕЦ ХОЛОСТАЯ ПРОБА
0,2М буферный раствор ацетата натрия, рН 5,0 1,00 мл 1,00 мл
Прозрачная дистиллированная вода 1,00 мл 1,00 мл
Раствор п-нитрофенил- ά-Ъ-арабинофуранозида 1,00 мл 1,00 мл
0,25 мл разбавленного ферментного раствора добавляли к растворам при 50°С, реакцию останавливали через 10 мин добавлением 4 мл 0,4М раствора глицина, рН 10,8 (стоп-реагент).
Поглощение измеряли при 400 нм при 25°С против холостого раствора.
Определяли 0В400нм исследуемого образца для измеряемых исследуемых образцов в двух повторностях.
Определяли 0О400нм холостой пробы.
Расчет.
/\ОВ^0ныИССЛЕДУЕМОГО ОБРАЗЦА (Т) = ΟΏ ^^ИССЛЕДУЕМОГО
ОБРАЗЦА-ОВ^оонмХОЛОСТОЙ ПРОБЫ
Единицы(мкмоль.мин-1) = χ 10б χγ
Активность (ед.мл или ед.г-1) = Единицы χ χ £>
где Т = 0О400нм исследуемого образца - 0О400нм холостой пробы;
18300 = молярный коэффициент экстинкции для п-нитрофенола (длина пути 1 см);
V = 7,25 (общий объем жидкости в исследуемом образце в мл);
= 10 (мин);
ед. = 1 мкмоль · мин-1;
Е = 0,25 (объем разбавленного образца фермента в мл);
Ό = коэффициент разбавления для фермента, например для 1 мл при разбавлении до 1 л Ό = 1000. Исследование целлобиогидролазы.
Принцип.
Реакция, катализируемая целлобиогидролазой, предполагала гидролиз 1,4-в-О-глюкозидных связей в целлюлозе и целлотетраозе с высвобождением целлобиозы с невосстанавливающих концов цепей.
Исследование целлобиогидролазы было основано на ферментативном гидролизе п-нитрофенил-βΌ-целлобиопиранозида. Продукт реакции, п-нитрофенол, определяли колориметрически (после доведения рН). Ферментную активность рассчитывали исходя из зависимости между концентрацией пнитрофенола и поглощением при 400 нм.
Исследование выполняли в пределах определенного линейного диапазона Л0П540нм исследуемого образца (Т) = 0,400-0,800.
Методика.
Каждое исследование образца фермента предполагало три анализа: анализы исследуемого образца в
- 15 027084 двух повторностях (исследуемый образец) и анализ холостой пробы (холостая проба). Приведенная методика описывала анализ одного образца фермента.
ИССЛЕДУЕМЫЙ ОБРАЗЕЦ ХОЛОСТАЯ ПРОБА
0,2М буферный раствор ацетата натрия, рН 5,0 1,00 мл 1,00 мл
Прозрачная дистиллированная вода 1,00 мл 1,00 мл
Раствор п- 1,00 мл 1,00 мл
нитрофенил-β-ϋ- целлобиопиранозида
0,25 мл разбавленного ферментного раствора добавляли к исследуемому раствору при 50°С, через 30 мин в каждую пробирку добавляли 4 мл 0,4М раствора глицина, рН 10,8 (стоп-реагент).
Поглощение измеряли при 20°С при 400 нм в 1 см стеклянной кювете против холостого раствора.
Определяли ОЭ400нм исследуемого образца для измеряемых исследуемых образцов в двух повторностях.
Определяли ОЭ400нм холостой пробы.
Расчет №Х0нмИССЛЕДУЕМОГО ОБРАЗЦА (Т) = ИССЛЕДУЕМОГО
ОБРАЗЦА-ΟΏ400нмХОЛОСТОЙ ПРОБЫ
Единицы (МКМОЛЬ .МИН-1) = х-ДТ X ΙΟ6 Xν ' 13300 1000 ί
Активность (ед. мл или ед. г-1) = Единицы χ | χ Ό, где Т = ОЭ400нм исследуемого образца - ОЭ400нм холостой пробы;
18300 = молярный коэффициент экстинкции для п-нитрофенола (длина пути 1 см);
V = 7,25 (общий объем жидкости в исследуемом образце в мл);
1000 = для пересчета в л;
106 = для пересчета в мкмоль;
= 30 (мин);
ед. = 1 мкмоль · мин-1;
Е = 0,25 (объем разбавленного образца фермента в мл);
Г) = коэффициент разбавления для фермента, например для 1 мл при разбавлении до 1 л I) = 1000. Пронумерованные варианты осуществления согласно настоящему изобретению
1. Фермент, характеризующийся эндо-1,4-β-ксиланазной активностью, причем данный фермент содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность с любой последовательностью, выбранной из δΕ^ ГО NО: 1, δΕ^ ГО NО: 2, δΕΟ ГО NО: 3, δΕΟ ГО NО: 4, δΕΟ ГО NО: 5, δΕΟ ГО NО: 6, δΕΟ ГО NО: 17 и δΕΟ ГО NО: 18 или их любого функционального фрагмента.
2. Фермент согласно варианту осуществления 1, причем данный фермент имеет соотношение активности в отношении растворимого арабиноксиланового субстрата (^Ε-АХ) и нерастворимого арабиноксиланового субстрата (^ϋ-АХ), которые относятся к арабиноксилановому субстрату, менее приблизительно 7,0, например менее приблизительно 6,5, например менее приблизительно 6,0, например менее приблизительно 5,5, например менее приблизительно 5,0, например менее приблизительно 4,5.
3. Фермент, характеризующийся эндо-1,3(4)-β-глюканазной активностью, причем данный фермент содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность с любой последовательностью, выбранной из δΕΟ ГО NО: 7, δΕ^ ГО NО: 8, δΕΟ ГО NО: 9, δΕΟ ГО NО: 10 и δΕ^ ГО Ш: 11, δΕς ГО 12, δΕΟ ГО 13, δΕΟ ГО 14, δΕΟ ГО 15, δΕΟ ГО 16 или их любого функционального фрагмента.
4. Фермент согласно любому из вариантов осуществления 1-3, причем данный фермент характеризуется оптимальным значением температуры в диапазоне 40-70°С, например в диапазоне 45-65°С, например в диапазоне 50-65°С, например в диапазоне 55-65°С.
5. Фермент согласно любому из вариантов осуществления 1-4, где указанный фермент имеет по меньшей мере 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из δΕΟ ГО NО: 1-18 или их любого функционального фрагмента.
6. Фермент согласно любому из вариантов осуществления 1-5, который имеет общее количество аминокислот менее 350, например менее 340, например менее 330, например менее 320, например менее
- 16 027084
310, например менее 300 аминокислот, например в диапазоне 200-350, например в диапазоне 220-345 аминокислот.
7. Фермент согласно любому из вариантов осуществления 1-6, где аминокислотная последовательность указанного фермента имеет по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных замен по сравнению с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из 8ЕР ГО N0: 1-18 или их любого функционального фрагмента.
8. Фермент согласно любому из вариантов осуществления 1-7, где аминокислотная последовательность указанного фермента имеет максимум одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных замен по сравнению с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из 8ЕР ГО N0: 1-18 или их любого функционального фрагмента.
9. Фермент согласно любому из вариантов осуществления 1-8, причем данный фермент содержит аминокислотную последовательность, определенную в любой из 8ЕР ГО N0: 1-18 или их любом функциональном фрагменте.
10. Фермент согласно любому из вариантов осуществления 1 или 3, причем данный фермент состоит из аминокислотной последовательности, определенной в любой из 8ЕР ГО N0: 1-18 или их любом функциональном фрагменте.
11. ДНК-конструкт, содержащий последовательность ДНК, кодирующую фермент согласно любому из вариантов осуществления 1-10.
12. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий ДНК-конструкт согласно варианту осуществления 11.
13. Клетка, которая была трансформирована ДНК-конструктом согласно варианту осуществления 11 или вектором согласно варианту осуществления 12.
14. Препарат, содержащий фермент согласно любому из вариантов осуществления 1-10, или ДНКконструкт согласно варианту осуществления 11, или вектор согласно варианту осуществления 12, или клетку согласно варианту осуществления 13.
15. Композиция, содержащая фермент, характеризующийся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, согласно любому из вариантов осуществления 1, 2, 4-10 в комбинации с любой одной или несколькими β-глюканазами.
16. Композиция согласно варианту осуществления 15, где указанная одна или несколько β-глюканаз представляют собой фермент, характеризующийся эндо-1,3(4)-β-глюканазной активностью согласно любому из вариантов осуществления 3-10.
17. Композиция, содержащая фермент, характеризующийся эндо-1,3(4)-β-глюканазной активностью согласно любому из вариантов осуществления 3-10 в комбинации с любой одной или несколькими ксиланазами.
18. Композиция согласно варианту осуществления 17, где указанная одна или несколько ксиланаз представляют собой фермент, характеризующийся эндо-1,4-β-ксиланазной активностью согласно любому из вариантов осуществления 1, 2, 4-10.
19. Композиция согласно любому из вариантов осуществления 15-18, где указанная эндо-^^)^глюканазная активность и указанная эндо-1,4-β-ксиланазная активность происходят по меньшей мере из двух различных ферментов, например по меньшей мере двух различных ферментов из двух различных видов.
20. Композиция согласно любому из вариантов осуществления 15-19, содержащая комбинацию по меньшей мере из двух ферментов, причем указанные два фермента или два фермента с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 80% идентичность последовательности с соответствующей 8ЕР ГО или ее любым функциональным фрагментом, выбраны из перечня, состоящего из
5Е<2 Ю N0:1 и ЗЕС Ю N0:7;
5Е<2 Ю N0:2 и ЗЕС Ю N0:7;
5Е<2 Ю N0:3 и ЗЕО ю N0:7;
5Е<2 Ю N0:4 и ЗЕС ю N0:7;
5Е<2 ю N0:5 и ЗЕС ю N0:7;
5Е<2 ю ΝΟ: б и ЗЕС ю N0:7;
5ΕΩ ю N0:17 и ЗЕС 1 Ю N0:7
5Е<2 ю N0: 1Е ! и ЗЕС ) Ю N0:7
5Е<2 ю N0:1 и ЗЕС Ю N0:8;
5Е<2 ю N0:2 и ЗЕС Ю N0:8;
5Е<2 ю N0:3 и ЗЕС Ю N0:8;
5Е<2 ю N0:4 и ЗЕС Ю N0:8;
3Εζ) Ю N0 5 и 5Е<2 Ю N0:8;
3Εζ) Ю N0 6 и 5Е<2 Ю N0:8;
5Е<2 Ю N0 17 и 5Е<2 Ю N0:8;
5Е<2 Ю N0 18 и [ 5Е<2 Ю N0:8;
5Е<2 Ю N0 1 и 5Е<2 Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 2 и 5Е<2 Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 3 и 5Е<2 Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 4 и 5Е<2 Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 5 и 5Е<2 Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 б и 5Е<2 Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 17 и 5Е<2 Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 18 и 5Е<2 Ю N0:9;
5Е<2 Ю N0 1 и 5Е<2 Ю N0:10;
5Е<2 Ю N0 2 и 5Е<2 Ю N0:10;
5Е<2 Ю N0 3 и 5Е<2 Ю N0:10;
5Е<2 Ю N0 4 и 5Е<2 Ю N0:10;
5Е<2 Ю N0 5 и 5Е<2 Ю N0:10;
5Е<2 Ю N0 б и 5Е<2 Ю N0:10;
5Е<2 Ю N0 17 и 5Е<2 Ю N0:10
5Е<2 Ю N0 18 и 5Е<2 Ю N0:10
5Е<2 Ю N0 1 и 5Е<2 Ю N0:11;
5Е<2 Ю N0 2 и 5Е<2 Ю N0:11;
5Е<2 Ю N0 3 и 5Е<2 Ю N0:11;
5Е<2 Ю N0 4 и 5Е<2 Ю N0:11;
5Е<2 Ю N0 5 и 5Е<2 Ю N0:11;
5Е<2 Ю N0 б и 5Е<2 Ю N0:11;
5Е<2 Ю N0 17 и 5Е<2 Ю N0:11
5Е<2 ю N0 18 и 5Е<2 Ю N0:11
5Е<2 ю N0 1 и 5Е<2 Ю N0:12;
5Е<2 ю N0 2 и 5Е<2 Ю N0:12;
5Е<2 ю N0 3 и 5Е<2 Ю N0:12;
5Е<2 ю N0 4 и 5Е<2 Ю N0:12;
5Е<2 ю N0 5 и 5Е<2 Ю N0:12;
5Е<2 ю N0 б и 5Е<2 Ю N0:12;
5Е<2 ю N0 17 и 5Е<2 Ю N0:12
5Е<2 ю N0 18 и 3 Е 0 Ю N0:12
5Е<2 Ю N0: 1 и 5Е<2 Ю N0:13;
5Е<2 Ю N0:2 и ЗЕО Ю N0:13;
5Е<2 Ю N0:3 и ЗЕО Ю N0:13;
5Е<2 Ю N0:4 и ЗЕО Ю N0:13;
5Е<2 ю N0:5 и ЗЕО Ю N0:13;
ЗЕО ю N0: 6 и ЗЕО Ю N0:13;
ЗЕО ю N0:17 и ЗЕО ΙΌ N0:13;
ЗЕО ю N0:18 и ЗЕО Ю N0:13;
ЗЕ<2 ю N0:1 и ЗЕО Ю N0:14;
ЗЕ<2 ю N0:2 и 5Е<2 Ю N0:14;
ЗЕ<2 ю N0:3 и ЗЕО Ю N0:14;
ЗЕ<2 ю N0:4 и ЗЕО Ю N0:14;
5Е<2 ю N0: 5 и ЗЕО Ю N0:14;
ЗЕО ю N0: 6 и ЗЕО Ю N0:14;
ЗЕО ю N0:17 и ЗЕО ΙΌ N0:14;
ЗЕО ю N0:18 и ЗЕО ΙΌ N0:14;
ЗЕО ю N0:1 и ЗЕО Ю N0:15;
ЗЕ<2 ю N0:2 и 5Е<2 Ю N0:15;
ЗЕ<2 ю N0:3 и 5Е<2 Ю N0:15;
ЗЕ<2 ю N0:4 и ЗЕО Ю N0:15;
ЗЕ<2 ю N0:5 и ЗЕО Ю N0:15;
ЗЕО ΙΌ N0: 6 и ЗЕО Ю N0:15;
ЗЕО ю N0:17 и ЗЕО ΙΌ N0:15;
ЗЕО ю N0:18 и ЗЕО ΙΌ N0:15;
3Εζ) ю N0: 1 и ЗЕО Ю N0:16;
ЗЕО ю N0:2 и ЗЕО Ю N0:16;
ЗЕО ΙΌ N0:3 и ЗЕО Ю N0:16;
ЗЕО ю N0:4 и ЗЕО Ю N0:16;
ЗЕО ю N0:5 и ЗЕО Ю N0:16;
ЗЕО ю N0: б и ЗЕО Ю N0:16;
ЗЕО ю N0:17 и ЗЕО ΙΌ N0:16; и
ЗЕО ю N0:18 и ЗЕО Ю N0:16.
21. Композиция согласно любому из вариантов осуществления 15-20, где при применении перед фильтрованием пивного сусла в пивоварении общий подъем давления уменьшен до значения менее 470 мм АС, например менее 450 мм АС, например менее 430 мм АС, например менее 410 мм АС, например менее 390 мм АС, например менее 370 мм АС, например менее 350 мм АС, например менее 330 мм АС, например менее 310 мм АС, например менее 300 мм АС, например менее 290 мм АС.
22. Композиция согласно любому из вариантов осуществления 15-21, где при применении перед фильтрованием пивного сусла в пивоварении общий подъем давления снижен по меньшей мере на 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 или 95% по сравнению с применением отрицательного контроля без указанной композиции.
23. Композиция согласно любому из вариантов осуществления 15-22, где при применении в пивоварении перед отделением сусла фильтруемость сусла, измеренная по объему сусла, собранного через 5 мин фильтрации, по сравнению с контролем без ферментов повышена до более 1,5, например более 1,6, например более 1,7, например более 1,8, например более 1,9, например более 2,0, например более 2,1, например более 2,2, например более 2,3, например более 2,4, например более 2,5.
24. Композиция согласно любому из вариантов осуществления 15-2 3, при применении которой в пивоварении перед отделением сусла фильтруемость сусла, измеренная по объему сусла, собранного через 5 мин фильтрации, повышена по меньшей мере на 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 или 300% по сравнению с применением отрицательного контроля без указанной композиции.
25. Композиция согласно любому из вариантов осуществления 15-24, содержащая любой один или несколько дополнительных ферментов.
26. Композиция согласно варианту осуществления 25, где указанный один или несколько дополнительных ферментов выбраны из перечня, состоящего из ксиланазы, отнесенной к ЕС 3.2.1.32, ЕС 3.2.1.136 или ЕС 3.2.1.156, целлюлазы, ламинариназы, эндо-1,5-а-Ь-арабинаназы, β-Όглюкозидглюкогидролазы, β-ксилозидазы, целлобиогидролазы, глюкан-1,4-в-глюкозидазы, ксилоглюкан-специфической экзо-в-1,4-глюканазы и α-Ν-арабинофуранозидазы.
27. Применение фермента согласно вариантам осуществления 1-10, или препарата согласно варианту осуществления 14, или композиции согласно любому из вариантов осуществления 15-26 при получении пищевого продукта, кормового продукта или солодового продукта-напитка.
28. Применение фермента согласно вариантам осуществления 1-10, или препарата согласно варианту осуществления 14, или композиции согласно любому из вариантов осуществления 15-26 при получении заготовок из теста или выпеченных продуктов.
29. Применение фермента согласно вариантам осуществления 1-10, или препарата согласно варианту осуществления 14, или композиции согласно любому из вариантов осуществления 15-26 при получении пульпы или бумаги.
30. Применение фермента согласно вариантам осуществления 1-10, или препарата согласно варианту осуществления 14, или композиции согласно любому из вариантов осуществления 15-26 для получения злаковых компонентов.
31. Применение согласно варианту осуществления 29, при котором злак представляет собой рожь, пшеницу или ячмень.
32. Применение фермента согласно вариантам осуществления 1-10, или препарата согласно варианту осуществления 14, или композиции согласно любому из вариантов осуществления 15-26 при получении пива или модификации побочных продуктов из процесса пивоварения.
33. Применение фермента согласно вариантам осуществления 1-10, или препарата согласно варианту осуществления 14, или композиции согласно любому из вариантов осуществления 15-26 при получении вина или сока.
34. Применение фермента согласно вариантам осуществления 1-10, или препарата согласно варианту осуществления 14, или композиции согласно любому из вариантов осуществления 15-26 при получении биотоплива первого или второго поколения, например биоэтанола.
35. Способ изменения фильтруемости крахмалсодержащего материала, причем указанный способ включает этап обработки указанного крахмалсодержащего материала ферментом согласно вариантам осуществления 1-10, или препаратом согласно варианту осуществления 14, или композицией согласно любому из вариантов осуществления 15-26.
36. Способ уменьшения подъема давления во время фильтрования пивного сусла в пивоварении, причем указанный способ включает этап обработки пивного затора ферментом согласно вариантам осуществления 1-10, или препаратом согласно варианту осуществления 14, или композицией согласно любому из вариантов осуществления 15-26.
37. Способ получения пищевого продукта, кормового продукта или продукта-напитка, например спиртного или безалкогольного напитка, например, напитка на основе злака или на основе солода, на- 19 027084 пример пива или виски, причем указанный способ включает этап обработки крахмалсодержащего материала ферментом согласно вариантам осуществления 1-10, или препаратом согласно варианту осуществления 14, или композицией согласно любому из вариантов осуществления 15-26.
38. Способ получения пивного затора, причем указанный способ включает этап обработки крахмалсодержащего материала ферментом согласно вариантам осуществления 1-10, или препаратом согласно варианту осуществления 14, или композицией согласно любому из вариантов осуществления 15-26.
39. Способ получения биотоплива первого или второго поколения, например биоэтанола, причем указанный способ включает этап обработки крахмалсодержащего материала ферментом согласно вариантам осуществления 1-10, или препаратом согласно варианту осуществления 14, или композицией согласно любому из вариантов осуществления 15-26.
40. Продукт, полученный при помощи способа согласно любому из вариантов осуществления 3839.
41. Композиция, содержащая продукт согласно варианту осуществления 40, например, в которой данный продукт присутствует в диапазоне 0,1-99,9%.
Примеры
Пример 1. Способы и результаты применительно к регистрации ксиланаз/глюканазы для пивоварения.
Описанные ниже способы применяли для скрининга по отношению к ксиланазам и глюканазам с применением в пивоварении.
Способы.
Способ для ксиланазы с использованием арабиноксилана, экстрагируемого водой (АЕ-АХ)
Получали образцы, с получением в данном исследовании ОИ540 = приблизительно 0,25-0,30, и стандарты ксилозы (0, 0,125, 0,250, 0,375 и 0,500 мг/мл дистиллированной воды) в дистиллированной воде. В момент времени 1=0 мин 1,75 мл растворимого арабиноксилана из пшеницы (0,5% арабиноксилан из пшеницы (РАЛХУН, Меда/уте, Брей, Ирландия)) в 0,1М ацетате натрия/уксусной кислоте, рН 5 помещали в пробирку при 50°С. В момент времени 1=5 мин 250 мкл ферментного раствора добавляли к субстрату при 50°С с последующим перемешиванием. Дистиллированную воду использовали в качестве холостой пробы. В момент времени 1=15 мин 2 мл раствора ΌΝ8 (1% 3,5-динитросалициловая кислота (ΌΝ8), 1,6% гидроксид натрия, 30% тартрат калия-натрия в дистиллированной воде) добавляли к ферментно-субстратному раствору и 2,0 мл стандартного раствора. Образцы, холостые пробы и стандарты с добавленной ΌΝ8 помещали в кипящую водяную баню (95°С) на 5 мин. Вслед за этим образцы, холостые пробы и стандарты охлаждали путем их помещения в водяную баню при 25°С на 20 мин. Оптическую плотность всех образцов считывали при ОИ540 с применением спектрофотометра. Исходя из разбавления образцов, количества используемого образца и стандартов можно рассчитать активность ксиланаз в образце.
Одну единицу эндо-1,4-β-ксиланазной активности в отношении АЕ-АХ определяли как количество фермента, которое образовывал 1 мкмоль эквивалентов ксилозы за минуту при условиях, упомянутых выше (способ для ксиланазы с использованием арабиноксилана, экстрагируемого водой (АЕ-АХ)).
Способ для ксиланазы с использованием арабиноксилана, не экстрагируемого водой (АИ-АХ).
Образцы получали в дистиллированной воде. В момент времени 1=0 мин 1,75 мл нерастворимой пшеницы (0,5% арабиноксилан из пшеницы (РААХУ1, Меда/уте, Брей, Ирландия)) в 0,1М ацетате натрия/уксусной кислоте, рН 5 помещали в пробирку при 50°С. В момент времени 1=5 мин 250 мкл ферментного раствора добавляли к субстрату при 50°С с последующим перемешиванием. Дистиллированную воду использовали в качестве холостой пробы. В момент времени 1=15 мин образцы и холостые пробы помещали в кипящую водяную баню (95°С) на 5 мин. Вслед за этим образцы и холостые пробы центрифугировали для осаждения остаточного нерастворимого субстрата. Количество арабиноксилана, введенного в раствор, определяли с применением способа, описанного Коиаи, X. апб 8игде1, А. (1994), СагЬоБубга1е Ро1утегк, 24, 123-132.
Эндо-1,4-β-ксиланазную активность в отношении АИ-АХ определяли как количество растворенных пентоз (мкг, пентоз) при условиях, описанных выше, что давало определение единицы как мкг пентозы/г образца ксиланазы.
Исследование ксиланазной активности.
Получали образцы, с получением в данном исследовании ОИ540 = приблизительно 0,25-0,30, и стандарты ксилозы (0, 0,125, 0,250, 0,375 и 0,500 мг/мл дистиллированной воды) в дистиллированной воде. В момент времени 1=0 мин 1,75 мл растворимого арабиноксилана из пшеницы (0,5% арабиноксилан из пшеницы (РААХУН, Меда/уте, Брей, Ирландия)) в 0,1М ацетате натрия/уксусной кислоте, рН 5 помещали в пробирку при 50°С. В момент времени 1=5 мин 250 мкл ферментного раствора добавляли к субстрату при 50°С с последующим перемешиванием. Дистиллированную воду использовали в качестве холостой пробы. В момент времени 1=15 мин 2 мл раствора ΌΝ8 (1% 3,5-динитросалициловая кислота (ΌΝ8), 1,6% гидроксид натрия, 30% тартрат калия-натрия в дистиллированной воде) добавляли к ферментно-субстратному раствору и 2,0 мл стандартного раствора. Образцы, холостые пробы и стандарты с
- 20 027084 добавленной ΌΝδ помещали в кипящую водяную баню (95°С) на 5 мин. Вслед за этим образцы, холостые пробы и стандарты охлаждали путем их помещения в водяную баню при 25°С на 20 мин. Оптическую плотность всех образцов считывали при ΟΌ540 с применением спектрофотометра. Исходя из разбавления образцов, количества используемого образца и стандартов можно рассчитать активность ксиланаз в образце.
Одну единицу эндо-1,4-в-ксиланазной активности в отношении УЕ-АХ определяли как количество фермента, которое образовывал 1 мкмоль эквивалентов ксилозы за минуту при условиях, упомянутых выше.
Исследование глюканазной активности.
Получали образцы, с получением в данном исследовании ΟΌ540 в пределах калибровочной кривой и стандарты глюкозы (0; 0,125; 0,250; 0,500 и 0,750 мг/мл дистиллированной воды) в дистиллированной воде. В момент времени 1=0 мин 1,75 мл β-глюкана из ячменя (1,5% β-глюкан из ячменя (Р-ВОВМ, Мсда/утс. Брей, Ирландия)) в 1М ацетате натрия/уксусной кислоте, рН 5 помещали в пробирку при 50°С. В момент времени 1=5 мин 250 мкл ферментного раствора добавляли к субстрату при 50°С с последующим перемешиванием. Дистиллированную воду использовали в качестве холостой пробы. В момент времени 1=15 мин 2 мл раствора ΌΝδ (1% 3,5-динитросалициловая кислота (ΌΝδ), 1,6% гидроксид натрия, 30% тартрат калия-натрия в дистиллированной воде) добавляли к ферментно-субстратному раствору и 2,0 мл стандартного раствора. Образцы, холостые пробы и стандарты с добавленной ΌΝδ помещали в кипящую водяную баню (95°С) на 15 мин. Вслед за этим образцы, холостые пробы и стандарты охлаждали путем их помещения на водяную баню при 25°С в течение 20 мин. Оптическую плотность всех образцов считывали при ΟΌ540 с применением спектрофотометра. Исходя из разбавления образцов, количества используемого образца и стандартов можно рассчитать глюканазную активность в образце.
Одну единицу эндо-1,3 (4)-в-глюканазной активности определяли как количество фермента, которое образовывал 1 мкмоль эквивалентов глюкозы за минуту при условиях исследования (рН 5,0 (или как указано) и 50°С).
Способ пивоварения в лабораторном масштабе.
Изучение пивоварения в лабораторном масштабе осуществляли с использованием солода РШпсгячменя в соотношении 75:25 при соотношении вода:крупка 3:1 (150 мл:50 г крупки). Сначала воду предварительно нагревали до 53°С перед началом затирания и доведения рН (5,4, 2М Н2§04). После возвращения к начальной температуре (период 10 мин) начинали профиль затирания (см. фиг. 1) и добавляли ферменты. После завершения затирания осуществляли отделение сусла с использованием обычной пластмассовой воронки и фильтровальной бумаги (бумажный фильтр № 1, диаметр 24 см, УЬа1тап, Англия). Эффективность фильтрации оценивали так же, как и несколько других параметров сусла, таких как, например, вязкость, β-глюкан и пентозан.
Фильтрацию сусла измеряли в течение 30 мин, после чего фильтрацию прекращали. Собранное сусло охлаждали перед любым дополнительным анализом.
Фильтрация.
Данные фильтрации представляли как объем сусла, собранного через 5, 10, 15 и 30 мин по сравнению с холостой пробой (пивоварение без добавленных экзогенных ферментов).
Пивоварение в полупромышленном масштабе.
Испытания осуществляли на оборудовании для пивоварения в полупромышленном масштабе (производительность 2 гектолитра). Отделение сусла осуществляли путем фильтрования пивного сусла и фильтрации пива посредством фильтрации через горизонтальный кизельгуровый фильтр.
Для выявления оптимизации фильтрации при помощи комбинации глюканазы и ксиланазы при затруднительных условиях пивоварения осуществляли испытания пивоварения в полупромышленном масштабе с использованием смешанной крупки, содержащей 75% солода и 25% ячменя. Сначала устанавливали соотношение вода:крупка при 2,8:1 (начало затирания), причем с увеличением до 3,1:1 в начале фильтрования пивного сусла. Для сравнения соотношения вода:крупка приблизительно 3,2-3,8 являются обычными при фильтровании пивного сусла в промышленной пивоварне. Таким образом, считалось, что установочные параметры данного полупромышленного испытания, соотношение вода:крупка 3,1:1, находились в конце шкалы, соответствующем затруднительным условиям.
Осуществляли сухой размол солода и ячменя с применением двухвальцовой мельницы. Помол как ячменя, так и солода осуществляли дважды с использованием расстояния между вальцами ~0,7 мм.
Начало затирания осуществляли, стремясь к начальной температуре затора 53°С. После начала затирания осуществляли небольшие корректировки, такие как регулирование объема затора для получения соотношения вода:крупка 2,8:1 и доведение рН до ~5,56 (молочная кислота). После точного регулирования по отношению к затору добавляли фермент и соблюдали профиль затирания, приведенный на фиг. 1. Выдержку для осахаривания при 70°С запрограммировали на 15 мин, однако период выдержки продлевали на 5 мин до тех пор, пока йодная проба не показала, что крахмал не присутствовал. (ЪиФущ №ιι7ι$<, апй Уегпег Васк, Тескпкске ишуег811ае1 Миепскеп (Раки11ае1 Еиег Вгаитезеп, Уе1кеп81еркап), АЬгШ йег В1егЬгаиегек \νΐΕΕΥ-νί'.Ή Vе^1адδ ОтЬН Уешке1т Оегтапу, 2005).
- 21 027084
Завершение затирания начинали после 5 мин выдержки при 78°С. Затор перемещали в фильтрационный чан, который заранее предварительно наполняли водой до уровня немного ниже ложного дна. Затор оставляли для выдержки в течение 5 мин для осаждения фильтрационного осадка. За этим следовала рециркуляция в течение 15 мин (140 л/ч), обеспечивающая осаждение фильтрационного осадка и осветление сусла. Типично, в промышленном пивоварении фильтрацию будут начинать, когда получена заданная степень помутнения сусла, однако в данном испытании рециркуляцию оставляли постоянной на 15 мин, что давало возможность сравнения испытаний. Во время фильтрования пивного сусла собирали следующие данные, в том числе время (мин), объем собранного сусла (л), разность давления при фильтрации по всему фильтрационному осадку (мм ^С, мм водяного столба), производительность насоса (%), степень помутнения сусла (ЕВС) и температуру затора (°С).
Считалось, что подъем давления по всему фильтрационному осадку во время фильтрации являлся фактором, оказывающим влияние на установление стандарта эффективности фильтрования пивного сусла. Достижение очень высоких разностей давления, например, 250 мм ^'С во время первого сбора сусла и, например, 450 мм ^'С для остального периода фильтрования пивного сусла, вызывало разрыхление фильтрационного осадка (также известное как глубокое резание). Разрыхление являлось процессом, при котором осуществляли разрушение фильтрационного осадка или облегчали образование фильтрационного канала путем замедления разрезания фильтрационного осадка при помощи специально приспособленных ножей. После разрыхления фильтрационного осадка рециркуляцию сусла в течение 6 мин (скорость потока 120 л/ч) проводили с подготовкой фильтрационного осадка для дальнейшей фильтрации. Разрыхление фильтрационного осадка способствовало эффективности фильтрации, которая была снижена в остальных случаях, что в остальных случаях также приводило в результате к плохому качеству сусла. Если вызванное давлением разрыхление не осуществляли до начала 3-го промывания дробины, автоматические разрыхления осуществляли в начале 3-го и 4-го промываний дробины для обеспечения того, чтобы полная блокировка фильтрации не возникала непосредственно перед завершением отделения сусла.
Фильтрование пивного сусла осуществляли при установочных параметрах, проиллюстрированных в табл. 1.
Таблица 1
Установочные параметры фильтрования пивного сусла. Собранные объемы (л), фильтрационный поток (л/ч) и объемы для промывания дробины (л)
Сусло Собранные объемы, л Филь трационный поток, л/ч Объемы для промывания дробины, л
Первое 0-60 130
сусло 1-е 60-78 140 18
промывание 2-е промывание 78-96 160 18
3-е 96-114 180 18
промывание
4-е 114-140 180 26
промывание
После окончания фильтрования пивного сусла сладкое сусло возвращали в заторный чан, нагревали до кипения и добавляли шишки хмеля. Охмеление продолжали в течение 80 мин и в конце охмеления рН доводили до 5,10±0,05. Шишки хмеля очищали от горького сусла при помощи гидроциклонного чана и в дальнейшем сусло охлаждали до ~8°С. Для сбраживания выбирали высушенные дрожжи низового брожения (Зассйаготусез сегеу1з1ае) ^34/70 от Регтепйз. Дрожжи регидрировали в течение 30 мин и вводили при 100 г/гл. Основное сбраживание проводили в течение 5-6 дней при 10°С с последующим созреванием при 15°С до истощения и содержания диацетила ниже 80 ч./млрд. Пиво хранили в течение еще 2-3 недель при 1°С и 0,7 бар перед фильтрацией.
Осуществляли горизонтальную фильтрацию пива при помощи 1,2 мкм свечных картриджей РР и кизельгура. До 8 картриджей могли быть включены в фильтровальный элемент, что давало в результате общую площадь фильтрации ~0,5 м2. В данном изучении включали 3 картриджа и осуществляли фильтрацию при скорости потока 130 л/ч, что давало в результате скорость фильтрации 6,9 гл/(ч-м2). В промышленных пивоварнях скорость фильтрации обычно устанавливают в пределах 5-7 гл/(ч-м2). Следовательно, очевидно, что данные установочные параметры находятся в границах верхнего предела, что соответствует преднамеренному выбору затруднительных условий фильтрации пива для подтверждения
- 22 027084 возможных положительных эффектов в результате выбора использования фермента в процессе пивоварения. Во время фильтрации пива отслеживали скорости потока (л/ч), а также значения давления (Р внутри и Р за пределами) для подтверждения эффективности фильтрации пива. Также ряд анализов пива, например начальная плотность (ОО), видимое содержание экстрактивных веществ (АЕ), объемное содержание спирта (АΒV), видимая степень сбраживания (АРР), действительная степень сбраживания (КОР), рН, цвет и горечь, осуществляли для оценки качества пива.
Результаты.
Ксиланазы.
Осуществляли скрининг ксиланаз на предмет их активности в отношении растворимого субстрата и нерастворимого субстрата, их характеристик, связанных с рН и температурой. Результаты показаны в табл. 2.
Таблица 2
Ксиланазы, скрининг которых проводили, их активность в отношении растворимого (\Е-АХ) и нерастворимого (\И-АХ) арабиноксиланового субстрата и их биохимические характеристики по отношению к температуре и рН
Название Происхож- СН АУЕ-АХ \УЕ-АХ АУЕ-АХ/ Оптималь- Т1/2 темп., рН опт.
дение
АГиХуп2 АзрегдШиз 11 7798 68790526 8822 йшйдаГиз
АГиХупЗ АзрегдШиз 11 26283 99716865 3794 йшпдаГиз
АГиХуп5 АзрегдШиз 11 90005 714363158 7937 йшпдаГиз
АУи-АХ ная темп., °С
ВзиХупЗ ВасШиз зиЬйПз
В53
ВзиХуп4 ВасШиз зиЬйПз
82 1095357 13388
54 1005400 18619
В84#160
ТегХуп1 ОеозтИЫа 10 1467 6208786 4232 етегзопп
АЩХупЗ АзрегдШиз 10 1220 7760982 6361
1иЫп£еп818
А1иХуп4 АзрегдШиз 11 1600 12934971 8084
1иЪт§еп818
АасХуп2 АзрегдШиз 10 777 3880491 4994
1иЪт§еп818
ТгеХуп2 ТпсЬобегт 11 2244 16015846 7137 а геезе1
ТгеХупЗ ТпсЬобегш 10 21487 141108772 6567 а геезе!
ТгеХуп5 ТпсЬобегш 11 1410 8842816 а геезе!
6272 °с
п.б.
п.б.
>78
5,5
п.б.
4,5
5,5
п.б. = не определено
Ферментные активности в отношении \Е-АХ и \Ц-АХ (ед.) измеряли, как описано в разделах способ для ксиланазы с использованием арабиноксилана, экстрагируемого водой (\Е-АХ) и способ для ксиланазы с использованием арабиноксилана, не экстрагируемого водой (\Ц-АХ).
- 23 027084
Исходя из результатов биохимического скрининга ксиланазы, имеющие соответствующее соотношение активности в отношении растворимого по сравнению с нерастворимым арабиноксиланом, выбирали для дополнительного тестирования в испытаниях, связанных с применением. Результаты показаны в табл. 3.
Таблица 3
Ксиланазы, скрининг которых проводили, и относительный выход экстракта, полученный с применением ксиланаз по сравнению с холостой пробой (без ксиланаз). В конечном итоге субстратная специфичность ксиланаз была проиллюстрирована как соотношение их активности в отношении нерастворимого по сравнению с растворимым арабиноксиланом (^ϋ-ΆΧ/^Ε-ΑΧ)
Эффективность фильтрации
Название Холостая проба Происхождение 5 мин 1,00 10 мин 1,00 15 мин 1,00 30 мин 1,00 гси-Ах/ Ϊ7Ε-ΑΧ
ВзиХупЗ ВасШиз зиЬ/Шз взз 0,93 0, 95 0,96 0,95 13388
ВзиХуп4 ВасШиз зиЬИПз В34 #160 п.а п.а п.а п.а 18619
ТегХуп1 СеозпйШа етегзопП (Та1еготусез етегзопП) 2,19 1,92 1,70 1,44 4232
АЪиХупЗ АзрегдШиз #иЫпдепз1з 2,06 1,75 1,59 1,37 6361
АЪиХуп4 АзрегдШиз #иЫпдепз1з 1,02 1,01 1,01 1,01 8084
АасХуп2 АзрегдШиз #иЫпдепз1з 2,07 1,86 1, 67 1,43 4994
ТгеХупЗ ТгасЬоДегта геезеа 2,41 2,02 1,81 1,55 6567
ТгеХуп5 Тг1сЬо0егта геезег 2,06 1,75 1,59 1,37 6272
Эффективность фильтрации измеряли, как описано ранее (фильтрация), и она была представлена как объем фильтрата в разные моменты времени по сравнению с отрицательным контролем (холостая проба).
Ферментные активности в отношении \УЕ-А.Х и ^ϋ-ΆΧ (ед.) измеряли, как описано в разделах способ для ксиланазы с использованием арабиноксилана, экстрагируемого водой (\УЕ-АХ) и способ для ксиланазы с использованием арабиноксилана, не экстрагируемого водой (^ϋ-ΆΧ).
Глюканазы.
Осуществляли скрининг глюканаз на предмет их активности и характеристик, связанных с температурой, и результаты показаны в табл. 4.
- 24 027084
Таблица 4
Глюканазы, скрининг которых проводили, их активность и их биохимические характеристики по отношению к температуре
Название Происхождение Ед/ мл Оптимальная темп., ° С ТШ2 темп. буфера, °С Т1/2 темп. сусла, °С рН опт.
ТегС1и1 Та1аготусез етегзопы/Сеозт ИЫа етегзопы 7338 70 78 78 3
ВзиС1и5 ВасШиз зиЫЧПз 208 55-65 60 68 5-6
ВзиС1и103ЕиЬЬ ВасШиз зиЬЕШз 391 50-60 53 58 5-6
ТегС1и2 Тг1с1аос1егта геезет 13 40-50 70 74 4,5- 6
ТегС1иЗ Тг1с1аос1егта геезет 9215 40-51 58 62 4,5- 6
ТегС1и4 ТгШНоПегта η.ά. 40-52 62 62 4,5-
геезет 6
ТегС1и6 ТгтсГюсАегта геезет η.ά. 40-53 62 64 4,5- 6
ТегС1и7 ТгтсГюсАегта геезет η.ά. 40-54 62 62 4,5- 6
ТегС1и8 ТгтсГюсАегта геезет η.ά. 40-55 61 63 4,5- 6
ВзиС1иС ΟΒϋ ВасШиз зиЫШз 10 50-60 60 67 5-6
η.ά. = не определено
Глюканазную активность/единицы определяли, как описано в исследовании глюканазной активности, описанном выше.
Исходя из результатов биохимического скрининга глюканазы, имеющие подходящие характеристики, выбирали для дополнительного тестирования в испытаниях, связанных с применением. Результаты показаны в табл. 5.
- 25 027084
Таблица 5
Название и происхождение глюканаз, скрининг которых проводили, и относительный выход экстракта, полученный с применением глюканаз по сравнению с холостой пробой (без фермента)
Эффективность фильтрации
Название Происхождение 5 мин 10 мин 15 мин 30 мин
Холостая проба Негативный контроль 1, 00 1, 00 1, 00 1,00
ТегС1и1 Сеозти Ша ешегзопИ 1, 36 1,43 1,46 1,36
Взи61иЗ ВасШиз зиЪВШз 1, 48 1,49 1,48 1,35
ВзиШиЮЗЕиь Ь ВасШиз зиШНз 1, 29 1,28 1,30 1,22
ТегС1и2 Тг1 сВкШегта геезе! 1 ,15 1,18 1,20 1,15
ТегШиЗ Тг1 сВкШегта геезеи 1 ,29 1,32 1,30 1,22
ТегС1и4 Тг1 сВкШегта геезе! 1 ,11 1,11 1,11 1,09
ТегС1иб Тг1 <Шос1егта геезе! 1 ,13 1,15 1,13 1,10
ТегС1и7 Тг1 сВюсВегта геезе! 1 , 06 п.а. 1,01 1,02
ТегС1и8 Тг1 сВюсВегта геезе! 1 ,12 1,11 1,13 1,09
ВзиШиС СВИ ВасШиз зиЫсШз 1 ,33 1,37 1,37 1,32
Эффективность фильтрации измеряли, как описано ранее (фильтрация), и она была представлена как объем фильтрата в разные моменты времени по сравнению с отрицательным контролем (холостая проба).
Исходя из отдельного скрининга ксиланаз и глюканаз осуществляли эксперименты, основанные на комбинировании, и результаты были проиллюстрированы в табл. 6.
- 26 027084
Таблица 6
Результаты пивоварения исходя из экспериментов, основанных на комбинировании ксиланаз и глюканаз, по сравнению с холостой пробой и по сравнению с икгаИо® Мах. 250 единиц грибной ксиланазы ТХИ-3/г; 700 единиц целлюлазы ЕСИ/г (Νονοζνηκ'κ Дания), причем результаты были проиллюстрированы как полученный относительный выход экстракта Эффективность фильтрации
Название Происхождение 5 мин 10 15 30 мин
мин мин
Контроль 1, 00 1, 00 1,00 1, 00
и£шах 0.1 А. аси1еа£из 2,29 2,13 2,00 1,77
ВзиС1иЗ/ТаиХуп1 В. зиЬ/Т. аигапИасиз 1,70 1, 69 1, 60 1,47
Взи61иЗ/АбиХупЗ В. зиЬ/А. ^иЫпдепзаз 2,57 2,14 1,96 1,75
(Происхождение ЦДгаИо® Мах может подразумевать другие микроорганизмы, помимо А. аеи1еаШ5, например, описанные в патентном документе ^О 05059084).
Эффективность фильтрации измеряли, как описано ранее (фильтрация), и она была представлена как объем фильтрата в разные моменты времени по сравнению с отрицательным контролем (холостая проба).
Подходящие комбинации дополнительно тестировали на 2 гл полупромышленном оборудовании для подтверждения, и результаты показаны в табл. 7 и на фиг. 3.
Таблица 7
Результаты пивоварения в полупромышленном масштабе исходя из подтверждения скрининга глюканазы и ксиланаз. Глюканазу 3 В. зиЪ в комбинации с ксиланазами А. 1иЪ тестировали по сравнению с холостой пробой и ЦЦ;гаР1о® Мах. Собранные данные представляли собой средний поток (л/ч), общий подъем давления на протяжении фильтрования пивного сусла (мм ^С) и зафиксированное максимальное давление во время фильтрования пивного сусла (мм ^С)
Ю образца Средний поток (л/ч) Общий подъем давления (мм КС) Макс. давление (мм КС)
Холостая проба 148 556 356
ШбгаЕ1о® Мах 149 478 280
В5и61иЗ/АбиХупЗ 147 263 163
Пример 2.
В данном примере была сделана попытка показать, что ксиланазы для пивоварения могут характеризоваться очень высокой избирательностью по отношению к высокомолекулярному растворимому арабиноксилану (НМ^3-АХ) и арабиноксилану, экстрагируемому водой (^Е-АХ). Таким образом, считалось, что только ограниченные количества арабиноксилана должны быть растворенными. Следовательно, связанная с этим возможность постороннего привкуса была существенно снижена.
Значительно сниженная вязкость способствовала разделению затора и отделению пива. Необходимые характеристики ксиланазы для пивоварения могли включать один или несколько из следующих аспектов в табл. 8.
Таблица 8
Критерии скрининга для отбора ксиланазы
Субстратная специфичность фермента
Соотношение ИЕ-АХ/Ии-АХ оказывает влияние на вязкость
- 27 027084
Избирательность фермента по отношению к субстрату То, насколько близко к точкам разветвления фермент будет осуществлять разрезание, оказывает влияние на функциональные свойства.
Термостабильность фермента
При длительном растворении ΆΧ во время затирания термостабильность является ключевым свойством
Оптимальное значение рН для фермента (рН 5,4-5,6)
Ингибирование фермента (например, известный ключевой фактор для ксиланаз)
Таблица 9 Ксиланазы - биохимические характеристики Ингибирование эндогенными ингибиторами ксиланаз злаков происходит по отношению к обоим СН ксиланаз
СН ксиланаз сню СН11
Мм +30 кДа 2 0 кДа
Субстратная Гидролиз Необходимо больше
специфичность близко к незамещенной
замещениям в ксилозы для
арабинозе гидролиза АХ
Избирательность ИЕ-АХ/ТО-АХ ИЕ-АХ/ТО-АХ
по отношению к субстрату типично > 1 типично < 1
3ΒΏ Часто Нет типичного
отдельный 3ΒΏ 3ΒΏ, но вторичный Βϋ на поверхности
Технический Понизители Растворитель/
эффект вязкости понизители вязкости
Не растворимый в воде арабиноксилан (^ϋ-АХ) у злаков, как показано на фиг. 3, связан со стабильностью фильтрационного осадка в пивоварне.
Концентрация феруловой кислоты (РА) у злаков очень сильно зависит от ткани. Наиболее высокая концентрация была обнаружена в материале перикарпия, в то время как концентрация в эндосперме была намного ниже. Сообщали о различных концентрациях. Концентрация 2700 мкг/г нерастворимой клетчатки, 185 мкг/г растворимой клетчатки является вероятной (Випге1 е! а1. 2001, 1оигпа1 о£ 8с. о£ £оой апй а§псийиге, уо1. 81, р. 653-60).
Если представить это в более широком контексте, это означает, что РА обнаруживали только раз на каждые 200 молекул ксилозы в арабиноксилане в нерастворимой клетчатке (^ϋ-АХ) и на каждые 2500 ксилоз в растворимой клетчатке (^Е-АХ).
Хорошо известным фактом является то, что ксиланазы могут привести к образованию постороннего привкуса в пиве, например свободная феруловая кислота и 4-УО.
Способы.
Исходя из критериев, упомянутых в табл. 8, 9, более 15 ксиланаз от 1)нРоп1 1пйиз1г1а1 Вюзшепсез обнаружили в качестве возможных кандидатов. Осуществляли скрининг ксиланаз при затирании в лабораторных условиях с применением до 30% ячменя в комбинации с солодом. Среди прочего, отслеживали
- 28 027084 скорость разделения затора, уровень пентозана/арабиноксилана и значения вязкости сусла. Наилучших кандидатов тестировали при изучении на нескольких пивоваренных заводах в полупромышленном масштабе для тестирования наших гипотез и связи характеристик ксиланазы с функциональными свойствами в пивоварении. Оптимальную дозу выбранного ксиланазного кандидата тестировали в комбинации с β-глюканазой.
Результаты и обсуждение.
Таблица образца 10. Ю Контроль Эталон (Х+В). XI Х2 ХЗ
Дин. вязкость (12 0Плато), мПа.с 1,798 1, 670 1,801 1,746 1,794
Экстракт °Плато) 15, 1 15, 7 15, 6 15, 2 15, 1
Общий пентозан (мг/л) 1610 1910 2440 2020 1710
Пивоварение на полупромышленном оборудовании, при котором доза фермента являлась единственной переменной. Применение ксиланазы, избирательной в отношении АИ-АХ (Х1), приводило в результате к разрушению фильтрующего слоя. Ксиланазные кандидаты, избирательные в отношении АЕАХ (эталон, Х2, Х3), приводили в результате к низкому подъему давления. Эталон представлял собой смесь ксиланазы + β-глюканазы.
Таблица 11
Анализ сусла - изучение на полупромышленном оборудовании
Ιϋ образца Эталон Х+В хь+в
Экстракт (°Плато) 15,70 16, 00 15, 95
Бета-глюкан в сусле (мг/л) 44 35 25
Дин. вязкость при 12°Плато (мПа.с) 1, 65 1, 68 1, 68
Общий пентозан (мг/л) 3540 2970 ЗОЮ
Таблица 12
Анализ альдегида Штрекера в выдержанном пиве
Маркеры выдержки (пиво ускоренной выдержки) Единица Эталон Х+В хь+в
2-Ме-Рг частей на миллиард 25 24 22
2-Ме-Ви частей на миллиард 3 2 3
З-Ме-Ви частей на миллиард 9 7 8
Фурфурол частей на миллиард 113 85 93
Метионал частей на миллиард 6 5 6
РПеАса1 частей на миллиард 10 9 10
Τ2Ν частей на миллиард 0, 022 0, 022 0, 022
Оптимизированные смеси ксиланазы, избирательной в отношении АЕ-АХ, применяли при средней (Х) и высокой дозе (Хй) в комбинации с β-глюканазой (В) к 20% ячменя/80% солода. Результаты указывали на хорошую эффективность разделения затора и отделения пива с низким риском образования по- 29 027084 стороннего привкуса и разрушения фильтрующего слоя.
Вывод.
При помощи данного изучения была доказана важность применения ксиланаз для пивоварения, причем тех, которые являются высокоизбирательными по отношению к ^Е-АХ во время затирания. Были достигнуты следующие положительные эффекты.
Хорошее разделение затора и эффективность фильтрации пива.
Сведенный к минимуму риск разрушения фильтрующего слоя при фильтровании пивного сусла.
Сниженная возможность образования постороннего привкуса, связанного с распадом арабиноксиланов.
Устойчивость к избыточной дозе ксиланазы.
Ксиланазы часто можно применять со значительным благоприятным эффектом в комбинации с βглюканазами для регулирования разделения.
Пример 3. Оценка комбинаций Х3/Вд18 (также называемых А1иХуп3/В8иО1и8) в испытаниях с полупромышленным пивоварением объемом 2 гл.
Материал и способы.
Эксперименты.
Ферменты:
А1иХуп3 (Х3)/В§иО1и8 (Вд1к) (а): комбинация Вд18 (глюканаза ВасШик) и Х3 (ксиланаза АкрегдШик; В§Ь8: 0,50 мг белка/кг крупки и Х3: 1,50 мг белка/кг крупки).
А1иХуп3 (Х3)/В8иО1и8 (Вд1к) (Ь): так же, как и в А1иХуп3 (Х3)/В8иО1и8 (Вд1к) (а), но с 20% увеличением дозы Х3 для тестирования надежности.
Эталон: эталонный ферментный продукт (иИгайо® Мах) с дозой при 0,20 кг/т крупки.
Сырьевой материал.
Добавочный материал: ячмень 22% вес./вес.
Солод: солод РШпег СЫга/ 42,6% вес./вес, солод РШпег ЦиепсЬ ΌΜΟ 35,4 вес.% по весу (вес./вес.).
Весь материал, который использовали для доведения рН при помощи кислоты, уровней кальция, цинка и горечи, являлся пищевым и его рассматривали как стандартные материалы для пивоварения.
Рецептура для варения пива была направлена на стиль пива в виде лагерного пива международного типа.
Помол.
Полупромышленная 2-вальцовая мельница Кип/е1. Молотый материал проходил вальцы дважды, что имитировало 4-вальцовую мельницу.
Солодовая крупка: мельница работала при 1,5 мм при первом прохождении и 0,7 мм при втором прохождении вальцов.
Ячменная крупка: мельница работала при 1,5 мм при первом прохождении и 0,7 мм при втором прохождении вальцов.
Пивоварня на 2 гл.
Все варение пива было основано на настойном затирании для НОВ (пивоварение при высокой плотности) и стандартном фильтровании пивного сусла объемом 190 л сусла, направленном на достижение 16°Плато. Во время фильтрования пивного сусла, которое осуществляли при постоянном потоке, фиксировали перепад давления (использовали в качестве параметра для оценки эффективности фильтрования пивного сусла). Помол всех материалов для варения пива осуществляли заранее (24 ч) и их держали в закрытых бадьях до контакта с водой. Весь материал выгружали в заторный котел в пределах первых 3 мин после начала затирания. Доведение кальция и рН осуществляли перед добавлением фермента. Повторно проверяли рН (20°С) во время паузы при 52°С. Нормальность по йодной пробе подтверждали через 10 мин при 72°С. Фильтрование пивного сусла проводили при 78°С.
Эффективность фильтрования пивного сусла оценивали по отношению к постоянному потоку при 90 л/ч во время первого сбора сусла. Поток увеличивали до 110 л/ч и 130 л/ч во время промывания дробины и сбора отфильтрованного сусла. Химический анализ проводили на холодном сусле.
Кипячение сусла.
Кипячение проводили с применением внешнего нагревателя с 4-5% испарением. Экстракты хмеля добавляли с самого начала кипячения сусла, стремясь к 20 Ви в конечном пиве.
Сбраживание объемом 50 л.
Все сбраживания проводили в 50 л цилиндроконических емкостях. Сбраживание осуществляли согласно стандартным рабочим методикам. Засевание осуществляли при помощи 15х106 живых дрожжевых клеток/мл. Количество дрожжей и жизнеспособность рассчитывали с применением счетчика №.1с1ео.
Обработка пива.
Пластинчатый и рамочный фильтр, работающий при постоянном давлении. Оценку потока проводили по весу.
Данные собирали исходя из 1 и 3 фильтровальных пластин.
Понижение крепости.
- 30 027084
Осуществляли понижение крепости всех видов пива до 5,0% ΑΒν (объемное содержание спирта), что рассматривали в качестве международного стандарта лагерного пива.
Разлив в бутылки.
СО2 доводили до 5,0 г/л. Все образцы пива разливали в 33 сантилитровые стандартные бутылки на автоматической разливочной машине МеЬеппоп с применением одного вакуумирования.
Анализ пива.
Виды свежего пива анализировали с применением ОС-Μδ.
Химический профиль выдержки определяли с применением ОС-Μδ.
Результаты и наблюдения: затирание.
Затирание проводили при следующем условии:
52°С в течение 10 мин, что имитировало затирание в течение 15-20 мин с применением работающей мельницы;
65°С в течение 40 мин;
72°С в течение 30 мин;
78°С в течение 10 мин.
Осуществляли все этапы с линейным изменением на 1°С. Графическое представление приведено на фиг. 7.
Все испытания проводили с данным режимом затирания, направленным на варение пива при 16°Плато. Не было замечаний, относящихся к этому этапу процесса.
Результаты и наблюдения.
Фильтрование пивного сусла.
Фильтрование пивного сусла проводили в пивоварне на 2 гл с загрузкой 150 кг/м2. Это являлось типичным для стандартной работы пивоварни. Осуществляли регулирование процесса фильтрования пивного сусла в качестве постоянного потока при среднем значении 100 л/ч. Начальная скорость потока составляла 90 л/ч с увеличением до 130 л/ч во время сбора отфильтрованного сусла. Перепад давления и поточное измерение мутности фиксировали для четырех варок пива. Общее фильтрование пивного сусла и сбор сусла проводили в течение приблизительно 2 ч.
Предположили, что испытание Χ3/Β§ίδ (Ь) и Χ3/Β§ίδ (а) являлись испытаниями, которые характеризовались наилучшей эффективностью фильтрования пивного сусла, за которыми следовали испытание Χ3/Β§ίδ (а) и испытание ИЕ тах с наихудшей эффективностью.
Таблица 13
Собранные данные во время фильтрования пивного сусла из затора, полученные из четырех испытаний
иг макс. Х3/Вд15 (а) Х3/Вд15 (Ь) Х3/Вд15 (а)
Загрузка фильтрационного чана (кг/мЗ) 153 153 153 153
Время фильтрования (мин) 154 164 170 154
Перепад давления (см) 40 30 30 30
Разрыхление (# глубоких резаний) 1 1 1 1
Мутность (ЕВС) 10 15 10 10
Первый подъем давления сусла (см/ч) 40 33 31 30
Время до глубокого резания (мин) 45 60 120 115
Перепад давления и первый подъем давления сусла в таблице измеряли как см ШС (см водяного стоба), а не как (см) и (см/ч) соответственно.
Результаты и наблюдения.
Анализ сусла после кипячения.
Анализ холодного сусла продемонстрировал сходные результаты. Анализ β-глюканов показал небольшое различие между образцами.
- 31 027084
Химический анализ холодного сусла
Сусло иг макс. Х3/Вд13 (а) Х3/Вд13 (Ь) Х3/Вд13 (а)
Содержание экстрактивных веществ (% плато) 16, 09 16, 05 15, 99 16, 1
Цвет (ЕВС) 9,7 9,3 9,3 9,3
рН 5 5,2 5,2 5,2
Йодная реакция (Есть/Нет) Есть Есть Есть Есть
Горечь (ВИ, ЕВС) 52 51 46 50
Таблица 14
Таблица 15
Аналитические данные по холодному суслу
иг макс. Х3/Вд13 (а) Х3/Вд13 (Ь) Х3/Вд13 (а)
Бета-глюкан в сусле (мг/л) 49 40 25 30
Дин.вязкость при 12°С (мПа.с) 1,888 1, 685 1, 679 1, 686
Пентозан (%) 63,5 63,7 63,5 64,4
Феруловая кислота (мкг/мл) 4,3 3,9 3,8 3,9
4-УС (4- винилгваякол, мкг/мл) <0,49 <0,49 <0,49 <0,49
(12°С представляют собой 12°Плато);
(%Плато можно использовать взаимозаменяемо с °Плато)
Результаты и наблюдения.
Сбраживание.
Анализ молодого пива приведен в табл. 16.
Таблица 16
Анализ молодого пива
Молодое пиво иг макс. Х3/Вд13 (а) Х3/Вд13 (Ь) Х3/Вд13 (а)
Содержание спирта (%) 6, 79 6, 79 6,7 6, 86
Действительное содержание экстрактивных веществ (% Р) 6,28 6 6 6
ΕΌΕ (%) 63,5 63,7 63, 5 64,4
Массовая доля сухих вещества в начальном сусле (% Р) 16,29 16,25 16, 09 16,24
Цвет (ЕВС) 8,3 83,5 - -
рН 4,4 4,4 4,4 4,4
502(частей на миллион) 7 9 11 10
Горечь (ВЦ, ЕВС) 29 28 27 27
Анализ молодого пива продемонстрировал высокую степень сходства между испытаниями. Все испытания характеризовались относительно низкой ΚΌΡ, но это обычно наблюдается при включении 22% ячменя, что рассчитано на основе веса по весу (вес./вес.).
Результаты и наблюдения.
Фильтрация пива.
- 32 027084
Образцы пива фильтровали при помощи пластинчатого и рамочного фильтра с использованием постоянного давления. Фильтровали два кега весом приблизительно 15 кг, и данные, относящиеся к фильтрации отдельного кега, представлены в табл. 17. Первый кег фильтровали с использованием 1 фильтрующего слоя и второй кег фильтровали с использованием 3 фильтрующих слоев. Перепад давления во всех случаях составлял 0,5 бар. Фильтровальные пластины представляли собой ΚΌ7 (20x20 см) от Ведего\у.
Общая картина кривых фильтрации исходя из фильтраций либо с 1, либо с 3 фильтровальными пластинами являлась одной и той же. Мы предполагаем, что задокументированные данные с использованием 1 фильтровальной пластины могли быть слишком нестабильными для того, чтобы продемонстрировать действительное соотношение различий.
Таблица 17
Данные, относящиеся к фильтрации кега, из четырех испытаний
Фильтрация иг макс. Х3/Вд13 (а) Х3/Вд13 (Ь) Х3/Вд13 (а)
Скорость фильтрации - 1 фильтрующий слой (л/ч) 4,8 5, 6 9,9 11,8
Скорость фильтрации - 3 фильтрующих слоя (л/ч) 77,2 59, 6 70, 6 105, 4
Результаты и наблюдения.
Анализ конечного пива.
Виды пива из испытаний анализировали согласно стандартным рабочим методикам (ЕВС) и результаты представлены в табл. 18.
Таблица 18
Анализ конечного пива
Выдержанное пиво иг макс. Х3/Вд13 (а) Х3/Вд13 (Ь) Х3/Вд13 (а)
Содержание спирта 4,82 4,89 5, 01 4,92
(%)
Действительное 4,5 4, 6 4, 6 4,4
содержание
экстрактивных
веществ (% Р)
ΚΌΕ (%) 63,2 63,4 63, 8 64,3
Массовая доля сухих 11, 85 11, 99 12,19 11,89
вещества в начальном
сусле (% Р)
Цвет (ЕВС) 4,8 4, 9 5 5
рН 4,4 4,4 4,4 4,4
302(частей на 13 13 10 6
миллион)
Горечь (Ви, ЕВС) 22 22 20 18
Мутность (ЕВС) 0,43 0,4 0, 38 0,4
Общая мутность - 8, 6 12,9 7,3 6, 2
инкубирование при
60°С в течение 5 дн.
(ЕВС)
СО2 (г/л) 4,9 5, 3 5, 1 5,2
Диацетил (частей на 12 11 8 10
миллион)
Пеностойкость (сек) 107 111 119 108
Объем пены (мл) 452 476 460 470
Результаты и наблюдения.
Альдегиды Штрекера и маркеры выдержки в конечном пиве. Анализ проводили как на свежем, так и на выдержанном пиве.
- 33 027084
Альдегиды Штрекера и маркеры выдержки и тепловой обработки (2-Ме-Рг (2-метилпропаналь), 2Ме-Ви (2-метилбутаналь), 3-Ме-Ви (3-метилбутаналь), фурфурол, метионал, РйеАса1 (фенилацетальдегид) и Τ2Ν (транс-2-ноненаль)) анализировали при помощи ОС-М8 как в свежем, так и в выдержанном пиве. Данные из анализа свежего пива представлены в табл. 19.
Таблица 19
Анализ альдегидов Штрекера в свежем пиве Маркеры тепловой обработки и выдержки (фурфурол и транс-2-ноненаль) использовали в качестве контрольного образца
Маркеры выдержки (свежее пиво) иг макс. Х3/Вд15 (а) Х3/Вд15 (Ь) Х3/Вд15 (а)
2-МЕ-Рг 5 5 5 6
2-МЕ-Рг 2 2 2 2
3-МЕ-Рг б б б б
Фурфурол 10 11 11 10
Метионал 4 4 4 4
РЬеАса1 б 6 6 7
Τ2Ν 0, ООН 0, 005 0, 004 0, 006
Виды пива из испытаний инкубировали при 37°С в течение 2 недель перед анализом альдегидов Штрекера. Данные для образцов выдержанного пива представлены в табл. 20.
Таблица 20
Анализ альдегидов Штрекера в выдержанном пиве Маркеры тепловой обработки и выдержки (фурфурол и транс-2-ноненаль) использовали в качестве контрольного образца
Маркеры выдержки ускоренной выдержки) (пиво иг макс. Х3/Вд15 (а) Х3/Вд15 (Ь) Х3/Вд15 (а)
2-МЕ-Рг миллиард) (частей на 25 23 22 26
2-МЕ-Рг миллиард) (частей на 3 3 3 2
3-МЕ-Рг миллиард) (частей на 9 7 7 8
Фурфурол миллиард) (частей на 111 92 93 78
Метионал миллиард) (частей на б 5 б б
РЬеАса1 миллиард) (частей на 10 9 9 10
Τ2Ν (частей на миллиард) 0, 017 0, 022 0, 022 0, 022
Данные, представленные в табл. 20, продемонстрировали ожидаемое увеличение уровня альдегидов Штрекера. Увеличение содержания фурфурола и транс-2-ноненаля достигало ожидаемого уровня.
Вывод.
Исходя из экспериментов в полупромышленном масштабе мы можем сделать вывод, что соотношения В §18 и Х3, которые тестировали в данном эксперименте, продемонстрировали такой же хороший или даже лучший результат, чем эталонный и11гаР1о Мах при пивоварении в полупромышленном масштабе.
Результаты являются неожиданными, если рассматривать их с учетом используемого затруднительного сырьевого материала, а именно включения 22% ячменя в комбинации с солодом, содержащим 300 мг/л β-глюкана. Эффективность наблюдали не только по отношению к результатам разделения затора, но также по отношению к фильтрации пива. По причине низкого растворения материала клеточных стенок при применении ВКЕА2 (данные, относящиеся к пентозану) можно зафиксировать более низкий уровень материала клеточных стенок, который может привести к проблемам с качеством, связанным с нежелательным вкусом и стабильностью.
В конечном итоге, можно сделать вывод, что, как оказывается, 20% увеличение дозы ксиланазного компонента в Х3/В§1§ (Ь) не оказывает какого-либо влияния на любой из оцениваемых параметров, что указывает на то, что Х3/В§1§ (а) является надежной комбинацией ферментов.
- 34 027084
Перечень последовательностей
АЕиХупЗ, АзрегдШиз ЁиЫдепзиз (ЗЕ<2 Ю N0:1), 302 аминокислоты
ОАЗУЗΙϋΤΚΕΚΑΗΟΚΚΥΕΟΝΙΟϋΟΥΤΕΤΚΝΞΚΤΡΑΙΙΚΑΟΕΟΑΕΤΡΕΝ3ΜΚΝΌΑΤΕΡ3 КСОЕЗЕЗСЗОУЬУХЕАОЗЫХКЫКСНТЪУИНЗОЬРЗИУОАШОКЫТЫЕУМКОТПТТУМОНУК ΟΚΙΥΑ№ΡννΝΕΙΕΝΕΡΟ3ΕΚΡ3νΕΥ<2νΐΟΕΡΥνΚΙΑΕΕΤΑΚΑΑΡΡΝΑΚΕΥΙΝΡΥΝΕΡ5Α3ΥΡΚ ЪТСМУЗНУККИ1ЕАС1Р10С1СЗОТНЪЗАСССАС13САЕХАЪАСАСТКЕ1АУТЕЪ01АСАЗЗТ ϋΥνΕλΛΙΕΑΟΕϋΟΡΚΟ IСI ΤνΝ0νΑϋΡ03ΝΗ3 3 3 Τ РЪЪ ΕΌ3ΝΥΝΡΚΡΑΥΤΑΙАХГАЪ
ТегХуп1, СеозтИ^Ыа етегзопИ (Та1еготусез етегзопИ) (ЗЕО Ю N0:2)
ΑΟΕΝΤΑΑΚΑΙΟΕΚΥΕΟΤΑΤΟΝΡΕΕ3ΌΤΑΥΕΤ0ΕΝΝΤ0ϋΕΟ0ΕΤΡΑΝ3ΜΚΝΟΑΤΕΡΕ0ΝνΕΤΕ3 ΑΟϋ0ΙΑΝΕΑΚΑΝΟ0ΜΕΗΟΗΝΕνΝΥΝ0ΕΡ3ΝνΤ3Ο3ΝΤΝΕΤΕΕΑΑΜΚΝΗΙΤΝννΤΗΥΚΟ0ΟΥΑΝ ϋννΝΕΑΕΝΟΟΟΤΥΚ3ΝνΕΥ0ΥΙΟΕΑΥΙΡΙΑΕΑΤΑΑΑΑΟΡΝΑΚΕΥΥΝΟΥΝΙΕΥΡΟΑΚΑΤΑΑ0ΝΕ УКЪУОЗЕСАН10СУСЬОЗНЕ1УСЕТРЗТЗЗОООЕМААЕТАЪСУЕУА1ТЕЪ01КМОЪРЕТЕАЪЪ Τ00ΑΤΌΥ03Τν0ΑΟΑΝΤΚΟθνθΙΤνΐΛίϋΝΤϋΚΥ3ΝνΡ3ΤΕ3ΟΥΟϋΑΟΡΝϋΑΝΥ0ΚΚΡΑΥΕΟΙΕΤ ΟΕΟ0ΤνΤ3ΤΤΥΙΙ3ΡΤΤ3νθΤΟΤΤΤ33ΟΟ3ΟΟΤΤθνΑ0ΗΝΕ0ΟΟΟΕΟΝΤΟΡΤνθΑ3ΟΥΤΟΤνΐ ΝΕΥΥ300Ε
АЕиХуп4, АзрегдШиз ЁиЫдепзиз (ЗЕО Ю N0:3)
ΕΡΙΕΡΗ0Α3ν3ΙΟΤΚΕΚΑΗΟΚΚΥΕΟΝΙΟΟ0ΥΤΕΤΚΝ3ΚΤΡΑΙΙΚΑϋΕΟΑΕΤΡΕΝ3ΜΚΝ
ΟΑΤΕΡ3ΗΟ0Ε3Ε3Ο3ϋΥΕνΝΕΑ03ΝΝΚΕΙΗΟΗΤΕνΝΗ30ΕΡ3Νν03ΙΤΟΚΝΤΕΙΕνΜΚΝΗΙΤΤ νΜ0ΗΥΚΟΚΙΥΑΝϋννΝΕΙΕΝΕΟΟ3ΕΚΟ3νΕΥΚνΐΟΕΟΥνΚΙΑΕΕΤΑΚΑΑΟΡΝΑΚΕΥΙΝΟΥΝΕΟ ЗАЗЕРКЪТСМУЗНУККИ1ААС1Р10С1СЗОТНЪЗАСССАС13СА14ЯАЪАСАСТКЕ1АУТЕЪ01 АСАЗ 3 ΤϋΥνΕννΕΑΟΕΝΟΡΚΟΙΟΙТУИСУАРРРЗИКЗ 3 3 Т РЪЪ ΕΡ3ΝΥΝΡΚΡΑΥΤΑΙАЛАЪ
АасХуп2, АзрегдШиз аси!еаЁиз (ЗЕО Ю N0:4) МУСЬЬ31ТААЪААТУЪРШУЗАУСЬО0ААУАКСЬ0ЕЕСТАТОПРЕЪТО1РЕУТ01АЖТАОЕС0 ΙΤΡΟΝ3ΜΚΝΟΑΤΕΡ30ΟΤΕΤΕΤΚΟϋνΐΑΟΕΑΕΟΝΟ0ΥΕΗΟΗΤΕνΝΥΝ0ΕΡ3ΝνΤ3ΟΤΝΤΝΑΤΕ
ΤΑΑΕΚΝΗΙΤΝνν3ΗΥΚΟΚΟΕΗΝΡννΝΕΑΕΝΡΡΟΤΥΚΤΝΙΕΥΤΤΙΟΕΑΥΙΡΙΑΕΑΑΑΑΑΑΡΡΡΑ
ΚΕΕΥΝΟΥΝΕΕΥΟΟΑΚΑΑ3ΑΗΑΐν0ΕνΚΝΑΟΑΚΙϋθνθΕ0ΑΗΕ3νθΤνΡ3Τ33Εν3νΕ03ΕΤΑΕ θνΕνΑΥΤΕΑθνΗΙΕΕΡΤΤΑΤΤΕΑ0033ϋΕ0ΑΕν03θν0ΤΤΟθνθΕΤΙΝΟΝΤΟΚΥ3ΝνΡ3ΤΕ3Ο УСААЬ ΡΝϋΕΝΕνΚΚΡΑΥΝΟΕΕΑΟΜΟνΤУТ Τ Τ Τ Τ Τ ΤΤΑΤΑΤ ОКТ Τ Τ Τ Τ ΤСАТ 3 Τ СТ ТААНИС0С ΟΟΕΝΝ3ΟΡΤΑΟΑΤΟΥΤΟΤΥνΝϋΥΥ30ΟΕ
ТгеХупЗ, ТгисАодегта геезе! (ЗЕО Ю N0:5) мкаишъсььары/ааъртетшъореъааъкаиътентаоъионоазозюоыкнк
ΟΚΕΥΕΟΤΑΤΟΗΟΕΕ0ΗΕΚΝΑΑΙΙ0ΑΟΕΟ0νΤΡΕΝ3ΜΚΝ03ΕΕΝΝ0Ο0ΕΝΝΟΟΑϋΥΕνΝΕΑ00Ν
ΟΚ3ΙΚΟΗΤΕΙΝΗ30ΕΡΑΝνΝΝΙΝΝΑΟΤΕΚ0νΐΚΤΉν3ΤννθΚΥΚΟΚΙΚΑΝθννΝΕΙΕΝΕΟΟΤΕ
Κ33νΕ3ΚΕΕΟΕΕΕν3ΙΑΕΚΑΑΚΟΑΟΡ3ΑΚΕΥΙΝΟΥΝΕΟΚΑΝΥΟΚνΝΟΕΚΤΥν3ΚΝΙ30θνΡΙϋ
С1С303НЪЗССССЗСТЪСАЪ00ЪАТУРУТЕЪА1ТЕЪО10САРТТОЕТ0УУ0АСЬЗУЗКСУС1Т νΝΟΙ3ϋΚΟ3ΝΚΑ3ΤΝΡΕΕΕΟΑΝΕΝΡΚΡΑΥΝ3ΐνθΙΕ0
ТгеХуп5, Тг1сАос1егта геезе! (ЗЕО Ю N0:6)
0ΟΙ0ΡΟΤΟΥΝΝΟΥΕΥ3ΥΝΝϋΟΗΟθνΤΥΟΝΟΡΟΟ0Ε3νΝΝ3Ν3ΟΝΕνθΟΚΟΝ0ΡΟΤΚΝΗ νΐΝΕ3Ο3ΥΝΡΝΟΝ3ΥΕ3νΥΟΝ3ΗΝΡΕΙΕΥΥΐνΕΝΕΟΤΥΝΡ3ΤΟΑΤΚΕΟΕνΤ3ϋΟ3νΥΟΙΥΗΤ0 ΚνΝ0Ρ311С ΤΑΤΡΥΰ ΥΜ5νΚΚΝΗΚ5565νΝΤΑΝΗΡΝΑΜΑ<2<2<ΑΑ ΤΡ6ΤΜΟΥ0ΐνΑνΡ6ΥΡ5565
Α5ΙΤν5Ό
Взи61иЗ, ВасШиз зиЬШиз (ЗЕО Ю N0:7), 214 аминокислот
0ΤΟΟ3ΕΕΟΡΕΝΟΥΝ3ΟΕΝ0ΚΑΟΟΥ3ΝΟΝΜΕΝΟΤΝΚΑΝΝν3ΜΤ3ΕΟΕΜΚΕΑΕΤ3ΡΑΥΝΚ
ΕϋΟΟΕΝΗ3ν0ΤΥΟΥΟΕΥΕνΚΜΚΡΑΚΝΤΟΐν33ΕΕΤΥΤΟΡΤϋΟΤΡΝϋΕΙϋΙΕΕΕΟΚϋΤΤΚν0ΕΝ
ΥΥΤΝΟΑΟΝΗΕΚΐνθΕΟΕΟΑΑΝΑΥΗΤΥΑΕΟΝ0ΡΝ3ΙΚΝΥνθΟ0ΕΚΗΤΑΤΝ0ΙΡΤΤΡΟΚΙΜΜΝΕΝ
Ν0Τ0ν0ΕΝΕ03ΥΝ0νΝΡΕΥΑΗΥ0ΝνΚΥΤΚΚ
ТегО1и1, СеозтиЁМа етегзопИ (Та1еготусез етегзопИ) (ЗЕО Ю N0:8)
ΑΡνΚΕΚΟΙΚΚΗΑ3ΡΕ0ΝΕΟ3ΝΕ3ΟΑΕΕΟΝΝΝΙΡθνΕΟΤΟΥΤΕΡΝΤ3ΑΙ0ΙΕΙΟ0ΟΜΝΙ
ΕΚνΡΕΕΜΕΚΜνΡΝ0ΜΤΟΡνΡ3ΑΥΕ0ΟΥ30νΐΝΥΙΤ3ΗΟΑ3ΑνΐΡΡΗΝΕΟΚΥΥΝΝΙΙ33Ρ3ΡΕ0
ΤΕΝΗΤΙΑ3ΝΕΑΡΝΡΝνΐΕΡΤΝΝΕΥΗΡΜΡΕ3Ενν0ΕΝ0ΑΑΙΡΟΙΚΑΑΟΑΤ30ΥΙΕνΕΟΝ3ΝΤΟΑ
ΝΤΝΤ0νΝΡΑΜΑΝΕΤΡΡ0ΝΚΐνΥΕΜΗ0ΥΕΡ3ΡΟ3ΟΤ3Ρ0θνΝ3ΤΙΟ0ΡΚνΕ3ΑΤΑΝΕΚ0ΝΟΚΚΑ
ΙΕΟΕΥΑΟΟΑΝ3νθΕΤΑνΤΟΜΕΡΥΕΑΝΝΤΡνΝΤΟΑΙΝΝΑΑΟΡΝΝΟΡΥΙΕ3ΜΕΡΡ3ΟΙΑΥΕ0νΕΡ
ЬЬОРЕЕ
- 35 027084
ВзиС1и1ОЗЕЫЬЬ, ВасШиз зиЫзШз (ЗЕО Ю N0:9)
ООУЗУУЕЕНС0Ь313ЕСЕЬУЕЕНСЕ0У0ЬКСМЗЗНСЬ0ИУС0ЕУЕУЕЗМКИЬНООИС1
ΤνΕΚΑΑΜΥΤ33ΟΟΥΙϋϋΡ3νΚΕΚνΚΕΤνΕΑΑΙϋΕΟΙΥνΐΙΌΝΗΙΕ3ϋΝϋΡΝΙΥΚΕΕΑΚΌΕΕϋΕ
Μ3ΕΡΥΟϋΥΡΝνΐΥΕΙΑΝΕΡΝΟ3ϋνΤΝΌΝ0ΙΚΡΥΑΕΕνΐΡνΐΡΌΝϋΡΝΝΐνΐνθΤΟΤΐΛί30ϋνΗΗ ΑΑΟΝΟΕΑΌΡΝνΜΥΑΕΗΕΥΑΟΤΗΟΟΝΕΚΟΟνϋΥΑΕΟΟΟΑΑΙЕУЗЕИСТЗААТСОССУЕЬОЕАОУ №ЮЕМОЕКЕЬЗИ7Ш1л/ЗЬТНКОЕЗЗААЬМРС7ШРТССИТЕАЕЬЗРЗСТЕУНЕК1НЕЗАЗI ΡΡ3ϋ
ΡΤΡΡ3ΌΡΟΕΡΏΡΟΕΡϋΡΤΡΡ3ΌΡΟΕΥΡΑΐΛίΟ3Ν<2ΙΥΤΝΕΐνΥΗΝΟ0υΛί0ΑΚΐΛί№Τ<2Ν<2ΕΡΟΟΡΥΟ
ΡΝΕΡΡΚ5ΟΡϋ5ΟΕΡϋΡΤΡΡ5ϋΡΟΕΥΡΑ1/ίΌ5Ν0ΙΥΤΝΕΐνΥΗΝΟ0Μ/ί0ΑΚ№/ίΤ0Ν0ΕΡΟΟΡΥΟΡ
ΝΕΡΡΝ
ТгеО1и2, Тг1 скодегта геезе! (ЗЕО Ю N0:10)
00ΤνΝΟ0ΟΟΟΙΟΝ3ΟΡΤΝΟΑΡΟ3ΑΟ3ΤΕΝΡΥΥΑ0ΟΙΡΟΑΤΤΙΤΤ5ΤΚΡΡ5ΟΡΤΤΤΤΚΑ
Τ3Τ333ΤΡΡΤ33θνΗΕΑθνΝΙΑΟΕΟΕΟΟΤΤΟΟΤθνΤ3ΚνΥΡΡΕΚΝΕΤΟ3ΝΝΥΡϋΟΙΟ0Μ0ΗΕν
ТОО6МТ1ЕКЪРУСИ0У1ЛАЖ№^ССЖ^ЗТ313КУО01ЛЛ2ССЬ5ЬСАУС1УО1ШУАК1ЖСС11
Ο0ΟΟΡΤΝΑ0ΕΤ3ΕΝ30ΡΑ3ΚΥΑ303ΗνΝΕΟΙΜΝΕΡΗϋνΝΙΝΤ№ΑΑΤν0ΕννΤΑΙΚΝΑΟΑΤ30Ε
Ι3ΡΡΟΝϋΝ03ΑΟΑΕΙ3ϋΟ3ΑΑΑΡ30νΤΝΡϋΟ3ΤΤΝΕΙΕϋνΗΚΥΡϋ3ϋΝ3ΟΤΗΑΕΟΤΤΝΝΙϋΟΑ
Ε3ΡΕΑΤΝΕΗ0ΝΝΗ0ΑΙΕΤΕΤΟΟΟΝν03ΟΙ0ΟΜΟ00Ι0ΥΕΝ0Ν3ϋνΥΕΟΥνθ№ΟΑΟ3ΕΟ3ΤΥνΕ
ТЕТРТСЗСЕЗИТЬТЗЬУЗЗСЬАНК
ТгеО1иЗ, Тги сЬодегта геезеи (ЗЕ£> Ю N0:11)
ОТ 3 СРОИАТ ЕТСЖУТУЗЕЖКСАЗАСЗ СЕССУТАУЗ ЬЗ ССАЗИНАРИОИЗ ΟΟΟΝΝνΚ 3Υ0Ν30ΙΑΙΡ0ΚΚΤνΝ3Ι33ΜΡΤΤΑ3№3Υ3Ο3ΝΙΡΑΝνΑΥΌΡΕΤΑΑΝΡΝΗνΤΥ3ΟϋΥΕΕΜΙΐΛίΡ ΟΚΥΟΌΙΟΡΙΟ330ΟΤνΝνθΟ03ΝΤΕΥΥΟΥΝΟΑΜ0νΥ3ΕνΑ0ΤΝΤΤΝΥ3ΟΌνΚΝΕΕΝΥΕΚΌΝΚΟ ΥΝΑΑΟ0ΥνΕ3Υ0ΕΟΤΕΡΕΤΟ3ΟΤΕΝνΑ3ΝΤΑ3ΙΝ
ТгеО1и4, Тг1 сВодегта геезе! (ЗЕ£> ΙΡ N0:12)
ΗΟΗΙΝΡΐνΐΝθνΐΛίΥ0ΑΥΡΡΤΤΕΡΥΕ3ΝΡΡΐννθΐΛίΤΑΑΡΡΡΝΟΕν3ΡΡΑΥ0ΝΡΡΙ 1СНК ΝΑΤΝΑΚΟΗΑ3νΚΑΟΌΤΙΡΕΟΝνΡνΡΝΡΗΡΟΡΐνΌΥΕΑΝΟΝΟϋΟΕΤνϋΚΤΤΡΕΕΕΚΙΌθνθΡΡ3 ΟΟϋΡΟΤΝΑ3ϋνΡΙ3ΝΝΝΤΝννΚΙΡϋΝΕΑΡΟΝΥνΕΡΗΕΙΙΑΕΗ3ΑΟ0ΑΝΟΑ0ΝΥΡ0ΟΕΝΙΑν3Ο ЗСЗЬОРЗСУЬСТРЬУНАТРРСУЫШУТЗРЬЕУЫРСРТУУЗСЬРТЗУАОСЗЗААТАТАЗАТУ РСССЗСРТЗНТТТТАНТТОАЗЗНРЗЗТРРАТТЗАРАССРТОТЬУСОСССЗСУЗСРТНСАРРАТ Ο3ΤΝΡΥΥΑ0ΟΕΝ
ТгеС1и6, Тг1скодегта геезе! (ЗЕО ΙΡ N0:13)
АЕ5И^УКЬСССССЕУРС11 ΕΗΡΚΤΚ0νΑΥΑΡΤΡΙ00ΡΥΡΡΝΑΡΡ5ΐΛΓΤΑνΤΡ0ΙΑΡΝΑ
СИНШС1РАУАЬРР0РР0КУУААУСМУТЕЗИРР5ЕСА11КЗЗРКСАТСТЗЕТЕЬРЕКУССЫМРС
КСАСЕКЬАУРРАЖШ1УЕСАКЗСЕСЬИКЗТРССУТЕЗКУЗЗЕТАТСТУ1РРРЗРЗЕСУЕЗРК
0СРМИУТЕРЗТЗЗТТССАТЗР1ЕУСТАРЫ1ТАЗУУУЗТРАСЗТИЗАУРС0РСКУЕРНКАКР0Р АЕКАЬУЬТУЗШРРА0ЬЕНЗТРЗСТТИЗР1ИАИАЗУРТЕТУУУЗI3ΤΡΚΑΡ№ΙΚΝΝΕΙΡνΤ3Ε ЗРЗРСЫККЬСИМ1ЕЗЬЕ1РРТРЗ№ВДЬУСТСМТ1ЕССНРЬТШРТКНЕУ31ОЗЬАРС1ЕЕЕЗ
УОРЬАЗАРССЗЕЬЬААУСРРЕСЕТЕАЗВПРЬСТЗРОТУМАТРТИАТЗТЗУРУАСЕЗУКЗУУВУ ΟΝΤΑΟΤΟΟνΑΙ33РССАТИЗIϋΥΑΑϋΤ3ΜΝΟΟΤνΑΥ3ΑϋΟϋΤIЬИЗТАЗ3СУОНЗ0Е0СЗЕАЗ
УЗЗЬРАСАУ1АЗРККТЕЗУЕУАСЗСЗТЕУУЗКРТСЗЗЕТКСРКЬСЗАСТ1КР1ААНРТТАСТЬ
УУЗТРУС1ЕНЗТРЗСТТЕС0УЗТАЬТЕТУ01АЬСУСЗСЗЕИЕЬУАЕСТСРЗСАНЬУАЗСРЗСА ЗИТРЮСЗОСЕСЗ 1РЗТКУАСЗСЗТАСОУУУСТЖЖСУЕУАОСТУСССТССТЗЗЗТКОЗЗЗЗТ ЗЗАЗЗЗТТЬНЗЗУУЗТТНАЗТУТЗЗНТЗЗААСРТСЗСУАСНУАОСССЮИТСРТОСУАРУУСО ΚΟΝϋΥΥΥΟΟν
ТгеС1и7, ТгисВодегта геезе! (ЗЕО ΙΡ N0:14)
ΗΟ0ν0ΝΕΤΙΝΟ0ΥΝ0ΟΕΙΡΡΥΥΥ0Κ0ΝΤΟΗΕΡΝνΑΟΝΥΑΕΡΡΡΡΟΕΙ3ΡΡ0ΥΤΤΡΡΐν
ΟΗΚΝΑΑΡΟΑΙ3ΑΤΑΑΑΟ3ΝΐνΕ0ΝΟΡθνΝΡΗΡΥΟΡΐνΤΥννΕΟ3Ο3ΟΤΤνΝΚΝΝΕΗΝνΚΙ0ΕΑ
ΟΙΝΥΝΤ0νΝΑ00ϋΕΙΝ0ΟΝΚΝΤνΚΙΡ33ΕΚΡΟΝΥνΕΚΗΕΕΕΑΑΗΟΑ33ΑΝΟΜ0ΝΥΡ0θνΝΙΑν
ТСЗСТКАЬРАСТРАТ0ЬУКРТРРС1ЬЕЕРУТТ1ТЗУТ1РСРАЬИ0С
Тге61и8, ТгисВодегта геезе! (ЗЕО ΙΡ N0:15)
СК1КУЬСУА1РС1РЕССР1РСЗСРТРТЗЗУРЬЬЗУКССРСАС0МКНЕАЕРРСЬЕУЕН1 3ΑΤΝ0ΕνΡΝΝΤνΡΟΚΡΡΕΡΝΝΟ3ΥΝΚννΝΑΟΡΕΤΟΑΥΟΜΙΡΜΗΝΕΑΗΥΝΟΟΙ1С0ССУЗРР1Е УРЬИУ01АКУУЕРЕРК11ЕСЬМЕЕРНРЬР1Е1ИА0ТС0КУУТА1ККАСАТ30М1ЬЬРСТЕЕАЗ УЕТУУЗТСЗАЕАЬСК1ТЕРРСЗТРЬЬУЕРУНКУЬР1ЕЕЗСЗНАЕСТТРЕУРАЕЕРЕАРИЬК0Е ΚΗΟΑΙ13ЕТСАЗМЕРЗСМТАЕСА0ККА13ЕКЗРУУ1СЕУСИСАСЗЕРТЗУ1ЬТЬТРЬСКРСКУ ΤΡΝΚΡΜΝΕΟΙΡΡ0ΕΤΡΡΕΚΥΗΡΤΡΤ3Ι3ΤΑΑΕΕΤΑΤΑΤΑΤ3ΡΟΡΑΡ3ΤΤΚΡΙΕΗΕΕΤΑ3ΡΤΡΝ АУТКРЗРРТЗРЗЗРРРКРЗААЗМЗАОСЬТСТУЬЕТУААЬСУМЬУАЕ
ВзиС1иС СВР, ВасШиз зиЬШиз (ЗЕО ΙΡ N0:16)
МКНЗ131ΕΙТСЬЫ ТЬЬТМССМ1АЗ РАЗААСТКТРУАКЖЗОЬЗ 1КСТ0ЬУ№ЮСКАУ0 ЬКС 13 3 НСЬОИУСЕΥνΝΚΠ3 ЬКИЬНППИСIТУЕНААМУТАРССΥIΠΝΡ 3УКЕКУКЕАУЕААКЕ ЬСIΥνίIПИНIΕΝϋΟΝΡΝΟΝΚΕΚΑΚΕ ЕЕКЕМЗ 3 ЬΥΟΝΤΡΝνΐΥΕI ΑΝΕ ΡΝΟΠνΝΗΚΗΠIΚΡΥΑ ΕΕνΐ3νΐΗΚΝΠΡΠΝΙI1УСТСТИ30ПУЕПААПП0ЬКП7ШУМУАЬНЕУАСТНС0ЕЬНПКАЕУАЬ ЗКСАР1ЕУТЕИСТЗПАЗСЕССУЕЬПОЗНЕИЬКУЬПЗКТ13ИУЕИЕЬЗПКОЕЗЗЗАЬКРСАЗКТ ССИНЬЗПЬЗАЗСТЕУНЕШЬСТКПЗТКП1РЕТРЗКПКРТ0ЕЕС13У0УНАСПСЗМЕЗЕ01НР0 ΡΟΙΚΝΝΟΝΤΤνΠΡΚΠνΤΑΗΥΗΥΚΑΚΝΚΟΟΝΕΠΟΠΥΑΟΙΟΟΟΝνΤΗΚΕνΤΡΗΚΡΚΟΟΑΠΤΥΡΕΡ ΟΕΚΝΟΤΡΑΡΟΑ3ΤΟΝΙ0ΡΗΡΗΝΠΠΗ3ΝΥΑ03ΟΠΥ3ΕΕΚ3ΝΤΕΚΤΤΚΚΙΤΡΥΠ0ΟΚΡΙΗΟΤΕΡΝ
Вариант ксиланазы ВзиХупЗ, ВасШиз зиЪШЛз (ЗЕО ΙΠ N0:17)
Α3ΤϋΥΝ0ΝΝΤΕΟΟΟΐνΝΑνΝΟ3ΟΟΝΥ3νΝΝ3ΝΤΟΝΕννθΚΟΝΤΤΟ3ΡΕΗΤΙΝΥΝΑθνΝ
АРИСЕСУЬТЬУСИТНЗРЫЕУУУУРЗИСТУНРТСТУКСТУКЗРССТУР1ΥΤΤΤΗΥΝΑΡ31РСР
ΟΤΤΕΤ0ΥΝ3νΗ03ΚΗΡΤΟ3ΝΑΤΙΤΕ3ΝΗνΝΑΝΚ3ΗΟΜΝΕΟ3ΝΝΑΥ0νΜΑΤΕΟΥ033Ο33Νντν
И
Вариант ксиланазы ВзиХуп4, ВасШиз зиЪШЛз (ЗЕО ΙΠ
- 36 027084
N0:18)
Α3ΤΟΥΜ0ΝΜΤΟΟΥΟΐνΝΑνΝΟ3ΟΟΝΥ3νΝΜ3ΝΤΟΝΓννθΚΟΜΤΤΟ3ΡΓΗΤΙΝΥΝΑθνΜΑΡΝΟΝ
0ΥΡΤΡΥ0ΜΤΗ3ΡΡΙΕΥΥνν03Μ0ΤΥΗΡΤ0ΤΥΚ0ΤνΥ3000ΜΥ0ΙΥΤΑΤΗ0ΝΑΡ3Ιϋ00ΡΤΤΡΤ
0ΥΜ3νΗ03ΚΗΡΤΟ3ΝΑΤΙΤΡ3ΝΗνΝΑΜΗ3ΗΟΜΟΡΟ3ΝΜΑΥ0νΜΑΤΕΟΥΡ33Ο33ΝντνΜ

Claims (28)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Композиция, содержащая фермент, характеризующийся эндо-1,4-в-ксиланазной активностью, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с 8ЕР ГО NО: 1; в комбинации с ферментом, характеризующимся эндо-1,3(4)-в-глюканазной активностью, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с 8ЕР ГО NО: 7.
  2. 2. Композиция по п.1, где указанный фермент характеризуется оптимальным значением температуры в диапазоне 40-70°С, например в диапазоне 45-65°С, например в диапазоне 50-65°С, например в диапазоне 55-65°С.
  3. 3. Композиция по п.1 или 2, где указанные ферменты имеют по меньшей мере 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность с аминокислотной последовательностью 8ЕР ГО NО: 1 или 7.
  4. 4. Композиция по любому из пп.1-3, где указанные ферменты имеют общее количество аминокислот менее 350, например менее 340, например менее 330, например менее 320, например менее 310, например менее 300 аминокислот, например, в диапазоне 200-350, например в диапазоне 220-345 аминокислот.
  5. 5. Композиция по любому из пп.1-4, где указанные аминокислотные последовательности указанных ферментов имеют по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных замен по сравнению с любой аминокислотной последовательностью 8ЕР ГО NО: 1 и 7.
  6. 6. Композиция по любому из пп.1-5, где указанные аминокислотные последовательности указанных ферментов имеют максимум одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью 8ЕР ГО NО: 1 или 7.
  7. 7. Композиция по любому из пп.1-5, где указанные ферменты содержат аминокислотные последовательности, определенные в 8ЕР ГО NО: 1 и 7.
  8. 8. Композиция по п.1, где указанные ферменты состоят из аминокислотных последовательностей, определенных в 8ЕР ГО NО: 1 и 7.
  9. 9. Композиция по любому из пп.1-8, где указанные эндо-1,3(4)-в-глюконазная активность и эндо1,4-в-ксиланазная активность происходят по меньшей мере из двух различных ферментов, например по меньшей мере двух различных ферментов из двух различных видов.
  10. 10. Композиция по любому из пп.1-9, где общий подъем давления по сравнению с применением отрицательного контроля без указанной композиции уменьшен по меньшей мере на 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 или 95%, при применении перед фильтрованием пивного сусла в пивоварении.
  11. 11. Композиция по любому из пп.1-10, где фильтруемость сусла, измеренная по объему сусла, собранного через 5 мин фильтрации, по сравнению с контролем без ферментов повышена до более 1,5, например более 1,6, например более 1,7, например более 1,8, например более 1,9, например более 2,0, например более 2,1, например более 2,2, например более 2,3, например более 2,4, например более 2,5, при применении в пивоварении перед отделением сусла.
  12. 12. Композиция по любому из пп.1-11, где фильтруемость сусла, измеренная по объему сусла, собранного через 5 мин фильтрации, по сравнению с применением отрицательного контроля без указанной композиции повышена по меньшей мере на 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 или 300% при применении в пивоварении перед отделением сусла.
  13. 13. Композиция по любому из пп.1-12, содержащая любой один или несколько дополнительных ферментов.
  14. 14. Применение композиции по любому из пп.1-13 для получения пищевого продукта, кормового продукта или солодового продукта-напитка.
  15. 15. Применение композиции по любому из пп.1-13 при получении заготовок из теста или выпеченных продуктов.
  16. 16. Применение композиции по любому из пп.1-13 при получении пульпы или бумаги.
  17. 17. Применение композиции по любому из пп.1-13 для получения злаковых компонентов.
  18. 18. Применение по п.17, в котором злак представляет собой рожь, пшеницу или ячмень.
  19. 19. Применение композиции по любому из пп.1-13 при получении пива или модификации побочных продуктов из процесса пивоварения.
  20. 20. Применение композиции по любому из пп.1-13 при получении вина или сока.
    - 37 027084
  21. 21. Применение композиции по любому из пп.1-13 при получении биотоплива первого или второго поколения, например биоэтанола.
  22. 22. Способ изменения фильтруемости крахмалсодержащего материала, причем указанный способ включает этап обработки указанного крахмалсодержащего материала композицией по любому из пп.113.
  23. 23. Способ уменьшения подъема давления во время фильтрования пивного сусла в пивоварении, причем указанный способ включает этап обработки пивного затора композицией по любому из пп.1-13.
  24. 24. Способ получения пищевого продукта, кормового продукта или продукта-напитка, например спиртного или безалкогольного напитка, например, напитка на основе злака или на основе солода, например пива или виски, причем указанный способ включает этап обработки крахмалсодержащего материала композицией по любому из пп.1-13.
  25. 25. Способ получения пивного затора, причем указанный способ включает этап обработки крахмалсодержащего материала композицией по любому из пп.1-13.
  26. 26. Способ получения биотоплива первого или второго поколения, например биоэтанола, причем указанный способ включает этап обработки крахмалсодержащего материала композицией по любому из пп.1-13.
  27. 27. Продукт, полученный способом по любому из пп.24-26.
  28. 28. Композиция, содержащая продукт по п.27, например, в которой продукт присутствует в диапазоне 0,1-99,9%.
EA201490624A 2011-09-14 2012-09-14 Ферменты EA027084B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161534574P 2011-09-14 2011-09-14
EP11181241 2011-09-14
US201261676535P 2012-07-27 2012-07-27
PCT/EP2012/068041 WO2013037933A2 (en) 2011-09-14 2012-09-14 Enzymes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201490624A1 EA201490624A1 (ru) 2014-06-30
EA027084B1 true EA027084B1 (ru) 2017-06-30

Family

ID=47883847

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201790153A EA201790153A3 (ru) 2011-09-14 2012-09-14 Ферменты
EA201490624A EA027084B1 (ru) 2011-09-14 2012-09-14 Ферменты

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201790153A EA201790153A3 (ru) 2011-09-14 2012-09-14 Ферменты

Country Status (15)

Country Link
US (2) US9683224B2 (ru)
EP (2) EP2756078B9 (ru)
JP (1) JP6084617B2 (ru)
CN (2) CN106434246A (ru)
AR (1) AR087885A1 (ru)
AU (1) AU2012307299C1 (ru)
BR (1) BR112014005873B1 (ru)
DK (1) DK2756078T3 (ru)
EA (2) EA201790153A3 (ru)
ES (1) ES2645921T3 (ru)
HU (1) HUE037237T2 (ru)
MX (1) MX353745B (ru)
PL (1) PL2756078T3 (ru)
WO (1) WO2013037933A2 (ru)
ZA (1) ZA201400889B (ru)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2880158A4 (en) * 2012-08-03 2016-10-26 Dupont Nutrition Biosci Aps ENZYMES
CA2910239A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
JP2016533741A (ja) 2013-07-29 2016-11-04 ダニスコ・ユーエス・インク 酵素の変異体
EP3017706A1 (en) 2014-11-05 2016-05-11 Dupont Nutrition Biosciences ApS Enzymes for malting
CN106906198B (zh) * 2015-12-23 2019-12-13 东莞泛亚太生物科技有限公司 提升耐温性的纤维素酶
AU2017220672B2 (en) * 2016-02-18 2023-06-22 Biopract Gmbh Arabinanase and uses thereof
KR20180117166A (ko) 2016-03-04 2018-10-26 다니스코 유에스 인크. 미생물에서의 단백질 생산을 위한 유전자 조작 리보솜 프로모터
WO2018049342A1 (en) * 2016-09-09 2018-03-15 Alpha Revolution, Inc. Systems, devices, and methods for fermenting beverages
WO2019089898A1 (en) 2017-11-02 2019-05-09 Danisco Us Inc Freezing point depressed solid matrix compositions for melt granulation of enzymes
CN110714037A (zh) * 2019-11-29 2020-01-21 江南大学 一种木聚糖酶的制备方法及其在啤酒生产中的应用
CN116286751B (zh) * 2023-05-15 2023-07-25 北京市科学技术研究院 催化效率提高的双功能纤维素酶突变体及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5470725A (en) * 1989-02-16 1995-11-28 Carlsberg A/S Thermostable (1,3-1,4)-β-glucanase
US5610046A (en) * 1992-12-24 1997-03-11 Gist-Brocades, N.V. Cloning and expression of xylanase B
WO1997013853A2 (en) * 1995-10-13 1997-04-17 Gist-Brocades B.V. Protein detection
WO1998005788A1 (en) * 1996-08-05 1998-02-12 Mogen International N.V. Improved process for the production of alcoholic beverages using maltseed
WO2005056744A1 (de) * 2003-12-13 2005-06-23 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien Hybridenzyme mit kationischer bindedomäne
WO2005059084A1 (en) * 2003-12-19 2005-06-30 Novozymes A/S Mashing process
WO2009108941A2 (en) * 2008-02-29 2009-09-03 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Production and use of plant degrading materials
WO2010128140A1 (en) * 2009-05-07 2010-11-11 Danisco A/S Enzyme complex from trichoderma reesei and p. funiculosum enzymes

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69333067T2 (de) 1992-12-23 2004-05-13 Novozymes A/S Enzym mit endoglukanase wirkung
DE69435154D1 (de) 1993-03-10 2008-12-04 Novozymes As Enzyme mit Xylanaseaktivität aus Aspergillus aculeatus
BR9507678A (pt) 1994-05-11 1997-09-23 Novo Nordisk As Construção de dna vetor de expressão recombinante célula proceso para produzir uma enzima enzima preparação de enzima uso da enzima e cultura
CA2252919A1 (en) 1996-05-03 1997-11-13 Gist-Brocades B.V. Method for making wort having improved filterability and/or increased yield
EA000002B1 (ru) 1996-05-07 1997-09-30 Владимир Михайлович Шемякин Алкогольный напиток и способ его получения
US6103511A (en) * 1996-10-04 2000-08-15 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Lichenase and coding sequences
WO1998028410A1 (en) 1996-12-20 1998-07-02 Novo Nordisk A/S A novel endoglucanase
EP0976838A1 (en) 1998-05-06 2000-02-02 Rhone-Poulenc Nutrition Animale Enzymes mixture
EP1142491A3 (en) * 2000-04-06 2002-04-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of removing off-flavor from foods and deodorizer
EP1613729A1 (en) 2003-04-04 2006-01-11 Novozymes A/S Mash viscosity reduction
BRPI0412279A (pt) 2003-07-02 2006-09-19 Diversa Corp glucanases, ácidos nucléicos codificando as mesmas e métodos para preparar e aplicar os mesmos
WO2005100582A2 (en) 2004-03-25 2005-10-27 Novozymes Inc. Methods for degrading or converting plant cell wall polysaccharides
WO2005100852A1 (de) 2004-04-13 2005-10-27 Saf Armaturen Gmbh Verfahren und vorrichtung zur erzeugung farbiger flüssigkeitsströme für eine warmwasserarmatur
EP1812547A1 (en) 2004-06-03 2007-08-01 Novozymes A/S Mashing process and enzyme composition useful therein
US20090117630A1 (en) 2004-12-22 2009-05-07 Novozymes A/S Fermentation product processes
DK1877568T4 (da) 2005-04-26 2021-01-11 Novozymes As Hydrolysering af arabinoxylan
CN103798505A (zh) 2005-11-08 2014-05-21 诺维信北美公司 酒糟脱水
EP3406621A1 (en) * 2006-02-14 2018-11-28 BP Corporation North America Inc. Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
WO2008023060A1 (en) 2006-08-25 2008-02-28 Novozymes A/S Fermentation process
GB0805360D0 (en) * 2008-03-25 2008-04-30 Univ Leuven Kath Arabinoxylan oligosaccharide preparation
WO2010059424A2 (en) 2008-11-18 2010-05-27 Novozymes, Inc. Methods and compositions for degrading cellulosic material
EP3037528B1 (en) 2008-12-23 2018-08-29 DuPont Nutrition Biosciences ApS Polypeptides
DK2382310T3 (en) 2008-12-23 2016-12-12 Dupont Nutrition Biosci Aps POLYPEPTIDES HAVING xylanase activity
WO2010072226A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Danisco A/S Polypeptides with xylanase activity
JP2010148485A (ja) * 2008-12-26 2010-07-08 Kirin Brewery Co Ltd フェルラ酸高含有発酵アルコール飲料

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5470725A (en) * 1989-02-16 1995-11-28 Carlsberg A/S Thermostable (1,3-1,4)-β-glucanase
US5610046A (en) * 1992-12-24 1997-03-11 Gist-Brocades, N.V. Cloning and expression of xylanase B
WO1997013853A2 (en) * 1995-10-13 1997-04-17 Gist-Brocades B.V. Protein detection
WO1998005788A1 (en) * 1996-08-05 1998-02-12 Mogen International N.V. Improved process for the production of alcoholic beverages using maltseed
WO2005056744A1 (de) * 2003-12-13 2005-06-23 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien Hybridenzyme mit kationischer bindedomäne
WO2005059084A1 (en) * 2003-12-19 2005-06-30 Novozymes A/S Mashing process
WO2009108941A2 (en) * 2008-02-29 2009-09-03 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Production and use of plant degrading materials
WO2010128140A1 (en) * 2009-05-07 2010-11-11 Danisco A/S Enzyme complex from trichoderma reesei and p. funiculosum enzymes

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BANERJEE GOUTAMI; CAR SUZANA; SCOTT-CRAIG JOHN S; BORRUSCH MELISSA S; WALTON JONATHAN D: "Rapid optimization of enzyme mixtures for deconstruction of diverse pretreatment/biomass feedstock combinations", BIOTECHNOLOGY FOR BIOFUELS, BIOMED CENTRAL LTD, GB, vol. 3, no. 1, 12 October 2010 (2010-10-12), GB, pages 22, XP021082870, ISSN: 1754-6834, DOI: 10.1186/1754-6834-3-22 *
DATABASE Geneseq 3 September 2009 (2009-09-03), DANIELL H: "Plant biomass degradation related protein SEQ ID NO:4.", XP002667967 *
DATABASE UniProt [online] "RecName: Full=Beta-glucanase; EC=3.2.1.73; AltName: Full=1,3-1,4-beta-D-glucan 4-glucanohydrolase; AltName: Full=Endo-beta-1,3-1,4 glucanase; AltName: Full=Lichenase; Flags: Precursor;", XP002694418, retrieved from EBI *
ITO K ET AL: "CLONING AND SEQUENCING OF THE XYNA GENE ENCODING XYLANASE A OF ASPERGILLUS-KAWACHII", BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY BIOCHEMISTRY., JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY, TOKYO, JAPAN, vol. 56, no. 6, 1 January 1992 (1992-01-01), TOKYO, JAPAN, pages 906 - 912, XP002330988, ISSN: 0916-8451 *
JUNQING WANG, HUIMIN ZHANG, MINCHEN WU, CUNDUO TANG: "Cloning and sequence analysis of a novel xylanase gene, Auxyn10A, from Aspergillus usamii", BIOTECHNOLOGY LETTERS, SPRINGER, vol. 33, no. 5, 1 May 2011 (2011-05-01), pages 1029 - 1038, XP055017436, ISSN: 01415492, DOI: 10.1007/s10529-011-0524-9 *
KVESITADZE E, ET AL.: "THERMOSTABLE ENDO-BETA-1,4-GLUCANASE AND ENDO-BETA-1,4-XYLANASE ACTIVITY IN CULTURE FILTRATES AND A PURIFIED ENZYME FRACTION IN THE THERMOPHILIC FUNGUS ALLESCHERIA TERRESTRIS", MICROBIOS, CAMBRIDGE, GB, vol. 80, no. 323, 1 January 1994 (1994-01-01), GB, pages 115 - 123, XP009007267, ISSN: 0026-2633 *
LEO K. DE GRAAFF, HETTY C. VAN DEN BROECK, ALBERT J. J. VAN OOIJEN, JAAP VISSER: "Regulation of the xylanase-encoding xlnA gene of Aspergillus tubigensis.", MOLECULAR MICROBIOLOGY., WILEY-BLACKWELL PUBLISHING LTD, GB, vol. 12, no. 3, 1 May 1994 (1994-05-01), GB, pages 479 - 490, XP002667969, ISSN: 0950-382X, DOI: 10.1111/J.1365-2958.1994.TB01036.X *

Also Published As

Publication number Publication date
BR112014005873B1 (pt) 2021-11-16
ES2645921T3 (es) 2017-12-11
ZA201400889B (en) 2017-06-28
EP2756078B1 (en) 2017-08-16
JP2014527813A (ja) 2014-10-23
EA201790153A2 (ru) 2017-06-30
EP3061816A1 (en) 2016-08-31
AU2012307299C1 (en) 2018-10-25
AR087885A1 (es) 2014-04-23
EA201790153A3 (ru) 2017-09-29
HUE037237T2 (hu) 2018-08-28
EA201490624A1 (ru) 2014-06-30
MX2014002950A (es) 2014-07-09
EP2756078B9 (en) 2018-09-12
US9683224B2 (en) 2017-06-20
MX353745B (es) 2018-01-26
US20140329283A1 (en) 2014-11-06
US20170314004A1 (en) 2017-11-02
AU2012307299A1 (en) 2014-02-20
CN103814129A (zh) 2014-05-21
JP6084617B2 (ja) 2017-02-22
AU2012307299B2 (en) 2018-03-22
CN106434246A (zh) 2017-02-22
WO2013037933A3 (en) 2013-05-30
PL2756078T3 (pl) 2017-12-29
BR112014005873A2 (pt) 2018-08-07
DK2756078T3 (da) 2017-11-27
EP2756078A2 (en) 2014-07-23
WO2013037933A2 (en) 2013-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA027084B1 (ru) Ферменты
US20150337247A1 (en) Enzymes
CA2761008C (en) Enzyme complex from trichoderma reesei and p. funiculosum enzymes
CN107109313A (zh) 用于麦芽制造的酶
WO2005118769A1 (en) Mashing process and enzyme composition useful therein
Abolore et al. An overview of industrial enzymes in beverage production and processing
JP2017038604A (ja) 酵素
DK2427550T3 (en) ENZYM COMPLEX FROM TRICHODERMA REESEI AND P. FUNICULOSUM ENZYMER
UA128152C2 (ru)

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM