ES2644089T3

ES2644089T3 - Procedimientos de cultivo celular

Info

Publication number: ES2644089T3
Application number: ES08868009.5T
Authority: ES
Inventors: Andre Giovagnoli; Sylvain Roy; Veronique Ducros; Virginie Charlot; Yves-Olivier Stauffer
Original assignee: Baxalta GmbH; Baxalta Inc
Current assignee: Baxalta GmbH; Baxalta Inc
Priority date: 2007-12-27
Filing date: 2008-12-22
Publication date: 2017-11-27
Anticipated expiration: 2028-12-22
Also published as: SG187397A1; EP2574676A1; ES2649094T3; DK2574677T3; SI2574677T1; JP2011507551A; ES2647294T3; US20090176269A1; MX343269B; HUE036712T2; PL2574676T3; HRP20171375T1; JP2016013140A; MX343271B; CN106222220A; EP2574677B1; JP5890854B2; HRP20171495T1; KR20160112025A; EP2235197A2

Abstract

Un método de cultivo de células de mamíferos que secretan proteínas heterólogas en un sobrenadante de cultivo celular, en el que el sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una temperatura que se establece a 36±0,9ºC, 5 en el que el cultivo celular es un cultivo continuo mantenido a una densidad de 1,4x106 a 2,8x106 células/ml, y en el que la célula de mamífero es una célula CHO.

Description

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DESCRIPCION

Procedimientos de cultivo celular

Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud provisional estadounidense n.° 61/009.328, presentada el 27 de diciembre de 2007.

CAMPO DE LA INVENClON

La invencion se refiere a procedimientos para cultivar celulas de mairnfero, particularmente celulas de mairnfero que secretan protemas heterologas y/o recombinantes y, mas particularmente, celulas de mairnfero que secretan protemas de la sangre, tales como el factor de coagulacion sangumea VIII (a continuacion en el presente documento “factor VIII”, o simplemente “FVIN”), ADAMTS-13, furina o factor de coagulacion VII (a continuacion en el presente documento “factor VII”, o simplemente “FVII”).

ANTECEDENTES DE LA INVENClON

El factor de coagulacion sangumea VIII es una glicoprotema plasmatica traza que se encuentra en mairnferos y esta implicada como cofactor de IXa en la activacion del factor X. Una deficiencia heredada del factor VIII da como resultado el trastorno hemorragico hemofilia A, que puede tratarse satisfactoriamente con factor VIII purificado. El factor VIII puede extraerse del plasma sangumeo o puede producirse mediante tecnicas basadas en ADN recombinante. En el plasma, circula como un complejo con el factor de von Willebrand (vWF).

Puede producirse factor VIII recombinante (rFVIII) mediante celulas de ovario de hamster chino (CHO) transfectadas con un vector que porta una secuencia de ADN que codifica para la molecula de factor VIII. En algunos casos, el factor VIII recombinante se produce conjuntamente con factor de von Willebrand recombinante (rvWF), que estabiliza el factor VIII. Tal produccion conjunta puede implicar el cultivo conjunto de lmeas celulares respectivas que expresan FVIII y vWF, o la expresion conjunta de las dos protemas en la misma celula. Vease el documento US 5 250 421 (Genetics Institute) y Kaufman et al (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 1233-1242.

En un procedimiento tfpico para preparar factor VIII recombinante, se cultivan celulas en un medio y secretan factor VIII al medio. Entonces puede purificarse el factor FVIII del medio, opcionalmente como complejo con vWF.

El factor VIII recombinante es caro de producir debido a los rendimientos relativamente bajos obtenidos en los procedimientos conocidos en la tecnica. El rendimiento por celula tiene a ser bajo en comparacion con el rendimiento que podna obtenerse para otras protemas recombinantes. Si el medio de cultivo no se complementa con productos animales, tales como suero, el medio puede soportar solamente densidades celulares relativamente bajas. Esto reduce el rendimiento por volumen de medio. Sin embargo, es deseable no complementar el medio de cultivo con productos animales con el fin de reducir el riesgo de contaminacion con virus y otros agentes transmisibles. Se conocen medios libres de protemas animales para la produccion de FVIII a partir del documento US 6 936 441 (Baxter AG), por ejemplo.

La presente invencion proporciona procedimientos para producir protemas de la sangre, incluyendo rFVIII, en los que el rendimiento se mejora en comparacion con procedimientos conocidos en la tecnica.

SUMARIO DE LA INVENCION

Un primer aspecto de la invencion proporciona un metodo de cultivo de celulas de mairnferos que secretan protemas heterologas en un sobrenadante de cultivo celular tal como se define en las reivindicaciones.

Un segundo aspecto de la invencion tal como se define en las reivindicaciones proporciona un metodo de cultivo de celulas de mamffero que secretan protemas heterologas en un sobrenadante de cultivo celular en el que el sobrenadante de cultivo celular se mantiene a un pH que se establece a X+0,05 en el que X tiene un valor de desde 7,15 hasta 7,20, con la condicion de que el pH se establezca a mas de 7,10.

Un tercer aspecto de la invencion tal como se define en las reivindicaciones proporciona un metodo de cultivo de celulas de mamffero que secretan protemas heterologas en un sobrenadante de cultivo celular en el que el sobrenadante de cultivo celular tiene una concentracion de CO2 del 1-10%.

Un cuarto aspecto de la invencion tal como se define en las reivindicaciones proporciona un metodo de cultivo continuo de celulas de mamffero que secretan FVIII en un recipiente que comprenden un sobrenadante de cultivo celular en el que la densidad de las celulas en el sobrenadante de cultivo celular se mide mediante un sensor en lmea y el flujo de entrada de medio nuevo en el recipiente se controla de manera automatica para mantener la densidad de las celulas en un intervalo deseado.

descripciOn detallada de realizaciones preferidas de la invenciOn

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7,15 hasta 7,20, con la condicion de que el pH se establezca a mas de 7,10. En realizaciones preferidas, el pH se establece a 7,20+0,05, preferiblemente 7,20+0,03, mas preferiblemente 7,20+0,01 y lo mas preferiblemente a 7,20; o 7,15+0,05, preferiblemente 7,15+0,03, mas preferiblemente 7,15+0,01 y lo mas preferiblemente a 7,15. En un procedimiento convencional para producir una protema recombinante, el sobrenadante de cultivo celular se mantiene at pH 7,1. De manera sorprendente, el solicitante ha encontrado que el cultivo de las celulas de mairnfero a un pH mas alto, tal como pH 7,2, aumenta el rendimiento de protema recombinante.

Por “cultivar a” o “mantener a” un pH, se hace referencia al pH al que los sistemas de control del procedimiento se establecen, es decir, el pH deseado objetivo. Cuando se hace referencia a “cultivar a” o “mantener a” un pH que se establece a X+Y, quiere decirse que el punto establecido esta a un valor de desde X+Y hasta X-Y. Para cada uno de los valores preferidos de X, el punto establecido esta a un valor dentro del intervalo X+0,05, +0,04, +0,03, +0,02 o +0,01°C. Se prefieren intervalos mas estrechos. Lo mas preferido es un punto establecido de X.

Para cualquier punto establecido dado, pueden producirse ligeras variaciones en el pH. Normalmente, tal variacion puede producirse debido a que los medios que controlan el pH, por ejemplo, anadiendo acido o base, o cambiando la velocidad de burbujeo, se activan unicamente despues de que el pH se haya desviado algo del punto establecido. Normalmente, el pH se controla a +0,05, +0,04, +0,03, +0,02 o +0,01°C unidades de pH mas proximas.

Cuando el punto establecido de pH se establece a un valor dentro del intervalo X+Y, y la tolerancia es +Z, esto tambien puede expresarse como punto establecido de (X-Y a X+Y) +Z. Para cada valor posible de X, se conciben todas las combinaciones de +Y y +Z, tal como se indico anteriormente, con la condicion de que el pH se establezca a mas de 7,10.

En una realizacion preferida, el pH se establece a 7,20+Y. Preferiblemente, el pH se establece a (7,15-7,25) +0; o (7,16-7,24) +0,1 o +0°C; o (7,17-7,23) +0,2, +0,1 o +0°C; o (7,18-7,22) +0,3, +0,2, +0,1 o +0°C; o (7,19-7,21) +0,4, +0,3, +0,2, +0,1 o +0°C; o 7,20+0,5, +0,4, +0,3, +0,2, +0,1 o +0°C.

En otra realizacion preferida, el pH se establece a 7,15+Y. Preferiblemente, el pH se establece a (7,11-7,19) +0; o (7,12-7,18) +0,1 o +0°C; o (7,13-7,17) +0,2, +0,1 o +0°C; o (7,14-7,16) +0,3, +0,2, +0,1 o +0°C; o 7,15 +0,4, +0,3, +0,2, +0,1 o +0°C.

En el procedimiento del tercer aspecto de la invencion tal como se define en las reivindicaciones, el sobrenadante de cultivo celular tiene una concentracion de CO2 del 1 al 10%, por ejemplo del 4,0-9,0%, del 5,5-8,5% o aproximadamente del 6-8%. De manera convencional, la concentracion de CO2 es superior a esto debido a que el CO2 producido por las celulas no se elimina del sobrenadante de cultivo celular. De manera sorprendente, el solicitante ha encontrado que mantener la concentracion de CO2 al 10% o menos aumenta el rendimiento de protema recombinante. Ayuda a que se mantenga la dCO2 baja si el medio de alimentacion se desgasifica (por ejemplo, haciendo burbujear aire a traves del mismo) asf como hacer burbujear el sobrenadante de cultivo celular en el biorreactor.

Preferiblemente, el procedimiento de cada uno de los tres primeros aspectos de la invencion, tal como se define en las reivindicaciones, se hace funcionar para incluir la caractenstica particular especificada en relacion con el procedimiento de uno o mas de los otros aspectos de la invencion. Es decir, cuando la temperatura se mantiene a 36 +0,9°C, es ventajoso mantener tambien el pH a X+0,05 en el que X tiene un valor de desde 7,15 hasta 7,20, y/o la concentracion de CO2 al 10% o menos.

En esta tecnica se conocen bien modos para monitorizar los tres parametros definidos (temperatura, pH y concentracion de CO2) y generalmente se basan en sondas que se insertan en el biorreactor, o se incluyen en bucles a traves de los cuales se hace circular el medio de cultivo, o se insertan en muestras extrafdas de medio de cultivo. Se describe un sensor de dCO2 en lmea adecuado y su uso en Pattison et al (2000) Biotechnol. Prog. 16:769-774. Un sensor de pH en lmea adecuado es InPro 3100/125/Pt100 de Mettler Toledo (Mettler-Toledo Ingold, Inc., Bedford, MA). Un sistema fuera de lmea adecuado para medir dCO2, ademas del pH y pO2, es el BioProfile pHOx (Nova Biomedical Corporation, Waltham MA). En este sistema, se mide dCO2 mediante electrodos potenciometricos dentro del intervalo de 3-200 mmHg con una resolucion de imprecision del 5%. Puede medirse el pH en este sistema a una temperatura de 37°C, que es proxima a la temperatura del sobrenadante de cultivo celular en el biorreactor. Tambien se conocen bien modos de alterar el parametro especificado con el fin de mantenerlo en el nivel predefinido. Por ejemplo, mantener la temperatura constante implica habitualmente calentar o enfriar el biorreactor o el medio de alimentacion (si es un proceso continuo o semicontinuo); mantener el pH constante implica habitualmente elegir y suministrar suficiente cantidad de un tampon adecuado (normalmente bicarbonato) y anadir acido, tal como acido clorhndrico, o alcali, tal como hidroxido de sodio, bicarbonato de sodio o una mezcla de los mismos, al medio de alimentacion segun sea necesario; y mantener la concentracion de CO2 constante implica habitualmente ajustar la velocidad de burbujeo (vease mas adelante), o regular el flujo de CO2 en el espacio de cabeza. Es posible que la calibracion de una sonda de pH en lmea pueda divagar a lo largo del tiempo, tal como a lo largo de periodos de dfas o semanas, durante los cuales se cultivan las celulas. En ese caso, puede ser beneficioso reiniciar la sonda en lmea usando las mediciones obtenidas de una sonda fuera de lmea recientemente calibrada.

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Una sonda fuera de lmea adecuada es la BioProfile pHOx (Nova Biomedical Corporation, Waltham MA).

Los inventores han encontrado que aumentar el pH (por ejemplo, anadiendo NaOH) no es suficiente por sf mismo para lograr el beneficio maximo en cuanto a la produccion de protema activa. En su lugar, es deseable reducir la concentracion de CO2. Normalmente, se mantendnan los otros parametros del procedimiento constantes. Sin embargo, los inventores han encontrado que es ventajoso reducir la concentracion de CO2 pero permitir que el pH se eleve de 7,1, por ejemplo a 7,15 o 7,2, preferiblemente sin anadir NaOH.

Los cultivos de celulas de mairnfero necesitan oxfgeno para que las celulas crezcan. Normalmente, esto se proporciona forzando oxfgeno en el cultivo a traves de orificios de inyeccion. Tambien es necesario eliminar el CO2 que se acumula debido a la respiracion de las celulas. Esto se logra “burbujeando”, es decir, haciendo pasar un gas a traves del biorreactor con el fin de arrastrar y expulsar el CO2. De manera convencional, esto tambien puede realizarse usando oxfgeno. Sin embargo, los inventores han encontrado que es ventajoso usar aire en su lugar. Se ha encontrado que habitualmente un gas inerte convencional tal como nitrogeno es menos eficaz en el burbujeo de CO2 que usar aire. Dado que el aire es aproximadamente el 20% de oxfgeno, podna pensarse que se usana cinco veces mas de aire. Sin embargo, se ha encontrado que esto inadecuado en cultivos a gran escala, particularmente en cultivos a escala de 2500 l. En un biorreactor de 2500 l, se usa de 7 a 10 veces mas de aire, preferiblemente 9 veces mas de aire aproximadamente. Por ejemplo, en condiciones convencionales, el biorreactor de 2500 l se burbujea con O2 a un tamano de burbuja de 10 |im a una velocidad de 0,02 VVH (volumen de O2 por volumen de cultivo por hora). Se burbujeana el mismo biorreactor de 2500 l usado segun el metodo de la invencion con aire a un tamano de burbuja de 10 |im a una velocidad de 0,18 VVH.

Por tanto, se ha encontrado que el uso de volumenes sorprendente altos de aire proporciona un suministro de oxigeno adecuado y elimina el CO2 no deseado.

Durante la fase de produccion, se prefiere eliminar el CO2 burbujeando aire, tal como se describio anteriormente. Este es especialmente el caso cuando se usan biorreactores de gran capacidad, en los que el sobrenadante de cultivo celular acumulana de lo contrario CO2 hasta altos niveles perjudiciales. Sin embargo, al inicio del cultivo, o en un cultivo a pequena escala, tal como una escala de 1 l o 2,5 l, el espacio de cabeza puede recubrirse con CO2. En tales condiciones, todavfa pueden lograrse niveles bajos de dCO2. El recubrimiento del espacio de cabeza con CO2 tambien podna usarse para reducir el pH al punto establecido, si el pH es demasiado basico.

Las celulas son celulas de mamffero que pueden cultivarse, preferiblemente en un procedimiento de fabricacion (es decir, al menos 1 litro), para producir una protema deseada tal como FVIII. Los ejemplos incluyen celulas de ovario de hamster chino/-DHFR, tales como el subclon DUKX-B11 (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 [1980]).

Las celulas de mamifero son celulas CHO, tal como se define en la reivindicacion 1.

Un metodo preferido para preparar clones de celulas CHO estables que expresan una protema recombinante es tal y como sigue. Se transfecta una lmea celular de CHO deficiente en DHFR, DUKX-BII, con un vector de expresion de DHFR para permitir la expresion de la protema recombinante relevante, esencialmente tal como se describe en el documento Us 5.250.421 (Kaufman et al, Genetics Institute, Inc.). Se selecciona transfeccion con metotrexato. Se logra la amplificacion de la region relevante que codifica para la expresion de la protema recombinante y el gen de DHFR mediante propagacion de las celulas en concentraciones crecientes de metotrexato. Cuando sea adecuado, pueden adaptarse lmeas celulares de CHO para el crecimiento en medio libre de protemas y/o suero, esencialmente tal como se describe en el documento US 6.100.061 (Reiter et al, Immuno Aktiengesellschaft).

El medio basal elegido para cultivar la lmea celular huesped no es cntico para la presente invencion y puede ser uno cualquiera de, o una combinacion de, los conocidos en la tecnica que son adecuados para cultivar celulas de marnffero. Medios tales como medio de Eagle modificado por Dulbecco, medio F-12 de Ham, medio esencial mmimo de Eagle y medio RPMI-1640 y similares estan disponibles comercialmente. La adicion de factores de crecimiento tales como insulina recombinante es opcional.

Historicamente, se han cultivado celulas animales en medios que contienen suero animal. Sin embargo, tales medios no estan definidos completamente y portan el riesgo de infeccion. Los expertos en la tecnica han disenado, por tanto, medios “libres de protemas” que estan o bien completamente libres de cualquier protema o bien al menos libres de cualquier protema que no se produzca de manera recombinante. Debido a la naturaleza labil del factor VIII, la productividad de las celulas huesped modificadas por ingeniena genetica se reduce severamente en condiciones libres de protemas. La albumina serica humana se usa frecuentemente como complemento para el cultivo libre de suero para la produccion de protemas recombinantes. La albumina por sf misma estabiliza el FVIII y las impurezas presentes en preparaciones de albuminas derivadas de suero tambien pueden contribuir al efecto estabilizador de la albumina. Se han identificado factores tales como lipoprotema como reemplazo para la albumina serica humana para la produccion de factor VIII recombinante en condiciones libres de suero.

Los medios preferidos incluyen los divulgados en los documentos US 6 171 825 (Bayer, Inc) y US 6 936 441 (Baxter

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El medio del documento US 6 171 825 consiste en medio esencial mmimo modificado de Dulbecco y medio F-12 de Ham (50:50, en peso) complementado con insulina recombinante, hierro, un poliol, cobre y opcionalmente otros oligoelementos.

La insulina debe ser recombinante y puede obtenerse como insulina “Nucellin” de Eli Lilly). Puede anadirse a de 0,1 a 20 |ig/ml (preferiblemente 5-15 |ig/ml, o aproximadamente 10 |ig/ml). El hierro esta preferiblemente en forma de iones Fe2+, por ejemplo, proporcionado como FeSO^EDTA, y puede estar presente a 5-100 |iM (de manera preferible aproximadamente 50 |im). Los polioles adecuados incluyen copolfmeros de bloque no ionicos de poli(oxietileno) y poli(oxipropileno) que tienen pesos moleculares que oscilan entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 16.000. Un poliol particularmente preferido es Pluronic F-68 (BASF Wyandotte), que tiene un peso molecular promedio de 8400 y consiste en un bloque central de poli(oxipropileno) (el 20% en peso) y boques de poli(oxietileno) en ambos extremos. Tambien esta disponible como Synperonic F-68 de Unichema Chemie BV. Otros incluyen los Pluronic F-61, F-71 y F-108. Puede anadirse cobre (Cu2+) en una cantidad equivalente a CuSO4 50800 nM, preferiblemente 100-400 nM, de manera conveniente aproximadamente 250 nM. La inclusion de un panel de oligoelementos tales como manganeso, molibdeno, silicio, litio y cromo puede conducir a aumentos adicionales en la produccion de factor VIII. Las celulas BHK crecen bien en este medio basal libre de protemas.

El medio del documento US 6 936 441 tambien se basa en una mezcla 50/50 de DMEM y F12 de Ham pero incluye peptona de soja o extracto de levadura a entre 0,1 y 100 g/l, preferiblemente entre 1 y 5 g/l. Como realizacion particularmente preferida, puede usarse extracto de soja, por ejemplo peptona de soja. El peso molecular de la peptona de soja puede ser menor de 50 kD, preferiblemente menor de 10 kD. La adicion de peptona de soja ultrafiltrada que tiene un peso molecular promedio de 350 Dalton ha demostrado ser particularmente ventajosa para la productividad de las lmeas celulares recombinantes. Es un aislado de soja que tiene un contenido en nitrogeno total de aproximadamente el 9,5% y un contenido en aminoacidos libres de aproximadamente el 13%, o aproximadamente el 7-10%.

Un medio particularmente preferido tiene la siguiente composicion: medio mmimo sintetico (por ejemplo, 50/50 de DMEM/F12 de Ham) de 1 a 25 g/l; peptona de soja de 0,5 a 50 g/l; L-glutamina de 0,05 a 1 g/l; NaHCO3 de 0,1 a 10 g/l; acido ascorbico de 0,0005 a 0,05 g/l; etanolamina de 0,0005 a 0,05; y selenito de sodio de 1 a 15 |ig/l. Opcionalmente, puede anadirse un agente tensioactivo no ionico tal como un polipropilenglicol (por ejemplo, Pluronic F-61, Pluronic F-68, Pluronic F-71 o Pluronic F-108) al medio como agente desespumante. Este agente se aplica generalmente para proteger las celulas de los efectos negativos de la aireacion (“burbujeo”), puesto que sin la adicion de un agente tensioactivo la elevacion y explosion de las burbujas de aire pueden danar las celulas que estan en la superficie de las burbujas de aire.

La cantidad de agente tensioactivo no ionico puede oscilar entre 0,05 y 10 g/l, preferiblemente entre 0,1 y 5 g/l. Ademas, el medio tambien puede contener ciclodextrina o un derivado de la misma. Preferiblemente, el medio libre de protemas y suero contiene un inhibidor de proteasas, tal como un inhibidor de la serina proteasa, que es adecuado para cultivo tisular y que es de origen sintetico o vegetal.

En otra realizacion preferida, se anade adicionalmente la siguiente mezcla de aminoacidos al medio mencionado anteriormente: L-asparagina (de 0,001 a 1 g/l; preferiblemente de 0,01 a 0,05 g/l; particularmente de manera preferible de 0,015 a 0,03 g/l), L-cistema (de 0,001 a 1 g/l; preferiblemente de 0,005 a 0,05 g/l; particularmente de manera preferible de 0,01 a 0,03 g/l), L-cistina (de 0,001 a 1 g/l; preferiblemente de 0,01 a 0,05 g/l; particularmente de manera preferible de 0,015 a 0,03 g/l), L-prolina (de 0,001 a 1,5 g/l; preferiblemente de 0,01 a 0,07 g/l; particularmente de manera preferible de 0,02 a 0,05 g/l), L-triptofano (de 0,001 a 1 g/l; preferiblemente de 0,01 a 0,05 g/l; particularmente de manera preferible de 0,015 a 0,03 g/l) y L-glutamina (de 0,05 a 10 g/l; preferiblemente de 0,1 a 1 g/l). Estos aminoacidos pueden anadirse al medio de manera individual o en combinacion. La adicion combinada de la mezcla de aminoacidos que contiene todos los aminoacidos mencionados anteriormente se prefiere particularmente.

En una realizacion particular, se usa adicionalmente un medio libre de protemas y suero que contiene una combinacion de las mezclas de aminoacidos mencionadas anteriormente y peptona de soja purificada y ultrafiltrada.

El medio del documento US 6 936 441 es particularmente muy adecuado para el cultivo de celulas CHO pero puede usarse tambien con otras celulas.

Un medio adecuado adicional es el medio libre de oligopeptidos divulgado en el documento US 2007/0212770 (Grillberger et al; Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.)

Preferiblemente, el medio de cultivo se tampona mediante el uso de iones bicarbonato, suministrados normalmente como bicarbonato de sodio.

De manera adecuada, el medio de cultivo tiene una osmolalidad de entre 210 y 650 mOsm, preferiblemente de 270

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a 450 mOsm, mas preferiblemente de 310 a 350 mOsm y lo mas preferiblemente de 320 mOsm. Preferiblemente, la osmolalidad del sobrenadante se mantiene dentro de uno o mas de estos intervalos a lo largo de todo el metodo de la invencion.

El cultivo es un cultivo continuo. Los cultivos continuos adecuados inclman cultivo discontinuo repetido, en quimiostato, turbidostato o perfusion.

Un cultivo discontinuo empieza con todos los nutrientes y celulas que se necesitan, y el cultivo continua hasta la finalizacion, es decir hasta que los nutrientes se agotan o el cultivo se detiene por algun motivo.

Un cultivo semicontinuo es un proceso discontinuo en el sentido de que empieza con las celulas y nutrientes pero luego se le alimenta con nutrientes adicionales de manera controlada con el fin de limitar el crecimiento de las celulas. La estrategia semicontinua se usa normalmente en procedimientos bioindustriales para alcanzar una alta densidad celular en el biorreactor. La disolucion de alimentacion esta habitualmente altamente concentrada para evitar la dilucion del biorreactor. La adicion controlada del nutriente afecta directamente a la tasa de crecimiento del cultivo y permite evitar que el metabolismo se desborde (formacion de subproductos metabolicos) y la limitacion de oxfgeno (anaerobiosis). En la mayona de los casos, el nutriente que limita el crecimiento es glucosa que se alimenta al cultivo como jarabe de glucosa altamente concentrado (por ejemplo, 600-850 g/l).

Pueden usarse diferentes estrategias para controlar el crecimiento en un proceso semicontinuo. Por ejemplo, cualquiera de tension de oxfgeno disuelto (DOT, pO2), velocidad de captacion de oxfgeno (OUR), concentracion de glucosa, concentracion de lactato, pH y concentracion amoniaco puede usarse para monitorizar y controlar el crecimiento del cultivo manteniendo ese parametro constante. En un cultivo continuo, se anaden nutrientes y, normalmente, se extrae el medio con el fin de eliminar subproductos no deseados y mantener un estado estacionario. Metodos de cultivo continuo adecuado son cultivo discontinuo repetido, cultivo en quimiostato, turbidostato y perfusion.

Pueden cultivarse celulas CHO, por ejemplo, en un tanque con agitacion o un tanque aereo que esta perfundido con un medio adecuado a una velocidad de perfusion de desde 2 hasta 10 intercambios de volumen por dfa y a una concentracion de oxfgeno de entre el 40% y el 60%, preferiblemente de aproximadamente el 50%. Ademas, las celulas pueden cultivarse por medio del metodo de quimiostato, usando el valor de pH preferido facilitado anteriormente, una concentracion de oxfgeno de entre el 10% y el 60% (preferiblemente de aproximadamente el 20%) y una velocidad de dilucion D de 0,25 a 1,0, preferiblemente de aproximadamente 0,5.

En un cultivo discontinuo repetido, tambien conocido como subcultivo en serie, las celulas se situan en un medio de cultivo y se hacer crecer hasta una densidad celular deseada. Para evitar el inicio de una fase de declive y muerte celular, el cultivo se diluye con medio de crecimiento completo antes de que las celulas alcancen su concentracion maxima. La cantidad y frecuencia de dilucion vanan ampliamente y dependen de las caractensticas de crecimiento de la lmea celular y conveniencia del procedimiento de cultivo. El procedimiento puede repetirse tantas veces como se requiera y, a menos que se desechen las celulas y el medio en el subcultivo, el volumen de cultivo aumentara de manera gradual con cada dilucion que se realice. El volumen creciente puede manejarse teniendo un reactor de tamano suficiente para permitir diluciones dentro del recipiente o dividiendo el cultivo dividido en varios recipientes. La justificacion de este tipo de cultivo es mantener las celulas en un estado de crecimiento exponencial. El subcultivo en serie se caracteriza porque el volumen de cultivo siempre aumenta de manera gradual, puede haber multiples cosechan, las celulas continuan creciendo y el procedimiento puede continuar tanto como se desee.

En los metodos de quimiostato y turbidostato, el medio extrafdo contiene celulas. Por tanto, las celulas que permanecen en el recipiente de cultivo celular deben crecer para mantener un estado estacionario. En el metodo de quimiostato, la tasa de crecimiento se controla normalmente controlando la velocidad de dilucion, es decir, la velocidad a la que se anade el medio nuevo. Las celulas se cultivan a una tasa de crecimiento submaxima, que se logra restringiendo la velocidad de dilucion. La tasa de crecimiento es normalmente alta. En cambio, en el metodo de turbidostato, se establece la velocidad de dilucion para permitir la velocidad de crecimiento maxima que las celulas pueden lograr a las condiciones de funcionamiento dadas, tales como pH y temperatura.

En un cultivo de perfusion, el medio extrafdo se empobrece en celulas porque la mayona de las celulas se retienen en el recipiente de cultivo, por ejemplo, al retenerse sobre una membrana a traves de la cual fluye el medio extrafdo. Sin embargo, normalmente una membrana de este tipo no retiene el 100% de las celulas, y por tanto se elimina una proporcion cuando se extrae el medio. Puede no ser crucial hacer funcionar cultivos de perfusion a tasas de crecimiento muy altas, puesto que la mayona de las celulas se retienen en el recipiente de cultivo.

Cultivos continuos, particularmente cultivos discontinuos repetidos, de quimiostato y turbidostatos se hacen funcionar normalmente a tasas de crecimiento muy altas. Segun la practica comun, es tfpico que se busque mantener las tasas de crecimientos al maximo, o cerca del maximo, en un esfuerzo por obtener una productividad volumetrica maxima. La productividad volumetrica se mide en unidades de cantidad o actividad de protema por volumen de cultivo por intervalo de tiempo. Un crecimiento celular mas alto se equipara con un mayor volumen de cultivo que esta produciendose al dfa y, por tanto, se considera de manera convencional que refleja una

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productividad volumetrica mayor. Los presentes inventores han encontrado de manera inesperada que, en determinadas realizaciones, la productividad volumetrica maxima no se alcanza a la tasa de crecimiento maxima de la celula. Tal como se describe en los ejemplos, se observo una tasa de crecimiento maxima de un clon de celulas CHO que expresaba furina en un cultivo de quimiostato a una temperatura de 36,5°C, pero la productividad volumetrica maxima se observo a 35,1°C. A pesar de los menores volumenes de cosecha obtenidos, que surgen de una tasa de crecimiento menor a la temperatura menor, la cantidad de protema recombinante producida fue mucho mayor, de manera que el cultivo a temperatura menor fue, en general, el mas productivo.

De manera adecuada, en cualquiera de los aspectos primero, segundo o tercero de la invencion tal como se define en las reivindicaciones, el sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una temperatura que se establece a una temperatura que es menor que la temperatura a la que se observa la tasa de crecimiento maxima en al menos 0,5°C, preferiblemente al menos 1,0°C. En esta realizacion, se prefiere que el cultivo sea un cultivo continuo, particularmente un cultivo discontinuo repetido, de quimiostato o turbidostato.

Se cultivan generalmente celulas de mairnfero tales como CHO y BHK como cultivos en suspension. Es decir, las celulas se suspenden en el medio, en vez de adherirse a un soporte solido. Las celulas pueden alternativamente inmovilizarse sobre un portador, en particular sobre un microportador. Portadores porosos, tales como Cytoline®, Cytopore® o Cytodex®, pueden ser particularmente adecuados.

La densidad celular se monitoriza frecuentemente en cultivos celulares. En principio, una alta densidad celular se considerana deseable puesto que, siempre que la productividad por celula se mantenga, esto conducina a una mayor productividad por volumen de biorreactor. Sin embargo, aumentar la densidad celular puede ser en realidad perjudicial para las celulas, y se reduce la productividad por celula. Existe por tanto la necesidad de monitorizar la densidad celular. Hasta la fecha, en procedimientos de cultivo de celulas de marnffero, esto se ha realizado extrayendo muestras del cultivo y analizandolas bajo un microscopio o usando un dispositivo de recuento de celulas tal como el dispositivo CASY TT comercializado por Scharfe System GmbH, Reutlingen, Alemania. Ahora se ha encontrado que es ventajoso analizar la densidad celular por medio de una sonda adecuada introducida en el propio biorreactor (o en un bucle a traves del cual el medio y las celulas en suspension se hacen pasar y luego se devuelven al biorreactor). Tales sondas estan disponibles comercialmente de Aber Instruments, por ejemplo el monitor de biomasa 220, 210 220 o 230. Las celulas en el cultivo actuan como capacitadores diminutos bajo la influencia de un campo electrico, puesto que la membrana celular no conductora permite una acumulacion de la carga. La capacitancia resultante puede medirse, es dependiente del tipo de celula y es directamente proporcional a la concentracion de celulas viables. Una sonda de 10 a 25 mm de diametro usa dos electrodos para aplicar un campo de radiofrecuencia a la biomasa y un segundo par de electrodos para medir la capacitancia resultante de las celulas polarizadas. El procesamiento electronico de la senal resultante produce una salida que es una medicion precisa de la concentracion de celulas viables. El sistema no es sensible a celulas con membranas permeables, el medio, burbujas de aire y residuos.

Normalmente, la densidad celular es de desde 1,0x106 hasta 5,0x106 celulas/ml, de manera adecuada de 1,0x106 a 3,5x106 celulas/ml, de manera adecuada de 1,4x106 a 2,8x106 celulas/ml, preferiblemente de 1,6x106 a 2,6x106 celulas/ml, lo mas preferiblemente de 1,8x106 a 2,4x106 celulas/ml. Aumentar la concentracion de celulas hacia el extremo superior de los intervalos preferidos puede mejorar la productividad volumetrica. No obstante, se conciben intervalos de densidad celular que incluyen cualquiera de los valores puntuales anteriores como extremos inferiores o superiores de un intervalo.

El cultivo se lleva a cabo normalmente en un biorreactor, que es habitualmente un recipiente de acero inoxidable, vidrio o plastico de 1 (uno) a 10000 (diez mil) litros de capacidad, por ejemplo 5, 10, 50, 100, 1000, 2500, 5000 u 8000 litros. El recipiente es habitualmente ngido pero pueden usarse bolsas de plastico flexibles, particularmente para volumenes mas pequenos. Estas son generalmente del tipo de “un unico uso”.

La protema heterologa o recombinante producida por el metodo de cualquiera de los tres primeros aspectos de la invencion es preferiblemente una protema de la sangre. Por “protema de la sangre” se incluye cualquier protema que esta o puede estar presente en la sangre de un humano o animal, incluyendo protemas que se modifican por ingeniena genetica para uso intravenoso. Las protemas de la sangre adecuadas incluyen albumina serica, factores de la coagulacion I, II, III, V, VII, VIII, IX, X, XI, XlI y XIII, furina, factor de von Willebrand, activador del plasminogeno tisular, interleucinas, interferones, metaloproteasas tales como ADAMTS proteasas (por ejemplo ADAMTS-13), inmunoglobulinas tales como IgG, IgM, IgA o IgE y fragmentos de inmunoglobulina. Los fragmentos de anticuerpo o inmunoglobulina adecuados incluyen moleculas de tipo Fab (Better et al (1988) Science 240, 1041); moleculas Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moleculas Fv de cadena sencilla (ScFv) en las que los dominios de pareja de Vh y Vl estan unidos mediante un oligopeptido flexible (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) y anticuerpos de un unico dominio (dAb) que comprenden dominios V aislados (Ward et al (1989) Nature 341, 544). Las inmunoglobulinas y sus fragmentos pueden “humanizarse”. Es decir, pueden fusionarse dominios variables de origen de roedor con dominios constantes de origen humano de manera que el anticuerpo resultante conserva la especificidad antigenica del anticuerpo original de roedor (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,6851-6855).

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En una realizacion preferida, el cultivo celular se usa para producir el factor VIII, opcionalmente junto con el factor de von Willebrand (vWF). El vWF puede anadirse por separado al medio de cultivo y es preferiblemente recombinante. Alternativamente, el vWF puede producirse conjuntamente incluyendo celulas que secretan vWF en el cultivo, asf como las celulas que secretan FVlII. Preferiblemente, sin embargo, el FVIII y vWF se expresan conjuntamente, es decir, cada celula secreta tanto FVIII como vWF. Puede obtenerse vWF recombinante como en Schlokat, et al. (1995), “Large Scale Production of Recombinant von Willebrand Factor”, Thrombosis and Haemostasis 78, 1160 o el documento US 6 114 146 (Baxter AG). Esta ultima patente tambien divulga celulas que pueden usarse para producir conjurantemente vWF con celulas que secretan FVIII. Las celulas que expresan conjuntamente ambas protemas se divulgan en el documento US 5 250 421 (Genetics Institute) y Kaufman et al (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 1233-1242.

El termino factor VIII se usa en el presente documento para indicar cualquier polipeptido o complejo de polipeptidos que tiene actividad de factor de coagulacion VIII. El factor VIII activado funciona como cofactor en la conversion del factor X en factor Xa por el factor IXa activado en presencia de fosfolfpidos e iones de calcio. De manera conveniente, la cantidad de factor VIII activo puede estimarse a partir del grado en el que promueve la conversion del factor X en el factor Xa en un ensayo adecuado. En un ensayo tfpico, el factor Xa hidroliza un sustrato cromogenico espedfico, liberando asf un cromoforo, cuya cantidad de se determina de manera espectrofotometrica. Los kits de ensayo disponibles comercialmente incluyen el kit de ensayo cromogenico del factor VIII (Dade Behring, Suiza; documento US 6.100.050); y el kit de factor VIII Coatest (Chromogenix, Suecia). La concentracion del factor VIII en humanos se define como 1 UI/ml de sangre. El kit de factor VIII Coatest puede determinar una actividad de FVIII equivalente a al menos 0,01 UI/ml de sangre. Para considerarse como factor VIII tal como se definio anteriormente, un polipeptido o complejo de polipeptidos debe tener al menos el 1% de la actividad del factor VIII nativo de manera que, cuando esta presente en la sangre en la misma concentracion nanomolar que el factor VIII nativo, su actividad es detectable por el ensayo del factor VIII Coatest.

Un FVIII adecuado para produccion mediante el metodo de la invencion es FVII nativo de longitud completa. Puede producirse FVIII porcino segun la invencion pero el FVIII es mas preferiblemente humano. Como alternativa al FVIII nativo, pueden producirse variantes y analogos. Muchos se conocen en esta tecnica, por ejemplo las variantes y derivados de delecion descritos en las patentes estadounidenses n.os 5 422 260, 4 749 780, 4 868 112, 4 877 614 y 5 171 844. El termino “derivado de delecion de factor VIII recombinante” se define como una o mas cadenas de polipeptido que tienen actividad de factor VIII, derivadas de polipeptido de factor VIII de longitud completa delecionando uno o mas aminoacidos. Preferiblemente, dicho derivado de delecion esta desprovisto de la mayona del dominio B, pero conserva partes de las secuencias aminoterminales y carboxiterminales del dominio B que son esenciales para el procesamiento proteolftico in vivo del producto de traduccion primario para dar dos cadenas de polipeptido. La produccion de un derivado de delecion de factor VIII de este tipo, identificado “r-VIII SQ”, se describe en el documento WO 91/09122. El termino “r-VIII SQ” se define como una cadena de polipeptido derivada de factor VIII de longitud completa y que carece de los aminoacidos 743 a 1636. En el documento US 6 358 703 se describen variantes de FVIII adicionales que carecen de todo o parte del dominio B.

Se divulgan vectores adecuados para transformar celulas CHO y 293S en el documento US 5 854 021. Pueden prepararse celulas BHK que expresan FVIII tal como se divulga en Wood et al (1984) Nature 312, 330-337 u obtenerse de la ATCC como cultivo CRL-8544. Se describen celulas CHO que expresan variantes de FVIII con dominio B delecionado en Lind et al (1995) Eur. J. Biochem. 232, 19-27 y en el documento US 5 661 008. Tres tipos de celula se este tipo se depositaron en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen como DSM 6415, DSM 6417 y DSM 6416.

Cuando FVIII y vWF se producen conjuntamente, el complejo entre ellos puede purificarse centrifugando el medio para eliminar las celulas y luego exponiendo el lfquido resultante a un soporte solido inmovilizado que contiene un anticuerpo para o bien FVIII o bien vWF, o un peptido que se unira espedficamente a FVIII o vWF, en condiciones que no provocaran que el complejo se disocie. Se ensenan metodos adecuados en los documentos US 6 307 032 (Baxter AG) y US 5 200 510 (ZymoGenetics).

El FVIII (opcionalmente en complejo con vWF) puede entonces formularse y usarse de modos conocidos. Por ejemplo, FVIII, que se ha producido en un cultivo libre de protemas animales, se formula preferiblemente en una composicion libre de protemas, tal como se divulga, por ejemplo, en los documentos Us 6 586 573 (Baxter International), WO 94/07510 o US 6 599 724, y se usa para tratar pacientes con hemofilia A.

Cuando se usa el metodo de la invencion tal como se define en las reivindicaciones para producir FVIII, se prefiere que el sobrenadante de cultivo celular se mantenga a una temperatura que se establece a 36+0,5°C, mas preferiblemente 36+0,2°C y lo mas preferiblemente 36°C y/o el pH se establezca a 7,20+0,05, preferiblemente 7,20+0,03, mas preferiblemente 7,20+0,01, lo mas preferiblemente 7,20; y/o el sobrenadante de cultivo celular tenga una concentracion de CO2 disuelto del 1 al 10%, preferiblemente del 4,0 al 9,0%, mas preferiblemente del 5,5 al 8,5%. Preferiblemente, al menos dos de estos parametros se encuentran dentro de los lfmites preferidos, concretamente temperatura y pH, o temperatura y dCO2. Lo mas preferiblemente, los tres parametros se establecen dentro de los lfmites preferidos.

Tal como se muestra en los ejemplos, es ventajoso incluir cobre en el sobrenadante de cultivo celular cuando se usa

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la invencion para producir FVIII. Normalmente, se cultivan celulas en un sobrenadante de cultivo celular que comprende 4 ppb de Cu2+. Ventajosamente, la concentracion de la concentracion de Cu2+ en el sobrenadante de cultivo celular es de al menos 5 ppb, y preferiblemente de al menos 7, 10, 15 o 25 ppb.

En una realizacion alternativa preferida, el cultivo celular se usa para producir ADAMTS-13.

ADAMTS-13, tambien conocida como proteasa de escision del factor de von Willebrand (VWF-cp) es un elemento de la familia de metaloproteasas. Tiene la capacidad de metabolizar grandes multfmeros de VWF para dar formas mas pequenas, escindiendo el enlace peptfdico entre los residuos Tyr-842 y Met-843 de VWF. Esta metaloproteasa se activa por Ca2_/Ba2, y no se inhibe por inhibidores de serina o cistema proteasas. La degradacion de factor de von Willebrand (VWF) deficiente se ha asociado con purpura trombocitopenica trombotica (TTP). En la TTP hereditaria, ADAMTS-13 esta ausente o es funcionalmente defectuosa, mientras que en la forma adquirida, no familiar de TTP, se encuentra transitoriamente en la mayona de los pacientes un autoanticuerpo que inhibe la actividad de ADAMTS- 13.

La clonacion y expresion del gen de ADAMTS-13 humano se describe en Plaimauer et al, 2002, Blood. 15; 100(10):3626-32. La clonacion y expresion del gen de ADAMTS-13 humano, junto con la secuencia completa del AdNc, tambien se divulgan en el documento US 2005/0266528 A1 (Laemmle et al). Una ADAMTS-13 para la produccion mediante el metodo de la invencion es ADAMTS-13 de longitud completa, nativa, preferiblemente ADAMTS-13 humana. Como alternativa a FVIII nativa, pueden producirse variantes y analogos.

El termino ADAMTS-13 se usa en el presente documento para indicar cualquier polipeptido o complejo de polipeptidos que tenga actividad de ADAMTS-13, particularmente la capacidad de escindir el enlace peptfdico entre los residuos Tyr-842 y Met-843 de VWF. De manera conveniente, la cantidad de ADAMTS-13 activa puede determinarse mediante ensayos funcionales, tales como ensayos funcionales que emplean peptidos de factor de von Willebrand modificados como sustrato para ADAMTS-13 (Tripodi et al J Thromb Haemost. Septiembre de 2008; 6(9):1534-41). Un metodo preferido de determinacion de la actividad de ADAMTS13 r-hu se divulga en Gerritsen et al. Assay of von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). Thromb Haemost 1999; 82:1386-1389. En este ensayo, 1 U se corresponde al nivel de actividad de ADAMTS-13 en plasma humano normal reunido. Para considerarse como ADAMTS-13 tal como se definio anteriormente, un polipeptido o complejo de polipeptidos debe tener al menos el 1% de la actividad de ADAMTS-13 nativa. La cantidad de ADAMTS-13 tambien puede determinarse mediante la medicion de antfgeno de ADAMTS-13 usando, por ejemplo, el metodo de ELISA divulgado en Rieger et al, 2006, Thromb Haemost. 2006 95(2):212-20.

Puede prepararse ADAMTS-13 recombinante proteoltticamente activa mediante expresion en cultivos de celulas de mairnferos, tal como se describe en Plaimauer et al, 2002, citado anteriormente y en el documento US 2005/0266528 A1. Se divulgan metodos de cultivo recombinante de celulas que expresan ADAMTS-13 en Plaimauer B, Scheiflinger F.Semin Hematol. Enero de 2004; 41(1):24-33. Los tipos de celulas preferidos para la expresion de ADAMTS-13 incluyen celulas HEK-293 y celulas CHO.

El documento US 2005/0266528 A1 y Zheng et al, 2001, Blood, 98:1662-1666 divulgan metodos de purificacion de ADAMTS-13. Puede formularse ADAMTS-13 purificada segun metodos convencionales y usarse terapeuticamente, por ejemplo, para tratar TTP.

Cuando el metodo de la invencion tal como se define en las reivindicaciones se usa para producir ADAMTS-13, se prefiere que el sobrenadante de cultivo celular se mantenga a una temperatura que se establece a 36,0+0,5°C, mas preferiblemente 36,0+0,2°C y lo mas preferiblemente 36,0°C y/o el pH se establezca a 7,15+0,05, preferiblemente 7,15+0,03, mas preferiblemente 7,15+0,01, lo mas preferiblemente 7,15; y/o el sobrenadante de cultivo celular tenga un concentracion de CO2 disuelto del 1 al 10%, preferiblemente del 4,0 al 9,0%, mas preferiblemente del 5,5 al 8,5%. Preferiblemente, al menos dos de estos parametros estan dentro de los lfmites preferidos, concretamente temperatura y pH, o temperatura y dCO2. Lo mas preferiblemente, los tres parametros se establecen dentro de los lfmites preferidos.

En una realizacion alternativa preferida, el cultivo celular se usa para producir furina.

La furina, tambien denominada PACE (enzima de escision de aminoacidos basicos apareados), pertenece al grupo de las serina proteasas de tipo subtilisina, que desempenan un papel importante en la escision de proprotemas, especialmente en smtesis secretora (Van de Ven et al., Crit. Rev. Oncogen., 4:115-136, 1993). Es una serina endoproteasa dependiente de calcio dispuesta estructuralmente en varios dominios, concretamente un peptido senal, propeptido, dominio catalftico, dominio homo-B o P, el dominio rico en cistema ubicado en el extremo C- terminal, dominio transmembrana y cola citoplasmatica. El sitio de escision de proteasas comprende una secuencia de reconocimiento que se caracteriza por la secuencia de aminoacidos Arg-X-Lys/Arg-Arg. La proteasa furina escinde proprotemas espedficamente tras esta secuencia consenso (Hosaka et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:1212712130).

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Se incorpora furina intacta en el sistema de membranas del aparato de Golgi y alft es funcionalmente activa (Bresnahan et al, J Cell Biol. 1990; 111:2851-9). Tras el transito del precursor de furina recien sintetizado desde el retmulo endoplasmatico hasta el compartimento de Golgi, el propeptido se elimina de manera autocatalftica en un acontecimiento de procesamiento en dos etapas (Anderson et al, EMBO J. 1997; 16: 1508-18). La furina tambien experimenta ciclos entre la red de trans-Golgi y la superficie celular por medio de vesmulas endosomales, procesando de ese modo tanto protemas precursoras durante su transporte a traves de la ruta secretora constitutiva asf como moleculas que entran en la ruta endocftica. La distribucion celular de furina a los compartimentos de procesamiento esta dirigida por caractensticas estructurales definidas dentro de su cola citoplasmatica (Teuchert et al, J Biol Chem. 1999; 274:8199-07).

Puesto que una sobreexpresion de la furina proteasa nativa afecta negativamente al crecimiento de cultivos celulares en crecimiento continuo, se han buscado soluciones para reducir la influencia toxica de la furina sobre las celulas. Se ha encontrado que los dominios C-terminales son prescindibles para la actividad funcional de la furina y pudo detectarse una forma truncada de la furina nativa sobreexpresada de 75-80 kD en el sobrenadante celular como protema secretada (Wise et al, PNAS. 1990; 87:9378-82). Esta furina truncada secretada de manera natural tambien se conoce como “furina desprendida” (Vidricaire et al, Biochem Biophys Res Comm. 1993; 195:1011-8; Plaimauer et al, Biochem J. 2001; 354:689-95) y se escinde de manera N-terminal de la parte transmembrana (Vey et al, J Cell Biol. 1994; 127: 1829-42).

Se han descrito protemas de furina truncadas mediante ingeniena genetica, en las que la parte codificante de los dominios transmembrana y citoplasmatico se han delecionado, por ejemplo para los aminoacidos A714-794 (Leduc et al, J Biol Chem. 1992; 267: 14304-8; Molloy et al, J Biol Chem. 1992; 267:16396-402) y para los aminoacidos A716-794 (“Sol-PACE”, Wasley et al., J Biol Chem. 1993; 268:8458-65; Rehemtulla y Kaufman, Blood. 1992; 79:2349-55) y para los aminoacidos A705-794 (Hatsuzawa et al, J Biol Chem. 1992; 267:16094-9). Tambien se han descrito mutantes de furina que comprenden adicionalmente una delecion de la region rica en cistema (Hatsuzawa et al, J Biochem. 1992; 101:296-301; Creemers et al, J Biol Chem. 1993; 268:21826-34).

El documento WO 2008/141824 (Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.) divulga una furina humana truncada que carece de los aminoacidos 578 a 794, es decir A578-794.

El termino “furina” se usa en el presente documento para indicar cualquier polipeptido o complejo de polipeptidos que tiene actividad proteolftica de furina.

La evaluacion de la actividad proteolftica de una furina, furina truncada o derivado de furina puede realizarse mediante cualquier prueba adecuada, por ejemplo usando sustratos fluorogenicos que estan compuestos por un sitio de escision dibasico para el que la furina es espedfica (Schlokat et al, Biotechnol Appl Biochem. 1996; 24:257-67). Con dicho ensayo, se define 1 unidad como la cantidad de furina que liberara 1 pmol de 7-amino-4-metilcumarina (AMC) del sustrato fluorogenico Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC en 1 minuto a 30°C. El ftmite de cuantificacion para esta prueba es normalmente de 0,625 U/ml. Alternativamente, la actividad proteolftica tambien puede medirse incubando furina con proprotemas, por ejemplo pro-rvWF, durante un tiempo suficiente. El grado de procesamiento de pro- rvWF puede analizarse por ejemplo mediante inmunotransferencia de tipo Western. La cantidad de antfgeno de furina puede medirse mediante una prueba de ELISA. Una prueba de ELISA adecuada es la DuoSet de furina humana disponible de R&D Systems, MN (n.° de cat. DY1503) en la que se usa anticuerpo de raton anti-furina humana como anticuerpo de captura, y se usa anticuerpo de cabra biotinilado anti-furina humana como anticuerpo de deteccion.

Una furina adecuada para la produccion mediante el metodo de la invencion es furina nativa, de longitud completa, preferiblemente furina humana. Como alternativa a la furina nativa, pueden producirse variantes y analogos, incluyendo los descritos anteriormente.

En el documento WO 2008/141824 se describen vectores adecuados para transformar celulas de mairftfero, particularmente celulas CHO, con furina o variantes de furina (Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.), junto con metodos para purificar la furina asf producida. El documento WO 91/06314 (Holland Biotechnology) describe vectores de expresion de furina, un metodo de expresion de furina en celulas de mairftfero, particularmente celulas COS-1, y la purificacion de furina producida de manera recombinante. El documento WO 92/09698 (Genetics Institute y Chiron Corp) describe la expresion de furina en celulas CHO, o bien sola, o bien en combinacion con vWF o factor IX.

Se procesa pro-rVWF para dar su forma madura durante el cultivo celular mediante furina producida de manera endogena, que se expresa a niveles relativamente bajos en muchos tipos de celulas (Wise et al, 1990, PNAS 87:9378-9382). El procesamiento de pro-rVWF puede realizarse mas eficazmente mediante coexpresion de furina heterologa con el pro-rVWF. Alternativamente, el documento WO 2008/141824 sugiere que una furina purificada puede ser adecuada para su uso como reactivo para promover el procesamiento de rVWF.

Cuando el metodo de la invencion tal como se define en las reivindicaciones se usa para producir furina, se prefiere que el sobrenadante de cultivo celular se mantenga a una temperatura que se establece a 35,1°C y/o el pH se

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establezca a 7,15+0,05, preferiblemente 7,15+0,03, mas preferiblemente 7,15+0,01, lo mas preferiblemente 7,15; y/o el sobrenadante de cultivo celular tenga una concentracion de CO2 disuelto del 1 al 10%, preferiblemente del 4,0 al 9,0%, mas preferiblemente del 5,5 al 8,5%. Preferiblemente, al menos dos de estos parametros estan dentro de los lfmites preferidos, concretamente temperatura y pH, o temperatura y dCO2. Lo mas preferiblemente, los tres parametros se establecen dentro de los lfmites preferidos.

En una realizacion alternativa preferida, el cultivo celular se usa para producir factor VII.

“Polipeptido de factor VII” abarca factor VII de tipo natural (es decir, un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos divulgada en la patente estadounidense n.° 4.784.950), asf como variantes de factor VII que presentan una actividad biologica sustancialmente igual o mejorada en relacion con factor VII de tipo natural, y variantes de factor VII que tienen una actividad biologica sustancialmente modificada o reducida en relacion con factor VII de tipo natural. El termino “factor VII” pretende abarcar polipeptidos de factor VII en su forma no escindida (zimogeno), asf como los que se han procesado proteoltticamente para producir sus formas bioactivas respectivas, que pueden designarse factor VIIa. Normalmente, el factor VII se escinde entre los residuos 152 y 153 para producir factor VIla. El termino “polipeptido de factor VII” tambien abarca polipeptidos, incluyendo variantes, en los que la actividad biologica del factor VIIa se ha modificado sustancialmente o reducido algo en relacion con la actividad de factor VIIa de tipo natural. Estos polipeptidos incluyen, sin limitacion, factor VII o factor VIIa en el que se han introducido alternaciones espedficas en la secuencia de aminoacidos que modifican o alteran la bioactividad del polipeptido.

La actividad biologica del factor VIIa en la coagulacion sangumea se deriva de su capacidad para (i) unirse a factor tisular (TF) y (ii) catalizar la escision proteolftica de factor IX o factor X para producir factor IX o X activado (factor IXa o Xa, respectivamente). La actividad biologica de polipeptidos de factor VII (“actividad biologica de factor VII”) puede cuantificarse midiendo la capacidad de una preparacion para promover la coagulacion sangumea usando plasma deficiente en factor VII y tromboplastina, tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.997.864 o el documento WO 92/15686. En este ensayo, la actividad biologica se expresa como la reduccion en el tiempo de coagulacion en relacion con una muestra control y se convierte en “unidades de factor VII” mediante comparacion con un patron de suero humano reunido que contiene una actividad de factor VII de 1 unidad/ml. Alternativamente, la actividad biologica de factor VIIa puede cuantificarse (i) midiendo la capacidad del factor VIIa (o el polipeptido de factor VII) para producir factor X activado (factor Xa) en un sistema que comprende TF incrustado en una membrana lipfdica y factor X (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) midiendo la hidrolisis de factor X en un sistema acuoso; (iii) midiendo la union ffsica de factor VIIa (o el polipeptido de factor VII) a TF usando un instrumento basado en resonancia de plasmon superficial (Persson, fEbS Letts. 413:359-363, 1997); (iv) midiendo la hidrolisis in vitro de un sustrato sintetico mediante factor VIIa (o un polipeptido de factor VII); o (v) midiendo la generacion de trombina en un sistema in vitro independiente de TF. Alternativamente, puede determinarse el antfgeno de FVII mediante ELISA. Un ELISA adecuado es el kit de ELISA de factor VII humano (FVII) AssayMax disponible de Assay Pro (St Charles, MO), n.° de cat. EF1007-1, que usa un anticuerpo monoclonal anti-FVII humano como anticuerpo de captura, y un anticuerpo policlonal biotinilado anti-FVII humano como anticuerpo de deteccion.

Un ensayo de proteolisis in vitro preferido para factor VIIa nativo (de tipo natural) y/o variante de factor VIIa se lleva a cabo en una placa de microtitulacion (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca), tal como se describe en el documento US 2007/0219135 (Novo Nordisk HealthCare A/G). Se incuban durante 15 min factor VIIa (10 nM) y factor X (0,8 |iM) en 100 |il de Hepes 50 mM, pH 7,4, que contiene NaCl 0,1 M, CaCl2 5 mM y albumina serica bovina 1 mg/ml. Entonces se detiene la escision de factor X mediante la adicion de 50 |il de Hepes 50 mM, pH 7,4, que contiene NaCl 0,1 M, EDTA 20 mM y albumina serica bovina 1 mg/ml. La cantidad de factor Xa generado se mide mediante adicion del sustrato cromogenico Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida (S-2765, Chromogenix, Suecia), concentracion final de 0,5 mM. Se mide la absorbancia a 405 nm de manera continua en una placa SpectraMax™ 340. La absorbancia desarrollada durante 10 minutos, tras la resta de la absorbancia de un pocillo de blanco que no contiene FVIIa, puede usarse para calcular la razon entre las actividades proteolfticas de factor VIIa de tipo natural y variante:

Razon = (A405 nm factor VII variante)/(A405 nm factor VIIa de tipo natural)

En una variacion de este ensayo, se determina FVII. Se incluye una tromboplastina. FVII en la muestra forma un complejo con iones Ca2+ y factor tisular que genera pequenas cantidades de FXa. El FXa activa FVII para dar FVIIa.

Un ensayo de actividad de FVII disponible comercialmente es el kit de reactivo de FVII HEMOCLOT, disponible de Aniara (Mason, OH), n.° de cat. ACK081K en el que se mide la coagulacion se desencadenada mediante una tromboplastina calcica.

Las variantes de factor VII que tienen una actividad biologica sustancialmente igual o mejorada en relacion con el factor VIIa de tipo natural abarcan las que presentan al menos aproximadamente el 25%, preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, mas preferiblemente al menos aproximadamente el 75% y lo mas preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de la actividad espedfica de factor VIIa que se ha producido en el mismo tipo de celula, cuando se somete a prueba en uno o mas de un ensayo de coagulacion, ensayo de proteolisis o ensayo de union a TF tal como se describio anteriormente. Las variantes de factor VII que tienen una actividad biologica

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sustancialmente reducida en relacion con el factor Vila de tipo natural son las que presentan menos de aproximadamente el 25%, preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, mas preferiblemente menos de aproximadamente el 5% y lo mas preferiblemente menos de aproximadamente el 1% de la actividad espedfica de factor Vila de tipo natural que se ha producido en el mismo tipo de celula cuando se somete a prueba en uno o mas de un ensayo de coagulacion, ensayo de proteolisis o ensayo de union a TF tal como se describio anteriormente. Las variantes de factor VII que tienen una actividad biologica sustancialmente modificada en relacion con factor VII de tipo natural incluyen, sin limitacion, variantes de factor VII que presentan actividad proteolftica de factor X independiente de TF y las que se unen a TF pero no escinden el factor X. Las variantes de factor VII, ya presenten una bioactividad sustancialmente igual o mejor que el factor VII de tipo natural, o, alternativamente, presenten una bioactividad sustancialmente modificada o reducida en relacion con el factor VII de tipo natural, incluyen, sin limitacion, polipeptidos que tienen una secuencia de aminoacidos que difiere de la secuencia de factor VII de tipo natural por insercion, delecion o sustitucion de uno o mas aminoacidos.

Los ejemplos no limitativos de variantes de factor VII que tienen sustancialmente la misma actividad biologica que el factor VII de tipo natural incluyen S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); variantes de factor VIla que presentan estabilidad proteolftica aumentada tal como se divulga en la patente estadounidense n.° 5.580.560; factor VIIa que se ha escindido proteolfticamente entre los residuos 290 y 291 o entre los residuos 315 y 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); formas oxidadas de factor VIIa (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); variantes de factor VII tal como se divulga en el documento PCT/DK02/00189; y variantes de factor VII que presentan estabilidad proteolftica aumentada tal como se divulga en el documento WO 02/38162 (Scripps Research Institute); variantes de factor VII que tienen un dominio Gla modificado y que presentan una union a la membrana potenciada tal como se divulga en el documento WO 99/20767 (University of Minnesota); y variantes de factor VII tal como se divulga en el documento WO 01/58935 (Maxygen ApS).

Los ejemplos no limitativos de variantes de factor VII que tienen una actividad biologica aumentada en comparacion en comparacion con factor VIIa de tipo natural incluyen variantes de factor VII tal como se divulga en los documentos WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, WO 03/27147, WO 03/37932; WO 02/38162 (Scripps Research Institute); y variantes de factor VIIa con actividad potenciada tal como se divulga en el documento Jp 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.). Los ejemplos no limitativos de variantes de factor VII que tienen una actividad biologica sustancialmente reducida o modificada en relacion con el factor VII de tipo natural incluyen RI 52E-FVIIa (Wild-goose et al., Biochem 29:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al, J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Hoist et al, Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998) y factor VIIa que carece del dominio Gla, (Nicolaisen et al, FEBS Letts. 317:245-249, 1993).

Tras la produccion de FVII, el polipeptido puede purificarse del medio. La purificacion de polipeptidos de factor VII puede implicar, por ejemplo, cromatograffa de afinidad en una columna de anticuerpo anti-factor VII (vease, por ejemplo, Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; y Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988) y activacion mediante escision proteolftica, usando factor Xlla u otras proteasas que tienen especificidad de tipo tripsina, tales como, por ejemplo, factor IXa, calicrema, factor Xa y trombina. Vease, por ejemplo, Osterud et al., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, patente estadounidense n.° 4.456.591; y Hedner et al., J. Clin. Invest. 71:1836 (1983). Alternativamente, el factor VII puede activarse haciendolo pasar a traves de una columna de cromatograffa de intercambio ionico, tal como Mono Q® (Pharmacia) o similar.

El factor VII o factor VII activado puede formularse y usarse de modos conocidos. Por ejemplo, puede usarse en el tratamiento de hemorragias en hemofflicos.

Cuando el metodo de la invencion tal como se define en las reivindicaciones se usa para producir factor VII, se prefiere que el sobrenadante de cultivo celular se mantenga a una temperatura que se establece a 36,5+0,2°C y lo mas preferiblemente 36,5°C y/o el pH se establezca a 7,20+0,05, preferiblemente 7,20+0,03, mas preferiblemente 7,29+0,01, lo mas preferiblemente 7,29; y/o el sobrenadante de cultivo celular tenga una concentracion de CO2 disuelto del 1 al 10%, preferiblemente del 4,0 al 9,0%, mas preferiblemente del 5,5 al 8,5%. Preferiblemente, al menos dos de estos parametros estan dentro de los ftmites preferidos, concretamente temperatura y pH, o temperatura y dCO2. Lo mas preferiblemente, los tres parametros se establecen dentro de los ftmites preferidos.

La presente invencion se ilustrara adicionalmente en los siguientes ejemplos, sin ninguna limitacion en la misma.

Ejemplo de referencia 1: Cultivo celular basico

Produccion de FVIII

Se establecieron cultivos ffpicos en biorreactores, usando un subclon de la ftnea de celulas CHO 10A1C6 transformada para que coexpresara factor VIII y factor de von Willebrand descrito en Kaufman et al (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1233-1242 y el documento US 5.250.421. Se obtuvo el subclon particular mediante adaptacion a un medio convencional que no contiene productos derivados de animales, y subclonacion en una microplaca.

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El medio de cultivo convencional es:

DMEM/F12 de Ham 50/50 11,76 g/kg

al que se le anadieron:

L-glutamina 0,6 g/kg

Etanolamina 1,53 mg/kg

Synperonic F68 0,25 g/kg

NaHCOa 2 g/kg

Peptona de soja 4 g/kg

CUSO4.5H2O 17,02 mg/kg

El medio DMEM/F12 de Ham 50/50 basal contiene Cu2+ 1,3 mg/kg suficiente para que el medio completo contenga 4,3 ppb de Cu2+.

Produccion de ADAMTS-13

Se transfectaron celulas CHO DUKX-B11 usando el metodo de coprecipitacion con fosfato de calcio, para introducir el gen de ADAMTS-13. Se cultivaron las celulas en condiciones de seleccion con neomicina y se seleccionaron tras el tratamiento con metotrexato y G418. Tras la adaptacion libre de suero, se subclonaron las celulas y se eligio el subclon 640-2 como clon de produccion.

El medio de cultivo convencional es un medio libre de suero, de insulina y de oligopeptidos basado en el medio divulgado en el documento US 2007/0212770 (Grillberger et al; Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.).

Produccion de furina

Se transfectaron celulas CHO DUKX-B11 usando el metodo de coprecipitacion con fosfato de calcio, para introducir el gen de furina. Se seleccionaron las celulas con medio DHFR sin hipoxantina, timidina y glicina. Se identifico el clon de produccion 488-3 mediante subclonacion y seleccion en medio que contema metotrexato 100 nM, seguido por adaptacion libre de suero.

Produccion de FVII

Se transfectaron celulas CHO DUKX-B11 con un vector bicistronico para permitir la coexpression de FVII y VKORC (complejo de vitamina K epoxido reductasa). La expresion genica esta dirigida por el promotor de CMV, y un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) esta ubicado entre el gen de FVII y el gen de VKORC. Se transfectaron las celulas usando el metodo de precipitacion con fosfato de calcio. El medio de seleccion contema higromicina B 200 |ig/ml. Se subclonaron las celulas en condiciones libres de suero y se eligio el subclon de alta expresion 1E9 como clon de produccion. Se selecciono 1E9 ya que tema propiedades ventajosas con respecto al crecimiento, la productividad y la estabilidad en condiciones de cultivo continuo. Se evaluo la estabilidad durante un periodo de dos meses en modo de quimiostato.

El medio de cultivo convencional se basa en el medio de cultivo divulgado en el documento US 6.936.441 (Baxter AG), y contiene, entre otros, peptona de soja 2,5 g/l e insulina 5 mg/l (Nucellin®; Eli Lilly o Novolin®, Novo Nordisk).

Procedimientos convencionales usados para la produccion de FVIII

Cultivo continuo de 51

Se preacondiciona el medio durante varias horas en un incubador de CO2 (el 5-15% de CO2) a 37°C. Para establecer el cultivo, se descongela al menos un vial de 1 ml (107 celulas CHO/ml) y se diluyen las celulas en 60 ml de medio preacondicionado en frascos Roux (200 ml) y se cultivan en el incubador de CO2 a 37°C. Tras aproximadamente 3 dfas, se anade el cultivo de 60 ml a 140 ml de medio nuevo en 1 frasco rotativo (1,8 l). Se burbujea el frasco rotativo con el 15% de CO2 y se cultiva a 37°C con rotacion. Tras dos dfas, se dividen las celulas 1/3 y se cultivan en 2 frascos rotativos en medio nuevo (200 ml de medio + 100 ml de cultivo = 300 ml por frasco rotativo). Tras dos o tres dfas adicionales, se dividen las celulas de nuevo 1/3 y se cultivan en un total de 6 frascos rotativos en medio nuevo tal como se describio anteriormente. Una vez que se alcanza la densidad celular requerida de aproximadamente 1 x 106 celulas/ml, se inocula el inoculo de 1800 ml en 3,2 l de medio que se habfa preacondicionado tal como se describio anteriormente, y se cultiva en el biorreactor de 5 l. En condiciones convencionales, se hace funcionar el biorreactor de 5 l a pH 7,2, una densidad celular de 1,4 x 106 celulas/ml y una temperatura de 37°C. En condiciones convencionales, se burbujea el cultivo con O2 que tiene un tamano de burbuja de 10 |im a una velocidad de 0,25 VVH (volumen de O2 por volumen de cultivo por hora).

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Acumulacion de inoculo en el biorreactor de 401

Se obtiene un conjunto de inoculo esencialmente tal como se describio anteriormente en relacion con el cultivo continuo de 5 l. Sin embargo, el conjunto es de aproximadamente 5 l, y se obtiene a partir de 18 en vez de 6 frascos rotativos. Se limpia el biorreactor bR-40 y se esteriliza antes de la operacion, y se transfieren aproximadamente 8 l de medio al BR-40 antes de la inoculacion. Se transfiere el conjunto de inoculo de aproximadamente 5 l desde el tanque de reunion hasta el biorreactor por medio de una lmea de transferencia hasta alcanzar un volumen de cultivo total de aproximadamente 13 l. Una vez que la densidad celular alcanza > 9x105 celulas/ml, se diluye el cultivo (1:3) con medio. Tras de 1 a 3 dfas mas, la concentracion celular alcanza de nuevo > 9x105 celulas/ml, y se lleva a cabo la transferencia del inoculo al biorreactor de 320 l.

Expansion en el biorreactor de 3201

Se limpia el biorreactor BR-320 y se esteriliza antes de la operacion, y se transfieren aproximadamente 80 l de medio al BR-320 antes de la inoculacion. Se transfiere el inoculo de aproximadamente 40 l desde el biorreactor BR- 40 hasta el biorreactor BR-320 por medio de una lmea de transferencia hasta alcanzar un volumen de cultivo inicial de aproximadamente 120 l. Una vez que la densidad celular alcanza > 9x105 celulas/ml, se diluye el cultivo (1:3) con medio. Tras de 3 a 6 dfas (tiempo total), la concentracion celular alcanza de nuevo > 9x105 celulas/ml, y se lleva a cabo la transferencia del inoculo al biorreactor de 2500 l.

Biorreactor de 25001

Acumulacion

El inoculo de aproximadamente 320 l se transfiere desde el biorreactor BR-320 hasta el BR1 por medio de una lmea de transferencia que ya contema aproximadamente 630 l de medio hasta alcanzar un volumen de cultivo inicial de aproximadamente 950 l. Una vez que la densidad celular alcanza > 9x105 celulas/ml, se diluye el cultivo (~1:3) con medio hasta un volumen final de aproximadamente 2500 l. Tras de 4 a 7 dfas (tiempo total), la concentracion celular alcanza de nuevo > 9x105 celulas/ml, y se transfieren aproximadamente 1150 l del inoculo desde el biorreactor BR1 hasta el BR2 que contiene aproximadamente 1350 l de medio. Tras la transferencia, se anaden aproximadamente 1150 l de medio al biorreactor BR1, hasta alcanzar un volumen de cultivo final de aproximadamente 2500 l.

Quimiostato

El modo de cultivo en “quimiostato” se inicia en cuanto la concentracion celular en cada biorreactor alcanza > 1,2x106 celulas/ml. Se anaden aproximadamente 1250 l de medio al dfa en un modo continuo a cada biorreactor. La concentracion celular es de entre 9x105 - 1,6x106 celulas/ml en cada biorreactor de 2500 l. Se almacenan multiples cosechas de aproximadamente 1250 lMa/biorreactor en bolsas esteriles a 2 - 8°C. El cultivo se mantiene durante aproximadamente 50-57 dfas en el modo de quimiostato. En condiciones convencionales, se establece el pH a 7,2, se establece la temperatura a 37°C y se burbujea el cultivo con O2 que tiene un tamano de burbuja de 10 |im a una velocidad de 0,02 VVH (volumen de O2 por volumen de cultivo por hora).

Tambien pueden aplicarse metodos de cultivo similares al cultivo de celulas CHO que expresan ADAMTS-13, furina o FVII.

Ejemplo 2: Efectos del cambio de diversos parametros sobre la productividad de FVIII

Se determino la productividad de FVIII del clon de celulas CHO que expresaba FVIII y vWF descrito en el ejemplo 1 en diversas condiciones de cultivo.

En experimentos separados, se hicieron variar el pH, la densidad celular y la temperatura en cultivo continuo a escala de 5 l. En cada caso, el experimento control uso pH 7,1, una densidad celular de 1,4 x106 celulas/ml y 37°C.

Cuando se aumento la densidad celular, la productividad volumetrica de FVIII (UI por litro por dfa), en relacion con el valor para una densidad celular de 1,2 x106 celulas/ml, aumento tal como sigue:

Densidad celular (x106 celulas/ml): Porcentaje de aumento de la densidad celular Aumento de la productividad (%)

1,2: - -

1,4: 17 43

1,6: 33 51

1,8: 50 65

2,0: 67 73

2,2: 83 74

2,4: 100 76

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

2,6_____________________117____________|_________49

Por tanto, pudo lograrse un aumento sustancial en la productividad aumentando la densidad celular. Esto no podna haberse predicho, puesto que el aumento de la densidad celular puede reducir la productividad por celula. Ademas, a determinadas densidades celulares, se encontro que el aumento en la productividad era mayor que el aumento en la densidad celular, lo que es incluso mas sorprendente.

Se aumento el pH hasta 7,2 alterando los parametros de burbujeo. En el recipiente de control a pH 7,1, se burbujeo el cultivo con O2 que tema un tamano de burbuja de 10 |im a una velocidad de 0,25 VVH (volumen de O2 por volumen de cultivo por hora). En el recipiente de prueba a pH 7,2, se burbujeo el cultivo con aire que tema un tamano de burbuja de 10 |im a una velocidad de 1,25 VVH (volumen de aire por volumen de cultivo por hora). Al aumentar el pH desde 7,1 hasta 7,2, la productividad pudo aumentarse en aproximadamente el 16%.

Al disminuir la temperatura desde 37°C hasta 36°C, la productividad aumento en aproximadamente el 22%.

Ejemplo 3: Influencia de la densidad celular y la concentracion de cobre sobre la productividad de FVIII

Se utilizo un cultivo control a pH 7,1, 37°C, 4 ppb de Cu2+ y una densidad celular de 1,4x106 celulas/ml.

Se ejecutaron cultivos comparativos a pH 7,2 y 36°C. En un cultivo se aumento la densidad celular hasta 1,6x106 celulas/ml y en otro se aumento hasta 2,0x106 celulas/ml. En un tercer cultivo, la densidad celular era de 2,0x106 celulas/ml y se aumento la concentracion de cobre desde 4 ppb hasta 6 ppb.

Resultados: Al reducir la temperatura, aumentar el pH y aumentar la densidad celular hasta 1,6 x106 celulas/ml (un aumento del 14%), la productividad de FVIII aumento en un 41-50%. Un aumento adicional de la densidad celular hasta 2,0x106 celulas/ml (43%) dio un aumento de la productividad (en comparacion con el cultivo control) del 3977%. Cuando el cobre en un cultivo de 2,0x106 celulas/ml se aumento hasta 6 ppb, la productividad (en comparacion con el cultivo de control) aumento en un 48-98%.

Por tanto, al elevar el pH ligeramente, disminuir la temperatura ligeramente, aumentar la densidad celular en solo un 43% y aumentar la concentracion de cobre en un 50%, la productividad de FVIII puede casi duplicarse.

Ejemplo 4: Influencia de la densidad celular y la concentracion de cobre sobre la productividad de vWF

Se repitio el ejemplo 3 pero se midio la productividad volumetrica de vWF. A 1,6 x106 celulas/ml y 4 ppb de cobre (36°C, pH 7,2), la productividad era del 124% del control. A 2,0 x106 celulas/ml y 6 ppb de cobre, la productividad era del 182%.

Por tanto, de nuevo pueden lograrse aumentos sustanciales en la productividad realizando cambios aparentemente pequenos en los parametros del proceso.

Ejemplo 5: Influencia de la densidad celular, pH y dCO?

En este experimento, la densidad celular se aumento desde 1,41x106 celulas/ml hasta 2,03x106 celulas/ml, el pH se aumento desde 7,1 hasta 7,2 y la concentracion de dCO2 se redujo desde el 9,5% hasta el 6,2%.

La productividad volumetrica de FVIII (UI por litro por dfa) aumento en un 98% y la productividad espedfica de FVIII (IU por millon de celulas por dfa) aumento en un 36%.

Ejemplo 6: Influencia del pH y la temperatura sobre la produccion de furina

Se cultivaron celulas CHO que expresaban furina en biorreactores de 2,5 l en modo quimiostatico. Se mantuvo la densidad celular a un promedio de entre 1,52x106 y 1,78x106 celulas/ml para cultivos individuales a lo largo de 5 dfas de cultivo. Se controlo el oxfgeno disuelto en todos los experimentos a un punto establecido del 20% de saturacion del aire. Se mantuvo la concentracion de CO2 disuelto entre el 5%-6% recubriendo el espacio de cabeza de los biorreactores con CO2.

Por medio del “metodo de diseno de experimentos”, se combinaron diferentes temperaturas con diferentes valores de pH para determinar las condiciones que daban como resultado una productividad volumetrica maxima de furina. Se combinaron cinco temperaturas con tres valores de pH segun la “matriz Doehlert”, dando como resultado siete

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

combinaciones de temperatura y pH tal como sigue:

Lote de fermentacion: Temp. (°C) pH

1: 35,1 7,20

2: 35,8 7,10

3: 35,8 7,30

4: 36,5 7,20

5: 36,5 7,20

6: 37,2 7,10

7: 37,2 7,30

8: 37,9 7,20

Se eligio la combinacion de 36,5°C y pH 7,20 como punto central, que se aplico a dos lotes de fermentacion (4 y 5 en la tabla anterior).

Los datos, incluyendo la productividad volumetrica y espedfica, y la tasa de crecimiento, se analizaron estadfsticamente con la metodologfa de superficie de respuesta (RSM), usando el software “Minitab”.

La temperatura, pero no el pH, influyo significativamente sobre la tasa de crecimiento, produciendose un maximo para la tasa de crecimiento a 36,5°C. Al disminuir la temperatura desde 37°C hasta 35,1°C, la productividad volumetrica pudo elevarse en aproximadamente 2,7 veces. Se observo una tendencia similar para la productividad espedfica. Esto es un resultado sorprendente, ya que podna haberse esperado que la productividad volumetrica maxima se observase a la temperatura a la que la tasa de crecimiento era maxima. La influencia del pH para la productividad volumetrica y espedfica era minoritaria en el intervalo investigado de 7,20 +/- 0,1. Se observo una productividad ligeramente superior en el intervalo de pH inferior de 7,15 +/-0,05 (o entre 7,10 y 7,20), por tanto se selecciono pH 7,15 como punto establecido para la produccion de furina.

Ejemplo de referencia 7: Influencia de dCO2 sobre la produccion de furina

Se llevaron a cabo dos rondas de fermentacion en paralelo en el modo de quimiostato en biorreactores de 2,5 l, una ronda con una concentracion de CO2 de aproximadamente el 7,5% y la otra con una concentracion de CO2 de aproximadamente el 12%. Se ajusto la concentracion de CO2 variando la fraccion de CO2 en el flujo de espacio de cabeza. Se llevaron a cabo las fermentaciones a 37°C, a un pH de 7,15 y con una pO2 del 20%. El recuento celular era de aproximadamente 1,07x106 celulas/ml a lo largo de 12 dfas en el cultivo con alta concentracion de CO2, y de 1,49x106 celulas/ml en el cultivo con baja concentracion de CO2.

La reduccion de la concentracion de CO2 desde el 12% hasta el 7,5% tuvo el efecto de aumentar la productividad volumetrica en aproximadamente 2,78 veces y la productividad espedfica en 2 veces. La tasa de crecimiento celular tambien era mas alta en el cultivo con baja concentracion de CO2.

Ejemplo 8: Influencia del pH y la temperatura sobre la produccion de FVII

Se cultivaron celulas CHO que expresaban FVII en biorreactores de 2,5 l en modo quimiostatico, en los que se mantuvo la densidad celular a un promedio de aproximadamente 2,5x106 celulas/ml (entre 2 x 106 y 3 x 106 celulas/ml) para cultivos individuales a lo largo de 4 semanas de cultivo. Se controlo el oxfgeno disuelto en todos los experimentos a un punto establecido del 20% de saturacion del aire. Se mantuvo la concentracion de CO2 disuelto entre el 4%-7% recubriendo el espacio de cabeza de los biorreactores con CO2.

Por medio del “metodo de diseno de experimentos”, se combinaron diferentes temperaturas con diferentes valores de pH para determinar las condiciones que dan como resultado una productividad volumetrica maxima de FVII. Se combinaron tres temperaturas con tres valores de pH segun la “matriz Doehlert”, dando como resultado cinco combinaciones de temperatura y pH tal como sigue:

Lote de fermentacion: Temp. (°C) pH

1: 36,0 7,15

2: 36,0 7,25

3: 36,5 7,20

4: 37,0 7,15

5: 37,0 7,25

La productividad cinetica volumetrica maxima media se logro a 36,5°C y un punto establecido del pH de 7,20. Hubo una interaccion positiva de los parametros, de manera que el resultado de la optimizacion de ambos parametros fue mayor que los efectos combinados de la optimizacion de cada parametro individualmente.

Ejemplo 9: Influencia de dCO? sobre la produccion de FVII

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Se sometio a prueba el efecto de cuatro concentraciones de CO2 diferentes (el 5,0, el 6,3, el 7,6 y el 8,9%) sobre la productividad de FVII en cultivo continuo a pequena escala.

Se cultivaron las celulas hasta el dfa ocho de quimiostato, y luego se transfirieron a biorreactores Rushton de 2,5 l y se cultivaron en condiciones continuas a pH 7,20 y 36,5°C durante casi cuatro semanas. Se analizaron los datos de solo las ultimas tres semanas debido al equilibrado necesario a las diferentes concentraciones de CO2 durante la primera semana. Se controlaron los niveles de CO2 mediante medicion fuera de lmea y adicion de CO2 al espacio de cabeza de los biorreactores.

Las densidades celulares registradas variaron desde 2,36x106 celulas/ml a un nivel de CO2 del 8,9% hasta 2,87x10 celulas/ml al 5,0%. Las tasas de crecimiento para el mismo intervalo son de 0,42 d y 0,49 d . El aumento de las tasas de crecimiento espedficas a un bajo nivel de CO2 se correlacionaba con productividades espedficas aumentadas. Los efectos combinados del CO2 sobre la tasa de crecimiento y la productividad espedfica dieron como resultado un efecto sustancial sobre la productividad volumetrica.

Una disminucion en la concentracion de CO2 desde el 8,9% hasta el 5% aumenta la tasa de crecimiento espedfica en un 17%, la productividad espedfica en un 10% y la productividad cinetica volumetrica en un 35%.

Ejemplo 10: Influencia de la temperatura y el pH sobre la produccion de ADAMTS-13

Se cultivaron celulas CHO transfectadas que expresaban ADAMTS-13 recombinante en cultivos en quimiostato en biorreactores de 1,5 l.

En un primer experimento, se establecieron el pH y la temperatura a diferentes puntos establecido en el intervalo de 36°C a 38°C y pH de 7,10 a 7,30. Se analizaron muestras del estado estacionario para determinar el recuento celular y la expresion de ADAMTS-13 mediante ELISA, y se midieron las tasas de dilucion a partir de los cultivos en quimiostato para calcular la tasa de crecimiento y la expresion volumetrica de ADAMTS-13. Una vez que se encontro que el optimo estaba en el intervalo externo del espacio de diseno, se establecio un segundo experimento con un intervalo de temperatura de desde 35° hasta 37°C y pH de 7,05 a 7,15, y se analizaron los datos del estado estacionario. Las densidades celulares oscilaban entre 1,17-1,71 x 106 celulas/ml. Se controlo el CO2 recubriendo el espacio de cabeza con CO2 hasta alcanzar una concentracion de CO2 disuelto del 4-6%.

Se normalizaron los datos de ambos experimentos y se analizaron usando el software estadfstico Minitab.

Se encontro que la tasa de crecimiento espedfica tema su optimo a pH 7,13 y 36,0°C usando un modelo cuadratico para el pH y la temperatura. El efecto de la temperatura sobre la tasa de crecimiento era debil.

Se encontro que la productividad volumetrica tema su optimo a pH 7,15 y 36,0°C. A pesar del efecto debil de la temperatura sobre la tasa de crecimiento, hubo un efecto relativamente fuerte de la temperatura sobre la productividad volumetrica.

Suponiendo una temperatura constante de 37°C, el efecto de la elevacion del pH desde 7,10 hasta 7,15 era un aumento de la productividad volumetrica en un 10%. Suponiendo un pH constante de 7,10, el efecto de la disminucion de la temperatura desde 37°C hasta 36°C era un aumento de la productividad volumetrica en un 14%. El efecto global del cambio de las condiciones desde pH 7,10 y temperatura de 37°C hasta pH 7,15 y temperatura de 36°C era un aumento de la productividad volumetrica en un 24%.

Claims

2.

10
3.

15 4.
5.

20
6.

25 7.
8.

30
9.
10. 35
11.

40 12.
13. 45
14.

50
15.

REIVINDICACIONES

Un metodo de cultivo de celulas de mai^eras que secretan protemas heterologas en un sobrenadante de cultivo celular, en el que el sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una temperatura que se establece a 36+0,9°C, en el que el cultivo celular es un cultivo continuo mantenido a una densidad de 1,4x106 a 2,8x106 celulas/ml, y en el que la celula de mairnfero es una celula CHO.

El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la temperatura se establece a 36+0,5°C, 36+0,2°C, 36°C o 36,5°C.

El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el sobrenadante de cultivo celular se mantiene a un pH que se establece a X+0,05 en el que X tiene un valor de desde 7,15 hasta 7,20, con la condicion de que el pH se establezca a mas de 7,10.

El metodo segun la reivindicacion 3, en el que el pH se establece a 7,20+0,05, 7,20+0,03, 7,20+0,01, 7,20, 7,15+0,05, 7,15+0,03, 7,15+0,01 o 7,15.

El metodo segun cualquier reivindicacion anterior, en el que el sobrenadante de cultivo celular tiene una concentracion de CO2 disuelto del 1 al 10%, tal como en el que la concentracion de CO2 es del 4,0 al 9,0% o del 5,5 al 8,5%.

El metodo segun cualquier reivindicacion anterior, en el que el sobrenadante de cultivo celular se tampona con bicarbonato o en el que el sobrenadante se burbujea con aire.

El metodo segun cualquier reivindicacion anterior, en el que la densidad celular es de 1,4 x106 a 2,8x106 celulas/ml, de 1,6 x 106 a 2,6x106 celulas/ml o de 1,8x106 a 2,4x106 celulas/ml.

El metodo segun cualquier reivindicacion anterior, en el que la protema heterologa es una protema de la sangre.

El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la protema heterologa es el factor VIM.

El metodo segun la reivindicacion 9, en el que el factor VIII se expresa conjuntamente con el factor de von Willebrand.

El metodo segun cualquier reivindicacion anterior, en el que la concentracion de Cu2+ en el sobrenadante de cultivo celular es de al menos 5 ppb, tal como al menos 7, 10, 15 o 25 ppb.

El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la protema heterologa es ADAMTS- 13, furina o factor VII.

El metodo segun cualquier reivindicacion anterior, en el que el cultivo continuo es un cultivo en quimiostato o turbidostato.

El metodo segun la reivindicacion 1, en el que las celulas de mamfferos que secretan protemas heterologas secretan el factor VIII y las celulas de mamfferos que secretan el factor VIII se cultivan en un recipiente que comprende un sobrenadante de cultivo celular en el que la densidad de las celulas en el sobrenadante de cultivo celular se mide mediante un sensor en lmea y la entrada de medio nuevo en el recipiente se controla de manera automatica con el fin de mantener la densidad de las celulas en un intervalo deseado.

El metodo segun la reivindicacion 9, en el que el cultivo celular se mantiene a una temperatura que se establece a 36+0,9°C, preferiblemente 36+0,5°C, mas preferiblemente 36+0,2°C y lo mas preferiblemente 36°C, y/o el pH se establece a 7,20+0,05, preferiblemente 7,20+0,03, mas preferiblemente 7,20+0,01, lo mas preferiblemente 7,20, y/o el sobrenadante de cultivo celular tiene una concentracion de CO2 disuelto del 1 al 10%, preferiblemente del 4,0 al 9,0%, mas preferiblemente del 5,5 al 8,5%.