JP4740138B2 - 真核生物細胞におけるポリペプチドの大規模生産方法及びそれに適した培養容器 - Google Patents
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Description
本発明の一つの側面は、培養液中に含まれる真核生物細胞中のポリペプチドの大規模生産方法に関する。本方法の特徴は、塩基の添加の必要性を減少するか又は排除するために、CO2及びpHの制御のため、該培養液を通してエアーを一定に又は断続的にスパージングすることである。
溶解CO2のモニターされた濃度が濃度設定値-5mmHgに等しいとき、培養液1L当たり0.000-0.005 L/分の範囲、例えば約0.0 L/分であり;及び
溶解CO2のモニターされた濃度が濃度設定値+5mmHgに等しいとき、培養液1L当たり0.010-0.100 L/分の範囲、例えば0.030-0.070 L/分、例えば約0.040-0.060 L/分である。
本発明はまた、本発明の方法のために特に有用な培養溶液をも提供する。
本発明は、内在性遺伝子からか、或いはタンパク質をコードする組換え遺伝子のそのような細胞への導入に続いて、興味のあるタンパク質の一以上を発現する真核生物細胞の改善された大規模培養に適切な方法に関する。そのようなタンパク質には、これらに限定されないが、VII因子ポリペプチド;VIII因子;IX因子;X因子;タンパク質C;組織因子;レンニン;ヒト成長ホルモンを含む成長ホルモン;ウシ成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;アルファ-1-アンチトリプシン;インスリンA-鎖;インスリンB-鎖;プロインスリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;心房性ナトリウム利尿因子;肺サーファクタント(lung surfactant);ウロキナーゼ又はヒト尿のようなプラスミノーゲン活性化因子又は組織型プラスミノーゲン活性化因子(t-PA);ボンベシン;トロンビン;造血性成長因子;腫瘍壊死因子-アルファ及びベータ;エンケファリナーゼ;ヒトマクロファージ炎症性タンパク(MIP-1-アルファ);ヒト血清アルブミンのような血清アルブミン;ミュラー-阻害物質;リラキシンA-鎖;リラキシンB-鎖;プロリラキシン;マウス性腺刺激ホルモン-付随ペプチド;ベータ-ラクタマーゼのような微生物タンパク質;DNA分解酵素;インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子(VEGF);ホルモン又は成長因子のレセプター;インテグリン;タンパク質 A 又は D;リウマチ様因子;骨組織-由来神経栄養性因子(BDNF)のような神経栄養性因子、ニューロトロフィン-3, -4, -5, 又は -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 又は NT-6)、又はNGF-β血小板-由来成長因子(PDGF)のような神経成長因子;α-FGF 及び β-FGFのような線維芽細胞成長因子;上皮細胞成長因子(EGF); TGF-アルファ 及び TGF-ベータのようなトランスフォーミング成長因子(TGF)、インスリン様成長因子-I 及び -II (IGF-I 及び IGF-II); CD-3, CD-4, CD-8, 及び CD-19 のようなCD タンパク質;エリスロポエチン;骨誘導(osteoinductive)因子;イムノトキシン;骨形成タンパク質(BMP);インターフェロン-アルファ、-ベータ、及び-ガンマのようなインターフェロン;コロニー刺激因子(CSFs)、例えば、M-CSF, GM-CSF, 及びG-CSF;インターロイキン(ILs)、例えば、IL-1からIL-10;スーパーオキシドジスムターゼ;T-細胞レセプター;表面膜タンパク質;崩壊促進因子;例えばAIDSエンベロープ部分のようなウイルス性抗原;輸送タンパク質;ホーミングレセプター;アドレッシン(addressin);調節タンパク質;抗体;及び上記ポリペプチドの任意の配列変異体及び断片、が含まれる。
本発明の実施において、前記細胞は真核生物細胞であり、より好ましくは、これらに限定されないが、CHO (例えば、ATCC CCL 61)、COS-1 (例えば、ATCC CRL 1650)、ベビー・ハムスター・腎臓(BHK)、及びHEK293 (例えば、ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977)細胞株を含む確立された真核生物細胞株である。好ましいBHK細胞株は、tk- ts13 BHK細胞株であり(Waechter and Baserga, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1106-1110, 1982)、これ以後、BHK 570細胞と称する。BHK 570細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852から、ATCC アクセッションナンバーCRL 10314で入手可能である。tk- ts13 BHK細胞株も、ATCCから、アクセッションナンバーCRL 1632で入手可能である。好ましいCHO細胞株は、CHO K1細胞株であり、ATCCからアクセッションナンバーCCl61で入手可能である。
本発明の方法は、典型的には、攪拌された培養容器中で行われ、好ましくはマイクロキャリアに基づく処理タイプが用いられる。マイクロキャリアに基づく処理において、細胞は、該キャリア(マクロ孔質キャリア)の内部構造中へ移動し、或いは、キャリア(固体キャリア)の表面へ接着するか、或いはその両方である。マイクロキャリアに基づく処理において、真核生物細胞、マイクロキャリア及び培養培地は、培養容器に初めに供給される。以降の日々において、培養容量が開始時から容器の最終動作容量にならない場合、さらなる培養培地が与えられることができる。続く期間の間、培養が最終的に終了するまで、生産物含有培養上清の定期的な収集及び新しい培地との交換が行われる。生産物含有上清の収集の間、攪拌(agitation)、例えば培養物の攪拌(stirring)は停止され、細胞含有キャリアは、生産物含有培養培地の一部が除去されるのに続いて沈降させられる。
さらなるダウンストリーム処理のための生産物含有培養上清の定期的な収集を行う生産段階に達する前に、細胞は、問題の特定の細胞に適し得る任意のスキーム又はルーチンに従って増殖される。増殖段階は、単一工程又は複数工程方法であってよい。単一工程増殖方法において、細胞は、貯蔵から除去されて該増殖が行われるマイクロキャリアを含む培養容器に直接接種される。複数工程増殖方法において、細胞は、貯蔵から除去されて、生産が行われるマイクロキャリアを含む最終的な培養容器に到達するまで、次第にサイズが増大する多くの培養容器を通して増殖される。増殖工程の間、細胞は、成長に最適な条件下で成長する。培養条件、例えば温度、pH、溶解酸素張力などは、特定の細胞に最適であると知られているものであり、当業者及び当該分野の技術者には明らかである(例えば、「Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood, D. and Hames, B.D., eds., Oxford University Press, New York (1992)」を参照されたい。)
一つのアプローチにおいて、細胞培養プロセスは、一つの培養容器中で操作される:細胞は、生産が行われるマイクロキャリアを含む培養容器中に直接接種される;細胞は、適切な細胞密度に達するまで増殖され、生産段階が開始される。
本発明の方法は、主に生産段階に興味があるが、所望の場合は、増殖段階のために利用されることもできる(表1を参照されたい)。
ここで用いられるように、マイクロキャリアは、懸濁液培養物(細胞に著しい剪断ダメージを与えない攪拌速度での)中で用いられることが可能であるよう十分小さい粒子である。それらは固体、多孔質であり、或いは、表面に多孔質コーティングを有する固体コアを有する。マイクロキャリアは、例えば、これらに限定されないが、セルロース又はデキストランに基づくものであってよく、それらの表面(多孔質キャリアの場合は外部及び内部の表面)は、正に帯電していてもよい。さらなる詳細は、WO 02/29083に開示されている。
ここで用いられるように、大規模培養容器は、少なくとも約100Lの容量を有し、好ましくは少なくとも約500L、より好ましくは少なくとも約1000L、及び最も好ましくは少なくとも約5000Lの容量を有する。細胞培養プロセスが少なくとも二つの異なる培養容器で操作される場合、そのような一以上の播種培養容器(第一の増殖段階)は、生産培養容器(生産段階に続く最後の増殖段階)が続き、次いで、該プロセスは、典型的には、約50Lの増殖された播種培養物(約1.0 x 106 cells/mLを有する)を、150Lの培養培地を含有する500Lの培養容器に移動することを含む。大規模培養は、例えば温度、pH,溶解酸素張力(DOT)及び攪拌速度などの適切な条件下で維持され、その容量は、培養容器に培地を追加することによって次第に増加される。マイクロキャリアプロセスの場合、培養容器もまた、1〜10 g/Lの範囲の最終マイクロキャリア濃度に対応する量のマイクロキャリアを含む。移動の後、細胞は典型的には、最初の24時間以内にキャリアの表面或いはキャリアの内部へ移動する。
「細胞培養培地」及び「培養培地」(或いは単に「培地」)という語は、以下のカテゴリーの一以上から少なくとも一つの成分を典型的に提供する、真核生物細胞を成長させるために用いられる栄養溶液を指す:(1)培地の重量モル浸透圧濃度に寄与する、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、及びカルシウム等の塩;(2)通常グルコースのような糖の形体であるエネルギー源;(3)全ての必須アミノ酸、及び通常の20アミノ酸の基本セット;(4)低濃度で必要なビタミン及び/又は他の有機成分;及び(5)微量元素、ここにおいて、微量元素は、典型的には極めて低い濃度、通常はマイクロモーラーの範囲で必要とされる無機成分として定義される。栄養溶液は、任意に、次のカテゴリーの任意のものから一以上の成分を補充されてもよい: (a) 動物血清; (b) ホルモン及び他の成長因子、例えば、インスリン、トランスフェリン、及び上皮成長因子;及び(c) タンパク質及び組織の加水分解産物。
一旦、培地が培養容器から除去されれば、それは所望のタンパク質を得るための一以上の処理工程に供され、これらに限定されないが、キャリアに固定化されていない細胞を除去するための遠心分離又は濾過;親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー;イオン交換クロマトグラフィー;サイズ排除クロマトグラフィー;電気泳動的方法(例えば、分取等電点電気泳動(IEF))、示差溶解性(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)、或いは抽出等が含まれる。一般には、「Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982」;及び「Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989」を参照されたい。
一般的な方法
VII因子ポリペプチドの生物学的活性の測定に適したアッセイ
本発明に従って有用なVII因子ポリペプチドは、簡単な予備的インビトロ試験として行うことができる適切なアッセイによって選択され得る。例として、本発明の明細書は、VII因子ポリペプチドの活性のための簡単な試験(「インビトロ加水分解アッセイ」と題する)を記載する。
天然の(野生型)VIIa因子及びVII因子ポリペプチド(何れもこれ以後、「VIIa因子」と称す)の比活性がアッセイされ得る。それらは、同時にアッセイされてそれらの比活性が直接比較され得る。アッセイは、マイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, Denmark)で行われる。色素生産性基質D-Ile-Pro-Arg-p-ニトロアニリド(S-2288, Chromogenix, Sweden)、最終濃度 1 mMを、0.1 M NaCl、5 mM CaCl2 及び1 mg/mL ウシ血清アルブミンを含む50 mM HEPES、pH 7.4中のVIIa因子(最終濃度100 nM)に添加する。405 nmでの吸光度を、SpectraMaxTM 340 プレートリーダー(Molecular Devices, USA)で連続的に測定する。20分のインキュベーションの間に発達した吸光度は、酵素を含まないブランクウェルでの吸光度を減算した後、VII因子ポリペプチドと野生型VIIa因子の活性の間の比を算出するために用いられる:
比 = (A405 nm VII因子ポリペプチド)/(A405 nm VIIa因子野生型)。
天然の(野生型)VIIa因子及びVII因子ポリペプチド(何れもこれ以後「VIIa因子」と称する)を同時にアッセイし、それらの比活性が直接比較される。このアッセイは、マイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, Denmark)で行われる。0.1 M NaCl, 5 mM CaCl2 及び 1 mg/mL ウシ血清アルブミンを含有する100 μL の50 mM HEPES, pH 7.4中の、VIIa因子(10 nM) 及び X因子(0.8 microM)を、15分インキュベートする。次いで、X因子の切断を、0.1 M NaCl, 20 mM EDTA 及び 1 mg/mL ウシ血清アルブミンを含む50 μL 50 mM HEPES, pH 7.4を添加して停止する。生成したXa因子の量は、色素生産性基質Z-D-Arg-Gly-Arg-p-ニトロアニリド(S-2765, Chromogenix, Sweden)を最終濃度 0.5 mMで添加することによって測定される。405 nmでの吸光度を、SpectraMaxTM 340 プレートリーダー(Molecular Devices, USA)で連続的に測定する。10分の間に発達した吸光度は、FVIIaを含まないブランクウェルでの吸光度を減算した後、VII因子ポリペプチドと野生型VIIa因子のタンパク分解活性の間の比を算出するために用いられる:
比 = (A405 nm VII因子ポリペプチド)/(A405 nm VIIa因子野生型)。
次の実験を、試験的な大規模培養でVII因子を生産するために行った。
Claims (13)
- 培養液中に1〜12 × 106 細胞/mLの細胞密度で含まれる真核生物細胞中のポリペプチドの、少なくとも100 Lの培養容器を伴う大規模生産のための方法であって、該方法は、該培養液中の溶解CO2 の濃度をモニタリングすること、及び、該培養液を通して一定に又は断続的にエアーをスパージングすることを含み、ここで、該エアーのスパージング速度は、前記培養液中の溶解CO2 のモニターされた濃度に関連して制御され、前記エアーは、前記培養液中の溶解CO 2 の濃度が、前記濃度のための設定値を含む80-200 mmHgの範囲内に維持されるのに十分な速度でスパージングされ、塩基が前記培養液に添加されていないことを特徴とする方法。
- 前記培養液中の溶解 CO2 の濃度設定値が、100-180 mmHgの範囲の値である、請求項1に記載の方法。
- 前記エアーのスパージング速度が、培養液1L当たり0.000-0.100 L/分の範囲である、請求項2に記載の方法。
- 前記エアーのスパージング速度が、モニターされた溶解CO2濃度が濃度設定値に等しいとき、培養液1L当たり0.005-0.020 L/分の範囲である、請求項3に記載の方法。
- 請求項4に記載の方法であって、前記エアーのスパージング速度が、
溶解CO2のモニターされた濃度が濃度設定値−5mmHgに等しいとき、培養液1L当たり0.000-0.005 L/分の範囲であり;
溶解CO2のモニターされた濃度が濃度設定値+5mmHgに等しいとき、培養液1L当たり0.010-0.100 L/分の範囲であることを特徴とする方法。 - 請求項1〜5の何れか1項に記載の方法であって、前記培養液に加えられる任意の固体又は液体物質の何れも、該培養液中で7.5以上の局所的なpH値の上昇をあたえないことを特徴とする方法。
- 前記ポリペプチドが、VII因子ポリペプチドである、請求項1〜6の何れか1項に記載の方法。
- 培養液中に1〜12 × 10 6 細胞/mLの細胞密度で含まれる真核生物細胞中のポリペプチドの、少なくとも100 Lの培養容器を伴う大規模生産のための方法であって、該方法は、前記培養液中の溶解CO2 の濃度を、該濃度のための設定値を含む80-200 mmHgの範囲内に維持するのに十分な速度で、該培養液を通してエアーを一定に又は断続的にスパージングすることを含み、ここで、塩基が前記培養液に添加されておらず、該培養液に加えられる任意の固体又は液体物質の何れも、該培養液中で7.5以上の局所的なpH値の上昇を与えないことを特徴とする方法。
- 前記エアーのスパージング速度は、培養液1L当たり0.000-0.070 L/分の範囲である、請求項8に記載の方法。
- 前記培養液中の溶解CO2 の濃度がモニターされることを特徴とする、請求項8〜9の何れか1項に記載の方法。
- 前記エアーのスパージング速度が、モニターされた溶解CO2濃度が濃度設定値に等しいとき、培養液1L当たり0.005-0.020 L/分の範囲である、請求項10に記載の方法。
- 請求項11に記載の方法であって、前記エアーのスパージング速度が、
溶解CO2のモニターされた濃度が濃度設定値−5mmHgに等しいとき、培養液1L当たり0.000-0.005 L/分の範囲であり;
溶解CO2のモニターされた濃度が濃度設定値+5mmHgに等しいとき、培養液1L当たり0.010-0.100 L/分の範囲であることを特徴とする方法。 - 前記ポリペプチドが、VII因子ポリペプチドである、請求項8〜12の何れか1項に記載の方法。
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