CN115927250A - 第256位点突变的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体及其应用 - Google Patents
第256位点突变的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了第256位点突变的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体及其应用。该突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示，是由疏棉状嗜热丝孢菌野生型脂肪酶的第256位氨基酸位脯氨酸分别突变为丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸或谷氨酸时所得，相比野生型脂肪酶，最适温度显著提升，除突变为谷氨酸的脂肪酶突变体外，热耐受后的相对酶活也均有提高，表明所得的突变体均具有较理想的耐热性，热稳定性显著提高，为工业应用鉴定了基础，具有显著的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，具体涉及第256位点突变的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)具有水解甘油三酯为游离脂肪酸和甘油的功能，同时能催化酯合成、酯交换、酸解、氨解和醇解等反应。其功能的多样性决定了脂肪酶在食品加工、饲料、有机合成、精细化工和生物柴油等领域用途广泛。由于工业应用环境的需要，对脂肪酶的耐高温特性的要求越来越高，但常规脂肪酶的耐高温特性均较弱。因此，需要设计一款具有耐高温特性优良的脂肪酶，以满足工业化应用的需要。
疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一种具有生长温度上限高、嗜热等特性的真菌，广泛存在自然界中。其所含的脂肪酶也具有相对较好的耐热性，并被广泛地应用于各个工业领域。但目前，来源于T.lanuginosus脂肪酶的耐高温特性仍难以完全满足工业应用的需要。
发明内容
本发明的目的是提供第256位点突变的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，为解决野生型脂肪酶高温耐受性差的问题，弥补现有的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在工业生产应用中的局限性，为脂肪酶的工业化应用提供基础。
为了达到上述目的，本发明提供了第256位点突变的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示，具体分别如下所示：
其中，氨基酸序列如SEQ ID NO.2的脂肪酶突变体P256A是由氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的野生型疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶中第256位脯氨酸(P)突变为丙氨酸(A)而获得，该突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其最适温度相比野生型脂肪酶提高了10℃，其在80℃耐受60min相对剩余酶活为59.98％；
氨基酸序列如SEQ ID NO.3的脂肪酶突变体P256I是由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶中第256位脯氨酸(P)突变为丙氨酸(I)而获得，该突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，其最适温度相比野生型脂肪酶提高了5℃，其在80℃耐受60min相对剩余酶活为64.25％；
氨基酸序列如SEQ ID NO.4的脂肪酶突变体P256K是由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶中第256位脯氨酸(P)突变为丙氨酸(K)而获得，该突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，其最适温度相比野生型脂肪酶提高了10℃，其在80℃耐受60min相对剩余酶活为55.69％；
氨基酸序列如SEQ ID NO.5的脂肪酶突变体P256E是由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶中第256位脯氨酸(P)突变为丙氨酸(E)而获得，该突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，其最适温度相比野生型脂肪酶提高了10℃，其在80℃耐受60min相对剩余酶活为42.24％；
其中野生型脂肪酶的最适温度为40℃，其在80℃耐受60min相对剩余酶活为43.28％。
本发明还提供了一种包含上述脂肪酶突变体的编码基因的重组载体。
本发明还提供了一种包含上述脂肪酶突变体的编码基因的表达菌。
本发明还提供了一种上述脂肪酶突变体的制备方法，包含如下步骤：
S1.将核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的野生型脂肪酶编码基因和表达载体相连接，获得包含野生型脂肪酶编码基因的重组载体；
S2.以S1中所得的重组载体为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12、SEQ IDNO.13～14、SEQ ID NO.15～16或SEQ ID NO.17～18所示的四对位点突变引物分别进行突变扩增，获得包含脂肪酶突变体编码基因的重组表达质粒；
S3.将S2所得的重组表达质粒转入表达菌中，表达并纯化，得到脂肪酶突变体。
优选地，上述制备方法中的表达载体为pPIC9K。
优选地，上述制备方法中的表达菌为GS115酵母菌。
本发明提供的的制备方法可被应用于制备脂肪酶突变体中。
本发明提供的脂肪酶突变体可被应用于食品加工领域中，尤其可应用于食品发酵。
本发明的第256位点突变的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体及其应用，解决了野生型脂肪酶高温耐受性差的问题，具有以下优点：
本发明提供的脂肪酶突变位点，该位点突变的脂肪酶突变体P256A、P256I、P256K、P256E与野生型脂肪酶在高温下耐受经实验证明，突变后的最适温度均高于野生型，突变后的相对剩余酶活均高于野生型。突变体P256A、P256I、P256K、P256E的最适温度为50℃、45℃、50℃、50℃，相比野生型脂肪酶的最适温度来说，最适温度分别提高10℃、5℃、10℃、10℃。突变体P256A、P256I、P256K、P256E的Tm值测定分别为94.23℃、95.66℃、95.45℃、95.84℃。突变体P256A、P256I、P256K、P256E在80℃下耐受60min后相对酶活剩余59.98％、64.25％、55.69％、42.24％，相比野生型脂肪酶的来说P256A、P256I、P256K在80℃下耐受60min后相对酶活提高16.70％、20.97％、12.41％，而P256E在80℃下耐受60min后相对酶活相比野生型脂肪酶的来说差异较小(降低了1.04％)。表明最适温度提高后，脂肪酶突变体P256A、P256I、P256K、P256E的热稳定性相比野生型达到了意想不到的效果，填补了脂肪酶在工业生产应用中的局限性，为脂肪酶的工业化应用提供了多层保障基础。
附图说明
图1为本发明的野生型脂肪酶与其突变体P256A的最适温度测定图。
图2为本发明的野生型脂肪酶与其突变体P256A的温度耐受测定图。
图3为本发明的野生型脂肪酶与其突变体P256I的最适温度测定图。
图4为本发明的野生型脂肪酶与其突变体P256I的温度耐受测定图。
图5为本发明的野生型脂肪酶与其突变体P256K的最适温度测定图。
图6为本发明的野生型脂肪酶与其突变体P256K的温度耐受测定图。
图7为本发明的野生型脂肪酶与其突变体P256E的最适温度测定图。
图8为本发明的野生型脂肪酶与其突变体P256E的温度耐受测定图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实验例中用到的实验材料和试剂如下：
1、菌株和载体：含有野生型疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的重组菌株和GS115酵母表达菌株由云南师范大学酶工程重点实验室提供，其中，野生型脂肪酶的基因是连接在质粒pPIC9K中的，而该重组菌株是转入了连接基因的重组载体；pPIC9K表达载体购于美国Invitrogen公司；DMT克隆菌株，购于北京全式金生物公司。
2、主要试剂：定点突变试剂盒Fast Mutagenesis System(购于北京全式金生物公司)；质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I(购于美国Omega公司)。
3、主要培养基：
LB培养基：0.5％酵母粉，1％蛋白胨，1％Nacl，pH自然(约为7)，固体培养基在此基础上加2％(w/v)琼脂。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实验例1脂肪酶突变体的制备
(1)采用质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I，从含有野生型疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的重组菌株中提取含有野生型脂肪酶基因的重组质粒pPIC9K，根据核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的野生型脂肪酶基因序列设计如下所示的四对突变引物，分别采用四对突变引物利用定点突变试剂盒Fast Mutagenesis System对提取的重组质粒pPIC9K进行定点突变扩增，其中，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的野生型脂肪酶基因所对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述的四对突变引物序列如下(均为5’→3’)：
F-P256A(SEQ ID NO.11):
CCTAACATTCCTGATATCGCTGCCCACCTATG；
R-P256A(SEQ ID NO.12):
AGCGATATCAGGAATGTTAGGCTGGTTGTTTCC；
F-P256I(SEQ ID NO.13):
CCTAACATTCCTGATATCATTGCCCACCTATG；
R-P256I(SEQ ID NO.14):
AATGATATCAGGAATGTTAGGCTGGTTGTTTCC；
F-P256K(SEQ ID NO.15):
CCTAACATTCCTGATATCAAGGCCCACCTATG；
R-P256K(SEQ ID NO.16):
CTTGATATCAGGAATGTTAGGCTGGTTGTTTCC；
F-P256E(SEQ ID NO.17):
CCTAACATTCCTGATATCGAGGCCCACCTATG；
R-P256E(SEQ ID NO.18):
CTCGATATCAGGAATGTTAGGCTGGTTGTTTCC；
PCR反应体系如下：
PCR反应参数如下：
94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环后72℃保温10min。
其中，引物对F-P256A和R-P256A可将核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的野生型脂肪酶基因通过扩增突变为核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的脂肪酶突变基因。
引物对F-P256I和R-P256I可将核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的野生型脂肪酶基因通过扩增突变为核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的脂肪酶突变基因。
引物对F-P256K和R-P256K可将核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的野生型脂肪酶基因通过扩增突变为核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的脂肪酶突变基因。
引物对F-P256E和R-P256E可将核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的野生型脂肪酶基因通过扩增突变为核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的脂肪酶突变基因。
(2)四对引物分别扩增完成后，将扩增产物采用热激法分别转入DMT感受态中，并涂布至带抗性的LB培养皿上，于37℃培养箱中过夜培养。
(3)次日随机挑取平板上的单菌落，将选取的单菌落分别标记后送测序，选取测序比对成功的记为突变成功的单菌落，即获得了可分别表达上述四种脂肪酶突变体的菌株。
(4)常规培养上述四种脂肪酶突变体菌株，提取其重组质粒，将重组质粒电转化入宿主菌GS115中进行异源表达，纯化得到脂肪酶突变体。其中脂肪酶突变体P256A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，脂肪酶突变体P256I的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，脂肪酶突变体P256K的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，脂肪酶突变体P256E的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。
实验例2脂肪酶最适温度的测定
依据脂肪酶酶活测定方法测定野生型脂肪酶(TLL)和实验例1所得的四个脂肪酶突变体(P256A、P256I、P256K、P256E)的最适温度，在最适pH条件下，将反应体系置于不同温度(30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃)下反应。
脂肪酶突变体酶促反应的最适温度如图1、图3、图5、图7所示，可知，疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体P256A、P256I、P256K、P256E的最适温度分别为50℃、45℃、50℃、50℃，相比野生型脂肪酶的最适温度来说，最适温度提高10℃、5℃、10℃、10℃。突变体P256A、P256I、P256K、P256E的Tm值测定分别为94.23℃、95.66℃、95.45℃、95.84℃。与野生型脂肪酶Tm值相比相差较小甚至比它大。
实验例3脂肪酶温度耐受测定
将酶液稀释到相应倍数，然后放在80℃下耐受1min、3min、5min、7min、10min、15min、20min、25min、30min、45min、60min，之后按照脂肪酶酶活测定方法在最适pH和最适温度下反应，测定野生型脂肪酶(TLL)和四个脂肪酶突变体(P256A、P256I、P256K、P256E)的耐受性。
高温下脂肪酶的温度耐受情况如图2、图4、图6、图8所示，可知，随着时间的增加，脂肪酶的相对酶活也逐渐下降，突变体P256A、P256I、P256K、P256E在80℃下耐受60min后相对酶活分别剩余59.98％、64.25％、55.69％、42.24％。相比野生型脂肪酶的来说，突变体P256A、P256I以及P256K在80℃下耐受60min后相对酶活分别提高了16.70％、20.97％、12.41％，P256E在80℃下耐受60min后相对酶活降低了1.04％。表明最适温度提高后，脂肪酶突变体P256A、P256I、P256K的热稳定性与野生型相比达到了意想不到的结果，而这种热稳定性提高的脂肪酶突变体可被应用于工业化生产中，包括用于食品发酵、有机合成等，具有巨大的应用价值。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (9)
1.第256位点突变的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，其特征在于，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
2.如权利要求1中所述脂肪酶突变体的编码基因，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的突变体，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示的突变体，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示的突变体，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示的突变体，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
3.包含如权利要求3所述编码基因的重组载体。
4.包含如权利要求3所述编码基因的表达菌。
5.一种如权利要求1所述脂肪酶突变体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
S1.将核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的野生型脂肪酶编码基因和表达载体相连接，获得包含所述野生型脂肪酶编码基因的重组载体；
S2.以步骤S1中所得的重组载体为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12、SEQ IDNO.13～14、SEQ ID NO.15～16或SEQ ID NO.17～18所示的四对位点突变引物分别进行突变扩增，获得包含突变体编码基因的重组表达质粒；
S3.将S2所得的重组表达质粒转入表达菌中，表达并纯化，得到如权利要求1所述的脂肪酶突变体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的表达载体为pPIC9K。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的表达菌为GS115酵母菌。
8.如权利要求1所述的脂肪酶突变体在食品加工领域中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的食品加工包括食品发酵。
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