CN101784662B

CN101784662B - 用于改善蛋白质特性的方法

Info

Publication number: CN101784662B
Application number: CN200880101988.3A
Authority: CN
Inventors: W·埃赫勒; L·G·卡斯康-佩雷拉; J·T·小凯利斯; A·肖
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2007-06-06
Filing date: 2008-06-06
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2028-06-06
Also published as: JP2010528657A; JP2010529842A; CN101802194A; CN101778940B; KR20100032367A; WO2008153935A3; DK2171055T3; EP2171055A2; WO2008153934A3; BRPI0812206A2; CN101784662A; CA2690032C; CA2690023A1; JP5548613B2; RU2553550C2; RU2009149660A; JP2010528656A; CN101778940A; MX2009013084A; WO2008153925A3

Abstract

本发明提供了用于改造蛋白质以优化某些目的环境条件下蛋白质性能的方法。在一些实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化特定环境条件下酶催化活性的方法。在一些优选的实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化不利环境条件下其催化活性和/或稳定性的方法。在一些优选的实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化它们的贮存稳定性，尤其不利环境条件下的贮存稳定性的方法。在一些优选的实施方案中，本发明提供了用于改变酶(例如金属蛋白酶)的表面净电荷和/或表面电荷分布以获得与初始酶或亲代酶相比在洗涤剂制剂中显示改良性能和/或稳定性的酶变体的方法。

Description

用于改善蛋白质特性的方法

与相关申请的交叉参照

本申请要求2007年6月6日提交的美国临时专利申请系列号60/933,307、60/933,331和60/933,312的优先权，其全文在此并入作为参考。

发明领域

本发明提供了用于改造蛋白质以优化某些目的环境条件下蛋白质性能的方法。在一些实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化特定环境条件下酶催化活性的方法。在一些优选的实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化不利环境条件下酶催化活性和/或稳定性的方法。在一些优选的实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化它们的贮存稳定性，尤其不利环境条件下的贮存稳定性的方法。在一些优选的实施方案中，本发明提供了用于改变酶(例如金属蛋白酶)的表面净电荷和/或表面电荷分布以获得与初始酶或亲代酶相比在洗涤剂制剂中显示改良性能和/或稳定性的酶变体的方法。

发明背景

在其天然环境之外发挥作用的蛋白质的特性往往是次优的。例如，酶(例如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等)经常在一般包括有效成分的复杂组合的衣物洗涤剂中用于从织物清除污渍。事实上，大部分清洁产品包括表面活性剂***、漂白剂、助洗剂、抑泡剂、悬污剂、去污剂、光漂白剂、柔软剂、分散剂、染料转移抑制化合物、研磨剂、杀菌剂和香料以及用于清洁的酶。因此，尽管当前洗涤剂的复杂，然而仍存在难以彻底除去的众多污点，这部分归咎于次优的酶性能。尽管在酶开发方面已有众多研究，然而本领域仍需要用于为特定用途和环境改造蛋白质的方法。确实地，本领域仍需要迅速和***地修改其他蛋白质的静电特性以优化它们在商业应用中性能的方法。尤其，本领域仍需要用于改造工业用酶以提供了在清洁溶液中改良活性、稳定性和溶解度的方法，所述工业用酶包括但不限于脂肪酶、淀粉酶、角质酶、甘露聚糖酶、氧化还原酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和其他酶。

发明概述

本发明提供了用于产生改良蛋白质变体的方法，所述方法包括：在第一特性的第一试验和在第二特性的第二试验中测试多种单一替换的蛋白质变体，其中亲代蛋白质的特性在每个试验中给予值1.0，适宜的第一或第二特性具有大于1.0的值，并且非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0.80的值或在一些优选的实施方案中具有小于约0.60的值；在单一替换的蛋白质变体的至少之一中鉴定与适宜第一特性相关并且与非常不适宜的第二特性不相关的替换；在单一替换的蛋白质变体的至少之一中鉴定与适宜第二特性相关并且与非常不适宜的第一特性不相关的替换；导入来自前述步骤的替换至蛋白质以产生多重替换的蛋白质变体。在一些实施方案中，所述方法还包括在第一试验和第二试验中测试多重替换的蛋白质变体，其中改良的蛋白质变体在所述第一和第二试验中均实现大于1.0的值，或在第一试验中实现大于1.0的值并且在第二试验中实现0.8至1.0的值。在一些其他实施方案中，所述方法还包括产生改良的蛋白质变体。在一些实施方案中，所述第一和第二特性是负相关的。在一些额外的实施方案中，适宜的第一或第二特性具有大于约1.2的值。在一些其他实施方案中，非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0.40的值。在一些优选的实施方案中，第一特性是稳定性，并且第二特性是洗涤性能。在一些特别优选的实施方案中，所述稳定性包含在洗涤剂中的稳定性并且洗涤性能包含在洗涤剂中的血-乳-墨(BMI)洗涤性能。在一些其他优选的实施方案中，所述蛋白质是中性金属蛋白酶。在一些其他实施方案中，亲代蛋白是中性金属蛋白酶的野生型成熟形式，而在其他实施方案中，该变体从芽孢杆菌科(Bacillaceae)中性金属蛋白酶衍生，在一些特别优选的实施方案中，该变体从芽孢杆菌属中性金属蛋白酶衍生。又在额外的实施方案中，在具有5与12之间pH的粉末或液体洗涤剂组合物中测试洗涤性能。在一些其他实施方案中，在具有碱性pH的冷水液体洗涤剂中测试洗涤性能。又在额外的实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代中性金属蛋白酶的0、-1或-2的净电荷改变，而在一些备选实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代中性金属蛋白酶的+1或+2的净电荷改变。不意图使所述步骤限于上文所列的确切顺序，因为在本发明中使用任何适宜的顺序。在一些优选的实施方案中，相对于亲代中性金属蛋白酶，改良的蛋白酶变体具有+1或+2的净电荷改变。又在额外的实施方案中，所述替换位于亲代中性金属蛋白酶中具有大于约50％溶剂可及表面(SAS)的位置中。仍在其他实施方案中，亲代中性金属蛋白酶中的一个或多个位置是具有大于约65％溶剂可及表面(SAS)的位置。

本发明提供了用于产生改良蛋白酶变体的方法，所述方法包括：在第一特性的第一试验和在第二特性的第二试验中测试多种单一替换的蛋白酶变体，其中在每个试验中给予亲代蛋白酶的特性为1.0的值，适宜的第一或第二特性具有大于1.0的值，并且非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0.80的值或在一些优选的实施方案中具有小于约0.60的值；在单一替换的蛋白酶变体的至少之一中鉴定与适宜第一特性相关并且与非常不适宜的第二特性不相关的替换；在单一替换的蛋白酶变体的至少之一中鉴定与适宜第二特性相关并且与非常不适宜的第一特性不相关的替换；导入来自前述步骤的替换至蛋白酶以产生多重替换的蛋白酶变体。在一些实施方案中，所述方法还包括测试第一试验和第二试验中多重替换的蛋白酶变体，其中改良的蛋白酶变体在第一和第二试验中均实现大于1.0的值，或在第一试验中实现大于1.0的值并且在第二试验中实现0.8至1.0的值。在一些其他实施方案中，所述方法还包括产生改良的蛋白酶变体。在一些实施方案中，所述第一和第二特性是负相关的。在一些额外的实施方案中，适宜的第一或第二特性具有大于约1.2的值。在一些其他实施方案中，非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0.40的值。在一些优选的实施方案中，第一特性是稳定性，并且第二特性是洗涤性能。在一些特别优选的实施方案中，所述稳定性包含在洗涤剂中的稳定性并且洗涤性能包含在洗涤剂中的血-乳-墨(BMI)洗涤性能。在一些其他优选的实施方案中，所述蛋白酶是中性金属蛋白酶。在一些其他实施方案中，亲代蛋白酶是中性金属蛋白酶的野生型成熟形式，而在其他实施方案中，该变体从芽孢杆菌科中性金属蛋白酶衍生。在一些特别优选的实施方案中，该变体从芽孢杆菌属中性金属蛋白酶衍生。又在额外的实施方案中，在具有5与12之间pH的粉末或液体洗涤剂组合物中测试洗涤性能。在一些其他实施方案中，在具有碱性pH的冷水液体洗涤剂中测试洗涤性能。又在额外的实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代中性金属蛋白酶的0、-1或-2的净电荷改变，而在一些备选实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代中性金属蛋白酶的+1或+2的净电荷改变。不意图使所述步骤限于上文所列的确切顺序，因为在本发明中使用任何适宜的顺序。在一些优选的实施方案中，相对于亲代中性金属蛋白酶，改良的蛋白酶变体具有+1或+2的净电荷改变。又在额外的实施方案中，所述替换位于亲代中性金属蛋白酶中具有大于约50％溶剂可及表面(SAS)的位置中。仍在其他实施方案中，亲代中性金属蛋白酶中的一个或多个位置是具有大于约65％溶剂可及表面(SAS)的位置。本发明也提供了使用本文中所述方法产生的多重替换的蛋白质。在一些优选的实施方案中，本发明提供了通过本文所述方法产生的中性金属蛋白酶变体。在一些特别优选的实施方案中，本发明提供了蛋白酶变体，该蛋白酶变体在与SEQ ID NO：3所示的芽孢杆菌中性金属蛋白酶的残基位置83对应的残基位置处包含替换。在一些其他优选的实施方案中，所述替换包含L83K替换。还提供了NprE变体，该变体包含选自由i)4K-45K-50R-54K-59K-90K-129I-138L-179P-190L-199E-214Q-220E-244S-265P-269H-285R-296E；45K-50R-59K-90K-1291-138L-179P-190L-199E-214Q-220E-244S-265P-285R；45K-59K-90K-1291-138L-179P-190L-199E-214Q-220E-265P-285R；和59K-90K-1291-179P-190L-199E-214Q-220E-265P-285R组成的组中的替换组合。

本发明也提供了编码本文所述蛋白酶变体的分离的多核苷酸。此外，本发明提供了包含与启动子有效组合的本文所述多核苷酸的表达载体。本发明中也提供了用本文提供的表达载体所转化的宿主细胞。本发明也提供了清洁组合物，其包含使用本发明方法产生的蛋白酶变体。

本发明提供了用于产生改良的蛋白质变体的方法，所述方法包括：a)在第一特性的第一试验和在第二特性的第二试验中测试多种单一替换的蛋白质变体，其中亲代蛋白质的特性在每个试验中给予值1.0，适宜的第一或第二特性具有大于1.0的值，并且非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0.80的值；b)在单一替换的蛋白质变体的至少之一中鉴定与适宜第一特性相关并且与非常不适宜的第二特性不相关的替换；c)在单一替换的蛋白质变体的至少之一中鉴定与适宜第二特性相关并且与非常不适宜的第一特性不相关的替换；和d)导入来自步骤b的替换和来自步骤c的替换至蛋白质以产生多重替换的蛋白质变体。在一些实施方案中，所述方法还包括步骤e)在第一试验和第二试验中测试多重替换的蛋白质变体，其中改良的蛋白质变体在第一和第二试验中均实现大于1.0的值，或在第一试验中实现大于1.0的值并且在第二试验中实现0.8至1.0的值。

在一些实施方案中，蛋白质是选自由蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、氧化酶、转移酶、过氧化氢酶和碱性蛋白酶(alkalase)组成的组中的酶。在一些优选的实施方案中，该酶是蛋白酶或淀粉酶。在一些实施方案中，第一和所述第二目的特性包含选自底物结合作用、酶抑制、表达、洗涤剂中稳定性、热稳定性、反应速率、反应程度、热活性、淀粉液化、生物质降解、糖化作用、酯水解、酶漂白、洗涤性能和纺织品修饰作用的两种或多种特性。在一些特别优选的实施方案中，所述方法还包括产生改良的蛋白质变体。在一些实施方案中，所述第一和第二特性是负相关的。在本发明的一些实施方案中，适宜的第一或第二特性具有大于约1.2的值，和/或非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0.60的值。在一些优选的实施方案中，第一特性是稳定性，并且第二特性是洗涤性能。在这些实施方案的亚类中，稳定性包含在洗涤剂中的稳定性并且洗涤性能包含在洗涤剂中的血-乳-墨(BMI)洗涤性能。在一些实施方案中，第一特性是蛋白质表达，并且第二特性是酶活性。在这些实施方案的亚类中，酶活性包含在洗涤剂中的稻淀粉洗涤性能。在一些优选的实施方案中，蛋白酶选自由中性金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和枯草蛋白酶组成的组。在这些实施方案的亚类中，中性金属蛋白酶是芽孢杆菌科的中性金属蛋白酶。在一些示例性实施方案中，中性金属蛋白酶来自芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)NprE)。在其他实施方案中，淀粉酶是芽孢杆菌科的α淀粉酶。在一些示例性实施方案中，该α淀粉酶来自芽孢杆菌属(例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)Amys)。在一些优选的实施方案中，在具有5与12之间pH的粉末或液体洗涤剂组合物中和/或在具有碱性pH的冷水液体洗涤剂中测试洗涤性能。在一些实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代酶的0、-1或-2的净电荷改变。在一些实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代酶的+1或+2的净电荷改变。在一些优选的实施方案中，所述替换的至少之一包含至少两个替换，第一替换具有相对于亲代酶的0、-1或-2的净电荷改变；并且第二替换具有相对于亲代酶的+1或+2的净电荷改变。在一些实施方案中，所述至少一个替换包含从1至20个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个替换。在一些实施方案中，相对于亲代酶，改良的酶变体具有-2、-1、0、+1或+2的净电荷改变。在一些实施方案中，所述替换位于亲代酶中具有大于约25％、大于约50％或大于约65％溶剂可及表面(SAS)的位置内。本发明也提供了编码本文所述酶变体的分离的多核苷酸。在其他实施方案中，本发明提供了包含与启动子有效组合的该多核苷酸的表达载体。在一些实施方案中，提供了包含该表达载体的宿主细胞。在其他实施方案中，提供了包含使用本发明方法产生的酶变体的清洁组合物。

本发明提供了用于产生改良蛋白质变体的方法，所述方法以可操作的顺序包括：a)在第一特性的第一试验和在第二特性的第二试验中测试多种单一替换的蛋白质变体，其中亲代蛋白质的特性在每个试验中给予值1.0，适宜的第一或第二特性具有大于1.0的值，并且非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0.80的值；b)在单一替换的蛋白质变体的至少之一中鉴定与适宜第一特性相关并且与非常不适宜的第二特性不相关的替换；c)在单一替换的蛋白质变体的至少之一中鉴定与适宜第二特性相关并且与非常不适宜的第一特性不相关的替换；和d)导入来自步骤b的替换和来自步骤c的替换至蛋白质以产生多重替换的蛋白质变体，其中所述多重替换的蛋白质变体是改良的蛋白质变体。在一些优选的实施方案中，所述方法还包括步骤e)在第一试验和第二试验中测试多重替换的蛋白质变体，其中改良的蛋白质变体在第一和第二试验中均实现大于1.0的值，或在第一试验中实现大于1.0的值并且在第二试验中实现0.8至1.0的值。在一些额外的实施方案中，亲代蛋白是酶并且其中改良的蛋白质变体是酶。在一些额外的实施方案中，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、氧化酶、转移酶和过氧化氢酶。在一些特别优选的实施方案中，该酶是蛋白酶或淀粉酶。在一些额外的实施方案中，第一和所述第二目的特性包含由底物结合作用、酶抑制、表达、洗涤剂中稳定性、热稳定性、反应速率、反应程度、热活性、淀粉液化、生物质降解、糖化作用、酯水解、酶漂白、洗涤性能和纺织品修饰作用组成的组中的两种或多种特性。仍在一些额外的实施方案中，所述方法还包括产生改良的蛋白质变体的步骤。在一些额外的实施方案中，所述第一和第二特性是负相关的。在一些特别优选的实施方案中，适宜的第一或第二特性具有大于约1.2的值。在一些额外优选的实施方案中，非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0.60的值。仍在一些额外的实施方案中，非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0.40的值。在一些优选的实施方案中，第一特性是稳定性，并且第二特性是洗涤性能。在一些特别优选的实施方案中，所述稳定性包含在洗涤剂组合物中的稳定性并且洗涤性能包含血-乳-墨(BMI)洗涤性能。仍在一些其他实施方案中，在包含约5与约12之间pH的粉末或液体洗涤剂组合物中测试洗涤性能。在一些额外优选的实施方案中，在包含碱性pH的冷水液体洗涤剂中测试洗涤性能。在一些其他实施方案中，第一特性是蛋白质表达，并且第二特性是酶活性。在一些额外的实施方案中，蛋白酶选自中性金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。在一些特别优选的实施方案中，该丝氨酸蛋白酶是枯草蛋白酶。在一些其他实施方案中，中性金属蛋白酶是从芽孢杆菌科成员获得的中性金属蛋白酶。在一些备选实施方案中，淀粉酶是从芽孢杆菌科成员获得的α淀粉酶。在一些其他实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代酶的0、-1或-2的净电荷改变。在一些备选实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代酶的+1或+2的净电荷改变。仍在一些其他实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代酶的0、-1或-2的净电荷改变。在一些额外备选的实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代酶的+1或+2的净电荷改变。仍在一些其他实施方案中，相对于亲代酶，改良的酶变体具有+1或+2的净电荷改变。在一些备选的实施方案中，所述替换位于亲代酶中具有大于约25％溶剂可及表面(SAS)的位置内。在一些优选的实施方案中，所述替换位于亲代酶中具有大于约50％或大于约65％溶剂可及表面(SAS)的位置内。在一些特别优选的实施方案中，亲代酶是野生型酶。

本发明也提供了清洁组合物，其包含根据本文所述方法产生的改良的蛋白质变体。

本发明也提供了分离的中性金属蛋白酶变体，其具有包含至少一个氨基酸替换的氨基酸序列，所述的氨基酸替换在与包含SEQ ID NO：3中所述氨基酸序列的中性金属蛋白酶的位置等同的位置处产生。在一些优选的实施方案中，至少一个氨基酸替换在与SEQ ID NO：3中所述氨基酸序列的第83位置等同的位置处产生。在一些特别优选的实施方案中，该替换是L83K。

附图简述

图1A显示AmyS-S242Q组合电荷文库(CCL)的BODIPY-淀粉水解的相对比活性与振荡管表达。

图1B显示AmyS-S242Q CCL在TIDE 2x中的稻淀粉微量样品清洁的相对活性与振荡管表达。

图2A显示AmyS-S242Q CCL的相对振荡管表达与相对净电荷变化。

图2B显示AmyS-S242Q CCL的BODIPY淀粉水解的相对比活性与相对净电荷变化。

图3A显示AmyS-S242Q CCL的相对振荡管表达与相对净电荷变化。

图3B显示AmyS-S242Q CCL的稻淀粉微量样品清洁活性与相对净电荷变化。

发明概述

枯草蛋白酶是衣物洗涤剂中使用的主要酶并且可能是世界上使用最广泛的酶。已经指出表面静电效应能调节枯草蛋白酶的催化活性(见例如Russell和Fersht，Nature 328：496-500 [1987])。最近，观察到涉及改变枯草蛋白酶净电荷的突变对洗涤剂中的洗涤性能产生巨大影响(见例如欧洲专利号0 479 870 Bl)。认为这种有益效应是因枯草蛋白酶pI(等电点)向洗液pH方向改变所致。然而，稍后的工作证实这个结论并不总是适用(见例如美国专利号6,673,590 Bl)。如该专利中所示，枯草蛋白酶中电荷突变的作用明显取决于洗涤剂浓度，即降低亲代枯草蛋白酶pI的突变提供在低洗涤剂浓度上更有效的酶而升高亲代枯草蛋白酶pI的突变产生在高洗涤剂浓度上更有效的酶。这是极有用的，因为洗液中的洗涤剂浓度在全球范围内变化很大。因此，本领域技术人员显而易见的是，对于枯草蛋白酶洗涤性能的最适pI，其取决于洗液中的pH和洗涤剂浓度。此外，已经描述了改善衣物洗涤剂中枯草蛋白酶活性的其他工作(见美国专利公开号2005/0221461)。出乎意料地，发现与亲代枯草蛋白酶具有相同净静电荷的枯草蛋白酶变体在高洗涤剂浓度和低洗涤剂浓度洗涤条件下均具有提高的洗涤性能。

除非另外说明，本发明的实施涉及蛋白质工程、分子生物学、微生物学和重组DNA中常用的常规技术，它们处在本领域技术人员的能力范围内。此类技术是本领域技术人员已知的并且在本领域技术人员熟知的众多教材和参考书中描述。本文此前和以下提到的全部专利、专利申请、文章和出版物通过引用方式明确地并入本文，因为它们的相关教导与本发明所提供的方法和组合物相关。

除非本文另外定义，本文中所用的全部技术术语和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料用于本发明的实施，然而本文中描述了所述优选方法和材料的某一些。因此，下文马上定义的术语通过参考本说明书作为整体进行更完整地描述。

另外，如本文中所用，单数“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另外清楚地说明。数字范围包括定义该范围的数字。除非另外说明，核酸从左至由以5’至3’方向书写；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基方向书写。应当理解本发明不限于所描述的具体方法学、方案和试剂，因为这些内容可以根据本领域技术人员所用的背景变化。

在本说明书通篇范围内给出的每个最大数字界限意图包括每个较小的数字界限，如同在本文中明确地写出此类较小的数字界限。在本说明书通篇范围内给出的每个最小数字界限将包括每个较高的数字界限，如同在本文中明确地写出此类较高的数字界限。在本说明书通篇范围内给出的每个数字范围将包括属于这种较宽泛数字范围内的每个较窄的数字界限，如同在本文中明确地写出此类较窄的数字界限。

此外，本文中提供的标题不是本发明多个方面或实施方案的限制，其中所述的方面或实施方案可以通过参考作为一个整体的本说明书获得。因此，下文马上定义的术语通过参考作为一个整体的本说明书进行更充分地描述。然而，为了促进理解本发明，下文定义了众多术语。

定义

如本文中所用，术语“蛋白酶”和“蛋白酶水解活性”指这样的蛋白质或肽，其显示水解肽或具有肽键的底物的能力。存在用于测量蛋白酶水解活性的众多熟知方法(见例如Kalisz，″Microbial Proteinases，″在：Fiechter(编辑)，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，[1988])。例如，蛋白酶水解活性可以通过比较测定法确定，其中所述比较测定法分析相应蛋白酶水解商品底物的能力。在这种分析蛋白酶或蛋白酶水解活性中有用的示例性底物包括但不限于二-甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原蛋白(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN Biomedical902111)。使用这些底物的比色测定法是本领域中熟知的(见例如WO99/34011和美国专利号6,376,450)。pNA测定法(见例如Del Mar等人，AnalBiochem，99：316-320[1979])也发现用于确定梯度洗脱期间所收集级分的有效酶浓度。这种测定法测量酶水解可溶性合成底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(sAAPF-pNA)时释放对硝基苯胺的速率。从水解反应产生黄颜色的速率在分光光度计上于410nm处测量并且与有效酶浓度成正比。此外，在280nm处的吸光度量值可以用来确定总蛋白浓度。有效酶/总蛋白比产生了该酶纯度。

如本文中所用，术语“ASP蛋白酶”、“Asp蛋白酶”和“Asp”指本文中所述和在美国专利申请号10/576,331中描述的丝氨酸蛋白酶。在一些优选的实施方案中，Asp蛋白酶是从纤维单胞菌属(Cellulomonas)菌株69B4获得的本文中命名为69B4蛋白酶的蛋白酶。因此，在优选的实施方案中，术语“69B4蛋白酶”指从纤维单胞菌属菌株69B4(DSM 16035)衍生的天然存在的成熟蛋白酶。在备选实施方案中，本发明提供了ASP蛋白酶的部分。

术语“纤维单胞菌属蛋白酶同源物”指与衍生自纤维单胞菌属菌株69B4的成熟蛋白酶具有基本上相同氨基酸序列的天然存在蛋白酶，或编码此类天然存在蛋白酶的多核苷酸序列，并且所述蛋白酶保留由此类核酸编码的丝氨酸蛋白酶的功能性特征。在一些实施方案中，这些蛋白酶同源物被称作“纤维单胞菌蛋白(cellulomonadin)”。

如本文中所用，使用术语“ASP变体”、“ASP蛋白酶变体”和“69B蛋白酶变体”指代这样的蛋白酶，所述蛋白酶与野生型ASP相似、尤其在其功能上相似，但在其氨基酸序列中具有使它们在序列上不同于野生型蛋白酶的突变。

如本文中所用，“纤维单胞菌属物种”指“纤维单胞菌属”中的全部物种，它们是分类为放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌目(Actinomycetales)，微球菌亚目(Micrococcineae)，纤维单胞菌科(Cellulomonadaceae)成员的革兰氏阳性菌。认识到纤维单胞菌属继续经历分类学重新编排。因而，意图该属包括已经被重新划分的物种。

如本文中所用，“链霉菌属物种”指“链霉菌属”中的全部物种，它们是分类为放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌目(Actinomycetales)，链霉菌亚目(Micrococcineae)，链霉菌科(Cellulomonadaceae)成员的革兰氏阳性菌。认识到链霉菌属继续经历分类学重新编排。因而，意图该属包括已经被重新划分的物种。

如本文中所用，“芽孢杆菌属(Bacillus)”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌属”中的全部物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)耐碱芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。认识到芽孢杆菌属继续经历分类学重新编排。因而，意图该属包括已经被重新划分的物种，包括但不限于此类生物诸如嗜热脂肪芽孢杆菌，它现在命名为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”。在氧存在下产生抗性芽孢被视为芽孢杆菌属的定义特征，尽管该特征也适用于新近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alleyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、Filobacillus、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、解脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。

本文中可相互交换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些术语包括但不限于单链、双链或三链的DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体或包含嘌呤和嘧啶碱基，或其他天然的、化学的、生物化学修饰的、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因、基因片段、染色体片段、EST、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。在一些实施方案中，多核苷酸包含修饰的核苷酸(如甲基化核苷酸)和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团如氟代核糖(fluororibose)与硫代酯(thioate)和核苷酸分支(nucleotide branche)。在备选实施方案中，核苷酸的序列被非核苷酸组分打断。

如本文中所用，术语“DNA构建体”和“转化DNA”可互换地用来指将序列导入宿主细胞或生物中所用的DNA。该DNA可以在体外通过PCR或本领域技术人员已知的任意其他合适技术产生。在特别优选的实施方案中，DNA构建体包含目的序列(例如作为引入的序列)。在一些实施方案中，该序列与额外元件如调控元件(例如启动子等)有效连接。该DNA构建体还可以包含选择标记。它还可以包含在侧翼分布有同源性盒的引入的序列。在其他实施方案中，转化DNA包含添加至末端的其他非同源序列(例如填充序列或侧翼序列)。在一些实施方案中，引入的序列的末端闭合，从而该转化DNA形成闭合环。所述转化序列可以是野生型、突变或修饰的。在一些实施方案中，该DNA构建体包含与宿主细胞染色体同源的序列。在其他实施方案中，该DNA构建体包含非同源序列。一旦该DNA构建体在体外装配起来，则它可以用来：1)***异源序列至宿主细胞的预期靶序列中；和/或2)诱变宿主细胞染色体的区域(即用异源序列替换内源序列)，和/或3)缺失靶基因；和/或导入复制型质粒至宿主中。

如本文中所用，术语“表达盒”和“表达载体”指重组或合成产生的核酸构建体，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列指定核酸元件。该重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段。一般地，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子，以及其他序列。在优选的实施方案中，表达载体具有掺入和在宿主细胞中表达异源DNA片段的能力。众多原核和真核表达载体是市售的。对适宜表达载体的选择处在本领域技术人员的知识范围内。术语“表达盒”在本文中与“DNA构建体”可互换地使用并且它们的语法等同物可互换地使用。对适宜表达载体的选择处在本领域技术人员的知识范围内。

如本文中所用，术语“载体”指设计旨在导入核酸至一个或多个细胞类型中的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等。在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含编码蛋白酶(例如前体或成熟蛋白酶)的DNA序列，其中所述DNA序列与能够引起该DNA在合适宿主中表达的合适前导序列(例如分泌序列等)有效连接。

如本文中所用，术语“质粒”指用作克隆载体并且在一些真核生物或原核生物中形成染色体外自我复制性遗传元件或整合至宿主染色体中的环状双链(ds)DNA构建体。

如本文在导入核酸序列至细胞中的上下文中所用，术语“导入”指适合转移核酸序列至细胞中的任意方法。此类导入方法包括但不限于原生质体融合法、转染法、转化法、接合法和转导法(见例如Ferrari等人，“Genetics”在Hardwood等人(编辑)，Bacillus.Plenum Publishing Corp.，第57-72页[1989]中)。

如本文中所用，术语“转化”和“稳定转化”指细胞，所述细胞使非天然(异源)多核酸序列整合至其基因组中或作为维持至少两个世代的游离型质粒。

如本文中所用，术语“编码选择标记的核苷酸序列”指这样的核苷酸序列，它能够在宿主细胞中表达并且其中该选择标记的表达赋予含有所表达基因的细胞在相应选择剂存在下或缺少必需养分时生长的能力。

如本文中所用，术语“选择标记”和“选择性标记”指允许易于选择含有所述载体的那些宿主的能够在宿主细胞中表达的核酸(例如基因)。此类选择标记的例子包括但不限于抗微生物剂。因而，术语“选择标记”指这样的基因，它们提供了宿主细胞已经摄取外来目的DNA或某种其他反应已经发生的指示。一般，选择标记是这样的基因，它们赋予宿主细胞抗微生物抗性或代谢优势以使得含有外源DNA的细胞区别于转化期间没有接受任何外源序列的细胞。“原住选择标记”是位于待转化的微生物的染色体上的选择标记。原住选择标记编码与转化DNA构建体上的选择标记不同的基因。选择标记是本领域技术人员熟知的。如上文所述，标记优选地是抗微生物抗性标记(例如amp^R；phleo^R；spec^R；kan^R；ery^R；tet^R；cmp^R和neo^R(见例如Guerot-Fleury，Gene，167：335-337[1995)；Palmeros等人，Gene 247：255-264[2000]和Trieu-Cuot等人，Gene，23：331-341 [1983])。根据本发明有用的其他标记包括，但不限于营养缺陷型标记如色氨酸；和检测标记，如β-半乳糖苷酶。

如本文中所用，术语“启动子”指发挥指导下游基因转录的作用的核酸序列。在优选的实施方案中，启动子适用于其中表达靶基因的宿主细胞。该启动子，连同其他转录性和翻译性调节核酸序列(又称作“调控序列”)是对于表达给定基因必需的。通常，该转录性和翻译性调节序列包括，但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列和增强子或激活子序列。

当一种核酸与另一个核酸序列处于功能性关系中时，它是“有效连接的”。例如，如果表达为参与多肽分泌的前蛋白，则编码分泌性前导序列(即信号肽)的DNA与编码多肽的DNA有效连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列有效连接；或者，如果核糖体结合位点的放置促进翻译，则核糖体结合位点与编码序列有效连接。通常，“有效连接”意指连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情况下，是连续且符合可读相的(in reading phase)。然而，增强子不必是连续的。连接通过在便利的限制性位点处连接而完成。如此类位点不存在，则根据常规实践使用合成性寡核苷酸衔接头或接头。

如本文中所用，术语“基因”是指这样的多核苷酸(例如，DNA区段)，该多核苷酸编码多肽并包括在编码区之前和之后的区域，也包括在各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

如本文中所用，“同源基因”指来自不同但通常相关物种的基因对，它们相互对应并且是彼此相同或极为相似的。该术语包括因物种形成(即新物种发展)而分离的基因(例如直向同源基因)，以及因遗传复制而分离的基因(例如旁系同源基因)。

如本文中所用，“直向同源物”和“直向同源基因”指不同物种中因物种形成而已经从共同先祖基因(即同源基因)进化的基因。一般，直向同源物在进化期间仍保留相同的功能。直向同源物的鉴定用于新测序基因组中可靠地预测基因功能。

如本文中所用，“旁系同源物”和“旁系同源基因”指因基因组内部复制而相关的基因。尽管直向同源物在进化期间自始至终保留相同的功能，然而旁系同源物演化出新功能，即便一些功能往往与初始功能相关。旁系同源基因的例子包括，但不限于编码胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶的基因，其中所述酶均为丝氨酸蛋白酶并在相同物种中共同存在。

如本文中所用，“同源性”指序列相似性或同一性，优选同一性。使用本领域已知的标准技术(见例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2：482[1981]；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443[1970]；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444[1988]；程序如威斯康辛Genetics软件包Genetics Computer Group，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA和Devereux等人，Nucl.Acid Res.，12：387-395[1984))确定这种同源性。

如本文中所用，“类似序列”是这样一种序列，其中所述基因的功能基本上与基于亲代基因的基因(例如纤维单胞菌属菌株69B4蛋白酶)相同。另外，类似基因包括与亲代基因序列的至少约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或约100％序列同一性。备选地，类似序列与亲代基因(例如纤维单胞菌属菌株69B4蛋白酶)区域中比对存在的70至100％之间的基因具有匹配性和/或至少具有下述区域中存在的5-10个基因，其中所述的区域与含有该亲代基因的染色体(例如纤维单胞菌属菌株69B4染色体)中的基因匹配。在额外的实施方案中，不止一种以上属性适用于该序列。类似序列通过已知的序列比对方法确定。常见使用的比对方法是BLAST，不过如上文及下文所示，存在用于比对序列的其他方法。

一个有用算法的例子是PILEUP。使用累进配对比对法，PILEUP从一组相关序列产生多重序列比对结果。它也可以绘制显示聚类关系的进化树，其中所述聚类关系用来产生该比对结果。PILEUP使用Feng和Doolittle累进比对方法(Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.，35：351-360[1987])的简化形式。该方法类似于Higgins和Sharp描述的方法(Higgins和Sharp，CABIOS5：151-153[1989])。有用的PILEUP参数包括默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10和加权末端空位。

有用算法的另一个例子是由Altschul等人(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410[1990]和Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：5873-5787[1993))描述的BLAST算法。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(见，Altschul等人，Meth.Enzymol.，266：460-480[1996])。WU-BLAST-2使用几个搜索参数，其中大部分设置为默认值。设置具有以下值的可调节参数：重叠覆盖区＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值并且根据具体序列的组成和具体数据库的组成，由程序自身建立，其中目的序列针对所述具体数据库进行检索。然而，可以调节所述值以提高灵敏度。％氨基酸序列同一性值由匹配的相同残基数除以比对区域中“较长”序列的残基总数确定。“较长”序列是比对区域中具有最多实际残基的序列(忽略由WU-Blast-2导入以使得比对评分最大化的空位)。

因而，“核酸序列同一性百分数(％)”定义为候选序列中与起始序列(即目的序列)的核苷酸残基相同的核苷酸残基百分数。一个优选的方法使用设置成默认参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块，重叠覆盖区和重叠分数分别设置成1和0.125。

如本文中所用，术语“杂交”指核酸的一条链通过碱基配对作用与互补链结合的过程，如本领域已知。

将一个核酸序列视为与一个参考核酸序列“可选择性杂交”，若这两个序列在高严格杂交和洗涤条件下彼此特异地杂交。杂交条件基于结合复合体或探针的核酸的解链温度(Tm)。例如，“最大严格性”一般在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)上出现；“高严格性”在低于该Tm约5-10℃上出现；“中等严格性”在低于探针Tm的10-20℃上出现并且“低严格性”在低于该Tm约20-25℃上出现。在功能上，最大严格性条件可以用来鉴定与杂交探针具有严格同一性或近乎严格同一性的序列；而中等或低严格杂交可以用来鉴定或检测多核苷酸序列同源物。

中等至高严格杂交是本领域熟知的。高严格性条件的例子包括在约42℃于50％甲酰胺，5×SSC，5×Denhardt’s溶液，0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中杂交，随后在室温于2X SSC和0.5％SDS中洗涤2次并且在42℃于0.1×SSC和0.5％SDS中额外洗涤2次。中等严格条件的例子包括在37℃于包含20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切鲑精DNA的溶液中过夜孵育，随后在约37-50℃于1×SSC中洗涤滤膜。本领域技术人员知道如何按照需要调节温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。

如本文中所用，“重组体”包括对细胞或载体的称谓，其中所述的细胞或载体已经通过导入异源核酸序列被修饰或所述细胞从如此修饰的细胞衍生。因而，例如重组细胞表达在该细胞的天然(非重组)形式中不以相同形式存在的基因或因人有意干预而异常表达、不足表达或根本不表达的天然基因。“重组”、“进行重组”和生成“重组的”核酸一般是两个或多个核酸片段的装配，其中所述装配产生嵌合基因。

在一个优选的实施方案中，使用在至少一个密码子中的位点饱和诱变法产生突变DNA序列。在另一个优选的实施方案中，对2个或多个密码子进行位点饱和诱变。在一个其他实施方案中，突变DNA序列对野生型序列具有大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于98％的同源性。在备选实施方案中，使用任意的已知诱变方法如辐射、亚硝基胍等，在体内产生突变DNA。随后分离想要的DNA序列并用于本文提供的方法中。

如本文中所用，术语“靶序列”指宿主细胞中编码这样序列的DNA序列，其中想要在所述序列处将引入的序列***宿主细胞基因组。在一些实施方案中，靶序列编码有功能的野生型基因或操纵子，而在其他实施方案中，靶序列编码有功能的突变基因或操纵子，或无功能的基因或操纵子。

如本文中所用，“侧翼序列”指位于所讨论序列上游或下游的任意序列(例如，对于基因A-B-C，基因B在侧翼具有A和C基因序列)。在一个优选的实施方案中，该引入的序列在每一侧具有同源盒。在另一个其他实施方案中，该引入的序列和同源盒包含在每一侧具有填充序列的单元。在一些实施方案中，侧翼序列仅在单侧(3’或5’)存在，不过在优选的实施方案中，它在侧翼相接的序列的每一侧存在。在一些实施方案中，侧翼序列仅在单侧(3’或5’)存在，而在优选的实施方案中，它在侧翼相接的序列的每一侧存在。

如本文中所用，术语“填充序列”指在同源盒侧翼的任意额外DNA(一般是载体序列)。然而，该术语包括任意非同源的DNA序列。不受任何理论限制，填充序列为细胞提供了非关键靶以启动DNA摄取。

如本文中所用，术语“扩增”和“基因扩增”指这样的过程，其中凭借该过程不成比例地复制特异的DNA序列，从而扩增的基因以比起初基因组中拷贝数更高的拷贝数存在。在一些实施方案中，通过在药物(例如可抑制酶的抑制物)存在下生长而选择细胞，这导致编码在该药物存在下生长所需的基因产物的内源性基因扩增，或通过扩增编码这种基因产物的外源(即输入)序列或这两种方式选择细胞。

“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的具体情形。它与非特异性模板复制(即具有模板依赖性但不依赖于特异性模板的复制)形成对比。模板特异性这里区别于复制忠实性(即正确多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖或脱氧核糖)特异性。模板特异性往往以术语“靶”特异性描述。靶序列是如下意义上的“靶”，用来将它们与其他核酸区分开。扩增技术已经主要设计用于这种区分过程。

如本文中所用，术语“共扩增”指将可扩增标记连同其他基因序列(即包含一个或多个不可选择性基因如表达载体中所包含的那些基因)导入单个细胞并且施加适宜的选择压力，从而该细胞扩增这个可扩增标记和其余不可选择性基因序列。这个可扩增标记可以与其余基因序列物理地连接或备选地，可以一个含有可扩增标记并且另一个含有非选择标记的两个分立DNA片段导入相同的细胞。

如本文中所用，术语“可扩增标记”、“可扩增基因”和“扩增载体”指在适宜生长条件下引起该基因扩增的基因或编码基因的载体。

“模板特异性”在大多数扩增技术中通过酶的选择实现。扩增酶是在使用这些酶的条件下仅会处理异质性核酸混合物中特定核酸序列的酶。例如在Qβ复制酶的情况下，MDV-I RNA是该复制酶的特异性模板(见例如Kacian等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：3038[1972])并且其他核酸不被这种扩增酶复制。类似地，在T7 RNA聚合酶的情况下，这种扩增酶具有对其自身启动子的严格特异性(见Chamberlin等人，Nature 228：227[1970))。在T4 DNA连接酶的情况下，该酶不会连接其中寡核苷酸或多核苷酸底物与模板之间在连接接合处存在错配的两个寡核苷酸或多核苷酸(见Wu和Wallace，Genomics 4：560[1989])。最后，由于Taq和Pfu聚合酶在高温下发挥作用的能力，发现它们针对由引物结合并且因而限定的序列表现高度特异性；所述高温产生促进引物与靶序列杂交而不与非靶序列杂交的热动力条件。

如本文中所用，术语“可扩增的核酸”指可以由任意扩增方法扩增的核酸。考虑了“可扩增的核酸”通常包含“样品模板”。

如本文中所用，术语“样品模板”指源自样品的核酸，其中对所述样品分析(下文定义的)“靶”的存在性。相反，“背景模板”用来指代样品模板之外的核酸，它可能存在或可能不存在于样品中。背景模板最经常地是偶然存在的。它可以是夹带的结果，或它可以因试图从样品中纯化去除的核酸杂质存在所致。例如，源自待检测生物之外的生物的核酸可以作为背景存在于试样中。

如本文中所用，术语“引物”指这样的寡核苷酸，无论天然存在(如在纯化的限制性消化产物中)或合成地产生，其中所述寡核苷酸在被置于诱导互补于一条核酸链的引物延伸产物合成的条件(即存在核苷酸和诱导物质(如DNA聚合酶)和在适宜的温度和pH上)下之时能够充当合成的起始点。为了扩增中的最大效率，引物优选地是单链的，不过可以备选地是双链的。若为双链，首先处理该引物以在使用前分开其链，旨在制备延伸产物。优选地，该引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导物质存在下引发延伸产物合成。引物的确切长度将取决于众多因素，这包括温度、引物来源和所用的方法。

如本文中所用，术语“探针”指能够与另一种目的寡核苷酸杂交的寡核苷酸(即核苷酸序列)，无论它是天然存在的(如在纯化的限制性消化产物中)或合成地、重组地或由PCR扩增产生。探针可以是单链的或双链的。探针用于检测、鉴定和分离特定的基因序列。考虑了在本发明中使用的任意探针将以任何“报道分子”标记，从而是在任意检测***中可检测的，所述检测***包括，但不限于酶(例如ELISA以及基于酶的组织化学测定法)、荧光、放射性和化学发光***。不意图将本发明限于任何具体检测***或标记物。

如本文中所用，当谈及聚合酶链反应时，术语“靶”指由用于聚合酶链反应的引物结合的核酸区域。因而，试图将“靶”与其他核酸序列区别开。“区段”定义为靶序列内部的核酸区域。

如本文中所用，术语“聚合酶链反应”(“PCR”)指美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188的方法，所述方法包括用于提高基因组DNA混合物中靶序列区段的浓度而不进行克隆或纯化的方法，如本领域技术人员已知。因为想要扩增的靶序列区段在该混合物中变成优势序列(就浓度而言)，所以称它们是“PCR扩增”的。

如本文中所用，术语“扩增试剂”指除引物、核酸模板和扩增酶之外的为扩增所需的那些试剂(脱氧核糖核苷酸三磷酸、缓冲液等)。一般，将扩增试剂连同其他反应组分置于并纳入反应容器(试管、微孔等)中。

采用PCR，有可能将基因组DNA中单拷贝的特异性靶序列扩增至通过几种不同方法学(例如与标记探针杂交；掺入生物素化引物，随后进行抗生物素蛋白-酶缀合物检测；掺入³²P-标记的脱氧核苷酸三磷酸如dCTP或dATP至扩增的区段)可检测的水平。除基因组DNA之外，还可以用适宜的成套引物分子扩增任意的寡核苷酸或多核苷酸序列。特别地，由PCR过程自身产生的扩增区段本身是后继PCR扩增的高效模板。

如本文中所用，术语“PCR产物”、“PCR片段”和“扩增产物”指两轮或多轮PCR步骤变性、复性和延伸结束后所得的化合物混合物。这些术语包括其中已经扩增一个或多个序列的一个或多个区段的情况。

如本文中所用，术语“RT-PCR”指RNA序列的复制和扩增。在这个方法中，逆转录偶联于PCR，最经常地使用其中使用热稳定性聚合酶的单一酶方法，如美国专利号5,322,770中所述。在RT-PCR中，RNA模板因聚合酶的逆转录酶活性转换成cDNA，并随后使用聚合酶的聚合活性(即如同其他PCR方法中那样)进行扩增。

如本文中所用，术语“限制性核酸内切酶”和“限制性酶”指均在特定核苷酸序列处或其附近切割双链DNA的细菌酶。

“限制性位点”指被给定的限制性核酸内切酶识别和切割并往往是DNA片段***位点的核苷酸序列。在本发明的某些实施方案中，将限制性位点设计到选择标记中和设计到DNA构建体的5’和3’末端。

如本文中所用，术语“染色体整合”指引入的序列籍此导入宿主细胞染色体的过程。转化DNA的同源区域与染色体的同源区域整列。随后，同源盒之间的序列在双交换中由引入的序列替换(即同源重组)。在本发明的一些实施方案，DNA构建体的失活性染色体区段的同源部分与芽孢杆菌染色体的固有染色体区域的侧翼同源区整列。随后，所述固有染色体区域在双交换中由该DNA构建体缺失(即同源重组)。

“同源重组”意指两个DNA分子或配对染色体之间在相同或几乎相同的核苷酸序列位点处交换DNA片段。在一个优选的实施方案中，染色体整合过程是同源重组。

如本文中所用的“同源序列”意指为比较而最佳排列时，与另一个核酸或多肽序列具有100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、88％、85％、80％、75％或70％序列同一性的核酸或多肽序列。在一些实施方案中，同源序列具有85％与100％之间的序列同一性，而在其他实施方案中，存在90％与100％之间的序列同一性，并且在更优选的实施方案中，存在95％与100％之间的序列同一性。

如本文中所用，“氨基酸”指肽或蛋白质序列或其部分。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换地使用。

如本文中所用，“目的蛋白”和“目的多肽”指想要的和/或正在评估的蛋白质/多肽。在一些实施方案中，“目的蛋白”是“亲代蛋白”(即起始蛋白)。在一些实施方案中，亲代蛋白是作为蛋白质工程/设计起点使用的野生型酶。在一些实施方案中，目的蛋白在细胞内表达，而在其他实施方案中，它是分泌的多肽。在特别优选的实施方案中，这些酶包括本文中所述的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。在一些实施方案中，目的蛋白是与信号肽(即待分泌蛋白质中的氨基端延伸部分)融合的分泌多肽。几乎全部分泌性蛋白使用氨基端蛋白质延伸部分，其中所述的氨基端蛋白质延伸部分在引导前体蛋白至膜上和其跨模转运中发挥重要作用。该延伸部分在膜转移期间或其后立即由信号肽酶以蛋白酶解方式除去。

如本文中所用，术语“异源蛋白”指不天然存在于宿主细胞中的蛋白质或多肽。异源蛋白的例子包括酶，如水解酶，包括蛋白酶。在一些实施方案中，编码蛋白质的基因是天然存在的基因，而在其他实施方案中，使用突变基因和/或合成性基因。

如本文中所用，“同源蛋白”指细胞中固有或天然存在的蛋白质或多肽。在优选的实施方案中，所述细胞是革兰氏阳性细胞，而在特别优选的实施方案中，该细胞是芽孢杆菌属宿主细胞。在备选的实施方案中，同源蛋白是由其他生物产生的天然蛋白，所述其他生物包括但不限于大肠杆菌、纤维单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属(Streptomyces)、木霉属(Trichoderma)和曲霉属(Aspergillus)生物。本发明包括凭借重组DNA技术产生同源蛋白的宿主细胞。

如本文中所用，“操纵子区”包含作为单一转录单元从共同启动子转录并因而接受共调节作用的一组连续基因。在一些实施方案中，该操纵子包括调节基因。在最优选的实施方案中，使用这样的操纵子，其中该操纵子高度表达，如由RNA水平所测量，但具有未知或不需要的功能。

如本文中所用、“抗微生物区域”是含有编码抗微生物蛋白的至少一个基因的区域。

若某多核苷酸在其天然状态下或由本领域技术人员已知的方法导入时，可以被转录和/或翻译以产生RNA、多肽或其片段，则称该多核苷酸“编码”RNA或多肽。还称这种核酸的反义链编码了序列。

如本领域已知，DNA可以被RNA聚合酶转录以产生RNA，不过RNA可以被逆转录酶逆转录以产生DNA。因而DNA可以编码RNA并且反之亦然。

术语“调节区段”或“调节序列”或“表达调控序列”指DNA的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列与编码多肽链的氨基酸序列的DNA的多核苷酸序列有效连接以实现所编码氨基酸序列的表达。调节序列可以抑制、阻遏或促进有效连接的编码氨基酸的多核苷酸序列表达。

“宿主株”或“宿主细胞”指对于包含本发明DNA的表达载体适合的宿主。

一种酶在宿主细胞中“过量表达”，若该酶在所述细胞中以比相应野生型细胞中表达此酶的水平更高的水平表达。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换地使用。在本公开内容中通篇使用如按照IUPAC-IUB生物化学命名联合委员会定义的氨基酸3字母代码。也应当理解多肽可以由多于一个核苷酸序列编码，原因在于遗传密码子的简并性。

“前序列(prosequence)”是在信号序列与成熟蛋白酶之间对于该蛋白酶分泌为必需的氨基酸序列。该前序列的切割会产生成熟的活性蛋白酶。

术语“信号序列”或“信号肽”指参与成熟或前体形式的蛋白质分泌的任意核苷酸序列和/或氨基酸序列。信号序列的这个定义是一个功能性定义，意指包括由该蛋白质基因的氨基端部分编码的参与实现蛋白质分泌的全部那些氨基酸序列。它们往往但并非普遍地与蛋白质的氨基端部分或与前体蛋白的氨基端部分结合。信号序列可以是内源或外源的。信号序列可以是通常与该蛋白质(例如蛋白酶)连接的信号序列，或可以来自编码另一种分泌性蛋白的基因。一个示例性外源信号序列包含来自枯草芽孢杆菌枯草蛋白酶信号序列的头7个氨基酸残基，所述的氨基酸残基与来自缓慢芽孢杆菌(ATCC 21536)的枯草蛋白酶的信号序列的剩余部分融合。

术语“杂合信号序列”指其中部分序列从表达宿主获得的与待表达基因的信号序列融合的信号序列。在一些实施方案中，使用合成性序列。

术语“基本上相同的信号活性”指如基本上相同地将蛋白酶分泌至发酵培养基中所示的信号活性，例如发酵培养基蛋白酶水平是该发酵培养基中如信号序列所提供的分泌性蛋白酶水平的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％。

术语“成熟”形式的蛋白质或肽指该蛋白质或肽的最终功能性形式，例如，成熟形式的本发明NprE蛋白酶至少包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

术语“前体”形式的蛋白质或肽指这样的成熟形式蛋白质，其具有与该蛋白质的氨基末端或羧基末端有效连接的前序列。该前体也可以具有与该前序列的氨基末端有效连接的“信号”序列。该前体也可以具有参与翻译后活性的额外多核苷酸(例如从中被切除以留下成熟形式蛋白质或肽的多核苷酸)。

“天然存在的酶”和“天然存在的蛋白质”指具有与自然界中存在的氨基酸序列相同的未修饰氨基酸序列的酶或蛋白质。天然存在的酶包括天然酶，即天然表达的或在特定微生物中发现的那些酶。

术语“从......衍生”和“从......获得”不仅指由所讨论生物的菌株产生或可产生的酶(例如蛋白酶)，还指由分离自此菌株的DNA序列编码和在含有此DNA序列的宿主生物中产生的酶。另外，该术语指由合成来源和/或cDNA来源的DNA序列编码并且具有所讨论酶的鉴别特征的酶。

“衍生物”在该定义的范围内通常仍保留在野生型、天然或亲代形式中观察到的特征性蛋白酶水解活性至这样的程度，从而该衍生物用于与野生型、天然或亲代形式相似的目的。有功能的酶衍生物包括具有亲代酶一般特征的天然存在的、合成或重组产生的肽或肽片段。

术语“功能性衍生物”指具有编码酶的核酸的功能性特征的核酸的衍生物。编码本文中所提供酶的核酸的功能性衍生物包括天然存在的、合成或重组产生的核酸或片段。基于本领域已知的遗传密码子简并性，编码本发明酶的野生型核酸包括天然存在的等位基因和同源物。

术语“同一的”在两个核酸序列或多肽序列的上下文中指这两个序列中为了最大对应性而比对时是相同的残基，其中所述最大对应性使用以下序列比较或分析算法之一测量。

术语“最佳比对”指产生最高同一性百分数评分的比对。

“序列同一性百分数”、“氨基酸序列同一性百分数”、“基因序列同一性百分数”和/或“核酸/多核苷酸序列同一性百分数”就两个氨基酸序列、多核苷酸序列和/或基因序列(如适宜的话)而言，指当最佳比对所述序列时这两个序列中相同的残基的百分数。因而，80％氨基酸序列同一性意指这两个最佳比对的多肽序列中的80％氨基酸是相同的。

短语“基本上相同的”在两个核酸或多肽的上下文中因而指这样的多核苷酸或多肽，其中使用程序或算法(例如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)，使用标准参数，与参考序列相比时，所述多核苷酸或多肽包含至少70％序列同一性、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少97％、优选至少98％并且优选至少99％序列同一性。两个多肽基本上同一的一个指示是第一多肽与第二多肽发生免疫学交叉反应。一般，因保守性氨基酸替换而不同的多肽是免疫学交叉反应的。因而，例如，一个多肽与第二多肽基本上相同，其中这两个肽仅因保守性替换而不同。两个核酸序列基本上同一的另一个指示是这两个分子在严格条件(例如在中等至高严格性范围内)下相互杂交。

术语“分离的”或“纯化的”指从其初始环境(例如天然环境，若它是天然存在的)中取出的物质。例如，当该物质在特定组合物中以高于或低于天然存在生物或野生型生物中的浓度存在或与从天然存在生物或野生型生物表达时通常不存在的组分联合存在时，称该物质是“纯化”的。例如，在活的动物中存在的天然存在多核苷酸或多肽不是分离的，然而与该天然***中一些或全部共存物质分开的相同多核苷酸或多肽是分离的。在一些实施方案中，此类多核苷酸是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽是组合物的一部分，并且仍是分离的，以至这种载体或组合物不是其天然环境的一部分。在一些优选的实施方案中，例如若核酸或蛋白质在电泳凝胶或印迹物中产生基本上一条带，则称它是纯化的。

当谈及DNA序列使用时，术语“分离的”指这样的DNA序列，其中所述DNA序列已经从天然遗传环境中移出并且因而不含有其他外部或不想要的编码序列，并且处于适合在基因工程蛋白质生产***中使用的形式。此类分离的分子是与其天然环境分开的那些分子并且包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不含有通常与之连接的其他基因，但可以包含天然存在的5’和3’非翻译区如启动子和终止子。鉴定相关的区域对本领域普通技术人员将是显而易见的(见例如Dynan和Tijan，Nature316：774-78，1985)。术语“分离的DNA序列”备选地称作“克隆的DNA序列”。

当谈及蛋白质使用时，术语“分离的”指在其天然环境之外的条件下存在的蛋白质。在优选的形式中，分离的蛋白质基本上不含其他蛋白质，尤其其他同源蛋白。分离的蛋白质具有大于10％的纯度、优选大于20％的纯度并且甚至更优选大于30％的纯度，如SDS-PAGE所确定。本发明的其他方面包括处于高度纯化形式(即大于40％纯度、大于60％纯度、大于80％纯度、大于90％纯度、大于95％纯度、大于97％纯度并且甚至大于99％纯度)的蛋白质，如SDS-PAGE所确定。

如本文中所用，术语“组合诱变法”指其中产生起始序列的变体文库的方法。在这些文库中，所述变体含有选自预定义突变集合的一个或几个突变。此外，所述方法提供了导入随机突变的手段，其中所述随机突变不是预定义突变集合的成员。在一些实施方案中，所述方法包括在2000年10月26日提交的美国专利申请号09/699,250中描述的那些方法。在备选的实施方案中，组合诱变方法包括市售试剂盒(例如QUIKCHANGEMultisite，Stratagene，La JoIIa，CA)。

如本文中所用，术语“变体”指已经通过添加、替换或缺失一个或多个氨基酸而从前体蛋白(例如“亲代”蛋白)衍生的蛋白质。在一些实施方案中，与前体蛋白相比，该变体包含至少一个修饰，其中所述修饰包含电荷改变。在一些优选的实施方案中，该前体蛋白是为野生型蛋白的亲代蛋白。

如本文中所用，术语“突变体文库”指绝大部分基因组相同但包括一个或多个基因的不同同源物的细胞群体。此类文库可以用来例如鉴定具有改良性状的基因或操纵子。

如本文中所用，术语“起始基因”指编码目的蛋白的目的基因，其中所述的目的蛋白待使用本发明改良和/或改变。

如本文中所用，术语“多重序列比对”和“MSA”指使用算法(例如Clustal W)进行比对的一个起始基因的多个同源物的序列。

如本文中所用，术语“共有序列”和“规范序列”指具体目的蛋白质或目的序列的全部变体与之进行比较的原型氨基酸序列。该术语也指显示目的DNA序列中最经常存在的核苷酸的序列。对于基因的每个位置，共有序列给出在MSA中该位置内最多见的氨基酸。

如本文中所用，术语“共有突变”指起始基因序列和共有序列中的差异。共有突变通过比较起始基因的序列和从MSA获得的共有序列进行鉴定。在一些实施方案中，将共有突变导入起始基因，从而起始基因变得与共有序列更相似。共有突变也包括将起始基因中的氨基酸改变成下述氨基酸的氨基酸变化，其中所述氨基酸相对于起始基因中该氨基酸的频率更频繁地在该位置处出现于MSA中。因而，术语“共有突变”包含以比MSA中氨基酸更丰富的氨基酸替换起始基因中氨基酸的全部单一氨基酸改变。

如本文中所用，术语“初始命中”指通过筛选组合共有诱变文库所鉴定的变体。在优选的实施方案中，与起始基因相比，初始命中具有改良的性能特征。

如本文中所用，术语“初始命中”指通过筛选增强性组合共有诱变文库所鉴定的变体。

如本文中所用，术语“改良性突变”和“增强性能的突变”指当导入起始基因时产生改良性能的突变。在一些优选的实施方案中，通过对所述方法的筛选步骤期间鉴定的命中测序来鉴定这些突变。在大多数实施方案中，与未筛选的组合共有诱变文库相比，在命中之中更频繁存在的突变可能是改良性突变。

如本文中所用，术语“增强性组合共有诱变文库”指基于筛选来自较早轮次CCM诱变和筛选法的结果和/或对其测序进行设计和构建的CCM文库。在一些实施方案中，增强性CCM文库以源自较早轮次CCM的初始命中的序列为基础。在额外的实施方案中，如此设计增强性CCM，从而促进在源自较早轮次诱变和筛选过程的初始命中之中频繁观察到的突变。在一些优选的实施方案中，通过省去编码降低性能的突变的引物或相对于用在较早CCM文库中的其他引物，通过提高编码增强性能的突变的引物的浓度，实现了这一点。

如本文中所用，术语“降低性能的突变”指组合共有诱变文库中这样的突变，与未筛选的组合共有诱变文库相比，所述突变不太频繁地存在于源自筛选过程的命中结果中。在优选的实施方案中，该筛选过程除去含有“降低性能的突变”的变体和/或降低其丰度。

如本文中所用，术语“功能测定法”指提供了蛋白质的活性指示的测定法。在特别优选的实施方案中，该术语指分析蛋白质以其常见能力发挥作用的能力的测定***。例如在酶的情况下，功能测定法涉及确定酶在催化一个反应中的效能。

如本文中所用，术语“目标特性”指待改变的起始基因的特性。不意图使本发明限于任何具体的目标特性。然而，在一些优选的实施方案中，所述目标特性是基因产物的稳定性(例如，针对变性、蛋白酶解或其他降解性因素的抗性)，而在其他实施方案中，改变了生产宿主中的产生水平。实际上，构思了起始基因的任意特性将用于本发明中。

如本文中所用，术语“特性”或其语法等同物在核酸的上下文中指可以选择或检测的核酸的任意特征或属性。这些特性包括，但不限于影响与多肽结合的特性、被赋予包含特定核酸的细胞的特性、影响基因转录的特性(例如，启动子强度、启动子识别作用、启动子调节作用、增强子功能)、影响RNA加工的特性(例如，RNA剪接、RNA稳定性、RNA构象和转录后修饰)、影响翻译的特性(例如，水平、调节、mRNA与核糖体蛋白的结合、翻译后修饰)。例如，可以改变核酸中转录因子、聚合酶、调节因子等的结合位点以产生想要的特征或鉴定不希望的特征。

如本文中所用，术语“特性”或其语法等同物在多肽的上下文中指可以选择或检测的多肽的任意特征或属性。这些特性包括，但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、碱稳定性、pH活性谱、对蛋白酶解降解作用的抵抗力、K_M、k_cat、k_caι/k_M比率、蛋白质折叠、免疫应答诱导作用、与配体结合的能力、与受体结合的能力、分泌的能力、展示在细胞表面的能力、寡聚化能力、信号作用的能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞增殖的能力、诱导凋亡的能力、通过磷酸化或糖基化修饰的能力、治疗疾病的能力。

如本文中所用，术语“筛选”具有本领域中其常见意思，并且一般是一个多步骤过程。在第一步骤中，提供了突变核酸或源自其的变体多肽。在第二步骤中，确定该突变核酸或源自其的变体多肽的特性。在第三步骤中，将所确定特性与对应亲代核酸的特性比较，与对应天然存在多肽的特性或与用于产生该突变核酸的起始物质(例如起始序列)的特性比较。

技术人员显而易见用于获得特性改变的核酸或蛋白质的筛选方法取决于起始物质的特性，其中该突变核酸的产生意图促进修饰所述特性。技术人员因而会理解本发明不限于待筛选的任何具体特性并且对特性的以下描述仅列出说明性例子。在本领域中一般地描述了用于筛选任何具体特性的方法。例如，可以在突变之前和之后测量结合作用、pH、特异性等，其中测量结果的改变表示特征的变化。优选地，所述筛选法以高通量方式进行，包括同时筛选多个样品，包括但不限于利用芯片、噬菌体展示和多种底物和/或指示物的测定法。

如本文中所用，在一些实施方案中，筛选法包括从变体群中富集目的变体的选择步骤。这些实施方案的例子包括选择赋予宿主生物生长优势的变体，以及噬菌体展示法或任何其他展示方法，其中可以基于其结合或催化特性而从变体群中捕获变体。在一个优选的实施方案中，使变体文库暴露于应激(热、蛋白酶、变性作用)并且随后在筛选法中鉴定或通过选择法富集仍完好的变体。意图该术语包括任何适宜的选择手段。实际上，不意图使本发明限于任何具体的筛选方法。

如本文中所用，术语“定向随机化”指产生其中一个或多个位置已经随机化的多个序列的方法。在一些实施方案中，随机化是彻底的(即，全部4种核苷酸A、T、G和C可以出现在随机化位置处)。在备选实施方案中，核苷酸的随机化限于这4种核苷酸的子集。定向随机化可以应用于编码一种或几种目的蛋白的序列的一个或几个密码子。当所得文库表达时，它们产生其中一个或多个氨基酸位置可以含有全部20种氨基酸或一部分氨基酸的混合体的蛋白质群体，如通过随机化密码子的随机化方案确定。在一些实施方案中，因定向随机化产生的群体的各个成员在氨基酸数目上不同，原因在于密码子的定向或随机***或缺失。在其他实施方案中，在产生的蛋白质群体种包含合成性氨基酸。在一些优选的实施方案中，因定向随机化产生的群体的大部分成员对共有序列显示比起始基因更大的序列同源性。在一些实施方案中，该序列编码一种或多种目的蛋白。在备选的实施方案中，所述蛋白质具有不同的生物学功能。在一些优选的实施方案中，引入的序列包含至少一个选择标记。该序列可以编码一种或多种目的蛋白。它可以具有其他生物学功能。在众多情况下，该引入的序列会包括选择标记，如赋予抗生素抗性的基因。

术语“修饰的序列”和“修饰的基因”在本文中可互换地用来指包括对天然存在的核酸序列的缺失、***或打断的序列。在一些优选的实施方案中，修饰序列的表达产物是截短的蛋白质(例如若所述缺失是序列缺失或打断)。在一些特别优选的实施方案中，这种截短的蛋白质仍保留生物学活性。在备选的实施方案中，修饰序列的表达产物是延长的蛋白质(例如，包含向核酸序列中***的修饰)。在一些实施方案中，***产生截短的蛋白质(例如当该***导致终止密码子形成时)。因而，***可以产生截短的蛋白质或延长的蛋白质作为表达产物。

如本文中所用，术语“突变序列”和“突变基因”可互换地使用并且指在宿主细胞的野生型序列中出现的至少一个密码子中具有改变的序列。该突变序列的表达产物是相对于野生型具有已改变氨基酸序列的蛋白质。该表达产物可以具有改变的功能性能力(例如增强的酶活性)。

“致突变引物”或“致突变寡核苷酸”(在本文中可互换地使用)意图指对应于模板序列的一部分并能够与之杂交的寡核苷酸组合物。就致突变引物而言，该引物不会精确地匹配模板核酸，该引物中的一个错配或多个错配用于导入想要的突变至核酸文库中。如本文中所用，“非致突变引物”或“非致突变寡核苷酸”指与模板核酸精确匹配的寡核苷酸组合物。在本发明的一个实施方案中，仅使用致突变引物。在本发明的另一个优选实施方案中，如此设计引物从而其中已经包括致突变引物的至少一个区域，也存在包含于寡核苷酸混合物中的非致突变引物。通过添加致突变引物和与所述致突变引物至少之一相对应的非致突变引物的混合物，有可能产生其中提供了多种组合突变模式的结果核酸文库。例如，若想要突变核酸文库的一些成员仍在某些位置处保留其亲代序列而其他成员在此类位点处突变，则所述非致突变引物提供了在该核酸文库内部针对给定残基获得特定水平非突变成员的能力。本发明的方法使用一般具有10-50之间碱基长度、更优选约15-45碱基长度的致突变和非致突变寡核苷酸。然而，可能需要使用比10碱基更短或比50碱基更长的引物以获得想要的诱变结果。就相应的致突变和非致突变引物而言，不需要相应的寡核苷酸具有相同的长度，不过仅需要在对应于待添加突变的区域中存在重叠。

在一些实施方案中，以预定比率添加引物。例如，若想要所得文库在相同或不同位点处具有显著水平的某种特定突变和较少量的不同突变，则通过调整添加的引物数量，有可能产生想要的偏态文库。备选地，通过添加更少或更多数量的非致突变引物，有可能调节突变核酸文库中产生相应突变的频率。

如本文中所用，短语“连续突变”指存在于相同寡核苷酸引物中的突变。例如，连续突变可以相互毗邻或接近，然而，它们将由相同引物导入所得的突变模板核酸中。

如本文中所用，短语“不连续突变”指存在于分别的寡核苷酸引物中的突变。例如，不连续突变将由独立制备的引物导入所得的突变模板核酸中。

术语“野生型序列”、“野生型核酸序列”和“野生型基因”在本文中可互换地用来指宿主细胞中固有或天然存在的序列。在一些实施方案中，野生型序列指作为蛋白质工程项目起点的目的序列。该野生型序列可以编码同源或异源蛋白。同源蛋白是宿主细胞在无干预下产生的蛋白质。异源蛋白是宿主细胞本不会产生但因干预而产生的蛋白质。

术语“氧化稳定的”指在本发明的蛋白酶水解、水解、清洁或其他过程期间占优势的条件下，例如当暴露于或与漂白剂或氧化剂接触时，经过给定时间段后仍保留指定量酶活性的本发明蛋白酶。在一些实施方案中，与漂白剂或氧化剂接触后经过给定时间段，例如至少1分钟、3分钟、5分钟、8分钟、12分钟、16分钟、20分钟等之后，所述蛋白酶仍保留至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％蛋白酶水解活性。

术语“螯合剂稳定的”指在本发明的蛋白酶水解、水解、清洁或其他过程期间占优势的条件下，例如当暴露于或与螯合剂接触时，经过给定时间段后仍保留指定量酶活性的本发明蛋白酶。在一些实施方案中，与螯合剂接触后经过给定时间段，例如至少10分钟、20分钟、40分钟、60分钟、100分钟等之后，所述蛋白酶仍保留至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％蛋白酶水解活性。

术语“热稳定的”和“热稳定性”指在暴露于确定的温度后，在本发明的蛋白酶水解、水解、清洁或其他过程期间占优势的条件下，例如当暴露于改变的温度时，经过给定时间段后仍保留指定量酶活性的本发明蛋白酶。改变的温度包括提高或降低的温度。在一些实施方案中，在暴露于改变的温度后经过给定时间段，例如至少60分钟、120分钟、180分钟、240分钟、300分钟等之后，所述蛋白酶仍保留至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％蛋白酶水解活性。

术语“增强的稳定性”在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定的蛋白酶的上下文中指随时间流逝，与丝氨酸蛋白酶(例如枯草蛋白酶)和/或野生型酶相比仍保留的更高蛋白酶水解活性。

术语“削减的稳定性”在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定的蛋白酶的上下文中指随时间流逝，与丝氨酸蛋白酶(例如枯草蛋白酶)和/或野生型酶相比仍保留的更低蛋白酶水解活性。

如本文中所用，术语“清洁组合物”除非另外指出包括颗粒形式或粉末形式的通用或“强效(heavy-duty)”洗涤剂，尤其清洁洗涤剂；液体剂、凝胶剂或糊剂形式的通用洗涤剂，尤其所谓强效液体型洗涤剂；液体精细-织物洗涤剂；盘碟手洗洗涤剂或轻垢盘碟洗涤剂，尤其那些泡沫丰富类型的盘碟洗涤剂；盘碟机洗洗涤剂，包括居家和机构用途的多种片状、颗粒、液体和树脂辅助型盘碟机洗洗涤剂；液体清洁与消毒剂，包括抗菌性洗手液型、清洁棒、漱口液、义齿清洁剂、轿车或毛毯香波、浴室清洁剂；发用香波和护发素；沐浴凝胶和泡沫浴清洁剂和金属清洁剂；以及清洁助剂如漂白添加剂和“粘污渍剂(stain-stick)”、预处理类型添加剂。

除非另外说明，全部组分或组合物水平指的是该组分或组合物的有效水平，并且不包括杂质，例如可能存在于市售原料中的残余溶剂或副产物。

酶组分重量基于总活性蛋白质。全部百分数和比率由重量计算，除非另外说明。基于总组成计算AU百分数和比率，除非另外说明。

应当理解在本说明书通篇范围内给出的每个最大数字界限包括每个较小的数字界限，如同在本文中明确地写出此类较小的数字界限。在本说明书通篇范围内给出的每个最小数字界限将包括每个较高的数字界限，如同在本文中明确地写出此类较高的数字界限。在本说明书通篇范围内给出的每个数字范围将包括属于这种较宽泛数字范围内的每个较窄的数字界限，如同在本文中明确地写出此类较窄的数字界限。

术语“清洁活性”指由所述蛋白酶在本发明的蛋白酶水解、水解、清洁或其他过程期间占优势的条件下实现的清洁性能。在一些实施方案中，清洁性能通过应用涉及酶敏感性污渍例如草、血液、乳或卵蛋白的多种测定法确定，如所述污渍经历标准洗涤条件作用后，通过多种色谱、分光光度或其他定量方法学所确定。示例性测定法包括，但不限于WO 99/34011和美国专利号6,605,458中描述的那些测定法以及实施例中所包括的那些方法。

术语蛋白酶的“清洁有效量”指本文中前述的蛋白酶量，所述的蛋白酶量在特定清洁组合物中实现希望的酶活性水平。这种有效量由本领域技术人员轻易地确定并且以众多因素为基础，如所用的具体蛋白酶、清洁用途、该清洁组合物的具体组成和是否需要液态或干态(例如颗粒状、棒状)组合物等。

如本文中所用的术语“清洁辅助物质”意指选择为想要的清洁组合物的特定类型或产品形式(例如液体剂、颗粒剂、粉剂、棒剂、糊剂、喷撒剂、片剂、凝胶剂或泡沫剂组合物)所选择的任何液体、固体或气态物质，所述物质也优选地相容于该组合物中使用的蛋白酶。在一些实施方案中，颗粒剂组合物是“密实”形式，而在其他实施方案中，液体剂组合物是“浓缩”形式。

术语“增强的性能”在清洁活性的上下文中指对某种酶敏感性污渍如卵、乳、草或血液的提高或更大的清洁活性，如标准洗涤循环和/或多个洗涤循环后通过常规评价确定。

术语“削弱的性能”在清洁活性的上下文中指对某种酶敏感性污渍如卵、乳、草或血液的降低或更小的清洁活性，如标准洗涤循环和/或多个洗涤循环后通过常规评价确定。

术语“比较性能”在清洁活性的上下文中指比较蛋白酶(例如市售蛋白酶)的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％清洁活性。清洁性能可以通过在涉及酶敏感性污渍如血液、乳和/或墨水(BMI)的多种测定法比较本发明蛋白酶与其他蛋白酶来确定，如标准洗涤循环条件后，通过常规分光光度或分析方法学确定。

如本文中所用，“低洗涤剂浓度”***包含其中小于约800ppm洗涤剂组分存在于洗涤水中的洗涤剂。一般认为日本洗涤剂是低洗涤剂浓度***，因为它们通常具有存在于洗涤水中的大约667ppm洗涤剂组分。

如本文中所用，“中等洗涤剂浓度”***包含其中约800ppm与约2000ppm洗涤剂组分存在于洗涤水中的洗涤剂。通常认为北美洗涤剂是中等洗涤剂浓度***，因为它们通常具有存在于洗涤水中的大约975ppm洗涤剂组分。巴西洗涤剂一般具有存在于洗涤水中的大约1500ppm洗涤剂组分。

如本文中所用，“高洗涤剂浓度”***包括大于约2000ppm洗涤剂组分存在于洗涤水中的洗涤剂。通常认为欧洲洗涤剂是高洗涤剂浓度***，因为它们通常具有洗涤水中大约3000-8000ppm的洗涤剂组分。

如本文中所用、“织物清洁组合物”包括手动和机器衣物洗涤剂组合物，其包括衣物添加组合物和适用于浸泡和/或预处理污渍织物(例如衣物、亚麻布和其他纺织材料)的组合物。

如本文中所用，“非织物清洁组合物”包括非纺织物(即织物)表面清洁组合物，其包括，但不限于洗涤餐具的洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、义齿清洁组合物和个人清洁组合物。

本文中清洁组合物的“密实”形式最好由密度反映，并且就组合物而言，由无机填充盐的量反映。无机填充盐是粉末形式的洗涤剂组合物常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填充盐以相当大的量存在，一般占总组成重量的17-35％。相反，在密实组合物中，填充盐以不超过总组成15％的量存在。在一些实施方案中，填充盐以不超过组合物重量10％、更优选5％的量存在。在一些实施方案中，无机填充盐选自硫酸碱金属盐和碱土金属盐以及氯化碱金属盐和碱土金属盐。优选的填充盐是硫酸钠。

发明详述

在一些实施方案中，本发明提供了用于改造酶以同时优化其在不利环境条件下的催化活性和稳定性的方法，即便当分析单一突变的作用时这两种特性是负相关的。特别地，本发明提供了用于改变金属蛋白酶的表面净电荷和/或表面电荷分布以获得在洗涤剂制剂中显示改良性能的酶变体的方法。

本发明提供了包含在洗涤剂制剂中具有的改良洗涤性能和/或稳定性的至少一种变体中性金属蛋白酶的方法和组合物。在一些特别优选的实施方案中，本发明提供了解淀粉芽孢杆菌中性金属蛋白酶的变体。本发明特别用于包括但不限于清洁、漂白和消毒的用途。此外，本发明提供了用于改造酶以优化其在不利环境条件下催化活性的方法。特别地，本发明提供了用于改变金属蛋白酶的表面净电荷和/或表面电荷分布以获得在洗涤剂制剂中显示改良性能和/或稳定性的酶变体的方法。

众多蛋白质和酶高度易于变性并且在衣物洗涤剂中贮存时发生不可逆性变性。已知衣物洗涤剂含有阴离子、阳离子和非离子表面活性剂，其中所述表面活性剂根据它们在水中的离子特性(电荷)分类。这些成分与蛋白质分子的表面电荷相互作用，导致蛋白质变性(例如结构和功能丧失)。已经证明NprE(一种中性金属蛋白酶)在包含表面活性剂如LAS的洗涤剂制剂中贮存时是不稳定的。LAS是一种阴离子表面活性剂，其中总体负电荷增强与蛋白质表面上存在的氨基酸的带正电荷侧链的相互作用。此类静电相互作用通过削弱或扰动静电相互作用的稳定性影响蛋白质的内在稳定性。去稳定的蛋白质随后解折叠并变成无活性。在本发明的开发期间，发现所述酶的表面电荷明显影响洗涤性能和/或洗涤剂稳定性。另外，发现蛋白酶表面上带电荷残基的分布强烈影响洗涤性能和/或稳定性。通过优化表面净电荷和/或表面电荷分布，本发明的蛋白质工程方法有效地优化了蛋白酶，用于增强洗涤剂制剂中一种或多种特性的性能。

简而言之，在本发明的一些实施方案中，所述方法包括在目的酶中众多氨基酸残基处产生位点评价文库并分析变体酶的目的特性。随后鉴定对于目的特性(相对于亲代酶)有益、中性和有害的突变以及最佳电荷分布。在一些备选实施方案中，对全部残基进行电荷扫描以产生带有改变每个位点处电荷的突变的变体(例如，将中性残基突变成带正电荷和/或负电荷的残基，并且将带电荷残基突变成带相反电荷的残基和/或中性残基)。在一些其他优选的实施方案中，所述方法包括产生变体的组合“电荷平衡”文库，所述文库包括以希望的方向改变酶电荷的有益突变和以相反方向改变该电荷的有益或中性突变，并随后分析该电荷平衡文库的目的特性。因而，同时优化了酶的表面电荷和表面电荷分布，并且有可能鉴定出在多种特性上改良的酶变体。

本发明的方法用于改善多种类型的酶以及蛋白酶(例如淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶、甘露聚糖酶、果胶酶、淀粉酶、脂肪酶等)的性能。实际上，不意图使本发明限于任何具体的酶和酶类型。此外，本发明用于优化要求特定表面电荷和电荷分布(例如表达、细胞表面结合作用、制剂可操作性等)的非酶性蛋白质特性。

I.产生具有改良特性的蛋白酶变体

对NprE构建了大量的位点评价文库，其中成熟蛋白质的每个氨基酸替换为大部分的其他氨基酸(见美国专利申请号10/576,331和WO2005/052146)。筛选这些文库的洗涤剂稳定性和BMI清洁性能。随后就突变所引起的电荷改变效果方面分析筛选数据。在改造的NprE变体中提高的稳定性和良好BMI(血液、乳、墨水)清洁性能是希望的，然而它们最初似乎是相互排斥的特性。本发明提供了产生更稳定变体的方法，其中所述变体显示良好的BMI清洁性能。

因而，本发明提供了鉴定突变的方法，所述突变产生提高的稳定性或BMI清洁性能，而没有不当地损害其它参数。如本文中所用，短语“非常不适宜的”指具有小于预期值的蛋白质特性。该术语包括具有中性突变的一些低性能蛋白质(小于亲代或野生型蛋白的性能值的80％)；具有无害突变的不良性能蛋白质(小于50％)和具有有害突变的基本上失活的蛋白质(小于5％)。在一些实施方案中，相对性能值表述为性能指数(PI)，它是变体蛋白质性能对亲代蛋白性能之比。随后，平衡电荷突变，从而终末变体相对于野生型酶是+1至+3的。此外，本发明提供了选择氨基酸残基的方法，所述氨基酸残基在酶的3-D结构中似乎不相互作用，因而使多个突变之间的非叠加性最小化。

如本文中所述，使用本发明方法构建了4个NprE变体。这些变体含有10至18个突变。如实施例中更详细地描述，这些变体显示提高的稳定性和与野生型酶相似的BMI清洁性能。

II.用于产生有益的酶变体的一般方法

如本文中所述，确定了BMI微量样品(microswatch)测定法中洗涤性能与酶表面上总体电荷之间的关系。本发明方法用于改善多种酶和蛋白质(例如淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶和其他酶)的性能。简而言之，鉴定了超过约25％暴露于溶剂、超过约50％暴露于溶剂、超过约65％暴露于溶剂的位于野生型酶表面上的氨基酸残基，并且产生其中每个野生型残基被替换为多种其他天然存在的氨基酸的位点评价文库。在一些实施方案中，在分子表面的蛋白质工程包括用酸性或碱性侧链替换中性氨基酸侧链和/或用中性或带负电荷侧链替代带正电荷的侧链或反之操作。此外，指出了在BMI方面显示改良洗涤性能的变体酶的净电荷改变，旨在定义这种结构-功能关系。在额外的实施方案中，一旦确定给定酶的最佳电荷，则筛选天然分离株，旨在鉴定具有最佳电荷/电荷分布的酶变体。

III.产生具有改良特性的淀粉酶变体

通过在成熟酶中4个位置内导入替换组合构建了AmyS-S242Q的组合电荷文库。筛选该文库的BODIPY淀粉水解作用、稻淀粉微量样品清洁性能和酶表达。随后就突变所引起的电荷改变效果方面分析筛选数据。在AmyS-S242Q变体中想要的是提高的蛋白质表达和良好的酶性能，然而发现这些特性是负相关的。本发明提供了产生更高表达的变体的方法，其中所述变体显示良好的稻淀粉清洁性能。因而，本发明提供了鉴定突变的方法，所述突变产生提高的表达或酶活性，而没有不当地损害其它参数。

实验

提供了以下实施例旨在展示和进一步说明本发明的某些优选实施方案和方面，并且不应解释为限制本发明的范围。

在随后的实验公开内容中，使用以下缩写：℃(摄氏度)；rpm(转/分钟)；H₂O(水)；HCl(盐酸)；aa和AA(氨基酸)；bp(碱基)；kb(千碱基)；kD(千道尔顿)；gm(克)；μg和ug(微克)；mg(毫克)；ng(纳克)；μl和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫升)；nm(纳米)；μm和um(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM和uM(微摩尔)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；hr(小时)；MgCl₂(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；OD_28O(在280nm的光密度)；OD_40S(在405nm的光密度)；OD₆₀₀(在600nm的光密度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸盐缓冲盐水[150mM NaCl，10mM磷酸钠缓冲液，pH7.2])；LAS(十二烷基磺酸钠)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；TAED(N，N，N’N’-四乙酰乙二胺)；BES(聚醚砜(polyethersulfone))；MES(一水合2-吗啉乙磺酸；分子量195.24；Sigma # M-3671)；CaCl₂(无水氯化钙；分子量110.99；Sigma # C-4901)；DMF(N，N-二甲基甲酰胺，分子量73.09，d＝0.95)；Abz-AGLA-Nba(2-氨基苯甲酰-L-丙氨酰甘氨酰-L-亮氨酰-L-丙氨酰-4-硝基苄酰胺，分子量583.65；Bachem # H-6675，VWR目录号# 100040-598)；SBG 1％(“具葡萄糖的超级肉汤”；6g大豆胨[Difco]、3g酵母提取物、6g NaCl、6g葡萄糖)；在使用本领域已知的方法消毒前，用NaOH调节pH至7.1；w/v(重量比体积)；v/v(体积比体积)；Npr和npr(中性金属蛋白酶)；SEQUEST(SEQUEST数据库搜索程序，华盛顿大学)；Npr和npr(中性金属蛋白酶基因)；nprE和NprE(解淀粉芽孢杆菌中性金属蛋白酶)；PMN(纯化的MULTIFECT金属蛋白酶)；MTP(微量滴定板)；MS(质谱)；SRI(污渍去除指数)；TIGR(基因组研究所，Rockville，MD)；AATCC(美国纺织化学师与印染师协会)；Procter & Gamble(Procter & Gamble，Inc.，Cincinnati，OH)；Beckman(Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，CA)；Amersham(AmershamLife Science，Inc.Arlington Heights，IL)；ICN(ICN Pharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，CA)；Pierce(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)；EMPA(Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt，St.Gallen，瑞士)；CFT(试验材料中心，Vlaardingen，荷兰)；Amicon(Amicon，Inc.，Beverly，MA)；ATCC(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)；Becton Dickinson(Becton Dickinson Labware，Lincoln Park，NJ)；Perkin-Elmer(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)；Rainin(Rainin Instrument，LLC，Woburn，MA)；Eppendorf(德国汉堡Eppendorf AG)；Waters(Waters，Inc.，Milford，MA)；Geneart(德国雷根斯堡Geneart GmbH)；Perseptive Biosystems(Perseptive Biosystems，Ramsey，MN)；MolecularProbes(Molecular Probes，Eugene，OR)；BioRad(BioRad，Richmond，CA)；Clontech(CLONTECH实验室，Palo Alto，CA)；Difco(Difco实验室，Detroit，MI)；GIBCO BRL或Gibco BRL(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)；Epicentre(Epicentre Biotechnologies，Madison，WI)；Zymo Research(Zymo Research Corp.，Orange，CA)；IntegratedDNA Technologies(Integrated DNA Technologies，Inc.，Coralville，IA)；New Brunswick(New Brunswick Scientific Company，Inc.，Edison，NJ)；Thermoelectron(Thermoelectron Corp.，Waltham，MA)；BMG(德国奥芬堡BMG Labtech，GmbH，)；Greiner(Greiner Bio-One，Kremsmuenster，奥地利)；Novex(Novex，San Diego，CA)；Finnzymes(Finnzymes OY，芬兰)；Qiagen(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)；Invitrogen(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)；Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；DuPontInstruments(Asheville，NY)；Global Medical Instrumentation或GMI(Global Medical Instrumentation；Ramsey，MN)；MJ Research(MJResearch，Waltham，MA)；Infors(Infors AG，Bottmingen，瑞士)；Stratagene(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)；Roche(HoffmannLa Roche，Inc.，Nutley，NJ)；离子束分析实验室(萨里大学离子束中心离子束分析实验室(Guildford，UK)；TOM(Terg-o-Meter)；BMI(血液、乳、墨水)；BaChem(BaChem AG，Bubendorf，瑞士)；Molecular Devices(Molecular Devices，Inc.，Sunnyvale，CA)；MicroCal(Microcal，Inc.，Northhampton，MA)；Chemical Computing(Chemical Computing Corp.，Montreal，加拿大)；NCBI(美国国家生物技术信息中心)；GE Healthcare(GE Healthcare，UK)。

实施例1

测定法

在下文描述的实施例中使用以下测定法。在实施例中指出对下文所提供方案的任意偏离。在这些实验中，使用分光光度计来测量反应结束后形成的产物的吸光度。使用反射计来测量样品的反射率。

A.蛋白质含量测定

1.蛋白质含量测定的BCA(2，2-联喹啉-4，4’-二羧酸；bicinchoninic acid) 测定法

在这些测定法中，使用BCA(Pierce)测定法在微量滴定板(MTP)规格上确定蛋白酶样品中的蛋白质浓度。在这个测定***中，使用的化学品和试剂溶液是：BCA蛋白质测定试剂和Pierce稀释缓冲液(50mM MES，pH6.5，2mM CaCl₂，0.005％TWEEN-80)。使用的设备是SpectraMAX(340型)MTP读数仪。MTP从Costar获得(9017型)。

在本试验中，将200μl BCA试剂移入每一孔，随后移入20μl稀释的蛋白质。彻底混合后，MTP在37℃孵育30分钟。除去气泡，并且在562nm处读取孔内溶液的光密度(OD)。为测定蛋白质浓度，从样品读数中扣除背景读数。对蛋白质标准品(纯化的蛋白酶)标出OD₅₆₂值以产生标准曲线。从该标准曲线外推出样品的蛋白质浓度。

2.用于蛋白质含量测定的Bradford测定法

在这些测定法中，使用Bradford染料试剂(Quick Start)测定法在(MTP)规格上确定蛋白酶样品中的蛋白质浓度。

在这个测定***中，使用的化学品和试剂溶液是：快速启动Bradford染料试剂(BIO-RAD目录号500-0205)、稀释缓冲液(10mM NaCl，0.1mMCaCI₂，0.005％TWEEN-80)。使用的设备是Biomek FX Robot(Beckman)和SpectraMAX(340型，Molecular Devices)MTP读数仪。MTP来自Costar(9017型)。

在本试验中，将200μl Bradford染料试剂移入每一孔，随后移入15μl稀释缓冲液。最后，添加10μl滤过的培养肉汤至诸孔。

彻底混合后，MTP在室温孵育至少10分钟。吹去气泡并且在595nm处读取孔的OD。为测定蛋白质浓度，从样品读数中扣除背景读数(即来自非孵育孔的读数)。所得OD₅₉₅值提供了样品中蛋白质含量的相对量值。

B.用于测试蛋白酶性能的微量样品测定法

使用的设备包括Eppendorf热混合仪和SpectraMAX(340型)MTP读数仪。MTP从Costar获得(9017型)。

洗涤剂制品(TIDE2X Ultra，Clean Breeze液体衣物洗涤剂(Procter& Gamble)；US洗涤调理剂)

将Milli-Q水调节至6gpg水硬度(Ca/Mg＝3/1)，并添加0.78g/L TIDE2X Ultra Clean Breeze洗涤剂。该洗涤剂已经事先在95℃热处理1小时以灭活该制剂中存在的任何酶。搅拌洗涤剂溶液15分钟。然后，添加5mMHEPES(无酸)并调节pH至8.2。

微量样品(microswatches)

从CFT Vlaardingen获得0.25英寸环直径的微量样品。在切割所述样品前，用水洗涤织物(EMPA 116)。将一份微量样品置于96孔微量滴定板的每个孔中。

测试方法

如上文所述制备想要的洗涤剂溶液。在25℃校准热混合仪(Thermomixer)后，将190μl洗涤剂溶液添加至MTP的每个含有微量样品的孔内。对于该混合物，添加10μl稀释的酶溶液，从而酶的终浓度是1μg/ml(从BCA测定法测定)。MTP用胶带密封并置于培养箱中30分钟，以1400转/分钟混合。在适宜条件下孵育后，来自每孔的100μl溶液转移至一个新MTP中。使用MTP SpectraMax读数仪在405nm处对含有100μl溶液/孔的新MTP读数。还包括空白对照以及含有微量样品和洗涤剂但不含酶的对照。

BMI性能的计算

所得吸光度值对空白值(即在无酶时孵育微量样品后获得的吸光度值)进行校正。所得吸光度提供了所测试酶的水解活性的量值。

C.TIDE稳定性测定法

在25％热处理的TIDE2x Ultra Clean Breeze液体衣物洗涤剂存在下，在孵育步骤后测量野生型和变体蛋白酶的稳定性。使用下文所述的AGLA-测定法、荧光96孔板读数仪、培养箱/振荡器(iEMS；Thermoelectron)和培养箱/振荡器(Innova；New Brunswick(4230型)，测定初始和残余活性。MTP来自Costar(9017型)并来自Greiner(黑色板，655076型)。

化学品和试剂

在这个测定***中，使用的化学品和试剂溶液是：

TIDE2x Ultra Clean Breeze

溶解于50g 50mM HEPES pH 8.2和275ml水的混合物中的125gTIDE2x Ultra Clean Breeze(如上文在95℃热处理)；用上清液25％稀释后，TIDE浓度是27.7％(下文称作“TIDE”)。

MES稀释缓冲液

52.6mM MES/NaOH，2.6mM CaCl₂，0.005％ TWEEN-80，pH6.5

AGLA底物

BaChem，目录号H-6675或American Peptide Co.，目录号81-0-31

AGLA底物溶液

溶解于16ml N，N二甲基甲酰胺的451mg AGLA；将该溶液倾倒至304ml MES-缓冲液(52.6mM MES/NaOH，2.6mM CaCl₂，0.005％TWEEN-80，pH 6.5)，同时搅拌。

测试方法

非应激条件

首先，20μl滤过的培养肉汤用180μl MES稀释缓冲液稀释。随后，20μl这种稀释的肉汤用180μl MES稀释缓冲液稀释。随后，10μl这种稀释液用190μl AGLA-底物溶液在25℃预温的板中稀释。吹去存在的任何气泡并且根据AGLA蛋白酶测定方案测量该板。

应激条件

首先，20μl滤过的培养肉汤用180μl TIDE洗涤剂溶液稀释并且在iEMS振荡器中混合5分钟后，在Innova振荡器中进一步孵育。

该板在32℃以200转/分钟孵育总共60分钟。此外，20μl滤过的培养肉汤用180μl TIDE洗涤剂溶液稀释并且在iEMS振荡器中预混合5分钟后，在Innova振荡器中进一步孵育。该板在20℃以200转/分钟孵育总共40分钟。然后，20μl这两种溶液任一者用180μl MES稀释缓冲液稀释并且10μl这种稀释物用190μl AGLA-底物溶液在25℃预温的板中稀释。吹去存在的任何气泡并且根据AGLA蛋白酶测定方案测量该板。

计算

荧光量值在350nm激发和415nm发射处取得。荧光分光光度计软件计算每孔荧光增加对milli-RFU/min线性回归的反应速率：

残余活性百分数：(应激条件的斜率)＊100/(非应激条件的斜率)

D.2-氨基苯甲酰-L-丙氨酰甘氨酰-L-亮氨酰-L-丙氨酰-4-硝基苄酰胺蛋白酶测定法(Abz-AGLA-Nba)

下文所提供的方法提供了某种程度的技术细节，其中所述技术细节产生独立于时间和地点的可重复性蛋白酶测定数据。尽管该测定法可适应于给定的实验条件，然而必须使通过改良方法获得的任意数据与通过原始方法产生的结果相一致。

中性金属蛋白酶切割2-氨基苯甲酰-L-丙氨酰甘氨酰-L-亮氨酰-L-丙氨酰-4-硝基苄酰胺(Abz-AGLA-Nba)的甘氨酸与亮氨酸之间的肽键。溶液中游离的2-氨基苯甲酰-L-丙氨酰甘氨酸(Abz-AG)在415nm处具有最大荧光发射，在340nm处具有最大激发。Abz-AG的荧光被完整Abz-AGLA-Nba分子中的硝基苄酰胺猝灭。

在这些实验中，通过荧光光谱(激发340/发射415)监测由蛋白酶切割Abz-AGLA-Nba引起的Abz-AG释放。Abz-AG的出现率是蛋白酶水解活性的度量值。测定法在非底物限制性初始速度条件下进行。

对于可重复性测定结果，需要带温度控制的微量板混合器(例如Eppendorf Thermomixer)。在添加酶之前，测定溶液在微量板混合器孵育至想要的温度(例如25℃)。添加酶溶液至该混合器中的板，剧烈混合并迅速转移至板读数仪。

需要具有连续数据记录和线性回归分析连同温度控制能力的荧光分光光度计(例如SpectraMax M5、Gemini EM、Molecular Devices)。读数仪总是维持在想要的温度(例如25℃)。设置该读数仪用于顶部读数荧光检测并且将激发设置到350nm并将激发设置到415nm，不使用截止滤光镜。将PMT设置成中等灵敏度并且每孔5个读数。打开自动校准，但仅在第一次读数前校准。该测定法测量3分钟，同时根据选择待监测的孔数，使读数间隔最小化。将读数仪设置成计算milli-RFU/分钟的速率(千个相对荧光单位/每分钟)。用来计算速率的读数数目(Vmax点)设置成等同于2分钟的数目，如通过读数间隔期确定(例如每隔10秒的读数将使用12个点来计算速率)。最大RFU设置成50,000。

酶和底物贮存液的所有吸取均用正压可调节移液器(RaininMicroman)进行。缓冲液、测试液和酶工作溶液由单通道或多通道空气可调节移液器(Rainin LTS)从试管、试剂储库或贮存微量板吸取。仅当使用少数孔时，连续移液器(Eppendorf)才用于转移测试溶液至微量板孔，以使试剂损失最小化。自动移液仪如Beckman FX或Cybio Cybi-well也用于从工作贮存微量板转移酶溶液至分析微量板以便同时注入整个微量板。

试剂和溶液：

52.6mM MES/NaOH，2.6mM CaCl₂，pH 6.5-MES缓冲液

MES酸(10.28g)和292mg无水CaCl₂于大约900mL纯化水中溶解。溶液用NaOH滴定至pH 6.5(在25℃或用温度调节pH探头)。调节过pH的缓冲液补足至1L总体积。最终溶液经过0.22μm无菌滤器过滤并保持在室温。

在DMF中的48mM Abz-AGLA-Nba-Abz-AGLA-Nba贮存液

将大约28mg Abz-AGLA-Nba置于一支小管内。使其溶解于DMF(体积根据聚结的Abz-AGLA-Nba变化)并且涡旋混合几分钟。该溶液在室温避光贮存。

50mM MES，2.5mM CaCl₂，5％DMF，2.4mM Abz-AGLA-NbapH 6.5-测试溶液

1mL Abz-AGLA-Nba贮存液添加至19mL MES缓冲液中并涡旋混合。该溶液在室温避光贮存。

50mM MES，2.5mM CaCl₂，pH 6.5-酶稀释缓冲液

通过添加5mL纯化水至95mL MES缓冲液产生这种缓冲液。

50mM MES，2.5mM CaCl₂，，5％DMF，pH 6.5-底物稀释缓冲液

5mL纯DMF添加至95mL MES缓冲液。该缓冲液用来确定动力学参数。

酶溶液

酶贮存溶液用酶稀释缓冲液稀释成大约1ppm(1μg/mL)浓度。将MULTIFECT中性蛋白酶(野生型NprE)稀释浓度低于6ppm(6μg/mL)。优选连续稀释物。溶液在室温稳定1小时，不过对于较长的贮存时间，在冰上保持所述溶液。

方法

首先，制备全部缓冲液、贮存液和工作溶液。除非另有说明，每种酶稀释液一式三份进行测试。当未完全占满时，酶工作溶液贮存微量板以自板左边开始的全部垂直列排列(以适应板读数仪)。类似地设置相应的测试板。微量板荧光分光光度计如前述设置。

首先，将200μL等份的测试溶液置于96孔微量板的孔内。该板在25℃于温控微量板混合器中避光孵育10分钟。通过从贮存微量板转移10uL酶工作溶液至混合器中的测试微量板启动该测定法。最佳地，使用96孔移液吸头，或在一些实验中，使用8孔多通道移液器首先从最左边列转移。剧烈混合该溶液15秒(在Eppendorf Thermomixer中900转/分钟)。将测试微量板立即转移至微量板荧光分光光度计并且开始记录在350nm激发和415nm发射的荧光量值。荧光分光光度计软件计算每孔荧光增加对milli-RFU/分钟的线性回归的反应速率。在一些实验中，当第一板正在读数时，将第二块板置于微量板混合器用于温度平衡。

初始速率与产物浓度(即释放的2-氨基苯甲酰荧光)成线性关系至多到0.3mM产物，这与具有大约22,000RFU背景荧光的始自2.3mMAbz-AGLA-Nba的溶液中的大约50,000RFU相对应。Abz-AGLA-Nba溶解于DMF中并且在制备当日使用。

实施例2在枯草芽孢杆菌中的NprE蛋白酶产生

在该实施例中，描述了在枯草芽孢杆菌中产生NprE蛋白酶所开展的实验。特别地，提供了在将质粒pUBnprE转化至枯草芽孢杆菌中所使用的方法。转化如本领域已知那样(见，例如WO 02/14490和美国专利申请系列号11/581,102)进行。下文提供的DNA序列(来自解淀粉芽孢杆菌的nprE前导序列、nprE pro和nprE成熟DNA序列)编码NprE前体蛋白。GTGGGTTTAGGTAAGAAATTGTCTGTTGCTGTCGCCGCTTCCTTTATGAGTTTAACCATCAGTCTGCCGGGTGTTCAGGCCGCTGAGAATCCTCAGCTTAAAGAAAACCTGAC GAATTTTGTACCGAAGCATTCTTTGGTGCAATCAGAATTGCCTTCTGTCAGTGACAA AGCTATCAAGCAATACTTGAAACAAAACGGCAAAGTCTTTAAAGGCAATCCTTCTG AAAGATTGAAGCTGATTGACCAAACGACCGATGATCTCGGCTACAAGCACTTCCGT TATGTGCCTGTCGTAAACGGTGTGCCTGTGAAAGACTCTCAAGTCATTATTCACGTC GATAAATCCAACAACGTCTATGCGATTAACGGTGAATTAAACAACGATGTTTCCGC CAAAACGGCAAACAGCAAAAAATTATCTGCAAATCAGGCGCTGGATCATGCTTATA AAGCGATCGGCAAATCACCTGAAGCCGTTTCTAACGGAACCGTTGCAAACAAAAAC AAAGCCGAGCTGAAAGCAGCAGCCACAAAAGACGGCAAATACCGCCTCGCCTATG ATGTAACCATCCGCTACATCGAACCGGAACCTGCAAACTGGGAAGTAACCGTTGAT GCGGAAACAGGAAAAATCCTGAAAAAGCAAAACAAAGTGGAGCATGCCGCCACAACCGGAACAGGTACGACTCTTAAAGGAAAAACGGTCTCATTAAATATTTCTTCTGAAAGCGGCAAATATGTGCTGCGCGATCTTTCTAAACCTACCGGAACACAAATTATTACGTACGATCTGCAAAACCGCGAGTATAACCTGCCGGGCACACTCGTATCCAGCACCACAAACCAGTTTACAACTTCTTCTCAGCGCGCTGCCGTTGATGCGCATTACAACCTCGGCAAAGTGTATGATTATTTCTATCAGAAGTTTAATCGCAACAGCTACGACAATAAAGGCGGCAAGATCGTATCCTCCGTTCATTACGGCAGCAGATACAATAACGCAGCCTGGATCGGCGACCAAATGATTTACGGTGACGGCGACGGTTCATTCTTCTCACCTCTTTCCGGTTCAATGGACGTAACCGCTCATGAAATGACACATGGCGTTACACAGGAAACAGCCAACCTGAACTACGAAAATCAGCCGGGCGCTTTAAACGAATCCTTCTCTGATGTATTCGGGTACTTCAACGATACTGAGGACTGGGATATCGGTGAAGATATTACGGTCAGCCAGCCGGCTCTCCGCAGCTTATCCAATCCGACAAAATACGGACAGCCTGATAATTTCAAAAATTACAAAAACCTTCCGAACACTGATGCCGGCGACTACGGCGGCGTGCATACAAACAGCGGAATCCCGAACAAAGCCGCTTACAATACGATTACAAAAATCGGCGTGAACAAAGCGGAGCAGATTTACTATCGTGCTCTGACGGTATACCTCACTCCGTCATCAACTTTTAAAGATGCAAAAGCCGCTTTGATTCAATCTGCGCGGGACCTTTACGGCTCTCAAGATGCTGCAAGCGTAGAAGCTGCCTGGAATGCAGTCGGATTGTAA(SEQ IDNO：1)

在以上序列中，粗体表示编码成熟NprE蛋白酶的DNA，标准字体表示前导序列(nprE前导序列)，且未下划线部分表示前序列(nprE pro)。下文提供的氨基酸序列(NprE前导序列、NprE pro和NprE成熟DNA序列)(SEQ ID NO：2)与全长NprE蛋白相对应。在这个序列中，下划线部分表示前序列并且粗体表示成熟NprE蛋白酶。

MGLGKKLSVAVAASFMSLTISLPGVQAAENPQLKENLTNFVPKHSLVQSELPSVSDKAI KQYLKQNGKVFKGNPSERLKLIDQTTDDLGYKHFRYVPVVNGVPVKDSQVIIHVDKSN NVYAINGELNNDVSAKTANSKKLSANQALDHAYKAIGKSPEAVSNGTVANKNKAELK AAATKDGKYRLAYDVTIRYIEPEPANWEVTVDAETGKILKKQNKVEHAATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSMDVTAHEMTHGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTDAGDYGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGL(SEQ ID NO：2)

成熟NprE序列描述为SEQ ID NO：3。使用该序列作为制备本文所述变体文库的基础。

AATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSMDVTAHEMTHGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTDAGDYGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGL(SEQ ID NO：3)

使用两条特异性引物：Oligo AB 1740：CTGCAGGAATTCAGATCTTAACATTTTTCCCCTATCATTTTTCCCG(SEQ ID NO：4)和Oligo AB 1741：GGATCCAAGCTTCCCGGGAAAAGACATATATGATCATGGTGAAGCC(SEQ ID NO：5)，通过PCR从解淀粉芽孢杆菌染色体DNA扩增nprE基因而构建pUBnprE表达载体。

PCR在热循环仪中用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes)进行。PCR混合物含有10μl 5×缓冲液(Finnzymes Phusion)、1μl 10mMdNTPs、1.5μl DMSO、1μl每种引物、1μl Finnzymes PhusionDNA聚合酶、1μl染色体DNA溶液50ng/μl，34.5μl MilliQ水。使用以下PCR方案：1)98℃ 30秒；2)98℃ 10秒；3)55℃ 20秒；4)72℃ 1分钟；5)步骤2至4进行25个循环；和6)72℃ 5分钟。

该PCR产生1.9kb DNA片段，该片段用BgIII和BclI DNA限制性酶消化。多拷贝芽孢杆菌载体pUB110(见例如Gryczan，J Bacteriol，134：318-329[1978))用BamHl消化，随后在pUB110 xBamHI载体中连接PCR片段x BgIIIxBclI以形成pUBnprE表达载体。

将pUBnprE转化至枯草芽孢杆菌(ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::(xylR，pxylA-comK)菌株。如WO 02/14490描述开展枯草芽孢杆菌转化。在含有25ml MBD培养基(基于MOPS的确定成分培养基)和20mg/L新霉素的摇瓶中获得携带pUBnprE载体的枯草芽孢杆菌转化体的选择性生长。基本上如本领域已知那样(见Neidhardt等人，J Bacteriol，119：736-747[1974])制备MBD培养基，差异在于基础培养基不含NH₄Cl₂、FeSO₄和CaCl₂之外，使用3mM K₂HPO₄并且该基础培养基补充有60mM脲、75g/L葡萄糖和1％大豆胨。另外，将该微营养物制备为1升中含有400mg FeSO₄.7H₂O、100mg MnSO₄.H₂O、100mgZnSO₄.7H₂O、50mg CuCl₂.2H₂O、100mg CoCl₂.6H₂O、100mgNaMoO₄.2H₂O、100mg Na₂B₄O₇.10H₂O、10ml 1M CaCl₂和10ml 0.5M柠檬酸钠的100X贮存液。培养物在37℃于培养箱/振荡器(Infors)中孵育3日。该培养导致具有蛋白酶水解活性的分泌性NprE蛋白酶的产生，如蛋白酶测定法证实。使用NuPage Novex 10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，目录号NP0301BOX)进行凝胶分析。为制备分析用样品，2体积上清液与1体积1M HCl、1体积4×LDS样品缓冲液(Invitrogen，目录号NP0007)和1％PMSF(20mg/ml)混合并且随后在70℃加热10分钟。然后，25μL每份样品连同10μL SeeBlue plus 2预染蛋白质标准(Invitrogen，目录号LC5925)一起上样到凝胶上。结果清晰地证明本实施例中描述的nprE克隆策略适合在枯草芽孢杆菌中产生有活性的NprE。

实施例3

位点评价文库(SEL)的产生

在本实施例中，描述了用于nprE SEL构建中所用的方法。

含有上文所述nprE表达盒的pUBnprE载体充当模板DNA。该载体含有在位点评价文库构建中使用的独特的BglII限制性位点。简而言之，为构建nprE位点评价文库，开展3个PCR反应，包括在成熟nprE DNA序列中导入突变的目的密码子的2个诱变PCR和用来融合这两个诱变PCR以构建pUBnprE表达载体的第三PCR，其中所述pUBnprE表达载体在成熟nprE序列中包括想要的突变密码子。

诱变的方法基于密码子特异性突变方法，其中使用包含专门设计的三联体DNA序列NNS(N＝A、C、T或G；并且S＝C或G)的长度25至45个核苷酸的正向和反向寡核苷酸引物开展在特定DNA三联体中一次产生全部可能的突变，其中所述NNS与待突变密码子的序列相对应，并且确保在这个特定nprE成熟密码子处随机掺入核苷酸。引物名称中列出的数字对应于特定nprE成熟密码子位置。评价的位点包括：4、12、13、14、23、24、33、45、46、47、49、50、54、58、59、60、65、66、87、90、96、97、100、186、196、211、214、228和280。示例性引物序列表在美国专利申请系列号11/581,102)中描述。

用来构建位点评价文库的两条额外引物含有BglII限制性位点连同两侧有BglII限制性位点的一部分pUBnprE DNA序列。这些引物由Invitrogen产生(50nmole规格，脱盐)：pUB-BglII-FWGTCAGTCAGATCTTCCTTCAGGTTATGACC(SEQ ID NO：6)和pUB-BglII-RV GTCTCGAAGATCTGATTGCTTAACTGCTTC(SEQ IDNO：7)。

每个SEL的构建始于使用pUB-BglII-FW引物和特异性nprE反向诱变引物的两个初级PCR扩增。对于第二PCR，使用pUB-BglII-RV引物和特异性nprE正向诱变引物(对于正向和反向诱变引物等同的nprE成熟密码子位置)。

所述突变在成熟nprE序列中的导入使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes；目录号F-530L)进行。全部PCR根据随同该聚合酶提供的Finnzymes方案进行。对于初级PCR的PCR条件是：

对于初级PCR 1：

pUB-BglII-FW引物和特异性NPRE反向诱变引物-两者均1μL(10μM)；

对于初级PCR 2：

pUB-BglII-RV引物和特异性NPRE正向诱变引物-两者均1μL(10μM)；

以及

5×Phusion HF缓冲液10μL

10mM dNTP混合物1μL

Phusion DNA聚合酶0.75μL(2单位/μL)

DMSO，100％1μL

pUBnprE模板DNA 1μL(0.1-1ng/μL)

高压灭菌蒸馏水直至50μL

PCR程序是：98℃ 30秒，30x(98℃ 10秒，55℃ 20秒，72℃ 1.5分钟)和72℃ 5分钟，在PTC-200 Peltier热循环仪(MJ Research)中进行。所述PCR实验产生大约2至3kB的2个片段，其具有目的NprE成熟密码子周围约30个核苷酸碱基的重叠。在第三PCR反应中使用前述这两个片段和正向和反向BglII引物融合片段。该融合PCR反应在以下溶液中实施：pUB-BglII-正向引物和pUB-BglII-反向引物-均1μL(10μM)，以及5×Phusion HF缓冲液10μL

10mM dNTP混合物1μL

Phusion DNA聚合酶0.75μL(2单位/μL)

DMSO，100％1μL

初级PCR 1反应混合物1μL

初级PCR 2反应混合物1μL

高压灭菌蒸馏水直至50μL

PCR融合程序如下：98℃ 30秒，30x(98℃ 10秒，55℃ 20秒，72℃2:40分钟)和72℃ 5分钟，在PTC-200 Peltier热循环仪(MJ Research)中进行。

扩增的线性6.5Kb片段使用QIAQUICKPCR纯化试剂盒(Qiagen，目录号28106)进行纯化并用BgIII消化以在该融合片段的两侧产生粘性末端：

-35μL纯化的线性DNA片段

-4μL REACT3缓冲液(Invitrogen)

-1μL BglII，10单位/ml(Invitrogen)反应条件：1小时，30℃。

连接经BglII消化并使用QIAQUICKPCR纯化试剂盒(Qiagen，目录号28106)纯化的片段产生了含有所希望突变的环状和多聚DNA：

-30μL纯化的BglII消化的DNA片段

-8μL T4 DNA连接酶缓冲液(Invitrogen目录号46300-018)

-1μL T4 DNA连接酶，1单位/μL(Invitrogen目录号15224-017)

反应条件：16-20小时，在16℃。

随后，将连接混合物转化到枯草芽孢杆菌(ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::(xylR，pxylA-comK)菌株中。如WO02/14490描述开展枯草芽孢杆菌转化。对于每个文库，挑取96个单菌落并在含新霉素和1.25g/L酵母提取物的MOPS培养基中培养用于序列分析(BaseClear)和筛选目的。每个文库包括最多19个nprE位点特异性变体。

通过在37℃在96孔MTP中的含20mg/L新霉素和1.25g/L酵母提取物的MBD培养基中培育枯草芽孢杆菌SEL转化体68小时，产生了所述变体。

实施例4通过QUIKCHANGE诱变法产生变体蛋白酶

在本实施例，描述了产生nprE SEL的备选方法，尽管本文中提供的方法适合产生其他目的酶的SEL(例如Asp)。如上文实施例3中那样，含有nprE表达盒的pUBnprE载体充当用于产生nprE SEL和NprE变体的模板DNA来源。这两种方法之间的主要不同在于本方法需要使用互补性位点定向致突变引物进行完整载体的扩增。

材料

含有pUBnprE载体的芽孢杆菌菌株

Qiagen质粒微量制备试剂盒(Qiagen目录号12143)

即用型-Lyse溶菌酶(Epicentre目录号R 1802M)

dam甲基化酶试剂盒(New England Biolabs目录号M0222L)

Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(Zymo Research目录号D4001)

nprE位点定向致突变引物，100nmole规格，5’磷酸化的，PAGE纯化的(Integrated DNA Technologies)

QUIKCHANGE多位点定向诱变试剂盒(Stratagene目录号200514)

MJ Research PTC-200 Peltier热循环仪(Bio-Rad Laboratories)

1.2％琼脂糖E-凝胶(Invitrogen目录号G5018-01)

TempliPhi扩增试剂盒(GE Healthcare目录号25-6400-10)

枯草芽孢杆菌感受态细胞(ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::(xylR，pxylA-comK)

方法

为获得含有一个突变的pUBnprE质粒(通过如上文实施例4中和美国专利申请系列号11/581,102中所述的nprE SEL筛选法鉴定的)，使用每种目的芽孢杆菌菌株的单菌落来接种5ml LB+10ppm新霉素试管(例如起子培养物)。该培养物在37℃培育，以225转/分钟振摇6小时。然后，100ml新鲜LB+10ppm新霉素用1ml起子培养物接种。该培养物在37℃培育过夜，以225转/分钟振摇。在这次孵育后，通过充分离心以提供细胞沉淀来收集细胞沉淀。该细胞沉淀重悬于10ml缓冲液P1(Qiagen质粒微量制备试剂盒)中。随后，添加10μl即用型-Lyse溶菌酶至重悬的细胞沉淀并在37℃孵育30分钟。使用造成细胞培养物容积增加的10ml缓冲液P2和P3继续进行Qiagen质粒微量制备试剂盒方案。从芽孢杆菌分离含有单一nprE突变的每种pUBnprE质粒后，测定每种质粒的浓度。所述质粒随后使用dam甲基化酶试剂盒(New England Biolabs)按照制造商的说明书进行dam甲基化，旨在甲基化每管大约2μg每种pUBnprE质粒。使用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒来纯化和浓缩dam-甲基化的pUBnprE质粒。随后将dam-甲基化pUBnprE质粒定量并稀释成每种质粒的50ng/μl工作浓度。分别为每个反应制备混合的位点定向致突变引物。例如，使用pUBnprE T14R质粒作为模板来源，混合的位点定向致突变引物管会含有10μl的nprE-S23R、10μl nprE-G24R、10μl nprE-N46K和10μlnprE-T54R(全部引物均为10μM)。使用QuikChange多位点定向诱变试剂盒(Stratagene)按照照制造商的说明书进行PCR反应(例如，1μl dam甲基化的含有一个突变的pUBnprE质粒(50ng/μl)、2μl nprE位点定向致突变引物(10μM)、2.5μl 10×QuikChange Multi反应缓冲液、1μl dNTP混合物、1μl QuikChange Multi酶混合物(2.5U/μl)，和17.5μl高压灭菌的蒸馏水以产生总计25μl反应混合物。使用以下条件扩增nprE变体文库：95℃，1分钟(仅第1循环)，随后95℃ 1分钟，55℃ 1分钟，65℃ 13.5分钟并且重复循环29次。反应产物在4℃贮存过夜。随后，该反应混合物进行DpnI消化处理(由QUIKCHANGEMulti位点定向诱变试剂盒供应)以使用制造商方案(即1.5μl DpnI限制性酶添加至每个管并在37℃孵育3小时；2μl经DpnI消化的PCR反应物随后在1.2％E-凝胶上分析以确保PCR反应运行和亲代模板被降解)消化亲代pUB-nprE质粒。随后TempliPhi滚环扩增来产生大量的DNA，使用制造商方案(即对于约11μl总反应，1μl经DpnI处理的QuikChange Multi位点定向诱变PCR产物、5μl TempliPhi样品缓冲液、5μl TempliPhi反应缓冲液和0.2μl TempliPhi酶混合物；在30℃孵育3小时；该TempliPhi反应通过添加200μl高压灭菌的蒸馏水进行稀释并短暂涡旋混合)增加nprE多重变体文库的大小。随后，将1.5μl稀释的TempliPhi物质转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞中，并且使用LA+10ppm新霉素+1.6％脱脂乳板选择nprE多重变体。挑取菌落并随后对其测序以鉴定不同的nprE变体文库组合。

表4-1提供了引物名称和在这些实验种使用的序列。综合的DNA技术(Integrated DNA Technologies)合成全部引物(100nmole规格，5’-磷酸化和PAGE纯化)。额外的诱变引物在美国专利申请系列号11/581,102)中描述。评价的位点包括：4、12、13、23、45、49、50、54、59、60、65、82、90、110、119、128、129、130、135、136、137、138、139、140、151、152、155、179、190、197、198、199、204、205、214、216、217、218、219、220、221、222、224、243、244、260、261、263、265、269、273、282、285、286、289、293、296、297和299。

实施例5变体蛋白酶的表达、发酵、纯化和表征

本实施例描述了用来表达、发酵和纯化前述实施例的经转化枯草芽孢杆菌的蛋白酶的方法。

重组枯草芽孢杆菌通过常规分批发酵法在营养培养基中培养。使用一个甘油小管的含有解淀粉芽孢杆菌中性金属蛋白酶的枯草芽孢杆菌培养物来接种600ml含有200mg/L氯霉素的SBG 1％培养基。所述培养物在37℃培育36-48小时，此时间后，如本领域已知，通过在12,000转/分钟离心回收培养液。该流程重复两次。48小时培养获得的最终酶浓度在约1.4和2g/L范围内。在37℃孵育36小时后，将发酵肉汤回收并在12,000转/分钟离心(SORVALL，离心模式RC5B)。从培养液分离所述分泌性中性金属蛋白酶并使用具有BES(聚醚砜)10kDa截止值的Amicon过滤***8400浓缩大约10倍。

浓缩的上清液在4℃对含有10mM NaCl的pH 5.4的25mM MES缓冲液透析过夜。透析物随后加载到如下文所述的阳离子交换柱Poros HS20(总体积约83mL；结合容量约4.5g蛋白质/mL柱；水)上。该柱用含有10mM NaCl的pH 5.4的25mM MES缓冲液预先平衡。随后，将约200-300mL样品加载到该柱上。使用5.4至6.2的pH梯度经10个柱体积的MES缓冲液洗脱结合的蛋白质。蛋白质洗脱在pH 5.8和6.0之间进行并使用如本文中所述的蛋白酶水解活性和10％(w/v)NUPAGESDS-PAGE(Novex)评估。随后汇集含有中性蛋白酶的级分。在调整pH至5.8之前以3∶1比率添加氯化钙和氯化锌盐。Perceptive Biosystens BIOCADVision(GMI)用于蛋白质纯化。

使用10％(w/v)NUPAGESDS-PAGE进行评估，确定纯化的蛋白质是均一的，纯度大于95％。一般，当使用标准蛋白酶测定法以底物N-琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺(Bachem)评估时，纯化的制备物显示可忽略不计的丝氨酸蛋白酶活性。该测定法以微量滴定板(MTP)形式进行，使用含有10mM CaCl₂和0.005％TWEEN-80的pH 8.5的100mM Tris-HCl缓冲液。底物(p-AAPF NA)通过在DMSO(二甲基亚砜)(100mg/ml)中产生160mM贮存液并用含有CaCl₂和0.005％TWEEN-80的Tris-HCl缓冲液稀释该贮存液100倍而制备。随后，10μL稀释的蛋白酶溶液(稀释物使用含有10mM CaCl₂和0.005％TWEEN-80的pH 8.5的100mM Tris-HCl缓冲液制备)添加至190μL 1mg/ml p-AAPF NA溶液。混合该分析物5分钟并且在2至5分钟期间读取在410nm的动力学变化。测量应答的斜率并将其用作丝氨酸蛋白酶活性的量的指示。使用含有1mM氯化锌、4mM氯化钙和40％丙二醇的pH 5.8的25mM MES缓冲液，配制蛋白质用于贮存。

实施例6平衡对蛋白酶活性和稳定性的突变效应

本实施例描述了改造旨在优化两种冲突的酶特性的多重替换蛋白酶变体。表6-1显示如何计算电荷改变。

如本发明研发期间所确定的那样，中位稳定性随增加正电荷而降低。然而，BMI清洁性能随增加正电荷而提高。在测试条件下的最佳BMI清洁性能在约+1的电荷改变取得。

增强的稳定性和BMI清洁性能是NprE工程化变体中受欢迎的。然而，这些特性似乎是冲突的特征。如本发明研发期间确定的那样，使用本发明方法，有可能通过选择性组合单一突变来产生更稳定的变体，同时没有严重损害BMI清洁性能。本文中所述的策略成功地用来产生多重替换NprE变体，所述的NprE变体具有第一特性(例如作为主要特性的稳定性)上的改良，同时改善或未牺牲第二特性(例如作为次要特性的BMI清洁性能)。尤其地，使用以下标准来选择目的替换。选择了提供提高的洗涤剂稳定性或BMI清洁性能而没有不当牺牲其余参数的突变。此外，平衡了电荷突变，从而终末变体相对于野生型酶是+1至+3的。此外，选择在3-D结构中似乎不相互作用的氨基酸残基以使得多个突变之间的非叠加性最小化。

在本发明研发期间，构建了4个变体，每个变体含有10至18个替换。在表6-3中显示这些变体。重要的是，与野生型酶相比，这些多重替换变体具有提高的洗涤剂稳定性和相似的清洁性能。通过导入没有严重损害BMI清洁性能的负电荷和中性电荷稳定性突变，同时平衡没有不当影响稳定性的正电荷性能突变，实现了这一点。构建了额外成组的变体对。每对的第一者具有降低BMI清洁性能的稳定化负电荷突变，并且每对的第二者具有恢复BMI清洁性能同时维持高于稳定性高于野生型水平的补偿性正电荷突变。这些变体的清洁性能和稳定性值也在表6-4中。

实施例7平衡对淀粉酶活性和表达的突变效应

本实施例说明可以通过导入多个氨基酸替换同时优化两个冲突的酶特性。

在该实施例中，描述了旨在产生嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)α淀粉酶(本文中也称作AmyS)、其在枯草芽孢杆菌中突变截短形式(具有一个29氨基酸缺失的S242Q，本文中也称作S242Q)的AmyS变体所开展的实验。转化如本领域已知那样(见，例如WO02/14490)进行。简而言之，将编码所述亲代淀粉酶的基因克隆到pHPLT表达载体中，其中所述pHPLT表达载体含有LAT启动子(PLAT)、编码LAT信号肽的序列(preLAT)，后接用于克隆的PstI和HpaI限制性位点。

嗜热脂肪芽孢杆菌AmyS-S242Q CCL的产生

AmyS-S242Q质粒DNA从转化的枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)分离并送至DNA2.0 Inc.作为用于CCL构建的模板。要求DNA2.0 Inc.(Mountain View，CA)在AmyS-S242Q(S242Q)淀粉酶中4个位点的每个位点处产生位置文库。变体作为96孔板中的甘油贮藏物提供。通过鉴定以下4个残基Gln-97、Gln 319、Gln 358和Gln 443设计出AmyS S242Q组合电荷文库。通过取得三种可能性：野生型、精氨酸或天冬氨酸在每个位点的全部组合，产生一个4位点、81个成员的CCL。

以斜体显示的带有替换氨基酸的成熟截短S242Q淀粉酶的氨基酸序列作为基础用于制备本文中所述的变体文库：

AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKGTSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVYADVVFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDESRKLSRIYKFRGIGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFFFPDWLSYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTASKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTT(SEQ ID NO：13).

淀粉酶表达-2ml规模

含有AmyS、S242Q或AmyTS23t表达载体的枯草芽孢杆菌克隆用钢制96孔复制器从甘油贮藏物复制到含有150μl LB培养基+10μg/ml新霉素的96孔培养板(BD，353075)中，在37℃于加湿箱中220转/分钟培育过夜。来自过夜培养物的100μl等份样用来接种5ml塑料培养管中的2000μl确定成分培养基+10μg/ml新霉素。该培养基是基于MOPS缓冲液的丰富半确定成分培养基，以脲作为主要氮源，以葡萄糖作为主要碳源，并且补充有1％大豆胨和5mM钙用于活跃的细胞生长。培养管在37℃以250转/分钟孵育72小时。孵育后，培养肉汤以3000xg离心10分钟。将上清液倾倒至15ml聚丙烯锥形管并且每个样品80μL分配至96孔板用于蛋白质定量。

通过抗体滴定确定淀粉酶浓度

如本文中所述，通过用抑制性多克隆抗体滴定确定α-淀粉酶的浓度和比活性。发现针对嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)产生的多克隆抗体强烈地抑制AmyS和来自芽孢杆菌物种TS23的α-淀粉酶(例如，结合牢固足以产生活性丧失的线性滴定)。因而，这种抗体可以用来测量酶浓度，后者转而用来计算比活性。简而言之，测量了由抗体的几个已知浓度引起的酶抑制作用的量。从这个信息外推出完全抑制作用所需的抗体浓度，所述抗体浓度等同于样品中酶浓度。使用产生荧光的BODIPY-淀粉测定法测量α-淀粉酶活性和抑制作用。缓冲液是含有0.005％Tween-80的pH 7.0的50mM MOPS。

针对纯化的AmyS的多克隆抗体在兔中产生并由标准方法纯化。通过测量对比活性已知的AmyS样品的抑制作用，确定了抗体贮存液的实验性“表观浓度”值。随后，抗体样品用来确定AmyS和TS23t变体的浓度和比活性。使用这些值来产生归一化96孔酶贮存板，其中全部变体稀释至通常浓度。

用于确定淀粉酶活性的Bodipy-淀粉测定法

使用EnzChek超级淀粉酶测定试剂盒(E33651，Invitrogen)开展Bodipy-淀粉测定。通过将含有冻干底物的小瓶的内容物溶解于pH 4.0的100μL 50mM乙酸钠缓冲液中制备1mg/mL DQ淀粉底物的贮存液。将小瓶涡旋混合约20秒并置于室温黑暗中，偶尔混合直至溶解。添加900μL测试缓冲液(50mM乙酸钠，含2.6mM CaCl₂，pH 5.8)并且将该小瓶涡旋混合约20秒。该底物溶液贮存在室温于黑暗中直至待用或贮存在4℃。对于该测定法，从测试缓冲液中的1mg/mL底物溶液制备100μg/mL DQ底物工作溶液。190μL 100μg/mL底物溶液添加至96孔平底微量滴定板中的每个孔。添加10μL酶样品至各孔，使用热混合仪以800转/分钟混合30秒。测定法中包括仅含有缓冲液和底物的空白样品(无酶空白)。在25℃于荧光微量滴定板读数仪中测量荧光强度变化率(激发：485nm，发射：520nm)5分钟。

α-淀粉酶结合

淀粉酶变体在标准洗涤条件下与或不与CS-28稻淀粉微量样品孵育30分钟。游离酶的量由BODIPY-淀粉测定法测量。与所述微量样品结合的酶的部分计算如下：结合的部分＝(样品不存在时的酶活性-样品存在时的酶活性)/(样品不存在时的酶活性)

结果

如本发明研发期间所确定的那样，AmyS-242Q的中位表达随增加正电荷而降低。然而，特异性BODIPY淀粉水解作用随增加正电荷而提高。增强的重组淀粉酶表达和淀粉水解作用例如在适用于燃料乙醇工业中淀粉液化或洗涤剂应用中清洁的AmyS-242Q的工程化变体中是受欢迎的。然而，这些特性明显是冲突的特征。如本发明研发期间所确定的那样，使用本发明方法，有可能通过选择性组合单一突变来产生更高度表达的淀粉酶变体，同时没有严重损害淀粉水解作用。本文中所述的策略成功地用来产生和选择多重替换的AmyS-242Q变体，所述的AmyS-242Q变体具有第一特性(例如作为主要特性的表达)上的改良，同时改善或未牺牲第二特性(例如作为次要特性的淀粉水解作用)。

此外，与AmyS-242Q变体的中位表达相反，稻淀粉微量样品清洁作用随增加正电荷而提高。增强的重组淀粉酶表达和清洁性能在AmyS-242Q的工程化变体中是受欢迎的。然而，这些特性明显也是冲突的特征。如本发明研发期间所确定的那样，使用本发明方法，有可能通过选择性组合单一突变来产生更高度表达的淀粉酶变体，同时没有严重损害清洁性能。本文中所述的策略成功地用来产生和选择多重替换的AmyS-242Q变体，所述的AmyS-242Q变体具有第一特性(例如作为主要特性的表达)上的改良，同时改善或未牺牲第二特性(例如作为次要特性的稻淀粉微量样品清洁作用)。

特别地，测试了一个含80个成员的AmyS-S242Q电荷组合文库(CCL)的振荡管表达、BODIPY-淀粉水解作用和稻淀粉清洁活性，其中所述AmyS-S242Q电荷组合文库包含具有1至4个带电荷残基替换的组合的变体。在表7-1和7-1中显示AmyS-S242Q优胜者。重要的是，与亲代酶相比，表7-1的多重替换变体具有等同或改善的表达和等同或改良的BODIPY-淀粉水解作用。类似地，与亲代酶相比，表7-2的多重替换变体具有等同或改善的表达和等同或改良的稻淀粉清洁活性。

总之，因为酶活性和酶产生具有不同的电荷依赖性(见图2A，2B，3A和3B)，故它们是负相关的(见图1A和1B)。然而，存在着在表达和活性方面均改善的众多变体，并且以这种方式分析所述文库导致鉴定到这些变体。

尽管以淀粉酶进行了阐述，然而本方法适用于其他酶类，如蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、转移酶和果胶酶。另外，可以同时分析两种或多种特性的任何组合，如表达、活性、结合作用、热稳定性、洗涤剂和/或螯合剂稳定性。

本说明书中提到的全部专利及出版物说明了本发明所属领域的技术人员的水平。本领域技术人员轻易地认识到本发明充分地适应于实施所述目的并且获得所提及的结果和优势，以及其中固有的那些结果和优势。本文所述的组合物和方法是优选实施方案的代表，是示例性的，并且不意图作为对本发明范围的限制。本领域技术人员轻易地知道可以对本文披露的本发明进行各种替换和修改而不脱离本发明的范围和精神。

本文中示范性描述的本发明可以在本文未具体披露的任意要素或诸要素、限制或诸限制不存在的情况下实施。已经使用的术语和表述作为描述性而非限制性术语使用，并且在使用此类术语和表述时不意图排除所示或所述属性或其部分的任意等同物，不过应当意识到在要求授予权利的本发明范围内可能存在多种修改。因此，应当理解尽管本发明已经通过优选的实施方案和任选特性具体地披露，然而本领域技术人员可以求助于本文所披露概念的修改和变化，并且将此类修改和变化认为属于如本文中定义的本发明范围。

本发明已经在本文中广泛且一般性地加以描述。属于一般性公开内容的每个更小种类组和次级类属组也形成本发明的部分。这包括用限制条款或否定性限制条件对本发明的类属性描绘，其中所述的限制条款或否定性限制条件从所述类属中排除任意主题物，无论所排除的材料是否在本文中具体提及。

序列表

<110>丹尼斯科美国公司

<120>用于改善蛋白质特性的方法

<130>30973WO-2

<140>PCT/US2008/007114

<141>2008-06-06

<150>US 60/933,307

<151>2007-06-06

<150>US 60/933,331

<151>2007-06-06

<150>US 60/933,312

<151>2007-06-06

<160>15

<170>PatentIn版本3.5

<210>1

<211>1566

<212>DNA

<213>解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400>1

gtgggtttag gtaagaaatt gtctgttgct gtcgccgctt cctttatgag tttaaccatc 60

agtctgccgg gtgttcaggc cgctgagaat cctcagctta aagaaaacct gacgaatttt 120

gtaccgaagc attctttggt gcaatcagaa ttgccttctg tcagtgacaa agctatcaag 180

caatacttga aacaaaacgg caaagtcttt aaaggcaatc cttctgaaag attgaagctg 240

attgaccaaa cgaccgatga tctcggctac aagcacttcc gttatgtgcc tgtcgtaaac 300

ggtgtgcctg tgaaagactc tcaagtcatt attcacgtcg ataaatccaa caacgtctat 360

gcgattaacg gtgaattaaa caacgatgtt tccgccaaaa cggcaaacag caaaaaatta 420

tctgcaaatc aggcgctgga tcatgcttat aaagcgatcg gcaaatcacc tgaagccgtt 480

tctaacggaa ccgttgcaaa caaaaacaaa gccgagctga aagcagcagc cacaaaagac 540

ggcaaatacc gcctcgccta tgatgtaacc atccgctaca tcgaaccgga acctgcaaac 600

tgggaagtaa ccgttgatgc ggaaacagga aaaatcctga aaaagcaaaa caaagtggag 660

catgccgcca caaccggaac aggtacgact cttaaaggaa aaacggtctc attaaatatt 720

tcttctgaaa gcggcaaata tgtgctgcgc gatctttcta aacctaccgg aacacaaatt 780

attacgtacg atctgcaaaa ccgcgagtat aacctgccgg gcacactcgt atccagcacc 840

acaaaccagt ttacaacttc ttctcagcgc gctgccgttg atgcgcatta caacctcggc 900

aaagtgtatg attatttcta tcagaagttt aatcgcaaca gctacgacaa taaaggcggc 960

aagatcgtat cctccgttca ttacggcagc agatacaata acgcagcctg gatcggcgac 1020

caaatgattt acggtgacgg cgacggttca ttcttctcac ctctttccgg ttcaatggac 1080

gtaaccgctc atgaaatgac acatggcgtt acacaggaaa cagccaacct gaactacgaa 1140

aatcagccgg gcgctttaaa cgaatccttc tctgatgtat tcgggtactt caacgatact 1200

gaggactggg atatcggtga agatattacg gtcagccagc cggctctccg cagcttatcc 1260

aatccgacaa aatacggaca gcctgataat ttcaaaaatt acaaaaacct tccgaacact 1320

gatgccggcg actacggcgg cgtgcataca aacagcggaa tcccgaacaa agccgcttac 1380

aatacgatta caaaaatcgg cgtgaacaaa gcggagcaga tttactatcg tgctctgacg 1440

gtatacctca ctccgtcatc aacttttaaa gatgcaaaag ccgctttgat tcaatctgcg 1500

cgggaccttt acggctctca agatgctgca agcgtagaag ctgcctggaa tgcagtcgga 1560

ttataa 1566

<210>2

<211>521

<212>PRT

<213>解淀粉芽孢杆菌

<400>2

Met Gly Leu Gly Lys Lys Leu Ser Val Ala Val Ala Ala Ser Phe Met

1 5 10 15

Ser Leu Thr Ile Ser Leu Pro Gly Val Gln Ala Ala Glu Asn Pro Gln

20 25 30

Leu Lys Glu Asn Leu Thr Asn Phe Val Pro Lys His Ser Leu Val Gln

35 40 45

Ser Glu Leu Pro Ser Val Ser Asp Lys Ala Ile Lys Gln Tyr Leu Lys

50 55 60

Gln Asn Gly Lys Val Phe Lys Gly Asn Pro Ser Glu Arg Leu Lys Leu

65 70 75 80

Ile Asp Gln Thr Thr Asp Asp Leu Gly Tyr Lys His Phe Arg Tyr Val

85 90 95

Pro Val Val Asn Gly Val Pro Val Lys Asp Ser Gln Val Ile Ile His

100 105 110

Val Asp Lys Ser Asn Asn Val Tyr Ala Ile Asn Gly Glu Leu Asn Asn

115 120 125

Asp Val Ser Ala Lys Thr Ala Asn Ser Lys Lys Leu Ser Ala Asn Gln

130 135 140

Ala Leu Asp His Ala Tyr Lys Ala Ile Gly Lys Ser Pro Glu Ala Val

145 150 155 160

Ser Asn Gly Thr Val Ala Asn Lys Asn Lys Ala Glu Leu Lys Ala Ala

165 170 175

Ala Thr Lys Asp Gly Lys Tyr Arg Leu Ala Tyr Asp Val Thr Ile Arg

180 185 190

Tyr Ile Glu Pro Glu Pro Ala Asn Trp Glu Val Thr Val Asp Ala Glu

195 200 205

Thr Gly Lys Ile Leu Lys Lys Gln Asn Lys Val Glu His Ala Ala Thr

210 215 220

Thr Gly Thr Gly Thr Thr Leu Lys Gly Lys Thr Val Ser Leu Asn Ile

225 230 235 240

Ser Ser Glu Ser Gly Lys Tyr Val Leu Arg Asp Leu Ser Lys Pro Thr

245 250 255

Gly Thr Gln Ile Ile Thr Tyr Asp Leu Gln Asn Arg Glu Tyr Asn Leu

260 265 270

Pro Gly Thr Leu Val Ser Ser Thr Thr Asn Gln Phe Thr Thr Ser Ser

275 280 285

Gln Arg Ala Ala Val Asp Ala His Tyr Asn Leu Gly Lys Val Tyr Asp

290 295 300

Tyr Phe Tyr Gln Lys Phe Asn Arg Asn Ser Tyr Asp Asn Lys Gly Gly

305 310 315 320

Lys Ile Val Ser Ser Val His Tyr Gly Ser Arg Tyr Asn Asn Ala Ala

325 330 335

Trp Ile Gly Asp Gln Met Ile Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Ser Phe Phe

340 345 350

Ser Pro Leu Ser Gly Ser Met Asp Val Thr Ala His Glu Met Thr His

355 360 365

Gly Val Thr Gln Glu Thr Ala Asn Leu Asn Tyr Glu Asn Gln Pro Gly

370 375 380

Ala Leu Asn Glu Ser Phe Ser Asp Val Phe Gly Tyr Phe Asn Asp Thr

385 390 395 400

Glu Asp Trp Asp Ile Gly Glu Asp Ile Thr Val Ser Gln Pro Ala Leu

405 410 415

Arg Ser Leu Ser Asn Pro Thr Lys Tyr Gly Gln Pro Asp Asn Phe Lys

420 425 430

Asn Tyr Lys Asn Leu Pro Asn Thr Asp Ala Gly Asp Tyr Gly Gly Val

435 440 445

His Thr Asn Ser Gly Ile Pro Asn Lys Ala Ala Tyr Asn Thr Ile Thr

450 455 460

Lys Ile Gly Val Asn Lys Ala Glu Gln Ile Tyr Tyr Arg Ala Leu Thr

465 470 475 480

Val Tyr Leu Thr Pro Ser Ser Thr Phe Lys Asp Ala Lys Ala Ala Leu

485 490 495

Ile Gln Ser Ala Arg Asp Leu Tyr Gly Ser Gln Asp Ala Ala Ser Val

500 505 510

Glu Ala Ala Trp Asn Ala Val Gly Leu

515 520

<210>3

<211>300

<212>PRT

<213>解淀粉芽孢杆菌

<400>3

Ala Ala Thr Thr Gly Thr Gly Thr Thr Leu Lys Gly Lys Thr Val Ser

1 5 10 15

Leu Asn Ile Ser Ser Glu Ser Gly Lys Tyr Val Leu Arg Asp Leu Ser

20 25 30

Lys Pro Thr Gly Thr Gln Ile Ile Thr Tyr Asp Leu Gln Asn Arg Glu

35 40 45

Tyr Asn Leu Pro Gly Thr Leu Val Ser Ser Thr Thr Asn Gln Phe Thr

50 55 60

Thr Ser Ser Gln Arg Ala Ala Val Asp Ala His Tyr Asn Leu Gly Lys

65 70 75 80

Val Tyr Asp Tyr Phe Tyr Gln Lys Phe Asn Arg Asn Ser Tyr Asp Asn

85 90 95

Lys Gly Gly Lys Ile Val Ser Ser Val His Tyr Gly Ser Arg Tyr Asn

100 105 110

Asn Ala Ala Trp Ile Gly Asp Gln Met Ile Tyr Gly Asp Gly Asp Gly

115 120 125

Ser Phe Phe Ser Pro Leu Ser Gly Ser Met Asp Val Thr Ala His G1u

130 135 140

Met Thr His Gly Val Thr Gln Glu Thr Ala Asn Leu Asn Tyr Glu Asn

145 150 155 160

Gln Pro Gly Ala Leu Asn Glu Ser Phe Ser Asp Val Phe Gly Tyr Phe

165 170 175

Asn Asp Thr Glu Asp Trp Asp Ile Gly Glu Asp Ile Thr Val Ser Gln

180 185 190

Pro Ala Leu Arg Ser Leu Ser Asn Pro Thr Lys Tyr Gly Gln Pro Asp

195 200 205

Asn Phe Lys Asn Tyr Lys Asn Leu Pro Asn Thr Asp Ala Gly Asp Tyr

210 215 220

Gly Gly Val His Thr Asn Ser Gly Ile Pro Asn Lys Ala Ala Tyr Asn

225 230 235 240

Thr Ile Thr Lys Ile Gly Val Asn Lys Ala Glu Gln Ile Tyr Tyr Arg

245 250 255

Ala Leu Thr Val Tyr Leu Thr Pro Ser Ser Thr Phe Lys Asp Ala Lys

260 265 270

Ala Ala Leu Ile Gln Ser Ala Arg Asp Leu Tyr Gly Ser Gln Asp Ala

275 280 285

Ala Ser Val Glu Ala Ala Trp Asn Ala Val Gly Leu

290 295 300

<210>4

<211>46

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的引物

<400>4

ctgcaggaat tcagatctta acatttttcc cctatcattt ttcccg 46

<210>5

<211>46

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的引物

<400>5

ggatccaagc ttcccgggaa aagacatata tgatcatggt gaagcc 46

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的引物

<400>6

gtcagtcaga tcttccttca ggttatgacc 30

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的引物

<400>7

gtctcgaaga tctgattgct taactgcttc 30

<210>8

<211>50

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的引物

<400>8

ggtacgactc ttaaaggaaa aagagtctca ttaaatattt cttctgaaag 50

<210>9

<211>49

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的引物

<400>9

gtctcattaa atatttcttc tgaaagaggc aaatatgtgc tgcgcgatc 49

<210>10

<211>50

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的引物

<400>10

ctcattaaat atttcttctg aaagcagagg caaatatgtg ctgcgcgatc 50

<210>11

<211>45

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的引物

<400>11

cacaaattat tacgtacgat ctgcaaaaac gcgagtataa cctgc 45

<210>12

<211>43

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的引物

<400>12

gtataacctg ccgggcagac tcgtatccag caccacaaac cag 43

<210>13

<211>486

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的淀粉酶

<400>13

Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu

1 5 10 15

Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn

20 25 30

Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys

35 40 45

Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp

50 55 60

Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met

85 90 95

Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly

100 105 110

Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln

115 120 125

Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp phe

130 135 140

Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His

145 150 155 160

Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr

165 170 175

Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu

180 185 190

Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His

195 200 205

Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn

210 215 220

Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys

225 230 235 240

Phe Gln Phe phe pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly

245 250 255

Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys

260 265 270

Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp

275 280 285

Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala

290 295 300

Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro

305 310 315 320

Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln

325 330 335

Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala

340 345 350

Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp

355 360 365

Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile

370 375 380

Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His

385 390 395 400

Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val

405 410 415

Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

420 425 430

Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val

435 440 445

Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser

450 455 460

Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp

465 470 475 480

Val Pro Arg Lys Thr Thr

485

<210>14

<211>4

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的试剂

<400>14

Ala Gly Leu Ala

1

<210>15

<211>4

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的底物

<400>15

Ala Ala Pro Phe

1

Claims

1.用于产生改良的蛋白质变体的方法，所述方法以可操作的顺序包括：a)在第一特性的第一试验和在第二特性的第二试验中测试多种单一替换的蛋白质变体，其中亲代蛋白质的特性在每个试验中给予值1.0，适宜的第一或第二特性具有变体蛋白质性能对亲代蛋白性能之比大于1.0，并且非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0.80的比值；b)在单一替换的蛋白质变体的至少之一中鉴定与适宜第一特性相关并且与非常不适宜的第二特性不相关的替换；c)在单一替换的蛋白质变体的至少之一中鉴定与适宜第二特性相关并且与非常不适宜的第一特性不相关的替换；d)导入来自步骤b的替换和来自步骤c的替换至蛋白质以产生多重替换的蛋白质变体；和e)在第一试验和第二试验中测试多重替换的蛋白质变体，其中改良的蛋白质变体在所述第一和第二试验中均实现大于1.0的比值，或在第一试验中实现大于1.0的比值并且在第二试验中实现0.80至1.0的比值，其中所述的多重替换的蛋白质变体是改良的蛋白质变体，且其中(i)所述亲代蛋白质是蛋白酶，所述第一特性是稳定性，且所述第二特性是洗涤性能；或(ii)所述亲代蛋白质是淀粉酶，所述第一特性是蛋白质表达，且所述第二特性是酶活性，且其中所述替换的至少之一包含相对于亲代酶的0、-1或-2的净电荷改变；和/或所述替换的至少之一包含相对于亲代酶的+1或+2的净电荷改变；其中所述改良的酶变体相对于亲代酶具有+1或+2的净电荷改变。

2.权利要求1的方法，还包括产生改良的蛋白质变体。

3.权利要求1的方法，其中第一和第二特性是负相关的。

4.权利要求1的方法，其中所述适宜的第一或第二特性具有大于约1.2的比值。

5.权利要求1的方法，其中所述非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0.60的比值。

6.权利要求5的方法，其中所述非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0.40的比值。

7.权利要求1的方法，其中所述亲代蛋白质是蛋白酶，所述第一特性是稳定性，并且所述第二特性是洗涤性能。

8.权利要求7的方法，其中所述稳定性包含在洗涤剂组合物中的稳定性并且所述洗涤性能包含血-乳-墨洗涤性能。

9.权利要求8的方法，其中所述洗涤性能在包含约5与约12之间pH的粉末或液体洗涤剂组合物中进行测试。

10.权利要求8的方法，其中所述洗涤性能在包含碱性pH的冷水液体洗涤剂中进行测试。

11.权利要求1的方法，其中所述亲代蛋白质是淀粉酶，所述第一特性是蛋白质表达，并且所述第二特性是酶活性。

12.权利要求1的方法，其中所述的蛋白酶选自中性金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。

13.权利要求12的方法，其中所述的丝氨酸蛋白酶是枯草蛋白酶。

14.权利要求12的方法，其中所述的中性金属蛋白酶是从芽孢杆菌科(Bacillaceae)成员获得的中性金属蛋白酶。

15.权利要求1的方法，其中所述的淀粉酶是从芽孢杆菌科成员获得的α淀粉酶。

16.权利要求1的方法，其中所述替换位于亲代酶中具有大于约25％溶剂可及表面的位置内。

17.权利要求1的方法，其中所述替换位于亲代酶中具有大于约50％或大于约65％溶剂可及表面的位置内。

18.权利要求1的方法，其中所述的亲代酶是野生型酶。

19.根据权利要求1的方法获得的分离的中性金属蛋白酶变体，其中所述分离的中性金属蛋白酶变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列的基础上存在选自(i)Q45K和S199E；(ii)G24K、K269T和D220E；(iii)T4K和R280L；和(iv)S23K和K244S的氨基酸替换。

20.清洁组合物，其包含根据权利要求19的改良的蛋白质变体。