ES2622114T3 - Sustancia para restablecer una coexpresión y una interacción normales entre las proteínas LOX y NRAGE - Google Patents

Abstract

Utilización de una sustancia que estimula la expresión de la proteína LOX que tiene la secuencia ID NO: 1 para el tratamiento o la prevención del envejecimiento de la piel, siendo dicha sustancia un extracto de madera entera de Cuasia de Surinam (Cassia amara), preparándose dicha sustancia en forma de composición cosmética.

Description

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DESCRIPCION

Sustancia para restablecer una coexpresion y una interaccion normales entre las protemas LOX y NRAGE.

La invencion se refiere a la utilizacion de una sustancia para restablecer una coexpresion y una interaccion normales entre las protemas LOX y NRAGE.

Estado de la tecnica

1) Generalidades

En los organismos multicelulares, la homeostasis se mantiene mediante un equilibrio entre la proliferacion celular, la diferenciacion de celulas implicadas con una funcion definida y la muerte celular, programada o no.

La piel, por ejemplo, puede considerarse como un organo cuya una de las funciones espedficas es proteger al organismo de las agresiones externas. El aislamiento con el exterior lo garantiza una capa cornea muy queratinizada compuesta por celulas muertas. Por tanto, la via de las celulas de la epidermis, los queratinocitos, esta marcada por una sucesion de evoluciones sucesivas que conducen a esta diferenciacion en celulas queratinizadas y muertas: (1) mantenimiento de celulas iniciadoras (celulas “madre" de la capa basal de la epidermis), (2) division asimetrica (cada celula madre produce dos celulas hermanas), (3) diferenciacion (formacion de capas suprabasales de la epidermis a partir de una de las celulas "hermanas iniciadoras"), (4) adquisicion de una resistencia a la muerte celular de tipo apoptotico, (5) evolucion hacia celulas cornificadas y (6) muerte celular programada de capas celulares superiores de la epidermis. Cualquier modificacion de este equilibrio puede ser patologica.

El experto en la materia conoce diversas moleculas y mecanismos biologicos que tienen en cuenta determinados aspectos de fenomenos celulares de proliferacion, diferenciacion y apoptosis. Sin embargo, realmente no hay datos que informen sobre cualquier mecanismo que relacione estos tres fenomenos, y que constituina asf una diana sobre la cual actuar en vista de controlarlos y regularlos.

2) LOX (proteina)

LOX pertenece a la familia de las lisil oxidasas (LO), que son amina oxidasas dependientes de cobre. Hasta ahora, se han caracterizado 5 genes LO: LOX, LOXL, LOXL2, LOXL3 y LOXL4. Si LOX se conoce por su funcion en la reticulacion del colageno ex vivo e in vivo, LOXL esta claramente asociado a la homeostasis de fibras elasticas. La funcion in vivo de las otras isoformas se desconoce.

Diversas celulas, tales como los fibroblastos, las celulas musculares lisas, las celulas endoteliales y los queratinocitos sintetizan las LO. Esta enzima esta por tanto presente en numerosos tejidos tales como en la piel, el hngado, los rinones, el bazo y la aorta, tanto a nivel extracelular como intracelular.

2.1) Estabilizacion de la matriz extracelular - funcion extracelular

La funcion extracelular de LOX, a partir de ahora bien conocida, consiste en estabilizar la matriz extracelular (MEC) de los tejidos conjuntivos. LOX tiene en efecto como funcion reticular los colagenos fibrilares y la elastina. Para ello, cataliza la desaminacion oxidativa de restos lisilo e hidroxilisilo de moleculas de procolageno fibrilares y de tropolastina, reaccion que viene acompanada por la liberacion de amoniaco y de peroxido de hidrogeno. Los restos aldehndo formados se condensan por tanto espontaneamente con funciones de aldehndos o aminas adyacentes, conduciendo a enlaces intra o intermoleculares. Estas condensaciones originan puentes que se encuentran en las fibras de colageno y de elastina. Por tanto, tanto LOX como las LO, se estudian en campos biomedicos que implican una evolucion de la MEC (envejecimiento, fibrosis, cancer, cicatrizacion, patologfas osteoarticulares y cardiovasculares, angiogenesis).

Se ha demostrado in vitro que los nitrilos organicos eran inhibidores irreversibles de LOX. De este modo, el, U- aminoproprilnitrilo (U-APN) se fija, de manera competitiva, con los sustratos alquil amina, sobre el sitio activo de LOX; las LO utilizan como sustrato el U-APN, formando asf una base de Schiff, pero sin liberacion de producto aldehndo, lo que bloquea el sitio activo de manera covalente sin tener efecto sobre la smtesis. Basandose en esto, los inventores han descrito la utilizacion de diferentes inhibidores de lisil oxidasas, entre ellos U-APN, para evitar la desdiferenciacion de ciertos tipos celulares (condrocitos...) que se produce sistematicamente cuando se cultivan estas celulas (Farjanel et al, patente francesa 01.10443, CNRS, Utilizacion de inhibidores de lisil oxidasas para el cultivo celular e ingeniena tisular n.° depositada el 3 de agosto de 2001, n.° de publication: 2 828 206). Sin embargo, este documento se refiere a las lisil oxidasas en su conjunto y no particularmente a la isoforma de LOX; ademas, se refiere exclusivamente a la inhibicion de la desdiferenciacion de celulas en cultivo in vitro, no dando ninguna informacion sobre la funcion de las lisil oxidasas, ni aun mas de LOX, en el mantenimiento del equilibrio entre la proliferacion, diferenciacion y apoptosis, ni tampoco proporciona informacion sobre nuevos companeros o sustratos de lisil oxidasas, ni de LOX.

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2.2) Funcion intracelular

La funcion intracelular de LOX, y de las LO en general, es menos conocida. De este modo, aunque se admite que LOX participa en la regulacion del desarrollo, en la diferenciacion, movilidad o senescencia celular (Csizar, Lysyl oxydases: A novel multifunctional amine oxydase familty, Nucleic Acid research and Molecular Biology, 2001, 70:228), los mecanismos moleculares subyacentes no estan aclarados.

2.2.1) LOX y homeostasis celular.

La posible implicacion de LOX en la regulacion de la homeostasis celular (mantenimiento de un equilibrio fisiologico entre proliferacion, diferenciacion y apoptosis) esta comunmente aceptada (Jeay et al., Lysyl oxydase inhibits Ras- mediated transformation by preventing activation of NF-KB, Mol. Cell. Biol., 2003, 23:2251-2263), sin embargo los mecanismos subyacentes aun son desconocido para el experto en la materia.

Por tanto, el experto en la materia dispone actualmente de algunos datos que indican una relacion posible entre LOX y la diferenciacion, por un lado, y LOX y la proliferacion/transformacion celular, por otro lado. Por lo tanto, la tecnica anterior no indica una posible relacion entre LOX y apoptosis.

2.2.2) LOX y diferenciacion epidermica

LOX se ha localizado en la epidermis, con una expresion regulada en funcion del nivel de diferenciacion de los queratinocitos (Noblesse et al, Lysyl oxydase like and lysyl oxydase are present in the dermis and epidermis of a skin equivalent and in human skin and are associated to elastic fibers, J. Invest. Dermatol., 2004, 122 621-630). Sin embargo, los estudios realizados a dfa de hoy no han permitido definir la funcion de LOX en los queratinocitos ni investigar sus companeros en estas celulas, que no forman (o muy poco) colageno y elastina.

2.2.3) LOX y transformacion celular.

El gen LOX esta claramente asociado al mantenimiento del fenotipo no tumoral de las celulas.

Se han emitido dos hipotesis para explicar esta funcion de LOX. La primera hipotesis sugiere que la reticulacion de la MEC induce a un entorno tridimensional favorable al mantenimiento del estado no tumoral. Esta hipotesis esta demostrada por el hecho de que LOX y LOXL no se expresan cuando los canceres se convierten en invasivos, mientras que estan presentes en los canceres in situ (Peyrol et al., Lysyl oxidase gene expression in the stromal reaction to in situ and invasive ductal breast carcinoma., Am J Pathol. Feb; 150(2):497-507 1997). La otra hipotesis se refiere a la funcion intracelular de las LO, sobre sustratos aun por descubrir por experto en la materia (Li et al. Localization and activity of lysyl oxidase within nuclei of fibrogenic cells., Proc Natl Acad Sci USA., 1997 Nov 25; 94(24):12817-2.).

En efecto, parece que la enzima LOX es un supresor del oncogen ras, y que mutaciones somaticas en el gen estan asociadas a diversos canceres (Contente et al., Expression of gene rrg is associated with reversion of NIH 3T3 transformed by LTR-c-H-ras, Science, 1990, 249:796-798; Csiszar et al., Somatic mutations of the lysyl oxidase gene on chromosome 5q23.1 in colorectal tumors, Int. J. Cancer, 2002, 97:636-642). Recientes trabajos muestran que el bajo nivel de expresion de LOX en los fibroblastos transformados por ras se debe a la actividad del factor de crecimiento autocrino FGF-2, y que el farmaco antitumoral suramina permite la re induccion de la expresion de la enzima (Palamakumbura et al., Autocrine growth factor regulation of lysyl oxidase expression in transformed fibroblasts., J Biol Chem., 2003, Aug 15; 278(33):30781-7; Epub 2003 Jun 4). Por otra parte, se ha demostrado que la reexpresion de LOX en estos fibroblastos inhibe su crecimiento en agar blando, y que, actua sobre la via de senalizacion NF-kB a traves de la regulacion de la localizacion de la protema AKT (Jeay et al., Lysyl oxydase inhibits Ras-mediated transformation by preventing activation of NF-B, Mol. Cell. Biol., 23:2251-2263, 2003).

Como ocurre con otros supresores tumorales, LOX actua probablemente segun la disponibilidad y la regulacion de sus sustratos y companeros celulares, pero estos ultimos siguen siendo desconocidos para el experto en la materia.

2.2.4) Apoptosis

El termino apoptosis se utiliza para describir una forma particular de muerte celular, que presenta caractensticas morfologicas diferentes de celulas de la necrosis.

La apoptosis es un proceso de muerte celular programada que requiere la adquisicion de caspasas. Durante este proceso, las celulas adquieren caractensticas morfologicas particularmente notables, como la condensacion de la cromatina y la fragmentacion del nucleo, conduciendo a su autodestruccion y a su eliminacion del tejido sin danar las celulas adyacentes.

La apoptosis corresponde a la muerte natural de las celulas, durante su desarrollo, o durante la homeostasis.

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La tecnica anterior informa sobre un determinado numero de actores y de mecanismos que, a traves de los procesos celulares de apoptosis y de diferenciacion, estan implicados en la regulacion del ciclo celular.

3) NRAGE (PROTEINA)

De este modo, en particular, se conoce una familia de protemas que estan implicadas en la regulacion del ciclo celular, de la diferenciacion y de la apoptosis. Se trata de la familia de protemas MAGE (por las siglas en ingles Melanoma Associated Antigen, antigeno asociado a melanoma), cuyo de sus miembros, la protema NRAGE, denominada tambien "neurotrophin-receptor-interacting MAGE homolog, homologo de MAGE que interacciona con el receptor de neurotrofina” es particularmente conocida por su funcion proapoptotica mediante el factor neurotrofico NGF.

La protema NRAGE contiene 778 aminoacidos. Lleva un primer dominio caractenstico de las protemas MAGE: el dominio de homologfa MAGE (MHD-1) en la region central y, en la region N-terminal, un segundo dominio: MHD-2, unicamente presente en determinadas isoformas. Estos dos dominios presentan zonas ricas de restos lisilo. Entre estos dos dominios, existe una region denominada IRD (por las siglas en ingles Interspersed Repeat Domain, Dominio de Repeticion Intercalado) que no existe en ninguna protema conocida hasta ahora.

La protema NRAGE esta implicada en el control de la apoptosis a traves de diferentes rutas.

• Por su interaccion con p75NTR, que es receptor de “baja afinidad” de factores de neutrofilos (NGF) o de TNF, NRAGE pueden bloquear la progresion del ciclo celular y es, de este modo, proapoptotica a traves de la ruta de las caspasas.

• NRAGE es tambien proapoptotica ya que interacciona con los inhibidores citoplasmicos de protemas apoptoticas IPA.

• NRAGE tambien puede actuar directamente sobre la actividad de homofactores nucleares, como los factores Msx y Dlx que intervienen en la regulacion morfogenica de tejidos.

Aunque la expresion de NRAGE es ubicua, la tecnica anterior no informa de su presencia a nivel de la piel.

La tecnica anterior tampoco aporta ninguna informacion sobre una eventual relacion entre LOX y la apoptosis, ni tampoco sobre un vinculo entre LOX y NRAGE.

4) Conclusion sobre la tecnica anterior

La tecnica anterior no proporciona la identidad de nuevos companeros o sustratos de LOX, particularmente interviniendo en el mantenimiento del equilibrio celular entre proliferacion, diferenciacion y apoptosis, por otra parte, la tecnica anterior no proporciona la identidad de estos nuevos companeros o sustratos ni en las celulas epiteliales (en particular los queratinocitos), ni en ningun otro tipo celular en absoluto.

La tecnica anterior no informa sobre las eventuales variaciones de expresion de LOX a nivel epidermico (particularmente expresada por los queratinocitos), en funcion de la edad, de la existencia o no de exposicion a los UV o de otros tipos de agresiones, o en caso de patologfas que afectan a la piel (soriasis, respuesta de huesped contra injerto, cancer...).

La tecnica anterior no describe la implicacion de LOX en la apoptosis.

La tecnica anterior no informa sobre la eventual presencia de NRAGE en la piel, bien se trate de piel sana, de piel alterada por la edad o por los UV, o que haya sufrido otros tipos de agresiones, o de piel patologica.

La tecnica anterior no dispone de modelos conocidos para estudiar NRAGE en estas celulas de origen epitelial, ni en la epidermis.

La tecnica anterior no informa de ninguna otra interaccion de LOX con NRAGE, cualquiera que sea el tejido.

La tecnica anterior no proporciona ningun modelo que permita la identificacion de principios activos capaces de modular la expresion de LOX y/o de NRAGE en los queratinocitos.

Por otro lado, actualmente la experimentacion con animales esta prohibida en Europa para determinadas aplicaciones y la experimentacion con seres humanos esta eticamente discutida. Por tanto, no es aceptable para los inventores efectuar un metodo de seleccion aplicado en animales o en seres humanos.

En el modelo tridimensional MIMESKIN® (Coletica, Francia), LOX se expresa a nivel de la epidermis, con una expresion regulada en funcion del nivel de diferenciacion de los queratinocitos (Noblesse et aI, 2004). Durante estos estudios, no se investigaba ni la expresion de NRAGE, ni la existencia de una eventual relacion entre LOX y la apoptosis. De este modo, no era obvio para el experto en la materia interesarse en la modulacion de la expresion de LOX y/o de NRAGE para regular la homeostasis celular basandose en el equilibrio entre proliferacion, diferenciacion

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y apoptosis, en el caso en el que este alterada (edad, estres, patolog^as), lo que constituye por tanto un problema tecnico nuevo.

Por tanto, la tecnica anterior no proporciona principios activos capaces de modular la expresion de companeros intracelulares de LOX (como NRAGE) asociada o no a una modulacion de la expresion de LOX con el objetivo de actuar sobre la regulacion celular. En este ambito, tambien es difmil obtener criterios objetivos que permitan juzgar el impacto de estos principios activos.

Objetos de la invencion

La invencion tiene principalmente por objeto resolver los problemas tecnicos anunciados anteriormente y, particularmente, se refiere a regular el equilibrio celular entre proliferacion, diferenciacion y apoptosis, en el caso en el que este perturbada en el caso de piel alterada por la edad.

La invencion tambien se refiere a la utilizacion de acuerdo con la reivindicacion 1. En particular el principio activo que estimula la expresion de LOX permite regular el equilibrio celular entre proliferacion, diferenciacion y apoptosis en el caso en el que este perturbada en el caso de piel alterada por la edad.

Descripcion de la invencion

En el conjunto de la invencion, los inventores entienden por los terminos:

«LOX», la isoforma de la protema humana de la lisil oxidasa LOX, en particular definida por la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1;

«NRAGE», la protema humana NRAGE, en particular, definida por la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 2; «modular la expresion de LOX», la modulacion del gen que codifica LOX, y particularmente, la modulacion de la expresion del ARN mensajero que codifica LOX, aunque tambien la modulacion de la smtesis de LOX a partir de este ARN mensajero, asf como la modulacion de la actividad de LOX;

«modular la expresion de NRAGE», la modulacion del gen que codifica NRAGE, y particularmente, la modulacion de la expresion del ARN mensajero que codifica NRAGE, aunque tambien la modulacion de la smtesis de NRAGE a partir de este ARN mensajero, asf como la modulacion del efecto biologico NRAGE.

Estas modulaciones deben permitir reinducir un estado de equilibrio entre proliferacion, diferenciacion y apoptosis en situaciones en las que este equilibrio este perturbado.

Es preferible considerar como eficaces sobre LOX los principios activos que permiten obtener de una diferencia de aproximadamente ± 50 % de la expresion del ARNm de LOX y/o una diferencia de aproximadamente ± 15 % de la expresion de LOX y/o de la actividad de LOX sobre un modelo, que comprende al menos un tipo celular que presenta una expresion y/o una actividad de LOX, en contacto con estos principios activos con respecto al nivel de expresion y/o de actividad de LOX en un modelo control (generalmente sin la puesta en contacto de principios activos).

Es preferible considerar como eficaces sobre NRAGE los principios activos que permiten obtener una diferencia de aproximadamente ± 50 % de la expresion del ARNm de NRAGE y/o una diferencia de aproximadamente ± 15 % de la expresion de NRAGE y/o del efecto biologico de NRAGE sobre un modelo, que comprende al menos un tipo celular que presenta una expresion y/o una actividad NRAGE, en contacto con estos principios activos con respecto a un nivel de expresion y/o de actividad de NRAGE en un modelo control (generalmente, sin la puesta en contacto de principios activos). Es por esto que la presente invencion se refiere segun un primer aspecto a la utilizacion de acuerdo con la reivindicacion 1. Ventajosamente, la expresion de LOX esta estimulada en celulas epiteliales, en particular en queratinocitos.

La sustancia esta destinada al tratamiento y/o a la prevencion del envejecimiento de la piel.

Ventajosamente, la sustancia esta destinada a disminuir la apoptosis a nivel de la epidermis en caso de fuerte apoptosis durante el envejecimiento de la piel.

Ventajosamente, la sustancia esta destinada para aumentar la proliferacion celular en caso de hipoproliferacion celular a nivel de la epidermis durante el envejecimiento.

La sustancia esta por tanto destinada a estimular la expresion de LOX, y eventualmente a inhibir la expresion de NRAGE, durante el envejecimiento de la piel.

Dicha composicion es una composicion cosmetica.

Ventajosamente, el equilibrio celular entre la proliferacion, la diferenciacion y la apoptosis es el equilibrio entre la proliferacion, la diferenciacion y la apoptosis de los queratinocitos.

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Ventajosamente, la materia prima utilizada para la preparacion del principio activo, se esteriliza o no por radiacion, por ejemplo, beta o gamma, preferentemente a una dosis de 5 kGy y despues se reduce en polvo, si fuera necesario, por ejemplo, triturando a temperatura ambiente. Despues, el polvo se dispersa a razon de 2 a 5 % (peso/peso) de polvo, preferentemente 5 %, bien en un disolvente polar, por ejemplo, agua, alcohol, glicol, tal como butilenglicol o poliol, y/o en una mezcla de disolventes polares, ventajosamente una mezcla de agua/(alcohol, glicol o poliol) (tales como etanol, glicerol, butilenglicol y otros glicoles, xilitol etc.) en proporciones variables y preferentemente en una mezcla de agua/butilenglicol 75/25 o 50/50, bien en un disolvente apolar, como por ejemplo un alcano, bien en una mezcla de disolventes apolares, bien en una mezcla de disolventes polares y apolares. Despues de una agitacion, preferentemente, durante un mmimo de 2 horas, por ejemplo magnetica, y eventualmente termica, del disolvente, la muestra se clarifica preferentemente por decantacion o centrifugacion y despues se filtra preferentemente a 0,45 pm o 0,22 pm.

Ventajosamente, el principio activo obtenido de acuerdo con uno de los metodos descritos anteriormente, se utiliza en una concentracion final comprendida preferentemente entre 0,01 % volumen/volumen (v/v) y 10 % (v/v) y preferentemente comprendida entre 0,1 % y 1 % (v/v).

Dicha sustancia es un extracto de madera entera de Cuasia de Surinam (Cassia amara).

La invencion se refiere, de acuerdo con otro aspecto, a un procedimiento de la preparacion de una composicion que comprende:

- la mezcla del principio activo con al menos un excipiente, para realizar una composicion cosmetica, destinada a prevenir o a tratar al menos un estado en el que el equilibrio celular entre la proliferacion, la diferenciacion y la apoptosis esta ausente o esta alterado.

Ventajosamente, los queratinocitos son queratinocitos humanos.

Descripcion detallada de la invencion:

Los inventores han descubierto, de manera inesperada, una interaccion entre LOX y la protema NRAGE. Este descubrimiento es importante y es el punto de partida de la presente invencion. Representa, en efecto, como que LOX es la protema que, situada en el cruce de las rutas de proliferacion, diferenciacion y apoptosis, es capaz de controlar la homeostasis celular.

Por otra parte, los inventores han descubierto que la protema NRAGE esta presente en particular a nivel de la epidermis y se expresa en particular en los queratinocitos. Este descubrimiento permite tambien hacer la interaccion entre LOX y NRAGE una diana de accion de cuidados cosmeticos o de tratamientos destinados a restablecer la homeostasis celular, en situaciones en la que esta perturbada.

1) Descubrimiento y caracterizacion de la interaccion LOX/NRAGE in vitro

Habiendo descubierto previamente la presencia de LOX en la epidermis (Noblesse et al, Lysyl oxydase-like and lysyl oxydase are present in the dermis and epidermis of a skin equivalent and in human skin and are associated to elastic fibers, J. Invest. Dermatol. 122:621-630, 2004)), los inventores han investigado determinar la funcion (o funciones) que LOX podfa desempenar a este nivel, sabiendo que el papel principal que se le conoce actualmente - reticulacion del colageno y de la elastina - era poco verosfmil en estas celulas que no forman (o muy poco) colageno y elastina a nivel donde se ha localizado LOX.

En este objetivo, se han investigado los companeros proteicos de LOX mediante la tecnica de doble hnbrido en levadura, se exploro una biblioteca de ADNc de queratinocitos de piel humana normal, utilizando en particular el cebo GAL4 BD hL0Xmat, permitiendo de este modo poner de manifiesto NRAGE como posible companero de LOX (vease el ejemplo 1).

A continuacion los inventores han verificado, mediante la tecnica de doble tnbrido en celulas HeLa, que esta posible asociacion tambien podna observarse en celulas de mairnfero (vease el ejemplo 2).

La siguiente etapa consistio en determinar si la identificacion de esta posible asociacion ente LOX y NRAGE podfa corresponder a una interaccion ffsica, directa, entre estas dos protemas. Esto se realizo, en particular, mediante una tecnica de co-inmunoprecipitacion de protemas LOX y NRAGE producidas despues de la transfeccion de sus genes en celulas COS7. Los resultados obtenidos han confirmado, por un lado, la interaccion ffsica entre LOX y NRAGE y, por otro lado, han permitido precisar que LOX interaccionaba con una region particular de NRAGE, denominada IRD (dominio de repeticion intercalado), que es una region espedfica de NRAGE en la familia de protemas MAGE (vease el ejemplo 3).

En este ambito, cabe destacar en ese estado que el descubrimiento de la interaccion entre LOX y NRAGE reviste un interes muy particular cuando se considera de manera conjugada que, por un lado, la protema NRAGE contiene dos

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dominios ricos en restos lisilo, que podnan ser sitios propicios para su dimerizacion bajo la accion catalttica de LOX y que, por otro lado, esta precisamente en forma de dfmero que parece ejercer la funcionalidad de NRAGE.

Habiendose descubierto tambien la existencia, in vitro, de una interaccion ffsica, directa, entre LOX y NRAGE, localizada a nivel de la region IRD de NRAGE, los inventores se han planteado la cuestion de saber si esta interaccion intervendna tambien in vivo. Es esencial recordar en este estado que, contrariamente de lo que ocurre con LOX, la presencia NRAGE a nivel de la piel no se habfa descrito nunca antes.

2) Manifestacion de la presencia de NRAGE en la piel humana normal y en la piel humana normal reconstruida

Los inventores han puesto de manifiesto la expresion de NRAGE en la piel, tanto a nivel de la dermis como de la epidermis (veanse los ejemplos 4 y 5).

En el ambito de la presente invencion, los inventores han realizado un metodo de localizacion de la expresion de NRAGE en la piel.

A nivel de la epidermis, los inventores han puesto de manifiesto, de manera inesperada, que NRAGE no se expresada de manera homogenea, como podfa esperarse de una protema cuya presencia se describe generalmente como ubicua, sino en forma de un gradiente de expresion.

Recordatorio sobre la estructura de la epidermis:

La epidermis es un epitelio estratificado que se situa sobre una membrana basal que la ancla a la dermis. Su espesor vana de 60 a 100 pm como promedio, y esta constituida por cuatro capas continuas, desde la mas profunda a la mas superficial, dando como resultado la diferenciacion progresiva de queratinocitos:

- la capa basal (formada unicamente por celulas)

- la capa espinosa (de 5 a 6 basamentos celulares)

- la capa granulosa (de 1 a 3 basamentos celulares)

- la capa cornea o escamosa (de 5 a 10 basamentos celulares)

Por tanto NRAGE esta ausente en la capa basal y aparece a nivel de las primeras capas de queratinocitos diferenciados, aumentando el marcaje en las capas escamosas. El marcaje de las primeras capas suprabasales de la epidermis corresponde al observado para LOX, LOX apareda en la capa basal. Por otro lado, el marcaje de LOX disminuye en las capas superiores de la epidermis, donde NRAGE esta presente, de ah la distincion de 3 zonas

- 1 zona inferior de la epidermis que comprende la capa basal y las primeras suprabasales proliferativas donde solo se expresa LOX;

- 1 zona intermedia, que va desde las primeras capas suprabasales no proliferativas a los primeros basamentos escamosos, en la que se coexpresan LOX y NRAGE;

- 1 zona superior de la epidermis donde solo se expresa NRAGE.

Las observaciones a nivel celular muestran que LOX y NRAGE aparecfan en la periferia de las celulas, en particular en la region submembranosa, NRAGE tambien aparecfa a nivel del citoplasma. (Veanse los ejemplos 4 y 5)

Los inventores han demostrado asf, por primera vez, la presencia de NRAGE a nivel de la piel, en la dermis y en la epidermis. Tambien han mostrado que la epidermis comprende una parte en la que las dos protemas LOX y NRAGE se expresan y comparten, a nivel celular, particularmente a nivel de queratinocitos, la misma localizacion: la zona periferica submembranosa (estando NRAGE adicionalmente presente a nivel citoplasmico).

Los inventores han puesto asf de manifiesto que se reuman las condiciones para que pudiese darse la interaccion directa, que habfan puesto de manifiesto in vitro, en la epidermis, a nivel de la zona de colocalizacion de LOX y NRAGE.

3) Manifestacion de perturbaciones de la expresion de LOX y/o de NRAGE a nivel de la epidermis con la edad y en determinadas situaciones patologicas

Los inventores tambien han puesto de manifiesto, de manera inesperada, que el envejecimiento cutaneo, asf como un determinado numero de situaciones patologicas, vienen acompanados por perturbaciones de la expresion de LOX y/o de NRAGE a nivel de la epidermis.

3.1) Estado de LOX y de NRAGE en la epidermis

3.1.1) Piel de las personas de edad avanzada

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La piel de las personas de edad avanzada se caracteriza por una epidermis hipoproliferativa, muy fina (reducida a algunas capas celulares) e hiperqueratinizada.

Los inventores han puesto de manifesto la ausencia total de LOX (detectable mediante las tecnicas utilizadas) en esta piel. En cambio, NRAGE se expresa con intensidad, se localiza a nivel del citoplasma y aparece desde la primera capa suprabasal, sin gradiente de expresion.

De este modo, la presente invencion permite estimular la expresion (y/o la actividad) de LOX, con o sin inhibicion de la expresion (y/o actividad) de NRAGE, para re-inducir una zona de diferenciacion y/o una zona de apoptosis regulada, particularmente por el restablecimiento de una zona de coexpresion de LOX y de NRAGE. Ademas, se obtiene asf un espesamiento de la piel, particularmente de la epidermis.

De este modo, la presente invencion esta destinada particularmente a corregir los defectos del envejecimiento de la piel, o a prevenirlos.

3.1.2) Reaccion de injerto contra huesped- GVH (Graft Versus Host)

La GVH es una enfermedad que puede producirse despues de aloinjertos de celulas madre hematopoyeticas. Esta relacionada con el efecto de las celulas inmunitarias (linfocitos) contenidas en el injerto contra los organos normales del paciente (particularmente la piel, el hngado y el tubo digestivo). A nivel de la piel, se manifiesta por una erupcion maculopapulosa, pruriginosa e inflamatoria.

Los pacientes con esta enfermedad tienen una piel muy fina, con una epidermis intensamente apoptotica.

El estudio histologico realizado por los inventores ha puesto de manifiesto la ausencia de LOX y una presencia muy marcada de NRAGE, localizada a nivel citoplasmico y que aparece desde las primeras capas suprabasales.

3.1.3) Liquen plano

El liquen es una enfermedad de la piel, de causa desconocida, caracterizada por la presencia de papulas de algunos milfmetros de diametro, violaceas, aplastadas, delimitadas, secas, muy pruriginosas.

Los inventores han puesto de manifiesto una disminucion muy intensa de la expresion de LOX, es decir, su ausencia total, asf como una expresion muy irregular de NRAGE. Estas observaciones expresan, sin duda, un nivel de interaccion inexistente, o muy debil, entre las dos protemas estudiadas.

3.1.4) Soriasis

La soriasis es una enfermedad cronica de la piel, caracterizada por lesiones eritematoescamosas. El elemento fundamental es un aumento de la velocidad de la duplicacion de los queratinocitos, responsable de una renovacion mas rapida y de un espesamiento de la epidermis.

A nivel histologico, se observa una hiperproliferacion de celulas comprometidas en las primeras etapas de diferenciacion terminal, una diferenciacion terminal incompleta, en la que se asocia una apoptosis ausente o muy poco marcada.

Los inventores han detectado una expresion muy intensa de LOX y una presencia moderada de NRAGE, con un marcaje mas o menos homogeneo de zonas implicadas, que solo muestra gradiente de expresion. A estas caractensticas de intensidad de expresion, que vanan de lo normal, se anaden anomalfas mucho mas importantes en cuanto a localizacion de las protemas en cuestion. De este modo, en las pieles soriasicas, LOX se expresa esencialmente en la parte inferior de la epidermis y NRAGE unicamente en su parte superior, diferenciandose asf la expresion de las protemas, sin zona de recubrimiento, tal como normalmente se observa la piel sana. A nivel celular, NRAGE se observa unicamente a nivel citoplasmatico y no en la zona periferica submembranosa.

Estas observaciones muestran que, en la soriasis, aunque las dos protemas LOX y NRAGE, estan presentes en la epidermis, no pueden interaccionar de manera directa entre sf ya que no estan presentes ffsicamente en el mismo lugar. Esta ausencia de interaccion se traduce en disfunciones observadas a nivel de la epidermis, reflejando de este modo la funcion de la interaccion entre LOX y NRAGE en el mantenimiento de la homeostasis epidermica.

De este modo, la inhibicion de la expresion (y/o actividad) de LOX, y/o eventualmente la estimulacion, preferentemente parcial, de la expresion (y/o actividad) de NRAGE permite particularmente obtener una zona de recubrimiento de la expresion de LOX y de NRAGE para re-inducir una zona de proliferacion regulada que permita disminuir la hiperproliferacion favoreciendo la apoptosis a nivel de los queratinocitos.

Por otra parte, la estimulacion de la expresion (y/o la actividad) de NRAGE y/o la inhibicion, preferentemente parcial, de la expresion (y/o actividad) de LOX, permite particularmente obtener una zona de recubrimiento de la expresion

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de LOX y de NRAGE para re-inducir una zona de proliferacion regulada que permita disminuir la hiperproliferacion favoreciendo la apoptosis a nivel de los queratinocitos.

3.1.5) Eccema

El eccema es una afeccion de la piel que se caracteriza clmicamente por enrojecimiento, inflamacion localizada mas o menos extendida, as^ como por vesmulas supurativas que forman despues costras, acompanadas por un intenso picor. En su fase cronica el eccema se complica desde una modificacion de la piel con espesamiento. A nivel de la epidermis, la apoptosis se reduce.

Los inventores han puesto de manifiesto una expresion muy intensa de LOX, localizada en la periferia de las celulas. En cambio, NRAGE se expresa poco y solo se observa a nivel citoplasmico, lo que se traduce ciertamente en un nivel de interaccion inexistente, o muy debil, entre las dos protemas estudiadas.

De este modo, la estimulacion de la expresion (y/o actividad) de NRAGE, y/o la inhibicion, preferentemente parcial, de la expresion (y/o actividad) de LOX, permite aumentar la apoptosis y reducir de este modo determinados efectos del eccema.

3.1.6) Canceres cutaneos epiteliales.

Se diferencian dos grandes tipos de carcinomas cutaneos epiteliales:

- el carcinoma basocelular (90 % de los casos) es un tumor de evolucion lenta, esencialmente local, que casi nunca metastatiza. Se produce por una proliferacion incontrolada de los queratinocitos de la capa basal.

- el carcinoma espinocelular (10 % de los casos) tiene una evolucion local mucho mas agresiva y puede metastatizar. Se origina por una proliferacion incontrolada de los queratinocitos de la capa espinosa.

Los inventores han puesto de manifiesto la ausencia de LOX y de NRAGE en las celulas invasoras de dos tipos de canceres estudiados (canceres basocelulares y espinocelulares) con una perdida progresiva de LOX y de NRAGE en la epidermis en las proximidades de los tumores. Los inventores tambien han observado que LOX se expresa intensamente en la reaccion estromal alrededor de tumores, mientras que NRAGE esta ausente.

Se puede observar en este estado que la perdida de expresion de LOX, que nunca se habfa puesto de manifiesto anteriormente en el caso de estos dos tipos de canceres, es inesperada y, puede ser, espedfica de los canceres epiteliales, ya que generalmente se considera que LOX esta presente en los canceres in situ.

La perdida de expresion de NRAGE es tambien completamente nueva, ya que nunca se habfa descrito en ningun cancer.

De este modo, la estimulacion de la expresion (y/o actividad) de NRAGE, y de la expresion (y/o actividad) de LOX, permite restablecer la homeostasis. Es posible invertir el fenotipo tumoral, particularmente a nivel de canceres cutaneos epiteliales.

3.2) Conclusion de estudios en tejidos patologicos

A partir de estas observaciones, los inventores han podido poner de manifiesto que las situaciones en las que interviene una desregulacion del equilibrio entre proliferacion, diferenciacion y apoptosis, bien a nivel de la epidermis de sujetos de edad avanzada, o de sujetos que padecen diversas patologfas que afectan particularmente a la epidermis, se caracterizaban de manera sistematica por defectos de la expresion de LOX y/o de NRAGE, cuyos defectos eran por naturaleza alterar o hacer imposible su interaccion.

Esta constatacion ha conducido a los inventores a investigar la manera de restablecer el equilibrio entre proliferacion, diferenciacion y apoptosis utilizando el control ejercido por LOX o NRAGE, preferentemente utilizando el par LOX-NRAGE.

De este modo, a partir de estos descubrimientos inesperados, los inventores han realizado metodos de identificacion de principios activos modulando la expresion de LOX y/o de NRAGE para restablecer el control ejercido por estas protemas mediante de su interaccion, con el objetivo de identificar principios activos para elaborar composiciones particularmente cosmeticas o farmaceuticas.

De esta manera, en el caso de hipoproliferacion epidermica (pieles envejecidas, GVH), caracterizada por una epidermis extremadamente fina y por la ausencia de expresion de LOX, la expresion de LOX se estimula, con o sin inhibicion de la expresion de NRAGE, con objeto de re-inducir, a traves de la modulacion de la coexpresion de LOX y de NRAGE, una zona de diferenciacion y de apoptosis regulada, que conduce a un espesamiento de la piel.

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En los casos de hiperproliferacion epidermica (soriasis, eccema), en los que NRAGE esta infraexpresada, la expresion de NRAGE se estimula, con o sin inhibicion (ligera) de la de LOX, para favorecer la apoptosis re- induciendo una zona de proliferacion regulada (recubrimiento LOX/NRAGE) y permitiendo detener la hiperproliferacion.

En los casos de apoptosis intensa a nivel de la epidermis (pieles envejecidas, exposicion de la piel a un estres, en particular exposicion al calor, o exposicion de la piel a una radiacion, en particular radiacion solar, o una exposicion de la piel a un agente toxico, por ejemplo, qmmico o microbiologico, o la enfermedad de injerto contra huesped- GVHD, por las siglas en ingles Graft-Versus-Host Disease), en los que NRAGE esta sobreexpresada, la expresion de NRAGE se inhibe, con o sin estimulacion de la expresion de LOX.

4) Manifestacion de la implicacion de LOX en la apoptosis celular

De manera inesperada, los inventores han puesto de manifiesto la existencia de una relacion aun desconocida entre LOX y la apoptosis. De este modo, los datos obtenidos reflejan, en concreto, la funcion antiapoptotica de LOX en los queratinocitos, cuya funcion hace intervenir la regulacion de la protema proapoptotica NRAGE.

5) Busqueda de principios activos

La puesta de manifiesto de principios activos se realizo en concreto mediante el analisis de la expresion de ARN mensajeros de LOX y de NRAGe, en particular en queratinocitos en cultivo, preferentemente queratinocitos humanos. Los principios activos, cuya actividad se va a ensayar, se ponen en contacto con los queratinocitos en cultivo durante un tiempo suficiente y en condiciones adecuadas para que el contacto sea eficaz. Los principios activos se ensayan, preferentemente, a diferentes concentraciones para detectar eventualmente la influencia de la concentracion.

Ventajosamente, los principios activos explorados son de origen vegetal, particularmente para evitar los problemas relacionados con la smtesis qmmica. Las ventajas de los principios activos de origen vegetal son bien conocidas por el experto en la tecnica, particularmente en farmacia, dermofarmacia, nutraceutica y cosmetica.

La busqueda de principios activos se efectua en particular realizando la extraccion de los ARN totales y despues efectuando una RT-PCR cuantitativa. En particular, las secuencias de cebadores preferidas son las utilizadas en el ejemplo 13 sin estar limitadas a estas.

La cantidad de ADNc de cada ensayo se relaciona con la cantidad de ADNc de la actina. A continuacion se compara el efecto de la presencia o no de los principios activos. Cuando la expresion y/o la actividad de NRAGE y/o LOX estan moduladas (estimuladas o inhibidas) con respecto a los controles, se puede entonces calificar la sustancia de principio activo. Ventajosamente, un principio activo permite modular al menos un 50 % de la expresion del ARN mensajero de LOX y/o NRAGE, o al menos un 15 % de la expresion y/o de la actividad de LOX y/o de NRAGE.

El compuesto de acuerdo con la presente invencion se preparo en forma de composicion cosmetica. Para ello, para esta composicion, el excipiente contiene, por ejemplo, al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en conservantes, emolientes, emulsionantes, tensioactivos, hidratantes, espesantes, acondicionadores, agentes matificantes, estabilizantes, antioxidantes, agentes texturizantes, agentes abrillantadores, agentes filmogenos, solubilizantes, pigmentos, colorantes, perfumes, y filtros solares. Estos excipientes se seleccionan preferentemente del grupo que consiste en aminoacidos y sus derivados, poligliceroles, esteres, polfmeros y derivados de celulosa, derivados de lanolina, fosfolfpidos, lactoferrinas, lactoperoxidasas, estabilizantes a base de sacarosa, vitamina E y sus derivados, ceras naturales y sinteticas, aceites vegetales, trigliceridos, insaponificables, fitosteroles, esteres vegetales, siliconas y sus derivados, hidrolizados de protemas, aceite de jojoba y sus derivados, esteres lipo/hidrosolubles, betamas, aminoxidos, extractos de plantas, esteres de sacarosa, dioxidos de titanio, glicinas y parabenos, e incluso preferentemente del grupo que consiste en butilenglicol, estearet-2, estearet-21, estearil eter glicol-15, alcohol ceteanlico, fenoxietanol, metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, butilenglicol, tocoferoles naturales, glicerina, dihidroxicetil sodico, hidroxietil eter isopropflico, glicol estearato, triisononaoina, octil cocoato, poliacrilamida, isoparafina, lauret-7, un carbomer, propilenglicol, glicerol, bisabolol, una dimeticona, hidroxido de sodio, PEG-30 dipolihidroxiesterato, los trigliceridos caprico/capnlico, cetearil octanoato, dibutil adipato de, aceite de pepita de uva, aceite de jojoba, sulfato de magnesio, EDTA, una ciclometicona, goma xantana, acido cftrico, lauril sulfato de sodio, ceras y aceites minerales, isostearil isostearato, dipelargonato de propilenglicol, isostearato de propilenglicol, PEG 8 cera de abeja, gliceridos de aceite de corazon de palma hidrogenado, gliceridos de aceite de palma hidrogenados, aceite de lanolina, aceite de sesamo, cetil lactato, alcohol de lanolina, aceite de ricino, dioxido de titanio, lactosa, sacarosa, polietileno de baja densidad, una solucion isotonica salina.

Ventajosamente, la composicion anteriormente citada se formula en una forma seleccionada del grupo que consiste en una solucion, acuosa u oleaginosa, una crema o un gel acuoso o un gel oleaginoso, particularmente en un tarro o en un tubo, particularmente un gel de ducha, un champu; una leche; una emulsion, una microemulsion o una nanoemulsion, particularmente de aceite en agua o de agua en aceite o multiple o siliconada; una locion, particularmente en un frasco de vidrio, de plastico o en un frasco dosificador o en aerosol; una ampolla ; un jarabe;

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un jabon Ifquido; una barrita dermatologico; una pomada; una crema; una solucion inyectable; un producto anhidro, preferentemente Kquido, pastoso o solido, por ejemplo, en forma de bastoncillo, particularmente en forma de pintalabios; un polvo; un comprimido.

Sobre las Figuras:

- La figura 1 representa una secuencia y un esquema de la protema NRAGE;

- La figura 2 representa la media de los resultados obtenidos en el ejemplo 2 para la interaccion en doble hnbrido;

- La figura 3 representa la puesta de manifiesto de la presencia de LOX y de NRAGE en la piel reconstruida;

- La figura 4 representa la localizacion con microscopfa confocal de LOX y NRAGE en cortes de piel humana;

- La figura 5 representa una deteccion de LOX y de NRAGE en cortes de piel humana de un donante de 91 anos;

- La figura 6 representa la deteccion de LOX y de NRAGE en la piel de una persona con enfermedad de respuesta

de injerto contra huesped;

- La figura 7 representa la deteccion de LOX y de NRAGE en la piel de un paciente que presenta un cancer de tipo basocelular o espinocelular;

- La figura 8 representa la deteccion de LOX y de NRAGE en la piel de un paciente con liquen plano;

- La figura 9 representa la puesta de manifiesto de la localizacion de LOX y de NRAGE en la piel de un paciente con soriasis;

- La figura 10 representa la puesta de manifiesto de la localizacion de LOX y de NRAGE en la piel de un paciente con eccema.

- La figura 11 presenta el marcaje global de la piel reconstruida con azul Evans (las capas epidermicas de color rojo, las celulas de color azul, las fibras de sustrato dermico de color rojo, la union dermoepidermica con una lmea de puntos).

- La figura 12 presenta la deteccion inmunohistoqmmica de la citoqueratina 10 sobre la piel reconstruida (las celulas que expresan intensamente el marcador en color rojo, los nucleos en azul, la union dermoepidermica con una lmea de puntos).

- La Figura 13 presenta la deteccion inmunohistoqmmica de la transglutaminasa sobre la piel reconstruida (las celulas que expresan intensamente el marcador en color rojo, los nucleos en azul, la union dermoepidermica con una lmea de puntos).

Otros objetos, caractensticas y ventajas de la invencion apareceran claramente para el experto en la materia despues de la lectura de la descripcion explicativa que hace referencia a ejemplos que solo se proporcionan a modo ilustrativo y que de ninguna manera pretende limitar el alcance de la invencion.

Los ejemplos forman parte integrante de la presente invencion y cualquier caractenstica que aparezca nueva con respecto a un estado de la tecnica anterior, cualquiera que sea a partir de la descripcion tomada en su conjunto, incluyendo los ejemplos, forma parte integrante de la invencion en su funcion y en su generalidad.

De este modo, cada ejemplo tiene un alcance general.

Por otro lado, en los ejemplos, salvo que se indique lo contrario, todos los porcentajes se dan en peso, la temperatura se expresa en grados Celsius y la presion es la presion atmosferica.

Ejemplos

Ejemplo 1: clonacion de NRAGE por la tecnica de doble hnbrido en levadura.

Inicialmente consistio en buscar los posibles companeros de LOX en los queratinocitos. Se empleo la tecnica de doble tnbrido en levadura (2HL). El sistema 2HL permite la identificacion y la caracterizacion de interacciones entre una protema "cebo" y los posibles companeros “dianas”. En este contexto, el cebo ha sido la region madura de LOX fusionada al dominio de union (Binding Domain, BD) al ADN del gen Gal4. La diana o dianas han sido los genes codificados por un banco de ADN complementario de queratinocitos humanos, fusionados al dominio de activacion (Activation Domain, AD) del gen Gal4. La interaccion de dominios del cebo (LOX) con los dominios codificados por una secuencia del banco permite la union y la activacion del promotor Gal4, que controla diferentes genes que confieren la auxotrofia a las levaduras AH109, permitiendo el crecimiento en medio deficiente y la activacion de las actividades galactosidasas. Un gen que codifica una protema candidata para ser companero de LOX tambien se ha puesto de manifiesto, gracias a esta tecnica de seleccion de posibles interaccionantes: la protema intracelular Melanoma Associated Antigen D1 (MAGE-D1, antfgeno D1 asociado a Melanoma) o NRAGE (Figura 1).

Exploracion de una biblioteca de queratinocitos de doble hibrido en levadura para el cebo GAL4 BD- hLOXmat (LOX humana madura).

Se utilizo la biblioteca de ADNc de queratinocitos de piel humana normal en el vector pGAD-10. El cebo seleccionado para la exploracion fue LOXmat, codificada por la region del ADNc humano de la enzima LOX sin el peptido senal ni la region pro. La secuencia nucleotidica se inserto en fase detras del dominio de union al ADN (en ingles Binding Domaine: BD) del factor de transcripcion GAL4 en el vector pBD-Gal4 Cam. El fragmento LOX +494 a

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+ 1254 a insertar se amplifico por PCR (reaccion en cadena de la polimerasa), detras del dominio de union de GAL4 en un vector pGal4-BD usando los siguientes cebadores:

1) ggg atc cgc atg gtg ggc gac gac (introduciendo Bam HI) (SEQ ID NO: 11)

2) ttg tcg act aat acg gtg aaa ttg tgc (introduciendo Sal I a nivel de terminacion que esta conservada) (SEQ ID NO: 12).

El fragmento amplificado se introdujo inicialmente en el vector TOPO, y despues se inserto en pGal4-BD. Para validar la expresion de la protema de fusion BD-LOXmat, las levaduras AH 109 se transformaron por el plasmido cebo pBD-LOxmat.

Se efectuo la exploracion de las levaduras transformadas: 6,88 x 106 (ufc) (crecimiento en medio deficiente) en la levadura AH 109, se seleccionaron 80 clones que crecieron en medio deficiente en adenina, histidina, triptofano y leucina, de los cuales 23 se conservaron por su fuerte crecimiento.

Ejemplo 2: validacion de la interaccion entre LOX y NRAGE por la tecnica de doble hibrido en mamifero (2HM).

Se transfectaron celulas Hela, por un lado con los plasmidos pAct y pAct-NRAGE, y por el otro, con pBIND y pBIND- LOXmat en presencia de lipofectamina. La actividad luciferasa se ensayo despues de 48 h, y los resultados se expresaron en relacion con la actividad luciferasa con respecto al control (vector vacro pBIND). Los experimentos se efectuaron por triplicado, obteniendose la media de los resultados representada en la Figura 2.

La secuencia hLOX utilizada en el ejemplo 1 para el doble hforido en levadura se inserto en fase detras del dominio de union de Gal4 en el vector pBIND (Promega, Madison USA) para las interacciones de doble hforido en mairnfero.

La presa N-RAGE se inserto detras de la activacion del dominio VP16 Gal4 en el vector pAct (Promega). Esta comienza en el aminoacido 152 (nucleotido 458).

Ejemplo 3: co-inmunoprecipitacion de LOX y de NRAGE en celulas de mamifero.

Celulas COS7 (celulas epiteliales de rinon de mam^era) se cotransfectaron para los genes LOX (completo humano, region madura humana y region madura murina) para las construcciones pcLOX32-V5His (LOX), o, pcLOX36-V5His

0 pcLOX-27-V5His y para el gen NRAGE por pNM3-HA (NRAGE completa) o pNM7-HA (region IRD). La transfeccion se realizo en placas de Petri de 100 mm de diametro utilizando lipofectamina. Despues de 48 h, las celulas transfectadas se lisaron en 500 pl de tampon de lisis. Las protemas de los lisados celulares se incubaron con anti-V5 o con anti-HA; el anticuerpo monoclonal anti-V5 o anti-HA se anadio a 1/250 al lisado celular durante 1 h 30 con agitacion a 4 °C.

Los complejos inmunitarios (CI) asf formados se precipitaron por la protema G-sefarosa con agitacion a 4 °C durante

1 h. Despues de tres lavados de 10 min en tampon de lisis y una elucion en tampon de SDS-PAGE, se realizo una electroforesis de todos los CI en un gel de SDS-PAGE al 10 % seguido de una transferencia Western. Despues de trasferir los CI a una membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno), se realizo el revelado:

- para NRAGE, con el anti-HA diluido a 1/1.000 despues del anti-raton-HRP (peroxidasa de rabano picante) diluido a 1/20.000

- para LOX, por el anticuerpo V5-HRP diluido a 1/5.000

La deteccion final se realizo mediante quimioluminiscencia de la HRP.

Los resultados obtenidos demuestran que la forma completa de NRAGE (NM3-HA) coinmunoprecipita con la forma completamente humana de LOX (LOX 32H), de LOX humana madura (LOX 36H) y de LOX murina madura (LOX 27H). Ademas, NRAGE (NM7-HA), que corresponde a la region IRD, se coinmunoprecipita de la misma manera con esas tres protemas recombinantes, mostrando la implicacion de esta region en la interaccion.

Ejemplo 4: manifestacion, por inmunohistoqmmica, de la presencia de LOX y de NRAGE en un modelo de piel reconstruida.

La manifestacion se realizo en un modelo de piel reconstruida (MIMESKIN®, Engelhard Lyon, France) preparado a partir de un sustrato dermico (colageno/glucosaminoglucanos/quitosano, MIMEDISC®, Engelhard Lyon, Francia) sembrado con fibroblastos humanos normales, en cuya superficie se depositaron queratinocitos humanos normales.

Despues de 45 dfas de cultivo, permitiendo la diferenciacion de los queratinocitos por exposicion a la interfaz aire- lfquido, las muestras se fijaron en fijador de Bouin o en formaldehido, y despues se incluyeron en parafina.

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Los inmunomarcajes sobre cortes se realizaron con los anticuerpos descritos a continuacion:

- anticuerpo anti-LOX obtenido y purificado de acuerdo con el metodo descrito por Sommer et al. (Transient expression of lysyl oxidase by liver myofibroblasts in murine schistosomiasis, Laboratory Investigation 69:460470, 1993)

- anticuerpo anti-NRAGE (IgG policlonal de cabra),

- anticuerpo secundario de conejo anti-cabra.

Los inmunocomplejos se detectaron con una IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa, utilizando diaminobencidina como sustrato, y despues efectuando una tincion de contraste con hematoxilina.

La Figura 3 presenta la deteccion inmunohistoqmmica de LOX y NRAGE en la piel reconstruida.

La posicion de la union dermoepidermica se indica con una lmea continua, la del sustrato dermico con una flecha, y la localizacion de los queratinocitos se indica con una cabeza de flecha.

La expresion de LOX aparece desde la capa basal, persiste en las capas suprabasales y desaparece progresivamente en las capas diferenciadas. La expresion de NRAGE esta ligeramente desfasada, se afirma desde las capas suprabasales no proliferativas y se intensifica fuertemente en las capas granulosas y escamosas, allf donde LOX no se expresa mas.

Por tanto estan asociadas en las capas suprabasales no proliferativas de la epidermis del modelo de piel reconstruido MIMESKIN®. Esta colocalizacion se ha confirmado en inmunohistologfa (IH) sobre la piel humana normal.

Los inventores tambien han puesto de manifiesto que las protemas de LOX y NRAGE se expresan en la epidermis, con una zona de colocalizacion a nivel de las capas espinosas.

Ejemplo 5: manifestacion de la colocalizacion de LOX y de NRAGE en la piel humana normal con microscopia confocal.

Se realizaron cortes congelados de muestras de piel humana normal obtenidas por reseccion quirurgica (prepucio). Se utilizaron los anticuerpos primarios anti-LOX y anti-NRAGE del ejemplo 4 para detectar la expresion de LOX y de NRAGE. Los anticuerpos secundarios utilizados son:

- IgG anti-conejo de burro-FITC, marcaje de fluorescema de color verde;

- IgG anti-cabra de burro-R, marcaje de rodamina de color rojo.

Se realizo un control negativo sin anticuerpos primarios.

La observacion de doble marcaje se realizo utilizando un microscopio directo confocal AXIOPLAN 2 LSM510 ZEISS, y la adquisicion de las imagenes se realizo utilizando programa informatico de ZEISS LSM5 Image Browser.

La Figura 4 presenta la inmunodeteccion de LOX y de NRAGE en la piel humana normal con microscopia confocal.

Las observaciones confirman los resultados del ejemplo 4, que ilustran adicionalmente la colocalizacion de LOX y de NRAGE en las capas espinosa de la epidermis de piel humana normal, con una yuxtaposicion de la expresion de LOX y de NRAGE casi perfecta. De este modo, las observaciones a nivel celular muestran que LOX y NRAGE aparecen en la periferia de la celula (en la zona periferica submembranosa) apareciendo del mismo modo NRAGE a nivel del citoplasma.

Los inventores han puesto asf de manifiesto que se reuman las condiciones para que la interaccion directa que habfan puesto de manifiesto in vitro podfa funcionar en la epidermis a nivel de la zona de colocalizacion de LOX de NRAGE.

Ejemplo 6: manifestacion de la localizacion de LOX y de NRAGE en la piel de personas con edades diferentes.

Se realizo un estudio inmunohistologico utilizando el protocolo descrito en el ejemplo 4, en cortes de piel humana que proveman de 2 donantes de clases de edades diferentes (menos de 20 anos y mas de 60 anos).

La Figura 5 presenta un marcaje efectuado en la piel de un donante de 91 anos. Las observaciones muestran una epidermis hipoproliferativa, muy fina (reducida a algunas capas celulares) e hiperqueratinizada.

Los inventores han puesto de manifiesto la ausencia total de LOX (detectable por las tecnicas utilizadas). En cambio,

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NRAGE, localizada a nivel del citoplasma, se expresaba con intensidad y apareda en la primera capa suprabasal, sin gradiente de expresion.

Ejemplo Comparativo 7: deteccion de LOX y de NRAGE en la piel de una persona con enfermedad de respuesta de injerto contra huesped (o GVHD: graft versus host).

Se realizo un estudio inmunohistologico utilizando el protocolo descrito en el ejemplo 4, en cortes de piel humana de pacientes con enfermedad de reaccion de injerto contra huesped (GVHD). En este estudio participaron 5 donantes diferentes.

La Figura 6 pone de manifiesto una desaparicion casi total de LOX en la epidermis (sin modificacion de su expresion a nivel dermico) y una presencia muy marcada de NRAGE, localizada a nivel citoplasmico y apareciendo en las primeras capas suprabasales.

Ejemplo Comparativo 8: deteccion de LOX y de NRAGE en la piel de una persona que presenta un cancer de tipo basocelular y espinocelular.

Se llevo a cabo un estudio inmunohistologico utilizando el protocolo descrito en el ejemplo 4 en muestras de piel de pacientes que presentaban un cancer basocelular o espinocelular.

La Figura 7 pone de manifiesto, en los dos tipos de cancer estudiados:

- una disminucion progresiva de la expresion de LOX y de NRAGE, en la epidermis, en la periferia de los tumores,

- una ausencia de LOX y de NRAGE a nivel de celulas invasivas epidermicas.

- una fuerte expresion de LOX a nivel de la reaccion estromal dermica, alrededor de los tumores,

- la ausencia de NRAGE a nivel de la reaccion estromal dermica, alrededor de los tumores.

Ejemplo comparativo 9: deteccion de LOX y de NRAGE en la piel de un paciente con liquen plano.

Se realizo un estudio inmunohistologico utilizando el protocolo descrito en el ejemplo 4, en cortes de piel de 3 pacientes con liquen plano.

La Figura 8 muestra una disminucion muy fuerte de la expresion de LOX en la epidermis, es decir su ausencia total. Esta perturbacion se correlaciona con una irregularidad de la expresion de NRAGE en la epidermis.

Ejemplo comparativo 10: manifestacion de la localizacion de LOX y de NRAGE en la piel de un paciente con soriasis.

Se realizo un estudio inmunohistologico utilizando el protocolo descrito en el ejemplo 4, en cortes de piel de 5 pacientes con soriasis.

La Figura 9 es representativa del conjunto de cortes observados y muestra, a nivel de la epidermis, una expresion muy fuerte de LOX y una presencia moderada de NRAGE, con un marcaje mas o menos homogeneo de zonas afectadas, no mostrando gradiente de expresion. A estas caractensticas de intensidad de expresion que vanan de lo normal, se anaden anomalfas mucho mas importantes en lo que se refiere a la localizacion de las protemas implicadas. De este modo, en las pieles soriasicas, LOX se expresa esencialmente en la parte inferior de la epidermis y NRAGE unicamente en su parte superior, diferenciandose asf la expresion de las protemas, sin zona de recubrimiento, tal como normalmente se observa la piel sana. A nivel celular, NRAGE se observa unicamente a nivel citoplasmatico y no en la zona periferica submembranosa.

Ejemplo comparativo 11: manifestacion de la localizacion de LOX y de NRAGE en la piel de un paciente con eccema.

Se realizo un estudio inmunohistologico utilizando el protocolo descrito en el ejemplo 4 en cortes de piel de pacientes con eccema.

La Figura 10 manifiesta, a nivel epidermico, una expresion muy fuerte pericelular de LOX. En cambio, NRAGE se expresa poco y se observa a nivel citoplasmico unicamente, lo que se traduce en una perdida de la colocalizacion a nivel celular.

Ejemplo 12: manifestacion de la implicacion de LOX en la inhibicion de la apoptosis.

El estudio se realizo en cultivos de queratinocitos humanos diferenciados en monocapa y a confluencia. El efecto de LOX sobre la apoptosis se puso de manifiesto inhibiendo su actividad, anadiendo p-APN (0,02 % p/v- (peso/volumen)), en condiciones normales o proapoptoticas (choque termico provocado por una exposicion a una temperatura de 45 °C +/-0,5 °C durante 1h30).

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La deteccion y la cuantificacion de la muerte celular por apoptosis utilizan la tecnica TUNEL (por sus siglas en ingles terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling, marcado de final de corte de dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal) que se basa en el marcaje de deleciones del ADN acompanante de la apoptosis.

La primera etapa consiste en marcar las roturas del ADN con TdT (desoxinucleotidil transferasa terminal) que cataliza la polimerizacion de nucleotidos marcados con fluorescema en el extremo 3'-OH libre del ADN. La segunda etapa consiste en detectar la fluorescema incorporada por un anticuerpo anti-fluorescema, conjugado con fosfatasa alcalina, despues de incubacion con el sustrato de esta ultima.

La experimentacion se valido con un control positivo obtenido por fragmentacion del ADN a traves de una solucion de DNasa y de un control negativo obtenido depositando tampon fosfato.

Los resultados obtenidos se presentan en la siguiente tabla.

Tabla 1

Sin choque termico (% de celulas marcadas) Con choque termico (% de celulas marcadas)

Sin p-APN

6 % 39 %

Con p-APN

56 % 81 %

Los resultados obtenidos demuestran que:

- el choque termico (45 °C +/- 0,5 °C durante 1h30) induce una apoptosis celular marcada,

- la inhibicion de la actividad enzimatica de LOX por p-APN conlleva a un aumento significativo de la apoptosis.

Estos resultados ponen de manifiesto un efecto antiapoptotico de la actividad de LOX.

Ejemplo comparativo 13: Analisis de la expresion de los ARN mensajeros de LOX y de NRAGE por queratinocitos en cultivo, diferenciados en medio calcico, con y sin puesta en contacto de principios activos cuya actividad va a ensayarse (Analisis realizado, por ejemplo, por RT-PCR cuantitativa, exploracion de principios activos).

Los principios activos se ensayaron en queratinocitos de prepucio humano normal de sujetos jovenes (pooled normal human epidermal keratinocytes foreskin-Clonetics).

Los queratinocitos se amplificaron, por ejemplo, en medio K-SFM (keratinocytes serum free medium, medio aserico sin queratinocitos) complementado con antibioticos hasta el tercer pase a 37 °C con CO2 al 5 %.

Las celulas se sembraron en placas de 96 pocillos, por ejemplo, a razon de 40.000 celulas por cm2 y se cultivaron hasta aproximadamente 80 % de confluencia. A continuacion las celulas se cultivaron en medio de hipercalcico (CaCl2-1,7 mm a 37 °C con CO2 al 5 %) para inducir una diferenciacion de las celulas.

La materia prima utilizada para la preparacion de los principios activos, cuando se trata de plantas (preferentemente rafces, tallos, corteza, flores, frutos, granos, semillas, gomas, exudados, hojas o la planta entera) o de protemas, se esterilizo, o no, por radiacion, por ejemplo, beta o gamma, a una dosis preferentemente de 5 kGy, y despues se redujo en polvo, si fuera necesario, por ejemplo, triturando a temperatura ambiente. Despues, el polvo se disperso a razon de 2 a 5 % (peso/peso) de polvo, preferentemente 5 %, bien en un disolvente polar, por ejemplo, agua o butilenglicol, y/o en una mezcla de disolventes polares, ventajosamente una mezcla de agua/(alcohol, glicol o poliol) (tales como etanol, glicerol, butilenglicol y otros glicoles, xilitol etc...,) en proporciones variables y preferentemente en una mezcla de agua/butilenglicol 75/25 o 50/50, o en un disolvente apolar, como por ejemplo un alcano, o en una mezcla de disolventes apolares o una mezcla de disolventes polares y apolares. Despues de agitar durante un mmimo de 2 horas, por ejemplo con agitacion magnetica, la muestra se clarifico por decantacion o centrifugacion y despues se filtro preferentemente a 0,45 pm o 0,22 pm.

La materia prima utilizada para la preparacion de los principios activos, cuando se trata de moleculas caracterizadas (por ejemplo, moleculas obtenidas por smtesis o hemismtesis, moleculas biologicas obtenidas por purificacion) se diluye en un disolvente, preferentemente agua o dimetilsulfoxido (concentracion preferentemente comprendida entre 10'°M y 10-2M, y preferentemente del orden de 10-4 M, o preferentemente comprendida entre 1 % en peso/peso y 5 % en peso/peso, en funcion de las moleculas). La solucion obtenida a continuacion se filtra eventualmente, preferentemente, a 0,45 pm o 0,22 pm.

Los principios activos obtenidos de acuerdo con uno de los metodos descritos anteriormente, se ensayaron despues a una concentracion final preferentemente comprendida entre 0,01% volumeiWolumen (v/v) y 10% (v/v) y ventajosamente comprendida entre 0,1 % y 1 % (v/v), por ejemplo al 1 % (v/v).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La incubacion en presencia de celulas se realizo ventajosamente durante 24 horas en medio K-SFM hipercalcico sin factores de crecimiento. Las celulas se congelaron en seco a -80 °C despues de un aclarado en tampon fosfato a pH de 7,4.

Extraccion de los ARN totales

Los ARN totales se extrajeron con el sistema SV Total RNA Isolation System (Promega, Meylan, Francia) para las condiciones de las placas de 96 pocillos de acuerdo con el protocolo del fabricante.

La modificacion de la expresion de genes se realizo por RT-PCR en tiempo real midiendo la expresion de cada gen relacionado con la actina (housekeeping gene, gen constitutivo) y expresado en % del control negativo no tratado.

RT-PCR cuantitativa en tiempo real (Q-RT-PCR)

Se anadieron 10 jl de ARN totales 5 ng/jjl a 40 jl de mezcla de PCR (compuesta por 25 jl de SYBR Green Buffer Mix 2X, 0,5 jl de mezcla de enzima, 0,5 jM de cebador final en sentido y 0,5 jM de cebador final antisentido, ARNasa agua y DNasa libre csp para 40 jl).

La RT-PCR se lleva a cabo en diferentes etapas tal como retrotranscripcion a 50 °C, 30 min, activacion de la polimerasa 95 °C, 15 min, realizacion de ciclos de PCR (95 °C, 15 s; 60 °C, 30 s; 72 °C, 30 s) x 50 ciclos

Realizacion de la curva de fusion

90 °C, 1min 30 °C, 1min

50 °C a 95 °C, 10 s/°C (curva de fusion)

El porcentaje de estimulacion o de inhibicion se expresa en relacion con el control no tratado tratar (en ausencia de la sustancia a ensayar).

Gen de Actina - Hibridacion a 60 °C

sentido GTGGGGCGCCCCAGGCACCA (SEQ ID NO 7) antisentido CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC (SEQ ID NO 8)

Gen de LOX - Hibridacion 60 °C

sentido ACGTACGTGCAGAAGATGTCC (SEQ ID NO 3) antisentido GGCTGGGTAAGAAATCTGATG (SEQ ID NO 4)

Gen de NRAGE-Hibridacion a 60 °C

sentido TGCACAGACATCAGCAGATGG (SEQ ID NO 5) antisentido TTCACGGATGATATCTCTCAGC (SEQ ID NO 6)

Gen de Involucrina-Hibridacion a 60 °C

sentido TGTTCCTCCTCCAGTCAATACCC (SEQ ID NO 9) antisentido ATTCCTCATGCTGTTCCCAGTGC (SEQ ID NO 10)

Para tener en cuenta la poblacion celular presente, todos los resultados se generaron como senal de "actina”, utilizada como gen constitutivo (Housekeeping gene). De acuerdo con la experimentacion, el umbral de medicion de C(T) (en ingles = Cycle Threshold, umbral de ciclo) se fijo para un T (Threshold, umbral en espanol) comprendido entre 0,05 y 0,01 y finalmente despues se calculo una unidad arbitraria de medicion para cada gen de acuerdo con la formula:

Sgen «x» 107 x (1/2)C<T)9en«x»

En la que, C(T) gen «x», significa el numero de ciclos necesarios para alcanzar el umbral de fluorescencia de 0,010,05 del gen «x».

Los valores de los genes de interes se generaron como senal de «actina» calculando la relacion:

R = Sgen «x»/Sactina

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Estas relaciones se compararon entre las muestras tratadas y no tratadas, siendo «x» el gen de actina, de LOX o de NRAGE.

Exploracion de principios activos:

Las cantidades de ADNc de cada ensayo se relacionaron con la cantidad de ADNc de la actina y finalmente con controles negativos (sin principios activos). Los resultados se consideran como significativos cuando el efecto medido alcanza un factor de aproximadamente 2. Sobre 120 principios activos ensayados, 3 corresponden a estos criterios, a las concentraciones ensayadas y en las condiciones definidas. Estos principios activos son los siguientes y son el objeto de la siguiente tabla:

Tabla 2

Nombre

NRAGE Control multiplicado por: LOX Control multiplicado por:

Efedra

2 2

Soja

2,5 1

Lupulo

1 2

Preferentemente, el extracto de efedra se extrae de toda la planta, particularmente por una extraccion con un disolvente polar como el agua o una mezcla de agua/butilenglicol (por ejemplo, 75/25 o 50/50), preferentemente agua.

Preferentemente, el extracto de lupulo se extrae de conos, particularmente por una extraccion con un disolvente polar como el agua o una mezcla de agua/butilenglicol (75/25 o 50/50), preferentemente agua.

Preferentemente, el extracto de soja se extrae de la semilla, particularmente por una extraccion con un disolvente polar como el agua o una mezcla de agua/butilenglicol (75/25 o 50/50), preferentemente agua.

Conclusiones

A partir del banco de 120 principios activos y en las condiciones tenidas en cuenta:

- 1 principio activo puede activar significativamente la tasa de smtesis de ARNm de los genes que codifican NRAGE y LOX,

- 1 principio activo puede activar significativamente la tasa de smtesis de ARNm del gen que codifica NRAGE, sin tener efecto sobre el gen que codifica LOX,

- 1 principio activo puede activar significativamente la tasa de smtesis de ARNm del gen que codifica LOX, sin tener efecto sobre el gen que codifica NRAGE.

Este estudio ha permitido seleccionar principios activos susceptibles de modular, al menos a nivel de los queratinocitos, el equilibrio entre proliferacion, diferenciacion y apoptosis.

El extracto de efedra puede utilizarse, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades tales como canceres, preferentemente canceres epiteliales cutaneos (basocelulares o espinocelulares) o liquen plano, o eventualmente para tratar determinadas manifestaciones cutaneas del GVH, o incluso para reducir los efectos del envejecimiento de la piel.

El extracto de soja puede utilizarse, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades tales como canceres, como los canceres epiteliales cutaneos (basocelulares o espinocelulares), el GVH, o el liquen plano, o para combatir o prevenir el envejecimiento. El extracto de soja puede utilizarse particularmente para combatir la hiperproliferacion celular.

El extracto de lupulo puede utilizase, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades tales como canceres, como los canceres epiteliales cutaneos (basocelulares o espinocelulares), eccema, soriasis. El extracto de lupulo puede utilizarse particularmente para combatir la hipoproliferacion celular.

El extracto de soja y el extracto de lupulo pueden utilizarse en asociacion, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades tales como canceres, como los canceres epiteliales cutaneos (basocelulares o espinocelulares), o el liquen plano.

El extracto de soja y el extracto de efedra pueden utilizarse en asociacion, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades tales como canceres, como los canceres epiteliales cutaneos (basocelulares o espinocelulares), o el liquen plano.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

El extracto de lupulo y el extracto de efedra pueden utilizarse en asociacion, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades tales como canceres, como los canceres epiteliales cutaneos (basocelulares o espinocelulares), o el liquen plano.

Ejemplo comparativo 14: analisis de la cinetica de la expresion de los ARN mensajeros, por RT-PCR cuantitativa, de NRAGE y de LOX sobre queratinocitos durante la diferenciacion calcica. Efecto de los principios activos sobre la cinetica de expresion.

Las condiciones experimentales aplicadas para obtener celulas en confluencia al 80 % son identicas a las descritas en el ejemplo comparativo 13. La diferenciacion se efectua en presencia calcio (CaCh 1,7 mM) y del principio activo. Se efectua un analisis despues de 2, 3 y 4 dfas de incubacion por Q-RT-PCR (metodo descrito en el ejemplo 13).

Tambien se ensayaron otras nueve sustancias. Una de ellas, un extracto de canela, permite tener una inhibicion de LOX y de NRAGE en las condiciones experimentadas tenidas en cuenta.

Tabla 3

Nombre

NRAGE Control multiplicado por LOX Control multiplicado por

Canela

2 D

0,9 0,5

3 D

0,7 0,7

4 D

0,2 0,5

(D=Dfas)

Preferentemente, el extracto de canela es extracto de la corteza, particularmente por una extraccion con un disolvente polar como el agua o una mezcla de agua/butilenglicol (75/25 o 50/50), preferentemente agua.

Conclusion

El extracto de canela puede utilizarse, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades tales como la soriasis.

El extracto de canela y el extracto de soja (cuyo efecto se ha detectado en el ejemplo comparativo anterior) pueden utilizarse en asociacion, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades tales como el tratamiento de determinadas manifestaciones cutaneas de GVH, un eczema, una soriasis, o incluso para reducir los efectos del envejecimiento de la piel.

Ejemplo 15: Analisis de la expresion de los ARN mensajeros de LOX por queratinocitos en cultivo en ausencia de diferenciacion calcica, con y sin puesta en contacto de principios activos cuya actividad se va a ensayar (Analisis realizado por ejemplo por RT-PCR cuantitativa, exploracion de principios activos).

Los principios activos se ensayaron en queratinocitos humanos normales de sujetos jovenes obtenidos por extraccion enzimatica de biopsias humanas recogidas despues de reseccion quirurgica y cultivados en monocapas en medio definido K-SFM (medio aserico con queratinocitos con complementos) complementado con antibioticos a 37 °C con CO2 al 5%.

Las celulas se sembraron al segundo pase en placas de 24 pocillos, por ejemplo, a razon de 30.000 celulas por cm2 y se cultivaron hasta aproximadamente una confluencia del 95 %. Los sedimentos celulares se aclararon en tampon fosfato pH 7,4 preferentemente con calcio y magnesio, antes de poner en contacto con los principios activos a ensayar o con los controles positivos de referencia diluidos en el medio K-SFM preparados sin complementos pero con antibioticos.

Se ensayaron principios activos de diferentes ongenes (vegetal, biotecnologico o moleculas de smtesis, por ejemplo) de 0,1 % volumen/volumen (v/v) a 1 % (v/v). Los principios activos de origen vegetal se ensayaron, por ejemplo, a 1 % (v/v) y las moleculas de smtesis se ensayaron, por ejemplo, a 0,1 % (v/v).

En particular, los principios activos de origen vegetal son extractos que se obtienen macerando las plantas (preferentemente rafces, rizomas, tallos, cortezas, flores, frutos, granos, semillas u hojas) a 2-5 % (p/p) en un disolvente o en una mezcla de disolventes, ventajosamente una mezcla de agua/(alcohol, glicol o poliol) (tales como etanol, glicerol, butilenglicol y otros glicoles, xilitol etc..,) de 100/0 a 0/100 (v/v). A continuacion los extractos obtenidos se filtran o destilan para recuperar la fraccion soluble que despues se filtra preferentemente a 0,45 pm. Los hidrolizados biotecnologicos se obtienen por fermentacion de extractos vegetales en presencia de microorganismos ventajosamente de la familia de Lactobacillus o Saccharomyces. Estos hidrolizados se filtran

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

despues preferentemente a 0,45 pm.

La incubacion se realiza ventajosamente durante 24 horas a 37 °C con CO2 al 5 % en medio K-SFM sin factores de crecimiento con antibioticos. Los controles negativos son bien el medio de cultivo solo, bien el medio de cultivo que contiene de 0,1 % (v/v) a 1 % (v/v) de disolvente utilizado durante el procedimiento de extraccion de los extractos ensayados. El control positivo de referencia utilizado para inducir una diferenciacion de las celulas es una solucion de cloruro de calcio (CaCl2- a una concentracion final de 1,7 pml).

Las celulas no tratadas (control NT) se congelaron en seco a -80 °C despues de aclarar en tampon fosfato a pH 7,4. Despues de tratamiento durante 24 h en presencia de principios activos o controles, las celulas se congelaron en seco a -80 °C despues de aclarar en tampon fosfato a pH 7,4.

Extraccion de ARN totales

Los ARN totales se extraen usando el sistema SV Total RNA Isolation System (Promega, Meylan, Francia) para las condiciones de placas de 24 pocillos de acuerdo con el protocolo del fabricante.

La modificacion de la expresion de los genes se realiza por RT- PCR en tiempo real midiendo la expresion de cada gen en relacion con la actina (gen conservador) y se expresa en % del control negativo no tratado (NT).

RT-PCR cuantitativa en tiempo real (Q-RT-PCR)

Se anadieron 10 pl de ARN totales 5 ng/pl a 40 pl de mezcla de PCR (compuesta por 25 pl de SYBR Green Buffer Mix 2X, 0,5 pl de mezcla de enzima, 0,5 pM de cebador final en sentido y 0,5 pM de cebador final antisentido, ARNasa agua y DNasa libre csp para 40 pl).

La RT-PCR se lleva a cabo en diferentes etapas tal como retrotranscripcion a 50 °C, 30 min, activacion de la polimerasa 95 °C, 15 min, realizacion de ciclos de PCR (95 °C, 15 s; 60 °C, 30 s; 72 °C, 30 s) x 50 ciclos

Realizacion de la curva de fusion

90 °C, 1min 30 °C, 1min

50 °C a 95 °C, 10 s/°C (curva de fusion)

Cebadores utilizados:

Gen de Actina-Hibridacion 60 °C

Sentido GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA (SEQ ID NO: 7)

Antisentido CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC (SEQ ID NO: 8)

Gen de LOX - Hibridacion 60 °C

Sentido TAC CAG CAG AAG ATG GTG direccion TCC (SEQ ID NO: 3)

Antisentido GGC TGG AGA GTA AAT CTG ATG (SEQ ID NO: 4)

Para tener en cuenta la poblacion celular presente, todos los resultados se generaron como senal de "actina”, utilizada como gen constitutivo (Housekeeping gene). De acuerdo con la experimentacion, el umbral de medicion de C(T) (en ingles = Cycle Threshold, umbral de ciclo) se fijo para un T (Threshold, umbral en espanol) comprendido entre 0,05 y 0,01 y finalmente despues se calculo una unidad arbitraria de medicion para cada gen de acuerdo con la formula:

Sgen «LOX»107x (1/2) C(T)gen «LOX»

C(T)gene «LOX», significa el numero de ciclos necesarios para alcanzar el umbral de fluorescencia de 0,01-0,05 del gen «LOX».

Los valores de los genes de interes se generaron como senal de «actina» calculando la relacion:

R = Sgen «LOX»/Sactina.

Estas relaciones se compararon con las muestras tratadas y no tratadas.

Exploracion de principios activos:

Las cantidades de ADNc de cada ensayo se relacionaron con la cantidad de ADNc de la actina y finalmente con controles negativos (NT). Los resultados se consideran como significativos cuando el efecto medido es una 5 modulacion de un factor de aproximadamente 2 (estimulacion) o 0,5 (inhibicion). Sobre 60 principios activos ensayados, 30 corresponden a estos criterios, en las condiciones definidas. Estos principios activos son los siguientes y son el objeto de la siguiente tabla:

Tabla 1

Descripcion

Nombre en latin Modulacion de LOX frente a NT Parte de la planta utilizada preferentemente

Saponaria blanca

Gypsophila ssp 0,4 raiz

Sandalo rojo

Pterocarpus santalinus 0,4 madera entera

Brionia

Bryonia dioica 0,5 raiz

Acebo enano

Ruscus aculeatus 2,0 raiz

Limon

Citrus limonia 2,0 fruto

Mandaria

Citrus reticulata 2,1 fruto

Etil trans 3 hexenoato

hexenoato 2,3 -

Khella

Amni visnaga 2,4 fruto

Acido alginico

2,4 -

Zanahoria

Daucus Carota 2,4 raiz

2 Metil butirato de metilo

/ 2,5 -

Badianier de china

Illicium verum 2,5 fruto

Cipres

Cupressus semperviren 2,6 fruto

Goma asafoetida

2,6 -

Xllitol

/ 2,8 -

Lupulo

Humulus lupulus 2,8 fruto

Endrino

Prunus spinosa 3,1 fruto

Madrono

Arbutus unedo 3,3 hoja

Pyrole

Chimaphila umbellata 3,4 planta

Alhucena aromatica

Asperula odorata 4,7 planta

Artemisa

Artemisia vulgaris 4,7 raiz

Sauco

Sambucus nigra 5,0 fruto

Col china

Brassica Brassica campestris var. Pekinen 5,3 planta

Canela

Cinnamomum spp 5,5 tallo lenoso

Efedra

efedra sinica 6,0 planta

Casia de Surinam

Cassia amara 6,2 madera entera

Cacaotero

Theobroma cacao 7,4 cascara de fruto

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Descripcion

Nombre en latin Modulacion de LOX frente a NT Parte de la planta utilizada preferentemente

Espiga

Serica 7,9 -

Zarzaparilla roja

Smilax ornata 9,0 raiz

Grosella

Ribes rubrum 9,1 fruto

Piretro

Anacyclus pyrethrum 9,8 raiz

Hinojo

Foeniculum 10,2 planta

Conclusiones

A partir del banco de 60 principios activos y en las condiciones tenidas en cuenta:

- 3 principios activos pueden inhibir significativamente la tasa de smtesis de ARNm del gen que codifica LOX,

- 28 principios activos, incluida la Cuasia de Surinam, pueden activar significativamente la tasa de smtesis de ARNm del gen que codifica LOX,

Este estudio ha permitido seleccionar principios activos susceptibles de modular, al menos a nivel de queratinocitos, el equilibrio entre proliferacion, diferenciacion y apoptosis.

Ejemplo comparativo 16: Analisis de la expresion de proteinas implicadas en la regulacion de la homeostasis proliferacion/diferenciacion epidermica en un modelo de piel reconstruida con y sin puesta en contacto con principios activos, cuya actividad se ensaya mediante histologia (ejemplo el extracto de efedra).

La manifestacion de marcadores de proliferacion o diferenciacion se realizo en un modelo de piel reconstruida

(MIMESKIN®, Engelhard Lyon, Francia) preparado a partir de un sustrato dermico

(colageno/glucosaminoglucano/quitosano, MIMEDISC®, Engelhard Lyon, Francia) sembrado por fibroblastos humanos normales, en cuya superficie se depositaron queratinocitos humanos normales, extrayendose las celulas por tratamiento enzimatico de biopsias obtenidas por reseccion quirurgica.

El modelo de piel reconstruida se realiza en particular de acuerdo con el siguiente protocolo:

- de 0,5 a 1.106 fibroblastos de piel humana normal se sembraron en un sustrato matricial a base de colageno/glucosaminoglucanos/quitosano, despues se cultivaron en un medio nutritivo, por ejemplo DMEM- Glutamax complementado con 10 % de suero de ternero; acido ascorbico, preferentemente a una concentracion final de 1 mM; EGF (factor de crecimiento epidermico), preferentemente a una concentracion final de 10 ng/ml; Normocina, preferentemente a una concentracion final de 100 pg/ml, durante 21 dfas.

- de 0,5 a 1.106 queratinocitos humanos normales se sembraron en el equivalente dermico, despues se cultivaron en un medio nutritivo, por ejemplo DMEM-Glutamax/Ham F-12 (proporcion 3/1 v/v) complementado con suero de ternero; acido ascorbico, preferentemente a una concentracion final de 1 mM; EGF (factor de crecimiento epidermico), preferentemente a una concentracion final de 10 ng/ml; hidrocortisona, preferentemente a una concentracion final de 0,4 pg/m ; umulina, preferentemente a una concentracion final de 0,12 UI/ml; isuprel, preferentemente a una concentracion final de 0,4 pg/ml; triyodotironina, preferentemente a una concentracion final de 2.10"9 M; adenina, preferentemente a una concentracion final de 24,3 pg/ml; Normocina, preferentemente a una concentracion final de 100 pg/ml. El cultivo prosiguio durante 7 dfas en inmersion. A continuacion los cultivos se colocaron en la interfaz aire-lfquido durante 14 dfas mas en el mismo medio que el cultivo en inmersion, sin incluir suero de ternero, hidrocortisona, isuprel, triyodotironina y umulina.

El principio activo (extracto de efedra) se diluyo ventajosamente en los medios de cultivo anteriormente descritos a 0,5 y 1 % y se utilizo 3 dfas despues de la siembra respectiva de fibroblastos y de queratinocitos (es decir, los dfas 3 a 21 y los dfas 24 a 42). El control positivo se realizo preferentemente anadiendo cloruro de calcio 1,5 mM en una concentracion final durante la fase emergente de pieles reconstruidas (los dfas 28 a 42) para estimular la diferenciacion epidermica.

Al final del cultivo, las muestras se congelaron, se incluyeron en una resina termosensible y despues se crioseccionaron a 5 pm.

Los marcajes sobre los cortes se realizaron con los reactivos descritos a continuacion:

5

10

15

20

25

30

35

40

- anticuerpo primario anti-transglutaminasa humana

- anticuerpo primario anti-citoqueratina 10 humana

- anticuerpos secundarios acoplados a alexa-fluor

- azul de Evans

- Dapi

La visualizacion de los inmunomarcajes se realizo al microscopio fotonico (Axioskop2plus - Zeiss, alemania) y la cuantificacion de los inmunomarcajes de transglutaminasa se realizo por analisis de imagenes (Lucia - Nikon, Francia) y se evaluaron los efectos del tratamiento por el principio activo (ensayo estadfstico Holm-sidak, p<0,01).

Tabla 1: Cuantificacion de la intensidad de marcaje de la transglutaminasa.

INTENSIDAD

No tratada Calcio Efedra al 0,5 % Efedra al 1 %

0,149 0,061 0,082 0,276

0,099 0,076 0,126 0,196

0,092 0,064 0,094 0,192

Media

0,113 0,067 0,100 0,221

Desviacion tfpica

0,031 0,008 0,023 0,048

Variacion frente a NT

100 % 59% 88% 196 %

Significatividad frente a NT

- Non Non Oui

Variacion frente a Ca

169 % 100 % 149 % 330 %

Significatividad frente a Ca

No - No Si

Estos resultados indican que el principio activo induce el mismo tipo de diferenciacion epidermica que el control positivo con una relacion dosis-efecto. En efecto, las pieles tratadas presentan un mayor numero de capas queratinocitarias que expresan la transglutaminasa, en particular en la capa denominada granulosa. Por otro lado, el marcaje obtenido es mas intenso y mas definido, tal como se ilustra en el engrosamiento de la parte epidermica. La cuantificacion demuestra claramente la induccion de la forma proteica despues de tratamiento en particular, a la concentracion de principio activo de 1 % (introduccion de 2 veces).

La Figura 11 presenta el marcaje global de la piel reconstruida con azul de Evans (capas epidermicas en color rojo, las celulas en azul, las fibras del sustrato dermico en rojo, la union dermoepidermica con una lmea de puntos).

Estos resultados indican que el principio activo induce el mismo tipo de diferenciacion epidermica que el control positivo con una relacion dosis-efecto. En efecto, las pieles tratadas presentan un mayor numero de capas queratinocitarias diferenciadas y en particular se observarse un aumento del espesor de la capa denominada granulosa. Por otro lado, tambien se obtiene un efecto interesante sobre la densidad fibroblastica a nivel de las dermis tratadas con efedra.

La Figura 12 presenta la deteccion inmunohistoqmmica de la citoqueratina 10 sobre piel reconstruida (celulas que expresan intensamente el marcador en rojo, el nucleo en azul, la union dermoepidermica con lmea de puntos).

Estos resultados indican que el principio activo induce el mismo tipo de diferenciacion epidermica que el control positivo con una relacion dosis-efecto. En efecto, las pieles tratadas presentan un mayor numero de capas queratinocitarias que expresan la citoqueratina 10 y en particular en la capa denominada granulosa.

La Figura 13 presenta la deteccion inmunohistoqmmica de la transglutaminasa sobre la piel reconstruida (celulas que expresan intensamente el marcador en rojo, el nucleo en azul, la union dermoepidermica con lmea de puntos).

Ejemplo 17: utilizacion de productos de la invencion en formulaciones cosmeticas o farmaceuticas de tipo emulsion de aceite en agua

A

Formulacion 17a:

Agua

Butilenglicol

Glicerina

Dihidroxicetil sodico Fosfato,

Isopropil Hidroxicetil Eter

csp 100 2 3 2

B

Glicol Estearato SE Triisononaoina Octil Cocoato

14

5

6

5

Butilenglicol,

Metilparabeno,

Etilparabeno, Propilparabeno, pH ajustado a 5,5

Productos de la invencion

0,01

A

Formulacion 17b: Agua csp 100

Butilenglicol 2

Glicerina 3

Poliacrilamida, Isoparafina, 2,8

B

Lauret-7 Butilenglicol, 2

Metilparabeno, Etilparabeno, Propilparabeno; Fenoxietanol, 2

Metilparabeno, Propilparabeno, Butilparabeno, Etilparabeno 0,5

D

Butilenglicol Productos de la invencion 0,01 - 10 %

A

Formulacion 17c: Carbomer 0,50

Propilenglicol 3

Glicerol 5

Agua csp 100

B

Octil Cocoato 5

Bisabolol 0,30

Dimeticona 0,30

C

Hidroxido de Sodio 1,60

D

Fenoxietanol, 0,50

E

Metilparabeno, Propilparabeno, Butilparabeno, Metilparabeno, Etilparabeno Perfume 0,30

F

Productos de la invencion 0,01 - 10 %

C

2

Ejemplo 18 de la invencion: Utilizacion de productos de la invencion en una formulacion de tipo agua en aceite

A

PEG 30 -

Dipolihidroxiestearato Trigliceridos Capricos Cetearil Octanoato Dibutil Adipato Aceite de Semilla de Uva Aceite de Jojoba Fenoxietanol,

Metilparabeno,

Propilparabeno, Butilparabeno; Etilparabeno

3

3

4 3

1.5

1.5 0,5

B

Glicerina

Butilenglicol

3

3

C

D

E

Sulfato de Magnesio

EDTA

Agua

Ciclometicona

Dimeticona

perfume

productos de la invencion

0,5 0,05 csp 100

1

1

0,3

0,01-10 %

Ejemplo 19 de la invencion: Utilizacion de productos de la invencion en una formulacion de tipo champu o gel de ducha

A

B

C

D

E

5

Goma Xantana 0,8

Agua csp 100

Butilenglicol, Metilparabeno, 0,5 Etilparabeno, Propilparabeno Fenoxietanol, 0,5

Metilparabeno,

Propilparabeno, Butilparabeno Etilparabeno

Acido Cttrico 0,8

Lauret Sulfato Sodico 40,0

Producto de la invencion 0,0-10 %

Ejemplo 20 de la invencion: Utilizacion de productos de la invencion en una formulacion de tipo pintalabios y otros productos anhidros

10

A

B

C

Cera mineral

17,0

Isostearil Isostearato

31,5

Propilenglicol Dipelargonato

2,6

Propilenglicol Isostearato

1,7

PeG 8 Cera de Abeja

3,0

Aceite de Semilla de Palma Hidrogenado

3,4

Gliceridos,

Gliceridos de Palma Hidrogenados

Aceite de Lanolina

3,4

Aceite de Sesamo

1,7

Cetil Lactato

1,7

Aceite Mineral, Alcohol de Lanolina

3,0

Aceite de Ricino

csp 100

Dioxido de Titanio

3,9

CI 15850:1

0,616

CI 45410:1

0,256

CI 19140:1

0,048

CI77491

2,048

Productos de la invencion

0,01-5 %

Ejemplo 21 de la invencion: Utilizacion de productos de la invencion en una formulacion de geles acuosos (contornos de ojo, adelgazantes, etc...)

A

Agua

Carbomer

Butilenglicol

Fenoxietanol, Metilparabeno, Propilparabeno, Butilparabeno; Etilparabeno

csp 100 0,5 15 0,5

B Productos de la invencion 0,0 -10 %

Ejemplo 22 de la invencion: Utilizacion de productos de la invencion en una formulacion de tipo emulsion triple

A

Emulsion primaria PEG 30 -

dipolihidroxiestearato Trigliceridos Capricos Isohexadecano PPG-15 Estearil Ester

W1/O

4

7.5 15

7.5

B |Agua

65,3

C

Fenoxietanol,

Metilparabeno

Propilparabeno, Butilparabeno; Etilparabeno

Emulsion secundaria W1/O/W2 A Emulsion primaria

0,7

60

B

Poloxamer 407 Fenoxietanol,

Metilparabeno,

Propilparabeno,

2-bromo- 2 nitropropan-1,3 diol agua

2

0,3

csp 100

C |Carbomer

15

D |Trietanolamina

PH 6,0-6,5

5 Ejemplo comparativo 23: Preparacion de formulaciones farmaceuticas que contienen el producto de la invencion

A

Formulacion comparativa 23a: preparacion de comprimidos

Excipientes

Lactosa

Sacarosa

En g por comprimido

0,359

0,240

B__________________________Productos de la invencion*________0,001 -0,1_____________________________

*El producto de la invencion se obtiene, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento de extraccion descrito en el ejemplo 13 seguido de una etapa de secado.__________________________________________________________

A

Formulacion comparativa 23b: preparacion de una pomada

Excipientes

Polietileno de baja densidad 5,5

Parafina lfquida cps 100

B__________________________Productos de la invencion*________0,001 -0,1_____________________________

*El producto de la invencion se obtiene, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento de extraccion descrito en el ejemplo 13 seguido de una etapa de secado.__________________________________________________________

10

A

Formulacion comparativa 23c: preparacion de una formula inyectable

Excipientes

Solucion Isotonica salada 5,5 ml

B__________________________Productos de la invencion*________0,001 -0,1_____________________________

*El producto de la invencion se obtiene, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento de extraccion descrito en el ejemplo 13 seguido de una etapa de secado.__________________________________________________________

5

10

15

20

25

30

35

40

Ejemplo 24: Evaluacion de la aceptacion cosmetica de una preparacion que contiene el sujeto de la invencion

Los ensayos de toxicologfa se realizaron sobre el compuesto obtenido segun el ejemplo 2 incorporado a 10 % en un gel de xantana a 0,5 %, para una evaluacion ocular en el conejo, estudiando la ausencia de toxicidad anomala por administracion oral unica en la rata y estudiando el poder sensibilizante en la cobaya.

Evaluacion de la irritacion primaria cutanea en el conejo:

Las preparaciones descritas anteriormente se aplicaron sin dilucion a segun el metodo recomendado por la Directiva OECD concerniente al sobre la piel".

Los productos se clasificaron de acuerdo con los criterios definidos por del 21/02/82.

Los resultados de estos ensayos, permiten llegar a la conclusion de clasificados como no irritantes para la piel.

Evaluacion de irritacion ocular en el conejo:

Las preparaciones descritas anteriormente se instilaron puras una sola vez, a razon de 0,1 ml, en el ojo de 3 conejos de acuerdo con el metodo recomendado por la directiva de la OCDE N.° 405 del 24 de febrero 1.987 concerniente al estudio del "efecto irritante/corrosivo agudo sobre ojos."

Los resultados de este ensayo permiten llegar a la conclusion de que las preparaciones pueden considerarse como no irritantes en los ojos, segun la directiva 91/326 CEE utilizadas puras o sin dilucion.

Ensayo sobre la ausencia de toxicidad anomala por administracion oral unica en la rata:

Las preparaciones descritas se administraron en una vez por via oral a la dosis de 5 g/kg de peso corporal, a 5 ratas macho y 5 ratas hembra de acuerdo con un protocolo inspirado de la directiva de la OCDE N.° 401 del 24 febrero de febrero de 1987 y adaptado a productos cosmeticos.

Las (Dosis Letales) DL0 y DL50 eran superiores a 5.000 mg/kg. Por tanto, las preparaciones ensayadas no se clasificaron como peligrosas por ingestion.

Evaluacion del potencial de sensibilizacion cutanea en la cobaya:

Las preparaciones descritas se sometieron al ensayo de maximizacion descrito por Magnusson y Kligmann, protocolo de acuerdo con la lmea directriz n.° 406 de la OCDE.

Las preparaciones se clasificaron como no sensibilizantes por contacto con la piel.

la dosis de 0,5 ml en la piel de 3 conejos estudio del "efecto irritante/corrosivo agudo

el decreto del 1/02/1982 publicado en JORF

que los productos de la invencion estaban

Claims (6)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. Utilizacion de una sustancia que estimula la expresion de la protema LOX que tiene la secuencia ID NO: 1 para el tratamiento o la prevencion del envejecimiento de la piel, siendo dicha sustancia un extracto de madera entera de Cuasia de Surinam (Cassia amara), preparandose dicha sustancia en forma de composicion cosmetica.
2. 2. La utilizacion de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por que la composicion cosmetica comprende 0,01 % y 10 % (v/v) de dicha sustancia.
3. 3. Utilizacion de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por que la composicion cosmetica comprende 0,1 % y 1 % (v/v) de dicha sustancia.
4. 4. Utilizacion, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que una planta se reduce a polvo y el polvo se dispersa a razon de 2 a 5 % (peso/peso) de polvo en un disolvente polar, ventajosamente en una mezcla de agua/(alcohol, glicol o poliol), y preferentemente en una mezcla de agua/butilenglicol de 75/25 o 50/50, para preparar dicha sustancia.
5. 5. Utilizacion, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que dicho extracto de Cuasia de Surinam (Cassia amara) se obtiene macerando la planta a un 2-5 % (p/p) en un disolvente o en una mezcla de disolventes, filtrandose o destilandose despues el extracto obtenido para recuperar la fraccion soluble que despues se filtra preferentemente a 0,45 pm, pudiendo dicho extracto activar significativamente la tasa de smtesis de ARNm del gen que codifica LOX por queratinocitos en cultivo en ausencia de diferenciacion calcica.
6. 6. Utilizacion, de acuerdo con una cualquiera de reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que la composicion comprende al menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en conservantes, emolientes, emulsionantes, tensioactivos, hidratantes, espesantes, acondicionadores, agentes matificantes, estabilizantes, antioxidantes, agentes texturizantes, agentes abrillantadores, agentes filmogenos, solubilizantes, pigmentos, colorantes, perfumes y filtros solares.

   Figura 1: Secuencia y esquema de la proteina NRAGE (Neurotrophin-Receptor-interactig MAGE homolog o MAGE D1).

   MAQKMDCGAGLLGFQAEASVEDSALLMQTLMEAIQISEAPPTNQATAAASPQSSQPPTANEM

   ADIQVSAAAARPKSAFKVQNATTKGPNGVYDFSQAHNAKDVPNTQPKAAFKSQNATSKGPNA

   AYDFSQAATTGELAANKSEMAFKAQNATTKVGPNATYNFSQSLNANDLANSRPKTPFKAWND

   TTKAPTADTQTQNVNQAKMATSQADIETDPGISEPDGATAQTSADGSQAQNLESRTIIRGKR

   TRKINNLNVEENSSGDQRRAPLAAGTWRSAPVPVTTQNPPGAPPNVLWQTPLAWQNPSGW

   QNQTARQTPPARQSPPARQTPPAWQNPVAWQNPVIWPNPVIWQNPVIWPNPIVWPGPVVW

   PNPLAWQNPPGWQTPPGWQTPPGWQGPPDWQGPPDWPLPPDWPLPPDWPLPTDWPLPP

   DWIPADWPIPPDWQNLRPSPNLRPSPNSRASQNPGAAQPRDVALLQERANKLVKYLMLKDYT

   KVPIKRSEMLRDIIREYTDVYPEIIERACFVLEKKFGIQLKEIDKEEHLYILISTPESLAGILGTTKD

   TPKLGLLLVILGVIFMNGNRASEAVLWEALRKMGLRPGVRHPLLGDLRKLLTYEFVKQKYLDYR

   RVPNSNPPEYEFLWGLRSYHETSKMKVLRFIAEVQKRDPRDWTAQFMEAADEALDALDAAAA

   EAEARAEARTRMGIGDEAVSGPWSWDDIEFELLTWDEEGDFGDPWSRIPFTFWARYHQNAR

   SRFPQTFAGPIIGPGGTASANFAANFGAIGFFWVE

   imagen1

   1 mhd.-iI Dominio de homologia de MAGE f Trd I Dominio repetido intercalado Zonas ricas en restos de lisina

   ]Ct

   Figura 2: Interaccion en doble hibrido de mam^fero.

   imagen2

   imagen3

   LOX NRAGE

   Figura 4: Colocalizacion con microscopia confocal de LOX y NRAGE en cortes de piel humana.

   imagen4

   imagen5

   Figura 6: Deteccion de LOX y de NRAGE en la piel de una persona con enfermedad de respuesta de injerto contra huesped (o GVH: graft versus host).

   imagen6

   Figura 7: Deteccion de LOX y de NRAGE en la piel de una persona que presenta un cancer de tipo basocelular y espinocelular

   imagen7

   Figura 8: Deteccion de LOX y de NRAGE en la piel de un paciente con liquen plano.

   imagen8

   imagen9

   Figura 10: Manifestacion de la localizacion de LOX y de NRAGE en la piel de un paciente con eccema.

   imagen10