KR100889460B1 - Ｇｄｎｆ를 포함하는 모발의 멜라닌 생성 촉진용 조성물,ｇｄｎｆ를 이용하는 모발의 멜라닌 생성 촉진 방법 및ｇｄｎｆ의 발현정도를 이용하여 모발 멜라닌 생성촉진제를 스크리닝하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GDNF를 포함하는 모발의 멜라닌 생성 촉진용 또는 백모억제용 조성물, GDNF를 단백질 또는 그 유전자 형태로 투여하는 단계를 포함하는 모발의 멜라닌 생성 촉진 또는 백모 억제 방법 및 GDNF의 발현정도를 이용하여 모발 멜라닌 생성 촉진제를 스크리닝하는 방법을 개시한다. 본 발명에 따르면, 흑모에 비하여 백모에서 GDNF의 발현이 현저하게 감소된다는 사실 및 GDNF의 발현이 멜라닌합성과 관련된다는 사실에 근거하여, GDNF를 단백질 또는 그 유전자 형태로 이용하여 모발의 멜라닌 생성을 촉진하고 백모를 억제할 수 있다. 또한 GDNF를 모발 멜라닌 생성 촉진제를 개발하는 표적으로 활용하고, 개발된 모발 멜라닌 생성 촉진제를 스크리닝하는 방법으로 활용할 수 있다.

GDNF(Glial cell line derived Neurotrophic Factor), 백모 억제, 멜라닌, 모발

Description

ＧＤＮＦ를 포함하는 모발의 멜라닌 생성 촉진용 조성물, ＧＤＮＦ를 이용하는 모발의 멜라닌 생성 촉진 방법 및 ＧＤＮＦ의 발현정도를 이용하여 모발 멜라닌 생성 촉진제를 스크리닝하는 방법 {Composition for enhancing melanogenesis in hair containing GDNF, method for enhancing melanogenesis in hair using GDNF, and method for screening hair-melanogenesis enhancer using GDNF expression level}

본 발명은 GDNF 단백질을 포함하는 모발의 멜라닌 생성 촉진용 조성물, GDNF 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 투여하는 단계를 포함하는 모발의 멜라닌 생성 촉진 방법 및 GDNF의 발현정도를 이용하여 모발 멜라닌 생성 촉진제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 흑모에 비하여 백모에서 GDNF의 발현이 현저하게 감소된다는 사실 및 GDNF의 발현이 멜라닌합성과 관련된다는 사실에 근거하여 GDNF를 백모 치료의 표적으로 이용하는 백모 억제용 조성물, 백모 억제 방법 및 백모억제제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

모발은 크게 모표피, 모피질, 모수질의 3부분으로 구성되어 있다. 모수질을 감싸고 있는 모피질은 모발에서 가장 두터운 부분(80~90%)으로서 멜라닌색소 및 지 질막과 TRP-1(Tyrosinase Related Protein-1), TRP-2 (Tyrosinase Related Protein-2)및 기타단백질로 구성된 멜라노좀이라는 과립을 포함하고 있다. 멜라닌 색소는 멜라노사이트내의 소기관인 멜라노좀에서 합성되며, 멜라노사이트의 수지상 돌기를 통하여 주위의 케라티노사이트로 이동한다. 멜라닌의 합성 경로를 보면, 먼저 아미노산인 타이로신이 산화되어 도파가 생성되는 단계 및 도파가 산화되어 도파퀴논이 생성되는 단계에서 티로시나제가 관여하며 그 후의 반응은 자동 산화적으로 진행되지만, TRP-1 및 TRP-2와 같은 효소가 관여하여 반응을 가속화 시키는 것으로 알려져 있다.

모발의 색상은 아미노산인 타이로신을 원료로 하여 형성되는 유멜라닌 및 페오멜라닌의 유형과 분포 비율 등의 요인에 의해 모발의 밝기가 결정된다. 즉 멜라닌의 유형과 과립의 크기에 따른 흑색, 적색, 금발 등의 다양한 모발색상을 결정한다고 볼 수 있다. 백모는 색소 알갱이가 없어 나타나는 머리색이다.

멜라닌은 물에 용해되지 않는 단백질로서 두발에 색상을 부여한다. 아미노산인 타이로신은 모유두에서 생성된 멜라닌의 기질이며. 백모의 경우 티로시나제 효소를 만들지 못하기 때문에 산화작용이 이루어지지 못하여 도파퀴논에서 그 작용을 멈추므로 모발이 케라틴화 (각화) 되어 위로 올라가면서 형성된다. 즉, 백모는 멜라노사이트에서 멜라닌 생성이 멈추기 때문에 일어나는 현상으로 일종의 노화현상이다.

도파퀴논은 두 가지 경로로 중합반응이 진행된다. 도파퀴논이 도파크롬을 거쳐 흑갈색의 유멜라닌을 생성하는 경로와 도파퀴논이 케라틴 단백질에 존재하는 시 스테인과 결합한 후 적갈색의 페오멜라닌을 생성하는 경로가 있다. 시스테인 함량이 많은 모발에는 페오멜라닌이 많이 존재한다. 이 반응에서는 방향족 아민과 페놀모노머(phenolmonomer)가 산화 중합하고, 또한 모발중의 아미노산 잔기와 결합한다.

생성된 멜라닌은 케라티노사이트에 전달된 후, 모발의 성장과 함께 위쪽으로 이동한다. 생리적 노화의 한 현상으로서 인식되는 백모는 모발 멜라노사이트의 수적 감소 및 멜라노사이트의 기능저하에 의한 멜라닌 생성의 감소에 의해 유발된다.

백모는 일반적으로 노화가 진행되면서 발생하는 것으로 노령이라는 인상을 강하게 주기 때문에, 생성된 백모를 감추기 위하여 백모를 검게 염색하는 염색제가 많이 연구되고 널리 시판되고 있다. 그러나, 염색은 일시적인 방법으로 백모의 성장에 의해 다시 염색하지 않으면 안되고, 또 현재 널리 사용되고 있는 산화형 흑발염색은 산화제 등의 사용에 의해 피부에 손상을 준다.

따라서, 백모의 발생을 방지하는 백모억제제에 대하여 각종 연구가 행해지고 있다. 검정참깨, 호도살, 한련초, 꿀에 보조성분으로 숙지황, 천문동, 맥문동을 배합하여 이용하거나, 적하수오, 측백나무잎, 여정자, 한련초, 석염과 숙지황, 천문동, 맥문동과 함께 검정콩과 함께 용기에 넣은 후 50℃의 온도에서 끓여 약액이 검정콩을 흑모 유지하는 방법, 검정깨, 흑송잎, 다시마를 이용한 것, 오갈피추출 엑기스를 이용한 것 등의 식물 추출물을 유효성분으로 하는 것이 있다. 또, 뇌하수체 호르몬을 이용한 것, C-AMP(아데노신-3,5' 사이클릭 포스페이트)를 이용한 것, 비타민 D3을 이용한 것 등이 개시되어 있다. 그러나 최근의 백모억제제의 유효성분은 주로 식물, 동물성분의 추출물 또는 동물의 생체활동에 관여하는 성분으로 사람이 체감할 수 있는 효과를 발휘하지 못하고, 더욱이, 이러한 특허들의 대다수는 어떤 물질이 백모에 좋다는 현상학적인 면이 대다수를 이루고 있으며 기전적 연구는 아직 미흡한 실정이다. 세계적으로도 백모 기전에 대한 연구가 진행이 되고 있으나 모낭 멜라노사이트 연구가 표피의 그것과는 달라서 연구 진행 속도가 느린 편이다.

일반적으로 GDNF 단백질은 신경교세포 주 유래 뉴로트로픽 인자(Glial cell line derived neurotrophic factor)로 TGF-b 패밀리와 관련이 있는 뉴로트로픽 인자이다. NCBI accession ID는 NP_000505이고, 그 분자량은 15KDa이다. GDNF는 그 이름에서도 알 수 있듯이 뉴런의 생존과 관련되어, 뉴런의 뉴라이트(neurite)와 액손(axon)의 성장을 촉진하는 것이 주 역할이다. 그러므로 GDNF는 주로 신경학쪽에서 많은 연구가 이루어지고 있다.

이에 본 발명자는 흑모에 비하여 백모에서 GDNF의 발현이 현저하게 감소된다는 사실 및 GDNF의 발현이 멜라닌합성과 관련된다는 사실을 밝혀내었다. 따라서 본 발명은 상기 사실을 기초로 GDNF 단백질을 포함하는 모발의 멜라닌 생성 촉진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 GDNF 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 투여하여 모발의 멜라닌 생성을 촉진하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 GDNF의 발현 정도를 이용하여 모발 멜라닌 생성 촉진제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 신경교세포주 유래 성장인자(Glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF) 을 유효성분으로 함유하는 모발의 멜라닌 생성 촉진용 조성물 및 백모 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 GDNF, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 투여하는 단계를 포함하는 모발의 멜라닌 생성 촉진 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 시험 물질에 대하여 모발 멜라닌 생성 촉진 여부를 스크리닝하는 방법으로서, 상기 시험 물질이 GDNF의 발현을 촉진하는지를 ELISA 또는 웨스턴블럿(immuno blot) 방법으로 확인하는 단계를 포함하는 모발 멜라닌 생성 촉진제 스크리닝 방법 또는 GDNF의 프로모터 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포에 트랜스펙션시키는 단계; 상기 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험 물질이 상기 리포터 유전자의 발현을 촉진하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 모발 멜라닌 생성 촉진제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 흑모에 비하여 백모에서 GDNF의 발현이 현저하게 감소된다는 사실 및 GDNF의 발현이 멜라닌합성과 관련된다는 사실에 근거하여, GDNF 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 이용하여 모발의 멜라닌 생성을 촉진할 수 있다. 또한 GDNF를 모발 멜라닌 생성 촉진제를 개발하는 표적으로 활용하고, 개발된 모발 멜라닌 생성 촉진제를 스크리닝하는 방법으로 활용할 수 있다.

본 발명은 흑모에 비하여 백모에서 GDNF의 발현이 현저하게 감소된다는 사실 및 GDNF의 발현이 멜라닌합성과 관련된다는 사실을 밝혀내고, 이를 기초로 GDNF를 포함하는 모발의 멜라닌 생성 촉진용 또는 백모 억제용 조성물, 및 GDNF 또는 GDNF를 암호화하는 유전자를 이용하는 모발의 멜라닌 생성 촉진 또는 백모 억제 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 GDNF의 발현정도를 이용하여 모발 멜라닌 생성 촉진제 또는 백모억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, GDNF는 MITF의 발현을 촉진함으로써 모발의 멜라닌 생성을 촉진하고, 모발의 멜라닌 생성을 촉진함으로써 백모를 억제할 수 있다.

화장품에 적용할 경우에는 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함 유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다. 특히, 두피 또는 모발에 도포하는 샴푸, 린스, 컨디셔닝, 토닉 또는 두피에센스의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 화장료 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 이들 보조제는 화장품학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

의약품에 적용할 경우에는 본 발명의 일실시예에 따른 GDNF 단백질을 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 비경구 투여제(주사, 경피 투여 또는 외용도포)로 제제화할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제재로는 국소 주사용제제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제 등을 들 수가 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 GDNF투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 주사제를 제외한 제재에 대해서는 백모가 발생되는 부위에 외용 도포하는 식으로 당업자의 수준에서 적용할 수 있고, 주사제의 경우에는 백모가 진행된 두피의 진피와 피하지방에 국소적으로 주사할 수 있다. 일반적으로 투여량은 0.001mg/kg/일 내지 대략 2000mg/kg/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎍/kg/일 내지 100 ㎍/kg/일이다.

본 발명의 일실시예에 따른 GDNF 단백질은 백모 억제 또는 모발 멜라닌 생성 촉진을 할 수 있는 한 천연의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 다른 잔기로 치환, 결실 또는/및 첨가되어 다양하게 변형된 형태일 수 있으며, 또한 인산화, 당화, 메틸화, 파네실화 등의 변형이 일어난 형태일 수도 있다.

본 발명의 일실시예에서, GDNF 또는 유사단백질을 암호화하는 유전자를 투여하기 위하여 여러가지 방법을 사용할 수 있다. 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하여 유전자를 투여할 수 있는데, 바이러스성 벡터로는, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 등이 있고, 비바이러스성 벡터로는, 마 이셀 또는 리포좀과 같은 구조 등이 있으며, DNA를 벡터 없이 전기 천공법(electroporation) 또는 유전자총(gene gun)을 이용하여 투여할 수도 있다. 특히, 리포좀에 GDNF 또는 유사단백질을 암호화하는 유전자를 운반하여 투여할 수 있다.

GDNF의 발현 정도를 이용한 백모 억제제 또는 모발 멜라닌 생성 촉진제 스크리닝은 시험 물질이 GDNF 단백질의 발현을 촉진하는지를 면역검정법(예를 들어 ELISA 또는 Immunoblot)으로 확인하거나, GDNF의 프로모터를 포함하는 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포에 트랜스펙션(transfection)시키고 상기 세포에 시험 물질을 처리하여 상기 시험 물질이 상기 리포터 유전자의 발현을 촉진하는지 여부를 확인하는 방법으로 수행될 수 있다.

상기 백모억제제 스크리닝을 위한 리포터 유전자 분석(assay)법은 일반적인 분자생물학 기법에 의해 제조된 리포터 유전자 벡터를 이용한다. 리포터 유전자로는 반딧불(firefly) 루시퍼라제(luciferase) 유전자 또는 가우시아 루시퍼라제 유전자 (GLuc) 등을 사용할 수 있다. GDNF의 프로모터는 당업자가 미국 NCBI 데이터베이스로부터 유전자 ID(2668)를 이용하여 쉽게 디자인하여 얻을 수 있다. 일차 배양한 멜라노사이트 혹은 불멸화된 멜라노사이트나 멜라노마 세포에 상기 준비된 플라스미드를 트랜스펙션시킨 후 24시간 경과 시점에 백모억제제 후보 약물을 처리하고 루시퍼라제 활성을 루미노미터(Luminometer)로 측정하면, 백모억제제 후보 약물이 GDNF의 발현에 미치는 영향을 확인할 수 있다.

이하, 하기 시험예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[시험예 1] 백모와 흑모에서의 사이토카인(cytokine) 발현 비교 분석

총 3명의 두피에서 각각 백모와 흑모 부위를 생검하여 얻은 뒤에 각각에서 멜라노사이트를 분리하여 배양한다. 각각의 배양된 멜라노사이트에 대하여 ml당 50000개의 세포를 평판 배지에 넣어서 24시간을 키운다. 그 다음에 이 배양액을 걷어서 1차 배양액이라 명명한다. 다시 여기에 새 배지를 넣어준 후에 72시간 동안 배양한 후 이 배양액을 걷어서 2차 배양액이라 한다. 1차와 2차 배양약을 1:1 로 섞어서 적합한 배지(conditioned media, CM)를 만든다. 준비된 백모와 흑모의 CM을 가지고 Raybiotech에서 구입한 사이토카인 어세이 키트 (제품번호:AAH-GF1) 를 이용하여 키트에서 제공하는 표준 실험법에 의해 실험을 수행한다. 결과는 도 1과 같다. 비교 분석 결과 백모의 배양액에서 흑모의 배양액에서보다 GDNF의 발현량이 낮아졌음을 확인하였다.

사이토카인 어세이 결과에서 GDNF가 백모에서 발현이 낮아진다는 사실을 확보하고 실제로 인체 흑모와 백모에서 GDNF의 발현 정도를 알아보기 위해 mRNA의 발현을 살펴보았다.

[시험예 2] 흑모와 백모에서의 GDNF의 mRNA 발현

총 3명의 두피에서 백모 부위와 흑모 부위를 각각 생검을 한 후 이 조직으로부터 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다(2-a). 또한 조직으로부터 멜라노사이트를 배양하여 그 세포로부터 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다(2-b). 그 결과를 도 2에 나타내었다. RT-PCR 결과 조직과 세포 모두에서 흑모가 백모보다 GDNF를 많이 발현하고 있음을 확인하였다.

상기 두 시험으로 정상 흑모일 때보다 백모에서 GDNF의 발현이 낮아지고 있음을 확인한 후, GNDF가 실제로 멜라닌 합성 (melanogensis)을 촉진시켜줄 수 있는지를 알아보았다. 우선 멜라닌 합성에 있어서 초기 단계에 중요하다고 알려진 MITF(Microphthalmia-associated transcription factor)와 관련하여 이 유전자의 활성을 상승시켜주는지를 알아보고, 또한 멜라닌 합성의 최종 생성물인 멜라닌의 생성량도 측정을 하였다.

[시험예 3] GDNF의 MITF 프로모터 활성 효과

MITF 프로모터가 포함된 melan-a 세포 시스템을 이용하여 GDNF에 대한 MITF 활성을 GLuc 분석을 이용하여 측정하였다. 그리고 이때 사용된 세포를 이용하여 멜라닌 양 또한 정량하였다.

구체적으로는 세포 배양 접시에서 소량의 배지를 따서 측정 플레이트로 옮긴 후, 이 배지에 1X GLuc assay working solution(NEB)을 4:1의 비율로 넣고 루미노미터를 이용해서 470nM에서 발생하는 빛의 양을 측정하였다. 24공 평판 플레이트를 이용하여 50000개의 세포를 깐 뒤에 GDNF(R&D system, cat no.212-GD)는 50 ng/ml, IBMX는 100uM을 처리한다. 이때 IBMX는 양성 대조군으로 사용되었다. 물질 처리 후 배양 24시간, 48시간에 GLuc 분석을 한다. 상기 분석 결과는 도 3a에 나타나 있다.

그리고 3일째에 물질이 들어간 새 배지로 배양액을 바꿔준 후, 5일째에 세포를 모은다. 여기에 1N NaOH를 첨가하여 세포를 녹인 후에 OD405 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 멜라닌의 양을 측정한다. 멜라닌 양 측정 결과는 도 3b에 나타나 있다.

도 3a 및 3b의 결과에서 알 수 있듯이, GDNF는 MITF 프로모터 활성을 약 60% 정도 증가시키고 멜라닌 생성량도 약 30 % 이상을 증가시킴으로써 GDNF가 멜라닌 합성을 촉진시키는 효과를 갖는다는 것을 보여준다.

[시험예 4] 정상 인체 멜라노사이트에서의 효과

GDNF가 인체 멜라노사이트에서 어떠한 효과를 나타내는지 알아보기 위해 정상 인체 멜라노사이트의 멜라닌 합성 효과를 살펴보았다. 이를 평가하기 위해 멜라닌 합성 과정에서 마지막 단계에서 중요한 역할을 하는 티로시나제 활성을 측정하였다. 이는 DOPA 염색을 이용하여 티로시나제 활성을 인시추(in situ)상에서 알아보는 방법으로 수행되었다. 6공 배지에 정상 인체 멜라노사이트를 100,000개 깔아주고, GDNF를 50ng/ml을 넣어준 후 5일 배양 한다. 이때 3일째 되는 날 새로운 배지로 한번 갈아준다. 5일째 세포를 PBS로 씻어준 후에 PMSF와 1.0% Triton X-100이 들어간 0.05M 소디움 인산 버퍼 (pH6.8)를 사용하여 소니케이션을 한다. 그리고 멜라노좀 멤브레인으로부터 티로시나제를 분리하기 위해서 4℃에서 30분간 놓아둔다. 그리고 나서 40000g 에서 20분간 원심분리를 한 후에 상등액만 수거하여 단백질을 획득한다. 단백질 10 ug 을 SDS 샘플 버퍼와 섞은 후 Tris-Glycine 젤을 이용하여 전기 영동을 한다. 전기 영동이 끝난 후 젤을 0.5M 소디움 인산 버퍼 (pH6.5)에서 15분 동안 인큐베이션한다. 그 후 0.2% L-DOPA가 포함된 0.1M 소디움 인산 버퍼 (pH6.8)에 젤을 넣어서 37℃ 에서 반응을 시킨다. 밴드가 나타나면 반응을 멈춘다. 그 결과는 도 4a에 나타내었다. 그리고 이를 정량화 하여 그래프로 도 4b에 나타내었다. 도 4에서 보여주듯이 GDNF는 티로시나제 활성 촉진 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일실시예에 따른 조성물은 다음과 같은 제조예로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

[제조예 1] 모발 샴푸

성분명	중량 %
라우릴황산나트륨액(30%)	20.0
야자유지방산디에탄올아미드	5.0
폴리쿼터늄-10	0.3
프로필렌글리콜	2.0
GDNF	0.01
피록톤올아민	0.5
황색203호	적량
파라옥시안식향산에스테르	0.2
조합향	적량
구연산	적량
정제수	잔량

[제조예 2] 모발 컨디셔닝

성분명	중량 %
염화세틸트리메틸암모늄(29%)	7.0
염화디스테아릴디메틸암모늄(75%)	4.0
세토스테아릴알콜	3.5
폴리옥시에틸렌스테아릴에테르	1.0
유동파라핀	2.0
프로필렌글리콜	1.5
GDNF	0.01
조합향	적량
구연산	적량
정제수	잔량

[제조예 3] 두피 헤어토닉

성분명	중량 %
멘톨	0.1
D-판테놀	0.6
살리실산	0.05
글리세린	1.0
폴리옥시에틸렌경화피마자유	0.8
초산토코페롤	0.03
조합향	적량
GDNF	0.02
에탄올	30.0
정제수	잔량

[제조예 4] 두피 에센스

성분명	중량 %
에탄올	30.0
폴리솔베이트 60	1.5
글리세린	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
GDNF	0.03
방부제	적당량
향료 및 색소	적당량
정제수	잔량

[제조예 5] 주사제

성분명	중량비 (1ml 당)
염화나트륨	9mg
소듐 카르복시메틸셀룰로오즈	30.0mg
Tween 20	1.0mg
GDNF	100ug
주사용 증류수	잔량

[제조예 6] 연고

성분명	중량 %
카프린/카프릴 트리글리세리드	10
액상파라핀	10
솔비탄세스퀴올리에이트	6
옥틸도데세스-25	9
세칠에칠헥사노에이트	10
스쿠알란	1
살리실산	1
글리세린	15
솔비톨	1
GDNF	0.03
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제조예 7] 로션

성분명	중량 %
GDNF	0.01
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소 및 향료	적량
정제수	잔량

[제조예 8] 스프레이

성분명	중량 %
GDNF	0.01
에탄올	80
Tween 80	5
글리세린	5
초산토코페롤	1
방부제, 색소 및 향료	적량
정제수	잔량

도 1은 백모와 흑모에서의 사이토카인(cytokine) 발현을 비교하기 위하여 사이토카인 어세이를 수행한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2는 흑모와 백모에서의 GDNF의 mRNA 발현을 비교하기 위하여 조직(2a) 및 멜라노사이트(2b)로부터 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행한 결과이다.

도 3은 MITF 프로모터가 포함된 melan-a 세포 시스템을 이용하여 GLuc 분석방법으로 측정한 GDNF에 대한 MITF 활성(3a), 및 세포로부터 정량된 멜라닌 양(3b)을 나타내는 그래프이다.

도 4는 인체 멜라노사이트에서 GDNF의 멜라닌 합성 효과를 확인하기 위하여 인시추(in situ)로 티로시나제 활성을 측정한 결과이다. 도 4a는 DOPA 염색이 된 젤을 나타내는 사진이고, 4b는 티로시나제 활성을 정량화한 그래프이다.

Claims (14)

1. 신경교세포주 유래 성장인자(Glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF) 를 유효성분으로 함유하는 백모 억제용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 마이크로프탈미아 연관 전사인자(microphthalmia-associated transcription factor, MITF)의 발현을 촉진함으로써 모발의 멜라닌 생성을 촉진하는 백모 억제용 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 두피 또는 모발에 도포하는 것인 백모 억제용 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 샴푸, 컨디셔닝, 토닉, 두피에센스, 로션, 연고, 스프레이 또는 국소 주사용제제의 제형을 가지는 백모 억제용 조성물.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 모발의 멜라닌 생성을 촉진함으로써 백모를 억제하는 백모 억제용 조성물.
7. 삭제
8. 삭제
9. 신경교세포주 유래 성장인자(Glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF) 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 모발의 멜라닌 생성 촉진용 키트.
10. 삭제
11. 제9항에 있어서, 상기 GDNF 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 주사, 경피 투여 또는 외용도포용 제형으로 이루어진 모발의 멜라닌 생성 촉진용 키트.
12. 시험 물질에 대하여 모발 멜라닌 생성 촉진 여부를 스크리닝하는 방법으로서,

    상기 시험 물질이 GDNF의 발현을 촉진하는지를 확인하는 단계를 포함하는 모발 멜라닌 생성 촉진제 스크리닝 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 발현 촉진 여부 확인은 ELISA 또는 웨스턴블럿(immuno blot) 방법으로 수행되는 모발 멜라닌 생성 촉진제 스크리닝 방법.
14. GDNF의 프로모터 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포에 트랜스펙션시키는 단계;

    상기 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및

    상기 시험 물질이 상기 리포터 유전자의 발현을 촉진하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 모발 멜라닌 생성 촉진제 스크리닝 방법.

Images