ES2607851T3 - Objetivos novedosos para la regulación de la angiogénesis - Google Patents

Objetivos novedosos para la regulación de la angiogénesis Download PDF

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ES2607851T3 ES09747001.7T ES09747001T ES2607851T3 ES 2607851 T3 ES2607851 T3 ES 2607851T3 ES 09747001 T ES09747001 T ES 09747001T ES 2607851 T3 ES2607851 T3 ES 2607851T3
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Cam Patterson
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Abstract

Uso de un inhibidor de la expresión y/o actividad de SFRP2 en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir cáncer o metástasis, o para tratar trastornos relacionados con angiogénesis excesiva o no deseada en un sujeto, en donde dicho inhibidor se enlaza o se direcciona a SFRP2 y es (i) un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o aptámero direccionado a SFRP2; o (ii) un oligonucleótido antisentido, oligonucleótido de triple hélice, ARN, miARN o ribozima direccionado a un ácido nucleico que codifica SFRP2.

Description

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DESCRIPCION
Objetivos novedosos para la regulacion de la angiogenesis Declaracion de apoyo federal
Esta invencion se hizo, en parte, con el apoyo gubernamental bajo los numeros de concesion P50-CA58223, 1 K08 CA098034-01A2 y CA009688 de los National Institutes of Health y W23RYX-3340-N609 del Departamento de Defensa. El gobierno de los Estados Unidos tiene derechos ciertos sobre esta invencion.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a la identificacion de polinucleotidos y polipeptidos que tienen una expresion aumentada en vasos sangumeos tumorales. La invencion se refiere ademas al uso de los polinucleotidos y polipeptidos identificados, e inhibidores de los polinucleotidos y polipeptidos, en la regulacion de la angiogenesis y el diagnostico y tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogenesis tales como el cancer.
Antecedentes de la invencion
La angiogenesis es el crecimiento de nuevos vasos capilares y es un componente cntico del crecimiento de tumores solidos (Folkman, N. Engl. J. Med. 285: 1182 (1971)). La terapia antiangiogenica dirigida para el cancer de mama metastasico con bevacizumab, un anticuerpo monoclonal para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), ha demostrado eficacia en pacientes con cancer de mama metastasico (Miller, E2100 Study. Scientific session on monoclonal antibody therapy in breast cancer. Ann. Mtg. Am. Soc. Clin. Oncol. ) y valido la metodologfa de la terapia antiangiogenica para esta enfermedad. Aunque el VEGF es un factor cntico de crecimiento implicado en la angiogenesis del cancer de mama (Schneider et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 4: 181 (2007)), una comprension mas detallada de la seleccion de genes que se expresan en vasos tumorales de mama puede facilitar el desarrollo de novedosos agentes antiangiogenicos direccionados molecularmente.
Varios estudios han establecido pruebas que sugieren que los vasos sangumeos que abastecen tumores expresan genes no compartidos por vasos sangumeos que residen en tejidos normales (Buckanovich et al., J. Clin., Oncol. 25: 852 (2007), Madden et al., Am. J. Pathol. 165: 601 (2004), Parker et al., Cancer Res. 64: 7857 (2004), St. Croix et al., Science 259: 1197 (2000)). St. Croix et al. utilizaron una metodologfa de disociacion tisular e inmunopurificacion celular para aislar celulas tumorales y endoteliales normales y luego compararon patrones de expresion genica de celulas endoteliales derivadas de un cancer colorrectal y mucosa colonica normal del mismo paciente (St. Croix et al., Science 259: 1197 (2000)). Usando el analisis en serie de la expresion genica, este analisis identifico 46 transcripciones, denominadas marcadores endoteliales tumorales (TEMs), que fueron significativamente sobrerreguladas en el tumor en comparacion con el endotelio normal. Utilizando un metodo similar, Parker et al., aislaron celulas endoteliales de dos tumores de mama humano y una mamoplastia de reduccion normal e identificaron genes que se expresaron diferencialmente en comparacion con el tejido mamario normal (Parker et al., Cancer Res. 64: 7857 (2004)). Este estudio identifico 30 genes vasculares del tumor de mama, de los cuales se confirmo que HEYL y PRL3 estaban localizados en el endotelio mediante hibridacion in situ. Estos estudios tambien han mostrado diferencias tumorales espedficas en marcadores endoteliales tumorales entre tumores de colon, mama y cerebro. Buckanovich et al. subsecuentemente utilizaron la microdiseccion por captura laser de celulas vasculares de cancer de ovario y ovarios normales y se identificaron 70 TEM expresados diferencialmente (Buckanovich y col., J. Clin Oncol. 25: 852 (2007)).
Los estudios de expresion genica que usan microarreglos de ADN han identificado varios subtipos distintos de cancer de mama (Perou et al., Nature 406: 747 (2000)) que diferencian los canceres de mama en grupos separados que difieren marcadamente en el pronostico (Sorlie et al., Proc. Natl Acad Sci. USA 98: 10869 (2001)). Los subtipos intnnsecos incluyen 2 subtipos principales de tumores negativos de receptores de estrogenos (ER): Subtipo basal (ER negativo y Her2/neu negativo) y subtipo Her2/neu (Her2/neu positivo y ER negativo); y un ER positivo (subtipo luminal). Dado que los TEM difieren entre los tipos de tumor, y que los canceres de mama son molecularmente heterogeneos, es conveniente determinar si los TEM difieren dentro de los diferentes subtipos moleculares de cancer de mama.
Mirotsou et al. PNAS 104 (5): 1643-1648 (2007) discute el potencial de SFRP2 en el manejo de la lesion aguda del miocardio y divulga anticuerpos para SFRP2.
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Deb et al. STEM CELLS 26 (1): 35-44 (2006) describe como SFRP2 inhibe la diferenciacion cardiomiogenica y que el silenciamiento de SFRP2 aumenta la diferenciacion cardiomiogenica.
En 2007, el inventor Klaber-DeMore planteo la hipotesis de que el uso de inhibidores de SFRP2 podna prevenir la angiogenesis y el crecimiento tumoral.
La presente invencion aborda inconvenientes previos en la tecnica y la hipotesis de 2007 de Klaber-Demore proveyendo novedosos objetivos de angiogenesis que pueden usarse para metodos diagnosticos y terapeuticos.
Resumen de la invencion
La presente invencion se basa, en parte, en la identificacion de polinucleotidos y polipeptidos que tienen una expresion incrementada en vasos sangumeos en tumores y el papel que desempenan en la angiogenesis. La invencion se basa ademas en el uso de estos polinucleotidos y polipeptidos, e inhibidores de los mismos, en la regulacion de la angiogenesis y en el diagnostico y tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogenesis.
La invencion segun se reivindica provee el uso de un inhibidor de la expresion y/o actividad de SFRP2 en la fabricacion de un medicamento para tratar o prevenir cancer o metastasis, o para tratar trastornos relacionados con angiogenesis excesiva o no deseada en un sujeto, en donde dicho inhibidor se une o se dirige a SFRP2 y es (i) un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o aptamero direccionado a SFRP2; o (ii) un oligonucleotido antisentido, oligonucleotido de triple helice, ARNsi, miARN o ribozima direccionados a un acido nucleico que codifica SFRP2.
La invencion tambien provee un metodo para identificar un compuesto que regula la angiogenesis o es util para la inhibicion del crecimiento o metastasis tumoral, que comprende determinar la expresion y/o actividad de SFRP2 en una muestra en presencia y ausencia de un compuesto de prueba y que selecciona un compuesto que incrementa o disminuye el nivel de expresion y/o actividad de SFRP2 con respecto al nivel en ausencia del compuesto, como un compuesto que regula la angiogenesis o es util para la inhibicion del crecimiento tumoral o metastasis.
La invencion provee todavfa ademas un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo que se une espedficamente al SFRP2 humano en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo reconoce espedficamente un epttopo seleccionado del grupo que consiste de aminoacidos
a. 202-220 (EITYINRDTKIILETKSKT-Cys (SEQ ID NO:6)), y
b. 270-295 (ITSVKRWQKGQREFKRISRSIRKLQC (SEQ ID NO:7)); y
en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo es para tratar o prevenir cancer o metastasis, o para tratar trastornos relacionados con angiogenesis excesiva o no deseada.
La invencion provee ademas un inhibidor de la expresion y/o actividad de SFRP2 para su uso en el tratamiento o prevencion de cancer o metastasis, o para tratar trastornos relacionados con la angiogenesis excesiva o no deseada en un sujeto, en donde dicho inhibidor se une o se dirige a SFRP2 y es (i) un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o aptamero dirigido a SFRP2; o (ii) un oligonucleotido antisentido, oligonucleotido de triple helice, ARNsi, miARN o ribozima dirigidos a un acido nucleico que codifica SFRP2.
Un aspecto de la divulgacion se refiere a metodos para inhibir la angiogenesis en una celula, que comprende disminuir la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en la celula.
En un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a metodos para inhibir la angiogenesis en un tejido de un sujeto, que comprende disminuir la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en el tejido del sujeto.
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a metodos para tratar trastornos relacionados con la angiogenesis excesiva o no deseada en un sujeto, que comprende disminuir la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en el sujeto.
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a metodos para tratar o prevenir el cancer en un sujeto, que comprende disminuir la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listyados en la Tabla 1 en el sujeto.
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La divulgacion se refiere ademas a metodos para tratar o prevenir metastasis en un sujeto, que comprende disminuir la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en el sujeto.
En un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a metodos para reducir la tumorigenicidad en un sujeto, que comprende disminuir la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en dicho sujeto.
En un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a metodos para inhibir la angiogenesis en un tejido de un sujeto, metodos para tratar trastornos relacionados con angiogenesis excesiva o no deseada en un sujeto, metodos para tratar o prevenir el cancer en un sujeto, metodos para tratar o prevenir metastasis en un sujeto, y/o metodos para reducir la tumorigenicidad en un sujeto, que comprende la administracion al sujeto de una calcineurina o inhibidor de NF-ATc, por ejemplo, tacrolimus.
En cada uno de estos aspectos, el sujeto puede ser diagnosticado con cancer, por ejemplo, cancer de mama. En ciertos aspectos, la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos se reduce disminuyendo el nivel de un acido nucleico que codifica el polipeptido (por ejemplo, con ARN antisentido, microARN o ARNsi), disminuyendo el nivel del propio polipeptido, o disminuyendo la actividad del polipeptido (por ejemplo, con un anticuerpo, aptamero o molecula pequena que inhibe espedficamente el propio polipeptido o una ruta de senalizacion corriente arriba o corriente abajo del polipeptido). En un aspecto, el uno o mas polipeptidos se selecciona del grupo que consiste de SFRP2, JAK3 y FAP o combinaciones de los mismos. En otra realizacion, uno o mas polipeptidos no incluyen SFRP2. En otro aspecto, el uno o mas polipeptidos no incluye JAK3. En otro aspecto, el uno o mas polipeptidos no incluye FAP.
Un aspecto adicional de la divulgacion se refiere a metodos para incrementar la angiogenesis en una celula, que comprende incrementar la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en la celula. En ciertos aspectos, la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 se incrementa suministrando un acido nucleico que codifica el polipeptido o el propio polipeptido a la celula.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a metodos para incrementar la angiogenesis en un tejido de un sujeto, que comprende incrementar la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en el tejido del sujeto. En ciertos aspectos, la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 se incrementa suministrando un acido nucleico que codifica el polipeptido o el propio polipeptido al sujeto.
La divulgacion se refiere ademas a metodos para diagnosticar cancer en un sujeto, que comprende obtener una muestra (por ejemplo, una muestra de tejido o celulas) del sujeto y determinar la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en la muestra, en donde un incremento en la expresion y/o actividad en relacion con el nivel de expresion y/o actividad en una muestra de control es indicativo de cancer. En un aspecto, se determina la expresion y/o actividad de al menos 2, 5, 10 o mas de los polipeptidos listados. En ciertos aspectos, la expresion puede determinarse determinando el nivel de acido nucleico que codifica el polipeptido o el propio polipeptido.
Un aspecto adicional de la divulgacion se refiere a metodos para determinar el potencial de angiogenesis de un cancer en un sujeto, que comprende obtener una muestra (por ejemplo, una muestra de tejido o celulas) del cancer del sujeto y determinar la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en la muestra, en donde un incremento en la expresion y/o actividad en relacion con el nivel de expresion y/o actividad en una muestra de control es indicativo de un aumento del potencial de angiogenesis del cancer.
La divulgacion tambien se refiere a metodos para determinar el potencial metastasico de un cancer en un sujeto, que comprende obtener una muestra (por ejemplo, una muestra de tejido o celulas) del cancer del sujeto y determinar la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 de la muestra, en donde un incrfemento de la expresion y/o actividad en relacion con el nivel de expresion y/o actividad en una muestra de control es indicativo de un potencial metastasico incrementado del cancer.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a metodos para monitorizar la efectividad de un tratamiento para cancer en un sujeto, que comprende obtener una muestra (por ejemplo, una muestra de tejido o celulas) de un sujeto que ha recibido tratamiento para cancer, determinar la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en la muestra, y qque comparan el nivel de expresion y/o actividad con el nivel de expresion y/o actividad en una muestra de control, en donde una disminucion en el nivel de expresion y/o actividad en la muestra con relacion a la muestra de control es indicativa de la efectividad del tratamiento.
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La divulgacion se refiere ademas a metodos para monitorizar la progresion del cancer en un sujeto, que comprende obtener una muestra (por ejemplo, una muestra de tejido o celulas) de un sujeto que tiene cancer, que dfeterminan la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listdos en Tabla 1 en la muestra, y que comparan el nivel de expresion y/o actividad con el nivel de expresion y/o actividad en una muestra de control, en donde un incremento en el nivel de expresion y/o actividad en la muestra con relacion a la muestra de control es indicativo de la progresion del cancer.
La divulgacion tambien se refiere a metodos para distinguir entre subtipos de cancer de mama, que comprende obtener una muestra de cancer de mama de un sujeto, que determinan la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en la muestra y que determinan el subtipo de cancer con base en el patron de expresion y/o actividad. En una realizacion, el metodo se utiliza para distinguir entre canceres de mama ER negativos y ER positivos. En otro aspecto, el metodo se utiliza para distinguir entre los subtipos basales, subtipos Her2 /neu y luminal.
La divulgacion se refiere ademas a metodos para distinguir entre canceres de mama in situ e invasivos, que comprende obtener una muestra de cancer de mama de un sujeto, que determinan la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en la muestra y que determinan el tipo de cancer con base en el patron de expresion y/o actividad.
Adicionalmente, la divulgacion se refiere a metodos para identificar un compuesto que regula la angiogenesis, que comprende determinar la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en un ensayo basado en celulas o un ensayo no basado en celulas en presencia y ausencia de un compuesto de prueba, y seleccionar un compuesto que incrementa o disminuye el nivel de expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos en relacion con el nivel en ausencia del compuesto, como un compuesto que regula la angiogenesis.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a metodos para identificar un compuesto util para la inhibicion del crecimiento o metastasis tumoral, que comprende determinar la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en un ensayo basado en celulas o en un ensayo no basado en celulas, en presencia y ausencia de un compuesto de prueba, y seleccionar un compuesto que incrementa o disminuye el nivel de expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos con respecto al nivel en ausencia del compuesto, como un compuesto util para Inhibicion del crecimiento tumoral o metastasis.
La divulgacion tambien se refiere a arreglos de acidos nucleicos (por ejemplo, oligonucleotidos) o polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) que comprenden acidos nucleicos que codifican al menos dos polipeptidos listados en la Tabla 1, por ejemplo, al menos 5, 10, 15, 20 o mas polipeptidos.
La divulgacion se refiere ademas a moleculas que incrementan o disminuyen la expresion y/o la actividad de un polipeptido listado en la Tabla 1 o un acido nucleico que codifica el polipeptido. Las moleculas pueden ser, por ejemplo, ARN antisentido, ARNsi, aptameros, anticuerpos, moleculas pequenas y similares. En un aspecto, la divulgacion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden las moleculas.
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a kits para establecer la angiogenesis, que comprenden un reactivo para determinar la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1.
En un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a kits para diagnosticar cancer, que comprenden un reactivo para determinar la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1.
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a kits para determinar el potencial metastasico de un cancer, que comprende un reactivo para determinar la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1.
Estos y otros aspectos de la divulgacion se exponen con mas detalle en la descripcion de la invencion a continuacion.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra la microdiseccion por captura laser de celulas vasculares mamarias humanas antes y despues de la microdiseccion (400x).
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La figura 2 muestra analisis de integridad de ARN. Los cebadores de RT-PCR para genes de niveles bajos y altos de abundancia se usaron en ADNc de "Montaje entero", que se refiere a una seccion congelada de todo el tumor antes de la microdiseccion, y "LCM", que se refiere a la muestra de vasos microdiseccionados de una seccion congelada de un tumor de mama humano. Lmea 1, escalera de ADN; Lmea 2, extremo 3' del gen del factor I de ribosilacion de ADP expresado inferior (ARF F1) del "montaje completo" (239 pb); Lmea 3, extremo 5' de ARF F1 desde el "Montaje entero" (336 pb); Lmea 4, extremo 3' del gen cuidador GAPDH del "Montaje entero" (540 pb); Lmea 5, extremo 5' de GAPDH del "montaje completo" (887 pb); Lmea 6, extremo 3' de ARF F1 de las celulas del vaso microdiseccionadas; Lmea 7, extremo 5' de ARF F1 a partir de las celulas del vaso microdiseccionadas; Lmea 8, extremo 3' de GAPDH de las celulas del vaso microdiseccionadas; Lmea 9, extremo 5' de GAPDH de las celulas del vaso microdiseccionadas.
La figura 3 muestra el analisis de la expresion genica que confirma la identidad vascular. Los arreglos para celulas de vasos LCM, lmeas celulares endoteliales y lmeas celulares derivadas de tumores de mama se ordenaron de izquierda a derecha. Los arreglos de celulas endoteliales cultivadas in vitro se marcan: celula endotelial dermalmicrovascular, celula endotelial de la vena umbilical, celulas endoteliales de la vena umbilical, celula del musculo liso aortico. Los arreglos de lmeas celulares derivadas de tumores de mama in vitro se marcan: T47D-1, T47D-2, MCF7, MDA-MB-365, MDA-MB-453, HCC1937-1, HCC1937-2. Los datos para diferentes conjuntos de genes fueron identificados y agrupados dentro de cada categona relevante, que estan en orden descendente: A) genes endoteliales, B) TEMs, C) genes hematopoyeticos, D) genes pericfticos y E) genes epiteliales.
La figura 4 muestra la confirmacion del origen vascular de los genes marcadores vasculares. Las imagenes se tomaron con una ampliacion de 600x.
Las figuras 5A-5D muestran la expresion diferencial de protemas de genes vasculares entre vasos de tumor de mama y vasos de mama normales.
La figura 6 muestra que SFRP2 induce angiogenesis en la membrana corioalantoide.
La figura 7 muestra que SFRP2 incrementa la migracion de celulas endoteliales en un ensayo de rayado de heridas.
La figura 8 muestra que SFRP2 induce formacion de tubo endotelial a las 8 horas de una manera dependiente de la concentracion.
La figura 9 muestra que SFRP2 induce la angiogenesis en el ensayo de tapon de Matrigel de raton.
La figura 10 muestra que SFRP2 inhibe la apoptosis inducida por hipoxia en celulas MEC.
La figura 11 muestra el perfil de expresion genica de celulas endoteliales tratadas con y sin SFRP2.
La figura 12 muestra el analisis de transferencia Western para la expresion nuclear y citoplasmica de p-catenina en celulas endoteliales de raton tratadas con SFRP2.
La figura 13 muestra analisis de transferencia Western de fracciones nucleares de celulas MEC tratadas con y sin SFRP2 (700 pM) durante 1 hora.
La figura 14 muestra que el tacrolimus inhibe la formacion de tubo de celulas endoteliales de raton inducida por SFRP2 in vitro.
La figura 15 muestra que el tacrolimus invierte la formacion de tubos de celulas endoteliales de raton inducida por SFRP2 in vitro.
La figura 16 muestra que SFRP2 se incrementa en la lmea celular de angiosarcoma SVR en comparacion con las celulas endoteliales de raton de control.
Las figuras. 17A - 17D muestran A) SFRP2 induce formacion de tubos en celulas MEC; B) el tacrolimus inhibe la formacion de tubos en celulas MEC inducidas por SFRP2; C) tacrolimus inhibe la formacion de tubos en celulas de angiosarcoma de SVR; y D) la formacion de tubo SVR es inhibida por un anticuerpo policlonal a SFRP2.
La figura 18 muestra que el tacrolimus inhibe la formacion de tubos de celulas endoteliales de raton inducida por SFRP2 en celulas 2H11 in vitro.
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La figura 19 muestra que el tacrolimus inhibe la formacion de tubos de celulas endoteliales de raton inducida por VEGF en celulas 2H11 in vitro.
Las figuras. 20A - 20B muestran que un anticuerpo policlonal contra SFRP2 inhibe la formacion de tubo SVR in vitro. La figura 21 muestra que un RNAsi a SFRP2 inhibe la formacion de tubo SVR in vitro.
La figura 22 muestra la actividad inhibidora de anticuerpos policlonales elevados contra diferentes epftopos de SFRP2. Se utilizaron sueros de ratones inmunizados contra secuencias pepffdicas de SFRP2 (AbA, AbB, AbC, AbD, AbE) y sueros de control a una dilucion de 1:100. Los anticuerpos para el peptido AbA, AbB, AbC y AbD todos inhibieron la formacion de tubos, sin embargo AbB y AbC teman la mayor inhibicion. N = 4 para todos los grupos.
Las figuras. 23A-23C muestran que los anticuerpos monoclonales elevados contra SFRP2 inhiben la formacion de tubos. A) Pozo de control representativo. B) Celulas de angiosarcoma tratadas con sobrenadante de un hibridoma que secreta anticuerpos que muestra inhibicion de formacion de tubo. C) Puntos de ramificacion de celulas de angiosarcoma de control en comparacion con los sobrenadantes de los 8 hibridomas seleccionados para subclonacion adicional.
La figura 24 muestra que SFRP2 esta sobreexpresado en suero de pacientes con cancer. Las lmeas C1-C3 son controles y las lmeas P1-P6 son muestras de suero de pacientes con cancer de mama (P <0,0001).
La figura 25 muestra que la protema SFRP2 esta presente en el endotelio en una amplia variedad de tipos de tumores por inmunohistoqmmica. Las secciones embebidas en parafina de tumores humanos se tineron con un anticuerpo para SFRP2. Las imagenes se toman con una ampliacion de 600 X.
La figura 26 muestra que tacrolimus inhibe el crecimiento de xenoinjertos de angiosarcoma de SVR en ratones lampinos. La imagen muestra un tumor de raton de control representativo y un tumor de raton tratado con tacrolimus representativo el dfa 19 del tratamiento.
La figura 27 muestra que el tacrolimus inhibe la tasa de crecimiento de los tumores de raton transgenicos MMTV-neu (n = 12 tratados con tacrolimus, n = 9 sin tratamiento, p = 0,04).
La figura 28 muestra la capacidad de Jak3 para promover la angiogenesis in vivo utilizando un ensayo de membrana corioalantoide de pollo (CAM). Las graficas muestran un analisis cuantitativo de los vasos que rodean el control versus a los discos tratados con Jak3. Las fotograffas ilustran la angiogenesis en vasos que rodean los discos tratados con Jak3 versus los discos de control.
La figura 29 muestra las propiedades de migracion de Jak3 en HCAEC usando un ensayo de herida por rayado. La grafica muestra el analisis cuantitativo de la tasa de cierre de heridas en todos los pozos. Las fotograffas ilustran el cierre relativo de la herida del control versus las celulas tratadas con Jak3 a las 28 horas.
La figura 30 muestra las propiedades de formacion de tubos de Jak3 en HCAEC usando un ensayo de formacion de tubos de celulas endoteliales. La grafica muestra el analisis cuantitativo del numero de puntos de ramificacion en todos los pozos. Las fotograffas ilustran la formacion relativa de tubos en el control versus las celulas tratadas con Jak3.
La figura 31 muestra el efecto de Jak3 sobre la apoptosis inducida por hipoxia en HCAEC.
La figura 32 muestra la proliferacion de HCAEC en presencia de Jak3.
La figura 33 muestra el papel de la activacion de STAT3 en la formacion de tubos mediada por Jak3 usando un pequeno inhibidor pepffdico de STAT3 fosforilado (P-STAT3). La grafica muestra el analisis cuantitativo del numero de puntos de ramificacion en todos los pozos. Las fotograffas ilustran la formacion relativa de tubos en celulas tratadas con Jak3 versus celulas tratadas con Jak3 + inhibidor P-STAT3.
Descripcion detallada de la invencion
La presente divulgacion se describira ahora con mas detalle con referencia a los dibujos adjuntos.
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A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientificos usados aqm tienen el mismo significado que comunmente entiende un experto en la tecnica al que pertenece esta invencion.
Las secuencias de nucleotidos se presentan aqm por solamente una sola hebra, en la direccion 5' a 3', de izquierda a derecha, a menos que se indique espedficamente otra cosa. Los nucleotidos y aminoacidos se representan aqm de la manera recomendada por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission, o (para aminoacidos) por el codigo de una letra, o el codigo de tres letras, ambos de acuerdo con 37 C.F.R. § 1.822 y uso establecido.
Excepto que se indique otra cosa, los metodos estandar conocidos por los expertos en la tecnica pueden usarse para clonar genes, amplificar y detectar acidos nucleicos, y similares. Tales tecnicas son conocidas por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989); Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., Nueva York).
I. Definiciones
Como se usa en la descripcion de la invencion y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el, ella" pretenden incluir tambien las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa.
Tambien, tal como se usa aqm, "y/o" se refiere a y abarca todas y cada una de las combinaciones posibles de uno o mas de los items listados asociados, asf como la falta de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa ("o").
El termino "consiste esencialmente de" (y variantes gramaticales), tal como se aplica a una secuencia de polinucleotidos o polipeptidos de esta invencion, significa un polinucleotido o polipeptido que consiste tanto de la secuencia citada (por ejemplo, SEQ ID NO) como de un total de diez o menos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) nucleotidos o aminoacidos adicionales en los extremos 5' y/o 3' o terminal N y/o terminal C de la secuencia citada de tal manera que la funcion del polinucleotido o polipeptido no se altera materialmente. El total de diez o menos nucleotidos o aminoacidos adicionales incluye el numero total de nucleotidos o aminoacidos adicionales en ambos extremos anadidos entre sf. El termino "alterado materialmente", tal como se aplica a polinucleotidos de la invencion, se refiere a un incremento o disminucion en la capacidad para expresar el polipeptido codificado de al menos aproximadamente 50% o mas en comparacion con el nivel de expresion de un polinucleotido que consiste de la secuencia citada.
El termino "regular", "regula" o "regulacion" se refiere a la mejora (por ejemplo, un incremento) o inhibicion (por ejemplo, una disminucion) en el nivel o actividad especificada.
El termino "mejorar" o "incrementar" se refiere a un incremento en el parametro especificado de al menos aproximadamente 1,25 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 8 veces, 10 veces, doce veces o incluso quince veces.
El termino "inhibir" o "reducir'' o variaciones gramaticales del mismo tal como se usa aqm se refiere a una reduccion o disminucion en el nivel o actividad especificada de al menos aproximadamente 15%, 25%, 35%, 40%, 50%, 60% 75%, 80%, 90%, 95% o mas. En realizaciones particulares, la inhibicion o reduccion da como resultado una actividad pequena o esencialmente no detectable (como maximo, una cantidad insignificante, por ejemplo, menos de aproximadamente 10% o incluso 5%).
Una cantidad "terapeuticamente efectiva" tal como se utiliza aqm es una cantidad que provee alguna mejora o beneficio para el sujeto. Alternativamente indicado, una cantidad "terapeuticamente efectiva" es una cantidad que proveera algun alivio, mitigacion o disminucion en al menos un smtoma clmico en el sujeto (por ejemplo, en el caso de cancer, reduccion de la carga tumoral, prevencion de crecimiento tumoral adicional, prevencion de metastasis, o incremento del tiempo de supervivencia). Los expertos en la tecnica apreciaran que los efectos terapeuticos no necesitan ser completos o curativos, siempre que se proporcione algun beneficio al sujeto.
Por los terminos "trato", "tratar" o "tratamiento", se pretende que la gravedad de la condicion del sujeto sea reducida o al menos parcialmente mejorada o modificada y que se consiga algun alivio, mitigacion o disminucion en al menos un smtoma clmico.
La palabra "tumorigenicidad" se refiere principalmente al estatus tumoral de una celula o celulas (por ejemplo, el gradfo de la transformacion neoplasica de una celula, la malignidad de una celula, la propension de una celula para
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formar un tumor y/o tener caractensticas de un tumor o simplemente la presencia o ausencia de celulas tumorales en un paciente o tejido/organo), que es un reflejo de un cambio de una celula o poblacion de celulas de un estado normal a maligno. La tumorigenicidad indica que las celulas tumorales estan presentes en una muestra, y/o que la transformacion de celulas de celulas normales a tumorales esta en progreso, como puede ser confirmado por cualquier estandar de medicion del desarrollo tumoral. El cambio involucra tipicamente proliferacion celular a una tasa que es mas rapida que el crecimiento observado para las celulas normales bajo las mismas condiciones y que se caracteriza tipicamente por uno o mas de los siguientes rasgos: crecimiento continuo incluso despues de que el factor instigante (por ejemplo, carcinogeno, virus) ya no esta presente; una carencia de organizacion estructural y/o coordinacion con tejido normal y, tipicamente, una formacion de una masa de tejido o tumor. Por lo tanto, un tumor se describe mas generalmente como una proliferacion de celulas (por ejemplo, una neoplasia, un crecimiento, un polipo) resultante del crecimiento neoplasico y es mas tipicamente un tumor maligno. En el caso de una transformacion neoplasica, una neoplasia es maligna o esta predispuesta a ser maligna. Los tumores malignos se caracterizan tfpicamente por ser anaplasicos (crecimiento celular primitivo caracterizado por una carencia de diferenciacion), invasivos (se desplaza hacia y destruye los tejidos circundantes) y/o metastasicos (se dispersan a otras partes del cuerpo).
La expresion "trastorno relacionado con la angiogenesis excesiva o no deseada", como se usa aqrn, se refiere a cualquier enfermedad, trastorno o condicion en la que ocurre la angiogenesis no deseada. Ejemplos de tales trastornos incluyen, sin limitacion, cancer, enfermedades infecciosas, trastornos autoinmunes, malformaciones vasculares, smdrome de DiGeorge, HHT, hemangioma cavernoso, aterosclerosis, arteriopatfa de trasplante, obesidad, psoriasis, verrugas, dermatitis alergica, queloides de cicatriz, granulomas piogenicos, enfermedad de formacion de ampollas, sarcoma de Kaposi, smdrome vftreo hiperplasico persistente, retinopatfa diabetica, retinopatfa del prematuro, degeneracion macular, neovascularizacion coroidea, hipertension pulmonar primaria, asma, polipos nasales, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad periodontal, ascitis, adherencias peritoneales, endometriosis, sangrado uterino, quistes ovaricos, hiperestimulacion ovarica, embarazo ectopico, artritis, sinovitis, osteomielitis y/o formacion de osteofitos.
El termino “cancer”, tal como se utiliza aqrn, se refiere a cualquier crecimiento anormal de celulas, benigno o maligno. Ejemplos incluyen, sin limitacion, cancer de mama, cancer de prostata, linfoma, cancer de piel, cancer de pancreas, cancer de colon, melanoma, melanoma maligno, cancer de ovario, cancer de cerebro, carcinoma de cerebro primario, cancer de cabeza-cuello, glioma, glioblastoma, cancer de vejiga, cancer de pulmon de celulas no pequenas, carcinoma de cabeza o cuello, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon de celulas pequenas, tumor de Wilms, carcinoma cervical, carcinoma testicular, carcinoma de vejiga, carcinoma de pancreas, carcinoma de estomago, carcinoma de colon, carcinoma de prostata, carcinoma prostatico, carcinoma genitourinario, carcinoma de tiroides, carcinoma esofagico, mieloma, mieloma multiple, carcinoma adrenal, carcinoma de celulas renales, carcinoma endometrial, carcinoma de la corteza suprarrenal, insulinoma pancreatico maligno, carcinoma carcinoide maligno, coriocarcinoma, micosis fungoides, hipercalcemia maligna, hiperplasia cervical, leucemia, leucemia linfocftica aguda, leucemia linfocftica cronica, leucemia mielogena aguda, leucemia mielogena cronica, leucemia granulocftica cronica, leucemia granulocftica aguda, leucemia de celulas pilosas, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de Kaposi, policitemia vera, trombocitosis esencial, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, sarcoma de tejidos suaves, sarcoma osteogenico, macroglobulinemia primaria y retinoblastoma. En algunas realizaciones, el cancer se selecciona del grupo de canceres que forman tumores.
El termino "cancer de mama", como se usa aqrn, se refiere a un cancer que comienza en las celulas de la mama de un sujeto. El termino incluye canceres invasivos e in situ, y abarca todos los subtipos de cancer de mama, incluyendo el subtipo basal (ER negativo y Her2/neu negativo), suptipo Her2/neu (Her2/neu positivo y ER negativo); y subtipo luminal (ER positivo).
El termino "muestra de control", tal como se utiliza aqrn, se refiere a una muestra de tejido o celula que se utiliza para comparar el nivel de expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 con el nivel de expresion y/o actividad en una muestra de interes. La muestra de control puede ser, por ejemplo, de una porcion normal (es decir, no enferma) del mismo tipo de tejido o celula en el sujeto, de un tipo de tejido o celula diferente en el sujeto, de un individuo emparejado o puede ser un estandar derivado del promedio de mediciones tomadas de una poblacion de sujetos. En otra realizacion, la muestra de control puede ser del tejido de la enfermedad del sujeto, por ejemplo, en el momento del diagnostico, antes del tratamiento, o despues de una etapa de tratamiento.
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Como se usa aqm, se usan indistintamente "acido nucleico", "secuencia nucleotfdica" y "polinucleotido" y abarcan tanto ARN como ADN, incluyendo ADNc, ADN genomico, ARNm, ADN o ARN sintetico (por ejemplo, sintetizado qmmicamente) y quimeras de ARN Y ADN. El termino polinucleotido, secuencia de nucleotidos o acido nucleico se refiere a una cadena de nucleotidos sin tener en cuenta la longitud de la cadena. El acido nucleico puede ser de cadena doble o monocatenario. Cuando es monocatenario, el acido nucleico puede ser una cadena en sentido o una cadena antisentido. El acido nucleico se puede sintetizar usando analogos o derivados de oligonucleotidos (por ejemplo, nucleosidos de inosina o fosforotioato). Tales oligonucleotidos pueden usarse, por ejemplo, para preparar acidos nucleicos que tienen capacidades de apareamiento de bases alteradas o resistencia incrementada a nucleasas. La presente invencion provee ademas un acido nucleico que es el complemento (que puede ser un complemento completo o un complemento parcial) de un acido nucleico, secuencia de nucleotidos o polinucleotidos de esta invencion.
Un "polinucleotido aislado" es una secuencia de nucleotidos (por ejemplo, ADN o ARN) que no es inmediatamente contigua con secuencias de nucleotidos con las que es inmediatamente contigua (una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma de orgen natural del organismo del cual se deriva. Por tanto, en una realizacion, un acido nucleico aislado incluye algunas o todas las secuencias 5' no codificantes (por ejemplo, promotoras) que son inmediatamente contiguas a una secuencia codificante. Por lo tanto, el termino incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plasmido o virus de replicacion autonoma, o en el ADN genomico de un procariota o eucariota, o que existe como una molecula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genomico producido por PCR o tratamiento de endonucleasa de restriccion), independientemente de otras secuencias. Tambien incluye un ADN recombinante que es parte de un acido nucleico hnbrido que codifica un polipeptido o secuencia peptfdica adicional. Un polinucleotido aislado que incluye un gen no es un fragmento de un cromosoma que incluye tal gen, sino que mas bien incluye la region codificadora y regiones reguladoras asociadas con el gen, pero no se encuentran naturalmente genes adicionales en el cromosoma.
El termino “aislado” puede referirse a un acido nucleico, secuencia de nucleotidos o polipeptido que es sustancialmente libre de material celular, material viral y/o medio de cultivo (cuando se produce mediante tecnicas de ADN recombinante), o precursores qrnmicos u otros productos qrnmicos (cuando es sintetizado qmmicamente). Por otra parte, un "fragmento aislado" es un fragmento de un acido nucleico, secuencia de nucleotidos o polipeptidos que no se produce naturalmente como un fragmento y no se encontrana en el estado natural. "Aislado" no significa que la preparacion sea tecnicamente pura (homogenea), pero es suficientemente pura para proveer el polipeptido o acido nucleico en una forma en la que pueda usarse para el proposito previsto.
Una celula aislada se refiere a una celula que esta separada de otros componentes con los que esta normalmente asociada en su estado natural. Por ejemplo, una celula aislada puede ser una celula en medio de cultivo y/o una celula en un vehnculo farmaceuticamente aceptable de esta invencion. Asf, una celula aislada puede ser suministrada a y/o introducida en un sujeto. En algunas realizaciones, una celula aislada puede ser una celula que se elimina de un sujeto y se manipula como se describe aqm ex vivo y luego se devuelve al sujeto.
El termino "fragmento", tal como se aplica a un polinucleotido, se entendera que significa una secuencia de nucleotidos de longitud reducida con respecto a una secuencia de acidos nucleicos o nucleotidos o nucleotidos de referencia y que comprende, que consiste esencialmente de, y/o que consiste de una secuencia de nucleotidos de nucleotidos contiguos Identicos o casi identicos (por ejemplo, 90%, 92%, 95%, 98%, 99% identicos) a la secuencia de nucleotidos o acido nucleico de referencia. Tal fragmento de acido nucleico de acuerdo con la invencion puede ser, cuando sea apropiado, incluido en un polinucleotido mayor del que es un constituyente. En algunas realizaciones, tales fragmentos pueden comprender, consisten esencialmente de, y/o consisten de oligonucleotidos que tienen una longitud de al menos aproximadamente 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, o mas nucleotidos consecutivos de una secuencia de acido nucleico o nucleotido de acuerdo con la invencion.
El termino "fragmento", tal como se aplica a un polipeptido, se entendera que significa una secuencia de aminoacidos de longitud reducida con respecto a un polipeptido de referencia o una secuencia de aminoacidos y que comprende, que consiste esencialmente de, y/o que consiste de una secuencia de aminoacidos de aminoacidos contiguos identicos o casi identicos (por ejemplo, 90%, 92%, 95%, 98%, 99% identicos) al polipeptido de referencia o secuencia de aminoacidos. Tal fragmento de polipeptido de acuerdo con la invencion puede ser, cuando sea apropiado, incluido en un polipeptido mayor del cual es un constituyente. En algunas realizaciones, tales fragmentos pueden comprender, consisten esencialmente de, y/o consisten de peptidos que tienen una longitud de al menos aproximadamente 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, o mas aminoacidos consecutivos de un polipeptido o secuencia de aminoacidos de acuerdo con la invencion.
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Un "vector" es cualquier molecula de acido nucleico para la clonacion y/o transferencia de un acido nucleico en una celula. Un vector puede ser un replicon al que se puede unir otra secuencia de nucleotidos para permitir la replicacion de la secuencia de nucleotidos unida. Un "replicon" puede ser cualquier elemento genetico (por ejemplo, plasmido, fago, cosmido, cromosoma, genoma viral) que funciona como una unidad autonoma de replicacion de acido nucleico in vivo, es decir, capaz de replicarse bajo su propio control. El termino "vector" incluye moleculas de acido nucleico virales y no virales (por ejemplo, plasmido) para introducir un acido nucleico en una celula in vitro, ex vivo y/o in vivo. Se puede utilizar un gran numero de vectores conocidos en la tecnica para manipular acidos nucleicos, incorporar elementos de respuesta y promotores en genes, etc. Por ejemplo, puede realizarse la insercion de los fragmentos de acido nucleico correspondientes a elementos de respuesta y promotores en un vector adecuado ligando los fragmentos de acido nucleico apropiados en un vector elegido que tenga terminales cohesivos complementarios. Alternativamente, los extremos de las moleculas de acido nucleico pueden ser modificados enzimaticamente o cualquier sitio puede ser producido ligando secuencias de nucleotidos (enlazantes) a los terminales de acido nucleico. Tales vectores pueden ser modificados geneticamente para que contengan secuencias que codifiquen marcadores seleccionables que proveen la seleccion de celulas que contienen el vector y/o han incorporado el acido nucleico del vector en el genoma celular. Tales marcadores permiten la identificacion y/o seleccion de celulas huesped que incorporan y expresan las protemas codificadas por el marcador. Un vector "recombinante" se refiere a un vector viral o no viral que comprende una o mas secuencias de nucleotidos heterologos (es decir, transgenes), por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco o mas secuencias de nucleotidos heterologos.
Los vectores virales se han usado en una amplia variedad de aplicaciones de suministro genico en celulas, asf como en sujetos animales vivos. Los vectores vmcos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, lentivirus, virus adeno-asociados, poxvirus, alfavirus, baculovirus, virus de la vacuna, virus del herpes, virus de Epstein-Barr y vectores de adenovirus. Los vectores no vmcos incluyen plasmidos, liposomas, lfpidos cargados electricamente (citofectinas), complejos acido nucleico-protema y biopolfmeros. Ademas de un acido nucleico de interes, un vector puede comprender tambien una o mas regiones reguladoras y/o marcadores seleccionables utiles para seleccionar, medir y monitorizar los resultados de transferencia de acidos nucleicos (suminisro a tejidos espedficos, duracion de la expresion, etc.).
Los vectores pueden introducirse en las celulas deseadas por metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo transfeccion, electroporacion, microinyeccion, transduccion, fusion celular, DEAE dextrano, precipitacion con fosfato de calcio, lipofeccion (fusion de lisosoma), uso de una pistola genetica o un transportador de vectores de acidos nucleicos (vease, por ejemplo, Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963 (1992), Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621 (1988) y Hartmut et al. Solicitud de Patente Canadiense No. 2,012,311, presentada el 15 de Marzo de 1990).
En algunos aspectos, un polinucleotido de esta divulgacion puede ser suministrado a una celula in vivo por lipofeccion. Los lfpidos cationicos sinteticos disenados para limitar las dificultades y los peligros encontrados con la transfeccion mediada por liposomas pueden usarse para preparar liposomas para la transfeccion in vivo de una secuencia de nucleotidos de esta divulgacion (Feigner et al., Proc. Nat. Acad Sci. USA 84: 7413 (1987), Mackey et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 8027 (1988) y Ulmer et al., Science 259: 1745 (1993)). El uso de lfpidos cationicos puede promover la encapsulacion de acidos nucleicos cargados negativamente y tambien promover la fusion con membranas celulares cargadas negativamente (Felgner et al., Science 337: 387 (1989)). Compuestos lipfdicos particularmente utiles y composiciones para la transferencia de acidos nucleicos se describen en las Publicaciones de Patentes Internacionales WO95/18863 y WO96/17823, y en la Patente de Estados Unidos No. 5,459,127. El uso de la lipofeccion para introducir secuencias de nucleotidos exogenas en organos espedficos in vivo tiene ciertas ventajas practicas. El direccionamiento molecular de liposomas a celulas espedficas representa un area de beneficio. Es claro que dirigir la transfeccion a tipos celulares particulares sena particularmente preferido en un tejido con heterogeneidad celular, tal como pancreas, hngado, rinon y cerebro. Los lfpidos pueden estar acoplados qmmicamente a otras moleculas con el fin de direccionar (Mackey, et al., 1988, supra). Los peptidos direccionados, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores, y protemas tales como anticuerpos, o moleculas no pepticas pueden acoplarse qmmicamente a los liposomas.
En diversos aspectos, pueden usarse otras moleculas para facilitar el suministo de un acido nucleico in vivo, tal como un oligopeptido cationico (por ejemplo, WO95/21931), peptidos derivados de protemas de enlazamiento a acidos nucleicos (por ejemplo, WO96/25508), y/o un polfmero cationico (por ejemplo, WO95/21931).
Tambien es posible introducir un vector in vivo como acido nucleico lampino (veanse las patentes de los Estados Unidos numeros 5,693,622, 5,589,466 y 5,580,859). Tambien pueden usarse enfoques de suministro de acido
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nucleico mediados por receptores (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147 (1992), Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429 (1987)).
El termino transfeccion o transduccion significa la captacion de acido nucleico exogeno o heterologo (ARN y/o ADN) por una celula. Una celula ha sido "transfectada" o "transducida" con un acido nucleico exogeno o heterologo cuando tal acido nucleico ha sido introducido o suministrado dentro de la celula. Una celula ha sido "transformada" por acido nucleico exogeno o heterologo cuando el acido nucleico transfectado o transducido imparte un cambio fenotipico en la celula y/o un cambio en una actividad o funcion de la celula. El acido nucleico transformante puede integrarse (enlazado covalentemente) al ADN cromosomico que constituye el genoma de la celula o puede estar presente como un plasmido estable.
Como se usa aqrn, los terminos "protema" y "polipeptido" se usan indistintamente y abarcan tanto peptidos como protemas, a menos que se indique otra cosa.
Una "protema de fusion" es un polipeptido producido cuando dos secuencias nucleotfdicas heterologas o sus fragmentos que codifican dos (o mas) polipeptidos diferentes no encontrados fusionados juntos en la naturaleza se fusionan juntos en el marco de lectura de traduccion correcto. Los polipeptidos de fusion ilustrativos incluyen fusiones de un polipeptido de la invencion (o un fragmento del mismo) a toda o una parte de glutation-S-transferasa, protema de enlazamiento a maltosa, o una protema informadfora (por ejemplo, Protema Fluorescente Verde, p- glucuronidase, B-galactosidasa, luciferasa, etc.), hemaglutinina, c-myc, epttopo FLAG, etc.
Como se usa aqrn, un polipeptido "funcional" o "fragmento funcional" es aquel que sustancialmente retiene al menos una actividad biologica normalmente asociada con ese polipeptido (por ejemplo, actividad angiogenica, enlazante a protema, enlazamiento de ligando o receptor). En realizaciones particulares, el polipeptido "funcional" o "fragmento funcional" retiene sustancialmente todas las actividades posefdas por el peptido no modificado. Por "sustancialmente retiene" actividad biologica, se entiende que el polipeptido retiene al menos aproximadamente el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% , 99% o mas de la actividad biologica del polipeptido nativo (e incluso puede tener un nivel de actividad mas alto que el polipeptido nativo). Un polipeptido "no funcional" es aquel que presenta poca o esencialmente ninguna actividad biologica detectable normalmente asociada con el polipeptido (por ejemplo, como maximo, solo una cantidad insignificante, por ejemplo, menos de aproximadamente 10% o incluso 5%). Las actividades biologicas tales como el enlazamiento a protemas y la actividad angiogenica se pueden medir usando ensayos que son bien conocidos en la tecnica y como se describen aqrn.
Por el termino "expresar" o "expresion" de una secuencia codificadora de polinucleotido, se entiende que la
secuencia se transcribe y, opcionalmente, se traduce. Tfpicamente, de acuerdo con la presente invencion, la expresion de una secuencia codificante de la invencion dara como resultado la produccion del polipeptido de la
invencion. El polipeptido o fragmento completo expresado tambien puede funcionar en celulas intactas sin
purificacion.
El termino "aproximadamente", tal como se utiliza aqrn cuando se hace referencia a un valor medible, tal como una cantidad de polipeptido, dosis, tiempo, temperatura, actividad enzimatica u otra actividad biologica y similares, pretende abarcar variaciones de ± 20%, ± 10 %, ± 5%, ± 1%, ± 0,5%, o incluso ± 0,1% de la cantidad especificada.
II. Polinucleotidos y polipeptidos no regulados en celulas tumorales de vasos sangumeos
Los inventores han identificado y caracterizado polipeptidos, y polinucleotidos que codifican los polipeptidos, que estan significativamente sobrerregulados en celulas de vasos sangumeos tumorales en comparacion con vasos sangumeos no tumorales. La Tabla 1 lista 55 polinucleotidos que estan sobrerregulados al menos cuatro veces en celulas asociadas con vasos sangumeos de tumor de mama. Cada uno de estos polinucleotidos y polipeptidos sobrerregulados representa un objetivo util para el estudio de la angiogenesis, formacion de tumores, crecimiento y metastasis. Ademas, estos objetivos son utiles para el diagnostico y tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con la angiogenesis, por ejemplo, cancer, isquemia, etc. Adicionalmente, estos objetivos pueden usarse para seleccionar agentes que pueden usarse para diagnosticar y tratar enfermedades relacionadas con la angiogenesis y trastornos.
Tabla 1. Genes sobrerregulados en celulas del vaso tumoral con mas de cuatro repeticiones
Sfmbolo del Gen
No. de Accveso GenBank. Nombre del Gen Repeticiones
NAT1
NM_000662 N-acetiltransferasa 1 (arilamina N-acetiltransferasa) 17.6
DHRS2
NM_005794 Miembro 2 de Deshidrogenasa/reductasa (familia SDR) 11.9
IF127
NM_005532 Interferon, protema 27 alfa-inducible 11.7
S100A8
NM_002964 VVGyO'+ S100A8 S100 Protema de union al calcio A8 (calgranulina A) 11.7
MTL5
NM_004923 MTL5 5 similar a Metalotioneina, espedfico para los testmulos (tesmin) 10.9
FAP
NM_004460 FAP Protema de activacion de fibroblastos 10.7
IFI27
NM_005532 Interferon, protema 27 alfa-inducible 10.1
UNG2
NM_021147 Uracilo-ADN glicosilasa 2 9.0
THC1546313 8.9
APXL2
AB075840 Protema Apical 2 8.8
MGC16121
NM_032762 Protema Hipotetica MGC16121 8.7
MMP1
NM_002421 metaloproteinasa 1 de matriz (colagenasa intersticial) 8.1
MMP11
NM_005940 metaloproteinasa 11 de Matriz (estromelisina 3) 8.1
SULF1
NM_015170 Sulfatasa 1 7.9
SLITRK6
NM_032229 SLIT y familia similar a NTRK, miembro 6 7.6
LTB
NM_002341 Linfotoxina beta (superfamilia TNF, miembro 3) 7.3
INHBA
NM_002192 Inhibina, beta A (activina A, activin AB polipeptido alfa) 7.2
THC1598071 6.6
PREX1
NM_020820 Fosfatidilinositol interecambiador 1 de RAC dependiente de 3,4,5-trisfosfato 6.4
CHST8
NM_022467 Carbohidrati (N-acetilgalactosamina 4-0) sulfotransferasa 8 6.4
SFRP2
AF311912 Protema 2 relacionada con frizzled secretada 6.3
SMPD3
NM_024703 Esfingomielina fosfodiesterasa 3, membrana neutra 6.3
KAZALD1
AF333487 Dominio 1 inhibidor de la serina peptidase tipo Kazal 6.2
FGFR3
NM_000142 Receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos 6.2
SPOCD1
NM_144569 SPOC dominio que contiene 6.1
IRF7
NM_004030 Factor 7 regulador de Interferon 5.9
COL1A2
NM_000089 Colageno, tipo I, alfa 2 5.8
CD19
NM_001770 Antfgeno CD 19 5.7
BF
NM_001710 B-factor, properdina 5.6
SQLE
NM_003129 Escualeno epoxidasa 5.6
HOXB6
NM_156036 Homeo box B6 5.6
MLPH
NM_024101 Melanofilina 5.2
DKFZp434E2321
NM_207310 Protema hipotetica DKFZp434E2321 5.2
HTRA3
NM_053044 HtrA serina peptidasa 3 5.1
T3JAM
NM_025228 Modulador que activa Jun N-terminal quinasa (JNK) que interactua con TRAF3 4.9
ASCL2
NM_005170 2 como complejo Achaete-scute 2 (Drosophila) 4.9
I_960623 4.7
HSPB1
NM_001540 Choque temico 27kDa protema 1 4.6
COL12A1
NM_004370 Colageno, tipo XII, alfa 1 4.6
HOXB2
NM_002145 Homeo box B2 4.6
HIG2
NM_013332 Protema 2 inducible por Hipoxia 2 4.6
FLJ00332
BC036873 Protema FLJ00332 4.6
JAK3
BC028068 Janus quinasa 3 (una protema tirosina quinasa, leucocito) 4.5
S100P
NM_005980 S100 Protema P de union al calcio 4.5
RAMP1
NM_005855 Protema 1 modificadora de la actividad del receptor (calcitonina) 4.4
COL5AI1
NM_000093 Colageno, tipo V, alfa 1 4.4
CENPF
NM_016343 Centromero protema F, 350/400ka (mitosina) 4.3
DOK3
BC004867 Protema 3 de acoplamiento 4.2
AA516420 AA516420 4.2
NID2
NM_007361 Nidogen 2 (osteonidogen) 4.2
I_1000437 4.1
FGD3
NM_033086 Familia FGD1, miembro 3 4.1
AK098833 Gen hipotetico apoyado por AK098833 4.1
AEBP1
NM_001129 AE protema 1 de union 4.0
A_23_BS21882 4.0
III. Inhibicion de la angiogenesis
De acuerdo con lo anterior, como un aspecto, la divulgacion provee metodos para inhibir la angiogenesis en una celula, que comprende disminuir la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en la 5 celula.
En otro aspecto, la divulgacion provee metodos para inhibir la angiogenesis en un tejido de un sujeto, que comprende disminuir la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en el tejido del sujeto.
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a metodos para tratar o prevenir el cancer en un sujeto, que comprende 10 disminuir la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en el sujeto.
La divulgacion se refiere ademas a metodos para tratar o prevenir metastasis en un sujeto, que comprende disminuir la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en el sujeto.
En un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a metodos para reducir la tumorigenicidad en un sujeto, que comprende disminuir la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en el sujeto.
15 La divulgacion se refiere ademas a metodos para regular la fertilidad en un sujeto femenino (por ejemplo, prevenir la concepcion o finalizar un embarazo), que comprende disminuir la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en el sujeto (vease Patente de EE.UU. 6,017,949).
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En un aspecto de cada uno de estos aspectos, el sujeto puede ser uno que ha sido diagnosticado con cancer, por ejemplo, cancer de mama. En otro aspecto, el sujeto puede ser uno que esta en riesgo de desarrollar cancer (por ejemplo, predispuesto debido a factores hereditarios, fumar, infeccion viral, exposicion a productos qmmicos, etc.). En otro aspecto, el sujeto puede ser uno que ha sido diagnosticado con otra enfermedad o trastorno asociado con angiogenesis excesiva o anormal, por ejemplo, enfermedades infecciosas, trastornos autoinmunes, malformaciones vasculares, smdrome de DiGeorge, HHT, hemangioma cavernoso, aterosclerosis, arteriopatfa de trasplante, obesidad, psoriasis, verrugas, dermatitis alergica, queloides cicatrizales, granulomas piogenicos, enfermedad de formacion de ampollas, sarcoma de Kaposi, smdrome vftreo hiperplasico persistente, retinopatfa diabetica, retinopatfa del prematuro, neovascularizacion coroidea, hipertension pulmonar primaria, asma, polipos nasales, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad periodontal, ascitis, adhesiones peritoneales, endometriosis, hemorragia uterina, quistes ovaricos, hiperestimulacion ovarica, artritis, sinovitis, osteomielitis y/o formacion de osteofitos.
En un aspecto, la expresion y/o la actividad de 2, 3, 4, 5 o mas de los polipeptidos listados en la Tabla 1 pueden disminuir. Puede inhibirse cualquier polipeptido individual o combinacion de polipeptidos en la lista. Se contempla ademas que uno cualquiera o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 pueden excluirse de los metodos, por ejemplo, el metodo se puede practicar con cualquier polipeptido listado excepto SFRP2. En un aspecto, los polipeptidos se seleccionan del grupo que consiste de SFRP2, JAK3, y FAP, o cualquier combinacion de los mismos. En otro aspecto, el uno o mas polipeptidos no incluye SFRP2. En otro aspecto, el uno o mas polipeptidos no incluye JAK3. En otro aspecto, el uno o mas polipeptidos no incluye FAP.
En un aspecto de la divulgacion, la disminucion de la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 comprende disminuir el nivel de un acido nucleico (ADN o ARN) que codifica el polipeptido o el nivel de expresion del polipeptido desde el nucleico acido. Se conocen numerosos metodos para reducir el nivel y/o la expresion de polinucleotidos in vitro o in vivo. Por ejemplo, las secuencias de nucleotidos codificantes y no codificantes para los polipeptidos listados en la Tabla 1 son conocidas por los expertos en la tecnica y estan facilmente disponibles en bases de datos de secuencias tales como GenBank. Una secuencia de nucleotidos antisentido o acido nucleico que codifica una secuencia de nucleotidos antisentido se puede generar por cualquier porcion de la misma de acuerdo con tecnicas conocidas.
El termino "secuencia de nucleotidos antisentido" o de "oligonucleotido antisentido" tal como se utiliza aqrn, se refiere a una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia de ADN o ARN especificada. Los oligonucleotidos antisentido y los acidos nucleicos que expresan los mismos pueden hacerse de acuerdo con tecnicas convencionales. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5,023,243 de Tullis; La Patente de Estados Unidos No. 5,149,797 de Pederson et al. La secuencia de nucleotidos antisentido puede ser complementaria a toda la secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido o una porcion de la misma de al menos 10, 20, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300 o 500 bases contiguas y reducira el nivel de produccion de polipeptidos.
Los expertos en la tecnica apreciaran que no es necesario que la secuencia de nucleotidos antisentido sea totalmente complementaria a la secuencia objetivo mientras el grado de similitud de secuencia sea suficiente para que la secuencia de nucleotidos antisentido se hibride con su objetivo y reduzca la produccion del polipeptido Como es conocido en la tecnica, en general se requiere un mayor grado de similitud de secuencia para secuencias de nucleotidos antisentido cortas, mientras que un mayor grado de bases no coincidentes sera tolerado por secuencias de nucleotidos antisentido mas largas.
Por ejemplo, la hibridacion de tales secuencias de nucleotidos puede llevarse a cabo bajo condiciones de rigurosidad reducida, rigurosidad media o incluso condiciones rigurosas (por ejemplo, condiciones representadas por una rigidez de lavado de 35-40% de formamida con 5x solucion de Denhardt, SDS al 0,5% y 1x SSPE A 37°C, condiciones representadas por una rigidez al lavado de 40-45% de formamida con 5x solucion de Denhardt, SDS al 0,5% y 1x SSPE a 42°C y/o condiciones representadas por una rigidez al lavado de formamida al 50% con 5x Denhardt, SDS al 0,5% y 1 x SSPE a 42°C, respectivamente) para las secuencias de nucleotidos espedficamente descritas aqrn. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989).
En otros aspectos, las secuencias de nucleotidos antisentido de la invencion tienen una similitud de secuencia de al menos el 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% o mas con el complemento de las secuencias codificantes espedficamente descritas aqrn y reduciran el nivel de la produccion de polipeptidos.
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En otros aspectos, la secuencia de nucleotidos antisentido puede dirigirse contra cualquier secuencia de codificacion, cuyo silenciamiento da como resultado una modulacion de un polipeptido listado en la Tabla 1.
La longitud de la secuencia de nucleotidos antisentido (es decir, el numero de nucleotidos en la misma) no es cntica a condicion de que se una selectivamente a la localizacion deseada y reduzca la transcripcion y/o traduccion de la secuencia objetivo y se puede determinar de acuerdo con procedimientos de rutina En general, la secuencia de nucleotidos antisentido tendra una longitud de aproximadamente ocho, diez o doce nucleotidos hasta aproximadamente 20, 30, 50, 75 o 100 nucleotidos o mas de longitud.
Una secuencia de nucleotidos antisentido se puede construir usando smtesis qmmica y reacciones de ligacion enzimatica por procedimientos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, una secuencia de nucleotidos antisentido puede sintetizarse qmmicamente utilizando nucleotidos de origen natural o diversos nucleotidos modificados disenados para incrementar la estabilidad biologica de las moleculas o para incrementar la estabilidad ffsica del duplex formado entre las secuencias de nucleotidos antisentido y en sentido, por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleotidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucleotidos modificados que pueden usarse para generar la secuencia de nucleotidos antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-uracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2- metiladenina, 2 metilguanina, 3 metilcitosina, 5 metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5- metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio- N6-isopenteniladienina, acido uracil-5-oxiacetico (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2- tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metil ester del acido uracil-5- oxiacetico, acido uracil-5-oxiacetico (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, la secuencia de nucleotidos antisentido se puede producir usando un vector de expresion en el que un acido nucleico ha sido clonado en una orientacion antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del acido nucleico insertado sera de una orientacion antisentido frente a un acido nucleico objetivo de interes).
Las secuencias de nucleotidos antisentido de la invencion incluyen ademas secuencias de nucleotidos en donde al menos uno, o todos los residuos de fosfato de puente internucleotidico son fosfatos modificados, tales como fosfonatos de metilo, fosfonotioatos de metilo, fosforomorfolidatos, fosforopiperazidato y fosforamidato. Por ejemplo, cada uno de los residuos de fosfato de puente internucleotfdico puede modificarse como se ha descrito. En otro ejemplo no limitante, la secuencia de nucleotidos antisentido es una secuencia de nucleotidos en la que uno o todos los nucleotidos contienen una unidad estructural de alquilo inferior de 2' (por ejemplo C1-C4, alquilo lineal o ramificado, saturado o insaturado, tal como metilo, etilo, etenilo, propilo, 1-propenilo, 2-propenilo e isopropilo). Por ejemplo, cada uno de los nucleotidos puede ser modificado como se describe. Vease tambien, Furdon et al., Nucleic Acids Res. 17: 9193 (1989); Agrawal et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 87: 1401 (1990); Baker et al., Nucleic Acids Res. 18: 3537 (1990); Sproat et al., Nucleic Acids Res. 17: 3373 (1989); Walder y Walder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5011 (1988).
Tambien se pueden emplear metodos de apareamiento de bases de triple helice para inhibir la produccion de polipeptidos listados en la Tabla 1. Se cree que el apareamiento de triple helice trabaja inhibiendo la capacidad de la doble helice de abrirse suficientemente para la union de polimerasas, factores de transcripcion o moleculas reguladoras. Los avances terapeuticos recientes que usan el ADN triplex se han descrito en la literatura (por ejemplo, Gee et al., (1994) In: Huber et al., Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY).
El ARN de interferencia pequena (si), tambien conocido como moleculas de interferencia de ARN (ARNi), provee otra metodologfa para modular la expresion de polipeptidos listados en la Tabla 1. El ARNsi puede dirigirse contra secuencias de polinucleotidos que codifican los polipeptidos listados o cualquier otra secuencia que da como resultado modulacion de la expresion de los polipeptidos listados.
El ARNsi es un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional de genes en el que ARN bicatenario (ARNds) que corresponde a una secuencia codificante de interes se introduce en una celula o un organismo, dando como resultado la degradacion del mARN correspondiente. El mecanismo por el cual el ARNsi alcanza el silenciamiento genico ha sido revisado en Sharp et al., Genes Dev. 15: 485 (2001); y Hammond et al., Nature Rev. Gen. 2: 110 (2001)). El efecto de ARNsi persiste para multiples divisiones celulares antes de recuperar la expresion genica. El ARNsi es por lo tanto un metodo de gran alcance para hacer anulacion o "modificacion" direccionada en el nivel de ARN. El ARNsi ha demostrado ser exitoso en celulas humanas, incluyendo rinon embrionario humano y celulas
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HeLa (vease, por ejemplo, Elbashir et al., Nature 411: 494 (2001)). En una realizacion, el silenciamiento puede inducirse en celulas de mai^ero mediante la imposicion de expresion endogena de horquillas de ARN (vease Paddison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 1443 (2002)). En otra realizacion, la transfeccion de ARNds pequeno (21-23 nt) inhibe espedficamente la expresion del acido nucleico (revisado en Caplen, Trends Biotechnol., 20:49 (2002)).
La tecnolog^a de ARNsi utiliza metodos estandar de biologfa molecular. El ARNds que corresponde a la totalidad o a una parte de una secuencia codificante objetivo que va a ser inactivada se puede producir mediante metodos estandar, por ejemplo, mediante transcripcion simultanea de ambas cadenas de un ADN molde (correspondiente a la secuencia objetivo) con ARN polimerasa T7. Los kits para la produccion de ARNds para uso en ARNsi estan disponibles comercialmente, por ejemplo, de New England Biolabs, Inc. Los metodos de transfeccion de ARNds A o de plasmido disenados para hacer ARNds son rutina en la tecnica.
Se pueden usar microARN (miARN), moleculas de ARN de cadena sencilla de aproximadamente 21-23 nucleotidos de longitud, de manera similar al ARNsi para modular la expresion genica (vease la Patente de Estados Unidos No. 7,217,807).
Se ha informado de efectos de silenciamiento similares a los producidos por ARNsi en celulas de mairnfero con transfeccion de un constructo dbrida de mARN-ADNc (Lin et al., Biochem. Biophys Res. Commun. 281: 639 (2001)), proveyeno aun otra estrategia para silenciar una secuencia codificante de interes.
La expresion de los polipeptidos listados en la Tabla 1 tambien puede inhibirse usando ribozimas. Las ribozimas son complejos de ARN-protema que escinden acidos nucleicos de una manera espedfica del sitio. Las ribozimas tienen dominios catalfticos espedficos que poseen actividad endonucleasa (Kim et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8788 (1987), Gerlach et al., Nature 328: 802 (1987), Forster and Symons, Cell 49:211 (1987)). Por ejemplo, un gran numero de ribozimas acelera las reacciones de transferencia del fosfoester con un alto grado de especificidad, frecuentemente escindiendo solamente uno de varios fosfoesteres en un sustrato de oligonucleotido (Michel and Westhof, J. Mol. Biol. 216: 585 (1990) Reinhold-Hurek and Shub, Nature 357:173 (1992)). Esta especificidad se ha atribuido al requisito de que el sustrato se une a traves de interacciones de apareamiento de bases espedficas con la secuencia grna interna ("IGS") de la ribozima antes de la reaccion qmmica.
La catalisis de ribozima se ha observado principalmente como parte de las reacciones de escision/ligacion espedficas de secuencia que involucra acidos nucleicos (Joyce, Nature 338: 217 (1989)). Por ejemplo, la patente U.S. No. 5,354,855 informa que ciertas ribozimas pueden actuar como endonucleasas con una especificidad de secuencia mayor que la de las ribonucleasas conocidas y aproximandose a la de las enzimas de restriccion de ADN. Por lo tanto, la inhibicion de la expresion genica mediada por ribozima espedfica de secuencia puede ser particularmente adecuada para aplicaciones terapeuticas (Scanlon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10591 (1991); Sarver et al., Science 247:1222 (1990); Sioud et al., J. Mol. Biol. 223:831 (1992)).
En otra realizacion de la divulgacion, la disminucion de la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 comprende disminuir la actividad de dicho polipeptido. La actividad del polipeptido se puede modular mediante la interaccion con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede unirse al polipeptido o a cualquier otro polipeptido de interes, siempre que la union entre el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo y el polipeptido objetivo de como resultado modulacion de la actividad del polipeptido listado.
El termino “anticuerpo” o “anticuerpos” tal como se utiliza aqrn se refiere a todos los tipos de inmunoglobulinas, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y puede ser de cualquier especie de origen, incluyendo (por ejemplo) raton, rata, conejo, caballo, cabra, oveja, camello o humano, o puede ser un anticuerpo quimerico. Vease, por ejemplo, Walker et al., Molec. Immunol. 26: 403 (1989). Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes producidos de acuerdo con los metodos descritos en la Patente de Estados Unidos No. 4,474,893 o en la Patente de Estados Unidos No. 4,816,567. Los anticuerpos tambien pueden construirse qmmicamente de acuerdo con el metodo descrito en la Patente de Estados Unidos No. 4,676,980.
Los fragmentos de anticuerpos incluidos dentro del alcance de la presente divulgacion incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; anticuerpos de dominio, diacuerpos; vaccicuerpos; anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpo monocatenario; y anticuerpos multiespedficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Tales fragmentos se pueden producir mediante tecnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos F(ab')2 pueden producirse por digestion con pepsina de la molecula de anticuerpo, y los fragmentos Fab se pueden generar
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reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Alternativamente, pueden construirse bibliotecas de expresion Fab para permitir la rapida y facil identificacion de fragmented Fab monoclonales con la especificidad deseada (Huse et al., Science 254: 1275 (1989)).
Los anticuerpos de la divulgacion pueden alterarse o mutarse para compatibilidad con especies distintas de la especie en la que se produjo el anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser humanizados o camelizados. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murmicos) son inmunoglobulinas quimericas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos que se enlazan a antigenos) que contienen secuencia minima derivada de Inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una region determinante de complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como raton, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos marco de Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados tambien pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias marco. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos al menos uno y, tfpicamente, dos dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado tambien comprendera optimamente al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), tfpicamente la de una inmunoglobulina humana (Jones et al., Nature 321: 522 (1986), Riechmann et al., Nature, 332: 323 (1988) y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593 (1992)).
Los metodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la tecnica. En genral, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas residuos de aminoacidos introducidos en el mismo a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoacidos no humanos se denominan frecuentemente como residuos de "importacion", que se toman tfpicamente de un dominio variable de "importacion". La humanizacion puede realizarse esencialmente siguiendo el metodo de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321: 522 (1986), Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)), sustituyendo las CDR de roedor o secuencias CDR para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quimericos (Patente de Estados Unidos No. 4,816,567), en donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados son tfpicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos de sitios analogos en anticuerpos de roedor.
Tambien se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas tecnicas conocidas en el arte, incluyendo bibliotecas de presentacion en fagos (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 (1991)). Las tecnicas de Cole et al. y Boerner et al. tambien estan disponibles para la preparacion de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Anticorps Monoclonal and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pagina 77 (1985) y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)). De forma similar, los anticuerpos humanos pueden hacerse introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgenicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endogena han sido parcial o completamente inactivados. Tras la exposicion, se observa la produccion de anticuerpos humanos, que se asemeja mucho a la observada en humanos en todos los aspectos, incluyendo el reordenamiento de genes, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en las siguientes publicaciones cientfficas: Marks et al., Bio/Technology 10:779 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856 (1994); Morrison, Nature 368:812 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14:845 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65 (1995).
Los anticuerpos policlonales utilizados para llevar a cabo la presente divulgacion pueden producirse mediante la inmunizacion de un animal adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, etc.) con un antfgeno al que se une un anticuerpo monoclonal al objetivo, recolectando suero inmune del animal y separando los anticuerpos policlonales del suero inmune, de acuerdo con procedimientos conocidos.
Los anticuerpos monoclonales utilizados para llevar a cabo la presente divulgacion pueden producirse en una lmea celular de hibridoma de acuerdo con la tecnica de Kohler y Milstein, Nature 265: 495 (1975). Por ejemplo, se puede inyectar una solucion que contiene el antfgeno apropiado en un raton y, despues de un tiempo suficiente, el raton es sacrificado y se obtienen celulas de bazo. Las celulas del bazo se inmortalizan entonces fusionandolas con celulas
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de mieloma o con celulas de linfoma, tipicamente en presencia de polietilenglicol, para producir celulas de hibridoma. Las celulas de hibridoma se hacen crecer entonces en un medio adecuado y el sobrenadante es tamizados para obtener anticuerpos monoclonales que tienen la especificidad deseada. Los fragmented Fab monoclonales se pueden producir en E. coli mediante tecnicas recombinantes conocidas por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Huse, Science 246: 1275 (1989).
Tambien pueden obtenerse anticuerpos espedficos del polipeptido objetivo mediante tecnicas de presentacion de fagos conocidas en el arte.
Pueden usarse diversos inmunoensayos para el cribado para identificar anticuerpos que tengan la especificidad deseada para los polipeptidos de esta divulgacion. Son bien conocidos en la tecnica numerosos protocolos para ensayos de enlazamiento competitivo o inmunoradiometricos usando anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidad establecida. Tales inmunoensayos involucran tfpicamente la medicion de la formacion de complejos entre un antigeno y su anticuerpo espedfico (por ejemplo, formacion de complejo antfgeno/anticuerpo). Se puede usar un inmunoensayo basado en monoclonales de dos sitios que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos a dos epftopos no interferentes sobre los polipeptidos o peptidos de esta divulgacion, asf como un ensayo de enlazamiento competitivo.
Los anticuerpos pueden conjugarse con un soporte solido (por ejemplo, perlas, placas, laminas o pozos formados a partir de materiales tales como latex o poliestireno) de acuerdo con tecnicas conocidas. Los anticuerpos tambien pueden conjugarse a grupos detectables tales como radiomarcadores (por ejemplo, 35S, 125I, 131I), marcadores enzimaticos (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina) y marcadores de fluorescencia (por ejemplo, fluorescema) de acuerdo con tecnicas conocidas. La determinacion de la formacion de un complejo anticuerpo/antfgeno en los metodos de esta invencion puede ser por deteccion de, por ejemplo, precipitacion, aglutinacion, floculacion, radiactividad, desarrollo o cambio de color, fluorescencia, luminiscencia, etc., como es bien conocido en el arte.
En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) que se enlaza espedficamente a SFRP2. El anticuerpo puede enlazarse a un epttopo espedfico sobre SFRP2, por ejemplo, el dominio de enlazamiento a WNT (aproximadamente de los aminoacidos 30-160) o el dominio NTR (aproximadamente de los aminoacidos 169-295), que causa la inhibicion de la actividad de SFRP2. Los epitopes adecuados para aumentar anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, los aminoacidos 29-40 de SFRP2 humano GQPDFSYRSNC (SEQ ID NO:1)), 85-96 (KQCHPDTKKELC (SEQ ID NO:2)),119-125 (VQVKDRC (SEQ ID NO:3)) 138-152 (DMLECDRFPQDNDLC (SEQ ID NO:4)),173-190 (EACKNKNDDDNDIMETLC (SEQ ID NO:5)),202-220 (EITYINRDTKIILETKSKT-Cys (SEQ ID NO:6)), o 270-295 (ITSVKRWQKGQREFKRISRSIRKLQC (SEQ ID NO:7)). En otro aspecto, el epftopo es un fragmento de la protema desde aproximadamente el aminoacido 156 hasta aproximadamente el aminoacido 295. La numeracion de aminoacidos se basa en la lista de GenBank para SFRP2 humano (numero de acceso AAH08666).
En un aspecto, la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 se inhibe usando aptameros. Recientemente, los ARN de cadena sencilla de estructura pequena, tambien conocidos como aptameros de ARN, han surgido como alternativas viables para moleculas pequenas y terapia basada en anticuerpos (Que-Gewirth et al., Gene Ther. 14: 283 (2007), Ireson et al., Mol. Cancer Ther. 5: 2957 (2006)). Los aptameros de ARN unen espedficamente protemas objetivo con alta afinidad, son bastante estables, carecen de inmunogenicidad y provocan respuestas biologicas. Los aptameros se desarrollan por medio de un metodo de seleccion iterativo llamado SELEX (evolucion sistematica de ligandos por enriquecimiento exponencial) para reconocer espedficamente y enlazar estrechamente sus objetivos mediante estructuras tridimensionales complementarias bien definidas.
Los aptameros de ARN representan una clase emergente unica de agentes terapeuticos (Que-Gewirth et al., Gene Ther. 14: 283 (2007), Ireson et al., Mol. Cancer Ther. 5: 2957 (2006)). Son oligonucleotidos de ARN de cadena sencilla (12-30 nucleotidos) relativamente cortos que asumen una forma tridimensional estable para unir estrecha y espedficamente las protemas seleccionadas para obtener una respuesta biologica. En contraste con los oligonucleotidos antisentido, los aptameros de ARN pueden direccionar efectivamente objetivos extracelulares. Al igual que los anticuerpos, los aptameros poseen afinidades de enlazamiento en el rango nanomolar a picomolar bajo. Ademas, los aptameros son estables al calor, carecen de inmunogenicidad y poseen una variabilidad interlotes minima. Las modificaciones qrnmicas, tales como sustituciones amino o fluoro en la posicion 2' de pirimidinas, pueden reducir la degradacion por nucleasas. La biodistribucion y eliminacion de aptameros tambien pueden alterarse por adicion qrnmica de unidades estructurales tales como polietilenglicol y colesterol. Ademas, SELEX
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permite la seleccion de bibliotecas que consisten de hasta 1015 ligandos para generar ligandos de oligonucleotidos de alta afinidad a objetivos bioqmmicos purificadas.
En otro aspecto, el metodo para disminuir la actividad de un polipeptido listado en la Tabla 1 comprende suministrar a una celula oa un sujeto un compuesto que disminuye la actividad de un polipeptido listado en la Tabla 1, el compuesto administrado en una cantidad efectiva para modular la lactividad del polipeptido listado en la Tabla 1. El compuesto puede interaccionar directamente con el polipeptido listado en la Tabla 1 para disminuir la actividad del polipeptido. Alternativamente, el compuesto puede interactuar con cualquier otro polipeptido, acido nucleico u otra molecula si tal interaccion da como resultado una disminucion de la actividad del polipeptido listado en la Tabla 1.
El termino "compuesto" tal como se usa aqrn esta destinado a ser interpretado ampliamente y abarca moleculas organicas e inorganicas. Los compuestos organicos incluyen, pero no se limitan a, moleculas pequenas, polipeptidos, lfpidos, carbohidratos, coenzimas, aptameros y moleculas de acido nucleico (por ejemplo, vectores de suministro de genes, oligonucleotidos antisentido, ARNsi, todos como se describieron mas arriba).
Los polipeptidos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos (descritos en mas detalle anteriormente) y enzimas. Los acidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, moleculas quimericas de ADN, ARN y ADN-ARN. Las moleculas de ARN adecuadas incluyen ARNsi, moleculas de ARN antisentido y ribozimas (todas las cuales se describen con mas detalle anteriormente). El acido nucleico puede codificar ademas cualquier polipeptido de tal manera que la administracion del acido nucleico y la produccion del polipeptido de como resultado una disminucion de la actividad de un polipeptido listado en la Tabla 1.
El compuesto puede ademas ser un compuesto que se identifica por cualquiera de los metodos de seleccion descritos mas adelante.
En un aspecto de la divulgacion, el polipeptido listado en la Tabla 1 es SFRP2, que parece estimular la angiogenesis mediante la activacion de la ruta no canonica Wnt. La actividad angiogenica de SFRP2 puede inhibirse suministrando a un sujeto un inhibidor de esta ruta, por ejemplo, un inhibidor de calcineurina o NF-ATc, por ejemplo, un agente que inhiba la desfosforilacion de NF-ATc de calcineurina; un agente que inhiba la translocacion nuclear de NF-ATc desfosforilada (agentes que bloquean la importacion nuclear de NF-ATc3 y NF-ATc4, un agente que inhibe el enlazamiento a ADN de un complejo de enlazamiento a una protema asociada a NF-ATc, por ejemplo, a traves del enlazamiento a una porcion de enlazamiento a ADN de NF-ATc y/o a la region de enlazamiento de protema asociada, que incluye agentes que inhiben el enlazamiento a ADN por NF-ATc y agentes que previenen la interaccion de NF-ATc con sus protemas nucleares asociadas, un agente que reduce la cantidad de NF-ATc intracelular, por ejemplo, agentes que inhiben la expresion de NF-ATc (tal como antisentido o ARNsi), o un agente que incrementa la tasa de exportacion nuclear mediante la activacion de GSK3, PKA u otras quinasas de NFAT. Exemplos de inhibidores que pueden usarse en la invencion incluyen, sin limitacion, tacrolimus, pimecrolimus, ciclosporina, rapamicina, y los inhibidores divulgados en las Patentes de Estados Unidos Nos. 7,323,439; 7,160,863; 7,084,241; 7,019,028; 6,967,077; 6,875,571; 6,780,597; 6,686,450; 6,537,810; 6,399,322; y 5,807,693.
Los compuestos de la presente divulgacion pueden suministrarse opcionalmente junto con otros agentes terapeuticos. Los agentes terapeuticos adicionales pueden suministrarse concurrentemente con los compuestos de la divulgacion. Tal como se utiliza aqrn, la palabra "simultaneamente" significa suficientemente proximo en el tiempo para producir un efecto combinado (es decir, concurrentemente puede ser simultaneamente, o puede ser dos o mas eventos que ocurren dentro de un corto penodo de tiempo antes o despues uno de otro). En un aspecto, los compuestos de la invencion se administran conjuntamente con agentes anticancengenos, tales como 1) alcaloides vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina); 2) epipodofilotoxinas (por ejemplo, etoposido y teniposido); 3) antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (actinomicina D), daunorubicina (daunomicina, rubidomicina), doxorrubicina, bleomicina, plicamicina (mitramicina) y mitomicina (mitomicina C); 4) enzimas (por ejemplo, L- asparaginasa); 5) modificadores de la respuesta biologica (por ejemplo, Interferonalfa); 6) complejos de coordinacion de platino (por ejemplo, cisplatino y carboplatino); 7) antracendionas (por ejemplo, mitoxantrona); 8) ureas sustituidas (por ejemplo, hidroxiurea); 9) derivados de metilhidrazina (por ejemplo, procarbazina (N-metilhidrazina, MIH)); 10) supresores adrenocorticales (por ejemplo, mitotano (o,p'-DDD) y aminoglutetimida); 11) adrenocorticosteroides (por ejemplo, prednisona); 12) progestinas (por ejemplo, caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona y acetato de megestrol); 13) estrogenos (por ejemplo, dietilestilbestrol y etinilestradiol); 14) antiestrogenos (por ejemplo, tamoxifeno); 15) androgenos (por ejemplo, propionato de testosterona y fluoximesterona); 16) antiandrogenos (por ejemplo, flutamida): y 17) analogos de la hormona liberadora de gonadotropina (por ejemplo, leuprolida). En otra realizacion, los compuestos de la invencion se administran conjuntamente con agentes
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antiangiogenesis, tales como anticuerpos para VEGF (por ejemplo, bevacizumab (AVASTIN), ranibizumab (LUCENTIS)) y otros promotores de angiogenesis (por ejemplo, bFGF, angiopoietina-1), anticuerpos para la integrina vascular alfa-v/beta-3 (por ejemplo, VITAXIN), angiostatina, endostatina, dalteparina, ABT-510, conjugado CNGRC peptido TNF alfa, ciclofosfamida, fosfato de combretastatina A4, acido dimetilxantenona acetico, docetaxel, lenalidomida, enzastaurina, paclitaxel, formulacion de nanopartmulas estabilizadas con albumina de paclitaxel (Abraxane), isoflavona de soja (Genistein), citrato de tamoxifeno, talidomida, ADH-1 (EXERINA), AG-013736, AMG- 706, AZD2171, tosilato de sorafenib, BMS- 582664, CHIR- 265, pazopanib, PI-88, vatalanib, everolimus, suramina, malato de sunitinib, XL184, ZD6474, ATN-161, cilenigtida y celecoxib.
IV. Estimulacion de la angiogenesis
Un aspecto de la divulgacion se refiere a metodos para incrementar la angiogenesis en una celula, que comprende incrementar la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en la celula.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a metodos para incrementar la angiogenesis en un tejido de un sujeto, que comprende incrementar la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en el tejido del sujeto. En un aspecto, el sujeto es uno que tiene deficiencias vasculares, enfermedad cardiovascular, o se beneficiana de la estimulacion de la activacion y estabilizacion de celulas endoteliales de microvasos u otros vasos recien formados, tales como en apoplejfa, infarto del miocardio, u otros tipos de isquemia, o sujetos que necesitan curacion de heridas, por ejemplo, sujetos con ulceras, llagas de cama, quemaduras, etc.
En un aspecto, el incremento de la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 comprende suministrar un acido nucleico que codifica el polipeptido o un fragmento o homologo de este a la celula o tejido. En otro aspecto, el incremento de la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 comprende suministrar los propios polipeptidos o un fragmento o homologo de los mismos a la celula o tejido. Tal como se usa aqrn, el termino “homologo” se usa para referirse a un polipeptido que difiere de un polipeptido de origen natural mediante modificaciones menores al polipeptido de origen natural, pero que conserva significativamente una actividad biologica del polipeptido de origen natural. Las modificaciones menores incluyen, sin limitacion, cambios en una o algunas cadenas laterales de aminoacidos, cambios en uno o algunos aminoacidos (incluyendo supresiones, inserciones y sustituciones), cambios en estereoqmmica de uno o unos pocos atomos y derivaciones menores, Incluyendo, sin limitacion, metilacion, glicosilacion, fosforilacion, acetilacion, miristoilacion, prenilacion, palmitacion, amidacion y adicion de glucosilfosfatidil inositol. El termino "sustancialmente retiene", tal como se utiliza aqrn, se refiere a un fragmento, homologo u otra variante de un polipeptido que retiene al menos aproximadamente el 20% de la actividad del polipeptido de origen natural (por ejemplo, actividad angiogenica), por ejemplo, aproximadamente 30%, 40%, 50% o mas. La actividad angiogenica se puede medir, por ejemplo, midiendo la proliferacion celular, el brote angiogenico, la formacion de tubulos o la capacidad de migracion e invasion. Otras actividades biologicas, que dependen del polipeptido, pueden incluir la actividad enzimatica, la union al receptor, la union al ligando, la induccion de un factor de crecimiento, un evento de transduccion de senales celulares, etc.
En un aspecto, el metodo comprende suministrar al sujeto un polipeptido aislado listado en la Tabla 1. En aspectos de ejemplo, el polipeptido comprende, consiste esencialmente de, o consiste de la secuencia de aminoacidos conocida publicamente del polipeptido (divulgada en los numeros de acceso GenBank en la Tabla 1) o un fragmento funcional de la misma. En otro aspecto, el polipeptido aislado comprende, consiste esencialmente de, o consiste de una secuencia de aminoacidos que es identica al menos en un 70%, por ejemplo, al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identica a la secuencia de aminoacidos conocida publicamente o a un fragmento funcional de la misma (y secuencias polinucleotfdicas que codifican la misma).
El polipeptido de la divulgacion tambien incluye porciones funcionales o fragmentos (y secuencias polinucleotfdicas que codifican la misma). La longitud del fragmento no es cntica a condicion de que retenga sustancialmente la actividad biologica del polipeptido (por ejemplo, actividad angiogenica). Los fragmentos ilustrativos comprenden al menos aproximadamente 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, o mas aminoacidos contiguos de un polipeptido listado en Tabla 1.
Del mismo modo, los expertos en la tecnica apreciaran que la presente divulgacion tambien abarca polipeptidos de fusion (y secuencias de polinucleotidos que codifican la misma) que comprenden el polipeptido listado en la Tabla 1 (o un fragmento funcional del mismo). Por ejemplo, puede ser util expresar el polipeptido (o fragmento funcional) como una protema de fusion que puede ser reconocida por un anticuerpo comercialmente disponible (por ejemplo, motivos FLAG) o como una protema de fusion que de otra manera puede purificarse mas facilmente (por ejemplo,
por adicion de una cola poli-His). Adicionalmente, pueden producirse protemas de fusion que mejoran la estabilidad del polipeptido, por ejemplo, protemas de fusion que comprenden protema de union a maltosa (MBP) o glutation-S- transferasa. Como otra alternativa, la protema de fusion puede comprender una molecula informadora. En otros aspectos, la protema de fusion puede comprender un polipeptido que provee una funcion o actividad que es la 5 misma o diferente de la actividad del polipeptido, por ejemplo, una actividad o funcion de direccionamiento, enlazamiento o enzimatica.
Igualmente, se entendera que los polipeptidos espedficamente descritos aqrn toleraran tfpicamente sustituciones en la secuencia de aminoacidos y conservaran sustancialmente la actividad biologica. Para identificar polipeptidos de la invencion distintos de los espedficamente divulgados aqrn, las sustituciones de aminoacidos pueden basarse en 10 cualquier caractenstica conocida en la tecnica, incluyendo la similitud o diferencias relativas de los sustituyentes de
la cadena lateral de aminoacidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamano, y similares.
Las sustituciones de aminoacidos distintas de las descritas aqrn pueden conseguirse cambiando los codones de la secuencia de ADN (o secuencia de ARN), de acuerdo con la siguiente tabla de codones:
TABLA 2
Aminoacidos
Codones
Alanina
Ala A GCA GCC GCG GCT
Cisteina
Cys C TGC TGT
Acido aspartico
Asp D GAC GAT
Acido glutamicod
Glu E GAA GAG
Fenilalanina
Phe F TTC TTT
Glicina
Gly G GGA GGC GGG GGT
Histidina
His H CAC CAT
Isoleucina
Ile I ATA ATC ATT
Lisina
Lys K AAA AAG
Leucina
Leu L TTA TTG CTA CTC CTG CTT
Metionina
Met M ATG
Asparagina
Asn N AAC AAT
Prolina
Pro P CCA CCC CCG CCT
Glutamina
Gln Q CAA CAG
Arginina
Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT
Serina
Ser S AGC ACT TCA TCC TCG TCT
Treonina
Thr T ACA ACC ACG ACT
Valina
Val V GTA GTC GTG GTT
Triptofano
Trp W TGG
Tirosina
Tyr Y TAC TAT
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En la identificacion de secuencias de aminoacidos que codifican polipeptidos distintos de los espedficamente descritos aqrn, puede considerarse el mdice hidropatico de aminoacidos. La importancia del mdice de aminoacidos hidropaticos en conferir funcion biologica interactiva a una protema se entiende generalmente en la tecnica (vease, Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157: 105 (1982)). Se acepta que el caracter hidropatico relativo del aminoacido 20 contribuye a la estructura secundaria de la protema resultante, que a su vez define la interaccion de la protema con otras moleculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antfgenos, y similares.
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A cada aminoacido se le ha asignado un mdice hidropatico en base a sus caractensticas de hidrofobicidad y carga (Kyte and Doolittle, id.), estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cistema/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
De acuerdo con lo anterior, el mdice hidropatico del aminoacido (o secuencia de aminoacidos) puede ser considerado cuando se modifican los polipeptidos espedficamente diculgados aqm.
Tambien se entiende en la tecnica que la sustitucion de aminoacidos puede hacerse sobre la base de la hidrofilicidad. La Patente de Estados Unidos No. 4,554,101 establece que la mayor hidrofilicidad promedio local de una protema, segun se rige por la hidrofilicidad de sus aminoacidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biologica de la protema.
Como se detalla en la Patente de Estados Unidos No. 4,554,101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoacidos: arginina (+3.0); lisina (±3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cistema (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4).
Por lo tanto, la hidrofilicidad del aminoacido (o secuencia de aminoacidos) puede ser considerada cuando se identifican polipeptidos adicionales mas alla de los espedficamente divulgados aqm.
En aspectos de la divulgacion, el polinucleotido que codifica el polipeptido listado en la Tabla 1 (o fragmento funcional) se hibridara con las secuencias de acido nucleico espedficamente descritas aqm o fragmentos de las mismas bajo condiciones estandar como las conocidas por los expertos en la tecnica y codifican un polipeptido funcional o fragmento funcional del mismo.
Por ejemplo, la hibridacion de tales secuencias puede llevarse a cabo bajo condiciones de rigurosidad reducida, rigurosidad media o incluso condiciones rigurosas (por ejemplo, condiciones representadas por una rigidez de lavado de 35-40% de formamida con 5x solucion de Denhardt, SDS al 0,5% y 1x SSPE a 37°C, condiciones representadas por una rigidez al lavado de 40-45% de formamida con 5x solucion de Denhardt, SDS al 0,5% y 1x SSPE a 42°C y condiciones representadas por una rigidez al lavado de formamida al 50% con 5x solucion de Denhardt, 0,5 % SDS y 1x SSPE a 42°C, respectivamente) a las secuencias polinucleotidicas que codifican los polipeptidos listados en la Tabla 1 o fragmentos funcionales de los mismos espedficamente descritos aqm. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989).
En otros aspectos, las secuencias de polinucleotidos que codifican los polipeptidos listados en la Tabla 1 tienen una identidad de secuencia de al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencia con las secuencias de acidos nucleicos conocidas publicamente (divulgadas en los numeros de acceso de GenBank en la Tabla 1) o fragmentos funcionales de las mismas y codifican un polipeptido funcional o fragmento funcional del mismo.
Ademas, los expertos en la tecnica apreciaran que puede haber variabilidad en los polinucleotidos que codifican los polipeptidos (y fragmentos de los mismos) de la presente divulgacion debido a la degeneracion del codigo genetico. La degeneracion del codigo genetico, que permite que diferentes secuencias de acido nucleico codifiquen para el mismo polipeptido, es bien conocida en la literatura (vease, por ejemplo, la Tabla 2).
Del mismo modo, los polipeptidos (y fragmentos de los mismos) de la divulgacion incluyen polipeptidos que tienen al menos aproximadamente 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas de identidad de secuencia de aminoacidos con las secuencias polipeptfdicas conocidas publicamente.
Como se conoce en la tecnica, se pueden usar varios programas diferentes para identificar si un polinucleotido o polipeptido tiene identidad o similitud de secuencia con una secuencia conocida. La identidad o similitud de secuencia puede determinarse usando tecnicas estandar conocidas en la tecnica, incluyendo, pero sin limitarse a, el algoritmo de identidad de secuencia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Mates. 2: 482 (1981), por el algoritmo de alineacion de identidad de secuencia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la busqueda del metodo de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de
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Software Genetico de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), el programa de secuencia Best Fit descrito por Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12: 387 (1984), preferiblemente usando los ajustes predeterminados, o por inspeccion.
Un ejemplo de un algoritmo util es PILEUP. PILEUP crea una alineacion de secuencias multiples de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones progresivas, por parejas. Tambien puede representar un arbol que muestra las relaciones de agrupacion utilizadas para crear la alineacion. PILEUP utiliza una simplificacion del metodo de alineacion progresiva de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351 (1987); El metodo es similar al descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151 (1989).
Otro ejemplo de un algoritmo util es el algoritmo BLAST, descrito en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990) y Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873 (1993). Un programa BLAST particularmente util es el programa WUBLAST - 2 que se obtuvo de Altschul et al., Meth. Enrymol, 266: 460 (1996); Blast.wustl/edu/blast/README.html. WU-BLAST-2 utiliza varios parametros de busqueda, que preferiblemente se ajustan a los valores predeterminados. Los parametros son valores dinamicos y son establecidos por el propio programa dependiendo de la composicion de la secuencia y composicion particulares de la base de datos particular contra la que se busca la secuencia de interes; Sin embargo, los valores pueden ajustarse para aumentar la sensibilidad.
Un algoritmo util adicional es gapped BLAST segun lo informado por Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389 (1997).
Un porcentaje de valor de identidad de secuencia de aminoacidos se determina por el numero de residuos identicos que coinciden dividido por el numero total de residuos de la secuencia "mas larga" en la region alineada. La secuencia "mas larga" es la que tiene los residuos mas reales en la region alineada (las brechas introducidas por WU-Blast-2 para maximizar la puntuacion de alineacion se ignoran).
De una manera similar, el porcentaje de identidad de secuencia de acido nucleico con respecto a la secuencia codificante de los polipeptidos divulgados aqrn se define como el porcentaje de residuos de nucleotidos en la secuencia candidata que son identicos con los nucleotidos en el polinucleotido espedficamente divulgado aqrn.
La alineacion puede incluir la introduccion de brechas en las secuencias que se van a alinear. Ademas, para las secuencias que contienen mas o menos aminoacidos que los polipeptidos espedficamente divulgados aqrn, se entiende que en un aspecto, el porcentaje de identidad de secuencia se determinara en base al numero de aminoacidos identicos en relacion con el numero total de aminoacidos. Por lo tanto, por ejemplo, la identidad de secuencia de secuencias mas cortas que una secuencia espedficamente divulgada aqrn, se determinara usando el numero de aminoacidos en la secuencia mas corta, en un aspecto. En porcentajes de calculo de identidad, el peso relativo no esta asignado a diversas manifestaciones de variacion de secuencia, tales como inserciones, eliminaciones, sustituciones, etc.
En un aspecto, solo las identidades se califican positivamente (+1) y todas las formas de variacion de secuencia que incluyen las brechas se asignan un valor de "0", lo que evita la necesidad de una escala o parametros ponderados como se describe a continuacion para los calculos de similitud de secuencia. El porcentaje de identidad de secuencia se puede calcular, por ejemplo, dividiendo el numero de residuos identicos coincidentes por el numero total de residuos de la secuencia "mas corta" en la region alineada y multiplicando por 100. La secuencia "mas larga" es la que tiene mas residuos reales en la region alineada.
Los expertos en la tecnica apreciaran que los polinucleotidos aislados que codifican los polipeptidos de la divulgacion se asociaran tipicamente con secuencias de control de expresion apropiadas, por ejemplo, senales de control de transcripcion/traduccion y senales de poliadenilacion.
Se apreciara ademas que puede usarse una variedad de elementos promotores/potenciadores dependiendo del nivel y de la expresion espedfica del tejido deseada. El promotor puede ser constitutivo o inducible, dependiendo del patron de expresion deseado. El promotor puede ser nativo o extrano y puede ser una secuencia natural o una secuencia sintetica. Por extranos, se entiende que la region de iniciacion transcripcional no se encuentra en el huesped de tipo silvestre en el que se introduce la region de iniciacion transcripcional. El promotor se escoge de manera que funcione en las celulas de interes.
Para ilustrar, la secuencia codificadora del polipeptido puede estar operativamente asociada con un promotor inmediato-temprano principal de citomegalovirus (CMV), un promotor de la albumina, un promotor del Factor de
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Elongacion 1-a (EF1-a), un promotor PyK, un promotor MFG o un promotor MFG, o un promotor del virus del sarcoma de Rous.
Los elementos promotores/potenciadores inducibles incluyen elementos inducibles por hormonas e inducibles por metal, y otros promotores regulados por compuestos suministrados exogenamente, incluyendo, sin limitacion, el promotor metalotionema (MT) inducible por cinc; el promotor del virus del tumor mamario de raton inducible de dexametasona (Dex) (MMTV); el sistema promotor de polimerasa T7 (vease el documento WO 98/10088); el promotor de insecto ecdisoma (No et al., Proc. Nat. Acad Sci. USA 93: 3346 (1996)); el sistema represor de la tetraciclina (Gossen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 5547 (1992)); el sistema inducible por tetraciclina (Gossen et al., Science 268: 1766 (1995), vease tambien Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 512 (1998)); el sistema inducible por RU486 (Wang et al., Nat. Biotech., 15: 239 (1997), Wang et al., Gene Ther., 4: 432 (1997)); y el sistema inducible por rapamicina (Magari et al., J. Clin. Invest. 100: 2865 (1997)).
Otros promotores espedficos del tejido o o promotores reguladores incluyen, pero no se limitan a, promotores que tfpicamente confieren especificidad tisular en las celulas endoteliales. Estos incluyen, pero no se limitan a, promotores para VE-caderina, PPE-1, PPE-1-3x, TIE-I, TIE-2, Endoglin, von Willebrand, KDR/flk-1, FLT-1, 1, ICAM-I, ICAM-2, VCAM-1, PECAM-I, y protema similar a la carboxipeptidasa aortica (ACLP).
Ademas, generalmente se requieren senales de iniciacion espedficas para la traduccion eficaz de las secuencias de codificacion de polipeptidos insertados. Estas secuencias de control de traduccion, que pueden incluir el codon de iniciacion ATG y secuencias adyacentes, pueden ser de una variedad de ongenes, tanto naturales como sinteticos.
La presente divulgacion provee ademas celulas que comprenden los polinucleotidos y polipeptidos aislados de la divulgacion. La celula puede ser una celula cultivada o una celula in vivo, por ejemplo, para uso en metodos terapeuticos, metodos de diagnostico, metodos de cribado, metodos para estudiar la accion biologica de los polipeptidos listados en la Tabla 1, en metodos de produccion de los polipeptidos o en metodos de mantenimiento o amplificacion de los polinucleotidos de la invencion, etc. En otro aspecto, la celula es una celula ex vivo que ha sido aislada de un sujeto. La celula ex vivo puede modificarse y luego reintroducirse en el sujeto con fines diagnosticos o terapeuticos.
En aspectos particulares, la celula es una celula endotelial no transformada o una celula de una lmea celular endotelial. Las celulas endoteliales y las lmeas celulares incluyen, sin limitacion, HUVEC, HCEC, HGEC, HMEC-1, HUV-ST, ECY304, ECV304 y EA.hy926. En otras realizaciones, la celula es un pericito u otro tipo celular asociado con vasos sangumeos.
El polinucleotido aislado puede incorporarse en un vector de expresion. Los vectores de expresion compatibles con diversas celulas huesped son bien conocidos en la tecnica y contienen elementos adecuados para la transcripcion y traduccion de acidos nucleicos. Tfpicamente, un vector de expresion contiene un "casete de expresion", que incluye, en la direccion 5 'a 3', un promotor, una secuencia codificante que codifica un polipeptido listado en la Tabla 1 o un fragmento funcional del mismo asociado operativamente con el promotor y opcionalmente, una secuencia de terminacion que incluye una senal de parada para ARN polimerasa y una senal de poliadenilacion para poliadenilasa.
Ejemplos no limitantes de promotores de esta divulgacion incluyen promotores de CYC1, HIS3, GAL1, GAL4, GAL10, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TP1 y fosfatasa alcalina (utiles para la expresion en Saccharomyces ); Promotor AOX1 (util para la expresion en Pichia); Promotores de p-lactamasa, lac, ara, tet, trp, IPl, IPr, T7, tac y trc (utiles para la expresion en Escherichia coli); patogenesis regulada por la luz, espedfica de la semilla, espedfica del polen, espedfica del ovario o promotores relaionados con la enfermedad, virus del mosaico de la coliflor 35S, CMV 35S mmimo, virus de mosaico de la vena del cassaya (CsVMV), protema de union a la clorofila a/b, ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa, promotores espedficos de brotes, promotores espedficos de la rafz, quitinasa, promotores inducibles por estres, virus tungro bacilliforme de arroz, superpromotor de plantas, aminopeptidasa de leucina de patata, nitrato reductasa, manopin sintasa, nopalina sintasa, ubiquitina, protema zema promotores de antocianina (utiles para la expresion en celulas vegetales).
Ejemplos adicionales de promotores animales y de mairnferos conocidos en la tecnica incluyen, pero no se limitan a, la region promotora temprana de SV40 (SV40e), el promotor contenido en la repeticion terminal larga (LTR) de 3' del virus del sarcoma de Rous (RSV), los promotores de los genes E1A o promotor tardfo principal (MLP) de adenovirus (Ad), promotor temprano de citomegalovirus (CMV), el virus de herpes simple, promotor de timidina quinasa (TK), promotor IE1 de baculovirus, promotor del factor de elongacion 1 alfa (EF1), promotor de fosfoglicerato quinasa
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(PGK) promotor de la ubiquitina (Ubc), un promotor de la albumina, las secuencias reguladoras del promotor de la metalotionema-L de raton y las regiones de control transcripcional, los promotores ubicuos (HPRT, vimentina, a- actina, tubulina y similares), los promotores de los filamentos intermedios (desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP y similares), los promotores de genes terapeuticos (del tipo MDR, CFTR o de factor VIII, y similares), patogenesis y/o promotores relacionados con la enfermedad y promotores que exhiben especificidad tisular, tal como la region de control del gen de la elastasa I, que es activa en celulas acinares pancreaticas; la region de control del gen de la insulina activa en las celulas beta pancreaticas, la region de control del gen de la inmunoglobulina activa en celulas linfoides, la region de control del virus del tumor mamario de raton activa en celulas testiculares, mamarias, linfoides y de mastocitos; el promotor del gen de la albumina, las regiones de control Apo AI y Apo All activas en el fugado, la region de control del gen alfa-fetoproteina activa en el fugado, la region de control del gen alfa 1 -antitripsina activa en el fugado, la region de control del gen beta-globina en las celulas mieloides, la region de control del gen de la protema basica de la mielina activa en las celulas oligodendrodticas en el cerebro, la region de control del gen 2 de la cadena ligera de la miosina activa en el musculo esqueletico y la region de control del gen de la hormona liberadora gonadotropica activa en el hipotalamo, el promotor de la piruvato quinasa, el promotor de la vilina, el promotor de la protema intestinal enlazada a los acidos grasos, el promotor de la a-actina de las celulas del musculo liso, y similares. Ademas, cualquiera de estas secuencias de expresion de esta invencion puede modificarse por adicion de secuencias potenciadoras y/o reguladoras y similares.
Los potenciadores que pueden usarse en aspectos de la divulgacion incluyen, pero no se limitan a: un potenciador de SV40, un potenciador de citomegalovirus (CMV), un potenciador de factor de elongacion I (EF1), potenciadores de levaduras, potenciadores de genes virales y similares.
Las regiones de control de terminacion, es decir, secuencias de terminacion o poliadenilacion, pueden derivarse de diversos genes nativos de los huespedes preferidos. En algunos aspectos de la invencion, la region de control de terminacion puede comprender o derivarse de una secuencia sintetica, una senal de poliadenilacion sintetica, una senal de poliadenilacion tardfa de SV40, una senal de poliadenilacion de SV40, una senal de poliadenilacion de hormona de crecimiento bovina (BGH), secuencias terminatorias virales,o similares.
Sera evidente para los expertos en la tecnica que cualquier vector adecuado puede usarse para suministrar el polinucleotido a una celula o sujeto. El vector puede suministrarse a las celulas in vivo. En otros aspectos, el vector puede suministrarse a celulas ex vivo, y luego las celulas que contienen el vector se suministran al sujeto. La seleccion del vector de suministro puede hacerse basandose en un numero de factores conocidos en la tecnica, incluyendo la edad y las especies del huesped objetivo, el suministro in vitro versus in vivo, el nivel y la persistencia de la expresion deseada, el proposito pretendido (por ejemplo, para terapia o cribado), la celula u organo objetivo, la ruta de suministro, el tamano del polinucleotido aislado, las preocupaciones de seguridad y similares.
Los vectores adecuados incluyen vectores de plasmidos, vectores vmicos (por ejemplo, retrovirus, alfavirus, virus de la vacuna, adenovirus, virus adenoasociado y otros parvovirus, lentivirus, poxvirus o virus herpes simplex), vectores lipfdicos, vectores poliesilina, vectores polimericos poliamino sinteticos, y similares.
Cualquier vector viral que se conoce en la tecnica puede usarse en la presente divulgacion. Los protocolos para producir vectores virales recombinantes y para el uso de vectores virales para el suministro de acido nucleico pueden encontrarse en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York) y otros manuales de laboratorio estandar (por ejemplo, Vectors for Gene Therapy. In: Current Protocols in Human Genetics. John Wiley and Sons, Inc.: 1997).
Tambien se pueden emplear metodos de transferencia no virales. Muchos metodos no virales de transferencia de acido nucleico se basan en mecanismos normales utilizados por celulas de mairnfero para la captacion y transporte intracelular de macromoleculas. En aspectos particulares, los sistemas de suministro de acido nucleico no virales se basan en vfas endodticas para la captacion de la molecula de acido nucleico por la celula objetivo. Los sistemas de ejemplo de suministro de acido nucleico de este tipo incluyen sistemas derivados de liposomas, conjugados de poli- lisina y envolturas vmcas artificiales.
En aspectos particulares, se usan vectores plasmfdicos en la practica de la presente invencion. Por ejemplo, los plasmidos lampinos se pueden introducir en las celulas musculares mediante inyeccion en el tejido. La expresion puede prolongarse durante muchos meses, aunque el numero de celulas positivas es tfpicamente bajo (Wolff et al., Science 247: 247 (1989)). Se ha demostrado que los lfpidos cationicos ayudan en la introduccion de acidos nucleicos en algunas celulas en cultivo (Felgner and Ringold, Nature 337: 387 (1989)). Se ha demostrado que la
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inyeccion de complejos de ADN de plasmido lip^dico cationico en la circulacion de ratones da como resultado la expresion del ADN en el pulmon (Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298: 278 (1989)). Una ventaja del ADN del plasmido es que puede introducirse en celulas que no se replican.
En un aspecto representativo, una molecula de acido nucleico (por ejemplo, un plasmido) puede ser atrapada en una partmula lipfdica que porta cargas positivas sobre su superficie y, opcionalmente, marcada con anticuerpos contra antigenos de superficie celular del tejido objetivo (Mizuno et al., No Shinkei Geka 20: 547 (1992), publicacion PCT WO 91/06309, solicitud de patente japonesa 1047381 y publicacion de patente europea EP-A-43075).
Los liposomas que consisten en moleculas cationicas anfifflicas son utiles como vectores no vmcos para el suministro de acido nucleico in vitro e in vivo (revisado en Crystal, Science 270: 404 (1995), Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291 (1995), Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382 (1994), Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647 (1994) y Gao et al., Gene Therapy 2: 710 (1995)). Se cree que los liposomas cargados positivamente se complejan con acidos nucleicos cargados negativamente a traves de interacciones electrostaticas para formar complejos de lfpido: acido nucleico. Los complejos lfpido: acido nucleico tienen varias ventajas como vectores de transferencia de acido nucleico. A diferencia de los vectores virales, los complejos de lfpido: acido nucleico pueden usarse para transferir casetes de expresion de tamano esencialmente ilimitado. Dado que los complejos carecen de protemas, pueden evocar menos respuestas inmunogenas e inflamatorias. Ademas, no pueden replicarse o recombinarse para formar un agente infeccioso y tienen baja frecuencia de integracion. Varias publicaciones han demostrado que los lfpidos cationicos anfifflicos pueden mediar el suministro de acido nucleico in vivo e in vitro (Felgner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 7413 (1987), Loeffler et al., Meth. Enzymol 217: 599 (1993), Felgner et al., J. Biol. Chem. 269: 2550 (1994)).
Varios grupos han informado del uso de complejos de lfpidos cationicos anfifflicos:acidos nucleicos para la transfeccion in vivo tanto en animales como en humanos (revisados en Gao et al., Gene Therapy 2: 710 (1995), Zhu et al., Science 261: 209 (1993) y Thierry et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92: 9742 (1995)). La patente de Estados Unidos No. 6,410,049 describe un metodo para preparar complejos de lfpidos cationicos: acidos nucleicos que tienen una vida util prolongada.
Los vectores de expresion pueden disenarse para la expresion de polipeptidos en celulas procarioticas o eucariotas. Por ejemplo, los polipeptidos pueden expresarse en celulas bacterianas tales como E. coli, celulas de insecto (por ejemplo, el sistema de expresion de baculovirus), celulas de levadura, celulas vegetales o celulas de mairnfero. Algunas celulas huesped adecuadas se discuten adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990). Ejemplos de vectores bacterianos incluyen pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); Ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, y pRIT5 (Pharmacia). Ejemplos de vectores para la expresion en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari y col., EMBO J. 6: 229 (1987)), pMFa (Kurjan y Herskowitz, Cell 30: 933 (1982)), pJRY88 (Schultz et al, Gene 54: 113 (1987)), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Los vectores de baculovirus disponibles para la expresion de acidos nucleicos para producir protemas en celulas de insecto cultivadas (por ejemplo, celulas Sf9) incluyen la serie pAc (Smith et al., Mol. Cell. Biol. 3: 2156 (1983)) y la serie pVL Lucklow y Summers Virology 170: 31 (1989)).
Ejemplos de vectores de expresion de marnfferos incluyen pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, PBPV, pMSG, PSVL (Pharmacia), pCDM8 (Seed, Nature 329: 840 (1987)) y pMT2PC (Kaufman et al. J. 6: 187 (1987)). Cuando se usan en celulas de mamffero, las funciones de control del vector de expresion son frecuentemente provistas por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores comunmente usados se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus de Simio 40.
Los vectores virales se han usado en una amplia variedad de aplicaciones de suministro genica en celulas, asf como en sujetos animales vivos. Los vectores vmcos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, virus retrovirus, lentivirus, virus adeno-asociados, poxvirus, alfavirus, baculovirus, virus vaccinia, virus herpes, virus Epstein-Barr, adenovirus, geminivirus y vectores caulimovirus. Los vectores no vmcos incluyen plasmidos, liposomas, lfpidos cargados electricamente (citofectinas), complejos de protemas de acidos nucleicos y biopolfmeros. Ademas de un acido nucleico de interes, un vector puede comprender tambien una o mas regiones reguladoras y/o marcadores seleccionables utiles para seleccionar, medir y monitorizar los resultados de transferencia de acidos nucleicos (suministro a tejidos espedficos, duracion de la expresion, etc.).
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Ademas de las secuencias de control reguladoras discutidas anteriormente, el vector de expresion recombinante puede contener secuencias de nucleotidos adicionales. Por ejemplo, el vector de expresion recombinante puede codificar un gen marcador seleccionable para identificar celulas huesped que tienen incorporado el vector.
El ADN vector puede introducirse en celulas procarioticas o eucariotas a traves de tecnicas convencionales de transformacion o transfeccion. Los terminos "transformacion" y "transfeccion" se refieren a una variedad de tecnicas reconocidas en el arte para introducir acidos nucleicos extranos (por ejemplo, ADN y ARN) en una celula huesped, incluyendo fosfato de calcio o coprecipitacion de cloruro de calcio, transfeccion mediada por dextrano-DEAE, lipofeccion, electroporacion, microinyeccion, liposomas cargados de ADN, complejos de lipofectamina-ADN, sonicacion celular, bombardeo de genes utilizando microproyectiles de alta velocidad y transfeccion mediada por virus. Metodos adecuados para transformar o transfectar celulas huesped pueden encontrarse en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989), y otros manuales de laboratorio.
Si se desea una integracion estable, frecuentemente solo una pequena fraccion de celulas (en particular, celulas de mairnfero) integran el ADN extrano en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar integrantes, un acido nucleico que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibioticos) se puede introducir en las celulas huesped junto con el acido nucleico de interes. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a farmacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Los acidos nucleicos que codifican un marcador seleccionable pueden introducirse en una celula huesped en el mismo vector que el que comprende el acido nucleico de interes o pueden introducirse en un vector separado. Las celulas transfectadas de forma estable con el acido nucleico introducido pueden identificarse mediante seleccion de farmacos (por ejemplo, las celulas que han incorporado el gen marcador seleccionable sobreviviran, mientras que las otras celulas moriran).
Los polipeptidos y fragmentos de la invencion pueden modificarse para su uso in vivo mediante la adicion, en los extremos de los terminales amino- y/o carboxilo, de un agente bloqueante para facilitar la supervivencia del polipeptido relevante in vivo. Esto puede ser util en aquellas situaciones en las que los peptidos terminales tienden a ser degradados por proteasas antes de la captacion celular. Tales agentes bloqueantes pueden incluir, sin limitacion, secuencias peptfdicas adicionales relacionadas o no relacionadas que se pueden unir a los residuos amino y/o carboxilo terminales del peptido a administrar. Esto puede hacerse qmmicamente durante la smtesis del peptido o mediante tecnologfa de ADN recombinante por metodos conocidos para artesanos de exoeiencia promedio. Alternativamente, los agentes bloqueantes tales como el acido piroglutamico u otras moleculas conocidas en la tecnica se pueden unir a los residuos amino y/o carboxilo terminales o el grupo amino en el extremo amino o grupo carboxilo en el extremo carboxilo puede reemplazarse con una unidad estructural diferente. Del mismo modo, los peptidos pueden estar covalentemente o no covalentemente acoplados a protemas "portadoras" farmaceuticamente aceptables antes de la administracion.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a homologos de los polipeptidos de la invencion que son compuestos peptidomimeticos que se disenan basandose en las secuencias de aminoacidos de los fragmentos polipeptfdicos funcionales. Los compuestos peptidomimeticos son compuestos sinteticos que tienen una conformacion tridimensional (es decir, un "motivo peptfdico") que es sustancialmente igual que la conformacion tridimensional de un peptido seleccionado.El motivo peptfdico provee el compuesto peptidomimetico con la capacidad de potenciar la angiogenesis de una manera cualitativamente identica a la del fragmento funcional del que se derivo el peptidomimetico. Los compuestos peptidomimeticos pueden tener caractensticas adicionales que potgencian su utilidad terapeutica, tales como una permeabilidad celular aumentada y una vida media biologica prolongada.
Los peptidomimeticos tienen tfpicamente un esqueleto principal que es parcial o totalmente no peptido, pero con grupos laterales que son identicos a los grupos laterales de los residuos de aminoacidos que se producen en el peptido en el que se basa el peptidomimetico. Se conocen en la tecnica varios tipos de enlaces qmmicos, por ejemplo, ester, tioester, tioamida, retroamida, enlaces reducidos de carbono A, dimetileno y cetometileno, para ser sustituos generalmente utiles para enlaces peptfdicos en la construccion de peptidomimeticos resistentes a las proteasas.
En un aspecto, los polinucleotidos, polipeptidos, u homologos de los mismos de la divulgacion se administran directamente al sujeto. Generalmente, los compuestos de la invencion se suspenderan en un vehfculo farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, solucion salina fisiologica) y se administraran por via oral o por infusion intravenosa o se inyectaran por via subcutanea, intramuscular, intratecal, intraperitoneal, intrarrectal, intravaginal, intranasal, intragastrica, o intrapulmonarmente. Se suministran preferiblemente directamente al sitio de la enfermedad o trastorno, tales como celulas tumorales, por ejemplo, a un tumor o un lecho tumoral despues de la
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extirpacion quirurgica del tumor, con el fin de eliminar cualquier celula tumoral restante. La dosificacion requerida depende de la eleccion de la v^a de administracion; la naturaleza de la formulacion; la naturaleza de la enfermedad del paciente; el tamano, el peso, el area de la superficie, la edad y el sexo del sujeto; otros farmacos que se administran; y el juicio del medico que lo atiende. Las dosificaciones adecuadas estan en el rango de 0,01-100,0 |jg/kg. Se esperan amplias variaciones en la dosificacion necesaria en vista de la variedad de polipeptidos y fragmentos disponibles y de las diferentes efivciencias de diversas rutas de administracion. Por ejemplo, se espera que la administracion oral requiera dosificaciones mas altas que la administracion por inyeccion i.v. Las variaciones en estos niveles de dosificacion se pueden ajustar usando rutinas empmcas estandar para la optimizacion como se entiende bien en la tecnica. Las administraciones pueden ser simples o multiples (por ejemplo, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 20, 50, 100, 150 o mas veces). La encapsulacion del polipeptido en un vehmulo de administracion adecuado (por ejemplo, micropartfculas polimericas o dispositivos implantables) puede aumentar la eficacia del suministro, particularmente para administracion oral.
De acuerdo con ciertos aspectos, los polinucleotidos o vectores pueden direccionarse a celulas o tejidos espedficos in vivo. Se conocen en la tecnica vehmulos de suministro dirigidos, incluyendo liposomas y sistemas de vectores virales. Por ejemplo, un liposoma puede dirigirse a una celula o tejido objetivo particular usando un agente de direccionamiento, tal como un anticuerpo, receptor soluble o ligando, incorporado con el liposoma, para direcciona a una celula o tejido particular al que la molecula de direccionamiento puede unirse. Los liposomas de direccionamiento se describen, por ejemplo, en Ho et al., Biochemistry 25: 5500 (1986); Ho et al., J. Biol. Chem. 262: 13979 (1987); Ho et al., J. Biol. Chem. 262: 13973 (1987); y Pat. 4.957.735 de Huang et al.). Los vectores virales envueltos pueden modificarse para suministrar una molecula de acido nucleico a una celula objetivo mediante la modificacion o sustitucion de una protema de envoltura de tal manera que el virus infecte un tipo celular espedfico. En vectores adenovirales, el gen que codifica las fibras de union se puede modificar para codificar un dominio de protema que se une a un receptor espedfico de celula. Los vectores del herpesvirus se dirigen naturalmente a las celulas del sistema nervioso central y periferico. Alternativamente, la ruta de administracion puede usarse para dirigirse a una celula o tejido espedfico. Por ejemplo, se ha demostrado que la administracion intracoronaria de un vector adenoviral es efectivo para el suministro de un gen de miocitos cardiacos (Maurice et al., J. Clin. Invest. 104: 21 (1999)). Se ha demostrado que la administracion intravenosa de liposomas cationicos que contienen colesterol se dirige preferentemente a tejidos pulmonares (Liu et al., Nature Biotechnol., 15: 167 (1997)), y media efectivamente la transferencia y expresion de genes in vivo. En la tecnica se conocen otros ejemplos de administracion exitosa in vivo de moleculas de acido nucleico. Finalmente, una molecula de acido nucleico recombinante puede ser expresada selectivamente (es decir, preferencialmente, sustancialmente exclusivamente) en una celula objetivo seleccionando una secuencia de control de transcripcion, y preferiblemente un promotor, que se induce selectivamente en la celula objetivo y permanece sustancialmente inactivo en celulas no objetivo.
V. Diagnostico y monitorizacion de enfermedades relacionadas con la angiogenesis
La identificacion de polinucleotidos y polipeptidos que son sobrerregulados en vasos sangumeos tumorales provee objetivos para ser utilizados para la deteccion de angiogenesis y diagnostico de enfermedades y trastornos relacionados con la angiogenesis.
Un aspecto de la divulgacion se refiere a metodos para detectar angiogenesis en un tejido de un sujeto, que comprende obtener una muestra del tejido y determinar la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en la muestra, en donde un incremento en expresion y/o actividad relativa al nivel de expresion y/o actividad en una muestra de control es indicativa de angiogenesis. En una realizacion, el tejido es tejido enfermo tal como tejido de cancer, por ejemplo, tejido de cancer de mama. En otro aspecto, el tejido no es tejido enfermo.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a metodos para diagnosticar cancer en un sujeto, que comprende obtener una muestra de tejido del sujeto y determinar la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en la muestra, en donde un incremento en la expresion y/o actividad relativa al nivel de expresion y/o actividad en una muestra de control es indicativa de cancer.
Un aspecto adicional de la divulgacion se refiere a metodos para determinar el potencial de angiogenesis de un tejido en un sujeto, que comprende obtener una muestra del tejido del sujeto y determinar la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en donde un incremento en la expresion y/o actividad en relacion con el nivel de expresion y/o actividad en una muestra de control es indicativo de un potencial de angiogenesis incrementado de dicho tejido.
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Otro aspecto de la divulgacion se refiere a metodos para determinar el potencial metastasico de un cancer en un sujeto, que comprende obtener una muestra de tejido del cancer del sujeto y determinar la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en la muestra, en donde un incremento en la expresion y/o actividad en relacion con el nivel de expresion y/o actividad en una muestra de control es indicativo de un potencial metastasico incrementado de dicho cancer.
En cada uno de estos aspectos, se puede determinar la expresion y/o actividad de mas de un polipeptido listado en la Tabla 1, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 o mas polipeptidos. En un aspecto, dichos uno o mas polipeptidos se seleccionan del grupo que consiste de SFRP2, JAK3 y FAP, o combinaciones de los mismos. En otro aspecto, el uno o mas polipeptidos no incluye SFRP2. En otro aspecto, el uno o mas polipeptidos no incluye JAK3. En otro aspecto, el uno o mas polipeptidos no incluye FAP. La muestra de tejido puede ser obtenida por cualquier metodo conocido en la tecnica, tal como cirugfa, biopsia, lavado, aspiracion, etc. La muestra puede ser un fluido corporal, por ejemplo, sangre, suero, plasma, saliva, orina, lfquido cefalorraqmdeo, transpiracion, etc. La muestra de control puede ser de una porcion normal (es decir, no enferma) del mismo tipo de tejido o celula en el sujeto, de un tipo de tejido o celula diferente en el sujeto, de un individuo emparejado, o puede ser un estandar derivado del promedio de mediciones tomadas de una poblacion de sujetos. En un aspecto, la muestra de tejido es vasos sangumeos aislados o celulas endoteliales aisladas. Los vasos sangumeos pueden aislarse por cualquier medio conocido en la tecnica y como se describe aqrn. Las celulas endoteliales se pueden aislar por cualquier medio conocido en la tecnica, por ejemplo, clasificacion celular, inmunoprecipitacion, etc.
En un aspecto, el sujeto tiene cancer, por ejemplo, cancer de mama.
En un aspecto, la determinacion de la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 comprende determinar el nivel de un acido nucleico que codifica dicho uno o mas polipeptidos. La determinacion del nivel de un acido nucleico puede llevarse a cabo por cualquier medio conocido en la tecnica y como se describe aqrn, tal como inmunoprecipitacion Northern, inmunoprecipitacion de manchas, PCR, RTPCR, PCR cuantitativa, analisis de secuencias, analisis de microarreglos de genes, hibridacion in situ y deteccion de un gen informador. Los ensayos para la expresion y/o actividad se pueden llevar a cabo automatica o parcialmente de manera automatica en una maquina o aparato disenado para realizar tales ensayos, por ejemplo, usando metodos asistidos por ordenador. Los resultados de los ensayos pueden almacenarse en una base de datos informatica y analizarse para producir resultados de diagnostico. En algunos aspectos, los datos de diagnostico se pueden analizar, por ejemplo, comparando los resultados intra-pacientes en el tiempo o antes y despues del tratamiento o comparando los resultados inter-pacientes para determinar valores basales y/o anormales en una poblacion.
En otro aspecto, la determinacion de la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 comprende determinar el nivel de dichos uno o mas polipeptidos. La determinacion del nivel de un polipeptido puede llevarse a cabo por cualquier medio conocido en la tecnica y como se describe aqrn, tales como inmunotransferencias Western, inmunotransferencias, inmunoprecipitacion, inmunohistoqmmica,
inmunofluorescencia, ensayos inmunosorbentes enlazados a enzimas y radioinmunoensayos.
En otro aspecto, la determinacion de la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 comprende determinar la actividad de dichos uno o mas polipeptidos. La actividad puede ser cualquier actividad asociada con el polipeptido, incluyendo, sin limitacion, actividad angiogenica, actividad enzimatica, interaccion proteica, enlazamiento al receptor, enlazamiento al ligando, induccion de un factor de crecimiento, un evento de transduccion de senales celulares, etc.
La divulgacion tambien se refiere a metodos para distinguir entre subtipos de cancer de mama, que comprende obtener una muestra de cancer de mama de un sujeto, determinar la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en la muestra y determinar el subtipo de cancer basado en el patron de expresion y/o actividad. En un aspecto, el metodo se utiliza para distinguir entre los canceres de mama ER negativos y ER positivos. En otro aspecto, el metodo se utiliza para distinguir entre los subtipos basales, Her2/neu y luminal.
La divulgacion se refiere ademas a metodos para distinguir entre canceres de mama in situ e invasivos, que comprende obtener una muestra de cancer de mama de un sujeto, determinar la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en la muestra y determinar el tipo de cancer basado en el patron de expresion y/o actividad.
Un aspecto de la divulgacion se refiere al uso de los marcadores identificados de angiogenesis para monitorizar la regulacion de la angiogenesis debido a enfermedad o tratamiento de la enfermedad. En un aspecto, la divulgacion
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se refiere a metodos para monitorizar la efectividad de un tratamiento para cancer en un sujeto, que comprende obtener una muestra de un sujeto que ha recibido tratamiento para cancer, determinar la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos enumerados en Tabla 1 en la muestra, y comparar el nivel de expresion y/o actividad con el nivel de expresion y/o actividad en una muestra de control, en donde una disminucion en el nivel de expresion y/o actividad en la muestra con respecto a la muestra de control es indicativo de la efectividad del tratamiento.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a metodos para controlar la progresion del cancer en un sujeto, que comprende obtener una muestra de un sujeto que tiene cancer, determinar la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en la muestra, y comparar el nivel de expresion y/o actividad con el nivel de expresion y/o actividad en una muestra de control, en donde un incremento en el nivel de expresion y/o actividad en la muestra con respecto a la muestra de control es indicativo de la progresion del cancer .
La muestra de control puede ser de una porcion normal (es decir, no enferma) del mismo tipo de tejido o celula en el sujeto, de un tipo de tejido o celula diferente en el sujeto, de un individuo emparejado o puede ser un estandar derivado del promedio de mediciones tomadas de una poblacion de sujetos. En otro aspecto, la muestra de control puede ser del tejido de la enfermedad del sujeto, por ejemplo, en el momento del diagnostico, antes del tratamiento
0 despues de una etapa de tratamiento.
En cada uno de estos aspectos, se puede determinar un nivel basal de expresion y/o actividad sobre el diagnostico inicial de cancer o antes del primer tratamiento. Despues de establecer una lmea base, la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos se pueden determinar repetidamente, por ejemplo, en un horario regular (por ejemplo, una vez cada 2, 3, 4, 5 o 6 dfas, 1, 2, 3 o 4 semanas, o mas) o segun se desee (por ejemplo, despues de cada tratamiento terapeutico). La expresion y/o la actividad se pueden determinar como se ha descrito anteriormente, y pueden estar en el nivel de acido nucleico o polipeptido. La informacion obtenida de la monitorizacion puede usarse para modificar el tratamiento que recibe el sujeto.
Un aspecto de la divulgacion se refiere a kits utiles para llevar a cabo los metodos de la invencion. Un aspecto se refiere a kits para evaluar la angiogenesis, que comprende un reactivo para determinar la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1. Otra realizacion se refiere a kits para diagnosticar cancer, que comprende un reactivo para determinar la expresion y/o la actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1. En cada realizacion, los kits pueden contener reactivos para determinar la expresion y/o la actividad de 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, o mas polipeptidos listados en la Tabla 1. Los reactivos pueden ser acidos nucleicos (por ejemplo, un oligonucleotido que se hibrida espedficamente con un acido nucleico que codifica un polipeptido listado en la Tabla
1 y puede usarse como sonda de hibridacion o un cebador de amplificacion), anticuerpos (por ejemplo uno que se une espedficamente a un polipeptido listado en la Tabla 1), u otros agentes que reconocen espedficamente los polinucleotidos o polipeptidos de la invencion.
Los reactivos pueden conjugarse con una etiqueta detectable o marcador detectable. Tal etiqueta puede ser cualquier etiqueta adecuada que permita la deteccion de los reactivos e incluye, pero no se limita a, cualquier composicion o marcador detectable por medios espectroscopicos, fotoqmmicos, bioqmmicos, inmunoqdmicos, electricos, opticos o qmmicos. Los marcadores utiles en la presente divulgacion incluyen biotina para tincion con conjugado de estreptavidina marcado, perlas magneticas (por ejemplo, Dynabeads™), colorantes fluorescentes (por ejemplo, fluorescema, rojo Texas, rodamina, protema fluorescente verde y similares), radiomarcadores (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C o 32P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina y otras comunmente usadas en un ELISA) y marcadores colorimetricos tales como oro coloidal o vidrio coloreado o perlas de plastico (por ejemplo poliestireno, polipropileno, latex, etc.).
Ademas, los reactivos pueden inmovilizarse sobre un sustrato. Tal sustrato puede incluir cualquier sustrato adecuado para la inmovilizacion de un reactivo de deteccion tal como se utilizana en cualquiera de los metodos de deteccion descritos anteriormente. En resumen, un sustrato adecuado para la inmovilizacion de un reactivo de deteccion incluye cualquier soporte solido, tal como cualquier soporte organico solido, biopolfmero o inorganico que pueda formar una union con el reactivo de deteccion sin afectar significativamente la actividad y/o capacidad del reactivo de deteccion para detectar la molecula objetivo deseada. Soportes solidos organicos de ejemplo incluyen polfmeros tales como poliestireno, nailon, resinas de fenol-formaldeddo, copolfmeros acnlicos (por ejemplo, poliacrilamida), celulas enteras intactas estabilizadas y homogeneizados de celulas enteras crudas estabilizadas /membranas. Soportes de biopolfmeros de ejemplo incluyen celulosa, polidextranos (por ejemplo, Sephadex®), agarosa, colageno y quitina. Soportes inorganicos de ejemplo incluyen perlas de vidrio (porosas y no porosas), acero inoxidable, oxidos metalicos (por ejemplo ceramicas porosas tales como ZrO2 TiO2 A^O3, y NiO) y arena.
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Los kits pueden comprender ademas otros componentes utiles para detectar expresion o actividad, por ejemplo, reguladores, celulas, medios de cultivo, enzimas, reactivos de marcaje, recipientes, etc.
En un aspecto, el kit comprende un arreglo de reactivos para determinar la expresion y/o la actividad. El arreglo puede comprender un sustrato que tiene una pluralidad de direcciones. Al menos una direccion de la pluralidad incluye una sonda de captura que se une espedficamente a un polinucleotido o polipeptido de la invencion. El arreglo puede comprender sondas de captura que corresponden a 5, 10, 15, 20, 25 o mas de los polipeptidos listados en la Tabla 1. El arreglo puede tener una densidad de al menos 10, 20, 50, 100, 200, 500, 700, 1.000, 2.000, 5.000 o 10.000 o mas direcciones/cm2, y vana entre. El sustrato puede ser un sustrato bidimensional tal como laminas de vidrio, una oblea (por ejemplo, de silica o plastico), una placa de espectroscopia de masas o un sustrato tridimensional tal como una almohadilla de gel. Las direcciones ademas de direcciones de la pluralidad pueden estar dispuestas en el arreglo.
En un aspecto, al menos una direccion de la pluralidad incluye una sonda de captura de acido nucleico que hibrida espedficamente con un polinucleotido de la divulgacion, por ejemplo, la cadena en sentido o antisentido. Cada direccion del subconjunto puede incluir una sonda de captura que hibrida con una region diferente de un polinucleotido. Un arreglo puede ser generado por cualquiera de una variedad de metodos. Metodos apropiados incluyen, por ejemplo, metodos fotolitograficos (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nos. 5,143,854; 5,510,270; y 5,527,681), metodos mecanicos (por ejemplo, procedimientos de flujo dirigido como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5,384,261) metodos basados en pasadores (por ejemplo, como se describen en la Patente de Estados Unidos No. 5,288,514), y tecnicas basadas en perlas (por ejemplo, como se describe en el documento WO 93/022684).
En otro aspecto, al menos una direccion de la pluralidad incluye una sonda de captura de polipeptido que se une espedficamente a un polipeptido de la invencion o fragmento del misma. La sonda de captura del polipeptido puede ser un asociado de interaccion de origen natural de un polipeptido listado en la Tabla 1, por ejemplo, en el que el polipeptido es un receptor o un receptor en el que el polipeptido es un ligando. En un aspecto, el polipeptido es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo espedfico para un polipeptido listado en la Tabla 1, tal como un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo monocatenario.
VI. Ensayos de deteccion y modelos animals
La identificacion de polinucleotidos y polipeptidos que son sobrerregulados en vasos sangumeos tumorales provee objetivos que pueden usarse para cribar agentes que regulan la angiogenesis asf como modelos para estudiar el proceso de angiogenesis in vitro o en animales.
Un aspecto de la divulgacion se refiere a metodos para identificar un compuesto que regula la angiogenesis, que comprende determinar la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en presencia y ausencia de un compuesto de ensayo y seleccionar un compuesto que incrementa o disminuye el nivel de expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos en relacion con el nivel en ausencia del compuesto, como un compuesto que regula la angiogenesis.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a metodos para identificar un compuesto util para la inhibicion del crecimiento tumoral o metastasis, que comprende determinar la expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos listados en la Tabla 1 en presencia y ausencia de un compuesto de prueba y seleccionar un compuesto que incrementa el nivel de expresion y/o actividad de uno o mas polipeptidos en relacion con el nivel en ausencia del compuesto, como un compuesto util para la inhibicion del crecimiento tumoral o metastasis.
En cada aspecto anterior, el ensayo puede ser un ensayo basado en celulas o sin celulas. En un aspecto, la celula puede ser una celula primaria, por ejemplo, una celula endotelial o una celula tumoral, tal como una celula de tumor de mama. En otro aspecto, la celula es de una lmea celular, por ejemplo, una lmea celular endotelial o una lmea celular tumoral. Las celulas endoteliales y las lmeas celulares incluyen, sin limitacion, HUVEC, HCEC, HGEC, HMEC-1, HUV-ST, ECY304, ECV304 y EA.hy926. La celula puede ponerse en contacto con el compuesto in vitro (por ejemplo, en un plato de cultivo) o en un animal (por ejemplo, un animal transgenico o un modelo animal). En un aspecto, el incremento o disminucion detectados en la expresion y/o actividad es estadfsticamente significativo, por ejemplo, al menos p < 0,05, por ejemplo, p < 0,01, 0,005 o 0,001. En otro aspecto, el incremento o disminucion detectado es al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o mas.
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Cualquier punto final deseado se puede detectar en un ensayo de cribado, por ejemplo, enlazamiento al polipeptido, gen o ARN, modulacion de la actividad del polipeptido, modulacion de rutas relacionadas con la angiogenesis y/o interferencia con el enlazamiento por un regulador conocido de un polinucleotido o polipeptido. Los metodos de deteccion de las actividades anteriores son conocidos en la tecnica e incluyen los metodos divulgados aqrn.
Cualquier compuesto de interes se puede cribar de acuerdo con la presente divulgacion. Compuestos de prueba adecuados incluyen moleculas organicas e inorganicas. Las moleculas organicas adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, moleculas pequenas (compuestos de menos de aproximadamente 1000 Daltons), polipeptidos (incluyendo enzimas, anticuerpos y fragmentos Fab'), carbohidratos, lfpidos, coenzimas y moleculas de acido nucleico (incluyendo ADN, y quimericos y analogos de los mismos) y nucleotidos y analogos de nucleotidos. En aspectos particulares, el compuesto es un acido nucleico antisentido, un ARNsi o una ribozima que inhibe la produccion de un polipeptido listado en la Tabla 1.
Ademas, los metodos de la divulgacion se pueden practicar para cribar una biblioteca de compuestos, por ejemplo, una biblioteca de moleculas pequenas, una biblioteca combinatoria de compuestos qmmicos, una biblioteca de polipeptidos, una biblioteca de ADNc, una biblioteca de acidos nucleicos antisentido y similares, o una coleccion dispuesta de compuestos tales como arreglos de polipeptidos y acido nucleico.
En un aspecto representativo, la divulgacion provee metodos de cribado de compuestos de prueba para identificar un compuesto de prueba que se une a un polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento funcional del mismo. Los compuestos que se identifican como que se enlazan al polipeptido o al fragmento funcional pueden someterse a cribado adicional (por ejemplo, para la modulacion de la angiogenesis) usando los metodos descritos aqrn u otras tecnicas adecuadas.
Tambien se proveen metodos de cribado de compuestos para identificar aquellos que modulan la actividad de un polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento funcional del mismo. El termino "modular" se refiere a compuestos que potencian (por ejemplo, incrementan) o inhiben (por ejemplo, reducen) la actividad del polipeptido (o fragmento funcional). Por ejemplo, se puede evaluar la interaccion del polipeptido o fragmento funcional con un asociado de enlazamiento. Como otra alternativa, los metodos ffsicos, tales como la RMN, pueden usarse para evaluar la funcion biologica. La actividad de los polipeptidos listados en la Tabla 1 o fragmento funcional se puede evaluar por cualquier metodo conocido en la tecnica, incluyendo los metodos descritos aqrn.
Los compuestos que se identifican como moduladores de la actividad pueden opcionalmente ser seleccionados adicionalmente usando los metodos descritos aqrn (por ejemplo, para el enlazamiento al polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento funcional del mismo, polinucleotido o ARN, modulacion de mineralizacion y similares). El compuesto puede interactuar directamente con el polipeptido o fragmento funcional, polinucleotido o mARN y, de este modo, modular su actividad. Alternativamente, el compuesto puede interactuar con cualquier otro polipeptido, acido nucleico u otra molecula, siempre que la interaccion de como resultado una modulacion de la actividad del polipeptido o fragmento funcional.
Como otro aspecto, la divulgacion provee un metodo para identificar compuestos que modulan la angiogenesis. En un aspecto representativo, el metodo comprende poner en contacto un polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento funcional del mismo con un compuesto de prueba; y detectar si el compuesto de prueba se enlza al polipeptido o fragmento funcional y/o modula la actividad del polipeptido (o fragmento). En otro aspecto de ejemplo, el metodo comprende introducir un compuesto de prueba en una celula que comprende el polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento funcional; y detectar si el compuesto se une al polipeptido o fragmento funcional y/o modula la actividad del polipeptido o fragmento funcional en la celula. El polipeptido puede producirse endogenamente en la celula. Alternativamente o adicionalmente, la celula puede ser modificada para comprender un polinucleotido aislado que codifica, y opcionalmente que sobreexpresa, el polipeptido o fragmento funcional del mismo.
El ensayo de cribado puede ser un ensayo basado en celulas o sin celulas. Ademas, el polipeptido listado en la Tabla 1 (o fragmento funcional del mismo) o polinucleotido puede estar libre en solucion, fijado a un soporte solido, expresado en una superficie celular o situado dentro de una celula.
Con respecto a los ensayos de enlazamiento libres de celulas, los compuestos de prueba pueden sintetizarse o fijarse de otro modo a un sustrato solido, tales como pasadores de plastico, laminas de vidrio, pozos de plastico y similares. Por ejemplo, los compuestos de prueba pueden inmovilizarse utilizando conjugacion de biotina y estreptavidina mediante tecnicas bien conocidas en el arte. Los compuestos de prueba se ponen en contacto con el polipeptido o su fragmento funcional y se lavan. El polipeptido enlazado puede detectarse usando tecnicas estandar
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en la tecnica (por ejemplo, mediante marcaje radioactivo o de fluorescencia del polipeptido o fragmento funcional, por metodos ELISA y similares).
Alternativamente, el objetivo puede inmovilizarse en un sustrato solido y los compuestos de prueba se ponen en contacto con el polipeptido enlazado o fragmento funcional del mismo. La identificacion de los compuestos de prueba que se enlazan y/o modulan el polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento funcional puede llevarse a cabo con tecnicas de rutina. Por ejemplo, los compuestos de prueba pueden inmovilizarse utilizando conjugacion de biotina y estreptavidina mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica. Como otro ejemplo ilustrativo, los anticuerpos reactivos con el polipeptido o fragmento funcional pueden unirse a los pozos de la placa, y el polipeptido atrapado en los pozos por conjugacion de anticuerpos. Las preparaciones de compuestos de prueba pueden incubarse en los pozos que presentan el polipeptido (o fragmento funcional) y la cantidad de complejo atrapado en el pozo puede cuantificarse.
En otro aspecto representativo, se puede proveer una protema de fusion que comprende un dominio que facilita el enlazamiento del polipeptido a una matriz. Por ejemplo, las protemas de fusion de glutation-S-transferasa pueden adsorberse sobre perlas de glutation sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulacion derivadas con glutation, que luego se combinan con lisados celulares (por ejemplo marcados con 35S) y el compuesto de prueba, y la mezcla se incuba bajo condiciones que conducen a la formacion de complejos (por ejemplo, en condiciones fisiologicas para sal y pH). Despues de la incubacion, las perlas se lavan para eliminar cualquier marcador no unido, y la matriz inmovilizada y radiomarcadora se detecta directamente, o en el sobrenadante despues de que los complejos estan disociados. Alternativamente, los complejos pueden disociarse de la matriz, separados por SDSPAGE, y el nivel de polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento funcional del mismo encontrado en la fraccion de perlas cuantificada a partir del gel usando tecnicas electroforeticas estandar.
Otra tecnica para el cribado de compuestos provee un cribado de alto rendimiento de compuestos que tienen afinidad de union adecuada al polipeptido de interes, tal como se describe en la solicitud PCT publicada WO84/03564. En este metodo, un gran numero de diferentes compuestos de prueba pequenos se sintetizan sobre un sustrato solido, tal como pasadores de plastico o alguna otra superficie. Los compuestos de prueba se hacen reaccionar con el polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento funcional del mismo y se lavan. El polipeptido unido se detecta entonces mediante metodos bien conocidos en la tecnica. El polipeptido purificado o un fragmento funcional tambien puede recubrirse directamente sobre placas para su uso en las tecnicas de deteccion de farmacos anteriormente mencionadas. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos no neutralizantes para capturar el peptido e inmovilizarlo sobre un soporte solido.
Con respecto a los ensayos basados en celulas, se puede utilizar cualquier celula adecuada, incluyendo bacterias, levaduras, celulas de insecto (por ejemplo, con un sistema de expresion de baculovirus), celulas aviares, celulas de mairnferos, o celulas vegetales. En aspectos de ejemplo, el ensayo se lleva a cabo en una lmea celular que expresa de forma natural el polinucleotido o produce el polipeptido, por ejemplo, celulas endoteliales o pericitos. Ademas, en otros aspectos, es deseable usar celulas no transformadas (por ejemplo, celulas primarias) ya que la transformacion puede alterar la funcion del polipeptido.
El ensayo de cribado puede usarse para detectar compuestos que se unen o modulan la actividad del polipeptido nativo listado en la Tabla 1 (por ejemplo, polipeptido que normalmente se produce por la celula). Alternativamente, la celula puede ser modificada para expresar (por ejemplo, sobreexpresar) un polipeptido recombinante o fragmento funcional del mismo. De acuerdo con esta realizacion, la celula puede transformarse transitoriamente o de forma estable con un polinucleotido que codifica el polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento funcional, pero preferiblemente se transforma de forma estable, por ejemplo, mediante integracion estable en el genoma del organismo o por expresion de un episoma mantenido de forma estable (por ejemplo, episomas derivados de Virus Epstein Barr). En otro aspecto, un polinucleotido que codifica una molecula informadora puede estar enlazado a un elemento regulador del polinucleotido que codifica un polipeptido listado en la Tabla 1 y utilizado para identificar compuestos que modulan la expresion del polipeptido.
En un ensayo basado en celulas, el compuesto que va a ser cribado puede interactuar directamente con el polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento funcional del mismo (es decir, unirse a el) y modular su actividad. Alternativamente, el compuesto puede ser uno que modula la actividad del polipeptido (o la actividad de un fragmento funcional) al nivel del acido nucleico. Para ilustrar, el compuesto puede modular la transcripcion del gen (o transgen), modular la acumulacion de mARN (por ejemplo, afectando la tasa de transcripcion y/o la rotacion del mARN), y/o modular la tasa y/o cantidad de traduccion del transcripto de mARN.
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Como un tipo adicional de ensayo de union a base de celulas, el polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento funcional del mismo puede usarse como una "protema cebo" en un ensayo de dos hnbridos o tres hnbridos (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5,283,317 , Zervos et al., Cell 72: 223 (1993), Madura et al., J. Biol. Chem. 268: 12046 (1993), Bartel et al., Biotechniques 14: 920 (1993), Iwabuchi et al. Oncogene 8: 1693 (1993) y la publicacion PCT WO94/10300), para identificar otros polipeptidos que se unen o interaction con el polipeptido de la invencion o fragmento funcional del mismo.
El sistema de dos hnbridos se basa en la naturaleza modular de la mayona de los factores de transcripcion, que consisten en dominios separables de union al ADN y de activacion. En resumen, el ensayo utiliza dos constructos de ADN diferentes. En un constructo, el polinucleotido que codifica el polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento funcional del mismo se fusiona con un acido nucleico que codifica el dominio de union al ADN de un factor de transcripcion conocido (por ejemplo, GAL-4). En el otro constructo, se fusiona una secuencia de ADN, opcionalmente a partir de una biblioteca de secuencias de ADN, que codifica una protema no identificada ("presa" o "muestra") a un acido nucleico que codifica el dominio de activacion del factor de transcripcion conocido. Si las protemas "cebo" y "presa" son capaces de interactuar in vivo, formando un complejo, los dominios de union al ADN y de activacion del factor de transcripcion se acercan a la proximidad. Esta proximidad permite la transcripcion de una secuencia informadora (por ejemplo, LacZ), que esta operativamente enlazada a un sitio regulador transcripcional sensible al factor de transcripcion. La expresion del informador puede ser detectada y las colonias celulares que contienen el factor de transcripcion funcional pueden aislarse y usarse para obtener el acido nucleico que codifica el polipeptido que exhibe union al polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento funcional.
Como otro ensayo basado en celulas, la divulgacion provee un metodo de seleccion de un compuesto para la modulacion de la angiogenesis. En aspectos particulares, la celula comprende un polinucleotido aislado que codifica el polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento funcional del mismo. De acuerdo con este aspecto, se prefiere que el polinucleotido aislado que codifica el polipeptido o fragmento funcional se incorpore de forma estable en la celula (es decir, mediante integracion estable en el genoma del organismo o por expresion a partir de un episoma mantenido de forma estable tal como episomas derivados del virus Epstein Barr).
Los ensayos de cribado tambien pueden llevarse a cabo in vivo en animales. Por lo tanto, como todavfa un aspecto adicional, la divulgacion provee un animal no humano transgenico que comprende un polinucleotido aislado que codifica un polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento funcional del mismo, que puede producirse de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica. El animal transgenico no humano puede ser de cualquier especie, incluyendo aves y mairnferos no humanos. De acuerdo con este aspecto de la divulgacion, los marnfferos no humanos adecuados incluyen ratones, ratas, conejos, cobayas, cabras, ovejas, cerdos y ganado vacuno. Los aviares apropiados incluyen pollos, patos, gansos, codornices, pavos, y faisanes.
El polinucleotido que codifica el polipeptido o fragmento funcional puede incorporarse de forma estable en celulas dentro del animal transgenico (tfpicamente, mediante integracion estable en el genoma o por constructos episomicos mantenidos de forma estable). No es necesario que cada celula contenga el transgen, y el animal pueda ser una quimera de celulas modificadas y no modificadas, siempre y cuando un numero suficiente de celulas comprendan y expresen el polinucleotido que codifica el polipeptido o fragmento funcional para que el animal sea util herramienta de seleccion.
Metodos de ejemplo de utilizacion de los animales transgenicos no humanos de la invencion para el cribado in vivo de compuestos que modulan la angiogenesis, el crecimiento tumoral, la metastasis y/o la actividad de un polipeptido listado en la Tabla 1 comprenden administrar un compuesto de prueba a un animal no humano transgenico (por ejemplo, un mamffero tal como un raton) que comprende un polinucleotido aislado que codifica un polipeptido listado en la Tabla 1 o un fragmento funcional del mismo incorporado de forma estable en el genoma y que detecta si el compuesto de ensayo modula la angiogenesis, el crecimiento tumoral, la metastasis y/ o la actividad del polipeptido (o la actividad de un fragmento funcional).
Se conoce en la tecnica como medir estas respuestas in vivo. Los enfoques ilustrativos incluyen la observacion de cambios que se pueden estudiar mediante examen macroscopico (por ejemplo, formacion de tubulos y vasos sangumeos), histopatologfa, marcadores celulares y actividad enzimatica.
En la tecnica se conocen metodos para producir animales transgenicos. Los constructos de ADN o ARN pueden introducirse en la lmea germinal de un ave o mamffero para hacer un animal transgenico. Por ejemplo, una o varias copias del constructo pueden incorporarse al genoma de un embrion mediante tecnicas transgenicas estandar.
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En un aspecto de ejemplo, se produce un animal transgenico no humano introduciendo un transgen en la lmea germinal del animal no humano. Los transgenes se pueden introducir en las celulas objetivo embrionarias en diversas etapas de desarrollo. Se utilizan diferentes metodos dependiendo de la etapa de desarrollo de la celula objetivo embrionaria. La lmea o lmeas espedficas de cualquier animal utilizado deben ser, si es posible, seleccionadas para una buena salud general, buenos rendimientos embrionarios, buena visibilidad pronuclear en el embrion y buena capacidad reproductora.
La introduccion del transgen en el embrion puede realizarse por cualquiera de una variedad de medios conocidos en la tecnica tales como microinyeccion, electroporacion, lipofeccion o un vector viral. Por ejemplo, el transgen puede introducirse en un mairnfero por microinyeccion del constructo en los pronucleos del ovulo de mamfferos fertilizados para hacer que una o mas copias del constructo sean retenidas en las celulas del (de los) mamifero (s) en desarrollo. Despues de la introduccion del constructo transgenico en el ovulo fertilizado, el ovulo puede incubarse in vitro durante cantidades variables de tiempo, o reimplantarse en el huesped sustituto, o ambos. Un metodo comun es incubar los embriones in vitro durante aproximadamente 1-7 dfas, dependiendo de la especie, y luego reimplantarlos en el huesped sustituto.
La progenie de los embriones transgenicamente manipulados puede ser probada para detectar la presencia del constructo mediante analisis por transferencia Southern de un segmento de tejido. Un embrion que tiene una o mas copias del constructo clonado exogeno integrado de forma estable en el genoma puede usarse para establecer una lmea animal transgenica permanente.
Los animales alterados transgenicamente pueden ser ensayados despues del nacimiento para la incorporacion del constructo en el genoma de la descendencia. Esto puede hacerse hibridando una sonda correspondiente a la secuencia polinucleotfdica que codifica el polipeptido o un segmento del mismo sobre el material cromosomico de la progenie. Aquellas progenies que se ha encontrado que contienen al menos una copia del constructo en su genoma se hacen madurar.
Tambien se conocen metodos de produccion de aves transgenicas en la tecnica, vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5,162,.215.
En aspectos particulares, para crear un modelo animal en el que se disminuye la actividad o expresion de un polipeptido listado en la Tabla 1, es deseable inactivar, reemplazar o anular el gen endogeno que codifica el polipeptido mediante recombinacion homologa con un transgen usando celulas madre de embrion. En este contexto, se entiende que un transgen se refiere a acido nucleico heterologo que al insertarse dentro o adyacente al gen da como resultado una disminucion o inactivacion de la expresion o la cantidad o actividad del polipeptido.
Una anulacion de un gen significa una alteracion en la secuencia de un gen que da como resultado una disminucion de la funcion del gen, preferiblemente de tal manera que la expresion del gen o la cantidad o actividad del polipeptido sea indetectable o insignificante. Las anulaciones tal como se usan aqrn incluyen tambien anulaciones condicionales, en los que la alteracion del gen puede producirse, por ejemplo, mediante la exposicion del animal a una sustancia que promueve la alteracion genica (por ejemplo tetraciclina o ecdisona), la introduccion de una enzima que promueve recombinacion en un sitio del gen (por ejemplo, Cre en el sistema Cre-lox), u otro metodo para dirigir la alteracion genetica despues del nacimiento. Los animales anulados pueden prepararse usando metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Hogan, et al. (1986) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
Un constructo anulado es una secuencia de acido nucleico, tal como un constructo de ADN o ARN, que, cuando se introduce en una celula, da como resultado la supresion (parcial o completa) de la expresion de un polipeptido codificado por ADN endogeno en la celula. Un constructo anulado tal como se utiliza aqrn puede incluir un constructo que contiene un primer fragmento del extremo 5' del gen que codifica un polipeptido listado en la Tabla 1, un segundo fragmento del extremo 3' del gen y un fragmento de ADN que codifica un marcador seleccionable colocado entre el primer y segundo fragmentos. Debe ser entendido por el experto en la tecnica que cualquier fragmento 5' y 3' adecuado de un gen puede usarse mientras la expresion del gen correspondiente se suprime parcial o completamente mediante la insercion del transgen. Los marcadores seleccionables adecuados incluyen, pero no se limitan a, neomicina, puromicina e higromicina. Ademas, el constructo puede contener un marcador, tal como la toxina A de difteria o la timidina quinasa, para incrementar la frecuencia de obtencion de celulas correctamente direccionadas. Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, pBLUESCRIPT, pBR322 y pGEM7.
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Alternativamente, un constructo anulado puede contener moleculas de ARN tales como ARN antisentido, ARNsi y similares para disminuir la expresion de un gen que codifica un polipeptido listado en la Tabla 1. Tfpicamente, para expresion estable la molecula de ARN se coloca bajo el control de un promotor. El promotor puede ser regulado, si las deficiencias en la protema de interes pueden conducir a un fenotipo letal, o el promotor puede impulsar la expresion constitutiva de la molecula de ARN de tal manera que el gen de interes se silencie bajo todas las condiciones de crecimiento. Mientras que la recombinacion homologa entre el constructo anulado y el gen de interes puede no ser necesaria cuando se usa una molecula de ARN para disminuir la expresion genica, puede ser ventajoso direccionar el constructo anulado a una ubicacion particular en el genoma del organismo huesped de tal manera que los fenotipos no deseados no se generan por insercion aleatoria del constructo anulado.
El constructo anulado puede ser subsecuentemente incorporado en un vector viral o no viral para su suministro al animal huesped o puede introducirse en celulas madre de embrion (ES). Las celulas ES se seleccionan tfpicamente por su capacidad para integrarse y convertirse en parte de la lmea germinal de un embrion en desarrollo de tal manera que crea la transmision de la lmea germinal del constructo anulado. Por lo tanto, cualquier lmea de celulas ES que pueda hacerlo es adecuada para su uso en la presente invencion. Lmeas celulares adecuadas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, la lmea celular 129J ES o la lmea celular J1 ES. Las celulas se cultivan y se preparan para la insercion de ADN usando metodos bien conocidos por el experto en la tecnica (por ejemplo, vease Robertson (1987) In: Teratocarcinomas and Embrionic Stem Cells: A Practical Approach, EJ Robertson, ed. Bradley et al., Curr. Topics Develop. Biol. 20: 357 (1986), Hogan et al., (1986) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
La insercion del constructo anulado en las celulas ES puede realizarse usando una variedad de metodos bien conocidos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, electroporacion, microinyeccion y tratamiento con fosfato de calcio. Para la insercion de la secuencia de ADN o ARN, se anaden los acidos nucleicos de construccion anulado a las celulas ES bajo condiciones apropiadas para el metodo de insercion elegido. Si las celulas van a ser electroporadas, las celulas ES y los acidos nucleicos del constructo se exponen a un pulso electrico usando una maquina de electroporacion (electroporador) y siguiendo las directrices del fabricante para su uso. Despues de la electroporacion, se deja que las celulas se recuperen bajo condiciones de incubacion adecuadas. A continuacion, las celulas son cruibadas para detectar la presencia del constructo anulado.
Cada constructo anulado que se va a introducir en la celda primero se linealiza de manera tfpica si el constructo anulado se ha insertado en un vector. La linealizacion se logra digiriendo el constructo anulado con una endonucleasa de restriccion adecuada seleccionada para cortar solamente dentro de la secuencia del vector y no dentro de la secuencia del constructo anulado.
El cribado para las celulas que contienen el constructo anulado (recombinantes homologos) se puede hacer usando una variedad de metodos. Por ejemplo, tal como se describe aqrn, las celulas pueden procesarse segun sea necesario para hacer que el ADN en ellas este disponible para la hibridacion con una sonda de acido nucleico disenada para hibridarse solamente con celulas que contienen el constructo. Por ejemplo, el ADN celular puede ser sondeado con ADN marcado con 32P que se localiza fuera del fragmento objetivo. Esta tecnica se puede utilizar para identificar esas celulas con la integracion apropiada del constructo anulado. El ADN se puede extraer de las celulas usando metodos estandar (por ejemplo, vease Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989)). El DNA puede entonces ser analizado por transferencia Southern con una sonda o sondas disenadas para hibridarse en un patron espedfico al ADN genomico digerido con una o mas enzimas de restriccion particulares.
Una vez que se identifican las celulas ES apropiadas, se introducen en un embrion utilizando metodos estandar. Pueden introducirse por microinyeccion, por ejemplo. Se obtienen embriones en la etapa apropiada de desarrollo para la integracion de la celula ES que se produce, tal como por perfusion del utero de mujeres embarazadas. Por ejemplo, los embriones de raton a los 3-4 dfas de desarrollo pueden obtenerse e inyectarse con celulas ES usando una micropipeta. Despues de la introduccion de la celula ES en el embrion, el embrion se introduce en el utero de un raton hembra pseudopregnant. La etapa de la seudopre- nancia se selecciona para aumentar las posibilidades de implantacion exitosa. En ratones, son apropiadas las hembras pseudoembarazadas de 2-3 dfas.
La transmision en lmea germinal del constructo anulado se puede determinar usando metodos estandar. La genotipia resultante de la implantacion de embriones que contienen las celulas ES descritas anteriormente se examinan en busca de la presencia de la alteracion deseada (por ejemplo, anulacion del polipeptido listado en la Tabla 1). Esto puede hacerse, por ejemplo, obteniendo ADN de progenie (por ejemplo, ADN de cola) para evaluar el
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constructo anulado, usando metodos conocidos (por ejemplo, analisis Southern, analisis inmunoprecipitacion de mancha, analisis PCR). Vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989). La genotipia identificada como quimeras puede cruzarse entre sf para producir animales con eliminacion de homocigoticos.
Los ratones se usan frecuentemente como modelos animales porque son faciles de albergar, relativamente baratos y faciles de criar. Sin embargo, tambien se pueden hacer otros animales anulados de acuerdo con la presente invencion tales como, pero sin limitarse a, monos, ganado, ovejas, cerdos, cabras, caballos, perros, gatos, cobayas, conejos y ratas. Por consiguiente, se pueden seleccionar y utilizar vectores y promotores apropiados bien conocidos en la tecnica para generar un animal transgenico deficiente en la expresion de un polipeptido listado en la Tabla 1.
En otro aspecto, pueden crearse modelos animales usando animales que no son transgenicos. Por ejemplo, se pueden usar modelos de tumores (por ejemplo, creados mediante la administracion de celulas tumorigenicas en animales inmunocomprometidos) para estudiar los efectos de los reguladores de la angiogenesis sobre el crecimiento tumoral y la metastasis. En otro ejemplo, las celulas tumorigenicas que sobreexpresan o subexpresan un polipeptido listado en la Tabla 1 pueden suministrarse a un animal bajo condiciones en las que se desarrollan tumores a partir de las celulas. El crecimiento tumoral en los animales puede compararse con el crecimiento tumoral en animales que contienen celulas que no sobreexpresan o subexpresan el polipeptido.
VIII. Composiciones farmaceuticas
Como un aspecto adicional, la divulgacion provee formulaciones farmaceuticas y metodos de administracion de la misma para lograr cualquiera de los efectos terapeuticos (por ejemplo, inhibicion o estimulacion de la angiogenesis) discutidos anteriormente. La formulacion farmaceutica puede comprender cualquiera de los reactivos descritos anteriormente en un vehuculo farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, un polinucleotido que codifica un polipeptido listado en la Tabla 1 o un fragmento del mismo, un polipeptido listado en la Tabla 1 o fragmento del mismo, un anticuerpo contra un polipeptido listado en Tabla 1, un oligonucleotido antisentido, una molecula de ARNsi, una ribozima, un aptamero, un peptidomimetico, una molecula pequena, o cualquier otro compuesto que modula la actividad de un polipeptido listado en la Tabla 1, incluyendo compuestos identificados por los metodos de cribado descritos aquf
Por "farmaceuticamente aceptable" se entiende un material que no es biologicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material se puede administrar a un sujeto sin causar ningun efecto biologico indeseable tal como toxicidad.
Las formulaciones de la divulgacion pueden comprender opcionalmente agentes medicinales, agentes farmaceuticos, portadores, adyuvantes, agentes dispersantes, diluyentes y similares.
Los compuestos de la divulgacion pueden formularse para administracion en un vehuculo farmaceutico de acuerdo con tecnicas conocidas. Vease, por ejemplo, Remington, The Science And Practice of Pharmacy (9a edicion, 1995). En la fabricacion de una formulacion farmaceutica de acuerdo con la invencion, el compuesto (incluyendo sus sales fisiologicamente aceptables) se mezcla tfpicamente, entre otros, con un vehfculo aceptable. El vehuculo puede ser un solido o un lfquido, o ambos, y se formula preferiblemente con el compuesto como una formulacion de dosis unitaria, por ejemplo, una tableta, que puede contener desde 0,01% o 0,5% a 95% o 99% en peso del compuesto. Se pueden incorporar uno o mas compuestos en las formulaciones de la divulgacion, que pueden prepararse mediante cualquiera de las tecnicas bien conocidas de farmacia.
Un aspecto adicional de la divulgacion es un metodo para tratar sujetos in vivo, que comprende administrar a un sujeto una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la divulgacion en un vehuculo farmaceuticamente aceptable, en donde la composicion farmaceutica se administra en una cantidad terapeuticamente eficaz. La administracion de los compuestos de la presente invencion a un sujeto humano oa un animal en necesidad del mismo puede ser por cualquier medio conocido en la tecnica para administrar compuestos.
Las formulaciones de la divulgacion incluyen aquellas adecuadas para administracion oral, rectal, topica, bucal (por ejemplo, sublingual), vaginal, parenteral (por ejemplo, subcutanea, intramuscular incluyendo musculo esqueletico, musculo cardfaco, musculo de diafragma y musculo liso, intradermico, intraperitoneal), topica (es decir, tanto superficies de la piel como de las mucosas, incluidas las superficies de las vfas respiratorias), intranasal, transdermica, intraarticular, intratecal e inhalatoria, administracion al hugado por suministro intraporal, asf como inyeccion directa a organos, (por ejemplo, en el hugado, en el cerebro para su administracion al sistema nervioso central, al pancreas, o a un tumor o al tejido que rodea al tumor). La ruta mas adecuada en un caso dado dependera
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de la naturaleza y gravedad de la condicion que se este tratando y de la naturaleza del compuesto particular que se esta utilizando.
Para inyeccion, el vehnculo sera tfpicamente un Kquido, tal como agua esteril exenta de pirogenos, solucion salina regulada con fosfato exenta de pirogenos, agua bacteriostatica o Cremophor EL[R] (BASF, Parsippany, N.J.). Para otros metodos de administracion, el vehnculo puede ser solido o Kquido.
Para la administracion oral, el compuesto puede administrarse en formas de dosificacion solidas, tales como capsulas, tabletas y polvos, o en formas de dosificacion lfquidas, tales como elixires, jarabes y suspensiones. Los compuestos pueden encapsularse en capsulas de gelatina junto con ingredientes inactivos y vehnculos en polvo, tales como glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidon, celulosa o derivados de celulosa, estearato de magnesio, acido estearico, sacarina de sodio, talco, carbonato de magnesio y similares. Ejemplos de ingredientes inactivos adicionales que pueden annadirse para proveer color, sabor, estabilidad, capacidad de regulacion y dispersion deseables u otras caractensticas deseables conocidas son oxido de hierro rojo, silica gel, laurilsulfato de sodio, dioxido de titanio, tinta blanca comestible y similares. Se pueden usar diluyentes similares para preparar tabletas comprimidas. Tanto las tabletas como las capsulas pueden fabricarse como productos de liberacion sostenida para proveer liberacion continua de la medicacion durante un penodo de horas. Las tabletas comprimidas pueden recubrirse con azucar o recubrise con pelfcula para enmascarar cualquier sabor desagradable y proteger la tableta de la atmosfera o recubrirse con un recubrimiento enterico para desintegracion selectiva en el tracto gastrointestinal. Las formas de dosificacion lfquidas para administracion oral pueden contener colorantes y saborizantes para incrementar la aceptacion del paciente.
Las formulaciones adecuadas para la administracion bucal (sublingual) incluyen comprimidos para deshacer en la boca que comprenden el compuesto en una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; Y pastillas que comprenden el compuesto en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia.
Las formulaciones de la presente divulgacion adecuadas para la administracion parenteral comprenden soluciones de inyeccion acuosas y no acuosas esteriles del compuesto, preparaciones que preferiblemente son isotonicas con la sangre del receptor deseado. Estas preparaciones pueden contener antioxidantes, reguladores, bacteriostaticos y solutos que hacen que la formulacion sea isotonica con la sangre del receptor deseado. Las suspensiones esteriles acuosas y no acuosas pueden incluir agentes de suspension y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes unitarios o de multiples dosis, por ejemplo ampollas selladas y viales, y pueden almacenarse en una condicion secada por congelacion (liofilizada) que requiere solamente la adicion del vehnculo lfquido esteril, por ejemplo, solucion salina o agua-para-inyeccion inmediatamente antes del uso.
Pueden prepararse soluciones y suspensiones inyectables extemporaneas a partir de polvos, granulos y tabletas esteriles del tipo anteriormente descrito. Por ejemplo, en un aspecto de la presente divulgacion, se provee una composicion esteril, estable e inyectable que comprende un compuesto de la invencion, en una forma de dosificacion unitaria en un recipiente sellado. El compuesto o sal se provee en forma de un liofilizado que es capaz de ser reconstituido con un vehnculo farmaceuticamente aceptable adecuado para formar una composicion lfquida adecuada para su inyeccion en un sujeto. La forma de dosificacion unitaria comprende tfpicamente de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 10 gramos del compuesto o sal. Cuando el compuesto o sal es substancialmente insoluble en agua, se puede emplear una cantidad suficiente de agente emulsionante que sea farmaceuticamente aceptable en cantidad suficiente para emulsionar el compuesto o sal en un vetnculo acuoso. Uno de tales agentes emulsionantes utiles es fosfatidilcolina.
Las formulaciones adecuadas para la administracion rectal se presentan preferiblemente como supositorios de dosis unitaria. Estos se pueden preparar mezclando el compuesto con uno o mas vehnculos solidos convencionales, por ejemplo, manteca de cacao, y luego moldeando la mezcla resultante.
Las formulaciones adecuadas para aplicacion topica en la piel preferiblemente toman la forma de un unguento, crema, locion, pasta, gel, aspersion, aerosol o aceite. Los vehnculos que pueden usarse incluyen gel de petroleo, lanolina, polietilenglicoles, alcoholes, potenciadores transdermicos y combinaciones de dos o mas de los mismos.
Las formulaciones adecuadas para la administracion transdermica pueden presentarse como parches discretos adaptados para permanecer en contacto mtimo con la epidermis del receptor durante un penodo prolongado de tiempo. Las formulaciones adecuadas para la administracion transdermica tambien pueden administrarse por iontoforesis (vease, por ejemplo, Tyle, Pharm. Res. 3: 318 (1986)) y tfpicamente toman la forma de una solucion
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acuosa opcionalmente regulada del compuesto. Las formulaciones adecuadas comprenden citrato o regulador bis\tris (pH 6) o etanol/agua y contienen de 0,1 a 0,2 M del compuesto.
El compuesto puede ser formulado alternativamente para administracion nasal o administrado de otra manera a los pulmones de un sujeto por cualquier medio adecuado, por ejemplo, administrado por una suspension en aerosol de partfculas respirables que comprenden el compuesto, que el sujeto inhala. Las partfculas respirables pueden ser lfquidas o solidas. El termino "aerosol" incluye cualquier fase suspendida de origen gaseoso, que es capaz de ser inhalada en los bronquiolos o en los conductos nasales. Espedficamente, el aerosol incluye una suspension de gotitas de origen gaseoso, tal como se puede producir en un inhalador de dosis medida o nebulizador, o en un pulverizador de neblina. El aerosol tambien incluye una composicion de polvo seco suspendida en aire u otro gas portador, que puede suministrarse por insuflacion desde un dispositivo inhalador, por ejemplo. Vease Ganderton y Jones, Drug Delivery to the Respiratory Tract, Ellis Horwood (1987); Gonda (1990) Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6: 273 - 313; Y Raeburn et al., J. Pharmacol. Toxicol. Meth. 27: 143 (1992). Los aerosoles de partfculas lfquidas que comprenden el compuesto pueden producirse por cualquier medio adecuado, tal como con un nebulizador de aerosol a presion o un nebulizador ultrasonico, como es conocido por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 4,501,729. Los aerosoles de particulas solidas que comprenden el compuesto se pueden producir igualmente con cualquier generador de aerosol de medicamento en particulas solidas, por tecnicas conocidas en el arte farmaceutico.
Alternativamente, se puede administrar el compuesto de una manera local en lugar de sistemica, por ejemplo, en una formulacion de deposito o de liberacion sostenida.
Ademas, la presente divulgacion provee formulaciones liposomicas de los compuestos divulgados aqrn y sus sales. La tecnologfa para formar suspensiones liposomales es bien conocida en la tecnica. Cuando el compuesto o sal del mismo es una sal soluble en agua, usando tecnologfa de liposomas convencional, el mismo puede ser incorporado en vesiculas lipfdicas. En tal caso, debido a la solubilidad en agua del compuesto o sal, el compuesto o sal sera sustancialmente arrastrado dentro del centro o nucleo hidrofflico de los liposomas. La capa lipfdica empleada puede ser de cualquier composicion convencional y puede contener colesterol o puede estar libre de colesterol. Cuando el compuesto o sal de interes es insoluble en agua, empleando de nuevo la tecnologfa convencional de formacion de liposomas, la sal puede ser sustancialmente arrastrada dentro de la bicapa lipfdica hidrofoba que forma la estructura del liposoma. En cualquier caso, los liposomas que se producen pueden ser reducidosa en tamano, tal como mediante el uso de tecnicas estandar de sonicacion y homogeneizacion.
Las formulaciones liposomales que contienen los compuestos divulgados aqrn o sus sales pueden ser liofilizadas para producir un liofilizado que puede ser reconstituido con un vehfculo farmaceuticamente aceptable, tal como agua, para regenerar una suspension liposomal.
En el caso de compuestos insolubles en agua, se puede preparar una composicion farmaceutica que contiene el compuesto insoluble en agua, tal como por ejemplo, en una emulsion de base acuosa. En tal caso, la composicion contendra una cantidad suficiente de agente emulsionante farmaceuticamente aceptable para emulsionar la cantidad deseada del compuesto. Los agentes emulsionantes particularmente utiles incluyen fosfatidil colinas y lecitina.
En aspectos particulares, el compuesto se administra al sujeto en una cantidad terapeuticamente efectiva, tal como se define anteriormente. Las dosificaciones de compuestos farmaceuticamente activos pueden determinarse por metodos conocidos en la tecnica, vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa). La dosificacion terapeuticamente efectiva de cualquier compuesto espedfico variara algo de compuesto a compuesto y de paciente a paciente y dependera de la condicion del paciente y de la ruta de administracion. Como proposicion general, una dosificacion de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg tendra eficacia terapeutica, calculandose todos los pesos basandose en el peso del compuesto, incluyendo los casos en los que se emplea una sal. Los problemas de toxicidad en el nivel superior pueden restringir las dosificaciones intravenosas a un nivel inferior tal como hasta aproximadamente 10 mg/kg, calculandose todos los pesos basandose en el peso del compuesto, incluyendo los casos en los que se emplea una sal. Se puede emplear una dosificacion de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg para la administracion oral. Tfpicamente, se puede emplear una dosificacion de aproximadamente 0,5 mg/kg a 5 mg/kg para inyeccion intramuscular. Las dosificaciones particulares son de aproximadamente 1 pmol/kg a 50 pmol/kg, y mas particularmente a aproximadamente 22 pmol/kg y a 33 pmol/kg del compuesto para administracion intravenosa u oral, respectivamente.
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En aspectos particulares de la divulgacion, se puede emplear mas de una administracion (por ejemplo, dos, tres, cuatro o mas administraciones) a traves de una variedad de intervalos de tiempo (por ejemplo, hora, diaria, semanal, mensual, etc.) para lograr efectos terapeuticos.
La presente invencion encuentra su uso en aplicaciones veterinarias y medicas. Los sujetos adecuados incluyen tanto aviuarios como mairnferos, prefiriendose los mai^eras. El termino "aviar", tal como se usa aqrn, incluye, pero no se limita a, pollos, patos, gansos, codornices, pavos y faisanes. El termino "mam^fero" tal como se usa aqrn incluye, pero no se limita a, humanos, bovinos, ovinos, caprinos, equinos, felinos, caninos, lagomorfos, etc. Los sujetos humanos incluyen neonatos, infantes, juveniles y adultos. En otras realizaciones, el sujeto es un modelo animal de enfermedad osea.
La presente divulgacion se describe mas particularmente en los siguientes ejemplos que se pretende que sean ilustrativos solamente puesto que numerosas modificaciones y variaciones en ellos seran evidentes para los expertos en la tecnica.
Ejemplo 1
Metodos experimentales
Fuente del tejido mamario: Los tejidos y tumores congelados utilizados se obtuvieron de la Lineberger Comprehensive Cancer Center Tissue Procurement and Analysis Core y se han obtenido de los pacientes que fueron debidamente informados y que han consentido a que su tejido obtenido para la investigacion. El tejido se obtuvo a partir de tumores de mama primario en pacientes que no fueron tratados con quimioterapia neoadyuvante, o de pacientes sin cancer sometidos a mamoplastia de reduccion. Los tumores de mama utilizados para la microdiseccion fueron ER+, Her2/neu- (inmunofenotipo A luminal).
Inmunohistoqmmica para la microdiseccion por captura laser: Se fijaron porciones de tejido mamario congelado de forma instantanea en un compuesto OCT y se seccionaron a -35°C en un criostato a 8 pm sobre laminas de vidrio de membrana de polietilen naftalato (Arcturus Bioscience, Mt View, CA, catalogo # LCM0522). Se utilizo la tecnica de RNAse libre durante todo el procedimiento y se usaron reguladores y soluciones de alcohol frescas cada vez. Las laminas se fijaron en acetona durante 2 minutos a 4°C y se enjuagaron en solucion salina equilibrada de Hank (HBSS) (Gibco, Grand Island, NY). Las laminas se incubaron con un anticuerpo antihumano de raton contra el antfgeno relacionado con el factor VIII (BioGenex, San Ramon, CA, catalogo # MU016-UC) a una dilucion 1: 6 durante 7 minutos a 4°C. El IHC se realizo con el sistema DakoCytomation LSAB 2 (Carpinteria, CA), un sistema de estreptavidina-biotina de tres etapas con las siguientes modificaciones. Despues de lavar en HBSS, el enlace biotinilado se incubo durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se uso un revelador de fosfatasa alcalina BCIP/NBT (Vector Labs, Burlingame, CA) a una concentracion muy alta (3 gotas/300 pl de regulador) y se incubo durante 10-15 minutos a 4°C. Las laminas se deshidrataron en ETOH al 75% durante 30 segundos, ETOH al 95% durante 30 segundos y ETOH al 100% durante 2 minutos (Arcturus, Mountain View, CA). Se anadio inhibidor de ARNasa protector (Roche, Indianapolis, IN) a una dilucion 1:10 para todos los reguladores usados en el proceso de tincion. Las laminas se colocaron en hielo seco hasta la microdiseccion, que ocurrio el mismo dfa que la inmunohistoqmmica (IHC).
Microdiseccion por captura laser: La microdiseccion siguio inmediatamente a la preparacion del tejido. La microdiseccion por captura laser se realizo en un Sistema de Microdiseccion Laser Leica. Los tejidos que se microdiseccionaron se vieron a traves de un microscopio de video y la posicion de la lamina se ajusto de tal manera que las celulas deseadas estaban bajo la luz de direccionamiento. La activacion del laser UV corta el tejido alrededor de los grupos de celulas de interes. El tejido cortado se transporto entonces por gravedad a un tubo eppendorf que contema 25 pl de regulador de extraccion de ARN del Picopure ARN Extraction Kit™ (Arcturus, Mountain View, CA). Con el fin de mantener la integridad del ARN, las laminas se mantuvieron en hielo seco hasta la microdiseccion, y la microdiseccion se realizo por no mas de 15 minutos por lamina. Quince laminas fueron microdiseccionadas por muestra. El ARN se extrajo entonces con el Arcturus Picopure Extraccion ARN Kit™ (Arcturus, Mountain View, CA) como se describe en las instrucciones del fabricante y seADN I tratado.
Amplificacion de ARN: La amplificacion de ARN se realizo utilizando un sistema de amplificacion de dos rondas. En la primera ronda se utilizo el kit de amplificacion de ARN RiboAmp® HS (Arcturus, Mountain View, CA). Quinientos ng de la primera ronda de amplificacion se pusieron en el Agilent Low-Input Fluorescente Linear ARN Amplification Kit™ (Palo Alto, CA). Esta segunda ronda empleo una amplificacion de la polimerasa T7 que incorporo la sonda fluorescente en la preparacion de analisis de microarreglos.
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Analisis de la integridad del ARN: La integridad del ARN se verifico despues de la primera ronda de amplificacion antes de cada experimento de microarreglo usando deteccion RT-PCR de genes de diferentes niveles de abundancia y demostracion de preparaciones de ADNc de longitud completa intactas con Kit de integridad de ADNc (KPL, Gaithersburg, Maryland) ). Este ultimo sistema utiliza conjuntos de cebadores y genes objetivo que permiten la evaluacion de ADNC en proceso o de doble cadena para la presencia de transcritos de ADCc de longitud completa y extendida. Los conjuntos de cebadores amplifican regiones de los extremos 3' y 5' de los genes cuidadores GAPDH y el gen de factor I de ribosilacion de ADP expresado bajo. La generacion del producto usando los conjuntos de cebadores 3' indica que el gen se expresa en el sistema, y la produccion de amplfmeros utilizando los conjuntos de cebadores 5' indica el ADNc intacto de longitud completa.
Medicion del sesgo de amplificacion: Las celulas de cancer de mama MDA-MB-435 se sembraron (2.5 x 106 celulas) en matraces de 75 cm2 o placas de 100 mm en DMEM con suero bovino fetal al 10% y 100 U de penicilina- estreptomicina (Gibco). Despues de 48 horas, el ARN total se extrajo utilizando el kit Qiagen RNeasy y se purifico con QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA). Las muestras se sometieron solamente a una ronda de amplificacion (Grupo A) o a dos rondas de amplificacion (Grupo B). Los coeficientes de correlacion entre arreglos se compararon con la correlacion interclase (Hu et al., Biotechniques 38: 121 (2005)).
Experimentos de microarreglos: Se realizo la smtesis del ADNc marcado como se describio anteriormente con ADNc de referencia que es la Stratagene Human Universal Reference (Hu et al., Biotechniques 38: 121 (2005)) marcada con Cy3-dUTP y los ADNc de muestra marcados con Cy5-dUTP. Las hibridaciones de microarreglo se realizaron utilizando microarreglos de oligonucleotidos humanos de Agilent (basado en Agilent 1Av1 disenado espedfricamente para lmeas celulares y Agilent 44k para los espedmenes disecionados en vasos) como se describio previamente (Hu et al., Biotechniques 38: 121 (2005)). Se realizaron replicas tecnicas (que se refieren a utilizar el mismo ARN de un tumor en dos microarreglos) para todos los espedmenes de vasos diseccionados.
Normalizacion de datos, preprocesamiento y estadfstica: Se cuantificaron los valores de expresion genica utilizando la relacion log2 de la intensidad del canal rojo normalizado de Lowess frente a la intensidad del canal verde (Yang et al., Nucleic Acids Res. 30: e15 (2002)). Se utilizo la base de datos UNC Microarray (genome.unc.edu) para realizar el filtrado y el preprocesamiento, y todos los datos estan disponibles en el UMD y han sido depositados en el GEO bajo el numero de acceso de GSE7413. Se realize un SAM de dos clases (Significance Analysis of Microarrays, www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM) (Storey, JR Stat. Soc. Series B: 479 (2002), Tusher et al., Proc. Natl Acad Sci. USA 98: 5116 (2001)) para identificar genes expresados significativamente de forma diferencial entre todas las 5 muestras vasculares tumorales frente a las 5 muestras vasculares normales. Cada muestra tema un arreglo de replicacion tecnica, por lo tanto, habfa 10 arreglos en cada grupo que se utilizaron para el SAM. Con el fin de identificar los genes expresados diferencialmente que codifican membranas potenciales o protemas secretadas, se realizo una busqueda Gene Cards (
www.genecards.org/index.shtml) para identificar la potencial localizacion subcelular de genes con una expresion incrementada de > 4 veces.
Con el fin de interpretar las listas de genes derivados de los resultados del SAM, y convertir la lista de genes en temas biologicos, se aplico el analisis EASE (la Expression Analysis Systematic Explorer, david.abcc.ncifcrf.gov, david.abcc.ncifcrf.gov).
Identidad de tipos de celulas en celulas de vasos microdiseccionados: Se identificaron los tipos de celulas que comprenden los vasos microdiseccionados analizando la expresion de genes para genes que se sabe que se expresan selectivamente en poblaciones espedficas de celulas (endoteliales, hematopoyeticas, pericitas y epiteliales) y comparando los perfiles de expresion genica de los espedmenes de celulas vasculares a cultivos de celulas endoteliales in vitro y cultivos de celulas derivadas de tumores de mama in vitro. Los ARN totales de celulas endoteliales humanas se adquirieron de Cell Application Incorporation (San Diego, CA). El ARN total se purifico a partir de lmeas celulares de cancer de mama usando el kit Qiagen RNAeasy. Se determino la integridad del ARN utilizando el kit ARN 6000 Nano LabChip y el bioanalizador Agilent 2100. Se analizaron los genes espedficos para el endotelio, los TEM previamente caracterizados, los marcadores hematopoyeticos, los marcadores peridticos y el epitelio luminal y se mostraron los datos utilizando Java Treeview (Saldanha, Bioinformatics 20: 3246 (2004)).
Confirmacion del origen vascular de los genes marcadores vasculares: Para validar el origen vascular de los genes asociados con el endotelio tumoral obtenido por inmuno-LCM, se realizo inmunohistoqmmica con anticuerpos para seleccionar transcritos genicos y se comparo con tincion en secciones subsiguientes tenidas con anticuerpos contra el antfgeno relacinado con el factor VIII en tumores ER +, Her2/neu- de mama embebidos en parafina.
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Anticuerpos comercialmente disponibles: Se utilizo anticuerpo policlonal de conejo a SFRP-2 (H-140) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, catalogo # sc-13940) a una dilucion de 1:150; Se uso protema de activacion de conejo policlonal a FAP/fibroblastos, region alfa-Stalk (Abcam, Cambridge, MA, catalogo # Ab28244) a una dilucion de 1:600; se uso anticuerpo monoclonal de raton a JAK3 (Genetex Inc., San Antonio, TX, catalogo # GTX23301) a dilucion 1:100; se utilizo anticuerpo anti-Hep27 (17) (DHRS2) de raton, un regalo del Dr. Franco Gabrielli (Universita di Pisa, Pisa, Italia), a dilucion 1:1000; se uso anticuerpo antihumano de raton contra el antfgeno relacionado con el factor VIII (BioGenex, San Ramon, CA, catalogo # MU016-UC), a una dilucion de 1:100; se uso CD-19 anti-humano monoclonal de raton (AbD Serotec, Raleigh, NC, catalogo # MCA2454T) a 1:200).
Metodos de generacion de anticuerpos: Los peptidos para las protemas SLTRK6 (Cys-
SRPRKVLVEQTKNEYFELKANLHAEPDYLEVLEQQT (SEQ ID NO: 8)) y SMPD3
(TSKSSGQKGRKELLKGNGRRIDYMLHC (SEQ ID NO: 9)) se sintetizaron y se conjugaron con hemocianina de lapa californiana (KLH) para las inmunizaciones de los conejos. Los conejos blancos de Nueva Zelanda (5-6 lbs) se inmunizaron tres veces con 200 |jg del conjugado de peptido mezclado con adyuvante completo de Freund para la inmunizacion primaria. El Adyuvante Incompleto de Freund se uso para todas las inmunizaciones de refuerzo. La via de inyeccion fue subcutanea e intramuscular en multiples sitios. Los sueros se recogieron del muestreo de sangre despues de la tercera inmunizacion. Se utilizo anticuerpo SLITRK6 a una dilucion de 1:5000 y se utilizo anticuerpo SMPD3 a una dilucion de 1: 1000.
Inmunohistoqmmica en tumor de mama embebido en parafina y muestras normales: El tejido se secciono a 8 jm sobre Superfrost mas laminas. Las laminas se desparafinaron sumergiendolos en xileno durante 5 minutos dos veces. Las laminas se hidrataron en ETOH al 100%, ETOH al 95% durante 3 minutos cada uno. Las laminas se deuvieron en H2O2 al 3% (Kit DakoCytomation, LSAB2 HRP, Carpinteria, CA) durante 10 minutos, se enjuagaron con ETOH al 70% durante 3 minutos y luego con PBS durante 3 minutos. Se calento el regulador Citra (BioGenex, San Ramon, CA) en un horno a 60°C y las laminas se sumergieron en regulador citra a 100°C en un vaporizador de arroz durante 30 minutos. Las laminas se enjuagaron en PBS durante 3 minutos y luego se marcaron con un lapiz PAP. Se aplicaron 100 jl-200 jl de anticuerpo primario y se colocaron las laminas en una caja sellada en una habitacion fna a 4°C durante la noche. Las laminas se enjuagaron entonces en PBS durante 3 minutos y se anadieron 1-2 gotas de anticuerpo secundario biotinilado (DakoCytomation, Kit LSAB2 HRP) a cada lamina durante 20 minutos. Las laminas se enjuagaron en PBS durante 3 minutos y se aplicaron 1-2 gotas de estreptavidina-HRP (Kit DakoCytomation LSAB2 HRP) durante 20 minutos. Se aplicaron 1-2 gotas de complejo DAB y las laminas se colocaron en un cajon oscuro durante aproximadamente 10 minutos. Las laminas se enjuagaron en agua destilada durante 3 minutos y se contratineron con azul de tripano (Sigma, St Louis, MO) durante 30-45 segundos. Las laminas se enjuagaron en PBS, se deshidrataron a traves de alcohol graduado y xileno, y Cytoseal XYL (Richard-Allan, Kalamazoo, MI) y se aplicaron laminas de cubierta. Se realizo un control negativo sin anticuerpo primario para todos los experimentos, y el control positivo fue antfgeno relacionado con el factor VIII.
Evaluacion de la expresion diferencial de protemas de los genes vasculares entre el tumor de mama y el tejido mamario normal: Una vez confirmados los genes vasculares para localizar al endotelio, se evaluo si la expresion diferencial de mARN se correlacionaba con la expresion diferencial de protemas usando inmunohistoqmmica en tumores de mama embebidos en parafina y tejido de mama normal.
Seleccion de tumores de mama: Se usaron tres grupos de tumores de mama embebidos en parafina fijados en formalina y designados como luminal A, basal o Her2/neu basado en sus inmunofenotipos (Livasy et al., Mod. Pathol. 19: 264 (2005)) ("Luminal A" ER positivo, Her2/neu negativo, "basal" ER negativo, PR negativo, HER2/neu negativo, ck5/6 positivo o EGFR positivo y "Her2/neu" ER negativo, PR negativo, Her2/neu positivo), asf como el tejido mamario normal de mamoplastia de reduccion. Los tejidos normales de mama se tineron primero con anticuerpos contra el antfgeno relacionado con el factor VIII y solo se utilizaron tejidos que teman vasos en la muestra. ER negativo, PR negativos, tumores negativos de Her2/neu se tineron para anticuerpo CK5/6 (clon 05/16B4 dilucion 1:10, Boehringer Mannheim, Indianapolis) como se describio anteriormente (Livasy et al., Mod. Pathol. 19: 264 2005)) y el anticuerpo EGFR (clon pharmDx, DakoCytomation Carpinteria, CA) segun las instrucciones del fabricante para definir ademas el fenotipo basal.
Puntuacion de Inmunohistoqmmica: Un unico patologo certificado por la junta (CAL) certifico cada seccion de tejido para la expresion FAP, SFRP2, JAK3, SMPD3, SLITRK6, DHRS2 y CD19 basandose en un sistema de calificacion que midio la intensidad de tincion en el endotelio como: (Puntuacion de intensidad del vaso) 0, ninguna; 1, frontera; 2, debil; 3, moderado/fuerte, y porcentaje de tincion de celulas endoteliales positivas como: 0, ninguno; 1, 1-24%; 2, 25-49%; 3, 50-74%; 4, 75-100%. Las diferencias en la puntuacion de Intensidad del vaso entre los tumores y el tejido
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normal se dicotomizaron y evaluaron, donde una puntuacion "alta" fue 3 y una puntuacion baja fue 0-2. Para definir adicionalmente la expresion de la angiogenesis, la expresion se dicotomizo como alta (3 + de intensidad y celulas positivas >75%) y no alta (0, 1, o 2 de intensidad y/o <75% de celulas positivas), y se designo como Puntuacion de Angiogenesis. La prueba exacta de Fisher se uso para probar posibles diferencias en las proporciones (o porcentajes) de expresion, clasificadas como "altas" o "bajas" tanto para la puntuacion de angiogenesis como para la puntuacion de intensidad de vaso entre luminal A vs. normal, Her2neu vs. Basal vs. tejido normal. Los analisis estadfsticos se realizaron utilizando el software estadfstico SAS, versiones 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC.
Ejemplo 2
Identificacion de genes expresados diferencialmente en vasos de tumores mamarios
Aislamiento de vasos y analisis de microarreglos: Con el fin de estudiar las diferencias en la expresion genica entre los vasos tumorales y normales, se realizo IHC rapida con anticuerpos contra el antfgeno relacionado con factor VIII, seguido de microdisseccion por captura laser (LCM) de celulas vasculares de 5 tumores de mama luminal A y 5 espedmenes normales de tejido mamario de mamoplastia de reduccion. La inmunotincion segun el protocolo IHC rapido requiere solo 30-35 minutos de fijacion a LCM. La calidad de la tincion fue excelente, las celulas vasculares se identificaron facilmente y la LCM se realizo con exito (Fig. 1).
La amplificacion de ARN se realizaron usando un sistema de amplificacion de dos rondas. La integridad del ARN se evaluo despues de la primera ronda de amplificacion. El ARN extrafdo mantuvo su integridad como lo demuestra la deteccion por RT-PCR de genes de diferentes niveles de abundancia (Figura 2). No se observaron senales despues de la amplificacion del control negativo (regulador de extraccion de ARN sin la muestra microdiseccionada, datos no mostrados). La integridad del ARN se comprobo en todas las muestras antes de hibridacion de microarreglo y solo las muestras que manteman la integridad de ARN se utilizaron para analisis de microarreglos.
Para estimar el sesgo de amplificacion, se comparo una ronda de ARN amplificado con dos rondas de amplificacion de ARN extrafdo de celulas de cancer de mama MDA-MB-435 humanas cultivadas in vitro. Cuando tanto el ARN amplificado como el no amplificado se hibrididaron a microarreglos de ADN de oligonucleotidos largos Agilent de 44,000 elementos, los coeficientes de correlacion variaron entre 0,95-0,97 entre repeticiones tecnicas.
Confirmacion de la identidad y pureza de las celulas vasculares: Los genes espedficos del endotelio se expresaron uniformemente y altamente en los espedmenes de celulas vasculares y lmeas celulares endoteliales con expresion significativamente menor en las lmeas celulares tumorales de mama, que confirman que las muestras de celulas vasculares estaban altamente enriquecidas para endotelio (Figura 3).
Los marcadores endoteliales tumorales 1, 2, 4, 5, 6, 7, 7R, 8 (informados previamente por estar diferencialmente expresadoa entre tumor de colon y endotelio normal) (St. Croix, Science 289: 1197 (2000)) se expresaron altamente tanto en las celulas vasculares tumorales como en las celulas vasculares normales cunado se compararon en relacion con la baja expresion observada en las lmeas celulares tumorales de mama (Fig. 3). Los genes vasculares de tumores espedficos de mama informados previamente HEY1, Col4A2, C4A, SPARCL1, SNAIL1 (Parker et al., Cancer Res. 64: 7857 (2004)) tambien se expresaron de forma similar en las muestras tanto de celulas tumorales como de celulas vasculares normales, con valores bajos de expresion en las lmeas celulares tumorales de mama (figura 3). Estos resultados sugieren que estos son marcadores de endotelio de mama, pero su expresion no fue consistentemente mayor en celulas vasculares tumorales frente a las normales.
El receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGFR-p), un marcador de pericito, se expreso altamente en las muestras de celulas vasculares, lo que confirmo la presencia de pericitos (Figura 3). Hubo una alta expresion de genes espedficos para el epitelio luminal del tumor mamario en las lmeas celulares de cancer de mama, con baja expresion en las muestras de celulas vasculares y las lmeas celulares endoteliales (Figura 3). Esto confirmo el enriquecimiento de las celulas endoteliales y pericitos sin altos niveles de expresion de los genes asociados al epitelio.
La expresion de marcadores hematopoyeticos en las muestras de celulas vasculares fue similar a la expresion en las lmeas celulares endoteliales in vitro (Figura 3). CD45 (leucocitos) y CD22 (celulas B) teman baja expresion en vasos LCM y lmeas celulares endoteliales. CD14 (macrofagos) y CD5 (celulas T) se incrementaron tanto en las muestras de celulas vasculares como en las lmeas celulares endoteliales. Esto podna explicarse por la presencia de ARN de macrofagos y celulas T en las muestras de celulas vasculares. Alternativamente, es posible que CD14 y CD5 se expresen en celulas endoteliales, ya que hay evidencia previa de origen de monocitos de precursores de
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celulas vasculares (Coukos et al., Br. J. Cancer 92: 1182 (2005)) y expresion de CD14 en celulas endoteliales (Jersmann, Immunol. Cell Biol. 83: 462 (2005)); CD14 tambien se elevo en un informe previo de endotelio de tumor ovarico microdiseccionado (Buckanovich et al., Cancer Biol. Ther. 5: 635 (2006)), y se ha informado previamente que CD5 esta presente en el endotelio vascular (Gogolin-Ewens et al., Eur. J. Immunol., 19: 935 (1989)).
Analisis supervisado de los vasos tumorales versus los normales: Utilizando el Analisis de Significancia de Microarreglo (SAM), se identificaron los genes expresados diferencialmente entre el tumor y las celulas vasculares normales. Se encontraron 1176 genes expresados diferencialmente con un numero mediano de falso significado = 7,76, de los cuales 368 se incrementaron. Con el fin de interpretar la lista de genes derivados de SAM y convertir la lista de genes en temas biologicos, se aplico el Explorador Sitematico de Analisis de Expresion (EASE). Al examinar los resultados ajustados de Bonferonni, se encontro que la categona de ontologfa de la matriz extracelular se incremento en las celulas vasculares tumorales, mientras que la categona de ontologfa ribosomica se redujo, demostrando una respuesta biologica separada.
Confirmacion del origen vascular de los genes marcadores vasculares: Para validar el origen vascular de los genes asociados con el endotelio tumoral obtenido por inmuno-LCM, se realizo IHC en tumores de mama humano luminal A embebidos en parafina. Dado que el objetivo era identificar los genes altamente expresados diferencialmente, el primer foco se centro en los 55 genes que teman l expresion incrementada > 4 veces en las celulas del vaso tumoral (Tabla 1). A partir de esta lista, se ralizo una busqueda de Gene Cards (
www.genecards.org/index.shtml) para identificar la localizacion subcelular potencial de los genes con expresion incrementada > 4 veces, y se centro en algunos de los genes que potencialmente codifican protemas de membrana (FAP, JAK3 , SMPD3, SLITRK6, CD 19), y una protema secretada (SFRP2). Estas ofrecenan objetivos de farmacos particularmente buenos debido a su accesibilidad. Tambien se eligio un gen que se ha descrito recientemente que se expresa en endotelio in vitro (DHRS2) (Shafqat et al., Cell. Mol. Life Sci. 63: 1205 (2006)).
Se utilizaron anticuerpos contra el antfgeno relacionado con el factor VIII para un control positivo para identificar el endotelio, y en las secciones subsiguientes se realizo el IHC con anticuerpos contra FAP (protema de activacion de fibroblastos, alfa), SFRP2 (protema 2 secreta relacionada con frizzled), JAK3 (janus quinasa 3), SMPD3 (esfingomielinasa 2 neutra), SLITRK6, miembro 2 de DHRS2 (deshidrogenasa/reductasa (familia SDR), tambien conocido como Hep27) y CD19.
Los anticuerpos contra FAP, SFRP2, JAK3, SMPD3, SLITRK6 y DHRS2 mostraron tincion con localizacion celular en endotelio (Fig. 4), asf como estroma tumoral y epitelio tumoral. CD19, un marcador de celulas B, no se localizo en el endotelio. Por lo tanto 6/7 genes marcadores vasculares identificados por inmuno-LCM que fueron estudiados parecen estar validados de origen vascular.
Ejemplo 3
Evaluacion de la expresion diferencial de protemas de genes vasculares entre los vasos de tumores de mama y los vasos normales de mama
Para los seis genes validados por ser de origen vascular, se evaluo a continuacion si la expresion diferencial de mARN se correlaciono con la expresion diferencial de la protema utilizando IHC en, Her2/neu, luminal A, normal y los tumores basales embebidos en parafina. La expresion de protema diferencial significativa para SLTRK6 y DHRS2 no se detecto, posiblemente porque habfa muy alta tincion tanto en el endotelio del tumor como en el endotelio normal (datos no presentados). Para SMPD3 no hubo diferencias en la Puntuacion de Angiogenesis para luminal A versus normal, pero hubo un incremento en la Puntuacion de Intensidad del Vaso comparando luminal A versus normal (15/16 (94%) vs. 6/10 (60%) P = 0,05). JAK3 presento una mayor tincion en los tumores luminal A y Her2/neu en comparacion con la normal (p = 0,01 y p = 0,006 respectivamente, Fig. 5D) y fue casi estadfsticamente significativa para el puntaje de Angiogenesis (p = 0,11, Fig. 5C). Los tumores basales teman una expresion muy baja de JAK3 (Fig. 5C, 5D). Para FAP, las Puntuaciones de Angiogenesis fueron significativamente mayores en los tumores luminal A, Her2/neu y basales comparados con los normales (p = 0,04, p = 0,03 y p = 0,03, respectivamente, vease Fig. 5A). Para SFRP2, la puntuacion de Angiogenesis fue significativamente mayor en los tumores luminal A y tumores basales en comparacion con los normales (p = 0,03 y p = 0,02 respectivamente) con significancia cercana en los tumores Her2/neu (*** p = 0,10). Esto parece validar el descubrimiento original de la expresion genica diferencial en el luminal A versus las celulas del vaso normal en una segunda muestra utilizando una plataforma diferente (IHC).
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Funcion Angiogenica de SFRP2
Ensayo de membrana corioalantoica de pollo (CAM): Para determinar si SFRP2 induce angiogenesis in vivo, se incubaron ovulos de pollo fertilizados (NC State University Chicken Research Farm) a 100°F en un turner de ovulo durante 4 dfas. En el dfa 4, los ovulos se rompieron en placas de Petri esteriles y se incubaron a 99°F en 3% de CO2, 65% de humedad. Para la aplicacion de farmaco en la CAM, se corto el papel de filtro Whatman grado 1 en drculos con un punzon de papel de 6 mm de diametro y se sometio a autoclave. Para disminuir los efectos inflamatorios del disco, los discos se empaparon en 1 ml de 3,0 mg/ml de acetato de cortisona en ETOH absoluto y se secaron al aire durante 60 minutos en una campana de flujo laminar. Al dfa 8, se colocaron 5 discos por ovulo en el tercio externo de la CAM, a 2-3 mm de un recipiente. Se anadieron 7 pl d PBS de control a los discos para las CAM de control y se anadio SFRP2 100 ng/7 pl de PBS a los discos para las CAM tratadas (n = 5 discos de control y 5 discos tratados con SFRP2). Las CAM se evaluaron bajo un estereomicroscopio al dfa 3 despues de la colocacion del disco. Las imagenes se tomaron con un Macrosistema Wild M-4 70, y la angiogenesis se cuantifico usando Software Metamorph con un modulo de angiogenesis. Para investigar si SFRP2 induce la angiogenesis in vivo, se implantaron pellas impregnados de SFRP2 en la CAM de desarrollo al dfa 8. Despues de 3 dfas, SFRP2 indujo angiogenesis en la CAM con un incremento estadfsticamente significativo en el numero de puntos de ramificacion (0,010), segmentos (0,013) area de porcentaje de tubo recubierta (0,004), area total de tubo (0,008) y longitud total de tubo (0,008) (Figura 6).
Ensayo de heridas por rasguno: Se evaluaron las propiedades de migracion de SFRP2 en celulas de celulas endoteliales de raton (MEC) usando un ensayo de herida por rasguno. Se sembraron celulas endoteliales de raton a 10.000 celulas/pozo en una placa de 96 pozos y se dejo confluir en DMEM con FBS al 10%. Las celulas se suspendieron en DMEM sin suero durante 18 horas. La herida se formo usando una punta de pipeta de 1 ml y se anadio una curva de dosis de 0,7 pM-700 pM de SFRP2 recombinante de raton (US Biologicals, Swampscott) a las celulas. Cada concentracion se realizo por triplicado y el experimento se repitio tres veces con resultados similares. La migracion se midio de 16 a 32 horas. La distancia de migracion se midio en cada punto de tiempo. Las diferencias estadisticas entre SFRP2 y control se evaluaron con una prueba t de Student de dos colas no apareada, con p <0,05 siendo significativa. SFRP2 incremento la migracion de celulas endoteliales en la concentracion picomolar (p <0,01 a las 16 horas, p <0,001 a las 19 horas) (Figura 7).
Ensayo de formacion de tubos: Se evaluaron las propiedades de formacion de tubos de SFRP2 en celulas de celulas endoteliales de raton (MEC) utilizando un ensayo de formacion de tubo de celulas endoteliales. ECMatrix (Chemicon) se descongelo, se diluyo y se solidifico en una placa de 96 pozos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sembraron 1x104 celulas/pozo en 150 pl de DMEM (cellgro) con FBS al 10% (HyClone) y un rango de concentracion (7-7000 pM) de SFRP2 (US Biologicals) sobre la matriz y se devolvio a 37°C, CO2 al 5% durante 8 horas. Las imagenes se adquirieron utilizando el microscopio Nikon Eclipse TS100 con una ampliacion de 4x con una camara digital Nikon CoolPix 995. Los resultados se cuantificaron contando el numero de puntos de ramificacion. La formacion de tubo endotelial fue inducida por SFRP2 en una forma dependiente de la concentracion a las 8 horas (p = 0,0006 a 7 nM) (Figura 8).
Ensayo de tapon de Matrigel: Se evaluo la capacidad de SFRP2 recombinante de raton para estimular la angiogenesis en un ensayo de angiogenesis de tapon de Matrigel de raton. Se inyectaron ratones C57BL/6 hembra (8 semanas de edad) s.c. con 0,5 ml de matriz de membrana basal reducida por factor de crecimiento (Matrigel) que contema SFRP2 recombinante de raton (800 ng/ml) con 30 U/ml de heparina o PBS con 30 U/ml de heparina para control negativo. Siete dfas mas tarde los ratones se sacrificaron y se eliminaron los tapones de Matrigel y se evaluo la angiogenesis por concentracion de hemoglobina con el reactivo de Drabkin. La evaluacion de la respuesta angiogenica mediante la medicion del contenido de hemoglobina mostro un aumento de 3.3 veces en los tapones de SFRP2 en comparacion con el control del vehfculo (n = 25 tapones de SFRP2, n = 26 tapones de control, p = 0,01, Figura 9).
Ensayo de apoptosis de celulas endoteliales: Se usaron celulas endoteliales de arterias coronarias humanas (HCAEC) para ensayos de apoptosis debido a que no se podfa inducir apoptosis en las celulas MEC. Las HCAEC se cultivaron en placas de 10 cm (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) con medio Bulletkit de medio basal de celulas endoteliales 2 (EGM-2) (Clonetics, San Diego, CA) hasta 80% de confluencia. El medio se reemplazo entonces con medio optimo de acuerdo con diferentes ensayos. La condicion hipoxica se creo incubando HCAECs en medio EGM-2 sin factores de crecimiento BulletKit a 37°C en una camara de hipoxia con una atmosfera de 5% de CO2/95% de N2. El nivel de oxfgeno en la camara se controlo hasta el 1,0%. La apoptosis se determino midiendo la actividad de la caspasa 3 escindida usando un sustrato fluorogenico espedfico de caspasa de acuerdo con el protocolo para
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el Kit de Ensayo de Caspasa 3 (Sigma). Las HCAEC se sometieron a lisis despues del tratamiento con concentraciones de SFRP2 (70 pM y 700 pM) durante 36 h bajo hipoxia. A continuacion, se incubaron 5 |jl de extracto celular en regulador de reaccion a temperatura ambiente durante 1 h. La liberacion catalizada por enzima de 7-amino-4-metil cumarina (AMC) se midio mediante un lector de microplacas de fluorescencia. Se encontro que SFRP2 protegido contra la hipoxia inducida apoptosis de celulas endoteliales (p <0,02) (Figura 10).
Analisis de expresion genica: Se evaluaron los efectos corriente abajo de SFRP2 en perfiles de expresion genica utilizando microarreglos de oligonucleotidos. Las celulas MEC se cultivaron con y sin SFRP2 700 pM durante 16 horas. El ARN se extrajo y se purifico usando el Qiagen RNeasy Kit (Qiagen). La concentracion y pureza del ARN total se determino espectrofotometricamente, y la integridad se verifico utilizando el ARN 6000 Nano LabChip (Agilent Technologies) y el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies). Las repeticiones biologicas fueron (n = 3) para cada grupo para mejorar la confianza para la relacion de intensidad experimental promedio a control para cada gen. El ARN de celulas se marco con Cy5-CTP usando el Sistema de Amplificacion de ARN Linear de Baja Entrada (Agilent), y se hibrido con concentraciones equimolares de ARN de referencia comun de raton marcado con Cy3. Las hibridaciones de microarreglo se realizaron utilizando microarreglos de oligonucleotidos Agilent Mouse Whole Genoma 44 K. Despues de la hibridacion, los arreglos se escanearon en un escaner Axon Gene Pix 4000b (Axon Instruments, Inc., Foster City, CA). Las imagenes fueron analizadas utilizando el software Feature Extraction V 9.1 (Agilent). Los valores de expresion genica se cuantificaron por la relacion Log2 de la intensidad del canal rojo versus la intensidad del canal verde (muestra vs. referencia), seguida de la normalizacion del loess para eliminar el sesgo y variacion del colorante dependiente de la intensidad. El filtrado de datos y el preprocesamiento se realizaron utilizando scripts Perl personalizados. Los datos asociados con este estudio estan disponibles en el genoma. Unc.edu/pubsup/breastTumor. Se identificaron genes significativamente diferencialmente expresados utilizando una prueba T heteroscedasica (de dos colas, tipo 3) (p <0,01), y seleccion subsiguiente para un cambio de repeticiones de media absoluta de > 1,3. Para interpretar las listas de genes y convertirlos en temas biologicos, se utilizo la interfaz web GATHER (Gene Annotation Tool to Help Explain Relationships; gather.genome.duke.edu) para el analisis. Utilizando esta tecnica, se encontraron 33 mARN expresados diferencialmente (Figura 11).
Efecto de SFRP2 en rutas Wnt: SFRP2 ha sido descrito como un antagonista y agonista de de Wnt, pero sus efectos sobre senalizacion de Wnt en las celulas endoteliales no se han dilucidado. Para determinar si SFRP2 media la senalizacion de Wnt canonica en las celulas endoteliales, los niveles citoplasmaticos y nucleares de 13-catenina se midieron en celulas endoteliales tratadas con SFRP2. Las celulas endoteliales de raton se sembraron en placas de 12 pozos y se dejaron unir durante la noche. Al dfa siguiente, el medio se cambio y se anadio a los pozos con y sin SFRP2 (700 pM). Las celulas se incubaron durante 16 horas, y las protemas nucleares y citoplasmicas se extrajeron utilizando reactivo de extraccion nuclear y citoplasmica NE-PER™ de PIERCE (Pierce Biotechnology) como se describe en el manual del fabricante. El analisis de transferencia de Western se realizo utilizando metodos estandar, con anticuerpo primario al anticuerpo de 13-catenina desfosforilada (activa) (Santa Cruz, Clone BDI480, catalogo # sc-59893). No hubo cambios en la 13-catenina nuclear en las celulas estimuladas con SFRP2, lo que sugiere que la propiedad angiogenica de SFRP2 no esta mediada a traves de la ruta de senalizacion de Wnt canonica (Figura 12).
Para evaluar el papel de la ruta no-canonica de Wnt/Ca en SFRP2 inducida por la angiogenesis, se compararon los niveles de la protema NFATc3 nuclear desfosforilada en el control y celulas endoteliales tratadas con SFRP2. Las celulas MEC se sembraron en placas de 12 pozos y se dejaron unir durante la noche. Al dfa siguiente, el medio se cambio y se anadio a los pozos con y sin SFRP2 (700 pM). Las celulas se incubaron durante 1,2, 4, 8 y 16 horas, y las protemas nucleares se extrajeron mediante el uso de reactivo de extraccion nuclear y citoplasmica NE-PER™ de PIERCE (Pierce Biotechnology) como se describe en el manual del fabricante. El analisis de transferencia Western se realizo utilizando metodos estandar, con anticuerpo primario para anticuerpo de 13-catenina desfosforilada (activa) o NFATc3. Como mas arriba, no hubo cambios en la 13-catenina nuclear en las celulas endoteliales estimuladas con SFRP2 (p = 0,4, Fig. 13), lo que sugiere que la propiedad angiogenica de SFRP2 no esta mediada a traves de la ruta de senalizacion de Wnt canonica. Se encontro que NFATc3 se incremento a los 30 minutos en la fraccion nuclear de celulas endoteliales tratadas con SFRP2 (Figura 13).
Para evaluar si el tacrolimus inhibe la formacion de tubo inducido por SFRP2, las celulas MEC se trataron como mas arriba con SFRP2 7 nM con y sin tacrolimus 100 uM durante 8 horas y se determinaron los puntos de ramificacion como se ha descrito anteriormente. Para evaluar si el tacrolimus invirtio tubos establecidos, las celulas se incubaron con SFRP2 7 nM durante 8 horas y luego se anadieron BSA o tacrolimus 100 jM a celulas tratadas con SFRP2 durante 4 horas adicionales y luego se conto el numero de puntos de ramificacion. El tacrolimus inhibio la formacion de tubo inducido por SFRP2 en celulas MEC (figura 14). El tacrolimus no fue citotoxico para las celulas MEC, ya que solo el 5% de las celulas tratadas con tacrolimus tomaron colorante azul tripano (datos no mostrados). Ademas,
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despues de que se formaron tubos con tratamiento con SFRP2, el tacrolimus invirtio la formacion de tubo inducida por SFRP2 (figura 15).
Un modelo de raton de angiosarcoma sobreexpresa la protema SFRP2: Con el fin de estudiar si la inhibicion de SFRP2 inhibira el crecimiento tumoral, se propuso identificar un modelo tumoral que sobreexpresa SFRP2. Para ello, se estudio una lmea de celulas endoteliales de raton transformadas. Las celulas Ms1 se generaron inmortalizando celulas endoteliales murmicas expresando el antfgeno T grande sensible a la temperatura (regalo del Dr. Jack Arbiser, Universidad Emory). Tras la implantacion en ratones, estas celulas forman hemangiomas latentes. Las celulas Ms1 fueron transfectadas con Ras (lmea celular SVR), y esta lmea celular forma angiosarcomas cuando se inyecta en ratones lampinos. Los lisados de protemas se recogieron a partir de lmeas celulares MS1 y SVR y, utilizando analisis de transferencia Western sondeando para SFRP2, se encotro que SFRP2 se incremento en celulas SVR (figura 16). Dado que esta lmea celular forma angiosarcomas agresivos, es un modelo de raton ideal para estudiar la inhibicion del crecimiento tumoral por los inhibidores de SFRP2.
Ensayo de formacion de tubos Las propiedades de formacion de tubos de SFRP2 en celulas MEC se evaluaron utilizando un ensayo de formacion de tubo de celulas endoteliales. ECMatrix (Chemicon) se descongelo, se diluyo y se solidifico en una placa de 96 pozos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sembraron 1x104 celulas/pozo en 150 pl de DMEM (cellgro) con FBS al 10% (HyClone) y un rango de concentracion (3-3000 pM) de SFRP2 (US Biologicals) sobre la matriz y se devolvio a 37°C, CO2 al 5% durante 8 horas. Las imagenes se adquirieron utilizando el microscopio Nikon Eclipse TS100 con una ampliacion de 4x con una camara digital Nikon CoolPix 995. Los resultados se cuantificaron contando el numero de puntos de ramificacion. Para evaluar si el tacrolimus inhibe la formacion de tubos inducidos por SFRP2, las celulas MEC se trataron como mas arriba con SFRP2 30 nM con y sin tacrolimus (1 pM - 100 pM) durante 8 horas y se determinaron los puntos de ramificacion como se ha descrito mnas arriba. Para evaluar si los inhibidores de la angiogenesis mediada por SFRP2 inhibinan el crecimiento de celulas tumorales de SVR, las celulas SVR se trataron con tacrolimus (1 pM - 100 pM) o con un anticuerpo policlonal de conejo para SFRP - 2 (H -140) (Santa Cruz Biotechnology , Santa Cruz, CA, catalogo # sc - 13940) en el ensayo de formacion de tubos.
Como se muestra mas arriba, la formacion de tubo endotelial MEC se indujo por SFRP2 de una manera dependiente de la concentracion a las 8 horas (p = 0,0006 a 7 nM) (Figura 17A). Para evaluar adicionalmente si los efectos angiogenicos de SFRP2 fueron mediados a traves de NFAT, las celulas endoteliales se trataron en un ensayo de formacion de tubos con SFRP2 (30 nM) con y sin el inhibidor de la calcineurina tacrolimus. Tacrolimus (1 pM) inhibio la formacion de tubo inducido por SFRP2 en 64% ± (0,002) (Figura 17B). El tacrolimus no fue citotoxico para las celulas MEC, ya que solo el 5% de las celulas tratadas con tacrolimus tomaron colorante azul tripano (datos no mostrados). La formacion de tubos en las celulas del angiosarcoma SVR tambien fue inhibida por tacrolimus (Figura 17C), y la formacion de tubo SVR fue inhibida por un anticuerpo policlonal para SFRP2, lo que sugiere que SFRP2 es necesaria para la formacion de tubos en esta lmea de celulas tumorales de angiosarcoma.
La capacidad de tacrolimus para inhibir SFRP2 y formacion de tubo endotelial 2H11 estimulado por VEGF in vitro se estudio en un ensayo de formacion de tubo de Matrigel. El tacrolimus inhibio la formacion de tubo endotelial tanto en las celulas endoteliales estimuladas con SFRP2 (Figura 18) como con VEGF (Figura 19).
Como una prueba adicional de la contribucion de SFRP2 a la formacion de tubo endotelial, se evaluo si la perdida de funcion de SFRP2 inhibina la formacion de tubo de angiosarcoma SVR. Esto se estudio de dos maneras diferentes, primero con un anticuerpo de bloqueo a SFRP2, y luego utilizando ARNsi a SFRP2. Las celulas SVR se sembraron en matrigel en un ensayo de formacion de tubos y se trataron con un anticuerpo policlonal para SFRP2. La formacion de tubo SVR se inhibio con el anticuerpo policlonal para SFRP2 de una manera dependiente de la concentracion (Figuras 20A-B). A continuacion, se transfectaron celulas SVR con ARNsi a SFRP2 de Santa Cruz y control simulado. Las celulas SVR fueron transfectadas con ARNsi 72 pM para SFRP2 (FRP-2 ARNsi (sc-40001, Santa Cruz Biotechnology) es un grupo de 3 ARNsi espedficas de destino de 20-25 nt disenado para anular la expresion genica de SFRP2). Las tres secuencias son 5'-GAGAUAACGUACAUCAACA-3 '(SEQ ID NO: 10), 5'- CAAGCUGCAAUGCUAGUUU-3' (SEQ ID NO: 11), 5'-CCAUGUCAGGCGAAUUGUU-3 '(SEQ ID NO: 12). El ARNsi de control (sc-36869, Santa Cruz Biotechnology) que se uso contiene una secuencia codificada que no conduce a la degradacion espedfica de cualquier mARN celular conocido. Las celulas SVR se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero fetal de ternera al 10%. Despues de 72 h de transfeccion usando el reactivo de transfeccion de Lipofectamine™ RNAiMAX (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante, las celulas se recolectaron y se prepararon para analisis de transferencia Western y ensayo de formacion de tubos. Las celulas se sembraron para un ensayo de formacion de tubo de 4 horas. Celulas transfectadas ARNsi a SFRP2
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tuvieron una reduccion del 70% en la formacion de tubos en comparacion con las celulas simuladas transfectadas (Figura 21]. Estos estudios demuestran que SFRP2 es necesario para la formacion de tubos de angiosarcoma.
SFRP2 pertenece a una gran familia de protemas relacionadas con frizzle secretada (SFRPs) que estan relacionados con la cascada de senalizacion de Wnt. Esta protema contiene un dominio rico en cistema que es homologo al dominio putativo de enlazamiento a Wnt. La red de senalizacion de Wnt influye en procesos biologicos que van desde el destino celular de desarrollo hasta la adhesion celular y la apoptosis. Datos recientes sugieren que la ruta de senalizacion Wnt esta involucrada en la formacion y remodelacion de los vasos sangumeos.
Las protemas Wnt se han agrupado en dos clases: canonica y no canonica. Las Wnts canonicas estabilizan la p- catenina, activando de este modo la transcripcion de los genes objetivo de Tcf/LEF. Se ha informado que SFRP2 es un antagonista de la ruta de senalizacion Wnt canonica al unirse directamente a Wnts, alterando asf su capacidad para unirse al complejo receptor de Wnt. Sin embargo, en este estudio no se encontro ningun cambio en los niveles citoplasmaticos o nucleares de 13-catenina en celulas endoteliales tratadas con SFRP2 en la concentracion y los puntos de tiempo que indujeron la formacion de tubo y la migracion, lo que indica que SFRP2 no esta mediando angiogenesis a traves de la ruta de senalizacion de Wnt canonica.
Las Wnts no canonicas activan otras rutas de senalizacion, tal como la ruta Wnt/Ca2+ que regulan NFATc. La familia NFAT consta de cuatro miembros (NFATc1-c4), que existen como fosfoprotemas citosolicas transcripcionalmente inactivas. La localizacion nuclear NFAT depende de un balance dinamico de importacion-exportacion entre la actividad de la fosfatasa dependiente de Ca2+/calmodulina, la calcineurina y la actividad de serina/treonina quinasas. Los mutantes de perdida de funcion han demostrado que la senalizacion de NFAT es crucial para las valvulas cardfacas normales y el desarrollo vascular durante la embriogenesis. Postnatalmente, esta ruta contribuye a la regulacion del crecimiento celular, la diferenciacion y la progresion del ciclo celular en diversos tipos de celulas, y hay cada vez mas datos que apoyan un papel cntico de NFAT en la mediacion de respuestas angiogenicas.
Wnt5a ha demostrado ser un mediador de la ruta no canonica de Wnt, y se ha demostrado que SFRP2 se une a Wnt5a en el rango nanomolar. Basandose en esto, se evaluo si SFRP2 activo la ruta no canonica de Wnt en las celulas endoteliales. Tacrolimus, un inhibidor de la calcineurina, inhibio la formacion de tubo inducido por SFRP2, lo que sugiere que SFRP2 induce la formacion de tubo a traves de la ruta de senalizacion no canonica de Wnt-Ca2+, dando como resultado a la translocacion nuclear de NFATc.
Ejemplo 5
Anticuerpos para SFRP2
Se realizo un analisis de la secuencia de aminoacidos de la secuencia de SFRP2 humana para determinar epitopes candidatos para fabricar peptidos sinteticos para inyeccion en animales para desarrollar anticuerpos monoclonales para SFRP2 humano. Se identificaron siete secuencias candidatas basadas en su inmunogenicidad predicha: AA29- 40 : GQPDFSYRSNC (SEQ ID NO: 1); AA85-96 : KQCHPDTKKELC (SEQ ID NO:2); AA119-125 : VQVKDRC (SEQ ID NO:3); AA138-152 : DMLECDRFPQDNDLC (SEQ ID NO:4); AA173-190 : EACKNKNDDDNDIMETLC (SEQ ID NO:5); AA202-220 EITYINRDTKIILETKSKT- Cys (SEQ ID NO:6); AA270-295: ITSVKRWQKGQREFKRISRSIRKLQC (SEQ ID NO:7). Los ratones se inmunizaron contra las cinco primeras de las secuencias peptfdicas anteriores con una segunda ronda de inmunizacion un mes despues y se realizaron hemorragias dos semanas mas tarde. Se realizo un ELISA para determinar el tftulo de los ratones a los peptidos, lo que demostro que los ratones respondfan a los diversos inmunogenos. Los sueros de raton inmunizados contra el inmunogeno utilizado como el epttopo correspondiente a los aminoacidos AA202-AA220 (que se denomino AbB) y AA270-AA295 (que se denomino AbC) inhibieron la formacion de tubos SVR en comparacion con los sueros de raton de control (Figura 22), lo que indica que estas secuencias peptfdicas son funcionalmente activas. Estos dos peptidos se seleccionaron para la produccion de un anticuerpo monoclonal.
Se prepararon anticuerpos monoclonales para el epftopo que corresponde a AbB (AA202-AA220). Se realizo una inyeccion terciaria de antfgeno y los ratones se estimularon mediante una sola inyeccion intraperitoneal. Los tttulos del inmunogeno en los ratones inyectados se elevaron, y se seleccionaron dos ratones para la recoleccion del bazo. Los ratones seleccionados fueron sometidos a una inmunizacion i.p. tres semanas despues de la ultima inmunizacion. Estos ratones se sacrificaron 3 dfas despues del refuerzo final y se recogio sangre. El bazo se retiro y se fusiono con celulas de mieloma para la formacion de hibridomas. La fusion de las celulas del bazo se realizo con celulas P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL-1580) utilizando una solucion de PEG al 50%. La fusion se sembro en placas de 96 pozos a una concentracion de celulas totales de ~ 1,5 x 105 celulas por pocillo en el medio de seleccion de
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HAT. Las placas de fusion se alimentaron despues de 7 d^as con medio HAT. Las placas de fusion se cribaron 14 dfas despues de que se realizo la fusion. El cribado se realizo sembrando celulas de angiosarcoma SVR en un ensayo de formacion de tubo de matrigel en placas de 96 pozos. Las celulas de angiosarcoma se suspendieron en 150 |jl de anticuerpo que contema medios de crecimiento para 90 muestras diferentes y medios de control. Despues de 6 horas, se tomaron fotograffas y se conto el numero de puntos de ramificacion para cada pozo. Los controles formaron 39 puntos de ramificacion. Hubo 61 muestras que tuvieron una inhibicion > 50% de la formacion de tubo. Se seleccionaron ocho muestras que cada una tema menos de 4 puntos de ramificacion (Figura 23) para utilizar subclonacion adicional, y 32 muestras que tienen inhibicion > 50% se congelaron de nuevo.
Ejemplo 6
SFRP2 como biomarcador para cancer de mama
Para investigar si SFRP2 es un biomarcador para el cancer de mama, se probo la presencia de la protema SFRP2 en suero de pacientes con cancer de mama en comparacion con el control normal. El suero se obtuvo de la instalacion de adquisicion de tejidos de UNC, donde el suero se recogio bajo un protocolo aprobado por IRB. El suero del paciente se diluyo 1:14 y se filtro. El nivel de protema total se midio usando el ensayo Bio-Rad Protein. Se cargo cantidad igual de protema y se realizo inmunoprecipitacion Western de acuerdo con el metodo estandar. La inmunoprecipitacion se probo con el anticuerpo SFRP2. Se encontro que SFRP2 esta presente en el control y en el suero del paciente de cancer de mama, pero mas altamente expresado en el ultimo (p <0,0001, figura 24).
Ejemplo 7
SFRP2 es un objetivo vascular de amplio espectro
Se evaluo la expresion vascular de SFRP2 en angiosarcoma, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de pulmon, cancer de ovario, carcinoma hepatocelular, carcinoma de celulas renales y cancer de pancreas utilizando IHC con anticuerpos contra SFRP2 en tumores humanos embebidos en parafina. Se encontro que SFRP2 se expresa fuertemente en todos los tumores, haciendo SFRP2 un objetivo vascular de amplio espectro (Fig. 25).
Ejemplo 8
Tacrolimus inhibe la angiogenesis in vivo
Para probar la capacidad del tacrolimus para inhibir la angiogenesis in vivo, se inyectaron celulas de angiosarcoma de raton SVR (0,5 x 106) en el flanco de ratones machos lampinos de 6 semanas de edad obtenidos de Charles River Breeding Laboratories. El tratamiento se inicio el dfa despues de la inoculacion. Los ratones recibieron tacrolimus 3 mg/kg/dfa o control de vehmulo suspendido en Intralipid al 20% (Baxter Healthcare, Deerfield, IL) en un volumen total de 0,3 ml intraperitonealmente (i.p.), y se trataron diariamente durante 19 dfas. Para calcular el volumen del tumor se utilizaron mediciones de calibre en serie de diametros perpendiculares utilizando la siguiente formula: (diametro mas corto)2 X (diametro mas largo) x 0,52. Las diferencias en el volumen tumoral a lo largo del tiempo se analizaron con un ANOVA de dos vfas. Un valor de P de < 0,05 indico una reduccion estadfsticamente significativa en el crecimiento del tumor del grupo tratado en comparacion con el grupo de control. El tratamiento con tacrolimus (n = 14) durante 19 dfas fue efectivo en suprimir el crecimiento del tumor de angiosarcoma de SVR en ratones lampinos en comparacion con el control (n = 14). El tratamiento con tacrolimus redujo el volumen tumoral medio en un 46% al dfa 19 (589 ± 129 mm3 vs. 315 ± 93 mm3, ANOVA de dos vfas , p = 0,04, figura 26). No hubo signos de toxicidad (es decir, diarrea, infeccion, letargia o perdida de peso) despues de 19 dfas de tratamiento.
En un segundo estudio, ratones transgenicos MMTV-neu fueron tratados con tacrolimus 3 mg/kg/dfa o ningun tratamiento. El tratamiento comenzo cuando los tumores fueron palpables y continuo durante 21 dfas. El volumen de los tumores se monitorizo con ultrasonidos en serie. Se uso una prueba T de dos colas para determinar la diferencia entre las tasas de crecimiento de los tumores entre los tumores tratados y los no tratados. Los grupos fueron significativamente diferentes (P = 0,04, prueba t de dos colas) al final del estudio el dfa 21, con una reduccion del 59% en la tasa de crecimiento (Figura 27). No hubo signos de toxicidad (es decir, diarrea, infeccion, letargia o perdida de peso) despues del tratamiento.
Ejemplo 9
Funcion Angiogenica de Jak3
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Cultivo celular: Se cultivaron celulas de las arterias coronarias humanas (HCAEC) en el medio basal de celulas endoteliales-2 (EGM-2) con suplementos de crecimiento BulletKit (Clonetics, San Diego, CA). Las celulas se pasaron a 80-90% de confluencia usando tripsina sin EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los pasajes 3-9 se utilizaron en experimented.
Ensayo de membrana corioalantoidea de pollo (CAM): Los ovulos de pollos fertilizados (NC State University Chicken Research Farm) se incubaron a 100,4°F en un dispositivo para hacer rotar ovulod (Modelo # 1588 Genesis Hova- Bator, GQF Mfg Co., Inc.) durante 3 dfas. El dfa 3, los ovulos se agrietaron en placas esteriles de 100 x 25 mm y se incubaron a 99°F, CO2 al 5%, 65% de humedad durante 5 dfas. Para la aplicacion de farmaco en la CAM, se corto el papel de filtro Whatman grado 1 en drculos con un punzon de papel de 6 mm de diametro y se sometio a autoclave. Para disminuir los efectos inflamatorios del disco, se remojaron en 1 ml de acetato de cortisona 3,0 mg/ml en ETOH absoluta y se secaron al aire durante 60 min en una campana de flujo laminar bajo luz ultravioleta. El dfa 8, se inocularon los discos con 7 pl de BSA al 0,1% en PBS para CAM de control o 100 ng de Jak3/7 pl, BSA al 0,1% en PBS para CAMs tratados con Jak3 (n = 16 discos de control y n = 16 discos tratados con Jak3). Los discos se colocaron entonces en el tercio externo de la CAM, a 2-3 mm de un vaso principal. Las CAM se evaluaron bajo un estereomicroscopio al dfa 3 despues de la colocacion del disco. Las imagenes se tomaron con un Macrosistema Wild M-4 70 y se cuantifico la angiogenesis usando el Software Metamorph con un modulo de angiogenesis. Despues de 3 dfas, Jak3 indujo la angiogenesis en la CAM con un aumento estadfsticamente significativo en el numero de puntos de ramificacion (0,0001), segmentos (0,0001), porcentaje de area del tubo cubierto (0,0001) y longitud total del tubo (0,0001) (figura 28).
Ensayo de heridas por rasguno: Se sembraron HCAEC a 10.000 celulas/pozo en una placa de 96 pozos y se dejo confluir en EGM-2 con suplementos de crecimiento BulletKit. Las celulas se suspendieron en EGM-2 con FBS al 0,1% sin suplementos de crecimiento BulletKit durante 18 horas. La herida se formo usando una punta de pipeta de 1 ml. Se anadio a las celulas una curva de dosis de 20 nM - 200 pM de Jak3 humano recombinante (Millipore, Temecula, CA). Cada concentracion se realizo por triplicado y el experimento se repitio tres veces con resultados similares. La distancia de migracion se midio a las 12 horas y luego cada 4 horas hasta el cierre de la herida en todos los pozos. Los datos se registraron como porcentaje de la herida cerrada en cada punto de tiempo. Jak3 incremento la migracion de celulas endoteliales en la concentracion nanomolar (p <0,03 a las 20 horas, p <0,001 a las 28 horas) (Figura 29).
Ensayo de formacion de tubos: Se descongelo ECMatrix (Chemicon, Temecula, CA), se diluyo y se solidifico en una placa de 96 pozos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sembraron HCAEC sobre la matriz a 2.000 celulas/pozo en 150 pl de EGM-2 con FBS al 5% sin suplementos de crecimiento BulletKit. Se anadio una curva de dosis de 20 nM - 200 pM de Jak3 humana recombinante a las celulas y las placas se devolvieron a 37°C, CO2 al 5% durante 8 horas. Cada concentracion se realizo por triplicado y el experimento se repitio tres veces con resultados similares. Los pozos se evaluaron bajo un microscopio Nikon Eclipse TS100 con una ampliacion de 4x y se tomaron fotograffas con una camara digital Nikon CoolPix 995. La angiogenesis se cuantifico mediante el conteo de puntos de ramificacion en la imagen resultante. La formacion de tubo endotelial fue inducida por Jak3 de una manera dependiente de la concentracion a las 8 horas (p = 0,04 a 200 pM, p = 0,0001 a 20 nM) (Figura 30).
Ensayo de apoptosis de celulas endoteliales: Se sembraron HCAEC en una placa de 96 pozos a 2.000 celulas/pocillo en EGM-2 con suplementos de crecimiento BulletKit. Las celulas se cultivaron durante 18 horas y se reemplazo el medio con EGM-2 sin suplementos de crecimiento BulletKit y se anadio una curva de dosis de 20 nM - 200 pM de Jak3 humano recombinante a las celulas. La placa se incubo en condiciones hipoxicas (37°C en una camara de hipoxia con una atmosfera de 5% de CO2/95 N2 con un nivel de oxfgeno de 1,0%) durante 36 horas. La apoptosis se determino midiendo la actividad de la caspasa 3 escindida usando un sustrato fluorogenico espedfico para caspasa de acuerdo con el protocolo para el Ensayo Homogeneo Caspase-3/7 de Apo-ONE® (Promega, Madison, WI). En resumen, el control y la HCAEC tratada se sometieron a lisis en 100 pl de reactivo Caspasa-3/7 de Apo-ONE ® y se incubaron en ese reactivo a temperatura ambiente durante 1 h. La activacion de la caspasa 3 del sustrato profluorante rodamina 110, amida de acido bis-(N-CBZ-L-aspartil-L-glutamil-L-valil-L-aspartico (Z-DEVD- R110) se midio mediante un lector de microplacas de fluorescencia. Se encontro que Jak3 protegido contra la hipoxia infujo apoptosis de celulas endoteliales (p <0,05) (Figura 31).
Ensayo de proliferacion de celulas endoteliales: Se sembraron HCAEC en una placa de 96 pozos a una concentracion de 2000 celulas/pozo y se dejo proliferar durante 24 horas en EGM-2 con suplementos de crecimiento BulletKit. Las celulas se suspendieron entonces en EGM-2 con FBS al 0,1% sin suplementos de crecimiento BulletKit durante 18 horas. El medio se reemplazo con EGM-2 fresco con suplementos de crecimiento BulletKit y las
5
10
15
20
25
30
35
celulas se trataron por triplicado con: PBS solo; VEGF murmico recombinante (60 ng/ml); o Jak3 (a una concentracion de 200 nM - 200 pM). Despues de 48 h, se anadieron a cada pozo 10 jl del compuesto colorimetrico bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio (MTT) (5 mg/ml) y se dejaron incubar durante 4 h a 37°C. Se elimino todo menos 25 jl de medio en cada pozo y se anadieron 50 jl de dimetilsulfoxido (DMSO). Despues de una incubacion de 10 min a 37°C, se midio el A540 usando un lector de microplacas. A540 se convirtio en el numero de celulas sobre la base de una curva estandar creado mediante la siembra de una placa de 96 pozos con concentraciones conocidas de celulas, segun lo determinado por hemocitometna, y la medicion de su A540 despues de 4 horas de incubacion con MTT. Jak3 incremento de la proliferacion celular a las 48 horas (p = 0,007 a 20 nM) (Figura 32).
Efecto de STAT3 sobre la formacion de tubos: Se evaluo el papel de la activacion de STAT3 en la formacion de tubos mediada por Jak3 usando un pequeno inhibidor peptfdico de STAT3 fosforilado (P-STAT3). Se solidifico ECMatrix en pozos de una placa de 96 pozos. Se sembraron HCAEC sobre la matriz a 2.000 celulas/pozo en 150 jl de EGM-2 con FBS al 5% sin suplementos adicionales de crecimiento BulletKit. Los pozos se trataron por triplicado con: PBS solo, PBS + inhibidor P-STAT3 100 jM, Jak3 20 nM, o Jak3 20 nM + inhibidor P-STAT3 100 jM. Los pozos se fotografiaron a las 8 horas y la formacion de tubos se cuantifico mediante conteo de puntos de ramificacion en la imagen resultante. La adicion de inhibidor STAT3 previno la formacion de tubos mediada por Jak3, lo que indica que la senal Jak3 esta mediada a traves de la ruta STAT3 (Figura 33).
Listado de secuencias
<110> University of North Carolina at Chapel Hill DeMore, Nancy Patterson, Cam Bhati, Rajendra
<120> OBJETIVOS NOVEDOSOS PARA LA REGULACION DE LA ANGIOGENESIS
<130> 5470-487WO
<150> US 61/053,397
<151> 2008-05-15
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
G1 y
1
<210>2 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Gin Pro Asp Phe Ser Tyr Arg Ser Asn Cys
5 1 0
Lys Gin Cys His Pro Asp Thr Lys Lys Glu Leu Cys
1 5 10
<210>3 <211>7 <212> PRT
5 <213> Homo sapiens
<400>3
Va I Gin Val Lys Asp Arg Cys 1 5
<210> 4 <211> 15 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 4
As p Met Leu Glu C ys Asp Arg Phe Pro G1n Asf> Asri Asp Leu Cys 1 5 10 15
<210> 5 15 <211> 18
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5
Glu Ala Cys Lys Asn Lys Asn Asp Asp Asp Asn Asp lie Met Glu Thr 1 5 10 15
Leu Cys 20 <210>6 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
31 u Tl<; Thi Tyr lie Asm Arg Asp Tht Lys He lie Leu Glu Thr Lys 1 5 10 15
Ser Lys 'Thr Cys 20
<210>7 <211> 26 <212> PRT
5 <213> Homo sapiens
<400>7
lie Thr Ser Val Lys Arg Trp Gin Lys Gly Gin Arg Glu Phe Lys Arg 1 5 10 15
lie Ser Arg Ser lie Arg Lys Leu Gin Cys
20 2 5
<210>8 <211> 37 10 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptido antigenico sintetico <400> 8
Cys Ser Arg Pro Arg Lys Val Leu val Glu Gin Thr r.ys Asn Glu Tyr 1 5 10 15
Phe Glu Leu Lys Ala Asn Leu His Ala Glu Pro Asp Tyr Leu Glu Val
20 25 30
Leu Glu Gin Gin Thr
35
<210>9
<211> 27 <212> PRT
<213> Artificial
5
10
15
20
25
<223> Peptido antigenico sintetico <400>9
Thr Sor Lys Set Set Gly Girt Lys GLy 7, eg Lys Glu Lea Leu Lys C-ly 15 10 IS
Asn Gly Arg Arg lie Asp Tyr Met Leu His Cys 2 0 ' 2 5
<210> 10 <211> 19 <212>ARN <213> Artificial <220>
<223> Secuencia de ARNsi <400> 10
gagauaacgu acaucaaca 19
<210> 11
<211> 19
<212> ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de ARNsi <400> 11
caagcugcaa ugcuaguuu 19
<210> 12
<211> 19
<212>ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de ARNsi <400> 12
ccaugucagg cgaauuguu 19

Claims (10)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    Reivindicaciones
    1. Uso de un inhibidor de la expresion y/o actividad de SFRP2 en la fabricacion de un medicamento para tratar o prevenir cancer o metastasis, o para tratar trastornos relacionados con angiogenesis excesiva o no deseada en un sujeto, en donde dicho inhibidor se enlaza o se direcciona a SFRP2 y es (i) un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o aptamero direccionado a SFRP2; o (ii) un oligonucleotido antisentido, oligonucleotido de triple helice, ARN, miARN o ribozima direccionado a un acido nucleico que codifica SFRP2.
  2. 2. El uso de la reivindicacion 1, en donde el medicamento es para tratar o prevenir cancer o metastasis.
  3. 3. El uso de la reivindicacion 1 o 2, en donde dicho sujeto ha sido diagnosticado con cancer.
  4. 4. El uso de la reivindicacion 3, en donde dicho cancer es cancer de mama.
  5. 5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el inhibidor disminuye el nivel de un acido nucleico que
    codifica SFRP2 o disminuye la actividad de SFRP2.
  6. 6. El uso de cualquier reivindicacion precedente, en donde el medicamento es para tratar o prevenir angiosarcoma o metastasis de angiosarcoma, o para tratar trastornos relacionados con angiogenesis excesiva o no deseada.
  7. 7. Un metodo para identificar un compuesto que regula la angiogenesis o es util para la inhibicion del crecimiento tumoral o metastasis, que comprende determinar la expresion y/o actividad de SFRP2 en una muestra en presencia y ausencia de un compuesto de prueba, y seleccionar un compuesto que incremente o disminuya el nivel de expresion y/o actividad de SFRP2 en relacion con el nivel en ausencia del compuesto, tal como un compuesto que regula la angiogenesis o es util para la inhibicion del crecimiento tumoral o metastasis.
  8. 8. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo que se enlaza espedficamente a SFRP2 humano en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo reconoce espedficamente un epftopo seleccionado del grupo que consiste de aminoacidos
    a. 202-220 (EITYINRDTKIILETKSKT-Cys (SEQ ID NO:6)), and
    b. 270-295 (ITSVKRWQKGQREFKRISRSIRKLQC (SEQ ID NO:7)); y
    en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo es para tratar o prevenir cancer o metastasis, o para tratar trastornos relacionados con angiogenesis excesiva o no deseada.
  9. 9. Un inhibidor de la expresion y/o actividad de SFRP2 para uso en el tratamiento o prevencion de cancer o metastasis, o para tratar trastornos relacionados con angiogenesis excesiva o no deseada en un sujeto, en donde dicho inhibidor se enlaza o se direcciona a SFRP2 y es (i) un fragmento de anticuerpo o aptamero direccionado a SFRP2; o (ii) un oligonucleotido antisentido, oligonucleotido de triple helice, ARNsi, miARN o ribozima direccionados a un acido nucleico que codifica SFRP2.
  10. 10. Un inhibidor para el uso de acuerdo con la reivindicacion 9, en donde el cancer o la metastasis es angiosarcoma o metastasis de angiosarcoma.
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