ES2604880T3 - Utilización de tiosulfato para potenciar el efecto antipatógeno de los lactobacilos - Google Patents
Utilización de tiosulfato para potenciar el efecto antipatógeno de los lactobacilos Download PDFInfo
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Abstract
Tiosulfato para su utilización en el tratamiento de infecciones genitourinarias tales como vaginosis, candidiasis e infecciones urinarias, para potenciar el efecto antipatógeno de bacterias lactobacilos, estando el tiosulfato en una cantidad de por lo menos 100 mg/gramo de polvo, para un polvo que comprende de 107 a 1010 UFC/g de lactobacilos.
Description
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DESCRIPCION
Utilizacion de tiosulfato para potenciar el efecto antipatogeno de los lactobacilos.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a composiciones que comprenden unos lactobacilos en asociacion con tiosulfato, potenciando el tiosulfato el efecto antipatogeno de dichos lactobacilos.
En una mujer sana, la flora genitourinaria comprende casi 50 especies diferentes de microorganismos. Entre estos microorganismos, el 95% de la poblacion esta constituido por varias cepas de lactobacilos, denominados tambien “bacilos de Doderlein”. Estos lactobacilos tienen un papel de proteccion contra los patogenos mediante varios mecanismos: produccion de peroxido de hidrogeno, produccion de acido lactico, produccion de bacteriocinas, inhibicion de la adhesion y desarollo de patogenos. En particular, estos lactobacilos mantienen un pH acido mediante la produccion de acido lactico a partir del glucogeno presente en el moco vaginal. Asf, se inhibe el crecimiento de numerosos patogenos de la flora vaginal tales como Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma, Mobiluncus y, sobretodo Candida albicans.
Asf, la flora vaginal normal esta constituida principalmente por lactobacilos que forman una biopelfcula protectora sobre la superficie de la mucosa. Los lactobacilos mas frecuentemente identificados en la vagina son, en particular, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus inners y Lactobacillus gasseri.
La candidiasis vulvo-vaginal afecta al 70-75% de las mujeres en periodo de actividad genital al menos una vez en su vida; aproximadamente el 40-50% de ellas presentaran un segundo episodio. Se ha estimado en un 5-8% la incidencia de candidiasis vulvo-vaginal recurrente (definida por la aparicion de al menos 4 episodios por ano, entre ellos dos confirmados mediante examen micologico). Esta afeccion benigna tiene un impacto muy negativo sobre la calidad de vida de las pacientes y genera importantes deterioros de la salud. Tratar tal patologfa es diffcil debido a la patogenesis multifactorial de esta afeccion.
El tratamiento tradicional de mantenimiento utilizando un antifungico oral o vaginal debe ser de al menos 6 meses, pero el fndice de recafda sigue siendo alto con un 60-70% de mujeres que presentan una recurrencia en los dos meses siguientes a la interrupcion del tratamiento. Ademas, los efectos secundarios de los antifungicos son frecuentes y su uso a largo plazo puede favorecer la aparicion de vaginosis bacteriana.
La vaginosis bacteriana se debe a un desequilibrio cualitativo y cuantitativo de la flora vaginal normal que puede desembocar en una desaparicion casi completa de los lactobacilos en beneficio de la flora anaerobia, y tambien de la aparicion de germenes tales como Gardnerella vaginalis y Atopobium vaginae. La vaginosis bacteriana es una de las infecciones vaginales mas frecuentes, con un fndice de frecuencia de 10 a 15. Esta patologfa benigna en mujeres puede ser grave durante el embarazo ya que puede causar partos prematuros, bajo peso en los recien nacidos, asf como abortos espontaneos.
La vaginosis bacteriana, asf como otros desequilibrios de la microflora vaginal se tratan comunmente mediante terapia con antibioticos. Este tratamiento tiene los inconvenientes habituales de los tratamientos antibioticos y resultan cada vez menos eficaces. Ademas, pretende eliminar la flora patogena pero destruye tambien la flora beneficiosa normal.
Estado de la tecnica
Se ha descrito la administracion de lactobacilos "beneficiosos" por via oral o vaginal para promover la salud vaginal. En particular, las solicitudes de patente WO 84/04675, WO 2000/035465, US 2002/0044926 y WO 2006/04575 describen la administracion por via oral o vaginal de bacterias lacticas para promover la salud vaginal y para prevenir las recafdas de candidiasis vulvo-vaginal.
La solicitud de patente WO 2010/004005 se refiere a la administracion de prebioticos asociados a un extracto vegetal que contiene isoflavonas, para promover el desarrollo de la flora vaginal normal.
Los lactobacilos preferidos son Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillos crispatus y Lactobacillus vaginalis. Las patentes US n° 6.093.394, US n° 6.468.526 y US n° 7.807.440, asf como la solicitud de patente US 2010/0151026, describen la administracion de cepas especfficas de Lactobacillus crispatus.
Estos lactobacilos pueden ser administrados en forma liofilizada o en solucion y eventualmente en combinacion con otros agentes activos. En efecto, aunque los lactobacilos tienen un efecto antipatogeno real y reconocido, este es frecuentemente insuficiente para combatir una infeccion. Agentes activos suplementarios, o agentes que potencien el efecto antipatogeno de los lactobacilos son activamente buscados por la comunidad cientffica.
Se ha propuesto administrar lactobacilos en combinacion con un agente antimicrobiano, estando la bacteria
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microencapsulada (EP 0 732 916 B1); en presencia de acido lactico y un extracto de ajo (EP 1 911 455 A1); en presencia de goma arabiga (EP 2 211 640 A1); en presencia de estrogenos y/o gestagenos (WO 2010/133314) o tambien en presencia de un antibiotico y de un acido graso esterificado insaturado (WO 2011/066949).
Los resultados presentados en el artfculo (Nivoliez et al., 2012) indican que el procedimiento de fabricacion de las bacterias probioticas podrfa desempenar un papel importante en las caracterfsticas de los lactobacilos preparados de manera industrial.
Se utiliza el tiosulfato de sodio como un excipiente en numerosas composiciones farmaceuticas o veterinarias que contienen lactobacilos, tales como las composiciones TROPHIGIL, PROBIOS® y ALLBIO®. Por otro lado, la solicitud de patente CN 20091145852 describe un medicamento compuesto de extractos de plantas chinas y de tiosulfato de sodio. Se propone este medicamento en particular para el tratamiento de la gonorrea.
En estas composiciones, se utiliza el tiosulfato de sodio como un excipiente y no tanto como un agente activo.
La solicitud de patente de americana US 2011/0008467 describe unas composiciones farmaceuticas que comprenden solamente tiosulfato de sodio con grado farmaceutico. Las aplicaciones terapeuticas propuestas son las siguientes: tratamiento de pacientes que han sufrido un envenenamiento con cianuro, platino, tratamiento de la calcificacion vascular y de las enfermedades dermatologicas.
Descripcion de la invencon
El efecto antipatogeno de los lactobacilos existe realmente, pero no es suficientemente fuerte, en la mayorfa de los casos, para combatir la infeccion (vease la figura 2A) y por lo tanto, es necesario, frecuentemente, utilizar otros principios activos tales como antibioticos o antifungicos en complemento.
La presente invencion propone un medio para potenciar el efecto antipatogeno de los lactobacilos. Los inventores han descubierto en efecto que la asociacion de tiosulfato, en particular tiosulfato de sodio, con lactobacilos permite potenciar el efecto antipatogeno de estos lactobacilos, cuando el tiosulfato esta presente a una concentracion de al menos 100 mg/gramo de polvo, para un polvo que comprende de 107 a 1010 UFC/g de lactobacilos.
Este efecto “antipatogeno” se caracteriza en particular por una inhibicion del crecimiento de patogenos vaginales tales como Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia y especialmente Candida Albicans.
La invencion se refiere asimismo a una composicion farmaceutica que comprende al menos 100 mg/g de tiosulfato de sodio en combinacion con Lactobacillus crispatus.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a la utilizacion de tiosulfato para potenciar el efecto antipatogeno de bacterias Lactobacillus, estando el tiosulfato en una cantidad de al menos 100 mg/gramo de polvo, para un polvo que comprende de 107 a 1010 UDC/g de lactobacilos.
Definiciones
El termino “potenciar” significa proporcionar una mayor eficacia, aumentar los efectos beneficiosos de un principio activo. En particular, el agente potenciador (aquf el tiosulfato) no tiene accion propia contra los patogenos, sino que actua a traves de lactobacilos, de los cuales potencia el efecto antipatogeno.
El termino “efecto antipatogeno” designa la accion preventiva y curativa de lactobacilos con respecto a diferentes patogenos cuyo crecimiento puede ser inhibido por la presencia de lactobacilos. Se expresa este efecto mediante varios mecanismos: disminucion del pH, produccion de peroxido de hidrogeno (H2O2), produccion de acido lactico y/o acido acetico, produccion y secrecion de bacteriocinas, peptidos, acidos organicos y acidos grasos de cadena corta, inhibicion de la adhesion y desarrollo de patogenos. En particular, se mide este efecto antipatogeno en porcentaje de inhibicion del crecimiento de los patogenos, asf como en porcentaje de produccion de bacteriocinas, compuestos peptido que tienen propiedades antimicrobianas.
El termino “patogenos” se refiere a todos los patogenos susceptbiles de instalarse en el tracto urogenital y en particular Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma, Mobiluncus, Candida albicans y Candida glabrata, asf como los patogenos susceptibles de provocar unas infecciones intestinales, tales como, por ejemplo las enterobacterias (de las cuales Escherichia coli), las salmonelas, los estafilococos, Clorstrfdium difficile y las Shigellas.
El termino “lactobacilos” se refiere al conjunto de las bacterias del genero Lactobacillus, bacterias Gram positiva, inmoviles, de formas y tamanos variables, y anaerobicos facultativos. La mayorfa de los lactobacilos convierten la lactosa y otros azucares simples en acido lactico. Los lactobacilos colonizan la vagina y el tracto gastrointestinal y
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constituyen un elemento importante de la flora endogeno intestinal y vaginal.
La presente invencion se refiere principalmente a lactobacilos que constituyen la flora vaginal; sin embargo, se debe comprender que la invencion puede ser realizada con otros tipos de lactobacilos tales como aquellos presentes en el tracto gastrointestinal (en particular Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei y Lactobacillus rhamnosus).
El termino “UFC” se refiere a la unidad de medicion reconocida generalmente por los expertos en la materia para cuantificar a las bacterias capaces de fundar una colonia y significa precisamente “Unidad que forma una colonia”.
El termino “tiosulfato" se refiere a iones tiosulfato S2O32". Es la forma basica del acido tiosulfurico (H2S2O3), inestable en un medio acuoso.
Segun un aspecto preferido de la invencion, los patogenos cuyo crecimiento es inhibido por la asociacion de tiosulfato y lactobacilos pertenecen a la familia de Candida Albicans, Prevotella bivia, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma o Mobiluncus.
Candida albicans es la especie de levadura mas importante y mejor conocida del genero Candida. Provoca infecciones fungicas (candidiasis o candida) esencialmente a nivel de las mucosas del tracto digestivo y ginecologicas.
Prevotella bivia es una bacteria anaerobica que provoca esencialmente vaginosis e infecciones en el tracto urinario.
Garnerella vaginalis es una bacteria que se presenta en forma de bastoncillo pleomorfico o cocobacilus. Es una bacteria que se encuentra frecuentemente en casos de vaginosis (vaginitis no especffica), ya sea como unico germen patogeno o en asociacion con otras bacterias. Produce una toxina perforante que afecta solo a las celulas humanas. Se puede encontrar tambien en la sangre, la orina y la faringe.
El termino micoplasmas (Mycoplasma) designa una familia de mas de 100 especies de bacterias que son insensibles a las familias de antibioticos tales como penicilina y beta-lactama. En particular, Mycoplasma genitalium es responsable de infecciones genitales (uretritis, cervicitis, vaginitis, salpingitis) y problemas de esterilidad.
Mobiluncus es una bacteria anaerobica Gram positiva que se encuentra frecuentemente asociada con Gardnerella vaginalis en vaginosis bacterianas.
El termino “vaginosis” se refiere a un desequilibrio de la flora microbiana de la vagina. Se caracteriza por la desaparicion de lactobacilos y la multiplicacion de germenes anaerobicos tales como Gardnerella vaginalis.
El termino “candidiasis” se refiere a una infeccion fungica causada por levaduras del genero Candida. Candida albicans, la especie mas frecuente, es parte de la flora comun de la orofaringe y del tubo digestivo, y puede estar presente tambien en una pequena cantidad en la flora vaginal normal. La candidiasis vulvo-vaginal es bastante comun y puede estar sujeta a varias recidivas.
El termino “infeccion urinaria” se refiere a la colonizacion de la orina por bacterias, lo que se traduce generalmente por unos sfntomas de infeccion urinaria. Los germenes mas frecuentemente implicados son Escherichia coli (un 75% de los casos), Proteus mirabilis y Klebsiella o cualquiera de las tres enterobacterias (bacilos Gram negativos).
Segun la invencion, ni la vaginosis ni la candidiasis ni las infecciones urinarias pueden ser consideradas como infecciones sexualmente transmisibles, tales como la gonorrea.
Segun un aspecto de la invencion, el tiosulfato se selecciona entre el tiosulfato de sodio o tiosulfato de potasio. Se utiliza preferentemente el tiosulfato de sodio. El tiosulfato de sodio esta constituido de iones de sodio e de iones de tiosulfato. Preferentemente, la cantidad utilizada es de al menos 100 mg/g de polvo, preferiblemente al menos de 150 mg y mas preferiblemente al menos de 200 mg de tiosulfato por gramo de polvo, comprendiendo este polvo entre 107 y 1010 bacterias lactobacilos (UFC). Preferentemente, la cantidad de tiosulfato de sodio en el producto final sera de aproximadamente 230 mg/gramo de polvo, que comprende 107 a 1010 UFC de lactobacilos.
Segun un aspecto preferido de la invencion, se utiliza al tiosulfato en una cantidad de mas o menos 230 mg/gramo de polvo, para un polvo que incluye entre 108 y 1010 UFC de lactobacilos por gramo y mas preferiblemente entre 109 y 1010 UFC/gramo. El experto en la materia, especialista en liofilizacion, sabra adaptar la cantidad de tiosulfato anadida antes de la liofilizacion para obtener la cantidad deseada en el polvo obtenido despues de la liofilizacion. En particular, esta cantidad final de tiosulfato de sodio se obtiene mediante la adicion de 113 g/litro de tiosulfato de sodio al medio de cultivo bacteriano antes de la liofilizacion. Sin embargo, los ejemplos demuestran que una simple adicion de 1 g/litro de tiosulfato en el medio de cultivo bacteriano permite potenciar los efectos de los lactobacilos en el cultivo.
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Segun un aspecto preferido de la invencion, los lactobacilos son unos Lactobacills rhamnosus y/o Lactobacillus crispatus. Las cepas preferidas son en particular la cepa Lcr35® y la cepa BLL2005.
La invencion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que comprende al menos 100 mg de tiosulfato, preferiblemente al menos 150 mg y con mas preferiblemente al menos 200 mg de tiosulfato por gramo de polvo, en combinacion con una cepa Lactobacillus crispatus. Segun una forma de realizacion preferida, la cantidad de lactobacilos por gramo de composicion estara entre 107 y 1010 UFC, mas preferiblemente entre 108 y 109 UFC/g.
Preferentemente, la cepa de Lactobacillus crispatus esta en forma liofilizada. La cepa puede ser el unico elemento liofilizado de la composicion, pero preferentemente la cepa esta liofilizada en un medio que comprende unos constituyentes adicionales, que seran agregados antes o despues de la etapa de liofilizacion. En particular, se puede anadir el tiosulfato de sodio antes de la liofilizacion, en particular en una cantidad de 113 g/litro del medio bacteriano. Se puede agregar el tiosulfato de sodio en una cantidad de 1 g/litro, 5 g/litro, 10 g/litro, 20 g/litro, 30 g/litro, 50 g/litro o 100 g/litro del medio bacteriano.
Segun otro aspecto particular de la invencion, la composicion farmaceutica comprende ademas una matriz de conservacion y/o unos excipientes bien conocidos por el experto en la materia, y opcionalmente otros principios activos que tienen una accion complementaria.
En particular, esta composicion puede comprender los siguientes principios activos: hormonas (estriol, progesterona, etc.), agentes antiinflamatorios y/o agentes bactericidas y/o agentes antifungicos. El experto en la materia sabra determinar cuales son los principios activos que pueden ser combinados ventajosamente con una cepa de Lactobacillus crispatus. Esta composicion comprende tambien, segun un aspecto especffico de la invencion, varias cepas de lactobacilos.
La invencion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que comprende el sobrenadante de cultivo de una cepa de Lactobacillus, preferiblemente de Lactobacillus crispatus, cultivada en presencia de tiosulfato, en particular tiosulfato de sodio, particularmente de al menos 100 g/litro de tiosulfato de sodio en el medio de cultivo. Este sobrenadante de cultivo contiene tiosulfato pero no contiene lactobacilos. Presenta una fuerte actividad antipatogena.
Tal como se demuestra en los ejemplos, la presencia de tiosulfato potencia la secrecion de bacteriocinas, compuestos peptidos que tienen propiedades antimicrobianas. Por lo tanto, es probable que el “sobrenadante de cultivo” que ya no contiene lactobacilos, contenga grandes cantidades de bacteriocinas, secretadas previamente por los lactobacilos.
Estas composiciones farmaceuticas son formuladas para administracion por via vaginal o para administracion por via oral. En particular, las formas galenicas utilizadas seran en forma de capsulas blandas, de comprimidos, de cremas, de suspensiones lfquidas u oleosas, o cualquier otro dispositivo medico apropiado.
La invencion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que comprende al menos 100 mg, preferiblemente al menos 150 mg y mas preferiblemente al menos 200 mg de tiosulfato por gramo de polvo, en asociacion con una cepa de Lactobacillus crispatus, para su uso en el tratamiento de infecciones genitourinarias tales como vaginosis, candidiasis e infecciones urinarias.
Preferentemente, esta composicion comprendera de aproximadamente 230 mg de tiosulfato de sodio en combinacion con 108 a 109 UFC/g de una cepa de Lactobacillus crispatus.
Se pueden determinar los modos de administracion, las posologfas y las formas galenicas de los compuestos y de las composiciones segun la invencion, segun los criterios tomados generalmente en cuenta en el establecimiento de un tratamiento farmaceutico adaptado para un paciente tales como, por ejemplo, la edad o el peso corporal del paciente, la gravedad de su estado general, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios constatados. El tratamiento de las infecciones genitourinarias se realizara de manera preferida por administracion de una o dos capsulas blandas de 350 mg/dfa.
La presente invencion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que comprende al menos 100 mg, preferiblemente al menos 150 mg y mas preferiblemente al menos 200 mg de tiosulfato por gramo de polvo, en asociacion con 107 a 1010 UFC de una cepa de Lactobacillus, para su uso en el tratamiento de infecciones genitourinarias tales como vaginosis, candidiasis e infecciones urinarias, mediante la potenciacion del efecto antipatogeno de los lactobacilos.
Tambien se describe en la presente solicitud la utilizacion de tiosulfato y en particular de tiosulfato de sodio, para el tratamiento de infecciones genitourinarias tales como vaginosis, candidiasis e infecciones urinarias, mediante potenciacion del efecto antipatogeno de lactobacilos.
Se podra utilizar el tiosulfato en combinacion con lactobacilos, tal como se describio anteriormente. Tambien se
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describe la administracion del tiosulfato solo con el objetivo de potenciar el efecto antipatogeno de los lactobacilos presentes de manera endogena en la cavidad vaginal.
Descripcion de las figuras
figura 1. Influencia de la concentracion de tiosulfato de sodio en la formulacion de la cepa L. Crispatus BLL2005, para la inhibicion del patogeno C. albicans. Se expresan los resultados como disminucion logarftmica decimal (logic) del numero de UFC entre la numeracion T0 y en los diferentes puntos de muestreo (T=4h, 24h y 28h).
figura 2. Composiciones que comprenden diferentes cepas de lactobacilos sin (figura 2A) o con (figura 2B) tiosulfato de sodio, para la inhibicion del patogeno C. albicans. Se expresan los resultados como la disminucion logarftmica decimal (log™) del numero de UFC entre la numeracion a T0 y en los diferentes puntos de muestreo (T=4h, 24h y 28h).
figura 3. Composicion que comprende la cepa L. crispatus BLL2005 sin (figura 3A) o con (figura 3B) tiosulfato de sodio, para la inhibicion de diferentes patogenos. Se expresan los resultados como la disminucion logarftmica decimal (log-10) del numero de UFC entre la numeracion a T0 y en los diferentes puntos de muestreo (T=4h, 24h y 28h).
figura 4. Efecto del tiosulfato de sodio (TS, 1 g/litro o 3g/litro) utilizado solo, sobre el crecimiento del patogeno C. albicans.
figura 5. Efecto de la 'formulacion A' con o sin la presencia de L. crispatus, sobre el crecimiento del patogeno C. albicans. Los lotes E117 y E122 contienen unos L. crispatus; los lotes LYO A1 y LYO A1 no los contienen.
figura 6. Cocultivo de la cepa Lcr35® (L rhamnosus) formulada con 150 mg de tiosulfato (despues de liofilizacion en el producto final) y de Candida albicans.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Asociacion de la cepa L. crispatus BLL2005 y de diferentes concentraciones de tiosulfato de sodio, para la inhibicion del patogeno C. albicans
Se realizaron unos ensayos de coincubacion entre la cepa patogena Candida albicans UMIP48.72 (ATCC10231) con la cepa L. crispatus BLL2005, formulada con diferentes concentraciones de tiosulfato de sodio. La base de la formulacion corresponde a la formulacion A (ver a continuacion), en la que se hizo variar la concentracion de tiosulfato de sodio. Se anade este elemento al terminar la fermentacion, antes de la etapa de liofilizacion.
La formulacion A comprende los siguientes componentes:
- Medio de cultivo: 116 g/l de leche, 15 g/l de dextrosa, 10 g/l de autolizado de levadura, 2 ml/l de Tween,
- Medio de liofilizacion: 110 g/l de leche, 101,5 g/l de FOS, 9,5 ml/l de glutamato, 5,25 g/l de acido ascorbico, 113 g/l de tiosulfato de sodio.
Se ensayaron las siguientes formulaciones (Tabla 1):
- Referencia del lote
- Formulacion A asociada con una concentracion de tiosulfato de sodio de:
- E289-2005
- 0 g/l
- E290-2005
- 10 g/l
- E291-2005
- 25 g/l
- E292-2005
- 50 g/l
- E293-2005
- 75 g/l
- E115-2005 = formulacion A
- 113 g/l
Descripcion del modo de puesta en practical
Medios de cultivo utilizados:
- Cepas de lactobacilos: Caldo/agar de MRS (a 37°C)
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- Cepas patogenas: Caldo y agar de Sabouraud (a 25°C)
- Medio de cultivo del ensayo: mezcla homogenea de los dos medios de cultivo.
Preparacion de los inoculos:
- Trabajar con muestras sin bloqueo en frfo,
- Producto probiotico: se coloca 0,2 g en 20 ml de caldo MRS - en horno a 37°C durante 48 h,
- Cepa patogena: se coloca 0,2 ml en 20 ml de caldo de Sabouraud a 25°C durante 48 h,
- Se controla mediante aislamiento la pureza de las cepas.
Preparacion de los controles:
- Para la fabricacion del control patogeno, se colocan 5 ml de caldo de Sabouraud inoculado (titulacion cerca de 1.108 UFC/ml) con 5 ml de caldo MRS no inoculado.
- Para la fabricacion del control probiotico, se colocan 5ml de MRS inoculado (titulacion cerca de 1.108 UFC/ml) con 5 ml de caldo de Sabouraud no inoculado.
Puesta en contacto de los inoculos:
- Colocar 5 ml de la cepa patogena con 5 ml de la cepa probiotica. Se realizan unas extracciones directamente de la mezcla.
Seguimiento:
- Determinacion de la numeracion del patogeno y del probiotico a T0, T4, T24 y T28h
- Determinacion del pH de la solucion a T0, T4, T24 y T28h Resultados
Los resultados estan representados en la figura 1 y en la tabla 2 siguiente. Se expresan los resultados como la disminucion logarftmica decimal (log™) del numero de UFC entre la numeracion a T0 y en los diferentes puntos de muestreo (T4h, T24h y T28h).
- Reduccion en log10
- 4 horas
- 24 horas 28 horas
- Candida albicans vs E289-2005 (0 q/l)
- 0 1 2
- Candida albicans vs E290-2005 (10 g/l)
- 0 3 3
- Candida albicans vs E291-2005 (25 g/l)
- 0 3 5
- Candida albicans vs E292-2005 (50 g/l)
- 0 3 3
- Candida albicans vs E293-2005 (75 g/l)
- 0 3 7
- Candida albicans vs E115-2005 (113 g/l)
- 0 6 7
Para todos los ensayos, la numeracion de la cepa BLL2005 permanecfa constante durante la coincubacion. Conclusion
Este experimento permite demostrar que a partir de 10 g/l de tiosulfato de sodio en la formulacion A de la cepa L. Crispatus BLL2005, se observa despues de 28 h de coincubacion un aumento en la inhibicion contra la cepa patogena Candida albicans ensayada, de al menos 1 log. A partir de una concentracion de 75 g/l, se obtuvo in vitro una inhibicion completa del patogeno.
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Ejemplo 2 - Asociacion de diferentes cepas Lactobacillus y tiosulfato de sodio, para la inhibicion del patogeno C. albicans
Cepas ensayadas
Las cepas siguientes se ensayaron con o sin la 'formulacion A' que comprende 113 g/litro de tiosulfato de sodio (tabla 3)
- PB 0003
- CIP 69.17 Lb jensenii T
- PB 004
- CIP 101887 Lb reuteri T
- PB 0033
- CIP 105932 Lb vaginalis T
- PB 0041
- BLL2005 Lb crispatus
- PB 0039
- Lcr35® Lb casei variedad rhamnosus
El modo de puesta en practica es equivalente al descrito en el ejemplo 1.
Para todos los ensayos, las numeraciones de las cepas de lactobacilos permanecfan constantes durante la coincubacion.
Se muestran los resultados en la figura 2. Se expresan los resultados como la disminucion logarftmica decimal (log-10) del numero de UFC entre la numeracion a T0 y los diferentes puntos de muestreo (T4h, T24h y T28h).
Conclusion:
En el estado natural, todas las cepas de Lactobacillus ensayadas tienen pocas o ninguna capacidades inhibidoras frente al patogeno C. albicans (vease la figura 2A).
Por el contrario, cuando se utiliza la formulacion A en asociacion con las cepas PB00033, BLL2005 y Lcr35®, se observa una inhibicion completa del patogeno despues de 28 h de coincubacion. La asociacion de la formulacion A con las cepas PB0003 y PB0004 permite obtener una inhibicion del patogeno superior a 3 log.
Asf, la formulacion de diferentes especies de lactobacilos con tiosulfato de sodio permite que las 5 cepas ensayadas aumenten muy significativamente su capacidad para inhibir el patogeno Candida albicans.
Ejemplo 3 - Asociacion de L. crlspatus BLL2005 y tiosulfato de sodio, para la inhibicion de varios patogenos
Se realizaron diferentes ensayos de coincubacion entre varias cepas Candida y la cepa L. crispatus BLL2005 formulada sin tiosulfato de sodio (figura 3A) o segun la formulacion A (figura 3B).
Tabla 4 - Cepas patogenicas ensayadas
- PBp0001 - Candida albicans
- ATCC 10231
- PBp0016 - Candida Albicans
- Aislamiento clinico
- PBp0017 -Candida kefyr
- Aislamiento clinico
- PBp0018 - Candida tropi-calis
- Aislamiento clinico
- PBp0019 - Candida albicans
- Aislamiento clinico
- PBp0020 - Candida albicans
- Aislamiento clinico
- PBp0021 - Candida albicans
- Aislamiento clinico
El modo de puesta en practica es equivalente al descrito en el Ejemplo 1.
Para todos los ensayos, la numeracion de las cepas de lactobacilos permanece constante durante la coincubacion. La determinacion de la numeracion del patogeno y del probiotico se realiza a T0, T4h, T24H y T28h. Para todos los ensayos, la numeracion de la cepa BLL2005 permanece constante durante la coincubacion.
Los resultados se presentan en la figura 3. Se expresan los resultados como la disminucion logarftmica decimal (log10) del numero de UFC entre la numeracion a T0 y en los diferentes puntos de muestreo (T0, T4h, T24H y T28h).
Conclusion:
La formulacion A de la cepa L. crispatus BLL2005 (lote ensayado: E115-2005) permite obtener, despues de 28h de coincubacion, una inhibicion superior o igual a 3 log frente a todas las cepas de Candida ensayadas.
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Ejemplo 4 - Preparacion de la “formulacion A”
Se cultiva la cepa BLL2005 en el siguiente medio de cultivo:
116 g/l de leche, 15 g/l de dextrosa, 10 g/l de autolizado de levadura, 2 ml/l de Tween.
Despues de la inoculacion del medio de cultivo, se mantiene la fermentacion a una temperatura de 37°C mediante un dispositivo termostaticamente apropiado durante 48 a 72 horas. Al final de la fermentacion, se vierte en una cuba de mezcla el cultivo que ha alcanzado una numeracion superior o igual a 108 UFC/ml. El cultivo se agita fuertemente para romper el coagulo y se anaden los siguientes adyuvantes de liofilizacion: 110 g/l de leche, 101,5 g/l de FOS, 9,5 ml/l de glutamato de sodio, 5,25 g/l de acido ascorbico, 113 g/l de tiosulfato de sodio.
Despues, se realiza la liofilizacion segun las condiciones clasicas bien conocidas por el experto en la materia: se distribuyen las bacterias asepticamente sobre bandejas de acero inoxidable, se congelan rapidamente hasta -40°C y despues se someten a una operacion de sublimacion a -22°C. Despues, se realiza el secado en horno a 37 °C.
Despues, se tritura y se tamiza el producto bajo atmosfera controlada. El polvo obtenido puede ser mezclado ventajosamente con un 1% de estearato de magnesio para facilitar el llenado de las capsulas duras/capsulas blandas.
Se distribuye el polvo asf obtenido en capsulas blandas de tamano n° 0 a razon de 350 mg de polvo por capsula blanda.
Ejemplo 5 - Efectos antipatogenos del sobrenadante de cultivo de la formulacion A
Se ensayo la siguiente cepa Candida: PBpOOO1- Candida albicans ATCC 10231.
Medios de cultivos utilizados:
- Cepas Lactobacilos: Caldo/agar de MRS (a 37°C).
- Cepas patogenas: Caldo y agar Sabouraud (a 25°C).
- Medio de cultivo del ensayo: mezcla homogenea de los dos medios de cultivo.
Preparacion de los inoculos:
- Trabajar con muestras sin bloqueo en frfo,
- Producto probiotico:
- Se coloca 0,2 gramos de la formulacion A en 20 ml de caldo MRS - en horno a 37°C durante 48 h.
- Cepa patogena: Se coloca 0,2 ml en 20 ml de caldo Sabouraud a 25°C durante 48 h.
- Se controla la pureza de las cepas mediante aislamiento.
Preparacion de los controles:
- Para la fabricacion del control patogeno, se colocan 5 ml del caldo Sabouraud inoculado (titulacion proxima a 1.108 UFC) con 5 ml de caldo MRS no inoculado.
- Para la fabricacion del control probiotico, se colocan 5 ml de MRS inoculado (titulacion proxima a 1.108 UFC/ml) con 5 ml de caldo Sabouraud no inoculado.
Puesta en contacto de los inoculos:
- Colocar 5 ml de la cepa patogena con 5 ml del sobrenadante de cultivo de la cepa probiotica. Se obtuvo el sobrenadante mediante centrifugacion a 10.000 rpm durante 10 minutos y despues una filtracion a 0,22 mm. Se realizan los muestreos directamente en la mezcla.
Resultados:
Se expresan los resultados en disminucion logarftmica decimal (log-10) del numero de UFC entre la numeracion de T0 y los diferentes puntos de muestreo (T24h, T48H y T72h).
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- Disminucion en log-iQ
- 24h
- 48h 72h
- Candida albicans frente al sobrenadante de la formulacion A BLL2005
- 0 7 7
- Control Candida albicans
- 0 0 0
Conclusion:
Despues del precultivo durante 48h en caldo MRS, el sobrenadante de la formulacion A, obtenido mediante centrifugacion a 10.000 rpm durante 10 minutos y despues filtracion a 0,22 mm, permite iniciar la inhibicion completa de la cepa patogena C. albicans a partir de 48h despues de la coincubacion.
Ejemplo 6 - Efecto del tiosulfato de sodio solo sobre el crecimiento del patogeno C. albicans
Descripcion del protocolo:
- Inoculacion de la cepa 66h antes de realizar el ensayo.
- Puesta en contacto del precultivo con el tiosulfato de sodio.
- Determinacion de la titulacion a T0h, 724h, T48h, T72h y T96h.
Preparacion del ensayo:
- Cepa Patogena:
Candida albicans: Caldo Sabouraud - 0,5 ml del tubo de trabajo en 50 ml a 25°C durante 48h.
- Tiosulfato: Se prepara el medio MRS (DeMan, Rogosa y Sharpe) + tiosulfato de sodio (TS) a las diferentes concentraciones como se indica a continuacion:
Medio MRS + 1 g/l de tiosulfato de sodio: se coloca 0,3 g de TS en 30 ml de caldo.
Medio MRS + 3 g/l de tiosulfato de sodio: se coloca 0,1 g de TS en 10 ml de caldo.
Puesta en contacto:
El medio de cultivo del ensayo es una mezcla homogenea del medio de cultivo de patogeno y del medio MRS que contiene tiosulfato de sodio.
- Candida albicans + medio MRS + TS (1 g/l): se colocan 5 ml de caldo Sabouraud inoculado con la cepa patogena y 5 ml del medio MRS + TS (1 g/l).
- Candida albicans + medio MRS + TS (3 g/l): se colocan 5 ml de caldo Sabouraud inoculado con la cepa patogena y 5 ml del medio MRS + TS (3 g/l).
- Controles de Candida: Se colocan 5 ml de caldo de Sabouraud inoculado con la cepa patogena y 5 ml de caldo MRS.
Los resultados se presentan en la figura 4.
La “formulacion A” que comprende 113 g/litro de tiosulfato de sodio tambien se ha ensayado por su accion anti- Candida.
Preparacion del control Candida:
Para la fabricacion del control Candida, se colocan 5 ml de caldo Sabouraud inoculado con la cepa patogena (titulacion proxima a 1.108 UFC/ml) y 5 ml de caldo MRS no inoculado.
Se realizan los muestreos y las determinaciones de las titulaciones a T0, T4h, T24h y T28h.
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- 0 4h 24h 28h
- Candida albicans frente a la formulacion A sin lactobacilos
- 6,00E+06 5,50E+06 8,00E+06 9,00E+06
- Control Candida sobre Sabouraud
- 5,00E+06 9,00E+06 1,50E+07 9,8E+06
La figura 5 ilustra varios tipos de cultivos:
- El control “Candida” cultivado solo;
- Dos lotes (E117 y E112) que comprenden la cepa BLL2005 en la formulacion A, tal como se ha descrito anteriormente;
- Dos lotes (LYO 2005 A1 y A2) que comprenden la formulacion A sola, sin bacterias.
Es evidente que la formulacion A, que contiene 113 g/litro de tiosulfato de sodio, no tiene ninguna actividad de inhibicion del crecimiento de Candida.
Conclusion: No se observa ningun potencial antipatogeno en presencia de tiosulfato de sodio, sea cual sea la concentracion estudiada. Este experimento demuestra que el tiosulfato por si mismo no permite inhibir el crecimiento de Candida albicans y que actua solamente como un agente potenciador de lactobacilos.
Ejemplo 7 - Cocultivo de la cepa Lcr35® (L. rhamnosus) formulada con 113 g/litro de tiosulfato y Candida albicans, y la produccion de bacteriocinas mediante esta cepa con o sin tiosulfato
A. Inhibicion del crecimiento de Candida albicans en presencia de la cepa Lcr35® (L. rhamnosus)
Los recuentos han mostrado una inhibicion total de T=24H de la cepa patogena con un formulacion de Lcr35® que contiene 113 g/l de tiosulfato (figura 6).
B. Potenciacion de la expresion de genes que codifican bacteriocinas por el tiosulfato.
La cepa L. rhamonosus Lcr35® es capaz de inhibir el crecimiento de patogenos. Ademas, la cepa formulada con tiosulfato es mas eficaz que la cepa sola. Para comprender los mecanismos que difieren entre estas dos condiciones, se buscan unos genes implicados en la produccion de bacteriocinas. En Lcr35®, se encontraron 7 genes que codifican a las bacteriocinas.
Materiales y Metodos
En la bibliograffa, varias bacteriocinas estan asociadas con bacterias lacticas. Las secuencias de genes que codifican a estas ultimas se descargaron de NCBI (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y despues se alinearon frente a los genomas de nuestra cepa probiotica gracias al BLAST.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y despues se alinearon frente a los genomas de nuestra cepa probiotica gracias al BLAST.
La Tabla 7 siguiente presenta los diferentes genes que codifican las bacteriocinas encontradas en los genomas de Lcr35®:
- entA
- Enterocina
- pedC/papC
- Pediocina
- spaR
- Subtlina
- cvpA
- Colicina
- Bac1
- Bacteriocina desconocida
- spiA
- Sakacina
- Iec1
- Leucocina
Seguimiento y cuantificacion de genes de interes
Se han disenado unos pares de cebadores especfficos de los genes objetivos anteriores con el fin de seguir su expresion por RT-PCRq. Se realizaron dos cultivos puros y un cocultivo para Lcr35®, los primeros con la cepa probiotica nativa, los segundos con una formulacion de 1 g/litro de tiosulfato y las ultimas con una formulacion de 113 g/l de tiosulfato y C. albicans.
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- Bacteriocinas y genes de codificacion
- Lcr35 Lcr35® + 1 g/l de tiosulfato Lcr35® + 113 g/l de tio-sulfato
- Enterocina
- entA1 1 1 1
- entA2
- 1 3 6
- Pediocina
- papC 1 3 5
- Subtilina
- spaR 1 2 1
- Colicina
- cvpA 1 3 5
- Bacteriocina desconocida
- bac1 1 2 2
- Sakacina
- spiA 1 4 4
- Leucocina
- Iec1 1 2 3
El seguimiento de la expresion de estos genes mediante RT-PCR cuantitativo demostro una sobreexpresion de 6 genes que codifican para unas bacteriocinas cuando se formula la cepa con 1 g/l de tiosulfato. Cuando esta formulacion comprende 113 g/l de tiosulfato, se sobreexpresan tambien con mas fuerza 3 genes implicados en la secrecion de las bacteriocinas. Por lo tanto, la presencia de tiosulfato puede favorecer la secrecion de bacteriocinas que participaran entonces en la inhibicion de patogenos tal como C. albicans.
Por lo tanto, se ha demostrado que el tiosulfato permite potenciar a los lactobacilos en la inhibicion del patogeno Candida Albicans, permitiendo en particular la sobreproduccion de bacteriocinas.
Referencias - documentos de patentes
WO 84/04675 WO 2000/035465 WO 2006/045475 WO 2010/004005 WO 2010/133314 WO 2011/066949 US 2002/0044926 US n° 6.093.394 US n° 6.468.526 US n° 7.807.440 US 2010/0151026 US 2011/0008467 EP 0 732 916 B1 EP 1 911 455 A1 EP 2 111 640 A1 CN 20091145852
Referencias bibliograficas
Nivoliez A, Camares O, Paquet-Gachinat M, Bornes S, Forestier C, Veisseire P. “Influence of manufacturing processes on in vitro properties of the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus Lcr35®". J. Biotechnol. 31 de agosto de 2012; 160(3-4): 236-41. Epub 19 de abril de 2012.
Claims (9)
- 51015202530REIVINDICACIONES1. Tiosulfato para su utilizacion en el tratamiento de infecciones genitourinarias tales como vaginosis, candidiasis e infecciones urinarias, para potenciar el efecto antipatogeno de bacterias lactobacilos, estando el tiosulfato en una cantidad de por lo menos 100 mg/gramo de polvo, para un polvo que comprende de 107 a 1010 UFC/g de lactobacilos.
- 2. Tiosulfato para su utilizacion segun la reivindicacion 1, caracterizado por que el tiosulfato se selecciona de entre el tiosulfato de sodio o el tiosulfato de potasio.
- 3. Tiosulfato para su utilizacion segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que el tiosulfato se utiliza en una cantidad de aproximadamente 230 mg/gramo de polvo, para un polvo que comprende entre 107 y 1010 UFC/g.
- 4. Tiosulfato para su utilizacion segun la reivindicacion 1, caracterizado por que los lactobacilos son Lactobacillus rhamnosus y/o Lactobacillus crispatus.
- 5. Composicion farmaceutica que comprende por lo menos 100 mg de tiosulfato por gramo, en combinacion con una cepa de Lactobacillus crispatus.
- 6. Composicion farmaceutica que comprende un sobrenadante de cultivo de una cepa Lactobacillus cultivada en presencia de tiosulfato de sodio, no conteniendo dicho sobrenadante lactobacilos.
- 7. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 5 o 6, formulada para una administracion por via vaginal o por via oral.
- 8. Composicion segun una de las reivindicaciones 6 a 7, para su utilizacion en el tratamiento de infecciones genitourinarias tales como la vaginosis, la candidiasis y las infecciones urinarias.
- 9. Composicion farmaceutica que comprende por lo menos 100 mg de tiosulfato por gramo, en combinacion con 107 a 1010 UFC/g de una cepa Lactobacillus, para su utilizacion en el tratamiento de infecciones genitourinarias tales como la vaginosis, la candidiasis y las infecciones urinarias, mediante potenciacion del efecto antipatogeno de los lactobacilos.
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