CN1888051B - 一株植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株植物乳杆菌及其应用。本发明所公开的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329分离自中国孕妇***分泌物,对妇***道常见的致病菌如金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌和***加德纳菌有较强的抑菌作用,产酸和产H202的能力均高于其它乳酸杆菌,培养96小时,培养液的pH可达3.96;该菌株表面具有厚厚的非菌毛黏附素,对***上皮细胞有较好的黏附作用,并且在室温适宜的保存液中放置,活菌数增加3×104倍。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329可用于制备***微生态制剂,用以预防和/或治疗妇***道感染性疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一株乳酸杆菌及其应用,特别涉及一株植物乳杆菌及其应用。
背景技术
一、乳酸杆菌和妇***道病
乳酸杆菌(Lactobacillus)是健康妇***道内主要的、也是最重要的正常菌群,***内乳酸杆菌不但无致病性,而且能自洁***微生态环境,制约其它致病菌定植生长。因此,临床上将***涂片可见大量(高倍镜下每个视野数个)乳酸杆菌,未察见或仅有少量革兰氏阴性杆菌作为正常、无***感染的标准,而***内乳酸杆菌缺失或减少是***感染的重要指标(Robert P.Nugent,Marijane A.Krohn,and Sharon L.Hillier Reliability of diagnosing bacterial vaginosisis improved by a standardized method of Gram stain interpretation Journalof Clincal Microbiology 1991,29(2):297-301)。
妇女细菌性***病(Bacterial Vaginosis,简称BV)主要是指由细菌、霉菌、滴虫等微生物引起的***炎,临床一般使用抗生素治疗,但抗生素治疗有较高的复发率,尤其对于一些老年性***炎和多发性***炎患者,抗生素治疗往往效果不佳,因为在使用抗生素杀灭致病微生物的同时也破坏了体内的正常菌群,尤其是抑制了***内乳酸杆菌的生长,从而失去了对微生态环境中致病微生物的制约作用,使其它致病微生物定植生长。另外,妇女怀孕期间由于免疫调节紊乱易发***感染,而孕妇的特殊性使其不能使用抗生素治疗。
二、乳酸杆菌***制剂的应用情况
乳酸杆菌作为微生态制剂治疗妇***道病在国外已得到广泛应用(Nigel W.Mclean and Isobel J.Rosenstein Characterisation and selection of aLactobacillus species to re-colonise the vagina of women with recurrentbacterial vaginosis L Med Microbiol 2000,49:543-552;Elmer GM.Probiotics:”living drugs”Am J Health Syst Pharm 2001,58(12):1101-9),该药属非处方制剂,患者可自行购买。制剂中的乳酸杆菌一般自正常妇***道中分离,常见的有嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)等。由于人种和个体的差异,国外同类制剂不一定适宜包括中国人在内的亚洲人,国内已开始研制同类制剂乳杆菌。
应用微生态制剂治疗疾病,肯定是抗生素辉煌时代后的又一灿烂亮点,是抗生素无法取代的又一制药方向,蕴藏着巨大的经济效益和社会效益。
乳酸杆菌作为***内微生态制剂适合于以下人群:
(1)老年***炎患者
老年***炎既萎缩性***炎,是老年妇女常见病之一,在绝经妇女中***炎发病率国内报道为30-50%,国外报道为30%.专家认为老年***炎的主要病因是***微环境中乳酸杆菌缺乏,其它致病微生物定植所致.抗生素治疗老年***炎效果不佳,而定期植入乳酸杆菌制剂可抑制其它致病菌生长,是改善老年患者***炎症状,使其处于健康状态,从而提高老年妇女生活质量的根本途径(Reid G,Bruce AW.Urogenital infections in women:can probiotics help?PostgradMed J.2003 Aug;79(934):428-32)。
(2)孕妇
孕妇与正常妇女比较,由于激素水平的变化引起T抑制淋巴细胞亢进,从而造成免疫力低下,易发生生殖***。治疗孕妇感染一般不使用抗生素,因为大多数抗生素对胎儿有影响,例如用于治疗滴虫和厌氧菌性***炎的药物“灭滴灵”,动物实验中显示有致癌和致畸作用,用于治疗非特异性***炎的大环内酯类药物影响胎儿骨骼发育。而乳酸杆菌是正常菌群,无致病性,对***微环境有自洁作用。因此对于患有***炎的孕妇***内植入乳酸杆菌制剂,可使其安全渡过孕期以及围产期。孕妇感染BV容易引起子***和早产,英国最新的调查表明,妊娠20周时,***内克隆有产H2O2的乳酸杆菌的孕妇,其患BV的危险性大大低于无产H2O2的乳酸杆菌的孕妇,其子***的患病率和早产率也大大低于后者(Wilks M,Wiggins R,Whiley A,Hennessy E,Warwick S,Porter H,CorfieldA,Millar M.Identification and H(2)O(2)production of vaginal lactobacillifrom pregnant women at high risk of preterm birth and relation with outcome.J Clin Microbiol.2004 Feb;42(2):713-7)。因此,有人利用产H2O2的乳酸杆菌菌液为22名患有BV,年龄在20-34岁、妊娠3个月的孕妇冲洗***,每天冲洗1次,冲洗7天为1个疗程,隔1周后开始第2疗程。结果治疗3天后全部孕妇症状得到改善,2个疗程后90%孕妇***状况恢复正常(Tasdemir M,Tasdemir I,Tasdemir S,Tavukcuoglu S.Alternative treatment for bacterial vaginosisin pregnant patients;restoration of vaginal acidity and flora.Arch AIDSRes.1996;10(4):239-41)。
(3)慢性病患者
对于慢性病患者,如糖尿病患者,红斑狼疮、风湿病、器官移植等长期使用免疫抑制剂和广普抗生素的人群,常常会出现正常菌群失调;一些肢体残疾、长期坐卧的女性***容易感染厌氧菌;对于这类妇女,植入乳酸杆菌***制剂,将会为她们解除痛苦,起到有效的“保洁”作用。
三、用作乳酸杆菌***制剂菌株的来源和应具有的条件
1、用作乳酸杆菌***制剂菌株的来源
用作乳酸杆菌***微生态制剂的菌株一般均来源于健康妇***道正常菌群,而分离自***清洁度极好的孕妇***正常菌群的乳酸杆菌将会有更好的效果。1999年英国报道从孕妇分离乳酸杆菌用于研制***微生态制剂。
孕妇在孕期,尤其是在孕前期,由于激素水平的变化引起机体免疫***絮乱,常常是T抑制细胞亢进造成免疫力低下,因而易发生生殖***。但在免疫力低下的状态下,有些孕妇仍能保持较好的***清洁度,说明其***正常菌群,既乳酸杆菌,具有较强抑制致病菌生长的能力。
2、用作乳酸杆菌***微生态制剂的菌株一般应具有以下几个方面的条件:
(1)黏附占位性
乳酸杆菌对***上皮细胞的黏附性对于用作微生态制剂非常重要,体外试验表明,乳酸杆菌在硅胶表面生长,可以干扰尿道致病菌在该硅胶表面的吸附(Velraeds MM Interference in initial adhesion of uropathogenic bacteriaand yeasts to silicone rubber by a Lactobacillus acidophilus J MedMicrobiol 1998,47(12):1081-5)。
乳酸杆菌在生长过程中不断向胞外分泌一种非菌毛黏附素,形态学观察可见细菌外周一层厚厚的、致密的、参差不齐、锯齿状物质,又称为毛发样突出物(fibritlae),其化学成分是脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA),起与宿主细胞的黏附作用。LTA与宿主细胞的黏附作用的机制被认为,一方面作为配体与宿主细胞受体相结合,另一方面通过LTA游离部分所带电荷与宿主细胞间相互作用(Otero MC,Ocana VS,Elena Nader-Macias M.Bacterial surfacecharacteristics applied to selection of probiotic microorganisms.MethodsMol Biol.2004;268:435-40)。因此,***的毛发样突出物越多,对宿主细胞的黏附作用越强。
乳酸杆菌利用非菌毛黏附素,即毛发样突出物可以很好地附着在***壁上,所形成的生物屏障使其它致病菌无法在***中形成克隆,起到了占位效应。乳酸杆菌体积越大,占位效应越好。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),在乳杆菌属中为体积最大的种,因而具有更好的占位性。关于植物乳杆菌用于微生态制剂以及其对***上皮细胞具有较好的黏附性和占位性,国外文献和专利已有报道(Bonetti A,Morelli L,Campominosi E,Ganora E,Sforza F.Adherenceof Lactobacillus plantarum P 17630 in soft-gel capsule formulation versusderlein’s bacillus in tablet formulation to vaginal epithelial cells.Minerva Ginecol.2003 Jun;55(3):279-84,284-7)。
(2)产酸
由于乳酸杆菌的嗜酸性,使其适于在酸性环境中生长,其发酵糖类所产生的谢产物几乎全部为乙酸,使***内环境pH降低,从而不利于其它致病菌生长。年妇女由于其***表皮细胞糖元化程度降低,大量乳酸杆菌丢失,因此***内微环境pH升高,使得老年妇女容易患***炎。因此,许多研究认为,乳酸杆菌的存在所形成的酸性微生态环境,是防止***病的最主要因素(E.R.Boskey,K.M.Telsch Acid production gyvaginal flora in vitro is consistent withthe rate and extent of vaginal acidification Infection and Immunity 1999,67(10):5170-5)。
(3)产过氧化氢(H2O2)
有些妇***道内寄生的乳酸杆菌数量并不算少,但仍然有炎症发生,这是因为这些乳酸杆菌不产H2O2,而清洁度好的妇***道寄生的乳酸杆菌大多产H2O2。如加利亚2003年分别调查了40名健康妇女和72名感染BV妇***道菌群的情况,发现健康妇女92.5%(37/40)***菌群中克隆有产H2O2的乳酸杆菌,而感染BV妇女仅有4.1%(3/72)***菌群中克隆有产H2O2的乳酸杆菌。作者认为,乳酸杆菌所产H2O2非特异性地起到保护***微环境的作用(Shopova E.Hydrogenperoxide-producing Lactobacillus species in healthy women and in women withbacterial vaginosis Akush Ginekol(Sofiia).2003;42 Suppl 1:12-5)。H2O2可以抑制某些好氧细菌和霉菌的生长。文献报道,缺乏产H2O2的乳酸杆菌,是大肠杆菌引起的***炎、尿道炎复发的主要因素(Juarez Tomas MS,Ocana VS,WieseB,Nader-Macias ME.Growth and lactic acid production by vaginalLactobacillus acidophilus CRL 1259,and inhibition of uropathogenicEscherichia coli.J Med Microbiol.2003 Dec;52(Pt 12):1117-24)。有人应用H2O2液冲洗***治疗BV感染,并与灭滴灵和氯洁霉素治疗进行比较:58名年龄在18-42岁感染BV的女性患者临床用30ml 3%H2O2液冲洗***,每天1次,共冲洗7天。3个月后与灭滴灵和氯洁霉素治疗进行比较,BV的主要症状得以清除,包括98%患者消除恶臭,98%***pH<4.5,97.7%胺试验阴性,100%***分泌物中未检出线索细胞并建立起含有产H2O2乳酸杆菌的正常菌群(Cardone A,Zarcone R,Borrelli A,Di Cunzolo A,Russo A,Tartaglia E.Utilisation of hydrogenperoxide in the treatment of recurrent bacterial vaginosis.Minerva Ginecol.2003 Dec;55(6):483-92)。
(4)抑菌作用
有些乳酸杆菌在生长过程中,可向体外分泌乳酸杆菌菌素,这些菌素对许多***致病微生物可产生抑制其生长的作用,这些菌素的成份和作用机理还不清楚,有研究证明乳酸杆菌菌素是一种具有抗菌作用的蛋白质成分的物质,也有人认为所谓乳酸杆菌菌素,即是乳酸杆菌的酸性代谢产物。但是无论乳酸杆菌菌素是何种成分的物质,用作***微生态制剂的乳酸杆菌菌株必须要有抑菌作用(Aroutcheva AA.Simoes JA,Faro S.Antimicrobial protein produced byvaginal Lactobacillus acidophilus that inbibits Gardnerella vaginalisInfect Dios Obstet gynecol 2001,9(1):33-9;Tomas MS,Claudia Otero M,OcanaV,Elena Nader-Macias M.Production of antimicrobial substances by lacticacid bacteria I:determination of hydrogen peroxide.Methods Mol Biol.2004.268:337-46)。
(5)生长条件和稳定性
乳酸杆菌生长对营养的需求差异很大,大多数乳酸杆菌营养需求苛刻,需要高成本的营养添加剂,并且生长缓慢,不适合用于制剂生产。用作***微生态制剂的乳酸杆菌菌株要能够适应普通生长条件,在普通生长条件下可以大量繁殖;另外,该菌株在适宜的保存液中可以长期存活也是用作***微生态制剂菌株的必备条件。
发明内容
本发明的目的是提供一株新的植物乳杆菌。
本发明所提供的植物乳杆菌是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323,该菌株已于2005年03月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),保藏编号为CGMCC No.1329。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323CGMCC No.1329分离自***清洁度高、微环境好的人体,对妇***道常见的致病菌如金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌和***加德纳菌显示有较强的抑菌作用,产酸和产H2O2的能力均高于其它乳酸杆菌,培养96小时,培养液的pH可达3.96;该菌株表面具有厚厚的非菌毛黏附素,对***上皮细胞有较好的黏附作用,并且在适宜的保存液中室温放置半年,活菌数增加3×104倍。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323CGMCC No.1329可用于制备***微生态制剂,用以预防和/或治疗妇***道感染性疾病。
附图说明
图1为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329的革兰氏染色照片
图2A为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329对金黄色葡萄球菌ATCC6035的抑菌作用
图2B为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329对白色念珠菌ATCC1023的抑菌作用
图2C为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329对大肠杆菌ATCC25922的抑菌作用
图2D为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329对***加德纳菌ATCC14018的抑菌作用
图3为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329产H2O2呈蓝绿色菌落的平板照片
图4为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329的电镜照片
具体实施方式
下述实施例中的实验方法,如无特别说明,均为常规方法。
实施例1、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329的分离及鉴定
1、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329的分离
首先采集在301医院妇产科定期进行孕期检查的300余位健康中国孕妇***后穹窿部位分泌物,在用MRS培养基进行细菌分离的同时,进行以下几方面的试验:(1)直接涂片,根据乳酸杆菌和革兰氏阴性细菌的数量进行清洁度评价(0-2分,正常;4-6分,轻度炎症;8-10分,重度炎症),其中,***清洁度的评价标准参照文献(Robert P.Nugent,Marijane A.Krohn,and Sharon L.HillierReliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardizedmethod of Gram stain interpretation Journal of Clincal Microbiology1991,29(2):297-301);(2)***分泌物pH测定;(3)定量测定***分泌物中乳酸杆菌的数量。结果得到一株分离自***清洁度评价为0-2分,***分泌物中乳酸杆菌数量大于1×108CFU/ml,pH值为3.25的***分泌物的乳酸杆菌,菌株号为L323。
2、细菌鉴定
菌体形态观察按常规法进行革兰氏染色镜检。革兰氏染色可见L323株乳酸杆菌为革兰氏阳性粗大杆菌,大小约为1×3-8um(图1)。
生化反应采用法国梅里埃生物公司API 50细菌鉴定***,包括API 50培养基、试验条、McFarland标准点、矿物油、培养盒和API Plus软件等。API 50细菌鉴定***鉴定结果表明L323株乳酸杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum),其生化反应结果如表1所示。
表1 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323的生化反应
七叶灵ESC | + | 木糖醇XLT | - |
甘油GLY | - | 龙胆二糖GEN | + |
赤癣醇ERY | - | D-松二糖TUR | + |
D-***糖DARA | - | D-来苏糖LYX | - |
L-***糖LARA | + | D-塔格糖TAG | - |
核糖RIB | + | D-岩糖DFUC | - |
D-木糖DXYL | - | L-岩糖LFUC | - |
L-木糖LXYL | - | D-***糖醇DARL | + |
阿东糖ADO | - | L-***糖醇LARL | - |
β-甲基-D-木糖甙MDX | - | 葡萄糖酸盐GNT | + |
半乳糖GAL | + | 2-酮基-葡萄糖酸盐2KG | - |
葡萄糖GLU | + | 5-酮基-葡萄糖酸盐5KG | + |
果糖FRU | + | 肝糖GLYG | - |
甘露糖MNE | + | 淀粉AMD | - |
山梨糖SBE | - | 棉子糖RAF | + |
鼠李糖RHA | - | 松叁糖MLZ | + |
卫茅醇DUL | - | 菊糖INU | - |
肌醇INO | - | 海藻糖TRE | + |
甘露醇MAN | + | 蔗糖SAC | + |
山梨醇SOR | + | 蜜二糖MEL | + |
α-甲基-D-甘露甙MDM | + | 乳糖LAC | + |
七叶灵ESC | + | 木糖醇XLT | - |
α-甲基-D-葡萄糖甙MDG | - | 麦芽糖MAL | + |
N-乙酰-葡萄胺NAG | + | 纤维二糖CEL | + |
苦杏仁甙AMY | + | 柳醇SAL | + |
熊果甙ARB | + |
注:“+”为反应阳性,“-”为反应阴性。
实施例2、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329的特性
材料
菌株金黄色葡萄球菌ATCC6035、白色念珠菌ATCC1023、大肠杆菌ATCC25922、***加德纳菌ATCC14018
试剂
MRS培养基、LM肉汤培养基,购自法国梅里埃生物公司;
胰蛋白胨、酵母抽提物、琼脂粉,购自Oxide;
四甲基联苯胺(TMB)、二甲基甲酰胺、辣根过氧化物酶(HRP),购自Sigma公司。
1、抑菌试验
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329菌株接种于MRS培养基,37℃、5%CO2培养24小时,用无菌生理盐水洗下菌苔,比浊并稀释成1×108CFU/ml浓度菌液,将直径为5mm的圆形灭菌滤纸片浸满菌液后备用。
将金黄色葡萄球菌ATCC6035、白色念珠菌ATCC1023、大肠杆菌ATCC25922分别接种于普通营养琼脂培养基(牛肉膏3.0克/L,蛋白胨10.0克/L,NaCl 5.0克/L,琼脂15克/L,pH 7.0)上,37℃培养24小时,***加德纳菌ATCC14018接种于GC血琼脂,37℃5%CO2培养24小时,分别用无菌生理盐水洗下菌体,比浊并稀释成1×108CFU/ml浓度菌液,各取0.1ml涂布普通营养琼脂平板,将上述浸有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323CGMCC No.1329的圆形滤纸片分别放在涂布有上述细菌的平板中间位置,贴紧,做好标记,将涂有金黄色葡萄球菌ATCC6035、白色念珠菌ATCC1023、大肠杆菌ATCC25922的平板分别放入普通培养箱,将涂有***加德纳菌ATCC14018的平板分别放入5%CO2孵箱,37℃培养48小时,测量记录抑菌圈直径并照相。
抑菌试验的结果如表2和图2A-图2D所示,表明植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)L323 CGMCC No.132对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌和***加德纳菌(金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌和***加德纳菌均是引起***炎常见致病菌)具有抑菌作用。说明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.132对妇***道常见的致病菌有较好的抑菌效果。
表2 L323株乳酸杆菌对常见致病菌的抑菌效果
2、产酸酸度和成分分析试验
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329接种于MRS培养基,37℃5%CO2培养24小时后,用生理盐水洗下菌苔,制成1×108CFU/ml菌悬液,取0.1ml菌悬液接种于5ml LM肉汤培养基中,37℃5%CO2分别培养24小时、48小时、72小时、96小时,用pH酸度仪测定不同时间培养菌液的pH值。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329的不同培养时间培养液的pH值的变化情况如表3所示。
表3.植物乳杆菌L323不同时间产酸试验结果
取上述培养24小时的乳酸杆菌LM肉汤培养基10ml,8000rpm离心15分钟,弃菌体沉淀,收集上清,对细菌代谢产物中的短碳有机酸:乙酸、丙酸、丁酸、戊酸进行气相色谱分析。结果如表4所示,表明植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)L323 CGMCC No.1329产生的短碳有机酸主要为乙酸,培养24小时生产乙酸可达1160ug/ml。
表4.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329产酸的成分和产量分析
有机酸成分 | 产量(ug/ml) |
乙酸 | 1160 |
丙酸 | <50 |
丁酸 | <50 |
戊酸 | <20 |
3、产过氧化氢(H2O2)试验
称取四甲基联苯胺(TMB)12.5mg溶于1ml二甲基甲酰胺中,与50ml MRS培养基混匀,121℃15分钟灭菌后铺平板,得到TMB-MRS培养基平板,4℃避光放置备用。
按0.01mg/ml浓度配制辣根过氧化物酶(HRP)溶液,0.45μm滤膜过滤除菌,菌株接种前取0.1ml均匀涂布TMB-MRS培养基平板,晾干,4℃避光放置。
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329接种于上述涂布有HRP的TMB-MRS培养基,37℃5%CO2孵箱避光培养24小时,取出培养板,暴露光线3分钟后,观察培养板上菌落颜色变化并记录结果。结果判读:在有H2O2存在的情况下,HRP会氧化TMB形成蓝绿色氧化物。因此,如果乳酸菌产H2O2,生长于含有TMB、并涂布有HRP的培养基上的菌落将会变为蓝绿色,而不产生H2O2的乳酸菌株的菌落为灰白色。结果如图3所示,植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)L323 CGMCC No.1329产H2O2呈蓝绿色菌落。乳酸杆菌产生H2O2可使***微环境缺氧,从而抑制好氧致病菌生长。有试验表明,由大肠杆菌引起的复发性***炎和尿道炎患者***和尿道内缺乏产H2O2的乳酸杆菌(Wilks M,Wiggins R,Whiley A,Hennessy E,Warwick S,Porter H,Corfield A,Millar M.Identification and H(2)O(2)production of vaginal lactobacilli frompregnant women at high risk of preterm birth and relation with outcome.J Clin Microbiol.2004 Feb;42(2):713-717)。
4、菌株超微结构的电镜观察
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329接种MRS培养基37℃5%CO2培养24h,用无菌棉拭子拭取菌苔接种于5ml LM肉汤培养基,37℃5%CO2培养24小时,5000rpm/min离心10分钟,弃上清,正常小鼠眼球取血后立即分离血清,取新鲜分离的小鼠血清1滴滴入菌体沉淀中,室温放置10分钟使菌块固定,加入戊二醛固定液1ml,放置4℃用于电镜标本的制备。电镜观察结果如图4所示,植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329菌体表面具有厚厚的毛发样突出物,即非菌毛黏附素,该物质是细菌黏附上皮细胞的基础。
5、菌株保存的稳定性试验
观察乳酸杆菌在不同保存液中细菌的存活情况。
保存液的配制:
保存液1:MRS培养基+5%(质量百分含量)脱脂牛奶
保存液2:MRS培养基+5%(质量百分含量)脱脂牛奶+海藻糖3.78g
保存液3:MRS培养基
将24小时培养的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329以4800rpm/min离心5分钟,以不同保存液悬浮沉淀菌体,菌体计数为2.2×105CFU/ml,分别分装保存管0.5ml/支,分别放置不同温度(37℃,室温)环境中避光保存,每月各取保存管1支,吸出菌液0.1ml,用1ml LB肉汤稀释成不同浓度,涂布MRS培养基平板,37℃5%CO2培养24小时后计数,观察并记录不同保存液保存效果,即细菌存活情况。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCCNo.1329的存活情况如表5所示。
表5.不同保存液中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCCNo.1329的存活数(CFU/ml)
Claims (2)
1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329。
2.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L323 CGMCC No.1329在制备预防和/或治疗妇***道感染性疾病药物中的应用。
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