ES2602501T3 - Método de liofilización - Google Patents

Abstract

Un método de liofilizar un material, que comprende las etapas de: presurizar la atmósfera de gas dentro de una cámara (202) a una presión entre la presión ambiente y 172,4 kPa (25 psi) por encima de la presión ambiente y enfriar el material en la cámara presurizada a una tasa de enfriamiento prescrita a una temperatura de nucleación deseada; rápidamente disminuir la presión en la cámara (202) en 40 segundos o menos o a una tasa de caída de presión, ΔP/Δt, mayor que 1,4 kPa (0,2 psi) por segundo para inducir la nucleación de congelación en el material a la temperatura de nucleación deseada; enfriar adicionalmente el material nucleado hasta o por debajo de una temperatura final para congelar el material; y secar el material congelado para producir un producto secado que tiene una humedad reducida o disolvente.

Description

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DESCRIPCION

Metodo de liofilizacion Campo de la Invencion

La presente invencion se refiere a un proceso de liofilizacion, y mas particularmente, a un metodo para inducir la nucleacion de congelar un material en el que el material se enfna inicialmente a una temperatura por debajo de una temperature de transicion de fase y posteriormente se despresuriza con el fin de inducir la nucleacion de la congelacion en el material.

Antecedentes de la Invencion

El control del proceso de nucleacion, generalmente aleatorio, en la etapa de congelacion de un proceso de liofilizacion o secado por congelacion para disminuir tanto el tiempo de procesamiento necesario para completar el secado por congelacion como para aumentar la uniformidad del producto a partir de un vial a otro en el producto acabado sena muy deseable en la tecnica. En un proceso de secado por congelacion farmaceutico tfpico, multiples viales que contienen una disolucion acuosa comun son colocados en estantes que son enfriados, por lo general a una tasa controlada, a bajas temperaturas. La disolucion acuosa en cada uno de los viales se enfna por debajo de la temperatura de congelacion termodinamica de la disolucion y permanece en un estado lfquido meta-estable sub- enfriado hasta que se produzca la nucleacion.

El intervalo de temperaturas de nucleacion a traves de los viales se distribuye aleatoriamente entre una temperatura proxima a la temperatura de congelacion termodinamica y un valor significativamente (p. ej., hasta aproximadamente 30°C) inferior a la temperatura de congelacion termodinamica. Esta distribucion de las temperaturas de nucleacion provoca una variacion de un vial a otro en la estructura de los cristales de hielo y en ultima instancia de las propiedades ffsicas del producto liofilizado. Ademas de ello, la etapa de secado del proceso de secado por congelacion debe ser excesivamente larga para dar cabida a la gama de tamanos de los cristales de hielo y estructuras producidas por el fenomeno de la nucleacion estocastico natural.

Se han utilizado aditivos para aumentar la temperatura de nucleacion de disoluciones sub-enfriadas. Estos aditivos pueden adoptar muchas formas. Es bien conocido que determinadas bacterias (p. ej., Pseudomonas syringae) sintetizan protemas que ayudan a nuclear la formacion de hielo en disoluciones acuosas sub-enfriadas. Cualquiera de las bacterias o sus protemas aisladas se pueden anadir a las disoluciones para aumentar la temperatura de nucleacion. Varios aditivos inorganicos tambien muestran un efecto de nucleacion; el aditivo mas comun de este tipo es el yoduro de plata, Agl. En general, cualquier aditivo o contaminante tiene el potencial de servir como un agente de nucleacion. Viales de liofilizacion preparados en entornos que contienen altos niveles de materiales en partmulas se nuclearan y congelaran generalmente en un menor grado de sub-enfriamiento que los viales preparados en entornos de bajos niveles de materiales en partmulas.

Todos los agentes de nucleacion descritos anteriormente se marcan como "aditivos", porque cambian la composicion del medio en el que nuclean una transicion de fase. Estos aditivos no son tfpicamente aceptables para productos farmaceuticos secados por congelacion regulados y aprobados por la FDA. Estos aditivos tampoco proporcionan control sobre el tiempo y la temperatura cuando se nuclean los viales y se congelan. Mas bien, los aditivos solo actuan para aumentar la temperatura media de nucleacion de los viales.

Los cristales de hielo pueden actuar por sf mismos como agentes nucleantes para la formacion de hielo en disoluciones acuosas sub-enfriadas. En el metodo de "niebla de hielo", un liofilizador humedo se llena con un gas fno para producir una suspension de vapor de pequenas partmulas de hielo. Las partmulas de hielo son transportadas a los viales e inician la nucleacion cuando entran en contacto con la interfaz de fluido.

El metodo de "niebla de hielo" no controla la nucleacion de multiples viales simultaneamente en un tiempo y temperatura controlados. En otras palabras, el evento de nucleacion no se produce al mismo tiempo o instantaneamente dentro de todos los viales despues de la introduccion del vapor fno en el liofilizador. Los cristales de hielo necesitaran un cierto tiempo para introducirse en cada uno de los viales para iniciar la nucleacion, y los tiempos de transporte son probablemente diferentes para viales en diferentes lugares dentro del liofilizador. Para liofilizadores a escala industrial, la implementacion del metodo de "niebla de hielo" requerina cambios en el diseno

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del sistema, ya que se requieren dispositivos de conveccion internos para ayudar a una distribucion mas uniforme de la "niebla de hielo" a lo largo de todo el liofilizador. Cuando los estantes de liofilizadores son enfriados continuamente, la diferencia de tiempo entre cuando se congela el primer vial y se congela el ultimo vial creara una diferencia de temperatura entre los viales, lo que aumentara la no uniformidad de un vial a otro en productos liofilizados.

El pre-tratamiento del vial por rayadura, rascado o corrugacion tambien se ha utilizado para reducir el grado de sub- enfriamiento requerido para la nucleacion. Al igual que con los otros metodos de la tecnica anterior, el tratamiento previo vial tambien no imparte grado de control alguno sobre el tiempo y la temperatura, cuando los viales individuales se nuclean y congelan, sino que solo aumenta la temperatura media de nucleacion de todos los viales.

La vibracion tambien se ha utilizado para nuclear una transicion de fase en un material meta-estable. Una vibracion suficiente para inducir la nucleacion se produce a frecuencias superiores a 10 kHz y puede producirse utilizando una diversidad de equipos. A menudo, las vibraciones en este intervalo de frecuencias se denominan "ultrasonicas", aunque las frecuencias en el intervalo de 10 kHz a 20 kHz estan tfpicamente dentro del intervalo audible de los seres humanos. La vibracion ultrasonica produce a menudo una cavitacion, o la formacion de pequenas burbujas de gas, en una disolucion sub-enfriada. En el regimen de cavitacion transitoria o de inercia, las burbujas de gas rapidamente crecen y se colapsan, provocando fluctuaciones de muy alta presion y temperatura localizadas. La capacidad de la vibracion ultrasonica para inducir la nucleacion en un material meta-estable se atribuye a menudo a las perturbaciones provocadas por la cavitacion transitoria. El otro regimen de cavitacion, denominado estable o no inercial, se caracteriza por burbujas que exhiben oscilaciones de volumen o forma estables sin colapsarse. La solicitud de patente de EE.UU. 20020031577 A1 describe que la vibracion ultrasonica puede inducir la nucleacion, incluso en el regimen de cavitacion estable, pero no se ofrece explicacion alguna del fenomeno. La solicitud de patente GB 2400901A tambien describe que la probabilidad de provocar cavitacion y, por lo tanto, nucleacion, en una disolucion utilizando vibraciones con frecuencias superiores a 10 kHz puede aumentarse mediante la reduccion de la presion ambiente en torno a la disolucion o la disolucion de un fluido volatil en la disolucion.

Tambien se ha utilizado en el pasado un metodo de electrocongelacion para inducir la nucleacion en lfquidos sub- enfriados. La electrocongelacion se logra generalmente suministrando campos electricos relativamente altos (~ 1 V/nm) de una manera continua o pulsada entre los electrodos espaciados estrechamente sumergidos en una disolucion lfquida o sub-enfriada. Los inconvenientes asociados con un proceso de electrocongelacion en aplicaciones tfpicas de liofilizacion incluyen la relativa complejidad y el coste de implementacion y mantenimiento, particularmente para aplicaciones de liofilizacion utilizando multiples viales o recipientes. La electrocongelacion tampoco se puede aplicar directamente a disoluciones que contienen especies ionicas (p. ej., NaCl). Recientemente, existen estudios que examinan el concepto de 'congelacion de la superficie inducida por vado' (Vease, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 6.684.524). En una 'congelacion de la superficie inducida por vacfo' de este tipo, los viales que contienen una disolucion acuosa se carga en un estante de temperatura controlada en un liofilizador y se mantienen inicialmente en aproximadamente 10 grados Celsius. Se hace luego un vacfo en la camara de secado por congelacion a una presion proxima al vacfo (p. ej., 1 mbar) que provoca la congelacion superficial de las disoluciones acuosas a profundidades de unos pocos milfmetros. La subsiguiente liberacion de vacfo y la disminucion de la temperatura del estante por debajo del punto de congelacion de la disolucion permiten el crecimiento de cristales de hielo de la capa de la superficie pre-congelada a traves del resto de la disolucion. Un inconveniente importante para la implementacion de este proceso de 'congelacion de la superficie inducida por vacfo' en una aplicacion de liofilizacion tfpica es el alto riesgo de la ebullicion violenta o la desgasificacion de la disolucion bajo condiciones establecidas.

Un control mejorado del proceso de nucleacion puede permitir que se produzca la congelacion de todos los viales de disolucion farmaceutica no congelados en un liofilizador dentro de un intervalo de temperaturas y tiempos mas estrecho, proporcionando de ese modo un producto liofilizado con una mayor uniformidad de un vial a otro. El control de la temperatura minima de nucleacion puede afectar a la estructura del cristal de hielo formado dentro del vial y permitir un proceso de secado por congelacion muy acelerado.

Por lo tanto, existe la necesidad de controlar el proceso aleatorio de la nucleacion en diversos procesos de congelacion, incluyendo la etapa de congelacion de un proceso de secado por congelacion o liofilizacion tanto para reducir el tiempo de procesamiento necesario para completar el secado por congelacion y mejorar la uniformidad del producto de un vial a otro en el producto acabado. Por tanto, sena deseable proporcionar un proceso que posea algunas, o preferiblemente todas las caractensticas anteriores.

Sumario de la Invencion

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La presente invencion es un metodo de liofilizar un material tal como se define en la reivindicacion 1.

Breve Descripcion de los Dibujos

Los anteriores y otros aspectos, caractensticas y ventajas de la presente invencion resultaran mas evidentes a partir de la siguiente descripcion mas detallada de la misma, presentada en union con los siguientes dibujos, en los que:

La Fig. 1 es un grafico que representa la temperature en funcion del tiempo de una disolucion que se somete a un proceso de congelacion estocastico y que muestra ademas el intervalo de temperaturas de nucleacion de la disolucion;

la Fig.2 es un grafico que representa la temperatura en funcion del tiempo de una disolucion que se somete a un proceso de congelacion equilibrado con nucleacion despresurizada de acuerdo con los presentes metodos;

la Fig. 3 es un grafico que representa la temperatura en funcion del tiempo de una disolucion que se somete a un proceso de congelacion dinamica con nucleacion despresurizada de acuerdo con los presentes metodos; y

la Fig. 4 es una representacion esquematica de un sistema de liofilizacion de acuerdo con la presente invencion.

Descripcion Detallada de la Invencion

La nucleacion es el inicio de una transicion de fase en una pequena region de un material. Por ejemplo, la transicion de fase puede ser la formacion de un cristal a partir de un lfquido. El proceso de cristalizacion (es decir, la formacion de cristales solidos a partir de una disolucion), a menudo asociado con la congelacion de una disolucion, comienza con un evento de nucleacion seguido del crecimiento del cristal.

En el proceso de cristalizacion, la nucleacion es la etapa en la que moleculas seleccionadas dispersadas en la disolucion u otro material comienzan a reunirse para crear racimos a escala nanometrica para volverse estables bajo las actuales condiciones de funcionamiento. Estos racimos estables constituyen los nucleos. Los racimos necesitan para alcanzar un tamano critico con el fin de convertirse en nucleos estables. Este tamano cntico viene generalmente dictaminado por las condiciones de funcionamiento tales como la temperatura, los contaminantes, el grado de sobresaturacion, etc., y puede variar de una muestra de la disolucion a otra. Es durante el evento de nucleacion que los atomos en la disolucion se disponen de una manera definida y periodica que define la estructura cristalina.

El crecimiento de cristales es el crecimiento subsiguiente de los nucleos que lograron alcanzar el tamano critico del racimo. Dependiendo de las condiciones, la nucleacion o el crecimiento de los cristales puede predominar sobre el otro, y como resultado, se obtienen cristales con diferentes tamanos y formas. El control del tamano y la forma de los cristales constituye uno de los principales retos en la fabricacion industrial tal como para productos farmaceuticos.

El presente metodo se refiere a un proceso para controlar el tiempo y/o la temperatura a la que se produce una transicion de fase nucleada en un material. En las aplicaciones de congelacion, la probabilidad de que un material se nuclee de forma espontanea y comience a cambiar de fase esta relacionada con el grado de sub-enfriamiento del material y la ausencia o presencia de contaminantes, aditivos, estructuras o perturbaciones que proporcionan un sitio o superficie para la nucleacion.

La etapa de congelacion o de solidificacion es particularmente importante en el proceso de secado por congelacion, en donde las tecnicas existentes dan lugar a diferencias de temperatura de nucleacion a traves de una multitud de viales o recipientes. Las diferencias de la temperatura de nucleacion tienden a proporcionar un producto no uniforme y un tiempo de secado excesivamente largo. Los actuales metodos, por otro lado, proporcionan un mayor grado de control del proceso en procesos de solidificacion por lotes (p. ej., secado por congelacion) y proporcionan un producto con estructura y propiedades mas uniformes. A diferencia de algunas de las tecnicas de la tecnica anterior para inducir la nucleacion, los presentes metodos requieren un equipo mmimo y cambios operacionales de implementacion.

En principio, los presentes metodos se pueden aplicar a cualquier etapa de procesamiento del material que implica una transicion de fase nucleada. Ejemplos de tales procesos incluyen la congelacion de un lfquido, la cristalizacion de hielo de una disolucion acuosa, la cristalizacion de los polfmeros y metales a partir de masas fundidas, la

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cristalizacion de materiales inorganicos a partir de disoluciones sobresaturadas, la cristalizacion de protemas, la produccion de nieve artificial, la deposicion de hielo a partir de vapor, la congelacion de alimentos, la concentracion por congelacion, la cristalizacion fraccionada, la crioconservacion, o la condensacion de los vapores a Kquidos. Desde un punto de vista conceptual, los presentes metodos tambien pueden aplicarse a transiciones de fases tales como fusion y ebullicion.

El metodo descrito en esta memoria representa una mejora a los procesos de liofilizacion farmaceuticos actuales. Por ejemplo, dentro de un gran liofilizador industrial puede haber mas de 100000 viales que contienen un producto farmaceutico que debe ser congelado y secado. La practica actual en la industria es enfriar la disolucion a un grado muy alto, de manera que se garantice que la disolucion en todos los viales o recipientes en el liofilizador se congele. El contenido de cada uno de los viales o recipientes, sin embargo, se congela al azar a lo largo de un intervalo de temperaturas por debajo del punto de congelacion, debido a que el proceso de nucleacion es incontrolado.

Volviendo ahora a las Figuras, y en particular a la Fig. 1, en ella se representa un grafico de temperatura en funcion del tiempo de seis viales de una disolucion acuosa que se somete a un proceso de nucleacion estocastico convencional que muestra el intervalo tfpico de temperaturas de nucleacion de la disolucion dentro de los viales (11,12,13,14,15 y 16). Como se ve en ella, los contenidos de los viales tienen una temperatura de congelacion termodinamica de aproximadamente 0°C, pero la disolucion dentro de cada uno de los viales vial nuclea de forma natural en el amplio intervalo de temperaturas de aproximadamente -7°C a -20°C o mas, tal como se destaca en la zona 18. El grafico 19 representa la temperatura del estante dentro de la camara de secado por congelacion.

A la inversa, la Fig. 2 y la Fig. 3 representan graficos de temperatura en funcion del tiempo de una disolucion sometida a un proceso de congelacion con nucleacion despresurizada de acuerdo con los presentes metodos. En particular, la Fig. 2 muestra el grafico de temperatura en funcion del tiempo de seis viales de una disolucion acuosa sometida a un proceso de enfriamiento equilibrado (Vease el Ejemplo 2) con nucleacion inducida a traves de la despresurizacion de la camara (21, 22, 23, 24, 25 y 26). El contenido del vial tiene una temperatura de congelacion termodinamico de aproximadamente 0°C, sin embargo la disolucion dentro de cada uno de los viales se nuclea al mismo tiempo tras la despresurizacion y dentro de un intervalo de temperaturas muy estrecho (es decir, -4°C a -5°C) tal como se ve en la zona 28. El grafico 29 representa la temperatura del estante dentro de la camara de secado por congelacion y representa un proceso de congelacion equilibrada, uno en el que la temperatura de los estantes se mantiene mas o menos constante antes de la despresurizacion.

De manera similar, la Fig. 3 muestra el grafico de temperatura en funcion del tiempo de tres viales de una disolucion acuosa sometida a un proceso de enfriamiento dinamico (Vease el Ejemplo 7) con la nucleacion inducida a traves de la despresurizacion de la camara (31,32 y 33). Una vez mas, el contenido del vial tiene una temperatura de congelacion termodinamica de aproximadamente 0°C, sin embargo la disolucion dentro de cada uno de los viales se nuclea al mismo tiempo tras la despresurizacion a un intervalo de temperaturas de aproximadamente -7°C a -10°C tal como se ve en la zona 38. El grafico 39 representa la temperatura del estante dentro de la camara de secado por congelacion y, en general, representa un proceso de enfriamiento dinamico, en el que la temperatura de los estantes se reduce activamente durante o antes de la despresurizacion.

Tal como se ilustra en las Figuras, los presentes metodos proporcionan un control mejorado del proceso de nucleacion al permitir que se produzca la congelacion de disoluciones farmaceuticas en un liofilizador dentro de un intervalo de temperaturas mas estrecho (p. ej., aproximadamente 0°C a -10°C) y/o al mismo tiempo, proporcionando de ese modo un producto liofilizado con una mayor uniformidad de vial a vial. Si bien no se ha demostrado, es previsible que el intervalo de temperaturas de nucleacion inducida pueda incluso extenderse ligeramente por encima de la temperatura de transicion de fase y tambien pueda extenderse a aproximadamente 40°C de sub-enfriamiento.

Otro beneficio asociado con los presentes metodos es que mediante el control de la temperatura de nucleacion minima y/o el momento preciso de la nucleacion se puede afectar a la estructura de los cristales de hielo formados dentro de los viales o recipientes congelados. La estructura de los cristales de hielo es una variable que afecta el tiempo que transcurre para que el hielo se sublime. Por lo tanto, mediante el control de la estructura de los cristales de hielo es posible acelerar enormemente el proceso general de la liofilizacion.

Volviendo ahora a la Fig. 4, la unidad de liofilizador (200) ilustrada tiene diversos componentes principales mas sistemas auxiliares adicionales para llevar a cabo el ciclo de liofilizacion. En particular, la unidad de liofilizador (200) incluye una camara de liofilizacion (202) que contiene los estantes (204) adaptados para contener viales o recipientes de la disolucion a liofilizar (no mostrado). La disolucion a liofilizar se formula de forma especial y tfpicamente contiene el ingrediente activo, un sistema de disolvente y varios agentes de estabilizacion o de otros

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soportes o aditivos farmaceuticamente aceptables. La liofilizacion de esta formulacion tiene lugar a partir de recipientes especializados ubicados en los estantes huecos. Estos recipientes pueden incluir viales con tapones, ampollas, jeringas o, en el caso de la liofilizacion a granel, cuencos.

La unidad de liofilizador (200) ilustrada tambien incluye un condensador (206) que esta adaptado para separar el disolvente sublimado y desorbido de la fase de vapor por condensacion o congelacion del mismo en forma de hielo para mantener el vado adecuado en el interior del liofilizador. El condensador (206) puede estar internamente situado en la camara de liofilizacion (202) o como una unidad externa separada en comunicacion con la camara de liofilizacion (202) a traves de una denominada valvula de aislamiento. La unidad de liofilizador (200) tambien incluye preferiblemente una bomba de vado (208) acoplada operativamente al condensador (206) y adaptada para hacer un vado en la camara de liofilizacion (202) y el condensador (206).

El sistema de refrigeracion criogenico (210) proporciona medios de control de temperatura para la unidad de liofilizador (200) por enfriamiento de un fluido prescrito de transferencia de calor que se hace circular por los estantes (204) dentro de la camara de liofilizacion (202) y el condensador (206). Tal como se ilustra, el sistema de refrigeracion criogenico (210) comprende una fuente de material criogeno (218), tal como nitrogeno lfquido, un intercambiador de calor criogenico (220) y un circuito de fluido de transferencia de calor (222), un orificio de ventilacion (224), un calentador (226) y bombas (227, 228).

El intercambiador de calor criogenico (220) es preferiblemente un sistema de intercambio de calor criogenicos no congelante NCOOL™ disponible de Praxair, Inc. Un aspecto importante del intercambiador de calor criogenico (220) es la vaporizacion del nitrogeno lfquido en el o dentro del intercambiador de calor, sin embargo de una manera que evita el contacto directo del nitrogeno lfquido sobre las superficies expuestas al fluido de transferencia de calor. Detalles de la estructura y el funcionamiento de un intercambiador de calor de este tipo se pueden encontrar en la Patente de EE.UU N° 5.937.656 (Cheng et al.), cuya descripcion se incorpora como referencia en esta memoria.

El circuito de fluido de transferencia de calor (222) prescrito esta adaptado para hacer circular un fluido de transferencia de calor y esta acoplado operativamente tanto a la camara de liofilizacion (202) como al condensador (206). Mas espedficamente, el fluido de transferencia de calor circula por el interior de los estantes huecos (204) dentro de la camara de liofilizacion (202) para comunicar con precision el enfriamiento o el calentamiento a traves de los estantes (204) a la disolucion segun sea necesario. Ademas, el fluido de transferencia de calor prescrito tambien fluye a traves del condensador (206) para proporcionar los medios de enfriamiento necesarios para sublimar el hielo y desorber aun mas el disolvente.

La bomba (227) y el calentador (226) estan dispuestos a lo largo del circuito de fluido de transferencia de calor (222) aguas arriba de la camara de liofilizacion (202) y aguas abajo del intercambiador de calor criogenico (220). La bomba (227) esta dimensionada para mover el fluido de transferencia de calor a traves del circuito de transferencia de calor (222) a los caudales requeridos. El calentador (226) es preferiblemente un calentador electrico adaptado para proporcionar calor suplementario al fluido de transferencia de calor y a la camara de liofilizacion (202) segun sean necesarios durante los procesos de secado.

Tal como se ve en la realizacion de la Fig. 4, el condensador (206) tambien es enfriado por un fluido de recirculacion de transferencia de calor de baja temperatura. La refrigeracion del fluido de transferencia de calor que fluye a traves del condensador (206) tambien es proporcionada por un intercambiador de calor criogenico (220). El intercambiador de calor criogenico (220) es capaz de enfriar el fluido de transferencia de calor de forma continua sin congelacion. Durante las fases de secado, el intercambiador de calor criogenico (220) se fija o adapta para conseguir la temperatura mas baja requerida para el condensador (206). Tal como se describio anteriormente, el intercambiador de calor criogenico (220) pre-evapora el nitrogeno lfquido en un gas fno criogenico para la transferencia de calor al fluido de transferencia de calor. A traves de la pre-evaporacion del nitrogeno lfquido se asegura que el nitrogeno lfquido evite la separacion por ebullicion directamente sobre una superficie de intercambio de calor en donde se dispone el fluido de transferencia de calor en el otro lado. Una disposicion de este tipo evita la congelacion del intercambiador de calor criogenico (220), puesto que el nitrogeno lfquido hierve a aproximadamente -195 grados centfgrados a la presion atmosferica.

La realizacion ilustrada de la Fig. 4 tambien incluye medios para controlar la atmosfera de gas de la camara de liofilizacion (250) y, en particular, la composicion del gas y la presion dentro de la camara (202). El control de la presion de la camara (202) permite la presurizacion y la despresurizacion rapida de la camara para inducir la nucleacion de la disolucion. La realizacion descrita utiliza preferiblemente una o mas valvulas de control de flujo (252) adaptadas de forma controlable para facilitar la introduccion de una atmosfera de gas a presion en la camara

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(202) de una fuente de gas (no mostrada) y para despresurizar la camara ventilando la atmosfera del gas a presion lejos de la camara (202) de una manera controlada y preferiblemente rapida, induciendo de este modo la nucleacion de la disolucion en los diversos recipientes o viales.

Aunque no se muestra, la unidad de liofilizador (200) tambien incluye diversos sistemas de hardware y software de control adaptados para ordenar y coordinar las diversas partes del equipo de liofilizacion, y llevar a cabo el ciclo de liofilizacion pre-programado. Los diversos sistemas de hardware y software de control tambien pueden proporcionar documentacion, registro de datos, alarmas, al igual que las capacidades de seguridad del sistema. Ademas, sistemas auxiliares para la unidad de liofilizador (200) pueden incluir diversos subsistemas para limpiar y esterilizar la camara de liofilizacion (202), auto-cargar y descargar el producto en la camara de liofilizacion (202); y accesorios del sistema criogenicos asociados tales como patines de refrigeracion, tanques de nitrogeno lfquido, tubenas, valvulas, sensores, etc.

En un sentido amplio, los metodos descritos en esta memoria para inducir la nucleacion de una transicion de fase dentro de un material comprenden las etapas de: (i) enfriar el material a una temperatura cerca o por debajo de una temperatura de transicion de fase del material; y (ii) disminuir rapidamente la presion para inducir la nucleacion de una transicion de fase en el material. Cada una de estas etapas importantes se discutira con mas detalle mas adelante.

ETAPA 1 - ENFRIAMIENTO DEL MATERIAL

Materiales ilustrativos utiles en el presente metodo incluyen sustancias puras, gases, suspensiones, geles, lfquidos, disoluciones, mezclas o componentes dentro de una disolucion o mezcla. Materiales adecuados para uso en el presente metodo puede incluir, por ejemplo, materiales farmaceuticos, materiales biofarmaceuticos, productos alimenticios, materiales qmmicos, y pueden incluir productos tales como productos para el cuidado de heridas, cosmeticos, productos veterinarios y productos relacionados con agentes de diagnostico in vivo/in vitro y similares. Cuando el material es un lfquido, puede ser deseable disolver los gases en el lfquido. Los lfquidos en un entorno de gas controlado tendran, por lo general, gases disueltos en ellos.

Otros materiales ilustrativos utiles en el presente metodo incluyen material biologico o biofarmaceutico tales como tejidos, organos y estructuras multicelulares. Para determinadas aplicaciones biologicas y farmaceuticas, el material puede ser una disolucion o mezcla que incluye: virus vivos o atenuados; acidos nucleicos; anticuerpos monoclonales; anticuerpos policlonales; biomoleculas; analogos no peptfdicos; peptidos, incluyendo polipeptidos, mimeticos de peptidos y peptidos modificados; protemas, incluyendo protemas de fusion y modificadas; ARN, ADN y subclases de los mismos; oligonucleotidos; partmulas virales; y materiales o componentes de los mismos similares de este tipo.

Disoluciones farmaceuticas o biofarmaceuticas contenidas en viales o recipientes para el secado por congelacion senan un buen ejemplo de un material que se beneficiana del presente metodo. Las disoluciones son principalmente de agua y son sustancialmente incompresibles. Tales disoluciones farmaceuticas o biofarmaceuticas son tambien altamente puras y generalmente estan libres de materiales en partmulas que pueden formar sitios para la nucleacion. Una temperatura de nucleacion uniforme es importante para crear una estructura de cristal de hielo consistente y uniforme de un vial al otro o de un recipiente a otro. La estructura de cristal de hielo desarrollaba tambien afecta en gran medida al tiempo necesario para el secado.

Tal como se aplica a un proceso de secado por congelacion, el material se coloca preferiblemente en una camara tal como una camara de secado por congelacion. Preferiblemente, la camara esta configurada de manera que permita el control de la temperatura, presion y atmosfera de gas dentro de la camara. La atmosfera de gas puede incluir, pero no se limita a: argon, nitrogeno, helio, aire, vapor de agua, oxfgeno, dioxido de carbono, monoxido de carbono, oxido nitroso, oxido mtrico, neon, xenon, cripton, metano, hidrogeno, propano, butano, y similares, incluyendo mezclas permisibles de los mismos. La atmosfera de gas preferida comprende un gas inerte tal como argon, a una presion entre 149,6 a 446,0 kPa (7-50 psig) o mas. Las temperaturas dentro de la camara del liofilizador a menudo vienen dictaminadas por el proceso de secado por congelacion y se controlan facilmente mediante el uso de un fluido de transferencia de calor que enfna o calienta los estantes dentro de la camara para conducir la temperatura de los viales o recipientes y el material dentro de cada uno de los viales o recipientes.

De acuerdo con los presentes metodos, el material se enfna a una temperatura proxima a o por debajo de su temperatura de transicion de fase. En el caso de una disolucion de base acuosa que se somete a un proceso de secado por congelacion, la temperatura de transicion de fase es el punto de congelacion termodinamica de la

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disolucion. En los casos en los que la disolucion alcanza temperatures por debajo del punto de congelacion termodinamico de la disolucion, se dice que esta sub-enfriado. Cuando se aplica a un proceso de congelacion de una disolucion de base acuosa, el presente metodo es eficaz cuando el grado de sub-enfriamiento oscila desde cerca a o por debajo de la temperature de transicion de fase hasta aproximadamente 40°C de sub-enfriamiento, y mas preferiblemente entre aproximadamente 3°C de sub-enfriamiento y 10°C de sub-enfriamiento. En algunos de los ejemplos descritos mas adelante, el presente metodo de inducir la nucleacion funciona deseablemente incluso en los casos en los que la disolucion tiene solo aproximadamente 1°C de sub-enfriamiento por debajo de su punto de congelacion termodinamico.

En los casos en los que el material esta a una temperatura por debajo de su temperatura de transicion de fase, se alude a menudo como estando en un estado metaestable. Un estado metaestable es un estado inestable y transitorio, pero de vida relativamente larga, de un sistema qmmico o biologico. Un material metaestable existe temporalmente en una fase o estado que no es su fase o estado de equilibrio. En ausencia de cualesquiera cambios en el material o en su entorno, un material metaestable pasara finalmente de su estado de no equilibrio a su estado de equilibrio. Materiales metaestables ilustrativos incluyen disoluciones super-saturadas y lfquidos sub-enfriados.

Un ejemplo tfpico de un material metaestable sena el agua lfquida a presion atmosferica y una temperatura de - 10°C. Con un punto de congelacion normal de 0°C, el agua lfquida no debena existir termodinamicamente a esta temperatura y presion, pero puede existir en ausencia de un evento o estructura de nucleacion para comenzar el proceso de cristalizacion del hielo. Agua extremadamente pura se puede enfriar a temperaturas muy bajas (-30°C a - 40°C) a presion atmosferica y todavfa puede permanecer en el estado Kquido. Un agua sub-enfriada de este tipo se encuentra en un estado de no-equilibrio termodinamicamente metaestable. Solo falta un evento de nucleacion para hacer que comience la transicion de fase mediante el cual se volvera al equilibrio.

Tal como se comento anteriormente, los metodos actuales de inducir la nucleacion de una transicion de fase dentro de un material o la congelacion de un material pueden utilizarse con diferentes perfiles de refrigeracion, incluyendo, por ejemplo, un entorno de refrigeracion equilibrada o un entorno de refrigeracion dinamico (Veanse las Figs. 2 y 3).

ETAPA 2 - DISMINUIR RAPIDAMENTE LA PRESION

Cuando el material ha alcanzado la temperatura deseada cerca o por debajo de la temperatura de transicion de fase, la camara es apresurada o rapidamente despresurizada. Esta despresurizacion dispara la nucleacion y la transicion de fase de la disolucion dentro de los viales o recipientes. En la realizacion preferida, la despresurizacion de la camara se logra mediante la aperture o la aperture parcial de una valvula de control grande que separa la camara de alta presion, ya sea del entorno ambiental o de una camara o entorno de presion inferior. La presion elevada es reducida rapidamente por el flujo de masa de la atmosfera gaseosa fuera de la camara. La despresurizacion necesita ser bastante rapida para inducir la nucleacion. La despresurizacion debena terminarse en varios segundos o menos, preferentemente 40 segundos o menos, mas preferiblemente 20 segundos o menos, y lo mas preferiblemente 10 segundos o menos.

En aplicaciones de secado por congelacion tfpicas, la diferencia de presion entre la presion de la camara inicial y la presion de la camara final, despues de la despresurizacion, debe ser mayor que aproximadamente 48,3 kPa (7 psi), a pesar de que cafdas de presion mas pequenas pueden inducir la nucleacion en algunas situaciones. La mayona de los liofilizadores comerciales pueden acomodar facilmente el intervalo de cafdas de presion necesarias para controlar la nucleacion. Muchos liofilizadores estan disenados con capacidades de presion de mas de 273,7 kPa (25 psig) para soportar procedimientos de esterilizacion convencionales empleando vapor de agua saturado a 121°C. Tales capacidades de los equipos proporcionan una amplia ventana para inducir la nucleacion siguiendo protocolos que se despresurizan desde presiones de partida por encima de la presion ambiente o la presion en el entorno ambiente circundante inmediato. La presion elevada y la subsiguiente despresurizacion se pueden lograr a traves de cualquier medio conocido (p. ej. neumatico, hidraulico o mecanico). En las realizaciones preferidas, las presiones de trabajo de los presentes metodos deben permanecer por debajo de la presion super-cntica de cualquier gas aplicado, y someter el material a bajas presiones extremas (es decir, aproximadamente 0,013 mbar (10 mTorr) o menos) debenan evitarse durante la nucleacion del material.

Aunque no se desea estar ligado a ningun mecanismo particular, un posible mecanismo para explicar la nucleacion controlada observado en la practica del presente metodo es que los gases en disolucion en el material salgan de la disolucion tras la despresurizacion y formen burbujas que nuclean el material. Una presion elevada inicial aumenta la concentracion de gas disuelto en la disolucion. La rapida disminucion de la presion despues del enfriamiento reduce

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la solubilidad del gas, y la liberacion subsiguiente de gas de la disolucion sub-enfriada dispara la nucleacion de la transicion de fase.

Otro posible mecanismo es que la disminucion de la temperatura del gas proximo al material durante la despresurizacion provoca un punto fno en la superficie del material que inicia la nucleacion. Otro posible mecanismo es que la despresurizacion provoca la evaporacion de algo de lfquido en el material y la refrigeracion resultante del proceso de evaporacion endotermico puede iniciar la nucleacion. Otro posible mecanismo es que el gas fno despresurizado proximo al material congela algo de vapor, ya sea en equilibrio con el material antes de la despresurizacion o liberado del material por evaporacion durante la despresurizacion; las partfculas solidas resultantes vuelven a entrar en el material y actuan como semillas o superficies para iniciar la nucleacion. Uno o mas de estos mecanismos puede contribuir a la iniciacion de la nucleacion de la congelacion o solidificacion en diferentes grados, dependiendo de la naturaleza del material, de su entorno y de la transicion de fase que este siendo nucleada.

El proceso puede llevarse a cabo por completo a una presion mayor que la presion ambiente o a lo largo de un intervalo de presiones que abarca la presion ambiente. Por ejemplo, la presion inicial de la camara puede ser superior a la presion ambiente y la presion final de la camara, despues de la despresurizacion, puede estar por encima de la presion ambiente, pero es menor que la presion inicial de la camara; la presion inicial de la camara puede estar por encima de la presion ambiental y la presion de la camara final, despues de la despresurizacion, puede ser aproximadamente la presion ambiente o ligeramente por debajo de la presion ambiente.

Tambien se cree que la tasa y la magnitud de la cafda de presion son un aspecto importante de los presentes metodos. Los experimentos han demostrado que se inducira la nucleacion en los casos en los que la cafda de presion (AP) sea mayor que aproximadamente 48,3 kPa (7 psi). Alternativamente, la magnitud de la cafda de presion puede ser expresada como una relacion de presion absoluta, R = P,/Pf, en donde P, es la presion absoluta inicial y Pf es la presion absoluta final. Se cree que la nucleacion puede ser inducida tras la despresurizacion, en donde la relacion de presion absoluta, R, es mayor que aproximadamente 1,2 en muchas aplicaciones practicas de los presentes metodos. La tasa de cafda de presion tambien juega un papel importante en los presentes metodos. Un metodo de caracterizar la tasa de cafda de presion es a traves del uso de un parametro, A, en que A =AP/At. Una vez mas, se supone que se induce la nucleacion para valores de A mayores que un valor prescrito, tal como aproximadamente 1,38 kPa/s (0,2 psi/s). Los datos empmcos a traves de la experimentacion deben ayudar a uno a determinar la cafda de presion y la velocidad de cafda de presion preferida.

Los siguientes ejemplos ilustran diversos aspectos y caractensticas de los metodos descritos en esta memoria de inducir la nucleacion en un material y no han de tomarse en un sentido limitativo. Mas bien, estos ejemplos son solo ilustrativos y el alcance de la invencion solo debe determinarse con respecto a las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS

Todos los ejemplos descritos en esta memoria se realizaron en un liofilizador VirTis 51-SRC a escala piloto que tiene cuatro estantes con aproximadamente espacio de estantena total de 1,0 m2 y un condensador interno. Esta unidad fue reforzada para mantener presiones positivas de hasta aproximadamente 204,7 kPa (15 psig). Una abertura circular de un diametro de 3,8 cm (1,5") tambien se anadio a la pared posterior de la camara de secado por congelacion extendiendose un tubo de acero inoxidable de 3,8 cm (1,5") de diametro desde el agujero a traves del aislamiento de la pared posterior para salir de la parte posterior del liofilizador. Dos valvulas de bola accionadas con aire, de paso completo, de 3,8 cm (1,5 ") se fijaron a este tubo a traves de accesorios sanitarios. Una valvula de bola permitio el flujo de gas hacia la camara de secado por congelacion y, con ello, proporciono presiones positivas de hasta 204,7 kPa (15 psig). La segunda valvula de bola permitio el flujo de gas fuera de la camara de secado por congelacion y, con ello, reducir la presion de la camara a las condiciones atmosfericas (101,3 kPa (0 psig)). Toda la refrigeracion de los estantes del liofilizador y el condensador se consiguio a traves de la circulacion del fluido de transferencia de calor Dynalene MV enfriado con nitrogeno lfquido utilizando el sistema Praxair NCool™-HX.

Todas las disoluciones se prepararon en una sala limpia de clase 100. El liofilizador se coloco con las puertas, los estantes y los controles de todo lo accesible desde la sala limpia, mientras que los otros componentes (bombas, calentadores, etc.) se encontraban en un entorno de sala no limpia. Todas las disoluciones se prepararon con agua de calidad HPLC (Fisher Scientific, filtrada a traves de una membrana de 0,10 pm). Las disoluciones finales se filtraron a traves de una membrana de 0,22 pm antes de llenar los viales o recipientes de liofilizacion. Todos los gases se suministraron a traves de cilindros y se filtraron a traves de filtros de 0,22 pm para separar los materiales en partfculas. Los recipientes de vidrio (viales de 5 mL y frascos de 60 mL) se obtuvieron previamente limpiados de

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materiales en partfculas de Wheaton Science Products. Se utilizaron, en caso apropiado, soportes farmaceuticamente aceptables. Las etapas anteriores se realizaron para asegurar que los materiales y metodos cumplieran las normas de fabricacion farmaceutica convencionales para los materiales en partfculas, que actuan como agentes de nucleacion.

Tal como se utiliza en esta memoria, "soporte farmaceuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, antioxidantes, sales, revestimientos, agentes tensioactivos, conservantes (p. ej., p-hidroxibenzoato de metilo o propilo, acido sorbico, agentes antibacterianos, agentes antifungicos), agentes isotonicos, agentes retardantes de la disolucion (p. ej., parafina), absorbentes (p. ej., arcilla de caolm, arcilla de bentonita), estabilizadores de farmacos (p. ej., lauril-sulfato de sodio), geles, aglutinantes (p. ej., jarabe, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto, polivinilpirrolidona, carboxi-metil-celulosa, alginatos), excipientes (p. ej., lactosa, azucar de la leche, polietilenglicol), agente de desintegracion (p. ej., agar-agar, almidon, lactosa, fosfato de calcio, carbonato de calcio, acido algmico, sorbitol, glicina), agentes humectantes (p. ej., alcohol cetnico, monoestearato de glicerol), lubricantes, aceleradores de la absorcion (p. ej., sales de amonio cuaternario), aceites comestibles (p. ej., aceite de almendras, aceite de coco, esteres oleosos o propilenglicol), agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes, materiales de carga (p. ej., almidon, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol), lubricantes de formacion de comprimidos (p. ej., estearato de magnesio, almidon, glucosa, lactosa, flor de arroz, greda), soportes para la inhalacion (p. ej., propelentes de hidrocarburos), agentes tamponadores, o materiales de este tipo y combinaciones de los mismos, tal como sera conocido por un experto ordinario en la tecnica.

Para las condiciones experimentales descritas en esta memoria y todas las formulaciones de liofilizacion estudiadas, se observo que la nucleacion estocastica se produda tfpicamente a temperaturas de los recipientes entre aproximadamente -8°C y -20°C y en ocasiones tan calientes como -5°C. Los recipientes en general podnan mantenerse a temperaturas mas calidas que -8°C durante largos penodos de tiempo sin nucleacion. El inicio de la nucleacion y el posterior crecimiento del cristal (es decir, la congelacion) se determino midiendo la temperatura como el punto en el que la temperatura del recipiente aumento rapidamente en respuesta al calor latente exotermico de fusion. El inicio de la congelacion tambien se pudo determinar visualmente a traves de una mirilla en la puerta de la camara del liofilizador.

Ejemplo 1 - Control de la Temperatura de Nucleacion

Cuatro viales separados se llenaron con 2,5 mL de disolucion de manitol al 5% en peso. El punto de congelacion termodinamica predicho de la disolucion de manitol al 5% en peso es de aproximadamente -0,5°C. Los cuatro viales se colocaron en un estante del liofilizador en estrecha proximidad entre sf. Las temperaturas de las cuatro viales fueron controladas utilizando termopares montados en superficie. El liofilizador se presurizo con argon a 197,9 kPa (14 psig).

El estante del liofilizador se enfrio para obtener temperaturas del vial de entre aproximadamente - 1,3°C y aproximadamente -2,3°C (+/- 1°C precision de medicion de los termopares). A continuacion, el liofilizador se despresurizo de aproximadamente 197,9 kPa (14 psig) a aproximadamente la presion atmosferica en menos de cinco segundos para inducir la nucleacion de la disolucion dentro de los viales. Los cuatro viales se nuclearon y comenzaron a congelarse inmediatamente despues de la despresurizacion. Los resultados se resumen en la Tabla 1 que figura a continuacion.

Tal como se ve en la Tabla 1, las temperaturas de nucleacion controlada en este ejemplo (es decir, las Temperaturas Iniciales del Vial) son bastante proximas al punto de congelacion termodinamica predicho de la disolucion. Asf, el presente metodo permite que se produzca el control de la nucleacion en disoluciones que tienen un grado muy bajo de sub-enfriamiento o a temperaturas de nucleacion cercanas o solo ligeramente mas fnas que sus puntos de congelacion.

Tabla 1. Control de la Temperature de Nucleacion.

Vial N°

Disolucion Atmos. Temperatura Inicial Vial [°C] del Cafda de [kPa (psi)] Presion Resultado Despresurizacion de

1

2,5 mL de 5% en peso manitol al Argon -2,3 96,5 (14) Nucleacion

2

2,5 mL de 5% en peso manitol al Argon -1,3 96,5 (14) Nucleacion

3

2,5 mL de 5% en peso manitol al Argon -2,1 96,5 (14) Nucleacion

4

2,5 mL de 5% en peso manitol al Argon -1,7 96,5 (14) Nucleacion

Ejemplo 2 - Control de la Temperature de Nucleacion

En este ejemplo, noventa y cinco viales se llenaron con 2,5 mL de disolucion de manitol al 5% en peso. El punto de 5 congelacion termodinamica de la disolucion de manitol al 5% en peso es de aproximadamente -0,5°C. Los noventa y cinco viales se colocaron en un estante del liofilizador en estrecha proximidad entre sf La temperatura de seis viales colocados en diferentes lugares en el estante del liofilizador se monitorizo continuamente utilizando termopares montados en superficie. El liofilizador se presurizo en una atmosfera de argon a aproximadamente 197,9 kPa (14 psig). El estante del liofilizador se enfrio a continuacion para obtener temperaturas de los viales de cerca de -5°C. A 10 continuacion, el liofilizador se despresurizo de aproximadamente 197,9 kPa (14 psig) a aproximadamente la presion atmosferica en menos de cinco segundos para inducir la nucleacion de la disolucion dentro de los viales. Todos los noventa y cinco viales se observaron visualmente que nucleaban y empezaba la congelacion inmediatamente despues de la despresurizacion. Los datos de termopar para los seis viales monitorizados confirmaron la observacion visual. Los resultados se resumen en la Tabla 2. Como se puede ver en ella, las temperaturas de 15 nucleacion controlada en este ejemplo (es decir, temperaturas Iniciales del Vial) estan algo por debajo del punto de congelacion termodinamica predicho de la disolucion. Asf, el presente metodo permite que se produzca el control de la nucleacion en disoluciones que tienen un grado moderado de sub-enfriamiento. Este ejemplo tambien demuestra la escalabilidad del presente metodo a una aplicacion vial multiple.

Tabla 2. Control de la Temperatura de Nucleacion.

Vial

Disolucion Atmos. Temperatura Inicial del Cafda de Presion Resultado de

N°

Vial [°C] [kPa (psi)] Despresurizacion

1

2,5 mL de 5% en peso manitol al Argon -4,2 96,5 (14) Nucleacion

2

2,5 mL de 5% en peso manitol al Argon - 4,4 96,5 (14) Nucleacion

3

2,5 mL de 5% en peso manitol al Argon -4,6 96,5 (14) Nucleacion

4

2,5 mL de 5% en peso manitol al Argon -4,4 96,5 (14) Nucleacion

5

2,5 mL de 5% en peso manitol al Argon -4,6 96,5 (14) Nucleacion

6

2,5 mL de 5% en peso manitol al Argon -5,1 96,5 (14) Nucleacion

20 Ejemplo 3 - Control de la Magnitud de Despresurizacion

En este ejemplo, multiples viales se llenaron con 2,5 mL de solucion de manitol al 5% en peso. Una vez mas, el punto de congelacion termodinamica predicho de la disolucion de manitol al 5% en peso es de aproximadamente - 0,5°C. Para cada uno de los ensayos realizados, los viales se colocaron en un estante del liofilizador en estrecha proximidad entre sf. Al igual que con los ejemplos descritos anteriormente, las temperaturas de los viales se 25 monitorizaron mediante termopares montados en superficie. La atmosfera de argon en el liofilizador se presurizo a presiones diferentes y el estante del liofilizador se enfrio para obtener temperaturas de los viales de

aproximadamente -5°C. En cada uno de los ensayos realizados, el liofilizador fue luego rapidamente (es decir, en menos de cinco segundos) despresurizado de la presion seleccionada a la presion atmosferica en un esfuerzo para inducir la nucleacion de la disolucion dentro de los viales. Los resultados se resumen en la Tabla 3.

Tal como se ve en la Tabla 3, la nucleacion controlada se produda en los casos en los que la cafda de presion era 5 de aproximadamente 7 psi o mayor, y la temperatura de nucleacion (es decir, la temperatura inicial del vial) era entre aproximadamente -4,7°C y -5,8°C.

Tabla 3. Efecto de la Magnitud de Despresurizacion

Vial

Disolucion Atmos. Temperatura Inicial del Cafda de Presion Resultado de

N°

Vial [°C] [kPa (psi)] Despresurizacion

1

2,5 5% mL de en peso manitol al Argon -4,7 48,3 (7) Nucleacion

2

2,5 5% mL de en peso manitol al Argon -5,1 48,3 (7) Nucleacion

3

2,5 5% mL de en peso manitol al Argon -5,3 48,3 (7) Nucleacion

4

2,5 5% mL de en peso manitol al Argon -5,6 48,3 (7) Sin nucleacion

5

2,5 5% mL de en peso manitol al Argon -5,6 48,3 (7) Nucleacion

6

2,5 5% mL de en peso manitol al Argon -5,8 48,3 (7) Nucleacion

7

2,5 5% mL de en peso manitol al Argon -5,4 41,4 (6) Sin nucleacion

8

2,5 5% mL de en peso manitol al Argon -5,7 41,4 (6) Sin nucleacion

9

2,5 5% mL de en peso manitol al Argon -5,8 41,4 (6) Sin nucleacion

10

2,5 5% mL de en peso manitol al Argon -5,1 34,5 (5) Sin nucleacion

11

2,5 5% mL de en peso manitol al Argon -5,4 34,5 (5) Sin nucleacion

12

2,5 5% mL de en peso manitol al Argon -5,5 34,5 (5) Sin nucleacion

13

2,5 5% mL de en peso manitol al Argon -4,7 27,6 (4) Sin nucleacion

14

2,5 5% mL de en peso manitol al Argon -5,1 27,6 (4) Sin nucleacion

15

2,5 5% mL de en peso manitol al Argon -5,3 27,6 (4) Sin nucleacion

Ejemplo 4 - Control de las Tasas de Despresurizacion

Para este ejemplo, multiples viales se llenaron con aproximadamente 2,5 mL de disolucion de manitol al 5% en peso 10 que tiene un punto de congelacion termodinamica predicho de aproximadamente -0,5°C. Para cada uno de los ensayos realizados de la variacion del tiempo de despresurizacion, los viales se colocaron en un estante del liofilizador en estrecha proximidad entre sl Al igual que con los ejemplos descritos anteriormente, las temperaturas de los viales se monitorizaron mediante termopares montados en superficie. Al igual que los ejemplos descritos anteriormente, la atmosfera de argon en el liofilizador se presurizo a aproximadamente 197,9 kPa (14 psig) y el 15 estante se enfrio para obtener temperaturas de los viales de aproximadamente -5°C. En cada uno de los ensayos realizados, el liofilizador se despresurizo entonces a diferentes velocidades de despresurizacion de 197,9 kPa (14 psig) a la presion atmosferica en un esfuerzo para inducir la nucleacion de la disolucion dentro de los viales. Para estudiar el efecto de la tasa de despresurizacion o el tiempo de despresurizacion, una valvula de bola restrictiva fue

colocada en la salida de la valvula de control de despresurizacion en la parte trasera del liofilizador. Cuando la valvula de restriccion esta completamente abierta, la despresurizacion de aproximadamente 197,9 kPa (14 psig) a aproximadamente 101,3 kPa (0 psig) se consigue en aproximadamente 2,5 segundos. Solamente cerrando parcialmente la valvula de restriccion, es posible aumentar de forma variable el tiempo de despresurizacion en la 5 camara. Utilizando la valvula de bola de restriccion, se realizaron varias pruebas de funcionamiento con la camara del liofilizador despresurizada a diferentes tasas para averiguar o determinar el efecto de la tasa de despresurizacion sobre la nucleacion. Los resultados se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4. Efecto del Tiempo de Despresurizacion

Vial N°

Disolucion Atmos. Temperatura del Vial [°C] Caida Inicial Presion (psi)] de [kPa Ti]empo Resultado de Despresurizacion

1

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -4,6 96,5 (14) 300 Sin nucleacion

2

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,4 96,5 (14) 300 Sin nucleacion

3

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,8 96,5 (14) 300 Sin nucleacion

4

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -4,6 96,5 (14) 200 Sin nucleacion

5

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,4 96,5 (14) 200 Sin nucleacion

6

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,4 96,5 (14) 200 Sin nucleacion

7

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -4,6 96,5 (14) 100 Sin nucleacion

8

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,2 96,5 (14) 100 Sin nucleacion

9

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,2 96,5 (14) 100 Sin nucleacion

10

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -4,7 96,5 (14) 60 Sin nucleacion

11

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,1 96,5 (14) 60 Sin nucleacion

12

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,1 96,5 (14) 60 Sin nucleacion

13

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,1 96,5 (14) 50 Sin nucleacion

14

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,3 96,5 (14) 50 Sin nucleacion

15

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -4,9 96,5 (14) 50 Sin nucleacion

16

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,4 96,5 (14) 42 Sin nucleacion

17

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,5 96,5 (14) 42 Sin nucleacion

18

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,0 96,5 (14) 42 Sin nucleacion

19

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,1 96,5 (14) 32 Nucleacion

20

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,7 96,5 (14) 32 Nucleacion

21

2,5 mL de manitol Argon -5,6 96,5 (14) 32 Nucleacion

Vial N°

Disolucion Atmos. Temperatura del Vial [°C] Caida Inicial Presion (psi)] de [kPa ^ Resultado de Despresurizacion

al 5% en peso

22

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -4,7 96,5 (14) 13 Nucleacion

23

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,3 96,5 (14) 13 Nucleacion

24

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -5,5 96,5 (14) 13 Nucleacion

Como se ve en la Tabla 4, la nucleacion solo se produjo en los casos en los que el tiempo de despresurizacion era menor que 42 segundos, la cafda de presion era de aproximadamente 96,5 kPa (14 psi) o mayor y la temperatura de nucleacion (es decir, la temperatura inicial del vial) era entre aproximadamente -4,6°C y aproximadamente -5,8°C. Estos resultados indican que la despresurizacion necesita ser realizada de forma relativamente rapida para que el 5 metodo sea eficaz.

Ejemplo 5 - Control de la Atmosfera de Gas

Una vez mas, multiples viales se llenaron cada uno con aproximadamente 2,5 mL de disolucion de manitol al 5% en peso y se colocaron en un estante del liofilizador en estrecha proximidad entre sl Al igual que con los ejemplos descritos anteriormente, la temperatura de los viales de ensayo se monitorizo mediante termopares montados en 10 superficie. Para las diferentes operaciones del ensayo, la atmosfera de gas en el liofilizador se vario manteniendo siempre una presion positiva de aproximadamente 197,9 kPa (14 psig). En este ejemplo, el estante del liofilizador se enfrio para obtener temperaturas del vial de aproximadamente -5°C a -7°C. En cada una de las operaciones del ensayo, el liofilizador se despresurizo luego rapidamente desde aproximadamente de 197,9 kPa (14 psig) a la presion atmosferica en un esfuerzo para inducir la nucleacion de la disolucion dentro de los viales. Los resultados se 15 resumen en la Tabla 5.

Como se ve en la misma, la nucleacion controlada se produjo en todas las atmosferas de gas, a excepcion de la atmosfera del gas helio, en donde la cafda de presion fue de 96,5 kPa (14 psi) y la temperatura de nucleacion (es decir, la temperatura inicial del vial) era entre aproximadamente -4,7°C y aproximadamente -7,4°C. Aunque no se muestra en los ejemplos, se cree que las condiciones alternativas permitiran probablemente una nucleacion 20 controlada en una atmosfera de helio.

Tabla 5. Efecto de la Composicion de la Atmosfera de Gas

Vial

Disolucion Temperatura Atmos. del Vial [°C] Inicial Cafda de Presion Resultado de la

N°

[kPa (psi)] Despresurizacion

1

2,5 mL de manitol 5% en peso al Argon -4,9 96,5 (14) Nucleacion

2

2,5 mL de manitol 5% en peso al Argon -5,2 96,5 (14) Nucleacion

3

2,5 mL de manitol 5% en peso p 1 l Nitrogeno -4,7 96,5 (14) Nucleacion

4

2,5 mL de manitol 5% en peso al Nitrogeno -5,1 96,5 (14) Nucleacion

5

2,5 mL de manitol 5% en peso al Xenon -4,8 96,5 (14) Nucleacion

6

2,5 mL de manitol 5% en peso al Xenon -5,0 96,5 (14) Nucleacion

7

2,5 mL de manitol 5% en peso p 1 Aire -7,4 96,5 (14) Nucleacion

8

2,5 mL de manitol 5% en peso al Aire -7,2 96,5 (14) Nucleacion

5

10

15

20

25

Vial

Disolucion Atmos. Temperatura Inicial Cafda de Presion Resultado de

N°

del Vial [°C] [kPa (psi)] Despresurizacion

9

2,5 mL de manitol 5% en peso al Helio -5,8 96,5 (14) Sin nucleacion

10

2,5 mL de manitol 5% en peso al Helio -5,5 96,5 (14) Sin nucleacion

Ejemplo 6 - Disoluciones de Gran Volumen

En este ejemplo, seis frascos de liofilizacion (60 mL de capacidad) se llenaron con aproximadamente 30 mL de disolucion de manitol al 5% en peso que tiene un punto de congelacion termodinamica predicho de aproximadamente - 0,5°C. Los seis frascos de liofilizacion fueron colocados en un estante del liofilizador en estrecha proximidad entre sf La temperatura de los seis frascos situados en diferentes lugares en el estante del liofilizador se controlo utilizando termopares montados en superficie. El liofilizador se presurizo en una atmosfera de argon a aproximadamente 197,9 kPa (14 psig). El estante del liofilizador se enfrio a continuacion para obtener temperaturas de los frascos de cerca de -5°C. A continuacion, el liofilizador se despresurizo de 197,9 kPa (14 psig) a aproximadamente la presion atmosferica en menos de cinco segundos para inducir la nucleacion de la disolucion dentro de los frascos. Los resultados se resumen en la Tabla 6.

En un experimento separado, una bandeja de secado por congelacion a granel de plastico (Gore LYOGUARD, 1800 mL de capacidad) se lleno con aproximadamente 1000 mL de disolucion de manitol al 5% en peso. La bandeja se obtuvo pre-limpiada para satisfacer los bajos requisitos del material en partfculas de la USP. La bandeja se coloco en un estante del liofilizador, y la temperatura de la bandeja se monitorizo mediante un termopar montado en la superficie exterior de la bandeja cerca del centro de uno de los lados. El estante del liofilizador se enfrio a continuacion para obtener una temperatura de la bandeja proxima a -7°C. A continuacion, el liofilizador se despresurizo de 197,9 kPa (14 psig) a aproximadamente la presion atmosferica en menos de cinco segundos para inducir la nucleacion de la disolucion dentro de la bandeja. Los resultados tambien se resumen en la Tabla 6.

Al igual que los ejemplos descritos anteriormente, todos los recipientes nucleados comenzaron a congelarse inmediatamente despues de la despresurizacion. Tambien. al igual que los ejemplos descritos anteriormente, las temperaturas de nucleacion (es decir, las Temperaturas de los Recipientes) en este ejemplo se controlaron mucho para ser algo proximas a la temperatura de congelacion termodinamica de la disolucion. Mas importante aun, este ejemplo ilustra que el presente metodo permite que se produzca el control de la nucleacion en las disoluciones de mayor volumen y diversos formatos de recipiente. Cabe senalar que se podna esperar que la eficacia del metodo de despresurizacion mejore a medida que aumente el volumen de la formulacion, porque es mas probable que el evento de nucleacion ocurra cuando estan presentes mas moleculas para agregarse y formar nucleos cnticos.

Tabla 6. Efecto del Volumen de la Disolucion y Tipo de Recipientes

Recipiente Disolucion

Atmos Temperatura Recipiente [°C] , . Cafda del Presion (psi)] de Resultado de [kPa Despresurizacion

Frasco 1

n° 30 mL de manitol 5% en peso al Argon -5,3 96,5 (14) Nucleacion

Frasco 2

n° 30 mL de manitol 5% en peso al Argon -5,1 96,5 (14) Nucleacion

Frasco 3

n° 30 mL de manitol 5% en peso al Argon -5,9 96,5 (14) Nucleacion

Frasco 4

n° 30 mL de manitol 5% en peso al Argon -5,2 96,5 (14) Nucleacion

Frasco 5

n° 30 mL de manitol 5% en peso al Argon -5,9 96,5 (14) Nucleacion

Frasco 6

n° 30 mL de manitol 5% en peso al Argon -6,1 96,5 (14) Nucleacion

Bandeja

1000 mL de manitol al 5% enpeso Argon -6,9 96,5 (14) Nucleacion

5

10

15

20

25

30

Ejemplo 7 - Enfriamiento Dinamico frente Enfriamiento Equilibrado

Los metodos actuales de control de la nucleacion se pueden utilizar en diversos modos. Los Ejemplos 1-6, descritos anteriormente, demuestran cada uno el aspecto de control de la temperature de nucleacion de una disolucion de liofilizacion que se equilibra esencialmente a una temperature por debajo de su punto de congelacion termodinamica (es decir, temperatura que cambia muy lentamente). Este ejemplo demuestra que la nucleacion tambien se puede producir a una temperatura por debajo del punto de congelacion termodinamica en un entorno de enfriamiento dinamico (es decir, la disolucion esta experimentando cambios rapidos de temperatura).

En este ejemplo, los viales 1 a 6 representan las muestras descritas anteriormente con referencia al Ejemplo 2. Ademas, tres viales separados (Viales 7-9) tambien se llenaron con 2,5 mL de disolucion de manitol al 5% en peso. En una operacion de ensayo separada, los tres viales adicionales fueron colocados en un estante del liofilizador en estrecha proximidad entre sf. El estante del liofilizador se enfrio rapidamente hacia una temperatura final del estante de -45°C. Cuando uno de los viales alcanzado una temperatura de aproximadamente -5°C, medida por los termopares montados en superficie, el liofilizador se despresurizo rapidamente desde aproximadamente 14 psig a 0 psig en un esfuerzo para inducir la nucleacion. Los tres viales se nuclearon y comenzaron a congelarse inmediatamente despues de la despresurizacion. Las temperaturas de los viales disminuyeron significativamente a entre -6,8°C y -9,9°C antes de la nucleacion como resultado del entorno de enfriamiento dinamico. Los resultados comparativos se resumen en la Tabla 7 que figura a continuacion.

Tabla 7. Resultados del Ensayo - Efecto del Enfriamiento Dinamico sobre la Nucleacion

vial

N°

1

2

3

4

5

6

7

8 9

Disolucion

2.5 mL de manitol 5% en peso

2.5 mL de manitol 5% en peso

2.5 mL de manitol 5% en peso

2.5 mL de manitol 5% en peso

2.5 mL de manitol 5% en peso

2.5 mL de manitol 5% en peso

2.5 mL de manitol 5% en peso

2.5 mL de manitol 5% en peso

2.5 mL de manitol 5% en peso

al

al

al

al

al

al

al

al

al

Modo T,e7. - Nucleacion

de Cafda de [°C] [kPa (psi)] Presion Resultado de Despresurizacion

Equilibrado -4,2

96,5 (14) Nucleacion

Equilibrado -4,4

96,5 (14) Nucleacion

Equilibrado -4,6

96,5 (14) Nucleacion

Equilibrado -4,4

96,5 (14) Nucleacion

Equilibrado -4,6

96,5 (14) Nucleacion

Equilibrado -5,1

96,5 (14) Nucleacion

Dinamico -6,8

96,5 (14) Nucleacion

Dinamico -7,2

96,5 (14) Nucleacion

Dinamico -9,9

96,5 (14) Nucleacion

la

La eficacia de los metodos actuales para el control de la nucleacion en disoluciones de liofilizacion equilibrada en un intervalo de temperaturas determinado o siendo enfriadas dinamicamente disoluciones de liofilizacion, proporciona al usuario final dos modos potenciales de aplicacion con diferentes beneficios y compensaciones. Al permitir que las disoluciones de liofilizacion se equilibren, el intervalo de temperaturas de nucleacion sera estrecho o se minimizara a los lfmites de comportamiento del propia liofilizador. La etapa de equilibrado puede requerir un tiempo extra para lograr protocolos de congelacion relativos a convencionales o dinamicos, en que las temperaturas de la camara y de los viales se dejan caer a menos de aproximadamente - 40°C en un solo paso. Sin embargo, el empleo de la etapa de equilibrado debena proporcionar una uniformidad nucleacion mas mejorada a lo largo de todos los viales o recipientes, asf como la realizacion de los otros beneficios asociados con el control con precision la temperatura de nucleacion del material. Alternativamente, si no desea equilibrar las temperaturas del material o de la disolucion de liofilizacion, se puede simplemente implementar la etapa de despresurizacion en un momento apropiado durante el protocolo de congelacion normal o de enfriamiento dinamico. La despresurizacion durante un enfriamiento dinamico producira una difusion mas amplia de las temperaturas de nucleacion para el material dentro de los recipientes de

liofilizacion, pero anadira un tiempo mmimo al protocolo de congelacion y todav^a permitira que se mitiguen los problemas de la sub-refrigeracion extrema.

Ejemplo 8 - Efecto de Diferentes Excipientes

El presente metodo de controlar o inducir la nucleacion en un material se puede utilizar para controlar la temperature 5 de nucleacion de disoluciones sub-enfriadas que contienen diferentes excipientes de liofilizacion. Este ejemplo demuestra el uso de los presentes metodos con los siguientes excipientes: manitol; hidroxietil-almidon (HES); polietilenglicol (PEG); polivinilpirrolidona (PVP); dextrano; glicina; sorbitol; sacarosa; y trehalosa. Para cada uno de los excipientes, dos viales se llenaron con 2,5 mL de una disolucion que contiene 5% en peso del excipiente. Los viales se colocaron en un estante del liofilizador en estrecha proximidad entre sf. El liofilizador se presurizo en una 10 atmosfera de argon a aproximadamente 197,9 kPa (14 psig). El estante del liofilizador se enfrio para obtener temperaturas de los viales proximas a -3°C y luego se despresurizo rapidamente para inducir la nucleacion. Los resultados se resumen en la Tabla 8.

Tabla 8. Efecto de Diferentes Excipientes de Liofilizacion

Vial

n°

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12

13

14

15

16

17

18

Disolucion/Excipiente Atmos. 2,5 mL de manitol al 5% en

peso

2.5 mL de manitol al 5% en peso

2.5 mL de HES al 5% en peso

2.5 mL de HES al 5% en peso

2.5 mL de PEG al 5% en peso

2.5 mL de PEG al 5% en peso

2.5 mL de PVP al 5% en peso

2.5 mL de PVP al 5% en peso

2.5 mL de dextrano al 5% en peso

2.5 mL de dextrano al 5% en peso

2.5 mL de glicina al 5% en peso

2.5 mL de glicina al 5% en peso

2.5 mL de sorbitol al 5% en peso

2.5 mL de sorbitol al 5% en peso

2.5 mL de sacarosa al 5% en peso

2.5 mL de sacarosa al 5% en peso

2.5 mL de trehalosa al 5% en peso

2.5 mL de trehalosa al 5% Argon

Argon

Argon

Argon

Argon

Argon

Argon

Argon

Argon

Argon

Argon

Argon

Argon

Argon

Argon

Argon

Argon

Argon

Temperatura del Vial [°C]

Inicial Cafda de Presion Resultado de [kPa (psi)] Despresurizacion

-3,3

96,5 (14) Nucleacion

-3,0

96,5 (14) Nucleacion

-3,1

96,5 (14) Nucleacion

-3,7

96,5 (14) Nucleacion

-3,8

96,5 (14) Nucleacion

-3,4

96,5 (14) Nucleacion

-3,5

96,5 (14) Nucleacion

-3,3

96,5 (14) Nucleacion

-4,0

96,5 (14) Nucleacion

-3,1

96,5 (14) Nucleacion

-3,8

96,5 (14) Nucleacion

-3,9

96,5 (14) Nucleacion

-3,6

96,5 (14) Nucleacion

-3,4

96,5 (14) Nucleacion

-3,3

96,5 (14) Nucleacion

3,4

96,5 (14) Nucleacion

3,7

96,5 (14) Nucleacion

la

5

10

15

20

25

30

35

40

Vial

n°

Disolucion/Excipiente

en peso

Atmos.

Temperature del Vial [°C]

-3,1

Inicial Ca^da de Presion Resultado de [kPa (psi)] Despresurizacion

96,5 (14) Nucleacion

la

Ejemplo 9 - Control de la Nucleacion de Disoluciones de Protemas

Los presentes metodos y el sistema descritos en esta memoria se pueden utilizar para controlar la temperature de nucleacion de disoluciones de proteinas sub-enfriadas sin efectos negativos o adversos sobre la solubilidad de la protema o la actividad enzimatica. En este ejemplo se utilizaron dos proteinas, albumina de suero bovino (BSA) y lactato deshidrogenasa (LDH).

BSA se disolvio en manitol al 5% en peso a una concentracion de 10 mg/mL. Tres viales de liofilizacion se llenaron con 2,5 mL de la disolucion de BSA-manitol y se colocaron en un estante del liofilizador en estrecha proximidad entre sr El liofilizador se presurizo en una atmosfera de argon a aproximadamente 197,9 kPa (14 psig). El estante del liofilizador se enfrio para obtener temperaturas de los viales proximas a -5°C. El liofilizador se despresurizo rapidamente para inducir la nucleacion. Todos los viales de disolucion de BSA se nuclearon y comenzaron a congelarse inmediatamente despues de la despresurizacion. No se observo precipitacion alguna de la protema despues de la descongelacion.

Las proteinas LDH se obtuvieron de dos proveedores diferentes y por motivos de claridad se designan como LDH-1 o LDH-2 para distinguir los dos lotes distintos. LDH-1 se disolvio en manitol al 5% en peso a una concentracion de 1 mg/mL. Seis viales de liofilizacion se llenaron con 2,5 mL de la solucion de LDH-1/manitol y se colocaron en un estante del liofilizador en estrecha proximidad entre sf. El liofilizador se presurizo en una atmosfera de argon a aproximadamente 197,9 kPa (14 psig). El estante del liofilizador se enfrio empezando desde la temperatura ambiente para obtener las temperaturas de los viales proximas a -4°C. A continuacion, el liofilizador se despresurizo rapidamente para inducir la nucleacion. Todos los viales se nuclearon y comenzaron a congelarse inmediatamente despues de la despresurizacion. Los viales se mantuvieron en este estado durante aproximadamente 15 minutos. A continuacion, el estante del liofilizador se enfrio a una velocidad de aproximadamente 1°C/min para obtener temperaturas de los viales proximas a -45°C y se mantuvo durante otros 15 minutos para asegurar la complecion del proceso de congelacion. Despues de la etapa de congelacion, el estante del liofilizador se calento despues a una velocidad de aproximadamente 1°C/min para elevar las temperaturas de los viales a cerca de 5°C. No se observo precipitacion alguna de la protema despues de la descongelacion. El contenido del vial se sometio a ensayo en cuanto a la actividad enzimatica, y los resultados se compararon con una muestra control de la disolucion de LDH- 1/manitol no congelada.

Como parte del Ejemplo 9, las muestras nucleadas despresurizadas de la disolucion de LDH-1/manitol se compararon con muestras estocasticamente nucleadas. En las muestras estocasticamente nucleadas de LDH-1, el procedimiento de congelacion se repitio sin presurizacion y despresurizacion y sin la atmosfera de argon. En concreto, LDH-1 se disolvio en manitol al 5% en peso a una concentracion de 1 mg/mL. Seis viales de liofilizacion se llenaron con 2,5 mL de la disolucion de LDH-1/manitol y se colocaron en un estante del liofilizador en estrecha proximidad entre sf. El estante del liofilizador se enfrio a partir de la temperatura ambiente a una velocidad de aproximadamente 1°C/min para obtener temperaturas de los viales proximas a -45°C y se mantuvo durante 15 minutos para asegurar la complecion del proceso de congelacion. Despues de la etapa de congelacion, el estante del liofilizador se calento a una velocidad de aproximadamente 1°C/min para elevar las temperaturas de los viales hasta cerca de 5°C. No se observo precipitacion alguna de la protema despues de la descongelacion. El contenido del vial se ensayo en cuanto a la actividad enzimatica, y los resultados se compararon con la misma muestra de control de disolucion de LDH-1/manitol no congelada.

Tambien como parte del Ejemplo 9, los experimentos descritos anteriormente para LDH-1 se repitieron utilizando LDH-2. La unica diferencia era una temperatura de nucleacion controlada proxima a -3°C para LDH-2 en lugar de - 4°C para LDH-1.

Tabla 9. Control de la Temperature de Nucleacion de Disoluciones de Protemas Sub-Refrigeradas

Vial n°

Disolucion Atmos. Temperatura Inicial del Vial Cafda Presion [ C] (psi)] de Actividad [kPa Enzimatica Perdida [%] Resultado de Despresurizacion

2,5 mL de

1

disolucion BSA de Argon -4,9 96,5 (14) - Nucleacion

2,5 mL de

2

disolucion BSA de Argon -4,3 96,5 (14) - Nucleacion

2,5 mL de

3

disolucion BSA de Argon -5,3 96,5 (14) - Nucleacion

2,5 mL de

4

disolucion LDH-1 de Argon -3,8 96,5 (14) 9,0 Nucleacion

2,5 mL de

5

disolucion LDH-1 de Argon -4,0 96,5 (14) 16,2 Nucleacion

2,5 mL de

6

disolucion LDH-1 de Argon -3,7 96,5 (14) 18,4 Nucleacion

2,5 mL de

7

disolucion LDH-1 de Argon -4,0 96,5 (14) 23,4 Nucleacion

2,5 mL de

8

disolucion LDH-1 de Argon -3,9 96,5 (14) 18,5 Nucleacion

2,5 mL de

9

disolucion LDH-1 de Argon -4,0 96,5 (14) 21,2 Nucleacion

2,5 mL de

10

disolucion LDH-1 de Aire -10,4 101,3 (0) 35,7 Nucleacion

2,5 mL de

11

disolucion LDH-1 de Aire -16,5 101,3 (0) 35,4 Nucleacion

2,5 mL de

12

disolucion LDH-1 de Aire -15,5 101,3 (0) 36,1 Nucleacion

2,5 mL de

13

disolucion LDH-1 de Aire -10,5 101,3 (0) 43,9 Nucleacion

2,5 mL de

14

disolucion LDH-1 de Aire -9,8 101,3 (0) 24,9 Nucleacion

2,5 mL de

15

disolucion LDH-1 de Aire -11,0 101,3 (0) 39,2 Nucleacion

2,5 mL de

16

disolucion LDH-2 de Argon -3,1 96,5 (14) 29,9 Nucleacion

2,5 mL de

17

disolucion de Argon -2,9 96,5 (14) 18,9 Nucleacion

LDH-2

Vial n°

Disolucion Atmos. Temperatura Inicial del Vial Cafda Presion [ C] (psi)] de Actividad [kPa Enzimatica Perdida [%] Resultado de Despresurizacion

18

2,5 mL disolucion LDH-2 de de Argon -3,1 96,5 (14) 23,3 Nucleacion

19

2,5 mL disolucion LDH-2 de de Argon -2,7 96,5 (14) 19,6 Nucleacion

20

2,5 mL disolucion LDH-2 de de Argon -3,1 96,5 (14) 32,1 Nucleacion

21

2,5 mL disolucion LDH-2 de de Argon -2,6 96,5 (14) 35,2 Nucleacion

22

2,5 mL disolucion LDH-2 de de Aire -5,0 101,3 (0) 38,3 Nucleacion

23

2,5 mL disolucion LDH-2 de de Aire -5,5 101,3 (0) 40,0 Nucleacion

24

2,5 mL disolucion LDH-2 de de Aire 2,3 101,3 (0) 36,5 Nucleacion

25

2,5 mL disolucion LDH-2 de de Aire -3,8 101,3 (0) 42,0 Nucleacion

26

2,5 mL disolucion LDH-2 de de Aire -5,1 101,3 (0) 50,2 Nucleacion

27

2,5 mL disolucion LDH-2 de de Aire -5,9 101,3 (0) 40,6 Nucleacion

Tal como se ve en la Tabla 9, el proceso de nucleacion y congelacion controladas logrado a traves de despresurizacion claramente no disminuye la actividad enzimatica con respecto a un protocolo de nucleacion estocastica y congelacion comparables. De hecho, el proceso de nucleacion controlada logrado a traves de la despresurizacion parece preservar mejor la actividad de la enzima con una perdida media de actividad de solo 5 17,8% para LDH-1 y 26,5% para LDH-2 en comparacion con la perdida de actividad media de 35,9 % para LDH-1 y

41,3% para LDH-2 despues de la nucleacion estocastica.

Debe senalarse que las temperaturas de nucleacion estocastica observadas para LDH-2 eran sustancialmente mas calidas que las temperaturas de nucleacion estocastica para LDH-1. Esta diferencia puede deberse a algun contaminante que actua en calidad de un agente de nucleacion en la LDH-2. Las temperaturas de nucleacion 10 estocastica estan mucho mas cerca de las temperaturas de nucleacion controlada para LDH-2 en comparacion con

LDH-1, sin embargo, las mejoras en la retencion de la actividad enzimatica obtenida a traves de la nucleacion controlada para LDH-1 y LDH-2 son similares en 18,1% y 14,8%, respectivamente. Este resultado sugiere que las mejoras en la retencion de la actividad enzimatica pueden ser atribuidas en parte a las caractensticas del proceso de nucleacion controlada en sf, no solo a las temperaturas de nucleacion mas calidas prescritas obtenidas a traves de 15 la despresurizacion.

Ejemplo 10 - Reduccion del Tiempo de Secado Primario

Una disolucion de manitol al 5% en peso se preparo mezclando aproximadamente 10,01 gramos de manitol con aproximadamente 190,07 gramos de agua. Los viales se llenaron con 2,5 mL de la disolucion de manitol al 5% en peso. Los viales se pesaron en vacfo y con la disolucion para determinar la masa de agua anadida a los viales. Los

20 veinte viales se colocaron en un soporte en un estante del liofilizador en estrecha proximidad entre sf. Las

5

10

15

20

25

temperatures de seis viales se monitorizaron mediante termopares montados en superficie; todos los viales monitorizados fueron rodeados por otros viales para mejorar la uniformidad del comportamiento del vial. El liofilizador se presurizo a aproximadamente 197,9 kPa (14 psig) en una atmosfera de gas controlada de gas argon. El estante del liofilizador se enfrio desde la temperatura ambiente a aproximadamente -6°C para obtener temperaturas de los viales de entre aproximadamente -1°C y -2°C. A continuacion, el liofilizador se despresurizo desde aproximadamente 197,9 kPa (14 psig) a aproximadamente la presion atmosferica en menos de cinco segundos para inducir la nucleacion de la disolucion dentro de los viales. Todos los viales observados visualmente o monitorizados a traves de termopares se nuclearon y comenzaron a congelarse inmediatamente despues de la despresurizacion.

A continuacion, se redujo rapidamente la temperatura del estante a aproximadamente -45°C para completar el proceso de congelacion. Una vez que todas las temperaturas de los viales eran de aproximadamente -40°C o menos, se hizo el vacfo en la camara de liofilizacion y se inicio el proceso de secado primario (es decir, la sublimacion). Durante este proceso de secado, el estante del liofilizador se calento a aproximadamente -14°C a traves de una rampa de una hora y se mantuvo a esa temperatura durante 16 horas. El condensador se mantuvo a aproximadamente -60°C a lo largo de todo el proceso de secado. El secado primario se detuvo apagando la bomba de vacfo y rellenando la camara con argon a presion atmosferica. Los viales se retiraron rapidamente del liofilizador y se pesaron para determinar la cantidad de agua que se habfa perdido durante el proceso de secado primario.

En un experimento separado, como parte del Ejemplo 10, otros viales se llenaron con 2,5 mL de la misma disolucion de manitol al 5% en peso. Los viales se pesaron en vacfo y con la disolucion para determinar la masa de agua anadida a los viales. Los viales fueron cargados en el liofilizador de la misma manera a la descrita anteriormente, y las temperaturas de los seis viales se monitorizaron una vez mas utilizando termopares montados en superficie. El estante del liofilizador se enfrio rapidamente desde la temperatura ambiente a aproximadamente -45°C para congelar los viales. La nucleacion se produjo estocasticamente entre aproximadamente -15°C y aproximadamente - 18°C durante la etapa de enfriamiento. Una vez que todas las temperaturas de los viales eran de aproximadamente - 40°C o menos, los viales se secaron de una manera identica al metodo descrito anteriormente. Tras concluir el secado primario, las muestras se retiraron rapidamente del liofilizador y se pesaron para determinar la cantidad de agua que se habfa perdido durante el proceso de secado primario.

Tabla 10. El Aumento de la Temperatura de Nucleacion mejora el Secado Primario

=3 O Q)

Disolucion Atmos. Temperatura Inicial del Vial [°C] Cafda de Presion [kPa (psi)] Perdida de Agua [%] Resultado de la Despresurizado

1

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -1,3 96,5 (14) 89,9 Nucleacion

2

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -1,9 96,5 (14) 85,2 Nucleacion

3

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -1,3 96,5 (14) 87,1 Nucleacion

4

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -2,3 96,5 (14) 88,8 Nucleacion

5

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -2,1 96,5 (14) 85,0 Nucleacion

6

2,5 mL de manitol al 5% en peso Argon -1,1 96,5 (14) 80,7 Nucleacion

7

2,5 mL de manitol al 5% en peso Aire -15,7 101,3 (0) 65,7 -

8

2,5 mL de manitol al 5% en peso Aire -16,7 101,3 (0) 66,9 -

9

2,5 mL de manitol al 5% en peso Aire -14,5 101,3 (0) 64,6 -

10

2,5 mL de manitol al 5% en peso Aire -15,6 101,3 (0) 64,7 -

11

2,5 mL de manitol al 5% en peso Aire -16,5 101,3 (0) 64,1 -

12

2,5 mL de manitol al 5% en peso Aire -17,9 101,3 (0) 65,7 -

Los resultados del proceso de secado por congelacion con nucleacion controlada y nucleacion estocastica se resumen en la Tabla 10. Hay que senalar que estos dos experimentos solo difieren en la adicion de la nucleacion controlada a traves de la etapa de despresurizacion a un experimented Tal como se ve en la Tabla 10, el proceso de nucleacion controlada logrado a traves de la despresurizacion permite una nucleacion a muy bajos grados de sub- 5 enfriamiento, entre aproximadamente -1,1°C y -2,3°C en este ejemplo. Las temperaturas de nucleacion mucho mas altas para el caso de la nucleacion controlada en comparacion con el caso de nucleacion estocastica proporcionan una estructura de hielo y la torta liofilizada resultante con propiedades de secado mejorado drasticamente. Para la misma cantidad de tiempo de secado, los viales nucleados utilizando los metodos de despresurizacion descritos entre aproximadamente -1,1°C y -2,3°C perdieron una media de 86,1% de su agua, mientras que los viales 10 nucleados estocasticamente entre aproximadamente - 14,5°C y -17,9°C solamente perdieron una media de 65,3%. Por lo tanto, los viales nucleados estocasticamente requerinan mucho mas tiempo de secado primario para lograr el mismo grado de perdida de agua que los viales nucleados de una manera controlada de acuerdo con los metodos descritos en esta memoria. La mejora en el tiempo de secado es probable que se atribuya a la formacion de cristales de hielo mas grandes a temperaturas de nucleacion mas altas. Estos cristales de hielo mas grandes dejan tras de sf 15 poros mas grandes tras la sublimacion, y los poros mas grandes ofrecen menos resistencia al flujo de vapor de agua durante la sublimacion ulterior.

Aplicabilidad Industrial

El presente metodo proporciona un metodo mejorado para controlar la temperatura y/o el tiempo en el que los materiales sub-enfriados, a saber, lfquidos o disoluciones, nuclean y luego se congelan. Aunque esta solicitud se 20 centra en parte en el secado por congelacion, un problema similar se produce para cualquier etapa de procesamiento de material que implique una transicion de fase nucleada. Ejemplos de tales procesos incluyen la cristalizacion de polfmeros y metales a partir de masas fundidas, la cristalizacion de los materiales a partir de disoluciones sobresaturadas, la cristalizacion de protemas, la produccion de nieve artificial, la congelacion de alimentos, la concentracion por congelacion, la cristalizacion fraccionada, la crio-conservacion o la condensacion de 25 vapores en lfquidos.

El beneficio mas inmediato de controlar la temperatura de nucleacion de un lfquido o disolucion es la capacidad de controlar el numero y tamano de los dominios de solidos producidos por la transicion de fase. En la congelacion del agua, por ejemplo, la temperatura de nucleacion controla directamente el tamano y numero de cristales de hielo formados. En terminos generales, los cristales de hielo son menores en numero y de mayor tamano cuando la 30 temperatura de nucleacion es mas alta.

La capacidad de controlar el numero y tamano de los dominios solidos producidos por una transicion de fase puede proporcionar beneficios adicionales. En un proceso de secado por congelacion, por ejemplo, el numero y tamano de los cristales de hielo influye fuertemente sobre las propiedades de secado de la torta liofilizada. Cristales de hielo grandes producidos por temperaturas de nucleacion mas altas dejan tras de sf poros mas grandes tras la 35 sublimacion, y los poros mas grandes ofrecen menos resistencia al flujo de vapor de agua durante la sublimacion subsiguiente. Por lo tanto, el sistema y los metodos descritos proporcionan medios de aumentar las tasas de secado primario (es decir, la sublimacion) en los procesos de secado por congelacion mediante el aumento de la temperatura de nucleacion.

Otro posible beneficio se puede conseguir en aplicaciones en las que materiales sensibles se conservan a traves de 40 procesos de congelacion (es decir, se crio-conservan). Por ejemplo, un material biologico que incluye, pero no se limita a muestras de tejidos de mairnferos (p. ej., sangre del cordon umbilical, biopsia de tejidos, celulas del huevo y del esperma, etc.), lmeas celulares (p. ej., de mamffero, levadura, procariotas, hongos, etc.) y moleculas biologicas (p. ej., protemas, ADN, ARN y subclases de los mismos) congelados en una disolucion acuosa pueden experimentar diversas tensiones durante el proceso de congelacion que pueden poner en peligro la funcion o actividad del 45 material. La formacion de hielo puede alterar ffsicamente el material o puede crear cambios serios en la union interfacial, las fuerzas osmoticas, las concentraciones de soluto, etc. experimentadas por el material. Dado que la nucleacion controla la estructura y la cinetica de la formacion de hielo, se puede influir significativamente en estas tensiones. El presente sistema y metodos, por lo tanto, proporcionan medios unicos de mitigar las tensiones asociadas con los procesos de crio-conservacion y la mejora de la recuperacion de la funcion o actividad de 50 materiales crio-conservados. Esto representa una mejora frente a los metodos de control de la nucleacion convencionales (p. ej., la siembra o el contacto con superficies fnas) utilizados para iniciar la formacion de hielo extracelular en los algoritmos de crio-conservacion de dos etapas disenados para las celulas vivas.

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Los presentes metodos pueden ser tambien aplicados a disoluciones de complejos o mezclas que contienen varios constituyentes, tanto en aplicaciones de crio-conservacion como de liofilizacion. Estas formulaciones son a menudo disoluciones con un disolvente acuoso, organico o acuoso-organico mixto que contiene un ingrediente farmaceuticamente activo (p. ej., un producto qmmico sintetico, protema, peptido o vacuna) y opcionalmente, uno o mas constituyentes mitigantes, incluyendo agentes de carga que ayudan a evitar la perdida ffsica del ingrediente activo durante el secado (p. ej., dextrosa, glucosa, glicina, lactosa, maltosa, manitol, polivinilpirrolidona, cloruro de sodio y sorbitol); agentes de tamponamiento o modificadores de la toxicidad que ayudan a mantener el pH del entorno o la toxicidad del componente activo apropiado (p. ej., acido acetico, acido benzoico, acido citrico, acido clortndrico, acido lactico, acido maleico, acido fosforico, acido tartarico, y las sales de sodio de los acidos anteriormente mencionados); agentes estabilizantes que ayudan a preservar la estructura y funcion del constituyente activo durante el procesamiento o en su forma lfquida o seca final de estabilizacion (p. ej., alanina, dimetilsulfoxido, glicerol, glicina, albumina de suero humano, polietilenglicol, lisina, polisorbato, sorbitol, sacarosa, y trehalosa); agentes que modifican el comportamiento de transicion vttrea de la formulacion (p. ej., polietilenglicol y azucares), y antioxidantes que protegen el componente activo frente a la degradacion (p. ej., ascorbato, bisulfito de sodio, formaldetndo sodico, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio, sulfoxilato y tioglicerol).

Dado que la nucleacion es tfpicamente un proceso aleatorio, una pluralidad del mismo material sometido a las condiciones de procesamiento identicas podna nuclear a diferentes temperaturas. Como resultado, las propiedades de los materiales que dependen del comportamiento de nucleacion probablemente difieren, a pesar de las condiciones de procesamiento identicas. El sistema y los metodos descritos proporcionan medios para el control de las temperaturas de nucleacion de una pluralidad de materiales de forma simultanea y, por lo tanto, ofrecen una manera de aumentar la uniformidad de las propiedades del producto que dependen del comportamiento de nucleacion. En un proceso tfpico de secado por congelacion, por ejemplo, la misma disolucion en viales separados puede nuclear estocasticamente a lo largo de un amplio intervalo de temperaturas y, como resultado, los productos finales liofilizados pueden poseer una variabilidad significativa en las propiedades cnticas tales como la humedad residual, la actividad y el tiempo de reconstitucion. Al controlar la temperatura de nucleacion mediante el proceso descrito en esta memoria, la uniformidad de un vial a otro de las propiedades del producto de un proceso de secado por congelacion puede mejorar drasticamente. Asf, cuando el material se mantiene en una pluralidad de recipientes o viales, mediante el uso del procedimiento descrito en esta memoria el producto seco obtenido a partir de la pluralidad de recipientes o viales puede exhibir tiempos de reconstitucion relativamente uniformes y/o una humedad residual o niveles de disolvente relativamente uniformes. Ademas de ello, el tiempo requerido para el secado del material congelado puede ser menor que el tiempo requerido para el secado del material congelado que es estocasticamente nucleado.

La capacidad de controlar el comportamiento de la nucleacion de un material tambien puede proporcionar un beneficio considerable en la reduccion del tiempo necesario para desarrollar un proceso industrial que gira en torno a un evento de nucleacion normalmente no controlado. Por ejemplo, a menudo se requieren muchos meses para desarrollar con exito un ciclo de secado por congelacion que se puede lograr en un penodo razonable de tiempo, proporciona propiedades deseadas del producto dentro de la uniformidad especificada, y conserva una suficiente actividad del ingrediente farmaceutico activo (API). Al proporcionar medios de controlar la nucleacion y, por lo tanto, mejorar potencialmente el tiempo de secado primario, la uniformidad del producto y la actividad de API, el tiempo necesario para el desarrollo con exito de protocolos de secado por congelacion debenan reducirse drasticamente.

En particular, los beneficios potenciales del proceso de nucleacion controlada proporcionaran una mayor flexibilidad en la especificacion de la composicion de la formulacion a ser secada por congelacion. Dado que la nucleacion controlada puede preservar mejor el API durante la etapa de congelacion, los usuarios debenan ser capaces de minimizar la adicion de los constituyentes mitigantes (p. ej., agentes estabilizantes) a la formulacion o elegir combinaciones mas simples de constituyentes de la formulacion para lograr los objetivos de estabilidad y de procesamiento combinados. Beneficios sinergicos pueden surgir en los casos en los que la nucleacion controlada minimiza el uso de agentes estabilizantes u otros componentes mitigantes que inherentemente alargan los tiempos de secado primario (p. ej., por la disminucion de las temperaturas de transicion vftrea de disoluciones acuosas).

Los metodos descritos son particularmente bien adecuados para operaciones de produccion o de fabricacion a gran escala, ya que pueden llevarse a cabo utilizando el mismo equipo y los mismos parametros del proceso que se pueden aumentar facilmente o adaptar para la fabricacion de una amplia gama de productos. El proceso proporciona la nucleacion de materiales utilizando un proceso en el que todas las manipulaciones se pueden llevar a cabo en una sola camara (p. ej., un liofilizador) y en el que el proceso no requiere el uso de un vacfo, el uso de aditivos, vibracion, electrocongelacion o similares para inducir la nucleacion. En contraste con la tecnica anterior, el presente metodo no anade nada al producto liofilizado. Solo requiere que los materiales, (p. ej., lfquidos en los viales) se mantengan inicialmente a una presion especificada bajo un entorno de gas y que la presion se reduzca rapidamente

a una presion mas baja. Cualquier gas aplicado sera separado de los viales durante el ciclo de liofilizacion. Los viales o sus contenidos no se ponen en contacto ni tocan con nada, excepto el gas. La simple manipulacion de la presion ambiente y el entorno del gas son suficientes por sf sola para lograr ese objetivo. Al confiar solo en el cambio de presion ambiente para inducir la nucleacion, el presente metodo descrito en esta memoria afecta de 5 manera uniforme y simultaneamente a todos los viales en un liofilizador. La presente realizacion tambien es menos costosa y mas facil de implementar y mantener que los metodos de la tecnica anterior de influir en la nucleacion en materiales en aplicaciones de liofilizacion. El presente metodo permite un secado primario significativamente mas rapido en los procesos de liofilizacion, reduciendo asf los costes de procesamiento de los productos farmaceuticos liofilizados. El presente metodo produce productos liofilizados mucho mas uniformes que los metodos de la tecnica 10 anterior, reduciendo asf las perdidas de producto y creando barreras de entrada para los procesadores que no puedan cumplir las especificaciones mas estrictas de uniformidad. Este metodo logra estas ventajas sin contaminar el producto liofilizado. Un mayor control del proceso debena conducir a un producto mejorado y a tiempos de proceso mas cortos.

De lo anterior, se debe apreciar que la presente invencion proporciona, por lo tanto, un sistema y un metodo de 15 liofilizacion. Diversas modificaciones, cambios y variaciones de los presentes metodos resultaran evidentes para una persona experta en la tecnica. Por ejemplo, los medios para controlar la temperatura pueden ser sistemas de enfriamiento basados en materiales criogenicos alternativos o sistemas de refrigeracion mecanicos convencionales o avanzados. Del mismo modo, los medios para controlar la presion y la atmosfera de gas en la camara se contemplan espedficamente para incluir tecnicas de presurizacion y despresurizacion conocidas.

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Claims (6)

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   15

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de liofilizar un material, que comprende las etapas de:

   presurizar la atmosfera de gas dentro de una camara (202) a una presion entre la presion ambiente y 172,4 kPa (25 psi) por encima de la presion ambiente y enfriar el material en la camara presurizada a una tasa de enfriamiento prescrita a una temperatura de nucleacion deseada;

   rapidamente disminuir la presion en la camara (202) en 40 segundos o menos o a una tasa de cafda de presion, AP/At, mayor que 1,4 kPa (0,2 psi) por segundo para inducir la nucleacion de congelacion en el material a la temperatura de nucleacion deseada;

   enfriar adicionalmente el material nucleado hasta o por debajo de una temperatura final para congelar el material; y

   secar el material congelado para producir un producto secado que tiene una humedad reducida o disolvente.
2. 2. El metodo de liofilizar segun la reivindicacion 1, en el que el material se enfna inicialmente a una temperatura que oscila entre la temperatura de transicion de fase y 20°C por debajo de la temperatura de transicion de fase antes de la despresurizacion.
3. 3. El metodo de liofilizar segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la presion se disminuye en aproximadamente 48,3 kPa (7 psi) o mas.
4. 4. El metodo de liofilizar segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la presion se disminuye de manera que una relacion de presion absoluta, Pi/Pf, es de aproximadamente 1,2 o mayor.
5. 5. El metodo de liofilizar segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el material comprende, ademas, uno o mas componentes que comprenden un virus vivo o atenuado; acido nucleico; anticuerpo monoclonal; anticuerpo policlonal; protema; peptido; o polipeptido.
6. 6. El metodo de liofilizar segun la reivindicacion 5, en el que componentes del material reconstituido exhiben una funcion o actividad mejorada frente a la funcion o actividad asociada con componentes de material reconstituido de un material nucleado estocasticamente.