ES2587397T3 - Procedimiento para preparar un conjugado específico de sitio de un polipéptido fisiológicamente activo - Google Patents

Procedimiento para preparar un conjugado específico de sitio de un polipéptido fisiológicamente activo Download PDF

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ES2587397T3 ES10753706.0T ES10753706T ES2587397T3 ES 2587397 T3 ES2587397 T3 ES 2587397T3 ES 10753706 T ES10753706 T ES 10753706T ES 2587397 T3 ES2587397 T3 ES 2587397T3
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Abstract

Un procedimiento para preparar un conjugado de polipéptido fisiológicamente activo específico de sitio, que comprende las etapas de: i) tratar un polipéptido fisiológicamente activo con un polímero no peptidílico en un medio de reacción que contiene una cantidad específica de un alcohol y tiene un pH específico para posibilitar que el polímero no peptidílico se una a un sitio diana del polipéptido fisiológicamente activo; y ii) aislar y purificar el conjugado de polipéptido fisiológicamente activo a partir de la mezcla de reacción de la etapa i) por cromatografía de intercambio iónico usando un alcohol, en el que el polipéptido fisiológicamente activo es una exendina, insulina, oxintomodulina, GLP-1, GLP-2, grelina, calcitonina o uno de los derivados de los mismos que tiene una estructura seleccionada de las fórmulas (I) a (IV):**Fórmula** en el que el alcohol es etanol o isopropanol; en el que el alcohol está presente en el medio de reacción en una cantidad de un 25 % a un 90 % en volumen, basado en el volumen total del medio de reacción; en el que el pH empleado en la etapa i) es de 7,0 a 10,0, cuando el polipéptido fisiológicamente activo es una exendina, oxintomodulina, GLP-1, GLP-2 o uno de los derivados de los mismos, y en el que el pH empleado en la etapa i) es de 4,0 a 10,0 cuando el polipéptido fisiológicamente activo es insulina humana o un derivado de la misma.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para preparar un conjugado espedfico de sitio de un polipeptido fisiologicamente activo Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un procedimiento para preparar un conjugado de polipeptido fisiologicamente activo espedfico de sitio, mas particularmente, a un procedimiento para preparar dicho conjugado en un alto rendimiento mediante la union de un polipeptido fisiologicamente activo con un polfmero no peptidflico.
Antecedentes de la invencion
Los peptidos se desnaturalizan facilmente debido a su baja estabilidad, se degradan por proteasas in vivo y se excretan a traves del rinon debido a su tamano relativamente pequeno. En consecuencia, para mantener una concentracion espedfica en la sangre de un farmaco peptfdico en su forma activa, es necesario administrar el farmaco peptfdico con frecuencia a un paciente. Sin embargo, los farmacos peptfdicos se administran normalmente en forma de preparaciones inyectables, y dicha administracion frecuente provoca fuertes molestias para los pacientes. Para resolver dicho problema, se han desarrollado varios procedimientos, por ejemplo, un procedimiento para transferir el farmaco peptfdico a traves de inhalacion orofarmgea o nasofarmgea mediante el aumento de la penetracion del farmaco peptidico a traves de las membranas biologicas, un procedimiento para modificar una secuencia de aminoacidos espedfica que es sensible a las proteasas (por ejemplo, secuencia de aminoacidos de GLP-1 para prevenir la perdida de los tttulos por una dipeptidil peptidasa) para estabilizar el peptido mediante la inhibicion de la degradacion por la enzima, y un procedimiento para anadir qmmicamente un poKmero no peptidflico con una alta solubilidad, tal como polietilenglicol (PEG), sobre la superficie del peptido.
El PEG, que se ha usado como un polfmero no peptidflico, se une de forma no espedfica a un sitio espedfico o a multiples sitios de un peptido diana para lograr el efecto de aumentar el peso molecular del peptido, el PEG-peptido resultante resiste la perdida a traves del rinon y la hidrolisis enzimatica, sin provocar ningun efecto secundario. Por ejemplo, la publicacion de patente internacional n.° WO 2006/076471 describe el mantenimiento de la actividad fisiologica de un peptido natriuretico de tipo B (BNP) usado como agente terapeutico para insuficiencia cardfaca congestiva mediante la union de PEG al mismo, y la patente de EE. UU. n.° 6.924.264 describe el aumento del tiempo de residencia in vivo de un farmaco de exendina-4 por medio de la union de PEG al residuo de lisina del mismo.
Estos procedimientos prolongan el tiempo de residencia in vivo de un farmaco peptfdico mediante el aumento del peso molecular de PEG, pero a medida que aumenta el peso molecular, el tttulo del farmaco peptfdico se reduce significativamente. Ademas, la union no espedfica de PEG puede ocultar el dominio activo de un polipeptido fisiologicamente activo para disminuir significativamente la actividad del polipeptido.
Por lo tanto, hay una necesidad de desarrollar un procedimiento mejorado para preparar un conjugado de un polipeptido fisiologicamente activo y un polfmero no peptidflico, en el que el polfmero se una al peptido de una manera espedfica de sitio que no afecte a la actividad del polipeptido.
Los autores de la presente invencion han completado la invencion mediante la confirmacion de que se puede preparar un conjugado de polipeptido fisiologicamente activo que tiene un polfmero no peptidflico unido de forma espedfica de sitio en un alto rendimiento mediante el ajuste del pH y el contenido de alcohol del medio de reaccion.
Sumario de la invencion
En consecuencia, es un objetivo de la presente invencion proporcionar un procedimiento de alto rendimiento para preparar un conjugado de polipeptido fisiologicamente activo en el que un polfmero no peptidflico se une de forma espedfica de sitio a un polipeptido fisiologicamente activo.
De acuerdo con un aspecto de la presente invencion, se proporciona un procedimiento para preparar un conjugado de polipeptido fisiologicamente activo espedfico de sitio, que comprende las etapas de: i) someter a una reaccion un polipeptido fisiologicamente activo y un polfmero no peptidflico en un medio de reaccion que contiene una cantidad espedfica de un alcohol y tiene un pH espedfico para posibilitar que el polfmero no peptidflico se una a un sitio diana del polipeptido fisiologicamente activo; y ii) aislar y purificar el conjugado de polipeptido fisiologicamente activo a partir de la mezcla de reaccion de la etapa (i) por cromatograffa de intercambio ionico usando un alcohol, en el que las condiciones del procedimiento y los reactivos son como se expone en la reivindicacion 1.
Breve descripcion de los dibujos
Los objetivos y caractensticas anteriores y otros de la presente invencion resultaran evidentes a partir de la siguiente descripcion de la invencion, cuando se toma en relacion con los dibujos adjuntos, que muestran respectivamente:
La Fig. 1: un perfil de purificacion de isomeros posicionales de DA-exendina-4-PEG usando la columna SOURCE S;
la Fig. 2: un perfil de purificacion de isomeros posicionales de CA-exendina-4-PEG usando la columna SOURCE S;
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a Fig. 3: un grafico que muestra isomeros Lys27-pegilados obtenido cuando se pegila CA-exendina-4 a pH variable;
a Fig. 4: un grafico que muestra isomeros Lys27-pegilados obtenidos cuando se pegila CA-exendina-4 a pH variable y en EtOH al 45 %.
a Fig. 5: un grafico que muestra isomeros Lys27-pegilados obtenidos cuando se pegila CA-exendina-4 a pH 7,5 y en una cantidad variable (%) de etanol;
a Fig. 6: un grafico que muestra isomeros Lys27-pegilados obtenidos cuando se pegila CA-exendina-4 a pH 7,5 y en una cantidad variable (%) de isopropanol;
a Fig. 7: un analisis de SDS-PAGE de CA-exendina-PEG-Fc de inmunoglobulina; a Fig. 8: un analisis de SDS-PAGE de CA-exendina-PEG Lys12 y Lys27;
a Fig. 9: un perfil de analisis de isomeros Lys12-pegilados de CA-exendina-4 por identificacion genetica;
a Fig. 10: un perfil de analisis de isomeros Lys27-pegilados de CA-exendina-4 por identificacion genetica;
a Fig. 11: un perfil de purificacion de isomeros posicionales de oxintomodulina-PEG usando la columna SOURCE S;
a Fig. 12: un perfil de purificacion de isomeros posicionales de imidazo-acetiloxintomodulina-PEG usando la columna SOURCE S;
a Fig. 13: un perfil de analisis de isomeros Lys30-pegilados de oxintomodulina por identificacion genetica;
a Fig. 14: un perfil de purificacion de un conjugado de imidazo-acetiloxintomodulina-PEG y Fc de inmunoglobulina usando la columna SOURCE Q;
a Fig. 15: un analisis de SDS-PAGE de un conjugado de imidazo-acetiloxintomodulina-PEG y Fc de inmunoglobulina;
a Fig. 16: un perfil de purificacion de isomeros posicionales de analogo de oxintomodulina-PEG usando la columna SOURCE S;
a Fig. 17: un perfil de analisis de isomeros Lys27-pegilados de analogo de oxintomodulina por identificacion genetica;
a Fig. 18: un perfil de purificacion de isomeros posicionales de imidazo-analogos de acetiloxintomodulina-PEG usando la columna SOURCE S;
a Fig. 19: un perfil de analisis de isomeros Lys27-pegilados de imidazo-analogo de acetiloxintomodulina por identificacion genetica;
la Fig. 20: un perfil de purificacion de un conjugado de imidazo-analogo de acetiloxintomodulina-PEG y Fc de inmunoglobulina usando la columna SOURCE Q;
la Fig. 21: un analisis de SDS-PAGE de un conjugado de imidazo-analogo de acetiloxintomodulina-PEG y Fc de inmunoglobulina;
a Fig. 22: un perfil de purificacion de isomeros posicionales de GLP-1-PEG usando la columna SOURCE S;
a Fig. 23: un perfil de analisis de isomeros Lys34-pegilados de GLP-1 por identificacion genetica;
a Fig. 24: un perfil de purificacion de isomeros posicionales de imidazo-acetil GLP-1-PEG usando la columna SOURCE S;
a Fig. 25: un perfil de analisis de isomeros Lys34-pegilados de imidazo-acetil GLP-1 por identificacion genetica;
a Fig. 26: un perfil de purificacion de un conjugado de imidazo-acetil GLP-1-PEG y Fc de inmunoglobulina usando la columna SOURCE Phe;
a Fig. 27: un analisis de SDS-PAGE de un conjugado de imidazo-acetil GLP-1-PEG y Fc de inmunoglobulina;
a Fig. 28: un perfil de purificacion de isomeros posicionales de GLP-2-PEG usando la columna SOURCE S;
a Fig. 29: un perfil de analisis de isomeros Lys30-pegilados de GLP-2 por identificacion genetica;
a Fig. 30: un perfil de purificacion de isomeros posicionales de imidazo-acetil GLP-2-PEG usando la columna SOURCE S;
a Fig. 31: un perfil de purificacion de un conjugado de imidazo-acetil GLP-2-PEG y Fc de inmunoglobulina usando la columna SOURCE Phe;
la Fig. 32: un analisis de SDS-PAGE de un conjugado de imidazo-acetil GLP-2-PEG y Fc de inmunoglobulina;
la Fig. 33: un perfil de purificacion de isomeros posicionales de insulina humana-PEG (B1F) usando la columna SOURCE S;
la Fig. 34: un perfil de purificacion de isomeros posicionales de insulina humana-PEG (A1G) usando la columna 5 SOURCE S;
la Fig. 35: un perfil de purificacion de isomeros posicionales de insulina humana-PEG (B29K) usando la columna SOURCE S; y
la Fig. 36: un perfil de analisis de isomeros A1G-, B1F- o B29K-pegilados de insulina humana por identificacion genetica.
10 Descripcion detallada de la invencion
A continuacion en el presente documento, se describira en detalle la presente invencion.
La presente invencion proporciona un procedimiento para preparar un conjugado de polipeptido fisiologicamente activo espedfico de sitio, que comprende las etapas de:
i) tratar un polipeptido fisiologicamente activo con un polfmero no peptidflico en un medio de reaccion que contiene 15 una cantidad espedfica de un alcohol y tiene un pH espedfico para posibilitar que el polfmero no peptidflico se una a
un sitio diana del polipeptido fisiologicamente activo; y
ii) aislar y purificar el conjugado de polipeptido fisiologicamente activo a partir de la mezcla de reaccion de la etapa (i) por cromatograffa de intercambio ionico usando un alcohol, en el que las condiciones del procedimiento y los reactivos son como se expone en la reivindicacion 1.
20 Un conjugado de polipeptido fisiologicamente activo en el presente documento se refiere a una sustancia en la que un polipeptido fisiologicamente activo y un extremo de un polfmero no peptidflico se unen covalentemente entre sf, y la presente invencion se caracteriza por la union de un polipeptido con un polfmero en una condicion espedfica y el aislamiento del conjugado de polipeptido resultante que tiene el polfmero unido en un sitio diana del mismo.
La expresion "polipeptido o peptido fisiologicamente activo", como se usa en el presente documento, se refiere a un 25 peptido que puede mostrar una actividad fisiologica in vivo, por ejemplo, se puede seleccionar de un grupo que consiste en peptido insulinotropico, factor sangumeo, hormona digestiva, hormona adrenocorticotrofica, hormona tiroidea, hormona intestinal, citocina, enzima, factor de crecimiento, neuropeptido, hormona hipofiseotropica, hormona hipofisiotropica, peptido antiobesidad, peptido antivmco, y derivados de peptidos no naturales que retienen la propiedad fisiologicamente activa, pero no limitada a los mismos. Mas particularmente, el polipeptido o peptido 30 fisiologicamente activo se selecciona del grupo que consiste en eritropoyetina, GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos), amilina, glucagon, insulina, somatostatina, PYY (peptido YY), NPY (neuropeptido Y), GLP-1, GLP-2, exendina-4, oxintomodulina, grelina, angiotensina, bradicinina, calcitonina, corticotropina, eledoisina, gastrina, leptina, oxitocina, vasopresina, LH (hormona luteinizante), prolactina, FSH (hormona foliculoestimulante), PTH (hormona paratiroidea), secretina, sermorelina, hGH (hormona humana del 35 crecimiento), peptido liberador de la hormona del crecimiento, G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos), interferones, interleucinas, peptido liberador de prolactina, orexina, peptido liberador de hormona tiroidea, pancreocimina, peptido inhibidor de gastrina, calmodulina, peptido liberador de gastrina, motilina, peptido vasoactivo intestinal, ANP (peptido natriuretico auricular), BNP (peptido natriuretico cerebral), CNP (peptido natriuretico de tipo C), neurocinina A, neuromedina, renina, endotelina, peptido sarafotoxina, peptido carsomorfina, dermorfina, dinorfina, 40 endorfina, encefalina, factor de linfocitos T, factor de necrosis tumoral, receptor del factor de necrosis tumoral, receptor de urocinasa, factor inhibidor tumoral, inhibidor de colagenasa, timopoyetina, timulina, timopentina, timosina, factor humoral tfmico, adrenomodulina, alatostatina, fragmento de protema beta-amiloide, peptido antimicrobiano, peptido antioxidante, bombesina, osteocalcina, peptido CART, E-selectina, ICAM-1, VCAM-1, leucocina, kringle-5, laminina, inhibina, galanina, fibronectina, pancreastatina y Fuzeon. Ademas, el polipeptido fisiologicamente activo 45 incluye un precursor, un derivado, un fragmento o una variante de los mismos.
Los polipeptidos activos exendina, insulina, GLP-1, GLP-2, oxintomodulina, grelina, angiotensina, bradicinina, calcitonina o un derivado de las mismas. El derivado de los mismos se puede preparar, por ejemplo, por sustitucion (por ejemplo, alfa-metilacion o alfa-hidroxilacion), eliminacion (por ejemplo, desaminacion o eliminacion de carbono) o modificacion (por ejemplo, N-metilacion) qrnmica de cualquier grupo en un residuo de aminoacido y, particularmente, 50 la preparacion del derivado de exendina se describe en detalle en la solicitud de patente coreana n.° 2008-69234.
En cambio, la expresion “polfmero no peptidflico”, como se usa en el presente documento, se refiere a un polfmero biocompatible que incluye dos o mas unidades de repeticion unidas entre sf por un enlace covalente excepto un enlace peptfdico.
El polfmero no peptidflico que se puede usar en la presente invencion se puede seleccionar del grupo que consiste en
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polietilenglicol, polipropilenglicol, copoUmeros de etilenglicol y propilenglicol, polioles polioxietilados, poli(alcohol vimlico), polisacaridos, dextrano, poli(eter viniletflico), poKmeros biodegradables, tales como PLA (poli(acido lactico)) y PLGA (poli(acido lactico-glicolico)), poKmeros lip^dicos, quitinas, acido hialuronico y combinaciones de los mismos, y se reivindica polietilenglicol. Se podna prever un derivado del mismo, que se conozca en la tecnica o se prepare facilmente basado en la experiencia de la tecnica. El polfmero no peptidflico que se puede usar en la presente invencion funciona aumentando el peso molecular de un polipeptido fisiologicamente activo para prevenir la perdida del conjugado a traves del rinon. Se puede usar sin ninguna limitacion cualquier polfmero no peptid^lico, siempre que sea resistente a las proteasas in vivo. El peso molecular del polfmero no peptidflico puede estar en el intervalo de 0,5 a 100 kDa, preferentemente de 0,5 a 20 kDa, y la proporcion molar adecuada del polipeptido fisiologicamente activo y el polfmero no peptidflico se puede elegir en el intervalo de 1:1 a 1:50.
El polfmero no peptidflico usado en la presente invencion tiene un grupo reactivo en un extremo o en ambos extremos. En el caso de que el polfmero no peptidflico tenga un grupo reactivo en ambos extremos, se puede unir a un veldculo fisiologicamente activo y un farmaco proteico que ayude a que funcione como una formulacion de accion prolongada.
El grupo reactivo en un extremo o ambos extremos del polfmero no peptidflico se selecciona preferentemente del grupo que consiste en un grupo aldelddo, un grupo propionaldelddo, un grupo butiraldelddo, un grupo maleimida y un grupo succinimida reactivo. Los ejemplos del grupo succinimida incluyen propionato de succinimidilo, butanoato de succinimidilo, hidroxisuccinimidilo, carboximetilsuccinimidilo o carbonato de succinimidilo. En particular, cuando el polfmero no peptidflico tiene un grupo reactivo aldelddo o un grupo reactivo succinimidilo en un extremo, es eficaz en la union en ambos extremos con un polipeptido fisiologicamente activo y una inmunoglobulina con reacciones no espedficas mmimas. El grupo reactivo aldehfdo se une de forma selectiva a un extremo N a un pH bajo, y se puede unir a un residuo de lisina para formar un enlace amida a un pH alto, tal como a pH 9,0. Ademas, el grupo reactivo succinimidilo puede formar un enlace amida estable con un extremo amino o residuo de lisina a pH 7,0 ~ 9,0.
Ademas, los grupos reactivos de ambos extremos del polfmero no peptidflico pueden ser iguales o diferentes. Cuando se usa un polietilenglicol que tiene un grupo reactivo hidroxilo en ambos extremos del mismo como el polfmero no peptidflico, se puede activar el grupo hidroxilo en varios grupos reactivos por reacciones qmmicas conocidas, o se puede usar un polietilenglicol disponible comercialmente que tenga un grupo reactivo modificado.
La etapa (i) de la presente invencion es preparar un conjugado de polipeptido fisiologicamente activo uniendo de forma espedfica de sitio un polfmero no peptidflico con un polipeptido fisiologicamente activo en un medio de reaccion adecuado.
La expresion "espedfico de sitio" o "de forma espedfica de sitio", como se usa en el presente documento, se refiere a la union de un polfmero no peptidflico en un sitio del aminoacido diana espedfico de un polipeptido fisiologicamente activo, preferentemente una amina del residuo de lisina o extremo N. La union o enlace espedfico de sitio puede prevenir la formacion de conjugados incidentales en los que el polfmero no peptidflico se une a un residuo de aminoacido fisiologicamente importante. Por ejemplo, cuando un polfmero no peptidflico se une al extremo N de exendina-4, se reduda la actividad in vitro de la exendina-4, pero cuando un polfmero no peptidflico se une a un residuo de lisina, se mantema la actividad in vitro. En particular, cuando un polfmero no peptidflico se une al 27.° residuo de lisina en lugar del 12.° residuo de lisina, se observo actividad in vitro mucho mayor (vease el ejemplo 10 y la tabla 2).
Los autores de la presente invencion han encontrado que la presencia de un alcohol en un medio de reaccion y el pH del medio de reaccion en la etapa (i) son factores cnticos para una union espedfica de sitio de un polfmero no peptidflico y un polipeptido fisiologicamente activo. En consecuencia, en la etapa (i) de la presente invencion, un poifmero no peptidflico se une a un sitio espedfico de un polipeptido fisiologicamente activo, usando un medio de reaccion que contiene un contenido espedfico de un alcohol y que tiene un pH espedfico.
En un modo de realizacion espedfico de la presente invencion, la proporcion de un isomero posicional espedfico del conjugado de polipeptido se puede variar basandose en el pH del medio de reaccion, o basandose en la concentracion (%) de un alcohol al mismo pH. Por lo tanto, es posible unir un polfmero no peptidflico a un aminoacido deseado de un polipeptido fisiologicamente activo de una manera espedfica de sitio.
Es decir, la etapa (i) de la presente invencion se lleva a cabo a un pH espedfico para posibilitar que el polfmero no peptidflico se una a un sitio deseado (o diana), es decir, que la dosis no afecte a la actividad del polipeptido. El intervalo de pH puede depender de los tipos de polipeptido fisiologicamente activo. Por ejemplo, en caso de un peptido insulinotropico (por ejemplo, la exendina-4), se observo en gran medida un isomero en el que el polfmero esta unido a la 12.° lisina a pH bajo del medio de reaccion, mientras que se observo en gran medida un isomero en el que el polfmero esta unido a la 27.° lisina que no afecta a la actividad insulinotropica a pH alto del medio de reaccion (vease el ejemplo 3 y la Fig. 3). En consecuencia, la etapa (i) se lleva a cabo preferentemente a un pH de 7,5 a 9,0 de manera que el polfmero no peptidflico se acople selectivamente a la 27.° lisina.
Ademas, la etapa (i) de la presente invencion se lleva a cabo en un medio de reaccion que contiene un alcohol de modo que un polfmero no peptidflico se pueda unir a un sitio que no afecte a la actividad del polipeptido. Los ejemplos
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del alcohol incluyen alcohol primario, secundario y terciario, preferentemente un alcohol que tiene un numero de carbonos de uno a diez, mas preferentemente etanol o isopropanol. En el caso de un peptido insulinotropico (por ejemplo, la exendina-4), puede estar presente un alcohol en el medio de reaccion, en una cantidad que vana, en volumen, de un 25 % a un 90 %, preferentemente de un 35 % a un 60 %, basandose en el volumen total del medio de reaccion, para posibilitar que un polfmero no peptidflico se una a la 27.° lisina que no afecta a la actividad insulinotropica.
Cuando un polipeptido fisiologicamente activo es exendina-4 o un derivado de la misma, el pH empleado en la etapa (i) puede ser de 7,0 a 10,0 para potenciar la proporcion de union de un polfmero no peptidflico a Lys27. En otro modo de realizacion de la presente invencion, cuando un polipeptido fisiologicamente activo es calcitonina, el pH empleado en la etapa (i) puede ser de 4,0 a 6,0 para potenciar la proporcion de union de un polfmero no peptidflico al extremo N. Cuando un polipeptido fisiologicamente activo es oxintomodulina o un derivado de la misma, el pH empleado en la etapa (i) puede ser de 7,0 a 10,0 para potenciar la proporcion de union de un polfmero no peptidflico a Lys27 o Lys30. Cuando un polipeptido fisiologicamente activo es insulina humana o un derivado de la misma, el pH empleado en la etapa (i) puede ser de 4,0 a 6,0 para potenciar la proporcion de union de un polfmero no peptidflico a Phe1 (1.° fenilalanina) N-terminal en la cadena B. Cuando un polipeptido fisiologicamente activo es insulina humana o un derivado de la misma, el pH empleado en la etapa (i) puede ser de 7,0 a 10,0 para potenciar la proporcion de union de un polfmero no peptidflico a Gly1 (1.° glicina) N-terminal en la cadena A, o a Lys29 (29.° lisina) en la cadena B. Cuando un polipeptido fisiologicamente activo es GLP-1 o un derivado del mismo, el pH empleado en la etapa (i) puede ser de 7,0 a 10,0 para potenciar la proporcion de union de un polfmero no peptidflico a Lys34. Cuando un polipeptido fisiologicamente activo es GLP-2 o un derivado del mismo, el pH empleado en la etapa (i) puede ser de 7,0 a 10,0 para potenciar la proporcion de union de un polfmero no peptidflico a Lys30.
En consecuencia, el conjugado de polipeptido fisiologicamente activo espedfico de sitio preferente de la presente invencion es un conjugado de exendina-4 en el que esta unido PEG a Lys27, un conjugado de calcitonina en el que esta unido PEG al extremo N, un conjugado de oxintomodulina o un analogo de la misma en el que esta unido PEG a Lys27 o Lys30, un conjugado de insulina humana o un analogo de la misma en el que esta unido PEG a Phe1 N-terminal en la cadena B, Gly1 N-terminal en la cadena A o a Lys29 en la cadena B, o un conjugado de GLP 1 o GLP-2 en el que esta unido PEG a Lys34 o Lys30.
En un aspecto preferente de la presente invencion, se puede usar un derivado del peptido (o analogo) para facilitar una union espedfica de sitio entre un polfmero no peptidflico y un polipeptido fisiologicamente activo. El derivado es un peptido que tiene cualquiera de los otros sitios de aminoacidos no diana eliminados o protegidos para prevenir la union no deseada. Por ejemplo, en el caso de un peptido insulinotropico como una exendina, se pueden usar varios derivados de la exendina, tales como como des-amino-histidil (DA)-exendina-4 de formula (I), beta-hidroxi-imidazopropionil (HY)-exendina-4 de formula (II), imidazoacetil (CA)-exendina-4 de formula (III) y dimetil-histidil (DM)-exendina-4 de formula (IV), que se preparan usando los procedimientos en los que se elimina un grupo amina alfa del aminoacido N-terminal, histidina, se sustituye el grupo amina N-terminal con un grupo hidroxilo, se modifica el grupo amina alfa N-terminal de histidina con dos grupos metilo, o se eliminan un carbono alfa de histidina N-terminal y un grupo amina unido a la misma para dejar un grupo imidazoacetilo, pero no limitados a los mismos. Las estructuras de dichos derivados de exendina ejemplares y procedimientos de preparacion de los mismos se describen en la publicacion de patente coreana no examinada n.° 2009-0008151, que se incluye dentro del alcance de la presente invencion por referencia a las formulas en la pagina 11 de la misma.
xN\
H
ch2
Xf
peptido
HCU o-CH2
peptido
xN\
H
ch2
peptido
II
O
Formula I
Formula II
Formula III
H
h3cVcXH2
peptido
r<3'-> ||
o
Formula IV
Del mismo modo, la oxintomodulina, GLP-1 y GLP-2 que tienen una histidina como 1.° aminoacido tambien se usan como un derivado que tiene cualquier estructura seleccionada de las formulas (I) a (IV).
En un modo de realization particular de la presente invention, los autores de la presente invention han investigado 5 los efectos del pH y el contenido de un alcohol (%) del medio de reaction sobre el aspecto de union espedfica de sitio del polimero no peptidflico, y confirmaron que la proportion de los conjugados de peptido insulinotropico que tienen el polimero unido a la 12.° lisina/27.° lisina es variada dependiendo del cambio de pH y la cantidad de etanol o isopropanol, en particular. En particular, se obtuvo en gran medida un isomero mas preferente que tiene el polimero no peptidflico unido al 27.° residuo de lisina cuando se usa de un 35 % a un 55 %, preferentemente aproximadamente 10 un 45 % de etanol o isopropanol a pH 7,5.
Despues de potenciar la proporcion del conjugado de polimero no peptidflico-polipeptido fisiologicamente activo deseado mediante el ajuste en un pH y un contenido de alcohol espedficos en la etapa (i), el conjugado deseado se puede aislar y purificar por cromatograffa de intercambio ionico usando un alcohol en la etapa (ii).
El alcohol usado en la etapa (ii) esta presente en una solution de purification, y sus ejemplos espedficos son como 15 se define en la etapa (i). Sin embargo, el alcohol de la etapa (i) se empleo con el fin de aumentar la reactividad y especificidad de sitio del polipeptido mediante la modificacion de la estructura secundaria o terciaria del mismo, mientras que el alcohol de la etapa (ii) se empleo con el proposito de facilitar el aislamiento de alto rendimiento y la purificacion del conjugado de polipeptido fisiologicamente activo especifico de sitio mediante la reduccion de enlaces
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no espedficos entre la columna de intercambio ionico y el conjugado. El aislamiento y purificacion se pueden llevar a cabo mediante el uso de varios procedimientos conocidos para un experto en la tecnica, preferentemente por cromatograffa de intercambio ionico, mas preferentemente por cromatograffa de intercambio ionico de alta presion.
En cambio, para facilitar el aislamiento y purificacion del isomero posicional, la cromatograffa de intercambio ionico se puede llevar a cabo a un pH espedfico. El pH se ajusto adecuadamente para aumentar la especificidad de sitio del conjugado en la etapa (i), mientras que se reajusto para unir el conjugado a y para separarlo de la columna de intercambio ionico en una solucion de purificacion que conteda un alcohol en la etapa (ii). El pH adecuado empleado en la etapa (ii) puede estar en el intervalo de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 6,0.
Ademas, el polipeptido fisiologicamente activo de la presente invencion ademas se puede unir con un vedculo fisiologicamente activo. En este caso, el poffmero no peptidflico debe ser un polfmero no peptidflico con ambos extremos para unirse con el vedculo fisiologicamente activo. Es decir, un vedculo fisiologicamente activo se une covalentemente a un extremo del polfmero no peptidflico que no esta unido covalentemente con el polipeptido fisiologicamente activo y, por lo tanto, se puede preparar un conjugado en el que ambos extremos del polfmero no peptidflico estan unidos con el polipeptido fisiologicamente activo y el vedculo fisiologicamente activo.
Como se describe anteriormente, el conjugado de polipeptido fisiologicamente activo preparado en la etapa (ii) se puede unir ademas con un vedculo fisiologicamente activo, y el conjugado de polipeptido-poffmero-vedculo resultante muestra actividades completamente diferentes en comparacion con el conjugado de polipeptido-polfmero, es decir, las excepcionales actividades fisiologicas, tales como la excelente duracion prolongada de los efectos farmacologicos de un polipeptido fisiologicamente activo, dirigido a un sitio espedfico, tal como una lesion a tratar, o la induccion de necrosis.
La expresion "vedculo fisiologicamente activo", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia fisiologicamente activa que muestra actividades adicionales distintas de la actividad fisiologica del polipeptido natural, que puede mantener las actividades fisiologicas del polipeptido, tales como los efectos farmacologicos, o inducir la direccion a un sitio espedfico o necrosis, mediante la union a un polipeptido no peptidflico junto con un polipeptido fisiologicamente activo.
El vedculo fisiologicamente activo usado en la presente invencion incluye una sustancia que tiene actividades mencionadas anteriormente sin ninguna limitacion, por ejemplo, albumina, region Fc de inmunoglobulina, transferrina, aptamero, toxina, colageno, dextrano, polisacaridos, acidos grasos, fibrinogeno y similares. Preferentemente, el vedculo fisiologicamente activo se puede seleccionar de una albumina, una region Fc de inmunoglobulina y una transferrina, mas preferentemente una region Fc de inmunoglobulina.
La region Fc de inmunoglobulina de la presente invencion se refiere a la region constante de la cadena pesada 2 (CH2) y la region constante de la cadena pesada 3 (CH3) de una inmunoglobulina, excluyendo las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, la region constante de la cadena pesada 1 (CH1) y la region constante de la cadena ligera 1 (CL1). Puede incluir ademas una region bisagra en la region constante de la cadena pesada. Ademas, la region Fc de inmunoglobulina de la presente invencion puede ser una forma prolongada que contiene parte o la totalidad de la region Fc, incluyendo la region constante de la cadena pesada 1 (CH1) y/o la region constante de la cadena ligera 1 (CL1), excepto las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, siempre que tenga una funcion fisiologica sustancialmente similar a o mejor que la de Fc de inmunoglobulina natural, y puede incluir regiones Fc de inmunoglobulina modificadas por fosforilacion, sulfatacion, acrilacion, glucosilacion, metilacion, farnesilacion, acetilacion, amidacion y similares. La gama de Fc de inmunoglobulina, el procedimiento para la preparacion de la misma, y el procedimiento para la union covalente de una Fc de inmunoglobulina a un conjugado de polfmero no peptidflico-polipeptido fisiologicamente activo se divulgan en las patentes coreanas n.° 775343, 725314, 725315 y 824505.
De acuerdo con el procedimiento de la presente invencion, se puede preparar un conjugado de polipeptido deseado que tenga una excelente actividad fisiologica en un alto rendimiento uniendo de forma espedfica de sitio un polfmero no peptidflico a un aminoacido espedfico de un polipeptido fisiologicamente activo, a la vez que se minimiza la formacion de conjugados adicionales.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar adicionalmente la presente invencion.
Ejemplo 1: preparacion y aislamiento de conjugado de DA-exendina-4 pegilada (Lys27)
<1-1> Preparacion de conjugado de DA-exendina-4 pegilada (Lys27)
Para preparar un conjugado de peptido pegilado mediante union covalente de Lys en el peptido con el PEG, la des-amino-histidil-exendina-4 (DA-exendina-4, AP, EE. UU.) y el 3,4 K PropionALD (2) PEG (PEG que tiene dos grupos propionaldeddo, BID Inc., Corea) se sometieron a una reaccion a 4 °C durante 12 horas en una proporcion molar de 1:30, con una concentracion de peptido de 3 mg/ml. En este momento, se uso tampon HEPES 1O0 mM (pH 7,5) que conteda isopropanol al 45 % como medio de reaccion, y se le anadio al mismo NaCNBH3 20 mM como agente reductor.
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<1-2> Aislamiento de isomero posicional
Un peptido monopegilado se purifico principalmente de la mezcla de reaccion del ejemplo <1-1> mediante el uso de una cromatograffa de intercambio ionico SOURCE Q (XK 16 ml, GE Healthcare, Corea) en las siguientes condiciones, y los isomeros posicionales se aislaron mediante el uso de una cromatograffa de intercambio ionico SOURCE S (XK 16 ml, GE Healthcare, Corea) en las siguientes condiciones. En este procedimiento, se uso etanol para facilitar el aislamiento de los isomeros, incluyendolo en una solucion de purificacion. Los sitios pegilados se confirmaron a partir de los picos eluidos por el procedimiento de identificacion genetica.
Columna: SOURCE Q
Caudal: 2,0 ml/min
Solucion de elucion: A (Tris 20 mM, pH 8,5) y B (A + NaCl 0,5 M); Gradiente A de 0^40 %, 80 min Columna: SOURCE S Caudal: 2,0 ml/min
Solucion de elucion: A (acido dtrico 20 mM, pH 3,0 + etanol al 45 %) y B (A + etanol al 45 % + KCl 0,5 M); Gradiente A de 0^100 %, 45 min.
A partir del analisis del perfil de purificacion de isomeros posicionales, se encontro que un pico para DA-exendina-4 Lys12-pegilada se eluyo antes, y luego un pico para Lys27-pegilada se eluyo en la ultima porcion (Fig. 1).
Ejemplo 2: preparacion y aislamiento de conjugado de CA-exendina-4 pegilada (Lys27)
Se repitio el procedimiento del ejemplo 1 excepto que se uso imidazo-acetil-exendina-4 (CA-exendina-4, Bachem, EE. UU.) en lugar de DA-exendina-4 del ejemplo 1 para obtener el conjugado de CA-exendina-4 pegilada (Lys27). A partir del analisis del perfil de purificacion de isomeros posicionales, se encontro que un pico para CA-exendina-4 Lys12-pegilada se eluyo antes, y luego un pico para Lys27-pegilada se eluyo en la ultima porcion (Fig. 2).
Ejemplo 3: cambio en la proporcion de conjugado de CA-exendina-4 pegilada (Lys27) de acuerdo con el pH del medio de reaccion
Para investigar el cambio en la proporcion de un polipeptido pegilado en un sitio espedfico por el pH, CA-exendina-4 y 3,4 K PropionALD (2) PEG se sometieron a pegilacion haciendo reaccionar el peptido y el PEG a 4 °C durante 12 horas en una proporcion molar de 1:30, con una concentracion de peptido de 3 mg/ml. En este momento, se usaron tampones acido dtrico 100 mM (pH 3,0), NaOAc 100 mM (pH 4,5), Na-P 100 mM (pH 7,5), Na-P 100 mM (pH 8,5), HEPES 100 mM (pH 8,0) y Na-borato 100 mM (pH 9,2) como medio de reaccion, respectivamente, y se le anadieron a los mismos NaCNBH3 20 mM como agente reductor. Cada mezcla de reaccion se purifico por el procedimiento descrito en el ejemplo 1, seguido por el analisis de la proporcion del conjugado Lys27-pegilado. Como se muestra en la Fig. 3, la proporcion del conjugado Lys27-pegilado se aumento basado en el aumento de pH, y se confirmo que el pH optimo era de 7,0 a 10,0.
Ejemplo 4: cambio en la proporcion de conjugado de CA-exendina-4 pegilada (Lys27) de acuerdo con el pH del medio de reaccion que contiene etanol
Para investigar el cambio en la proporcion de un polipeptido pegilado en un sitio espedfico por etanol y el pH, CA-exendina-4 y 3,4 K PropionALD (2) PEG se sometieron a pegilacion haciendo reaccionar el peptido y el PEG a 4 °C durante 12 horas en una proporcion molar de 1:30, con una concentracion de peptido de 3 mg/ml. En este momento, se usaron tampones acido dtrico 100 mM (pH 3,0)/etanol al 45 %, NaOAc 100 mM (pH 4,5)/etanol al 45 %, Na-P 100 mM (pH 7,5)/etanol al 45 %, HEPES 100 mM (pH 8,0)/etanol al 45 %, y Na-P 100 mM (pH 8,5)/etanol al 45 % como medio de reaccion, respectivamente, y se le anadieron a los mismos NaCNBH3 20 mM como agente reductor. Cada mezcla de reaccion se purifico por el procedimiento descrito en el ejemplo 1, seguido por el analisis de la proporcion del conjugado Lys27-pegilado. Como se muestra en la Fig. 4, la proporcion del conjugado Lys27-pegilado se aumento basado en el aumento de pH en un medio de reaccion que conterna EtOH al 45 %, y se confirmo que el pH optimo era de 7,0 a 9,0.
Ejemplo 5: cambio en la proporcion de conjugado de CA-exendina-4 pegilada (Lys27) de acuerdo con la concentracion de etanol en el medio de reaccion
Para investigar el cambio en la proporcion de un polipeptido pegilado en un sitio espedfico por la concentracion de etanol en el medio de reaccion, CA-exendina-4 y 3,4 K PropionALD (2) PEG se sometieron a pegilacion haciendo reaccionar el peptido y el PEG a 4 °C durante 12 horas en una proporcion molar de 1:30, con una concentracion de peptido de 3 mg/ml. En este momento, se usaron como tampones HEPES 100 mM (pH 7,5)/etanol al 0 %, HEPES 100 mM (pH 7,5)/etanol al 25 %, HEPES 100 mM (pH 7,5) /etanol al 35 %, HEPES 100 mM (pH 7,5) /etanol al 45 %, HEPES 100 mM (pH 7,5)/etanol al 55 %, HEPES 100 mM (pH 1,5)/etanol al 75 % y HEPES 100 mM (pH 7,5)/etanol al 90 % como medio de reaccion, respectivamente, y se le anadieron a los mismos NaCNBH3 20 mM como agente
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reductor. Cada mezcla de reaccion se purifico por el procedimiento descrito en el ejemplo 1, seguido por el analisis de la proporcion del conjugado Lys27-pegilado. Como se muestra en la Fig. 5, la proporcion del conjugado Lys27-pegilado se aumento hasta que la cantidad de etanol alcanza aproximadamente un 50 %, mientras que disminuyo en mas de un 50 % de etanol, y se confirmo que la cantidad optima de etanol era de un 35 % a un 60 %.
Ejemplo 6: cambio en la proporcion de conjugado de CA-exendina-4 pegilada (Lys27) de acuerdo con la concentracion de isopropanol en el medio de reaccion
Para investigar el cambio en la proporcion de un polipeptido pegilado en un sitio espedfico por el uso de isopropanol, en lugar de etanol, en el medio de reaccion, CA-exendina-4 y 3,4 K PropionALD (2) PEG se sometieron a pegilacion haciendo reaccionar el peptido y el PEG a 4 °C durante 12 horas en una proporcion molar de 1:30, con una concentracion de peptido de 3 mg/ml. En este momento, se usaron tampones HEPES 100 mM (pH 7,5)/isopropanol al 0 %, HEPES 100 mM (pH 7,5)/isopropanol al 30 %, HEPES 100 mM (pH 7,5)/isopropanol al 45 % y HEPES 100 mM (pH 7,5)/isopropanol al 60 % como medio de reaccion, respectivamente, y se le anadieron a los mismos NaCNBH3 20 mM como agente reductor. Cada mezcla de reaccion se purifico por el procedimiento descrito en el ejemplo 1, seguido por el analisis de la proporcion del conjugado Lys27-pegilado. Como se muestra en la Fig. 6, la proporcion del conjugado Lys27-pegilado se aumento hasta que la cantidad de etanol alcanza aproximadamente un 50 %, mientras que disminuyo en mas de un 50 % de etanol, y se confirmo que la cantidad optima de etanol era de un 35 % a un 60 %.
Ejemplo 7: preparacion de un conjugado de CA-exendina-4 (Lys27)-PEG y Fc de inmunoglobulina
Se acoplo conjugado de CA-exendina-4 (Lys27)-PEG con un fragmento Fc de inmunoglobulina (Hanmi Pharm. Co. Ltd., Corea), sometiendo a una reaccion el conjugado y el fragmento a 4 °C durante 16 horas en una proporcion molar de 1:8, con una concentracion de peptido de 20 mg/ml. En este momento, se uso tampon K-P 100 mM (pH 6,0) como medio de reaccion, y se le anadio al mismo NaCNBH3 20 mM como agente reductor. Despues de la reaccion de acoplamiento, se realizo la purificacion en dos etapas usando columnas SOURCE Phe y SOURCE Q, en las siguientes condiciones.
Columna: SOURCE Phe (XK 16 ml, Amersham Biosciences)
Caudal: 2,0 ml/min
Solucion de elucion: A (Tris 20 mM, pH 7,5) y B (A + NaCl 1,5 M); Gradiente A de 0^40 %, 80 min Columna: SOURCE Q (XK 16 ml, GE Healthcare)
Caudal: 2,0 ml/min
Solucion de elucion: A (Tris 20 mM, pH 7,5) y B (A + NaCl 1 M); Gradiente A de 0^40 %, 80 min
El conjugado preparado anteriormente se analizo usando SDS-PAGE. Como se muestra en la Fig. 7, se observo una unica banda con 60 K en una condicion no reductora, mientras que se observaron dos bandas con 35 K y 25 K en una condicion reductora.
Ejemplo 8: identificacion del sitio pegilado del conjugado de exendina-CA-4 (Lys27)-PEG
Para identificar el sitio de union de PEG a CA-exendina-4, los conjugados de CA-exendina-4 (Lys27)-PEG se digirieron con una enzima proteasa, lisina-C, y se analizaron usando una cromatograffa inversa.
Espedficamente, se analizaron isomeros de CA-exendina-4-PEG por SDS-PAGE (Fig. 8), y luego se disolvieron un conjugado purificado de CA-exendina-4-PEG y CA-exendina-4 en tampon trietilamina-acido clorhndrico (10 mmol/l; pH 7,5), se les anadieron 10 pl de enzima (0,1 mg/ml), y se hicieron reaccionar a 37 °C durante 4 horas. Despues de que se terminara la reaccion, la mezcla de reaccion se analizo por cromatograffa inversa (HPLC (Agilent), Jupiter C18 (Phenomenex)). Los resultados del analisis se muestran en las Fig. 9 y 10. Se confirmo un isomero de CA-exendina-4 Lys12-pegilado por la desaparicion simultanea de n.° 1 y n.° 2 como se muestra en la Fig. 9, y se confirmo un isomero de CA-exendina-4 Lys27-pegilado por la desaparicion simultanea de n.° 2 y n.° 3, como se muestra en la Fig. 10.
Ejemplo 9: identificacion del rendimiento de pegilacion por la concentracion de isopropanol en pegilacion N-terminal
Para pegilar metoxipolietilenglicol 5 K ALD (NOF Inc, Japon) al extremo N de calcitonina de salmon (Bachem, EE. UU.), una calcitonina de salmon y PEG se sometieron a pegilacion haciendo reaccionar el peptido y el PEG a 4 °C durante 1 hora en una proporcion molar de 1:1, con una concentracion de peptido de 1 mg/ml. En este momento, se usaron tampones NaAc 100 mM pH 5,2/isopropanol al 0 %, NaAc 100 mM pH 5,2/isopropanol al 45 % como medio de reaccion, respectivamente, y se les anadieron a los mismos NaCNBH3 20 mM como agente reductor. Se purifico un peptido monopegilado a partir de cada una de las mezclas de reaccion por columna SOURCE S (XK 16 ml, GE Healthcare, Corea) en las siguientes condiciones. Los resultados se muestran en la tabla 1 que se expone a continuacion.
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Columna: SOURCE S Caudal: 2,5 ml/min
Solucion de elucion: A (acetato 20 mM, pH 5,2) y B (A + NaCI 1 M); Gradiente A de 0^40 %, 60 min <TabIa 1>
Solucion de tampon de reaccion
Rendimiento de calcitonina-5 K monopegilada (%)
NaAc 0,1 M pH 5,2
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NaAc 0,1 M pH 5,2/IPA al 45 %
51,3
Como se muestra en la tabla 1, el rendimiento de una calcitonina pegilado aumento mediante la adicion de isopropanol.
Ejemplo 10: medicion de la actividad in vitro de exendina-4 por pegilacion y el sitio pegilado
Para medir la eficacia de la preparacion de accion prolongada de exendina-4 por pegilacion y el sitio de pegilacion, se uso un procedimiento para medir la actividad in vitro. La medicion de la actividad in vitro de GLP-1 es un procedimiento para medir si el AMPc en la celula estaba aumentado despues del tratamiento de GLP-1 para lmeas celulares CHO en las que se clonaron los receptores de GLP-1.
Espedficamente, se trato CHO/GLP-1R, una lmea celular en la que se clona GLP-1, con GLP-1, exendina-4 y los materiales de prueba descritos en la tabla 1 a concentraciones variables. Se midio la aparicion de AMPc y, por tanto, se compararon entre sf los valores de CE50. Como control, se uso Byetta disponible comercialmente (Eli Lilly). Las actividades in vitro (%) de acuerdo con el tratamiento de los materiales de ensayo se mostraron en la tabla 2.
<Tabla 2>
Material de prueba
Actividad in vitro (%)
Byetta
100
CA-exendina-4
77
CA-exendina-4-PEG (Lys12)
2,1
CA-exendina-4-PEG (Lys27)
8,5
Como se muestra en la tabla 2, la actividad fisiologica del peptido estaba relativamente menos afectada cuando se modifica PEG en Lys27, en comparacion con Lys12.
Ejemplo 11: preparacion y aislamiento de conjugado de oxintomodulina pegilada (Lys30)
<11-1> Preparacion de conjugado de oxintomodulina pegilada (Lys30)
Para preparar un conjugado de oxintomodulina pegilada, 3,4 K PropionALD (2) PEG y oxintomodulina (Anygen, Corea) se sometieron a pegilacion haciendo reaccionar el peptido y el PEG a 4 °C durante 4,5 horas en una proporcion molar de 1:15, con una concentracion de peptido de 3 mg/ml. En este momento, se uso tampon Na-borato 100 mM (pH 9,0) que contema isopropanol al 45 % como medio de reaccion, y se le anadio al mismo NaCNBH3 20 mM como agente reductor.
<11-2> Aislamiento de isomero posicional
Los isomeros posicionales Lys30-pegilados se purificaron a partir de la mezcla de reaccion mediante el uso de columna SOURCE 15S (XK 16 ml, Amersham Bioscience). En este procedimiento, se uso etanol en la solucion de purificacion para facilitar el aislamiento de los isomeros (Fig. 11).
Columna: SOURCE S
Caudal: 2,0 ml/min
Solucion de elucion: A (Na-citrato 20 mM, pH 3,0 + etanol al 45 %) y B (A + KCl 1 M); Gradiente A de 0^3 %, 1 min, Gradiente B de 0^40 %, 222 min
Ejemplo 12: preparacion y aislamiento de conjugado de imidazo-acetiloxintomodulina pegilada (Lys30)
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50
Se repitio el procedimiento del ejemplo 11 excepto por el uso imidazo-acetil-oxintomodulina (Anygen, Corea) en vez de oxintomodulina y usando tampon HEPES 100 mM (pH 7,5) que contema isopropanol al 45 % del ejemplo 11 para obtener el conjugado de imidazo-acetiloxintomodulina pegilada (Lys30).
Los isomeros purificados usando columna SOURCE Q se muestran en la Fig. 12, y la identificacion genetica usando una proteasa Asp-N se muestra en la Fig. 13. Como se muestra Fig. 13, una parte de n.° 4: Asp (22)-(37) desaparecio por modificacion con PEG en Lys30.
Ejemplo 13: preparacion de un conjugado de imidazo-acetiloxintomodulina (Lys30)-PEG y Fc de inmunoglobulina
El conjugado de imidazo-acetiloxintomodulina-PEG (Lys30) y un Fc de inmunoglobulina (Hanmi Pharm. Co. Ltd., Corea) se sometieron a una reaccion a 4 °C durante 16 horas en una proporcion molar de 1:10, con una concentracion de protema total de 20 mg/ml. En este momento, se uso fosfato de potasio 100 mM (pH 6,0) como medio de reaccion, y se le anadio al mismo NaCNBH3 20 mM como agente reductor. Despues de que se terminara la reaccion, la mezcla de reaccion se purifico mediante el uso de la columna SOURCE 15Q, en las siguientes condiciones.
Columna: SOURCE Q
Caudal: 2,0 ml/min
Solucion de elucion: A (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5) y B (A + NaCl 1 M); Gradiente A de 0^20 %, 100 min
El cromatograma que se consigue mediante la union de CA-oxintomodulina Lys30-pegilada con un Fc de inmunoglobulina y la purificacion del conjugado usando SOURCE Q se muestra en la Fig. 14, y los resultados de SDS-PAGE de un conjugado de CA-oxintomodulina (Lys30)-PEG y Fc de inmunoglobulina se muestran en la Fig. 15. Como se muestra en la Fig. 15, se observo una unica banda con 60 K en una condicion no reductora, y se observaron dos bandas con 35 K y 25 K en una condicion reductora.
Ejemplo 14: preparacion y aislamiento de conjugado de analogo de oxintomodulina pegilado (Lys27)
<14-1> Preparacion de conjugado de analogo de oxintomodulina pegilado (Lys27)
Para pegilar 3,4 K PropionALD (2) PEG a una lisina de un analogo de oxintomodulina ([20Asp, 24Ala, 28Ser]-oxintomodulina-[Eliminacion30-37]), el PEG y el analogo de oxintomodulina (Anygen, Corea) se sometieron a una reaccion a 4 °C durante 3,5 horas en una proporcion molar de 1:15, con una concentracion de peptido de 3 mg/ml. En este momento, se uso tampon Na-borato 100 mM (pH 9,0) que contema isopropanol al 45 % como medio de reaccion, y se le anadio al mismo NaCNBH3 20 mM como agente reductor.
<14-2> Aislamiento de isomero posicional
Los isomeros posicionales Lys27-pegilados se purificaron a partir de la mezcla de reaccion mediante el uso de columna SOURCE 15S (XK 16 ml, Amersham Bioscience). Las condiciones de purificacion y aislamiento fueron las mismas que las descritas en el ejemplo 11. En este procedimiento, se uso etanol en la solucion de purificacion para facilitar el aislamiento de los isomeros (Fig. 16). Las selectividades de lisina de los analogos de oxintomodulina monopegilados purificados se confirmaron mediante el procedimiento de identificacion genetica usando la proteasa Lys-C (Fig. 17). Como se muestra en la Fig. 17, una parte n.° 2 desaparecio por modificacion con PEG en Lys27.
Ejemplo 15: preparacion y aislamiento de conjugado de analogo de imidazo-acetiloxintomodulina pegilado (Lys27)
<15-1> Preparacion de conjugado de analogo de imidazo-acetiloxintomodulina pegilado (Lys27)
Para pegilar 3,4 K PropionALD (2) PEG a la Lys27 de un analogo de imidazo-acetiloxintomodulina ([20Asp, 24Ala, 28Ser])-oxintomodulina-[Eliminacion30-37]), el analogo de imidazo-acetiloxintomodulina (Anygen, Corea) y el PEG se sometieron a una reaccion a 4 °C durante 2,5 horas en una proporcion molar de 1:10, con una concentracion de protema total de 3 mg/ml. En este momento, se uso HEPES 100 mM (pH 7,5) que contema isopropanol al 45 % como medio de reaccion, y se le anadio al mismo NaCNBH3 20 mM como agente reductor.
<15-2> Aislamiento de isomero posicional
Los isomeros posicionales Lys27-pegilados se purificaron a partir de la mezcla de reaccion mediante el uso de columna SOURCE 15S (XK 16 ml, Amersham Bioscience). Las condiciones de purificacion y aislamiento fueron las mismas que las descritas en el ejemplo 11. En este procedimiento, se uso etanol en la solucion de purificacion para facilitar el aislamiento de los isomeros (Fig. 18). Las selectividades de lisina de los analogos de oxintomodulina monopegilados purificados se confirmaron mediante el procedimiento de identificacion genetica usando la proteasa Lys-C (Fig. 19). Como se muestra en la Fig. 19, una parte n.° 2 desaparecio por modificacion con PEG en Lys27.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Ejemplo 16: preparacion y aislamiento de un conjugado de analogo de imidazo-acetiloxintomodulina pegilado (Lys27) y Fc de inmunoglobulina
El analogo de imidazo-acetiloxintomodulina-PEG Lys27-pegilado preparado en el ejemplo 15 y un Fc de inmunoglobulina se sometieron a una reaccion a 4 °C durante 16 horas en una proporcion molar de 1:10, con una concentracion de peptido de 20 mg/ml. En este momento, se uso fosfato de potasio 100 mM (pH 6,0) como medio de reaccion, y se le anadio al mismo NaCNBH3 20 mM como agente reductor. Despues de que se terminara la reaccion, la mezcla de reaccion se purifico mediante el uso de la columna SOURCE 15Q, en las siguientes condiciones.
Columna: SOURCE Q
Caudal: 2,0 ml/min
Solucion de elucion: A (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5) y B (A + NaCl 1 M); Gradiente A de 0^20 %, 100 min
El cromatograma que se consigue mediante la union de analogo de CA-oxintomodulina Lys27-pegilado con un Fc de inmunoglobulina y la purificacion del conjugado usando SOURCE Q se muestra en la Fig. 20, y los resultados de SDS-PAGE de un conjugado de analogo de CA-oxintomodulina (Lys27)-PEG y Fc de inmunoglobulina se muestran en la Fig. 21. Como se muestra en la Fig. 21, se observo una unica banda con 60 K en una condicion no reductora, y se observaron dos bandas con 35 K y 25 K en una condicion reductora.
Ejemplo 17: preparacion y aislamiento de conjugado de GLP-1 pegilado (Lys34)
<17-1> Preparacion de conjugado de GLP-1 pegilado (Lys34)
Para pegilar 3,4 K PropionALD (2) PEG al residuo de lisina de GLP-1, el GLP-1 y el PEG se sometieron a una reaccion a 4 °C durante 3,5 horas en una proporcion molar de 1:15, con una concentracion de protema total de 3 mg/ml. En este momento, se uso Na-borato 100 mM (pH 9,0) que contema isopropanol al 45 % como medio de reaccion, y se le anadio al mismo NaCNBH3 20 mM como agente reductor.
<17-2> Aislamiento de isomero posicional
Los isomeros posicionales Lys34-pegilados se purificaron a partir de la mezcla de reaccion mediante el uso de columna SOURCE 15S (XK 16 ml, Amersham Bioscience). En este procedimiento, se uso etanol en la solucion de purificacion para facilitar el aislamiento de los isomeros (Fig. 22). Las selectividades de lisina de los analogos de oxintomodulina monopegilados purificados se confirmaron mediante el procedimiento de identificacion genetica usando la proteasa Lys-C (Fig. 23).
Columna: SOURCE S
Caudal: 2,0 ml/min
Solucion de elucion: A (Na-citrato 20 mM, pH 3,0 + etanol al 45 %) y B (A + KCl 1 M); Gradiente A de 0^3 %, 1 min, Gradiente B de 3^40 %, 150 min
Como se muestra en la Fig. 23, una parte n.° 2 desaparecio por modificacion con PEG en Lys34.
Ejemplo 18: preparacion y aislamiento de conjugado de imidazo-acetil GLP-1 pegilado (Lys34)
<18-1> Preparacion de conjugado de imidazo-acetil GLP-1 pegilado (Lys34)
Para pegilar 3,4 K PropionALD (2) PEG al residuo de lisina de imidazo-acetil GLP-1, el imidazo-acetil GLP-1 y el PEG se sometieron a una reaccion a 4 °C durante 4 horas en una proporcion molar de 1:10, con una concentracion de protema total de 3 mg/ml. En este momento, se uso HEPES 100 mM (pH 7,5) que contema isopropanol al 45 % como medio de reaccion, y se le anadio al mismo NaCNBH3 20 mM como agente reductor.
<18-2> Aislamiento de isomero posicional
Los isomeros posicionales Lys34-pegilados se purificaron a partir de la mezcla de reaccion mediante el uso de columna SOURCE 15S (XK 16 ml, Amersham Bioscience). En este procedimiento, se uso etanol en la solucion de purificacion para facilitar el aislamiento de los isomeros (Fig. 24). Las selectividades de lisina de los analogos de oxintomodulina monopegilados purificados se confirmaron mediante el procedimiento de identificacion genetica usando la proteasa Glu-C (Fig. 25).
Columna: SOURCE S
Caudal: 2,0 ml/min
Solucion de elucion: A (Na-citrato 20 mM, pH 3,0 + etanol al 45 %) y B (A + KCl 1 M); Gradiente A de 0^3 %, 1 min, Gradiente B de 3^40 %, 150 min
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Como se muestra en la Fig. 25, una parte n.° 4 desaparecio por modificacion con PEG en Lys34.
Ejemplo 19: preparacion y aislamiento de un conjugado de imidazo-acetil GLP-1 pegilado (Lys34) y Fc de inmunoglobulina
El imidazo-acetil GLP-1-PEG Lys34-pegilado preparado en el ejemplo 18 y un Fc de inmunoglobulina se sometieron a una reaccion a 4 °C durante 17 horas en una proporcion molar de 1:8, con una concentracion de peptido de 50 mg/ml. En este momento, se uso fosfato de potasio l0o mM (pH 6,0) como medio de reaccion, y se le anadio al mismo NaCNBH3 20 mM como agente reductor. Despues de que se terminara la reaccion, la mezcla de reaccion se purifico mediante el uso de la columna SOURCE Phe, en las siguientes condiciones.
Columna: SOURCE Phe
Caudal: 2,0 ml/min
Solucion de elucion: A (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5) y B (A + NaCl 2 M); Gradiente A de 100^0 %, 100 min
El cromatograma que se consigue mediante la union de un isomero de CA-GLP-1 Lys34-pegilado con un Fc de inmunoglobulina y la purificacion del conjugado usando SOURCE Phe se muestra en la Fig. 26, y los resultados de SDS-PAGE de un conjugado de CA-GLP-1 (Lys34)-PEG y Fc de inmunoglobulina se muestran en la Fig. 27. Como se muestra en la Fig. 27, se observo una unica banda con 60 K en una condicion no reductora, y se observaron dos bandas con 35 K y 25 K en una condicion reductora.
Ejemplo 20: preparacion y aislamiento de conjugado de GLP-2 pegilado (Lys30)
<20-1> Preparacion de conjugado de GLP-2 pegilado (Lys30)
Para pegilar 3,4 K PropionALD (2) PEG al residuo de lisina de GLP-2 (Anygen, corea), el GLP-2 y el PEG se sometieron a una reaccion a 4 °C durante 3 horas en una proporcion molar de 1:12, con una concentracion de protema total de 5 mg/ml. En este momento, se uso Na-borato 100 mM (pH 9,0) que contema isopropanol al 45 % como medio de reaccion, y se le anadio al mismo NaCNBH3 20 mM como agente reductor.
<20-2> Aislamiento de isomero posicional
Los isomeros posicionales Lys30-pegilados se purificaron a partir de la mezcla de reaccion mediante el uso de columna SOURCE 15S (XK 16 ml, Amersham Bioscience). En este procedimiento, se uso etanol en la solucion de purificacion para facilitar el aislamiento de los isomeros (Fig. 28). Las selectividades de lisina se confirmaron mediante el procedimiento de identificacion genetica usando la proteasa tripsina (Fig. 29).
Columna: SOURCE S
Caudal: 2,0 ml/min
Solucion de elucion: A (Na-citrato 20 mM, pH 3,0 + etanol al 45 %) y B (A + KCl 1 M); Gradiente A de 0^3 %, 1 min, Gradiente B de 3^40 %, 150 min
Como se muestra en la Fig. 29, una parte n.° 2 desaparecio por modificacion con PEG en Lys30.
Ejemplo 21: preparacion y aislamiento de conjugado de imidazo-acetil GLP-2 pegilado (Lys30)
<21-1> Preparacion de conjugado de imidazo-acetil GLP-2 pegilado (Lys30)
Para pegilar 3,4 K PropionALD (2) PEG al residuo de lisina30 de imidazo-acetil GLP-2 (Anygen, corea), el imidazo-acetil GLP-2 y el PEG se sometieron a una reaccion a 4 °C durante 6 horas en una proporcion molar de 1:20, con una concentracion de protema total de 3 mg/ml. En este momento, se uso HEPES 100 mM (pH 7,5) que contema isopropanol al 45 % como medio de reaccion, y se le anadio al mismo NaCNBH3 20 mM como agente reductor.
<21-2> Aislamiento de isomero posicional
Los isomeros posicionales Lys30-pegilados se purificaron a partir de la mezcla de reaccion mediante el uso de columna SOURCE 15S (XK 16 ml, Amersham Bioscience). En este procedimiento, se uso etanol en la solucion de purificacion para facilitar el aislamiento de los isomeros (Fig. 30).
Columna: SOURCE S
Caudal: 2,0 ml/min
Solucion de elucion: A (Na-citrato 20 mM, pH 3,0 + etanol al 45 %) y B
(A + KCl 1 M); Gradiente A de 0^3 %, 1 min, Gradiente B de 3^40 %, 150 min
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Ejemplo 22: preparacion y aislamiento de un conjugado de imidazo-acetil GLP-2 pegilado (Lys30) y Fc de inmunoglobulina
El imidazo-acetil GLP-2-PEG Lys30-pegilado preparado en el ejemplo 21 y un Fc de inmunoglobulina se sometieron a una reaccion a 4 °C durante 16 horas en una proporcion molar de 1:l5, con una concentracion de peptido de 20 mg/ml. En este momento, se uso fosfato de potasio 100 mM (pH 6,0) como medio de reaccion, y se le anadio al mismo NaCNBH3 20 mM como agente reductor. Despues de que se terminara la reaccion, la mezcla de reaccion se purifico mediante el uso de la columna SOURCE Phe, en las siguientes condiciones.
Columna: SOURCE Phe
Caudal: 2,0 ml/min
Solucion de elucion: A (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5) y B (A + NaCl 2 M); Gradiente A de 100^0 %, 100 min
El cromatograma que se consigue mediante la union de un isomero de CA-GLP-2 Lys30-pegilado con un Fc de inmunoglobulina y la purificacion del conjugado usando SOURCE Phe se muestra en la Fig. 31, y los resultados de SDS-PAGE de un conjugado de CA-GLP-2 (Lys30)-PEG y Fc de inmunoglobulina se muestran en la Fig. 32. Como se muestra en la Fig. 32, se observo una unica banda con 60 K en una condicion no reductora, y se observaron dos bandas con 35 K y 25 K en una condicion reductora.
Ejemplo 23: preparacion y aislamiento de conjugado de insulina humana pegilada (BIPhe)
<23-1> Preparacion de conjugado de insulina humana pegilada (BIPhe)
Para pegilar 5 K PropionALD (1) metoxiPEG (PEG que tiene un grupo propionaldetndo, NOF., Japon) a un extremo N de fenilalanina, que es un primer aminoacido de la cadena B de la insulina humana (Sigma), el PEG y la insulina humana se sometieron a una reaccion a 4 °C durante 12 horas en una proporcion molar de 1:2, con una concentracion de peptido de 2,3 mg/ml. En este momento, se uso tampon fosfato de potasio 100 mM (pH 6,0) como medio de reaccion, y se le anadio al mismo NaCNBH3 20 mM como agente reductor.
<23-2> Aislamiento de isomero posicional
Los isomeros posicionales se purificaron a partir de la mezcla de reaccion mediante el uso de columna SOURCE 15S (XK 16 ml, Amersham Bioscience). En este procedimiento, se uso etanol en la solucion de purificacion para facilitar el aislamiento de los isomeros (Fig. 33). Las monoPEGilaciones de los picos eluidos se confirmaron por analisis de SDS-PAGE, y las selectividades de lisina se confirmaron mediante el procedimiento de identificacion genetica con la proteasa Glu-C (Fig. 36).
Columna: SOURCE S
Caudal: 2,0 ml/min
Solucion de elucion: A (Na-citrato 20 mM, pH 2,0 + etanol al 60 %) y B (A + KCl 0,5 M); Gradiente A de 0^3 %, 1 min, Gradiente B de 0^50 %, 80 min
Como se muestra en la Fig. 36, una parte n.° 2 desaparecio por modificacion con PEG en B1F.
Ejemplo 24: preparacion y aislamiento de conjugado de insulina humana pegilada (AIGly)
<24-1> Preparacion de conjugado de insulina humana pegilada (AIGly)
Para pegilar 5 K metoxiPEG-butanoato de succinimidilo (1) (PEG que tiene un grupo reactivo SBA, NOF., Japon) a un extremo N de glicina, que es un primer aminoacido de la cadena A de la insulina humana (Sigma), el PEG y la insulina humana se sometieron a una reaccion a 25 °C durante 3 horas en una proporcion molar de 1:4, con una concentracion de peptido de 2 mg/ml. En este momento, se uso tampon Na-borato 100 mM (pH 9,0) que contema isopropanol al 35 % como medio de reaccion.
<24-2> Aislamiento de isomero posicional
Los isomeros posicionales se purificaron a partir de la mezcla de reaccion mediante el uso de columna SOURCE 15S (XK 16 ml, Amersham Bioscience). El procedimiento de purificacion fue el mismo que el descrito en el ejemplo 23. En este procedimiento, se uso etanol en la solucion de purificacion para facilitar el aislamiento de los isomeros (Fig. 34). Las monoPEGilaciones de los picos eluidos se confirmaron por analisis de SDS-PAGE, y las selectividades de lisina se confirmaron mediante el procedimiento de identificacion genetica con la proteasa Glu-C (Fig. 36).
Como se muestra en la Fig. 36, una parte n.° 1 desaparecio por modificacion con PEG en A1G.
Ejemplo 25: preparacion y aislamiento de conjugado de insulina humana pegilada (B29Lys)
<25-1> Preparacion de conjugado de insulina humana pegilada (B29Lys)
Para pegilar 5 K metoxiPEG-butanoato de succinimidilo (1) a un residuo de lisina que es un 29.° aminoacido de la cadena B de la insulina humana (Sigma), el PEG y la insulina humana se sometieron a una reaccion a 25 °C durante 1 hora en una proporcion molar de 1:2, con una concentracion de peptido de 2 mg/ml. En este momento, se uso 5 tampon Na-borato 100 mM (pH 9,0) que contema isopropanol al 45% como medio de reaccion.
<25-2> Aislamiento de isomero posicional
Los isomeros posicionales se purificaron a partir de la mezcla de reaccion mediante el uso de columna SOURCE 15S (XK 16 ml, Amersham Bioscience). El procedimiento de purificacion fue el mismo que el descrito en el ejemplo 23. En este procedimiento, se uso etanol en la solucion de purificacion para facilitar el aislamiento de los isomeros (Fig. 35). 10 Las monoPEGilaciones de los picos eluidos se confirmaron por analisis de SDS-PAGE, y las selectividades de lisina se confirmaron mediante el procedimiento de identificacion genetica con la proteasa Glu-C (Fig. 36).
Como se muestra en la Fig. 36, una parte n.° 4 desaparecio por modificacion con PEG en B29K.
Aunque la invencion se ha descrito con respecto a los modos de realizacion espedficos anteriores, se debe reconocer que los expertos en la tecnica pueden hacer varias modificaciones y cambios a la invencion que tambien 15 entran dentro del alcance de la invencion como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (3)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para preparar un conjugado de polipeptido fisiologicamente activo espedfico de sitio, que comprende las etapas de:
    i) tratar un polipeptido fisiologicamente activo con un polfmero no peptidilico en un medio de reaccion que contiene 5 una cantidad espedfica de un alcohol y tiene un pH espedfico para posibilitar que el polfmero no peptidilico se una a
    un sitio diana del polipeptido fisiologicamente activo;
    y
    ii) aislar y purificar el conjugado de polipeptido fisiologicamente activo a partir de la mezcla de reaccion de la etapa i) por cromatograffa de intercambio ionico usando un alcohol,
    10 en el que el polipeptido fisiologicamente activo es una exendina, insulina, oxintomodulina, GLP-1, GLP-2, grelina, calcitonina o uno de los derivados de los mismos que tiene una estructura seleccionada de las formulas (I) a (IV):
    imagen1
    N
    ii
    Peptido
    imagen2
    Formula I
    imagen3
    M
    15 Formula II
    imagen4
    M.
    Peptido
    Ik
    Formula III
    JSL
    N-
    Peptido
    Q
    Formula IV
    en el que el alcohol es etanol o isopropanol;
    en el que el alcohol esta presente en el medio de reaccion en una cantidad de un 25 % a un 90 % en volumen, basado 5 en el volumen total del medio de reaccion;
    en el que el pH empleado en la etapa i) es de 7,0 a 10,0, cuando el polipeptido fisiologicamente activo es una exendina, oxintomodulina, GLP-1, GLP-2 o uno de los derivados de los mismos, y
    en el que el pH empleado en la etapa i) es de 4,0 a 10,0 cuando el polipeptido fisiologicamente activo es insulina humana o un derivado de la misma.
    10 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el polfmero no peptidilico es polietilenglicol.
  2. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el alcohol esta presente en el medio de reaccion, en una cantidad de un 35 % a un 60 % en volumen, basado en la cantidad total del medio de reaccion.
  3. 4. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el conjugado de polipeptido fisiologicamente activo espedfico de sitio es un conjugado de exendina-4 en el que esta unido PEG a Lys27, un conjugado de calcitonina en el que esta
    15 unido PEG al extremo N, un conjugado de oxintomodulina en el que esta unido PEG a Lys27 o Lys30, un conjugado de insulina humana en el que esta unido PEG al extremo N de Gly1 en la cadena A o esta unido a Lys29 en la cadena B, o un conjugado de GLP-1 o GLP-2 en el que esta unido PEG a Lys34 o Lys30.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9278146B2 (en) 2010-10-08 2016-03-08 Kyoto University Peptide derivative and use of the same
WO2012046845A1 (ja) * 2010-10-08 2012-04-12 国立大学法人京都大学 ペプチド誘導体及びその使用
CN102675452B (zh) * 2011-03-17 2015-09-16 重庆富进生物医药有限公司 具持续降血糖和受体高结合的人胰岛素及类似物的偶联物
CN102718868A (zh) * 2011-03-30 2012-10-10 上海华谊生物技术有限公司 定点单取代聚乙二醇化Exendin类似物及其制备方法
US10166295B2 (en) 2011-06-02 2019-01-01 Opko Biologics Ltd. Pegylated OXM variants
BR112013030933A2 (pt) * 2011-06-02 2018-04-24 Prolor Biotech Inc agonistas do receptor de glp-1/glucágon de ação prolongada
CA2838503C (en) 2011-06-10 2020-02-18 Hanmi Science Co., Ltd. Novel oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
PH12018501119A1 (en) * 2011-06-17 2019-02-04 Hanmi Science Co Ltd A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
KR20130049671A (ko) * 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
KR101895047B1 (ko) 2011-12-30 2018-09-06 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 위치 특이적 글루카곤 유사 펩타이드-2 약물 결합체
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
AU2013273135B2 (en) 2012-06-04 2017-12-07 Opko Biologics Ltd. Pegylated OXM variants
KR101968344B1 (ko) * 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
KR101993393B1 (ko) * 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
EA031852B1 (ru) * 2012-11-06 2019-03-29 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Жидкая композиция белкового конъюгата, содержащего оксинтомодулин и фрагмент иммуноглобулина
KR20140088837A (ko) * 2013-01-03 2014-07-11 한미약품 주식회사 Ｎ-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체
PT2963055T (pt) 2013-02-26 2019-07-25 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conugado de insulina específico ao local
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
CN103804483A (zh) * 2014-03-13 2014-05-21 中国人民解放军第四军医大学 Orexin-A聚乙二醇化修饰物及其制备方法
KR20150140177A (ko) * 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
TWI802396B (zh) 2014-09-16 2023-05-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
KR102418477B1 (ko) 2014-12-30 2022-07-08 한미약품 주식회사 글루카곤 유도체
WO2017018742A1 (en) * 2015-07-24 2017-02-02 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method of preparing physiologically active polypeptide conjugate
KR101974305B1 (ko) * 2018-02-14 2019-04-30 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
CN109678930B (zh) * 2018-12-05 2022-04-29 西北工业大学 聚乙二醇修饰的npff及其用途
CN109535244B (zh) * 2018-12-11 2020-12-01 上海景峰制药有限公司 一种重组人脑利钠肽的纯化方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0788375A2 (en) 1994-11-09 1997-08-13 Robin Ewart Offord Functionalized polymers for site-specific attachment
EP0922446A1 (en) * 1997-12-03 1999-06-16 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Solution-phase site-specific preparation of GRF-PEG conjugates
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
BR0010705A (pt) 1999-04-30 2002-02-05 Amylin Pharmaceuticals Inc Exendinas modificadas e agonistas da exendina
EP1324777A1 (en) * 2000-10-05 2003-07-09 Ares Trading S.A. Regioselective liquid phase pegylation
US8423976B2 (en) * 2003-03-13 2013-04-16 Northrop Grumman Corporation Extreme pipeline and optimized reordering technology
US20050176108A1 (en) * 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US20040180054A1 (en) 2003-03-13 2004-09-16 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
SI1605897T1 (sl) 2003-03-19 2012-11-30 Lilly Co Eli Polietilen glikol povezane GLP spojine
KR100507796B1 (ko) * 2003-04-03 2005-08-17 한미약품 주식회사 생체내 반감기가 증가된 ｐｅｇ-생리활성 폴리펩티드 동종이량체 결합체 및 이의 제조방법
US9040664B2 (en) * 2003-04-11 2015-05-26 Antriabio, Inc. Materials and methods for preparing protein-polymer conjugates
EP1664108B1 (en) * 2003-08-21 2009-10-14 Novo Nordisk A/S Separation of polypeptides comprising a racemized amino acid
WO2006053299A2 (en) * 2004-11-12 2006-05-18 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of fviii
US20080207505A1 (en) * 2005-01-12 2008-08-28 James Kenneth D Bna Conjugates and Methods of Use
US8168592B2 (en) * 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
US20090252703A1 (en) 2006-10-19 2009-10-08 Gegg Jr Colin V Use of alcohol co-solvents to improve pegylation reaction yields
JP2009019027A (ja) * 2007-07-16 2009-01-29 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体

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