BRPI1013626B1

BRPI1013626B1 - Método para preparar conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo em sítio específico

Info

Publication number: BRPI1013626B1
Application number: BRPI1013626-6A
Authority: BR
Inventors: Dae Hae Song; Jae Hee Shin; Jae Min Lee; Young Kyung Park; Se Chang Kwon; Gwan Sun Lee
Original assignee: Hanmi Science Co., Ltd
Priority date: 2009-03-20
Filing date: 2010-03-18
Publication date: 2021-05-11
Also published as: IL215165A0; MY150536A; KR20100105494A; WO2010107256A2; JP2015127330A; SG174320A1; PL2408800T3; JP2012520873A; BRPI1013626B8; AU2010225523A1; WO2010107256A3; IL215165A; ES2587397T3; KR101164453B1; RU2011142332A; EP2408800A4; CA2755395C; RU2495881C2; US8895281B2; PT2408800T

Abstract

método para preparar conjugado de polipeptídeo flslologicamente ativo em sítio específico. a presente invenção provê um método para preparar conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo em sítio específico com alto rendimento, pelo tratamento de um poiipeptídeo fisiologicamente ativo com um polímero não peptídico na presença de um álcool em um ph especifico, o qual pode ser desejavelmente empregado no desenvolvimento de formulações de ação prolongada de vários fármacos peptídicos com alta atividade in vivo e meia-vida no sangue acentuadamente prolongada.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um método para preparar conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo em sítio específico, mais especialmente, a um método para preparar o referido conjugado compreendendo ligar um polipeptídeo fisiologicamente ativo a um polímero não-peptidil em alto rendimento.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Peptídeos são facilmente desnaturados em virtude apresentarem baixa estabilidade, serem degradados por proteases in vivo e excretados através do rim dado ao seu tamanho relativamente pequeno. Dessa forma, para que uma concentração específica no sangue de um fármaco peptídico em sua forma ativa seja mantida no sangue, é necessária à sua administração frequente ao paciente. No entanto, fármacos peptídicos são geralmente administrados na forma de preparados injetáveis e esse tipo de administração frequente causa grave desconforto aos pacientes. No intuito de solucionar essa questão, alguns métodos foram desenvolvidos, por exemplo, um método para transferir o fármaco peptídico através de inalação orofaríngea ou nasofaríngea no qual a permeação do fármaco peptídico através das membranas biológicas é aumentada, um método para modificar uma sequência específica de aminoácidos que seja sensível a proteases (por exemplo, a sequência de aminoácidos de GLP-1 para impedir a perda dos títulos provocada por dipeptidil peptidase), a fim de estabilizar o peptídeo, no qual a degradação pela enzima é inibida, e um método para adicionar quimicamente um polímero não-peptidil com alta solubilidade, como polietilenoglicol (PEG), à superfície do peptídeo.

[003] PEG, um dos polímeros não-peptidil que tem sido utilizado, liga-se inespecificamente a um sítio específico ou a múltiplos sítios de um peptídeo de interesse para atingir o efeito de aumentar o peso molecular do peptídeo, permitindo que o PEG-peptídeo resultante resista à perda através do rim e a hidrólise enzimática, sem causar quaisquer efeitos colaterais. Por exemplo, a Publicação da Patente Internacional No WO 2006/076471 descreve sustentar a atividade fisiológica de peptídeo natriurético tipo B (BNP), usado como agente terapêutico para insuficiência cardíaca congestiva, por sua ligação ao PEG, e a Patente U.S. No 6 924 264 descreve aumentar o tempo de residência in vivo de um fármaco derivado de exedin-4 por meio de ligação de PEG ao seu resíduo de lisina.

[004] Estes métodos prolongam o tempo de residência in vivo de um fármaco peptídico ao acrescentarem o peso molecular de PEG, porém, à medida que o peso molecular aumenta, o título do fármaco peptídico torna-se significativamente menor. Além disso, a ligação não específica do PEG pode blindar o domínio ativo de um polipeptídeo fisiologicamente ativo e diminuir consideravelmente a atividade do polipeptídeo.

[005] Portanto, há necessidade de ser desenvolvido um método para preparar conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo e polímero não-peptidil, no qual o polímero seja ligado ao peptídeo em maneira sítio-específica que não afete a atividade do polipeptídeo.

[006] Os presentes inventores concluíram a invenção ao confirmarem que um conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo tendo um polímero não-peptidil ligado especificamente a um sítio pode ser preparado em alto rendimento, ajustando- se o pH e o teor de álcool do meio de reação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Dessa forma, a presente invenção tem como objeto prover um método de alto rendimento para preparar um conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo, no qual um polímero não-peptidil liga-se a um polipeptídeo fisiologicamente ativo em um sítio específico.

[008] De acordo com um aspecto da presente invenção, é provido um método para preparar um conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo em sítio específico, compreendendo as etapas de: i) reagir um polipeptídeo fisiologicamente ativo e um polímero não-peptidil em um meio de reação que contenha uma quantidade específica de um álcool e com pH específico para permitir o polímero não-peptidil ligar- se a um sítio-alvo do polipeptídeo fisiologicamente ativo; e ii) isolar e purificar o conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo da mistura de reação da etapa (i) por cromatografia de troca iônica usando um álcool.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[009] O objeto acima e outros objetos e características da presente invenção se tornarão evidentes a partir da descrição a seguir da invenção, quando considerados em conjunto com os desenhos que a acompanham, os quais mostram respectivamente: Figura 1: perfil de purificação de isômeros posicionais de DA-exendina-4-PEG, usando coluna SOURCE S; Figura 2: perfil de purificação de isômeros posicionais de CA-exendina-4-PEG, usando coluna SOURCE S; Figura 3: gráfico mostrando isômeros obtidos de Lys27-peguilado quando CA- exendina-4 é peguilado em pH variados; Figura 4: gráfico mostrando isômeros obtidos de Lys27-peguilado quando CA- exendina-4 é peguilado em pH variados e em EtOH 45%; Figura 5: gráfico mostrando isômeros obtidos de Lys27-peguilado quando CA- exendina-4 é peguilado em pH 7,5 e em quantidade variada (%) de etanol; Figura 6: gráfico mostrando isômeros obtidos de Lys27-peguilado quando CA- exendina-4 é peguilado em pH 7,5 e em quantidade variada (%) de isopropanol; Figura 7: análise por SDS-PAGE de CA-exendina-PEG-Fc de imunoglobulina; Figura 8: análise por SDS-PAGE de CA-exendina-PEG Lys12 e Lys27; Figura 9: perfil de análise de isômeros Lys12-peguilados de CA-exendina-4 por mapeamento peptídico; Figura 10: perfil de análise de isômeros Lys27-peguilados de CA-exendina-4 por mapeamento peptídico; Figura 11: perfil de purificação de isômeros posicionais de oxintomodulina- PEG, usando coluna SOURCE S; Figura 12: perfil de purificação de isômeros posicionais de imidazo-acetil oxintomodulina-PEG, usando coluna SOURCE S; Figura 13: perfil de análise de isômeros Lys30-peguilados de oxintomodulina por mapeamento peptídico; Figura 14: perfil de purificação de um conjugado de imidazo-acetil oxintomodulina-PEG e Fc de imunoglobulina, usando coluna SOURCE Q; Figura 15: análise por SDS-PAGE de um conjugado de imidazo-acetil oxintomodulina-PEG e Fc de imunoglobulina; Figura 16: perfil de purificação de isômeros posicionais de análogo de oxintomodulina-PEG, usando coluna SOURCE S; Figura 17: perfil de análise de isômeros Lys27-peguilados de análogo de oxintomodulina por mapeamento peptídico; Figura 18: perfil de purificação de isômeros posicionais de análogo de imidazo-acetil oxintomodulina-PEG, usando coluna SOURCE S; Figura 19: perfil de análise de isômeros Lys27-peguilados de análogo de imidazo-acetil oxintomodulina por mapeamento peptídico; Figura 20: perfil de purificação de um conjugado de análogo de imidazo-acetil oxintomodulina-PEG e Fc de imunoglobulina, usando coluna SOURCE Q; Figura 21: análise por SDS-PAGE de um conjugado de análogo de imidazo- acetil oxintomodulina-PEG e Fc de imunoglobulina; Figura 22: perfil de purificação de isômeros posicionais de GLP-1-PEG, usando coluna SOURCE S; Figura 23: perfil de análise de isômeros Lys34-peguilados de GLP-1 por mapeamento peptídico; Figura 24: perfil de purificação de isômeros posicionais de imidazo-acetil GLP- 1-PEG, usando coluna SOURCE S; Figura 25: perfil de análise de isômeros Lys34-peguilados de imidazo-acetil GLP-1 por mapeamento peptídico; Figura 26: perfil de purificação de um conjugado de imidazo-acetil GLP-1-PEG e Fc de imunoglobulina, usando coluna SOURCE Phe; Figura 27: análise por SDS-PAGE de um conjugado de imidazo-acetil GLP-1- PEG e Fc de imunoglobulina; Figura 28: perfil de purificação de isômeros posicionais de GLP-2-PEG, usando coluna SOURCE S; Figura 29: perfil de análise de isômeros Lys30-peguilados de GLP-2 por mapeamento peptídico; Figura 30: perfil de purificação de isômeros posicionais de imidazo-acetil GLP- 2-PEG, usando coluna SOURCE S; Figura 31: perfil de purificação de um conjugado de imidazo-acetil GLP-2-PEG e Fc de imunoglobulina, usando coluna SOURCE Phe; Figura 32: análise por SDS-PAGE de um conjugado de imidazo-acetil GLP-2- PEG e Fc de imunoglobulina; Figura 33: perfil de purificação de isômeros posicionais de insulina humana- PEG (B1F), usando coluna SOURCE S; Figura 34: perfil de purificação de isômeros posicionais de insulina humana- PEG (A1G), usando coluna SOURCE S; Figura 35: perfil de purificação de isômeros posicionais de insulina humana- PEG (B29K), usando coluna SOURCE S; e Figura 36: perfil de análise de isômeros A1G, B1F ou B29K-peguilados de insulina humana por mapeamento peptídico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A seguir, a presente invenção é descrita detalhadamente.

[0010] A presente invenção provê um método para preparar um conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo em sítio específico, compreendendo as etapas de: i) tratar um polipeptídeo fisiologicamente ativo com um polímero não-peptidil em um meio de reação que contenha uma quantidade específica de um álcool e com pH específico para permitir o polímero não-peptidil ligar-se a um sítio-alvo do polipeptídeo fisiologicamente ativo; e ii) isolar e purificar o conjugado do polipeptídeo fisiologicamente ativo da mistura de reação da etapa (i) por cromatografia de troca iônica usando um álcool.

[0011] Conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo de acordo com a presente invenção refere-se a uma substância na qual um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma terminação de um polímero não-peptidil estão ligados covalentemente entre si, e a presente invenção é caracterizada por ligar um polipeptídeo com um polímero sob uma condição específica e isolar o conjugado resultante do polipeptídeo tendo o polímero ligado em um sítio-alvo deste.

[0012] O termo “polipeptídeo ou peptídeo fisiologicamente ativo”, neste relatório descritivo, refere-se a um peptídeo capaz de exibir atividade fisiológica in vivo, podendo, por exemplo, ser selecionado a partir de um grupo constituído por peptídeo insulinotrópico, fator sanguíneo, hormônio digestivo, hormônio adrenocorticotrófico, hormônio tireoidiano, hormônio intestinal, citocina, enzima, fator de crescimento, neuropeptídeo, hormônio hipofisiotrófico, peptídeo antiobesidade, peptídeo antiviral, além de derivados de peptídeos não nativos que retenham propriedades fisiologicamente ativas, entre outros. Mais especificamente, o polipeptídeo ou peptídeo fisiologicamente ativo é selecionado a partir do grupo constituído por eritropoietina, GM-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos), amilina, glucagon, insulina, somatostatina, PYY (peptídeo YY), NPY (neuropeptídeo Y), GLP-1, GLP-2, exendina-4, oxintomodulina, grelina, angiotensina, bradicinina, calcitonina, corticotropina, eledoisina, gastrina, leptina, oxitocina, vasopressina, LH (hormônio luteinizante), prolactina, FSH (hormônio folículo estimulante), PTH (hormônio da paratireoide), secretina, sermorelina, hGH (hormônio de crescimento humano), peptídeo liberador de hormônio de crescimento, G-CSFs (fator estimulador de colônias de granulócitos), interferons, interleucinas, peptídeo liberador de prolactina, orexina, peptídeo liberador de tireoide, colecistocinina, peptídeo inibidor de gastrina, calmodulina, peptídeo liberador de gastrina, motilina, peptídeo intestinal vasoativo, ANP (peptídeo natriurético atrial), BNP (peptídeo natriurético cerebral), CNP (peptídeo natriurético tipo C), neurocinina A, neuromedina, renina, endotelina, peptídeo sarafotoxina, peptídeo carsomorfina, dermorfina, dinorfina, endorfina, encepalina, fator de células T, fator de necrose tumoral, receptor de fator de necrose tumoral, receptor de uroquinase, fator inibitório de tumor, inibidor de colagenase, timopoietina, timulina, timopentina, timosina, fator humoral tímico, adrenomodulina, alatostatina, fragmento de beta-proteína amiloide, peptídeo antimicrobiano, peptídeo antioxidante, bombesina, osteocalcina, peptídeo CART, E-selectina, ICAM-1, VCAM- 1, leucocina, kringle-5, laminina, inibina, galanina, fibronectina, pancreastatina e fuzeon. Adicionalmente, o polipeptídeo fisiologicamente ativo inclui precursores, derivados, fragmentos ou variantes destes.

[0013] O polipeptídeo fisiologicamente ativo preferido usado na presente invenção é exendina, insulina, GLP-1, GLP-2, oxintomodulina, grelina, angiotensina, bradicinina, calcitonina ou um derivado destes. Estes derivados podem ser preparados, por exemplo, por substituição química (por exemplo, alfa-metilação ou alfa-hidroxilação), deleção (por exemplo, desaminação ou deleção de carbono) ou modificação (por exemplo, N-metilação) de quaisquer grupos em um resíduo de aminoácido e, especialmente, o preparo do derivado de exendina que está descrito detalhadamente no Pedido de Patente Coreana No 2008-69234.

[0014] Enquanto isso, o termo “polímero não-peptidil”, neste relatório descritivo, refere-se a um polímero biocompatível incluindo duas ou mais unidades repetidas, unidas entre si por ligação covalente, mas excluindo ligação peptídica.

[0015] O polímero não-peptidil a ser usado na presente invenção pode ser selecionado a partir do grupo constituído por polietilenoglicol, polipropilenoglicol, copolímeros de etilenoglicol e propilenoglicol, polióis polioxietilados, álcool polivinílico, polissacarídeos, dextrano, polivinil etil éter, polímeros biodegradáveis como PLA (ácido poli(lático) e PLGA (ácido polilático-glicólico), polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialurônico e combinações destes, sendo preferido polietilenoglicol. Um derivado destes, que seja conhecido no estado da técnica ou facilmente preparado por aqueles versados no estado da técnica, está incluído também no âmbito da presente invenção. O polímero não-peptidil a ser usado na presente invenção tem como função aumentar o peso molecular de um polipeptídeo fisiologicamente ativo para impedir a perda do conjugado através do rim. Qualquer polímero não-peptidil, contanto que resistente à protease in vivo, pode ser usado sem qualquer restrição. O peso molecular do polímero não-peptidil pode variar no intervalo de 0,5 a 100 kDa, de preferência de 0,5 a 20 kDa, e a razão molar adequada do polipeptídeo fisiologicamente ativo e o polímero não-peptidil pode ser escolhida no intervalo de 1:1 a 1:50.

[0016] O polímero não-peptidil usado na presente invenção contém um grupo reativo em uma extremidade ou em ambas as extremidades. No caso de conter um grupo reativo em ambas as extremidades, o polímero não-peptidil pode ligar-se a um veículo fisiologicamente ativo e a um fármaco proteico que auxiliem a atuação como formulação de ação prolongada.

[0017] O grupo reativo em uma extremidade ou em ambas as extremidades do polímero não-peptidil é de preferência selecionado a partir do grupo constituído por grupo aldeído reativo, grupo propionaldeído, grupo butiraldeído, grupo maleimida e grupo succinimidil. Exemplos do grupo succinimida incluem succinimidil-propionato, succinimidil-butanoato, hidróxi-succinidila, succinimidil carboximetila ou succinimidil- carbonato. Em especial, quando contém um grupo aldeído reativo ou um grupo succinimidil reativo em uma extremidade, o polímero não-peptidil é eficaz em ligar-se em ambas as extremidades com um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma imunoglobulina com reações não específicas mínimas. O grupo aldeído reativo ligase seletivamente a N-terminal em pH baixo e pode ligar-se a resíduo de lisina para formar um aminoácido em pH alto, tal como pH 9,0. Adicionalmente, o grupo succinimidil reativo pode formar uma ligação amida estável com amino terminal ou resíduo de lisina em pH 7,0 ~ 9,0.

[0018] Além disso, os grupos reativos em ambas as extremidades do polímero não-peptidil podem ser iguais ou diferentes. Quando polietilenoglicol contendo grupo reativo hidroxila em suas duas extremidades é utilizado como o polímero não-peptidil, o grupo hidroxila pode ser ativado e convertido em vários grupos reativos por reações químicas conhecidas, ou é possível utilizar polietilenoglicol comercialmente disponível contendo um grupo reativo modificado.

[0019] A etapa (i) da presente invenção visa preparar um conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo por meio de ligação em sítio específico de um polímero não-peptidil com um polipeptídeo fisiologicamente ativo em um meio adequado de reação.

[0020] O termo “sítio-específico” ou “em sítio específico”, neste relatório descritivo, refere-se à ligação de um polímero não-peptidil em um sítio-alvo específico de aminoácido de um polipeptídeo fisiologicamente ativo, de preferência uma amina do resíduo de lisina ou em N-terminal. A ligação ou união em sítio específico pode impedir a formação de conjugados acidentais nos quais o polímero não-peptidil é ligado a um resíduo de aminoácido fisiologicamente importante. Por exemplo, quando um polímero não-peptidil liga-se ao N-terminal de exendina-4, a atividade in vitro do exendina-4 tornou-se menor, mas quando um polímero não-peptidil liga-se a um resíduo de lisina, a atividade in vitro foi mantida. Em especial, quando um polímero não-peptidil liga-se ao 27° resíduo de lisina em vez de o 12° resíduo de lisina, atividade in vitro muito mais alta foi observada (Consultar o Exemplo 10 e a Tabela 2).

[0021] Os presentes inventores constataram que a presença de um álcool em um meio de reação e o pH do meio de reação na etapa (i) são fatores fundamentais para ligação sítio-específica de um polímero não-peptidil e um polipeptídeo fisiologicamente ativo. Dessa forma, na etapa (i) da presente invenção, um polímero não-peptidil torna-se ligado a um sítio específico de um polipeptídeo fisiologicamente ativo, usando um meio de reação contendo um teor conhecido de um álcool e tendo um pH específico.

[0022] Em uma modalidade específica da presente invenção, a razão de um isômero posicional específico do conjugado do polipeptídeo pode ser variada com base no pH do meio de reação, ou com base na concentração (%) de um álcool no mesmo pH. É, portanto, possível ligar um polímero não-peptidil a um aminoácido desejado de um polipeptídeo fisiologicamente ativo em maneira sítio-específica.

[0023] Ou seja, a etapa (i) da presente invenção é conduzida em um pH específico para permitir que o polímero não-peptidil ligue-se a um sítio desejado (ou alvo), ou seja, que não afete a atividade do polipeptídeo. O intervalo de pH pode depender dos tipos de polipeptídeo fisiologicamente ativo. Por exemplo, em caso de peptídeo insulinotrópico (por exemplo, exendina-4), um isômero no qual o polímero está ligado à 12a lisina foi altamente observado em pH baixo do meio de reação, enquanto que um isômero no qual o polímero está ligado à 27a lisina que não afeta a atividade insulinotrópica foi altamente observado em pH alto do meio de reação (Consultar o Exemplo 3 e a Figura 3). Portanto, a etapa (i) é realizada de preferência em pH de 7,5 a 9,0, de modo que o polímero não-peptidil acople-se seletivamente à 27a lisina.

[0024] Ademais, a etapa (i) da presente invenção é realizada em um meio de reação contendo um álcool, de modo que um polímero não-peptidil possa ligar-se a um sítio que não afete a atividade do polipeptídeo. Exemplos do álcool incluem álcool primário, secundário e terciário, de preferência um álcool com número de carbono de um a dez, mais preferivelmente etanol ou isopropanol. Em caso de peptídeo insulinotrópico (por exemplo, exendina-4), um álcool pode estar presente no meio de reação em quantidade variando de 0,1% a 100% em volume, de preferência de 25% a 90%, mais preferivelmente de 35% a 60%, com base no volume total do meio de reação, a fim de permitir um polímero não-peptidil ligar-se à 27a lisina e não afetar a atividade insulinotrópica.

[0025] Em uma modalidade da presente invenção, em que o polipeptídeo fisiologicamente ativo é exendina-4 ou um derivado deste, o pH empregado na etapa (i) pode ser de 7,0 a 10,0 para aumentar a razão de ligação de um polímero não-peptidil a Lys27. Em outra modalidade da presente invenção, em que o polipeptídeo fisiologicamente ativo é calcitonina, o pH empregado na etapa (i) pode ser de 4,0 a 6,0 para aumentar a razão de ligação de um polímero não-peptidil a N-terminal. Em outra modalidade da presente invenção, quando o polipeptídeo fisiologicamente ativo é oxintomodulina ou um derivado desta, o pH empregado na etapa (i) pode ser de 7,0 a 10,0 para aumentar a razão de ligação de um polímero não-peptidil a Lys27 ou Lys30. Em outra modalidade da presente invenção, quando o polipeptídeo fisiologicamente ativo é insulina humana ou um derivado desta, o pH empregado na etapa (i) pode ser de 4,0 a 6,0 para aumentar a razão de ligação de um polímero não-peptidil ao N-terminal de Phe1 (1a fenilalanina) na cadeia B. Em outra modalidade da presente invenção, quando o polipeptídeo fisiologicamente ativo é insulina humana ou um derivado desta, o pH empregado na etapa (i) pode ser de 7,0 a 10,0 para aumentar a razão de ligação de um polímero não-peptidil ao N-terminal de Gly1 (1a glicina) na cadeia A, ou a Lys29 (29a lisina) na cadeia B. Em outra modalidade da presente invenção, quando o polipeptídeo fisiologicamente ativo é GLP-1 ou um derivado deste, o pH empregado na etapa (i) pode ser de 7,0 a 10,0 para aumentar a razão de ligação de um polímero não-peptidil a Lys34. Em outra modalidade da presente invenção, quando o polipeptídeo fisiologicamente ativo é GLP-2 ou um derivado deste, o pH empregado na etapa (i) pode ser de 7,0 a 10,0 para aumentar a razão de ligação de um polímero não-peptidil a Lys30.

[0026] Dessa forma, o conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo em sítio específico preferido da presente invenção é conjugado de exendina-4 no qual PEG está ligado a Lys27, conjugado de calcitonina no qual PEG está ligado a N- terminal, conjugado de oxintomodulina ou de análogo desta no qual PEG está ligado a Lys27 ou Lys30, conjugado de insulina humana ou de análogo desta no qual PEG está ligado ao N-terminal de Phe1 na cadeia B, N-terminal de Gly1 na cadeia A ou a Lys29 na cadeia B, ou conjugado de GLP-1 ou GLP-2 no qual PEG está ligado a Lys34 ou Lys30.

[0027] Em um aspecto preferido da presente invenção, um derivado de peptídeo (ou análogo) pode ser utilizado para facilitar uma ligação sítio-específica entre um polímero não-peptidil e um polipeptídeo fisiologicamente ativo. O derivado é um peptídeo tendo qualquer um de outros sítios de aminoácidos que não são alvos deletados ou protegidos a fim de prevenir ligação indesejada. Por exemplo, em caso de peptídeo insulinotrópico, tal como exendina, vários derivados de exendina podem ser utilizados, como desamino-histidil (DA)-exendina-4 da Fórmula (I), beta-hidróxi- imidazopropionil (HY)-exendina-4 da Fórmula (II), imidazo-acetil (CA)-exendina-4 da Fórmula (III) e dimetil-histidil (DM)-exendina-4 da Fórmula (IV), os quais são preparados usando os métodos em que um grupo alfa-amino do aminoácido em N- terminal, histidina é deletado, o grupo amino em N-terminal é substituído com grupo hidroxila, o grupo alfa-amino de histidina é modificado com dois grupos metila, ou um carbono-alfa da histidina em N-terminal e um grupo amino a ele ligado são deletados para resultar em grupo imidazo-acetil, entre outros. As estruturas destes derivados exemplares de exendina e os métodos para prepará-los estão descritos na Publicação da Patente Coreana Não Examinada No 2009-0008151, a qual é incluída no âmbito da presente invenção por referência neste pedido de patente.

[0028] Da mesma forma, é possível também utilizar oxintomodulina, GLP-1 e GLP-2, contendo histidina como 1° aminoácido, em forma de derivado tendo qualquer estrutura selecionada a partir das Fórmulas (I) a (IV).

[0029] Em uma modalidade específica da presente invenção, os presentes inventores investigaram os efeitos do pH e do teor de um álcool (%) do meio de reação sobre o aspecto de ligação em sítio específico do polímero não-peptidil, e confirmaram que a razão dos conjugados de peptídeo insulinotrópico tendo o polímero ligado à 12a lisina/27a lisina varia dependendo da alteração de pH e da quantidade de etanol ou isopropanol, em particular. Especialmente, um isômero mais preferível tendo o polímero não-peptidil ligado ao 27° resíduo de lisina foi em grande parte obtido quando 35% a 55%, de preferência em torno de 45% de etanol ou isopropanol são utilizados em pH 7,5.

[0030] Após aumentar a razão do conjugado polímero não-peptidil- polipeptídeo fisiologicamente ativo desejado, ajustando-se para pH e teor de álcool específicos na etapa (i), o conjugado desejado pode ser isolado e purificado por cromatografia de troca iônica usando um álcool na etapa (ii).

[0031] O álcool utilizado na etapa (ii) está presente em uma solução de purificação, e seus exemplos específicos são iguais aos definidos na etapa (i). No entanto, o álcool da etapa (i) foi empregado com a finalidade de aumentar a reatividade do polipeptídeo e a especificidade de sítio, modificando a sua estrutura secundária ou terciária, enquanto que o álcool da etapa (ii) foi empregado com a finalidade de facilitar o isolamento e a purificação em alto rendimento do conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo em sítio específico por redução de ligação não específica entre a coluna de troca iônica e o conjugado. O isolamento e a purificação podem ser realizados por vários métodos conhecidos daqueles versados no estado da técnica, de preferência por cromatografia de troca iônica, mais preferivelmente por cromatografia de troca iônica de alta pressão.

[0032] Entretanto, a fim de facilitar o isolamento e a purificação de isômero posicional, a cromatografia de troca iônica pode ser realizada em um pH específico. O pH foi adequadamente ajustado para aumentar a especificidade de sítio do conjugado na etapa (i), enquanto que este foi reajustado para fixar e desprender o conjugado da coluna de troca iônica em uma solução de purificação contendo um álcool na etapa (ii). O pH adequado empregado na etapa (ii) pode variar no intervalo de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 6,0.

[0033] Além disso, o polipeptídeo fisiologicamente ativo da presente invenção pode estar ligado ainda a um veículo fisiologicamente ativo. Nesse caso, o polímero não-peptidil deve ser um polímero não-peptidil com ambas as extremidades para ligar-se ao veículo fisiologicamente ativo. Ou seja, um veículo fisiologicamente ativo liga-se covalentemente a uma extremidade do polímero não-peptidil que não está covalentemente ligada ao polipeptídeo fisiologicamente ativo e, assim, pode ser preparado um conjugado no qual as duas extremidades do polímero não-peptidil são ligadas ao polipeptídeo fisiologicamente ativo e o veículo fisiologicamente ativo.

[0034] De acordo com a descrição acima, o conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo preparado na etapa (ii) pode estar ainda ligado a veículo fisiologicamente ativo, e o conjugado polipeptídeo-polímero-veículo resultante exibe atividades completamente diferentes, quando comparado ao conjugado polipeptídeo- polímero, ou seja, as excepcionais atividades fisiológicas tais como excelente duração prolongada de efeitos farmacológicos de um polipeptídeo fisiologicamente ativo, direcionamento para um sítio específico como uma lesão a ser tratada, ou indução de necrose.

[0035] O termo “veículo fisiologicamente ativo”, neste relatório descritivo, refere-se a uma substância fisiologicamente ativa exibindo atividades adicionais distintas da atividade fisiológica nativa do polipeptídeo, e que podem sustentar as atividades fisiológicas do polipeptídeo, tais como os efeitos farmacológicos, ou induzir o direcionamento para um sítio específico ou necrose, ao ligar-se a um polipeptídeo [sic] não-peptidil junto com um polipeptídeo fisiologicamente ativo.

[0036] O veículo fisiologicamente ativo utilizado na presente invenção inclui uma substância com as atividades supracitadas, entre outras, por exemplo, albumina, região Fc de imunoglobulina, transferrina, aptâmero, toxina, colágeno, dextrano, polissacarídeos, ácidos graxos, fibrinogênio e os semelhantes. De preferência, o veículo fisiologicamente ativo pode ser selecionado partir de albumina, região Fc de imunoglobulina e transferrina, mais preferivelmente região Fc de imunoglobulina.

[0037] A região Fc de imunoglobulina da presente invenção refere-se à região constante 2 da cadeia pesada (CH2) e região constante 3 da cadeia pesada (CH3) de uma imunoglobulina, excluindo as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, a região constante 1 da cadeia pesada (CH1) e a região constante 1 da cadeia leve (CL1). Esta região Fc pode incluir ainda uma região de articulação (hinge) na região constante da cadeia pesada. Ademais, a região Fc de imunoglobulina da imunoglobulina Fc da presente invenção pode ser uma forma prolongada, contendo parte ou toda a região Fc, incluindo a região constante 1 da cadeia pesada (CH1) e/ou a região constante 1 da cadeia leve (CL1), exceto as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, desde que exiba função fisiológica substancialmente semelhante ou melhor do que a Fc nativa da imunoglobulina, e pode incluir regiões Fc de imunoglobulinas modificadas por fosforilação, sulfatação, acrilação, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação, amidação e os semelhantes. A gama de Fc de imunoglobulina, o método para prepará-la e o método para ligar covalentemente uma região Fc de imunoglobulina a um conjugado de polímero não-peptidil-polipeptídeo fisiologicamente ativo estão descritos nas Patentes Coreanas Nos 775343, 725314, 725315 e 824505, as quais estão incluídas no âmbito da presente invenção por referência neste pedido de patente.

[0038] De acordo com o método da presente invenção, um conjugado de polipeptídeo desejado com excelente atividade fisiológica pode ser preparado em alto rendimento por ligação em sítio específico de um polímero não-peptidil a um aminoácido específico de um polipeptídeo fisiologicamente ativo, ao mesmo tempo em que minimizando a formação de conjugados adicionais.

[0039] Os Exemplos a seguir destinam-se a ilustrar mais ainda a presente invenção sem restringir o seu âmbito.

Exemplo 1: Preparo e isolamento de conjugado de DA-exendina-4 (Lys27) peguilhado <1-1> Preparo de DA-exendina-4 (Lys27) peguilhado

[0040] A fim de preparar um conjugado de peptídeo peguilado por ligação covalente de Lys no peptídeo com o PEG, desamino-histidil-exendina-4 (DA- exendina-4, AP, EUA) e PropionALD(2) PEG de 3,4 K (PEG tendo dois grupos de propionaldeído, IDB Inc., Coreia) foram submetidos a uma reação a 4 °C por 12 horas em razão molar de 1:30, com concentração de peptídeo de 3 mg/mL. Neste momento, tampão HEPES 100 mM (pH 7,5), contendo isopropanol 45%, foi utilizado como meio de reação, ao qual NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor.

<1-2> Isolamento de isômero posicional

[0041] Um peptídeo mono-peguilado foi primariamente purificado da mistura de reação do Exemplo <1-1>, por meio de cromatografia de troca iônica em coluna SOURCE Q (XK 16 mL, GE healthcare, Coreia) sob as condições abaixo, e os isômeros posicionais foram isolados por cromatografia de troca iônica em coluna SOURCE Q (XK 16 mL, GE healthcare, Coreia) sob as condições abaixo. Nesse processo, etanol foi utilizado para facilitar o isolamento de isômeros, sendo incluído em uma solução de purificação. Os sítios peguilados foram confirmados a partir de picos de eluição pelo método de mapeamento peptídico. Coluna: SOURCE Q Vazão: 2,0 mL/minuto Solução de eluição: A (Tris 20 mM, pH 8,5) e B (A + NaCl 0,5 M); Gradiente A 0^40%. 80 minutos Coluna: SOURCE S Vazão: 2,0 mL/minuto Solução de eluição: A (Ácido cítrico 20 mM, pH 3,0 + etanol 45%) e B (A + etanol 45% + KCl 0,5 M); Gradiente A 0^100%, 45 minutos

[0042] A partir da análise do perfil de purificação de isômeros posicionais, foi constatado que um pico para DA-exendina-4 Lys12-peguilado foi eluído inicialmente e, depois, um pico de Lys27-peguilado foi eluído na última parte (Figura 1).

[0043] Exemplo 2: Preparo e isolamento de conjugado de CA-exendina-4 (Lys27) peguilhado

[0044] O procedimento do Exemplo 1 foi repetido, exceto pelo uso de imidazo-acetil-exendina-4 (CA-exendina-4, Bachem, EUA) em vez de DA-exendina-4 no Exemplo 1, para obter o conjugado de CA-exendina-4 (Lys27) peguilado. A partir da análise do perfil de purificação de isômeros posicionais, foi constatado que um pico para CA-exendina-4 Lys12-peguilado foi eluído inicialmente e, depois, um pico de Lys27-peguilado foi eluído na última parte (Figura 2).

[0045] Exemplo 3: Alteração em razão de conjugado de CA-exendina-4 (Lys27) peguilado de acordo com o pH do meio de reação

[0046] Para investigar a alteração em razão de polipeptídeo peguilado em um sítio específico provocada por pH, CA-exendina-4 e PropionALD(2) PEG de 3,4 K foram submetidos à peguilação, reagindo o peptídeo e o PEG a 4°C por 12 horas em razão molar de 1:30, com concentração de peptídeo de 3 mg/mL. Neste momento, os tampões ácido cítrico 100 mM (pH 3,0), NaOAc 100 mM (pH 4,5), Na-P 100 mM (pH 7,5), Na-P 100 mM (pH 8,5), HEPES 100 mM (pH 8,0) e Na-Borato 100 mM (pH 9,2) foram utilizados como meio de reação, respectivamente, aos quais NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor. Cada mistura de reação foi purificada pelo método descrito no Exemplo 1, seguido por análise da razão do conjugado Lys27-peguilado. Como mostrado na Figura 3, a razão do conjugado Lys27-peguilado aumentou de acordo com o aumento em pH, e o pH ótimo foi confirmado em 7,0 a 10,0.

[0047] Exemplo 4: Alteração em razão de conjugado de CA-exendina-4 (Lys27) peguilado de acordo com o pH de meio de reação contendo etanol

[0048] Para investigar a alteração em razão de polipeptídeo peguilado em um sítio específico provocada por etanol e pH, CA-exendina-4 e PropionALD(2) PEG de 3,4 K foram submetidos à peguilação, reagindo o peptídeo e o PEG a 4 °C por 12 horas em razão molar de 1:30, com concentração de peptídeo de 3 mg/mL. Neste momento, tampões de ácido cítrico 100 mM (pH 3,0)/etanol 45%, NaOAc 100 mM (pH 4,5)/etanol 45%, Na-P 100 mM (pH 7,5)/etanol 45%, HEPES 100 mM (pH 8,0)/etanol 45% etanol e Na-P 100 mM (pH 8,5)/etanol 45% foram utilizados como meio de reação, respectivamente, aos quais foi adicionado NaCNBH3 20 mM como agente redutor. Cada mistura de reação foi purificada pelo método descrito no Exemplo 1, seguido pela análise do conjugado Lys27-peguilado. Como mostrado na Figura 4, a razão do conjugado Lys27-peguilado foi aumentada de acordo com o aumento em pH em meio de reação contendo EtOH 45%, e o pH ótimo foi confirmado em 7,0 a 9,0.

[0049] Exemplo 5: Alteração em razão de conjugado CA-exendina-4 (Lys27) peguilado de acordo com a concentração de etanol no meio de reação

[0050] Para investigar a alteração em razão de um polipeptídeo peguilado em um sítio específico provocada pela concentração de etanol no meio de reação, CA-exendina-4 e PropionALD(2) PEG de 3,4 K foram submetidos à peguilação, reagindo o peptídeo e o PEG a 4 °C por 12 horas em razão molar de 1:30, com concentração de peptídeo de 3 mg/mL. Neste momento, tampões HEPES 100 mM (pH 7,5)/etanol 0%, HEPES 100 mM (pH 7,5)/etanol 25%, HEPES 100 mM (pH 7,5)/etanol 35%, HEPES 100 mM (pH 7,5)/etanol 45%, HEPES 100 mM (pH 7,5)/etanol 55%, HEPES 100 mM (pH 7,5)/etanol 75% etanol e HEPES 100 mM (pH 7,5)/etanol 90% etanol foram utilizados como meio de reação, respectivamente, aos quais NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor. Cada mistura de reação foi purificada pelo método descrito no Exemplo 1, seguido pela análise da razão do conjugado Lys27-peguilado. Conforme mostrado na Figura 5, a razão do conjugado Lys27-peguilado foi aumentada até a quantidade de etanol atingir aproximadamente 50%, enquanto diminuiu em mais de 50% de etanol, e a quantidade ótima de etanol foi confirmada em 35% a 60%.

[0051] Exemplo 6: Alteração em razão de conjugado CA-exendina-4 (Lys27) peguilado de acordo com a concentração de isopropanol no meio de reação

[0052] Para investigar a alteração em razão de um polipeptídeo peguilado em um sítio específico pelo uso de isopropanol em vez de etanol, no meio de reação, CA-exendina-4 e PropionALD(2) PEG de 3,4 K foram submetidos à peguilação, reagindo o peptídeo e o PEG a 4 °C por 12 horas em razão molar de 1:30, com concentração de peptídeo de 3 mg/mL. Nesse momento, tampões HEPES 100 mM (pH 7,5)/isopropanol 0%, HEPES 100 mM (pH 7,5)/isopropanol 30%, HEPES 100 mM (pH 7,5)/isopropanol 45% e HEPES 100 mM (pH 7,5)/isopropanol 60% foram utilizados como meio de reação, respectivamente, aos quais NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor. Cada mistura de reação foi purificada pelo método descrito no Exemplo 1, seguido pela análise da razão do conjugado Lys27-peguilado. Conforme mostrado na Figura 6, a razão do conjugado Lys27-peguilado foi aumentada até a quantidade de etanol [sic] atingir aproximadamente 50%, enquanto que diminuiu em mais de 50% de etanol [sic], e a quantidade ótima de etanol [sic] foi confirmada em 35% a 60%.

[0053] Exemplo 7: Preparo de conjugado de CA-exendina-4 (Lys27)-PEG e Fc de imunoglobulina

[0054] O conjugado CA-exendina-4 (Lys27)-PEG foi acoplado com um fragmento Fc de imunoglobulina Fc (Hanmi Pharm. Co. Ltd., Coreia), pela reação submetida ao conjugado e o fragmento a 4 °C por 16 horas em razão molar de 1:8, com a concentração de peptídeo de 20 mg/mL. Nesse momento, tampão K-P 100 mM (pH 6,0) foi utilizado como meio de reação, ao qual NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor. Após a reação de acoplamento, a purificação em duas etapas foi realizada, usando as colunas SOURCE Phe e SOURCE Q, sob as seguintes condições: Coluna: SOURCE Phe (XK 16 mL, GE healthcare) Vazão: 2,0 mL/minuto Solução de eluição: A (Tris 20 mM, pH 7,5) e B (A + NaCl 1,5 M); Gradiente A 0^40%, 80 minutos Coluna: SOURCE Q (XK 16 mL, GE healthcare) Vazão: 2.0 mL/minuto Solução de eluição: A (Tris 20 mM, pH 7,5) e B (A + NaCl 1 M); Gradiente A 0^40%, 80 minutos

[0055] O conjugado preparado acima foi analisado pela técnica de SDS- PAGE. Como mostrado na Figura 7, uma única banda com 60 K foi observada em condição não redutora, enquanto duas bandas com 35 K e 25 K foram observadas em condição redutora.

Exemplo 8: Identificação de sítio peguilado de conjugado de CA-exendina-4 (Lys27)-PEG

[0056] Para identificar o sítio de ligação de PEG a CA-exendina-4, os conjugados de CA-exendina-4 (Lys27)-PEG foram digeridos com enzima lisina C protease e analisados por cromatografia reversa.

[0057] Especificamente, isômeros de CA-exendina-4-PEG foram analisados por SDS-PAGE (Figura 8) e, depois, um conjugado de CA-exendina-4-PEG purificado e CA-exendina-4 foram dissolvidos em tampão trietilamina-ácido clorídrico (10 mmol/L; pH 7,5), no qual foram adicionados 10 μL de enzima (0,1 mg/mL), e reagiram a 37 °C por 4 horas. Depois de encerrada a reação, a mistura de reação foi analisada por cromatografia reversa (HPLC (Agilent), Jupiter C18 (Phenomenex)). Os resultados da análise são apresentados nas Figuras 9 e 10. Um isômero de CA-exendina-4 Lys12- peguilado foi confirmado pelo desaparecimento simultâneo do n° 1 e n° 2, como mostrado na Figura 9, e um isômero de CA-exendina-4 Lys27-peguilado foi confirmado pelo desaparecimento simultâneo do n° 2 e n° 3, como mostrado na Figura 10.

Exemplo 9: Identificação de rendimento de peguilação por concentração de isopropanol sobre peguilação em N-terminal

[0058] Para peguilar metóxi-polietilenoglicol 5K ALD (NOF Inc., Japão) ao N- terminal de calcitonina de salmão (Bachem, EUA), calcitonina de salmão e PEG foram submetidos à peguilação, reagindo o peptídeo e o PEG a 4 °C por 1 hora em razão molar de 1:1, com concentração de peptídeo de 1 mg/mL. Nesse momento, tampões de NaAc 100 mM pH 5,2/isopropanol 0% e NaAc 100 mM pH 5,2/isopropanol 45% foram utilizados como meio de reação, respectivamente, aos quais NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor. Um peptídeo mono-peguilado foi purificado de cada mistura de reação, usando coluna SOURCE S (XK 16 mL, GE healthcare, Coreia) sob as condições a seguir. Os resultados são apresentados na Tabela 1 abaixo. Coluna: SOURCE S Vazão: 2.5 mL/minuto Solução de eluição: A (Acetato 20 mM, pH 5.2) e B (A + NaCl 1 M); Gradiente A 0^40%, 60 minutos <Tabela 1>

Como mostrado na Tabela 1, o rendimento de calcitonina peguilada aumentou pela adição de isopropanol.

Exemplo 10: Mensuração de atividade in vitro de exendina-4 por peguilação e sítio peguilado

[0059] A eficácia de um preparado de ação prolongada de exendina-4 por peguilação e sítio de peguilação foi mensurada por um método que media a sua atividade in vitro. A mensuração de atividade in vitro de GLP-1 é um método no qual se mede o aumento ou não de cAMP na célula após tratamento com GLP-1 de linhagens de células CHO nas quais receptores de GLP-1 foram clonados.

[0060] Especificamente, CHO/GLP-1R, uma linhagem celular na qual GLP-1 está clonado, foi tratada com GLP-1, exendina-4 e os materiais em teste descritos na Tabela 1 em concentrações variadas. A ocorrência de cAMP foi medida e, a partir daí, valores de EC50 foram comparados entre si. Como controle, Byetta, disponibilizado comercialmente (Eli Lilly), foi utilizado. As atividades in vitro (%), de acordo com o tratamento de materiais em teste, são apresentadas na Tabela 2. <Tabela 2>

[0061] Como apresentado na Tabela 2, a atividade fisiológica do peptídeo foi relativamente menos afetada quando PEG está modificado em Lys27, comparado a Lys12.

Exemplo 11: Preparo e isolamento de conjugado de oxintomodulina (Lys30) peguilado <11-1> Preparo de conjugado de oxintomodulina (Lys30) peguilado

[0062] Para preparar conjugado de oxintomodulina peguilado, PropionALD(2) PEG de 3,4 K e oxintomodulina (Anygen, Coreia) foram submetidos à peguilação por reação do peptídeo e o PEG a 4°C por 4,5 horas em razão molar de 1:15, com concentração de peptídeo de 3 mg/mL. Nesse momento, tampão Na-Borato 100 mM (pH 9,0), contendo isopropanol 45%, foi utilizado como meio de reação, ao qual NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor.

<11-2> Isolamento de isômero posicionai

[0063] Isômeros posicionais Lys30-peguilados foram purificados a partir da mistura de reação, usando a coluna SOURCE 15S (XK 16 mL, Amersham Bioscience). Nesse processo, etanol foi utilizado na solução de purificação para facilitar o isolamento de isômeros (Figura 11). Coluna: SOURCE S Vazão: 2.0 mL/minuto Solução de eluição: A (Na-citrato 20 mM, pH 3,0 + etanol 45%) e B (A + KCl 1 M); Gradiente A 0^3%. 1 minuto, Gradiente B 0^40%. 222 minutos

Exemplo 12: Preparo e isolamento de conjugado imidazo-acetil oxintomodulina (Lys30) peguilado

[0064] O procedimento do Exemplo 11 foi repetido, exceto pelo uso de imidazo-acetil-oxintomodulina (Anygen, Coreia) em vez de oxintomodulina e o uso de tampão HEPES 100 mM (pH 7.5) contendo isopropanol 45% no Exemplo 11, para obter o conjugado imidazo-acetil oxintomodulina (Lys30) peguilado.

[0065] Isômeros purificados, usando a coluna SOURCE, são apresentados na Figura 12, e o mapeamento peptídico, usando Asp-N protease, é mostrado na Figura 13. Como mostrado na Figura 13, parte de n° 4:Asp(22)-(37) desapareceu por modificação de PEG em Lys30.

Exemplo 13: Preparo de conjugado de imidazo-acetil oxintomodulina (Lys30)- PEG e Fc de imunoglobulina

[0066] O conjugado imidazo-acetil oxintomodulina-PEG (Lys30) e um Fc de imunoglobulina (Hanmi Pharm. Co. Ltd., Coreia) foram submetidos a uma reação a 4 °C por 16 horas em razão molar de 1:10, com concentração de proteína total de 20 mg/mL. Nesse momento, fosfato de potássio 100 mM (pH 6,0) foi utilizado como meio de reação, ao qual NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor. Depois de encerrada a reação, a mistura de reação foi purificada, usando coluna SOURCE 15Q, sob as condições abaixo: Coluna: SOURCE Q Vazão: 2.0 mL/minuto Solução de eluição: A (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5) e B (A + NaCl 1 M); Gradiente A 0^20%, 100 minutos

[0067] O cromatograma, que é obtido por ligação de CA-oxintomodulina Lys30-peguilado com um Fc de imunoglobulina e purificação com coluna SOURCE Q, é apresentado na Figura 14, e os resultados de SDS-PAGE de um conjugado de CA- oxintomodulina (Lys30)-PEG e Fc de imunoglobulina são apresentados na Figura 15. Como mostrado na Figura 15, uma única banda com 60 K foi observada em condição não redutora, e duas bancas com 35 K e 25 K foram observadas em condição redutora.

Exemplo 14: Preparo e isolamento de conjugado de análogo de oxintomodulina (Lys27) peguilado <14-1> Preparo de conjugado de análogo de oxintomodulina (Lys27) peguilado

[0068] Para peguilar PropionALD(2) PEG de 3,4 K a uma lisina de um análogo de oxintomodulina ([20Asp, 24Ala, 28Ser]-oxintomodulina-[Deleção30-37]), o PEG e o análogo de oxintomodulina (Anygen, Coreia) foram submetidos a uma reação a 4 °C por 3,5 horas em razão molar de 1:15, com concentração de peptídeo de 3 mg/mL. Nesse momento, tampão Na-Borato 100 mM (pH 9,0), contendo isopropanol 45%, foi utilizado como meio de reação, ao qual NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor.

<14-2> Isolamento de isômero posicionai

[0069] Isômeros posicionais Lys27-peguilados foram purificados a partir da mistura de reação, usando coluna SOURCE 15S (XK 16 mL, Amersham Bioscience). As condições da purificação e do isolamento são iguais àquelas descritas no Exemplo 11. Nesse processo, etanol foi utilizado na solução de purificação para facilitar o isolamento de isômeros (Figura 16). As seletividades por lisina dos análogos purificados de oxintomodulina mono-peguilada foram confirmadas pelo método de mapeamento peptídico usando Lys-C protease (Figura 17). Como mostrado na Figura 17, parte do n° 2 desapareceu por modificação de PEG em Lys27.

Exemplo 15: Preparo e isolamento de conjugado de análogo de imidazo-acetil oxintomodulina (Lys27) peguilado <15-1> Preparo de conjugado de análogo de imidazo-acetil oxintomodulina (Lys27) peguilado

[0070] Para peguilar PropionALD(2) PEG de 3,4 K à Lys27 de um análogo de imidazo-acetil oxintomodulina ([20Asp, 24Ala, 28Ser])-oxintomodulina-[Deleção30- 37]), o análogo de imidazo-acetil oxintomodulina (Anygen, Coreia) e o PEG foram submetidos a uma reação a 4 °C por 2,5 horas em razão molar de 1:10, com concentração de proteína total de 3 mg/mL. Nesse momento, HEPES 100 mM (pH 7.5), contendo isopropanol 45%, foi utilizado como meio de reação, ao qual NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor.

<15-2> Isolamento de isômero posicionai

[0071] Isômeros posicionais Lys27-peguilados foram purificados a partir da mistura de reação, usando coluna SOURCE 15S (XK 16 mL, Amersham Bioscience). As condições da purificação e do isolamento foram iguais àquelas descritas no Exemplo 11. Nesse processo, etanol foi utilizado na solução de purificação para facilitar o isolamento de isômeros (Figura 18). As seletividades por lisina dos análogos purificados de oxintomodulina mono-peguilada foram confirmadas pelo método de mapeamento peptídico usando Lys-C protease (Figura 19). Como mostrado na Figura 19, parte do n° 2 desapareceu por modificação de PEG em Lys27.

Exemplo 16: Preparo e isolamento de conjugado de análogo de imidazo-acetil oxintomodulina (Lys27) peguilado e Fc de imunoglobulina

[0072] O análogo de imidazo-acetil oxintomodulina Lys27-peguilado-PEG preparado no Exemplo 15 e um Fc de imunoglobulina foram submetidos a uma reação a 4 °C por 16 horas em razão molar de 1:10, com concentração de peptídeo de 20 mg/mL. Nesse momento, fosfato de potássio 100 mM (pH 6,0) foi utilizado como meio de reação, ao qual NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor. Depois de encerrada a reação, a mistura de reação foi purificada usando coluna SOURCE 15Q, sob a seguinte condição: Coluna: SOURCE Q Vazão: 2.0 mL/minuto Solução de eluição: A (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5) e B (A + NaCl 1 M); Gradiente A 0^20%. 100 minutos

[0073] O cromatograma, obtido ligando um análogo de CA-oxintomodulina Lys27-peguilado com um Fc de imunoglobulina e purificando o conjugado com coluna SOURCE Q, é apresentado na Figura 20, e os resultados de SDS-PAGE de um conjugado de análogo de CA-oxintomodulina (Lys27)-PEG e Fc de imunoglobulina são apresentados na Figura 21. Como mostrado na Figura 21, uma única banda com 60 K foi observada em condição não redutora, e duas bandas com 35 K e 25 K foram observadas em condição redutora.

Exemplo 17: Preparo e isolamento de conjugado de GLP-1 (Lys34) peguilado <17-1> Preparo de conjugado de GLP-1 (Lys34) peguilado

[0074] Para peguilar PropionALD(2) PEG de 3,4 K ao resíduo de lisina de um GLP-1, o GLP-1 e o PEG foram submetidos a uma reação a 4 °C por 3,5 horas em razão molar de 1:15, com concentração de proteína total de 3 mg/mL. Nesse momento, Na-Borato 100 mM (pH 9,0), contendo isopropanol 45%, foi utilizado como meio de reação, ao qual NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor.

<17-2> Isolamento de isômero posicionai

[0075] Isômeros posicionais Lys34-peguilados foram purificados a partir da mistura de reação, usando coluna SOURCE 15S (XK 16 mL, Amersham Bioscience). Nesse processo, etanol foi utilizado na solução de purificação para facilitar o isolamento de isômeros (Figura 22). As seletividades por lisina dos análogos purificados de oxintomodulina mono-peguilado foram confirmadas pelo método de mapeamento peptídico usando Lys-C protease (Figura 23). Coluna: SOURCE S Vazão: 2.0 mL/minuto Solução de eluição: A (Na-citrato 20 mM, pH 3,0 + etanol 45%) e B (A + KCl 1 M); Gradiente A 0^3%. 1 minuto, Gradiente B 3^40%. 150 minutos Como mostrado na Figura 23, parte do n° 2 desapareceu por modificação de PEG em Lys34.

Exemplo 18: Preparo e isolamento de conjugado de imidazo-acetil GLP-1 (Lys34) peguilado <18-1> Preparo de conjugado imidazo-acetil GLP-1 (Lys34) peguilado

[0076] Para peguilar PropionALD(2) PEG de 3,4 K ao resíduo de lisina de imidazo-acetil GLP-1, o imidazo-acetil GLP-1 e o PEG foram submetidos a uma reação a 4 °C por 4 horas em razão molar de 1:10, com concentração de proteína total de 3 mg/mL. Nesse momento, HEPES 100 mM (pH 7,5), contendo isopropanol 45%, foi utilizado como meio de reação, ao qual NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor.

<18-2> Isolamento de isômero posicionai

[0077] Isômeros posicionais Lys34-peguilados foram purificados a partir da mistura de reação, usando coluna SOURCE 15S (XK 16 mL, Amersham Bioscience). Nesse processo, etanol foi utilizado na solução de purificação para facilitar o isolamento de isômeros (Figura 24). As seletividades por lisina dos análogos purificados de oxintomodulina mono-peguilada foram confirmadas pelo método de mapeamento peptídico usando Glu-C protease (Figura 25). Coluna: SOURCE S Vazão: 2.0 mL/minuto Solução de eluição: A (Na-citrato 20 mM, pH 3,0 + etanol 45%) e B (A + KCl 1 M); Gradiente A 0^3%. 1 minuto, Gradiente B 3^40%. 150 minutos Como mostrado na Figura 25, parte do n° 4 desapareceu por modificação de PEG em Lys34.

Exemplo 19: Preparo e isolamento de conjugado de imidazo-acetil GLP-1 (Lys34) peguilado e Fc de imunoglobulina

[0078] O imidazo-acetil GLP-1-PEG Lys34 peguilado preparado no Exemplo 18 e um Fc de imunoglobulina Fc foram submetidos a uma reação a 4 °C por 17 horas em razão molar de 1:8, com concentração de peptídeo de 50 mg/mL. Nesse momento, fosfato de potássio 100 mM (pH 6,0) foi utilizado como meio de reação, ao qual NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor. Depois de encerrada a reação, a mistura de reação foi purificada, usando coluna SOURCE Phe, sob a seguinte condição: Coluna: SOURCE Phe Vazão: 2.0 mL/minuto Solução de eluição: A (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5) e B (A + NaCl 2 M); Gradiente A 100^0%, 100 minutos

[0079] O cromatograma, obtido ligando um isômero de CA-GLP-1 Lys34 peguilado com Fc de imunoglobulina e purificando o conjugado usando coluna SOURCE Phe, é mostrado na Figura 26, e os resultados de SDS-PAGE de um conjugado de CA-GLP-1 (Lys34)-PEG e Fc de imunoglobulina são mostrados na Figura 27. Como mostrado na Figura 27, uma única banda com 60 K foi observada em condição não redutora, e duas bandas com 35 K e 25 K foram observadas em condição redutora.

Exemplo 20: Preparo e isolamento de conjugado de GLP-2 (Lys30) peguilado <20-1> Preparo de conjugado de GLP-2 (Lys30) peguilado

[0080] Para peguilar PropionALD(2) PEG de 3,4 k ao resíduo de lisina de um GLP-2 (Anygen, Coreia), o GLP-2 e o PEG foram submetidos a uma reação a 4 °C por 3 horas em razão molar de 1:12, com concentração de proteína total de 5 mg/mL. Nesse momento, Na-Borato 100 mM (pH 9,0), contendo isopropanol 45%, foi utilizado como meio de reação, ao qual NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor.

<20-2> Isolamento de isômero posicional

[0081] Isômeros posicionais Lys30-peguilados foram purificados a partir da mistura de reação, usando coluna SOURCE 15S (XK 16 mL, Amersham Bioscience). Nesse processo, etanol foi utilizado na solução de purificação para facilitar o isolamento de isômeros (Figura 28). As seletividades por lisina foram confirmadas pelo método de mapeamento peptídico usando tripsina protease (Figura 29). Coluna: SOURCE S Vazão: 2.0 mL/minuto Solução de eluição: A (Na-citrato 20 mM, pH 3,0 + etanol 45%) e B (A + KCl 1 M); Gradiente A 0^3%, 1 minuto, Gradiente B 3^40%, 150 minutos Como mostrado na Figura 29, parte do n° 2 desapareceu por modificação de PEG em Lys30.

Exemplo 21: Preparo e isolamento de conjugado de imidazo-acetil GLP-2 (Lys30) peguilado <21-1> Preparo de conjugado de imidazo-acetil GLP-2 (Lys30) peguilado

[0082] Para peguilar PropionALD(2) PEG de 3,4 K ao resíduo Lisina30 de um imidazo-acetil GLP-2 (Anygen, Coreia), o imidazo-acetil GLP-2 e o PEG foram submetidos a uma reação a 4 °C por 6 horas em razão molar de 1:20, com concentração de proteína total de 3 mg/mL. Nesse momento, HEPES 100 mM (pH 7,5), contendo isopropanol 45%, foi utilizado como meio de reação, ao qual NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor.

<21-2> Isolamento de isômero posicional

[0083] Isômeros posicionais Lys30-peguilados foram purificados a partir da mistura de reação, usando coluna SOURCE 15S (XK 16 mL, Amersham Bioscience). Nesse processo, etanol foi utilizado na solução de purificação para facilitar o isolamento de isômeros (Figura 30). Coluna: SOURCE S Vazão: 2.0 mL/minuto Solução de eluição: A (Na-citrato 20 mM, pH 3,0 + etanol 45%) e B (A + KCl 1 M); Gradiente A 0^3%, 1 minuto, Gradiente B 3^40%, 150 minutos

Exemplo 22: Preparo e isolamento de conjugado de imidazo-acetil GLP-2 (Lys30) peguilado e Fc de imunoglobulina

[0084] O imidazo-acetil GLP-2-PEG Lys30 peguilado preparado no Exemplo 21 e um Fc de imunoglobulina foram submetidos a uma reação a 4 °C por 16 horas em razão molar de 1:15, com concentração de peptídeo de 20 mg/mL. Nesse momento, fosfato de potássio 100 mM (pH 6.0) foi utilizado como meio de reação, ao qual NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor. Depois de encerrada a reação, a mistura de reação foi purificada, usando coluna SOURCE Phe sob a condição abaixo: Coluna: SOURCE Phe Vazão: 2.0 mL/minuto Solução de eluição: A (Tris-Cl 20 mM, pH 7,5) e B (A + NaCl 2 M); Gradiente A 100^0%, 100 minutos

[0085] O cromatograma, obtido ligando um isômero de CA-GLP-2 Lys30- peguilado com Fc de imunoglobulina e purificando o conjugado usando coluna SOURCE Phe, é mostrado na Figura 31, e os resultados de SDS-PAGE de um conjugado de CA-GLP-2 (Lys30)-PEG e Fc de imunoglobulina Fc são apresentados na Figura 32. Como mostrado na Figura 32, uma única banda de 60 K foi observada em condição não redutora, e duas bandas com 35 k e 25 K foram observadas em condição redutora.

Exemplo 23: Preparo e isolamento de conjugado de insulina humana (B1Phe) peguilada <23-1> Preparo de conjugado de insulina humana (BIPhe) peguilada

[0086] Para peguilar PropionALD(1) metoxiPEG (PEG tendo um grupo propionaldeído, NOF., Japão) de 5 K a um N-terminal de fenilalanina, que é o primeiro aminoácido da cadeia B em insulina humana (Sigma), o PEG e a insulina humana foram submetidos a uma reação a 4 °C por 12 horas em razão molar de 1:2, com concentração de peptídeo de 2,3 mg/mL. Nesse momento, tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 6,0) foi utilizado como meio de reação, ao qual NaCNBH3 20 mM foi adicionado como agente redutor.

<23-2> Isolamento de isômero posicional

[0087] Isômeros posicionais foram purificados a partir da mistura de reação, usando coluna SOURCE 15S (XK 16 mL, Amersham Bioscience). Nesse processo, etanol foi utilizado na solução de purificação para facilitar o isolamento de isômeros (Figura 33). As mono-peguilações de picos eluídos foram confirmadas por análise de SDS-PAGE, e as seletividades por lisina foram confirmadas pelo método de mapeamento peptídico usando Glu-C protease (Figura 36). Coluna: SOURCE S Vazão: 2.0 mL/minuto Solução de eluição: A (Na-citrato 20 mM, pH 2,0 + etanol 60%) e B (A + KCl 0,5 M); Gradiente A 0^3%, 1 minuto, Gradiente B 0^50%, 80 minutos Como mostrado na Figura 36, parte do n° 2 desapareceu por modificação de PEG em B1F.

Exemplo 24: Preparo e isolamento de conjugado de insulina humana (A1Gly) peguilada <24-1> Preparo de conjugado de insulina humana (AIGly) peguilada

[0088] Para peguilar metoxiPEG-Succinimidil Butanoato (1) (PEG tendo um grupo SBA reativo, NOF., Japão) de 5 K a um N-terminal de glicina que é o primeiro aminoácido da cadeia A em insulina humana (Sigma), o PEG e a insulina humana foram submetidos a uma reação a 25 °C por 3 horas em razão molar de 1:4, com concentração de peptídeo de 2 mg/mL. Nesse momento, tampão Na-Borato 100 mM (pH 9,0), contendo isopropanol 35%, foi utilizado como meio de reação.

<24-2> Isolamento de isômero posicional

[0089] Isômeros posicionais foram purificados a partir da mistura de reação, usando coluna SOURCE 15S (XK 16 mL, Amersham Bioscience). O procedimento de purificação foi igual ao descrito no Exemplo 23. Nesse processo, etanol foi utilizado na solução de purificação para facilitar o isolamento de isômeros (Figura 34). As mono-peguilações de picos eluídos foram confirmadas por análise de SDS-PAGE, e as seletividades por lisina foram confirmadas pelo método de mapeamento peptídico usando Glu-C protease (Figura 36). Como mostrado na Figura 36, parte do n° 1 desapareceu por modificação de PEG em A1G.

Exemplo 25: Preparo e isolamento de conjugado de insulina humana (B29Lys) peguilada <25-1> Preparo de conjugado de insulina humana (B29Lys) peguilada

[0090] Para peguilar metoxiPEG-Succinimidil Butanoato (1) de 5 K a um resíduo de lisina que é o 29° aminoácido da cadeia B em insulina humana (Sigma), o PEG e a insulina humana foram submetidos a uma reação a 25 °C por 1 hora em razão molar de 1:2, com concentração de peptídeo de 2 mg/mL. Nesse momento, tampão Na-Borato 100 mM (pH 9,0), contendo isopropanol 45%, foi utilizado como meio de reação.

<25-2> Isolamento de isômero posicional

[0091] Isômeros posicionais foram purificados a partir da mistura de reação, usando coluna SOURCE 15S (XK 16 mL, Amersham Bioscience). O procedimento de purificação foi igual àquele descrito no Exemplo 23. Nesse processo, etanol foi utilizado na solução de purificação para facilitar o isolamento de isômeros (Figura 35). As mono-peguilações de picos eluídos foram confirmadas por análise de SDS-PAGE, e as seletividades por lisina foram confirmadas pelo método de mapeamento peptídico usando Glu-C protease (Figura 36).

[0092] Como mostrado na Figura 36, parte do n° 4 desapareceu por modificação de PEG em B29K.

[0093] Embora a invenção tenha sido descrita com respeito às modalidades específicas acima, deve ser reconhecido que várias modificações e alterações à invenção podem ser efetuadas por aqueles versados no estado da técnica, as quais serão abrangidas também pelo âmbito da invenção como definido pelas reivindicações anexadas.

Claims

1. Método para preparar um conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo em sítio específico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: i) tratar um polipeptídeo fisiologicamente ativo com um polímero não-peptidil em um meio de reação que contém uma quantidade específica de um álcool e possui um pH específico para permitir que o polímero não-peptidil se ligue a um sítio alvo do polipeptídeo fisiologicamente ativo; e ii) isolar e purificar o conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo a partir da mistura de reação da etapa i) por cromatografia de troca iônica usando um álcool, em que o polipeptídeo fisiologicamente ativo é uma exendina, insulina, oxintomodulina, GLP-1, GLP-2, grelina, calcitonina ou um derivado dos mesmos tendo qualquer estrutura selecionada a partir das Fórmulas (I) a (IV):

em que o álcool é etanol ou isopropanol; em que o álcool está presente no meio de reação em quantidade de 25% a 90% em volume, com base no volume total do meio de reação; em que o pH empregado na etapa i) é de 7,0 a 10,0, quando o polipeptídeo fisiologicamente ativo é uma exendina, oxintomodulina, GLP-1, GLP-2 ou um derivado dos mesmos; e em que o pH usado na etapa i) é de 4,0 a 10,0, quando o polipeptídeo fisiologicamente ativo é uma insulina humana ou um derivado da mesma.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero não-peptidil é polietilenoglicol.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o álcool está presente no meio de reação, em quantidade de 35% a 60% em volume, com base no volume total do meio de reação.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo em sítio específico é um conjugado de exendina-4 no qual PEG está ligado a Lys27, um conjugado de calcitonina no qual PEG está ligado ao N-terminal, um conjugado de oxintomodulina no qual PEG está ligado a Lys27 ou Lys30, conjugado de insulina humana no qual PEG está ligado ao N-terminal de Gly1 na cadeia A ou está ligado a Lys29 na cadeia B, um conjugado de GLP-1 ou GLP-2 no qual PEG está ligado a Lys34 ou Lys30.