CN103804483A - Orexin-A聚乙二醇化修饰物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过orexin-A的N末端氨基共价键与聚乙二醇相连接的orexin-A聚乙二醇化修饰物，其制备方法为：将摩尔比为1:5-1:50的orexin-A与单甲氧基聚乙二醇丙醛或单氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂在pH为4-9、温度为4-37℃条件下反应0.5-24小时后，加入小分子氨基酸终止反应；将第一步骤得到的反应产物经过SepHadex G-50色谱柱除盐，将除盐后收集的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。所述的修饰物稳定性好，半衰期长，毒副作用小。

Description

Orexin-A聚乙二醇化修饰物及其制备方法
技术领域
本发明涉及用聚乙二醇修饰orexin-A的修饰产物及其制备方法，属于医药化学领域。
背景技术
蛋白质和多肽类药物聚乙二醇(PEG)化技术是指利用聚乙二醇衍生物对蛋白和多肽类药物进行化学修饰的一项热门技术。随着现代基因工程手段的使用，人们能够大量获取所需的蛋白质，但由于天然或重组的未经任何修饰的蛋白质类药物易引起免疫反应，以及其在体内半衰期较短等原因而减弱了临床效果，也大大限制了它们的使用。相比之下，部分聚乙二醇修饰的蛋白质包括聚乙二醇与蛋白质和多肽类药物的物理结合物和化学修饰物，可改变蛋白质药物的一些性质，如：                                                增加此类药物的溶解度和稳定性。减少或消除免疫原性，抗原性和毒性。改善药物体内的药动学性质，增加药物在体内的半衰期。
Figure 43103DEST_PATH_IMAGE004
增加药物的治疗指数，扩大临床使用等。因此，近年来有越来越多的聚乙二醇修饰化蛋白药物上市或者进入临床。例如Enzon公司开发的治疗免疫缺陷性疾病的腺苷脱胺酶，治疗白血病、恶性黑色素瘤的PEG化天冬酰胺酶、PEG化干扰素α-2b，罗氏的PEG化干扰素α-2b等。
Orexin-A是存在于下丘脑的一种神经多肽，参与调节饮食，睡眠-觉醒周期、生殖、体温、血压、激素分泌和感觉等生理功能，研究发现orexin-A具有促觉醒和抗脑缺血损伤的作用。然而，orexin-A很不稳定，已报道的体内半衰期只有半小时左右，这大大限制了orexin-A的开发应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定性好，体内半衰期长和安全性好的orexin-A修饰物，以克服orexin-A的上述不足，其修饰后产物对原有蛋白活性影响较小，未改变原有蛋白的功能；
本发明另一目的在于提供上述修饰物的制备方法，其产物均一性好、分离纯化简单。
本发明实现过程如下：
为实现上述目的，本发明提供一种orexin-A的聚乙二醇化修饰物，所述修饰物是由orexin-A的N末端氨键以共价键与聚乙二醇分子相连接。具体来说，与orexin-A的N末端氨键相连接的聚乙二醇为烷基化或酰基化的单甲氧基聚乙二醇。烷基化或酰基化的聚乙二醇常用于蛋白质氨基的修饰，而单甲氧基聚乙二醇分子一端的羟基被甲氧基封闭，只有一端可以与orexin-A连接，不会产生多个orexin-A交联的形式，从而防止了多个orexin-A交联凝聚而变性。
上述聚乙二醇的分子量介于4000-30000Da，优选为5000、10000、15000或20000 Da；
烷基化或酰基化的单甲氧基聚乙二醇分子优选为单甲氧基聚乙二醇丙醛或单氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂。
本发明提供上述结构的orexin-A修饰物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将摩尔比为1:5-1:50的orexin-A与单甲氧基聚乙二醇丙醛或单氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂在pH为4-9、温度为4-37℃条件下反应0.5-24小时后，加入小分子氨基酸终止反应;
（2）将步骤（1）的反应产物经过SepHadex G-50色谱柱除盐，将除盐后收集的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱,用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰, 浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
 上述反应条件优选为：摩尔比1:10-1:30，pH为6-8， 温度为20-25℃，反应时间为4-6小时。
本发明制备的orexin-A聚乙二醇化修饰物可用于制备治疗促觉醒和抗脑缺血损伤药物。
本发明制备得到的orexin-A聚乙二醇化修饰物保留原有蛋白活性，未改变原有蛋白的功能，产物均一性好，分离纯化简单。
具体实施方式
本发明实施例所用原材料除单氧聚乙二醇丙醛和单氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂购自美国Shearwater公司外，其余均为常规试剂，以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：
（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的PB缓冲液（10mM，pH=6），然后按摩尔比为1:10的比例加入单氧聚乙二醇丙醛（分子量：5000Da）并混匀，放置于25℃条件下反应6小时后终止反应；
（2）将步骤（1）的反应液，过SepHadex G-25柱除盐，将除盐后收集到的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
实施例2
orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：
（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的PB缓冲液（10mM,pH=7），然后按摩尔比为1:20的比例加入单氧聚乙二醇丙醛（分子量：5000Da）并混匀，放置于25℃条件下反应5小时后终止反应；
（2）将步骤（1）的反应液，过SepHadex G-25柱除盐，将除盐后收集到的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
实施例3
orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：
（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的磷酸盐缓冲液（10mM,PH=8），然后按摩尔比为1:30的比例加入单氧聚乙二醇丙醛（分子量：5000Da）并混匀，在25℃条件下避光反应4小时后终止反应；
（2）将步骤（1）的反应液，过SepHadex G-25柱除盐，将除盐后收集到的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用10 mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
实施例4
orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：
（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的PB缓冲液（10mM,pH=6），然后按摩尔比为1:10的比例加入单氧聚乙二醇丙醛（分子量：10000Da）并混匀，在25℃条件下避光反应6小时后终止反应；
（2）将步骤（1）的反应液，过SepHadex G-25柱除盐，将除盐后收集到的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
实施例5
orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：
（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的PB缓冲液（10mM,pH=7），然后按摩尔比为1:20的比例加入单氧聚乙二醇丙醛（分子量：10000Da）并混匀，在25℃条件下避光反应5小时后终止反应；
（2）将步骤（1）的反应液，过SepHadex G-25柱除盐，将除盐后收集到的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用含用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
实施例6
orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：
（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的PB缓冲液（10mM,pH=8），然后按摩尔比为1:30的比例加入单氧聚乙二醇丙醛（分子量：10000Da）并混匀，在25℃条件下避光反应4小时后终止反应；
（2）将步骤（1）的反应液，过SepHadex G-25柱除盐，将除盐后收集到的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
实施例7
orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：
（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的PB缓冲液（10mM,pH=6），然后按摩尔比为1:10的比例加入单氧聚乙二醇丙醛（分子量：20000Da）并混匀，在25℃条件下避光反应6小时后终止反应；
（2）将步骤（1）的反应液，过SepHadex G-25柱除盐，将除盐后收集到的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
实施例8
orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：
（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的PB缓冲液（10mM,PH=7），然后按摩尔比为1:20的比例加入单氧聚乙二醇丙醛（分子量：20000Da）并混匀，在25℃条件下避光反应5小时后终止反应；
（2）将步骤（1）的反应液，过SepHadex G-25柱除盐，将除盐后收集到的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
实施例9
orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：
（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的PB缓冲液（10mM,pH=8），然后按摩尔比为1:30的比例加入单氧聚乙二醇丙醛（分子量：20000Da）并混匀，在25℃条件下避光反应4小时后终止反应；
（2）将步骤（1）的反应液，过SepHadex G-25柱除盐，将除盐后收集到的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
实施例10
orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：
（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的PB缓冲液（10mM，pH=6），然后按摩尔比为1:10的比例加入单氧聚乙二醇琥珀亚酰胺碳酸脂（分子量：10000Da）并混匀，在20℃条件下避光反应6小时后终止反应；
（2）将步骤（1）的反应液，过SepHadex G-25柱除盐，将除盐后收集到的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
实施例11
orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：
（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的PB缓冲液（10mM，pH=7），然后按摩尔比为1:20的比例加入单氧聚乙二醇琥珀亚酰胺碳酸脂（分子量：10000Da）并混匀，在20℃条件下避光反应5小时后终止反应；
（2）将步骤（1）的反应液，过SepHadex G-25柱除盐，将除盐后收集到的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
实施例12
orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：
（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的PB缓冲液（10mM，pH=8），然后按摩尔比为1:30的比例加入单氧聚乙二醇琥珀亚酰胺碳酸脂（分子量：10000Da）并混匀，在20℃条件下避光反应4小时后终止反应；
（2）将步骤（1）的反应液，过SepHadex G-25柱除盐，将除盐后收集到的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
实施例13  orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：
（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的PB缓冲液（10mM，pH=6），然后按摩尔比为1:10的比例加入单氧聚乙二醇琥珀亚酰胺碳酸脂（分子量：20000Da）并混匀，在20℃条件下避光反应6小时后终止反应；
（2）将步骤（1）的反应液，过SepHadex G-25柱除盐，将除盐后收集到的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
实施例14  orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：
（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的PB缓冲液（10mM，pH=7），然后按摩尔比为1:20的比例加入单氧聚乙二醇琥珀亚酰胺碳酸脂（分子量：20000Da）并混匀，在20℃条件下避光反应5小时后终止反应；
（2）将步骤（1）的反应液，过SepHadex G-25柱除盐，将除盐后收集到的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
实施例15  orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：
（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的PB缓冲液（10mM，pH=8），然后按摩尔比为1:30的比例加入单氧聚乙二醇琥珀亚酰胺碳酸脂（分子量：20000Da）并混匀，在20℃条件下避光反应4小时后终止反应；
（2）将步骤（1）的反应液，过SepHadex G-25柱除盐，将除盐后收集到的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱，用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰，浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
测试例1  orexin-A聚乙二醇化修饰物的纯化
随机选取实施例1-15制备的样品3例，采用DIONEX P680高效液相色谱仪分析，色谱柱（C4、5μm、4.6*250mm），色谱条件为：流动相，A相：0.1%TFA  B相：100%乙腈。检测波长：215nm；柱温：35℃；流速：1.000mL/min。样品纯度检测结果如表1。
Figure 857475DEST_PATH_IMAGE005
测试例2  orexin-A聚乙二醇化修饰物的稳定性测定
将测试1所选的样品，分别在10℃条件下保存3个月、6个月、9个月、12个月，经高效液相色谱检测各样品含量的变化，HPLC检测条件同测试例1。
稳定性测定结果表明orexin-A聚乙二醇化修饰后较稳定，结果见表2。
表2  稳定性考察结果
测试例3  orexin-A聚乙二醇化修饰前后的药代动力学参数变化
   雄性SD大鼠，体重300~320kg，随机分为2组： OXA组（10μmol/kg的未修饰的orexin-A），PEG-OXA（10μmol/kg聚乙二醇修饰后的orexin-A），每组6只。水合氯醛腹腔注射将大鼠麻醉，于颈静脉给予相应剂量的药物，分别于给药后5min、10min、20min、40min、60min、90min、120min、180min从股动脉采集血液0.6ml。将收集的血液4℃，3000r/min离心15min，取上清，-80℃保存待用。采用orexin-A放射免疫试剂盒（PK-003-30，PHoenix PHarmacenticals, Belmont, USA）测定各组大鼠不同时间点的orexin-A浓度，使用DAS软件计算药代动力学参数。
 实验结果表明，orexin-A聚乙二醇化修饰后药物的半衰期明显延长，与修饰前比较差异具有显著性，结果如表3.
Figure 822337DEST_PATH_IMAGE007
测试例4  orexin-A聚乙二醇化修饰物的急性毒性评价
      昆明小鼠，体重17~22g，分为5组，分别为对照组、0.5mg/kg、0.9mg/kg、1.6mg/kg、2.8mg/kg剂量的PEG-OXA组，每组10只（雌雄各半）。通过尾静脉给予动物0.5ml的PEG-OXA或生理盐水，即可观察动物反应情况，并继续观察7天，记录动物毒性反应情况和死亡情况。
实验结果表明，小鼠对不同剂量的PEG-OXA均有较强的耐受性，未见明显异常，结果见表4。
 
Figure 21237DEST_PATH_IMAGE008

Claims (10)

1.一种orexin-A聚乙二醇化修饰物，其特征在于：orexin-A的N末端氨基以共价键与聚乙二醇连接。
2.根据权利要求1所述的orexin-A聚乙二醇化修饰物，其特征在于：每个orexin-A分子通过N末端共价键连接一个聚乙二醇分子。
3.根据权利要求1所述的orexin-A聚乙二醇化修饰物，其特征在于：所述的聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇，其分子量为4000-30000Da。
4.根据权利要求3所述的orexin-A聚乙二醇化修饰物，其特征在于：与orexin-A的N末端氨键相连接的分子为烷基化或酰基化的单甲氧基聚乙二醇。
5.根据权利要求4所述的orexin-A聚乙二醇化修饰物，其特征在于：与orexin-A的N末端氨键相连接的分子为单甲氧基聚乙二醇醛或单氧基聚乙二醇琥珀亚酰胺脂。
6.根据权利要求5所述的orexin-A聚乙二醇化修饰物，其特征在于：与orexin-A的N末端氨键相连接的分子为单甲氧基聚乙二醇丙醛或单氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂。
7.根据权利要求1至5任意之一所述的orexin-A聚乙二醇化修饰物，其特征在于：与orexin-A的N末端氨键相连接的聚乙二醇分子量为5000、10000、15000或20000 Da。
8.权利要求6所述的orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将摩尔比为1:5-1:50的orexin-A与单甲氧基聚乙二醇丙醛或单氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂在pH为4-9、温度为4-37℃条件下反应0.5-24小时后，加入小分子氨基酸终止反应；
（2）将步骤（1）的反应产物经过Sephadex G-50色谱柱除盐，将除盐后收集的蛋白上样于QAE-Sephadex A-50阴离子交换柱,用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰, 浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。
9.根据权利要求8所述的orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，将摩尔比为1:10-1:30的orexin-A与单甲氧基聚乙二醇丙醛或单氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂在pH为6-8、温度为20-25℃条件下反应4-6小时后，加入小分子氨基酸终止反应。
10.权利要求1所述的orexin-A聚乙二醇化修饰物在制备治疗促觉醒和抗脑缺血损伤药物中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106589102A (zh) * 2016-11-30 2017-04-26 青岛大学 Orexin‑A聚乙二醇化修饰物制备及用途
WO2023051801A1 (zh) * 2021-09-30 2023-04-06 康立泰生物医药(青岛)有限公司 聚乙二醇衍生物修饰的白介素12及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001004287A1 (en) * 1999-07-07 2001-01-18 Maxygen Aps A method for preparing modified polypeptides
CN102188381A (zh) * 2011-04-27 2011-09-21 中国人民解放军第四军医大学 orexin-A载药脂质体的制备方法及用于治疗发作性睡眠的药剂
CN102369209A (zh) * 2009-03-20 2012-03-07 韩美控股株式会社 制备特异性位点生理活性多肽结合物的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001004287A1 (en) * 1999-07-07 2001-01-18 Maxygen Aps A method for preparing modified polypeptides
CN102369209A (zh) * 2009-03-20 2012-03-07 韩美控股株式会社 制备特异性位点生理活性多肽结合物的方法
CN102188381A (zh) * 2011-04-27 2011-09-21 中国人民解放军第四军医大学 orexin-A载药脂质体的制备方法及用于治疗发作性睡眠的药剂

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张丽娜: "Oresin-A能神经***调节丙泊酚麻醉-觉醒过程的作用研究", 《第四军医大学硕士学位论文》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106589102A (zh) * 2016-11-30 2017-04-26 青岛大学 Orexin‑A聚乙二醇化修饰物制备及用途
WO2023051801A1 (zh) * 2021-09-30 2023-04-06 康立泰生物医药(青岛)有限公司 聚乙二醇衍生物修饰的白介素12及其制备方法和应用

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