ES2569907T3 - Composiciones adyuvantes novedosas - Google Patents

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ES2569907T3 ES09769768.4T ES09769768T ES2569907T3 ES 2569907 T3 ES2569907 T3 ES 2569907T3 ES 09769768 T ES09769768 T ES 09769768T ES 2569907 T3 ES2569907 T3 ES 2569907T3
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Paul Joseph Dominowski
Richard Lee Krebs
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Mary Kathryn Olsen
James Richard Thompson
Risini Dhammika Weeratna
Robert John Yancey, Jr.
Shucheng Zhang
Sangita Mediratta
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Abstract

Una composición inmunógena que comprende una formulación adyuvante y una cantidad inmunológicamente eficaz de un componente antigénico, en la que la formulación adyuvante comprende una saponina, un esterol, un compuesto de amonio cuaternario, un poli(ácido acrílico) y un glucolípido.

Description

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“Complejo inmunoestimulador” o ISCOM se refiere a una estructura específica que se forma cuando Quil A se combina con colesterol y fosfolípidos.
“Molécula inmunoestimuladora” se refiere a una molécula que genera una respuesta inmunitaria.
“Lípidos” se refiere a cualquiera de un grupo de compuestos orgánicos, que incluyen las grasas, aceites, ceras, esteroles y triglicéridos que son insolubles en agua pero son solubles en disolventes orgánicos no polares, son oleosos al tacto y junto con los carbohidratos y las proteínas constituyen el material estructural principal de las células vivas.
“Lipófilo” quiere decir que muestra una marcada atracción a, o solubilidad en, los lípidos.
“Liposoma” se refiere a una partícula esférica microscópica formada por una bicapa lipídica que incluye un compartimiento acuoso, que se usa en medicina para portar un fármaco, antígeno, vacuna, enzima, u otra sustancia a células diana del cuerpo.
“Agente medicinal” se refiere a cualquier agente que es útil en la prevención, cura, o mejora de una enfermedad, o en la prevención de alguna afección o suceso fisiológico.
“Administración parenteral” se refiere a la introducción de una sustancia, como por ejemplo una vacuna, en el cuerpo de un sujeto a través o mediante una vía que no incluye el tubo digestivo. La administración parenteral incluye administración subcutánea, intramuscular, transcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intraocular e intravenosa.
“Farmacéuticamente aceptable” se refiere a sustancias, que según el criterio médico informado, son adecuadas para usar en contacto con los tejidos de sujetos sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares, que se corresponde con una relación razonable entre beneficio y riesgo y eficaz para el uso que se pretenda.
“Capacidad reactógena” se refiere a los efectos secundarios provocados en un sujeto como respuesta a la administración de un adyuvante, un inmunógeno, o una composición de vacuna. Puede ocurrir en el sitio de administración y habitualmente se evalúa en términos de desarrollo de un número de síntomas. Estos síntomas pueden incluir inflamación, enrojecimiento y abceso. También se evalúa en términos de ocurrencia, duración y gravedad. Una reacción “baja”, por ejemplo, supondría inflamación que solo puede detectarse por palpitación y no a simple vista o que sería de duración corta. Una reacción más grave sería, por ejemplo, una que sea visible a simple vista o que sea de mayor duración.
“Temperatura ambiente” quiere decir una temperatura de 18 a 25 ºC.
“Saponina” se refiere a un grupo de glucósidos tensioactivos de origen vegetal compuestos por una región hidrófila (habitualmente de varias cadenas de azúcares) asociada a una región hidrófoba bien de estructura esteroide o bien de estructura triterpenoide.
“Esteroides” se refiere a cualquiera de un grupo de compuestos orgánicos que pertenecen a una clase bioquímica de lípidos, que son fácilmente solubles en disolventes orgánicos y ligeramente solubles en agua. Los esteroides comprenden un sistema de cuatro anillos condensados de tres anillos de ciclohexano (de seis carbonos) condensados más un cuarto anillo de ciclopentano (cinco carbonos).
“Esteroles” se refiere a compuestos en animales que se producen biológicamente a partir de precursores de terpenoides. Comprenden una estructura de anillos de esteroides, que tienen un grupo hidroxilo (OH), habitualmente unido al carbono-3. La cadena de hidrocarburo del sustituyente de ácidos grasos varía en longitud, habitualmente de 16 a 20 átomos de carbono y puede ser saturada o insaturada. Los esteroles habitualmente contienen uno o más enlaces dobles en la estructura de anillos y también una variedad de sustituyentes unidos a los anillos. Los esteroles y sus ésteres de ácidos grasos son esencialmente insolubles en agua.
“Sujeto” se refiere a cualquier animal para el que se desee la administración de una composición adyuvante. Incluye mamíferos y no mamíferos, que incluyen primates, ganado, animales de compañía, animales de laboratorio, animales salvajes cautivos, aves (incluidos los huevos), reptiles y peces. Así, este término incluye pero sin limitación monos, seres humanos, cerdos, ganado vacuno, ovejas, cabras, equinos, ratones, ratas, cobayas, hámsters, conejos, felinos, cánidos, pollos, pavos, patos, otras aves de corral, ranas y lagartijas.
“DOCT50” se refiere a “dosis de infección de cultivo tisular” y se define como aquella dilución de un virus necesaria para infectar el 50 % de un lote dado de cultivos celulares inoculados. Pueden usarse diversos procedimientos para calcular la DOCT50, incluyendo el procedimiento de Spearman-Karber que se utiliza en toda esta memoria descriptiva. Para una descripción del procedimiento de Spearman-Karber, Véase B.W. Mahy & H.O. Kangro, Virology Methods Manual, páginas 25-46 (1996).
“Cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un antígeno o vacuna que induciría una respuesta inmunitaria en un sujeto que recibe el antígeno o vacuna que es adecuada para evitar o reducir los signos o síntomas de enfermedad, que incluyen efectos adversos sobre la salud o sus complicaciones, provocadas por la
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aproximadamente 1 g a aproximadamente 4 mg por dosis, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 3 mg por dosis, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 2 mg por dosis y de aproximadamente 1 g a aproximadamente 1 mg por dosis. También se usan en una cantidad de aproximadamente 5 g a aproximadamente 750 g por dosis, de aproximadamente 5 g a aproximadamente 500 g por dosis, de aproximadamente 5 g a aproximadamente 200 g por dosis, de aproximadamente 5 g a aproximadamente 100 g por dosis, de 10 g a aproximadamente 100 g por dosis, de aproximadamente 15 g a aproximadamente 100 g por dosis y en una cantidad de aproximadamente 30 g a aproximadamente 75 g por dosis.
Esteroles
Los esteroles adecuados para usar en las composiciones adyuvantes incluyen β-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. Estos esteroles son notorios en la técnica y pueden comprarse comercialmente. Por ejemplo el colesterol se describe en The Merck Index, 12ª Ed., página 369. La cantidad de esteroles adecuada para usar en las composiciones adyuvantes depende de la naturaleza del esterol que se use. Sin embargo, generalmente se usan en una cantidad de aproximadamente 1 g a aproximadamente 5.000 g por dosis. También se usan en una cantidad de aproximadamente 1 g a aproximadamente 4.000 g por dosis, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 3.000 g por dosis, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 2.000 g por dosis y de aproximadamente 1 g a aproximadamente 1.000 g por dosis. También se usan en una cantidad de aproximadamente 5 g a aproximadamente 750 g por dosis, de aproximadamente 5 g a aproximadamente 500 g por dosis, de aproximadamente 5 g a aproximadamente 200 g por dosis, de aproximadamente 5 g a aproximadamente 100 g por dosis, de aproximadamente 15 g a aproximadamente 100 g por dosis y de aproximadamente 30 g a aproximadamente 75 g por dosis.
Inmunomoduladores
Las composiciones adyuvantes además pueden incluir uno o más agentes inmunomoduladores como por ejemplo, compuestos de amonio cuaternario (por ejemplo, DDA) e interleucinas, interferones, u otras citocinas. Estos materiales pueden comprarse comercialmente. La cantidad de inmunomodulador adecuado para usar en las composiciones adyuvantes depende de la naturaleza del inmunomodulador que se use y del sujeto. Sin embargo, generalmente se usan en una cantidad de aproximadamente 1 g a aproximadamente 5.000 g por dosis. También se usan en una cantidad de aproximadamente 1 g a aproximadamente 4.000 g por dosis, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 3.000 g por dosis, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 2.000 g por dosis y de aproximadamente 1 g a aproximadamente 1.000 g por dosis. También se usan en una cantidad de aproximadamente 5 g a aproximadamente 750 g por dosis, de aproximadamente 5 g a aproximadamente 500 g por dosis, de aproximadamente 5 g a aproximadamente 200 g por dosis, de aproximadamente 5 g a aproximadamente 100 g por dosis, de aproximadamente 15 g a aproximadamente 100 g por dosis y en una cantidad de aproximadamente 30 g a aproximadamente 75 g por dosis. Como ejemplo específico, las composiciones adyuvantes que contienen DDA pueden prepararse simplemente mezclando una solución antigénica con una solución preparada recientemente de DDA.
Polímeros
Las composiciones adyuvantes además pueden incluir uno o más polímeros tales como, por ejemplo, DEAE Dextrano, polietilenglicol y poli(ácido acrílico) y poli(ácido metacrílico) (por ejemplo, CARBOPOL®). Dicho material puede comprarse comercialmente. La cantidad de polímeros adecuada para usar en las composiciones adyuvantes depende de la naturaleza de los polímeros que se usen. Sin embargo, generalmente se usan en una cantidad de aproximadamente 0,0001 % en volumen por volumen (v/v) a aproximadamente 75 % v/v. En otras realizaciones, se usan en una cantidad de aproximadamente 0,001 % v/v a aproximadamente 50 % v/v, de aproximadamente 0,005 % v/v a aproximadamente 25 % v/v, de aproximadamente 0,01 % v/v a aproximadamente 10 % v/v, de aproximadamente 0,05 % v/v a aproximadamente 2 % v/v y de aproximadamente 0,1 % v/v a aproximadamente 0,75 % v/v. En otra realización, se usan en una cantidad de aproximadamente 0,02 v/v a aproximadamente 0,4 % v/v. Los DEAE-dextranos pueden tener un tamaño molecular en el intervalo de 50.000 Da a 5.000.000 Da, o pueden estar en el intervalo de 500.000 Da a 2.000.000 Da. Dicho material puede comprarse comercialmente o prepararse a partir de dextrano.
Otro ejemplo específico es poli(ácido acrílico) (por ejemplo, los polímeros CARBOPOL®), que tienen un peso equivalente ponderado de 76. Pueden producirse a partir de partículas de polímeros primarios de aproximadamente 0,2 a 6,0 micrómetros de diámetro medio. Los polímeros CARBOPOL® se hinchan en agua hasta 1000 veces su volumen original y diez veces su diámetro original formando un gel cuando se exponen a un entorno de pH superior al pKa del grupo carboxilato. A un pH superior al pKa del grupo carboxilato, los grupos carboxilato se ionizan provocando repulsión entre las cargas negativas, lo que se añade a la hinchazón del polímero.
Estimulantes de Th2
Las composiciones adyuvantes pueden incluir además uno o más estimulantes de Th2 como por ejemplo, por ejemplo, Bay R1005® y aluminio. La cantidad de estimulantes de Th2 adecuada para usar en las composiciones
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adyuvantes depende de la naturaleza del estimulante de Th2 que se use. Sin embargo, generalmente se usan en una cantidad de aproximadamente 0,01 g a aproximadamente 10 mg por dosis. En otras realizaciones, se usan en una cantidad de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 7.5 mg por dosis, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 5 mg por dosis, de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 2,5 mg por dosis y de 1 mg a aproximadamente 2 mg por dosis. Un ejemplo específico es Bay R1005®, un glucolípido con el nombre químico “acetato de N-(2-desoxi-2-L-leucilamino-β-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanamida”. Puede sintetizarse de acuerdo con el procedimiento que se encuentra en Lockhoff, 0. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:1611-1620; 1991). Se recomienda almacenarlo a 2-8° C en un envase hermético. Sus propiedades químicas o físicas son que es ligeramente higroscópico, no forma polimorfos, es químicamente estable en aire y luz a temperaturas de hasta 50° C y en disolventes acuosos a pH 2-12 a temperatura ambiente. Es una molécula anfipática que forma micelas en solución acuosa.
Antígenos y enfermedades
Las composiciones adyuvantes pueden contener uno o más antígenos. El antígeno puede ser cualquiera de una amplia diversidad de sustancias capaces de producir una respuesta inmunitaria deseada en un sujeto. Aunque Quil A por sí solo es viricida, Quil A se desintoxica con la adición de colesterol al formar micelas helicoidales (véase la patente de Estados Unidos número 7.122.191). Se ha encontrado que las composiciones adyuvantes que se describen en el presente documento no son viricidas, ni hemolíticas ni membranolíticas. Así, los antígenos que se usan con estas composiciones adyuvantes pueden ser uno o más de virus (inactivados, atenuados y vivos modificados), bacterias, parásitos, nucleótidos, polinucleótidos, péptidos, polipéptidos, proteínas recombinantes, péptidos sintéticos, extractos de proteínas, células (que incluyen células tumorales), tejidos, polisacáridos, carbohidratos, ácidos grasos, ácido teiquíco, peptidoglucanos, lípidos o glucolípidos, individualmente o en cualquier combinación de los mismos.
Los antígenos que se usan con los adyuvantes de la invención también incluyen fragmentos inmunógenos de nucleótidos, polinucleótidos, péptidos, polipéptidos, que pueden aislarse de los organismos a los que se hace referencia en el presente documento.
Las cepas vivas, vivas modificadas y atenuadas que no provocan enfermedad en un sujeto se han aislado en forma no virulenta o han sido atenuadas usando procedimientos notorios en la técnica, que incluyen pases seriados en una línea celular adecuada o exposición a luz ultravioleta o a un mutágeno químico. Las cepas víricas inactivadas o muertas son las que se han inactivado mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen el tratamiento con formalina, betapropiolactona (L), etilenoimina binaria (BEI), radiación esterilizante, calor u otros procedimientos de ese tipo.
Pueden combinarse dos o más antígenos produciendo una composición polivalente que puede proteger a un sujeto contra una amplia variedad de enfermedades provocadas por los patógenos. Actualmente, los fabricantes de vacunas comerciales, así como los usuarios finales, prefieren los productos de vacuna polivalentes. Aunque los adyuvantes convencionales a menudo se ven limitados en la variedad de antígenos con los que pueden usarse eficazmente (ya sea en vacunas monovalentes o polivalentes), los adyuvantes que se describen en el presente documento pueden usarse de forma eficaz con una amplia variedad de antígenos, tanto monovalentemente como polivalentemente. Así, los antígenos que se describen en el presente documento pueden combinarse en una única composición que comprende los adyuvantes que se describen en el presente documento.
Algunos ejemplos de bacterias que pueden usarse como antígenos con las composiciones adyuvantes incluyen, pero sin limitación, Aceinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Aeromonas hydrophila, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, Bordetella bronchiseptica, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila spp., Chromobacterium viscosum, Erysipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes, Ehrlichia canis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Helicobacter suis, Lawsonia intracellularis, Legionella pneumophilia, Moraxellsa sp., Mycobactrium bovis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Clostridium perfringens, Odoribacter denticanis, Pasteurella (Mannheimia) haemolytica, Pasteurella multocida, Photorhabdus luminescens, Porphyromonas gulae, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas salivosa, Propionibacterium acnes, Proteus vulgaris, Pseudomnas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescens SIKW1, Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11-1, Alcaliges eutrophus, Psychrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsia, Salmonella typhimurium, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Salmonella dublin, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraseuis, Salmonella newport, Serratia marcescens, Spirlina platensis, Staphlyoccocus aureus, Staphyloccoccus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptococcus suis, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, Treponema palladium y especies de Leptospira, tales como los patógenos conocidos Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno, Leptospira interrogans, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona y Leptospira bratislava y combinaciones
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de las mismas.
En las composiciones adyuvantes pueden usarse tanto virus inactivados como virus vivos atenuados. Algunos ejemplos de virus que pueden usarse como antígenos incluyen, pero sin limitación, herpesvirus aviarios, herpesvirus bovinos, herpesvirus caninos, herpesvirus equinos, virus de rinotraqueitis vírica felina, virus de la enfermedad de Marek, herpesvirus ovinos, herpesvirus porcinos, virus pseudorrábico, paramyxovirus aviarios, virus sincitial respiratorio bovino, virus del moquillo canino, virus paragripal canino, adenovirus canino, parvovirus canino, virus paragripal bovino 3, virus paragripal ovino 3, virus de Rinderpest, virus de la enfermedad de la frontera, virus de la diarrea vírica bovina (BVDV), BVDV de tipo I, BVDV de tipo II, virus de la fiebre porcina clásica, virus de leucosis aviaria, virus de inmunodeficiencia bovina, virus de leucemia bovina, tuberculosis bovina, virus de anemia infecciosa equina, virus de inmunodeficiencia felina, virus de leucemia felina (FeLV), virus de la enfermedad de Newcastle, virus de neumonía progresiva ovina, virus de adenocarcinoma pulmonar ovino, coronavirus canino (CCV), CCV pantrópico, coronavirus respiratorio canino, coronavirus bovino, Calicivirus felino, coronavirus entérico felino, virus de la peritonitis infecciosa felina, virus de diarrea epidémica porcina, virus de la encefalomielitis hemaglutinante porcina, parvovirus porcino, Circovirus porcino (PCV) de tipo I, PCV de tipo II, virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS), virus de la gastroenteritis transmisible, coronavirus del pavo, virus de la fiebre efímera bovina, rabia, Rotovirus, virus de la estomatitis vesicular, lentivirus, gripe aviar, rhinovirus, virus de la gripe equina, virus de la gripe porcina, virus de la gripe canina, virus de la gripe felina, virus de la gripe humana, virus de la encefalitis equina del este (EEE), virus de la encefalitis equina venezolano, virus del Nilo occidental, virus de la encefalitis equina occidental, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del papiloma humano, virus varicela-zóster, virus de la hepatitis B, rhinovirus y virus del sarampión y combinaciones de los mismos.
Los ejemplos de antígenos peptídicos incluyen péptidos de Bordetella bronchiseptica p68, de GnRH, de IgE, de Fel d1 y antígenos de cáncer y sus combinaciones. Los ejemplos de otros antígenos incluyen nucleótidos, carbohidratos, lípidos, glucolípidos, péptidos, ácidos grasos y ácido teiquíoco y peptidoglucanos y combinaciones de los mismos.
Algunos ejemplos de parásitos que pueden usarse como antígenos con las composiciones adyuvantes incluyen, pero sin limitación, Anaplasma, Fasciola hepatica (duela), Coccidia, Eimeria spp., Neospora caninum, Toxoplasma gondii, Giardia, Dirofilaria (gusanos cardiacos), Ancylostoma (tenia), Trypanosoma spp., Leishmania spp., Trichomonas spp., Cryptosporidium parvum, Babesia, Schistosoma, Taenia, Strongiloides, Ascaris, Trichinella, Sarcocystis, Hammondia e Isopsora y combinaciones de los mismos. También se contemplan los parásitos externos que incluyen, pero sin limitación, garrapatas, que incluyen especies de Ixodes, Rhipicephalus, Dermacentor, Amblyomma, Boophilus, Hyalomma y Haemaphysalis y combinaciones de los mismos.
La cantidad de antígeno que se usa para inducir una respuesta inmunitaria variará considerablemente dependiendo del antígeno que se use, del sujeto y del nivel de respuesta que se desee y puede ser determinado por un experto en la técnica. Para las vacunas que contienen virus vivos modificados o virus atenuados, una cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno generalmente varía desde aproximadamente 102 de dosis infecciosa de cultivo tisular (DOCT)50 a aproximadamente 1010 DOCT50, inclusive. Para muchos de estos virus, una dosis terapéuticamente eficaz está generalmente en el intervalo desde aproximadamente 102 DOCT50 a aproximadamente 108 DOCT50, inclusive. En algunas realizaciones, los intervalos de dosis terapéuticamente eficaces son de aproximadamente 103 DOCT50 a aproximadamente 106 DOCT50, inclusive. En algunas otras realizaciones, los intervalos de dosis terapéuticamente eficaces son de aproximadamente 104 DOCT50 a aproximadamente 105 DOCT50, inclusive.
Para las vacunas que contienen virus inactivados, una cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno es generalmente al menos aproximadamente 100 unidades relativas por dosis y a menudo están en el intervalo desde aproximadamente 1.000 a aproximadamente 4.500 unidades relativas por dosis, inclusive. En otras realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno están en un intervalo de aproximadamente 250 a aproximadamente
4.000 unidades relativas por dosis, inclusive, de aproximadamente 500 a aproximadamente 3.000 unidades relativas por dosis, inclusive, de aproximadamente 750 a aproximadamente 2.000 unidades relativas por dosis, inclusive, o de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 1.500 unidades relativas por dosis, inclusive.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de antígeno en vacunas que contienen virus inactivado puede medirse también en términos de potencia relativa (RP) por ml. Una cantidad terapéuticamente eficaz está a menudo en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 RP por ml, inclusive. En otras realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno está en un intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 RP por ml, inclusive, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 RP por ml, inclusive, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 RP por ml, inclusive, de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 RP por ml, inclusive, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 RP por ml, inclusive.
En una realización se produjo un antígeno FeLV a partir de la línea celular FL74-UCD-1 (número de ATCC CRL8012) que está infectada persistentemente con la cepa KT-FeLV-UCD-1 del virus de leucemia felina. La cantidad de antígeno FeLV en una vacuna puede medirse como la cantidad de proteína vírica gp70 por ml. Una cantidad terapéuticamente eficaz de antígeno FeLV, cuando se mide por la cantidad de proteína vírica gp70 por ml, generalmente está en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 350.000 ng/ml, inclusive. En otra realización el intervalo es de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 300.000 ng/ml, inclusive, o de
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aproximadamente 2.500 a aproximadamente 250.000 ng/ml, inclusive, o de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 220.000 ng/ml, inclusive, o de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 150.000 ng/ml, inclusive, o de aproximadamente 10.000 ng/ml a aproximadamente 100.000 ng/ml, inclusive.
El número de células para un antígeno bacteriano que se administra en una vacuna varía desde aproximadamente 1x106 a aproximadamente 5x1010 unidades formadoras de colonias (UFC) por dosis, inclusive. En otras realizaciones, el número de células varía en el intervalo de aproximadamente 1x107 a 5x1010 UFC/dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x108 a 5x1010 UFC/dosis, inclusive. Todavía en otras realizaciones, el número de células varía en el intervalo de aproximadamente 1x102 a 5x1010 UFC/dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x104 a 5x109 UFC/dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x105 a 5x109 UFC/dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x106 a 5x109 UFC/dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x106 a 5x108 UFC/dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x107 a 5x109 UFC/dosis, inclusive.
El número de células para un antígeno parasitario administrado en una vacuna varía en el intervalo de aproximadamente 1x102 a aproximadamente 1x1010 por dosis, inclusive. En otras realizaciones, el número de células varía en el intervalo de aproximadamente 1x103 a aproximadamente 1x109 por dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x104 a aproximadamente 1x108 por dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x105 a aproximadamente 1x107 por dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x106 a aproximadamente 1x108 por dosis, inclusive.
Es notorio en la técnica que con los adyuvantes convencionales, es necesaria una cantidad sustancialmente mayor de virus inactivado que de virus vivos modificados o atenuados para estimular un nivel comparable de respuesta serológica. Sin embargo, se ha encontrado sorprendentemente que con las composiciones adyuvantes que se describen en el presente documento, aproximadamente las mismas cantidades de virus inactivados y de virus vivos modificados estimulan niveles similares de respuesta serológica. Además, son necesarias cantidades más pequeñas de virus vivos modificados, atenuados e inactivados con los adyuvantes que se describen en el presente documento cuando se comparan con los adyuvantes convencionales para lograr el mismo nivel de respuesta serológica. Estos hallazgos inesperados demuestran la conservación de recursos y la reducción de costes para la preparación de composiciones inmunógenas y de vacunas. Para las vacunas con amplia utilidad es necesario fabricar millones de dosis al año, de forma que estos ahorros pueden ser cuantiosos.
Excipientes
Los adyuvantes acuosos proporcionan ciertas ventajas. Generalmente son fáciles de formular y de administrar y pueden inducir pocas o menos reacciones graves en el sitio de la inyección. Sin embargo, los adyuvantes acuosos con un antígeno tienden a difundirse desde el sitio de la inyección, son aclarados por el hígado del sujeto y generan una respuesta inmunitaria no específica indeseada. Se ha encontrado sorprendentemente que las composiciones adyuvantes acuosas que se describen en el presente documento permanecen en el sitio de la inyección hasta que se biometabolizan, lo que se produce durante un largo periodo de tiempo y proporcionan una respuesta inmunitaria dirigida.
El aceite, cuando se añade como componente de un adyuvante, generalmente proporciona un perfil de liberación largo y lento. En la presente invención, el aceite puede ser metabolizable o no metabolizable. El aceite puede estar en forma de una emulsión de aceite en agua, de agua en aceite, o de agua en aceite en agua.
Los aceites adecuados para usar en la presente invención incluyen alcanos, alquenos, alquinos y sus ácidos y alcoholes correspondientes, sus éteres y ésteres y sus mezclas. Los compuestos individuales del aceite son compuestos de hidrocarburos ligeros, es decir, dichos componentes tienen de 6 a 30 átomos de carbono. El aceite puede prepararse sintéticamente o purificarse a partir de productos de petróleo. El resto puede tener una estructura de cadena lineal o ramificada. Puede estar totalmente saturada o tener uno o más enlaces dobles o triples. Algunos aceites no metabolizables para usar en la presente invención incluyen aceite mineral, aceite de parafina y cicloparafinas, por ejemplo.
El término aceite también se pretende que incluya "aceite mineral ligero," es decir, aceite que se obtiene de forma similar por destilación de petrolato, pero que tiene una gravedad específica ligeramente menor que el aceite mineral blanco.
Los aceites metabolizables incluyen aceites metabolizables no tóxicos. El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, aceite animal o aceite preparado sintéticamente que puede ser metabolizado por el cuerpo del sujeto al que se administrará el adyuvante y que no es tóxico para el sujeto. Las fuentes de aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y granos.
Una emulsión de aceite en agua proporcionada por la presente invención está compuesta por una formulación de AMPHIGEN®. Esta formulación comprende un componente acuoso, lecitina, aceite mineral y tensioactivos. Las patentes que describen los componentes de la formulación incluyen US 5.084.269 y US 6.572.861.
Habitualmente, el componente de aceite de la presente invención está presente en una cantidad de 1 % a 50 % en volumen; o en una cantidad de 10 % a 45 %; o en una cantidad de 20 % a 40 %.
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Otros componentes de las composiciones pueden incluir excipientes farmacéuticamente aceptables, como por ejemplo vehículos, disolventes y diluyentes, agentes isotónicos, agentes tamponadores, estabilizantes, conservantes, agentes vasoconstrictores, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos y similares. Los vehículos, disolventes y diluyentes típicos incluyen agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol, aceite y similares. Los agentes isotónicos representativos incluyen cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol, lactosa y similares. Los estabilizantes útiles incluyen gelatina, albúmina y similares.
Los tensioactivos se usan para ayudar a la estabilización de la emulsión seleccionada para actuar como vehículo para el adyuvante y el antígeno. Los tensioactivos adecuados para usar en las presentes invenciones incluyen tensioactivos naturales y tensioactivos sintéticos no naturales biológicamente compatibles. Los tensioactivos biológicamente compatibles incluyen compuestos fosfolipídicos o una mezcla de fosfolípidos. Los fosfolípidos preferidos son fosfatidilcolinas (lecitina), como por ejemplo lecitina de soja o de huevo. La lecitina puede obtenerse en forma de una mezcla de fosfátidas y triglicéridos lavando con agua los aceites vegetales crudos y separando y secando las gomas hidratadas resultantes. Puede obtenerse un producto refinado fraccionando la mezcla entre fosfolípidos y glucolípidos insolubles en acetona que permanecen después de eliminar los triglicéridos y aceite vegetal lavando con acetona. De forma alternativa, la lecitina puede obtenerse de diversas fuentes comerciales. Otros fosfolípidos adecuados incluyen fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, cardiolipina y fosfatidiletanolamina. Los fosfolípidos pueden aislarse de fuentes naturales o sintetizarse convencionalmente.
Los tensioactivos sintéticos no naturales adecuados para usar en la presente invención incluyen tensioactivos no iónicos con base de sorbitán, por ejemplo tensioactivos de sorbitán sustituidos con ácidos grasos (disponibles comercialmente con el nombre de SPAN® o ARLACEL®), ésteres de ácidos grasos de sorbitol polietoxilado (TWEEN®), ésteres de polietilenglicol de ácidos grasos de fuentes como por ejemplo aceite de ricino (EMULFOR®); ácido graso polietoxilado (por ejemplo, ácido esteárico disponible con el nombre SIMULSOL M-53®), polímero de isooctilfenol polietoxilado/formaldehído (TYLOXAPOL®), éteres de alcoholes grasos de polioxietileno (BRIJ®); éteres no fenílicos de polioxietileno (TRITON® N), éteres de polioxietilenisooctilfenilo (TRITON® X).
Hablando de forma general, el tensioactivo, o la combinación de tensioactivos, si se usan dos o más tensioactivos, está presente en la emulsión en una cantidad de 0,01 % a 10 % en volumen, preferiblemente de 0,1 % a 6,0 %, más preferiblemente de 0,2 % a 5,0 %.
Tal como se usa en el presente documento, "un vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes que retrasan la adsorción y similares. El/los vehículo(s) deben ser “aceptables” en el sentido de ser compatibles con los otros componentes de las composiciones y no ser perjudiciales para el sujeto. Habitualmente, los vehículos serán estériles y apirógenos y se seleccionaran basándose en el modo de administración a emplear. Se conoce bien por los expertos en la técnica que las formulaciones preferidas para el vehículo farmacéuticamente aceptable que comprenden las composiciones son los vehículos farmacéuticos aprobados en las regulaciones aplicables promulgadas por el Departamento de agricultura estadounidense o la Administración de medicamentos y alimentos estadounidense, o agencia gubernamental equivalente en un país diferente de los Estados Unidos. Por lo tanto, el vehículo farmacéuticamente aceptado para la producción comercial de las composiciones es un vehículo que ya está aprobado o que será aprobado por la agencia gubernamental apropiada en los Estados Unidos o país extranjero.
Las composiciones opcionalmente pueden incluir diluyentes líquidos, semisólidos o sólidos compatibles farmacéuticamente aceptables (es decir, estériles o no tóxicos) que sirven como vehículos, excipientes o medios farmacéuticos. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol, aceite y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina, entre otros.
Las composiciones también pueden contener antibióticos o conservantes que incluyen, por ejemplo, gentamicina, mertiolato o clorocresol. Las diversas clases de antibióticos o conservantes de los que pueden seleccionarse son notorias para el experto en la técnica.
Preparación de las composiciones
Preparación de formulaciones adyuvantes
Un ISCOM puede prepararse combinando una saponina, un esterol y un fosfolípido. Por ejemplo, un ISCOM puede contener de 5 % a 10 % en peso de Quil A, 1 % a 5 % de colesterol y fosfolípidos y el resto de proteína. La proporción entre saponina y esterol en las formulaciones adyuvantes habitualmente será del orden desde 1:100 peso por peso (p/p) a 5:1 p/p. En algunas realizaciones, hay presente un exceso de esterol, en el que la proporción entre saponina y esterol es de al menos 1:2 p/p, o 1:5 p/p. En otras realizaciones, la saponina está en exceso relativa al esterol y se usa una proporción entre saponina y esterol de aproximadamente 5:1 p/p. ISCOM e ISCOMATRIX están disponibles comercialmente de Isconova AB (Suecia).
En algunas realizaciones, se usa CARBOPOL® combinado con DDA en una cantidad de al menos 0,1 partes en
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peso de CARBOPOL® por parte en peso de DDA. En otras realizaciones, se usan al menos 0,5 partes en peso de CARBOPOL® por parte en peso de DDA. Todavía en otras realizaciones, se usa al menos 1 parte en peso de CARBOPOL® por parte en peso de DDA. La combinación de CARBOPOL® y DDA forma un complejo por el que el grupo funcional de amina terciaria del DDA inmunofuncionaliza los grupos laterales de ácido carboxílico del polímero. Esto permite que las células inmunitarias específicas se dirijan al antígeno y al adyuvante de forma simultánea y coadministren el antígeno y adyuvante juntos en el momento y concentración óptimos a dichas células.
Los adyuvantes descritos en el presente documento generalmente no requerirán ningún vehículo específico y se formularán en un tampón acuoso u otro farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, las vacunas de las realizaciones descritas se presentarán en un vehículo adecuado, como por ejemplo, liposomas, microesferas o partículas antigénicas encapsuladas adicionales. El antígeno puede estar contenido en la membrana de las vesículas o estar contenido en el exterior de la membrana de las vesículas. Generalmente, los antígenos solubles están fuera y los antígenos hidrófobos o lipidados están bien contenidos en el interior o bien fuera de la membrana.
Las composiciones adyuvantes pueden prepararse en diversas formas dependiendo de la vía de administración, requisitos de almacenamiento y similares. Por ejemplo, pueden prepararse en forma de soluciones o dispersiones acuosas estériles adecuadas para uso inyectable, o prepararse en formas liofilizadas usando técnicas de liofilización, secado al vacío o secado por pulverización. Las composiciones liofilizadas pueden reconstituirse antes de su uso para estabilizar una solución, por ejemplo, solución salina o HEPES. Así, las composiciones adyuvantes pueden usarse como forma farmacéutica sólida, semisólida o líquida.
Los adyuvantes pueden fabricarse usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la saponina y el colesterol pueden mezclarse en un detergente adecuado, seguido de una técnica de extracción con disolvente formando liposomas o ISCOM. La saponina y el colesterol también pueden combinarse formando micelas helicoidales como se describe en la patente de Estados Unidos número 7.122.191.
Puede usarse solución salina tamponada con fosfato (PBS) como medio de tampón acuoso; el pH del tampón puede ser neutro o ligeramente alcalino o ligeramente ácido. Por consiguiente, el pH puede estar en el intervalo de pH de 6 a 8. Es habitual un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,3. La potencia del tampón puede estar entre P04 10 a 50 mM y entre PO4 10 a 150 mM. En un ejemplo, se usa 0,063 % de PBS. El pH puede ajustarse usando NaOH o HCl según sea necesario. Las concentraciones habituales incluyen HCl de 1 N a 10 N y NaOH de 1 N a 10
N.
La cantidad de adyuvante usada depende del antígeno con el que se usa y la dosis antigénica a aplicarse. También depende de las especies a la que se dirija y de la formulación deseada. Habitualmente la cantidad está incluida en un intervalo convencionalmente usado para los adyuvantes. Por ejemplo, los adyuvantes habitualmente comprenden de aproximadamente 1 μg a aproximadamente 1000 μg, inclusive, de una dosis de 1 ml. De forma similar, los antibióticos habitualmente comprenden de aproximadamente 1 μg a aproximadamente 60 μg, inclusive, de una dosis de 1 ml.
Las formulaciones adyuvantes pueden homogenizarse o microfluidificarse. Las formulaciones se someten a un procedimiento de mezclado primario, habitualmente pasando una o más veces a través de uno o más homogenizadores. Puede usarse cualquier homogenizador disponible comercialmente para este fin, por ejemplo, emulsionante Ross (Hauppauge, NY), homogenizador Gaulin (Everett, MA), o Microfluidics (Newton, MA). En una realización, las formulaciones se homogenizan durante tres minutos a 10.000 rpm. La microfluidificación puede lograrse mediante el uso de un microfluidificador comercial, como por ejemplo el modelo número 11OY disponible en Microfluidics, (Newton, Mass.); Gaulin Modelo 30CD (Gaulin, Inc., Everett, Mass.); y Rainnie Minilab Tipo 8.30H (Miro Atomizer Food y Dairy, Inc., Hudson, Wis.). Estos microfluidificadores operan forzando fluidos a través de pequeñas aperturas a presión elevada, de tal forma que dos chorros de líquido interactúen a velocidades elevadas en una cámara de interacción formando composiciones con gotitas de un tamaño submicrométrico. En una realización, las formulaciones se microfluidifican pasándolas a través de una cámara de limitación de las dimensiones de 200 micrómetros a 68950000 +/-3447380 pascales (10.000 +/-500 psi).
Las composiciones adyuvantes que se describen en el presente documento pueden estar tanto homogeneizadas como microfluidificadas. En una realización, se añade un antígeno a un tampón apropiado. La solución se agita y se añade lentamente una saponina a la solución antigénica. Después se añade lentamente un esterol a la solución de antígeno/saponina, seguido de la adición lenta de un compuesto de amonio cuaternario a la solución de antígeno, saponina y esterol. La composición resultante se homogeniza y después se microfluidifica. Después de la microfluidificación, se añade un polímero a la composición microfluidificada. Dependiendo de los componentes que se usen, puede alterarse el orden de estas etapas para optimizar la preparación de las composiciones.
Preparación de composiciones inmunógenas y de vacunas
Las composiciones adyuvantes que se describen en el presente documento pueden usarse para la fabricación de composiciones inmunógenas y de vacunas. Para las composiciones de vacunas o inmunógenas, cada dosis contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno o antígenos que puede variar dependiendo de la edad y estado general del sujeto, de la vía de administración, de la naturaleza del antígeno y de otros factores. Pueden
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Se disolvió Quil A (Superfos) en agua y se preparó una solución madre de 50 mg/ml. Se disolvió colesterol (Fabri Chem Inc.) en etanol y se preparó una solución madre de 18 mg/ml. Se filtró después la solución madre de colesterol usando un filtro de 0,2 micrómetros.
El intervalo de concentraciones de Quil A y colesterol en las diversas formulaciones fue tan baja como 1/1 µg/ml de Quil A frente a colesterol hasta tan altas como 1000/1000 µg/ml. Para preparar una solución madre de Quil A/colesterol de 50/50 µg/ml, la solución madre de Quil A se diluyó con agua hasta una concentración de 50 µg/ml. Mientras se agita esta solución, la solución madre de colesterol se añadió lentamente a una concentración final de 50 µg/ml.
Ejemplo 2. Soluciones de DDA (D)
Se disolvió bromuro de amonio de dimetildioctadecilo (DDA; Fluka Analytical), en etanol y se preparó una solución madre de 18 mg/ml. Se filtró después la solución madre de DDA usando un filtro de 0,2 micrómetros.
Ejemplo 3. Soluciones de Quil A/Colesterol/DDA (QCD)
Se preparó una solución madre de A Quil A/Colesterol como en el ejemplo 1 a las concentraciones deseadas. Se preparó una solución madre de DDA como en el ejemplo 2 y se añadió lentamente a la solución madre de Quil A/colesterol. Las soluciones se mezclaron para lograr las concentraciones finales deseadas. El pH de la solución se ajustó con NaOH o HCl según fue necesario para alcanzar el pH final deseado, que estuvo generalmente en un intervalo de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,5.
Ejemplo 4. Soluciones de CARBOPOL® (C).
El CARBOPOL® (Noveon, Méjico) se disolvió en agua desionizada y se preparó una solución madre del 1,5 %. En otra realización, se disolvió CARBOPOL® en agua desionizada y se preparó una solución madre del 0,75 %.
Ejemplo 5. Soluciones de DDA/CARBOPOL® (DC).
Se preparó una solución madre de DDA como en el ejemplo 2. Se preparó una solución madre de CARBOPOL® al 0,75 % como en el ejemplo 4. Las soluciones se mezclaron logrando las concentraciones finales deseadas.
Ejemplo 6. Soluciones Quil A/Colesterol/DDA/CARBOPOL® (QCDC)
Se preparó una solución madre de Quil A/colesterol/DDA como en el ejemplo 3. Se preparó una solución madre de CARBOPOL® al 0,75 % como en el ejemplo 4. La solución madre de CARBOPOL® se añadió lentamente a la solución madre Quil A/colesterol/DDA logrando la concentración final deseada. El pH de la solución se ajustó con NaOH o HCl alcanzando el pH final deseado, que estuvo generalmente en un intervalo de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,5.
Ejemplo 7. Soluciones de Bay R1005® (R)
Para preparar una solución madre de Bay R1005®, el glucolípido N-(2-desoxi-2-L-leucilamino-β-D-glucopiranosil)-Noctadecildodecanoilamida se disolvió en etanol (al 60 % v/v). Se añadieron después Tween 20 y ácido acético glacial. En un ejemplo, se disolvieron 3,49 gr de N-(2-desoxi-2-L-leucilamino-β-D-glucopiranosil)-Noctadecildodecanoilamida en 44,64 ml de etanol/agua (al 60 % v/v). Esto se combinó con 1,12 ml de Tween 20 y 0,68 ml de ácido acético glacial.
Ejemplo 8. Soluciones de Quil A/Colesterol/DDA/CARBOPOL®/Bay R1005® (QCDCR)
Se preparó una solución madre de Quil A/colesterol/DDA/CARBOPOL® como en el ejemplo 6. Se preparó una solución madre de Bay R1005® como en el ejemplo 7. La solución de Bay R1005® se añadió lentamente a la solución de Quil A/colesterol/DDA/CARBOPOL® para lograr la concentración final deseada. El pH de la solución se ajustó con NaOH o HCl según fue necesario para alcanzar el pH final deseado, que estuvo generalmente en un intervalo de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,5.
Ejemplo 9. Soluciones de DEAE Dextrano (X)
Se preparó una solución madre de DEAE dextrano (X) disolviendo 200 mg/ml de DEAE dextrano en agua. La solución puede autoclavarse durante aproximadamente 20 minutos a 120º centígrados (C).
Ejemplo 10. Soluciones de Quil A/Colesterol/DDA/DEAE (QCDX)
Se preparó una solución madre de Quil A/colesterol/DDA de acuerdo con el ejemplo 3. Se preparó una solución madre de DEAE de acuerdo con el ejemplo 9. Se combinaron las soluciones añadiéndolas directamente dentro de un homogeneizador. El mezclado emplea un procedimiento de mezcla ultrarrápida usando una fuerza de cizallamiento mayor de 1.000 seg-1. El mezclado se hace suministrando la solución acuosa directamente dentro de la fase oleosa que contiene los adyuvantes no polares y los componentes antigénicos y mezclando hasta que se logra
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una mezcla estable homogénea. Típicamente esto puede ser un mínimo de varios minutos o más dependiendo del tamaño de partícula deseado.
Ejemplo 11. Composiciones de Aceite (O)
Se preparó una solución madre de aceite combinando aceite mineral Drakeol con Tween 85 y Span 85, calentando a aproximadamente 55ºC y después enfriando y filtrando de forma estéril. Esta mezcla comprendería así el componente de base de la fase oleosa para un vehículo basado en aceite. Si el colesterol y/o el DDA se seleccionaron para ser un inmunomodulador colaborador para una de estas composiciones se añadirían después también a esta mezcla antes de filtración, dado que son solubles en la fase oleosa.
Ejemplo 12. Composiciones de Quil A/Colesterol/DDA/DEAE/Aceite (QCDXO)
Se preparó una solución madre de Quil A/colesterol/DDA/DEAE de acuerdo con el ejemplo 10. Se preparó una composición madre de aceite de acuerdo con el ejemplo 11. Las soluciones fueron una combinación de Quil-A, DEAE-dextrano y agua logrando la cantidad a dichas concentraciones. Se mezcló esta fase acuosa agitando continuamente la reacción durante varios minutos o más a temperatura ambiente o más alta y después se filtró de forma estéril y se almacenó para adición a la fase oleosa. La fase acuosa se añadió lentamente dentro de una fase aceitosa que se mezcla de forma continua.
Ejemplo 13. Preparación de Composiciones Inmunógenas o Composiciones de Vacunas
Para preparar una composición inmunógena o una composición de vacunas que comprenda un antígeno y uno de los adyuvantes anteriormente descritos, se añadió el antígeno deseado a un tampón apropiado. Después se añadieron los componentes del adyuvante deseado como se describe anteriormente. La solución resultante se llevó a un volumen final con el tampón.
Ejemplo 13a. Antígeno, Quil A, Colesterol, DDA, CARBOPOL®
Para preparar una composición inmunógena o una composición de vacuna que comprenda un antígeno, Quil A, colesterol, DDA y CARBOPOL®, el antígeno deseado se añadió a un tampón apropiado. Se preparó una solución madre de Quil A como en el ejemplo 1 y se añadió lentamente a la solución de antígeno. Se preparó una solución madre de colesterol como en el ejemplo 1 y se añadió lentamente a la solución de antígeno/Quil A. Se preparó una solución madre de DDA como en el ejemplo 2 y se añadió lentamente a la solución de antígeno/Quil A/colesterol. La solución de antígeno/Quil A/colesterol se homogeneizó y microfluidificó. Una solución de CARBOPOL® al 0,75 % se preparó como en el ejemplo 4. Después de microfluidificación, se añadió la solución de CARBOPOL® (0,05 % v/v) a composición microfluidificada y se ajustó el pH con NaOH o HCl a aproximadamente 6,9 hasta aproximadamente 7,5.
Ejemplo 13b. Antígeno, Quil A, Colesterol, DDA, CARBOPOL®, Bay R1005®
Para preparar una composición inmunógena o una composición de vacuna que comprenda un antígeno, Quil A, colesterol, DDA, CARBOPOL® y Bay R1005®, se añadió el antígeno deseado a un tampón apropiado. Se preparó una solución madre de Quil A como en el ejemplo 1 y se añadió lentamente a la solución de antígeno. Se preparó una solución madre de colesterol como en el ejemplo 1 y se añadió lentamente a la solución de antígeno/Quil A. Se preparó una solución madre de DDA como en el ejemplo 2 y se añadió lentamente a la solución de antígeno/Quil A/colesterol. La solución de antígeno/Quil A/colesterol/DDA se homogeneizó y microfluidificó. Se preparó una solución de CARBOPOL® al 0,75 % como en el ejemplo 4. Después de microfluidificación, se añadió la solución de CARBOPOL® (al 0,05 % v/v) a composición microfluidificada y se ajustó el pH con NaOH o HCl a aproximadamente 6,9 hasta aproximadamente 7,5. Se preparó una solución madre de Bay R1005® como en el ejemplo 7. Se añadió el componente de Bay R1005® a la fase acuosa después de que se añadió el DDA.
Ejemplo 13c. Antígeno, Quil A, Colesterol, DDA, DEAE Dextrano
Para preparar una composición inmunógena o una composición de vacuna que comprenda un antígeno, Quil A, colesterol, DDA y DEAE dextrano, el antígeno deseado se añadió a un tampón apropiado. Se preparó una solución madre de Quil A como en el ejemplo 1 y se añadió lentamente a la solución de antígeno. La composición se homogeneizó. Se preparó una solución madre de colesterol como en el ejemplo 1 y se añadió lentamente a la solución de antígeno/Quil A durante la homogeneización. Se preparó una solución madre de DDA como en el ejemplo 2 y se añadió lentamente a la solución de antígeno/Quil A/colesterol durante la homogeneización. Se preparó una solución madre de DEAE dextrano como en el ejemplo 9. Durante la homogeneización, se añadió la solución de DEAE dextrano y la composición resultante se llevó al volumen final.
Ejemplo 13d. Antígeno, Quil A, Colesterol, DDA, DEAE Dextrano, Aceite
Para preparar una composición inmunógena o una composición de vacuna que comprenda un antígeno, Quil A, colesterol, DDA, DEAE dextrano y aceite, se añadió el antígeno deseado a un tampón apropiado. Se preparó una solución madre de Quil A como en el ejemplo 1 y se añadió lentamente a la solución de antígeno. La composición se
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Los resultados finales de la semana 12 a la semana 16 tras la prueba indicaron que 16 animales por cada 19 (84 %) que recibieron la vacuna placebo (grupo T01) eran persistentemente virémicos para FeLV. 13 animales por cada 19 (68 %) en el grupo T02 estaban protegidos de la prueba virulenta de FeLV. El nivel de protección fue estadísticamente significativo (p= 0,0004) comparado con los gatitos vacunados con placebo. 12 animales por cada 19 (63 %) en el grupo T03 estaban protegidos de la prueba virulenta de FeLV. El nivel de protección fue estadísticamente significativo (p= 0,0013) comparado con los gatitos vacunados con placebo. 19 animales por cada 20 (95 %) en el grupo T04 estaban protegidos de la prueba virulenta de FeLV. El nivel de protección fue estadísticamente significativo (p= 0,0001) comparado con los gatitos vacunados con placebo.
Así, las vacunas administradas a los grupos T02, T03 y T04 demostraron todas ser seguras en gatitos a la edad mínima cuando se administraron en un régimen de dos dosis, separadas tres semanas. Adicionalmente, las vacunas administradas a estos grupos fueron también capaces de reducir significativamente el nivel de viremia persistente de FeLV en gatitos a la edad mínima cuando se administraron en un régimen de dos dosis, separadas tres semanas. Hubo una reducción estadísticamente significativa en el establecimiento de viremia persistente de FeLV en gatitos en los grupos T02, T03 y T04. Adicionalmente, hubo una diferencia estadísticamente significativa entre T04 y los otros grupos de vacunas (T02, T03). Fue sorprendente e inesperado que las vacunas que contienen la formulación de adyuvante novedosa demostraran ser más eficaces que aquellas que contienen componentes adyuvantes usados comúnmente en gatos.
Ejemplo 15. Vacunas del Virus de la Leucemia Felina (FeLV)
Se aclimataron los gatitos durante dieciséis días después de su llegada. Se asignaron los animales al azar a una habitación y dentro de una habitación, se asignaron al azar a tratamientos (1 animal por tratamiento en cada habitación). Se recogió una muestra de sangre (1,0 – 2,0 ml) de cada animal por venopunción de la vena yugular, en el día de estudio -1. Se administraron dosis sedantes de TELAZOL® (Fort Dodge Animal Health) de acuerdo con el peso corporal (aproximadamente 5,0 mg/kg) mediante la vía intramuscular con el fin de minimizar el estrés animal y para evitar daño a los manipuladores de animales durante la recogida de sangre. La sangre se recogió en tubos de separación de suero y se procesó para separación de suero. Todos los animales se observaron diariamente y las observaciones se registraron.
Se prepararon las vacunas como en el ejemplo 13 salvo porque se usó una solución madre de CARBOPOL® al 1,5 %. Se preparó LEUKOCELL® 2 (Pfizer, Inc.) propagando FeLV, subgrupos A, B y C, en células linfoides transformadas con FeLV. Los antígenos víricos se inactivaron químicamente, se combinaron con un adyuvante estéril logrando la respuesta inmune y se empaquetaron en forma líquida. Se preparó una cantidad total de 500,0 ml de IVP conteniendo el virus de la leucemia felina a una potencia relativa (RP) de 2, Quil A, colesterol y DDA de la siguiente manera. Se añadió un total de 20,7 ml de una solución madre de FeLV (50,0 RP/ml donde 1 RP = 3,624 ng/ml de antígeno) a 478,2 ml de tampón PBS al 0,063 %. Agitando mientras, se añadieron lentamente 0,21 ml de una solución de 50,0 mg/ml de Quil A a la solución de antígeno. Después, se añadieron lentamente 0,58 ml de una solución de colesterol/etanol de 18 mg/ml. Se añadió lentamente un total de 0,29 ml de una solución de DDA/etanol de 18,0 mg/ml a la composición agitando mientras. La composición se homogeneizó durante tres minutos a 10.000 rpm. La composición se microfluidificó mediante un paso a través de una cámara de dimensión limitante de 200 micrómetros a 68950000 (+ 3447380) pascales (10.000 (+ 500) psi). Agitando mientras, se añadieron lentamente 10,0 ml de una solución de CARBOPOL® al 1,5 % a 290,0 ml del virus de la leucemia felina, Quil A, colesterol y composición de DDA. El pH se ajustó a entre 7,0 y 7,3 con NaOH al 18 % o HCl 1 N, según se necesitase.
Se preparó el IVP que contiene el virus de la leucemia felina a una RP de 5 de la misma manera que el IVP con una RP de 2 usando 51,7 ml de la solución madre de FeLV y 447,2 ml de tampón de PBS al 0,063 %, con las cantidades de los otros componentes siguiendo siendo las mismas.
Se preparó el IVP que contiene el virus de la leucemia felina a una RP de 10 de la misma manera que el IVP con una RP de 2 usando 93,1 ml de la solución madre de FeLV, 355,9 ml de tampón de PBS al 0,063 %, 0,19 ml de la solución de Quil A, 0,52 ml de la solución de colesterol y 0,26 ml de la solución de DDA (volumen total de 450 ml). Después, se añadieron lentamente 8,3 ml de una solución de CARBOPOL® al 1,5 % a 241,7 ml del virus de la leucemia felina, Quil A, colesterol y composición de DDA.
Se preparó el IVP que contiene el virus de la leucemia felina a una RP de 15 de la misma manera que el IVP con una RP de 10 usando 139,7 ml de la solución madre de FeLV y 309,4 ml de tampón de PBS al 0,063 %, con las cantidades de los otros componentes siguiendo siendo las mismas.
Se preparó el IVP que contiene el virus de la leucemia felina a una RP de 20 de la misma manera que el IVP con una RP de 2 usando 206,9 ml de la solución madre de FeLV y 292,0 ml de tampón de PBS al 0,063 %, con las cantidades de los otros componentes siguiendo siendo las mismas.
Para administrar una dosis de 0,5 ml, se prepararon 300,0 ml de IVP que contiene el virus de la leucemia felina a una RP de 5, Quil A, colesterol, DDA y CARBOPOL® de la siguiente manera. Se añadió un total de 21,7 ml de una solución madre de FeLV (35,8 RP/ml donde 1 RP = 1,864 ng/ml de antígeno) a 277,7 ml de tampón de PBS al 0,063 %. Agitando mientras, se añadieron lentamente 0,12 ml de una solución de 50,0 mg/ml de Quil A a la solución de
antígeno. Después, se añadieron lentamente 0,35 ml de una solución de colesterol/etanol de 18 mg/ml. Se añadió lentamente un total de 0,17 ml de una solución de DDA/etanol de 18,0 mg/ml a la composición agitando mientras. La composición se homogeneizó durante tres minutos a 10.000 rpm. La composición se microfluidificó después mediante un paso a través de una cámara de dimensión limitante de 200 micrómetros a 68950000 (+ 3447380)
5 pascales (10.000 (+ 500) psi). Agitando mientras, se añadieron lentamente 3,3 ml de una solución de CARBOPOL® al 1,5 % a 96,7 ml del virus de la leucemia felina, Quil A, colesterol y composición de DDA. El pH se ajustó a entre 7,0 y 7,3 con NaOH al 18 % o HCl 1 N, según se necesitase.
Se preparó el IVP para administrar una dosis de 1,0 ml del virus de la leucemia felina a una RP of 5, Quil A, colesterol, DDA y CARBOPOL® de la misma manera que la dosis de 0,5 ml con las cantidades apropiadamente
10 ajustadas.
Se preparó una cantidad total de 300,0 ml de IVP conteniendo el virus de la leucemia felina a una RP de 10 y CARBOPOL®. Se añadió un total de 62,1 ml de una solución madre de FeLV (50,0 RP/ml donde 1 RP = 3,624 µg/ml de antígeno) a 237,9 ml de tampón de PBS al 0,063 %. La composición se homogeneizó durante tres minutos a
10.000 rpm. La composición se microfluidificó mediante un paso a través de una cámara de dimensión limitante de
15 200 micrómetros a 68950000 (+ 3447380) pascales (10.000 (+ 500) psi). Agitando mientras, se añadieron lentamente 3,3 ml de una solución de CARBOPOL® al 1,5 % a 96,7 ml de la composición del virus de la leucemia felina. El pH se ajustó a entre 7,0 y 7,3 con NaOH al 18 % o HCl 1 N, según se necesitase.
Se administraron vacunas placebo y vacunas de FeLV (tabla 2) a gatitos por la vía subcutánea usando una aguja de calibre 22 x 19,05 mm (0,75 pulgadas) y jeringuilla de 3 cc en el día de estudio 0 y en el día de estudio 20. El grupo
20 de tratamiento T01 se administró con la vacuna placebo a dosis de 1,0 ml. Los grupos de tratamiento T02, T04, T05, T06, T07, T08 y T09 se administraron con las vacunas de FeLV a dosis de 1,0 ml. El grupo de tratamiento T03 se administró con la vacuna de FeLV a dosis de 0,5 ml. El grupo de tratamiento T10 se administró con la vacuna de la viruela del canario de FeLV (Merial) por la vía intradérmica usando un inyector de pistola intradérmico.
Tabla 2: Diseño Experimental
Grupo de Tratamiento
Número de Animales Potencia Relativa Objetivo Vía de Vacunación Vacuna Adyuvante Medios de Cultivo Celular (Volumen deRecogida)
T01
10 N.A. SC PBS Sin Adyuvante Solución Salina Normal
T02
10 5 RP SC FeLV Inactivado Quil A – Colesterol DDA – CARBOPOL® RPMI
T03
10 5 RP SC/0,5 ml FeLV Inactivado Quil A – Colesterol DDA – CARBOPOL® RPMI
T04
10 20 RP SC FeLV Inactivado Quil A – Colesterol DDA – CARBOPOL® Cellgro
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10 15 RP SC FeLV Inactivado Quil A – Colesterol DDA – CARBOPOL® Cellgro
T06
10 10 RP SC FeLV Inactivado Quil A – Colesterol DDA – CARBOPOL® Cellgro
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10 5 RP SC FeLV Inactivado Quil A – Colesterol DDA – CARBOPOL® Cellgro
T08
10 2 RP SC FeLV Inactivado Quil A – Colesterol DDA – CARBOPOL® Cellgro
T09
10 10 RP SC FeLV Inactivado CARBOPOL® Cellgro
T10
10 rFeLV Vivo (Merial) ID rFeLV Vivo (Merial) Sin Adyuvante Registrado (Merial)
Todos los animales se observaron después de la primera vacunación (Estudio Día 0) y la segunda vacunación (Estudio Día 20) para las señales de dolor tras la administración de vacuna de ensayo que incluye vocalización,
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Tabla 3. Sumario del nivel de protección
Grupo de tratamiento
Potencia relativa de vacuna Nivel de Protección Fracción preventiva
T01
ND 10 %
T02
4,58 60 % 555,6 %
T03
4,58 90 % 88,9 %
T04
26,32 100 % 100 %
T05
18,58 100 % 100 %
T06
11,16 70 % 66,7 %
T07
4,77 100 % 100 %
T08
1,64 80 % 1077,8 %
T09
11,12 50 % 44,4 %
Discusión
Las vacunas usadas en los grupos de tratamiento T02, T03, T04, T06 y T07 demostraron un perfil de seguridad satisfactorio durante la primera vacunación, ya que no se observaron reacciones adversas en ese tiempo. Un único animal en el grupo de tratamiento T05 demostró una reacción inmediata (dolor en la administración, vocalización menor e intento agresivo/de escape) en la segunda vacunación. Este episodio podría estar asociado a una respuesta exacerbada a la vacunación para el animal particular en lugar de a un problema de formulación de vacuna. Todas las vacunas demostraron un perfil de seguridad satisfactorio después de la vacunación, ya que no se observaron ni reacciones locales ni episodios adversos relacionados con la vacunación.
Las vacunas de FeLV administradas a los grupos de tratamiento T03, T04, T05, T07 y T08 demostraron una eficacia significativa, ya que > 80 % de protección (> 75 % de fracción preventiva) se logró después de la exposición con FeLV virulento. Que la vacuna proporcionada al grupo T07 proporcionara una protección del 100 % es sorprendente e inesperado, ya que los animales en ese grupo recibieron 25 % y 33 % de la dosis de antígeno de los animales en los grupos T04 y T05, respectivamente. Una ventaja clara de los adyuvantes descritos y ensayados en el presente documento es que permiten que se use una dosis menor de antígeno, aunque se induce todavía una respuesta inmune protectora completamente. Las vacunas administradas a los grupos de tratamiento T02, T06 y T09 demostraron algo de disminución en la eficacia de protección (< 80 % de protección; fracción preventiva < 75 %) después de la exposición con FeLV virulento. La disminución en la eficacia de la vacuna administrada al grupo de tratamiento T02 se debía probablemente a la presencia de pocos animales respondedores en ese grupo.
Ejemplo 16. Vacunación in Ovo contra Eimeria en Pollos
La coccidiosis aviar es una enfermedad intestinal en general provocada por protozoos del género Eimeria y representa un grave problema en todo el mundo para la industria avícola. Los parásitos ingeridos en la alimentación se localizan en el tracto intestinal donde provocan graves daños a los tejidos intestinales y subyacentes. Las pérdidas económicas resultantes para la industria avícola son muy significativas, ya que la conversión de alimento y ganancia de peso de tanto los pollos como la puesta de huevos se ven alterados. Una adición general del estado de la técnica, que incluye los intentos de vacunar contra Eimeria que usan, por ejemplo, proteínas de Eimeria recombinantes como antígeno y una diversidad de sistemas de adyuvantes, se describen en las siguientes publicaciones, todas las cuales se incorporan en el presente documento como referencia, como si se establecieran completamente, (1) H.S. Lillehoj et al., J. Parisitol, 91(3), 2005, p. 666 -673; (2) H.S. Lillehoj et al., Avian Diseases, 49 2005, 112 -117; y (3) R. A. Dalloul et al., Expert Rev. Vaccines, 5(1), 2006, p.143 -163. El ejemplo presente se refiere al uso de composiciones de vacunas novedosas que emplean componentes de adyuvantes que proporcionan un comportamiento superior en el contexto de coccidiosis.
Los adyuvantes altamente eficaces de la presente invención se pueden usar en combinación con el material antigénico de todas las especies de Eimeria, incluyendo sus extractos de proteínas purificados o parcialmente purificados, o mediante una o más de sus proteínas expresadas de manera recombinante, o fragmentos de cualquiera y todas de tales proteínas, de este modo se incluyen materiales antigénicos proporcionados a partir de
Eimeria acervulina, Eimeria ahsata, Eimeria bovis, Eimeria brunetti, Eimeria fraterculae, Eimeria maxima, Eimeria meleagridis, Eimeria mitis, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria stiedae, Eimeria tenella y Eimeria zurnii, entre otros.
La vacuna con adyuvante de la invención se puede proporcionar contra cualquier proteína o macromolécula que se produce en uno o más puntos en el ciclo de vida de los protozoos, que incluye, sin limitación, oocisto (tanto esporulado como no esporulado), esporocisto, esporozoito, esquizonte, merozoito, células de gametos masculinos o femeninos. En un ejemplo preferido las proteínas que se desprenden en las heces en cantidades significativas en la
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realizaron las inyecciones sobre un inyector in ovo “Intelliject” (Avitech, Hebron, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada huevo recibió muestras de 100 microlitros en la cavidad amniótica usando una aguja de 17,5 cm de longitud y calibre 18 proporcionada por Avitech (Hebron, MD). Las dosis de 50 microlitros también estaban entre las que pueden funcionar en la práctica de la presente invención.
3. Pollos:
Tan pronto como los pollos de engorde se empollaron (aproximadamente el día 21 -22), se llevaron al laboratorio usando cajas de cartón de transporte de pollos desechables (Frederick Packaging, Inc., Milwaukee, WI) y los pollitos se alojaron después en las unidades de Petersime y se les proporcionó alimento y agua a voluntad.
Se mantuvieron las aves en gallineros de cría en una instalación sin Eimeria y se llevaron en jaulas suspendidas grandes en localizaciones separadas donde se infectaron con oocistos vivos de Eimeria maxima y se mantuvieron hasta el final del período de experimento.
4. Parásitos:
Se usó la cepa USDA BARC de Eimeria maxima n.º: 41, que se había mantenido en el Laboratorio de Enfermedades de Parásitos de Animales -BARC y se propagó de acuerdo con el procedimiento establecido en el Laboratorio del Dr. Lillehoj. Los oocistos recientemente producidos a partir de la cepa de E. maxima (Beltsville n.º: 41) se limpiaron mediante flotación sobre hipoclorito de sodio al 5 %, se lavaron tres veces con PBS y se enumeró la viabilidad mediante azul de triptano usando un hemocitómetro.
5. Infección de exposición de Eimeria:
Se marcaron aves de siete días de edad en las alas y las aves de todos los grupos experimentales salvo los grupos de control no infectados se inocularon por vía esofágica con E. maxima usando una aguja de inoculación y después se colocaron en jaulas de recogida de oocistos.
6. Determinación de la ganancia de peso corporal:
Se determinaron los pesos corporales individuales de las aves en los días 0 (sin infectar), 6 y 10 días después de la infección con E. maxima.
7. Determinación de la producción de oocistos fecales:
Se dio instrucciones a los cuidadores de animales para no limpiar las jaulas y se recogieron las deposiciones fecales. Las bandejas de recogida se colocaron debajo de cada jaula durante 5 días a partir del día 6 después de la infección y se recogieron los materiales fecales en grandes tarros de plástico (2 l). Las deposiciones fecales empapadas con agua corriente en cada tarro se molieron en un mezclador con más agua (el volumen total es 3 l) y se recogieron dos muestras al azar de 40 ml de cada muestra y se almacenaron en el frigorífico hasta que se contaron. Con el fin de contar los oocistos de coccidia, inicialmente se realizaron diversas diluciones para determinar las diluciones óptimas para determinar la enumeración de oocistos para cada muestra. Se contaron los oocistos de manera microscópica usando una cámara de recuento de McMaster usando un procedimiento de flotación de sacarosa que se ha establecido en el Laboratorio del Dr Lillehoj. Se calculó el número total de oocistos desprendidos por pollo usando la fórmula: oocistos totales /ave = (recuento de oocistos x factor de dilución x volumen de muestra fecal / volumen de la cámara de recuento)/número de aves por jaula.
8. Recogida de muestras:
Se recogió sangre el día 6 después de la fecha de infección y se determinó la respuesta de anticuerpo en suero. Se obtuvieron muestras de sangre de aves individuales (N = 4 -5/grupo), se permitió la coagulación 4 horas a 4 °C y se recogieron los sueros. Se ensayaron muestras de suero para la evaluación de anticuerpos anti-Eimeria usando ELISA. En resumen, se recubrieron placas de microtitulación durante toda una noche con 10 μg/pocillo de los antígenos coccidiales recombinantes Ea3-1E, EtMIF o EtMIC2, se lavaron con PBS-Tween al 0,05 % y se bloquearon con PBS-BSA al 1 %. Se añadieron diluciones en suero (1:20, 1:40, 1:80, 1:160; 100 μl/pocillo), se incubaron con agitación continua, se lavaron y se detectó el Ab unido con IgG anti-pollo de conejo conjugada con peroxidasa (Sigma) y sustrato específico de peroxidasa. Se determinó la densidad óptica (DO) a 450 nm con un lector de microplacas (Bio-Rad, Richmond, CA).
Se recogieron los tejidos intestinales en la incubación y a los 6 y 10 días después y se ensayaron para evaluar la producción de citocinas (IFN-γ, IL-2) mediante el uso de RT-PCR en tiempo real, según se mide por la estimulación de Th1.
9. Síntesis de ADNc
Se extrajo el ARN de IEL intestinales usando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se trataron cinco microgramos de ARN con 1,0 U de DNasa I y 1,0 l de tampón de reacción 10X (Sigma), se incubó durante 15 min a temperatura
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ambiente, se añadió 1,0 l de solución de detención para inactivar la DNasa I y se calentó la mezcla a 70ºC durante 10 minutos. Se transcribió de manera inversa el ARN usando el sistema de síntesis de primera hebra StrataScript (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
10. RT-PCR Cuantitativa
Los cebadores de oligonucleótidos de la RT-PCR cuantitativa para el interferón-γ de pollo (IFN-γ) y control GAPDH se enumeran en la Tabla 4. Se llevaron a cabo la amplificación y detección usando cantidades equivalentes de ARN total de IEL intestinales usando el sistema Mx3000P y mezcla maestra Brilliant SYBR Green QPCR (Stratagene). Se generaron curvas patrones usando ARN patrón diluido log10 y se normalizaron los niveles de transcripciones individuales con los de GAPDH analizados mediante el programa Q-gene. Se realizó cada análisis por triplicado. Para normalizar los niveles de ARN entre las muestras dentro de un experimento, se calcularon los valores de ciclo de umbral medio (Ct) para los productos de amplificación mediante la combinación de los valores de todas las muestras en ese experimento.
Tabla 4. Cebadores de oligonucleótidos usados para la RT-PCR cuantitativa de IFN-γ y GAPDH de pollo.
Diana ARN
de Secuencias de cebador Tamaño del producto de PCR (pb)
GAPDH
Nº de acceso K01458 264
Directo
5′-GGTGGTGCTAAGCGTGTTAT-3′ SEC ID N.º: 1
Inverso
5′-ACCTCTGTCATCTCTCCACA-3′ SEC ID N.º: 2
IFN-γ Directo Inverso
Nº de acceso Y07922 5′-GCTGACGGTGGACCTATTATT-3′ 5’-GGCTTTGCGCTGGATTC-3’ 259 SEC ID N.º: 3 SEC ID N.º: 4
IL-1β Directo Inverso
Nº de acceso Y15006 5′-TGGGCATCAAGGGCTACA-3′ 5′-TCGGGTTGGTTGGTGATG-3′ 244 SEC ID N.º: 5 SEC ID N.º: 6
IL-15 Directo Inverso
Nº de acceso AF139097 5′-TCTGTTCTTCTGTTCTGAGTGATG-3′ 5′-AGTGATTTGCTTCTGTCTTTGGTA-3′ 243 SEC ID N.º:7 SEC ID N.º:8
Se recogió el bazo antes de la inoculación con E. maxima y a 10th DPI (fecha después de la infección) para el ensayo de proliferación de esplenocitos. Se colocaron los bazos en una placa Petri con 10 ml de solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) suplementada con 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina (Sigma, St. Louis, MO). Se prepararon suspensiones de células individuales de linfocitos de bazo y se llevó a cabo la proliferación de linfocitos. En resumen, se ajustaron los esplenocitos a 5x106 o 1×107 células/ml en medio IMDM (Sigma) suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS) (Hyclone, Logan, UT), 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina (Sigma), que se llamará medio IMDM completo al 10 %. Se incubaron los esplenocitos (100 μl/pocillo) en placas de fondo plano de 96 pocillos a 41°C en un incubador humidificado (Forma, Marietta, OH) con 5 % de CO2 y 95 % de aire durante 48 hr. Se determinó la proliferación de células con sal monosódica de 2-(2-metoxi4-nitrofenill)-3-(4-nitrofenill)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio (WST-8, Cell-Counting Kit-8®, Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD). La Densidad Óptica (DO) se midió a 450 nm usando un espectrofotómetro de microplacas (BioRad, Richmond, CA).
Resultados
Los resultados mostraban que las aves de engorde vacunadas con 100 microlitros de formulación adyuvante (es decir, 100 microlitros que incluyen proteína 3-1E recombinante de acuerdo con las dosis definidas previamente) ganaron aproximadamente 45 a 85 gramos adicionales de peso corporal en comparación con la aves no vacunadas pero infectadas con E. maxima.
Las vacunas de la invención también mostraban efectos claros sobre la inmunidad mediada por células según se midió por ensayos de proliferación de linfocitos por mitógenos: Los resultados de la proliferación de linfocitos en bazo a 1 x 107 células/ml incubados con Con A durante 48 horas mostraban que los esplenocitos de pollos infectados con E. maxima inmunizados con adyuvante de Pfizer, con o sin antígeno muestran en general mayores niveles de proliferación de linfocitos, especialmente cuando se usaba una dosis de 50 g. Se observó un aumento significativo de la producción de IL-1B, la producción de IFN- y la producción de IL-15, más particularmente en el bazo después de la administración de las composiciones de vacuna con adyuvante de la invención. En resumen, estos resultados indican claramente el efecto del presente adyuvante sobre la respuesta de citocinas y confirman su efecto sobre la potenciación de la respuesta inmune mediada por células más que de la humoral.
Las vacunas de la invención también mostraban efectos claros sobre la producción de oocistos fecales. Las aves de control sin infectar no eliminaban oocistos. Después de la infección por E. maxima, se produjeron reducciones
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significativas en la producción de oocistos fecales en grupos que se trataron con adyuvantes de Pfizer en solitario. Las aves vacunadas in ovo con Eimeria maxima en bruto y adyuvante demostraron una producción de oocistos fecales mucho menor en comparación con grupos inoculados con una preparación de Eimeria maxima en bruto en solitario. Grupos EM.
Debería señalarse que aunque se ha usado proteína de E. maxima recombinante purificada 3-1E en la práctica de los experimentos mencionados anteriormente, el uso de los antígenos Ea3-1E, EaMIF y EtMIC2 recombinantes, bien individualmente o bien en combinación con 3-1E o cada uno de los otros, o como cualquier combinación de cualquiera de los mismos, también es una realización preferida de la invención y generalmente todos los antígenos de proteínas de Eimeria pueden funcionar en la práctica de la presente invención, siempre que se mezclen con los adyuvantes de la presente invención.
Ejemplo 17. Evaluación de Bacterina de la cepa J5 de Escherichia coli en ganado
El objetivo del estudio es evaluar la respuesta inmunológica en ganado a antígeno de Escherichia coli (cepa J-5) cuando se administra en diversas nuevas formulaciones. La bacterina J5 comercial se comercializa como una vacuna preventiva para mastitis por coliformes en ganado de leche y es moderadamente eficaz en su actual formulación. Antes de la vacunación, se determinó que los animales tenían un bajo título de anticuerpos contra J5 de
E. coli, basándose respectivamente en un análisis de muestras de suero sanguíneo tomadas antes de la vacunación.
Ganado Vacuno
Se formularon vacunas experimentales usando bacterina J5 de E. coli inactivada como el antígeno y se realizaron de acuerdo con el Ejemplo 13 anterior. Cada grupo de tratamiento contenía inicialmente siete animales (Tabla 5). Un grupo de tratamiento recibió solución salina (T01) y otro grupo recibió una vacuna J5 comercial (T02 -bacterina de Escherichia coli J-5 Enviracor™ Pfizer). Los otros grupos de tratamiento recibieron diversas formulaciones que contenían los adyuvantes especificados en la Tabla 5. Todas las vacunaciones se administraron por inyección subcutánea en los días de estudio 0 y 21. El volumen de dosificación era de 5 ml.
Tabla 5. Grupos de Vacunas – Ganado Vacuno
Grupo de Trat.
N.º de Animales Tratamiento Día Dosis (ml) Vía
T01
7 Solución salina 0, 21 5,0 SC
T02
7 Bacterina de Escherichia coli, cepa J-5 0, 21 5,0 SC
T03
7 QCDCR 0, 21 5,0 SC
T04
7 QCDO 0, 21 5,0 SC
T05
7 QCDX 0, 21 5,0 SC
T06
7 QCDXO 0, 21 5,0 SC
En la Tabla 5, QC es la abreviatura para QuilA/colesterol, D para DDA, C para carbopol, R para R1005, X para DEAE-dextrano y O para aceite.
Se prepararon soluciones madre como en los Ejemplos 1 a 13 anteriores para lo siguiente: se administró E. coli a aproximadamente 4-5 X 109 organismos por dosis según se determinó por recuento directo por microscopía óptica. Quil A en agua a 50 mg/ml, colesterol en etanol a 17 mg/ml, DDA en etanol a 17 mg/ml, R1005 en tampón fosfato 20 mM a 5 mg/ml, DEAE-dextrano en agua a 200 mg/ml, agonista de TLR en tampón TE a 20 mg/ml e Iscomatrix en agua a 5,4 mg/ml. Los componentes individuales se añadieron v/v en el orden de los símbolos de una letra de izquierda a derecha. Por ejemplo, en QCDC, se añadió el volumen apropiado de Quil A seguido de adición de colesterol, DDA y por último carbopol. Cuando las formulaciones contenían aceite, los componentes separados se mezclaron por adición después se emulsionaron en una mezcla de aceite mineral Drakeol® 5 LT con Span 80 y Tween 80 (QCDO) o Span 85 y Tween 85 (QCDXO). Drakeol® es un aceite mineral ligero disponible en el mercado.
Se recogieron muestras de sangre los días de estudio 0, 21 y 49 para ensayo serológico. Se determinaron los títulos de anticuerpo contra J5 de E. coli en muestras de suero por medio de un ensayo de ELISA indirecto específico de J5. Se determinaron los isotipos de anticuerpo IgG con conjugados de anticuerpo de oveja anti-bovino (Bethyl Labs). Se determinaron los títulos y se expresaron como sus medias geométricas.
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El MPS causa pérdidas económicas considerables en todas las áreas en las que se crían cerdos. Encuestas realizadas en diversas localizaciones por todo el mundo indican que las lesiones típicas de las que se observan con MPS aparecen en el 30 %-80 % de los cerdos en peso en canal. Debido a que las lesiones micoplásmicas pueden resolverse antes de que los cerdos alcancen el peso de sacrificio, la incidencia real puede ser mayor. Se ha descrito 5 que la prevalencia de la infección por M. hyopneumoniae en la neumonía porcina crónica oscila del 25 %-93 %. Cerdos de todas las edades son susceptibles a MPS, pero la enfermedad es más común en puercos en crecimiento y en terminación. Pruebas actuales indican que M. hyopneumoniae se transmite por aerosol o contacto directo con secreciones del tracto respiratorio de cerdos infectados. Es posible la transmisión de cerdas a lechones durante la lactación. Una vez establecido, el MPS aparece año tras año en piaras infectadas, variando en gravedad con
10 factores ambientales como la estación, ventilación y concentración de cerdos.
Objetivo de Estudio
Comparar la eficacia de vacunas de Mycoplasma hyopneumoniae formuladas con nuevos adyuvantes de la invención frente a la eficacia de una serie experimental de una bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae disponible en el mercado después de la exposición intratraqueal a un homogeneizado pulmonar de M. hyopneumoniae
15 virulento.
Animales
Se usaron en el estudio sesenta y seis (66) cerdos híbridos clínicamente sanos a aproximadamente 17 días de edad sin un historial de enfermedad causada por M. hyopneumoniae y PRRSV, o con vacunación contra los mismos organismos. Antes del transporte al sitio de estudio y durante 2 días después de su llegada, se trató a los cerdos con
20 Naxcel® por vía intramuscular en la pata trasera, siguiendo las instrucciones de la etiqueta, para evitar enfermedades relacionadas con el estrés tales como Streptococcus suis. Los animales se asignaron a tratamientos y establos de acuerdo con un plan de aleatorización. El diseño de estudio se muestra en la Tabla 15.

Tabla 15. Diseño Experimental
Grupo de Tratamiento
Tratamiento N.º de Animales Vacunación Vía Exposición
T01
Control Negativo 63464-70 12 Día 0 Día 14 Intramuscular Homogeneizado pulmonar de M. hyo
T02
DDA/Carbopol/R1005 (DCR) 12 Día 0 Día 14 Intramuscular Homogeneizado pulmonar de M. hyo
T03
QAC/ DDA/Carbopol (QCDC) 12 Día 0 Día 14 Intramuscular Homogeneizado pulmonar de M. hyo
T04
QAC/DDA/Carbopol/R1005 (QCDCR) 12 Día 0 Día 14 Intramuscular Homogeneizado pulmonar de M. hyo
T05
Bacterina de M. hyo 12 Día 0 Día 14 Intramuscular Homogeneizado pulmonar de M. hyo
NTX
Ninguno 6 N/A N/A N/A
QAC es la abreviatura para QuilA/colesterol.
25 Productos Veterinarios de Investigación (IVP)
Los antígenos y Productos Veterinarios de Investigación (IVP) se muestran en la Tabla 16. Las vacunas para los grupos de tratamiento T02, T03 y T04 (todos salvo T05) se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 13 usando las concentraciones de componentes que se muestran en la Tabla 16 a continuación. Los componentes se añadieron en el orden enumerado en la tabla.
30 Se añadió un expansor de solución salina a un recipiente y se inició la homogeneización y se continuó durante todo el procedimiento de preparación. Se preparó M. hyopneumoniae inactivado a partir de un volumen mezclado de 75
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Se evaluaron los animales para reacciones en el sitio de inyección y respuesta serológica a la vacuna. Se sometieron a eutanasia tres animales (dos en T02-H5N2 inactivado y uno en T05-solución salina) debido a hiperoxaluria congénita antes de la exposición. El día de estudio 49, todos los gatos supervivientes se expusieron por la vía intratraqueal a la cepa H5N1 A/Vietnam/1194/04 para evaluar la eficacia de los candidatos a vacunas. Los animales se expusieron a 5,0 ml de material que contenía 105 DICT50, que se liberaba justo encima de la bifurcación usando un pequeño catéter que se introdujo en la traquea usando un traqueoscopio. Los animales se observaron y se tomaron muestras durante cinco días después de la exposición. Al final de la fase animal (día de estudio 54) todos los animales supervivientes se sometieron a eutanasia y se realizó una necropsia en cada uno.

Tabla 18. Grupos de Vacuna
Grupo de Tratamiento
Vacuna Dosis Vía de Administración Día de Estudio Animales
T01
Vacuna de proteína hemaglutinina (HA) recombinante purificada (25.600 unidades de HA/dosis) 1,0 ml Subcutánea 0 y 21 6
T02
Vacuna de virus H5N2 modificado inactivado (25.600 unidades de HA/dosis) 1,0 ml Subcutánea 0 y 21 6
T03
Vacuna de virus H5N1 modificado inactivado (25.600 unidades de HA/dosis) 1,0 ml Subcutánea 0 y 21 6
T04
Placebo – Solo adyuvante 1,0 ml Subcutánea 0 y 21 6
T05
Placebo – Solo solución salina 1,0 ml Subcutánea 0 y 21 6
Se recogieron muestras de sangre los días de estudio -14 prevacunación, 0, 21 y 49 para ensayo serológico. En los días de estudio 49 y 54, se recogieron muestras de sangre para ensayo virológico. En el día de estudio 42, se tomó una muestra de sangre no programada de todos los animales supervivientes para someter a ensayo la función renal en sueros antes de la exposición.
Se recogieron hisopos orofaríngeos de todos los animales los días de estudio -14, 49 antes de la exposición y 50 a
54. Se recogieron hisopos rectales de todos los animales los días de estudio 49 antes de la exposición y los días 50 a 54. La recogida de los hisopos se realizó justo antes de la exposición en el día de estudio 49.
Durante la necropsia, se extirparon asépticamente todos los lóbulos pulmonares, se pesaron y se evaluaron macroscópicamente para lesiones características atribuibles a una infección por FAIV. Se usaron porcentajes para identificar el grado de consolidación pulmonar. El pulmón izquierdo se fijó con formalina tamponada neutra al 10 % para histopatología. El pulmón derecho se recogió y se obtuvieron muestras para ensayo virológico. Además de los pulmones también se tomó una muestra de riñón y de cualesquiera tejidos con patología macroscópica y se almacenaron en formalina tamponada neutra al 10 % para histopatología.
Se determinaron los títulos víricos en muestras de sangre, hisopos orofaríngeos y rectales y en muestras de tejido pulmonar por medio de una PCR TaqMan específica de H5N1. Brevemente, se aisló ARN usando un sistema MagnaPure LC con el kit de aislamiento de ácido nucleico total MagnaPure LC (Roche Diagnostics; Almere, Países Bajos) y se detectó el virus de la gripe A mediante el uso de un ensayo de RT-PCR a tiempo real. Los datos se expresaron como unidades de dilución de control (UDC). Se determinaron las UDC a partir de una curva patrón producida a partir de una reserva de virus, que se diluyó de forma seriada, sufriendo cada dilución a una extracción de ácido nucleico y amplificación por PCR TaqMan de la misma forma que las muestras de ensayo.
También se analizaron hisopos orofaríngeos y muestras de tejido pulmonar positivas por RT-PCR por aislamiento de virus y titulación en células de riñón canino Madine Darby (MDCK). Los resultados se expresaron como log10 de la dosis infecciosa al 50 % en cultivo de tejidos por mililitro o gramo de muestra (log10 DICT50/ml o log10 DICT50/g).
Se analizaron muestras de plasma por neutralización de virus y por inhibición de la hemaglutinación. Para el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), se incubó una suspensión de virus de la cepa de gripe Vietnam 1194/04 (H5N1, clase 1) o Indonesia 05/2005 (H5N1, clase 2) con diluciones seriadas (2 veces) de muestra de suero
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CR+OVA
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QCDC+OVA
3 6 2 10 21
CR+OVA
4 3 5 4 16
DCR+OVA
6 2 6 2 16
DC+OVA
2 4 3 5 14
OVA
1 1 1 1 4
QC es la abreviatura para QuilA/colesterol, Ch para colesterol, D para DDA, C para Carbopol®, R para Bay R1005®

Ejemplo 23. Coronavirus Canino (CCV)
Ámbito
Se empleó un modelo murino usando coronavirus canino (CCV) y nuevos adyuvantes de combinación para evaluar 5 el rendimiento de adyuvante con el componente antigénico dado.
Animales
A diez ratones CF-1 por grupo de tratamiento se les administró 0,2 ml por vía subcutánea por animal de cada grupo de tratamiento.
Grupos de Tratamiento
10 Las formulaciones de ensayo que se muestran en la Tabla 24 se prepararon como volúmenes de dosis de campo de 1,0 ml con las concentraciones proporcionadas a continuación. Solo se administraron 0,2 ml de la vacuna a cada ratón.

Tabla 24. Formulaciones de Ensayo.
Artículo N.º:
Formulaciones de Ensayo Concentración de Adj.: µg/2 ml (salvo Carbopol) CCV/dosis
1
PBS NA na
2
Antígeno PBS 6,040
3
AbISCO-100 100 6,040
4
AbISCO-200 100 6,040
5
AbISCO-300 100 6,040
6
Quil-A/Colesterol 100/100 6,040
7
R1005 1000 6,040
8
R1005/Carbopol 1000/0,075 % 12,079
9
DDA/R1005/Carbopol 50/1000/0,075 % 12,079
10
Quil-A/Colesterol/R1005 100/100/1000 6,040
11
Quil-A/ Colesterol/DDA/Carbopol 100/100/50/0,075 % 6,040
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Quil-A/ Colesterol/R1005/Carbopol 100/100/1000/0,075 % 12,079
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GrupoTratamiento
de Títulos Neutralizantes en Suero
QCDRC
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Sumario
Los efectos combinados de los adyuvantes formulados con CCV teniendo en cuenta las propiedades químicas de cada componente han proporcionado excelentes propiedades para un adyuvante de vacuna.
5 Los resultados serológicos del estudio se muestran en la Tabla 25. Títulos de anticuerpo neutralizante en suero mayores generalmente están asociados con mejor protección proporcionada por las vacunas. Varias de las formulaciones adyuvantes de la invención producían títulos mucho mayores que los productos con adyuvante comerciales, aun cuando estas formulaciones tenían una cantidad similar de antígeno de CCV añadido. Las formulaciones QCDC, QCR, DRC, QCRC y QCDRC eran especialmente eficaces en la inducción de una buena
10 respuesta inmune en los ratones.
Ejemplo 24. Antígeno de Rotavirus Bovino
Ámbito
Se empleó un modelo murino usando Rotavirus Bovino y adyuvantes de combinación de la invención para evaluar el rendimiento de adyuvante con el componente antigénico dado.
15 Animales
A diez ratones CF-1 por grupo de tratamiento se les administró 0,2 ml por vía subcutánea por animal para cada grupo de tratamiento.
Grupos de Tratamiento
Las formulaciones de ensayo que se muestran en la Tabla 26 se prepararon como volúmenes de dosis de campo de
20 2,0 ml con las concentraciones proporcionadas a continuación. Solo se administraron 0,2 ml de la vacuna a cada animal.

Tabla 26. Formulaciones de Ensayo
Artículo N.º
Formulaciones de Ensayo Concentración de Adj.: µg/2ml (salvo Carbopol) Rotavirus B223/dosis
1
Tampón fosfato PBS NA
2
Antígeno PBS 6,09 μg
3
AbISCO-100 100 6,09 μg
4
AbISCO-200 100 6,09 μg
5
AbISCO-300 100 6,09 μg
6
Quil-A/Colesterol 100/100 6,09 μg
7
Quil-A/Colesterol/DDA/Carbopol 100/100/50/0,075 % 6,09 μg
8
R1005 1000 6,09 μg
9
Quil-A/Colesterol/R1005 100/100/1000 6,09 μg
10
Quil-A/Colesterol/DDA/R1005/Carbo-pol 100/100/50/1000/0,075 % 6,09 μg
11
Quil-A/Colesterol/DDA/Carbopol 100/100/50 /0,075 % 12,18 μg
12
Quil-A/Colesterol/Carbopol/R1005 100/100/0,075 %/1000 12,18 μg
13
Quil-A/Colesterol/DDA/R1005/Carbopol 100/100/50/1000/0,075 % 12,18 μg
imagen29
Los efectos combinados de los adyuvantes formulados con Rotavirus Bovino y tener en cuenta las propiedades químicas de cada componente han proporcionado propiedades excelentes para un adyuvante de vacuna (véase la Tabla 27).
Aunque varias de las formulaciones adyuvantes proporcionaban niveles similares de títulos de anticuerpos 5 neutralizantes séricos, el adyuvante QCDCR proporcionaba el nivel más alto.
Ejemplo 25. Virus de la gripe Canina
Ámbito/Diseño de Estudio
Se empleó un modelo canino usando virus de la gripe canina (CIV) y adyuvantes de combinación novedosos para evaluar el rendimiento de adyuvante con el componente antigénico dado.
10 Este estudio tenía un diseño en bloques completamente aleatorizado (véase la Tabla 28). Los animales se clasificaron por fecha de nacimiento para formar bloques de un tamaño de 5. Dentro de un bloque los animales se asignaron al azar a tratamientos. Los animales en el mismo bloque se asignaron al azar a establos (jaulas) localizadas próximas entre sí. Los animales tenían buena salud sin historial de hipersensibilidad a vacunas disponibles en el mercado. Los animales no habían recibido vacunas contra CIV.
15 Tabla 28. Diseño de Estudio
Grupo de Trat.
N.º de Animales Tratamiento Día Dosis Vía
T01
8-10 Placebo Adyuvante (control neg.) 0 1 ml SQ
T02
8-10 Formulación de estudio de seguridad de campo (control pos.) 0 1 ml SQ
T03
8-10 QCDC dosis alta 0 1 ml SQ
T04
8-10 QCDC dosis media 0 1 ml SQ
T05
8-10 QCDC dosis baja 0 1 ml SQ
QC es la abreviatura para QuilA/colesterol, D para DDA, C para Carbopol®

Tabla 29. Composición Vacunal
T01
Adyuvante placebo, control negativo
Formulación
Quil A-colesterol-DDA-carbopol (20/20/10/0,075)
T02
Nombre Genérico
serie de seguridad de campo de CIV, control positivo
Formulación
Cepa Iowa-05 de gripe (H3N8) a 760 HA, combinada con Rehydragel LV al 5 %
T03
Nombre Genérico
CIV + QCDC de alta dosis
Formulación
Cepa Iowa-05 de gripe (H3N8) a 760 HA, combinada con Quil A-colesterol-DDAcarbopol (20/20/10/0,075)
T04
Nombre Genérico
CIV + QCDC dosis media
Formulación
Cepa Iowa-05 de gripe (H3N8) a 760 HA, combinada con Quil A-colesterol-DDAcarbopol (10/10/10/0,075)
T05
Nombre Genérico
CIV + QCDC de baja dosis

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