CN104771754B - 一种猪圆环病毒2型灭活疫苗水性佐剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的水性佐剂及应用，本发明的佐剂组合物能够显著提高猪圆环病毒2型灭活疫苗的免疫效果，而且可激发机体产生长达150天的高效保护力。同时疫苗的配制工艺稳定，以及因疫苗免疫后引起的副反应小等均具有独特优势。该佐剂组合物制备工艺简单，不需要大型设备，成本低廉，且便于疫苗的规模化生产。

Description

一种猪圆环病毒2型灭活疫苗水性佐剂及应用

技术领域

本发明主要涉及猪用疫苗领域。具体涉及一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的水性佐剂及应用。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是断奶仔猪多***衰竭综合征(PMWS)的主要病原，该疾病主要特征是免疫抑制和断奶仔猪多***衰竭。此病主要发生在6-15周龄的断奶仔猪，病猪主要表现在生长发育不良、呼吸困难、贫血、腹泻、衰弱、***肿大、增重迟缓、黄疸等临床症状，并且还能够使感染仔猪的免疫功能受到损害，导致机体免疫力下降，从而引发继发性感染，加重病情的发生。主要病理特征是淋巴组织中淋巴细胞缺失、炎性粒细胞浸润等。此外，PCV2还与母猪繁殖障碍、增生性坏死性肺炎、猪皮炎肾病综合征和猪呼吸道疾病综合征等病症相关。近几年来，我国猪群也大量爆发PMWS，随着PMWS大量流行，也给我国养猪业造成十分严重后果。疫苗免疫室控制PCV2感染引起相关疾病的重要手段。而在疫苗的研制中，病毒抗原含量与佐剂类型对免疫效果影响很大。

当前我国兽用疫苗主要以油佐剂为主，即以非离子表面活性剂(Tween80、Span80)作为剂型稳定剂和抗原在高剪切力作用下制备油包水剂型疫苗。该疫苗的黏度大，注射困难，副反应大，且难于吸收，易对动物胴体品质造成不良影响。近年来，国内外也成功制备出水包油包水疫苗和水包油疫苗。这些佐剂主要是通过不同的表面活性剂和适当的比例制备而成。但是由于这些佐剂不太稳定而且价格昂贵，使得国内疫苗厂家难以推广使用。

在选择合适佐剂时必须考虑多种因素。佐剂应该以最有效方式使抗原的释出和吸收速率缓慢，且对宿主的毒性、变应原性、刺激性及其它不想要的副作用。为了使人满意，佐剂应为非杀灭病毒性、可生物降解性、可持续产生高水平的免疫力、能够刺激交叉保护作用、可与多种抗原相互兼容、在多种物种中均有效、且对宿主无毒无副作用(如：无注射部位反应)。其它期望的佐剂特征为可微量给药、剂量节省、具有优良的货架稳定性、可承受干燥、可制成不含油、可作为固体或液体存在、容易简单制备、工艺简单且其制造并不昂贵。最后，高度期望能够根据疫苗接种方案的需要而将佐剂配置成诱导体液免疫应答或细胞免疫应答或二者兼有。然而，可符合上述条件的佐剂数量有限。

从南美洲皂树(Quillaja saponaria)树皮提取的皂苷作为佐剂已有一段时间。(Lacaille-Dubois，M and Wagner H.(A review of the biological andpharmacological activities of saponins。)当前许多兽用疫苗佐剂包含QuilA，QuilA来自南美洲智利皂荚树(Quillaja saponaria molina)树皮的皂苷馏分。将QuilA进一步分馏则产生次馏分，包括QS-7、QS-17、QS-18及QS-21(美国专利No：5057540)。

为了克服Quil A的溶血及杀病毒性质，现已将其与胆固醇和磷脂组合而形成称为免疫刺激性复合物(ISCOM)或ISCOM基质(ISCOMATRIX)的特殊结构。(Ozel M.，et al.；J.Ultrastruc.and Molec.Struc.Re 102，240-248(1989)。当与抗原组合时，ISCOM通常会诱导Th1细胞毒性T细胞应答。然而，尽管大幅减弱Quil A的溶血性质，但Quil A与胆固醇组合并不会完全消除此类性质。ISCOM的另一限制为蛋白质抗原必须具有足够大的疏水结构域来与ISCOM交互作用，从而被并入ISCOM中。高度亲水的蛋白质无法被并入ISCOM中。因此，ISCOM可以在受试者体内产生自体免疫应答。

二甲基双十八烷基溴化铵(以下称“DDA”)和拉韦定。DDA为亲脂性季铵化合物(胺)，其带有结合正电荷季铵分子的二个18碳烷基链及二个甲基基团，分子量为631。其作为佐剂的用途由Gall(Immunol.V.11，p.369，1966)发现。据报导，DDA可刺激强烈的经细胞介导的免疫应答，亦显示出可诱导体液免疫应答。许多论文已发表，证明DDA作为蛋白质抗原、半抗原(hapten)、肿瘤、病毒、原生动物及细菌的佐剂的效力。(Korsholm，K S.，et al.，Immunology，vol.121，pp.216-226，2007)。

Montanide GEL 01(购于法国SEPPIC公司)是一种高度稳定的聚合物(聚丙烯酸酯)凝胶颗粒分散体。储存效果以及多聚合物吸收所带来的缓释特性，改善了固有的免疫应答***。

优选的聚合物是由糖或多元醇的多链烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物。这些聚合物是以聚羧乙烯聚合物(carbomer)的名称为人们所熟识。这些聚合物通常是由烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联的。其中，可以提到974p、934p、971p。

左旋咪唑是一种广谱驱虫药，是第一个被发现具有免疫调节作用的化学合成物，具有广泛的免疫调节活性，在畜牧业中广泛应用。左旋咪唑能使抗胸腺依赖性和抗胸腺非依赖性抗原的抗体滴度明显升高。其免疫调节活性机理有三方面：一是具有拟胆碱能活性(与咪唑基团有关)；二是能诱导机体产生各种淋巴因子，三是其代谢产物具有清除自由基功能。

在本发明佐剂组合物之前并无佐剂组合物拥有理想期望特征。我们一直在努力寻求用于猪圆环病毒2型灭活疫苗中，可克服常规佐剂缺陷的新佐剂组合物。特别地，高度期望本发明佐剂组合物，可在动物中经细胞介导的细胞免疫应答及体液免疫应答，但无常规佐剂的副作用和配制困难等优点。本申请制备的佐剂组合物用于猪圆环病毒2型灭活疫苗。该疫苗的应用可以有效减少猪圆环病毒2型发病率，或减缓由猪圆环病毒感染引起的猪断奶后多***衰竭综合征。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水性佐剂组合物，该佐剂组合物包含聚合物、聚羧乙烯聚合物、皂苷、固醇、季铵化合物及左旋咪唑。本发明的佐剂组合物优选配方为：Montanide GEL 01，Carbopol 974p，Quil A，胆固醇，二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)及左旋咪唑。

本发明的另一个目的在于提供一种水性佐剂组合物在制备猪圆环病毒2型灭活疫苗中的应用。利用该佐剂组合物能够显著提高猪圆环病毒2型灭活疫苗的体液免疫应答和细胞免疫应答，不但可以在14天就产生较高抗体水平，而且可激发机体产生长达150天的高效保护力。该佐剂组合物制备疫苗时不需要大型乳化设备，疫苗制备工艺稳定、疫苗免疫后副反应小等优点。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种水性佐剂组合物，其配方包含：

所述的Carbopol 974p的浓度为10mg/ml；Quil A的浓度为60mg/ml；胆固醇的浓度为20mg/ml；二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)的浓度为20mg/ml；左旋咪唑的浓度为20mg/ml。

以上所述的水性佐剂组合物，优选配方包含：

以上所述的水性佐剂组合物，最佳配方包含：

利用上述水性佐剂组合物制备灭活疫苗的方法，包括：

a)利用PH7.2的PBS缓冲液，调整灭活病毒液病毒含量，制备病毒原液；

b)将Carbopol 974p加入步骤a的组合物中充分混匀；

c)将Montanide GEL 01加入步骤b的组合物中充分混匀；

d)将二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)加入步骤c的组合物中充分混匀；

e)将Quil A加入步骤d的组合物中充分混匀；

f)将胆固醇加入步骤e的组合物中充分混匀；

g)将左旋咪唑加入步骤f的组合物中充分混匀；

h)将混合均匀的制剂，最后通过均质机处理，即得。

优选的，所述的病毒为猪圆环病毒2型-WH株，CCTCC NO：V201333；

优选的，病毒原液与佐剂组合物的的体积比为13:7；

优选的，最终产品中的有效病毒含量为10⁷TCID₅₀/ml。

以上各组分的加入量依据本发明所述的水性佐剂组合物的配比进行添加。

一种水性佐剂组合物在制备猪圆环病毒灭活疫苗中的应用，包括在制备猪圆环病毒2型灭活疫苗中的应用。将制得的疫苗直接免疫动物，能够显著提高特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，效果优异。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)配制疫苗工艺简单，不需要大型乳化设备，可以大大减少污染机率和生产上的成本。

(2)该水性佐剂配制的疫苗具有独特的稳定性，在4℃、25℃和37℃放置都比其他疫苗要稳定；

(3)该水性佐剂配制的疫苗无副反应，注射部位无肉芽肿或炎症反应；

(4)该水性佐剂配制的疫苗免疫保护周期较长而且抗体水平较其他佐剂配制的疫苗高；

(5)在特殊情况下本佐剂制备的疫苗可以用于该疾病的应急治疗使用；

(6)该佐剂组合物配制的疫苗免疫后产生的特异性抗体较快而且高，并且可以同时诱导体液免疫和细胞免疫；

附图说明

图1为实施例5中组1疫苗免疫28天后吸收情况示意图。

图2为实施例5中组3免疫28天后吸收情况示意图。

图3为实施例5中201佐剂免疫28天后吸收情况示意图。

图4为实施例5中Marcol52佐剂免疫28天后吸收情况示意图。

图5为实施例3中不同佐剂组免疫后抗体平均值示意图。

图6为实施例4中不同佐剂组免疫后28天抗体平均值(血清1:320倍比稀释)示意图。

具体实施方式

结合具体实施对本发明做进一步描述和论证，但本发明内容并不局限于此。

本发明实施例所用试剂、病毒液及阳性对照组疫苗如下，如未特别说明，均为本领域的常规方案或试剂。

乳化机：德国，型号：IKA公司RW20D型号

将Quil A(Accurare Chemical&Scientific Corp.)溶解在去离子水中，制备成60mg/ml的储备溶液。然后，利用0.22微米滤器滤过Quil A溶解储备溶液。

将胆固醇(Sigma公司)溶解在无水乙醇中，制备成30mg/ml的储备溶液。然后，利用0.22微米滤器过滤胆固醇储备溶液。

将二甲基双十八烷基溴化铵(Sigma公司)溶解在无水乙醇中，制备成20mg/ml的储备溶液。利用0.22微米滤器过滤DDA储备溶液。

将Carbopol 974p(美国路博润公司)溶解在去离子水中，制备成10mg/ml的储备溶液。然后121℃高压灭菌15min备用。

将Montanide GEL 01(SEPPIC公司)溶液121℃高压灭菌15min备用。

将左旋咪唑(Sigma公司)溶解在去离子水中，制备成20mg/ml的储备溶液。然后，利用0.22微米滤器过滤左旋咪唑储备溶液。

本试验疫苗所用抗原为猪圆环病毒2型-WH株(CCTCC NO：V201333)灭活病毒液。

201佐剂购自法国SIPPEC公司。

201佐剂疫苗制备方法：用水浴锅分别将两相加热到31℃，将盛有佐剂的烧杯，置于搅拌器下，然后将猪圆环病毒2型-WH株(CCTCC NO：V201333)灭活病毒液缓慢加入到盛有佐剂的烧杯中，其中201佐剂与抗原按照质量比为1：1，搅拌转速为500rpm/min。持续搅拌10min即得，最终该疫苗产品中病毒含量为10⁷TCID₅₀/ml，用于本发明实施例。

Marcol52白油购自美国美孚石油化工公司。

Marcol 52佐剂疫苗制备方法：将加有吐温804％v/v猪圆环病毒2型-WH株(CCTCCNO：V201333)灭活病毒液缓慢加入到Marcol 52佐剂中(体积比1:1.5)，然后通过高速剪切2次即可得到该疫苗，最终该疫苗产品中病毒含量为10⁷TCID₅₀/ml，用于本发明实施例。

实施例1：

利用本发明所述佐剂组合物制备猪圆环病毒2型灭活疫苗(WH株)

根据佐剂组合物中不同成分含量进行配比，分别与65ml猪圆环病毒2型病毒液进行乳化，制备成100ml猪圆环病毒2型灭活疫苗(见表1)，制得的疫苗命名为组1、组2、组3、组4，用于以下实施例。

表1：不同佐剂配方制备的疫苗各成分(体积ml)

具体操作方法如下：

a)利用PH7.2PBS缓冲液，调整猪圆环病毒2型-WH株(CCTCC NO：V201333)灭活病毒液的病毒含量，制得病毒原液；

b)将Carbopol 974p加入步骤a的组合物中充分混匀；

c)将Montanide GEL 01加入步骤b的组合物中充分混匀；

d)将二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)加入步骤c的组合物中充分混匀；

e)将Quil A加入步骤d的组合物中充分混匀；

f)将胆固醇加入步骤e的组合物中充分混匀；

g)将左旋咪唑加入步骤f的组合物中充分混匀。

将g步骤得到的水性组合物通过均质机处理。然后按照疫苗总体积添加0.01％硫柳汞混合均匀，最终本疫苗产品中病毒含量为10⁷TCID₅₀/ml。最后分装、检验、压盖、贴签、包装、最后成品检验出库，用于以下实施例。

本发明的佐剂组合物不但能够显著提高猪圆环病毒2型灭活疫苗的体液免疫应答和细胞免疫应答，而且疫苗的配制工艺稳定、免疫持续期长以及因疫苗免疫引起的副反应方面均具有独特的优势。该佐剂组合物制备工艺简单不需要大型设备，成本低廉，且便于疫苗的规模化生产。

实施例2:疫苗稳定性对比试验

实施例1制备的4组猪圆环病毒2型灭活疫苗与201佐剂、Marcol52佐剂制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗稳定性对比试验

实施例1制备的4组猪圆环病毒2型灭活疫苗和201佐剂、Marcol52佐剂制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗分别放置在37℃、25℃、4℃观察。定期抽样观察该疫苗的稳定性(试验结果见表2、表3、表4)。

通过试验结果表明，本研发的佐剂制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗稳定性很好，特别是第一组佐剂，在37℃条件、25℃、4℃条件下都是最佳。

表237℃条件下观察稳定性天数

表325℃条件下观察稳定性天数

表44℃条件下观察稳定性天数

“-”表示颗粒均匀的乳剂。

“-+”表示在疫苗液面上层有乳白色/或有油析出/或分层。

“+”表示疫苗乳液有沉淀，液面上层有大量乳白色物/或破乳。

实施例3：

不同佐剂组合物制备的疫苗抗体消长规律试验

实施例1制备的4组猪圆环病毒2型灭活疫苗与201佐剂、Marcol52佐剂制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫消长规律对比试验

1、对某猪场进行主要病原和相关抗体检测后，选用21-25日龄的猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒等病原阴性猪、猪圆环病毒2型抗体阴性猪。

2、将购回35头抗体阴性猪，随机分为7组，每组5头，1组—6组经颈部肌肉接种1头份疫苗(10⁷TCID50/头份)。第7组(饲养过程中，其中有一头发病。最后在数据统计中将此猪淘汰掉。)作为空白对照(即非免疫组)。

3、免疫前和免疫后第7天、第14天、第28天、第60天、第90天、第120天、150天对每组仔猪采血，分离血清用ELISA方法检测抗体水平。

4、检测试剂

猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒由武汉科前生物股份有限公司诊断试剂部提供。

5、抗体检测方法

严格按照猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒使用说明书进行检测。

6、判定标准

在酶标仪上测定各孔OD_630nm值。试验成立条件为阳性对照孔OD_630nm值应≥1.0，阴性对照孔OD_630nm值应≤0.25。样品孔OD_630nm值≥0.40时，判定为阳性；样品孔OD_630nm值≤0.40时，判定为阴性。

7、不同佐剂制备的猪圆环病毒2型疫苗免疫后抗体检测结果(见表5、表6，图5)。

表5不同佐剂免疫后抗体检测结果

如表5所示，本发明的组1和组3疫苗，在免疫后14天产生抗体最快，平均OD₆₃₀达到0.9688和0.9394。在免疫后56天组1抗体效价OD₆₃₀能达到1.8418，而且组1和组3抗体水平持续150天时较其他佐剂组都高。通过此次试验可以说明，本发明的佐剂组1和组3具有较好的佐剂效果，特别是组1疫苗抗体水平最佳。因此，优选组1用于猪圆环病毒2型灭活疫苗的后备佐剂。

实施例4：

血清倍比稀释抗体检测试验

仔猪在免疫后28天采血、分离血清。对血清进行倍比稀释1/40、1/80、1/160、1/320、1/640。观察免疫后抗体水平(检测方法同实施例3)免疫28天后血清倍比稀释ELISA抗体检测结果(见表6，图6)。

表6免疫28天后血清倍比稀释ELISA抗体检测

如图6所示，在本发明佐剂组1—组4中，血清倍比稀释1：320时都比其他佐剂组都高。特别是组1抗体水平最高。而且通过此次试验可以再次说明，本发明的组1佐剂具有较好的佐剂免疫效果。

实施例5：

不同佐剂制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫效力对比试验

用实施例1制备的4组猪圆环病毒2型灭活疫苗与201佐剂、Marcol52佐剂制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗做免疫效力对比试验。

对某猪场进行主要病原和相关抗体检测，选用21-25日龄的猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒等病原阴性猪、猪乙型脑炎、猪圆环病毒2型抗体阴性猪40头。将符合条件的仔猪随机分为8组，第1-6组(每组5头猪)为免疫组，第7组(5头猪)为攻毒对照组；第8组(5头猪)为空白对照组。免疫组分别通过颈部肌肉免疫1头份疫苗(10⁷TCID₅₀/头份)。免疫后28天对第1-7组同时进行PCV2病毒WH株(病毒含量为1.0x10⁷TCID₅₀/ml，CCTCC NO：V201333)攻击，每只猪颈部肌肉注射3ml，滴鼻2ml，隔离饲养。于攻毒当日，称重所有试验仔猪体重。并于攻毒前3日(即免疫后25日)和攻毒后3日、6日，所有攻毒组仔猪均注射免疫刺激材料(费氏不完全佐剂制备的多孔血蓝蛋白乳剂)，每次每头颈部肌肉注射4ml。观察28天后，再次对所有试验仔猪称重；采集攻毒试验仔猪血样，分离血清检测病毒血症；剖杀攻毒试验仔猪，取腹股沟***和肠系膜***，进行组织学以及免疫组织化学检测。通过以上指标统计分析仔猪的发病情况，采集血样，通过ELISA法进行PCV2血清抗体分析。攻毒后28天剖检全部猪仔，符合以下三项中的两项，即可判定发病。

A体温症状：仔猪体温升高(≥40℃)，应至少持续3天；

B体重标准：相对增重率下降应不低于5.0％，攻毒仔猪的平均日增重应小于非攻毒对照组仔猪的平均日增重。于攻毒当日分别逐头称量所有试验仔猪体重，攻毒后28日再次称量所有试验仔猪体重；其中，“B体重标准”中相对增重率的计算按如下公式进行：

相对增重率(％)＝非攻毒对照组仔猪平均日增重-攻毒组仔猪平均日增重/攻毒对照组仔猪平均日增重X 100

C病毒抗原检测：用免疫组化技术检测***组织，检测到PCV2病毒。

用实施例1制备的4组猪圆环病毒2型灭活疫苗与201佐剂、Marcol52佐剂制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的攻毒保护对比试验结果(见表7)

通过攻毒保护试验结果可以看出每个免疫组保护率都在4/5以上，特别是免疫1组整体免疫效果都比其他各组好。而非免疫组攻毒后发病率在5/5，因此可见，该佐剂制备的疫苗免疫后能对仔猪产生有效的保护，且抗体水平能够作为疫苗效力检验的评价标准。由此可见，本发明的佐剂可以在猪圆环病毒2型疫苗中发挥重要作用，可以使动物得到有效保护。并能有效抵抗猪圆环病毒的感染。

表7：不同佐剂制备的疫苗攻毒保护试验结果

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。

实施例6：

不同佐剂制备猪圆环病毒2型灭活疫苗安全性试验

实施例1制备的4组猪圆环病毒2型灭活疫苗与201佐剂、marcol52佐剂制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗安全性对比试验。

对武汉某猪场进行主要病原和相关抗体检测，选用21-25日龄的猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒等病原阴性猪、猪圆环病毒2型抗体阴性猪35头。将符合条件的仔猪随机分为7组，第1-6组(每组5头猪)为免疫组，第7组为空白对照组。免疫组分别通过颈部肌肉超剂量接种4ml,观察14天，并测定7天体温变化。

实施例1制备的4组猪圆环病毒2型灭活疫苗与201佐剂、marcol52佐剂制备的猪圆环病毒2型疫苗免疫后7天体温变化结果(见表8)

实施例1制备的4组猪圆环病毒2型灭活疫苗与201佐剂、marcol52佐剂制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗安全性对比试验检测结果(见表9)

实施例1制备的4组猪圆环病毒2型灭活疫苗与201佐剂、marcol52佐剂制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫28天后吸收情况对比。

表8：接种前后不同时间的体温变化(℃)

如表8-9所示结果可以看出，本发明的组1-组4疫苗都没有出现任何由疫苗免疫而引起的不良反应。因此可以说明，本发明的水性佐剂组合物适合用于猪圆环病毒2型灭活疫苗的后备佐剂。

表9不同佐剂制备的疫苗安全性试验检测结果

通过上述试验可见，本发明水性佐剂组合物所制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗比其他油性佐剂在通透性、副反应和免疫效果上都效果卓著。该疫苗并能有效抵抗猪圆环病毒的感染,减少猪群发病率，改善猪群整体健康状况，特别是组1和组3疫苗在免疫效果上更具有优势。并且该佐剂组1疫苗稳定性最好，适合疫苗厂家规模化生产和存放。因此，组1疫苗对于目前来说具有很好的市场应用前景。

Claims (3)

1.一种适用于猪圆环病毒2型的水性佐剂组合物，其配方包含：

所述Carbopol 974p的浓度为10mg/ml；Quil A的浓度为60mg/ml；胆固醇的浓度为30mg/ml；二甲基双十八烷基溴化铵的浓度为20mg/ml；左旋咪唑的浓度为20mg/ml；

所述的猪圆环病毒2型为猪圆环病毒2型-WH株，CCTCC NO：V201333。

2.利用权利要求1所述的水性佐剂组合物制备疫苗的制备方法，包括：

a)利用PH7.2的PBS缓冲液，调整灭活病毒液病毒含量，制备病毒原液；

b)将Carbopol 974p加入步骤a的组合物中充分混匀；

c)将Montanide GEL 01加入步骤b的组合物中充分混匀；

d)将二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)加入步骤c的组合物中充分混匀；

e)将Quil A加入步骤d的组合物中充分混匀；

f)将胆固醇加入步骤e的组合物中充分混匀；

g)将左旋咪唑加入步骤f的组合物中充分混匀；

h)将混合均匀的制剂，最后通过均质机处理，即得。

3.权利要求1所述的水性佐剂组合物在制备猪圆环病毒2型灭活疫苗中的应用。