ES2564529T3

ES2564529T3 - Dispositivo y procedimiento para la microscopía de fluorescencia multifotónica para la obtención de informaciones de tejidos biológicos

Info

Publication number: ES2564529T3
Application number: ES10734059.8T
Authority: ES
Inventors: Karl-Heinz Schönborn
Original assignee: WOM World of Medicine GmbH
Current assignee: WOM World of Medicine GmbH
Priority date: 2009-06-17
Filing date: 2010-06-17
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2030-06-17
Also published as: US9846121B2; EP2443503A2; WO2010146134A2; US20150069268A1; EP2443503B1; DE102009029831A1; WO2010146134A3; US20120080616A1; CA2765620C; CA2765620A1; AU2010261751B2; US8912511B2; AU2010261751A1

Abstract

Dispositivo para la microscopia de fluorescencia multifotonica para la obtencion de informaciones a partir de tejido biologico, con - una unidad de laser (120) para generar una radiacion de excitacion (A), - una unidad optica (103), que esta disenada para enfocar la radiacion de excitacion (A) para generar una senal optica (S) a diferentes sitios en o sobre un objeto que va a examinarse (2), y - un modulo de deteccion (121) para registrar la senal optica (S) desde la zona del objeto (2), en donde la unidad optica (103) para generar la senal optica (S) en diferentes sitios en o sobre el objeto (2) puede moverse al menos en una direccion (X, Y, Z) con respecto al objeto (2), caracterizado por que - el dispositivo (1) presenta una unidad de control y de procesamiento (12) y un modulo de paciente (10) conectado a la unidad de control y de procesamiento (12), que para examinar el objeto (2) puede colocarse con respecto al objeto (2), siendo la unidad optica (103) parte del modulo de paciente (10), - la unidad de laser (120) genera una radiacion de excitacion (A) con una primera longitud de onda y aguas arriba de la unidad optica (103) esta conectado en el modulo de paciente un doblador de frecuencia (1001) para reducir a la mitad la longitud de onda de la radiacion de excitacion (A), - el modulo de paciente (10) presenta una seccion de contacto (107) permeable para la radiacion de excitacion (A) y la senal optica (S), que para examinar el objeto (2) ha de ponerse en contacto con el objeto (2), estando presentes medios que mueven la unidad optica (103) en direccion horizontal (X, Y) con respecto a la seccion de contacto (107) dentro del modulo de paciente (10) para generar imagenes en seccion con longitud de canto dada, - la unidad de laser (120) es parte de la unidad de control y de procesamiento (12), conectando una fibra optica (122) la unidad de laser (120) con el modulo de paciente (10) para transmitir la radiacion de excitacion (A) hacia la unidad optica (103), y - la unidad optica (103) puede moverse independientemente de la fibra optica (122) para transmitir la radiacion de excitacion (A).

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Dispositivo y procedimiento para la microscopia de fluorescencia multifotonica para la obtencion de informaciones de tejidos biologicos

La invencion se refiere a un dispositivo para la microscopia de fluorescencia multifotonica para la obtencion de informaciones a partir de tejido biologico segun el preambulo de la reivindicacion 1 asi como a un procedimiento para la microscopia de fluorescencia multifotonica.

Un dispositivo de este tipo presenta una unidad de laser para generar una radiacion de excitacion, una unidad optica, que esta disenada para formar la radiacion de excitacion para generar una senal optica y enfocarla a diferentes sitios en o sobre un objeto que va a examinarse, un modulo de detection para registrar la senal optica desde la zona del objeto asi como un modulo de control y procesamiento de senales para el procesamiento algoritmico y tecnico de senales de las senales opticas mencionadas, para su conversion en una senal de imagen evaluable mediante diagnostico y para el control de toda la instalacion.

En la microscopia de fluorescencia multifotonica (abreviado: microscopia multifotonica) se utilizan los denominados microscopios multifotonicos, en cuyo caso se trata de microscopios opticos especiales del grupo de los microscopios de escaneo laser. Las imagenes microscopicas de alta resolution se generan a este respecto mediante el uso de la denominada fluorescencia multifotonica (principalmente fluorescencia bifotonica) o la generation de armonicos superiores, por ejemplo el duplicado o triplicado de la frecuencia y resultantes de la generacion de los segundos o terceros armonicos (SHG: second harmonic generation; THG: third harmonic generation) de la luz de excitacion irradiada.

En la microscopia multifotonica, con ayuda de una radiacion de excitacion intensa, enfocada, principalmente generada por un laser, se generan efectos opticos no lineales en un tejido que va a examinarse, que se basan en la interaction de varios fotones (particulas de luz) que llegan al mismo tiempo a una molecula. La intensidad de la senal generada, a este respecto, no aumenta linealmente con el numero de los fotones irradiados por unidad de tiempo, sino con el cuadrado (en el caso de efectos bifotonicos) o la tercera potencia (en el caso de efectos trifotonicos). El modo de trabajo de un microscopio multifotonico se asemeja al de un microscopio de escaneo de laser confocal con respecto a la irradiation de la radiacion de excitacion en el tejido. En el microscopio confocal, a diferencia de en el microscopio multifotonico, se usa radiacion primaria remitida y no radiacion secundaria para la generacion de imagenes. El primer aparato presenta ademas, a diferencia del ultimo, en el canal de deteccion de senales, un “Pin-Hole" (diafragma estrecho para la elimination de radiacion remitida desde el exterior del foco de laser). Mientras que, debido a las particularidades mencionadas anteriormente los microscopios de escaneo de laser confocales presentan una profundidad de penetration, segun el preparado, de 50-80 ^m, con la microscopia multifotonica pueden representarse zonas mas profundas, por ejemplo hasta 200 ^m, en casos muy favorables incluso hasta 1000 ^m, de modo que son posibles tomas de imagenes relevantes o mas relevantes de tejido vivo, por ejemplo de capas de la piel de un ser humano.

El procedimiento mas extendido para la microscopia multifotonica es la microscopia de fluorescencia bifotonica (abreviado: microscopia bifotonica). Mientras que en la microscopia de fluorescencia (monofotonica) convencional, en una molecula fluorescente se excita un electron mediante la absorcion en cada caso de un foton, es decir, se desplaza a un estado energetico superior, en la microscopia de fluorescencia bifotonica la excitacion del electron se provoca por la absorcion simultanea o casi simultanea de dos fotones (absorcion bifotonica).

En la microscopia trifotonica, la excitacion tiene lugar, de manera correspondiente, mediante tres fotones que inciden al mismo tiempo o casi al mismo tiempo.

La fluorescencia se genera cuando colorantes absorben fotones (de excitacion) incidentes y, posteriormente emiten de nuevo otro foton. Mediante los fotones de excitacion un electron sube a un nivel energetico superior y, con ello, almacena de manera intermedia la energia fotonica. En la microscopia de fluorescencia normal, esta excitacion se produce mediante exactamente un foton. El electron permanece durante algunos cientos de picosegundos hasta varios nanosegundos en el nivel energetico superior, antes de que caiga de nuevo y, a este respecto, emita un nuevo foton, de menor energia, de mayor longitud de onda. Cuando se excita, por ejemplo, con luz azul, se genera por ejemplo fluorescencia verde, por ejemplo en el caso de la fluoresceina. En la microscopia bifotonica la excitacion de un electron tiene lugar exactamente mediante dos fotones que, en total, presentan la misma energia que el foton de excitacion de la microscopia de fluorescencia normal. Sin embargo, una condition previa para la excitacion es que los dos fotones lleguen al mismo tiempo, en el plazo de attosegundos (10-18 s), dado que no existe ningun nivel energetico intermedio estable del electron que va a excitarse.

En la microscopia de fluorescencia normal, el foton excitado tiene una longitud de onda mas corta y, por lo tanto mas energia que el foton emitido. A diferencia de esto, en la excitacion multifotonica se excita con fotones que presentan una longitud de onda claramente mayor y por lo tanto menos energia por foton que los fotones emitidos. Por ejemplo, de esta manera, puede utilizarse luz infrarroja o de color rojo oscuro para la excitacion, para generar fluorescencia verde. Esto es posible porque dos o mas fotones de excitacion solo llevan a la generacion de un foton

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

emitido. En la excitacion bifotonica, la longitud de onda de excitacion asciende aproximadamente al doble de la longitud de onda de excitacion usada normalmente, en la excitacion trifotonica asciende al triple, etc.

El concepto fundamental de la microscopia de fluorescencia bifotonica se describe en la publicacion W. Denk, J.H. Strickler, W.W. Webb “Two-Photon Laser Scanning Fluoroescence Microscopy", Science, Vol. 248, paginas 73-76 (6 de abril de 1990).

Por el documento US 5.034.613 se conoce un dispositivo para la microscopia de fluorescencia multifotonica en el que una radiacion de excitacion generada por un laser se dirige a traves de un espejo movil que se encuentra en la trayectoria del haz hasta un objeto que va a examinarse. A este respecto, para conseguir una excitacion en diferentes sitios del objeto y, de este manera, generar una imagen excitada pixel a pixel, se modifica la longitud del haz de excitacion mediante orientacion del espejo movil, de modo que el punto de enfoque de la radiacion de excitacion se mueve por el objeto, lo excita sitio por sitio y de esta manera genera senales sitio por sitio en el objeto. La radiacion secundaria generada de esta manera (compuesta por una radiacion de fluorescencia y posiblemente armonicos superiores generados de la radiacion de excitacion) se recoge y se detecta para generar una imagen completa en uno o varios planos del objeto por medio de las senales de los sitios individuales.

Con el dispositivo conocido por el documento US 5.034.613 pueden generarse esencialmente solo imagenes en seccion de un pequeno corte del objeto que va a examinarse. Esto se debe a que en la microscopia bifotonica, debido a las altas intensidades necesarias para la excitacion, que hacen necesario un enfoque de la radiacion de excitacion hasta un diametro de foco de 0,5 ^m a, como maximo, aproximadamente 3 ^m, son necesarias grandes aberturas de la optica usada (esto resulta de la ley de conservacion de productos de rayos en la formacion de imagenes optica de rayos laser). Estos aparatos presentan una abertura numerica de NA=0,4 a NA=1 (o en el caso del uso de un fluido de inmersion hasta NA=1,45), lo que corresponde a un angulo de cono completo del haz enfocado de aproximadamente 50° a 135°. Tales haces de rayos de gran abertura pueden enfocarse solamente por objetivos de microscopio de gran aumento u opticas complejas comparables, que presentan inevitablemente solo campos de visibilidad relativamente pequenos con un diametro de aproximadamente 0,5 mm a 1 mm (por un campo de visibilidad se entiende en este caso el campo maximo que puede cubrir un haz de excitacion desviado). Es decir, con otras palabras: en los grandes aparatos necesarios para la microscopia bifotonica, para enfocar la radiacion de excitacion hacia el objeto esta forzosamente limitada la superficie que puede cubrir la radiacion de excitacion mediante la desviacion del haz. Mediante la excitacion del haz, con el uso de espejos giratorios y orientables, pueden excitarse solamente campos con un diametro de, como maximo, 1 mm, de modo que las imagenes que pueden captarse estan limitadas a longitudes de canto de, como maximo, 1 mm.

Para utilizar la microscopia bifotonica por ejemplo para el examen de una capa de piel para detectar alteraciones patologicas, tales imagenes son, con frecuencia, demasiado pequenas.

Convencionalmente, en la microscopia bifotonica se lleva a cabo en primer lugar un escaneo lateral de un plano (capa de piel) y a continuacion se ajusta de nuevo la profundidad de foco para la toma de imagenes de otras capas de piel, por ejemplo mas profundas. De esta manera se registra sucesivamente una sucesion de capas superpuestas a traves de la piel. De manera deseable, por el contrario, desde el punto de vista del usuario, en el caso del uso medico, serian imagenes en seccion verticales a traves de la piel, que corresponden a la posicion de corte habitual en histopatologia, que son habituales para el examinador medico y que corresponden a su vista de diagnostico.

En conjunto, serian deseable por consiguiente, imagenes de la piel en posicion de corte vertical, que pueden representar completamente por ejemplo una lesion que se extiende a lo largo de una longitud de varios mm o incluso cm.

Por el documento EP 1 929 939 A2 se conoce un dispositivo que puede utilizarse por via endoscopica para la microscopia multifotonica, en el que la punta de una fibra optica que sirve como conductor de luz puede moverse en un endoscopio con una optica de enfoque miniaturizada dispuesta en la misma, para dirigir hacia un objeto una radiacion de excitacion generada por un laser. Debido a que en la punta del conductor de luz puede utilizarse unicamente una optica de pequenas dimensiones y, por consiguiente, tambien puede utilizarse una pequena abertura, esta limitada la resolucion espacial alcanzable, dado que solamente pueden conseguirse diametros de foco relativamente grandes con respecto a la excitacion espacial. Ademas, la disposicion del documento EP 1 929 939 A2 usa para la introduccion de la radiacion de excitacion y el retorno de las senales opticas tomadas del objeto usa el mismo conductor de luz, lo que representa por un lado altos requisitos en cuanto al conductor de luz (transmision de radiacion laser de pulso ultracorto de alta calidad de haz, es decir, en el modo TEM00) y, por otro lado, es desventajoso para la calidad y el rendimiento de transmision de las senales recibidas. La calidad de la radiacion de excitacion transmitida se empeora adicionalmente por la dispersion de fibras, por ejemplo mediante prolongacion de la duracion de pulso o el denominado “Chirping". Ademas, durante el movimiento de la optica de enfoque para la toma de imagen completa se mueve conjuntamente siempre el conductor de luz, lo que hace necesario y al mismo tiempo limita el movimiento espacial, dado que no pueden tomarse imagenes en seccion de gran extension lateral.

En el documento EP 1 929 939 A2 se genera una radiacion de excitacion mediante un laser de femtosegundos y se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

suministra a traves de un obturador, un debilitador y un espejo divisor dicroico de una fibra. En este se suministra directamente al objeto la radiacion de excitacion con la verdadera frecuencia de excitacion a traves de la fibra optica.

El documento WO 2007/054495 A1 se refiere a una estructura mecanica para el escaneo de un objeto, en la que no esta prevista una transmision de una radiacion de excitacion generada por una unidad de laser por medio de una fibra. Una estructura similar se conoce tambien por el documento US 5.459.325.

En el caso de un dispositivo conocido por el documento DE 100 65146 A1, se genera una radiacion de excitacion mediante un laser de femtosegundos con una longitud de onda de 800 nm y se suministra a traves de un brazo articulado optico con elementos reflectantes de una optica de escaner.

El documento US 6.249.630 describe una transmision entre una fuente optica y un aparato optico, en el que antes del acoplamiento en una fibra optica esta prevista una extension de pulsos opticos en un denominado extensor, para obtener pulsos opticos ampliados con una potencia pico reducida (“chirped optical pulses"). Estos pulsos han de comprimirse a su vez a la salida de las fibras, para deshacer la extension y devolver los pulsos a su forma de salida. Para ello esta previsto un denominado compresor.

La presente invencion se basa en el objetivo de crear un dispositivo y un procedimiento para la microscopia de fluorescencia multifotonica para la obtencion de informaciones a partir de tejido biologico, que en un gran campo visual permiten la toma de imagenes en seccion en particular verticales en un objeto y a este respecto estan construidas de manera sencilla y tienen un funcionamiento fiable. A este respecto, no se empeoraran o solo minimamente las propiedades de haz temporales, espectrales y relativas a la polarizacion de la radiacion de excitacion con respecto a su trayectoria del haz, y se mejoraran la manipulacion (ergonomia) y la capacidad de uso.

Este objetivo se resuelve mediante un objeto con las caracteristicas de la reivindicacion 1.

De acuerdo con la invencion esta previsto a este respecto que la unidad optica para generar la senal optica en diferentes sitios en o sobre el objeto este disenada y prevista para moverse al menos en una direccion con respecto al objeto.

La invencion parte de la idea fundamental de usar una denominada optica volante. La unidad optica para enfocar la radiacion de excitacion y para excitar una radiacion secundaria en un sitio en o sobre el objeto no esta dispuesta de manera fija, sino que se mueve en conjunto, para excitar diferentes sitios de un objeto, uno tras otro en el tiempo. Por lo tanto, la excitacion espacial no tiene lugar mediante desviacion del haz con el uso de espejos giratorios y orientables, sino mediante un movimiento unidimensional o multidimensional de la unidad optica en su conjunto. De manera ventajosa, durante el movimiento de la unidad optica para generar la senal optica, a este respecto, no deberia cambiar el eje optico de la radiacion de excitacion que incide sobre el objeto, de modo que, a diferencia de un uso de espejos giratorios y orientables, la radiacion de excitacion siempre incide con el mismo angulo sobre el objeto.

Debido a que se prescinde de una desviacion del haz por medio de espejos giratorios y orientables, pueden conseguirse grandes campos visuales. Esto significa que pueden excitarse teoricamente campos de cualquier tamano, para generar de esta manera imagenes con grandes longitudes de canto del objeto que va a examinarse. Esto permite por ejemplo, tomar imagenes en seccion de la piel humana, que pueden representar completamente lesiones.

De acuerdo con la invencion, la unidad optica puede moverse en direccion horizontal y/o en direccion vertical con respecto a una superficie del objeto dirigida a la unidad optica. Para la toma de una imagen en seccion se desplaza la unidad optica, por un lado, a lo largo de la superficie del objeto, por ejemplo a lo largo de la superficie de la piel de un paciente, pudiendo tener lugar el movimiento tambien de manera bidimensional en direccion X e Y a lo largo de la superficie de la piel y, al mismo tiempo, en direccion Z verticalmente con respecto a la superficie de la piel para generar senales en un espacio tridimensional. Durante el procedimiento se excitan uno tras otro diferentes sitios del objeto, y la radiacion secundaria generada en el objeto, compuesta por radiacion de fluorescencia generada en el objeto y armonicos generados por efectos no lineales de la radiacion de excitacion (SHG: second harmonic generation = generacion de la primera onda armonica), se recoge como senal optica.

Para conseguir de manera sencilla un movimiento del foco en direccion vertical, puede estar previsto no perfeccionar de manera movil toda la unidad optica (que comprende por ejemplo un elemento dicroico para la separation de radiacion de excitacion y senales opticas recibidas), sino unicamente un objetivo. El objetivo, que puede presentar por ejemplo una lente optica para enfocar, es por lo tanto movil con respecto al resto de la unidad optica al menos en direccion vertical, para mover en direccion vertical el foco dentro del objeto que va a excitarse y generar senales en forma de una radiacion secundaria en diferentes sitios, desplazados verticalmente.

Para la generacion pixel a pixel de una imagen en seccion vertical, la unidad optica puede ser desplazable al menos por secciones de manera continua en direccion horizontal y/o en direccion vertical con respecto al objeto. La unidad optica se mueve a lo largo de lineas de toma predefinidas (lineas de escaneo) y escanea el objeto a lo largo de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

estas lmeas de toma, excitandose uno tras otro, por ejemplo mediante desencadenamiento de la radiacion de excitacion para la exposicion dependiente del tiempo, sitios a lo largo de la linea de toma dentro del objeto para la emision de radiacion secundaria y recibiendose senales desde estos sitios. Las senales desde un sitio dan como resultado entonces un p^xel de la imagen que va a tomarse, tramandose por medio de las lineas de toma (lineas de escaneo) el objeto a lo largo de un plano que va a observarse, de modo que resulta una imagen completa, por ejemplo evaluable para el diagnostico medico.

El dispositivo se utiliza para la microscopia multifotonica y esta construido a este respecto de manera modular. Como unidad central, el dispositivo presenta una unidad de control y de procesamiento, que esta conectada a traves de un brazo de soporte con un denominado modulo de paciente. Por “brazo de soporte” se entiende en este caso y en lo sucesivo, un dispositivo de sujecion mecanico que permite una movilidad de marcha suave del modulo de paciente, dado el caso con compensacion de peso, mientras que permite el posicionamiento del equipo de medicion en relacion con el paciente o la muestra asi como una fijacion durante el periodo de tiempo de la toma de fluorescencia. La unidad de control y de procesamiento esta disenada de manera estacionaria, sirve para el control central del dispositivo y el procesamiento de las senales recibidas y presenta tambien la unidad de laser para generar la radiacion de excitacion. El modulo de paciente es movil a traves del brazo de soporte con respecto a la unidad de control y de procesamiento y puede colocarse sobre un objeto que va a examinarse de modo que la radiacion de excitacion incide de manera adecuada sobre el objeto, por ejemplo la piel de un paciente, y pueden recogerse las senales generadas. La unidad optica es parte del modulo de paciente y puede moverse dentro del mismo, presentando el modulo de paciente una seccion de contacto permeable para la radiacion de excitacion y la senal optica (por ejemplo un disco de vidrio dispuesto en una carcasa del modulo de paciente), que para examinar el objeto ha de ponerse en contacto con el objeto. Mientras que la seccion de contacto durante una toma se apoya de manera estacionaria contra el objeto que va a examinarse (por ejemplo con el uso de un fluido de inmersion), la unidad optica puede moverse en direction horizontal y/o en direction vertical con respecto a la seccion de contacto y por lo tanto tambien con respecto al objeto.

La unidad de laser es parte de la unidad de control y de procesamiento y por lo tanto esta separada espacialmente del modulo de paciente. La radiacion de excitacion generada por la unidad de laser se transmite a traves de una fibra optica hacia el modulo de paciente y hacia la unidad optica para la irradiation sobre el objeto. La fibra optica puede instalarse a este respecto a lo largo del brazo de soporte o tambien dentro del brazo de soporte con respecto al modulo de paciente.

Para conseguir para la microscopia bifotonica o multifotonica una llegada simultanea de dos o mas fotones en el punto de foco y de esta manera excitar las moleculas dentro del objeto, son necesarias densidades fotonicas muy altas en la radiacion de excitacion. Estas pueden conseguirse por ejemplo utilizandose un laser pulsado (laser de pulso ultracorto) para generar pulsos de laser en el intervalo de femtosegundos en particular con acoplamiento de modo. Laseres de este tipo envian pulsos de laser intensos, muy cortos (con longitudes de pulso en el intervalo de femtosegundos, por ejemplo 80-140 fs), que se repiten por ejemplo 80-120 millones de veces por segundo, de modo que resultan pausas entre los pulsos con una longitud de 8 a 12,5 ns (= 8000000-12500000 fs) y la energia generada en el laser total se emite de esta manera en forma pulsada con alta intensidad en una fraction del tiempo.

La unidad de laser genera una radiacion de excitacion de una primera longitud de onda, por ejemplo 1560 nm. En el modulo de paciente esta dispuesto entonces un doblador de frecuencia conectado aguas arriba de la unidad optica (por ejemplo en forma de un cristal de duplicado de frecuencia), que reduce a la mitad la longitud de onda de la radiacion de excitacion (por ejemplo de 1560 nm a 780 nm) y con ello dobla la frecuencia de la radiacion de excitacion. Esto tiene la ventaja de que la radiacion de excitacion puede transmitirse con una longitud de onda relativamente grande de por ejemplo 1560 nm a traves de una fibra optica adecuada desde la unidad de laser hacia el modulo de paciente, estando disponibles para un intervalo de longitud de onda de este tipo fibras, que permiten una transmision, tambien manteniendo la polarization (“fibras unimodales de mantenimiento de la polarization”), sin menoscabo notable de la calidad del haz. El doblador de frecuencia genera entonces la primera onda armonica de la radiacion de excitacion transmitida (por ejemplo 780 nm), que se usa para la excitacion del objeto.

La unidad de laser puede estar realizada tambien como un denominado laser de fibra de femtosegundos con fibra de laser a su traves, que se extiende hasta el modulo de paciente. De esta manera, puede prescindirse de un denominado “Pre Chirp” (una predistorsion de la radiacion de excitacion para la compensacion de los efectos de dispersion, sobre todo de la dispersion de la velocidad de grupo, en la trayectoria optica desde la fuente de haz de laser hasta el tejido), porque el extremo de la fibra de laser representa el sitio de salida de la radiacion de excitacion del resonador de laser y con ello la fuente de radiacion de laser primaria. En el modulo de paciente tiene lugar entonces el duplicado de frecuencia de la radiacion de excitacion o la reduction a la mitad de la longitud de onda desde 1560 nm hasta 780 nm.

La idea de usar una unidad de laser, que genera una radiacion de una primera longitud de onda, que se convierte entonces posteriormente en una radiacion de excitacion con otra longitud de onda y en la que la fuente de radiacion primaria, (genera la primera longitud de onda) esta montada en una unidad de aparato y transmite su radiacion a traves de una fibra optica a una segunda unidad de aparato separada, donde la radiacion mediante conversion se convierte en la longitud de onda de excitacion y entonces se reutiliza, representa en este contexto tambien un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

concepto independiente, que puede utilizarse en los mas diversos dispositivos para la microscop^a de fluorescencia multifotonica para la obtencion de informaciones a partir de tejido biologico. Un dispositivo de este tipo puede presentar por ejemplo, en general, las siguientes caracteristicas:

- una unidad de laser para generar una radiacion de excitacion,

- una unidad optica, que esta disenada para enfocar la radiacion de excitacion para generar una senal optica a diferentes sitios en o sobre un objeto que va a examinarse, y

- un modulo de deteccion para registrar la senal optica desde la zona del objeto, generando la unidad de laser una radiacion de una primera longitud de onda y transmitiendo a traves de una fibra optica hasta la unidad optica, donde se convierte entonces a continuation en la radiacion de excitacion con una segunda longitud de onda diferente de la primera longitud de onda.

De esta manera, la unidad de laser puede generar por ejemplo una radiacion con una longitud de onda de 1560 nm, que se convierte entonces en una radiacion de excitacion con una longitud de onda reducida a la mitad de 780 nm y se suministra a la unidad optica para la excitacion del objeto.

Tambien el concepto del escaneo lineal mediante el movimiento de la unidad optica a lo largo de una linea de toma predeterminada (linea de escaneo) para generar una imagen en section bidimensional o de una imagen volumetrica tridimensional es independientemente de la generation de haz en dos etapas mencionada anteriormente un concepto de la invencion independiente.

El rayo laser de la radiacion de excitacion puede estar polarizado linealmente por ejemplo originalmente de manera correspondiente a un modo fundamental transversal (TEM00), pudiendo polarizarse circularmente para compensar las inhomogeneidades del haz antes de alcanzar la unidad optica por ejemplo mediante incorporation de una placa de cuarto de onda.

De manera ventajosa, la unidad optica esta disenada, por un lado, para enfocar la radiacion de excitacion hacia el objeto y por otro lado para captar la senal optica excitada bifotonica. La unidad optica puede estar conectada a este respecto con una fibra optica, a traves de la que se transmite la senal optica recogida al modulo de deteccion para el procesamiento adicional. Para esta fibra optica (tambien denominada “fibra de recogida") se usa preferentemente una fibra multimodal o un haz de fibras de una pluralidad de fibras individuales, que estan cogidas en los extremos y asi forman en cada caso una superficie de entrada o de salida compacta de la radiacion de fluorescencia.

En el modulo de deteccion, que esta integrado ventajosamente en la unidad de control y de procesamiento, pero tambien puede estar incorporado directamente en el modulo de paciente, tiene lugar el procesamiento de senales y el tratamiento de imagenes. Para poder obtener a este respecto tanto informaciones de intensidad como informaciones espectroscopicas, puede tener lugar en varios canales el procesamiento de senales, dividiendose la senal recibida en el modulo de deteccion en varias fracciones de senal diferentes con diferentes intervalos de longitud de onda, que entonces pueden procesarse por separado unas de otras. De esta manera, la senal se divide en diferentes bandas de senal con diferentes longitudes de onda, pudiendo seleccionarse de manera adecuada las bandas en funcion de las informaciones buscadas. Si se debe determinar por ejemplo donde presenta aproximadamente un maximo, entonces, la relation de las fracciones espectrales puede representarse en una banda superior (con longitudes de onda mas largas) y en una banda inferior (con longitudes de onda mas cortas). Si deben detectarse determinadas sustancias fluorescentes, entonces una banda puede abarcar de manera dirigida el intervalo de longitudes de onda, en el que la sustancia investigada emite una radiacion de fluorescencia. Por ejemplo, pueden detectarse de esta manera para el fin del diagnostico fotodinamico (abreviado PDD) o terapia fotodinamica (abreviado PDT) porfirina (en particular la protoporfirina IX, PP IX) en celulas que con la excitacion emiten radiacion de fluorescencia en determinados intervalos de longitud de onda (PP IX por ejemplo, entre otras, a aproximadamente 630 nm). De la presencia de la porfirina puede deducirse entonces el estado del tejido, en particular las neoplasias de tejido patologicas tal como por ejemplo en el cancer, pudiendo usarse esta information a su vez para el control en el marco de la terapia fotodinamica para el dano o la destruction celular dirigida.

El dispositivo puede utilizarse para la representation tanto de sustancias propias del organismo como de sustancias fluorescentes ajenas al organismo (los denominados fluoroforos). Fluoroforos naturales que aparecen en la piel humana son a este respecto por ejemplo NAD(P)H, colageno, elastina, triptofano, flavinas, lipo-pigmentos, queratina, HPD (hematoporfirina y derivados) asi como PP IX, que fluorescen en diferentes intervalos de longitud de onda y por lo tanto pueden registrarse mediante la eleccion adecuada de las bandas consideradas en cada caso.

Para descomponer la senal recibida en fracciones de senal, el modulo de deteccion presenta uno o varios elementos de filtro dicroicos, que reflejan o transmiten en funcion de la longitud de onda la radiacion incidente y con ello descomponen en funcion de la longitud de onda.

Para poder analizar de manera sencilla diferentes bandas espectrales, puede estar previsto a este respecto configurar de manera intercambiable uno o varios elementos de filtro dicroicos a modo de un sistema modular. Si se considera la senal recibida en determinadas bandas, entonces se selecciona el conjunto adecuado para ello de elementos de filtro dicroicos, por ejemplo espejos o prismas dicroicos y se inserta en el modulo de deteccion. Si se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

consideran otras bandas, puede usarse otro conjunto de elementos de filtro y se repite de manera correspondiente la medicion. Este cambio de filtro puede realizarse manualmente o a modo de un revolver de filtro que se mueve a motor o cargador de cambio de filtro.

En este contexto puede concebirse tambien llevar a cabo con el dispositivo espectroscopia de alta resolucion, es decir, registrar pixel a pixel un espectro completo. Una condicion previa para ello es que desde cada sitio se reciba un numero suficientemente grande de fotones para una senal suficientemente intensa, evaluable. Opcionalmente, pueden integrarse para ello senales de varios sitios excitados.

Para la deteccion de las diferentes fracciones de senal, el modulo de deteccion presenta por ejemplo, en funcion del numero de las bandas consideradas, uno o varios detectores, que estan disenados por ejemplo como los denominados multiplicadores de electrones secundarios (Photo Multiplier Tube, PMT), como linea CCD, como campo CCD o como SiPMT (“Silicon Photo Multiplier”, es decir, elementos constructivos con campos de detector de fotodiodos de avalancha conectados de manera aditiva de fotosenal) y sirven para la conversion de la senal optica recibida o de su fracciones de senal individuales en senales de datos electronicas.

Para el procesamiento de imagenes, el modulo de deteccion puede generar a partir de las diferentes fracciones de senal, por un lado, una informacion de claridad y, por otro lado, una informacion espectroscopica y emitir como imagen en seccion mediante el objeto que va a examinarse con una informacion adicional espectroscopica y por ejemplo visualizarse en un monitor. A este respecto, por ejemplo a partir de la totalidad de las fracciones de senal, puede derivarse una informacion de claridad, que proporciona informaciones estructurales por medio del contraste de imagen. Pueden superponerse mediante un usuario de manera seleccionable y ajustable informaciones adicionales espectrales, que se han obtenido a partir de las fracciones de senal individuales y con ello diferentes bandas de longitudes de onda. Por ejemplo, a la imagen de claridad puede superponerse la informacion y se representan en colores alterados, sitios en los que esta presente una sustancia fluorescente determinada o sitios en los que aparecen ondas armonicas de senal (por ejemplo SHG) mediante propiedades de tejido estructurales (por ejemplo mediante la presencia de colageno en determinadas capas de piel).

El objetivo se resuelve ademas mediante un procedimiento para la microscopia de fluorescencia multifotonica para la obtencion de informaciones a partir de tejido biologico de acuerdo con la reivindicacion 9 en el que una unidad de laser genera una radiacion de excitacion, una unidad optica la radiacion de excitacion para generar una senal optica enfoca a diferentes sitios en o sobre un objeto que va a examinarse y un modulo de deteccion registra la senal optica desde la zona del objeto. En el marco del procedimiento esta previsto que la unidad optica para generar la senal optica se mueva en o sobre el objeto al menos en una direccion con respecto al objeto.

Las ventajas y configuraciones descritas anteriormente para el dispositivo pueden transmitirse de manera analoga al procedimiento.

A partir de las senales opticas recibidas, puede generarse en diferentes sitios del objeto pixel a pixel una imagen en seccion del objeto, exponiendose para la excitacion pixel a pixel el objeto de manera desencadenada a la radiacion de excitacion. Con otras palabras, la unidad optica se desplaza con respecto al objeto a lo largo de una linea de toma adecuada, previamente establecida (linea de escaneo), y a este respecto el objeto se excita y por lo tanto se expone sucesivamente en sitios individualmente, que corresponden en cada caso precisamente al sitio del foco momentaneo de la unidad optica, pudiendo controlarse el desencadenamiento en funcion del sitio y pudiendo ajustarse el tiempo de exposition, es decir, el tiempo de la irradiation de un sitio determinado, de manera adecuada.

El desencadenamiento de la radiacion de excitacion sirve, entre otras cosas, para establecer el tamano de pixel. El tamano de pixel de la imagen obtenida a partir de senales recibidas, dependientes de sitio, esta determinado en direccion horizontal mediante la anchura de foco de la radiacion de excitacion y mediante el ajuste del desencadenamiento, mientras que en direccion vertical el tamano de pixel esta dado mediante la longitud de talle de la radiacion de excitacion enfocada. Mediante un ensanche del haz de la radiacion de excitacion y ajuste del desencadenamiento puede ajustarse entonces el tamano de pixel, pudiendo usarse por ejemplo para la espectroscopia pixeles relativamente grandes, para obtener una senal relativamente intensa, mientras que para la microscopia de alta resolucion pueden utilizarse preferentemente pixeles pequenos. A este respecto, la generation de imagenes (microscopia) y la espectroscopia transcurren en paralelo en el tiempo durante el mismo proceso de escaneo.

En este contexto puede concebirse desplazar el tamano de pixel de manera escalonada o no escalonada, cambiando por un lado el ensanche del haz por medio de un cambio de aumento o de un ZOOM en un telescopio de ampliation y con ello se ajusta la longitud de talle y con ello la extension vertical del pixel y, por otro lado, mediante el cambio del desencadenamiento se varia de manera correspondiente la extension lateral del foco.

En la microscopia bifotonica se enfoca la radiacion de excitacion tal como se describio anteriormente en forma de un rayo laser con una alta abertura en el objeto (por regla general, un tejido), para conseguir un pequeno diametro de foco y una baja profundidad de campo y con ello un pequeno volumen de excitacion de fluorescencia, es decir una alta resolucion espacial lateral y axial. Distanciandose de esto, puede usarse como alternativa una denominada

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

“excitacion de fluorescencia homogeneizada”, en la que el objetivo es excitar una zona lateralmente delimitada, pero axialmente (verticalmente) extendida del objeto, de modo que en direccion axial, capas del objeto contribuyen en su mayor parte de manera equilibrada al menos a lo largo de un intervalo de profundidad determinada a la senal optica. Esta senal optica se recoge entonces y se integra y puede evaluarse y reprocesarse como valor medio individual, como espectro o en varios canales con bandas espectrales separadas (“espectroscopia de banda”).

Para la toma se mueve la unidad optica exclusivamente en direccion horizontal (lateral) (en direccion X o en direccion X e Y) hacia la superficie del objeto, y la senal optica se integra en direccion vertical. Se genera un cambo de valores de medicion, que no representa ninguna imagen de objeto (imagen de tejido) como en la microscopia bifotonica convencional, sino que proporciona en conjunto una information de resolution de sitio lateral a lo largo del estado del objeto.

La excitacion de fluorescencia homogeneizada puede conseguirse por que la radiation de excitacion se irradia con una abertura relativamente pequena en el tejido y se enfoca hasta una profundidad determinada. El haz e excitacion enfocado por un objetivo de la unidad optica, por ejemplo una lente asferica, se define en este sentido a traves de la abertura, la profundidad de foco y el diametro de foco. La profundidad de foco se ajusta para la excitacion de fluorescencia homogeneizada de manera ventajosa a un valor entre 100 ^m y 450 ^m, preferentemente de 200 ^m a 350 ^m (medido en aire, antes de la colocation del sistema de medicion sobre la piel, es decir sin correction del indice de refraction del tejido), el diametro de foco a un valor entre 6 ^m y 10 ^m, preferentemente entre 7 ^m y 9 ^m, y la abertura a un valor entre 50 y 80 mrad (de manera correspondiente al seno de la mitad del angulo de abertura del cono de abertura en aire, es decir sin correccion del indice de refraccion del tejido).

Sorprendentemente se muestra que mediante este ajuste de los parametros para la excitacion de fluorescencia homogeneizada pueden compensarse y nivelarse efectos indeseados. Normalmente, la radiacion de excitacion se debilita en un tejido mediante dispersion y absorcion, de modo que zonas de tejido en mayor profundidad se excitan mas debilmente para la fluorescencia que zonas cercanas a la superficie. Ademas, la senal optica de zonas cercanas a la superficie, en su trayectoria desde el sitio de excitacion hasta el sistema de medicion se debilita menos que senales opticas de mayores profundidades. Estas dos cosas llevan a que la senal optica medida se determine normalmente con demasiado peso por parte de las zonas cercanas a la superficie (en el caso de la piel, por ejemplo, esto significa que la capa de queratina, que se ve afectada considerablemente por sustancias extranas tal como cosmeticos, y que, de todos modos, puede observarse adecuadamente desde el exterior, eclipsa la senal optica deseada desde la profundidad). Con los parametros seleccionados en este caso para el ajuste de la profundidad y anchura de foco asi como la abertura, debido a la excitacion bifotonica, en la que la probabilidad de excitacion crece proporcionalmente con respecto al cuadrado de la intensidad, aumenta la probabilidad de excitacion en una medida tal como los efectos de profundidad mencionados anteriormente debilitan las senales opticas. Con ello se genera una contribution principalmente equilibrada en conjunto de todas las capas de tejido para la senal optica medida.

La profundidad de integration para la senal optica en el objeto (tejido) se limita principalmente por que el efecto bifotonico ya no actua despues de alcanzar la profundidad de foco. Mediante medidas opticas tal como la prevision de un diafragma en la optica de recogida (limitation de la eficiencia de recogida) puede reforzarse aun mas este efecto de corte.

Como una ventaja adicional se muestra que oscilaciones de la profundidad de foco en el caso de parametros por lo demas constantes de la radiacion de excitacion enfocada, solo influyen ligeramente en la senal optica medida (integrada a lo largo de la profundidad). La medicion es por lo tanto relativamente insensible frente a oscilaciones del acoplamiento del sistema de medicion con la piel.

Ha de senalarse en este punto que el principio de la optica volante como tambien la excitacion de fluorescencia homogeneizada mediante la election adecuada de diafragmas y enfoque puede emplearse de manera ventajosa tambien en la microscopia confocal y la microscopia de fluorescencia confocal (monofotonica).

La idea en la que se basa la invention se explicara en detalle a continuation por medio de los ejemplos de realization representados en las Figuras. Muestran:

la Figura 1 una representation de vista de conjunto de un dispositivo para la microscopia de

fluorescencia multifotonica, que presenta una unidad de control y de procesamiento central, que esta conectada a traves de un brazo de soporte con un modulo de paciente que va a disponerse en un paciente;

la Figura 2 una representacion esquematica de una toma de imagen en section vertical (sagital);

la Figura 3

una vista de conjunto esquematica de un dispositivo para la microscopia de fluorescencia multifotonica con sus componentes individuales;

la Figura 4

una vista esquematica de un modulo de paciente;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

la Figura 5 la Figura 6 la Figura 7 la Figura 8 la Figura 9 la Figura 10

una vista esquematica de una unidad optica que se mueve en horizontal y en vertical del modulo de paciente para la toma de una imagen en seccion;

una vista esquematica de un modulo de deteccion para la deteccion de senales recibidas; una representacion grafica de dos espectros de ejemplo;

una representacion en diagrama de un procedimiento para el procesamiento de senales; una representacion de una forma de realizacion alternativa de un modulo de paciente; un diagrama esquematico de una excitacion de fluorescencia homogeneizada y

las Figuras 11A, 11B representaciones graficas de un factor de peso dependiente de la profundidad en funcion de la profundidad de tejido sin corte de profundidad (Figura 11A) y con corte de profundidad (Figura 11 B).

La Figura 1 muestra en una representacion de vista de conjunto un dispositivo 1 para la microscopia de fluorescencia multifotonica para la obtencion de informaciones a partir de tejido biologico, que presenta una unidad de control y de procesamiento 12, que esta conectada a traves de un brazo de soporte 11 con un denominado modulo de paciente 10. Mientras que la unidad de control y de procesamiento 12 como unidad central, estacionaria se encarga por un lado del dispositivo y por otro lado del procesamiento de las senales recibidas y emite resultados de manera adecuada a traves de un monitor 13, el modulo de paciente 10 esta disenado como modulo cuya posicion puede adaptarse, que puede disponerse en un paciente, que presenta principalmente componentes opticos para el acondicionamiento, la transmision y modificacion optica de una radiacion de excitacion incidente, generada por una unidad de laser de la unidad de control y de procesamiento 12 y transmitida a traves de una fibra optica al modulo de paciente 10 por un lado, y para la recogida de una senal optica recibida, por otro lado.

El modulo de paciente 10 representa por lo tanto un cabezal de medicion que puede moverse libremente y detenerse con precision a traves del brazo de soporte 11 de varios ejes, de modo que despues del posicionamiento preciso del modulo de paciente 10 con respecto a un paciente pueden prepararse tomas con resolucion microscopica. El modulo de paciente 10 esta conectado a traves de conexiones de electricas y opticas de fibra de manera flexible con la unidad de control y de procesamiento 12.

Para el posicionamiento del modulo de paciente 10 puede estar previsto un interruptor de pedal para el control de un movimiento a motor del brazo de soporte 11.

El dispositivo 1 esta realizado de manera amortiguada frente a la vibraciones con la minimizacion de la masa que se mueve. La carcasa del modulo de paciente 10 debe ser opaca para evitar radiacion perturbadora exterior.

Es parte de la unidad de control y de procesamiento 12 tambien un PC de control, a traves del que pueden conectarse aparatos de entrada y salida de usuario (raton, teclado, palanca de mando, pantalla).

El dispositivo 1 puede clasificarse funcionalmente en

- un sistema optico, compuesto por ejemplo por un objetivo, una optica de formacion de haz y una optica de recogida, un numero de detectores opticos por ejemplo en forma de los denominados Photo Multiplier Tubes (PMT), filtros y elementos de filtro dicroicos correspondientes, fibras de cuarzo para la transmision de la luz, un laser de pulso ultracorto, un debilitador de haz en forma de un polarizador, un dispositivo de exposicion para el control de la exposicion de laser y una camara de imagenes reales con sistema de iluminacion correspondiente,

- un sistema mecanico, compuesto por ejemplo por el brazo de soporte 11, motores piezo-lineales con unidades de control y sistema de mesa correspondiente, un motor paso a paso para el debilitador de haz, un cambiador de optica para el cambio a motor o manual entre optica de microscopia y camara de imagenes reales y un adaptador de paciente para fijar la optica al paciente,

- un sistema de procesamiento de senales, compuesto por ejemplo por amplificadores, una electronica para la conversion y la evaluation de las senales recibidas y para el almacenamiento de datos, fotodiodos para el control de la potencia y supervision de la luz del entorno y convertidores correspondientes, asi como

- un sistema de procesamiento de datos, compuesto por ejemplo por una superficie grafica de usuario con funciones de gestion de datos y un sistema de control electronico, que coordina todas las funciones del sistema optico, del sistema mecanico y del sistema de procesamiento de senales.

El dispositivo 1 esta disenado para la microscopia de fluorescencia multifotonica, en particular para la microscopia bifotonica. El dispositivo 1 servira a este respecto como sistema no invasivo para el apoyo diagnostico de un medico, que utilizando procesos bifotonicos proporciona en particular imagenes en corte transversal in vivo de la piel humana con informaciones adicionales espectrales, debido a la que un medico obtienen informaciones complementarias con respecto a una imagen de superficie pura para el apoyo de su decision de diagnostico.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En principio, el dispositivo 1 puede utilizarse para el diagnostico de aplicaciones de apoyo de todas las degeneraciones de la piel, que se reflejan en cambios estructurales del tejido. El dispositivo 1 puede a este respecto

- proporcionar informacion de profundidad que proporciona imagenes con resolucion microscopica de capas de piel epidermicas / dermicas,

- generar representaciones en corte sagita de la piel de manera correspondiente a los cortes delgados histopatologicos,

- proporcionar mediante el uso de diferentes canales espectrales, informaciones espectrales en el sentido de una espectroscopia de banda de longitud de onda con resolucion espacial y

- proporcionar funciones para el apoyo del diagnostico, por ejemplo medios auxiliares de evaluation a maquina.

El dispositivo 1 es adecuado para pacientes de cualquier edad con lesiones cutaneas que no se diagnosticaran solamente mediante inspection clinica, sino por ejemplo deberan biopsiarse. Mediante la aplicacion del dispositivo 1 puede evitarse opcionalmente una biopsia (invasiva) o incluso encontrarse una preselection dirigida al objetivo para biopsias. Como lesiones se tienen en cuenta en particular partes de la piel con sospecha de enfermedad de Bowen, carcinoma de celulas basales, carcinoma de celulas escamosas o queratosis actinica. El manejo del aparato tiene lugar a este respecto por personal entrenado, que proporciona y, dado el caso prepara, el material de imagenes para el medico encargado, o por el propio medico.

Con el dispositivo 1 pueden tomarse en particular imagenes en section verticales (sagitales) a traves de la pi el de un paciente. Esto tiene lugar, tal como se representa esquematicamente en la Figura 2, excitandose en el marco de la microscopia bifotonica en un plano de imagen sagital 3 a lo largo de una linea de toma 31 el tejido de piel en sitios individuales 32. El sitio excitado 32 corresponde a este respecto en cada caso a una zona alrededor del punto de foco de una radiation de excitation con una extension en direction X (horizontal) de por ejemplo 0,5 ^m y en direction Z (vertical) de por ejemplo 2 ^m y se selecciona mediante desplazamiento del punto de foco a lo largo de la linea de toma 31.

En el caso del dispositivo 1 el desplazamiento del punto de foco, tal como esta representado en las Figuras 3 a 5 y se explicara a continuation, se consigue mediante una unidad optica 103 del modulo de paciente 10 que se mueve en al menos dos direcciones.

La Figura 3 muestra en una representation de vista de conjunto esquematica una forma de realization del sistema optico del dispositivo 1 y la Figura 4 una vista esquematica de la estructura optica del modulo de paciente 10.

El sistema optico se compone esencialmente de un microscopio bifotonico compacto, que presenta una unidad de laser en forma de un laser de pulso ultracorto 120 (laser de fibra fs), un sistema de detection en forma de un modulo de deteccion 121 y una camara de imagenes reales 111 junto con iluminacion para la toma de una imagen real.

Para la microscopia bifotonica el laser de pulso ultracorto 120 dispuesto en o sobre la unidad de control y de procesamiento 12 genera una radiacion de excitacion A con una longitud de onda fundamental de 1560 nm +/- 10nm, que se suministra a traves de una fibra optica 122 en forma de una fibra unimodal al modulo de paciente 10.

En el modulo de paciente 10 se conduce la radiacion de excitacion A en primer lugar a un dispositivo para el acondicionamiento del haz 100, en cuyo marco, tal como esta representado en la Figura 4, la longitud de onda de la radiacion de excitacion A se reduce a la mitad hasta 780 nm mediante un doblador de frecuencia 1001 en forma de un cristal adecuado (es decir, se dobla la frecuencia). A continuacion, la radiacion de excitacion A atraviesa un filtro 1002, que filtra la longitud de onda fundamental (1560 nm), el tercer armonico (520 nm) y el cuarto armonico (390 nm) y por lo tanto unicamente deja pasar la radiacion de excitacion A de frecuencia doblada con una longitud de onda de 780 nm. En un dispositivo de ajuste y medicion de potencia 1003 se regula la potencia de radiacion, pudiendo estar previsto por ejemplo un debilitador para debilitar la potencia de radiacion de excitacion. El debilitador sirve para la reduction de la potencia de laser despues de duplicarse la frecuencia desde un valor de por ejemplo aproximadamente 100 mW hasta un valor del 0 % al 100 % de la potencia de emision permitida (de manera correspondiente a la potencia irradiada por la optica sobre el objeto 2, por ejemplo, como maximo 50 mW) en el sitio de la excitacion bifotonica. El debilitador es preciso y puede ajustarse con precision de repetition a traves de un motor, pudiendo controlarse el motor por ejemplo a traves de una interfaz de usuario. Por medio de medicion optica (por ejemplo a traves de un fotodiodo PIN) se supervisa la potencia 1ST despues del debilitador.

Por ultimo, la radiacion de excitacion A atraviesa un telescopio 1004, que ensancha el rayo laser y lo conforma de manera adecuada.

Los datos caracteristicos del laser de pulso ultracorto 120 pueden ser por ejemplo:

- longitud de onda fundamental: 1560 nm +/- 50 nm;

- longitud de onda tras duplicado de frecuencia: 780 nm +/-30 nm;

- anchura espectral (780 nm): 8,8 nm;

- diametro del haz (780 nm): 1,3 mm;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

- divergencia del haz (780 nm): 3,8 mrad;

- M2 (780 nm): 1,07;

- frecuencia de repeticion de pulsos: 100 MHz;

- duracion de pulso (780 nm): <150 fs;

- potencia media (780 nm): >100 mW.

La radiacion de excitacion A (con una longitud de onda de 780 nm) puede generarse en una solucion alternativa tambien directamente en la unidad de control y de procesamiento 12 y transmitirse al modulo de paciente 10 a traves de una fibra optica 122 adecuada, en particular una denominada fibra fotonica.

En lugar de una fibra 122 puede utilizarse tambien un brazo articulado de espejo para la transmision flexible.

La radiacion de excitacion bifotonica A puede generarse en una solucion alternativa adicional directamente en el modulo de paciente 10, en el que esta integrado un laser. Puede suprimirse entonces una fibra optica para transmitir la radiacion de excitacion A desde la unidad de control y de procesamiento 12 hasta el modulo de paciente 10.

Como fuente de haces puede usarse en todos los casos tambien un laser en forma de un laser de femtosegundos, tal como por ejemplo un laser de titanio - zafiro, que (en lugar de la radiacion a 1560 nm para generar la radiacion de excitacion a 780 nm) genera una radiacion de excitacion en el intervalo de 700 a 900 nm, que se utiliza entonces sin duplicado de frecuencia directamente para la excitacion.

Despues de tener lugar el acondicionamiento del haz se desvia la radiacion de excitacion A a traves de espejos 101, 102 hacia la unidad optica 103, alli se desvian a traves de un espejo dicroico 104 hasta un objetivo 105, se enfoca a traves de una lente asferica 106 y se irradia sobre un objeto 2, por ejemplo la piel de un paciente.

El modulo de paciente 10 presenta una seccion de contacto 107 permeable para la radiacion de excitacion A en forma de un disco de vidrio, que se encuentra en contacto con la piel por ejemplo con el uso de un fluido de inmersion para mejorar la resolucion microscopica de manera estacionaria.

Para ajustar el sitio del foco puede ajustarse la unidad optica 103. La unidad optica 103 puede moverse a este respecto para el movimiento lateral del punto de foco con respecto a la seccion de contacto 107 al menos en direccion X (de manera correspondiente a un movimiento lateral BX), de manera ventajosa tambien en direction Y, es decir bidimensionalmente a lo largo de la superficie del objeto 2. Al mismo tiempo, el objetivo 105 de la unidad optica 103 puede desplazarse en direccion Z (de manera correspondiente a un movimiento axial BZ), para mover verticalmente de esta manera el punto de foco tambien en direccion Z (como alternativa puede concebirse tambien configurar de manera movil toda la unidad optica 103 en direccion Z). Mediante movimiento del punto de foco dentro del objeto 2 pueden generarse imagenes en seccion, haciendo posible la movilidad lateral de la unidad optica 103 la generation de imagenes en seccion con grandes longitudes de canto laterales de por ejemplo varios mm o tambien cm.

La Figura 5 muestra esquematicamente el movimiento de la unidad optica 103 durante el proceso de registro de una imagen en seccion vertical (sagital). Para registrar senales en diferentes sitios 32 desplazados lateralmente, se desplaza la unidad optica a lo largo de la linea de toma 31 (vease la Figura 2) en primer lugar de manera continua a lo largo de la direccion X y con ello se mueve horizontalmente con respecto al objeto 2 (y la seccion de contacto 107 dispuesta de manera estacionaria en el objeto 2 en forma del disco de vidrio del modulo de paciente 10). Durante el movimiento de la unidad optica 103 se excitan diferentes sitios 32 mediante una exposition desencadenada en funcion del sitio con la radiacion de excitacion A, y se recoge la senal excitada. De esta manera se recoge un numero de puntos de imagen (por ejemplo varios cientos o tambien miles) en una linea. Si se alcanza el extremo de la fila, se desplaza el objetivo 105 de la unidad optica 103 en direccion Z y con ello se mueve el foco en direccion Z. La unidad optica 103 se desplaza de vuelta entonces a lo largo de la direccion X, se registra la linea siguiente, etc., hasta que se ha registrado finalmente toda la imagen.

Este orden de exploration (primero lateralmente, entonces en la profundidad) puede producirse, naturalmente, tambien en orden inverso (primero en la profundidad, entonces lateralmente).

A este respecto, la exploracion perpendicular a la superficie (“exploracion Z”) puede provocarse mediante una suspension oscilante en vertical del objetivo 105, que se excita o acciona periodicamente y asi realiza el movimiento Z. Para la suspension oscilante se toman en consideration en particular muelles de laminas, articulaciones de muelle de lamina, muelles anulares o muelles neumaticos, que se accionan de manera piezoelectrica, electromagnetica o a motor a traves de un mecanismo de transmision de levas o de excentrica. El movimiento lateral de la unidad optica 103 tiene lugar entonces de manera continua en solo un pase por imagen en seccion, es decir de manera correspondiente mas lenta. La ventaja de esta disposition se basa en que el objetivo 105 tiene una masa claramente menor que la unidad optica 103 como un todo, por lo tanto puede moverse rapidamente con menores fuerzas de masa y con ello genera menos vibraciones del dispositivo 1.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ademas, la exploracion no solo puede tener lugar bidimensionalmente (“2D"), sino tambien tridimensionalmente (“3D"), efectuandose en cualquier orden uno tras otro dos escaneos laterales (X e Y) y un escaneo de profundidad (Z).

La unidad optica movil 103 del modulo de paciente 10 permite un movimiento motorizado de la optica de representacion a lo largo del objeto 2, pudiendo seleccionarse libremente por el usuario la direccion (0°-180°), posicion lateral y longitud lateral. El movimiento de la unidad optica 103 puede tener lugar en el plano en paralelo a la superficie del objeto por ejemplo mediante dos motores piezo-lineales, que se acoplan y coordinan mecanicamente. Como alternativa a un movimiento a motor coordinado, puede estar previsto tambien solamente un motor lineal para un movimiento unidimensional a lo largo de la superficie de la piel, girandose y orientandose manualmente por el usuario, para establecer la direccion de escaneo, todo el modulo de paciente 10 junto con la unidad optica 103, para determinar la direccion de escaneo.

Uno de los movimientos laterales puede producirse tambien (en el sentido de una exploracion en coordenadas polares) como movimiento de giro alrededor del eje de rotacion R representado en la Figura 3. Un primer motor mueve entonces la unidad optica 103 linealmente (en direccion radial), mientras que un segundo motor gira la unidad optica 103 alrededor del eje de rotacion R.

La resolucion de la imagen tomada se determina mediante el tamano de sus puntos de imagen (pixeles). En el caso de la fluorescencia bifotonica, estos se establecen mediante el tamano de foco de la radiacion de excitacion A, utilizandose ventajosamente un tamano de foco de 0,5 ^m en direccion lateral (direccion X) y 2 ^m en direccion axial (direccion Z), para conseguir una resolucion celular. Para mantener tan baja como sea posible la masa de la unidad optica 103 que va a moverse, se usa para enfocar una lente asferica 106 individual, lo que es posible por que el eje optico O de la radiacion de excitacion A irradiada sobre el objeto 2, no cambia en su posicion angular durante la toma de una imagen (a diferencia por ejemplo del uso de espejos giratorios y orientables) y por lo tanto solamente se necesitan propiedades de foco optimas en la zona inmediata del eje optico O. La lente asferica 106 puede presentar por ejemplo distancia focal geometrica optica de f = 8 mm, una distancia de trabajo (definida como la anchura de corte en el lado del foco, es decir la distancia del punto de foco desde la superficie optica de la lente situada a continuacion) de 6 mm y una abertura numerica de NA = 0,55.

Por medio de la radiacion de excitacion A se excita radiacion secundaria en sitios individuales de manera correspondiente al punto de foco de la radiacion de excitacion A en el objeto 2. La radiacion secundaria puede componerse a este respecto, por un lado, por una radiacion de fluorescencia, generada por sustancias propias del organismo o ajenas al organismo y, por otro lado, por ondas armonicas generadas en el objeto en estructuras, en particular el segundo armonico (SHG: second harmonic generation). La radiacion secundaria se recoge como senal S por la unidad optica 103 y se acopla a traves de la lente 106, el espejo dicroico 104, un filtro de bloqueo 108 para la supresion de la radiacion de excitacion A y una lente 109 en una segunda fibra optica 110 y se transmite al modulo de deteccion 121 de la unidad de control y de procesamiento 12. Las lentes 106 y 109 pueden estar realizadas preferentemente como no esferas, pero como alternativa tambien, en una eleccion independiente en cada caso, como lente individual esferica o grupo de lentes, (por ejemplo como objetivo acromatico u objetivo de microscopio) o como disposicion de espejos de representacion.

Las senales recibidas se transmiten al modulo de deteccion 121 de la unidad de control y de procesamiento 12 (vease la Figura 3). Una vista detallada de una forma de realizacion de la estructura optica del modulo de deteccion 121 esta representada en la Figura 6. El modulo de deteccion 121 esta construido a este respecto con tres canales y presenta tres detectores en forma de multiplicadores de electrones secundarios 1221, 1222, 1223 (Photo Multiplier Tube, PMT). La senal S suministrada al modulo de deteccion 121 a traves de la fibra optica 110 se descompone mediante una lente asferica 1210, mediante un filtro de bloqueo 1211 en forma un filtro de paso corto para la supresion adicional de la radiacion de excitacion A reflectada o dispersada, mediante elementos de filtro dicroicos 1212, 1213 en tres fracciones de senal S1, S2, S3 en diferentes bandas de longitudes de onda y se suministra a traves de filtros de bloqueo 1214, 1215, 1216 y lentes 1218, 1219, 1220 a los detectores 1221, 1222, 1223.

En el caso de una estructura de cuatro o mas canales, pueden estar previstos tambien mas filtros, lentes y detectores de manera correspondiente al numero de los canales.

Como detectores 1221, 1222, 1223 se usan PMT con sensibilidad espectral adecuada (fotocatodos), que a traves de los elementos de filtro 1212, 1213 dicroicos que sirven como divisor de haz, obtienen bandas parciales del espectro visible a partir de la luz fluorescente suministrada a traves de la fibra 110. Todo el sistema se encuentra en una carcasa totalmente opaca y ennegrecida en el interior, para suprimir reflejos y luz parasita perturbadores. Las senales electricas generadas por los PMT se intensifican en primer lugar, estando dispuestos los amplificadores en el entorno de los PMT, para minimizar perturbaciones electromagneticas, y entonces se digitalizan.

Como magnitudes de medicion para la deteccion sirven las cargas por pixel procedentes de los diferentes canales, que se obtienen por detector 1221, 1222, 1223 a partir de la integracion de la corriente fotoelectricas a lo largo de una duracion de integracion de pixel. A partir de estas senales, se crea con ayuda de parametros adecuados (por ejemplo valores de calibracion por canal, correccion de claridad y de contraste, funcion de color alterado y similares)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

una imagen de fluorescencia. Las cargas se convierten para ello en una tension en un ciclo de p^xeles predeterminable por ejemplo mediante integracion de una corriente mediante los detectores 1221, 1222, 1223, y esta tension se digitaliza con por ejemplo 12 bits.

Los PMT, en la incidencia de luz, no generan ninguna corriente en el intervalo de nA a ^A, que deba procesarse adicionalmente de manera correspondiente. Aguas debajo de cada PMT esta conectado un amplificador de corriente, que presenta por ejemplo un ancho de banda de 200 kHz a 8 MHz, un factor de amplification < 105 y una impedancia de entrada igual a la impedancia del PMT (50 Ohm) y a este respecto esta realizado de manera estable frente a derivas y de poco ruido. Aguas debajo de cada amplificador esta conectado un circuito de integracion, que se desencadena externamente (mediante un ciclo de codificador, que se conduce desde la optica que se mueve) y convierte la senal de corriente del PMT asociado en un valor de tension. Esta tension se convierte por medio de un convertidor analogico - digital en un valor de 12 bits y se almacena en un almacenamiento intermedio, a partir del cual se envian los datos a una interfaz de calculo para el procesamiento adicional.

Los PMT o SiPMT pueden usarse, en el caso de bajas velocidades de flujo de senales - fotones, como alternativa tambien en el funcionamiento de recuento de fotones individuales. Como senales digitales de salida se generan en este caso por pixel y canal, respectivamente, un numero de sucesos registrados, el “recuento de fotones".

Durante la toma de una imagen en section de microscopia, la unidad optica 103 (veanse la Figura 3 y la Figura 5) se desplaza con una velocidad lineal constante de manera continua a lo largo de la direction X. A este respecto se determina el ciclo de medicion mediante un desencadenador de resolution temporal, en concreto, el ciclo de descodificador del motor lineal. Dado que debe medirse con precision microscopica (resolucion < 1 ^m), son altos los requisitos en cuanto a la precision del proceso de exploration para la unidad optica 103 que se mueve. Si el proceso de integracion de los detectores 1221, 1222, 1223 se controla por el ciclo de codificador del motor lineal, las oscilaciones de la velocidad de movimiento no repercuten como distorsiones de imagen, no debiendo superar las desviaciones en las posiciones inicial o final de las lineas individuales, la anchura de un pixel, es decir, por ejemplo 0,5 ^m. La integracion para todos los canales debe tener lugar de manera exactamente simultanea, para obtener datos del mismo sitio en cada uno de los canales.

Para el control de la exposition del objeto a la radiation de excitation se utiliza un denominado obturador, que esta disenado como elemento opaco a la luz y se cierra para el apantallamiento y la interrupcion de la radiacion de excitacion en la trayectoria del haz de la radiacion de excitacion. El obturador se abre solamente durante una toma y esta cerrado en particular durante la verification del sistema, durante una parada de emergencia, en el caso de un contacto fallido con el paciente, siempre que no se lleve a cabo ninguna toma y en los puntos de inflexion de una linea de toma para minimizar la irradiation de laser en la piel del paciente. El obturador puede controlarse mediante un software de control, pudiendo estar previsto en un caso de fallo un cierre automatico e independiente del software. El obturador se conecta para la exposicion de cada uno de los sitios del objeto para generar cada una de las senales de pixel durante una toma con velocidad de ciclo relativamente alta (en el intervalo de menos ms), pudiendo estar previsto opcionalmente un obturador principal y un obturador de medicion, de los que el obturador principal esta fundamentalmente abierto durante una toma y el obturador de medicion se desencadena mediante el desencadenador.

En el caso de la estructura de acuerdo con la Figura 6, estan previstos tres canales para registrar tres bandas espectrales. Entre ellos pueden figurar:

- un canal de SHG en una banda de longitudes de onda de 390 nm ± 5 nm,

- un primer canal de onda corta en una banda de longitudes de onda de 450 nm ± 50 nm y

- un segundo canal de onda corta en una banda de longitudes de onda de 550 nm ± 50 nm.

A este respecto, el canal de SHG detectara exclusivamente la SHG de tejido de banda estrecha, generada de manera no resonante, mientras que los dos canales de onda corta detectan la senal de auto-fluorescencia con la posibilidad, para determinar una formation de relation espectral con resolucion espacial.

Adicionalmente, en una estructura ampliada, puede estar previsto un cuarto canal en una banda de longitudes de onda de 625 nm ± 25 nm, que es apropiado para registrar senales de fluorescencia, que se deben a marcadores tal como PP IX o ALA.

Dos espectros de ejemplo estan representados en la Figura 7, una vez para un espectro N de una piel normal y una vez para un espectro L de una lesion, es decir, una piel modificada por una patologia. Puede apreciarse claramente en los dos espectros L, N por ejemplo un pico de senal debido a la generation del segundo armonico (SHG) de 390 nm asi como una evolution espectral con un maximo marcado en aproximadamente 480 nm (N) o 500 nm (L). El pico de senal a 390 nm puede registrarse mediante el canal de SHG, mientras que mediante la formacion de relacion de las senales de los dos canales de onda corta puede cerrarse de nuevo a la position del maximo en un espectro L, N.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En la Figura 8 esta representado un esquema de procesamiento de diferentes fracciones de senal S1, S2, S3 en la configuracion de varios canales del modulo de deteccion 121. Las diferentes fracciones de senal S1, S2, S3 se detectan a este respecto mediante en cada caso un detector D1, D2, D3 (por ejemplo un PMT, vease la Figura 6) y se convierte en cada caso en una senal de datos electronica, que se amplifica a continuation mediante amplificadores V1, V2, V3. Las senales electronicas asi obtenidas pueden procesarse adicionalmente ahora para la obtencion de information. Por ejemplo, mediante la adicion 1 pueden combinarse las fracciones de senal S1, S2, S3 para dar una senal completa, de la que se obtiene una informacion de claridad. La imagen resultado E1 puede visualizarse en un monitor por ejemplo como imagen en blanco y negro y proporcionar a un usuario un mensaje sobre que distribution de intensidad de senal resulta en el tejido considerado. Al mismo tiempo, cada una de las fracciones de senal S1, S2, S3 pueden procesarse adicionalmente despues de la amplification tambien por separado, para generar imagenes resultado E2, que proporcionan por ejemplo informaciones sobre la presencia de un fluoroforo en sitios determinados en el tejido y pueden superponerse a la imagen de claridad E1 en colores alterados. Resulta una imagen en la que la informacion de claridad en blanco y negro e informaciones espectrales adicionales de cada una de las bandas de senal, se visualizan en colores alterados.

Las informaciones de imagen combinadas mencionadas (imagenes resultado E1, E2 etc.) pueden generarse de manera analoga a tal como se representa, a partir de las senales S1, S2 etc. Como alternativa, tambien justo despues de los amplificadores V1, V2 etc. se convierten de manera analogica - digital, para obtener a continuacion las imagenes resultado E1, E2 mencionadas mediante procesamiento de senales digital o calculo.

Diferentes senales de las diferentes bandas pueden superponerse a la imagen de claridad E1 en diferentes colores. Por ejemplo, la senal que corresponde a PP IX puede visualizarse en rojo y la senal que corresponde al segundo armonico (SHG) puede visualizarse en azul, pudiendo estar previsto que un usuario, para la optimization relacionada con problemas de la representation y para la representation de informaciones de diagnostico dirigidas pueda ajustarse por medio de un instrumento de entrada tal como un palanca de mando, de un regulador de disco o opcionalmente por medio de control de voz el nivel de senal de las senales individuales para la superposition.

Opcionalmente, puede efectuarse tambien una correction de claridad logaritmica o una optimizacion de contraste automatica.

La Figura 9 muestra una configuracion de un modulo de paciente 10', en el que un espejo orientable de dos ejes 107' se usa para desplazar el punto de foco de la radiation de excitation A y por lo tanto el sitio de la excitation. La radiation de excitacion A conducida a traves de la fibra optica 122 se colima a este respecto en primer lugar mediante una lente 100', se reduce a la mitad la longitud de onda a traves del doblador de frecuencia 101' (por ejemplo de 1560 nm a 780 nm), se polariza circularmente mediante un polarizador 102' y se desvia una placa de cuarto de onda 103' (la radiacion de excitacion A transmitida por la fibra optica 122 esta originalmente polarizada linealmente), mediante una lente 104' sobre un primer espejo adaptivo 105' y desde este a traves de una lente 106' sobre el espejo orientable de dos ejes 107'.

Los espejos 105', 107' puede estar fabricados por ejemplo como elementos constructivos de MEMS (MEMS: sistemas microelectromecanicos). El primer espejo 105' sirve a este respecto para la variation del frente de onda, mientras que el segundo espejo 107' mediante la orientation de dos ejes desvia la radiacion de excitacion A con respecto al movimiento espacial del punto de foco.

La radiacion de excitacion A asi desviada se dirige mediante un telescopio para el ensanche del haz 108', una lente 109', un divisor de haz dicroico 110', un objetivo 116' con una lente asferica 117' sobre un objeto 2, por ejemplo la piel de un paciente, y excita el tejido para la emision de una radiacion secundaria, que se conduce a su vez a traves del objetivo 116' y el divisor de haz 110' a traves de una lente 111' hacia un detector 112', que recibe la radiacion secundaria como senal optica y la convierte en senales de datos electronicas.

Para la evaluation de las senales de datos asi como para el control de cada uno de los grupos constructivos, el modulo de paciente 10' presenta una electronica de excitacion 113' (en particular para el control de un movimiento vertical del objetivo 116'), una electronica de deteccion 114' para el control del detector 112' y para el procesamiento adicional de las senales recibidas y una electronica de control 115' para el ajuste de los espejos 105', 107'.

Como una medida adicional en todos los ejemplos de realization descritos anteriormente del dispositivo 1, el foco de la radiacion de excitacion bifotonica A puede moverse (“tambalearse”) mediante medios adecuados rapidamente a traves de una pequena desviacion alrededor de su position central, para que la excitacion de fluorescencia pueda promediarse durante el tiempo de toma (= tiempo de integration) a lo largo de un volumen adecuado. El volumen de toma asi obtenido (“volumen de integracion”), del que proceden las senales S excitadas de dos fotones, es mayor que el volumen correspondiente al punto de foco y proporciona una senal evaluable, suficientemente intensa para la espectroscopia. Ademas de una homogeneizacion de la senal S se consigue por lo tanto el fin de no cargar innecesariamente la muestra o el tejido examinado mediante irradiation de larga duration del mismo volumen de foco microscopico.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

De manera especialmente ventajosa, este micromovimiento del foco puede realizarse de tal manera que los volumenes de excitacion, es decir aquellas zonas de los focos, cuya intensidad es suficiente para la excitacion multifotonica, no solapan directamente pulsos de laser sucesivos. La ventaja de un modo de proceder de este tipo consiste en que se reduce significativamente el riesgo de un dano optico del tejido. En el caso de solapamiento, el pulso de secuencia incide sobre zonas de tejido ya opticamente excitadas por el pulso previo. Dado que la distancia de pulso temporal en el caso de los laseres de pulso ultracorto usados se encuentra en el orden de magnitud de 10 ns, es decir, en el orden de magnitud de los tiempos de relajacion de la fluorescencia, existe una probabilidad no despreciable para transformar moleculas excitadas en el tejido en un estado energetico superior, que entonces lleva a modificaciones permanentes de las moleculas.

Para el micromovimiento rapido (“tambaleo”) de la radiacion de excitacion A para la espectroscopia bifotonica puede usarse por ejemplo un elemento constructivo optico oscilante o giratorio, por ejemplo una lente, un espejo, un prisma o similares.

Una forma de realizacion ventajosa representa un espejo basculante, es decir un espejo, que esta montado sobre un eje de rotacion accionado a motor para un movimiento de giro rapido, de modo que entre el eje de rotacion y la normal del espejo existe un pequeno angulo (por ejemplo de 0,5° a 2,5°). El haz reflejado gira por lo tanto alrededor de su eje, lo que lleva a un pequeno movimiento circular del foco y por lo tanto a un movimiento de foco libre de solapamiento.

Una realizacion ventajosa adicional es un espejo que oscila en dos ejes, en particular un MEMS, en el que las frecuencias de oscilacion de los dos ejes de oscilacion principales situados en perpendicular entre si en una relacion uno con respecto a otro, que corresponde a un numero racional como fraccion de dos numeros primos. Si esta oscilacion de dos ejes del espejo se excita mediante un accionamiento por ejemplo electromagnetico o electrostatico, entonces el haz reflejado y por lo tanto el foco de laser, realiza figuras de Lissajous, en las que en el punto de inversion de oscilacion de un eje de oscilacion el otro no tiene velocidad cero, sino un valor finito. Por lo tanto, durante este movimiento nunca resulta una parada del foco, que llevaria de hecho al solapamiento indeseado de los volumenes de excitacion de los pulsos de secuencia.

La Figura 10 muestra en una representacion esquematica (no a escala), una excitacion de fluorescencia homogeneizada, en la que se excita una zona lateralmente delimitada, pero axialmente (verticalmente) extendida (“FMV” = volumen de medicion de fluorescencia) del objeto 2, de modo que en direccion axial el objeto 2 contribuye principalmente de manera equilibrada al menos a lo largo de una determinada zona de profundidad determinada a la senal optica S. Esta senal optica S se recoge y se integra y puede evaluarse y procesarse adicionalmente como valor de medicion individual, como espectro o en varios canales con bandas espectrales separadas (“espectroscopia de bandas”).

Para la toma se mueve la unidad optica 103 (vease por ejemplo la Figura 3) exclusivamente en direccion horizontal (lateral) (en direccion X o en direccion X y direccion Y) con respecto a la superficie del objeto 2 (un movimiento en direccion vertical (Z) no es necesario porque la senal optica S se integra a lo largo de la profundidad).

Para obtener una excitacion de fluorescencia homogeneizada en una zona designada como volumen de medicion de fluorescencia FMV, se ajustan los parametros para la abertura del objetivo 106, el diametro de foco Dfoc y la profundidad de foco Zfoc a valores dentro de intervalos de parametros determinados. Asi se selecciona una abertura relativamente pequena entre 50 y 80 mrad (de manera correspondiente al seno de la mitad del angulo de abertura del cono de abertura en aire, es decir sin correccion del indice de refraccion del tejido). La profundidad de foco Zfoc se ajusta de manera ventajosa a un valor entre 100 ^m y 450 ^m, preferentemente de 200 ^m a 350 ^m (medido en aire, antes de la colocacion del sistema de medicion sobre la piel, es decir sin correccion del indice de refraccion del tejido) y el diametro de foco Dfoc a un valor entre 6 ^m y 10 |um, preferentemente entre 7 ^m y 9 ^m.

El volumen de medicion de fluorescencia FMV se extiende desde la superficie de tejido o de muestra GPO (objeto 2) axialmente hacia la profundidad hasta una profundidad de integracion Zmax. La profundidad de foco Zfoc es mayor (mas profunda) que la profundidad de integracion Zmax.

Normalmente, la radiacion de excitacion A en un tejido (objeto 2) se debilita mediante dispersion y absorcion, de modo que se excitan zonas de tejido en mayor profundidad mas debilmente con respecto a la fluorescencia que zonas cercanas a la superficie. Ademas, la senal optica S, a partir de zonas cercanas a la superficie se debilita en su trayectoria desde el sitio de excitacion hasta el sistema de medicion, menos que las senales opticas S procedentes de profundidades mayores. Estas dos cosas llevan a que la senal optica S medida se determine normalmente con gran peso por parte de las zonas cercanas a la superficie.

Sorprendentemente se ha mostrado que con los parametros seleccionados en este caso para el ajuste de la profundidad de foco Zfoc y la anchura de foco Dfoc asi como la abertura, se obtiene una contribucion en conjunto principalmente equilibrada de todas las capas de tejido dentro del volumen de medicion de fluorescencia FMV con una profundidad de integracion Zmax con respecto a la senal optica medida S. Esto se provoca por que la regla de escalonamiento de la excitacion bifotonica con la intensidad (a la que la probabilidad de excitacion crece

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

proporcionalmente al cuadrado de la intensidad) compensa en su mayor parte la debilitacion de la radiacion de excitacion A y de la senal optica S en el tejido.

La Figura 11A muestra cualitativamente el factor de peso dependiente de la profundidad, que indica en que medida contribuyen determinadas zonas de profundidad a la senal optica S medida. En este caso, la profundidad de foco Zfoc esta ajustada a 300 ^m, la profundidad de integracion asciende a Zmax = 200 ^m. Para profundidades menores que la profundidad de integracion seleccionada en este caso (200 ^m) la contribucion es esencialmente constante. Zonas situadas a mayor profundidad contribuyen por el contrario solamente de manera reducida a la senal optica S.

La profundidad de integracion Zmax para la senal optica S en el objeto 2 (tejido) se limita principalmente por que el efecto bifotonico despues de alcanzar la profundidad de foco ya no actua de manera que amplifica la senal (la profundidad de integracion Zmax maxima, hasta la que la contribucion de senal es aproximadamente constante independientemente de la profundidad, es a este respecto menor que la profundidad de foco Zfoc). Mediante medidas opticas tal como la prevision de un diafragma en la optica de recogida (limitacion de la eficiencia de recogida) puede amplificarse aun mas este efecto de corte. La Figura 11B muestra una representacion cualitativa del factor de peso dependiente de la profundidad en el caso del uso de un diafragma dispuesto en la trayectoria del haz de la senal optica S para cortar senales opticas S de mayores profundidades.

El proceso de examen de una lesion en un paciente con el uso del dispositivo 1 se divide fundamentalmente en dos secciones:

1. toma de una imagen real de la superficie por medio de la camara de imagenes reales 111 (Figuras 3 y 4) y decision sobre los volumenes parciales que van a examinarse en detalle, inclusive establecimiento de la linea de toma (carril de escaneo) en la imagen de la superficie de la piel;

2. realizacion del proceso de medicion para la verdadera toma de corte de microscopia a lo largo del o de los carriles de escaneo establecidos en la imagen real

La imagen real sirve a este respecto como toma de vision general inicial, para permitirle a un usuario la eleccion de una linea de toma adecuada, y proporciona al mismo tiempo informacion clinica de documentation adicional en el sentido de la dermatoscopia habitual.

Un examen de un paciente con el uso del dispositivo 1 puede transcurrir por ejemplo de la siguiente manera.

Un examen comienza con la colocation precisa en el paciente del modulo de paciente 10 (cabezal de medicion) fijado al am brazo de soporte 11. A este respecto se usa la camara de imagenes reales 111 para la busqueda, que proporciona las imagenes en movimiento de la superficie de la piel. Esta imagen de busqueda de video se visualiza continuamente en una superficie de usuario sobre el monitor 13 (Figura 1). Despues de detenerse el modulo de paciente 10 se realiza una toma de vision general individual y se almacena en el marco de un conjunto de datos de lesion.

Para facilitarle a un usuario el establecimiento del plano para la imagen en seccion que va a tomarse, en la toma de vision general de la superficie de usuario, puede insertarse de manera superpuesta un campo de selection, que corresponde al campo real de la siguiente toma de microscopia y puede adaptarse y definirse por el usuario en longitud y position lateral. Adicionalmente, el usuario debe indicar la profundidad axial para establecer un campo bidimensional para la imagen en section que va a tomarse.

Despues de la definition de la posicion de la imagen en seccion puede efectuarse en primer lugar una toma de calibration para el ajuste automatico de la potencia de laser en funcion de la profundidad axial; solamente a continuation tiene lugar entonces la verdadera toma microscopica. Durante la toma de la imagen en seccion se actualiza continuamente a este respecto la imagen ya obtenida, para poder interrumpir a tiempo tomas fallidas. Despues de la toma de la imagen en seccion, el usuario puede tomar otras imagenes y anadirlas al conjunto de datos de lesion.

Los siguientes datos pueden recaudarse por ejemplo para el examen de una lesion de un paciente:

- Imagen real: resolution de 4 megapixeles en el modo fotografico cualitativamente valioso; como minimo 1 megapixel de resolucion en el modo de video, frecuencia de imagen 25 fps; tiempo de exposition (en el modo fotografico) 50 ms o menor.

- Imagen de microscopio: el usuario define un tramo de 1-10 mm lateralmente con una profundidad maxima de 20 a 150 ^m axialmente, comenzando una medicion siempre en la superficie de la piel (a una profundidad de 0 ^m). Para una lesion, el usuario puede llevar a cabo cualquier cantidad de tomas de microscopia.

- Para poder reconocer posibles diferencias con respecto a la primera imagen real, se toma una segunda imagen real despues de la verdadera toma de corte de microscopia y se compara con la primera (la denominada “imagen de pre-escaneo” e “imagen de post-escaneo”).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Un proceso de medicion puede transcurrir por ejemplo en orden logico y temporal de la siguiente manera:

1. Inicializacion del dispositivo 1:

- se enciende el dispositivo 1,

- el motor lineal que mueve la unidad optica 103 se lleva a la posicion inicial,

- el dispositivo 1 se prepara para una toma (se preparan tensiones, se prueban e inicializan componentes, se prepara y senaliza la disponibilidad de servicio);

2. Inicio del proceso de examen:

- dado el caso el operador introduce datos del paciente,

- dado el caso se aplica un conjunto de datos de medicion por el operador;

3. Selection de la zona de examen y colocation del modulo de paciente 10:

- el operador prepara una condition adecuada para una toma,

- se visualiza una imagen de video de la superficie de la piel;

4. Toma de una imagen real (“imagen de pre-escaneo”):

- en cuanto queda fijada la colocacion (el brazo de soporte 11 esta parado y se visualiza la detention), se desencadena la toma y se muestra visualmente el resultado al usuario,

- el operador acepta o rechaza la imagen (en el ultimo caso repetition),

- la imagen aceptada se almacena como “imagen de pre-escaneo”, sirviendo los datos registrados al mismo tiempo para una valoracion clinica de la lesion por el medico y para la determination del campo de medicion;

5. Establecimiento de la linea de toma (carril de escaneo) en la imagen real de la superficie de la piel:

- en la imagen real se representa la linea de toma (= linea de corte del campo de escaneo X-Z con la superficie de la piel) como linea insertada,

- la linea de toma puede modificarse por el usuario en su orientation y longitud, para determinar la longitud de escaneo lateral (extension en direction X) y la posicion de escaneo,

- la profundidad de escaneo axial (extension en direccion Z) se ajusta a traves de un elemento de mando (por ejemplo un controlador de corredera de una interfaz de usuario grafica), pudiendo ajustarse por ejemplo valores entre 0 y 150 ^m;

6. Calibration de la potencia de laser:

- despues de establecerse los datos de escaneo, puede determinarse automaticamente la adaptation de la potencia de laser en funcion de la profundidad de escaneo o tambien puede definirse manualmente por el propio usuario;

7. Realization de la rutina de escaneo:

- al pulsarse un boton de “inicio” se inicia el escaneo microscopico, es decir:

- en primer lugar se lleva la camara de imagenes reales 111 (manual o automaticamente) a una posicion de desviacion,

- en el punto inicial de la linea de toma comienza la unidad optica 103 con la exploration del tejido,

- durante todo el transcurso de escaneo se supervisan continuamente funciones de seguridad (interruption, parada de emergencia, supervision de potencia) y se adapta continuamente la potencia de laser de acuerdo con la funcion predefinida (calibracion),

- simultaneamente se construye una imagen de escalas de grises de la senal de medicion en una o en varias ventanas (que estan asociadas a los diferentes canales espectrales) en el monitor 13,

- la rutina de escaneo termina regularmente de manera automatica con exploracion completa del campo de escaneo y mensaje de acabado en el monitor 13 (mas en el punto 8) o

- en caso de fallo con termination y mensaje de fallo (mas en el punto 10);

8. Terminacion de la rutina de escaneo en el caso normal:

- tras finalizar el proceso de escaneo se conecta el modo de imagen real, la camara de imagenes reales 111 se lleva a una posicion de toma y se toma una imagen real adicional; esta “imagen post-escaneo” se compara con la “imagen de pre-escaneo” almacenada correspondiente, en la que solamente en el caso de una congruencia suficientemente precisa la verdadera imagen de escaneo esta “no movida” y puede usarse;

- en el caso de una salida positiva del examen se ofrece al usuario almacenar los datos o dotarlos de comentarios (mas con el punto 9) o realizar otro toma en otro o en el mismo sitio (retorno al punto 3);

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9. Finalizacion del proceso de examen:

- si ya no deben realizarse mas escaneos o procesarse datos, se pasa el dispositivo 1 a un estado de reposo (en el que los motores estan en posicion inicial, el obturador esta cerrado y los PMT no tienen tension) y se finaliza el programa de aplicacion.

El control de mando puede realizarse mediante un software que puede estar implementado en un programa de aplicacion con una interfaz de usuario grafica (GUI) y presenta las siguientes funciones logicas:

- inicializacion de todo el sistema, en particular autocomprobacion de los componentes de HW y visualizacion del estado del sistema y fallos; funciones de supervision (potencia de laser; estado de laser);

- funciones para la gestion de los datos del paciente, en particular una estructura de carpetas y banco de datos, que permite la entrada estructurada de datos referidos al paciente asi como funciones administrativas correspondientes, tal como busqueda, modificacion, impresion y borrado de conjuntos de datos;

- funciones para la gestion de datos de medicion (imagen real; imagen de microscopio) y su asociacion a conjuntos de datos del paciente;

- funciones para la representation grafica de los datos de medicion a partir de diferentes canales espectrales y funciones para el procesamiento adicional de los datos de medicion (por ejemplo representacion en colores alterados, election de la zona, formation de relation, reconocimiento de cantos, etc.);

- funciones para el control del sistema optico y el sistema mecanico;

- funciones para el control de la evolution general, por ejemplo asistentes para la guia del usuario en los escaneos.

La unidad de control y de procesamiento 12 (vease la Figura 1) presenta para el control y procesamiento de senales preferentemente un circuito electronico, que tiene, por un lado, control sobre todos los subsistemas conectados a la misma y, por otro lado, controla la comunicacion con el software de usuario instalado en un ordenador de la unidad de control y de procesamiento 12. Mediante la biparticion por un lado del control de los componentes conectados sobre el circuito electronico y, por otro lado, la instalacion del software de aplicacion en un ordenador separado (PC), existe la posibilidad de realizar tareas sencillas de procesamiento de senales y el control de los componentes conectados tal como fotodiodos, obturadores y motores paso a paso o sus modulos de control en lados del circuito electronico en tiempo real, mientras que tareas mas complejas se realizan sin requisito de tiempo real y relevancia de seguridad por el programa de aplicacion en el ordenador. Para una flexibilidad suficiente, la unidad de control y de procesamiento 12 debera disenarse de manera programable.

Para proteger los detectores 1221, 1222, 1223 (por ejemplo realizados como PMT) del modulo de detection 121, puede estar previsto medir la claridad fuera del modulo de paciente 10 por medio de un fotodiodo. Si esta se encuentra por encima de un valor fiable, es decir se transporta potencialmente demasiada luz a traves de la fibra optica 110, se regula por disminucion una tension de control para los detectores 1221, 1222, 1223 y se envia un mensaje de fallo al programa de aplicacion.

Para eliminar una exposition del ojo humano a la luz laser, puede estar previsto abrir el obturador previsto para el control de la exposicion solamente cuando un dispositivo mecanico (conmutador) u optico (barrera fotoelectrica) senalice un contacto intimo del modulo de paciente 10 con el objeto 2 que va a examinarse. Si existe o no un contacto, puede transmitirse al programa de aplicacion.

El dispositivo 1 como sistema medico de formacion de imagenes representa graficamente los datos obtenidos, haciendose disponibles o representandose los datos tan proximos en el tiempo como sea posible (idealmente en tiempo real). Estados del sistema tal como mensajes de fallo pueden apreciarse a este respecto en visualizaciones correspondientes.

En el lado de entrada, puede estar disenado un software de aplicacion a este respecto para procesar entradas de usuario de manera intuitiva y referidas al objeto respectivo. Esto significa en particular que la colocation de un campo de medicion (Region of Interest, ROI) puede tener lugar directamente en la imagen real tomada por adelantado y que una eleccion de la zona en una imagen (imagen real o imagen de microscopio) se soporta con funciones de zoom y de desplazamiento asi como arrastrar y soltar. Ademas, pueden estar previstas herramientas que reducen los calculos necesarios para el usuario y apoyan la evaluation de las imagines (medicion de tamanos y distancias). Un examen puede interrumpirse o detenerse en cualquier momento a traves del software de aplicacion por un usuario. En funcion del tipo de funcionamiento (escaneo o evaluacion) el software proporciona mascaras de mando correspondientes.

En el lado de salida el software de aplicacion esta disenado para senalizar cualquier cambio del sistema y realizar inmediatamente una actualization de imagen. A esto pertenece por ejemplo el estado de funcionamiento en general, el estado de movimiento de los motores, el progreso de un programa de medicion y la formacion proxima en el tiempo de imagenes reales y de microscopio. Debido a la geometria de las imagenes en section tomadas (en las que la anchura de imagen es un multiplo de la altura de imagen, por ejemplo con una relacion de aproximadamente 1:50) es necesario que una imagen de microscopio se representa o bien en tiras parciales adyacentes o como corte

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(lo mas largo posible).

La invention no esta limitada a los ejemplos de realization expuestos anteriormente. En particular, los procedimientos y dispositivos expuestos no estan limitados a la excitation bifotonica, sino que pueden utilizarse tambien para la microscop^a o espectroscopia trifotonica o multifotonica.

Lista de simbolos de referencia

1 10, 10' 100 1001 1002 1003 1004 101,102 103 104 105 106 107 108 109 110 100' 101' 102' 103' 104' 105' 106' 107' 108' 109' 110' 111' 112' 113' 114' 115' 116' 117' 11 12 120 121 1210 1211 1212, 1213 1214, 1215, 1216 1218, 1219, 1220 1221,1222,1223 122 13 2 3 31 A BX, BZ C D1, D2, D3 Dfoc E1, E2 FMV GPO L: dispositivo modulo de paciente dispositivo para el acondicionamiento del haz doblador de frecuencia filtro de longitud de onda dispositivo de ajuste y de medicion de potencia telescopio para la adaptation del haz espejo unidad elemento dicroico objetivo lente disco filtro de bloqueo lente fibra optica lente doblador de frecuencia polarizador placa de cuarto de onda lente espejo adaptativo lente espejo orientable de dos ejes telescopio lente divisor de haz lente detector electronica de excitacion electronica de deteccion electronica de excitacion unidad optica lente brazo de soporte unidad de control y de procesamiento unidad de laser modulo de deteccion lente filtro de bloqueo espejo dicroico filtro de bloqueo lente detector fibra optica monitor objeto plano de imagen iinea de toma haz de excitacion movimiento conversion deteccion diametro de foco imagen resultado volumen de medicion de fluorescencia superficie de tejido o de muestra espectro de una lesion

z O cd co w >

, S1, S2, S3 adicion , V1, V2, V3 Zfoc Zmax

espectro de la piel normal eje optico eje de rotacion senal

amplificacion profundidad de foco

iimite de profundidad del volumen de medicion de fluorescencia

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Dispositivo para la microscopia de fluorescencia multifotonica para la obtencion de informaciones a partir de tejido biologico, con

- una unidad de laser (120) para generar una radiacion de excitacion (A),

- una unidad optica (103), que esta disenada para enfocar la radiacion de excitacion (A) para generar una senal optica (S) a diferentes sitios en o sobre un objeto que va a examinarse (2), y

- un modulo de deteccion (121) para registrar la senal optica (S) desde la zona del objeto (2), en donde la unidad optica (103) para generar la senal optica (S) en diferentes sitios en o sobre el objeto (2) puede moverse al menos en una direccion (X, Y, Z) con respecto al objeto (2),

caracterizado por que

- el dispositivo (1) presenta una unidad de control y de procesamiento (12) y un modulo de paciente (10) conectado a la unidad de control y de procesamiento (12), que para examinar el objeto (2) puede colocarse con respecto al objeto (2), siendo la unidad optica (103) parte del modulo de paciente (10),

- la unidad de laser (120) genera una radiacion de excitacion (A) con una primera longitud de onda y aguas arriba de la unidad optica (103) esta conectado en el modulo de paciente un doblador de frecuencia (1001) para reducir a la mitad la longitud de onda de la radiacion de excitacion (A),

- el modulo de paciente (10) presenta una seccion de contacto (107) permeable para la radiacion de excitacion (A) y la senal optica (S), que para examinar el objeto (2) ha de ponerse en contacto con el objeto (2), estando presentes medios que mueven la unidad optica (103) en direccion horizontal (X, Y) con respecto a la seccion de contacto (107) dentro del modulo de paciente (10) para generar imagenes en seccion con longitud de canto dada,

- la unidad de laser (120) es parte de la unidad de control y de procesamiento (12), conectando una fibra optica (122) la unidad de laser (120) con el modulo de paciente (10) para transmitir la radiacion de excitacion (A) hacia la unidad optica (103), y

- la unidad optica (103) puede moverse independientemente de la fibra optica (122) para transmitir la radiacion de excitacion (A).
2. Dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que durante un movimiento de la unidad optica (103) para generar la senal optica (S) no cambia la posicion angular del eje optico (O) de la radiacion de excitacion (A) que incide sobre el objeto (2).
3. Dispositivo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que la unidad optica (103) puede moverse en direccion horizontal (X, Y) y/o en direccion vertical (Z) con respecto a una superficie del objeto (2) dirigida a la unidad optica (103).
4. Dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 3, caracterizado por que la unidad optica (103) presenta un objetivo (105) para enfocar la radiacion de excitacion (A) a un sitio en o sobre el objeto (2), pudiendo moverse el objetivo (105) en direccion vertical (Z) con respecto a la superficie del objeto (2).
5. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la unidad optica (103), para generar pixel a pixel una imagen en seccion vertical, puede desplazarse al menos por secciones de manera continua en direccion horizontal (X, Y) y/o en direccion vertical (Z) con respecto al objeto (2).
6. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la unidad de laser (120) presenta un laser de pulso ultracorto para generar pulsos de laser en el intervalo de femtosegundos.
7. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la unidad optica (103) esta disenada para captar la senal optica (S) y esta conectada a traves de una fibra optica (110) con el modulo de deteccion (121) para transmitir la senal optica recogida (S) al modulo de deteccion (121).
8. Dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 7, caracterizado por que la fibra optica (110) para transmitir la senal optica recogida (S) al modulo de deteccion (121) se diferencia de una fibra optica (122) prevista para transmitir la radiacion de excitacion (A).
9. Procedimiento para la microscopia de fluorescencia multifotonica para la obtencion de informaciones a partir de tejido biologico, en el que

- una unidad de laser (120) genera una radiacion de excitacion (A),

- una unidad optica (103) enfoca la radiacion de excitacion (A) para generar una senal optica (S) a diferentes sitios en o sobre un objeto que va a examinarse (2) y

- un modulo de deteccion (121) registra la senal optica (S) desde la zona del objeto (2),

moviendose la unidad optica (103) para generar la senal optica (S) en o sobre el objeto al menos en una

5

10

15

20

25

30

direccion (X, Y, Z) con respecto al objeto (2), caracterizado por que

- el dispositivo (1) presenta una unidad de control y de procesamiento (12) y un modulo de paciente (10) conectado a la unidad de control y de procesamiento (12), que para examinar el objeto (2) puede colocarse con respecto al objeto (2), siendo la unidad optica (103) parte del modulo de paciente (10),

- la unidad de laser (120) genera una radiacion de excitacion (A) con una primera longitud de onda y aguas arriba de la unidad optica (103) esta conectado en el modulo de paciente un doblador de frecuencia (1001) para reducir a la mitad la longitud de onda de la radiacion de excitacion (A),

- el modulo de paciente (10) presenta una seccion de contacto (107) permeable para la radiacion de excitacion (A) y la senal optica (S), que para examinar el objeto (2) se pone en contacto con el objeto (2), moviendose la unidad optica (103) en direccion horizontal (X, Y) con respecto a la seccion de contacto (107) dentro del modulo de paciente (10) para generar imagenes en seccion con longitud de canto dada,

- la unidad de laser (120) es parte de la unidad de control y de procesamiento (12), conectando una fibra optica (122) la unidad de laser (120) con el modulo de paciente (10) para transmitir la radiacion de excitacion (A) hacia la unidad optica (103), y

- la unidad optica (103) puede moverse independientemente de la fibra optica (122) para transmitir la radiacion de excitacion (A).
10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9, caracterizado por que a partir de las senales opticas recibidas (S) en diferentes sitios del objeto (2) se genera pixel a pixel una imagen en seccion del objeto (2).
11. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado por que para generar pixel a pixel la imagen en seccion, el objeto (2) se expone de manera desencadenada a la radiacion de excitacion (A), estando el tamano de pixel determinado

- en direccion horizontal (X, Y) por el enfoque de la radiacion de excitacion (A) y por el ajuste del desencadenamiento y

- en direccion vertical (Z) por la longitud de talle de la radiacion de excitacion (A) enfocada,

pudiendo ajustarse el tamano de pixel mediante un ensanche del haz de la radiacion de excitacion (A) y ajuste del desencadenamiento.