ES2562077T3 - Regiones ultraconservadas que codifican ARNnc - Google Patents

Abstract

Un metodo para diferenciar canceres humanos que comprende usar uno o mas perfiles de expresion de regiones ultraconservadas transcritas (RUC-T), en el que la asociacion entre la localizacion genomica de las RUC-T y los elementos genomicos relacionados con cancer analizados es estadisticamente muy significativa y comparable a la indicada para los miARN; en donde el metodo usa el perfil de expresion de cinco RUC-T, uc.269A(N), uc. 16.0(N), uc.215(N), uc.346A(P) y uc.348(N) para diferenciar entre dos grupos de pronostico de leucemia linfocitica cronica (LLC).

Description

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DESCRIPCIÓN

Regiones ultraconservadas que codifican ARNnc

Declaración con respecto a la investigación financiada federalmente

La presente invención no se realizó con ningún apoyo del Gobierno y el Gobierno no tiene ningún derecho en la presente invención.

Antecedentes

Tomados en su conjunto, los cánceres son una fuente significativa de mortalidad y morbilidad en los Estados Unidos y en todo el mundo. Sin embargo, los cánceres son una clase de enfermedades grande y diversa con diversas etiologías. Los investigadores por lo tanto han sido incapaces de desarrollar tratamientos o ensayos de diagnóstico que abarquen más que algunos tipos de cáncer.

Por ejemplo, los cánceres se asocian a muchas clases diferentes de características cromosómicas. Una de dichas clases de características cromosómicas son perturbaciones en la estructura genómica de ciertos genes, tales como la supresión o mutación de genes supresores de tumores. La activación de protooncogenes por amplificación génica o activación de promotores (por ejemplo, por integración viral), modificaciones epigenéticas (por ejemplo, un cambio en la metilación de ADN) y translocaciones cromosómicas también pueden provocar carcinogénesis. Dichas perturbaciones en la estructura genómica que están implicadas en la etiología de cánceres se denominan “regiones genómicas asociadas con cáncer” o “RGAC”.

Los sitios frágiles cromosómicos son otra clase de elemento cromosómico implicado en la etiología de cánceres. Los sitios frágiles cromosómicos son regiones de ADN genómico que muestran una aparición anormalmente alta de huecos o roturas cuando se altera la síntesis de ADN durante la metafase. Estos sitios frágiles se clasifican como “raros” o “habituales”. Como su nombre sugiere, los sitios frágiles raros son poco habituales. Dichos sitios se asocian a repeticiones di- o trinucleotídicas, pueden inducirse en cromosomas en metafase por deficiencia de ácido fólico y se segregan de una manera Mendeliana. Un sitio frágil raro a modo de ejemplo es el sitio Frágil X.

Los sitios frágiles habituales se revelan cuando se cultivan células en presencia de afidocolina o 5-azacitidina, que inhiben la ADN polimerasa. Se han identificado al menos ochenta y nueve sitios frágiles habituales, y se encuentra al menos uno de dichos sitios en cada cromosoma humano. Por lo tanto, aunque su función apenas se entiende, los sitios frágiles habituales representan un componente básico de la estructura cromosómica humana.

La inducción de sitios frágiles in vitro conduce a aumento de intercambio de cromátidas hermanas y una alta tasa de supresiones, amplificaciones y translocaciones cromosómicas, mientras que los sitios frágiles se han colocalizado con puntos de rotura cromosómicos in vivo. Además, la mayoría de los sitos frágiles habituales estudiados en células tumorales contienen grandes supresiones o translocaciones intralocus, y se han identificado varios tumores con supresiones en múltiples sitios frágiles. Los sitios frágiles cromosómicos están por lo tanto implicados de forma mecánica en la producción de muchas de las lesiones cromosómicas habituales vistas en células cancerosas.

Todas las células malignas tienen alteraciones específicas en loci de ADN que codifican genes para oncoproteínas o supresores tumorales (Balmain et al., 2003; Wooster y Weber, 2003). Esta característica común se han expandido recientemente para incluir una gran clase de ARN no codificantes (ARNnc) denominados microARN (miARN) (Ambros, 2004) que también están implicados en el inicio y la progresión del cáncer (Calin et al., 2002; Croce y Calin, 2005; Berezikov y Plasterk, 2005a; Esquela-Kerscher y Slack, 2006; Calin y Croce, 2006a). Los miARN afectan a la regulación de la expresión génica en los niveles tanto transcripcional como postranscripcional (Ambros, 2003; Ambros, 2004).

El alcance de la implicación de los miARN y la implicación de otras clases de ARNnc en la tumorogénesis humana es desconocido. Por lo tanto, existe la necesidad de investigación adicional acerca de los mecanismos moleculares y las rutas de transducción de señales alteradas en el cáncer.

Existe una necesidad adicional de identificación de nuevos marcadores moleculares y agentes terapéuticos potenciales.

Las regiones ultraconservadas (RUC) del genoma humano (Bejerano et al., 2004b) también son miARN que están casi completamente conservados entre diversas especies (Berezikov et al., 2005b). Por ejemplo, se ha mostrado que las moléculas activas del grupo miR-16-1lmiR-15a, son un agente esencial en el inicio de la leucemia linfocítica crónica (LLC) (Calin et al., 2005a), y están completamente conservadas en ser humano, ratón y rata y altamente conservadas en nueve de las diez especies de primates secuenciados (Berezikov et al., 2005b). El análisis de secuencias comparativo ha identificado varias secuencias genómicas altamente conservadas. Algunas de estas regiones no producen un transcrito que se traduce a proteína y se consideran por lo tanto no génicas. Se han aplicado diversos nombres a esta clase de secuencias: secuencias no génicas conservadas (NGC) (Dermitzakis et

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al., 2005), secuencias no codificantes conservadas (SNC/NCC) (Meisler, 2001), secuencias conservadas de múltiples especies (SCM) (Thomas etal., 2003) o regiones altamente conservadas (RAC) (Duret etal., 1993).

Las RUC son un subconjunto de secuencias conservadas que se localizan en regiones tanto intra como intergénicas. Están absolutamente conservadas (100 %) entre regiones ortólogas de los genomas humano, de rata y de ratón (Bejerano etal., 2004b). A diferencia de otras regiones de secuencia conservada, el 53 % de las RUC se ha clasificado como no exónicas (“N”, 256/481 sin pruebas de proteínas codificantes), mientras que el otro 47 % se ha designado bien exónico (“E”, 111/481, que solapa con ARNm de genes codificantes de proteínas conocidos), o bien posiblemente exónicos (“P”, 114/481, con pruebas no concluyentes de solapamiento con genes codificantes de proteínas).

Una gran parte de los productos de transcripción de las regiones genómicas funcionales no codificantes tienen estructuras secundarias de ARN significativas y son componentes de grupos que contienen otras secuencias con significancia no codificante funcional (Bejerano et al., 2004a). Las RUC representan una fracción pequeña del genoma humano que probablemente sea funcional pero que no codifica proteínas, y se ha denominado la “materia oscura” del genoma humano (Bejerano et al., 2004a). Debido al alto grado de conservación, las RUC pueden tener importancia funcional fundamental para la ontogenia y filogenia de mamíferos y otros vertebrados. Esto se ilustró por el hallazgo reciente de un potenciador distante y un exón ultraconservador derivado de un nuevo retroposón activo en peces de aletas lobuladas y vertebrados terrestres hace más de 400 millones de años y se mantienen activos en un “fósil viviente”, celacanto (Bejerano etal., 2006).

Pruebas experimentales adicionales de la importancia funcional de las RUC se basan en el análisis de ratones con mutaciones dirigidas. Las supresiones de megabases de desiertos génicos que carecen de elementos ultraconservados o secuencias altamente conservadas dieron como resultado ratones viables que se desarrollaron aparentemente sin fenotipos detectables (Nobrega et al., 2004). Por el contrario, se ha mostrado que desiertos génicos que contienen varias RUC (tales como los dos desiertos génicos que rodean al gen de DA CHI en el cromosoma humano 13g21.33) contienen potenciadores de largo alcance, algunos de ellos compuestos de secuencias de RUC (Nobrega et al., 2003).

A pesar de la investigación considerable acerca de terapias para enfermedades relacionadas con cáncer, estas enfermedades siguen siendo difíciles de diagnosticar y tratar eficazmente. En consecuencia, existe la necesidad en la técnica de métodos mejorados para diagnosticar y/o tratar el cáncer. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona además otras ventajas relacionadas.

Sumario de la invención

Se describe en el presente documento una consulta genómica exhaustiva del estado de RUC en un gran panel de leucemias y carcinomas humanos.

Los inventores investigaron la expresión en todo el genoma de RUC en diversas muestras normales y cancerosas, y los inventores evaluaron la relación entre la localización genómica de estas secuencias y las regiones conocidas implicadas en cánceres.

Además, se identificó un papel funcional para los miARN en la regulación de la transcripción de RUC asociadas con cáncer.

También se describen en el presente documento pruebas en sistemas cancerosos de que una UCR expresada diferencialmente podría alterar las características funcionales de células malignas.

También se describe en el presente documento, combinando estos datos con los modelos elaborados que implican miARN en tumorogénesis humana, un modelo en el que la alteración de ARN tanto codificantes como no codificantes coopera en el inicio y la progresión del tumor maligno.

En un aspecto general, se describen en el presente documento métodos para diferenciar cánceres humanos que comprenden usar uno o más perfiles de expresión de regiones ultraconservadas transcritas (RUC-T) en los que la asociación entre la localización genómica de las RUC y los elementos genómicos relacionados con cáncer analizados es altamente estadísticamente significativa y comparable a la indicada para miARN. De acuerdo con un aspecto de la invención se proporciona un método para identificar riesgo de cáncer relativo en un sujeto humano, que comprende identificar si una muestra tisular de ensayo del ser humano de ensayo comprende al menos un perfil de expresión de regiones ultraconservadas transcritas (RUC-T) que tiene una correlación estadísticamente significativa con leucemia linfocítica crónica (LLC), en el que el perfil de expresión de RUC-T consiste al menos en uc.269A(N), uc.160(N), uc.215(N), uc.346A(P) y uc.348(N), y en el que una correlación estadísticamente significativa indica riesgo relativo para LLC, en el que las RUC-T en el perfil de expresión de RUC-T se expresan diferencialmente entre células normales y malignas, y en el que dicho perfil diferencia entre dos grupos de pronóstico de LLC.

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Diversos objetivos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la materia a partir de la siguiente descripción detallada de la realización preferida, cuando se lea a la luz de los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. Se proporcionarán copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujo o dibujos a color por la Oficina tras la petición y el pago de la tasa necesaria.

Figuras 1A - 1E. Características transcripcionales de diversos tipos de RUC:

Figura 1A. Transferencias de Northern que muestran la expresión de diversas RUC en tejidos normales. En el caso de uc.246(E) y uc.269A(N), la presencia del transcrito largo se confirmó por los experimentos de clonación de RACE. Para algunos tejidos, se proporcionaron muestras por duplicado para confirmar la reproducibilidad. Se realizó normalización con U6. Las flechas en el lado izquierdo muestran los transcritos identificados.

Figura 1B. Se confirmó la expresión de las RUC-T 291 y 73A (normalizada a ARNr 18S) por qRT-PCR (gráficos) y análisis de micromatrices (número normalizado bajo el gráfico) en linfocitos CD5+/CD19+ normales y muestras de LLC malignas. Los p valores fueron significativos para comparación estadística de datos tanto de qRT-PCR como de micromatrices. Cada caja representa la distribución de la expresión medida para pacientes normales (azul) y con LLC (rojo), los extremos de las cajas definen los percentiles 25° y 75°, una línea indica la mediana, las barras definen los percentiles 10° y 90°.

Figura 1C. Número de RUC expresadas en uno o más de 19 tejidos, como se revela por análisis de micromatrices; se indican los números de tipo RUC (E, N, P). Se descubrieron cuatro tipos de transcripción: RUC expresadas de forma ubicua (en 18 o 19 de 19 tejidos diferentes), RUC expresadas en la mayoría de los tejidos (10 a 17), RUC expresadas en una minoría de tejidos (2 a 9) y RUC expresadas de forma específica de tejido.

Figura 1D. Porcentaje de cada tipo de RUC (E, N, P) que se transcribe de forma ubicua (tanto uní- como bidireccionalmente) en todos los tejidos analizados; los números absolutos para cada tipo de RUC se muestran en las cajas.

Figura 1E. Expresión de las RUC de cadena con sentido o antisentido 73, 133 y 269, en relación con ARNr 18S. en linfocitos B CD 19+ de tres donantes diferentes. Se usó RT-PCR en tiempo real específica de cadena con sentido/antisentido para validar la expresión específica de cadena de las RUC observadas con análisis de micromatriz; la desviación típica +1 promedio de los resultados de micromatrices para muestras CDS+ está bajo cada gráfico. Las sondas de micromatrices se denominan de la siguiente manera: la sonda genómica con sentido se denomina “+”, mientras que la sonda para la secuencia complementaria se denomina “A+”.

Figuras 2A-2B. Agrupamiento jerárquico de tejidos y tumores de acuerdo con la expresión de RUC. Grupo no supervisado de (Figura 2A) 22 tejidos humanos normales y (Figura 2A\B) 133 leucemias y carcinomas realizado usando las RUC no exónicas de la microplaca. Algunas de las RUC-T que diferencian bien los tipos tisulares (Figura 2A) o carcinomas de leucemias (Figura 2B) se expanden a la derecha. Las muestran están en columnas, las RUC-T en filas. Un gen de color verde está regulado negativamente en comparación con su expresión mediana en todas las muestras, el rojo está regulado positivamente y el amarillo significa sin variación. El perfil de RUC completo de tejidos y tumores puede encontrarse en las Figuras 5 y 6.

Figuras 3A-3E. Las RUC-T representan dianas directas de miARN (SEC ID N° 1-3, 2, 4-8 y 2, respectivamente, en orden de aparición):

Figura 3A. Ejemplos de sitios de complementariedad RUC-T::m¡ARN. El emparejamiento uc.348::miR-155 se muestra como un ejemplo de bajos niveles de complementariedad en contraste con los otros 4 genes emparejados que interaccionan para los que se encuentran niveles mayores de complementariedad.

Figura 3B. La correlación por qRT-PCR para expresión de m¡R-155, uc.160 y UC.346A en 9 pacientes con LLC. Se usaron linfocitos de cuatro individuos diferentes como controles normales.

Figura 3C. La interacción directa de miARN::RUC-T. Represión relativa de expresión de luciferasa de luciérnaga normalizada para un control de transfección, luciferasa de Renilla. Se usó pGL-3 (Promega) como el vector vacío. Todos los experimentos se realizaron de cuatro a ocho veces por triplicado (n=12-24).

Figura 3D. Los efectos de la transfección de miR-155 en células MEG-01 en los niveles de expresión de uc.160 y UC.346A. Los efectos se midieron por qRT-PCR a las 0, 24 y 48 horas después de la transfección.

Figura 3E. Se presentan dos representaciones de dispersión entre valores de expresión de mir-24-1 y uc.160 y de miR-155 y UC.346A. La línea de regresión muestra la correlación negativa entre estos dos genes. El nombre

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de las sondas de matrices correspondientes se presentan en los ejes Y y X. Ambas sondas reconocen la forma madura del gen de miARN.

Figuras 4A-4D. RUC-T 73A(P) actúa como un oncogén en células de cáncer de colon:

Figura 4A. La inhibición de la expresión por diversos ARNip en células COLO-320. Como valor de referencia se usó un control de ARNip de Dharmacon. Se usaron los dos ARNip más eficaces y un grupo de cuatro ARNip diferentes, incluyendo estos dos.

Figura 2B. Los efectos antiproliferativos de la reducción en la expresión génica de uc.73A(P) usando ARNip- uc73A en células de cáncer colorrectal COLO-320. Todos los resultados representan la mediana de tres experimentos por triplicado independientes. Los niveles de expresión de uc. 73A (P) se midieron por RT-PCR. Dos asteriscos indican un efecto estadísticamente significativo en P<0,01, mientras que uno en P<0,05.

Figura 4C. Los niveles reducidos de uc.73A(P) (usando diversos ARNip) dan como resultado apoptosis potenciada como se muestra por el ensayo de tinción de Anexina V en células COLO-329. Como valor de referencia se usó un control de ARNip de Dharmacon.

Figura 4D. La inhibición de uc.73A(P) por diversos ARNip no influyó en la supervivencia de células de cáncer de colon SW620. Todos los resultados representan la mediana de tres experimentos por triplicado independientes.

Figura 5. Expresión de RUC en tejidos normales y malignos humanos por transferencia de Northern. Se presenta la expresión para uc.192(N) y uc.246(E) en células mononucleares normales (CMN) y muestras de LLC. Se realizó normalización con sonda U6. Las flechas en el lado izquierdo muestran los transcritos identificados. Bajo la imagen del gel están los promedios de valores de expresión normalizados para RUC en muestras de LLC y CMN de experimentos de micromatrices; los p valores fueron de estadística de ANOVA.

Figura 6. Expresión de RUC en tejidos normales y malignos humanos por qRT-PCR. Muestras de expresión génica relativa por qRT-PCR en linfocitos positivos para CD5+/CD19+ y leucemia linfocítica crónica humana (LLC). Se indican los valores de micromatrices de RUC de muestras de LLC y CD5+ bajo el gráfico; los p valores fueron de estadística de ANOVA.

Figura 7. Perfil de expresión de RUC-T de 22 tejidos humanos normales. El agolpamiento de tejidos y RUC reveló un patrón definido de expresión de RUC en tejidos humanos normales. Las muestras se muestran en columnas, las RUC-T en filas. Un gen en color verde está regulado negativamente en comparación con su expresión mediana en todas las muestras, el rojo está regulado positivamente y el amarillo significa sin variación.

Figura 8. Perfil de expresión de RUC-T de 173 cánceres y tejidos normales correspondientes. Se separan muestras de células de sangre con leucemia y normal de cáncer y tejido de origen epitelial. Las muestras se muestran en columnas, las RUC-T en filas. Un gen en color verde está regulado negativamente en comparación con su expresión mediana en todas las muestras, el rojo está regulado positivamente y el amarillo significa sin variación.

Figura 9. La expresión de gen uc.73A(P) en diversas líneas celulares de cáncer de colon por RT-PCR cuantitativa. La expresión en colon normal representa el valor mediano de 4 muestras diferentes. Para normalización se usó beta actina.

Figura 10. La inhibición de uc.73A(P) por ARNipI en células COLO-320 y SW-620 a las 48 horas. Se consiguieron niveles comparables de inhibición con respecto a un ARNip de control (Dharmacom) en ambos tipos de células. A pesar de esto, los efectos biológicos se vieron solamente en células COLO-320, en las que la RUC-T se sobreexpresa aproximadamente 2,5 veces en comparación con la expresión en colon normal.

Figura 11. Regulación negativa por interferencia pequeña de uc.73A(P) induce apoptosis en células COLO-320 pero no en células SW-620. Datos obtenidos con ensayo de caspasa-3 en COLO-320 (panel superior), en el que se encontró un aumento significativo en células apoptóticas, y en las células de control SW620 (panel inferior), en las que no pudo encontrarse diferencia. COLO-320 expresan altos niveles de uc.73A(P), mientras que en SW620 la expresión es comparable con la de los niveles de colon normales.

Figura 12 - Tabla 1. RUC expresadas diferencialmente más significativas en leucemias y carcinomas.

Figura 13 - Tabla 2. Resultados de regresión de Polsson de efecto mixto como asociación de RUC con regiones de interés.

Figura 14 - Tabla 3. RUC-T cuya expresión se correlaciona de forma inversa con miARN complementario expresado diferencialmente en pacientes con LLC.

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Figura 15 - Tabla 4. Expresión de RUC-T en 22 tejidos normales humanos (3 por duplicado, de 2 individuos diferentes).

Figura 16 - Tabla 5. RUC-T expresadas diferencialmente en LLC, CCR y CHC identificadas por análisis de ANOVA a P<0,005 (software GeneSpring GX).

Figura 17 - Tabla 6. La localización genómica de RUC se correlaciona con RGAC (bases de datos como en (Bejerano etal., 2004); (Calin etal., 2004)).

Figura 18 - Tabla 7. Correlaciones negativas entre la expresión de miARN y RUC-T en pacientes con LLC. Toda la correlación negativa validada por el método de TFD a umbral de 0,01, o 1 % de resultados de falso positivo, y con una correlación R menor de 0,40 se tuvo en cuenta.

Descripción de realizaciones

Como se usa en el presente documento, una “RGAC” incluye cualquier región del ADN genómico que comprende un cambio genético o epigenético (o el potencial de un cambio genético o epigenético) que difiere de ADN normal, y que se correlaciona con un cáncer. Los cambios genéticos a modo de ejemplo incluyen roturas mono y bicatenarias (incluyendo regiones de punto de rotura habituales en o cerca de posibles oncogenes o genes supresores de tumores); translocaciones cromosómicas; mutaciones, supresiones, inserciones (incluyendo integraciones virales, plasmídicas o transposónicas) y amplificaciones (incluyendo duplicaciones génicas) en el ADN; regiones mínimas de pérdida de heterocigosidad (PDH) que sugieren la presencia de genes supresores de tumores; y regiones mínimas de amplificación que sugieren la presencia de oncogenes. Los cambios epigenéticos a modo de ejemplo incluyen cualquier cambio en los patrones de metilación de ADN (por ejemplo, hiper o hipometilación de ADN, especialmente en regiones promotoras).

Muchos de los genes de miR conocidos en el genoma humano están en o cerca de RGAC, incluyendo 80 genes de miR que se localizan exactamente en regiones mínimas de PDH o regiones mínimas de amplificación correlacionada con diversos cánceres. Otros genes de miR se localizan en o cerca de regiones de punto de rotura, áreas suprimidas o regiones de amplificación.

Por ejemplo, los cánceres asociados a RGAC incluyen leucemia (por ejemplo, LMA, LLC, leucemia prolinfocítica), cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de pulmón microcítico y no microcítico), cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer cerebral (por ejemplo, astrocitoma, glioma, glioblastoma, meduloblastoma, meningioma, neuroblastoma), cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer del cuello uterino, cáncer epitelial, cáncer nasofaríngeo (por ejemplo, carcinoma de células escamosas oral o laríngeo), linfoma (por ejemplo, linfoma folicular), cáncer uterino (por ejemplo, histiocitoma fibroso maligno), cáncer hepático (por ejemplo, carcinoma hepatocelular), cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello), cáncer renal, tumores de células germinales masculinas, mesotelioma maligno, síndrome mielodisplásico, cáncer ovárico, cáncer pancreático o biliar, cáncer de próstata, cáncer de tiroides (por ejemplo, tumores tiroideos foliculares esporádicos) y cáncer urotelial.

Como se usa en el presente documento, un “FRA” incluye cualquier sitio frágil poco habitual o habitual en un cromosoma; por ejemplo, uno que pueda inducirse sometiendo una célula a tensión durante la replicación del ADN. Por ejemplo, puede inducirse un FRA poco habitual sometiendo la célula a deficiencia de ácido fólico durante la replicación de ADN. Puede inducirse un FRA habitual tratando la célula con afidocolina o 5-azacitidina durante la replicación del ADN. La identificación o inducción de sitios frágiles cromosómicos está dentro de la experiencia de la técnica; véase, por ejemplo, Arlt et al. (2003), Cytogenet. Genome Res. 100: 92-100 y Arlt et al. (2002), Genes, Chromosomes and Cáncer 33: 82-92.

Aproximadamente el 20 % de los genes de miR humanos conocidos se localizan en (13 miR) o a una distancia de 3 Mb (22 miR) de FRA clonados. De hecho, la incidencia relativa de genes de miR dentro de sitios frágiles aparece a una tasa 9,12 veces mayor que en sitios no frágiles. Además, después de estudiar 113 sitios frágiles en un cariotipo humano, se ha descubierto que 61 genes de miR se localizan en la misma banda cromosómica que un FRA.

Por ejemplo, los cánceres asociados con FRA incluyen cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de riñón, cáncer del cuello uterino, cáncer ovárico, cáncer de mama, linfoma, sarcoma de Ewing, tumores hematopoyéticos, tumores sólidos y leucemia.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Debería apreciarse por los expertos en la materia que las técnicas desveladas en los ejemplos a continuación representan técnicas que el inventor ha descubierto que actúan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto pueden considerarse constituyentes de modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la materia deberían apreciar, a la luz de la presente divulgación, que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones específicas que se desvelan y aún obtener un resultado parecido o similar sin alejarse del alcance de la invención.

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Ejemplo 1

Los perfiles de todo el genoma revelan transcripción extensiva de regiones ultraconservadas (RUC) en tejidos humanos normales.

Para investigar la implicación de las RUC en cánceres humanos, los inventores analizaron 481 regiones genómicas de más de 200 pb de longitud (Bejerano etal., 2004b) por transferencia de Northern, PCR cuantitativa (qRT-PCR) y

micromat rices.

Las sondas de RUC tanto exónicas (E) como no exónicas (N) detectaron transcritos (en orientación con sentido o antisentido - A) sobre un amplio intervalo de longitudes de diversos tejidos normales (Figura 1Ay Figura 5).

La longitud de dos de los transcritos se confirmó clonando el ADNc por 5’ y 3’-RACE para el uc.246(E) exónico de colon humano normal y el uc.269A(N) no exónico de médula ósea humana normal. Ninguno de estos ADNc contenía fases abiertas de lectura (ORF) de longitud significativa, lo que confirma su probable naturaleza no codificante de proteínas. Estos ADNc de longitud completa no cortados y empalmados, que se han denominado genes ultraconservados no codificantes, GUC-nc, son de longitud variable (aproximadamente 0,8 kb para el gen ultraconservador GUC.246 y aproximadamente 1,8 kb y 2,8 kb para el gen ultraconservador GUC.269A).

La transcripción de estos GUC-nc puede iniciarse a partir de regiones genómicas ricas en poliadenina, como se propuso recientemente para varios ARNnc largos de ratón (Furuno etal., 2006).

Los inventores compararon los niveles de transcripción de varias RUC de tejido normal y enfermo usando análisis de micromatrices seguido de qRT-PCR y confirmación por transferencia de Northern. La expresión de uc.291(P) y uc. 73A(P) fue significativamente mayor en linfocitos CD5+/CD19+ normales que en células LLC (P < 0,05) (Figura 1B). Los datos obtenidos con esta plataforma de micromatrices se han confirmado en diversos estudios (Calin et al., 2005a; Yanaihara etal., 2006; Volinia etal., 2006).

La potencia de los datos de los inventores se refuerza por el hecho de que dos conjuntos independientes de células CD5 normales se incluyeron en experimentos de micromatrices y de RT-PCR cuantitativa. Cuando se investigaron tanto uc.291(P) como uc.73A(P) por qRT-PCR y micromatrices en dos conjuntos diferentes de linfocitos B CD5/CD19 positivos y linfocitos B malignos, la expresión diferencial fue estadísticamente significativa por ambos ensayos (Figura 1B).

Además, la qRT-PCR y transferencia de Northern para once y seis RUC, respectivamente, proporcionaron resultados que eran concordantes con resultados de micromatrices (Figura 5 y Figura 6).

Usando análisis de micromatrices, se descubrió que la mayoría de las RUC transcritas (que se han nombrado aquí RUC-T) se expresaban en tejidos humanos normales tanto de forma ubicua como de manera específica de tejido (Figura 1C).

Aproximadamente el 34 % de las RUC-T potenciales (325/962) tenían señales de hibridación con una intensidad sobre el fondo (calculada como señal promedio de puntos blancos + 2 DT) en las 19 muestras tisulares. El mayor número de RUC-T se encontró en linfocitos B, mientras que el menor fue en ovarios. Aproximadamente el 93 % de las RUC (890 de 962) se expresaron sobre el fondo en al menos una muestra, y por lo tanto los inventores consideraron estas como RUC-T. Los tres tipos diferentes de RUC se transcribieron con frecuencias similares: 41 % de RUC exónicas, 33 % de RUC posiblemente exónicas y 30 % de RUC no exónicas.

La plataforma de micromatrices contiene RUC-T potenciales en orientación tanto con sentido como antisentido. Ochenta y cuatro de las 962 RUC (9 %) se transcribieron bidireccionalmente, mientras que 241 se transcribieron solamente a partir de una cadena, en todos los tejidos normales analizados (Figura 1D, Figura 1E y Tabla 4).

Ya que la identificación de la transcripción bidireccional por análisis de micromatrices puede impedirse por contaminación de trazas con ADN genómico, se realizó una comparación de resultados de micromatrices con qRT- PCR específica de cadena para uc.2 69(N), uc.233(E) y uc. 73(P). En los tres casos los datos fueron concordantes, mostrando transcripción predominante de una cadena (Figura 1E).

Debe observarse que de las 156 RUC-T no exónicas expresadas en los 19 tejidos, 92 (-60%) son intergénicas, mientras que 64 son intrónicas. De estas últimas, 37 están en la orientación antisentido en comparación con el gen hospedador, lo que sugiere que aproximadamente el 83% (129/156) de las RUC-T no exónicas no representaban transcripción intrónica de transcritos precursores largos de genes hospedadores conocidos, sino transcritos no codificantes independientes auténticos.

Como con los miARN (Liu et al., 2004), los inventores realizaron un agrupamiento jerárquico de la expresión de RUC-T en tejidos hematopoyéticos (representados por linfocitos B, linfocitos T y células mononucleares, cada uno recogido de dos individuos sanos) y tejidos no hematopoyéticos. Los mismos tipos de tejido de diferentes individuos

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se agruparon como los vecinos más cercanos (Figura 2A y Figura 7).

Estos hallazgos demuestran que las RUC representan, en una proporción de casos significativa, transcritos no codificantes en tejidos humanos normales y que la expresión de estas RUC-T es específica de tejido.

Identificaciones de RUC distintas en leucemias y carcinomas humanos

Ya que se han descrito ampliamente alteraciones de la expresión génica extensivas en células cancerosas tanto para genes codificantes de proteínas como para miARN (Esquela-Kerscher y Slack, 2006; Calin y Croce, 2006a; Calin y Croce, 2006b; Lu et al., 2005), los inventores han investigado la expresión de RUC en un panel de 173 muestras, que incluía 133 cánceres humanos y 40 tejidos normales correspondientes.

El agrupamiento jerárquico de las muestras mostró que diversos tipos de cánceres se agrupaban de forma diferente según sus orígenes de desarrollo: las leucemias (LLC) y los tejidos hematopoyéticos normales se ramificaron por separado de los carcinomas colorrectal (CCR) y hepatocelular (CHC) con sus homólogos normales (Figura 8); además, los grupos específicos de RUC parecían expresarse diferencialmente en tipos tumorales (Figura 2B).

Ya que diferentes tejidos tienen identificaciones de RUC específicas, este patrón de agrupamiento podría ser la consecuencia de un diferente origen específico de tejido de los tumores. Por lo tanto, se comparó la expresión de RUC entre las células normales y las tumorales del mismo origen. De las 962 RUC-T posibles, 88 (9,1 %) se expresaron diferencialmente a un nivel estadísticamente muy significativo (P< 0,005) en al menos un tipo de cáncer (Tabla 1 y Tabla 5).

Se descubrieron RUC-T tanto reguladas negativamente como reguladas positivamente en cánceres en comparación con la expresión en tejidos normales correspondientes. Comparando cada tipo de cáncer con los tejidos normales correspondientes, se descubrió que la identificación de LLC estaba compuesta de 19 RUC (8 reguladas positivamente y 11 reguladas negativamente), la identificación de CCR de 61 RUC (59 reguladas positivamente y 2 reguladas negativamente) y la identificación de CHC de 8 RUC (3 reguladas positivamente y 5 reguladas negativamente) (Tabla 5).

Dieciocho transcritos de las identificaciones fueron RUC exónicas (20 %), 28 fueron RUC posiblemente exónicas (32 %) y 42 fueron RUC no exónicas (48 %). De las 18 RUC-T exónicas, 9 representaban la dirección antisentido de los transcritos de genes codificantes de proteínas hospedadores conocidos. Se demostró por lo tanto que los perfiles de expresión de RUC-T pueden usarse para diferenciar cánceres humanos.

Las RUC se localizan frecuentemente en sitios frágiles y regiones genómicas implicadas en cánceres

Se comparó la localización genómica de RUC con la de alteraciones genéticas no aleatorias previamente indicadas identificadas en tumores humanos y sitios frágiles clonados (FRA) como se ha descrito (Calin et al., 2004b). Los inventores usaron el conjunto de 186 miARN previamente indicado (Calin etal., 2004b) y un conjunto de 297 genes codificantes de proteínas de dedos de cinc (ZNF) (genome.ucsc.edu), una familia bien conocida de factores de transcripción que se ha mostrado que están asociados a cáncer (Huntley etal., 2006).

Los inventores han indicado previamente que se localizan frecuentemente genes de miARN en sitios de FRA, grupos de genes HOX y regiones genómicas implicadas en cáncer, tales como regiones mínimas de pérdida de heterocigosidad (PDH), y regiones mínimas de amplificación, denominadas globalmente regiones genómicas asociadas con cáncer (RGAC) (Calin et al., 2004b).

Un estudio reciente, usando hibridación genómica comparativa de matriz de alta resolución (aCGH), confirmó que los loci de miARN mostraban alteraciones genómicas a alta frecuencia en cánceres humanos (Zhang et al, 2006). Además, analizando la expresión de miARN en líneas celulares NCI-60, otro grupo descubrió que los miARN supresores de tumores y oncogénicos candidatos se localizan en RGAC (Gaur et al, 2007).

Aquí, los inventores muestran que la asociación entre la localización genómica de RUC y los elementos genómicos relacionados con cáncer analizados es estadísticamente muy significativa y comparable con la indicada para miARN. Los factores de transcripción de ZNF no mostraron ninguna asociación significativa con ninguna de las regiones de interés analizadas (Tabla 2 y Tabla 6).

Hubo una falta similar de asociación para la menor familia de genes codificantes de proteínas implicados en el corte y empalme de ARN (80 genes, datos no mostrados). Por ejemplo, la probabilidad de asociación de RUC o miARN con regiones de PDH mínimas frente a regiones genómicas no suprimidas fue menor de 0,001 en ambos casos (IRR de 2.02 y 4,08, respectivamente). Como control interno, se usaron los sitios de integración del virus del papiloma humano 16 (VPH 16), que aparecen frecuentemente en sitios FRA. Si las RUC se asocian significativamente con FRA, entonces los inventores esperaban encontrar una asociación con el sitio de integración de VPH 16. Esto es exactamente lo que se observó tanto para RUC como para miARN, pero no para genes codificantes de proteínas de ZNF (Tabla 2) o para los genes codificantes de proteínas implicados en el corte y empalme de ARN (datos no

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mostrados).

Datos adicionales ilustran la importancia de la localización genómica de RUC. En primer lugar, se descubrió que las RUC-T expresadas de forma ubicua (expresadas en 18 o 19 tejidos normales en la Figura 1C) se localizan significativamente más frecuentemente en RGAC (P< 0,005, ensayo exacto de Fisher) en comparación con todas las otras RUC (97 de 189 frente a 71 de 292). En segundo lugar, las RUC-T expresadas diferencialmente en cánceres humanos se localizan en RGAC asociadas específicamente a ese tipo de cáncer. Por ejemplo, la región cromosómica 13g21.33-g22.2 se ha ligado a la susceptibilidad a LLC familiar (Ng et al, 2007). No se han descubierto mutaciones en ninguno de los 13 genes codificantes de proteínas explorados dentro de este intervalo.

Los inventores identificaron un grupo de siete RUC (uc.347 a uc.353) localizadas dentro de esta RGAC. Dos de ellas, uc.349A(P) y uc.352(N) están entre las RUC-T que se expresan diferencialmente entre células CD5 positivas de LLC-B malignas y normales.

Esto sugiere, al menos en este caso, que no son los genes codificantes de proteínas sino las RUC lo que representa a los culpables “desconocidos” localizados en la RGAC. Tomados juntos estos datos proporcionan pruebas de que las RUC se localizan en regiones genómicas alteradas durante el proceso maligno, y sugieren que las RUC-T podrían ser genes candidatos para susceptibilidad a cáncer.

Regulación negativa de RUC-T por interacción directa con microARN

Para comenzar a caracterizar funcionalmente algunas RUC implicadas en cánceres humanos, se realizó un estudio de expresión en todo el genoma en el mismo conjunto de muestras de LLC investigado anteriormente. Se descubrió que una identificación de cinco RUC, uc.269A(N), uc.160(N), uc.215(N), uc.346A(P) y uc.348(N), fue capaz de diferenciar entre dos grupos de pronóstico de LLC principales previamente diferenciados por la expresión de proteína asociada a zeta de 70 kDa (ZAP-70).

Estas cinco RUC-T presentaron variaciones en su nivel de expresión que se correlacionaban negativamente con la identificación de expresión de miARN presentada en LLC (Cahn etal., 2005a) (Tabla 3).

Aunque sin desear quedar ligado a la teoría, el inventor del presente documento cree ahora que este hallazgo aumenta la posibilidad de mecanismos reguladores complejos entre miARN y RUC-T. Los inventores han identificado, por alineamiento de secuencias, que tres de las 5 RUC tienen complementariedad antisentido significativa con 5 de los 13 miARN de la identificación, dando lugar a seis posibles pares de interacción: uc.160::miR-24, uc.160::miR-155, uc.160::miR-223, uc.160::miR-146a, uc.346A::miR-155y uc.-348::miR-29b (Figura 3 A).

En este conjunto analizado de pares de miARN::RUC, la regla de complementariedad de “semilla de 6 bases” del extremo 5’ descrita para la interacción de miARN::ARNm era válida; además, los niveles de complementariedad en el extremo 3’ podrían ser variables: más del 60 % de complementariedad para pares de miR-24::uc160 o miR- 155::uc.346A a menos del 25% para el par miR-155::uc.160. Como control, cuando se generan aleatoriamente combinaciones de cinco RUC y se compararon 13 miARN, la complementariedad con sentido y antisentido no fue significativa.

Las correlaciones negativas entre los valores de expresión de micromatriz de RUC-T específicas y miARN de interacción predichos se confirmó por qRT-PCR para RUC-T seleccionadas y miARN de linfocitos de un conjunto independiente de pacientes con LLC y controles normales (Figura 3B).

Los inventores realizaron ensayos In vltro de interacción de miARN::RUC que implicaban miR-155 que se sobreexpresa en la forma agresiva de LLC (Calin et al., 2005), algunos linfomas y carcinomas (Eis et al., 2005; Kluiver et al., 2005; Volinia et al., 2006) y miR-24-1 y miR29-b que portan mutaciones en transcritos primarios de pacientes con LLC (Calin et al., 2005a).

Los inventores clonaron las RUC uc.160(N), uc.346A(P) y uc.348(N) en vectores indicadores de luciferasa para evaluar la posible interacción directa con miR-155, miR-24-1 o miR-29-b. Los inventores observaron reducción uniforme y reproducible en expresión de luciferasa con cuatro emparejamientos miR::RUC-T coherentes con interacciones que tienen lugar In vltro (Figura 3C).

Por el contrario, uc.348(N) no interaccionó con miR155 como se indica por el ensayo de luciferasa, un resultado que está de acuerdo con la correlación de expresión positiva de estos dos genes en pacientes con LLC y la baja complementariedad de secuencia (Figura 3A).

Interacciones in vivo

Para determinar si estas interacciones se producen in vivo, los inventores transfectaron miR-155 en células de leucemia MEG01 y evaluaron los niveles de uc.346A y uc.160 (ambos bien expresados en esta línea celular). A las

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24 horas después de transfección, m¡R-155 redujo significativamente el nivel de expresión de ambas RUC-T; después de 48 horas, la reducción de los niveles de m¡R-155 exógenos fue análoga a un aumento en la expresión de RUC-T (Figura 3D).

Este efecto reversible apoya una regulación de RUC-T por miARN específicos. Ya que esta interacción se demostró para los genes de la “identificación de ZAP-70”, los inventores investigaron las correlaciones entre la expresión de todos los miARN y RUC-T en cuanto a todo el genoma en los 50 pacientes con LLC. Resulta interesante que los inventores descubrieron una correlación negativa significativa (a una tasa de falsa detección (TFD) de menos de 0,01) entre 87 miARN (de los 235 aplicados puntualmente en la microplaca, 37%) y los niveles de expresión de RUC-T (Tabla 7).

Además, entre los genes correlacionados los inventores identificaron los pares m¡R-24-1::uc.160 y m¡R155::uc346A(P), que se ha demostrado experimentalmente que interaccionan (Figura 3E).

Además, m¡R-155 y uc.348, que no interaccionaron experimentalmente, no eran miembros de esta lista. Otros pares de posibles agentes de interacción para los que los inventores identificaron ensayos de luciferasa positivos fueron miR-15-a:: uc.78 y miR16:: uc. 78 (datos no mostrados). Por lo tanto, las RUC-T no codificantes representan posibles dianas de miARN, y estas interacciones pueden tener importancia biológica y de pronóstico para pacientes de cáncer.

Los RUC-T pueden actuar como oncogenes

Para expandir la caracterización funcional de RUC-T, se examinaron los efectos biológicos de uc. 73A (P) en un modelo de cáncer. Ya que esta es una de las RUC-T reguladas positivamente más estadísticamente significativas en cánceres de colon (P < 0,001), los inventores decidieron investigar los efectos de su regulación negativa en células de cáncer colorrectal COLO-320 que expresaban altos niveles de uc.73A(P). Como control los inventores usaron las células de cáncer de colon SW620 en las que la expresión de este gen no difiere de células colónicas normales (Figura 9).

Se diseñaron dos ARN de interferencia pequeños (ARNipI y ARNip3), así como un grupo de cuatro ARNip (grupo de ARNip), para dirigirse a uc. 73A(P) y se transfectaron en células COLO-320 y SW620. Hubo significativamente menos expresión de uc.73A(P) después de 48 (Figura 4Ay Figura 10), 72 y 144 horas (datos no mostrados) en las células COLO-320 tratadas con ARNip 1, 3 y el grupo. Se descubrió lo mismo también para células SW-620 (Figura

6).

El crecimiento de células COLO-320 se redujo significativamente después de 144 horas de tratamiento con ARNip específicos en comparación con células de control no tratadas (nulas) o tratadas con ARNip (P < 0,05 a 96 horas y P < 0,005 a 144 horas) (Figura 4B).

En comparación, la proliferación de las células de control SW620 no cambió significativamente (P = 0,83 y P = 0,23 a las 96 y 144 horas, respectivamente) (datos no mostrados). Los estudios de ciclo celular revelaron un aumento en la fracción sub-G1 de células (lo que sugiere la presencia de células apoptóticas, datos no mostrados) en células COLO-320, pero no en células SW620, un hallazgo confirmado por el ensayo de AnexinaV específica de apoptosis (Figura 4C y Figura 4D) y por ensayo de caspasa 3 (Figura 11).

Además, la intensidad de los efectos en la proliferación celular y la supervivencia fueron proporcionales al grado de inhibición por ARNip (Figura 4).

Estos datos sugieren que en cánceres colorrectales, uc. 73A(P) se comporta como un oncogén aumentando el número de células malignas como consecuencia de la apoptosis reducida.

Análisis

De acuerdo con el dogma de la oncología molecular, el cáncer es una enfermedad genética que implica proteínas supresoras de tumores y oncogénicas (Bishop, 1991; Hunter, 1991; Weinberg, 1991). Recientes hallazgos apoyan en fuerte medida la implicación de microARN en la patogénesis de una mayoría de los cánceres analizados y añaden una mayor complejidad a la arquitectura molecular de cánceres humanos (Calin et al., 2002; Esquela- Kerschery Slack, 2006; Calin y Croce, 2006a). Los miARN representan, sin embargo, solamente un grupo particular de ARNnc implicados en cánceres humanos. Se ha mostrado que los niveles de ARNnc intrónico antisentido se correlacionan con el grado de diferenciación tumoral en cáncer de próstata (Reis etal., 2005) y que la expresión de ARNnc de MALAT-1 predice la metástasis y supervivencia en cáncer de pulmón no microcítico de estadio temprano (Ji et al., 2003), lo que sugiere una mayor relación entre los ARNnc y la biología tumoral.

Para abordar con claridad esta cuestión, los inventores investigaron al nivel genómico una nueva clase completa de ARNnc, concretamente las regiones ultraconservadas no codificantes transcritas (RUC-T). Los inventores usaron herramientas bioinformáticas para demostrar que las RUC se localizan en regiones genómicas que son diana

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durante el proceso de formación de tumores lo que es indicativo de una implicación potencial en la tumorogénesis humana.

Como se muestra ahora en el presente documento, los inventores fueron capaces de clonar por amplificación de RACE ADNc correspondientes a uc.246(E) y uc.269A(N), lo que demuestra que las RUC son genes auténticos (nombrados en el presente documento GUC-nc) que se expresan y pueden clonarse por métodos convencionales.

Diversas técnicas de expresión incluyendo transferencia de Northern, qRT-PCR y realización de perfiles de micromatrices de todo el genoma, demostraron que las RUC se transcriben con frecuencia y que hay distintas identificaciones en leucemias y carcinomas humanos. Los inventores se centraron en la leucemia linfocítica crónica, la leucemia del adulto más frecuente en el mundo Occidental (Chiorazzi et al., 2005), en carcinoma colorrectal, uno de los cánceres más comunes en países industrializados (de la Chapelle, 2004) y en carcinoma hepatocelular, el tipo de cáncer de más rápido crecimiento en América (Wilson, 2005).

Los inventores descubrieron que para todos los tipos tumorales examinados, las células malignas tienen un espectro único de RUC expresadas en comparación con las células normales correspondientes, lo que sugiere que están implicadas variaciones significativas en la expresión de RUC-T en el proceso de formación de tumores.

La caracterización de la significancia funcional de alteraciones de la RUC-T en cánceres humanos no es un asunto trivial. Se puede plantear la hipótesis de multitud de funciones potenciales de RUC-T, incluyendo un papel inhibidor antisentido para genes codificantes de proteínas y otros ARN no codificantes, o un papel como miARN “específicos”, lo que significa miARN con peculiaridades tales como precursores muy largos (por ejemplo uc.339(P) que tiene una longitud de precursor que es el doble del miARN habitual). Este puzle se hace más complicado por el hecho de que varias RUC no actúan como genes y se descubrió que tenían funciones reguladoras como potenciadores (Nobrega et al., 2003; Pennacchio et al., 2006), mientras que otros representan exones de genes codificantes de proteínas con conexiones de cáncer conocidas/desconocidas. Una región particularmente interesante es el locus DA CHI que contiene 7 RUC en aproximadamente 700 kb (Bejerano et al., 2004b). Tres de las RUC de esta región se expresan diferencialmente en cánceres analizados, dos de los cuales son miembros de la identificación de LLC. La mayoría de las regiones conservadas exploradas de este locus en un modelo de ratón son potenciadores, incluyendo la uc.351(N) que no se expresó en ninguno de los tejidos analizados en el estudio de los inventores.

Resulta interesante que las dos únicas regiones que no consiguieron tener función potenciadora son uc.348(N) y uc.352(N), ambas clasificadas como no codificantes y ambas expresadas diferencialmente en cánceres humanos. Aumenta adicionalmente el interés en estas RUC-T específicas el hallazgo de que esta región genómica se ha ligado a susceptibilidad a LLC familiar y que ninguno de los genes codificantes de proteínas conocidos se mutaron

(Ng etal, 2007).

Recientemente, se ha descubierto que aparecen bloques cortos de varias decenas de pb de las regiones no codificantes del genoma humano (denominados piknones) aparecen dentro de casi todos los genes codificantes de proteínas conocidos (Rigoutsos et al., 2006). Aunque los piknones son distintos de las RUC, el elemento ultraconservado que contiene el mayor número de piknones (cuatro) fue uc. 73(P), que los inventores descubrieron que era una de las RUC-T más diferencialmente expresadas tanto en LLC como en CCR. Estas intrigantes observaciones sugieren un posible papel regulador para uc. 73(P) en los genes codificantes con secuencias complementarias.

Expandiendo adicionalmente la implicación de esta RUC-T en cánceres humanos, los inventores fueron capaces de demostrar una función oncogénica para uc.73(P) en cáncer de colon, ya que la disminución de su sobreexpresión indujo apoptosis y tuvo efectos antiproliferativos específicamente en células de cáncer de colon que expresaban de forma anómala esta RUC-T.

Los hallazgos de los inventores de que otra clase de ARNnc, las RUC-T, está alterada uniformemente a nivel genómico en un alto porcentaje de leucemias y carcinomas analizados, apoya un modelo en el que están implicados genes tanto codificantes como no codificantes y cooperan en tumorogénesis humana (Calin y Croce, 2006b).

Además, las correlaciones entre la expresión de RUC y miARN en pacientes con LLC plantea la intrigante posibilidad de rutas reguladoras funcionales complejas en las que dos o más tipos de ARNnc interaccionan e influyen en el fenotipo.

Los inventores también demostraron la existencia de la interacción de miR-NA::RUC-T en la que interaccionan dos tipos diferentes de ARNnc.

Los inventores descubrieron que los GUC-nc están uniformemente alterados a nivel genómico en un alto porcentaje de leucemias y carcinomas, y pueden interaccionar con miARN en leucemias. Los hallazgos proporcionan apoyo para un modelo en el que genes tanto codificantes como no codificantes están implicados en y cooperan en tumorogénesis humana.

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Ejemplo I

Procedimientos experimentales

A) Clonación por RACE y análisis de expresión por micromatrices, qRT-PCR y transferencia de Northern

1) Clonación por RACE

Se analizó la expresión de seis RUC (uc.47(N), uc.110(N), uc.192(N), uc.246(E), uc.269A(N) y uc.352(N)) en el cerebro, el testículo, la médula ósea, el intestino delgado, colon y tejido hepático usando diversas combinaciones de cebadores de PCR diseñados para amplificar productos cortos. Estos productos incluyeron 40meros usados para sondas en análisis de micromatrices y la secuencia de RUC completa de > 200 pb. Dos de los productos de RUC, uno exónico, uc.246(E) y uno no exónico, uc.269A(N), se clonaron por Amplificación Rápida de Extremos de ADNc (RACE) en las direcciones tanto 5’ como 3’. Las fuentes de tejido del que se clonaron secuencias fueron médula ósea, leucocitos, cerebro fetal y clon de acuerdo con el protocolo del fabricante (Marathon-ready cDNAs, Clontech, Palo Alto, CA).

2) Estudio de expresión de RUC por micromatrices.

Se extrajo ARN total con Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de 19 tejidos humanos normales (Liu et al., 2004) y de 50 muestras de LLC de pacientes a los que se diagnosticó LLC. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes en las instituciones del Consorcio de Investigación de LLC en los Estados Unidos. Como controles, se usaron linfocitos B CDS+ de 6 individuos sanos (cuatro muestras distintas, siendo dos grupos de dos individuos sanos diferentes) y células mononucleares (MNC) de 3 individuos como se indica en (Calin et al., 2005a). También se extrajo ARN de 78 carcinomas colorrectales primarios, 21 mucosas colónicas normales, 9 carcinomas hepatocelulares primarios y 4 hígados normales, recogidos en la Universidad de Ferrara, Universidad de Bolonia y Universidad Tor Vergata, Roma (Italia). Todas las muestras se obtuvieron con el consentimiento informado por escrito de acuerdo con las directrices institucionales para la protección de sujetos humanos.

Se desarrollaron microplacas de micromatrices con un total de 481 secuencias de RUC humanas como en (soe.ucsc.edu/-jill/ultra). Para cada RUC se diseñaron dos sondas de 40 unidades, una correspondiente a la secuencia genómica con sentido (denominada “+”) y la otra a la secuencia complementaria (denominada “A+”). Los criterios de diseño fueron como se ha descrito (Liu et al., 2004). Cada oligo se imprimió por duplicado en dos localizaciones de portaobjetos diferentes, y por lo tanto estuvieron disponibles valores numéricos por cuadruplicado para su análisis. Se usaron varios miles de puntos en blanco (3484) para resta de fondo. Se realizaron experimentos de extracción de ARN y micromatrices, consistentes en el ensamblaje de micromatriz de RUC, preparación de diana e hibridación de matrices, como se describe en detalle en otra parte (Liu etal., 2004; Calin etal., 2004a).

Brevemente, se marcaron 5 pg de ARN de cada muestra tisular con biotina por transcripción inversa usando hexámeros aleatorios. Se llevó a cabo hibridación en la segunda versión de la microplaca de miARN de los inventores (número de referencia de ArrayExpress: A-MEXP-258) que contenía las 962 sondas de RUC, 238 sondas para miARN maduro y 143 sondas para miARN precursores. Cada oligo se imprimió por duplicado en dos localizaciones de portaobjetos diferentes. Se detectaron señales de hibridación por unión con biotina de un conjugado de Estreptavidina - Alexa647 (señal de un color) usando un explorador GenePix 4000B (Axon Instruments). Se cuantificaron imágenes usando el GenePix Pro 6.0 (Axon Instruments).

Se normalizaron los datos sin procesar y se analizaron en GeneSpring GX 7.3 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Los datos de expresión de las 22 muestras tisulares se normalizaron con función Lowess en Bioconductor (paquete de Limma) y después se centraron en la mediana usando normalización de Gene-Spring; el umbral usado para determinar el nivel de expresión de RUC se calculó como el promedio de puntos blancos + 2 DT (desviación típica). Los tumores se normalizaron usando la mediana de normalización en microplaca y en gen del software GeneSpring. Se realizó análisis de agrupamiento jerárquico usando enlace promedio y correlación de Pearson como medidas de similitud. Se realizaron comparaciones estadísticas de tumores y tejidos normales filtrando según factor de cambio y usando después la estadística de ANOVA (Análisis de Varianza) del software Gene-Spring y la corrección de Benjamín y Hochberg para reducción de falsos positivos. El filtro en factor de cambio se ajustó en 1,2 debido a que se demostró que este umbral, ya usado para microARN analizados con la misma microplaca [véase por ejemplo (Cahn et al., 2005a; Cimmino et al., 2005; lorio et al., 2005)], reflejaba una diferencia biológica real. Las RUC-T expresadas diferencialmente entre pacientes con LLC, se agruparon de acuerdo con la expresión de proteína asociada a zeta de 70 kDa (ZAP-70), se identificaron combinando los resultados de ANOVA con el análisis de SAM (Análisis de Significancia de Micromatrices) y PAM (Análisis de Predicción de Micromatrices). Su expresión se comparó con la de microARN (Calin et al., 2005a). Todos los datos se presentaron usando MIAMExpress a la base de datos ArrayExpress y pudieron recuperarse usando el número de referencia E-TABM-184.

31 RT-PCR Cuantitativa para RUC

La RT-PCR cuantitativa fue el primer método que usaron los inventores para confirmar los resultados de

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micromatrices. Los inventores validaron los datos de micromatrices para once RUC, incluyendo uc. 73 (P)/73A (P), uc.135(E), uc. 160(N), uc.233(E)/233A(E), uc.269(N)/269A(N), uc.289(N), uc.291(P) y uc.346A(P) en diversas combinaciones de muestras, incluyendo de 15 a 17 muestras de LLC seleccionadas aleatoriamente del conjunto de matriz de 50, y diversos linfocitos B CD 19+/CD5+ normales y controles de linfocitos B y T por qRT-PCR. Se obtuvo un conjunto adicional de 3 linfocitos B normales CD19+/CD5+ positivos, no usados para estudios de micromatrices, de AlICells (Berkeley, CA), y se usó como un conjunto de confirmación independiente. En todos los casos los datos de qRT-PCR confirmaron los datos de micromatrices. El ARN se trató con DNasa I sin RNasa y se transcribió de forma inversa a ADNc usando cebadores aleatorios y transcriptasa inversa SuperScript II. Para determinar si el transcrito de RUC con sentido o antisentido se expresaba, el ARN total se transcribió de forma inversa usando Thermoscript RT y un cebador específico de gen (es decir con sentido o antisentido). Las condiciones de RT fueron como se ha descrito (Schmittgen et al., 2004). Se amplificó ADNc usando PCR en tiempo real y detección de verde SYBR usando cebadores de PCR diseñados para amplificar las mismas regiones de 40 pb que la sonda de oligo en la micromatriz. La cantidad relativa de cada RUC para ARNr 18S se determinó usando la ecuación 2”dcT, en la que dCT = (CTUCR- CTARNr18s). En relación con la expresión génica los datos se multiplicaron por 106 para simplificar la presentación.

4) Análisis de transferencia de Northern de RUC-T.

Los inventores analizaron cinco RUC, uc.110(N), uc.192(N), uc.246(E), uc.269A(N)y uc.352(N), por transferencia de Northern, dos de los cuales se clonaron después por experimentos de RACE. Para una sexta, la uc. 47(N), los datos no se muestran. Se sometió ARN total a electroforesis en geles de PAA-urea al 15 % (Calin etal., 2002). Las fuentes de ARN incluían 11 tejidos normales (mama, hígado, pulmón, riñón y páncreas) por duplicado o triplicado (obtenidos de Ambion y Clontech) y 4 muestras de MNC normales y 16 muestras de LLC preparadas en el laboratorio. Como esto representa la investigación por transferencia de Northern de la expresión de RUC, se usaron múltiples muestras de los mismos tejidos para confirmar la reproducibilidad de los datos. Las sondas se diseñaron para ser idénticas a los oligonucleótidos en la microplaca para detectar los mismos transcritos que la micromatriz, y la hibridación se realizó como se ha descrito (Calin et al., 2002).

B) Bases de datos y análisis estadísticos.

11 Bases de datos para localizaciones genómicas.

Las bases de datos de RUC usadas para todos los estudios presentados en el presente documento son como se ha publicado (Bejerano et al., 2004b). Los inventores restringieron sus análisis a 481 segmentos de más de 200 pares de bases (pb) de longitud. La base de datos de sitio Frágil (FRA) y las bases de datos de regiones genómicas asociadas con cáncer (RGAC) son como se ha publicado previamente (Caín etal., 2004b).

21 Análisis estadísticos para localizaciones genómicas.

Para ensayar las hipótesis que asocian la incidencia de regiones ultraconservadas (RUC) con sitios frágiles, regiones amplificadas en cáncer y regiones de supresión en cáncer, los inventores utilizaron modelos de regresión binomial negativa y de Poisson de efecto aleatorio. Según estos modelos, los “acontecimientos” se definieron como el número de RUC, y el “tiempo” de exposición (es decir sitio frágil frente a sitio no frágil) se definió como longitudes no solapantes de la región de interés. La “longitud” de una región fue exacta, si se conocía, o estimada como 1 Mb si se desconocía. Por ejemplo, para cada cromosoma la longitud total de todos los sitios frágiles no solapantes se calculó y se usó como el tiempo de exposición para sitios frágiles. Los inventores contaron después el número de RUC que aparecían dentro de sitios frágiles para cada cromosoma. Se supuso que la longitud restante de cada cromosoma (Mb total - Mb de sitios frágiles) era no frágil, y se supuso que las RUC restantes en cada cromosoma aparecían en la región no frágil. Después para cada región, se ajustaron modelos de efectos aleatorios alternativos, los modelos de Poisson de ceros inflados y los binomiales negativos de ceros inflados y, de los tres, se seleccionó el mejor modelo usando los Criterios de Información de Akaike (basándose en la probabilidad logarítmica y el número de parámetros). Este mismo enfoque se usó para análisis de los datos de expresión de proteínas de dedos de cinc. El modelo de mejor ajuste para sitios frágiles con RUC y PDH con proteínas de dedos de cinc fue el binomial negativo de ceros inflados. Para todos los otros casos, se presenta el modelo de Poisson. Cuando el número de categorías con cero acontecimientos era mayor de lo esperado para una distribución de Poisson, se prefirió el modelo binomial negativo de ceros inflados. Cuando el número total de acontecimientos fue demasiado pequeño para una región, las probabilidades modelo fueron incapaces de converger y no se presentan los resultados. El efecto aleatorio en los modelos de Poisson, Poisson de ceros inflados y de regresión binomial negativa de ceros inflados, fue el cromosoma individual, porque se supuso que los datos dentro de un cromosoma estaban correlacionados. El efecto fijo en cada modelo consistía en una variable o variables indicadoras para el tipo de región que se compara. Los inventores presentan la relación de tasa de incidencia (IRR), intervalo de confianza al 95 % de 2 caras de la relación de tasa de incidencia, y p valores de 2 caras para ensayar la hipótesis de que la relación de tasa de incidencia es de 1,0. Una IRR significativamente > 1 indica un aumento en el número de RUC dentro de una región sobre lo esperado al azar.

Las proporciones de agrupamiento de miARN y proteínas de dedos de cinc se compararon usando un ensayo

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asintótico de la diferencia en dos proporciones independientes, en el que se indica la diferencia, el intervalo de confianza al 95 % de la diferencia y el p valor. Debe observarse que la clase de factores de transcripción de ZNF de los genes mostró un agrupamiento significativamente menor (un grupo se define como la localización de al menos dos genes de la misma clase a menos de 50 kb de distancia genómica) en comparación con los microARN (32 %, 95/297 genes de ZNF agrupados frente a 48 %, 90/186 miARN agrupados, diferencia=16,4 %, IC al 95 %=(7,5 %, 25,2 %), P< 0,001). Todos los cálculos se completaron usando STATA v7.0 y StatXact v7.0.

31 Análisis estadísticos para correlaciones negativas entre la expresión de micromatrices de RUC v miARN.

Se proporciona una descripción detallada en el Ejemplo II y los datos en el mismo. Brevemente, los datos aportados se constituyeron por una lista de RUC-T y por una lista de miARN (las “semillas”) y la matriz correspondiente de valores de expresión. Los inventores calcularon r, el coeficiente de rango de Spearman de correlación para cada par de genes (miR, UC); concretamente, los inventores evalúan los P valores de los ensayos de correlación y seleccionan los genes cuyo valor de correlación es significativo a un valor dado de rechazo. Dado el gran número de ensayos de correlación realizados, se corrigieran los P valores para ensayo múltiple usando la tasa de falsa detección (TFD), como en (Benjamini y Hochberg, 1995). De esta manera, los P valores controlan el número de falsos positivos sobre el número de ensayos verdaderamente nulos, mientras que la TFD controla el número de falsos positivos sobre el número de ensayos significativos.

C) Estudios funcionales

11 Regulación negativa de RUC por interacción directa con microARN.

Las secuencias genómicas de uc.160, uc.346Ay uc.348 se clonaron en el vector de control pGL3 (Clontech) usando el sitio Xbal inmediatamente cadena abajo del codón de terminación de luciferasa. Se cultivaron líneas celulares megacariocítica humana MEG-01 y la de carcinoma del cuello uterino HeLa como se recomendó por la ATCC. Se cotransfectaron células en placas de 12 pocilios usando siPORT neoFX (Ambion) de acuerdo con el protocolo del fabricante usando 0,4 pg del vector indicador de luciferasa de luciérnaga y 0,08 pg del vector de control que contiene luciferasa de Renilla, pRL-TK (Promega). Para cada pocilio se usaron 10 nM de precursor con sentido de miARN y oligonucleótidos mezclados (Ambion). Se midieron las actividades de luciferasa de Luciérnaga y Renilla usando consecutivamente los ensayos de luciferasa dobles (Promega) 24 horas después de la transfección. Todos los experimentos se realizaron por triplicado en de cuatro a seis días diferentes (n=12 a 18).

Se analizó la expresión tanto del ARN ultraconservado como del miARN maduro usando PCR en tiempo real. La expresión del ARN de RUC se determinó por PCR en tiempo real como se ha descrito anteriormente. La expresión del miARN maduro se realizó usando ensayos de cebadores en bucle TaqMan para miR-155 (Applied Biosystems) como se describe (Chen et al., 2005). Se presentó la expresión de miARN maduro como 2-dCT en la que dCT = CTmiARN - CT1 ARNr me); los datos se multiplicaron por 106 para simplificarla presentación.

Para la correlación del paciente se usó un conjunto de 13 muestras (incluyendo 9 pacientes con LLC y 4 muestras de linfocitos normales) y se analizaron los niveles de miR-155, UC.346A y uc.160 como se describe en el presente documento. Para la identificación de los efectos “In vivo" en MEG01 de la transfección de miR-155, se midieron los niveles de uc.346A y uc.160 por qRT-PCR como se describe a las 0, 24 y 48 horas después de la transfección con el pre-miARN 155 (Ambion) usando reactivo de Lipofectamine.

21 Efectos en la proliferación de células cancerosas por inhibición de uc. 73AÍP1.

El ARNip contra la uc. 73A(P) se diseñó usando el algoritmo de Dharmacon (Dharmacon siDESIGN (harmacon.com/sidesign)) introduciendo la secuencia completa del RUC. Se ensayaron las ocho secuencias diana de mayor rango. El rendimiento se evaluó después de 48, 72 y 144 horas después de la transfección por RT-PCR semicuantitativa. Se usaron los dos ARNip más eficaces y un grupo de cuatro ARNip diferentes, incluyendo estos dos. Los inventores denominaron a estos ARNipI, ARNip3 y grupoARNip. Para el ensayo de crecimiento celular, se cultivaron las líneas celulares de cáncer de colon humano COLO-320 y SW620 en medio RPMI1640 complementado con FBS al 10 % y se sembraron 1 x 104 células en una placa de 96 pocilios un día antes de la transfección. Las células se transfectaron con ARNip uc.73A(P) a una concentración final de 200 nM usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se usó el Grupo de ARNip Sin Dirección siCONTROL (Dharmacon Research, La-Fayette, CO, Estados Unidos) como un control negativo. La transfección se repitió en las mismas condiciones cada dos días, a las 48 y a las 96 horas. Para evaluar el número de células se usó el Ensayo de Proliferación Celular CelITiter 96 Aqueous One (Promega U.S., Madison, Wl, Estados Unidos). Las lecturas se realizaron a 0, 48, 96 y 144 horas, midiendo respectivamente la absorbancia a 490 nm usando un lector de placas de ELISA (Spectra MAX, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Estados Unidos). El ensayo de crecimiento celular se realizó tres veces por triplicado para cada tratamiento. Las diferencias estadísticas entre el número de células en diversos puntos temporales con respecto al tiempo 0, se calcularon usando el ensayo de t.

Para los ensayos tanto de ciclo celular como de apoptosis, se sembraron células en placas de 6 pocilios a 6x105

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células por pocilio. El día después y luego cada 48 horas, las células se transfectaron con ARNip 200 nM. Las células se recogieron y se fijaron en etanol al 70 % frío durante al menos 30 minutos. Se realizó tinción con yoduro de propidio (Pl) a las 48, 96 y 144 horas en una solución de PBS de Pl 50 pg/ml (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y RNAsa sin DNAsa 5 pg/ml (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN. Estados Unidos). La tinción de apoptosis se realizó con el Kit de Detección de Apoptosis de Anexina V-FITC (BD Pharmingen, San José, CA, Estados Unidos) y con el kit de apoptosis de anticuerpo de Caspasa-3 activo monoclonal conjugado con PE (BD Biosciences) a las 0 y 144 horas de acuerdo con el procedimiento del fabricante usando un FACS Calibur (BD Biosciences, San José, CA, Estados Unidos) para adquirir los datos. Cada experimento se realizó tres veces.

Los números de referencia de GeneBank para las RUC-T clonadas descritas en este estudio son los siguientes: DQ644536 (UCG.246), DQ644537 (UCG.269A, forma corta), y DQ644538 (UCG.269A, forma larga).

EJEMPLO II

Procedimientos experimentales

Análisis Estadísticos para correlaciones negativas entre la expresión de micromatrices de RUC y miARN.

Los datos de entrada se constituyeron por una lista de GUC y por una lista de miARN (las “semillas”) y la matriz correspondiente de valores de expresión. Los inventores calcularon r, el coeficiente de correlación por rangos de Spearman, una medida no paramétrica de correlación de tendencia de datos basada en clasificaciones, para cada par de genes (miR, RUC); concretamente, los inventores evalúan los P valores de los ensayos de correlación y seleccionaron los genes cuyo valor de correlación es significativo a un valor de rechazo dado. Se realizó evaluación de P valores suponiendo que los valores de correlación se distribuyen usando distribución acumulada de t de Student, con un número de grados de libertad correspondiente al número de muestras en el experimento de micromatrices. Los P-valores miden la “bondad” de las correlaciones individuales (entre pares de genes), por lo tanto, para entender si la correlación real deriva por casualidad o representa una información biológicamente importante, los inventores eligen el método de permutaciones, cambiando el orden de las muestras para cada fila (miR o RUC) y calculando las correlaciones entre pares de genes (miR, RUC) con diferentes órdenes de muestras cambiados. Los inventores repitieron la permutación de muestras y correlaciones calculadas 100 veces, de esta manera, cada correlación real tiene 100 correlaciones aleatorias con las que comparar. Usando todas las correlaciones aleatorias (100 * n° MIR * n° UC) y correlaciones reales, los inventores recalcularon los P-valores basándose en clasificación de correlaciones aleatorias y posición de las correlaciones reales.

Dado el alto número de ensayos de correlaciones realizados, los P valores se corrigieran para múltiples ensayos usando la tasa de falsa detección (TFD), como se define en (Benjamini y Flochberg, 1995). De esta manera, los P- valores controlan el número de falsos positivos sobre el número de ensayos verdaderamente nulos, mientras que la TFD controla el número de falsos positivos sobre el número de ensayos significativos. Se han propuesto varios modos de estimar este número, y los inventores han adoptado la solución presentada por Tom Nichols (véase froi.sourceforge.net/documents/technical/ matlab/FDR), que cambia de escala el P valor obtenido en un único ensayo multiplicándolo por una combinación de índices relacionados con el número total de ensayos realizados. Se realizó corrección semilla a semilla, lo que significa que los genes en la lista de semillas se consideraron ensayos independientes. Esta triple filtración validada estadísticamente permite la extracción dirigida de una lista de genes candidatos, ahorrando de este modo recursos para el siguiente análisis genético costoso y que requiere mucho tiempo.

Para construir una representación de dispersión entre los valores de expresión de miR-24-1 y uc.160, los inventores representaron una línea de regresión usando la función de MatLab ROBUSTFIT para explicar las hipótesis de correlación negativa entre estos dos genes. Obsérvese que solamente 11,67% (7/60) de los puntos (pares de valores de expresión) son atípicos.

EJEMPLO III

Ejemplos adicionales e información

Como se usan en el presente documento, miR y RUC se usan indistintamente; incluyendo de una manera no limitante: un “producto génico de miR”, “microARN”, “miR” o “miARN” se refiere al transcrito de ARN no procesado (por ejemplo, precursor) o procesado (por ejemplo, maduro) de un gen de miR.

Diagnóstico usando RUC (miARN)

En un aspecto, se proporcionan en el presente documento métodos para diagnosticar si un sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, un cáncer, que comprende medir el nivel de al menos una RUC en una muestra de ensayo del sujeto y comparar el nivel del producto génico de miR en la muestra de ensayo con el nivel del producto génico de miR correspondiente en una muestra de control. Como se usa en este documento, un “sujeto” puede ser cualquier mamífero que tenga, o se sospeche que tiene, un cáncer. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano

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que tiene, o se sospecha que tiene, un cáncer.

El nivel de al menos un producto génico de miR puede medirse en una muestra biológica (por ejemplo, células, tejidos) obtenida del sujeto. Por ejemplo, puede retirarse una muestra tisular (por ejemplo, de un tumor) de un sujeto que se sospecha que tiene una enfermedad relacionada con cáncer por técnicas de biopsia convencionales. En otra realización, puede retirarse una muestra de sangre del sujeto, y pueden aislarse células sanguíneas (por ejemplo, glóbulos blancos) para extracción de ADN por técnicas convencionales. La muestra de sangre o tejido se obtiene preferentemente del sujeto antes del inicio de la radioterapia, quimioterapia u otro tratamiento terapéutico. Puede obtenerse una muestra de tejido o sangre de control correspondiente de tejidos no aquejados del sujeto, de un individuo humano normal o de una población de individuos normales, o de células cultivadas correspondientes a la mayoría de células en la muestra del sujeto. La muestra de tejido o sangre de control se procesa después junto con la muestra del sujeto, de modo que los niveles del producto génico de miR producidos a partir de un gen de miR dado en células de la muestra del sujeto pueden compararse con los niveles del producto génico de miR correspondientes de células de la muestra de control. También puede usarse como control un patrón de expresión del miR de referencia para la muestra biológica.

Una alteración (por ejemplo, un aumento o una reducción) del nivel de un producto génico del miR en la muestra obtenida del sujeto, en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativa de la presencia de una enfermedad relacionada con cáncer en el sujeto.

En una realización, el nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo es mayor que el nivel del producto génico de miR correspondiente en la muestra de control (es decir, la expresión del producto génico de miR está “regulada positivamente”). Como se usa en el presente documento, la expresión de un producto génico de miR está “regulada positivamente” cuando la cantidad del producto génico de miR en una muestra celular o tisular de un sujeto es mayor que la cantidad del mismo producto génico en una muestra celular o tisular de control.

En otra realización, el nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo es menor que el nivel del producto génico de miR correspondiente en la muestra de control (es decir, la expresión del producto génico de miR está “regulada negativamente”). Como se usa en el presente documento, la expresión de un gen de miR está “regulada negativamente” cuando la cantidad de producto génico de miR producido a partir de ese gen en una muestra celular o tisular de un sujeto es menor que la cantidad producida del mismo gen en una muestra celular o tisular de control.

La expresión génica de miR relativa en las muestras de control y normales puede determinarse con respecto a uno o más patrones de expresión de ARN. Los patrones pueden comprender, por ejemplo, un nivel de expresión de gen de miR cero, el nivel de expresión del gen de miR en una línea celular convencional, el nivel de expresión del gen de miR en tejidos no aquejados del sujeto, o el nivel promedio de expresión del gen de miR previamente obtenido para una población de controles humanos normales.

El nivel de un producto génico de miR en una muestra puede medirse usando cualquier técnica que sea adecuada para detectar los niveles de expresión de ARN en una muestra biológica. Se conocen bien por los expertos en la materia técnicas adecuadas (por ejemplo, análisis de transferencia de Northern, RT-PCR, hibridación in situ) para determinar los niveles de expresión de ARN en una muestra biológica (por ejemplo, células, tejidos). En una realización particular, el nivel de al menos un producto génico de miR se detecta usando análisis de transferencia de Northern. Por ejemplo, puede purificarse ARN celular total de células por homogeneización en presencia de tampón de extracción de ácido nucleico, seguido por centrifugación. Los ácidos nucleicos se precipitan, y el ADN se retira por tratamiento con DNasa y precipitación. Las moléculas de ARN se separan después por electroforesis en gel en geles de agarosa de acuerdo con técnicas convencionales, y se transfieren a filtros de nitrocelulosa. El ARN se inmoviliza después en los filtros por calentamiento. La detección y cuantificación del ARN específico se consigue usando sondas de ADN o ARN marcadas de forma apropiada complementarias con del ARN en cuestión. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2a edición, Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Capítulo 7.

Pueden producirse sondas adecuadas para hibridación de transferencia de Northern de un producto génico de miR dado a partir de las secuencias de ácido nucleico e incluyen, pero sin limitación, sondas que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o complementariedad completa con un producto génico de miR de interés. Se describen métodos para la preparación de sondas de ADN y ARN marcadas, y las condiciones para hibridación de las mismas con secuencias de nucleótidos diana, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2a edición, Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Capítulos 10 y 11.

En un ejemplo no limitante, la sonda de ácido nucleico puede marcarse con, por ejemplo, un radionúclido, tal como 3H, 32P, 33P, 14C o 35S; un metal pesado; un ligando capaz de actuar como un miembro de par de unión específico para un ligando marcado (por ejemplo, biotina, avidina o un anticuerpo); una molécula fluorescente; una molécula quimioluminiscente; una enzima o similares.

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Las sondas pueden marcarse con alta actividad específica mediante el método de traslación de muesca de Rigby et al. (1977), J. Mol. Biol. 113: 237-251 o mediante el método de uso aleatorio de cebadores de Fienberg et al. (1983), Anal. Biochem. 132: 6-13. Este último es el método elegido para sintetizar sondas marcadas con 32P de alta actividad específica de ADN monocatenario o de moldes de ARN. Por ejemplo, reemplazando nucleótidos preexistentes con nucleótidos altamente radiactivos de acuerdo con el método de traslación de muesca, es posible preparar sondas de ácido nucleico marcadas con 32P con una actividad específica bastante superior a 10® cpm/microgramo. Después puede realizarse detección autorradiográfica de hibridación exponiendo los filtros hibridados a película fotográfica. El cribado densitométrica de las películas fotográficas expuestas por los filtros hibridados proporciona una medida precisa de los niveles de transcrito génico de m¡R. Usando otro enfoque, los niveles de transcrito génico de m¡R pueden cuantificarse por sistemas de captura de imágenes computarizadas, tales como el Molecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimaaer disponible de Amersham Biosciences, Piscataway, NJ.

Cuando el mareaje de radionúclidos de sondas de ADN o ARN no sea práctico, puede usarse el método de cebador aleatorio para incorporar un análogo, por ejemplo, el análogo de dTTP 5-(A/-(A/-biotinil-épsilon-aminocaproílo)-3- aminoalilo) desoxiuridina trifosfato, en la molécula de sonda. El oligonucleótido sonda biotinilado puede detectarse por reacción con proteínas de unión a biotina, tales como avidina, estreptavidina y anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos anti-biotina) acoplados con colorantes fluorescentes o enzimas que producen reacciones de color.

Además de las técnicas de hibridación de Northern y otros ARN, puede conseguirse determinar los niveles de transcritos de ARN usando la técnica de hibridación in sltu. Esta técnica requiere menos células que la técnica de transferencia de Northern e implica la deposición de células completas en un cubreobjetos de microscopio y explorar el contenido de ácido nucleico de la célula con una solución que contiene sondas de ácido nucleico marcado con radioactividad o de otro modo (por ejemplo, ADNc o ARN). Esta técnica está particularmente bien adaptada para analizar muestras de biopsia tisular de sujetos. La práctica de la técnica de hibridación in situ se describe en más detalle en la Patente de Estados Unidos n.° 5.427.916.

En un ejemplo no limitante, las sondas adecuadas para hibridación in situ de un producto génico de m¡R dado pueden producirse a partir de las secuencias de ácido nucleico, e incluyen, pero sin limitación, sondas que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o complementariedad completa con un producto génico de miR de interés, como se ha descrito anteriormente.

El número relativo de transcritos génicos de miR en células también puede determinarse por transcripción inversa de transcritos génicos de miR, seguido de amplificación de los transcritos de transcripción inversa por reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Los niveles de transcritos génicos de miR puede cuantificarse en comparación con un patrón interno, por ejemplo, el nivel de ARNm de un gen “constitutivo” presente en la muestra. Un gen “constitutivo” adecuado para uso como un patrón interno incluye, por ejemplo, miosina o gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH). Se conocen bien por los expertos en la materia métodos para realizar RT-PCR cuantitativa y semi-cuantitativa y variaciones de las mismas.

En algunos casos, puede ser deseable determinar simultáneamente el nivel de expresión de una pluralidad de productos génicos de miR diferentes en una muestra. En otros casos, puede ser deseable determinar el nivel de expresión de los transcritos de todos los genes de miR conocidos correlacionados con un cáncer. La evaluación de los niveles de expresión específicos de cáncer para cientos de genes de miR o productos génicos consume mucho tiempo y requiere una gran cantidad de ARN total (por ejemplo, al menos 20 pg para cada transferencia de Northern) y técnicas autorradiográficas que requieren isótopos radiactivos.

Para superar estas limitaciones, puede construirse una oligobiblioteca, en formato de microplaca (es decir, una micromatriz), que contiene un conjunto de sondas oligonucleotídicas (por ejemplo, oligodesoxinucleótidos) que son específicas para un conjunto de genes de miR. Usando dicha micromatriz, el nivel de expresión de múltiples microARN en una muestra biológica puede determinarse por transcripción inversa del ARN para generar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, e hibridarlos para explorar los oligonucleótidos en la micromatriz para generar un perfil de hibridación, o expresión. El perfil de hibridación de la muestra de ensayo puede después compararse con el de una muestra de control para determinar qué microARN tienen un nivel de expresión alterado en células cancerosas.

Como se usa en el presente documento, “oligonucleótido sonda” u “oligodesoxinucleótido sonda” se refiere a un oligonucleótido que es capaz de hibridar con un oligonucleótido diana. “Oligonucleótido diana” u “oligodesoxinucleótido diana” se refiere a una molécula para detectar (por ejemplo, mediante hibridación). Por “oligonucleótido sonda específico de miR” u “oligonucleótido sonda específico para un miR” se entiende un oligonucleótido sonda que tiene una secuencia seleccionada para hibridar con un producto génico de miR específico, o con un transcrito inverso del producto génico de miR específico.

Un “perfil de expresión” o “perfil de hibridación” de una muestra particular es esencialmente una identificación genética del estado de la muestra; mientras que dos estados pueden tener cualquier gen particular expresado de forma similar, la evaluación de varios genes simultáneamente permite la generación de un perfil de expresión génica que es único del estado de la célula. Es decir, el tejido normal puede distinguirse de tejido canceroso (por ejemplo,

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tumor), y dentro del tejido canceroso, pueden determinarse diferentes estados de pronóstico (por ejemplo, perspectivas de supervivencia a largo plazo buenas o malas). Comparando los perfiles de expresión del tejido canceroso en diferentes estados, se obtiene información acerca de qué genes son importantes (incluyendo regulación positiva y negativa de genes) en cada uno de estos estados. La identificación de secuencias que se expresan diferencialmente en tejido canceroso, así como expresión diferencial que da como resultado resultados de pronóstico diferentes, permite el uso de esta información de varias maneras.

En un ejemplo no limitante, puede evaluarse un régimen de tratamiento particular (por ejemplo, para determinar si un fármaco quimioterapéutico actúa para mejorar el pronóstico a largo plazo en un paciente particular. De forma similar, puede realizarse o confirmarse el diagnóstico comparando muestras de pacientes con perfiles de expresión conocidos. Además, estos perfiles de expresión génica (o genes individuales) permiten el cribado de candidatos farmacológicos que suprimen el perfil de expresión de cáncer o convierten un perfil de pronóstico negativo en un perfil de mejor pronóstico.

En consecuencia, también se proporcionan en el presente documento métodos para diagnosticar si un sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, un cáncer, que comprenden transcribir de forma inversa ARN a partir de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, hibridar los oligodesoxinucleótidos diana con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo, y comparar el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control o patrón de referencia, en el que una alteración en la señal de al menos un miARN es indicativa de que el sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, cáncer.

En una realización, la micromatriz comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para una parte sustancial de todos los miARN humanos conocidos. En una realización particular, la micromatriz comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para uno o más miARN seleccionados del grupo que consiste en miR29a, miR-29b, miR-29cy combinaciones de los mismos.

La micromatriz puede prepararse a partir de sondas oligonucleotídicas específicas de gen generadas a partir de secuencias de miARN conocidas. La matriz puede contener dos sondas oligonucleotídicas diferentes para cada miARN, conteniendo una la secuencia activa, madura y siendo la otra específica para el precursor del miARN. La matriz también puede contener controles, tales como una o más secuencias de ratón que difieren de ortólogos humanos en solamente algunas bases, que pueden actuar como controles para condiciones de rigurosidad de hibridación. También pueden imprimirse ARNt u otros ARN (por ejemplo, ARNr, ARNm) de ambas especies en la microplaca, proporcionando un control positivo, interno, relativamente estable, para hibridación específica. También pueden incluirse en la microplaca uno o más controles apropiados para hibridación no específica. Para este fin, se seleccionan secuencias basándose en la ausencia de cualquier homología con cualquier miARN conocido.

La micromatriz puede fabricarse usando técnicas conocidas en este campo. Por ejemplo, oligonucleótidos sonda de una longitud apropiada, por ejemplo, 40 nucleótidos, se modifican con amina 5’ en la posición C6 y se imprimen usando sistemas de micromatrices disponibles en el mercado, por ejemplo, el aparato de micromatrices Gen- eMachine OmniGrid™ 100 y Portaobjetos activados Amersham CodeLink™. Se prepara oligómero de ADNc marcado correspondiente a los ARN diana por transcripción inversa del ARN diana con cebador marcado. Después de la síntesis de primera cadena, los híbridos de ARN/ADN se desnaturalizan para degradar los moldes de ARN. Los ADNc diana marcados preparados de este modo se hibridan después con la microplaca de micromatrices en condiciones hibridantes, por ejemplo, SSPE 6X/formamida al 30 % a 25 °C durante 18 horas, seguido de lavado en TNT 0,75X (Tris HCI/NaCI/Tween 20) a 37 °C durante 40 minutos. En posiciones en la matriz en las que el ADN sonda inmovilizado reconoce un ADNc diana complementario en la muestra, se produce hibridación. El ADNc diana marcado señala la posición exacta en la matriz en la que se produce la unión, permitiendo la detección y cuantificación automática. El resultado consiste en una lista de acontecimientos de hibridación, que indican la abundancia relativa de secuencias de ADNc específicas, y por lo tanto la abundancia relativa de los m¡R complementarios correspondientes, en la muestra del paciente.

De acuerdo con una realización, el oligómero de ADNc marcado es un ADNc marcado con biotina, preparado a partir de una sonda marcada con biotina. La micromatriz se procesa después por detección directa de los transcritos que contienen biotina, usando, por ejemplo, conjugado de Estreptavidina-Alexa647 y se explora utilizando métodos de cribado convencionales. Las intensidades de imágenes de cada punto de la matriz son proporcionales a la abundancia del miR correspondiente en la muestra del paciente.

El uso de la matriz tiene varias ventajas para detección de expresión de miR. En primer lugar, la expresión global de varios cientos de genes puede identificarse en la misma muestra en un punto temporal. En segundo lugar, mediante un diseño cuidadoso de las sondas oligonucleotídicas, puede identificarse la expresión de moléculas tanto maduras como precursoras. En tercer lugar, en comparación con el análisis de transferencia de Northern, la microplaca requiere una cantidad pequeña de ARN, y proporciona resultados reproducibles usando 2,5 pg de ARN total. El número relativamente limitado de miARN (algunos cientos por cada especie) permite la construcción de una micromatriz común para varias especies, con sondas olignucleotídicas definidas para cada una. Dicha herramienta

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permite el análisis de expresión trans-especie para cada miR conocido en diversas condiciones.

Además del uso para ensayos del nivel de expresión cuantitativa de miR específicos, puede emplearse una microplaca que contienen oligonucleótidos sonda específicos de miARN correspondientes a una parte sustancial de miRNoma, preferentemente el miRNoma completo, para llevar a cabo el perfil de expresión génica de miR, para análisis de los patrones de expresión de miR. Pueden asociarse identificaciones de miR definidas a marcadores de enfermedades establecidos, o directamente con una patología.

De acuerdo con los métodos de realización de perfiles de expresión descritos en el presente documento, se transcribió de forma inversa cuantitativamente ARN total de una muestra de un sujeto que se sospechaba que tenía una enfermedad relacionada con cáncer para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana marcados complementarios del ARN en la muestra. Los oligodesoxinucleótidos diana se hibridan después con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra. El resultado es un perfil de hibridación para la muestra que representa el patrón de expresión de miARN en la muestra. El perfil de hibridación comprende la señal de la unión de los oligodesoxinucleótidos diana de la muestra con los oligonucleótidos sonda específicos de miARN en la micromatriz. El perfil puede registrarse como la presencia o ausencia de unión (señal frente a señal cero).

Más preferentemente, el perfil registrado incluye la intensidad de la señal de cada hibridación. El perfil se compara con el perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control normal, es decir, no cancerosa. Una alteración en la señal es indicativa de la presencia de, o propensión a desarrollar, cáncer en el sujeto.

Otras técnicas para medir la expresión génica de miR también están dentro de la experiencia de este campo, e incluyen diversas técnicas para medir las tasas de transcripción y degradación de ARN.

También se proporcionan en el presente documento métodos para determinar el pronóstico de un sujeto con un cáncer, que comprenden medir el nivel de al menos un producto génico de miR que se asocia a un pronóstico particular en una enfermedad relacionada con cáncer (por ejemplo, un pronóstico bueno o positivo, un pronóstico malo o adverso), en una muestra ensayo del sujeto.

De acuerdo con estos métodos, una alteración en el nivel de un producto génico de miR que se asocia a un pronóstico particular en la muestra de ensayo, en comparación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto tiene un cáncer con un pronóstico particular. En una realización, el producto génico de miR se asocia a un pronóstico adverso (es decir, malo). Los ejemplos de un pronóstico adverso incluyen, pero sin limitación, baja tasa de supervivencia y rápida progresión de la enfermedad. En ciertas realizaciones, el nivel del al menos un producto génico de miR se mide por transcripción inversa de ARN a partir de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, hibridación de los oligodesoxinucleótidos diana con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo, y comparación del perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control.

Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se cree que las alteraciones en el nivel de uno o más productos génicos de miR en células pueden dar como resultado la desregulación de una o más dianas pretendidas para estos miR, lo que puede conducir a la formación de cánceres. Por lo tanto, la alteración del nivel del producto génico de miR (por ejemplo, reduciendo el nivel de un producto génico de miR que está regulado positivamente en células cancerosas, aumentando el nivel de un producto génico de miR que está regulado negativamente en células cancerosas) puede tratar con éxito el cáncer.

En consecuencia, se proporciona adicionalmente en el presente documento métodos para inhibir la tumorogénesis en un sujeto que tiene, o se sospecha que tiene, un cáncer en el que al menos un producto génico de miR está desregulado (por ejemplo, regulado negativamente, regulado positivamente) en las células cancerosas del sujeto. Cuando el al menos un producto génico de miR aislado está regulado negativamente en las células cancerosas (por ejemplo, familia de miR-29), el método comprende administrar una cantidad eficaz del al menos un producto génico de miR aislado, o una variante aislada o fragmento biológicamente activo de la misma, de modo que la proliferación de células cancerosas en el sujeto está inhibida.

Por ejemplo, cuando un producto génico de miR está regulado negativamente en una célula cancerosa en un sujeto, la administración de una cantidad eficaz de un producto génico de miR aislado al sujeto puede inhibir la proliferación de la célula cancerosa. El producto génico de miR aislado que se administra al sujeto puede ser idéntico al producto génico de miR de tipo silvestre endógeno (por ejemplo, un producto génico de miR) que está regulado negativamente en la célula cancerosa o puede ser una variante o un fragmento biológicamente activo del mismo.

Como se define en el presente documento, una “variante” de un producto génico de miR se refiere a un ARNm que tiene menos de 100 % de identidad con un producto génico de miR de tipo silvestre correspondiente y posee una o más actividades biológicas del producto génico de miR de tipo silvestre correspondiente. Los ejemplos de dichas

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actividades biológicas incluyen, pero sin limitación, inhibición de la expresión de una molécula de ARN diana (por ejemplo, Inhibición de la traducción de una molécula de ARN diana, modulación de la estabilidad de una molécula de ARN diana, inhibición del procesamiento de una molécula de ARN diana) e inhibición de un proceso celular asociado a cáncer (por ejemplo, diferenciación celular, crecimiento celular, muerte celular). Estas variantes incluyen variantes de especie y variantes que son la consecuencia de una o más mutaciones (por ejemplo, una sustitución, una supresión, una inserción) en un gen de miR. En ciertas realizaciones, la variante es al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99% idéntica a un producto génico de miR de tipo silvestre correspondiente.

Como se define en el presente documento, un “fragmento biológicamente activo” de un producto génico de miR se refiere a un fragmento de ARN de un producto génico de miR que posee una o más actividades biológicas de un producto génico de miR de tipo silvestre correspondiente. Como se ha descrito anteriormente, los ejemplos de dichas actividades biológicas Incluyen, pero sin limitación, inhibición de la expresión de una molécula de ARN diana e inhibición de un proceso celular asociado a un cáncer. En ciertas realizaciones, el fragmento biológicamente activo es de al menos aproximadamente 5, 7, 10,12, 15 o 17 nucleótidos de longitud.

En una realización particular, un producto génico de miR aislado puede administrarse a un sujeto en combinación con uno o más tratamientos antlneopláslcos adicionales. Los tratamientos antlneopláslcos adecuados Incluyen, pero sin limitación, quimioterapia, radioterapia y combinaciones de los mismos (por ejemplo, quimiorradiación).

Cuando el al menos un producto génico de miR aislado está regulado positivamente en las células cancerosas, el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresión del al menos un producto génico de miR, denominado en el presente documento compuestos de inhibición de la expresión génica de miR, de modo que se inhiba la proliferación de las células cancerosas. En una realización particular, el al menos un compuesto de inhibición de la expresión de miR es específico para un producto génico de miR seleccionado del grupo que consiste en la familia de miR29, incluyendo m¡R-29a, m¡R-29b, miR-29c, y combinaciones de los mismos.

Los términos “tratar”, “tratando” y “tratamiento”, como se usan en el presente documento, se refieren a aliviar síntomas asociados a una enfermedad o afección, por ejemplo, un cáncer, incluyendo prevenir o retardar la aparición de los síntomas de enfermedad y/o reducir la gravedad o frecuencia de los síntomas de la enfermedad o afección. Se define en el presente documento que los términos “sujeto”, “paciente” e “individuo” incluyen animales, tales como mamíferos, incluyendo, pero sin limitación , primates, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, cobayas, ratas, ratones u otras especies bovinas, ovinas, equinas, caninas, felinas, roedoras o murinas. En una realización preferida, el animal es un ser humano.

Como se usa en el presente documento, una “cantidad eficaz” de un producto génico de miR aislado es una cantidad suficiente para inhibir la proliferación de una célula cancerosa en un sujeto que padece un cáncer. Un experto en la materia puede determinar fácilmente una cantidad eficaz de un producto génico de miR para administrar a un sujeto dado, teniendo en cuenta factores tales como la talla y el peso del sujeto; el alcance de penetración de enfermedad; la edad, la salud y el sexo del sujeto; la vía de administración; y si la administración es regional o sistémica.

Por ejemplo, una cantidad eficaz de un producto génico de miR aislado puede basarse en el peso aproximado de una masa tumoral para tratar. El peso aproximado de una masa tumoral puede determinarse calculando el volumen aproximado de la masa, en el que un centímetro cúbico de volumen es aproximadamente equivalente a un gramo. Una cantidad eficaz del producto génico de miR aislado basándose en el peso de una masa tumoral puede estar en el intervalo de aproximadamente 10-500 microgramos/gramo de masa tumoral. En ciertas realizaciones, la masa tumoral puede ser al menos aproximadamente 10 microgramos/gramo de masa tumoral, al menos aproximadamente 60 microgramos/gramo de masa tumoral o al menos aproximadamente 100 microgramos/gramo de masa tumoral.

Una cantidad eficaz de un producto génico de miR aislado puede basarse también en el peso corporal aproximado o estimado de un sujeto para tratar. Preferentemente, dichas cantidades eficaces se administran por vía parenteral o por vía entérica, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una cantidad eficaz del producto génico de miR aislado que se administra a un sujeto puede variar de aproximadamente 5 a aproximadamente 3000 microgramos/kg de peso corporal, de aproximadamente 700 a 1000 microgramos/kg de peso corporal, o más de aproximadamente 1000 microgramos/kg de peso corporal.

Un experto en la materia también puede determinar fácilmente un régimen de dosificación apropiado para la administración de un producto génico de miR aislado a un sujeto dado. Por ejemplo, puede administrarse un producto génico de miR al sujeto una vez (por ejemplo, como una única inyección o deposición). Como alternativa, una producto génico de miR puede administrarse una vez o dos veces al día a un sujeto durante un periodo de aproximadamente tres a aproximadamente veintiocho días, más particularmente de aproximadamente siete a aproximadamente diez días. En un régimen de dosificación particular, se administra un producto génico de miR una vez al día durante siete días. Cuando un régimen de dosificación comprende múltiples administraciones, se entiende que la cantidad eficaz del producto génico de miR administrado al sujeto puede comprender la cantidad total de

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producto génico de miR administrado durante el régimen de dosificación completo.

Como se usa en el presente documento, un producto génico de miR “aislado” es uno que se sintetiza, o se altera o retira del estado natural mediante intervención humana. Por ejemplo, se considera que un producto génico de miR sintético, o un producto génico de miR parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natural está “aislado”. Un producto génico de miR aislado puede existir en forma sustancialmente purificada, o puede existir en una célula en la que se ha suministrado el producto génico de miR. Por lo tanto, un producto génico de miR que se suministra deliberadamente a, o se expresa en, una célula se considera un producto génico de miR “aislado”. También se considera que un producto génico de miR producido dentro de una célula a partir de una molécula precursora de miR es una molécula “aislada”. De acuerdo con una realización particular, los productos génicos de miR aislados descritos en el presente documento pueden usarse para la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer en un sujeto (por ejemplo, un ser humano).

Pueden obtenerse productos génicos de miR aislados usando varias técnicas convencionales. Por ejemplo, los productos génicos de miR pueden sintetizarse químicamente o producirse de forma recombinante usando métodos conocidos en la técnica. En una realización, los productos génicos de miR se sintetizan químicamente usando ribonucleósido fosforamiditas protegidas apropiadamente y un sintetizador de ADN/ARN convencional. Los proveedores comerciales de moléculas de ARN sintéticas o reactivos de síntesis incluyen, por ejemplo, Proligo (Hamburgo, Alemania), Dhaumacon Research (Lafayette, CO, Estados Unidos), Pierce Chemical (parte de Perbio Science, Rockford, IL, Estados Unidos), Glen Research (Sterling, VA, Estados Unidos), ChemGenes (Ashland, MA, Estados Unidos) y Cruachem (Glasgow, Reino Unido).

Como alternativa, los productos génicos de miR pueden expresarse a partir de plásmidos de ADN circular o lineal recombinante usando cualquier promotor adecuado. Los promotores adecuados para expresar ARN a partir de un plásmido incluyen por ejemplo, las secuencias promotoras de ARN pol III U6 o H1, o los promotores de citomegalovirus. La selección de otros promotores adecuados está dentro de la experiencia de la técnica. Los plásmidos recombinantes de la invención también pueden comprender promotores inducibles o regulables para expresión de los productos génicos de miR en células cancerosas.

Los productos génicos de miR que se expresan a partir de plásmidos recombinantes pueden aislarse de sistemas de expresión de células cultivadas por técnicas convencionales. Los productos génicos de miR que se expresan a partir de plásmidos recombinantes también pueden suministrarse a, y expresarse directamente en, las células cancerosas. El uso de plásmidos recombinantes para suministrar los productos génicos de miR a células cancerosas se analiza en más detalle posteriormente.

Los productos génicos de miR pueden expresarse a partir de un plásmido recombinante separado, o pueden expresarse a partir el mismo plásmido recombinante. En una realización, los productos génicos de miR se expresan como moléculas precursoras de ARN a partir de un único plásmido, y las moléculas precursoras se procesan en el producto génico de miR funcional por un sistema de procesamiento adecuado, incluyendo, pero sin limitación, sistemas de procesamiento existentes dentro de una célula cancerosa. Otros sistemas de procesamiento adecuados incluyen, por ejemplo, el sistema de lisado celular de Drosophila in vitro (por ejemplo, como se describe en la solicitud de patente publicada de Estados Unidos N.° 2002/0086356 de Tuschl et al.) y el sistema de RNAsa III de E. colI (por ejemplo, como se describe en la solicitud de patente publicada de Estados Unidos N.° 2004/0014113 de Yang et al.).

La selección de plásmidos adecuados para expresar los productos génicos de miR, métodos para insertar secuencias de ácido nucleico en el plásmido para expresar los productos génicos, y métodos para suministrar el plásmido recombinante a las células de interés están dentro de la experiencia de la técnica. Véase, por ejemplo, Zeng et al. (2002), Molecular Cell 9:1327-1333; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol, 20:446-448; Brummelkamp et al. (2002), Science 296:550-553; Miyagishi et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:497-500; Paddison et al. (2002), Genes Dev. 16:948-958; Lee etal. (2002), Nat. Biotechnol. 20:500-505; y Paul etal. (2002), Nat. Biotechnol. 20:505-508.

En una realización, un plásmido que expresa los productos génicos de miR comprende una secuencia que codifica un ARN precursor de miR bajo el control del promotor intermedio-temprano de CMV. Como se usa en el presente documento “bajo el control” de un promotor significa que las secuencias de ácido nucleico que codifican el producto génico de miR se localizan 3’ del promotor, de modo que el promotor puede iniciar la transcripción de las secuencias codificantes del producto génico de miR.

Los productos génicos de miR también pueden expresarse a partir de vectores virales recombinantes. Se contempla que los productos génicos de miR puedan expresarse a partir de dos vectores virales recombinantes separados, o a partir del mismo vector viral. El ARN expresado a partir de los vectores virales recombinantes puede aislarse de sistemas de expresión de células cultivadas por técnicas convencionales, o puede expresarse directamente en células cancerosas. El uso de vectores virales recombinantes para suministrar los productos génicos de miR a células cancerosas se analiza en más detalle posteriormente.

Los vectores virales recombinantes de la invención comprenden secuencias que codifican los productos génicos de

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m¡R y cualquier promotor adecuado para expresar las secuencias de ARN. Los promotores adecuados incluyen, pero sin limitación, las secuencias promotoras de ARN pol III U6 o H1, o los promotores de citomegalovirus. La selección de otros promotores adecuados está dentro de la experiencia de la técnica. Los vectores virales recombinantes de la invención también pueden comprender promotores inducibles o regulables para expresión de los productos génicos de miR en una célula cancerosa.

Puede usarse cualquier vector viral capaz de aceptar las secuencias codificantes para los productos génicos de miR; por ejemplo, vectores derivados de adenovirus (AV); virus adenoasociado (VAA); retrovirus (por ejemplo, lentivirus (LV), rabdovirus, virus de leucemia murina); virus del herpes y similares. El tropismo de los vectores virales puede modificarse por pseudotipación de los vectores con proteínas de envoltura u otros antígenos de superficie de otros virus, o sustituyendo diferentes proteínas de la cápsida viral, según sea apropiado.

Por ejemplo, los vectores lentivirales de la invención pueden pseudotipificarse con proteínas de superficie de virus de estomatitis vesicular (VEV), rabia, ébola, Mokola y similares. Puede hacerse que los vectores de VAA de la invención se dirijan a células diferentes modificando técnicamente los vectores para expresar diferentes serotipos de proteínas de la cápsida. Por ejemplo, un vector de VAA que expresa una cápsida de serotipo 2 en un genoma de serotipo 2 se denomina VAA 2/2. Este gen de la cápsida de serotipo 2 en el vector de VAA 2/2 puede reemplazarse por un gen de en la cápsida de serotipo 5 para producir un vector de VAA 2/5. Las técnicas para construir vectores de VAA que expresan diferentes serotipos de proteínas de la cápsida están dentro de la experiencia de la técnica; véase, por ejemplo, Rabinowitz, J.E., etal. (2002), J. Viral. 76:791-801.

La selección de vectores virales recombinantes adecuados para su uso en la invención, métodos para insertar secuencias de ácido nucleico para expresar ARN en el vector, métodos para suministrar el vector viral a las células de interés y recuperación de los productos de ARN expresados están dentro de la experiencia de la técnica. Véase, por ejemplo, Dornburg (1995), Gene Therapy 2:301-310; Eglitis (1988), Biotechniques 6:608-614; Miller (1990), Hum. GeneTherapy 1:5-14; y Anderson (1998), Nature 392:25-30.

Son vectores virales particularmente adecuados los derivados de AV y VAA. Un vector de AV adecuado para expresar los productos génicos de miR, un método para construir el vector de AV recombinante, y un método para suministrar el vector a células diana, se describen en Xia et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010. Se describen vectores de VAA adecuados para expresar los productos génicos de miR, métodos para construir el vector de VAA recombinante, y métodos para suministrar los vectores a células diana en Samulski et al. (1987), J. Viral. 61:3096- 3101; Fisher et al. (1996), J. Viral., 70:520-532; Samulski et al. (1989), J. Viral. 63:3822-3826; patente de Estados Unidos N.° 5.252.479; patente de Estados Unidos N.° 5.139.941; solicitud de patente internacional N.° WO 94/13788; y solicitud de patente internacional N.° WO 93/24641. En una realización, los productos génicos de miR se expresan a partir de un único vector de VAA recombinante que comprende el promotor temprano intermedio de CMV.

En una cierta realización, un vector viral de VAA recombinante de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ARN precursor de miR en conexión operativa con una secuencia de terminación poliT bajo el control de un promotor de ARN U6 humano. Como se usa en el presente documento, “en conexión operativa con una secuencia de terminación poliT” significa que las secuencias de ácido nucleico que codifican las cadenas con sentido o antisentido están inmediatamente adyacentes a la señal de terminación poliT en la dirección 5’. Durante la transcripción de las secuencias de miR del vector las señales de terminación poliT actúan para terminar la transcripción.

En otras realizaciones de los métodos de tratamiento de la invención, puede administrarse una cantidad eficaz de al menos un compuesto que inhibe la expresión de miR al sujeto. Como se usa en el presente documento, “inhibir la expresión de miR” significa que la producción de la forma precursora y/o activa, madura de producto génico de miR después del tratamiento es menor que la cantidad producida antes del tratamiento. Un experto en la materia puede determinar fácilmente si la expresión de miR se ha inhibido en una célula cancerosa, usando, por ejemplo, las técnicas para determinar el nivel de transcrito de miR analizado anteriormente para el método de diagnóstico. La inhibición puede producirse en cuanto a expresión génica, (es decir, inhibiendo la transcripción de un gen de miR que codifica el producto génico de miR) o en cuanto a procesamiento (por ejemplo, inhibiendo el procesamiento de un precursor de miR en un miR maduro, activo).

Como se usa en el presente documento, una “cantidad eficaz” de un compuesto que inhibe la expresión de miR es una cantidad suficiente para inhibir la proliferación de una célula cancerosa en un sujeto que padece un cáncer (por ejemplo, un cáncer). Un experto en la materia puede determinar fácilmente una cantidad eficaz de un compuesto de inhibición de la expresión de miR para administrar a un sujeto dado, teniendo en cuenta factores, tales como la talla y el peso del sujeto; el grado de penetración de la enfermedad; la edad, la salud y el sexo del sujeto; la vía de administración; y si la administración es regional o sistémica.

Por ejemplo, una cantidad eficaz del compuesto de inhibición de la expresión puede basarse en el peso aproximado de una masa tumoral para tratar, como se describe en el presente documento. Una cantidad eficaz de un compuesto que inhibe la expresión de miR también puede basarse en el peso corporal aproximado o estimado de un sujeto para tratar, como se describe en el presente documento.

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Un experto en la materia también puede determinar fácilmente un régimen de dosificación apropiado para administrar un compuesto que inhibe la expresión de miR a un sujeto dado.

Los compuestos adecuados para inhibir la expresión génica de miR incluyen ARN bicatenario (tal como ARN de interferencia pequeño o corto o “ARNip”), ácidos nucleicos antisentido y moléculas de ARN enzimáticas, tales como ribozimas. Cada uno de estos compuestos puede dirigirse a un producto génico de miR dado e interferir con la expresión (por ejemplo, inhibir la traducción, inducir la escisión o destrucción) del producto génico de miR diana.

Por ejemplo, la expresión de un producto génico de miR dado puede inhibirse induciendo interferencia de ARN del gen de miR con una molécula de ARN bicatenario (“ARNbc”) aislada que tiene al menos 90 %, por ejemplo, al menos 95%, al menos 98 %, al menos 99% o 100%, de homología de secuencia con al menos una parte del producto génico de miR. En una realización particular, la molécula de ARNbc es un “ARN de interferencia pequeño o corto” o “ARNip”.

El ARNip útil en los presentes métodos comprende ARN bicatenario corto de aproximadamente 17 nucleótidos a aproximadamente 29 nucleótidos de longitud, preferentemente de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. El ARNip comprende una cadena de ARN con sentido y una cadena de ARN antisentido complementaria hibridadas entre sí por interacciones de formación de pares de bases de Watson-Crick convencionales (en lo sucesivo en el presente documento “con pares de bases”). La cadena con sentido comprende una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a una secuencia de ácido nucleico contenida dentro del producto génico de miR diana.

Como se usa en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico en un ARNip que es “sustancialmente idéntica” a una secuencia diana contenida dentro del ARNm diana es una secuencia de ácido nucleico que es idéntica a la secuencia diana, o que difiere de la secuencia diana en uno o dos nucleótidos. Las cadenas con sentido y antisentido del ARNip pueden comprender dos moléculas de ARN monocatenario, complementarias, o pueden comprender una única molécula en la que dos partes complementarias han formado pares de bases y están unidas covalentemente por una única área “en horquilla” monocatenaria.

El ARNip también puede ser ARN alterado que difiere de ARN de origen natural por la adición, supresión, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como al extremo o los extremos de ARNip o a uno o más nucleótidos internos del ARNip, o modificaciones que hacen al ARNip resistente a la digestión por nucleasa, o la sustitución de uno o más nucleótidos en el ARNip con deoxirribonucleótidos.

Una o ambas cadenas del ARNip también pueden comprender un saliente 3’. Como se usa en el presente documento, un “saliente 3”’ se refiere a al menos un nucleótido no emparejado que se extiende desde el extremo 3’ de una cadena de ARN bicatenaria. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el ARNip comprende al menos un saliente 3’ de 1 a aproximadamente 6 nucleótidos (que incluye ribonucleótidos o desoxirribunucleótidos) de longitud, de 1 a aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, de 1 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud. En una realización particular, el saliente 3’ está presente en ambas cadenas del ARNip y es de 2 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada cadena del ARNip puede comprender salientes 3’ de ácido ditimidílico (“TT”) o ácido diuridílico (“uu”).

El ARNip puede producirse de forma química o biológica, o puede expresarse a partir de un plásmido o vector viral recombinante, como se ha descrito anteriormente para los productos génicos de miR aislados. Se describen métodos ejemplares para producir y ensayar moléculas de ARNbc o ARNip en la solicitud de patente publicada de Estados Unidos N.° 2002/0173478 de Gewirtz y en la solicitud de patente publicada de Estados Unidos n.° 2004/0018176 de Reich etal.

La expresión de un gen de miR dado también puede inhibirse por un ácido nucleico antisentido. Como se usa en el presente documento un “ácido nucleico antisentido” se refiere a una molécula de ácido nucleico que se une con ARN diana por medio de interacciones ARN-ARN, ARN-ADN o ARN-ácido nucleico peptídico, que altera la actividad del ARN diana. Los ácidos nucleicos antisentido adecuados para su uso en los presentes métodos son ácidos nucleicos monocatenarios (por ejemplo, ARN, ADN, quimeras de ARN-ADN, ácido nucleico peptídico (PNA)) que generalmente comprenden una secuencia de ácido nucleico complementaria de una secuencia de ácido nucleico contigua en un producto génico de miR. El ácido nucleico antisentido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es 50-100% complementaria, 75-100% complementaria, o 95-100% complementaria de una secuencia de ácido nucleico contigua en un producto génico de miR.

Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se cree que los ácidos nucleicos antisentido activan RNasa H u otra nucleasa celular que digiere el producto génico de miR/doble cadena de ácido nucleico antisentido.

Los ácidos nucleicos antisentido también pueden contener modificaciones de la cadena principal de ácido nucleico o de los restos de azúcares y bases (o sus equivalentes) para potenciar la especificidad de diana, la resistencia nucleasa, suministro u otras propiedades relacionadas con la eficacia de la molécula. Dichas modificaciones

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incluyen restos de colesterol, intercaladores de doble cadena, tales como acridina, o uno o más grupos resistentes a nucleasa.

Pueden producirse ácidos nucleicos antisentldo de forma química o biológica, o pueden expresarse a partir de un plásmido o vector viral recombinante, como se ha descrito anteriormente para los productos génicos de miR aislados. Están dentro de la experiencia de la técnica métodos ejemplares para producir y ensayar; véase, por ejemplo., Stein y Cheng (1993), Science 261:1004 y patente de Estados Unidos N.° 5.849.902 de Woolf et al.

La expresión de un gen de miR dado también puede inhibirse por un ácido nucleico enzimático. Como se usa en el presente documento, un “ácido nucleico enzimático” se refiere a un ácido nucleico que comprende una región de unión a sustrato que tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico contigua de un producto génico de miR, y que es capaz de escindir específicamente el producto génico de miR. La región de unión al sustrato de ácido nucleico enzimático puede ser, por ejemplo, 50-100% complementaria, 75-100% complementaria, o 95- 100% complementaria de una secuencia de ácido nucleico contigua en un producto génico de miR. Los ácidos nucleicos enzimáticos también pueden comprender modificaciones en los grupos de base, azúcar y/o fosfato.

Los ácidos nucleicos enzimáticos ejemplares para uso en los presentes métodos incluyen metiltransferasas de novo, incluyendo DNMT3A y DNMT3B, como se describe en los ejemplos del presente documento.

Los ácidos nucleicos enzimáticos pueden producirse deforma química o biológica, o pueden expresarse a partir de un plásmido o vector viral recombinante, como se ha descrito anteriormente para los productos génicos de miR aislados. Se describen métodos ejemplares para producir y ensayar moléculas de ARNbc o ARNip en Werner y Uhlenbeck (1995), Nucí. Acids Res. 23:2092-96; Hammann et al. (1999), Antisense y Nucleic Acid Drug Dev. 9:25- 31; y patente de Estados Unidos N.° 4.987.071 de Cech et al.

La administración de al menos un producto génico de miR, o al menos un compuesto para inhibir la expresión de miR, inhibirá la proliferación de células cancerosas en un sujeto que tiene un cáncer.

Como se usa en el presente documento, “inhibir la proliferación de una célula cancerosa” significa destruir la célula, o detener o ralentizar permanente o temporalmente el crecimiento de la célula. La inhibición de la proliferación de células cancerosas puede inferirse si el número de dichas células en el sujeto permanece constante o se reduce después de la administración de los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR. También puede inferirse una inhibición de la proliferación de células cancerosas si el número absoluto de dichas células aumenta, pero la velocidad del crecimiento tumoral se reduce.

El número de células cancerosas en el cuerpo de un sujeto puede determinarse por medición directa, o por estimación del tamaño de masas tumorales primarias o metastásicas. Por ejemplo, el número de células cancerosas en un sujeto puede medirse por métodos inmunohistológicos, citometría de flujo u otras técnicas diseñadas para detectar marcadores de superficie característicos de células cancerosas.

El tamaño de una masa tumoral puede determinarse por observación visual directa, o por métodos de captura de imágenes de diagnóstico, tales como rayos X, captura de imágenes por resonancia magnética, ultrasonidos y escintigrafía. Pueden emplearse métodos de captura de imágenes de diagnóstico usados para determinar el tamaño de la masa tumoral con o sin agentes de contraste, como se conoce en la técnica. El tamaño de una masa tumoral también puede determinarse por medios físicos, tales como palpación de la masa tisular o medición de la masa tisularcon un instrumento de medición, tal como un calibrador.

Los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR pueden administrarse a un sujeto por cualquier medio adecuado para suministrar estos compuestos a células cancerosas del sujeto. Por ejemplo, los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión de miR pueden administrarse por métodos adecuados para transfectar células del sujeto con estos compuestos, o con ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican estos compuestos.

En una realización, las células se transfectan con un plásmido o vector viral que comprende secuencias que codifican al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR.

Se conocen bien en la técnica métodos de transfección para células eucariotas, por ejemplo, inyección directa del ácido nucleico en el núcleo o pronúcleo de una célula; electroporación; transferencia de liposoma o transferencia mediada por materiales lipófilos; suministro de ácido nucleico mediado por receptor, biobalística o aceleración de partículas; precipitación de fosfato cálcico y transfección mediada por vectores virales.

Por ejemplo, las células pueden transfectarse con un compuesto de transferencia liposómico, por ejemplo, DOTAP (N-[1-(2,3- dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetil-amonio metil-sulfato, Boehringer-Mannheim) o un equivalente, tal como LIPOFECTIN. La cantidad de ácido nucleico usada no es crítica para la práctica de la invención; pueden conseguirse resultados aceptables con 0,1-100 microgramos de ácido nucleico/105 células. Por ejemplo, puede usarse una relación de aproximadamente 0,5 microgramos de vector plasmídico en 3 microgramos de DOTAP por cada 105

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células.

Un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR también puede administrarse a un sujeto por cualquier vía de administración entérica o parenteral adecuada. Las vías de administración entéricas adecuadas para los presentes métodos incluyen, por ejemplo, suministro oral, rectal o intranasal. Las vías de administración parenterales adecuadas incluyen, por ejemplo, administración intravascular (por ejemplo, inyección de embolada intravenosa, infusión intravenosa, inyección de embolada intraarterial, infusión intraarterial e instilación por catéter en la vasculatura); inyección peri- e intratisular (por ejemplo, inyección peritumoral e intratumoral, inyección intrarretiniana o inyección subretiniana); inyección o deposición subcutánea, incluyendo infusión subcutánea (tal como por bombas osmóticas); aplicación directa al tejido de interés, por ejemplo por un catéter u otro dispositivo de colocación (por ejemplo, un microgránulo retiniano o un supositorio o un implante que comprende un material poroso, no poroso o gelatinoso); e inhalación. Son vías de administración particularmente adecuadas inyección, infusión e inyección directa en el tumor.

En los presentes métodos, puede administrarse un producto génico de miR o un compuesto de inhibición de la expresión de producto génico de miR al sujeto bien como ARN desnudo, en combinación con un reactivo de suministro, o como un ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido o vector viral recombinante) que comprende secuencias que expresan el producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión de producto génico de miR. Los reactivos de suministro adecuados incluyen, por ejemplo el reactivo lipófilo Mirus Transit TKO; lipofectina; lipofectamina; celfectina; policationes (por ejemplo, polilisina), y liposomas.

Se analizan en el presente documento y/o se conocen bien en la técnica plásmidos y vectores virales recombinantes que comprenden secuencias que expresan los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR y técnicas para suministrar dichos plásmidos y vectores a células cancerosas.

En una realización particular, se usan liposomas para suministrar un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o ácidos nucleicos que comprenden secuencias que los codifican) a un sujeto. Los liposomas también pueden aumentar la semivida en sangre de los productos génicos o ácidos nucleicos. Pueden formarse liposomas adecuados para uso en la invención a partir de lípidos formadores de vesículas convencionales, que generalmente incluyen fosfolípidos neutros o con carga negativa y un esteral, tal como colesterol. La selección de lípidos generalmente se guía por consideración de factores, tales como el tamaño de liposomas deseado y la semivida de los liposomas en el torrente sanguíneo. Se conoce diversos métodos para preparar liposomas, por ejemplo, como se describe en Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467; y patentes de Estados Unidos N.° 4.235,871,4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.

Los liposomas para su uso en los presentes métodos pueden comprender una molécula ligando que dirige el liposoma a células cancerosas. Se prefieren ligandos que se unan con receptores prevalentes en células cancerosas, tales como anticuerpos monoclonales que se unan con antígenos de células tumorales.

Los liposomas para su uso en los presentes métodos también pueden modificarse para evitar la eliminación por el sistema de macrófagos mononucleares (“MMS”) y sistema reticuloendotelial (“RES”). Dichos liposomas modificados tienen restos de inhibición de la opsonización en la superficie o incorporados en la estructura liposómica. En una realización particularmente preferida, un liposoma de la invención puede comprender tanto un resto de inhibición de la opsonización como un ligando.

Los restos inhibidores de la opsonización para su uso en la preparación de los liposomas de la invención son normalmente polímeros hidrófilos grandes que se unen con la membrana liposómica. Como se usa en el presente documento, un resto de inhibición de la opsonización está “unido” a una membrana liposómica cuando se une química o físicamente a la membrana, por ejemplo, por la intercalación de un anclaje soluble en lípidos en la membrana en sí misma, o mediante unión directamente con grupos activos de lípidos de membrana. Estos polímeros hidrófilos inhibidores de la opsonización forman una capa superficial protectora que reduce significativamente la captación de los liposomas por los MMS y RES; por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 4.920.016.

Los restos inhibidores de la opsonización adecuados para modificar liposomas son preferentemente polímeros solubles en agua con un peso molecular promedio en número de aproximadamente 500 a aproximadamente 40.000 dalton, y más preferentemente de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 20.000 dalton. Dichos polímeros incluyen derivados de polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol (PPG); por ejemplo, metoxi PEG o PPG, y estearato de PEG o PPG; polímeros sintéticos, tales como poliacrilamida o poli N-vinil pirrolidona; poliamidoaminas lineales, ramificadas o dendriméricas; ácidos poliacrílicos; polialcoholes, por ejemplo, polivinilalcohol y polixilitol con los que se unen químicamente grupos carboxílicos o amino, así como gangliósidos, tales como gangliósido GM1. También son adecuados copolímeros de PEG, metoxi PEG, o metoxi PPG, o derivados de los mismos. Además, el polímero inhibidor de la opsonización puede ser un copolímero en bloque de PEG y un poliaminoácido, polisacárido, poliamidoamina, polietilenamina o polinucleótido. Los polímeros inhibidores de la opsonización también pueden ser polisacáridos naturales que contienen aminoácidos o ácidos carboxílicos, por ejemplo, ácido galacturónico, ácido glucurónico, ácido manurónico, ácido hialurónico, ácido péptico, ácido neuramínico, ácido algínico, carragenina;

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polisacáridos u oligosacáridos aminados (lineales o ramificados); o polisacáridos u oligosacáridos carboxilados, por ejemplo, que han reaccionado con derivados de ácidos carbónicos con unión resultante de grupos carboxílicos. Preferentemente, el resto inhibidor de la opsonización es un PEG, PPG o un derivado de los mismos. Los liposomas modificados con PEG o derivados de PEG se denominan en ocasiones "liposomas PEGilados”.

El resto de inhibición de la opsonización puede unirse con la membrana liposómica por una cualquiera de numerosas técnicas bien conocidas. Por ejemplo, un N-hidroxi-succinimida áster de PEG puede unirse con un anclaje soluble en lípidos de fosfatidiletanolamina y después unirse con una membrana. De forma similar, un polímero de dextrano puede derivatizarse con un anclaje soluble en lípidos de estearilamina mediante aminación reductora usando Na(CN)BH3 y una mezcla disolvente, tal como tetrahidrofurano y agua en una relación 30:12 a 60 °C.

Los liposomas modificados con restos inhibidores de la opsonización permanecen en circulación mucho más tiempo que los liposomas no modificados. Por esta razón, dichos liposomas se denominan en ocasiones liposomas “sigilosos”. Se sabe que los liposomas sigilosos se acumulan en tejidos alimentados por microvasculatura porosa o “filtrante”. Por lo tanto, el tejido caracterizado por dichos defectos de microvasculatura, por ejemplo, tumores, acumulará eficazmente estos liposomas; véase Gabizon, et al. (1988), Proc. Nati. Acad. Sci., U.S.A., 18:6949-53. Además, la captación reducida por el RES reduce la toxicidad de liposomas sigilosos evitando la acumulación significativa de los liposomas en el hígado y el bazo. Por tanto, los liposomas que se modifican con restos de inhibición de la opsonización son particularmente adecuados para suministrar los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR (o ácidos nucleicos que comprenden secuencias que los codifican) a células tumorales.

Los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR pueden formularse como composiciones farmacéuticas, denominadas en ocasiones “medicamentos”, antes de administrarlos a un sujeto, de acuerdo con técnicas conocidas en este campo. En consecuencia, la invención abarca composiciones farmacéuticas para tratar un cáncer.

En una realización, la composición farmacéutica comprende al menos un producto génico de miR aislado o una variante aislada o fragmento biológicamente activo del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, el al menos un producto génico de miR corresponde a un producto génico de miR que tiene un nivel de expresión reducido en células cancerosas en relación con células de control adecuadas.

En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden al menos un compuesto de inhibición de la expresión de miR. En una realización particular, el al menos un compuesto de inhibición de la expresión génica de miR es específico para un gen de miR cuya expresión es mayor en células cancerosas que en células de control.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se caracterizan como al menos estériles y sin pirógenos. Como se usa en el presente documento, las “composiciones farmacéuticas” incluyen formulaciones para uso humano y veterinario. Los métodos para preparar composiciones farmacéuticas de la invención están dentro de la experiencia de la técnica, por ejemplo como se describe en Remington’s Pharmaceutical Science, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985).

Las presentes composiciones farmacéuticas comprenden al menos un producto génico de miR o un compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) (por ejemplo, 0,1 al 90 % en peso), o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, mezclado con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden adicionalmente uno o más agentes antineoplásicos (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos). Las formulaciones farmacéuticas de la invención también pueden comprender al menos un producto génico de miR o un compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) que están encapsulados por liposomas y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica comprende un gen o producto génico de miR que es uno o más de miR29a, miR-29b y miR-29c.

Son vehículos farmacéuticamente aceptables especialmente adecuados agua, agua tamponada, solución salina normal, solución salina al 0,4 %, glicina al 0,3 %, ácido hialurónico y similares.

En una realización particular, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) que es resistente a la degradación por nucleasas.

Un experto en la materia puede sintetizar fácilmente ácidos nucleicos que son resistentes a nucleasa, por ejemplo, incorporando uno o más ribonucleótidos que se modifican en la posición 2’ al producto génico de miR. Los ribonucleótidos modificados 2’ adecuados incluyen los modificados en la posición 2’ con fluoro, amino, alquilo, alcoxi y O-alilo.

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Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden comprender excipientes y/o aditivos farmacéuticos convencionales. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen estabilizadores, antioxidantes, agentes de ajuste de la osmolalidad, tampones y agentes de ajuste del pH. Los aditivos adecuados incluyen, por ejemplo, tampones fisiológicamente biocompatibles (por ejemplo, clorhidrato de trometamina), adiciones de quelantes (tales como, por ejemplo, DTPA O DTPA-bisamida) o complejos de quelados de calcio (tales como, por ejemplo, DTPA cálcico, CaNaDTPA-bisamida) u, opcionalmente, adiciones de sales de calcio o sodio (por ejemplo, cloruro cálcico, ascorbato cálcico, gluconato cálcico o lactato cálcico). Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden envasarse para su uso en forma líquida, o pueden liofilizarse.

Para composiciones farmacéuticas sólidas de la invención, pueden usarse vehículos farmacéuticamente aceptables sólidos no tóxicos convencionales; por ejemplo, usos farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.

Por ejemplo, una composición farmacéutica sólida para administración oral puede comprender cualquiera de los vehículos y excipientes enumerados anteriormente y 10-95%, preferentemente 25%-75%, del al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de m¡R (o a menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican). Una composición farmacéutica para administración de aerosol (por inhalación) puede comprender 0,01-20% en peso, preferentemente 1%- 10% en peso, del al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) encapsulado en un liposoma como se ha descrito anteriormente, y un propulsor. También puede incluirse un vehículo según se desee; por ejemplo, lecitina para suministro intranasal.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender además uno o más agentes antineoplásicos. En una realización particular, las composiciones comprenden al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) y al menos un agente quimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos que son adecuados para los métodos de la invención incluyen, pero sin limitación, agentes alquilantes de ADN, agentes antibióticos antitumorales, agentes anti metabólicos, agentes estabilizantes de tubulina, agentes desestabilizantes de tubulina, agentes antagonistas de hormonas, inhibidores de la topoisomerasa, inhibidores de proteína quinasa, inhibidores de HMG-CoA, inhibidores de CDK, inhibidores de ciclina, inhibidores de caspasa, inhibidores de metaloproteinasa, ácidos nucleicos antisentido, ADN de triple hélice, aptámeros de ácidos nucleicos y agentes virales, bacterianos y exotóxicos modificados molecularmente. Los ejemplos de agentes adecuados para las composiciones de la presente invención incluyen, pero sin limitación, arabinósido de citidina, metotrexato, vincristina, etopósido (VP-16), doxorrubicina (adriamicina), cisplatino (CDDP), dexametasona, arglabina, ciclofosfamida, sarcolisina, metilnitrosourea, fluorouracilo, 5-fluorouracilo (5FU), vinblastina, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, peróxido de hidrógeno, oxaliplatino, irinotecán, topotecán, leucovorina, carmustina, estreptozocina, CPT-11), taxol, tamoxifeno, dacarbacina, rituximab, daunorrubicina, 1-p-D-arabinofuranosilcitosina, imatinib, fludarabina, docetaxel, FOLFOX4.

Inhibidores de la tumorogénesis

También se proporcionan en el presente documento métodos para identificar un inhibidor de tumorogénesis, que comprenden proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR en la célula. En una realización, el método comprende proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR asociado a los niveles de expresión reducidos en células cancerosas. Un aumento en el nivel del producto génico de miR en la célula después de proporcionarse el agente, en relación con una célula de control adecuada (por ejemplo, no se proporciona agente), es indicativo de que el agente de ensayo es un inhibidor de la tumorogénesis.

En otras realizaciones, el método comprende proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR asociado a niveles de expresión aumentados en células cancerosas. Una reducción en el nivel del producto génico de miR en la célula después de proporcionarse el agente, en relación con una célula de control adecuada (por ejemplo, no se proporciona agente), es indicativa de que el agente de ensayo es un inhibidor de la tumorogénesis. En una realización particular, al menos un producto génico de miR asociado a niveles de expresión aumentados en células cancerosas se selecciona del grupo que consiste en miR29a, miR-29b, miR-29c, y combinaciones de los mismos.

Los agentes adecuados incluyen, pero sin limitación, fármacos (por ejemplo, moléculas pequeñas, péptidos), y macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos). El agente puede producirse de forma recombinante, sintética o puede aislarse (es decir, purificarse) a partir de una fuente natural. Se conocen bien en la técnica diversos métodos para proporcionar dichos agentes a una célula (por ejemplo, transfección), y varios de dichos métodos se han descrito anteriormente en el presente documento. También se conocen bien en la técnica métodos para detectar la expresión de al menos un producto génico de miR (por ejemplo, transferencia de Northern, hibridación in situ, RT-PCR, realización de perfiles de expresión). Varios de estos métodos también se han descrito

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anteriormente en el presente documento.

EJEMPLO IV

Métodos, reactivos y kits para diagnóstico, estadificación, pronóstico, supervisión y tratamiento de enfermedades relacionadas con cáncer

Debe entenderse que todos los ejemplos en el presente documento deben considerarse no limitantes en su alcance. Se describen diversos aspectos en más detalle en las siguientes subsecciones.

Métodos de diagnóstico

En una realización, se proporciona un método de diagnóstico para evaluar si un paciente tiene una enfermedad relacionada con cáncer o tiene un riesgo mayor de lo normal para desarrollar una enfermedad relacionada con cáncer, que comprende las etapas de comparar el nivel de expresión de un marcador en una muestra de paciente y el nivel normal de expresión del marcador en un control, por ejemplo, una muestra de un paciente sin una enfermedad relacionada con cáncer.

Un nivel de expresión significativamente mayor del marcador en la muestra del paciente en comparación con el nivel normal es un indicio de que el paciente está aquejado de una enfermedad relacionada con cáncer o tiene un riesgo mayor de lo normal de desarrollar una enfermedad relacionada con cáncer.

Los marcadores se seleccionan de modo que el valor predictivo positivo de los métodos sea al menos aproximadamente 10 %, y en ciertas realizaciones no limitantes, aproximadamente 25 %, aproximadamente 50 % o aproximadamente 90%. También se prefieren para su uso en los métodos marcadores que se expresan diferencialmente, en comparación con células normales, al menos el doble en al menos aproximadamente el 20 %, y en ciertas realizaciones no limitantes, aproximadamente el 50 % o aproximadamente el 75 %.

En un método de diagnóstico para evaluar si un paciente está aquejado de una enfermedad relacionada con cáncer (por ejemplo, nueva detección (“cribado”), detección de reaparición, ensayo de reflejos), el método comprende comparar: a) el nivel de expresión de un marcador en una muestra de paciente, y b) el nivel normal de expresión del marcador en una muestra de enfermedad no relacionada con cáncer de control. Un nivel de expresión significativamente mayor del marcador en la muestra de paciente en comparación con el nivel normal es un indicio de que el paciente está aquejado de una enfermedad relacionada con cáncer.

También se proporcionan métodos de diagnóstico para evaluar la eficacia de una terapia para inhibir una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente. Dichos métodos comprenden comparar: a) la expresión de un marcador en una primera muestra obtenida del paciente antes de proporcionar al menos una parte de la terapia al paciente, y b) expresión del marcador en una segunda muestra obtenida del paciente después de proporcionar la parte de la terapia. Un nivel significativamente menor de expresión del marcador en la segunda muestra en relación con la de la primera muestra es un indicio de que la terapia es eficaz para inhibir una enfermedad relacionada con cáncer en el paciente.

Se apreciará que en estos métodos la “terapia” puede ser cualquier terapia para tratar una enfermedad relacionada con cáncer incluyendo, pero sin limitación, composiciones farmacéuticas, terapia génica y terapia biológica tal como la administración de anticuerpos y quimiocinas. Por lo tanto, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para evaluar un paciente antes, durante y después de la terapia, por ejemplo, para evaluar la reducción en la patología.

En ciertos aspectos, los métodos de diagnóstico se dirigen a terapia usando un agente químico o biológico. Estos métodos comprenden comparar: a) la expresión de un marcador en una primera muestra obtenida del paciente y mantenida en presencia del agente químico o biológico, y b) expresión del marcador en una segunda muestra obtenida del paciente y mantenida en ausencia del agente. Un nivel significativamente menor de expresión del marcador en la segunda muestra en relación con la de la primera muestra es un indicio de que el agente es eficaz para inhibir una enfermedad relacionada con cáncer en el paciente. En una realización, las primera y segunda muestras pueden ser partes de una única muestra obtenida del paciente o partes de muestras agrupadas obtenidas del paciente.

Métodos para evaluar el pronóstico

También se proporciona un método de supervisión para evaluar la progresión de una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente, comprendiendo el método: a) detectar en una muestra de paciente en un primer punto temporal, la expresión de un marcador; b) repetir la etapa a) en un punto temporal posterior en el tiempo; y c) comparar el nivel de expresión detectado en las etapas a) y b), y a partir del mismo supervisar la progresión de una enfermedad relacionada con cáncer en el paciente. Un nivel significativamente mayor de expresión del marcador en la muestra en el punto temporal posterior en comparación con el de la muestra en el primer punto temporal es un

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indicio de que la enfermedad relacionada con cáncer ha progresado, mientras que un nivel significativamente menor de expresión es un indicio de que la enfermedad relacionada con cáncer ha retrocedido.

Se proporciona además un método de diagnóstico para determinar si una enfermedad relacionada con cáncer ha empeorado o es probable que empeore en el futuro, comprendiendo el método comparar: a) el nivel de expresión de un marcador en una muestra de paciente, y b) el nivel normal de expresión del marcador en una muestra de control. Un nivel significativamente mayor de expresión en la muestra de paciente en comparación con el nivel normal es un indicio de que la enfermedad relacionada con cáncer ha empeorado o es probable que empeore en el futuro.

Métodos para evaluar composiciones inhibidoras, terapéuticas y/o perjudiciales

También se proporciona un método de ensayo para seleccionar una composición para inhibir una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente. Este método comprende las etapas de: a) obtener una muestra que comprende células del paciente; b) mantener por separado alícuotas de la muestra en presencia de una pluralidad de composiciones de ensayo; c) comparar la expresión de un marcador en cada una de las alícuotas; y d) seleccionar una de las composiciones de ensayo que reduce significativamente el nivel de expresión del marcador en la alícuota que contiene esa composición de ensayo, en relación con los niveles de expresión del marcador en presencia de las otras composiciones de ensayo.

Se proporciona adlclonalmente un método de ensayo para evaluar el potencial perjudicial de un compuesto para provocar una enfermedad relacionada con cáncer. Este método comprende las etapas de: a) mantener alícuotas separadas de células en presencia y ausencia del compuesto; y b) comparar la expresión de un marcador en cada una de las alícuotas. Un nivel significativamente mayor de expresión del marcador en la alícuota mantenida en presencia del compuesto, en relación con el de la alícuota mantenida en ausencia del compuesto, es un indicio de que el compuesto posee dicho potencial perjudicial.

Además, se proporciona adicionalmente un método para inhibir una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente. Este método comprende las etapas de: a) obtener una muestra que comprende células del paciente; b) mantener por separado alícuotas de la muestra en presencia de una pluralidad de composiciones; c) comparar la expresión de un marcador en cada una de las alícuotas; y d) administrar al paciente al menos una de las composiciones que reducen significativamente el nivel de expresión del marcador en la alícuota que contiene esa composición, en relación con los niveles de expresión del marcador en presencia de las otras composiciones.

El nivel de expresión de un marcador en una muestra puede evaluarse, por ejemplo, detectando la presencia en la muestra de: la proteína marcadora correspondiente o un fragmento de la proteína (por ejemplo usando un reactivo, tal como un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo monocatenario, que se une específicamente con la proteína o el fragmento de proteína), el ácido nucleico marcador correspondiente (por ejemplo, un transcrito de nucleótido, o un complemento del mismo), o un fragmento del ácido nucleico (por ejemplo poniendo en contacto polinucleótidos transcritos obtenidos de la muestra con un sustrato que tiene fijado en el mismo uno o más ácidos nucleicos que tienen la secuencia de ácido nucleico completa o un segmento de ella o un complemento de la misma), un metabolito que se produce directamente (es decir, se cataliza) o indirectamente por la proteína marcadora correspondiente.

Cualquiera de los métodos anteriormente mencionados puede realizarse usando al menos uno o una pluralidad (por ejemplo, 2, 3, 5 o 10 o más) de marcadores de enfermedad relacionada con cáncer. En dichos métodos, el nivel de expresión en la muestra de cada uno de una pluralidad de marcadores, al menos uno de los cuales es un marcador, se compara con el nivel normal de expresión de cada uno de la pluralidad de marcadores en muestras del mismo tipo obtenido de seres humanos de control no aquejados de una enfermedad relacionada con cáncer. Un nivel significativamente alterado (es decir, aumentado o reducido como se ha especificado en los métodos anteriormente descritos usando un único marcador) de expresión en la muestra de uno o más marcadores, o alguna combinación de los mismos, en relación con el nivel normal o de control correspondiente de ese marcador, es un indicio de que el paciente está aquejado de una enfermedad relacionada con cáncer. Para todos los métodos anteriormente mencionados, el marcador o los marcadores se seleccionan de modo que el valor predictivo positivo del método sea al menos aproximadamente 10 %.

Ejemplos de agentes candidatos

Los agentes candidatos pueden ser agentes farmacológicos ya conocidos en la técnica o pueden ser agentes que previamente se desconocía que tuvieran ninguna actividad farmacológica. Los agentes pueden ser de origen natural o diseñarse en el laboratorio. Pueden aislarse a partir de microorganismos, animales o plantas, o pueden producirse de forma recombinante, o sintetizarse por cualquier método químico adecuado. Pueden ser moléculas pequeñas, ácidos nucleicos, proteínas, péptidos o peptidomiméticos. En ciertas realizaciones, los agentes candidatos son compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular de más de 50 y menos de aproximadamente 2.500 dalton. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para interacción estructural con proteínas. Los agentes candidatos también se encuentran entres biomoléculas incluyendo, pero sin limitación: péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o

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combinaciones de los mismos.

Se obtienen agentes candidatos de una amplia diversidad de fuentes incluyendo bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Existen, por ejemplo, numerosos medios disponibles para síntesis aleatoria y dirigida de una amplia diversidad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos seleccionados aleatoriamente. Como alternativa, están disponibles o se producen fácilmente bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales. Adicionalmente, se modifican fácilmente bibliotecas y compuestos naturales o producidos de forma sintética mediante medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y pueden usarse para producir bibliotecas combinatorias. En ciertas realizaciones, los agentes candidatos pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos enfoques en la técnica de métodos de bibliotecas combinatorias, incluyendo, como ejemplo no limitante: bibliotecas biológicas; bibliotecas de fase sólida o fase en solución paralelas espacialmente direccionables; métodos de bibliotecas sintéticas que requiere desconvolución; el método de biblioteca de “una perla un compuesto”; y métodos de bibliotecas sintéticas usando secuencias de cromatografía de afinidad.

En ciertas realizaciones adicionales, ciertos agentes farmacológicos pueden someterse a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc. para producir análogos estructurales.

Los mismos métodos para identificar agentes terapéuticos para tratar una enfermedad relacionada con cáncer también pueden usarse para validar compuestos/agentes candidatos generados a partir de estudios in vitro.

El agente candidato puede ser un agente que regule positiva o negativamente una o más rutas de respuesta a enfermedad relacionada con cáncer. En ciertas realizaciones, el agente candidato puede ser un antagonista que afecte a dicha ruta.

Métodos para tratar una enfermedad relacionada con cáncer

Se proporcionan en el presente documento métodos para tratar, inhibir, aliviar o invertir una respuesta de enfermedad relacionada con cáncer. En los métodos descritos en el presente documento, un agente que interfiere con una cascada de señalización se administra a un individuo que lo necesite, tal como, pero sin limitación, pacientes con enfermedad relacionada con cáncer en los que dichas complicaciones no son aún evidentes y los que ya tienen al menos una respuesta de enfermedad relacionada con cáncer.

En el primer caso, dicho tratamiento es útil para evitar la aparición de dicha respuesta de enfermedad relacionada con cáncer y/o reducir el grado en el que se produce. En este último caso, dicho tratamiento es útil para reducir el grado en que se produce dicha respuesta de enfermedad relacionada con cáncer, evitar su desarrollo posterior o invertir la respuesta de enfermedad relacionada con cáncer.

En ciertas realizaciones, el agente que interfiere con la cascada de respuesta de enfermedad relacionada con cáncer puede ser un anticuerpo específico para dicha respuesta.

Expresión de marcadores

La expresión de un marcador puede inhibirse de varias maneras, incluyendo, como ejemplo no limitante, un oligonucleótido antisentido puede proporcionarse a las células con enfermedad relacionada con cáncer para inhibir la transcripción, traducción, o ambos, del marcador o los marcadores. Como alternativa, un polinucleótido que codifica un anticuerpo, un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une específicamente con una proteína marcadora, y unido operativamente con una región promotora/reguladora apropiada, puede proporcionarse a la célula para generar anticuerpos intracelulares que inhibirán la función o la actividad de la proteína. La expresión y/o función de un marcador también puede inhibirse tratando la célula con enfermedad relacionada con cáncer con un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente con una proteína marcadora. Usando los métodos descritos en el presente documento, puede explorarse diversas moléculas, particularmente incluyendo moléculas suficientemente pequeñas para que puedan cruzar la membrana celular, para identificar moléculas que inhiban la expresión de un marcador o inhiban la función de una proteína marcadora. El compuesto identificado de este modo puede proporcionarse al paciente para inhibir células con enfermedad relacionadas con cáncer del paciente.

Puede usarse cualquier marcador o combinación de marcadores, así como cualquiera de ciertos marcadores en combinación con los marcadores, en las composiciones, kits y métodos descritos en el presente documento. En general, es deseable usar marcadores para los que la diferencia entre el nivel de expresión del marcador en células con enfermedad relacionada con cáncer y el nivel de expresión del mismo marcador de células normales sea tan grande como sea posible. Aunque esta diferencia puede ser tan pequeña como el límite de detección del método para evaluar la expresión del marcador, es deseable que la diferencia sea al menos mayor que el error típico del método de evaluación y, en ciertas realizaciones, una diferencia de al menos 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 15-, 20-, 100-, 500-, 1000 veces o más con respecto al nivel de expresión del mismo marcador en tejido normal.

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Se reconoce que ciertas proteínas marcadoras se secretan al espacio extracelular que rodea a las células. Estos marcadores se usan en ciertas realizaciones de las composiciones, los kits y los métodos, debido al hecho de que dichas proteínas marcadoras pueden detectarse en una muestra de fluido corporal asociada a cáncer, que puede recogerse más fácilmente de un paciente humano que una muestra de biopsia tisular. Además, las técnicas in vivo para detección de una proteína marcadora incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo marcado dirigido contra la proteína. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y localización en un sujeto puede detectarse por técnicas de captura de imágenes convencionales.

Para determinar si cualquier proteína marcadora particular es una proteína secretada, la proteína marcadora se expresa, por ejemplo, en una célula de mamífero, tal como una línea celular humana, se recoge fluido extracelular, y se evalúa la presencia o ausencia de la proteína en el fluido extracelular (por ejemplo usando un anticuerpo marcado que se une específicamente con la proteína).

Se apreciará que pueden usarse muestras de paciente que contienen tejido y/o células en fluido en los métodos descritos en el presente documento. En estas realizaciones, el nivel de expresión del marcador puede evaluarse evaluando la cantidad (por ejemplo, cantidad absoluta o concentración) del marcador en una muestra. La muestra celular puede, por supuesto, someterse a diversas técnicas preparatorias y de almacenamiento después de la recogida (por ejemplo, extracción de ácido nucleico y/o proteína, fijación, almacenamiento, congelación, ultrafiltración, concentración, evaporación, centrifugación, etc.) antes de evaluar la cantidad del marcador en la muestra.

También se apreciará que los marcadores pueden desprenderse de las células en el sistema digestivo, el torrente sanguíneo y/o espacios intersticiales. Los marcadores desprendidos pueden ensayarse, por ejemplo, examinando el suero o el plasma.

Las composiciones, los kits y los métodos pueden usarse para detectar la expresión de proteínas marcadoras que tienen al menos una parte que se presenta en la superficie de células que la expresan. Por ejemplo, pueden usarse métodos inmunológicos para detectar dichas proteínas en células completas, o pueden usarse métodos de análisis de secuencia basados en ordenador para predecir la presencia de al menos un dominio extracelular (es decir, incluyendo tanto proteínas secretadas como proteínas que tienen al menos un dominio de superficie celular). La expresión de una proteína marcadora que tiene al menos una parte que se presenta en la superficie de una célula que la expresa puede detectarse sin Usar necesariamente la célula (por ejemplo, usando un anticuerpo marcado que se une específicamente con un domino de superficie celular de la proteína).

La expresión de un marcador puede evaluarse por cualquiera de una amplia diversidad de métodos para detectar la expresión de un ácido nucleico o una proteína transcritos. Los ejemplos no limitantes de dichos métodos incluyen métodos inmunológicos para la detección de proteínas secretadas, de superficie celular, citoplasmáticas o nucleares, métodos de purificación de proteínas, ensayos de la función o actividad proteica, métodos de hibridación de ácido nucleico, métodos de transcripción inversa de ácido nucleico y métodos de amplificación de ácido nucleico.

En una realización particular, la expresión de un marcador se evalúa usando un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo radiomarcado, marcado con cromóforos, marcado con fluoróforos o marcado con enzimas), un derivado de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo conjugado con un sustrato o con la proteína o el ligando de un par de proteína-ligando), o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monocatenario, un dominio hipervariable de anticuerpo aislado, etc.) que se une específicamente con una proteína marcadora o fragmento de la misma, Incluyendo una proteína marcadora que ha experimentado toda o una parte de su modificación postraduccional normal.

En otra realización particular, la expresión de un marcador se evalúa preparando ARNm/ADNc (es decir, un polinucleótido transcrito) a partir de células en una muestra de paciente e hibridando el ARNm/ADNc con un polinucleótido de referencia que es un complemento de un ácido nucleico marcador, o un fragmento del mismo. Puede amplificarse ADNc, opcionalmente, usando cualquiera de diversos métodos de reacción en cadena de la polimerasa antes de hibridación con el polinucleótido de referencia; preferentemente, no se amplifica. La expresión de uno o más marcadores puede detectarse de forma similar usando PCR cuantitativa para evaluar el nivel de expresión del marcador o los marcadores. Como alternativa, puede usarse cualquiera de los muchos métodos para detectar mutaciones o variantes (por ejemplo, polimorfismos de un único nucleótido, deleciones, etc.) de un marcador para detectar la aparición de un marcador en un paciente.

En una realización relacionada, se pone en contacto una mezcla de los polinucleótidos transcritos obtenidos de la muestra con un sustrato que tiene fijado al mismo un polinucleótido complementario de u homólogo de al menos una parte (por ejemplo, al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 500, o más restos de nucleótidos) de un ácido nucleico marcador. Si los polinucleótidos complementarios u homólogos son detectables diferencialmente en el sustrato (por ejemplo, detectables usando diferentes cromóforos o fluoróforos, o fijados en diferentes posiciones seleccionadas), entonces los niveles de expresión de una probabilidad de marcadores pueden evaluarse simultáneamente usando un único sustrato (por ejemplo, una micromatriz de “microplaca génica” de polinucleótidos fijados en posiciones seleccionadas). Cuando se usa un método para evaluar la expresión de marcadores que

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implica hibridación de un ácido nucleico con otro, se desea que la hibridación se realice en condiciones de hibridación rigurosas.

Ensayos de biomarcadores

En ciertas realizaciones, los ensayos de biomarcadores pueden realizarse usando espectrometría de masas o resonancia de plasmón superficial. En diversas realizaciones, el método para identificar un agente activo contra una enfermedad relacionada con cáncer 1 puede incluir a) proporcionar una muestra de células que contienen uno o más marcadores o derivados de los mismos; b) preparar un extracto de dichas células; c) mezclar dicho extracto con una sonda de ácido nucleico marcada que contiene un sitio de unión a marcadores; y d) determinar la formación de un complejo entre el marcador y la sonda de ácido nucleico en presencia o ausencia del agente de ensayo. La etapa de determinación puede incluir someter dicha mezcla de extracto/sonda de ácido nucleico a un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforético.

En ciertas realizaciones, la etapa de determinación comprende un ensayo seleccionado de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayos basados en fluorescencia y ensayos de rendimiento ultraalto, por ejemplo resonancia de plasmón superficial (SPR) o ensayos de espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS). En dichas realizaciones, el sensor de SPR es útil para observación en tiempo real directa de interacciones biomoleculares ya que SPR es sensible a cambios en el índice refractario mínimos en una superficie dieléctrica metálica. SPR es una técnica superficial que es sensible a cambios de unidades del índice refractario (IR) de 105 a 10-6 dentro de aproximadamente 200 nm de la interfaz de sensor/muestra de SPR. Por lo tanto, la espectroscopia de SPR es útil para supervisar el crecimiento de películas orgánicas finas depositadas en la capa sensora.

Debido a que las composiciones, los kits y los métodos se basan en la detección de una diferencia en los niveles de expresión de uno o más marcadores, se desea que el nivel de expresión de marcador sea significativamente mayor que el límite de detección mínimo del método usado para evaluar la expresión en al menos una de células normales y células aquejadas de cáncer.

Se entiende que por cribado rutinario de muestras de pacientes adicionales usando uno o más de los marcadores, se determinará que algunos de los marcadores se sobreexpresan en células de diversos tipos, incluyendo enfermedades relacionadas con cáncer específicas.

Además, a medida que se evalúa un mayor número de muestras de pacientes con respecto a la expresión de los marcadores y los resultados de los pacientes individuales de los que se obtuvieron las muestras se correlacionan, también se confirmará que la expresión alterada de algunos de los marcadores está correlacionada fuertemente con una enfermedad relacionada con cáncer y que la expresión alterada de otros marcadores está correlacionada fuertemente con otras enfermedades. Las composiciones, los kits y los métodos son por lo tanto útiles para caracterizar uno o más del estadio, grado, tipo histológico y naturaleza de una enfermedad relacionada con cáncer en pacientes.

Cuando las composiciones, los kits y los métodos se usan para caracterizar uno o más del estadio, el grado, el tipo histológico, y la naturaleza de una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente, se desea que el marcador o panel de marcadores se seleccione de modo que se obtenga un resultado positivo en al menos aproximadamente el 20 %, y en ciertas realizaciones, al menos aproximadamente el 40 %, 60 % u 80 %, y en sustancialmente todos los pacientes aquejados de una enfermedad relacionada con cáncer del estadio, grado, tipo histológico o naturaleza correspondientes. El marcador o el panel de marcadores de la invención pueden seleccionarse de modo que se obtenga un valor predictivo positivo de más de aproximadamente el 10 % para la población general (en un ejemplo no limitante, acompañado de una especificidad de ensayo mayor del 80 %).

Cuando se usa una pluralidad de marcadores en las composiciones, los kits y métodos, el nivel de expresión de cada marcador en una muestra de paciente puede compararse con el nivel normal de expresión de cada uno de la pluralidad de marcadores en muestras no cancerosas del mismos tipo, bien en una única mezcla de reacción (es decir usando reactivos, tales como sondas fluorescentes diferentes, para cada marcador) o en mezclas de reacción individuales correspondientes a uno o más de los marcadores. En una realización, un nivel significativamente aumentado de expresión de más de uno de la pluralidad de marcadores en la muestra, en relación con los niveles normales correspondientes, es un indicio de que está aquejado de una enfermedad relacionada con cáncer. Cuando se usa una pluralidad de marcadores, pueden usarse 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 15, 20, 30 o 50 o más marcadores individuales; en ciertas realizaciones, puede desearse el uso de menos marcadores.

Para maximizar la sensibilidad de las composiciones, los kits y métodos (es decir por interferencia atribuible a células de origen no tisular y/o fluido en una muestra de paciente), es deseable que el marcador usado en los mismos sea un marcador que tenga una distribución tisular restringida, por ejemplo, normalmente no expresado en una célula no tisular.

Se reconoce que las composiciones, los kits y los métodos serán particularmente útiles para pacientes que tengan un riesgo potenciado de desarrollar una enfermedad relacionada con cáncer y sus asesores médicos. Los pacientes

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que se ha reconocido que tienen un riesgo potenciado de desarrollar una enfermedad relacionada con cáncer incluyen, por ejemplo, pacientes que tienen un historial familiar de una enfermedad relacionada con cáncer.

El nivel de expresión de un marcador en células humanas normales puede evaluarse de diversas formas. En una realización, este nivel normal de expresión se evalúa evaluando el nivel de expresión del marcador en una parte de las células que parecen ser normales y comparando este nivel normal de expresión con el nivel de expresión en una parte de las células que se sospecha que son anómalas. Como alternativa, y particularmente a medida que esté disponible más información como resultado de la realización rutinaria de los métodos descritos en el presente documento, pueden usarse valores de población promedios para expresión normal de los marcadores. En otras realizaciones, el nivel “normal” de la expresión de un marcador puede determinarse evaluando la expresión del marcador en una muestra de pacientes obtenida de un paciente no aquejado de cáncer, de una muestra de paciente obtenida de un paciente antes de la aparición sospechada de una enfermedad relacionada con cáncer en el paciente, de muestras de paciente archivadas, y similares.

También se proporcionan en el presente documento composiciones, kits y métodos para evaluar la presencia de células con enfermedad relacionada con cáncer en una muestra (por ejemplo una muestra tisular archivada o una muestra obtenida de un paciente). Estas composiciones, kits y métodos son sustancialmente iguales que los descritos anteriormente, excepto que, cuando sea necesario, las composiciones, los kits y métodos se adaptan para su uso con muestras distintas de las muestras de pacientes. Por ejemplo, cuando la muestra para usar es una muestra tisular humana archivada, parafinizada, puede ser necesario ajustar la relación de compuestos en las composiciones, en los kits o los métodos usados para evaluar los niveles de expresión de marcadores en la muestra.

Métodos para producir anticuerpos

También se proporciona en el presente documento un método para preparar un hibridoma aislado que produce un anticuerpo útil para evaluar si un paciente está aquejado de una enfermedad relacionada con cáncer. En este método, se sintetiza o aísla una proteína o un péptido que comprende la totalidad o un segmento de una proteína marcadora (por ejemplo por purificación a partir de una célula en la que se expresa o por transcripción y traducción de un ácido nucleico que codifica la proteína o el péptido in vivo o in vitro). Se inmuniza un vertebrado, por ejemplo, un mamífero tal como un ratón, una rata, un conejo o una oveja, usando la proteína o el péptido. El vertebrado puede opcionalmente (y preferentemente) inmunizarse al menos una vez más con la proteína o el péptido, de modo que el vertebrado muestre una respuesta inmunitaria robusta a la proteína o el péptido. Se aíslan esplenocitos del vertebrado inmunizado y se fusionan con una línea celular inmortalizada para formar hibridomas, usando cualquiera de diversos métodos. Después se exploran hibridomas formados de esta manera usando métodos convencionales para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente con la proteína marcadora o un fragmento de la misma. También se proporcionan en el presente documento hibridomas preparados por este método y anticuerpos preparados usando dichos hibridomas.

Métodos para evaluar la eficacia

También se proporciona en el presente documento un método para evaluar la eficacia de un compuesto de ensayo para inhibir células con enfermedad relacionada con cáncer. Como se describe en el presente documento, las diferencias en el nivel de expresión de los marcadores se correlacionan con el estado anómalo de las células. Aunque se reconoce que los cambios en los niveles de expresión de algunos de los marcadores probablemente resulten del estado anómalo de las células, probablemente se reconozca que cambios en los niveles de expresión de otros de los marcadores induces, mantienen y promueven el estado anómalo de esas células. Por lo tanto, los compuestos que inhiben una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente provocarán que el nivel de expresión de uno o más de los marcadores cambie a un nivel más cercano al nivel normal de expresión para ese marcador (es decir el nivel de expresión para el marcador de células normales).

Este método comprende por lo tanto comparar la expresión de un marcador en una primera muestra celular y mantenida en presencia del compuesto de ensayo y expresión del marcador en una segunda muestra celular y mantenida en ausencia del compuesto de ensayo. Una expresión significativamente reducida de un marcador en presencia del compuesto de ensayo es un indicio de que el compuesto de ensayo inhibe una enfermedad relacionada con cáncer. Las muestras celulares pueden, por ejemplo, ser alícuotas de una única muestra de células normales obtenidas de un paciente, muestras agrupadas de células normales obtenidas de un paciente, células de una línea celular normal, alícuotas de una única muestra de células con enfermedad relacionada con cáncer obtenidas de un paciente, muestras agrupadas de células con enfermedad relacionada con cáncer obtenidas de un paciente, células de una línea celular con enfermedad relacionada con cáncer, o similares.

En una realización, las muestras son células con enfermedad relacionada con cáncer obtenidas de un paciente y se ensaya una pluralidad de compuestos que se cree que son eficaces para inhibir diversas enfermedades relacionadas con cáncer para identificar el compuesto que probablemente inhiba mejor la enfermedad relacionada con cáncer en el paciente.

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Este método puede usarse probablemente para evaluar la eficacia de una terapia para inhibir una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente. En este método, se evalúa el nivel de expresión de uno o más marcadores en un par de muestras (una sometida a la terapia, la otra no sometida a la terapia). Como con el método para evaluar la eficacia de compuestos de ensayo, si la terapia induce un nivel un nivel significativamente menor de expresión de un marcador entonces la terapia es eficaz para inhibir una enfermedad relacionada con cáncer. Como antes, si se usan muestras de un paciente seleccionado en este método, entonces pueden evaluarse terapias alternativas in vitro para seleccionar una terapia que más probablemente sea eficaz para inhibir una enfermedad relacionada con cáncer en el paciente.

Métodos para evaluar potenciales perjudiciales

Como se describe en el presente documento, el estado anómalo de células humanas se correlaciona con cambios en los niveles de expresión de los marcadores. También se proporciona un método para evaluar el potencial perjudicial de un compuesto de ensayo. Este método comprende mantener alícuotas separadas de células humanas en presencia y ausencia del compuesto de ensayo. Se compara la expresión de un marcador en cada una de las alícuotas. Un nivel significativamente mayor de expresión de un marcador en la alícuota mantenido en presencia del compuesto de ensayo (en relación con la alícuota mantenida en ausencia del compuesto de ensayo) es un indicio de que el compuesto de ensayo posee un potencial perjudicial. El potencial perjudicial relativo de diversos compuestos de ensayo puede evaluarse comparando el grado de potenciación o inhibición del nivel de expresión de los marcadores relevantes, comparando el número de marcadores para los que el nivel de expresión se potencia o inhibe, o comparando ambos.

Proteínas y anticuerpos aislados

Un aspecto se refiere a proteínas marcadoras aisladas y partes biológicamente activas de las mismas, así como a fragmentos polipeptídicos adecuados para su uso como inmunógenos para inducir anticuerpos dirigidos contra una proteína marcadora o un fragmento de la misma. En una realización, la proteína marcadora nativa puede aislarse de células o fuentes tisulares por un esquema de purificación apropiado usando técnicas de purificación de proteínas convencionales. En otra realización, una proteína o un péptido que comprende la proteína marcadora completa o un segmento de la misma se produce por técnicas de ADN recombinante. Como alternativa a la expresión recombinante, dicha proteína o dicho péptido puede sintetizarse químicamente usando técnicas de síntesis de péptidos convencionales.

Una proteína “aislada” o “purificada” o parte biológicamente activa de la misma está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de proteína en las que la proteína se separa de componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de forma recombinante. Por lo tanto, la proteína que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 % o 5 % (en peso seco) de proteína heteróloga (también denominada en el presente documento “proteína contaminante”).

Cuando la proteína o parte biológicamente activa de la misma se produce de forma recombinante, también está preferentemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20 %, 10 % o 5 % del volumen de la preparación de proteínas. Cuando la proteína se produce por síntesis química, está preferentemente sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, está separada de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En consecuencia dichas preparaciones de la proteína tienen menos de aproximadamente el 30 %, 20 %, 10 %, 5 % (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del polipéptido de interés.

Las partes biológicamente activas de una proteína marcadora incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos de la proteína marcadora, que Incluyen menos aminoácidos que la proteína de longitud completa, y muestran al menos una actividad de la proteína de longitud completa correspondiente. Normalmente, las partes biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína de longitud completa correspondiente. Una parte biológicamente activa de una proteína marcadora puede ser un polipéptido que es, por ejemplo, de 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud. Además, otras partes biológicamente activas, en las que se suprimen otras reglones de la proteína marcadora, pueden prepararse por técnicas recombinantes y evaluarse con respecto a una o más de las actividades funcionales de la forma nativa de la proteína marcadora. En ciertas realizaciones, las proteínas útiles son sustancialmente idénticas (por ejemplo, al menos aproximadamente 40 %, y en ciertas realizaciones, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %) a una de estas secuencias y conservan la actividad funcional de la proteína marcadora de origen natural correspondiente pero difieren en su secuencia de aminoácidos debido a variación alélica natural o mutagénesis.

Además, pueden usarse bibliotecas de segmentos de una proteína marcadora para generar una población abigarrada de polipéptidos para cribado y posterior selección de proteínas marcadoras vanantes o segmentos de las

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mismas.

Medicina predictiva

También se proporcionan en el presente documento usos de los modelos animales y marcadores en el campo de la medicina predictiva en los que se usan ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico, farmacogenómica y supervisión de ensayos clínicos para fines de pronóstico (predictivos) para tratar de este modo a un individuo de forma profiláctica. En consecuencia también se proporcionan en el presente documento ensayos de diagnóstico para determinar el nivel de expresión de una o más proteínas marcadoras o ácidos nucleicos, para determinar si un individuo está en riesgo de desarrollar una enfermedad relacionada con cáncer. Dichos ensayos pueden usarse para fines de pronóstico o predictivos para tratar de este modo de forma profiláctica a un individuo antes de la aparición de la enfermedad relacionada con cáncer.

En otro aspecto, los métodos son útiles para cribado al menos periódica del mismo individuo para ver si ese individuo se ha expuesto a productos químicos o toxinas que cambien sus patrones de expresión.

Otro aspecto más se refiere a supervisar la influencia de agentes (por ejemplo, fármacos u otros compuestos administrados bien para inhibir una enfermedad relacionada con cáncer o bien para tratar o prevenir cualquier otro trastorno (por ejemplo, para entender cualquier efecto sistémico que pueda tener dicho tratamiento) en la expresión o actividad de un marcador en estadios clínicos.

Farmacogenómica

Los marcadores también son útiles como marcadores farmacogenómicos. Como se usa en el presente documento, un “marcador farmacogenómico” es un marcador bioquímico objetivo cuyo nivel de expresión se correlaciona con una respuesta o susceptibilidad a fármaco clínico específico en un paciente. La presencia o cantidad de la expresión del marcador farmacogenómico está relacionada con la respuesta predicha del paciente y más particularmente el tumor del paciente a terapia con un fármaco o una clase de fármacos específicos. Evaluando la presencia o cantidad de la expresión de uno o más marcadores farmacogenómicos en un paciente, puede seleccionarse una terapia farmacológica que sea más apropiada para el paciente, o que se prediga que tenga un mayor grado de éxito.

Supervisión de los ensayos clínicos

La supervisión de la influencia de los agentes (por ejemplo, compuestos farmacológicos) en el nivel de expresión de un marcador puede aplicarse no solamente en cribado farmacológico básico, sino también en ensayos clínicos. Por ejemplo, la eficacia de un agente para afectar a la expresión de marcadores puede controlarse en ensayos clínicos de sujetos que reciben tratamiento para una enfermedad relacionada con cáncer.

En una realización no limitante, la presente invención proporciona un método para supervisar la eficacia del tratamiento de un sujeto con un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña u otro candidato farmacológico) que comprende las etapas de (i) obtener una muestra preadministración de un sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel de expresión de uno o más marcadores seleccionados en la muestra preadministración; (iii) obtener una o más muestras postadministración del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión del marcador o los marcadores en las muestras postadministración; (v) comparar el nivel de expresión del marcador o los marcadores en la muestra preadministración con el nivel de expresión del marcador o los marcadores en la muestra o las muestras postadministración; y (vi) alterar la administración del agente al sujeto en consecuencia.

Por ejemplo, la expresión aumentada del gen o los genes marcadores durante el transcurso del tratamiento puede indicar dosificación ineficaz y la idoneidad de aumentar la dosificación. Por el contrario, la reducción de la expresión del gen o los genes marcadores puede indicar tratamiento eficaz y ausencia de necesidad de cambiar la dosificación.

Medio leíble por aparato electrónico, sistemas, matrices y métodos de uso del mismo

Como se usa en el presente documento, “medio leíble por aparato electrónico’’ se refiere a cualquiera medio adecuado para almacenar, retener o contener datos o información que puedan leerse y a los que puede accederse directamente por un aparato electrónico. Dichos medios pueden incluir, pero sin limitación: medio de almacenamiento magnético, tales como disquetes, medio de almacenamiento de disco duro y cinta magnética; medios de almacenamiento ópticos tales como discos compactos; medios de almacenamiento electrónicos tales como RAM, ROM, EPROM, EEPROM y similares; y discos duros generales e híbridos de estas categorías tales como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos. El medio se adapta o se configura para tener registrado en el mismo un marcador como se describe en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, la expresión “aparato electrónico” pretende incluir cualquier aparato de computación o procesamiento adecuado u otro dispositivo configurado o adaptado para almacenar datos o

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información. Los ejemplos de aparatos electrónicos adecuados para su uso con la presente invención incluyen aparatos de computación independientes; redes, incluyendo una red de área local (LAN), una red de área extensa (WAN), Internet, Intranet y Extranet; aparatos electrónicos tales como asistentes personales digitales (PDA), teléfonos móviles, localizadores y similares; y sistemas de procesamiento locales y distribuidos.

Como se usa en el presente documento, “registrado” se refiere a un proceso para almacenar o codificar información en el medio leíble por aparato electrónico. Los expertos en la materia pueden adaptar fácilmente cualquier método para registrar información en medios para generar materiales que comprendan los marcadores descritos en el presente documento.

Puede usarse diversos programas informáticos y formatos para almacenar la información del marcador de la presente invención en el medio libre por aparato electrónico. Puede emplearse cualquier variedad de formatos de estructuración de procesadores de datos (por ejemplo, archivo de texto o base de datos) para obtener o crear un medio que tenga registrado en el mismo los marcadores. Proporcionando los marcadores en forma leíble, se puede acceder rutinariamente a la información de secuencia de marcadores para diversos fines. Por ejemplo, un experto en la materia puede usar las secuencias de nucleótidos o aminoácidos en forma leíble para comparar una secuencia diana o un motivo estructural diana con la información de secuencia almacenada dentro de los medios de almacenamiento de datos. Se usan medios de búsqueda para identificar fragmentos o regiones de las secuencias que coincidan con una secuencia diana o un motivo diana particular.

Por lo tanto, también se proporciona en el presente documento un medio para contener instrucciones para realizar un método para determinar si un sujeto tiene una enfermedad relacionada con cáncer o una predisposición a una enfermedad relacionada con cáncer, en el que el método comprende las etapas de determinar la presencia o ausencia de un marcador y basándose en la presencia o ausencia del marcador, determinar si el sujeto tiene una enfermedad relacionada con cáncer o una predisposición a una enfermedad relacionada con cáncer y/o recomendar un tratamiento particular para una enfermedad relacionada con cáncer o afección previa a la enfermedad relacionada con cáncer.

También se proporciona en el presente documento un sistema electrónico y/o en una red, un método para determinar si un sujeto tiene una enfermedad relacionada con cáncer o una predisposición a una enfermedad relacionada con cáncer asociada a un marcador en el que el método comprende las etapas de determinar la presencia o ausencia del marcador, y basándose en la presencia o ausencia del marcador, determinar si el sujeto tiene una enfermedad relacionada con cáncer o una predisposición a una enfermedad relacionada con cáncer y/o recomendar un tratamiento particular para la enfermedad relacionada con cáncer o afección previa a la enfermedad relacionada con cáncer. El método puede comprender además la etapa de recibir información fenotípica asociada al sujeto y/o adquirir de una red de información fenotípica asociada al sujeto. También se proporciona en el presente documento una red, un método para determinar si un sujeto tiene una enfermedad relacionada con cáncer o una predisposición a una enfermedad relacionada con cáncer asociada a un marcador, comprendiendo el método las etapas de recibir información asociada al marcador, recibir información fenotípica asociada al sujeto, adquirir información de la red correspondiente al marcador y/o una enfermedad relacionada con cáncer, y basándose en uno o más de la información fenotípica, el marcador y la información adquirida, determinar si el sujeto tiene una enfermedad relacionada con cáncer o una predisposición a una enfermedad relacionada con cáncer. El método puede comprender además la etapa de recomendar un tratamiento particular para la enfermedad relacionada con cáncer o afección previa a la enfermedad relacionada con cáncer.

También se proporciona en el presente documento un método de negocio para determinar si un sujeto tiene una enfermedad relacionada con cáncer o una predisposición a una enfermedad relacionada con cáncer, comprendiendo el método las etapas de recibir información asociada al marcador, recibir información fenotípica asociada al sujeto, adquirir información de la red correspondiente al marcador y/o una enfermedad relacionada con cáncer, y basándose en uno o más de la información fenotípica, el marcador y la información adquirida, determinar si el sujeto tiene una enfermedad relacionada con cáncer o una predisposición a una enfermedad relacionada con cáncer. El método puede comprender además la etapa de recomendar un tratamiento particular para la enfermedad relacionada con cáncer o la afección previa a la enfermedad relacionada con cáncer.

Matrices

También se proporciona en el presente documento una matriz que puede usarse para ensayar la expresión de uno o más genes en la matriz. En una realización, la matriz puede usarse para ensayar la expresión génica en un tejido para determinar la especificidad tisular de genes en la matriz. De esta manera, pueden ensayarse simultáneamente hasta aproximadamente 7000 o más genes con respecto a expresión. Esto permite desarrollar un perfil que muestra una batería de genes que se expresan específicamente en uno o más tejidos.

Además de dicha determinación cualitativa, se proporciona en el presente documento la cuantificación de la expresión génica. Por lo tanto, puede determinarse no solamente la especificidad tisular, sino también el nivel de expresión de una batería de genes en el tejido. Por lo tanto, los genes pueden agruparse basándose en su expresión tisular en sí misma y el nivel de expresión en ese tejido. Esto es útil, por ejemplo, en la determinación de

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la relación de la expresión génica entre o dentro de tejidos. Por lo tanto, se puede alterar un tejido y determinarse el efecto en la expresión génica en un segundo tejido. En este contexto, puede determinarse el efecto de un tipo celular en otro tipo celular en respuesta a un estímulo biológico.

Dicha determinación es útil, por ejemplo, para conocer el efecto de la interacción célula-célula en el nivel de expresión génica. Si se administra un agente de forma terapéutica para tratar un tipo celular pero tiene un efecto indeseable en otro tipo celular, el método proporciona un ensayo para determinar la base molecular del efecto indeseable y proporciona de este modo la oportunidad de coadministrar un agente que contrarreste o tratar de otro modo el efecto no deseado. De forma similar, incluso dentro de un único tipo celular, pueden determinarse efectos biológicos indeseables en el nivel molecular. Por lo tanto, los efectos de un agente en la expresión de un gen distinto del diana pueden determinarse y contrarrestarse.

En otra realización, la matriz puede usarse para supervisar la evolución temporal de la expresión de uno o más genes en la matriz. Esto puede realizarse en diversos contextos biológicos, como se desvela en el presente documento, por ejemplo el desarrollo de una enfermedad relacionada con cáncer, progresión de una enfermedad relacionada con cáncer, y procesos, tales como transformación celular asociada a una enfermedad relacionada con cáncer.

La matriz también es útil para determinar el efecto de la expresión de un gen o la expresión de otros genes en la misma célula o en diferentes células. Esto proporciona, por ejemplo, una selección de dianas moleculares alternativas para intervención terapéutica si la diana última o comente abajo no puede regularse.

La matriz también es útil para determinar patrones de expresión diferenciales de uno o más genes en células normales y anómalas. Esto proporciona una batería de genes que podrían actuar como una diana molecular para diagnóstico o intervención terapéutica.

Marcadores sustitutos

Los marcadores pueden actuar como marcadores sustitutos para uno o más trastornos o patologías o para afecciones que conducen a una patología relacionada con el cáncer. Como se usa en el presente documento, un “marcador sustituto” es un marcador bioquímico objetivo que se correlaciona con la ausencia o presencia de una enfermedad o un trastorno, o con la progresión de una enfermedad o un trastorno. La presencia o cantidad de dichos marcadores es independiente de la enfermedad. Por lo tanto, estos marcadores pueden actuar para indicar si un curso de tratamiento particular es eficaz en la reducción de una patología o un trastorno. Los marcadores sustitutos son de uso particular cuando la presencia o el alcance de una patología o un trastorno es difícil de evaluar mediante metodologías convencionales, o cuando se desea una evaluación de la progresión de enfermedad antes de alcanzar un punto final clínico potencialmente peligroso.

Los marcadores también son útiles como marcadores farmacodinámicos. Como se usa en el presente documento, un “marcador farmacodinámico” es un marcador bioquímico objetivo que se correlaciona específicamente con efectos farmacológicos. La presencia o cantidad de un marcador farmacodinámico no se relaciona con la patología o el trastorno para el que se administra el fármaco; por lo tanto, la presencia o cantidad del marcador es indicativa de la presencia o actividad del fármaco en un sujeto. Por ejemplo, un marcador farmacodinámico puede ser indicativo de la concentración del fármaco en un tejido biológico, porque el marcador se expresa o se transcribe o no se expresa o no se transcribe en ese tejido en relación con el nivel del fármaco. De esta manera, la distribución o la captación del fármaco pueden controlarse por el marcador farmacodinámico. De forma similar, la presencia o cantidad del marcador farmacodinámico puede estar relacionada con la presencia o cantidad del producto metabólico de un fármaco, de modo que la presencia o cantidad del marcador es indicativa de la velocidad de degradación relativa del fármaco in vivo.

Los marcadores farmacodinámicos son de uso particular en el aumento de la sensibilidad de detección de efectos farmacológicos, particularmente cuando el fármaco se administra en dosis bajas. Ya que incluso una cantidad pequeña de un fármaco puede ser suficiente para activar múltiples ciclos de transcripción o expresión de marcadores, el marcador amplificado puede estar en una cantidad que es más fácilmente detectable que el fármaco en sí mismo. Además, el marcador puede detectarse más fácilmente debido a la naturaleza del marcador en sí mismo; por ejemplo, usando los métodos descritos en el presente documento, pueden emplearse anticuerpos en un sistema de detección basado en inmunidad para un marcador proteico, o pueden usarse sondas radiomarcadas específicas de marcador para detectar un marcador de ARNm. Además, el uso de un marcador farmacodinámico puede ofrecer predicción basa en el mecanismo del riesgo debido al tratamiento farmacológico más allá de la serie de observaciones directas posibles.

Protocolos para ensayo

El método para ensayar la enfermedad relacionada con cáncer comprende, por ejemplo medir el nivel de expresión de cada gen marcador en una muestra biológica de un sujeto a lo largo del tiempo y comparar el nivel con el del gen marcador en una muestra biológica de control.

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Cuando el gen marcador es uno de los genes descritos en el presente documento y el nivel de expresión se expresa diferencialmente (por ejemplo, es mayor o menor que el del control), se valora que el sujeto está afectado por una enfermedad relacionada con cáncer. Cuando el nivel de expresión del gen marcador queda dentro del Intervalo permisible, es poco probable que el sujeto esté afectado por una enfermedad relacionada con cáncer.

El valor convencional para el control puede predeterminarse midiendo el nivel de expresión del gen marcador en el control, para comparar los niveles de expresión. Por ejemplo, el valor convencional puede determinarse basándose en el nivel de expresión del gen marcador anteriormente mencionado en el control. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el intervalo permisible se toma como ± 2 D.T. basándose en el valor convencional. Una vez que se ha determinado el valor convencional, el método de ensayo puede realizarse midiendo solamente el nivel de expresión en una muestra biológica de un sujeto y comparando el valor con el valor convencional determinado para el control.

Los niveles de expresión de genes marcadores incluyen transcripción de los genes marcadores a ARNm, y traducción en proteínas. Por lo tanto, un método para ensayar una enfermedad relacionada con cáncer se realiza basándose en una comparación de la intensidad de expresión de ARNm correspondiente a los genes marcadores, o el nivel de expresión de proteínas codificadas por los genes marcadores.

Sondas

La medición de los niveles de expresión de genes marcadores en el ensayo para una enfermedad relacionada con cáncer puede llevarse a cabo de acuerdo con diversos métodos de análisis de genes. Específicamente, se puede usar, por ejemplo, una técnica de hibridación usando ácidos nucleicos que hibridan con estos genes como sondas, o una técnica de amplificación génica usando ADN que hibrida con los genes marcadores como cebadores.

Las sondas o los cebadores usados para el ensayo pueden diseñarse basándose en las secuencias de nucleótldos de los genes marcadores. Los números de identificación para las secuencias de nucleótidos de los genes marcadores respectivos se describen en el presente documento.

Además, debe entenderse que los genes de animales superiores generalmente acompañan al polimorfismo en una alta frecuencia. También hay muchas moléculas que producen isoformas que comprenden secuencias de aminoácidos mutuamente diferentes durante el proceso de corte y empalme. Cualquier gen asociado a una enfermedad relacionada con cáncer que tenga una actividad similar a la de un gen marcador se incluye en los genes marcadores, incluso si tiene diferencias de secuencias de nucleótidos debidas a polimorfismo o que es una isoforma.

También debe entenderse que los genes marcadores pueden incluir homólogos de otras especies además de seres humanos. Por lo tanto, a no ser que se especifique de otro modo, la expresión “gen marcador” se refiere a un homólogo del gen marcador único de la especie o un gen marcador ajeno que se ha introducido en un individuo.

Además, debe entenderse que un “homólogo de un gen marcador” se refiere a un gen derivado de una especie distinta de un ser humano, que puede hibridar con el gen marcador humano como una sonda en condiciones rigurosas. Dichas condiciones rigurosas se conocen por los expertos en la materia que pueden seleccionar una condición apropiada para producir una rigurosidad igual de forma experimental o empírica.

Un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de un gen marcador o una secuencia de nucleótidos que es complementaria de la cadena complementaria de la secuencia de nucleótidos de un gen marcador y tiene al menos 15 nucleótidos, puede usarse como un cebador o una sonda. Por lo tanto, una “cadena complementaria” significa una cadena de un ADN bicatenario con respecto a la otra cadena y que está compuesto de pares de bases A:T (U para ARN) y G:C.

Además, “complementario” significa no solamente los que son completamente complementarios para una región de al menos 15 nucleótidos continuos, sino también los que tienen una homología de secuencia de nucleótidos de al menos 40 % en ciertos casos, 50 % en ciertos casos, 60 % en ciertos casos, 70 % en ciertos casos, 80 % en ciertos casos, al menos 80 %, 90 % y 95 % o mayor. El grado de homología entre secuencias de nucleótidos puede determinarse por un algoritmo, BLAST, etc.

Dichos polinucleótidos son útiles como una sonda para detectar un gen marcador, o como un cebador para amplificar un gen marcador. Cuando se usa como un cebador, el polinucleótido comprende habitualmente de 15 pb a 100 pb, y en ciertas realizaciones de 15 pb a 35 pb de nucleótidos. Cuando se usa como una sonda, un ADN comprende la secuencia de nucleótidos completa del gen marcador (o la cadena complementaria de la misma); o una secuencia parcial de la misma que tiene al menos 15 pb de nucleótidos. Cuando se usa como un cebador, la región 3’ debe ser complementaria del gen marcador, mientras que la región 5’ puede estar unida a una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción o un marcador.

Los “polinucleótidos” pueden ser ADN o ARN. Estos polinucleótidos pueden ser sintéticos o de origen natural. Además, el ADN usado como una sonda para hibridación está habitualmente marcado. Los expertos en la materia entienden fácilmente dichos métodos de mareaje. En el presente documento, el término “oligonucleótido” significa un

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polinucleótido con un grado relativamente bajo de polimerización. Los oligonucleótidos se incluyen en polinucleótidos.

Ensayos para enfermedades relacionadas con cáncer

Pueden realizarse ensayos para una enfermedad relacionada con cáncer usando técnicas de hibridación usando, por ejemplo, hibridación de Northern, hibridación de transferencia puntual o la técnica de micromatrices de ADN. Además, pueden usarse técnicas de amplificación génica, tales como el método de RT-PRC. Usando el método de supervisión de amplificación por PCR durante la etapa de amplificación génica en RT-PCR, se puede conseguir un análisis más cuantitativo de la expresión de un gen marcador.

En el método de supervisión de la amplificación génica por PCR, la diana de detección (ADN o transcrito inverso de ARN) se híbrida con sondas que están marcadas con un colorante fluorescente y un interruptor que absorbe la fluorescencia. Cuando avanza la PCR y la Taq polimerasa degrada la sonda con su actividad 5’-3’ exonucleasa, el colorante fluorescente y el interruptor se separan y se detecta la fluorescencia. La fluorescencia se detecta en tiempo real. Midiendo simultáneamente una muestra convencional en la que se conoce el número de copias de una diana, es posible determinar el número de copias de la diana en la muestra objeto con el número de ciclo cuando la amplificación por PCR sea lineal. Además, un experto en la materia reconoce que el método de supervisión de amplificación por PCR puede llevarse a cabo usando cualquiera método adecuado.

El método de ensayo para una enfermedad relacionada con cáncer también puede llevarse a cabo detectando una proteína codificada por un gen marcador. En lo sucesivo en el presente documento, una proteína codificada por un gen marcador se describe como una “proteína marcadora”. Para dichos métodos de ensayo, por ejemplo, pueden emplearse el método de transferencia de Western, el método de inmunoprecipitación y el método de ELISA usando un anticuerpo que se una con cada proteína marcadora.

Pueden producirse anticuerpos usados en la detección que se unen con la proteína marcadora por cualquier técnica adecuada. Además, para detectar una proteína marcadora, puede marcarse de forma apropiada un anticuerpo tal. Como alternativa, en lugar de marcar el anticuerpo, puede marcarse una sustancia que se una específicamente con el anticuerpo, por ejemplo, proteína A o proteína G, para detectar la proteína marcadora indirectamente. Más específicamente, dicho método de detección puede incluir el método de ELISA.

Puede obtenerse una proteína o un péptido parcial de la misma usada como un antígeno, por ejemplo, insertando un gen marcador o una parte del mismo en un vector de expresión, introduciendo la construcción en una célula hospedadora apropiada para producir un transformante, cultivar el transformante para expresar la proteína recombinante, y purificar la proteína recombinante expresada del cultivo o el sobrenadante de cultivo. Como alternativa, la secuencia de aminoácidos codificada por un gen o un oligopéptido que comprende una parte de la secuencia de aminoácidos codificada por un ADNc de longitud completa se sintetizan químicamente para su uso como un inmunógeno.

Además, puede realizarse un ensayo con respecto a una enfermedad relacionada con cáncer usando como un índice no solamente el nivel de expresión de un gen marcador sino también la actividad de una proteína marcadora en una muestra biológica. La actividad de una proteína marcadora significa la actividad biológica intrínseca a la proteína. Pueden usarse diversos métodos para medir la actividad de cada proteína.

Incluso si no se diagnostica que un paciente esté afectado por una enfermedad relacionada con cáncer en un ensayo rutinario a pesar de síntomas que sugieran estas enfermedades, si dicho paciente padece o no una enfermedad relacionada con cáncer puede determinarse fácilmente realizando un ensayo de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento.

Más específicamente, en ciertas realizaciones, cuando el gen marcador es uno de los genes descritos en el presente documento, un aumento o una reducción en el nivel de expresión del gen marcador en un paciente cuyos síntomas sugieren al menos una susceptibilidad a una enfermedad relacionada con cáncer indica que los síntomas están causados principalmente por una enfermedad relacionada con cáncer.

Además, los ensayos son útiles para determinar si una enfermedad relacionada con cáncer está mejorando en un paciente. En otras palabras, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para valorar el efecto terapéutico de un tratamiento para una enfermedad relacionada con cáncer. Además, cuando el gen marcador es uno de los genes descritos en el presente documento, un aumento o una reducción en el nivel de expresión del gen marcador en un paciente, al que se ha diagnosticado que está afectado por una enfermedad relacionada con cáncer, implica que la enfermedad ha progresado más.

La gravedad y/o susceptibilidad a una enfermedad relacionada con cáncer también puede determinarse basándose en la diferencia en los niveles de expresión. Por ejemplo, cuando el gen marcador es uno de los genes descritos en el presente documento, el grado de aumento en el nivel de expresión del gen marcador se correlaciona con la presencia y/o gravedad de una enfermedad relacionada con cáncer.

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Control de la expresión del marcador

Además, la expresión en sí misma de un gen marcador puede controlarse introduciendo una mutación o mutaciones en la región reguladora de la transcripción del gen. Los expertos en la materia entienden dichas sustituciones de aminoácidos. Además, el número de aminoácidos que se mutan no está particularmente restringido, siempre que la actividad se mantenga. Normalmente, está a una distancia de 50 aminoácidos, en ciertas realizaciones no limitantes, a una distancia de 30 aminoácidos, a una distancia de 10 aminoácidos, o a una distancia de 3 aminoácidos. El sitio de mutación puede ser cualquier sitio, siempre que se mantenga la actividad.

Métodos de cribado

En otro aspecto más, se proporcionan en el presente documento métodos de cribado para compuestos candidatos con respecto a agentes terapéuticos para tratar una enfermedad relacionada con cáncer. Uno o más genes marcadores se seleccionan del grupo de genes descritos en el presente documento. Un agente terapéutico para una enfermedad relacionada con cáncer puede obtenerse seleccionando un compuesto capaz de aumentar o reducir el nivel de expresión del gen o los genes marcadores.

Debe entenderse que la expresión “un compuesto que aumenta el nivel de expresión de un gen” se refiere a un compuesto que promueve una cualquiera de las etapas de transcripción génica, traducción génica o expresión de una actividad proteica. Por otro lado, la expresión “un compuesto que reduce el nivel de expresión de un gen”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que inhibe una cualquiera de estas etapas.

En aspectos particulares, el método para explorar con respecto a un agente terapéutico para una enfermedad relacionada con cáncer puede llevarse a cabo bien in vivo o bien in vitro. Este método de cribado puede realizarse, por ejemplo, (1) administrando un compuesto candidato a un sujeto animal; (2) midiendo el nivel de expresión de un gen o genes marcadores en una muestra biológica del sujeto animal; o (3) seleccionando un compuesto que aumenta o reduce el nivel de expresión de un gen o genes marcadores en comparación con el de un control con el que no se ha puesto en contacto el compuesto candidato.

En otro aspecto más, se proporciona en el presente documento un método para evaluar la eficacia de un compuesto candidato para un agente farmacéutico en el nivel de expresión de un gen o genes marcadores poniendo en contacto un sujeto animal con el compuesto candidato y supervisando el efecto del compuesto en el nivel de expresión del gen o los genes marcadores en una muestra biológica derivada del sujeto animal. La variación en el nivel de expresión del gen o los genes marcadores en una muestra biológica derivada del sujeto animal puede supervisarse usando la misma técnica que se ha usado en el método de ensayo descrito anteriormente. Además, basándose en la evaluación, puede seleccionarse un compuesto candidato para un agente farmacéutico por cribado.

Kits

En otro aspecto, se proporcionan diversos kits de diagnóstico y ensayo. En una realización, un kit es útil para evaluar si un paciente está aquejado de una enfermedad relacionada con cáncer. El kit comprende un reactivo para evaluar la expresión de un marcador. En otra realización, un kit es útil para evaluar la idoneidad de un agente químico o biológico para inhibir una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente. Dicho kit comprende un reactivo para evaluar la expresión de un marcador, y también puede comprender uno o más de dichos agentes.

En una realización adicional, los kits son útiles para evaluar la presencia de células con enfermedades relacionadas con cáncer o tratar enfermedades relacionadas con cáncer. Dichos kits comprenden un anticuerpo, un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, que se une específicamente con una proteína marcadora o un fragmento de la proteína. Dichos kits también pueden comprender una pluralidad de anticuerpos, derivados de anticuerpo o fragmentos de anticuerpo en los que la pluralidad de dichos agentes de anticuerpo se une específicamente con una proteína marcadora o un fragmento de la proteína.

En una realización adicional, los kits son útiles para evaluar la presencia de células de enfermedad relacionada con cáncer, en los que el kit comprende una sonda de ácido nucleico que se une específicamente con un ácido nucleico marcador o un fragmento del ácido nucleico. El kit también puede comprender una pluralidad de sondas, en las que cada una de las sondas se une específicamente con un ácido nucleico marcador, o un fragmento del ácido nucleico.

Las composiciones, los kits y métodos descritos en el presente documento pueden tener los siguientes usos, entre otros: 1) evaluar si un paciente está aquejado de una enfermedad relacionada con cáncer; 2) evaluar el estadio de una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente humano; 3) evaluar el grado de una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente; 4) evaluar la naturaleza de una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente; 5) evaluar el potencial de desarrollar una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente; 6) evaluar el tipo histológico de células asociadas a una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente; 7) realizar anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o derivados de anticuerpo que son útiles para tratar una enfermedad relacionada con cáncer y/o evaluar si un paciente está aquejado de una enfermedad relacionada con cáncer; 8) evaluar la presencia de células con enfermedad relacionada con cáncer; 9) evaluar la eficacia de uno o más compuestos de ensayo para

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inhibir una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente; 10) evaluar la eficacia de una terapia para inhibir una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente; 11) supervisar la progresión de una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente; 12) seleccionar una composición o terapia para inhibir una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente; 13) tratar a un paciente aquejado de una enfermedad relacionada con cáncer; 14) inhibir una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente; 15) evaluar el potencial perjudicial de un compuesto de ensayo; y 16) prevenir la aparición de una enfermedad relacionada con cáncer en un paciente en riesgo de desarrollar una enfermedad relacionada con cáncer.

Los kits son útiles para evaluar la presencia de células con enfermedad relacionada con cáncer (por ejemplo en una muestra tal como una muestra de paciente). El kit comprende una pluralidad de reactivos, cada uno de los cuales es capaz de unirse específicamente con un ácido nucleico o una proteína marcadores. Los reactivos adecuados para unión con una proteína marcadora incluyen anticuerpos, derivados de anticuerpo, fragmentos de anticuerpo y similares. Los reactivos adecuados para unión con un ácido nucleico marcador (por ejemplo un ADN genómico, un ARNm, un ARNm con corte y empalme, un ADNc o similares) incluyen ácidos nucleicos complementarios. Por ejemplo, los reactivos de ácido nucleico pueden incluir oligonucleótidos (marcados o no marcados) fijados en un sustrato, oligonucleótidos marcados no unidos a un sustrato, pares de cebadores de PCR, sondas de balizas moleculares y similares.

Los kits pueden comprender opcionalmente componentes adicionales útiles para realizar los métodos descritos en el presente documento. Como ejemplo, el kit puede comprender fluidos (por ejemplo tampón SSC) adecuados para hibridar ácidos nucleicos complementarios o para unir un anticuerpo con una proteína con la que se una específicamente, uno o más compartimentos de muestras, un material didáctico que describe la realización del método, una muestra de células normales, una muestra de células con enfermedad relacionada con cáncer y similares.

Modelo animal

Puede producirse un modelo animal no humano para la evaluación de al menos una enfermedad relacionada con cáncer. El método incluye exponer al animal a dosis repetidas de al menos un producto químico que se cree que provoca el cáncer de interés. En ciertos aspectos, el método incluye además recoger una o más muestras seleccionadas del animal; y comparar la muestra recogida con uno o más indicios de inicio o desarrollo de cáncer potencial.

Un método para producir el modelo animal incluye: mantener el animal en un ambiente sin productos químicos específico y sensibilizar al animal con al menos un producto químico que se cree que provoca el cáncer. En ciertas realizaciones, al menos una parte del animal se sensibiliza por múltiples exposiciones secuenciales.

Un método para explorar un agente con respecto a eficacia frente a al menos una enfermedad relacionada con cáncer generalmente incluye: administrar al menos un agente a un animal de ensayo, determinar si el agente reduce o agrava uno o más de los síntomas de la enfermedad relacionada con cáncer; correlacionar una reducción en uno o más síntomas con la eficacia del agente frente a la enfermedad relacionada con cáncer; o correlacionar una falta de reducción en uno o más síntomas con la ineficacia del agente. El modelo animal es útil para evaluar una o más rutas metabólicas que contribuyen a al menos uno de inicio, progresión, gravedad, patología, agresividad, grado, actividad, discapacidad, mortalidad, morbilidad, subclasificación de enfermedad u otra característica patogénica o patológica subyacente de al menos una enfermedad relacionada con cáncer. El análisis puede ser por uno o más de: agrupamiento jerárquico, construcción de red de identificación, análisis proteómico por espectroscopia de masas, resonancia de plasmón superficial, modelización estadística lineal, análisis discriminante de mínimos cuadráticos parcial, y análisis de regresión lineal múltiple.

El modelo animal puede evaluarse con respecto a al menos una enfermedad relacionada con el cáncer, examinando un nivel de expresión de uno o más marcadores, o un equivalente funcional de los mismos.

Los modelos animales pueden usarse para el cribado de agentes terapéuticos útiles para el tratamiento o prevención de una enfermedad relacionada con cáncer. En consecuencia, los métodos son útiles para identificar agentes terapéuticos para tratar o prevenir una enfermedad relacionada con cáncer. Los métodos comprenden administrar un agente candidato a un modelo animal preparado por los métodos descritos en el presente documento, evaluar al menos una respuesta de enfermedad relacionada con cáncer en el modelo animal en comparación con un modelo animal de control al que no se ha administrado el agente candidato. Si se reducen los síntomas o se retarda la aparición de al menos una respuesta de enfermedad relacionada con cáncer, el agente candidato es un agente para tratar o prevenir la enfermedad relacionada con cáncer.

Los modelos animales para una enfermedad relacionada con cáncer pueden incluir un animal en el que el nivel de expresión de uno o más genes marcadores o un gen funcionalmente equivalente al gen marcador se ha elevado en el modelo animal. Un “gen funcionalmente equivalente” como se usa en el presente documento generalmente es un gen que codifica una proteína que tiene una actividad similar a una actividad conocida de una proteína codificada por el gen marcador. Un ejemplo representativo de un gen funcionalmente equivalente incluye un homólogo de un

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gen marcador de un animal objeto, que es intrínseco del animal.

El modelo animal para una enfermedad relacionada con cáncer es útil para detectar cambios fisiológicos debidos a una enfermedad relacionada con cáncer. En ciertas realizaciones, el modelo animal es útil para revelar funciones adicionales de genes marcadores y para evaluar fármacos cuyas dianas son los genes marcadores.

En una realización, un modelo animal para una enfermedad relacionada con cáncer puede crearse controlando el nivel de expresión de un gen homólogo o administrando un gen homólogo. El método puede incluir crear un modelo animal para una enfermedad relacionada con cáncer controlando el nivel de expresión de un gen seleccionado del grupo de genes descritos en el presente documento. En otra realización, el método puede incluir crear un modelo animal para una enfermedad relacionada con cáncer administrando la proteína codificada por un gen descrito en el presente documento, o administrando un anticuerpo contra la proteína. También debe entenderse que en ciertas otras realizaciones, el marcador puede sobreexpresarse de modo que el marcador pueda medirse después usando métodos apropiados.

En otra realización, puede crearse un modelo animal para una enfermedad relacionada con cáncer introduciendo un gen seleccionado de dichos grupos de genes, o administrando una proteína codificada por dicho gen.

En otra realización, puede inducirse una enfermedad relacionada con cáncer suprimiendo la expresión de un gen seleccionado de dichos grupos de genes o la actividad de una proteína codificada por dicho gen. Puede usarse un ácido nucleico antisentido, una ribozima o un ARNi para suprimir la expresión. La actividad de una proteína puede controlarse eficazmente administrando una sustancia que inhiba la actividad, tal como un anticuerpo.

El modelo animal es útil para dilucidar el mecanismo que subyace a una enfermedad relacionada con cáncer y también para ensayar la seguridad de compuestos obtenidos explorando. Por ejemplo, cuando un modelo animal desarrolla los síntomas de una enfermedad relacionada con cáncer, o cuando un valor medido implicado en una cierta enfermedad relacionada con cáncer se altera en el animal, puede construirse un sistema de cribado para explorar compuestos que tienen actividad para aliviar la enfermedad.

Como se usa en el presente documento, la expresión “un aumento en el nivel de expresión” se refiere a uno cualquiera de los siguientes: cuando un gen marcador introducido como un gen ajeno se expresa artificialmente; cuando la transcripción de un gen marcador intrínseco al animal objeto y la traducción del mismo en la proteína se potencian; o cuando la hidrólisis de la proteína, que es el producto de traducción, se suprime. Como se usa en el presente documento, la expresión “una reducción en el nivel de expresión” se refiere al estado en el que se inhiben la transcripción de un gen marcador del animal objeto y la traducción del mismo a la proteína, o el estado en el que se potencia la hidrólisis de la proteína, que es el producto de traducción. El nivel de expresión de un gen puede determinarse, por ejemplo, por una diferencia en la intensidad de señal en una microplaca de ADN. Además, la actividad del producto de traducción, la proteina, puede determinarse comparando con la del estado normal.

También está dentro del alcance contemplado que el modelo animal puede incluir animales transgénicos, incluyendo, por ejemplo animales en los que se ha introducido y se ha expresado artificialmente un gen marcador; animales con anulación de gen marcador; y animales con introducción en los que otro gen ha sustituido a un gen marcador. Un animal transgénico, en el que se ha introducido un ácido nucleico antisentido de un gen marcador, una ribozima, un polinucleótido que tiene un efecto de ARNi, o un ADN que actúa como un ácido nucleico señuelo o similares, puede usarse como el animal transgénico. Dichos animales transgénicos también incluyen, por ejemplo, animales en los que se ha potenciado o suprimido la actividad de una proteína marcadora introduciendo una mutación o mutaciones en la región codificante del gen, o la secuencia de aminoácidos se ha modificado para hacerse resistente o susceptible a hidrólisis. Las mutaciones en una secuencia de aminoácidos incluyen sustituciones, deleciones, inserciones y adiciones.

Aplicaciones terapéuticas

La invención es ampliamente aplicable a diversas situaciones en las que es deseable poder regular el nivel de expresión génica, tal como “encendiendo” y “apagando” la expresión génica, de una manera rápida, eficaz y controlada sin provocar efectos pleiotrópicos o citotoxicidad. La invención pude ser particularmente útil para fines de terapia génica en seres humanos, en tratamientos para enfermedades genéticas o adquiridas. El enfoque general de la terapia génica implica la introducción de una o más moléculas de ácido nucleico en células de modo que se produzcan uno o más productos génicos codificados por el material genético introducido en las células para restaurar o potenciar una actividad funcional. Para revisiones sobre los enfoques de terapia génica Anderson, et al. (1992); Miller et al. (1992); Friedmann et al. (1989); y Cournoyer et al. (1990). Sin embargo, los vectores de terapia génica actuales utilizan normalmente elementos reguladores constitutivos que son sensibles a factores de transcripción endógenos. Estos sistemas de vectores no permiten la capacidad de modular el nivel de expresión génica en un sujeto. Por el contrario, el sistema regulador de la invención proporciona esta capacidad.

Para usar el sistema de la invención para fines de terapia génica, se introduce al menos una molécula de ADN en células de un sujeto que necesite terapia génica (por ejemplo, un sujeto humano que padece una enfermedad

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genética o adquirida) para modificar las células. Las células se modifican para comprender: 1) ácido nucleico que codifica un regulador ¡nduclble de la invención en una forma adecuada para expresión del regulador inducible en las células hospedadoras; y 2) un ARNip (por ejemplo, para fines terapéuticos) unido operativamente con un promotor específico de tejido tal como un promotor s-ship1. Puede usarse una única molécula de ADN que codifica componentes del sistema regulador de la invención o, como alternativa, pueden usarse moléculas de ADN separadas que codifican cada componente. Las células del sujeto pueden modificarse ex vivo y después introducirse en el sujeto o las células pueden modificarse directamente in vivo por técnicas convencionales para introducir ácidos nucleicos en células. Por lo tanto, el sistema regulador de la invención no ofrece la ventaja sobre los sistemas reguladores constitutivos de permitir la modulación del nivel de expresión génica dependiendo de los requisitos de la situación terapéutica.

Los genes de interés particular para anular o reducir en células de un sujeto para tratamiento de enfermedades genéticas o adquiridas incluyen los que codifican un producto génico deletéreo, tal como una proteína anómala. Los ejemplos de enfermedades específicas no limitantes incluyen anemia, cánceres relacionados con la sangre, enfermedad de Parkinson y diabetes.

La presente Invención puede aplicarse para desarrollar líneas celulares autólogas o alogénicas para fines terapéuticos. Por ejemplo, se utilizan aplicaciones de terapia génica de interés particular en trasplante de células y/u órganos con la presente invención. En realizaciones ejemplares, la regulación negativa de antígenos de trasplante (tales como, por ejemplo, por regulación negativa de expresión de beta2-microglobulina mediante ARNip) permite el trasplante de células alogénicas mientras que minimiza el riesgo de rechazo por el sistema ¡nmunitario del paciente. La presente invención permitiría una desconexión del ARNi en caso de efectos adversos (por ejemplo replicación Incontrolable de las células trasplantadas).

Los tipos celulares que pueden someterse a la presente invención incluyen células madre hematopoyéticas, mioblastos, hepatocitos, linfocitos, epitelio de las vías respiratorias, epitelio cutáneo, islotes, neuronas dopaminérgicas, queratinocitos y así sucesivamente. Para descripciones adicionales de tipos celulares, genes y métodos para terapia génica véase por ejemplo, Armentano et al. (1990); Wolff et al. (1990); Chowdhury et al.

(1991) ; Ferry et al. (1991); Quantin et al (1992); Dai et al. (1992); van Beusechem et al. (1992); Rosenfeld et al.

(1992) ; Kay et al. (1992); Cristiano etal (1993); Hwu etal (1993); y Herz y Gerard (1993).

En realizaciones particulares de la presente invención hay un método para tratar cualquier condición de enfermedad susceptible de tratamiento con un promotor s-ship. En realizaciones específicas, el método comprende preparar una construcción polinucleotídica que tiene una región que codifica un gen (marcador) terapéutico o de diagnóstico que está unido operativamente con un promotor, en el que el gen codificado por la construcción es para el tratamiento de la condición de enfermedad.

A. Formulaciones farmacéuticas, suministro y regímenes de tratamiento

En una realización de la presente invención, se contemplan métodos de tratamiento. Una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, en general, se define como la cantidad suficiente para aliviar, reducir, minimizar o limitar de forma detectable y repetidamente el alcance de la enfermedad o sus síntomas. Pueden aplicarse definiciones más rigurosas, incluyendo eliminación, erradicación o cura de la enfermedad.

Las vías de administración variarán, de forma natural, con la localización y naturaleza de la lesión, e incluirán, por ejemplo, administración y formulación intradérmica, transdérmica, parenteral, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutánea, percutánea, intratraqueal, intraperitoneal, intratumoral, de perfusión, de lavado, de inyección directa y oral.

Pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como bases libres o sales farmacológicamente aceptables en agua convenientemente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (Patente de Estados Unidos n.° 5.466.468). En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y deben conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede proporcionarse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. Puede proporcionarse absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la

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absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debería taponarse convenientemente si es necesario y el diluyente líquido hacerse en primer lugar isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratumoral e intraperitoneal. En relación con esto, los expertos en la materia conocerán medio acuoso estéril que puede emplearse a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 mi de solución de NaCI isotónica y añadirse a 1000 mi de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión (véase por ejemplo “Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15a Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá necesariamente alguna variación de la dosificación dependiendo de la condición del sujeto que se trate. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para administración humana, las preparaciones deberían cumplir patrones de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según se requiere por la Oficina de patrones biológicos de la FDA.

Se preparan soluciones inyectables estériles incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.

Las composiciones desveladas en el presente documento pueden formularse en una forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que es terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en diversas formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Como se usa en el presente documento, “vehículo” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, tampones, soluciones de vehículo, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse en las composiciones principios activos complementarios.

La expresión “farmacéuticamente aceptable” o “farmacológicamente aceptable” se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción alérgica o desafortunada similar cuando se administra a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como un principio activo se entiende bien en la técnica. Normalmente, dichas composiciones se preparan como inyectables, bien como soluciones o bien como suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección.

B. Tratamientos de combinación

Los compuestos y métodos de la presente invención pueden usarse en el contexto de terapias tradicionales. Para aumentar la eficacia de un tratamiento con las composiciones de la presente invención, puede ser deseable combinar estas composiciones con otros agentes eficaces en el tratamiento de estas enfermedades y afecciones. Por ejemplo, el tratamiento de un cáncer puede implementarse con compuestos terapéuticos de la presente invención y otras terapias antineoplásicas, tales como agentes antineoplásicos o cirugía. De forma similar, el tratamiento de una enfermedad o afección vascular puede implicar tanto la presente invención como agentes o terapias vasculares convencionales.

Pueden emplearse diversas combinaciones; por ejemplo, una célula hospedadora de la presente invención es “A” y el agente/la terapia antineoplásico secundario es “B”: TABLA-US-00005 A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/BB/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A.

La administración de las construcciones de expresión terapéutica de la presente invención a un paciente seguirán protocolos generales para la administración de esa terapia secundaria particular, teniendo en cuenta la toxicidad, si

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la hubiera, del tratamiento. Se espera que los ciclos del tratamiento se repitan según sea necesario. También se contempla que pueden aplicarse diversas terapias convencionales, así como intervención quirúrgica, en combinación con la terapia descrita.

Aunque la invención se ha descrito y se ha ejemplificado en suficiente detalle para que los expertos en esta materia la preparen y la usen, deberían ser evidentes diversas alternativas, modificaciones y mejoras sin alejarse del alcance de la invención. Un experto en la materia aprecia fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetivos y obtener los fines y las ventajas mencionados, así como los inherentes en los mismos.

Los métodos y reactivos descritos en el presente documento son representativos de realizaciones preferidas, son ejemplares y no se pretende que sean limitaciones del alcance de la invención. Los expertos en la materia se darán cuenta de modificaciones de los mismos y otros usos. Estas modificaciones están abarcadas dentro de la invención y se definen por el alcance de las reivindicaciones. También resultará evidente para un experto en la materia que pueden realizarse diversas sustituciones y modificaciones a la invención desvelada en el presente documento sin alejarse del alcance de la invención.

Debería entenderse que aunque la presente invención se ha desvelado específicamente por realizaciones preferidas y características opcionales, puede acudirse a modificaciones y variaciones de los conceptos desvelados en el presente documento por los expertos en la materia, y que se considera que dichas modificaciones y variaciones están dentro del alcance de la presente invención como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Aunque la presente invención se ha descrito en referencia a diversas realizaciones preferidas, los expertos en la materia deberían entender que pueden realizarse diversos cambios y pueden sustituirse elementos de las mismas por equivalentes sin alejarse del alcance esencial de la invención. Además, pueden realizarse muchas modificaciones para adaptar una situación o un material particular a las enseñanzas de la invención sin alejarse del alcance esencial de las mismas.

Por lo tanto, se pretende que la invención no esté limitada a la realización particular desvelada en el presente documento, contemplada para llevar a cabo la presente invención, sino que la invención incluirá todas las realizaciones que quedan dentro del alcance de las reivindicaciones.

Todas las composiciones y/o los métodos y/o aparatos desvelados y reivindicados en el presente documento pueden prepararse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente divulgación. Aunque las composiciones y los métodos de la presente invención se han descrito con respecto a realizaciones preferidas, resultará evidente para los expertos en la materia que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y/o los métodos y/o aparatos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito en el presente documento sin alejarse del concepto, y alcance de la invención. Más específicamente, resultará evidente que ciertos agentes que están relacionados tanto química como fisiológicamente pueden sustituir a los agentes descritos en el presente documento obteniéndose aun así los mismos resultados o similares. Se considera que todos estos sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la materia están dentro del alcance y el concepto de la invención como se definen por las reivindicaciones adjuntas.

A lo largo de la presente divulgación, se hace referencia a diversas publicaciones, patentes y memorias descriptivas de patentes publicadas por una cita identificativa.

A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto habitual en la materia (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, química de ácidos nucleicos, técnicas de hibridación y bioquímica). Se usan técnicas convencionales para métodos moleculares, genéticos y bioquímicos que están dentro de la experiencia de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. de Sambrook, Fritsch y Maniatis (Coid Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Mullis et al. Patente de Estados Unidos n.° 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (Hames y Higgins eds., 1984); Transcription And Translation (Hames y Higgins eds., 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells (Millery Calos eds., 1987, Coid Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes l-IV (Weiry Blackwell, eds., 1986); The Laboratory Rat, editor in chief: Mark A. Suckow; autores: Sharp y LaRegina. CRC Press, Boston, 1988) y métodos químicos.

Referencias

La publicación y otro material usado en el presente documento para ilustrar la invención o proporcionar detalles adicionales con respecto a la práctica de la invención, y para mayor conveniencia se proporcionan en la siguiente bibliografía.

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La cita de cualquiera de los documentos enumerados en el presente documento no se entiende como una admisión de que ninguno de los siguientes sea técnica anterior pertinente. Todas las declaraciones con respecto a la fecha o representación con respecto a los contenidos de estos documentos se basan en la información disponible para el solicitante y no constituye ninguna admisión con respecto a la corrección de los datos o contenidos de estos documentos.

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genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci U S A 101,2999-3004.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para diferenciar cánceres humanos que comprende usar uno o más perfiles de expresión de regiones ultraconservadas transcritas (RUC-T), en el que la asociación entre la localización genómica de las RUC-T y los 5 elementos genómicos relacionados con cáncer analizados es estadísticamente muy significativa y comparable a la indicada para los miARN;

   en donde el método usa el perfil de expresión de cinco RUC-T, uc.269A(N), uc. 16.0(N), uc.215(N), uc.346A(P) y uc.348(N) para diferenciar entre dos grupos de pronóstico de leucemia linfocítica crónica (LLC).