ES2560219T3

ES2560219T3 - Biomarcadores del plasma sanguíneo para terapias de combinación con bevacizumab para el tratamiento del cáncer pancreático

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Publication number: ES2560219T3
Application number: ES11748601.9T
Authority: ES
Inventors: Paul Delmar; Dorothee Foernzler; Friedemann Krause; Stefan Scherer
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2010-07-19
Filing date: 2011-07-18
Publication date: 2016-02-17
Anticipated expiration: 2031-07-18
Also published as: US20130183301A1; MX339427B; US20130108626A1; EP2596364A1; CN103140761B; MX2013000671A; HK1181459A1; JP2013538337A; RU2582964C2; US20130195857A1; AU2011281700A1; BR112012033423A2; US20140302019A1; EP2596364B1; KR20130091746A; RU2013106940A; WO2012010546A1; JP5963005B2; CA2804348A1; AU2011281700B2

Abstract

Un método in vitro para la identificación de un paciente que responde o es sensible a la adición de tratamiento con bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método determinar el nivel de expresión de proteína de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una muestra de plasma sanguíneo de un paciente que se sospecha que padece o que es propenso a padecer cáncer pancreático, mediante el cual un nivel de expresión aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a los niveles de expresión de control determinados en pacientes que padecen cáncer pancreático es indicativo de una sensibilidad del paciente a la adición de bevacizumab a dicho régimen quimioterapéutico, en el que el cáncer pancreático es cáncer pancreático metastásico y el régimen quimioterapéutico comprende gemcitabina y erlotinib.

Description

Biomarcadores del plasma sanguíneo para terapias de combinación con bevacizumab para el tratamiento del cáncer pancreático

La presente divulgación proporciona métodos para mejorar el efecto de tratamiento de un régimen de quimioterapia de un paciente que padece cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico añadiendo bevacizumab (Avastin®) a un régimen de quimioterapia mediante la determinación del nivel de expresión, en particular el nivel de expresión en plasma sanguíneo, de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a niveles de control de pacientes diagnosticados con cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico. En particular, la presente divulgación proporciona métodos para mejorar el efecto de tratamiento, en el que el efecto de tratamiento es la supervivencia general y/o supervivencia libre de progresión del paciente. La presente divulgación proporciona además métodos para evaluar la sensibilidad o capacidad de respuesta de un paciente a bevacizumab (Avastin®) en combinación con un régimen de quimioterapia, determinando el nivel de expresión, en particular el nivel de expresión en plasma sanguíneo, de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a niveles de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico.

Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a la identificación y selección de biomarcadores del cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, que se correlaciona con la sensibilidad o capacidad de respuesta a los inhibidores de la angiogénesis, por ejemplo, bevacizumab (Avastin®), en combinación con regímenes terapéuticos, tales como la terapia con gemcitabina-erlotinib (GE). A este respecto, la divulgación se refiere al uso de (a) los perfiles de expresión específicos de plasma sanguíneo de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a los controles establecidos en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, para identificar pacientes sensibles o que respondan a la adición de inhibidores de la angiogénesis, por ejemplo, bevacizumab (Avastin®), a quimioterapias convencionales. La divulgación se refiere además a métodos para mejorar el efecto de tratamiento, en particular, la supervivencia general y/o la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, mediante la adición de inhibidores de la angiogénesis, por ejemplo, bevacizumab (Avastin®), a quimioterapias convencionales, por ejemplo, la terapia con gemcitabina-erlotinib (GE), determinando (a) los niveles de expresión específicos de plasma sanguíneo de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a los controles en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico. La divulgación proporciona además kits y composiciones para la identificación de pacientes sensibles o que responden a los inhibidores de la angiogénesis, en particular, bevacizumab (Avastin®), determinados y definidos de acuerdo con los métodos de la presente divulgación.

La angiogénesis es necesaria para el desarrollo del cáncer, regulando no solo el tamaño del tumor primario y el crecimiento, sino también teniendo impacto en el potencial invasivo y metastásico. Por consiguiente, se han investigado los mecanismos que median los procesos angiogénicos como dianas potenciales para terapias anticáncer dirigidas. De manera temprana en el estudio de los moduladores angiogénicos, se descubrió que la ruta de señalización del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) regula la actividad angiogénica en múltiples tipos de cáncer. Este factor señaliza a través del receptor 2 de VEGF (VEGFR-2), el principal receptor de la señalización de VEGF que media la angiogénesis. Se han desarrollado múltiples agentes terapéuticos para modular esta ruta en varios puntos. Estas terapias incluyen, entre otros, bevacizumab, sunitinib, sorafenib y vatalanib. Aunque el uso de inhibidores angiogénicos en la clínica ha sido exitoso, no todos los pacientes responden o no logran responder completamente a la terapia con inhibidor de la angiogénesis. Los mecanismos subyacentes a dicha respuesta incompleta se desconocen. Por lo tanto, hay una necesidad creciente para la identificación de subgrupos de pacientes sensibles o que responden a la terapia para el cáncer anti-angiogénica.

Aunque se conocen una serie de inhibidores de la angiogénesis, el inhibidor de la angiogénesis más destacado es bevacizumab (Avastin®). El bevacizumab es un anticuerpo IgG1 monoclonal humanizado recombinante que se une específicamente y bloquea los efectos biológicos de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular). El VEGF es un director clave de la angiogénesis tumoral, un proceso esencial necesario para el crecimiento tumoral y la metástasis, es decir, la diseminación del tumor a otras partes del cuerpo. Avastin® se ha aprobado en Europa para el tratamiento de estados avanzados de cuatro tipos comunes de cáncer: cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) y cáncer de riñón, que de manera colectiva causan más de 2,5 millones de muertes cada año. En estados unidos, Avastin® fue la primera terapia anti-angiogénesis aprobada por la FDA, y actualmente está aprobada para el tratamiento de cuatro tipos de tumor: cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de mama, de cerebro (glioblastoma) y de riñón (carcinoma de células renales). Más de medio millón de pacientes han sido tratados con Avastina hasta ahora, un programa clínico exhaustivo con más de 450 ensayos clínicos está investigando el uso adicional de Avastin en el tratamiento de múltiples tipos de cáncer (incluyendo colorrectal, de mama, de pulmón no microcítico, de cerebro, gástrico, de ovario y de próstata) en diferentes situaciones (por ejemplo, enfermedad avanzada o en estadío temprano). De manera importante, Avastin® ha mostrado ser prometedor como agente co-terapéutico, demostrando eficacia cuando se combina con una amplia variedad de quimioterapias y otros tratamientos anti-cáncer. Se han publicado estudios de fase II que demuestran los efectos beneficiosos de combinar bevacizumab con regímenes terapéuticos convencionales (véase, por ejemplo, Saltz et al., 2008, J. Clin. Oncol, 26:2013-2019; Yang et al., 2008, Clin. Cancer Res., 14:5893-5899; Hurwitz et al.,

2004, N. Engl. J. Med., 350:2335-2342). Sin embargo, como en estudios previos de inhibidores angiogénicos, algunos de estos estudios de fase III han demostrado que una parte de los pacientes experimentan una respuesta incompleta a la adición de bevacizumab (Avastin®) a sus regímenes terapéuticos.

Por consiguiente, hay una necesidad de métodos para determinar aquellos pacientes que responden o tienen posibilidades de responder a terapias combinadas que comprenden inhibidores de la angiogénesis, en particular, bevacizumab (Avastin®). Por lo tanto, el problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar métodos y medios para la identificación de (a) pacientes que padecen o son propensos a padecer cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, que pueden beneficiarse de la adición de inhibidores de la angiogénesis, en particular, bevacizumab (Avastin®), a terapias quimioterapéuticas, por ejemplo, la terapia con gemcitabina-erlotinib (GE).

El problema técnico se resuelve proporcionando las reivindicaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Por consiguiente, la invención se refiere a las realizaciones tal como se definen en las reivindicaciones. Por lo tanto, la invención se refiere a los siguientes artículos:

1.: Un método in vitro para la identificación de un paciente que responde a o es sensible a la adición de tratamiento con bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método determinar el nivel de expresión de proteína de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una muestra de plasma sanguíneo de un paciente que se sospecha que padece o que es propenso a padecer cáncer pancreático, mediante el cual un nivel de expresión aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a los niveles de expresión de control determinados en pacientes que padecen cáncer pancreático es indicativo de una sensibilidad del paciente a la adición de bevacizumab a dicho régimen quimioterapéutico, en el que el cáncer pancreático es cáncer pancreático metastásico y el régimen quimioterapéutico comprende gemcitabina y erlotinib.

2.: Un método in vitro para predecir la respuesta a o la sensibilidad a la adición de bevacizumab a un régimen quimioterapéutico de un paciente que se sospecha que padece, que padece o que es propenso a padecer cáncer pancreático que comprende determinar el nivel de expresión de proteína de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una muestra de plasma sanguíneo de un paciente, en el que el cáncer pancreático es cáncer pancreático metastásico y el régimen quimioterapéutico comprende gemcitabina y erlotinib.

3.: El método del artículo 1, en el que el efecto del tratamiento es supervivencia libre de progresión.

4.: El método del artículo 1, en el que el efecto del tratamiento es supervivencia general.

5.: El método de los artículos 2 a 4, en el que el nivel de expresión de proteína es de VEGFA o PLGF.

6.: El método de los artículos 2 a 4, en el que el nivel de expresión de proteína es de VEGFA o VEGFR2.

7.: El método de los artículos 1 a 4, en el que el nivel de expresión de proteína determinado es un nivel de expresión combinada de VEGFA y VEGFR2.

8.: El método de los artículos 1 a 4, en el que el nivel de expresión de proteína determinado es un nivel de expresión combinada de VEGFA y PLGF.

9.: El método de los artículos 1 a 4, en el que el nivel de expresión de proteína determinado es un nivel de expresión combinada de VEGFA, VEGFR2 y PLGF.

10.: El método de los artículos 1 a 9, en el que dicho nivel de expresión se detecta mediante un método de inmunoensayo.

11.: El método del artículo 10, en el que dicho método de inmunoensayo es ELISA.

12.: El método de los artículos 1 a 11, en el que dicho paciente se está tratando conjuntamente con una o más terapias anti-cáncer.

13.: El método del artículo 12, en el que dicha terapia anti-cáncer es radiación.

14.: El método de los artículos 1 a 13, en el que dicha muestra se obtiene antes de la terapia neoadyuvante o adyuvante o después de la terapia neoadyuvante o adyuvante.

Además, la presente divulgación proporciona un método para mejorar el efecto de tratamiento de un régimen de quimioterapia de un paciente que padece cáncer pancreático mediante la adición de bevacizumab a dicho régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): determinar el nivel de expresión de proteína de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una muestra de un paciente; y

(b): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a los niveles de expresión de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

La presente divulgación se refiere a un método para mejorar el efecto de tratamiento de un régimen quimioterapéutico de un paciente que padece cáncer pancreático añadiendo bevacizumab al régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de proteína de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a los niveles de expresión de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

La presente divulgación se refiere a un método para mejorar la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(b): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a los niveles de expresión de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(c): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a los niveles de expresión de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

La presente divulgación se refiere a un método para mejorar la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(b): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a los niveles de expresión de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

en el que el régimen quimioterapéutico comprende terapia de gemcitabina-erlotinib.

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(c): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a los niveles de expresión de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

La presente divulgación se refiere a un método para mejorar la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

La presente divulgación se refiere a un método para mejorar la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(a): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA o VEGFR2 en una muestra de paciente; y

(b): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión aumentado de VEGFA o VEGFR2 en relación a niveles de expresión de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA o de VEGFR2; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión aumentado de VEGFA o VEGFR2 en relación a niveles de expresión de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

(b): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión aumentado de VEGFA o VEGFR2 en relación a niveles de expresión de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

(a) obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA o de VEGFR2; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión aumentado de VEGFA o VEGFR2 en relación a niveles de expresión de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

(a): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA o PLGF en una muestra de paciente; y

(b): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión aumentado de VEGFA o PLGF en relación a niveles de expresión de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA o de PLGF; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión aumentado de VEGFA o PLGF en relación a niveles de expresión de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

(b): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión aumentado de VEGFA o PLGF en relación a niveles de expresión de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA o de PLGF; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión aumentado de VEGFA o PLGF en relación a niveles de expresión de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico, en el que el régimen quimioterapéutico comprende terapia de gemcitabina-erlotinib.

La divulgación proporciona un método para mejorar la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una muestra de un paciente; y

(b): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a un nivel de expresión combinado de control determinado en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

El cáncer pancreático puede ser cáncer pancreático metastásico.

Por consiguiente, la divulgación se refiere a un método para mejorar la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA, VEGFR2 y PLGF; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a un nivel de expresión combinado de control determinado en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

El cáncer pancreático puede ser cáncer pancreático metastásico.

La divulgación, por lo tanto, a un método para mejorar la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(b): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a un nivel de expresión combinado de control determinado en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

La divulgación se refiere a un método para mejorar la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(c): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a un nivel de expresión combinado de control determinado en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

La divulgación proporciona un método para mejorar la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

El cáncer pancreático puede ser cáncer pancreático metastásico.

Por consiguiente, la divulgación se refiere a un método para mejorar la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

El cáncer pancreático puede ser cáncer pancreático metastásico.

La divulgación, por lo tanto, se refiere a un método para mejorar la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

La divulgación se refiere a un método para mejorar la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

La divulgación proporciona un método para mejorar la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA y VEGFR2 en una muestra de paciente; y

(b): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y VEGFR en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico.

Por consiguiente, la divulgación se refiere a un método para mejorar la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA y de VEGFR2; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y VEGFR en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico.

(b): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y VEGFR2 en relación a un nivel de expresión combinada de control determinado en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA y de VEGFR2; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y VEGFR en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

La divulgación proporciona un método para mejorar la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(b): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y VEGFR en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico.

Por consiguiente, la divulgación se refiere a un método para mejorar la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA y de VEGFR2; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y VEGFR en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico.

(b): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y VEGFR en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA y de VEGFR2; y

La presente divulgación proporciona un método para mejorar la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA y PLGF en una muestra de paciente; y

(b): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y PLGF en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico.

Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a un método para mejorar la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA y de PLGF; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y PLGF en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico.

(b): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y PLGF en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA y de PLGF; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y PLGF en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

La presente divulgación proporciona un método para mejorar la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a un método para mejorar la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA y de PLGF; y

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de proteína de VEGFA y de PLGF; y

La presente divulgación proporciona un método in vitro para la identificación de un paciente que responde a o es sensible a la adición de tratamiento con bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método determinar el nivel de expresión de proteína de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una muestra de un paciente que padece, se sospecha que padece o es propenso a padecer cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, mediante el cual un nivel de expresión aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a los niveles de expresión de control en pacientes que padecen cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, es indicativo de una sensibilidad del paciente a la adición de bevacizumab a dicho régimen quimioterapéutico. El régimen quimioterapéutico puede comprender terapia con gemcitabina-erlotinib.

Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a un método in vitro para la identificación de un paciente que responde o es sensible a la adición de tratamiento de bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método:

(a): obtener una muestra de un paciente que padece, se sospecha que padece o es propenso a padecer cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico; y

(b): determinar el nivel de expresión de proteína de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF; mediante el cual un nivel de expresión aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a los niveles de expresión de control en pacientes que padecen cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, es indicativo de una sensibilidad del paciente a la adición de bevacizumab a dicho régimen quimioterapéutico. El régimen quimioterapéutico puede comprender terapia con gemcitabina-erlotinib.

La presente divulgación proporciona un método in vitro para la identificación de un paciente que responde a o es sensible a la adición de tratamiento con bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método determinar el nivel de expresión de proteína de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una muestra de un paciente que padece, se sospecha que padece o es propenso a padecer cáncer pancreático metastásico, mediante el cual un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y VEGFR2 o VEGFA y PLGF o VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a un nivel de expresión combinada de control determinado en pacientes que padecen cáncer pancreático metastásico es indicativo de una sensibilidad del paciente a la adición de bevacizumab a dicho régimen quimioterapéutico. El régimen quimioterapéutico puede comprender terapia con gemcitabina-erlotinib.

Por consiguiente, la presente invención resuelve el problema técnico identificado en tanto que se ha demostrado sorprendentemente que los niveles de expresión específicos en plasma sanguíneo de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en un paciente dado, en relación a niveles de control determinados en pacientes diagnosticados

con cáncer pancreático, en particular, pancreático metastásico, se correlaciona con el efecto del tratamiento en aquellos pacientes a los que se les administra inhibidor de la angiogénesis en combinación con un régimen quimioterapéutico. Específicamente, las variaciones en los niveles de expresión de proteínas de VEGFA, VEGFR2 y/o PLGF se identificaron sorprendentemente como marcadores/predictores para la supervivencia general mejorada y/o supervivencia libre de progresión del cáncer pancreático metastásico en respuesta a la adición de bevacizumab (Avastin®) al régimen quimioterapéutico de gemcitabina-erlotinib. Se identificó que los pacientes que muestran una respuesta o sensibilidad a la adición de bevacizumab (Avastin®) a los regímenes quimioterapéuticos tienen un nivel de expresión de proteína aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a los niveles de expresión de control establecidos en muestras obtenidas de pacientes diagnosticados con cáncer pancreático, en particular, cáncer pancreático metastásico. Los términos "marcador" y "predictor" pueden usarse de manera intercambiable y se refieren a los niveles de expresión de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF tal como se describen en el presente documento. La invención también abarca el uso de los términos "marcador" y "predictor" para referirse a una combinación de cualesquiera dos o más de los niveles de expresión en plasma de VEGFA, VEGFR2 y PLGF.

En el contexto de la presente invención, "VEGFA" se refiere a la proteína A de factor de crecimiento endotelial vascular, ilustrada por la SEC ID Nº: 1, mostrada en la FIGURA 8 (Número de referencia de Swiss Prot P15692, ID del gen (NCBI): 7422). El término "VEGFA" abarca la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1 así como los homólogos e isoformas de la misma. El término "VEGFA" también abarca las isoformas conocidas, por ejemplo, variantes de corte y empalme, de VEGFA, por ejemplo, VEGF111, VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189 y VEGF206, así como variantes, homólogos e isoformas de la misma, incluyendo el factor de crecimiento celular endotelial vascular humano de 110 aminoácidos generado por la escisión de plasmina de VEGF165, tal como se describe en Ferrara, Mol. Biol. Cell 21:687 (2010) y Leung et al. Science 246:1306 (1989), y Houck et al. Mol. Endocrin. 5:1806 (1991). En una realización particular de la presente invención, "VEGFA" se refiere a VEGF121 y/o VEGF110. En una realización particular de la presente invención, "VEGFA" se refiere a VEGF111. En el contexto de la divulgación, el término "VEGFA" también abarca proteínas que tienen al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95% de homología con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1, o con las secuencias de aminoácidos de las variantes y/u homólogos de las mismas, así como fragmentos de las secuencias, siempre que las proteínas variantes (incluyendo isoformas), proteínas homólogas y/o fragmentos se reconozcan por uno o más anticuerpos específicos de VEGFA, tales como el anticuerpo clon 3C5 y 26503, que están disponibles a través de Bender RELIATech y R&D Systems, respectivamente y A4.6.1, tal como se describe en Kim et al., Growth Factors 7(1): 53-64 (1992). En el contexto de la invención, el término "isoforma" de VEGF o VEGF-A se refiere tanto a isoformas de corte y empalme y a formas generadas mediante escisión enzimática (por ejemplo, plasmina).

En una realización, "VEGFA" se refiere a VEGF no modificado. En el contexto de la presente invención, VEGF "no modificado" se refiere a la secuencia de aminoácidos no modificada de VEGF, sus isoformas y sus productos de escisión. El VEGF no modificado puede producirse, por ejemplo, de manera sintética o preferentemente de manera recombinante en sistemas de expresión procariotas, por ejemplo, en E. coli. El VEGF no modificado, por ejemplo, no porta una modificación postraduccional, tal como una glucosilación. En el contexto de la divulgación, la expresión "VEGF-A no modificado" también abarca variantes y/u homólogos del mismo, así como fragmentos de VEGF-A, siempre que las proteínas variantes (incluyendo isoformas), proteínas homólogas y/o fragmentos se reconozcan por anticuerpos específicos de VEGF-A, tal como el anticuerpo clon 3C5, que está disponible a través de RELIATech GmbH, Wolfen-büttel, Alemania.

En el contexto de la presente invención, "VEGFR2" se refiere al receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular, ilustrada por la SEC ID Nº: 2, mostrada en la FIGURA 9 (Número de referencia de Swiss Prot P35968, ID del gen (NCBI): 3791). El término "VEGFR2" abarca la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 así como los homólogos e isoformas de la misma. En el contexto de la divulgación, el término "VEGFR2" también abarca proteínas que tienen al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95% de homología con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, o con las secuencias de aminoácidos de las variantes y/u homólogos de las mismas, así como fragmentos de las secuencias, siempre que las proteínas variantes (incluyendo isoformas), proteínas homólogas y/o fragmentos, se reconozcan por uno o más anticuerpos específicos de VEGFR2, tales como el anticuerpo clon 89115 y 89109, que están disponibles a través de R&D Systems.

En el contexto de la presente invención, "PLGF" se refiere al factor de crecimiento placentario ejemplificado por la SEC ID Nº: 3, mostrada en la FIGURA 10 (Número de referencia de Swiss Prot P49763, ID del gen (NCBI): 5228). El término "PLGF" abarca la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3 así como los homólogos e isoformas de la misma. En el contexto de la divulgación, el término "PLGF" también abarca proteínas que tienen al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95% de homología con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3, o con las secuencias de aminoácidos de las variantes y/u homólogos de las mismas, así como fragmentos de las secuencias, siempre que las proteínas variantes (incluyendo isoformas), proteínas homólogas y/o fragmentos se reconozcan por uno o más anticuerpos específicos de PLGF, tales como el anticuerpo clon 2D6D5 y 6A11D2, que están disponibles a través de Roche Diagnostics GmbH.

Por consiguiente, la presente divulgación abarca la determinación de los niveles de expresión de proteínas incluyendo, pero sin limitación, las secuencias de aminoácidos tal como se describen en el presente documento. En

este contexto, la divulgación abarca la detección de homólogos, variantes e isoformas de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF; pudiendo dichas isoformas o variantes, entre otras cosas, comprender variantes alélicas o variantes de corte y empalme. También se prevé la detección de proteínas que son homólogas a una o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF tal como se describe en el presente documento, o un fragmento de las mismas, por ejemplo, que tienen al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 3 o un fragmento de las mismas. Como alternativa o adicionalmente, la presente divulgación abarca la detección de los niveles de expresión de proteínas codificadas por secuencias de ácidos nucleicos, o fragmentos de las mismas, que son al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a una secuencia de ácido nucleico que codifica a SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 2 o un fragmento, variante o isoforma de las mismas. En este contexto, el término "variante" significa que la secuencia de aminoácidos de VEGFA, VEGFR2 y/o PLGF, o la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha secuencia de aminoácidos, difiere de las distintas secuencias identificadas por las SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 3 y/o disponibles bajo los números de referencia de Swiss Prot anteriormente identificados, mediante mutaciones, por ejemplo, eliminación adiciones, las sustituciones, inversiones, etc. Además, el término "homólogo" se refiere a moléculas que tienen al menos un 60%, más preferentemente al menos un 80% y lo más preferentemente al menos un 90% de identidad de secuencia con uno o más de los polipéptidos tal como se muestran en las SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 3, o un fragmento de las mismas.

Para determinar si una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico tiene un determinado grado de identidad con una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico, tal como se describe en el presente documento, el experto en la materia puede usar medios y métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, alineamientos, ya sea manualmente o usando programas informáticos conocidos en la técnica o descritos en el presente documento.

De acuerdo con la presente divulgación, el término "idéntico" o la expresión "porcentaje de identidad" en el contexto de dos o más secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales, o que tienen un porcentaje de restos de aminoácidos o de nucleótidos específico que son iguales (por ejemplo, una identidad del 60% o 65%, preferentemente, una identidad del 70-95%, más preferentemente al menos un 95% de identidad con las secuencias de aminoácidos de, por ejemplo, SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 3), cuando se comparan y alinean para máxima correspondencia en una ventana de comparación, o sobre una región designada medida usando un algoritmo de comparación de secuencia, tal como se conoce en la técnica, o mediante alineamiento manual e inspección visual. Las secuencias que tienen, por ejemplo, una identidad del 60% al 95% o mayor se consideran sustancialmente idénticas. Dicha definición también se aplica al complemento de una secuencia de ensayo. Preferentemente, la identidad descrita existe sobre una región que es de al menos aproximadamente 15 a 25 aminoácidos o nucleótidos de longitud, más preferentemente, sobre una región que es de aproximadamente 50 a 100 aminoácidos o nucleótidos de longitud. Los expertos en la materia sabrán cómo determinar el porcentaje de identidad entre secuencias usando, por ejemplo, algoritmos, tales como aquellos basados en el programa informático CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) o FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245), tal como se conoce en la técnica.

Aunque el algoritmo FASTDB no tiene en consideración típicamente eliminaciones o adiciones no coincidentes en secuencias, es decir, huecos, en su cálculo, esto puede corregirse manualmente para evitar una sobreestimación del % de identidad. CLUSTALW, sin embargo, no tiene en cuenta huecos de secuencia en sus cálculos de identidad. También están disponibles para los expertos en la materia los algoritmos BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) y BLAST 2.0 (Altshul, 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul, 1993 J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410). El programa BLASTN para secuencias de ácidos nucleicos usan como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectación (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 3, y una expectación (E) de 10. La matriz de puntuación BLOSUM62 (Henikoff (1989) PNAS 89:10915) usa alineamientos (B) de 50, expectación (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras.

Los algoritmos BLAST, como ya se ha discutido anteriormente, producen alineamientos de secuencias tanto de aminoácidos como de nucleótidos para determinar la similitud de secuencia. Debido a la naturaleza local de los alineamientos, BLAST es especialmente útil para determinar coincidencias exactas o para identificar secuencias similares. La unidad fundamental de la salida del algoritmo BLAST es el par de segmento de alta puntuación (HSP). Un HSP consiste en dos fragmentos de secuencia de longitudes arbitrarias pero iguales cuyo alineamiento es localmente máximo y para el que la puntuación de alineamiento alcanza o supera una puntuación umbral o de corte configurada por el usuario. La estrategia BLAST es buscar HSP entre una secuencia de búsqueda y una secuencia de base de datos, para evaluar la significación estadística de cualquier coincidencia encontrada, y para comunicar solo aquellas coincidencias que satisfacen el umbral de significación seleccionado por el usuario. El parámetro E establece el umbral estadísticamente significativo para comunicar coincidencias de secuencia de bases de datos. E se interpreta como el límite superior de la frecuencia de probabilidad de aparición esperada de un HSP (o conjunto de HSP) en el contexto de la búsqueda de base de datos completa. Cualquier secuencia de base de datos cuya coincidencia satisfaga E se comunica en la salida del programa.

Pueden usarse técnicas informáticas análogas que usan BLST para buscar moléculas idénticas o relacionadas en bases de datos de proteínas o nucleótidos, tales como GenBank o EMBL. Este análisis es mucho más rápido que las

hibridaciones múltiples basadas en membrana. Además, la sensibilidad de la búsqueda por ordenador puede modificarse para determinar si cualquier coincidencia concreta se cataloga como exacta o similar. La base de la búsqueda es la puntuación del producto que se define como:

y tiene en cuenta tanto el grado de similitud entre dos secuencias y la longitud de la coincidencia de secuencia. Por ejemplo, con una puntuación de producto de 40, la coincidencia será exacta con un 1-2% de error; y a 70, la coincidencia será exacta. Las moléculas similares se identifican normalmente seleccionando aquellas que muestran puntuaciones de producto entre 15 y 40, aunque pueden identificarse moléculas relacionadas con puntuaciones menores. Otro ejemplo de un programa capaz de generar alineamientos de secuencias es el programa informático CLUSTALW (Thompson, 1994, Nucl. Acids Res. 2:4673-4680) o FASTDB (Brutlag, 1990, Comp. App. Biosci. 6:237245), tal como se conoce en la técnica.

En el contexto de la divulgación descrita en el presente documento, los niveles de expresión, en particular los niveles de expresión de proteína, de VEGFA, VEGFR2 y/o PLGF, pueden considerarse por separado, como marcadores individuales, o en grupos de dos o más, como perfil de expresión o panel de marcadores. En el contexto de la divulgación descrita en el presente documento, un perfil de expresión o panel de marcadores en el que los perfiles de expresión de dos o más marcadores pueden considerarse conjuntamente también puede citarse como un nivel de expresión combinado. Por ejemplo, los niveles de expresión de dos o más marcadores pueden sumarse juntos y compararse con un nivel de expresión combinado de control determinado de manera similar. Por lo tanto, los métodos de la divulgación abarcan la determinación de un perfil de expresión, incluyendo un perfil de expresión combinado, basado en el nivel de expresión de uno o más de los marcadores.

En el contexto de la invención descrita en el presente documento, y de acuerdo con el ejemplo ilustrativo adjunto, para la consideración de VEGFA, VEGFR2 o PLGF por separado, se usaron los siguientes valores como el valor de alta o baja expresión correspondiente del marcador: Alto VEGFA (≥ 152,9 pg/ml), Bajo VEGFA (< 152,9 pg/ml), Alto VEFR2 (≥ 9,9 ng/ml), Bajo VEFR2 (< 9,9 ng/ml). Estos niveles se determinaron mediante la mediana de las muestras disponibles tal como se determinó previamente en un plan de análisis estadístico. Además, los niveles optimizados que constituyen el valor de corte entre alta y baja expresión de un marcador particular pueden determinarse variando el corte hasta el que el subconjunto de pacientes por encima y por debajo del valor de corte cumplen un criterio de optimalidad estadísticamente relevante. Por ejemplo, el punto de corte óptimo puede seleccionarse para maximizar las diferencias en la relación de peligro del tratamiento entre el subconjunto por encima y por debajo, o para maximizar el efecto del tratamiento en un subgrupo, o cualquier otro criterio estadístico relevante. De acuerdo con la invención descrita en el presente documento, y de acuerdo con el ejemplo ilustrativo adjunto, los valores de expresión optimizados para PLGF considerados por separado fueron Alto PLGF (≥ 36,5 pg/ml), y Bajo PLGF (<36,5 pg/ml). Este nivel se determinó como el 42º percentil de los datos disponibles. Se determinó este nivel para aumentar la diferencia estadística en el efecto de tratamiento entre nivel alto y bajo. El experto en la materia, sin embargo, entenderá que el nivel de expresión del marcador particular y, por lo tanto, de lo que constituye un nivel de expresión alto o bajo puede variar dependiendo del paciente y de la población de pacientes. Por consiguiente, el experto en la materia entenderá que cuando se usan métodos de detección distintos de aquellos descritos en el ejemplo ilustrativo adjunto y estudiando pacientes y poblaciones de pacientes distintas a aquellas descritas en el ejemplo ilustrativo adjunto, lo que el experto en la materia considera como un nivel de expresión alto y/o bajo para un biomarcador particular puede variar entre los valores descritos en el presente documento. Dados los métodos descritos en el presente documento, el experto en la materia puede determinar qué constituye un nivel de expresión alto y/o bajo de un biomarcador particular.

Como apreciará el experto en la materia, hay muchas formas de usar las mediciones de dos o más marcadores para mejorar la cuestión diagnóstica que se esté investigando. En una estrategia simple aunque a menudo eficaz, se asume un resultado positivo si una muestra es positiva para al menos uno de los marcadores investigados.

Sin embargo, también puede evaluarse una combinación de marcadores. Los valores medidos para marcadores de un panel de marcadores (o un nivel de expresión combinada), por ejemplo, para VEGFA y VEGFR2 o VEGFA y PLGF o VEGFA, VEGFR2 y PLGF, pueden combinarse matemáticamente y puede correlacionarse el valor combinado con la cuestión diagnóstica subyacente. Los valores de marcador pueden combinarse mediante cualquier método matemático del estado de la técnica. Los métodos matemáticos bien conocidos para correlacionar una combinación de marcadores con una enfermedad o con un efecto de tratamiento emplean métodos tales como análisis de discriminante (AD) (es decir, ad lineal, cuadrático, regularizado), métodos de Kernel (es decir, SVM), métodos no paramétricos (es decir, clasificadores de vecino más próximo k), MCP (mínimos cuadrados parciales), métodos basados en árbol (es decir, regresión lógica, CART, métodos de Selvas aleatorias, métodos de impulsión/embolsado), modelos lineales generalizados (es decir, regresión logística), métodos basados en componentes principales (es decir, SIMCA), modelos aditivos generales, métodos basados en lógica difusa, métodos basados en redes neurales y algoritmos genéticos. El experto en la materia no tendrá problemas para seleccionar un método adecuado para evaluar una combinación de marcadores de la presente invención. El método usado para

correlacionar combinaciones de marcadores de acuerdo con la invención divulgados en el presente documento con, por ejemplo, la supervivencia general mejorada, la supervivencia libre de progresión, la capacidad de respuesta o sensibilidad a la adición de bevacizumab a agentes quimioterapéuticos/regímenes quimioterapéuticos y/o la predicción de una respuesta a o de una sensibilidad a bevacizumab (además de a uno o más agentes quimioterapéuticos/regímenes quimioterapéuticos) se selecciona entre AD (es decir, análisis de discriminante lineal, cuadrático, regularizado), métodos de Kernel (es decir, SVM), métodos no paramétricos (es decir, clasificadores de vecino más próximo k), MCP (mínimos cuadrados parciales), métodos basados en árbol (es decir, regresión lógica, CART, métodos de Selvas aleatorias, métodos de impulsión), o modelos lineales generalizados (es decir, regresión logística). Los detalles referentes a estos métodos estadísticos se encuentran en las siguientes referencias: Ruczinski, I., et al, J. of Computational and Graphical Statistics, 12 (2003) 475-511; Friedman, J. H., J. of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175; Hastie, Trevor, Tibshirani, Robert, Friedman, Jerome, The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics, 2001; Breiman, L., Friedman, J. H., Olshen, R. A., Stone, C. J. (1984) Classification and regression trees, California: Wadsworth; Breiman, L., Random Forests, Machine Learning, 45 (2001) 5-32; Pepe, M. S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series, 28 (2003); y Duda, R. O., Hart, P. E., Stork, D. G., Pattern Classification, Wiley Interscience, 2ª Edición (2001).

Por consiguiente, la divulgación divulgada en el presente documento se refiere al uso de un valor de corte multivariable optimizado para la combinación subyacente de marcadores biológicos y para discriminar el estado A del estado B, por ejemplo, pacientes que responden o que son sensibles a la adición de bevacizumab a un régimen quimioterapéutico de pacientes que responden mal a la adición de terapia de bevacizumab a un régimen de quimioterapia. En este tipo de análisis, los marcadores ya no son independientes, sino que forman un panel de marcadores o un nivel de expresión combinada.

La presente divulgación, por lo tanto, se refiere a un método para mejorar el efecto del tratamiento de un régimen quimioterapéutico de pacientes que padecen cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico mediante la determinación de los niveles de expresión de dos o más de VEGFA, PLGF y VEGFR2, sumando estos niveles de expresión de tal forma que cada nivel de expresión se multiplica por una función de ponderación (o factor de ponderación). Sorprendentemente, el resultado ("valor", resultado de la operación matemática, o nivel de expresión combinada) se correlaciona con el efecto del tratamiento en pacientes a los que se administra bevacizumab en regímenes quimioterapéuticos combinados de tal forma que los valores por encima de un valor de corte especificado previamente (multivariable) son indicativos de un mejor efecto del tratamiento para el paciente y los valores por debajo de este valor de corte son indicativos de un peor efecto del tratamiento.

La presente divulgación, por consiguiente, se refiere a un método para mejorar el efecto del tratamiento de un régimen quimioterapéutico de pacientes que padecen cáncer, en particular cáncer pancreático metastásico, añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico mediante la determinación de los niveles de expresión de VEGFA y VEGFR2, y sumando estos niveles de expresión de tal forma que cada nivel de expresión se multiplica por una función de ponderación (o factor de ponderación). Sorprendentemente, el resultado ("valor", resultado de la operación matemática, o nivel de expresión combinada) se correlaciona con el efecto del tratamiento en pacientes a los que se administra bevacizumab en regímenes quimioterapéuticos combinados de tal forma que los valores por encima de un valor de corte especificado previamente (multivariable) son indicativos de un mejor efecto del tratamiento para el paciente y los valores por debajo de este valor de corte son indicativos de un peor efecto del tratamiento.

La presente divulgación también se refiere a un método para mejorar el efecto del tratamiento de un régimen quimioterapéutico de pacientes que padecen cáncer, en particular cáncer pancreático metastásico, añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico mediante la determinación de los niveles de expresión de VEGFA y PLGF, y sumando estos niveles de expresión de tal forma que cada nivel de expresión se multiplica por una función de ponderación (o factor de ponderación). Sorprendentemente, el resultado ("valor", resultado de la operación matemática, o nivel de expresión combinada) se correlaciona con el efecto del tratamiento en pacientes a los que se administra bevacizumab en regímenes quimioterapéuticos combinados de tal forma que los valores por encima de un valor de corte especificado previamente (multivariable) son indicativos de un mejor efecto del tratamiento para el paciente y los valores por debajo de este valor de corte son indicativos de un peor efecto del tratamiento.

La presente divulgación se refiere a un método para mejorar el efecto del tratamiento de un régimen quimioterapéutico de pacientes que padecen cáncer, en particular cáncer pancreático metastásico, añadiendo bevacizumab a un régimen quimioterapéutico mediante la determinación de los niveles de expresión de VEGFA, VEGFR2 y PLGF, y sumando estos niveles de expresión de tal forma que cada nivel de expresión se multiplica por una función de ponderación (o factor de ponderación). Sorprendentemente, el resultado ("valor", resultado de la operación matemática, o nivel de expresión combinada) se correlaciona con el efecto del tratamiento en pacientes a los que se administra bevacizumab en regímenes quimioterapéuticos combinados de tal forma que los valores por encima de un valor de corte especificado previamente (multivariable) son indicativos de un mejor efecto del tratamiento para el paciente y los valores por debajo de este valor de corte son indicativos de un peor efecto del tratamiento.

Por ejemplo, tal como se muestra en el ejemplo ilustrativo adjunto, pueden usarse las siguientes ecuaciones para evaluar el nivel de expresión combinada de VEGFA y VEGFR2 o de VEGFA y PLGF cuando el efecto del tratamiento es supervivencia general en pacientes que padecen cáncer pancreático metastásico.

Fórmula equivalente: VEGFA+3,3*VEGFR2. Valor de corte = median o 0 y

10 Fórmula equivalente: 0,19*VEGFA+0,67*PLGF, Valor de corte = median o 4,8

En donde se usa transformación log2 y

Por consiguiente, en el contexto de la invención descrita en el presente documento, y de acuerdo con el ejemplo ilustrativo adjunto, un alto nivel de expresión combinada de VEGFA y VEGFR2 es (fórmula 1 ≥ -0,1) y un bajo nivel de expresión de VEGFA y VEGFR2 es (Fórmula 1 < -0,1), con respecto a la supervivencia general. En el contexto de 20 la invención descrita en el presente documento, y de acuerdo con el ejemplo ilustrativo adjunto, un alto nivel de expresión combinada de VEGFA y PLGF es (fórmula 2 ≥ -0,042) y un bajo nivel de expresión de VEGFA y PLGF es (Fórmula 2 < -0,042), con respecto a la supervivencia general. El experto en la materia, sin embargo, hay que entender que los niveles de expresión medidos para marcadores de un panel de marcadores (o un nivel de expresión combinada), por ejemplo, para VEGFA y VEGFR2 o VEGFA y PLGF, pueden combinarse

25 matemáticamente y puede correlacionarse el nivel de expresión combinada con la cuestión diagnóstica subyacente de más de un modo. Por consiguiente, niveles de marcador pueden combinarse mediante cualquier método matemático del estado de la técnica.

Tal como también se muestra en el ejemplo ilustrativo adjunto, pueden usarse las siguientes ecuaciones para

30 evaluar el nivel de expresión combinada de VEGFA y VEGFR2 o de VEGFA y PLGF cuando el efecto del tratamiento es supervivencia libre de progresión en pacientes que padecen cáncer pancreático metastásico.

35 Fórmula equivalente: VEGFA+3,3*VEGFR2. Valor de corte = median o 0 y

Fórmula equivalente: 0,19*VEGFA+0,67*PLGF, Valor de corte = median o 4,8

40 En donde se usa transformación log2 y

45 Por consiguiente, en el contexto de la invención descrita en el presente documento, y de acuerdo con el ejemplo ilustrativo adjunto, un alto nivel de expresión combinada de VEGFA y VEGFR2 es (fórmula 1 ≥ -0,1) y un bajo nivel de expresión de VEGFA y VEGFR2 es (Fórmula 1 < -0,1), con respecto a la supervivencia libre de progresión. En el contexto de la invención descrita en el presente documento, y de acuerdo con el ejemplo ilustrativo adjunto, un alto nivel de expresión combinada de VEGFA y PLGF es (fórmula 2 ≥ -0,042) y un bajo nivel de expresión de VEGFA y

50 PLGF es (Fórmula 2 < -0,042), con respecto a la supervivencia libre de progresión. El experto en la materia, sin embargo, hay que entender que los niveles de expresión medidos para marcadores de un panel de marcadores (o un nivel de expresión combinada), por ejemplo, para VEGFA y VEGFR2 o VEGFA y PLGF, pueden combinarse matemáticamente y puede correlacionarse el nivel de expresión combinada con la cuestión diagnóstica subyacente de más de un modo. Por consiguiente, niveles de marcador pueden combinarse mediante cualquier método

55 matemático del estado de la técnica.

Por ejemplo, tal como se muestra en el ejemplo ilustrativo adjunto, puede usarse la siguiente ecuación para evaluar el nivel de expresión combinada de VEGFA, VEFR2 y PLGF cuando el efecto del tratamiento es supervivencia general o supervivencia libre de progresión en pacientes que padecen cáncer pancreático metastásico.

60 3

En donde ln = log en base e Por consiguiente, en el contexto de la invención descrita en el presente documento, y de acuerdo con el ejemplo ilustrativo adjunto, un alto nivel de expresión combinada de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es (fórmula 3 ≥ 0,837) y un bajo nivel de expresión combinada de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es (fórmula 3 < 0,837), con respecto a la supervivencia general. En el contexto de la invención descrita en el presente documento, y de acuerdo con el ejemplo ilustrativo adjunto, un alto nivel de expresión combinada de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es (fórmula 3 ≥ 0,837) y un bajo nivel de expresión combinada de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es (fórmula 3 < 0,837), con respecto a la supervivencia libre de progresión. El experto en la materia, sin embargo, hay que entender que los niveles de expresión medidos para marcadores de un panel de marcadores (o un nivel de expresión combinada), por ejemplo, para VEGFA, VEGFR2 y PLGF, pueden combinarse matemáticamente y puede correlacionarse el nivel de expresión combinada con la cuestión diagnóstica subyacente de más de un modo. Por consiguiente, niveles de marcador pueden combinarse mediante cualquier método matemático del estado de la técnica.

El nivel de expresión de uno o más de los marcadores VEGFA, VEGFR2 y PLGF puede evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica adecuado para la determinación de niveles de proteínas específicas en una muestra de paciente y se determina preferentemente mediante un método de inmunoensayo, tal como ELISA, empleando anticuerpos específicos para uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF. Dichos métodos se conocen bien y se aplican de manera rutinaria en la técnica y existen anticuerpos y/o kits comerciales correspondientes fácilmente disponibles. Por ejemplo, los anticuerpos/kits de ensayo comercialmente disponibles para VEGFA, VEGFR2 y PLGF pueden obtenerse de Bender RELIATech y de R&D Systems como el clon 3C5 y 26503, de R&D Systems como el clon 89115 y 89109 y de Roche Diagnostics GmbH como el clon 2D6D5 y 6A11D2, respectivamente. Preferentemente, los niveles de expresión de las proteínas marcadoras/indicadoras de la invención se evalúan usando los reactivos y/o recomendaciones del protocolo del fabricante del anticuerpo o kit. El experto en la materia también será consciente de medios adicionales para determinar el nivel de expresión de uno o más de VEGFA, VEFR2 y PLGF mediante métodos de inmunoensayo. Por lo tanto, puede determinarse de manera rutinaria y reproducible el nivel de expresión de uno o más de los marcadores/indicadores de la invención por un experto en la materia sin un esfuerzo innecesario. Sin embargo, para asegurar resultados precisos y reproducibles, la invención también abarca el ensayo de muestras de pacientes en un laboratorio especializado que pueda asegurar la validación de los procedimientos de ensayo.

Las proteínas VEGF121 y VEGF110 pueden detectarse usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, pueden ensayarse de manera conveniente muestras de tejidos o células respecto de, por ejemplo, proteínas usando Westerns, ELISA, etc. Hay muchas referencias disponibles para proporcionar orientación respecto de la aplicación de las técnicas anteriores (Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Ámsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Ámsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); y Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs. 147-1 58 (CRC Press, Inc., 1987)).

Si se hace referencia a la detección o al nivel de VEGF121 y VEGF110 esto significa que se mide la suma de ambas moléculas, por ejemplo, usando un ensayo que detecte tanto VEGF121 como VEGF110. Los ensayos que detectan moléculas tanto de VEGF121 como de VEGF110 incluyen, por ejemplo, ensayos que tengan una sensibilidad para la otra forma correspondiente, (es decir, para VEFF121 si se reconoce mejor a VEGF110, o para para VEFF110 si se reconoce mejor a VEGF121, respectivamente) de al menos el 25%. En determinadas realizaciones, los ensayos tienen una sensibilidad para la otra forma correspondiente de al menos el 50%, 75%, 80%, 85%, 90% o superior. En una realización se miden tanto VEGF121 como VEGF110 con esencialmente la misma sensibilidad.

En cuanto a la detección de la proteína de VEGF121 y de VEGF110, hay varios ensayos disponibles. Por ejemplo, puede ponerse en contacto la muestra con un anticuerpo o una combinación de anticuerpos (por ejemplo, en un ensayo en sándwich) que se unen preferencialmente o específicamente a las isoformas cortas de VEGF-A, VEGF121 y VEGF110, respectivamente, en comparación con las isoformas de origen natural más largas de VEGF-A, VEGF165 y VEGF189, respectivamente. Preferentemente, las isoformas cortas se detectan con una sensibilidad al menos 3 veces mayor en comparación con las isoformas más largas. Se reconoce una sensibilidad al menos 3 veces mayor si al establecer una curva patrón usando una isoforma corta (pureza del al menos el 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante DO 280 nm) y para una isoforma larga a una concentración predeterminada (pureza de al menos el 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante DO 280 nm) usando los mismos reactivos y la misma curva patrón, la lectura del valor de las curvas patrón es únicamente una tercera parte

o menor de la concentración esperada. También se prefiere que la sensibilidad para las isoformas cortas sea al menos 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces o 9 veces mayor en comparación con las isoformas largas, especialmente en comparación con VEGF105.

En una realización, se detectan específicamente ambas isoformas cortas, VEGF121 y VEGF110. Dicha detección específica es posible, por ejemplo, si se usan anticuerpos, especialmente anticuerpos monoclonales, que se unan a la secuencia generada uniendo los exones 4 y 8 en VEGF121 o al extremo C-terminal libre de VEGF110, respectivamente. Dicho anticuerpo anti-extremo C-terminal de VEGF110 no se une a cualquier isoforma de VEGFA que comprenda el aminoácido 110 como parte de una cadena polipeptídica más larga o a fragmentos más cortos de

VEGF-A que terminen, por ejemplo, en el aminoácido 109. El anticuerpo monoclonal que se une a la secuencia generada uniendo los exones 4 y 8, respectivamente, en VEGF121 no se unirá a las secuencias de aminoácidos comprendidas en las isoformas más largas de VEGF 165 y 189, respectivamente, ya que están presentes en las mismas otras secuencias de aminoácidos debido a la unión del exón 4 y el exón 7, y del exón 4 y el exón 5, respectivamente (véase: Ferrara, N., Mol. Biol. of the Cell 21 (2010) 687-690). Se reconoce la unión específica en el sentido anterior si el anticuerpo usado muestra menos de un 10% de reactividad cruzada con un fragmento más corto y menos de un 10% de reactividad cruzada con aquellas formas de VEGF-A que no tengan un aminoácido 110 C-terminal libre en el caso del anticuerpo anti-VEGF110, o aquellas isoformas que no comprendan la secuencia generada al unir los exones 4 y 8 en el caso del anticuerpo anti-VEGF121, respectivamente. También se prefiere que la reactividad cruzada sea menor del 5%, 4%, 3%, 2% y 1%, respectivamente, para ambos fragmentos más cortos y que no tengan un aminoácido 110 C-terminal libre o para isoformas de VEGF que no tengan la secuencia generada al unir los exones 4 y 8, respectivamente.

Los anticuerpos específicos adecuados que solo se unan a las isoformas de cortas de VEGF, VEGF121 o VEGF110, respectivamente, pueden obtenerse de acuerdo con procedimientos convencionales. Normalmente se sintetizará un péptido que represente o comprenda en el extremo C-terminal al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos de VEGF110 o un péptido que represente o comprenda al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos que comprendan los aminoácidos C-terminal y N-terminal al aminoácido 115 de VEGF121, respectivamente, opcionalmente acoplado a un vehículo y se usará para inmunización. Pueden obtenerse anticuerpos policlonales específicos mediante etapas de inmunoabsorción adecuadas. Pueden seleccionarse fácilmente anticuerpos monoclonales respecto de su reactividad con VEGF121 o VEGF110, respectivamente, y baja reactividad cruzada adecuada. La baja reactividad cruzada en términos del anticuerpo específico de VEGF110 puede evaluarse tanto para fragmentos más cortos de VEGF110 (por ejemplo, que carecen del aminoácido C-terminal de VEGF110) y para isoformas de VEGF-A que no tengan un aminoácido C-terminal libre de VEGF110. La baja reactividad cruzada en términos del anticuerpo específico de VEGF121 puede evaluarse usando isoformas de VEGF que contengan las secuencias de aminoácidos formadas tras la unión del exón 4 y el exón 7, y del exón 4 y el exón 5, respectivamente.

La proteína o los ácidos nucleicos de VEGF111 pueden detectarse usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, pueden ensayarse de manera conveniente muestras de tejidos o células respecto de, por ejemplo, proteínas usando Westerns, ELISA, ARNm o ADN de un biomarcador genético de interés usando Northern, transferencia por puntos, o análisis por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), hibridación de matrices, ensayo de protección de RNasa, o usando micromatrices de placas de SNP de ADN, que están disponibles comercialmente, incluyendo instantáneas de micromatrices de ADN. Por ejemplo, se conocen bien en la técnica ensayos de PCR en tiempo real (RT-PCR), tales como ensayos de PCR cuantitativa. En una realización ilustrativa de la divulgación, un método para detectar ARNm a partir de un biomarcador genético de interés en una muestra biológica comprende la producción de ADNc de la muestra mediante transcripción inversa usando al menos un cebador; amplificando el ADNc producido; y detectando la presencia del ADNc amplificado. Además, dichos métodos pueden incluir una o más etapas que permitan determinar los niveles de ARNm en una muestra biológica (por ejemplo, examinando simultáneamente los niveles de una secuencia de ARNm de control comparativa de un gen "constitutivo", tal como un miembro de la familia de actina). Opcionalmente, puede determinarse la secuencia del ADNc amplificado.

Hay muchas referencias disponibles para proporcionar orientación respecto de la aplicación de las técnicas anteriores (Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1980); Tijssen,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Ámsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Ámsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); y Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs. 147-1 58 (CRC Press, Inc., 1987).

En cuanto a la detección de la proteína de VEGF111, hay varios ensayos disponibles. Por ejemplo, puede ponerse en contacto la muestra con un anticuerpo o con una combinación de anticuerpos (por ejemplo, en un ensayo en sándwich) que se unan preferencialmente o específicamente a VEGF111 en comparación con las isoformas más largas de origen natural de VEGF-A, VEGF165 y VEGF189, respectivamente. Preferentemente, se detecta la isoforma corta VEGF111 con una sensibilidad al menos 3 veces mayor en comparación con las isoformas más largas. Se reconoce una sensibilidad al menos 3 veces mayor si al establecer una curva patrón usando una isoforma corta (pureza del al menos el 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante DO 280 nm) y para una isoforma larga a una concentración predeterminada (pureza de al menos el 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante DO 280 nm) usando los mismos reactivos y la misma curva patrón, la lectura del valor de las curvas patrón es únicamente una tercera parte o menor de la concentración esperada. También se prefiere que la sensibilidad para las isoformas cortas sea al menos 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces o 9 veces mayor en comparación con las isoformas largas.

En una realización, se detecta específicamente la isoforma VEGF111. Dicha detección específica es posible, por ejemplo, si se usan anticuerpos, especialmente anticuerpos monoclonales que se unen a la unión de exones única para VEGF111. Dicho anticuerpo no se une a otra isoforma de VEGF-A o a productos de escisión de la misma que no comprenda esta unión de exones específica. Se reconoce la unión específica en el sentido anterior si el anticuerpo usado muestra menos de un 10% de reactividad cruzada con otras isoformas de VEGF-A, como VEGF121 o

VEGF165, respectivamente, que no tengan esta unión de exones única. También se prefiere que la reactividad cruzada para por ejemplo VEGF121 sea menor del 5%, 4%, 3%, 2% y 1%, respectivamente.

La especificidad por VEGF111 en una realización se evalúa comparando VEGF111 (pureza de al menos el 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante DO 280 nm) y VEGF121 (pureza de al menos el 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante DO 280 nm) usando los mismos reactivos. Si en esta comparación la señal obtenida para el material de VEGF121 es solo una décima parte o menos de la señal obtenida con el material de VEGF111, la reactividad cruzada por VEGF121 es menor del 10%. Como apreciará el experto en la materia, la señal de VEGF121 se leerá preferentemente a una concentración que rinda aproximadamente el 50% de la señal máxima para VEGF111.

Los anticuerpos específicos adecuados que solo se unen a la isoforma corta de VEGF, VEGF111, pueden obtenerse de acuerdo con procedimientos convencionales. Normalmente se sintetizará un péptido que represente o comprenda los aminoácidos C-terminal y N-terminal al aminoácido 105 de VEGF111, opcionalmente acoplado a un vehículo y se usará para inmunización. Preferentemente, dicho péptido tendrá una longitud de al menos seis aminoácidos y comprenderá al menos los aminoácidos 105 y 106 de VEGF111. También preferentemente comprenderá al menos los aminoácidos 104, 105, 106 y 107 de VEGF111. Como apreciarán los expertos en la material, también pueden usarse péptidos más largos que comprendan, por ejemplo, 3 o más aminoácidos N-y C-terminales a la unión de exones entre los aminoácidos 105 y 106 de VEGF111 para obtener anticuerpos que se unan específicamente a VEGF111.

La proteína de VEGF no modificada puede detectarse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Preferentemente, se usará un anticuerpo que tenga al menos las propiedades de unión preferencial a VEGF no modificado en comparación con VEGF modificado, tal como MAB 3C5, que está comercialmente disponible a través de RELIATech GmbH, Wolfenbüttel, Alemania. Por ejemplo, pueden ensayarse de manera conveniente muestras de tejido o celulares de mamíferos respecto de la proteína VEGF no modificada usando Westerns, ELISA, etc. Hay muchas referencias disponibles para proporcionar orientación respecto de la aplicación de las técnicas anteriores (Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Ámsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Ámsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); y Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs. 147-1 58 (CRC Press, Inc., 1987)).

Si se hace referencia a la detección o al nivel de VEGF no modificado esto significa que se miden moléculas de VEGF no modificadas (isoformas o productos de escisión) como, por ejemplo, unidas a MAB 3C5.

En cuanto a la detección de la proteína de VEGF no modificada, hay varios ensayos disponibles. Por ejemplo, puede ponerse en contacto la muestra con un anticuerpo o una combinación de anticuerpos (por ejemplo, en un ensayo en sándwich) que se unen preferencialmente o específicamente a VEGF no modificado en comparación con VEGF modificado, por ejemplo, tal como sucede de manera natural en una muestra de un paciente. Preferentemente, se detecta VEGF no modificado usando un anticuerpo que se una específicamente a VEGF no modificado, es decir, con un anticuerpo que tenga una sensibilidad al menos 3 veces mayor por VEGF165 no modificado en comparación con VEGF165 modificado. Dicha sensibilidad al menos 3 veces mayor por VEGF no modificado se evalúa comparando VEGF165 producido de manera recombinante en E. coli (pureza de al menos el 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante DO 280 nm) y VEGF165 producido de manera recombinante en células HEK (pureza de al menos el 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante DO 280 nm) usando los mismos reactivos. Si en esta comparación la señal obtenida para el material producido en HEK es solo una tercera parte o menos de la señal obtenida con el material procedente de E. coli, el VEGF no modificado se detecta entonces con una sensibilidad al menos 3 veces mayor. Como apreciará el experto en la materia, la señal se leerá preferentemente a aproximadamente el 50% de la señal máxima. Preferentemente, se usa el ensayo del ejemplo 5 en esta evaluación. También se prefiere que el anticuerpo que se une específicamente a VEGF no modificado (por ejemplo, VEGF165 de E.coli) sea un anticuerpo que detecta a VEGF no modificado con una sensibilidad al menos 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces mayor en comparación con el material de VEGF no modificado (por ejemplo, VEGF165 de células HEK).

En una realización, se detecta específicamente VEGF no modificado usando un anticuerpo que tenga al menos la misma preferencia de unión por VEGF no modificado en comparación con VEGF modificado, tal como el anticuerpo comercialmente disponible MAB 3C5. En una realización, la sensibilidad relativa por o la unión preferencial de un anticuerpo a VEGF no modificado se evalúa en un inmunoensayo en sándwich, en el que se usa el anticuerpo para VEGF no modificado como anticuerpo de captura y se usa un anticuerpo de detección que se une a un epítopo presente en todas las principales isoformas o productos de escisión de VEGF. En una realización, el anticuerpo de detección se unirá a un epítopo fuera del epítopo para MAB 3C5, es decir, no se unirá a un epítopo comprendido en un péptido sintético que abarque los aminoácidos 33 a 43 de VEGF. Preferentemente, el anticuerpo de detección se unirá a un epítopo comprendido en los aminoácidos del 1 al 32, del 44 al 105, hasta los seis últimos aminoácidos de VEGF165 maduro, o a un epítopo conformacional que no solape con el epítopo unido por MAB 3C5. En una realización, el anticuerpo que se une específicamente a VEGF165 no modificado en comparación con VEGF

modificado tiene la propiedad de unirse a un epítopo comprendido en un péptido sintético que abarca los aminoácidos 33 a 43 de VEGF. Los anticuerpos específicos adecuados que se unen específicamente a VEGF no modificado pueden obtenerse de acuerdo con procedimientos convencionales. Normalmente, una isoforma de VEGF producida de manera recombinante en E. coli u obtenida sintéticamente, por ejemplo, mediante síntesis polipeptídica de fase sólida, o un péptido que represente o comprenda un epítopo de VEGF producido de manera recombinante en E. coli u obtenido de manera sintética, por ejemplo, mediante síntesis polipeptídica en fase sólida, se usará como inmunógeno. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse fácilmente de acuerdo con protocolos convencionales y seleccionarse respecto de su reactividad con VEGF no modificado y baja reactividad cruzada con VEGF modificado. Un método de selección conveniente y preferido se basa en el uso de VEGF165 producido de manera recombinante en E. coli (pureza de al menos el 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante DO 280 nm) y de VEGF165 producido de manera recombinante en células HEK (pureza de al menos el 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante DO 280 nm), respectivamente.

El nivel de expresión de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF puede evaluarse en una muestra de un paciente que sea una muestra biológica. La muestra de un paciente puede ser una muestra de sangre, una muestra de suero sanguíneo o una muestra de plasma sanguíneo. En una realización, la muestra es EDTA-plasma. En una realización, la muestra es citrato-plasma. Los métodos para obtener muestras de sangre, muestras de suero sanguíneo y muestras de plasma sanguíneo se conocen bien en la técnica. La muestra de un paciente puede obtenerse del paciente antes de o después de terapia neoadyuvante o antes de o después de terapia adyuvante.

En el contexto de la presente divulgación, se administrará bevacizumab además de o como terapia conjunta o como tratamiento conjunto con uno o más agentes quimioterapéuticos administrados como parte de un régimen de quimioterapia convencional, tal como se conoce en la técnica. Los ejemplos de agentes incluidos en dichos regímenes de quimioterapia convencionales incluyen 5-fluorouracilo, leucovorina, irinotecán, gemcitabina, erlotinib, capecitabina, taxanos, tales como docetaxel y paclitaxel, interferón alfa, vinorelbina, y agentes quimioterapéuticos basados en platino, tales como, carboplatino, cisplatino y oxaliplatino. Tal como se demuestra en el ejemplo ilustrativo adjunto, la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib efectuó un aumento en la supervivencia general y/o supervivencia libre de progresión en los pacientes y/o poblaciones de pacientes definidas y seleccionadas de acuerdo con el nivel de expresión de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF. Por lo tanto, puede combinarse bevacizumab con un régimen quimioterapéutico, tal como terapia de gemcitabina-erlotinib, tal como se demuestra en el ejemplo ilustrativo adjunto.

Los modos de administración comunes incluyen administración parenteral en forma de una dosis en bolo o en forma de una infusión durante un periodo de tiempo determinado, por ejemplo, administración de la dosis diaria total a lo largo de 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 60 min, 75 min, 90 min, 105 min, 120 min, 3 h, 4 h, 5 h o 6 h. Por ejemplo, pueden administrarse de 2,5 mg/kg de peso corporal a 15 mg/kg de peso corporal de bevacizumab (Avastin®) cada semana, cada 2 semanas o cada 3 semanas, dependiendo del tipo de cáncer que se esté tratando. Los ejemplos de dosificaciones incluyen 2,5 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal, 7,5 mg/kg de peso corporal, 10 mg/kg de peso corporal y 15 mg/kg de peso corporal administrados cada semana, cada 2 semanas o cada 3 semanas. Los ejemplos adicionales de dosificaciones son 5 mg/kg de peso corporal cada 2 semanas, 10 mg/kg de peso corporal cada 2 semanas, 7,5 mg/kg de peso corporal cada 3 semanas y 15 mg/kg de peso corporal cada 3 semanas. Para el tratamiento del cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, las dosificaciones incluyen 5 mg/kg de peso corporal cada 2 semanas, 10 mg/kg cada 2 semanas, 7,5 mg/kg de peso corporal cada 3 semanas y 15 mg/kg de peso corporal cada 3 semanas. El experto en la materia reconocerá que los modos de administración adicionales de bevacizumab están abarcados por la divulgación según se determinan para el paciente y régimen quimioterapéutico específicos, y que el modo de administración y la dosificación específicos se determinan mejor por el médico tratante de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Los pacientes seleccionados de acuerdo con los métodos de la presente divulgación se tratan con bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico, y pueden tratarse además con una o más terapias anti-cáncer adicionales. En determinados aspectos, la una o más terapia anti-cáncer adicional es radiación.

La presente divulgación también se refiere a una composición o kit diagnóstico que comprende oligonucleótidos o polipéptidos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF. Tal como se detalla en el presente documento, los oligonucleótidos, tales como sondas de ADN, ARN o de mezclas de ADN y ARN pueden ser útiles para detectar niveles de ARNm de las proteínas marcadoras/indicadoras, mientras que los polipéptidos pueden ser útiles para detectar directamente niveles de proteínas de las proteínas marcadoras/indicadoras mediante interacciones específicas proteína-proteína. En aspectos preferidos de la divulgación, los polipéptidos abarcados como sondas para los niveles de expresión de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF, e incluidos en los kits o composiciones diagnósticas descritas en el presente documento, son anticuerpos específicos para estas proteínas, o específicos para homólogos y/o truncamientos de las mismas.

Por consiguiente, en una realización adicional de la presente divulgación, se proporciona un kit útil para llevar a cabo los métodos descritos en el presente documento, que comprende oligonucleótidos o polipéptidos capaces de determinar el nivel de expresión de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF. Los oligonucleótidos pueden

comprender cebadores y/o sondas específicas para el ARNm que codifica uno o más de los marcadores/indicadores descritos en el presente documento, y los polipéptidos comprenden proteínas capaces de interacción específica con las proteínas marcadoras/indicadoras, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos de marcador/indicador.

Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a bevacizumab para su uso en un régimen quimioterapéutico mejorado para un paciente que padece cáncer pancreático en el que se determina el nivel de expresión de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una muestra de un paciente, mediante el cual a un paciente que tiene un nivel aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a niveles de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático se le administra bevacizumab además del régimen quimioterapéutico.

Los siguientes usos similares pueden aplicarse mutatis mutandis.

La presente divulgación se refiere al uso de bevacizumab para mejorar el efecto del tratamiento de un régimen quimioterapéutico de un paciente que padece cáncer pancreático que comprende las siguientes etapas:

(a): determinar el nivel de expresión de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una muestra de un paciente; y

(b): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a niveles de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

El cáncer pancreático puede ser cáncer pancreático metastásico. El régimen quimioterapéutico puede ser terapia con gemcitabina-erlotinib.

Por consiguiente, la presente divulgación se refiere al uso de bevacizumab para mejorar el efecto del tratamiento de un régimen quimioterapéutico de un paciente que padece cáncer pancreático que comprende las siguientes etapas:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a niveles de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

La presente divulgación se refiere al uso de bevacizumab para mejorar la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático que comprende las siguientes etapas:

(b): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a niveles de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

Por consiguiente, la presente divulgación se refiere al uso de bevacizumab para mejorar la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático que comprende las siguientes etapas:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(c): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a niveles de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

La presente divulgación se refiere al uso de bevacizumab para mejorar la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático que comprende las siguientes etapas:

(a) determinar el nivel de expresión de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una muestra de un paciente; y

(b) administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a niveles de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

Por consiguiente, la presente divulgación se refiere al uso de bevacizumab para mejorar la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático que comprende las siguientes etapas:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(a): determinar el nivel de expresión de VEGFA o VEGFR2 en una muestra de paciente; y

(b): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel aumentado de VEGFA o VEGFR2 en relación a niveles de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de VEGFA o de VEGFR2; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel aumentado de VEGFA o VEGFR2 en relación a niveles de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

(a): determinar el nivel de expresión de VEGFA o PLGF en una muestra de paciente; y

(b): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel aumentado de VEGFA o PLGF en relación a niveles de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de VEGFA o de PLGF; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel aumentado de VEGFA o PLGF en relación a niveles de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático.

La presente divulgación proporciona el uso de bevacizumab para mejorar la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico que comprende las siguientes etapas:

(a): determinar el nivel de expresión de VEGFA y VEGFR2 en una muestra de paciente; y

La presente divulgación se refiere al uso de bevacizumab para mejorar la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico que comprende las siguientes etapas:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de VEGFA y de VEGFR2; y

La divulgación se refiere al uso de bevacizumab para mejorar la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico que comprende las siguientes etapas:

(b): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y VEGFR en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

en el que el régimen quimioterapéutico es terapia de gemcitabina-erlotinib.

Por consiguiente, la presente divulgación se refiere al uso de bevacizumab para la supervivencia general de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico que comprende las siguientes etapas:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de VEGFA y de VEGFR2; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y VEGFR en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

en el que el régimen quimioterapéutico es terapia de gemcitabina-erlotinib.

La presente divulgación proporciona el uso de bevacizumab para mejorar la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico que comprende las siguientes etapas:

La presente divulgación se refiere al uso de bevacizumab para mejorar la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico que comprende las siguientes etapas:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de VEGFA y de VEGFR2; y

La divulgación se refiere al uso de bevacizumab para mejorar la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico que comprende las siguientes etapas:

en el que el régimen quimioterapéutico es terapia de gemcitabina-erlotinib.

Por consiguiente, la presente divulgación se refiere al uso de bevacizumab para la supervivencia libre de progresión de un paciente que padece cáncer pancreático metastásico que comprende las siguientes etapas:

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de VEGFA y de VEGFR2; y

en el que el régimen quimioterapéutico es terapia de gemcitabina-erlotinib.

(a): determinar el nivel de expresión de VEGFA y PLGF en una muestra de paciente; y

(b): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y PLGF en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico.

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de VEGFA y de PLGF; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y PLGF en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico.

(b): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y PLGF en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

en el que el régimen quimioterapéutico es terapia de gemcitabina-erlotinib.

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de VEGFA y de PLGF; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA y PLGF en relación a un nivel de expresión combinado de control en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

en el que el régimen quimioterapéutico es terapia de gemcitabina-erlotinib.

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de VEGFA y de PLGF; y

en el que el régimen quimioterapéutico es terapia de gemcitabina-erlotinib.

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de VEGFA y de PLGF; y

en el que el régimen quimioterapéutico es terapia de gemcitabina-erlotinib.

(a): determinar el nivel de expresión de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una muestra de un paciente; y

(b): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a un nivel de expresión combinado de control determinado en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico.

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de VEGFA, VEGFR2 y PLGF; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a un nivel de expresión combinado de control determinado en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico.

en el que el régimen quimioterapéutico es terapia de gemcitabina-erlotinib.

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de VEGFA, VEGFR2 y PLGF; y

(c): administrar bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente que tiene un nivel de expresión combinada aumentado de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a un nivel de expresión combinado de control determinado en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático metastásico,

en el que el régimen quimioterapéutico es terapia de gemcitabina-erlotinib.

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de VEGFA, VEGFR2 y PLGF; y

en el que el régimen quimioterapéutico es terapia de gemcitabina-erlotinib.

(a): obtener una muestra de dicho paciente;

(b): determinar el nivel de expresión de VEGFA, VEGFR2 y PLGF; y

en el que el régimen quimioterapéutico es terapia de gemcitabina-erlotinib.

Tal como se documenta en el ejemplo ilustrativo adjunto, la presente divulgación resuelve el problema técnico identificado en tanto que pudo demostrarse sorprendentemente que los niveles de expresión de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en un paciente dado, en relación a niveles de control determinados en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, se correlacionan con el efecto del tratamiento en pacientes a los que se les administra bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico de gemcitabina-erlotinib. Tal como se muestra en el ejemplo ilustrativo adjunto, se descubrió sorprendentemente que un nivel de expresión de proteína aumentado de VEGFA o VEGFR2 se correlacionó con la supervivencia general mejorada de pacientes que padecían cáncer pancreático metastásico que se trataron con bevacizumab y régimen quimioterapéutico de gemcitabina-erlotinib en comparación con pacientes tratados con placebo y un régimen quimioterapéutico de gemcitabina-erlotinib (figuras 2 y 3). Se descubrió sorprendentemente que un nivel de expresión de proteína aumentado de VEGFA o PLGF se correlacionó con una supervivencia libre de progresión mejorada de pacientes que padecían cáncer pancreático metastásico que se trataron con bevacizumab y un régimen quimioterapéutico de gemcitabina-erlotinib en comparación con pacientes tratados con placebo y una quimioterapia de gemcitabina-erlotinib (figuras 2 y 4). Además se descubrió sorprendentemente que un nivel de expresión de proteína combinado aumentado de VEGFA y VEGFR2 se correlacionó con la supervivencia general y la supervivencia libre de progresión mejoradas de pacientes que padecían cáncer pancreático metastásico que se trataron con bevacizumab y régimen quimioterapéutico de gemcitabina-erlotinib en comparación con pacientes tratados con placebo y un régimen quimioterapéutico de gemcitabina-erlotinib (figuras 5 y 6). También se descubrió sorprendentemente que un nivel de expresión de proteína combinado aumentado de VEGFA y PLGF se correlacionó con la supervivencia general y la supervivencia libre de progresión mejoradas en pacientes que padecían cáncer pancreático metastásico que se trataron con bevacizumab y régimen quimioterapéutico de gemcitabina-erlotinib en comparación con pacientes tratados con placebo y un régimen quimioterapéutico de gemcitabina-erlotinib (figuras 5 y 6). Además, se descubrió sorprendentemente que un nivel de expresión de proteína combinado aumentado de VEGFA, VEGFR2 y PLGF se correlacionó con la supervivencia general y la supervivencia libre de progresión mejoradas en pacientes que padecían cáncer pancreático metastásico que se trataron con bevacizumab y régimen quimioterapéutico de gemcitabina-erlotinib en comparación con pacientes tratados con placebo y un régimen quimioterapéutico de gemcitabina-erlotinib (figura 7). Estos resultados son particularmente sorprendentes en tanto que estos marcadores individuales y las combinaciones anteriormente descritas de estos marcadores no mostraron correlación con la supervivencia general cuando se analizaron en muestras de plasma sanguíneo del paciente a partir de un estudio que comparaba la terapia de docetaxel más bevacizumab o placebo en pacientes que padecían cáncer de mama negativo a HER-2 localmente avanzado, recurrente o metastásico.

La divulgación, por lo tanto, se refiere a un método in vitro para predecir la respuesta a o la sensibilidad a la adición de bevacizumab a un régimen quimioterapéutico de un paciente que padece, se sospecha que padece o es propenso a padecer cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, que comprende determinar el nivel de expresión, incluyendo niveles de expresión combinada, de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una

muestra de un paciente. Por consiguiente, en el contexto de los métodos descritos en el presente documento, la divulgación proporciona el uso de sondas específicas, incluyendo, por ejemplo, moléculas de unión, tales como anticuerpos y aptámeros, para la preparación de una composición diagnóstica para predecir la respuesta o la sensibilidad a la adición de bevacizumab a un régimen quimioterapéutico de un paciente que padece, se sospecha que padece o es propenso a padecer cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, que comprende determinar el nivel de expresión, incluyendo niveles de expresión combinada, de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una muestra de un paciente.

La divulgación, por lo tanto, proporciona un método in vitro para predecir la respuesta a o la sensibilidad a la adición de bevacizumab a un régimen quimioterapéutico de un paciente que padece, se sospecha que padece, o es propenso a padecer cáncer pancreático metastásico que comprende determinar el nivel de expresión combinada de VEGFA y VEGFR2 en una muestra de paciente. Por consiguiente, en el contexto de los métodos descritos en el presente documento, la divulgación proporciona el uso de sondas específicas, incluyendo, por ejemplo, moléculas de unión, tales como anticuerpos y aptámeros, para la preparación de una composición diagnóstica para predecir la respuesta o la sensibilidad a la adición de bevacizumab a un régimen quimioterapéutico de un paciente que padece, se sospecha que padece o es propenso a padecer cáncer pancreático metastásico que comprende determinar el nivel de expresión combinada de VEGFA y VEGFR2 en una muestra de paciente.

La divulgación proporciona un método in vitro para predecir la respuesta a o la sensibilidad a la adición de bevacizumab a un régimen quimioterapéutico de un paciente que padece, se sospecha que padece, o es propenso a padecer cáncer pancreático metastásico que comprende determinar el nivel de expresión combinada de VEGFA y PLGF en una muestra de paciente. Por consiguiente, en el contexto de los métodos descritos en el presente documento, la divulgación proporciona el uso de sondas específicas, incluyendo, por ejemplo, moléculas de unión, tales como anticuerpos y aptámeros, para la preparación de una composición diagnóstica para predecir la respuesta

o la sensibilidad a la adición de bevacizumab a un régimen quimioterapéutico de un paciente que padece, se sospecha que padece o es propenso a padecer cáncer pancreático metastásico que comprende determinar el nivel de expresión combinada de VEGFA y PLGF en una muestra de paciente.

La divulgación proporciona un método in vitro para predecir la respuesta a o la sensibilidad a la adición de bevacizumab a un régimen quimioterapéutico de un paciente que padece, se sospecha que padece, o es propenso a padecer cáncer pancreático metastásico que comprende determinar el nivel de expresión combinada de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una muestra de un paciente. Por consiguiente, en el contexto de los métodos descritos en el presente documento, la divulgación proporciona el uso de sondas específicas, incluyendo, por ejemplo, moléculas de unión, tales como anticuerpos y aptámeros, para la preparación de una composición diagnóstica para predecir la respuesta o la sensibilidad a la adición de bevacizumab a un régimen quimioterapéutico de un paciente que padece, se sospecha que padece o es propenso a padecer cáncer pancreático metastásico que comprende determinar el nivel de expresión combinada de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una muestra de un paciente.

La expresión "que responde a", en el contexto de la presente invención indica que un sujeto/paciente que padece, se sospecha que parece o es propenso a padecer cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, muestra una respuesta a un régimen quimioterapéutico que comprende la adición de bevacizumab. Un experto en la materia estará fácilmente en posición de determinar si una persona tratada con bevacizumab de acuerdo con los métodos de la invención muestra una respuesta. Por ejemplo, una respuesta puede reflejarse por un padecimiento disminuido a causa del cáncer pancreático metastásico, tal como un crecimiento tumoral disminuido y/o detenido, reducción del tamaño de un tumor, y/o mejora de uno o más de los síntomas del cáncer. Preferentemente, la repuesta puede verse reflejada por índices reducidos o disminuidos de la conversión metastásica del cáncer pancreático, tal como la prevención de la formación de metástasis o una reducción del número o tamaño de las metástasis (véase, por ejemplo, Eisenhauser et al., New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1) Eur. J. Cancer 2009 45: 228-247).

La expresión "sensible a", en el contexto de la presente invención indica que un sujeto/paciente que padece, se sospecha que parece o es propenso a padecer cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, muestra de algún modo una reacción positiva al tratamiento con bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico. La reacción del paciente puede ser menos pronunciada cuando se compara con un paciente "que responde a", tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Por ejemplo, el paciente puede experimentar menos sufrimiento asociado con la enfermedad, aunque no pueda medirse una reducción en el crecimiento tumoral o indicador metastásico, y/o la reacción del paciente al bevacizumab en combinación con el régimen quimioterapéutico puede ser solo de naturaleza transitoria, es decir, el crecimiento de tumores y/o metástasis puede solo reducirse o detenerse temporalmente.

La expresión "un paciente que padece", de acuerdo con la invención, se refiere a un paciente que muestra signos clínicos de cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico. Las expresiones "se sospecha que padece", "es susceptible a", "propenso a padecer" o "es propenso a", en el contexto del cáncer pancreático metastásico, se refiere a una indicación de enfermedad en un paciente basándose en, por ejemplo, una posible predisposición genética, una exposición previa o eventual a compuestos peligrosos o carcinogénicos, o exposición a riesgos físicos carcinogénicos, tales como radiación.

La expresión "efecto de tratamiento de un régimen quimioterapéutico", en el contexto de la presente invención, abarca las expresiones "supervivencia general" y "supervivencia libre de progresión". La expresión "supervivencia general", en el contexto de la presente invención, se refiere a la duración de tiempo de supervivencia del paciente durante y después del tratamiento. Como apreciará un experto en la materia, se mejora o potencia la supervivencia general de un paciente si el paciente pertenece a un subgrupo de pacientes que tiene un tiempo de supervivencia media más largo de manera estadísticamente significativa en comparación con otro subgrupo de pacientes.

La expresión "supervivencia libre de progresión", en el contexto de la presente invención, se refiere a la duración de tiempo durante y después del tratamiento que, de acuerdo con la evaluación del médico o investigador tratante, la enfermedad no empeora, es decir, no progresa. Como apreciará un experto en la materia, se mejora o potencia la supervivencia libre de progresión de un paciente si el paciente experimenta una mayor duración de tiempo durante la cual la enfermedad no progresa en comparación con el tiempo de supervivencia libre de progresión medio o promedio de un grupo de control de pacientes en una situación similar.

Los términos "administración" o "administrar", tal como se usan en el presente documento, significan la administración de un inhibidor de la angiogénesis, por ejemplo, bevacizumab (Avastin®), y/o una composición farmacéutica/régimen de tratamiento que comprende un inhibidor de la angiogénesis, por ejemplo, bevacizumab (Avastin®), a un paciente que necesite dicho tratamiento o intervención médica por cualquier medio adecuado conocido en la técnica para la administración de un anticuerpo terapéutico. Las rutas de administración no limitantes incluyen administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal

o intrabronquial (por ejemplo, efectuada por inhalación). Se prefiere particularmente en el contexto de esta divulgación la administración parenteral, por ejemplo, administración intravenosa.

El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en su sentido más amplio e incluye, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos quiméricos, anticuerpos con CDR injertadas, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, anticuerpos monocatenarios y fragmentos de anticuerpo y construcciones de fragmentos, por ejemplo, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos Fv monocatenarios (scFv), scFv biespecíficos, diacuerpos, anticuerpos de un solo dominio (dAb) y minicuerpos, que muestran la actividad biológica deseada, en particular, unión específica a uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF, o a homólogos, variantes, fragmentos y/o isoformas de los mismos.

El término "aptámero" se usa en el presente documento en su sentido más amplio e incluye, pero sin limitación, oligonucleótidos, incluyendo moléculas de ARN, ADN y ARN/ADN, o moléculas peptídicas, que muestran la actividad biológica deseada, en particular, unión específica a uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF, o a homólogos, variantes, fragmentos y/o isoformas de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, "régimen quimioterapéutico" o "agente quimioterapéutico" incluye cualquier agente activo que pueda proporcionar un efecto terapéutico anticáncer y puede ser un agente químico o un agente biológico, en particular, que es capaz de interferir con las células cancerosas o tumorales. Los agentes activos preferidos son aquellos que actúan como agentes antineoplásicos (quimiotóxicos o quimioestáticos) que inhiben o previenen el desarrollo, maduración o proliferación de células malignas. Los ejemplos no limitantes de un régimen quimioterapéutico o de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, tales como mostazas de nitrógeno (por ejemplo, mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalano y clorambucilo), nitrosoureas (por ejemplo, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), y semustina (metil-CCNU)), etileniminas/metilmelaminas (por ejemplo, trietilenmelamina (TEM), trietileno, tiofosforamida (tiotepa), hexametilmelamina (HMM, altretamina)), sulfonatos de alquilo (por ejemplo, busulfán) y triazinas (por ejemplo, dacarbazina (DTIC)); antimetabolitos, tales como análogos del ácido fólico (por ejemplo, metotrexato, trimetrexato), análogos de pirimidina (por ejemplo, 5fluorouracilo, capecitabina, fluorodesoxiuridina, gemcitabina, arabinósido de citosina (AraC, citarabina), 5-azacitidina, 2,2'-difluorodesoxicitidina), y análogos de purina (por ejemplo, 6-mercaptopurina, 2-tioguanina, azatioprina, 2'desoxicoformicina (pentostatina), eritrohidroxinoniladenina (EHNA), fosfato de fludarabina, y 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA)); fármacos antimitóticos desarrollados a partir de productos naturales (por ejemplo, paclitaxel, alcaloides de la vinca (por ejemplo, vinblastina (VLB), vincristina, y vinorelbina), docetaxel, estramustina, y fosfato de estramustina), epipodofilotoxinas (por ejemplo, etopósido, tenipósido), antibióticos (por ejemplo, actinomicina D, daunomicina (rubidomicina), daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, mitoxantrona, idarrubicina, bleomicinas, plicamicina (mitramicina), mitomicina C, actinomicina), enzimas (por ejemplo, L-asparaginasa), y modificadores de la respuesta biológica (por ejemplo, interferón alfa, IL-2, G-CSF, GM-CSF); agentes misceláneos, incluyendo complejos de coordinación de platino (por ejemplo, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino), antracenodionas (por ejemplo, mitoxantrona), urea sustituida (es decir, hidroxiurea), derivados de metilhidrazina (por ejemplo, N-metilhidrazina (MIH), procarbazina), supresores adrenocorticales (por ejemplo, mitotano (o,p'-DDD), aminoglutetimida); hormonas y antagonistas incluyendo antagonistas adrenocorticoides (por ejemplo, prednisona y equivalentes, dexametasona, aminoglutetimida), progestinas (por ejemplo, caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol), estrógenos (por ejemplo, dietilestilbestrol, etinil estradiol y equivalentes de los mismos); antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno), andrógenos (por ejemplo, propionato de progesterona, fluoximesterona y equivalentes de los mismos), antiandrógenos (por ejemplo, flutamida, análogos de la hormona liberadora de

gonadotropina, leuprolida), antiandrógenos no esteroideos (por ejemplo, flutamida), inhibidores de factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, erlotinib, lapatinib, gefitinib), anticuerpos (por ejemplo, trastuzumab), irinotecán y otros agentes, tales como leucovorina. Para el tratamiento del cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, los agentes quimioterapéuticos o regímenes quimioterapéuticos para su administración con bevacizumab incluyen gemcitabina y erlotinib y combinaciones de los mismos (véase también el ejemplo ilustrativo adjunto proporcionado en el presente documento).

En el contexto de la presente divulgación, "homología", con referencia a una secuencia de aminoácidos se entiende como una identidad de secuencia de al menos el 80%, particularmente una identidad de al menos el 85%, al menos el 90% o al menos el 95% sobre la longitud completa de la secuencia tal como se define por las SEC ID Nº proporcionadas en el presente documento. En el contexto de la presente divulgación, un experto en la materia entenderá que la homología abarca variaciones alélicas adicionales de las proteínas marcadoras/indicadoras en diferentes poblaciones de grupos étnicos.

Tal como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" se refiere a un péptido, una proteína, un oligopéptido o un polipéptido que abarca cadenas de aminoácidos de una longitud dada, en el que los restos de aminoácidos se unen mediante enlaces peptídicos covalentes. Sin embargo, los peptidomiméticos de dichas proteínas/polipéptidos, en los que se han sustituido aminoácidos y/o enlaces peptídicos por análogos funcionales, también están abarcados por la divulgación, por ejemplo, un resto de aminoácido distinto de uno de los 20 aminoácidos codificados por genes, por ejemplo, selenocisteína. Los péptidos, polipéptidos y proteínas pueden denominarse polipéptidos. Los términos polipéptido y proteína se usan de manera intercambiable en el presente documento. El término polipéptido también se refiere a, y no excluye, modificaciones del polipéptido, por ejemplo, glucosilación, acetilación, fosforilación y similares. Dichas modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en la voluminosa bibliografía de investigación. El término polipéptido también se refiere a y abarca el término "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento.

Los términos"tratar" y "tratamiento", tal como se usan en el presente documento, se refieren a la curación, mejora, aminoración de la gravedad, o reducción en el lapso de tiempo de la enfermedad o cualquier parámetro o síntoma de la misma. Preferentemente, dicho paciente es un paciente humano y la enfermedad que va a tratarse es cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico.

Los términos "evaluar" o "evaluación" de dicho paciente se refieren a métodos para determinar los niveles de expresión de una o más de las proteínas marcadoras/indicadoras descritas en el presente documento, incluyendo VEGFA, VEGFR2 y PLGF, y/o para seleccionar a dichos pacientes basándose en los niveles de expresión de dichas proteínas marcadoras/indicadoras en relación a niveles de control establecidos en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico.

La expresión "nivel de expresión", tal como se usa en el presente documento, también puede referirse a la concentración o cantidad de proteínas marcadoras/indicadoras de la presente divulgación en una muestra.

Además de los métodos descritos anteriormente, la divulgación también abarca métodos de inmunoensayo adicionales para evaluar o determinar el nivel de expresión de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF, tal como mediante transferencia de Western y detección basada en ELISA. Tal como se entiende en la técnica, el nivel de expresión de las proteínas marcadoras/indicadoras de la divulgación también puede evaluarse a nivel de ARNm mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, tal como transferencia de Northern, PCR en tiempo real, y RT-PCR. Los métodos y sistemas de detección basados en inmunoensayo y ARNm se conocen bien en la técnica y pueden deducirse a partir de libros de texto convencionales, tales como Lottspeich (Bioanalytik, Spektrum Akademisher Verlag, 1998) o Sambrook y Russell (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, EE.UU., 2001). Los métodos descritos son particularmente útiles para determinar los niveles de expresión de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en un paciente o grupo de pacientes en relación a niveles de control establecidos en una población diagnosticada con cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico.

El nivel de expresión de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF, también puede determinarse a nivel de proteína aprovechando la inmunoaglutinación, inmunoprecipitación (por ejemplo, inmuodifusión, inmunoelectroforesis, fijación inmune), técnicas de transferencia de Western (por ejemplo, inmunocitoquímica (in situ), cromatografía de afinidad, inmunoensayos enzimáticos), y similares. Las cantidades de polipéptido purificado en solución también pueden determinarse mediante métodos físicos, por ejemplo, fotometría. Los métodos para cuantificar un polipéptido particular en una mezcla se basan normalmente en la unión específica, por ejemplo, de anticuerpos. Los métodos de detección y cuantificación específicos que explotan la especificidad de los anticuerpos comprenden, por ejemplo, métodos de inmunoensayo. Por ejemplo, puede determinarse la concentración/cantidad de proteínas marcadoras/indicadoras de la presente divulgación en una muestra de un paciente mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Como alternativa, pueden llevarse a cabo análisis de transferencia de Western o inmunotinción. La transferencia de Western combina la separación de una mezcla de proteínas mediante electroforesis y la detección específica con anticuerpos. La electroforesis puede ser multidimensional, tal como electroforesis en 2D. Generalmente, los polipéptidos se separan en electroforesis en 2D según su peso molecular aparente a lo largo de una dimensión y según su punto isoeléctrico a lo largo de la otra dirección.

Tal como se ha mencionado anteriormente, el nivel de expresión de las proteínas marcadoras/indicadoras de acuerdo con la presente divulgación también puede reflejarse en una expresión aumentada de los genes que codifican VEGFA, VEGFR2 y/o PLGF. Por lo tanto, puede llevarse a cabo una evaluación cuantitativa del producto génico antes de su traducción (por ejemplo, ARNm cortado y empalmado, no cortado y empalmado o parcialmente cortado y empalmado) para evaluar la expresión de los genes correspondientes. El experto en la materia es consciente de los métodos convencionales que pueden usarse en este contexto o puede deducir estos métodos a partir de libros de texto convencionales (por ejemplo, Sambrook, 2001, anteriormente citado). Por ejemplo, pueden obtenerse datos cuantitativos acerca de las concentraciones/cantidades respectivas de ARNm que codifica uno o más de VEGFA, VEGFR2 y/o PLGF mediante transferencia de Northern, PCR en tiempo real y similares.

En un aspecto adicional de la divulgación, el kit de la divulgación puede usarse ventajosamente para llevar a cabo un método de la divulgación y puede, entre otras cosas, emplearse en una diversidad de aplicaciones, por ejemplo, en el campo diagnóstico o como herramienta de investigación. Las piezas del kit de la divulgación pueden empaquetarse individualmente en viales o en combinación en contenedores o unidades multicontenedor. La fabricación del kit sigue preferentemente procedimientos convencionales que se conocen por los expertos en la materia. El kit o las composiciones diagnósticas pueden usarse para la detección del nivel de expresión de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF de acuerdo con los métodos de la divulgación descritos en el presente documento, empleando, por ejemplo, técnicas inmunohistoquímicas, tal como se describen en el presente documento.

Aunque se ejemplifica usando bevacizumab, la divulgación abarca el uso de otros inhibidores de la angiogénesis tal como se conocen en la técnica, para su uso en combinación con regímenes quimioterapéuticos convencionales. La expresión "inhibidor de la angiogénesis", tal como se usa en el presente documento, se refiere a todos los agentes que alteran la angiogénesis (es decir, el proceso de formación de vasos sanguíneos) e incluye agentes que bloquean la formación y/o detienen o frenan el crecimiento de vasos sanguíneos. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de la angiogénesis incluyen, además de bevacizumab, pegaptanib, sunitinib, sorafenib y vatalanib. Preferentemente, el inhibidor de la angiogénesis para su uso de acuerdo con los métodos de la presente invención es bevacizumab. Tal como se usa en el presente documento, el término "bevacizumab" abarca todos los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de anticuerpo anti-VEGF correspondientes, que cumplan con los requisitos necesarios para obtener una autorización de comercialización como un producto idéntico o biosimilar en un país o territorio seleccionado entre el grupo de países que consisten en EE.UU., Europa y Japón.

Para su uso en los métodos de detección descritos en el presente documento, el experto en la materia tiene la capacidad de etiquetar los polipéptidos, por ejemplo, los anticuerpos u oligonucleótidos abarcados por la presente divulgación. Tal como se efectúa de manera rutinaria en la técnica, pueden etiquetarse las sondas de hibridación para su uso en la detección de los niveles de ARNm y/o los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo para su uso en los métodos de inmunoensayo y visualizarse de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la técnica, incluyendo los ejemplos no limitantes de sistemas usados de manera común el uso de radioetiquetas, etiquetas enzimáticas, etiquetas fluorescentes, complejos de biotina-avidina, quimioluminiscencia, y similares.

El experto en la materia, por ejemplo el médico tratante, se encuentra fácilmente en la posición de administrar el bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico al paciente/grupo de pacientes tal como se seleccionan y definen en el presente documento. En determinados contextos, el médico tratante puede modificar, cambiar o enmendar las pautas de administración de bevacizumab y del régimen quimioterapéutico de acuerdo con su experiencia profesional. Por lo tanto, en determinados aspectos de la presente divulgación, se proporciona un método para el tratamiento o mejora de la supervivencia general y/o supervivencia libre de progresión de un paciente que padece o que se sospecha que padece cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, con bevacizumab en combinación con un régimen quimioterapéutico, mediante dicho paciente/grupo de pacientes se caracteriza en la evaluación de una muestra biológica del paciente (en particular, una muestra de plasma sanguíneo), mostrando dicha muestra un nivel de expresión aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a niveles de control establecidos en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico. La presente divulgación también proporciona el uso de bevacizumab en la preparación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de un paciente que padece o que se sospecha que padece cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico, en el que los pacientes se seleccionan o caracterizan por el estado de la proteína marcadora/indicadora divulgada en el presente documento (es decir, uno o más de un nivel de expresión aumentado de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a niveles de control establecidos en pacientes diagnosticados con cáncer pancreático, en particular cáncer pancreático metastásico.

Las figuras muestran:

Figura 1: Curvas de Kaplan Meier para la supervivencia general (figura 1A) y para la supervivencia libre de progresión (figura 1B) para bevacizumab más terapia de gemcitabina-erlotinib frente a placebo de control más terapia de gemcitabina-erlotinib para pacientes que se estén tratando de cáncer pancreático metastásico. En las figuras, la línea continua representa el tratamiento de bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento de placebo/gemcitabina-erlotinib.

Figura 2: Curvas de Kaplan Meier para la asociación con el efecto de tratamiento en la supervivencia general para el marcador VEGFA (figura 2A) y para la asociación con el efecto de tratamiento en la supervivencia libre de progresión para el marcador VEGFA (figura 2B), para niveles de expresión tanto altos (≥ 152,9 pg/ml) como bajos (< 152,9 pg/ml), para terapia de bevacizumab más gemcitabina-erlotinib frente a la terapia de control de placebo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que se estén tratando de cáncer pancreático metastásico. En las figuras, la línea continua representa el tratamiento de bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento de placebo/gemcitabina-erlotinib.

Figura 3: Curvas de Kaplan Meier para la asociación con el efecto de tratamiento en la supervivencia general para el marcador VEGFR2, para niveles de expresión tanto altos (≥ 9,9 ng/ml) como bajos (< 9,9 ng/ml), para terapia de bevacizumab más gemcitabina-erlotinib frente a la terapia de control de placebo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que se estén tratando de cáncer pancreático metastásico. En las figuras, la línea continua representa el tratamiento de bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento de placebo/gemcitabina-erlotinib.

Figura 4: Curvas de Kaplan Meier para la asociación con el efecto de tratamiento en la supervivencia libre de progresión para el marcador PLGF, para niveles de expresión tanto altos (≥ 36,5 pg/ml) como bajos (< 36,5 pg/ml) optimizados, para terapia de bevacizumab más gemcitabina-erlotinib frente a la terapia de control de placebo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que se estén tratando de cáncer pancreático metastásico. En las figuras, la línea continua representa el tratamiento de bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento de placebo/gemcitabina-erlotinib.

Figura 5: Curvas de Kaplan Meier para la asociación con el efecto de tratamiento en la supervivencia general para los marcadores VEGFA y VEGFR2 (figura 5A), o como nivel de expresión combinada para niveles de expresión tanto altos (fórmula 1 ≥ -0,1) y bajos (fórmula 1 < -0,1), y VEGFA y PLGF (figura 5B), o como nivel de expresión combinada para niveles de expresión tanto altos (fórmula 2 ≥ -0,042) y bajos (fórmula 2 < -0,042), para terapia de bevacizumab más gemcitabina-erlotinib frente a la terapia de control de placebo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que se estén tratando de cáncer pancreático metastásico. En las figuras, la línea continua representa el tratamiento de bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento de placebo/gemcitabina-erlotinib.

Figura 6: Curvas de Kaplan Meier para la asociación con el efecto de tratamiento en la supervivencia libre de progresión para los marcadores VEGFA y VEGFR2 (figura 6A), o como nivel de expresión combinada para niveles de expresión tanto altos (fórmula 1 ≥ -0,1) y bajos (fórmula 1 < -0,1), y VEGFA y PLGF (figura 6B), o como nivel de expresión combinada para niveles de expresión tanto altos (fórmula 2 ≥ -0,042) y bajos (fórmula 2 < -0,042), para terapia de bevacizumab más gemcitabina-erlotinib frente a la terapia de control de placebo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que se estén tratando de cáncer pancreático metastásico. En las figuras, la línea continua representa el tratamiento de bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento de placebo/gemcitabina-erlotinib.

Figura 7: Curva de Kaplan Meier para la asociación con el efecto de tratamiento con la supervivencia general para los marcadores VEGFA, VEFR2 y PLGF (figura 7A), o como nivel de expresión combinada para niveles de expresión tanto altos (fórmula 3 ≥ 0,837) y bajos (fórmula 3 < 0,837), y para la asociación con el efecto de tratamiento en la supervivencia libre de progresión para los marcadores VEGFA, VEFR2 y PLGF (figura 7B), o como nivel de expresión combinada para niveles de expresión tanto altos (fórmula 3 ≥ 0,837) y bajos (fórmula 3 < 0,837), para terapia de bevacizumab más gemcitabina-erlotinib frente a la terapia de control de placebo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que se estén tratando de cáncer pancreático metastásico. En la figura, la línea continua representa el tratamiento de bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento de placebo/gemcitabina-erlotinib.

Figura 8: SEC ID Nº: 1, Secuencia de aminoácidos ejemplar de VEGFA.

Figura 9: SEC ID Nº: 2, Secuencia de aminoácidos ejemplar de VEGFR2.

Figura 10: SEC ID Nº: 3, Secuencia de aminoácidos ejemplar de PLGF.

Figura 11: Medidas del aumento de las concentraciones de VEGF111, VEGF121, VEGF165 y VEGF189 medidas en una microplaca IMPACT.

Figura 12: Medidas del aumento de las concentraciones de VEGF110, VEGF121, y VEGF165 medidas usando el ensayo Elecsys® en el analizador automatizado Elecsys®.

Figura 13: Datos de muestras de EDTA y de citrato de los mismos pacientes medidas dos veces con el ensayo IMPACT. La concentración de VEGFA es aproximadamente un 40% mayor para EDTA-plasma que para citrato con una correlación de Spearman para el método de comparación de EDTA-citrato de aproximadamente 0,8.

Figura 14: Muestra los recuentos (señal de ECL) medidos cuando aumentaban las concentraciones de VEGF165, producido de manera recombinante en E. coli o en células HEK, respectivamente, medidos en el analizador automatizado Elecsys®.

La presente invención se ilustra además por el siguiente ejemplo ilustrativo no limitante.

EJEMPLO 1

Se asignaron al azar pacientes con adenocarcinoma pancreático metastásico a gemcitabina-erlotinib más bevacizumab (n = 306) o placebo (n = 301).

Se recogieron muestras de plasma sanguíneo de los pacientes que participaban en un estudio de fase III aleatorizado comparando los resultados de añadir bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib para el tratamiento del cáncer pancreático metastásico (el estudio BO17706, véase la figura 1, véase también Van Cutsem, J Clin. Oncol. 2009 27:2231-2237). Se asignaron al azar pacientes con adenocarcinoma pancreático metastásico a gemcitabina-erlotinib más bevacizumab (n = 306) o placebo (n = 301). Los pacientes con adenocarcinoma pancreático metastásico se asignaron al azar para recibir gemcitabina (1.000 mg/m2/semana), erlotinib (100 mg/día), y bevacizumab (5 mg/kg cada 2 semanas) o gemcitabina, erlotinib, y placebo.

Una investigación del estado de los biomarcadores relacionados con la angiogénesis y la tumorigénesis reveló que los niveles de expresión de los tres biomarcadores en relación a niveles de control determinados en los biomarcadores de la población completa de pacientes se correlacionó con un parámetro del tratamiento mejorado. En particular, los pacientes que mostraban un mayor nivel de expresión de VEGFA en relación a los niveles de control determinados en el nivel de biomarcador de la población completa de pacientes, demostraron una supervivencia general prolongada y una supervivencia libre de progresión prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib. Los pacientes que mostraban un mayor nivel de expresión de VEGFR2 en relación a los niveles de control determinados en el nivel de biomarcador de la población completa de pacientes, demostraron una supervivencia general prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib. Los pacientes que mostraban un mayor nivel de expresión de PLGF en relación a los niveles de control determinados en el nivel de biomarcador de la población completa de pacientes, demostraron una supervivencia libre de progresión prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabinaerlotinib. También los pacientes que mostraban un nivel de expresión combinada mayor de VEGFA y VEGFR2 en relación a niveles de control determinados en el biomarcador de la población completa de pacientes, demostraron una supervivencia general prolongada y una supervivencia libre de progresión prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib. Además, los pacientes que mostraban un nivel de expresión combinada mayor de VEGFA y PLGF en relación a niveles de control determinados en la población completa de pacientes, demostraron una supervivencia general prolongada y una supervivencia libre de progresión prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib. Los pacientes que mostraban un nivel de expresión combinada mayor de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a los niveles de control determinados en la población completa de pacientes, demostraron una supervivencia general prolongada y una supervivencia libre de progresión prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib.

Pacientes y métodos inmunoquímicos

Un total de 607 pacientes participaron en el estudio BO17706, y hubo disponibles muestras de plasma sanguíneo de 224 de los participantes para el análisis de biomarcadores. Las características basales de los 224 en el análisis de biomarcadores se proporcionan en la tabla 1.

Tabla 1. Características basales: población de biomarcadores (n = 224)

bevacizumab: placebo

N: (%) N (%)

Sexo

Femenino: 45 38,46 32 29,91

Masculino: 72 61,54 75 70,09

Rango de edad (años)

<65: 73 62,39 71 66,36

> = 65: 44 37,61 36 33,64

KPS (%) Categoría inicial

<80%: 15 12,82 13 12,15

>=80%: 102 87,18 94 87,85

VAS Categoría inicial

bevacizumab: placebo

N: (%) N (%)

menor al inicial (no disponible): 10 8,55 16 14,95

<20: 68 58,12 56 52,34

>=20: 39 33,33 35 32,71

CRP Categoría (valor mediano) inicial (mg/dl)

menor al inicial (no disponible): 13 11,11 9 8,41

<=1,4: 52 44,44 49 45,79

>1,4: 52 44,44 49 45,79

VAS: Escala análoga visual del dolor KPS: Puntuación de rendimiento de Karnofsky

Análisis del plasma sanguíneo

Se recogieron muestras de plasma tras la asignación al azar y antes de que se administrase cualquier tratamiento 5 del estudio a los pacientes se midieron VEGFA, receptor 1 de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR1), VEGFR2, PLGF y E-SELECTINA usando un ensayo ELISA multicanal (IMPACT) de Roche Diagnostics GmbH.

Tecnología de ensayo multicanal IMPACT

10 Roche Professionar Diagnostics (Roche Diagnostics GmbH) ha desarrollado una plataforma multimarcador con el nombre comercial IMPACT (tecnología de chip inmunológico multiparámetro, del inglés Immunological MultiParameter Chip Technology). La tecnología se basa en un pequeño chip de poliestirerno fabricado según los procedimientos divulgados en los documentos EP 0939319 y EP 1610129. La superficie del chip se recubrió con una capa de estreptavidina, sobre la cual se depositaron los anticuerpos biotinilados para cada ensayo. Para cada

15 marcador, se cargaron depósitos de anticuerpos en una línea vertical sobre el chip. Durante el ensayo, se sondó la matriz con especímenes de muestras que contenían los analitos específicos.

El volumen de plasma necesario por cada espécimen para medir todos los marcadores en un chip fue de 8 μl, que se aplicó junto con 32 μl de un tampón de incubación (HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM, Thesit al 0,1 %, 20 albúmina de suero bovino al 0,5% y Oxy-PYRION al 0,1% como agente conservante). Después de incubar durante 12 minutos y lavar el chip usando un tampón de lavado (Tris 5 mM, pH 7,9, Thesit al 0,01% y Oxy-PYRION al 0,001%) se añadió la mezcla de anticuerpo monoclonal digoxigenilado (40 μl de tampón de incubación que incluía una mezcla de los anticuerpos específicos de analito marcados con digoxigenina) y se incubó durante 6 minutos adicionales para que se uniesen a los analitos capturados. El segundo anticuerpo se detectó finalmente con 40 μl de 25 un tampón de reactivo (TAPS 62,5 mM, pH 8,7, NaCl 1,25 M, albúmina de suero bovino al 0,5%, Tween 20 al 0,063% y Oxy-PYRION al 0,1%) que incluía un conjugado de anticuerpo anti-digoxigenina acoplado a látex fluorescente. Usando esta etiqueta, se pudo detectar 10 eventos de unión independientes en un solo depósito, dando como resultado una sensibilidad muy alta a una concentración del orden de fmol/l. Los chips se transportaron a la unidad de detección, y una cámara de dispositivo acoplado a carga (CCD) generó una imagen que se 30 transformó en intensidades de señal usando un programa informático dedicado. Los depósitos individuales se localizaron automáticamente en posiciones predeterminadas y se cuantificaron mediante análisis de imagen. Para cada marcador, se cargaron líneas de 10-12 depósitos sobre los chips, y se necesitó un mínimo de 5 depósitos para determinar la concentración media de las muestras. Las ventajas de la tecnología son la capacidad para multiplexar hasta 10 parámetros en un formato de sándwich o competitivo. Las muestras de calibración y de paciente se

35 midieron por duplicado. Se diseñó una ejecución para que contuviese un total de 100 determinaciones, incluyendo 2 controles múltiples como control de ejecución. Ya que algunos de los analitos seleccionados reaccionan entre sí (es decir, VEGFA y PLGF con VEGFR1 o VEGFR2 o VGFA forma heterodímeros con PLGF), se dividieron los 5 analitos en tres chips diferentes del modo siguiente:

40 Chip 1: VEGFA Chip 2: VEGFR1, VEGFR2, E-selectina Chip 3: PLGF

Se usaron los siguientes anticuerpos para los diferentes ensayos: 45

Analito: Anticuerpo de captura Fabricante Anticuerpo de detección Fabricante

VEGFA: <VEGF-A>M-3C5 Bender RELIATech <VEGF>M-26503 R&D Systems

VEGFR1: <VEGF-R1>M-49560 Roche Diagnostics <VEGF-R1>M-49543 Roche Diagnostics

VEGFR2: <VEGF-R2>M-89115 R&D Systems <VEGF-R2>M-89109 R&D Systems

E-selectina: <E-Selectin>M-BBIG-E5 R&D Systems <E-Selectin>M-5D11 R&D Systems

PLGF: <PLGF>M-2D6D5 Roche Diagnostics <PLGF>M-6A11D2 Roche Diagnostics

Análisis estadístico

Se usó la mediana de la muestra para dicotomizar los valores de marcadores como bajos (por debajo de la mediana) 5 o algos (por encima de la mediana).

Se estimó la proporción de riesgo del efecto de tratamiento en un subgrupo de pacientes con niveles de biomarcador altos o bajos mediante un análisis de regresión de Cox de riesgo proporcional.

10 Además, las regresiones de Cox de riesgo proporcional se usaron para evaluar la asociación entre el nivel de biomarcador y el efecto de tratamiento. El modelo incluyó las siguientes covariables: ensayo de tratamiento, nivel de biomarcador, término de interacción del tratamiento por nivel de biomarcador. Se usó la prueba de Wald para el término de interacción para determinar la asociación entre nivel de biomarcador y efecto de tratamiento. Un valor de P menor de 0,05 se consideró como significativo.

15 Resultados

Marcadores de plasma sanguíneo

20 Las estadísticas descriptivas basales de los biomarcadores se representan en la tabla 2.

Tabla 2: Estadísticas descriptivas de valores de biomarcadores (basales)

VEGFA (pg/ml) basal: VEGFR2 (ng/ml) basal PLGF (pg/ml) basal

min: 3,06 0,23 0

cu 25%: 80,08 7,9 32,9

mediana: 152,80 9,9 37,8

cu 75%: 275,90 12,6 43,6

máx: 2127,00 58,1 142,3

media: 215,30 10,4 39,4

de: 254,8 4,7 12,5

La tabla 3 representa el análisis de una variable de la asociación de los biomarcadores seleccionados con el efecto 25 de tratamiento en la supervivencia general.

Tabla 3: Asociación con el efecto de tratamiento en la supervivencia general (análisis de una variable)

HR (IC del 95%): Valor de P para la interacción

VEGFA bajo: 1,018 (0,69, 1,5). 0,0308

VEGFA alto: 0,558 (0,37, 0,83)

VEGFR2 bajo: 1,057 (0,72, 1,55) 0,0461

VEGFR2 alto: 0,583 (0,39, 0,87)

PLGF bajo: 1,048 (0,67, 1,63). 0,089

PLGF alto: 0,659 (0,46, 0,95).

En este análisis, se emplearon para VEGFA, bajo VEGFA < 152,9 pg/ml y alto VEGFA ≥ 152,9 pg/ml, para VEGFR2,

30 bajo VEGFR2 < 9,9 ng/ml y alto VEGFR2 ≥ 9,9 ng/ml, y para PLGF, bajo PLGF < 36,5 pg/ml y alto PLGF ≥ 36,5 pg/ml.

Para VEGFA y VEGFR2, los niveles de corte se determinaron como el valor de la mediana de los datos de la muestra, de tal forma que el 50% de los pacientes tienen alta expresión y el 50% de los pacientes tienen baja

35 expresión, según el plan de análisis predeterminado. Los niveles de corte de PLGF se determinaron como el 42º percentil de los datos. Por consiguiente, el 58% de los pacientes tienen alta expresión de PLGF y el 42% de los pacientes tienen baja expresión. Se determinó el corte para aumentar la diferencia estadística entre efecto de tratamiento en los subgrupos de alto y bajo nivel.

40 Esta tabla de resultados muestra que la relación de riesgo para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFA en comparación con pacientes con bajo VEGFA. Esta tabla de resultados también muestra que la relación de riesgo para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFR2 en comparación con pacientes con bajo VEGFR2. Por lo tanto, VEGFA y

VEGFR2 son cada uno biomarcadores predictivos independientes para el efecto de tratamiento de bevacizumab en la supervivencia general.

La tabla 4 representa el análisis de una variable de la asociación de los biomarcadores seleccionados con el efecto de tratamiento en la supervivencia libre de progresión.

Tabla 4: Asociación con el efecto de tratamiento en la supervivencia libre de progresión (análisis de una variable)

HR (IC del 95%): Valor de P para la interacción

VEGFA bajo: 0,771 (0,53, 1,13) 0,0603

VEGFA alto: 0,522 (0,35, 0,78)

VEGFR2 bajo: 0,773 (0,53, 1,12) 0,4012

VEGFR2 alto: 0,541 (0,36, 0,81)

PLGF bajo: 0,957 (0,63, 1,46) 0,0136

PLGF alto: 0,505 (0,35, 0,73)

10 bajo VEGFR2 < 9,9 ng/ml y alto VEGFR2 ≥ 9,9 ng/ml, y para PLGF, bajo PLGF < 36,5 pg/ml y alto PLGF ≥ 36,5pg/ml. Para VEGFA y VEGFR2, los niveles de corte se determinaron como el valor de la mediana de los datos de la muestra, de tal forma que el 50% de los pacientes tienen alta expresión y el 50% de los pacientes tienen baja expresión, según el plan de análisis predeterminado. Los niveles de corte de PLGF se determinaron como el 42º percentil de los datos. Por consiguiente, el 58% de los pacientes tienen alta expresión de PLGF y el 42% de los

15 pacientes tienen baja expresión. Se determinó el corte para aumentar la diferencia estadística entre efecto de tratamiento en los subgrupos de alto y bajo nivel.

Esta tabla de resultados muestra que la relación de riesgo para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFA en comparación con pacientes con bajo VEGFA. Esta tabla de

20 resultados también muestra que la relación de riesgo para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto PLGF en comparación con pacientes con bajo PLGF. Por lo tanto, VEGFA y PLGF son cada uno biomarcadores predictivos independientes para el efecto de tratamiento de bevacizumab en la supervivencia libre de progresión.

25 La tabla 5 presenta el análisis de la asociación de combinaciones de biomarcadores con el efecto de tratamiento en la supervivencia general.

Para el análisis se usaron las siguientes ecuaciones:

Fórmula equivalente: VEGFA+3,3*VEGFR2. Valor de corte = median o 0 y

Fórmula equivalente: 0,19*VEGFA+0,67*PLGF, Valor de corte = median o 4,8 En donde se usa transformación log2 y

Tabla 5: Asociación con el efecto de tratamiento en la supervivencia general (análisis de dos marcadores)

HR (IC del 95%): Valor de P para la interacción

VEGFA y VEGFR2 bajos: 1,317 (0,89, 1,94) 0,0002

VEGFA y VEGFR2 altos: 0,42 (0,28, 0,64)

VEGFA y PLGF bajos: 1,101 (0,74, 1,64) 0,0096

VEGFA y PLGF altos: 0,546 (0,37, 0,81)

45 En este análisis, un alto nivel de expresión combinada de VEGFA y VEGFR2 es (fórmula 1 > -0,10) y un bajo nivel de expresión de VEGFA y VEGFR2 es (Fórmula 1 < -0,10), y un alto nivel de expresión combinada de VEGFA y PLGF es (fórmula 2 ≥ -0,042) y un bajo nivel de expresión de VEGFA y PLGF es (Fórmula 2 < -0,042).

Esta tabla de resultados muestra que la relación de riesgo para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con combinación de VEGFA y VEGFR2 alta en comparación con pacientes con combinación de VEGFA y VEGFR2 baja. Esta tabla de resultados muestra que la relación de riesgo para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con combinación de VEGFA y PLFG alta en

5 comparación con pacientes con combinación de VEGFA y PLGF baja. Por lo tanto, la combinación de VEGFA y VEGFR2 y de VEGFA y PLGF son cada una biomarcadores predictivos independientes para el efecto de tratamiento de bevacizumab en la supervivencia general.

La tabla 6 presenta el análisis de la asociación de combinaciones de biomarcadores con el efecto de tratamiento en 10 la supervivencia libre de progresión.

Para el análisis se usaron las siguientes ecuaciones:

15 Fórmula equivalente:

20 Valor de corte = median o 0 y

Fórmula equivalente: 25

Valor de corte = median o 4,8

30 En donde se usa transformación log2 y

Tabla 6: Asociación con el efecto de tratamiento en la supervivencia libre de progresión (análisis de dos variables) HR (IC del 95%)

Valor de P para la interacción VEGFA y VEGFR2 bajos

0,984 (0,68, 1,43) 0,0040VEGFA y VEGFR2 altos

0,411 (0,26, 0,64) VEGFA y PLGF bajos

0,936 (0,64, 1,37) 0,0011VEGFA y PLGF altos 0,426 (0,28, 0,64)

35 En este análisis, un alto nivel de expresión combinada de VEGFA y VEGFR2 es (fórmula 1 > -0,10) y un bajo nivel de expresión de VEGFA y VEGFR2 es (Fórmula 1 < -0,10), y un alto nivel de expresión combinada de VEGFA y PLGF es (fórmula 2 ≥ -0,042) y un bajo nivel de expresión de VEGFA y PLGF es (Fórmula 2 < -0,042).

40 Esta tabla de resultados muestra que la relación de riesgo para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con combinación de VEGFA y VEGFR2 alta en comparación con pacientes con combinación de VEGFA y VEGFR2 baja. Esta tabla de resultados muestra que la relación de riesgo para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con combinación de VEGFA y PLFG alta en comparación con pacientes con combinación de VEGFA y PLGF baja. Por lo tanto, la combinación de VEGFA y

45 VEGFR2 y de VEGFA y PLGF son cada una biomarcadores predictivos independientes para el efecto de tratamiento de bevacizumab en la supervivencia libre de progresión. Las tablas 7 y 8 presentan el análisis de combinaciones de biomarcadores de VEGFA, VEGFR2 y PLGF y su asociación con el efecto de tratamiento en la supervivencia general y la supervivencia libre de progresión, respectivamente.

50 En este análisis, se usó la siguiente ecuación:

En donde ln = log en base e 55

Tabla 7: Asociación con el efecto de tratamiento en la supervivencia general (análisis de tres marcadores)

Supervivencia general: HR (IC del 95%) Valor de P para la interacción

VEGFA y VEGFR2 y PLGF bajos: 1,051 (0,71, 1,55) 0,0033

VEGFA y VEGFR2 y PLGF altos: 0,554 (0,38, 0,8).

Tabla 8: Asociación con el efecto de tratamiento en la supervivencia libre de progresión (análisis de tres variables)

Supervivencia libre de progresión: HR (IC del 95%) Valor de P para la interacción

VEGFA y VEGFR2 y PLGF bajos: 0,974 (0,64, 1,48) 0,0096

VEGFA y VEGFR2 y PLGF altos: 0,488 (0,34, 0,71)

En este análisis, para la supervivencia general, un alto nivel de expresión combinada de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es (fórmula 3 ≥ 0,837) y un bajo nivel de expresión combinada de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es (fórmula 3 < 0,837), y para la supervivencia libre de progresión, un alto nivel de expresión combinada de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es (fórmula 3 ≥ 0,837) y un bajo nivel de expresión combinada de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es (fórmula 3 < 0,837).

Esta tabla de resultados muestra que la relación de riesgo para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con combinación de VEGFA y VEGFR2 y PLGF alta en comparación con pacientes con combinación de VEGFA y VEGFR2 y PLGF baja. Por lo tanto, la combinación de VEGFA y VEGFR2 y PLGF es un biomarcador predictivo para el efecto de tratamiento de bevacizumab en la supervivencia libre de progresión.

Esta tabla de resultados también muestra que para la supervivencia general, la relación de riesgo para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con combinación de VEGFA y VEGFR2 y PLGF alta en comparación con pacientes con combinación de VEGFA y VEGFR2 y PLGF baja. Por lo tanto, la combinación de VEGFA y VEGFR2 y PLGF es un biomarcador predictivo para el efecto de tratamiento de bevacizumab en la supervivencia general.

Ejemplo 2: Detección de isoformas más cortas de VEGF-A usando el ensayo IMPACT

Este ejemplo demuestra que, basándose en los anticuerpos usados para la detección de VEGF-A en la plataforma IMPACT, las isoformas más cortas de VEGF-A se miden preferentemente en comparación con las isoformas más largas de VEGF-A.

El ensayo se llevó a cabo tal como se describe anteriormente en la sección referente a la tecnología IMPACT usando los anticuerpos enumerados en la tabla anterior a la sección de "análisis estadístico".

Cuatro formas de VEGF-A, es decir, VEGF111, VEGF121, VEGF165 y VEGF189 estaban disponibles y se usaron en los análisis. VEGF111, VEGF121 (ambas procedentes de la expresión en E. coli), y VEGF165 (obtenida de manera recombinante en una línea celular de insecto) se compraron a R&D Systems, Minneapolis, EE.UU. y VEGF189 se obtuvo de RELIATech, Wolfen-büttel, Alemania. Posteriormente se ha observado que VEGF189 es bastante inestable y que los datos obtenidos con ese material no son fiables. Tal como se muestra en la figura 11, las isoformas más cortas que tienen 111 o 121 aminoácidos, respectivamente, que se habían producido en E. coli, no se modifican secundariamente, por ejemplo, no se glucosilan, y se detectan mejor en comparación con las isoformas más largas con 165 aminoácidos. VEGF165 se había obtenido inicialmente en una línea celular de insecto y está al menos parcialmente glucosilado. El producto de escisión de plasmina biológicamente interesante, VEGF110 no estaba disponible para el ensayo en ese momento, pero cabe esperar que la detección de esta isoforma sea comparable a lo que se observa para la molécula de VEGF con 111 aminoácidos.

Ejemplo 3: Detección de isoformas cortas de VEGF usando el analizador Elecsys®

Este ejemplo describe experimentos que demuestran que un ensayo usando el analizador Elecsys® y un ensayo correspondiente pueden usarse para detectar isoformas cortas de VEGF en plasma humano.

El ensayo de VEGF-A se transfirió desde IMPACT al sistema de diagnóstico in vitro automatizado Elecsys® (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim). Se usó el mismo anticuerpo de captura que en el ensayo IMPACT, <hVEGF-A>m3C5 (RELIATech, Wolfenbüttel), mientras que el anticuerpo de captura <hVEGF-A>-m25603 (R&D Systems, Minneapolis) usado en el sistema IMPACT se sustituyó por <hVEGF-A>-mA4.6.1 (Genentech, South San Francisco).

Los inmunoensayos ejecutados en el sistema Elecsys® son inmunoensayos que usan electroquimioluminiscencia (ECLIA) como tecnología generadora de señales. En el presente ensayo en sándwich, el anticuerpo de captura biotinilado se une a micropartículas recubiertas con estreptavidina magnéticas y el anticuerpo de detección rutenilado permite la generación de la señal. 75 μl de <VEGF-A>-m3C5 biotinilado a 1,5 μg/ml and 75 μl <VEGFA>M-A.4.6.1 rutenilado a 2 μg/ml ambos en tampón de reacción (Tris 50 mM (pH 7,4), EDTA 2 mM, Thesit al 0,1 %, IgG bovina al 0,2 %, albúmina de suero bovina al 1,0 %) se incubaron durante 9 minutos con 20 μl de muestra. Se

añadieron 30 μl de una suspensión de micropartículas después de los primeros 9 minutos de incubación y entonces se incubó la mezcla completa durante 9 minutos adicionales. Durante estas etapas de incubación, se forma un sándwich de anticuerpo-analito-anticuerpo que se une a las micropartículas. Finalmente, se transfirieron las micropartículas a la cámara de detección del sistema Elecsys para la generación y lectura de las señales.

El producto de escisión/preferencia de isoforma del ensayo Elecsys® para VEGF-A se evaluó con proteínas recombinantes purificadas: VEGF 110 (producido mediante escisión de plasmina en Genentech, South San Francisco), VEGF 121 y VEGF 165 (ambas producidas en una línea celular de insecto y suministradas por R&D Systems, Minneapolis). La unión preferencial de las isoformas cortas de VEGF que se había observado en el ensayo IMPACT® se confirmó en el ensayo Elecsys. Tal como se muestra en la Figura 12, en el ensayo Elecsys® las isoformas VEGF 121 y el producto de escisión de plasmina VEGF 110, respectivamente, se detectaron con una sensibilidad aproximadamente 5 veces mayor que VEGF 165.

Ejemplo 4: Detección de las isoformas cortas de VEGF en plasma recogido en citrato de Na y EDTA

Se recogieron muestras de plasma emparejadas de pacientes con cáncer de mama localmente recurrente o metastásico HER2+ en tanto en un tubo de recogida Monovette EDTA (5 ml) como Monovette citrato (5 ml). Dentro de los 30 minutos tras la extracción de sangre, se colocaron los tubos en la centrifugadora y se centrifugaron a 1500 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, hasta que se separaron el plasma y las células. Inmediatamente después de la centrifugación, se transfirió cuidadosamente el plasma a un tubo de transferencia de propileno y después se separó en alícuotas iguales en 2 tubos de almacenamiento (mitad del volumen de cada uno de aproximadamente 1,25 ml) usando una pipeta. Se midieron los niveles de VEGF-A en las muestras usando el ensayo IMPACT, tal como se describe anteriormente. Tal como se muestra en la Figura 13, la concentración de VEGFA es aproximadamente un 40% mayor para las muestras de sangre recogidas y almacenadas en EDTA en comparación con las muestras de sangre recogidas y almacenadas en citrato con una correlación de Spearman para MC de EDTA-Citrato de aproximadamente 0,8 para las muestras basales recogidas antes del tratamiento.

Ejemplo 5: Medida comparativa de VEGF165 no modificado y modificado en el analizador Elecsys

Este ejemplo describe experimentos que demuestran que el analizador Elecsys® y un ensayo correspondiente pueden usarse para detectar VEGF no modificado en plasma humano.

El ensayo de VEGF-A se transfirió desde IMPACT al sistema de diagnóstico in vitro automatizado Elecsys® (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim). Se usó el mismo anticuerpo de captura que en el ensayo IMPACT, <hVEGF-A>m3C5 (RELIATech GmbH, Wolfenbüttel), mientras que el anticuerpo de detección <hVEGF-A>-m25603 (R&D Systems, Minneapolis) usado en el sistema IMPACT se sustituyó por <hVEGF-A>-mA4.6.1 (Genentech, South San Francisco).

Los inmunoensayos ejecutados en el sistema Elecsys son inmunoensayos que usan electroquimioluminiscencia (ECLIA) como tecnología generadora de señales. En el presente ensayo en sándwich, el anticuerpo de captura biotinilado se une a micropartículas recubiertas con estreptavidina magnéticas y el anticuerpo de detección rutenilado permite la generación de la señal. 75 μl de <VEGF-A>-m3C5 biotinilado a 1,5 μg/ml and 75 μl <VEGFA>M-A.4.6.1 rutenilado a 2 μg/ml ambos en tampón de reacción (Tris 50 mM (pH 7,4), EDTA 2 mM, Thesit al 0,1 %, IgG bovina al 0,2 %, albúmina de suero bovina al 1,0 %) se incubaron durante 9 minutos con 20 μl de muestra. Se añadieron 30 μl de una suspensión de micropartículas después de los primeros 9 minutos de incubación y entonces se incubó la mezcla completa durante 9 minutos adicionales. Durante estas etapas de incubación, se forma un sándwich de anticuerpo-analito-anticuerpo que se une a las micropartículas. Finalmente, se transfirieron las micropartículas a la cámara de detección del sistema Elecsys para la generación y lectura de las señales.

Se evaluó la preferencia del ensayo Elecsys de VEGF-A con proteínas recombinantes purificadas: VEGF165 (producida de manera recombinante en E. coli por Peprotech) y VEGF165 (producida de manera recombinante en células HEK por Roche Diagnostics, Alemania). La unión preferencial de VEGF165 que se había observado con el ensayo IMPACT se confirmó en el ensayo Elecsys. Tal como se muestra en la Figura 14, en el ensayo Elecsys, el VEGF165 no modificado se detectó con una sensibilidad aproximadamente 5 veces mayor que VEGF165 modificado.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> F. Hoffmann-La Roche AG et al.

<120> Biomarcadores del plasma sanguíneo para terapias de combinación con bevacizumab para el tratamiento del cáncer pancreático.

<130> S1945 PCT S3

<150> EP 10 17 0004.5

<151>

<160> 3

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 232

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 1356

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 221

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para la identificación de un paciente que responde o es sensible a la adición de tratamiento con bevacizumab a un régimen quimioterapéutico, comprendiendo dicho método determinar el nivel de expresión de 5 proteína de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en una muestra de plasma sanguíneo de un paciente que se sospecha que padece o que es propenso a padecer cáncer pancreático, mediante el cual un nivel de expresión aumentado de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación a los niveles de expresión de control determinados en pacientes que padecen cáncer pancreático es indicativo de una sensibilidad del paciente a la adición de bevacizumab a dicho régimen quimioterapéutico, en el que el cáncer pancreático es cáncer pancreático

10 metastásico y el régimen quimioterapéutico comprende gemcitabina y erlotinib.
2. Un método in vitro para predecir la respuesta a o la sensibilidad a la adición de bevacizumab a un régimen quimioterapéutico de un paciente que se sospecha que padece, que padece o que es propenso a padecer cáncer pancreático que comprende determinar el nivel de expresión de proteína de uno o más de VEGFA, VEGFR2 y PLGF

15 en una muestra de plasma sanguíneo de un paciente, en el que el cáncer pancreático es cáncer pancreático metastásico y el régimen quimioterapéutico comprende gemcitabina y erlotinib.
3. El método de la reivindicación 1, en el que el efecto del tratamiento es supervivencia libre de progresión.

20 4. El método de la reivindicación 1, en el que el efecto del tratamiento es supervivencia general.
5. El método de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el nivel de expresión de proteína es de VEGFA o PLGF.
6. El método de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el nivel de expresión de proteína determinado es de VEGFA o 25 de VEGFR2.
7. El método de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el nivel de expresión de proteína determinado es un nivel de expresión combinada de VEGFA y VEGFR2.

30 8. El método de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el nivel de expresión de proteína determinado es un nivel de expresión combinada de VEGFA y PLGF.
9. El método de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el nivel de expresión de proteína determinado es un nivel de

expresión combinada de VEGFA, VEGFR2 y PLGF. 35
10. El método de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho nivel de expresión se detecta mediante un método de inmunoensayo.
11.

El método de la reivindicación 10, en el que dicho método de inmunoensayo es ELISA. 40
12. El método de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho paciente se está tratando conjuntamente con una o más terapias anti-cáncer.
13.

El método de la reivindicación 12, en el que dicha terapia anti-cáncer es radiación. 45
14. El método de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicha muestra se obtiene antes de la terapia neoadyuvante o adyuvante o después de la terapia neoadyuvante o adyuvante.