ES2559430T3 - Adipocitos primarios cultivados para la terapia génica - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un pre-adipocito primario cultivado, en donde el pre-adipocito mantiene de forma estable un gen extraño que codifica una proteína que es secretada en el exterior de la célula, y en donde el gen ha sido insertado en un vector retroviral y ha sido transferido a la célula por el vector retroviral, en donde la proteína es lecitina colesterol aciltransferasa (LCAT).

Description

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preferiblemente una disolución que comprende una matriz extracelular tal como colágeno. La inyección en el tejido adiposo se puede realizar haciendo una incisión y exponiendo el tejido adiposo. Las células que se han diferenciado terminalmente en adipocitos maduros no proliferarán después del trasplante, y expresarán el gen extraño durante un largo periodo a un nivel constante. El nivel de expresión de un gen extraño en un cuerpo que recibe un implante es proporcional al número de células implantadas. Por lo tanto, al realizar un implante, un nivel de expresión deseado se puede mantener durante un largo período en un cuerpo receptor de un implante mediante ajustando la cantidad de adipocitos que se implantan para alinearse con un nivel de expresión de genes extraños pre-medidos in vitro.

Breve Descripción de los Dibujos

La Fig. 1 es un conjunto de microfotografías de adipocitos primarios cultivados, aislados de la grasa subcutánea de ratones ICR de tres semanas de edad. (A) muestra los adipocitos que se adhirieron a la superficie de cultivo del lado del techo después de 14 días de cultivo de techo, (B) muestra los adipocitos primarios cultivados desarrollados en un cultivo normal, (C) muestra adipocitos maduros que han almacenado gotitas de lípidos debido a la inducción de la diferenciación y (D) muestra una imagen teñida con aceite rojo O de células en las que se ha inducido la diferenciación.

La Fig. 2 muestra la actividad de fosfatasa alcalina (AP) de plasma, obtenida mediante la implantación de ratones ICR inmunodeficientes con adipocitos primarios cultivados (derivados de la grasa subcutánea de ratones ICR) que son transfectadas transitoriamente con el plásmido de expresión de AP pcDNA3.1-SEAPmh.

La Fig. 3 muestra una comparación de la eficiencia de la transferencia de genes cuando el vector retroviral MLV (VSV) / pBabeCL (PLAP) IP es transducido a adipocitos primarios cultivados derivados de diversos tejidos adiposos.

La Fig. 4 es un conjunto de microfotografías que muestran imágenes de la inducción de la diferenciación de los adipocitos primarios cultivados transducidos con MLV (VSV) / pBabeCL (GFP) IP. (A) y (B), respectivamente, muestran una microfotografía óptica y una fotografía de fluorescencia de GFP del mismo campo visual.

La Fig. 5 muestra la duración de la expresión de AP en subcultivos de adipocitos primarios cultivados transducidos con un vector viral de la expresión de AP. (A) muestra el resultado de transferir el gen SEAP (MLV (VSV) / pBabeCL (SEAPmh) I2G) o el gen PLAP (MLV (VSV) / pBabeCL (PLAP) IP) a células derivadas de grasa subcutánea de ratones C57BL/6. (B) muestra el resultado de transferir el gen PLAP (MLV (VSV) / pBabeCL (PLAP) IP) o el gen GFP (MLV (VSV) / pBabeCL (GFP) IP) en adipocitos derivados de ratones ICR.

La Fig. 6 es un conjunto de fotografías y un gráfico que muestra el cambio en la expresión de adipocitos transferidos con genes e inducidos por la diferenciación. (A) muestra una imagen de microscopio óptico GFP de adipocitos primarios cultivados en condiciones no inductoras de diferenciación, en donde los adipocitos transfectadas con MLV (VSV) / pBabeCL (GFP) IP se derivan de grasa subcutánea de ICR. (B) muestra una imagen similar al microscopio de GFP tomada bajo condiciones que inducen la diferenciación. (C) muestra la producción de AP por parte de adipocitos primarios cultivados transfectados con MLV(VSV) / pBabeCL (PLAP) IP (derivados de grasa subcutánea de ICR) bajo condiciones no inductores de diferenciación (sin diferenciación) y condiciones que inducen la diferenciación (diferenciación).

La Fig. 7 muestra la producción de (pro)insulina por transfección del plásmido a adipocitos primarios cultivados.

La Fig. 8 muestra la expresión estable de AP en adipocitos primarios cultivados (derivados de grasa subcutánea de ratones C57BL/6) transfectados con AAV que expresa AP.

La Fig. 9 muestra la expresión de insulina en el momento de la inducción de la diferenciación en adipocitos primarios cultivados transfectados con el vector retroviral que expresa insulina s1s2B10. (A) muestra los resultados utilizando un EIA producido por Morinaga y (B) muestra los resultados utilizando un EIA producido por IBL.

La Fig. 10 muestra la expresión de GLP-1(7-37) en adipocitos primarios cultivados transfectados con vector retroviral que expresa GLP-1(7-37). Las mediciones se realizaron por triplicado, y se muestran sus valores medios y las desviaciones estándar.

La Fig. 11 muestra el efecto de la presencia o ausencia de estimulación de pre-implantación de inducción de la diferenciación en la expresión de AP in vivo en la implantación de adipocitos primarios cultivados que expresan AP.

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La Fig. 12 es un conjunto de gráficos y una fotografía. (A) muestra el cambio en la actividad de AP en plasma cuando se implantan adipocitos primarios cultivados que expresan AP en presencia de estimulación de la diferenciación utilizando un Matrigel suplementado con FGF básico. (B) muestra la pérdida de actividad de AP en plasma en la extirpación del Matrigel implantado (A individual). (C) muestra una imagen de microscopio óptico GFP del Matrigel extirpado del grupo de control que recibió células GFP transfectadas. Para el grupo implantado con PLAP mostrado en (A), los valores mostrados son la media del grupo y la desviación estándar de los valores medidos para cada uno de los individuos hasta el día 32º. Los valores restantes son valores medios.

La Fig. 13 muestra los resultados del examen a largo plazo de la actividad de AP en la sangre de ratones que recibieron un implante por el método de la Fig. 12(A), y por una diversidad de otros métodos.

La Fig. 14 muestra los resultados de realizar un ensayo de extirpación similar al de la Fig. 12(B) en la etapa tardía de trasplante.

La Fig. 15 muestra la dependencia de la actividad de AP en sangre del número de células implantadas cuando se implantan los adipocitos que expresan AP. Los valores indicados son la media del grupo y la desviación estándar de las mediciones de cada uno de los individuos.

La Fig. 16 muestra el efecto de implantar adipocitos que expresan insulina s1s2B10 a ratones diabéticos inducida por STZ. (A) muestra el efecto sobre el nivel de glucosa en plasma en ayunas, y (B) muestra el efecto sobre el peso corporal. Los valores indicados son la media del grupo y la desviación estándar de las mediciones de cada uno de los individuos.

Mejor Modo de Llevar a cabo la Invención

La presente invención se describirá en detalle a continuación con referencia a los Ejemplos, pero no debe interpretarse como limitada a los mismos. Todas las referencias citadas en esta memoria se incorporan en esta descripción.

[Ejemplo 1] Cultivo primario de los adipocitos murinos [Métodos]

Ratones ICR machos tres semanas de edad o ratones C57BL/6 machos de cuatro a cinco semanas de edad (ambos de Charles River) fueron anestesiados con dietiléter y se sacrificaron mediante la recogida de sangre entera del corazón. A continuación, la grasa subcutánea inguinal, o la grasa que rodea el epidídimo, y el tejido adiposo mesentérico fueron extirpadas individualmente bajo condiciones estériles. Los tejidos extirpados se lavaron con PBS, y luego se morcelaron utilizando un par de tijeras o un bisturí. Este tejido morcelado se digirió con sacudimiento a 37°C durante 20 a 60 minutos en medio normal (DMEM-alto contenido en glucosa/SIGMA, FCS al 10%) que comprende 1 mg/mL de colagenasa (fracción S1/gelatina Nitta), y luego se separó en precipitado y capa suspendida mediante centrifugación (300 g, cinco minutos).

La capa flotante se centrifugó adicionalmente una vez o dos veces para separar la colagenasa mediante dilución, y luego se añadió a una matraz T-25 (IWAKI) lleno con el medio. Se eliminaron las burbujas y esto se cultivó bajo una atmósfera de 5% de CO2 en una incubadora de CO2 a 37°C, de modo que se invirtió la superficie de cultivo convencional (cultivo de techo). Diez a 14 días después del cultivo, las células que se adhieren a la superficie del techo se recogieron mediante tratamiento con tripsina y se transfirieron a un sistema de cultivo normal. El subcultivo se realizó a continuación, en una relación de 1:3 a 1:10.

Para inducir la diferenciación, el medio de las células cultivadas hasta la confluencia en una placa de 6 pocillos se transfirió a un medio de inducción (medio normal suplementado con IBMX 0,5 mM, dexametasona 0,25 µM y 10 µg/mL de insulina). Esta estimulación se continuó durante 48 horas. A continuación, las células se diferenciaron en un medio de maduración (medio normal suplementado con 10 µg/mL de insulina). El medio de maduración se intercambió cada tres días.

Disolución de tinción aceite rojo O se preparó mezclando una disolución madre, preparada mezclando 0,3 g de aceite rojo O en 100 mL de isopropanol (al 99%), con agua destilada en una relación de 3:2 en el momento de uso. Las células se lavaron con PBS y después se fijaron con disolución al 10% de formalina neutra (WAKO). Después de lavar de nuevo con PBS, las células se tiñeron con disolución de tinción aceite rojo O a temperatura ambiente durante diez minutos. Las células se lavaron con PBS de nuevo y luego se examinaron al microscopio.

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del implante, y la duración de la expresión era de 14 días. La duración de la expresión in vivo mediante la implantación de células que portan el gen transferido transitoriamente era corto, y se encontró que la concentración en sangre variaba en gran medida, aunque se mantuvo más tiempo que mediante la inyección de proteína.

[Ejemplo 3] Producción, mediante el uso de un vector viral, de los adipocitos que expresan AP de forma estable

[Métodos]

(1) Construcción de vectores de expresión de AP y GFP control

El gen PLAP se escindió de pTK-PLAP utilizando HindIII y BglII, tal como se describe en la bibliografía (Goto, M. et al. Mol. Pharmacol. vol. 49, 860-873 (1996)). El gen SEAP se obtuvo por doble digestión de pcDNA 3.1-SEAPmh con HindIII / PmeI. El gen GFP se escindió de pEGFP-N2 utilizando NotI-NcoI.

El plásmido, pBabeCLXI2G, utilizado para la producción de vector viral, se produjo sobre la base de pBabePuro (Morgenstern, J.P. et al. Nucleic Acids Res. vol.18, 3587-3596 (1990)), mediante la escisión de su promotor SV40 y genes de resistencia a neomicina utilizando SalI-ClaI, y haciendo romos esos extremos con fragmentos de Klenow, a continuación reemplazando éstos con el sitio de re-entrada al ribosoma interno (IRES) del virus de la encefalomiocarditis (EMCV), que se escindió de pIRES2-EGFP mediante HincII-HincII, y la proteína verde fluorescente (GFP); a continuación, reemplazando la porción de la repetición terminal larga (LTR) por el sitio de inserción del gen extraño (sitio de multiclonación) (SspI-BamHI) con una secuencia correspondiente (SspI-BamHI) de pCLXSN (IMGENEX). Además de ello, también se utilizó pBabeCLXIP, en el que la porción IRES-GFP de pBabeCLXI2G había sido reemplazada por el gen de resistencia a puromicina IRES.

Cada uno de los fragmentos de ADN de PLAP, SEAP y GFP arriba mencionados se hicieron romos con fragmentos de Klenow, y luego se insertaron en el vector pBabeCLXIP o pBabeCLXI2G escindido con Hpa I, proporcionando pBabeCL(PLAP)IP, pBabeCL(SEAPmh)I2G y pBabeCL(GFP)IP, respectivamente.

(2) Producción de vectores virales

Cada una de las transferencias de genes a una placa de 10 cm se realizó como sigue: 30 µl de reactivo de transfección de plásmidos TransIT (MIRUS) se mezcló en 500 µl de medio DMEM exento de FCS, y se dejó reposar a temperatura ambiente durante cinco minutos (disolución mixta de DMEM/TransIT). En un tubo separado, 3,3 µg de un vector que codifica VSV-G (pCALG, modificado de acuerdo con Arai, T. et al., J. Virol., 1998, 72, págs. 1115-21), 3,3 µg de un vector que codifica Gag-Pol (sistema pCLAmpho/RetroMax (IMGENEX)) y se mezclaron 3,3 µg de un vector que comprende una señal de empaquetamiento y el gen transferido (pBabeCL(PLAP)IP, pBabeCL(SEAPmh)I2G o pBabeCL(GFP)IP), para un total de 9,9 µg (disolución de plásmido). La disolución de plásmido se añadió a la disolución mixta de DMEM/TransIT, se mezcló a fondo y luego se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Esto se añadió después a células 293-EBNA (Invitrogen), cultivadas durante la noche de 2x 106 células/palca de 10 cm el día anterior.

El medio se intercambió ocho horas después de la adición, y el sobrenadante del cultivo se recogió después de cultivar durante otros dos días. El sobrenadante del cultivo recogido se centrifugó (300 g, cinco minutos) o se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 µm (Millipore) para separar los contaminantes, y este sobrenadante se utilizó como la disolución de virus (MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP, MLV(VSV)/pBabeCL(SEAPmh)I2G y MLV(VSV)/pBabeCL(GFP)IP, respectivamente). Algo de la disolución de virus se concentró mediante ultracentrifugación (19.500 rpm, 100 minutos) y luego se utilizó.

(3) Transferencia de genes a y cultivo de adipocitos primarios cultivados

Los adipocitos a utilizar para la transferencia de genes (derivados de grasa subcutánea, grasa que rodea el epidídimo y grasa mesentérica de ratones ICR, y la grasa subcutánea de ratones C57BL/6) se prepararon en placas de 6 pocillos o de 96 pocillos, de modo que eran 50 a 80% confluentes el día antes de la transfección. El medio se desechó, y cantidades iguales de 4 µg/mL de disolución de Polybrene (SIGMA) y disolución de virus se añadieron a las células para transducir el vector viral. Ocho horas después de la transducción, el medio se cambió a un medio normal y se realizó un cultivo y un subcultivo adicionales. La actividad de AP de una porción de las células se midió recogiendo el sobrenadante del cultivo de 24 horas en el cuarto día después de la transfección (Fig. 3).

El subcultivo se realizó de acuerdo con el método del Ejemplo 1 en una escala de placa de 10 cm. Las células se cultivaron durante cuatro a siete días, y se intercambió el medio tras alcanzar la confluencia. La actividad de AP se

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midió en el sobrenadante del cultivo 17 horas más tarde. Estas células se subcultivaron de forma continua y al realizar apropiadamente manipulaciones similares, se examinó el mantenimiento de la expresión (Figs. 5 y 6). La actividad de AP no se midió cada vez que se realizó el subcultivo.

La diferenciación se indujo en placas de 6 pocillos de acuerdo con el método del Ejemplo 1. Sin embargo, el tratamiento se llevó a cabo durante tres días con medio de inducción, que fue reemplazado por medio de maduración cada tres días a partir de entonces. La actividad AP del sobrenadante del cultivo se midió utilizando el sobrenadante del cultivo obtenido cada tres días, y los ejes x en las figuras muestran el día en que se recogió el sobrenadante. Para las células transfectadas con GFP, se tomaron microfotografías bajo luz GFP adecuada (Figs. 4 y 6). Condiciones no inductoras de diferenciación se refieren a condiciones en las que el cultivo se continúa en un medio normal en lugar de un medio de inducción o medio maduro.

[Resultados]

La Fig. 3 es una comparación de la eficiencia de transferencia de genes para cada uno de los tipos de células derivadas de tejido cuando se utilizan vectores retrovirales. La actividad AP se confirmó en el sobrenadante de cultivo de todas las células cuando la transferencia génica se realizó en los adipocitos primarios cultivados, aislados de cada uno de los tejidos adiposos existentes en el tejido inguinal subcutáneo, zona alrededor del epidídimo y el mesenterio de ratones ICR. Esto mostró que los vectores retrovirales pueden transferir genes independientemente del sitio del origen celular.

La Fig. 4 es un conjunto de microfotografías que muestra imágenes de la inducción por diferenciación de células transducidas con un vector retroviral que expresa GFP. La inducción de la diferenciación se inició 13 días después de la transferencia de genes, y las fotografías se tomaron tres semanas más tarde. La fluorescencia de GFP se observó en células que contienen gotitas de lípidos, que mostraron que el vector viral puede transferir genes en preadipocitos que poseen la capacidad de diferenciarse, y que la transferencia de genes por parte del vector no afecta a su capacidad de diferenciarse.

La Fig. 5 muestra la continuidad de expresión en los subcultivos de adipocitos primarios cultivados transfectados con un vector viral que expresa AP. La actividad de AP se midió en el sobrenadante del cultivo tomada 17 horas después de que las células alcanzaran la confluencia en una placa de 10 cm. La producción continua de AP fue confirmada a lo largo de los 87 días durante los cuales se examinaron (A) adipocitos primarios cultivados, derivados de la grasa subcutánea de ratones C57BL/6, y a lo largo de los 63 días durante los cuales se examinaron (B) adipocitos primarios cultivados, derivados de la grasa subcutánea de ratones ICR. Estos resultados demostraron que la transducción del vector viral a adipocitos primarios cultivados puede producir células de expresión estable que mantienen los genes extraños en las células hijas producidas después de la división.

La Fig. 6 es un conjunto de fotografías y un gráfico que muestra cambios de la expresión en los adipocitos transferidos con genes inducidos por diferenciación. Adipocitos que expresan GFP derivados de grasa subcutánea de ICR mostraron una fuerte expresión de GFP tanto en condiciones de cultivo normales (A) como en condiciones que inducen la diferenciación (B). Además de ello, adipocitos que expresan AP derivados de grasa subcutánea de ICR mostraron la expresión continua de AP bajo condiciones inductoras de no diferenciación (no-diferenciación) y condiciones inductoras de diferenciación (diferenciación) (C). Se encontró que los adipocitos primarios cultivados que fueron transferidos con genes por los vectores virales expresan de forma estable genes en cualquier fase, no sólo en las condiciones de proliferación descritas en la Fig. 5, sino también en condiciones inductoras de no diferenciación, o más específicamente en condiciones no proliferativas o condiciones maduras.

[Ejemplo 4] Producción, utilizando un vector de plásmido, de adipocitos que expresan insulina de forma estable

Métodos de transferencia de genes incluyen métodos que utilizan vectores de plásmidos.

[Métodos]

(1) Aislamiento y modificación del gen de la insulina humana

La PCR se realizó en un banco de ADNc derivado de páncreas humano (Stratagene), utilizando los cebadores mostrados en la Tabla 1 (insulina Fw (directa) y Rv (inversa)). Se obtuvo un fragmento de gen de la insulina humana. Se determinó la secuencia de nucleótidos de este fragmento de 354 pb obtenido, y el fragmento se subclonó en el vector pCR2.1TOPO (Invitrogen) como insulina nativa.

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Tabla 1 Secuencias de cebador utilizadas para la PCR

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5 (Las letras en negrita designan el codón de iniciación en Fw y el antisentido del codón de parada en Rv El subrayado indica porciones mutadas).

A continuación, con el fin de expresar insulina madura en los adipocitos, se realizó una modificación genética basada en la bibliografía (JBC, 1994, 269(8), 6241-). Más específicamente, cebadores de ambas direcciones se sintetizaron individualmente para que contuvieran mutaciones en cada uno de los sitios de unión entre la cadena B 10 de insulina humana y el péptido C (sitio1), entre el mismo péptido C y una cadena A (sitio 2), y el 10º residuo de histidina de la cadena B (B10) (Tabla 1). Los mutantes se obtuvieron utilizando un kit de mutagénesis Quikchange (Stratagene). Al realizar esta reacción en el sitio 1 y el sitio 2 se proporcionó el mutante s1s2. Al realizar la reacción en el sitio 1, el sitio 2 y B10 proporcionó insulina mutante s1s2B10. Después de confirmar la secuencia de nucleótidos del gen de la insulina humana modificado obtenido, el gen fue incorporado en el vector pcDNA3.1, y

15 luego se utilizó para la transferencia de genes.

(2) Transferencia de genes en adipocitos primarios cultivados

Después de mezclar 500 µL de medio DMEM exento de FCS y 15 µL de reactivo Fugene 6 (Roche), se añadieron 5 µg de plásmido de transfección y luego esto se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. La disolución mixta se añadió a adipocitos primarios cultivados (derivadas de tejido adiposo alrededor del epidídimo de 20 ratones C57BL/6), que habían sido cultivados a 70 a 80% de confluencia en una placa de 10 cm. Esto se cultivó durante 24 horas en una incubadora de CO2. Cuatro días después de la transferencia de genes, las células se subcultivaron en un matraz T225, y se cultivaron durante la noche. El medio se intercambió entonces por un medio que comprendía 0,2 mgU/mL de G418 (SIGMA), y se continuó el cultivo durante tres semanas, después de lo cual se seleccionaron las células transferidas con genes. Las células resistentes a G418 obtenidas se sembraron en una

25 placa de 10 cm, y la cantidad de insulina en el sobrenadante del cultivo se midió utilizando un kit EIA de insulina ultrasensible (Morinaga). Este kit EIA detecta tanto la proinsulina, que todavía no ha sido procesada, como la insulina madura.

[Resultados]

La Fig. 7 muestra la producción de (pro)insulina por la transfección del plásmido en adipocitos primarios cultivados.

30 Cada uno de los vectores pcDNA3.1Myc-His que incorporan individualmente el gen de la insulina humana nativa (nativo) y sitio 1/sitio 2/forma modificada B10 (s1s2B10), o un vector vacío (testigo), se transfectó en adipocitos derivados del tejido adiposo que rodea al epidídimo de los ratones C57BL/6. (Pro)insulina humana se detectó en el

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