ES2555282T3 - Nuevos epítopos inmunogénicos para inmunoterapia - Google Patents

Nuevos epítopos inmunogénicos para inmunoterapia Download PDF

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ES2555282T3
ES2555282T3 ES12191628.2T ES12191628T ES2555282T3 ES 2555282 T3 ES2555282 T3 ES 2555282T3 ES 12191628 T ES12191628 T ES 12191628T ES 2555282 T3 ES2555282 T3 ES 2555282T3
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Toni Weinschenk
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Abstract

Un péptido que consiste en la secuencia ALFVRLLALA de acuerdo con la SEC ID N.º 8 que induce la reacción cruzada de los linfocitos T con dicho péptido.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
Rufer, N, Reynard, S, Barbey, C, Cerottini, JC, Leyvraz, S, Pinilla, C, Y Romero, P; Decreased specific CD8+ T cell cross-reactivity of antigen recognition following vaccination with Melan-A peptide, Eur. J Immunol., 2006, 36, 18051814).
La Tabla 1 muestra los péptidos, sus respectivas SEC ID N. º así como la información sobre las proteínas originarias.
Tabla 1: Péptidos
SEC ID Nº
Código delpéptido Secuencia Alelos HLA Genes
1
C20-001 ALSNLEVTL A*02 C20orf42
2
NOX-001 ILAPVILYI A*02 NOX1
3
PCN-001 KLMDLDVEQL A*02 PCNA
4
PCN-002 SMSADVPLV A*02 PCNA
5
TOP-001 KIFDEILVNA A*02 TOP2A, TOP2B
6
TOP-002 AAFVEELDKV A*02 TOP2B
7
CEA-009 VLLLVHNLPQHLFG Clase II CEACAM5
8
TGFBI-001 ALFVRLLALA A*02,A*02/B*13? TGFBI
9
TGFBI-006 GDKLEVSLKNNVVS Clase II TGFBI
10
TGFBI-007 GKKLRVFVYRNSLCIENS Clase II TGFBI
11
TGFBI-008 LKNNWSVNKEPVAEPD Clase II TGFBI
KNNWSVNKEPVAEPD
Clase II TGFBI
KNNWSVNKEPVA
Clase II TGFBI
LKNNWSVNKEPVA
Clase II TGFBI
12
TGFBI-009 NGVIHYIDELLIPDS Clase II TGFBI
GVIHYIDELLIPDSA
Clase II TGFBI
13
TGFBI-010 LNRILGDPEALRDL Clase II TGFBI
14
TGFBI-004 TPPIDAHTRNLLRNH Clase II TGFBI
15
PTP-001 ALTTLMHQL A*02 PTPRZ1
16
GAL-001 SLDPSSPQV A*02 GAL3ST1
17
CHI-001 SLWAGWVL A*02 CHI3L2
18
JAK-001 KLTDIQIEL A*02 JAKMIP2
19
AKR-001 YLIHFPVSV A*02 AKR1C1, AKR1C2
20
FN1-001 IVDDITYNV A*02 FN1
21
EGFR-002 GAVRFSNNPALCNVES Clase II EGFR
AVRFSNNPALCNVES
Clase II EGFR
AVRFSNNPALCNVE
Clase II EGFR
22
EGFR-005 NPTTYQMDVNPEGKYS Clase II EGFR
23
EGFR-006 FKKIKVLGSGAFG Clase II EGFR
24
CHI3L1-001 TTLIKEMKAEFIKEAQPG Clase II CHI3L1
TLIKEMKAEFIKEAQPG
Clase II CHI3L1
TTLIKEMKAEFIKEA
Clase II CHI3L1
TLIKEMKAEFIKEA
Clase II CHI3L1
IKEMKAEFIKEAQPG
Clase II CHI3L1
TTLIKEMKAEFIKE
Clase II CHI3L1
25
CHI3L1-007 VKSKVQYLKDRQLAG Clase II CHI3L1
26
CHI3L1-008 SRRTFIKSVPPFLRT Clase II CHI3L1
27
DCA-001 KLGDFGLATW A*02 DCAMKL2
28
KCN-001 SLFDQWKV A*02 KCNJ10
29
GPM-001 ALLSEVIQL A*02 GPM6B
Marco de lectura abierta 42 del cromosoma 20
El C20orf42 es una proteína de adhesión focal que interviene en la fijación del citoesqueleto de actina a la 10 membrana plasmática y en procesos celulares mediados por las integrinas. La deficiencia de C20orf42 como
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En el caso del CEA se han descrito varios epítopos para los linfocitos T cooperadores y citotóxicos (Crosti, M, Longhi, R, Consogno, G, Melloni, G, Zannini, P, y Protti, MP; Identification of novel subdominant epitopes on the carcinoembryonic antigen recognized by CD4+ T-cells of lung cancer patients, J Immunol., 2006, 176, 5093-5099; Novellino, L, Castelli, C, y Parmiani, G; A listing of human tumor antigens recognized by T-cells: March 2004 update, Cancer Immunol. Immunother., 2004, 54, 187-207; Ruiz, M, Kobayashi, H, Lasarte, JJ, Prieto, J, Borras-Cuesta, F, Celis, E, y Sarobe, P; Identification and characterization of a T-helper peptide from carcinoembryonic antigen, Clin Cancer Res., 2004, 10, 2860-2867), lo que ha dado pie a una serie de ensayos con vacunas peptídicas en el marco del CCR (Babatz, J, Rollig, C, Lobel, B, Folprecht, G, Haack, M, Gwither, H, Kohne, CH, Ehninger, G, Schmitz, M, y Bornhauser, M; Induction of cellular immune responses against carcinoembryonic antigen in patients with metastatic tumors after vaccination with altered peptide ligand-loaded dendritic cells, Cancer Immunol. Immunother., 2006, 55, 268-276; Fong, L, Hou, Y, Rivas, A, Benike, C, Yuen, A, Fisher, GA, Davis, MM, y Engleman, EG; Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 2001, 98, 8809-8814; Liu, KJ, Wang, CC, Chen, LT, Cheng, AL, Lin, DT, Wu, YC, Yu, WL, Hung, YM, Yang, HY, Juang, SH, y Whang-Peng, J; Generation of carcinoembryonic antigen (CEA)-specific T-cell responses in HLAA*0201 and HLA-A*2402 late-stage colorectal cancer patients after vaccination with dendritic cells loaded with CEA peptides, Clin Cancer Res., 2004, 10, 2645-2651; Matsuda, K, Tsunoda, T, Tanaka, H, Umano, Y, Tanimura, H, Nukaya, I, Takesako, K, y Yamaue, H; Enhancement of cytotoxic T-lymphocyte responses in patients with gastrointestinal malignancies following vaccination with CEA peptide-pulsed dendritic cells, Cancer Immunol. Immunother., 2004, 53, 609-616; Ueda, Y, Itoh, T, Nukaya, I, Kawashima, I, Okugawa, K, Yano, Y, Yamamoto, Y, Naitoh, K, Shimizu, K, Imura, K, Fuji, N, Fujiwara, H, Ochiai, T, Itoi, H, Sonoyama, T, Hagiwara, A, Takesako, K, y Yamagishi, H; Dendritic cell-based immunotherapy of cancer with carcinoembryonic antigen-derived, HLA-A24restricted CTL epitope: Clinical outcomes of 18 patients with metastatic gastrointestinal or lung adenocarcinomas, Int. J Oncol., 2004, 24, 909-917; Weihrauch, MR, Ansen, S, Jurkiewicz, E, Geisen, C, Xia, Z, Anderson, KS, Gracien, E, Schmidt, M, Wittig, B, Diehl, V, Wolf, J, Bohlen, H, y Nadler, LM; Phase I/II combined chemoimmunotherapy with carcinoembryonic antigen-derived HLA-A2-restricted CAP-1 peptide and irinotecan, 5-fluorouracil, and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal cancer, Clin Cancer Res., 2005,11, 5993-6001). Estos y otros ensayos clínicos realizados hasta ahora han demostrado la seguridad de las vacunaciones con CEA y han aportado pruebas de la inducción de una respuesta inmunitaria contra este antígeno (von Mehren, M; Colorectal cancer vaccines: what we know and what we don't yet know, Semin. Oncol., 2005, 32, 76-84).
Gen inducido por el factor de crecimiento transformante, beta (TGFBI)
El TGFBI fue identificado por primera vez como un gen inducible por el TGF-beta en una estirpe celular de adenocarcinoma de pulmón humano. Codifica una proteína segregada en la matriz extracelular, que se piensa que actúa en la fijación celular y en la composición de dicha matriz.
También se ha demostrado que el TGFBI es uno de los genes cuya expresión es más elevada en el cáncer colorrectal, además de expresarse a altos niveles en adenomas. Los resultados obtenidos con la PCR cuantitativa demuestran la fuerte elevación tanto en tumores sin purificar como en células epiteliales tumorales purificadas. En consonancia, los experimentos de hibridación in situ revelan que el TGFBI se expresa en muchos tipos de células, tanto en el compartimento estromal como en el epitelial (Buckhaults, P, Rago, C, St, CB, Romans, KE, Sana, S, Zhang, L, Vogelstein, B, y Kinzler, K. W; Secreted and cell surface genes expressed in benign and malignant colorectal tumors, Cancer Res., 2001, 61, 6996-7001).
En un metanálisis de estudios que investigó la expresión génica en el carcinoma colorrectal, el TGFBI fue identificado como uno de los nueve únicos genes que aparecían reiteradamente regulados positivamente (4 estudios de TGFBI) (Shih, W, Chetty, R, y Tsao, MS; Expression profiling by microarrays in colorectal cancer, Oncol. Rep., 2005, 13, 517-524).
En tejidos de páncreas humano se apreció un incremento de 32,4 veces en los niveles del ARNm del TGFBI en tumores pancreáticos en comparación con los tejidos de control normales. Los análisis de hibridación in situ revelaron que el ARNm del TGFBI se expresaba principalmente en células cancerosas del interior de la masa tumoral pancreática (Schneider, D, Kleeff, J, Berberat, PO, Zhu, Z, Korc, M, Friess, H, y Buchler, MW; Induction and expression of betaig-h3 in pancreatic cancer cells, Biochim. Biophys. Acta, 2002, 1588, 1-6).
El TGFBI se ha identificado como un gen promotor de la angiogénesis en un modelo in vitro. Además, en varios tumores se ha detectado un aumento drástico de su expresión. Oligonucleótidos antisentido dirigidos contra el TGFBI bloquearon tanto la expresión génica como la formación del tubo endotelial in vitro, lo cual parece indicar que el TGFBI puede desempeñar un papel esencial en las interacciones entre la matriz y la célula endotelial (Aitkenhead, M, Wang, SJ, Nakatsu, MN, Mestas, J, Heard, C, y Hughes, CC; Identification of endothelial cell genes expressed in an in vitro model of angiogenesis: induction of ESM-1, (beta)ig-h3, and NrCAM, Microvasc. Res., 2002, 63, 159-171).
Proteína tirosina fosfatasa, de tipo receptor, Zeta 1 (PTPRZX)
La PTPRZ1 es un miembro de la familia de proteínas tirosina fosfatasa de tipo receptor y codifica una proteína de membrana de un solo paso de tipo 1 dotada de dos dominios citoplasmáticos de tirosina fosfatasa, un dominio alfaanhidrasa carbónica y un dominio de fibronectina de tipo III. La expresión de este gen se induce en células de
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cáncer gástrico (Wu, CW, Li, AF, Chi, CW, y Lin, WC; Protein tyrosine-phosphatase expression profiling in gastric cancer tissues, Cancer Lett., 2006, 242, 95-103), en los oligodendrocitos remielinizantes de lesiones de esclerosis múltiple (Harroch, S, Furtado, GC, Brueck, W, Rosenbluth, J, Lafaille, J, Chao, M, Buxbaum, JD, y Schlessinger, J; A critical role for the protein tyrosine phosphatase receptor type Z in functional recovery from demyelinating lesions, Nat. Genet., 2002, 32,411-414), y en células reñales embrionarias humanas en condiciones hipóxicas (Wang, V, Davis, DA, Haque, M, Huang, LE, y Yarchoan, R; Differential gene up-regulation by hypoxia-inducible factor-1 alpha and hypoxia-inducible factor-2 alpha in HEK293T-cells, Cancer Res., 2005, 65, 3299-3306).
Tanto la proteína como el transcrito se sobreexpresan en las células de glioblastoma, promoviendo su migración haptotáctica (Lu, KV, Jong, KA, Kim, GY, Singh, J, Dia, EQ, Yoshimoto, K, Wang, MY, Cloughesy, TF, Nelson, SF, y Mischel, PS; Differential induction of glioblastoma migration and growth by two forms of pleiotrophin, J Biol Chem., 2005, 280,26953-26964).
Además, la PTRPZ1 aparece amplificada con frecuencia a nivel del ADN genómico en el glioblastoma (Mulholland, PJ, Fiegler, H, Mazzanti, C, Gorman, P, Sasieni, P, Adams, J, Jones, TA, Babbage, JW, Vatcheva, R, Ichimura, K, East, P, Poullikas, C, Collins, VP, Carter, NP, Tomlinson, IP, y Sheer, D; Genomic profiling identifies discrete deletions associated with translocations in glioblastoma multiforme, Cell Cycle, 2006, 5, 783-791).
Janus Quinasa y proteína 2 de interacción con microtúbulos (JAKMIP2)
La JAKMIP2 se identificó como una de las muchas dianas aguas abajo conocidas y presuntas de PAX3-FKHR que aparecen muy sobreexpresadas en el rabdomiosarcoma pediátrico de subtipo alveolar o ARMS (Lae, M, Ahn, E, Mercado, G, Chuai, S, Edgar, M, Pawel, B, Olshen, A, Barr, F, y Ladanyi, M; Global gene expression profiling of PAX-FKHR fusion-positive alveolar and PAX-FKHR fusion-negative embryonal rhabdomyosarcomas, J Pathol., 2007, 212,143-151).
Fibronectina 1 (FN1)
La fibronectina es una glucoproteína de alto peso molecular que contiene alrededor de un 5 % de glúcidos y que se une a proteínas receptoras que atraviesan la membrana celular, denominadas integrinas. Además de unirse a las integrinas, también se une a componentes de la matriz extracelular, tales como el colágeno, la fibrina y la heparina. Existen varias isoformas de la fibronectina, todas ellas producto del mismo gen. Las fibronectinas desempeñan un papel esencial en el mantenimiento de la morfología celular normal, la adhesión y la migración celular, la hemostasia, la trombosis, la cicatrización de heridas, la diferenciación y la proliferación (Hynes, RO; Fibronectins, Sci. Am., 1987, 254, 42-51).
La fibronectina polimérica, sFN, se forma in vitro tratando la fibronectina soluble con un péptido de 76 aa, el III1-C (denominado anastelina), que procede de la primera repetición de tipo III de la fibronectina. Estudios in vivo realizados con ratones portadores de tumores, han demostrado que la aplicación sistémica de la anastelina o de sFN suprimía el crecimiento, la angiogénesis y la metástasis tumoral (Yi, M y Ruoslahti, E; A fibronectin fragment inhibits tumor growth, angiogenesis, and metastasis, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 2001, 98, 620-624). Anginex es un péptido sintético de 33 aminoácidos que se modeló inicialmente para reproducir la estructura en lámina beta de proteínas antiangiogénicas. Se ha demostrado que el anginex inicia la polimerización de la fibronectina y es inactivo en ratones que carecen de fibronectina plasmática (Akerman, ME, Pilch, J, Peters, D, y Ruoslahti, E; Angiostatic peptides use plasma fibronectin to home to angiogenic vasculature, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 2005, 102, 20402045). Un estudio examinó los efectos de la FN sobre la insuficiencia hepática fulminante inducida con Dgalactosamina (GalN)/lipopolisacárido (LPS) en ratones. Los resultados sugieren que la FN protegió contra la insuficiencia hepática provocada por GalN/LPS a través de un mecanismo que implica la inhibición de la activación del NF-kappaB, lo que causó la regulación negativa del TNF-alfa y la regulación positiva de la IL-10, así como la elevación del Bcl-xL que indujo el bloqueo de las señales apoptóticas, procesos que culminaron en la supresión de la apoptosis de los hepatocitos causada por GalN/LPS (Qiu, Z, Kwon, AH, Tsuji, K, Kamiyama, Y, Okumura, T, y Hirao, Y; Fibronectin prevents D-galactosamine/lipopolysaccharide-induced lethal hepatic failure in mice, Shock, 2006, 25, 8087). Otros resultados indican que la FN estimula la proliferación de las células de carcinoma de pulmón humano y disminuye la apoptosis in vitro al inducir la expresión del gen COX-2 y la biosíntesis de PGE2 (Han, S, Sidell, N, Roser-Page, S, y Roman, J; Fibronectin stimulates human lung carcinoma cell growth by inducing cyclooxygenase-2 (COX-2) expression, Int. J Cancer, 2004, 111,322-331).
Se ha demostrado que la fibronectina (FN) sufre un corte y empalme alternativo únicamente durante la organogénesis y la oncogénesis. Una de esas variantes de corte y empalme, la FN con dominio extra B (ED-B), normalmente no aparece en los tejidos adultos normales y se ha propuesto como marcador de la angiogénesis tumoral (Khan, ZA, Caurtero, J, Barbin, YP, Chan, BM, Uniyal, S, y Chakrabarti, S; ED-B fibronectin in non-small cell lung carcinoma, Exp. Lung Res., 2005, 31, 701-711). Mhawech y col. demostraron que los pacientes afectados por tumores de cabeza y cuello con tinción positiva para la EDB tienden a tener una supervivencia significativamente más corta (Mhawech, P, Dulguerov, P, Assaly, M, Ares, C, y Allal, AS; EB-D fibronectin expression in squamous cell carcinoma of the head and neck, Oral Oncol., 2005, 41, 82-88).
La expresión de la fibronectina regula la angiogénesis y la vasculogénesis y participa en las respuestas del tejido
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SH, Bigner, DD, Kinzler, KW, Hamilton, SR, y Vogelstein, B; Increased expression of the epidermal growth factor receptor gene in malignant gliomas is invariably associated with gene amplification, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1987, 84, 6899-6903; Chaffanet, M, Chauvin, C, Laine, M, Berger, F, Chedin, M, Rost, N, Nissou, MF, y Benabid, AL; EGF receptor amplification and expression in human brain tumors, 1992, Eur. J Cancer, 28, 11-17). La sobreexpresión de la proteína sin amplificación génica se ha descrito hasta en el 27 % de los glioblastomas, pero también se ha descrito que los astrocitomas y los oligodendrogliomas, menos malignos, también la presentan sin la amplificación del gen en cuestión (Reifenberger, J, Reifenberger, G, Ichimura, K, Schmidt, EE, Wechsler, W, y Collins, VP; Epidermal growth factor receptor expression in oligodendroglial tumors, Am. J Pathol., 1996,149, 29-35).
Las implicaciones pronósticas de la amplificación/sobreexpresión del EGFR en los tumores cerebrales son controvertidas. Algunos autores no han hallado ninguna influencia de la amplificación/sobreexpresión del EGFR en la supervivencia de los pacientes (Olson, JJ, Barnett, D, Yang, J, Assietti, R, Cotsonis, G, y James, CD; Gene amplification as a prognostic factor in primary brain tumors, Clin Cancer Res., 1998, 4, 215-222; Newcomb, EW, Cohen, H, Lee, SR, Bhalla, SK, Bloom, J, Hayes, RL, y Miller, DC; Survival of patients with glioblastoma multiforme is not influenced by altered expression of p16, p53, EGFR, MDM2 or Bcl-2 genes, Brain Pathol, 1998, 8, 655-667; Waha, A, Baumann, A, Wolf, HK, Fimmers, R, Neumann, J, Kinderrnann, D, Astrahantseff, K, Blumcke, I, von, DA, y Schlegel, U; Lack of prognostic relevance of alterations in the epidermal growth factor receptor-transforming growth factor-alpha pathway in human astrocytic gliomas, J Neurosurg, 1996, 85, 634-641) mientras que otros han llegado a la conclusión de que tales alteraciones influyeron negativamente en el pronóstico (Etienne, MC, Formento, JL, Lebrun-Frenay, C, Gioanni, J, Chatel, M, Paquis, P, Bernard, C, Courdi, A, Bensadoun, RJ, Pignol, JP, Francoual, M, Grellier, P, Frenay, M, y Milano, G; Epidermal growth factor receptor and labelling index are independent prognostic factors in glial tumor outcome, Clin Cancer Res., 1998, 4, 2383-2390; Jaros, E, Perry, RH, Adam, L, Kelly, PJ, Crawford, PJ, Kalbag, RM, Mendelow, AD, Sengupta, RP, y Pearson, AD; Prognostic implications of p53 protein, epidermal growth factor receptor, and Ki-67 labelling in brain tumors, Br. J Cancer, 1992, 66, 373-385; Schlegel, J, Merdes, A, Sturnm, G, Albert, FK, Forsting, M, Hynes, N, y Kiessling, M; Amplification of the epidermal-growth-factorreceptor gene correlates with different growth behaviour in human glioblastoma, Int. J Cancer, 1994, 56, 72-77; Zhu, A, Shaeffer, J, Leslie, S, Kolm, P, y El-Mahdi, AM; Epidermal growth factor receptor: an independent predictor of survival in astrocytic tumors given definitive irradiation, Int. J Radiat. Oncol. Biol Phys., 1996, 34, 809-815).
Existen algunas estrategias terapéuticas relacionadas con la molécula del EGFR en las células cancerosas. Las más ampliamente estudiadas son: el tratamiento con anticuerpos específicos mediante anticuerpos desnudos o conjugados con toxinas, liposomas o núclidos, y el uso de inhibidores de la tirosina-quinasa receptora. Existen varios tipos de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el EGFRwt. Unos bloquean el acceso de los ligandos al receptor (cetuximab) y otros provocan la rápida internalización del receptor (ABX-EGF) (Sridhar, SS, Seymour, L, y Shepherd, FA; Inhibitors of epidermal-growth-factor receptors: a review of clinical research with a focus on non-small-cell lung cancer, Lancet Oncol., 2003, 4, 397-406). Pero como el EGFRwt también aparece en la superficie de las células normales, los efectos secundarios pueden limitar su uso.
El EGFR aparece sobreexpresado en el carcinoma escamoso de cabeza y cuello (HNSCC) en el que sus niveles de expresión se correlacionan con la disminución de la supervivencia. Los tratamientos que bloquean el EGFR han demostrado eficacia limitada en los ensayos clínicos y básicamente en combinación con el tratamiento estándar. El EGFRvIII se expresa en el HNSCC, donde contribuye a reforzar el crecimiento y la resistencia frente a los tratamientos dirigidos contra el EGFR natural (wild type). La eficacia antitumoral de las estrategias dirigidas contra el EGFR podría mejorar con la adición del bloqueo específico del EGFRvIII (Sok, JC, Coppelli, FM, Thomas, SM, Lango, MN, Xi, S, Hunt, JL, Freilino, ML, Graner, MW, Wikstrand, CJ, Bigner, DD, Gooding, WE, Furnari, FB, y Grandis, JR; Mutant epidermal growth factor receptor (EGFRvIII) contributes to head and neck cancer growth and resistance to EGFR targeting, Clin Cancer Res., 2006, 12, 5064-5073).
Otra estrategia consiste en inducir, de manera selectiva, la muerte de células de glioblastoma y de otras células cancerosas que sobreexpresen el receptor del EGF. Con un vector no viral que reconoce específicamente el receptor del EGF se ha conseguido introducir de forma selectiva en células cancerosas un ARNdc sintético antiproliferativo (poliinosina-citosina [poli-IC]). La poli-IC dirigida contra el EGFR indujo con rapidez la apoptosis en las células diana tanto in vitro como in vivo. La liberación en el tumor de la poli-IC dirigida contra el EGFR indujo la regresión completa de tumores intracraneales preestablecidos en ratones atímicos, sin que se apreciaran efectos adversos tóxicos en el tejido cerebral normal. Un año después de finalizar el tratamiento, los ratones tratados seguían sanos y sin cáncer (Shir, A, Ogris, M, Wagner, E, y Levitzki, A; EGF receptor-targeted synthetic doublestranded RNA eliminates glioblastoma, breast cancer, and adenocarcinoma tumors in mice, PLoS. Med, 2006 Jan; 3(l):e6. Epub 2005 Dec 6).
La aplicación de ARN pequeños de interferencia (ARNsi) se ha convertido en una herramienta eficaz y muy específica para modular la expresión génica, y se ha silenciado de un modo satisfactorio una gran variedad de oncogenes. La regulación negativa del EGFR mediante ARNsi se demostró en dos estirpes celulares de glioma establecidas que presentaban diferentes niveles de expresión de este receptor (U373 MG, LN18). La expresión del ARNm y de la proteína del EGFR se regulo negativamente un 70 % -90 %. Sin embargo, el tratamiento con ARNsi no tuvo ningún efecto inhibidor sobre la proliferación, migración y estado de activación celular de las cascadas de señalización acopladas al EGFR. En concordancia con estos resultados, los análisis de la expresión génica con micromatrices solo revelaron pequeños cambios, aunque específicos, en los patrones de expresión. En suma, estos
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modificación simultánea de otros sitios nucleofílicos como sucede con la lisina y la histidina. Así pues, para la modificación de la cisteína hay disponible un gran número de reactivos. Las páginas web de empresas como Pierce Chemical Company, Sigma-Aldrich y otras ofrecen información sobre reactivos concretos.
La reducción selectiva de los puentes disulfuro de las proteínas también es habitual. El tratamiento térmico al cual se someten los productos biofarmacéuticos puede formar y oxidar puentes disulfuro. El reactivo K de Woodward se puede utilizar para modificar restos de ácido glutámico concretos. Se puede emplear N-(3-(dimetilamino)propil)-N’etilcarbodiimida para formar enlaces cruzados intramoleculares entre un resto de lisina y un resto de ácido glutámico. Por ejemplo, el dietilpirocarbonato es un reactivo empleado para la modificación de restos histidilo en proteínas. La histidina también puede modificarse con 4-hidroxi-2-nonenal. La reacción de los restos de lisina y otros grupos α-amino es útil, por ejemplo, para la unión de péptidos a superficies o para la formación de enlaces cruzados entre proteínas/péptidos. La lisina es el sitio de fijación del poli(etilen)glicol y el principal sitio de modificación en la glucosilación de proteínas. Los restos de metionina de las proteínas se pueden modificar, por ejemplo, con yodoacetamida, bromoetilamina y cloramina T. Los restos tirosilo se pueden modificar con tetranitrometano y Nacetilimidazol. La formación de enlaces cruzados por medio de la formación de ditirosina se puede efectuar con peróxido de hidrógeno/iones de cobre.
En estudios recientes sobre la modificación del triptófano se han empleado N-bromosuccinimida, 2-hidroxi-5nitrobenzilbromuro o 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-3H-indol (BPNS-escatol).
El éxito de la modificación de proteínas y péptidos terapéuticos con PEG se asocia a menudo con una prolongación de la semivida en circulación, mientras que el entrecruzamiento de proteínas con glutaraldehído, diacrilato de polietilenglicol y formaldehído se emplea en la preparación de hidrogeles. La modificación química de alérgenos para inmunoterapia se consigue a menudo mediante carbamilación con cianato potásico.
En general, los péptidos (al menos aquellos que contienen enlaces peptídicos entre los restos de aminoácidos) pueden sintetizarses utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida por el procedimiento de Fmoc-poliamida, como muestran Lu y col J. Org. Chem. 1981, 46, 3433 y las referencias que aparecen en dicho documento. La protección provisional del grupo N-amino se consigue con el grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La escisión repetida de este grupo protector muy sensible al pH básico se lleva a cabo con piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida. Los grupos funcionales de las cadenas laterales podrían protegerse si se transformaran en éteres de butilo (en el caso de la serina, treonina y tirosina), ésteres de butilo (en el caso del ácido glutámico y aspártico), derivados butiloxicarbonílicos (en la lisina y la histidina), derivados tritilados (en la cisteína) y derivados 4-metoxi-2,3,6trimetilbenzenosulfonílicos (en la arginina). Cuando los restos C-terminales son glutamina o asparragina se utiliza el grupo 4,4'-dimetoxibenzhidrilo para proteger los grupos funcionales amido de la cadena lateral. El soporte en fase sólida se basa en un polímero de polidimetil-acrilamida constituido por los tres monómeros dimetilacrilamida (monómero estructural), bisacriloiletilendiamina (reticulante) y acriloilsarcosina metiléster (funcionalizador). El agente escindible que mantiene unido el péptido a la resina es el derivado del ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético, sensible a pH ácido. Todos los derivados de aminoácidos se añaden en forma de derivados anhídridos simétricos preformados salvo la asparragina y la glutamina, que se añaden utilizando un procedimiento de acoplamiento inverso con N,Ndiciclohexil-carbodiimida/1-hidroxibenzotriazol. Todas las reacciones de acoplamiento y desprotección se controlan con procedimientos de ensayo con ninhidrina, ácido trinitrobencenosulfónico o isotina. Una vez completada la síntesis, los péptidos se separan del soporte de resina y al mismo tiempo se eliminan los grupos protectores de las cadenas laterales mediante el tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% con una mezcla de capturadores al 50 %. Los capturadores utilizados normalmente son etanditiol, fenol, anisol y agua, dependiendo de la elección exacta de los aminoácidos constituyentes del péptido que se está sintetizando. Además es posible optar por una combinación de procedimientos en fase sólida y fase en solución para la síntesis de péptidos (véase, por ejemplo, Bruckdorfer T, Marder O, Albericio F. From production of peptides in milligram amounts for research to multi-ton quantities for drugs of the future Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb; 5(l):29-43 y referencias citadas en su interior).
El ácido trifluoroacético se elimina por evaporación al vacío, con trituración posterior con dietiléter para obtener el péptido bruto. Todos los capturadores presentes se eliminan con un procedimiento de extracción simple que con la liofilización de la fase acuosa proporciona el péptido bruto exento de ellos. Para la síntesis de péptidos los reactivos pueden obtenerse, generalmente, por ejemplo, en Calbiochem-Novabiochem (RU) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Reino Unido.
La purificación puede efectuarse mediante una sola técnica o mediante una combinación de diversas técnicas, tales como recristalización, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por interacción hidrófoba, y (normalmente) cromatografía de líquidos de alto rendimiento con fase inversa utilizando,
p. ej., la separación con gradiente de acetonitrilo/agua.
El análisis de los péptidos puede efectuarse utilizando cromatografía de capa fina, electroforesis, en particular electroforesis capilar, extracción en fase sólida (CSPE), cromatografía de líquidos de alto rendimiento con fase inversa, análisis de aminoácidos tras hidrólisis ácida y análisis con espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos (FAB), así como análisis con espectrometría de masas MALDI y ESI-Q-TOF.
Otro aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico (p. ej. un polinucleótido) que codifica un péptido de la
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invención. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, de ADN, ADNc, ARN, ARNm y ARNsi o combinaciones de los mismos, mono y/o bicatenarios. Por supuesto, solo los péptidos que contengan restos de aminoácidos naturales unidos por enlaces peptídicos naturales pueden ser codificados por un polinucleótido. Otro aspecto más de la invención proporciona un vector de expresión capaz de expresar un polipéptido de acuerdo con la invención.
Se han desarrollado diversos procedimientos para unir funcionalmente polinucleótidos, especialmente ADN, a vectores, por ejemplo, a través de extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo, al segmento de ADN se le pueden añadir prolongaciones de homopolímeros complementarios para insertarlo en el vector de ADN. El vector y el segmento de ADN se unen después mediante puentes de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante.
Otro procedimiento alternativo para unir el segmento de ADN a los vectores son los enlazadores sintéticos que contienen uno o más sitios de restricción. Existen enlazadores sintéticos comerciales que contienen diversas dianas para las endonucleasas de restricción que facilitan diversos proveedores, tales como, International Biotechnologies Inc. New Haven, CN, EE. UU.
Un procedimiento deseable para modificar el ADN que codifica el polipéptido de la invención emplea la reacción en cadena de la polimerasa, tal y como exponen Saiki y col (1988) Science 239, 487-491. Este procedimiento puede utilizarse para introducir el ADN en un vector adecuado, por ejemplo diseñando las dianas de restricción adecuadas,
o puede emplearse para modificar el ADN de otros modos útiles conocidos en la técnica.
Si se opta por vectores virales, son preferibles los vectores poxvíricos o adenovíricos.
El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovíricos) puede expresarse después en un hospedador adecuado para producir un polipéptido que comprenda el péptido de la invención. Así pues, el ADN que codifica el péptido de la invención puede utilizarse de acuerdo con técnicas conocidas, modificado adecuadamente siguiendo las enseñanzas contenidas en la presente memoria para construir un vector de expresión que se emplee para transformar una célula hospedadora para que exprese y produzca el polipéptido de la invención. Tales técnicas incluyen las desveladas en las patentes de EE. UU. N. º 4. 440. 859 expedida el 3 de abril de 1984 a Rutter y col., 4.
530. 901 expedida el 23 de julio de 1985 a Weissman, 4. 582. 800 expedida el 15 de abril de 1986 a Crowl, 4. 677. 063 expedida el 30 de junio de 1987 a Mark y col., 4. 678. 751 expedida el 7 de julio de 1987 a Goeddel, 4. 704. 362 expedida el 3 de noviembre de 1987 a Itakura y col., 4. 710. 463 expedida el 1 de diciembre de 1987 a Murray, 4.
757. 006 expedida el 12 de julio de 1988 a Toole, Jr. y col., 4. 766. 075 expedida el 23 de agosto de 1988 a Goeddel y col. y 4. 810. 648 expedida el 7 de marzo de 1989 a Stalker.
El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovíricos) que codifica el polipéptido que constituye el compuesto de la invención se puede unir con una amplia variedad de secuencias de ADN distintas para introducirlo en un hospedador adecuado. El ADN acompañante dependerá de la naturaleza del hospedador, el modo de introducir el ADN en su interior y de si se pretende que se integre o que se mantenga como un episoma.
En general, el ADN se inserta en un vector de expresión, como un plásmido, con la orientación apropiada y el marco de lectura correcto para asegurar la expresión. Si es necesario, el ADN se puede enlazar con secuencias nucleotídicas de control que regulan la transcripción o la traducción y que son reconocidas por el hospedador deseado, aunque en general tales controles ya suelen estar incluidos en el propio vector de expresión. A continuación, el vector se introduce en el hospedador mediante técnicas estándar. En general, el vector no consigue transformar todos los hospedadores, lo que hará necesario seleccionar las células hospedadoras que hayan quedado transformadas. Una técnica de selección consiste en incorporar en el vector de expresión una secuencia de ADN con los elementos de control necesarios que codifique un rasgo seleccionable en la célula transformada, como por ejemplo de resistencia a antibióticos.
Otra alternativa consiste en incorporar el gen de ese rasgo seleccionable en otro vector con el que se transforma conjuntamente la célula hospedadora deseada.
Las células hospedadoras que se hayan transformado con el ADN recombinante de la invención se cultivarán después durante un tiempo suficiente y en las condiciones apropiadas que los expertos en la técnica conocen a la vista de las enseñanzas desveladas en la presente memoria para que el polipéptido pueda expresarse y, finalmente, recuperarse.
Son muchos los sistemas de expresión conocidos, como bacterias (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), levaduras (Saccharomyces cerevisiae, etc.), hongos filamentosos (género Aspergillus, etc.), células vegetales, animales o de insectos. Preferiblemente el sistema consistirá en células de mamífero, como las células de cáncer colorrectal o de glioblastoma disponibles en la ATCC Cell Biology Collection.
Un típico plásmido que sirve como vector para células de mamífero es el pSVL disponible en Pharmacia, Piscataway, NJ, EE. UU. Un ejemplo de vector de expresión inducible para mamífero es el pMSG, también suministrado por Pharmacia. Otros vectores plasmídicos de levadura que resultan útiles son pRS403-406 y pRS413416, en general disponibles en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integrativos de levadura (YIp) que incorporan los marcadores
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seleccionables de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos centroméricos de levadura (Ycp). En la técnica se conocen otros vectores y sistemas de expresión adecuados para su uso con una variedad de células hospedadoras.
La presente invención también se refiere a una célula hospedadora transformada con un vector polinucleotídico de la presente invención siendo dicha célula hospedadora una célula presentadora de antígeno.
La transformación de células hospedadoras apropiadas con una construcción de ADN de la presente invención se realiza con procedimientos bien conocidos que normalmente dependen del tipo de vector que se utilice. En lo referente a la transformación de células hospedadoras procariotas, véanse, por ejemplo, Cohen y col. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, y Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. La transformación de células de levadura aparece descrita en Sherman y col (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. El procedimiento de Beggs, Nature 1978, 275,104-109 también resulta útil. En lo que se refiere a los reactivos adecuados para transfectar las células de vertebrados, por ejemplo, el fosfato de calcio y el DEAE-dextrano o las formulaciones con liposomas, se pueden adquirir de Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EE. UU. La electroporación también es útil para la transformación y/o transfeccion de las células y es perfectamente conocida su aplicación en la transformación de células de levadura, de bacterias, de insectos y de vertebrados.
Las células transformadas con éxito, es decir, las que contengan una construcción de ADN de la presente invención, pueden identificarse con técnicas bien conocidas, tales como la PCR. Otra alternativa consiste en detectar la presencia de la proteína en el sobrenadante por medio de anticuerpos.
Se pueden utilizar células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas, para expresar los péptidos de la invención, de tal forma que puedan cargarse en las moléculas de MHC apropiadas.
La célula hospedadora es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica o una célula presentadora de antígeno. Actualmente se están investigando las células presentadoras de antígeno, cargadas con una proteína de fusión recombinante que contiene fosfatasa ácida prostática (PAP), como tratamiento para el cáncer de próstata (Sipuleucel-T) (Small EJ, Schellhammer PF, Higano CS, Redfern CH, Nemunaitis JJ, Valone FH, Verjee SS, Jones LA, Hershberg RM.; Placebo-controlled phase 3 trial of immunologic therapy with sipuleucel-T (APC8015) in patients with metastatic, asymptomatic hormone refractory prostate cancer; J Clin Oncol. 2006; 24(19):3089-3094; Rini BI, Weinberg V, Fong L, Conry S, Hershberg RM, Small EJ; Combination immunotherapy with prostatic acid phosphatase pulsed antigen-presenting cells (Provenge) plus bevacizumab in patients with serologic progression of prostate cancer after definitive local therapy; Cancer. 2006; 107(l):67-74).
Otro aspecto de la invención proporciona un procedimiento para producir un péptido. El procedimiento comprende el cultivo de la célula hospedadora y el aislamiento del péptido de dicha célula o de su medio de cultivo.
En otra realización, el péptido, el ácido nucleico o el vector de expresión de la invención, se emplean en medicina. Por ejemplo, el péptido puede prepararse para inyección por vía intravenosa (i. v.), subcutánea (s. c.), intradérmica
(i. d.), intraperitoneal (i. p.) o intramuscular (i. m.). Las vías preferidas para la inyección del péptido son s. c, i. d., i. p., i. m. e i. v. Los procedimientos preferidos para la inyección del ADN son i. d., i. m., s. c., i. p. e i. v. Según el péptido o el ADN de que se trate, se pueden administrar dosis de, por ejemplo, entre 50 µg y 1,5 mg, preferiblemente de 125 µg a 500 µg de péptido o ADN. En ensayos anteriores se han utilizado con éxito dosis de este intervalo (Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G, Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, Dyrhaug M, Trachsel S, Møller M, Eriksen JA, Gaudernack G; Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer; Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12):1553-1564; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, Reunión de ASCO 2007; Resumen N. º 3017).
Un aspecto importante de la presente invención es un procedimiento in vitro para producir CTL activados. El procedimiento comprende la puesta en contacto in vitro de CTL con moléculas de MHC de clase I humanas cargadas con antígeno y expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada durante un periodo de tiempo suficiente para activar los CTL de una manera específica de antígeno. El antígeno es un péptido de acuerdo con la invención. Preferentemente se emplea una cantidad de antígeno suficiente con una célula presentadora de antígeno.
Cuando se utilice como antígeno un epítopo de MHC de clase II, los CTL serán linfocitos cooperadores CD4 positivos, preferiblemente del tipo TH1. Las moléculas de MHC de clase II pueden expresarse en la superficie de cualquier célula adecuada pero es preferible que la célula no exprese de forma natural moléculas de MHC de clase II (en cuyo caso la célula será transfectada para expresar dicha molécula). Si, en cambio, la célula expresa de forma natural moléculas de MHC de clase II es preferible que sea defectuosa en los mecanismos de procesamiento o de presentación de los antígenos. De ese modo será posible que la célula que expresa la molécula de MHC de clase II quede completamente sensibilizada con un antígeno peptídico escogido antes de activar al CTL.
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decir, son CTL autólogos). Otra alternativa consiste en que los CTL no sean del paciente y procedan de otro individuo. Por supuesto, es preferible que el donante sea un individuo sano. Por “individuo sano” los autores de la invención entienden un individuo que goce de buen estado de salud general, preferentemente con un sistema inmunitario competente y, más preferentemente, que no padezca ninguna enfermedad que pueda detectarse fácilmente mediante análisis.
Las células diana in vivo para los CTL CD4 positivos de acuerdo con la presente invención pueden ser células del tumor (que a veces expresan MHC de clase II) y/o células estromales que envuelven el tumor (células tumorales) (que a veces también expresan MHC de clase II; (Dengjel, J, Nastke, MD, Gouttefangeas, C, Gitsioudis, G, Schoor, 0, Altenberend, F, Mulier, M, Kramer, B, Missiou, A, Sauter, M, Hennenlotter, J, Wernet, D, Stenzl, A, Rammensee, HG, Klingel, K, and Stevanovic, S; Unexpected Abundance of HLA Class II Presented Peptides in Primary Renal Cell Carcinomas, Clin Cancer Res., 2006, 12, 4163-4170)).
Los CTL de la invención pueden usarse como principios activos de una composición terapéutica. Así pues, la invención también describe un procedimiento para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresen de forma aberrante un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos de la invención. El procedimiento comprende la administración al paciente de un número eficaz de CTL tal y como se ha definido antes.
Por “expresado de forma aberrante” los autores de la invención también quieren decir que el polipéptido está sobreexpresado en comparación con los niveles normales de expresión o que el gen está reprimido en el tejido del que deriva el tumor pero en cambio se expresa en éste. Por “sobreexpresado” los autores de la invención quieren decir que el nivel del polipéptido es como mínimo 1,2 veces mayor que el nivel presente en el tejido normal; preferiblemente como mínimo 2 veces mayor, y más preferiblemente como mínimo 5 o 10 veces mayor que el del tejido normal.
Los CTL pueden obtenerse a través de procedimientos conocidos en la materia, tales como, por ejemplo, los descritos anteriormente.
Los protocolos para esta transferencia de CTL, denominada adoptiva, se conocen perfectamente en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo en: (Rosenberg, SA, Lotze, MT, Muul, LM, Chang, AE, Avis, FP, Leitman, S, Linehan, WM, Robertson, CN, Lee, RE, Rubin, JT, y col., A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interIeukin-2 or high-dose interleukin-2 alone, N. Engl. J. Med., 1987, 316, 889-897; Rosenberg, SA, Packard, BS, Aebersold, PM, Solomon, D, Topalian, SL, Toy, ST, Simon, P, Lotze, MT, Yang, JC, Seipp, CA, y col.; Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma. A preliminary report, N. Engl. J Med, 1988, 319, 1676-1680; Dudley, ME, Wunderlich, JR, Robbins, PF, Yang, JC, Hwu, P, Schwartzentruber, DJ, Topalian, SL, Sherry, R, Restifo, NP, Hubicki, AM, Robinson, MR, Raffeld, M, Duray, P, Seipp, CA, Rogers-Freezer, L, Morton, KE, Mavroukakis, SA, White, DE, y Rosenberg, SA; Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes, Science, 2002, 298, 850-854; Yee, C, Thompson, JA, Byrd, D, Riddell, SR, Roche, P, Celis, E, and Greenberg, PD; Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+ T cell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma: in vivo persistence, migration, and antitumor effect of transferred T cells, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 2002, 99, 16168-16173; Dudley, ME, Wunderlich, JR, Yang, JC, Sherry, RM, Topalian, SL, Restifo, NP, Royal, RE, Kammula, U, White, DE, Mavroukakis, SA, Rogers, LJ, Gracia, GJ, Jones, SA, Mangiameli, DP, Pelletier, MM, Gea-Banacloche, J, Robinson, MR, Berman, DM, Filie, AC, Abati, A, y Rosenberg, SA; Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma, J. Clin. Oncol., 2005, 23, 2346-2357); y aparecen revisados en (Gattinoni, L, Powell, DJ, Jr., Rosenberg, SA, y Restifo, NP; Adoptive immunotherapy for cancer: building on success, Nat. Rev. Immunol., 2006, 6, 383-393) y (Morgan, RA, Dudley, ME, Wunderlich, JR, Hughes, MS, Yang, JC, Sherry, RM, Royal, RE, Topalian, SL, Kammula, US, Restifo, NP, Zheng, Z, Nahvi, A, de Vries, CR, Rogers-Freezer, LJ, Mavroukakis; SA, y Rosenberg, SA; Cancer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes, Science, 2006, 314 (5796): 126-129).
Cualquier molécula de la invención, ya sea péptido, ácido nucleico, vector de expresión, célula o CTL activado es útil para el tratamiento de trastornos caracterizados por células que eluden la respuesta inmunitaria. Por consiguiente, cualquier molécula de la presente invención puede utilizarse como medicamento o en la fabricación de un medicamento. La molécula puede utilizarse sola o combinada con otra molécula o moléculas de la invención o con cualquier molécula o moléculas conocidas.
Preferiblemente, el medicamento es una vacuna. La vacuna puede administrarse directamente al paciente, en el órgano afectado o por vía sistémica, o aplicarse ex vivo a células procedentes del paciente o a una estirpe celular humana que después se administra al paciente, o utilizarse in vitro para seleccionar una subpoblación de células inmunitarias procedentes del paciente, que después vuelven a administrarse al mismo. Si el ácido nucleico se administra a células in vitro, puede ser útil que estas células se transfecten para que expresen simultáneamente citocinas inmunoestimuladoras, como la interleucina-2. El péptido puede ser sustancialmente puro, o combinarse con un adyuvante inmunoestimulador (véase más adelante) o utilizarse en combinación con citocinas inmunoestimuladoras, o administrarse mediante un sistema de liberación adecuado, como por ejemplo liposomas. El péptido también puede conjugarse con un transportador adecuado, tal como hemocianina de lapa californiana (KLH)
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o manano (véase el documento WO 95/18145 y Longenecker y col. (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690, 276-291). El péptido también puede estar marcado, o ser una proteína de fusión, o ser una molécula híbrida. Se espera que los péptidos de la presente invención estimulen a los CTL CD4 o CD8. No obstante, la estimulación es más eficiente si se cuenta con la ayuda de los linfocitos T positivos para el CD opuesto. Así pues, en el caso de los epítopos de MHC de clase II que estimulan a los CTL CD4, el compañero de fusión, o las secciones de una molécula híbrida adecuada, proporcionan epítopos que estimulan a los linfocitos T CD8 positivos. Por otro lado, en el caso de los epítopos de MHC de clase I que estimulan a los CTL CD8, el compañero de fusión, o las secciones de una molécula híbrida adecuada, proporcionan epítopos que estimulan a los linfocitos T CD4 positivos. Los epítopos estimuladores de los CD4 y los CD8 son bien conocidos en la técnica e incluyen los identificados en la presente invención.
En un aspecto de la invención, la vacuna comprende al menos un péptido, preferiblemente dos a 50, más preferiblemente dos a 25, incluso más preferiblemente dos a 15 y más preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o trece péptidos como los dados a conocer o péptidos adicionales. El péptido, o los péptidos, pueden proceder de uno o más AAT específicos y pueden unirse a moléculas de MHC de clase I y/o II.
Preferiblemente, cuando el péptido de la invención se usa en una vacuna o medicamento de la invención, está presente en forma de sal, tal como, por ejemplo, pero sin limitación, una sal de acetato o una sal de cloruro. El ejemplo 7 presenta estudios con la vacuna IMA-910, que contiene algunos de los péptidos dados a conocer y describe la preparación de la misma usando péptidos en su forma de sal y su tamaño de partícula.
El polinucleótido puede ser sustancialmente puro, o estar contenido en un vector o en un sistema de liberación adecuado. El ácido nucleico puede ser ADN, ADNc, ARN o una combinación de los mismos. En la técnica, los procedimientos para diseñar e introducir dicho ácido nucleico, son muy conocidos. Se puede obtener una visión general, por ejemplo, en S. Pascolo: Vaccination with messenger RNA Methods Mol Med 2006, 127; 23-40; R. Stan, JD Wolchok y AD Cohen DNA vaccines against cancer Hematol Oncol Clin North Am 2006, 3; 613-636 o en A Mahdavi y BJ Monk Recent advances in human papillomavirus vaccines Curr Oncol Rep 2006, 6, 465-472. Las vacunas polinucleotídicas son fáciles de preparar, pero el modo de acción por el cual tales vectores inducen una respuesta inmunitaria no se conoce con exactitud. Los vectores y sistemas de liberación adecuados incluyen los de ADN y/o ARN viral, como los sistemas basados en adenovirus, virus vacunal, retrovirus, herpesvirus, virus adenoasociados o híbridos que contienen elementos de más de un virus. Los sistemas de liberación no virales incluyen lípidos catiónicos y polímeros catiónicos y se conocen bien en las técnicas de liberación de ADN. También puede utilizarse la liberación física, tal como la “pistola génica”. El péptido o péptido codificado por el ácido nucleico, puede ser una proteína de fusión, por ejemplo, con un epítopo que estimule los linfocitos T para el respectivo CDR opuesto, tal y como se ha indicado anteriormente.
El medicamento de la invención también puede incluir uno o más adyuvantes. Los adyuvantes son sustancias que potencian o estimulan de forma inespecífica la respuesta inmunitaria (p. ej. respuestas inmunitarias mediadas por CTL y por linfocitos T cooperadores (TH) contra un antígeno, y por tanto, podrían considerarse útiles en el medicamento de la presente invención. Como adyuvantes adecuados se incluyen, pero sin limitación: 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax, AS 15, BCG, CP-870.893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, monofosforil lípido A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, sistema de vectores PepTel®, micropartículas de PLG, resiquimod, SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys, estimulón QS21 de Aquila, que procede de la saponina, extractos de micobacterias y miméticos sintéticos de la pared celular bacteriana, y otros adyuvantes patentados como Detox de Ribi, Quil o Superfos. Se prefieren adyuvantes tales como e, adyuvante de Freund o el GM-CSF. Anteriormente se han descrito diversos adyuvantes inmunitarios (p. ej., MF59) específicos para las células dendríticas y su preparación (Dupuis M, Murphy TJ, Higgins D, Ugozzoli M, van Nest G, Ott G, McDonald DM; Dendritic cells internalize vaccine adjuvant after intramuscular injection; Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison AC; The mode of action of immunological adjuvants; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11). También pueden utilizarse citocinas. A varias citocinas se les ha atribuido una influencia directa en la migración de las células dendríticas hacia los tejidos linfoides (p. ej. el TNF-α), como parte de un proceso que acelera su maduración hasta convertirlas en células presentadoras antígeno de los linfocitos T (p. ej. GM-CSF, IL-1 e IL-4) (Patente de EE. UU. N. º 5. 849. 589) y en el que actúan como inmunoadyuvantes (p. ej. la IL-12) (Gabrilovich DI, Cunningham HT, Carbone DP; IL-12 and mutant P53 peptide-pulsed dendritic cells for the specific immunotherapy of cancer; J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418).
También se ha descrito que los oligonucleótidos de CpG inmunoestimuladores potencian los efectos de los adyuvantes en las vacunas. Sin limitarse a la teoría, los oligonucleótidos de CpG actúan activando el sistema inmunitario innato (no adaptativo) a través de los receptores de tipo Toll (TLR), principalmente el TLR9. La activación del TLR9 desencadenada por los CpG potencia las respuestas humorales y celulares específicas de antígeno contra una amplia gama de antígenos, incluidos antígenos peptídicos o proteicos, virus vivos o muertos, vacunas de células dendríticas, vacunas de células autólogas y conjugados de polisacáridos, tanto en vacunas profilácticas como terapéuticas. Más importante aún, potencian la maduración y la diferenciación de las células dendríticas, lo que produce una mayor activación de los linfocitos TH1 y una generación más potente de linfocitos T citotóxicos (CTL), incluso sin la ayuda de los linfocitos T CD4. La tendencia hacia la respuesta TH1 provocada por la estimulación del TLR9 se mantiene incluso en presencia de adyuvantes vacunales como el aluminio o el adyuvante de Freund
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incompleto (IFA) que normalmente promueven un sesgo hacia la respuesta TH2. Los oligonucleótidos de CpG muestran incluso una mayor actividad adyuvante cuando se formulan o administran conjuntamente con otros adyuvantes o en formulaciones como micropartículas, nanopartículas, emulsiones de lípidos o formulaciones similares, que son especialmente necesarias para inducir una respuesta potente cuando el antígeno es relativamente débil. También aceleran la respuesta inmunitaria y permiten reducir las dosis de antígeno aproximadamente en dos órdenes de magnitud, habiendo obtenido en algunos experimentos respuestas de anticuerpos comparables a las conseguidas con la dosis completa de vacuna sin CpG (Arthur M. Krieg, Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation, Nature Reviews, Drug Discovery, 5, June 2006, 471-484). La patente de EE. UU. N. º 6. 406. 705 B1 describe el uso combinado de oligonucleótidos de CpG, adyuvantes que no son ácidos nucleicos y un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Un componente preferido de la composición farmacéutica de la presente invención es un antagonista CpG del TLR9 comercial conocido como dSLIM (inmunomodulador en horquilla doble), fabricado por Mologen (Berlín, Alemania). También se pueden utilizar otras moléculas que se unen a los TLR como ARN que se unen a TLR 7, TLR 8 y/o TLR 9.
Otros ejemplos de adyuvantes útiles incluyen, pero sin limitación, CpG químicamente modificados (p. ej. CpR, Idera), Poli(I:C), como AmpliGen, ADN o ARN bacteriano sin CpG, así como pequeñas moléculas inmunoactivas y anticuerpos como ciclofosfamida, sunitinib, bevacizumab, celebrex, NCX-4016, sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo, sorafinib, XL-999, CP-547632, pazopanib, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4 y SC58175, que pueden actuar terapéuticamente y/o como adyuvantes. Las cantidades y concentraciones de adyuvantes y de aditivos útiles en el contexto de la presente invención pueden determinarse fácilmente por los expertos en la técnica sin demasiada experimentación.
Los adyuvantes preferidos son dSLIM, BCG, OK432, ALDARA, PeviTer y JuvImmune.
Preferiblemente los medicamentos de la presente invención son activos contra el cáncer. El cáncer puede ser no metastásico o metastásico, en concreto cáncer de la cavidad bucal o la faringe, cáncer del tubo digestivo, cáncer de colon, recto o ano, cáncer de las vías respiratorias, cáncer de mama, cáncer de cuello de útero, vagina o vulva, cáncer del cuerpo uterino y de ovario, cáncer de las vías genitales masculinas, cáncer de las vías urinarias, cáncer de hueso y tejidos blandos, sarcoma de Kaposi, melanoma cutáneo, melanoma ocular, y cáncer ocular no melanómico, cáncer de cerebro y del sistema nervioso central, cáncer de tiroides y de otras glándulas endocrinas, linfoma de hodgkin, linfoma no hodgkiniano y mieloma. Más preferiblemente el trastorno neoplásico tratado con el procedimiento de la presente invención es cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de estómago, GIST o glioblastoma.
Como el péptido de la invención se aisló de glioblastoma y de cáncer colorrectal, pancreático, pulmonar, renal y gástrico, el medicamento de la invención será especialmente útil si el cáncer a tratar es un glioblastoma o un cáncer colorrectal, pancreático, pulmonar, renal o gástrico.
Además de ser útil para el tratamiento del cáncer, los péptidos como los descritos, son útiles para el diagnóstico. Puesto que los péptidos se generaron de glioblastoma y se ha determinado que no están presentes en los tejidos normales, dichos péptidos pueden utilizarse para diagnosticar la presencia de un cáncer
La presencia de los péptidos como los descritos, en biopsias de tejido, puede ayudar al histopatólogo a diagnosticar un cáncer. La detección de algunos de los péptidos descritos mediante anticuerpos, espectrometría de masas u otros procedimientos conocidos en la técnica, puede advertir al histopatólogo de que el tejido es maligno o que está inflamado o enfermo. La presencia de grupos de péptidos como los descritos puede permitir la clasificación o subclasificación de los tejidos enfermos.
La detección de los péptidos como los descritos, en una muestra de tejido enfermo, puede ayudar a decidir si los tratamientos que implican al sistema inmunitario pueden ser beneficiosos, sobre todo si se sabe o se espera que los linfocitos T estén implicados en el mecanismo de acción. La pérdida de expresión de MHC es un mecanismo muy conocido con el que las células infectadas o cancerosas logran eludir la vigilancia del sistema inmunitario. Así pues, la presencia de los péptidos como los descritos, indica que las células analizadas no utilizan este mecanismo.
Los péptidos dados a conocer, pueden utilizarse para analizar las respuestas de los linfocitos contra ellos, como son las respuestas de los linfocitos T o de los anticuerpos contra los péptidos como los descritos o los péptidos como los descritos formando complejos con moléculas de MHC. Estas respuestas de los linfocitos pueden utilizarse como marcadores pronósticos para decidir los pasos posteriores del tratamiento. Dichas respuestas también pueden utilizarse como marcadores indirectos en las estrategias de inmunoterapia destinadas a estimular respuestas linfocitarias a través de diferentes medios, tales como, por ejemplo, la vacunación con proteínas, ácidos nucleicos, materiales autólogos, o la transferencia de linfocitos de donantes. En el ámbito de la terapia génica, las respuestas de los linfocitos contra los péptidos como los descritos pueden tenerse en cuenta para la evaluación de efectos secundarios. El control de las respuestas de los linfocitos también puede ser una herramienta valiosa para el seguimiento en trasplantes, por ejemplo, con el fin de detectar enfermedades del injerto contra el hospedador y del hospedador contra el injerto.
Los péptidos de la presente invención pueden utilizarse para generar y desarrollar anticuerpos específicos contra
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complejos MHC/péptido. Estos pueden utilizarse como terapia, dirigiendo toxinas o sustancias radiactivas contra el tejido enfermo. Otro uso de estos anticuerpos consistiría en dirigir radionúclidos contra el tejido enfermo en aplicaciones de diagnóstico por imagen, como la TEP. Este uso puede ayudar a detectar metástasis pequeñas o a determinar el tamaño y la ubicación exacta de los tejidos enfermos. Además, los péptidos pueden utilizarse para verificar el diagnóstico histopatológico de un cáncer basado en una muestra de biopsia.
Se describe un kit que comprende (a) un envase que contiene una composición farmacéutica como la descrita anteriormente, en forma de solución o liofilizada; (b) opcionalmente, un segundo envase que contiene un diluyente o una solución de reconstitución para la formulación liofilizada; y (c) opcionalmente, instrucciones para (i) el uso de la solución o (ii) la reconstitución y/o el uso de la formulación liofilizada. Dicho kit puede comprender además uno o más de los siguientes componentes: (iii) un tampón, (iv) un diluyente, (v) un filtro, (vi) una aguja, o (vii) una jeringa. El envase es preferiblemente un frasco, un vial, una jeringa o un tubo de ensayo; puede ser un envase multiusos. Se prefiere que la composición farmacéutica esté liofilizada.
Los kit como los descritos, comprenden preferiblemente una formulación liofilizada de la presente invención en un envase adecuado e instrucciones para su reconstitución y/o uso. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales (p. ej. viales con doble cámara), jeringas (como jeringas con doble cámara) y tubos de ensayo. El envase puede estar formado por materiales diversos como vidrio o plástico. Preferiblemente el kit y/o envase contienen o van acompañados de instrucciones de reconstitución y/o uso. Por ejemplo, la etiqueta prospecto puede indicar que la formulación liofilizada debe reconstituirse para obtener ciertas concentraciones de péptidos como las descritas anteriormente. La etiqueta puede indicar, además, que la formulación puede administrarse o está destinada a la administración subcutánea.
El envase que contiene la formulación puede ser un vial multiuso que permita varias administraciones (p. ej. de 2 a 6 administraciones) de la formulación reconstituida. El kit puede comprender, además, un segundo envase que contenga un diluyente adecuado (p. ej., una solución de bicarbonato sódico).
Después de mezclar el diluyente y la formulación liofilizada, la concentración final del péptido en la formulación reconstituida es preferiblemente como mínimo de 0,15 mg/ml/péptido (=75 µg) y preferiblemente como máximo de 3 mg/ml/péptido (=1500 µg). El kit también puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, tales como otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.
Los kit que se describen pueden tener un solo envase que contenga la formulación de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención, acompañado o no de otros componentes (p. ej. otros compuestos o composiciones farmacéuticas de estos otros compuestos) o pueden tener un envase distinto para cada componente.
Preferiblemente, los kits como los descritos incluyen una formulación de la invención acondicionada para su uso y que se administra conjuntamente con un segundo compuesto (tal como un adyuvante (p. ej. GM-CSF), un agente quimioterapéutico, un producto natural, una hormona o un antagonista, un inhibidor o un agente antiangiogénesis, un inductor de la apoptosis o un quelante) o una composición farmacéutica de los mismos. Los componentes del kit pueden agruparse previamente o cada componente puede estar en un envase distinto separado antes de la administración al paciente. Los componentes del kit pueden proporcionarse en una o más soluciones líquidas, preferiblemente en una solución acuosa y, con mayor preferencia, en una solución acuosa estéril. Los componentes del kit también pueden facilitarse en forma de sólidos, y pueden convertirse en líquidos añadiendo los disolventes adecuados, que preferiblemente se proporcionan en otro envase distinto.
El envase de un kit terapéutico puede ser un vial, un tubo de ensayo, un matraz, un frasco, una jeringa, o cualquier otro medio para contener un sólido o un líquido. Si hay más de un componente, normalmente el kit contendrá un segundo vial u otro envase para permitir la dosificación por separado. El kit también puede contener otro envase para un líquido farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el kit terapéutico contendrá un aparato (p. ej., una o varias agujas, jeringas, cuentagotas, pipeta, etc.) para permitir la administración de los agentes de la invención que son componentes del presente kit.
La formulación farmacéutica de la presente invención es toda aquella que sea adecuada para la administración de los péptidos a través de cualquier vía aceptable como la oral (enteral), nasal, oftálmica, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa o transdérmica. Preferiblemente la administración será por vía subcutánea, y más preferiblemente intradérmica. Se puede utilizar una bomba de infusión para la administración.
Ejemplos
1. Síntesis y estructura
Los péptidos se sintetizaron mediante procedimientos convencionales y bien establecidos de síntesis en fase sólida utilizando química Fmoc. Después de la purificación con HPLC preparativa, se aplicó un procedimiento de intercambio iónico para incorporar contraiones (acetato o cloruro) fisiológicamente compatibles. Por último, se sometieron a liofilización y se obtuvo una sustancia sólida blanca o casi blanca. Todos los TUMAP se administran en forma de sales de acetato excepto el IMA-CCN-001 que se administra en forma de sal de cloruro por razones
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técnicas durante el proceso de fabricación.
2. Identificación de péptidos asociados a tumor (TUMAP) presentados en la superficie celular
Muestras de tejido
Los tejidos tumorales y sanos procedentes de pacientes fueron facilitados por varios centros clínicos (véase la Tabla más adelante). Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la intervención quirúrgica. Los tejidos se criogenizaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la operación y permanecieron a -80ºC hasta el aislamiento de los TUMAP.
Aislamiento de los péptidos HLA de las muestras de tejido
Las mezclas de péptidos HLA de las muestras de tejido criogenizadas se obtuvieron por inmunoprecipitación de los tejidos sólidos según un protocolo ligeramente modificado (Falk, K. Rotzschke, O., Stevanovic, S., Jung, G. y Rammensee, H. G. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eiuted from MHC molecules. Nature 351, 290-296 (1991); Seeger, F. H. y col. The HLA-A*6601 peptide motif: prediction by pocket structure and verification by peptide analysis. Immunogenetics 49, 571-576 (1999)) usando el anticuerpo específico de HLA-A*02 BB7. 2, el anticuerpo específico de HLA-A, B y C W6/32, sefarosa activada con CNBr, tratamiento con ácido y ultrafiltración.
Detección de los TUMAP mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas ESI (ESI-LCMS)
Las mezclas de péptidos HLA obtenidas se separaron en función de su hidrofobicidad por cromatografía de fase inversa (CapLC, Waters) y los péptidos eluidos se analizaron con un espectrómetro de masas en tándem híbrido con analizadores cuadrupolar y de tiempo de vuelo con aceleración ortogonal (Q-TOF Ultima, Waters) equipado con una fuente ESI. Las mezclas de péptidos se cargaron en una precolumna de C18 para proceder a la concentración y desalación. Una vez cargada, la precolumna se colocó en línea para la separación con una columna microcapilar de sílice fundido (75 µm de d. i. x 250 mm) rellena con material de fase inversa C18 de 5 µm (Dionex). El disolvente A era acetato de amonio 4 mM/agua. El disolvente B era acetato de amonio 2 mM en acetonitrilo al 80 %/agua. El pH de los dos disolventes se ajustó a 3,0 con ácido fórmico. Se aplicó un gradiente binario del 15 % al 60 % de B en 90 minutos, con un caudal de 5 µl/min reducido aproximadamente a 200 nl/min por un sistema de fraccionamiento. Para la introducción en la fuente micro-ESI se empleó un capilar de vidrio recubierto de oro (PicoTip, New Objective). El tiempo de integración del analizador TOF quedó ajustado en 1,9 s con una pausa entre barridos de 0,1 s. A continuación se reveló la identidad de las secuencias peptídicas mediante espectrometría de masas (ESI-LCMS/MS) con disociación inducida por colisión (CID). La secuencia del TUMAP identificada se confirmó comparando el patrón de fragmentación generado por el TUMAP natural con el patrón de fragmentación de un péptido de referencia sintético de secuencia idéntica.
Las Figuras 1 y 2 muestran a modo de ejemplo espectros obtenidos de tejido tumoral de varios TUMAP asociados a MHC de clase I (Fig. 1a-1h) y a MHC de clase II (Fig. 2a-2f).
3. Perfiles de expresión de genes que codifican los péptidos
Los péptidos identificados como presentes en la superficie de las células tumorales a través de las moléculas de MHC probablemente son capaces de estimular los linfocitos T con una alta especificidad de reconocimiento contra el tumor del cual proceden. A fin de minimizar el riesgo de que la vacuna con tales péptidos genere autoinmunidad los autores de la invención se centraron en los péptidos procedentes de proteínas que aparecen sobreexpresadas en las células tumorales en comparación con la mayoría de los tejidos normales.
El péptido ideal sería el procedente de una proteína que sea exclusiva del tumor y no esté presente en ningún otro tejido. Para identificar los péptidos que procedían de genes dotados con una expresión ideal, los péptidos identificados se asignaron a las proteínas y a los genes, respectivamente, de los que procedían y se generaron los perfiles de expresión de dichos genes.
Fuentes de ARN y preparación
Las muestras de tejido extirpado fueron facilitadas por diversos centros clínicos (véase Tabla 2); todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito.
Las muestras de tejido tumoral se congelaron instantaneamente en nitrógeno líquido inmediatamente después de la operación y se homogeneizaron a mano en un mortero con nitrógeno líquido. El ARN total se preparó a partir de estas muestras con TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y después se purificó con RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania); ambos procedimientos se efectuaron siguiendo las instrucciones del fabricante.
El ARN total procedente de tejidos humanos sanos se obtuvo por canales comerciales (Ambion, Huntingdon, Reino Unido; Clontech, Heidelberg, Alemania; Stratagene, Amsterdam, Holanda; BioChain, Hayward, CA, EE. UU.). El ARN de varios individuos (de 2 a 123 individuos) se mezcló de tal modo que el ARN de cada uno de ellos estuviera representado en la misma proporción. Cuatro voluntarios sanos donaron sangre de la que se extrajeron los
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secuencia principal. Como control positivo se empleó el ODC-001, un TUMAP identificado anteriormente (M. Diehl, tesis doctoral 1998, Universidad de Tubinga) y presente en un gran número de tumores de colon.
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5. Unión de los péptidos restringidos a HLA de clase I a HLA-A*0201
El ensayo de unión a HLA se realizó con el Kit ELISA EpI (proporcionado por Sceren Buus, Instituto de Inmunología y Microbiología Médicas de la Universidad de Copenhague, Dinamarca) siguiendo las indicaciones de Sylvester-Hvid (Sylvester-Hvid, C, Kristensen, N, Blicher, T, Ferre, H, Lauemoller, SL, Wolf, XA, Lamberth, K, Nissen, MH, Pedersen, LO, y Buus, S; Establishment of a quantitative ELISA capable of determining peptide -MHC class I interaction, Tissue Antigens, 2002, 59, 251-258) y del manual del fabricante del Kit ELISA EpI.
Preparación de las soluciones de péptidos
Los péptidos se disolvieron en DMSO + TFA al 0,5 % (Merck, Darmstadt, Alemania) hasta una concentración de 10 mg/ml. La solución de trabajo más alta usada en este ensayo fue de 200 µM, resultado de diluir la solución madre a
1:50 con tampón de dilución para péptidos (PBS con Lutrol-F68 al 0,1 % y rojo de fenol 10 mg/l) hasta un volumen final de 100 µl. Se hizo una dilución seriada 5x con tampón de dilución para péptidos.
Replegamiento de los complejos de HLA-A*0201/péptido
De acuerdo con las indicaciones del manual de instrucciones, se preparó una solución de HLA-A*0201 concentrada 2x mezclando tampón pH 3x (pH 6,6), Lutrol-F68, β2m humana y HLA-A*0201 recombinante (todos incluidos en el Kit ELISA EpI) con PBS.
Para el proceso de replegamiento se mezclaron 15 µl de las diluciones seriadas del péptido con 15 µl de la mezcla de MHC concentrada 2x en placas de 96 pocillos (Nunc, Rochester, NY, EE. UU.) que se incubaron a 18 °C durante 48 horas.
Cuantificación de los complejos mediante ELISA
Se recubrieron placas Maxisorp (Nunc, Rochester, NY, EE. UU.) con anticuerpo w6/32 5 µg/ml diluido en tampón de recubrimiento (pH 9,6), se incubaron durante 24 h a 4 °C y se bloquearon con PBS al que se había añadido leche en polvo desnatada al 5 % (Merck, Darmstadt, Alemania) hasta el día siguiente a 4 °C.
El patrón del complejo MHC (Kit ELISA EpI) se diluyó con PBS al que se había añadido leche en polvo desnatada (LPD) al 2 % (LPD/PBS) hasta una concentración de 10 nM. Se preparó una dilución seriada 3,16 x y se transfirió a una placa Maxisorp recubierta y bloqueada. Los complejos de péptido-MHC se diluyeron 10x con LPD/ PBS al 2 %, se transfirieron a la misma placa Maxisorp y se incubaron durante 2 horas a 4 °C. Se añadió anticuerpo de conejo anti-hβ2m (Kit ELISA EpI) diluido 1:2500 en una solución de LPD/ PBS al 2 %, y se incubó 1 hora a 4 °C. El tampón de amplificación (polímero de anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con HRP) y suero de ratón (ambos suministrados con el Kit ELISA EpI) se diluyeron con LPD/PBS al 2 %, se añadieron a las placas y se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación se añadió el tampón de desarrollo (tetrametilbencidina, TMB; Kit ELISA EpI) y las placas se incubaron a oscuras durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo añadiendo ácido sulfúrico 0,2 M (VWR, Darmstadt, Alemania). Las placas se leyeron a una D.O. de 450 nm con el lector de ELISA VERSAmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.).
Los datos se interpretaron con Excel y Prism®, Graphpad 3.0.
Los resultados se muestran en la Figura 4. Cuanto más bajo es el valor de KD mayor es la afinidad hacia el HLAA*0201. Las afinidades de unión abarcaron un amplio abanico de aproximadamente cuatro décadas, pero la mayoría de los péptidos presentaron afinidades similares dentro de una década (C20-001, ODC-001, PCN-001, TOP-001). La afinidad de MUC-001 se sitúa alrededor de una década por debajo de la mayoría de los ligandos incluidos, pero pese a ello dicho péptido fue capaz de inducir la respuesta de los linfocitos T en una vacuna empleada contra el carcinoma renal (Wierecky, J, Muller, MR, Wirths, S, Haider-Oehler, E, Dorfel, D, Schmidt, SM, Hantschel, M, Brugger, W, Schroder, S, Horger, MS, Kanz, L, y Brossart, P; Immunologic and clinical responses after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells in metastatic renal cancer patients, Cancer Res., 2006, 66, 5910-5918). Por otra parte, NOX-001 presenta una afinidad de unión ligeramente mayor y TGFBI-001 presenta la afinidad más potente, con un valor KD unas 100 veces menor que la mayoría de los demás péptidos.
En términos absolutos, los valores KD comprendidos entre 0,01 y 0,1 nM como los que se observan en la mayoría de estos péptidos ya representan una unión potente. También se han observado afinidades similares en péptidos contenidos en la vacuna contra el carcinoma de células renales IMA901, que ha sido probada con éxito (H. Singh-Jasuja, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, P. Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; Correlation of T-cell response, clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cell carcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine; Reunión de ASCO 2007 Póster n.º 3017; M. Staehler, A. Stenzl,
P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, Reunión de ASCO 2007; Póster n.º 3017). En definitiva, las propiedades de unión de los péptidos como los descritos son bastante similares a las de los péptidos que han demostrado generar una respuesta de los linfocitos T in vivo.
6. Inmunogenicidad in vitro de los péptidos presentados por MHC de clase I
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(continuación)
Antígeno
Inmunogenicidad detectada
ODC-001
sí
CCN-001
sí
PTP-001
sí
CHI-001
sí
JAK-001
sí
Tabla 3a: Inmunogenicidad in vitro de los péptidos
Antígeno
Donantes positivos / donantes analizados Pocillos positivos / pocillos analizados
IMA-HBV-001
7/16(44 %) 10/107(9 %)
IMA-TGFBI-001
3/4 (75 %) 4/22 (18 %)
IMA-NOX-001
3/5 (60 %) 9/60 (15 %)
IMA-PCN-001
3/4 (75 %) 4/42 (10 %)
IMA-TOP-001
2/5 (40 %) 7/72 (10 %)
IMA-C20-001
1/5 (20 %) 1/60 (2 %)
IMA-ODC-001
1/5 (20%) 1/60 (2%)
IMA-HBV-001
2/5 (40%) 10/54 (19%)
IMA-CEA-004
4/4 (100%) 50/60 (83% )
IMA-CCN-001
5/5 (100%) 42/54 (78%)
IMA-MET-001
4/6 ( 67% ) 30/72 (42%)
5 Aquí se resumen los resultados de los experimentos de inmunogenicidad in vitro llevados a cabo por los autores de la invención. Los resultados se han obtenido mediante estimulación de linfocitos CD8+ con microperlas de alta densidad. La variabilidad de los lotes de suero humano puede influir, y mucho, en los resultados de las pruebas de inmunogenicidad, por lo que solo se evaluaron los ensayos en los que se usó un único lote de suero.
7. Inmunogenicidad in vitro de los péptidos presentados por MHC de clase II
10 Los linfocitos T cooperadores desempeñan una importante función de apoyo a los CTL para activar y mantener la respuesta inmunitaria contra las células tumorales. Por tanto, en la vacuna IMA910 se incluyeron péptidos MHC de clase II. El TGFBI-004, uno de los tres péptidos de clase II presentes en IMA910, se analizó para determinar su potencial inmunogénico in vitro y demostró ser un inductor de linfocitos T específicos tanto CD4+ como CD8+. La generación de linfocitos T CD4+ y CD8+ funcionales se demostró en experimentos con estimulaciones realizados en
15 un sistema autólogo.
Principio de la prueba
La sensibilización y la expansión de linfocitos T CD4+ y CD8+ humanos específicos se analizó in vitro mediante la sensibilización de PBMC carentes de monocitos con células dendríticas autólogas y la reestimulación con PBMC autólogas. En resumen, para generar los linfocitos T CD4+ específicos de antígeno se estimularon PBMC 20 desprovistas de monocitos procedentes de un donante sano (genotipo HLA de clase I: A1/A25/B8/B18 y clase II: DQB1*02/DQB1*06/DRB1*03/DRB1*15/DRB3/DRB5) con células dendríticas autólogas pulsadas con el péptido y se reestimularon con PBMC autólogas más péptido. Como sistema de lectura se evaluó la producción de IFN-γ con ELISPOT y citometría de flujo tras la reestimulación de corta duración. Tras ocho estimulaciones, los linfocitos T se analizaron con ELISPOT y tinción intracelular del IFN-γ más CD4-FITC y CD8-PerCP para determinar el porcentaje
25 de células productoras de dicho interferón en las diversas subpoblaciones de linfocitos T. Como control negativo del experimento se usaron células estimuladas con el péptido TGFBI-004 recogidas de pocillos distintos, agrupadas e incubadas con el péptido irrelevante.
Generación de células dendríticas (CD)
Las células dendríticas (CD) humanas se obtuvieron de monocitos cultivados en medio para CD consistente en 30 RPMI 1640-Glutamax/25mM Hepes (Invitrogen, Alemania) complementado con plasma autólogo al 10 %/penicilina
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dividir en linfocitos de alta y baja avidez. Como se ha demostrado anteriormente (Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, y Stevanovic, S; Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 2003, 171, 4974-4978), se pueden generar CTL humanos de gran avidez usando menos péptido para la activación que en el caso de los linfocitos T CD8+ de baja avidez. También se ha demostrado que las células expandidas de esa forma son más eficaces a la hora de reconocer las estirpes de células tumorales que expresan el antígeno, por lo que podrían constituir una herramienta importante para el desarrollo de estrategias terapéuticas.
A fin de determinar la capacidad de los péptidos para generar estirpes de CTL de alta avidez, los linfocitos CD8+ humanos aislados se sensibilizaron y expandieron mediante repetidas estimulaciones in vitro con perlas recubiertas de pMHC en baja densidad (complejo péptido-MHC) y anticuerpo anti-CD28 en presencia de IL-12 e IL-2. Al cabo de tres estimulaciones, una parte de los linfocitos T sensibilizados in vitro se sometió a tinción con tetrámeros de pMHC y a análisis por citometría. Las células tetrámero-positivas de cada donante se agruparon después según la especificidad hacia el antígeno, se tiñeron con tetrámetros de pMHCy con el anticuerpo anti-CD8-FITC humano y, por último, se sometieron a cribado por FACS en un citómetro FACSAria. Las células seleccionadas se cultivaron y expandieron en presencia de células nodriza irradiadas, citocinas y mitógeno. Para averiguar si se generaban linfocitos específicos de antígeno con alta avidez sensibilizados, se procedió a la tinción con tetrámeros de pMHC. Y para determinar su funcionalidad se analizó la producción de IFN-γ con ELISPOT y se examinó la destrucción de estirpes de células tumorales con un ensayo de citotoxicidad con tinción vital después de reestimular a las células con el péptido correspondiente y las pertinentes estirpes tumorales.
Generación de estirpes de linfocitos T CD8+ específicos
Las estimulaciones in vitro con células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) cargadas con complejo péptido-MHC (pMHC) y anticuerpo anti-CD28 se realizaron del modo antes descrito. La única diferencia respecto al procedimiento anterior es que dichas estimulaciones se realizaron con perlas cargadas con 2 ng de una peptidoteca (pMHC)MHC relevante más 200 ng de una irrelevante (perlas de baja densidad) en lugar de con 200 ng de MHC relevante (perlas de alta densidad). De ese modo se generaron mayoritariamente linfocitos T con alta afinidad para la validación en profundidad de los péptidos. Después de tres estimulaciones, una parte de los linfocitos T sensibilizados in vitro se sometió a la tinción con tetrámeros de pMHC y a análisis por citometría. La inmunogenicidad de un antígeno determinado se detectaba si al menos un pocillo estimulado in vitro y evaluable de un donante sano contenía una estirpe de linfocitos T CD8+ específica después de la estimulación in vitro (esto es, el pocillo contenía al menos un 1 % de tetrámero+ específico entre los linfocitos T CD8+ y el porcentaje de células tetrámero+ específicas era al menos 10 veces la mediana de las estimulaciones del control negativo). Las células tetrámero-positivas de cada donante se agruparon después según la especificidad hacia el antígeno, se tiñeron con el correspondiente tetrámetro de pMHC y anticuerpo anti-CD8-FITC humano clon SKI y, por último, se sometieron a selección por FACS en un citómetro FACSAria (BD Biosciences, Alemania). Las células seleccionadas se cultivaron en medio para linfocitos T (RPMI-Glutamax complementado con suero AB humano termoinactivado al 10 %, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 µg/ml, piruvato sódico 1 mM y gentamicina 20 µg/ml) en presencia de 5 x 105 céls./ml de PBMC alogénicas recién extraídas e irradiadas, 5 x 104 céls./ml de células LG2-EBV irradiadas, IL-2 150 U/ml (Chiron, Munich, Alemania) y PHA-L 0,5 µg/ml (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). La expansión de dichas células tuvo lugar en medio para linfocitos T con IL-2 150 U/ml. Para averiguar si se generaban linfocitos específicos de antígeno con alta avidez sensibilizados se efectuó la tinción con tetrámeros de pMHC del modo indicado antes y se analizaron en un citómetro de cuatro colores FACSCalibur (BD Biosciences, Alemania).
Pruebas de funcionalidad
A fin de determinar su funcionalidad se evaluó la producción de IFN-γ con ELISPOT (IFNγ ELISPOT Set, BD, Alemania) tras la reestimulación de las células con el péptido correspondiente. Además, se investigó la citotoxicidad celular de los CTL específicos en la destrucción de estirpes tumorales con el Kit de citotoxicidad celular LIVE/DEAD ((L7010, Invitrogen, Alemania). Si no se indica otra cosa, ambos ensayos se realizan siguiendo las instrucciones del fabricante.
Resultados
Ambos péptidos, NOX-001 y TGFBI-001, fueron inmunogénicos in vitro tal y como demuestra la sensibilización lograda mediante las células aAPC con baja densidad de pMHC. Tanto con NOX-001 como con TGFBI-001 se detectaron estirpes de linfocitos T específicos en la citometría FACS, lo que demuestra la existencia de linfocitos T CD8+ precursores de alta avidez en los donantes sanos.
Además, en el caso de NOX-001, se descubrió una estirpe de linfocitos T que demostró su funcionalidad en ELISPOT, puesto que expresó de forma específica el IFN-γ tras la reestimulación con este péptido (Fig. 8).
9. Unión de los péptidos restringidos a HLA de clase I al HLA-A*0201
El objetivo del análisis consistía en evaluar la afinidad de los péptidos de HLA de clase I CHI-001, DCA-001, JAK001 y PTP-001 hacia la molécula de MHC codificada por el alelo HLA-A*0201. Las afinidades de todos los péptidos hacia el HLA-A*0201 resultaron comparables con las del péptido control bien conocida HBV-001, situándose las

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