DE102016123893A1

DE102016123893A1 - T-Zellrezeptoren mit verbesserter Bindung

Info

Publication number: DE102016123893A1
Application number: DE102016123893.7A
Authority: DE
Inventors: Sebastian Bunk; Dominik Maurer; Jens FRITSCHE; Claudia Wagner; Leonie ALTEN; Franziska Hoffgaard; Mathias Ferber
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2016-12-08
Filing date: 2016-12-08
Publication date: 2018-06-14
Also published as: TWI710572B; CN110099923A; AU2017371260A1; TW201827460A; MX2019006726A; AU2017371260C1; PE20191150A1; BR112019010803A2; CR20190280A; US20210380659A1; JP2020500525A; US20180162922A1; AU2017371260B2; WO2018104407A1; MA47359A; EP3551653A1; EP3551653B1; CA3045230A1; US11072645B2; JP7346294B2

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf modifizierte α- oder β-Ketten des T-Zell-Rezeptors (TCR) oder Heterodimere, die diese enthalten, wobei in der variablen Domäne der modifizierten α- oder β-Kette Q an Position 44 gemäß der IMGT-Nummerierung durch eine andere Aminosäure substituiert ist ().

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf den Bereich der T-Zell-Rezeptoren, insbesondere der rekombinanten T-Zell-Rezeptoren, sowie auf Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.
Hintergrund
Das adaptive Immunsystem besteht aus Antikörpern, B-Zellen und CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen, die eine hochspezifische Reaktion gegen ein bestimmtes Ziel ermöglichen. T-Zell-Rezeptoren (TCR) sind Disulfid-verknüpfte membranverankerte heterodimere Proteine, die normalerweise aus den hochvariablen alpha (α)- und beta (β)-Ketten bestehen, die als Teil eines Komplexes mit den invarianten CD3-Kettenmolekülen auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert werden. Der Prozess der Bildung des Heterodimers wird als „Pairing“ (Bindung) bezeichnet. T-Zellen, die solche Rezeptoren exprimieren, werden als α:β (oder αβ) T-Zellen bezeichnet, obwohl eine Minderheit von T-Zellen einen alternativen Rezeptor exprimiert, der aus variablen Gamma-Ketten (ү) und Delta-Ketten (δ) gebildet wird, die als үδ T-Zellen bezeichnet werden.
Jede Kette besteht aus zwei extrazellulären Domänen: Variable (V)-Region und konstante (C)-Region, die beide zur Immunglobulin-Superfamilie (IgSF)-Domäne gehören und antiparallele β-Faltblätter bilden. Die konstante Region ist proximal zur Zellmembran, gefolgt von einer transmembranen Region und einem kurzen zytoplasmatischen Schwanz, während die variable Region an den Peptid/MHC-Komplex einer antigenpräsentierenden Zelle bindet.
Die variable Domäne sowohl der TCR α-Kette als auch der β-Kette haben jeweils drei hypervariable oder komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs), während die variable Region der β-Kette einen zusätzlichen Bereich der so genannten Hypervariabilität (HV4) aufweist, der normalerweise kein Antigen kontaktiert und daher nicht als CDR gilt.
TCRs befinden sich auf der Oberfläche von T-Zellen und als Antigenrezeptormoleküle sind sie für die Erkennung von entsprechend prozessiertem Antigen verantwortlich, das den T-Zellen durch Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Moleküle auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) präsentiert wird, was möglicherweise zur Aktivierung der T-Zelle und zu einer Immunantwort auf das Antigen führen kann.
CDR3 ist das für die Erkennung des prozessierten Antigens verantwortliche Haupt-CDR3, obwohl CDR1 der Alpha-Kette auch mit dem N-terminalen Teil des antigenen Peptids interagiert, während CDR1 der β-Kette mit dem C-terminalen Teil des Peptids interagiert. Von CDR2 wird angenommen, dass er den MHC erkennt. Es wird angenommen, dass der CDR4 der β-Kette sich nicht an der Antigenerkennung beteiligt, sondern, wie es gezeigt wurde, mit so genannten Superantigenen interagiert. Die konstante Domäne der TCR-Domäne besteht aus kurzen Verbindungssequenzen, in denen ein Cysteinrest Disulfidbindungen bildet, die ein Bindeglied zwischen den beiden Ketten bilden.
In den letzten Jahren wurden neue Ansätze entwickelt, um diesen Mechanismus für die Entwicklung von Therapien für Patienten zu nutzen. T-Zellen, welche mit den Genen transduziert sind, die für die α- und β-Ketten eines Tumor-spezifischen T-Zell-Rezeptors (TCR) kodieren, können bei Patienten eine antitumorale Immunität vermitteln. Als eine Strategie stellt die TCR-Gentherapie Patienten autologe T-Zellen zur Verfügung, die mit transgenen TCR-Ketten gentechnisch verändert werden. Diese Technik bietet einen viel versprechenden Ansatz für die Behandlung, insbesondere von Tumoren und Virusinfektionen. Bei diesem Ansatz werden TCR alpha- und beta-Ketten, die einen bestimmten Antigen-MHC-Komplex erkennen, in eine Wildtyp-T-Zelle eines Patienten geklont. Die transgene T-Zelle wird dann in vitro vermehrt und die proliferierten Zellen an den Patienten zurückgegeben, um eine Immunantwort gegen das Pathogen, der die Quelle des jeweiligen Antigens ist, zu liefern.
Die produzierten transgenen T-Zellen exprimieren somit sowohl einen Wildtyp-TCR mit Wildtyp-alpha- und -beta-Ketten als auch den transgenen TCR mit den für den jeweiligen rekombinanten Antigen-MHC-Komplex spezifischen alpha- und beta-Ketten. Üblicherweise sind sowohl die alpha- und beta-Ketten des Wildtyps als auch die transgenen alpha- und beta-Ketten noch immer in der Lage, mit einander kreuzzubinden. Diese unerwünschte Möglichkeit, die als „TCR-Fehlpaarung“ (TCR mispairing) bezeichnet wird, ist ein anerkanntes Problem im Bereich der TCR (Gen-) Therapie.
Der Begriff „Fehlpaarung“ (mispairing) definiert also die falsche Paarung zwischen einem TCR α oder β-Transgen und einer endogenen TCR α- bzw. β-Kette und führt zu einer verdünnten Oberflächenexpression des transgenen TCRaß-Heterodimers, was die funktionelle Avidität der modifizierten T-Zellen reduziert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass T-Zellen, die fehl gepaarten (mispaired) TCRs exprimieren und unter hohen IL-2-Bedingungen expandierten, in einem präklinischen Modell die Graft-versus-Host-Krankheit (GvHD) induzieren (Bendle et al., 2009).
Für eine genaue Untersuchung der klonalen Diversität, Gewebeverteilung und Spezifizität von protektiven und pathologischen T-Zell-vermittelten Immunreaktionen ist die Analyse der gepaarten, d. h. passender TCR α- und β-Ketten-Umlagerung einzelner humaner T-Zellen erforderlich.
Einige Strategien zur Optimierung von transgenen TCR α- und β-Paarung zur Verbesserung der funktionellen Avidität von therapeutischen T-Zellen wurden, z. B. in Govers et al (2010), diskutiert. Zu den Möglichkeiten, Fehlpaarung zu vermeiden, gehören die folgenden:

1. Murinisierte TCRs: Bei diesem Ansatz werden humane TCR konstante α- und β-Ketten durch die entsprechenden murinen Domänen ersetzt. Obwohl humane und murine TCR-C-Domänen ein hohes Maß an Homologie aufweisen, beeinflussen kleine Unterschiede die Stabilität der TCR/CD3-Interaktionen und damit die Expressionsniveaus des TCRs auf der Oberfläche.
2. Cystein-modifizierte TCRs: Dieser Ansatz führt Cysteinaminosäuren an einer strukturell günstigen Position ein und ermöglicht damit die Bildung einer zusätzlichen Disulfidbrücke und fördert die korrekte Paarung zwischen den beiden TCR-Ketten. Site-directed (positionsgerichtete) Mutationen von z. B. T48C in der konstanten TCR alpha-Kette und S57C in der konstanten TCR beta-Kette, die zu einem Heterodimer mit TCR alpha-beta-Ketten führten, der durch zwei Zwischenkettenbindungen (d. h. einer eingeführten Disulfidbrücke und einer endogenen transmembranen Disulfidbrücke (Position Nr. 95 in der konstanten Domäne-alpha und Position Nr. 131 in der konstanten Domäne-beta) verbunden ist.
3. Domänentausch (Domain swapping). Selektierte konstante Domänen werden zwischen den α- und β-Ketten eines Tumor-spezifischen T-Zell-Rezeptors vertauscht, wodurch ein Domain-swapped (ds) TCR entsteht. Bei korrekter Paarung behalten diese dsTCR-Ketten alle Domänen, die notwendig sind, um CD3-Proteine zu rekrutieren, auf der T-Zelloberfläche zu exprimieren und funktionelle T-Zellantworten zu vermitteln, wenn ein Zielantigen angesteuert wird. Im Gegensatz dazu fehlen den fehlgepaarten TCRs, die eine dsTCR-Kette und eine Wildtyp-TCR-Kette enthalten, Schlüsseldomänen, welche für die Rekrutierung, den Export und die Signalisierung von CD3 notwendig sind, und können daher keine schädliche Autoimmunität vermitteln.
4. Exklusive TCR Heterodimere: In diesem Ansatz werden sterische und elektrostatische Kräfte genutzt, um die korrekte Paarung zwischen TCR alpha- und beta-Transgenen zu erleichtern und gleichzeitig die Paarung zwischen exogenen und endogenen TCR alpha- und beta-Ketten zu verhindern. Ein Beispiel verwendet ortsgerichtete Mutationen, um eine S85R in die alpha-konstante-Domäne und R88G in die beta-konstante-Domäne einzuführen, um die erforderlichen Änderungen der elektrostatischen Ladungen zu erhalten und damit eine reziproke „Knopf-zu-Loch“-Konfiguration („knob-into-hole“) zu erzeugen, die angeblich Sekundär- und Tertiärstrukturen minimal verzerrt.
5. Verwendung einer chimären TCR-CD3ζ-Kette mit jeder TCR-Kette, die mit einem CD3ζ-Molekül fusioniert ist.
6. Verwendung von einkettigen TCRs, wobei die V-alpha eines definierten TCRs mit der beta-Kette unter Verwendung eines flexiblen Peptid-Linkers fusioniert wird.
7. Verwendung von shRNA-Sequenzen oder Zinkfinger-Nukleasen, um die Expression des endogenen TCR zu unterbinden.

Ein weiterer Ansatz wurde von O'Shea et al [O'Shea E, Lumb K, Kim P. (1993) Current Biology 3(10):658-667] vorgeschlagen, die ein Peptidpaar namens Velcro entwickelt haben, das aufgrund günstiger elektrostatischer Wechselwirkungen im heterodimeren Zustand miteinander paaren kann. Diese Autoren zeigten, dass die beiden Peptide überwiegend in isolierter Form nicht gefaltet sind, aber vorzugsweise in ein stabiles paralleles Coil-Heterodimer assoziieren, wenn sie gemischt werden. Dieser Ansatz wurde von Chang et al [Chang HC et al. (1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91(24): 11408-12] angewandt, um einen löslichen TCR herzustellen, bei dem ein heterodimerer Komplex durch Verschmelzung der Peptide zu alpha- bzw. beta-Ketten mit abgeschnittenen alpha- bzw. beta-Ketten begünstigt wurde.
Kürzlich wurde ein evolutionär konserviertes Motiv in der transmembranen Region der membrangebundenen Form der Immunglobulin-Schwerkette identifiziert [Varriale S, et al. (2010) Mol Phylogenet Evol 57: 1238-44]. Dieses Motiv ist in sehr entfernten Spezies (vom Hai bis zu Säugetieren) evolutionär konserviert und wurde mit Hilfe von Lipid-Doppelschicht-Molekulardynamik-Simulationen gefunden. Das Motiv ist für die Assoziation der beiden schweren Ketten durch zwei Paare von hydrophoben Phe-Phe-Wechselwirkungen und zwei Paare von Ser/Thr-Ser/Ser Wasserstoffbindungen verantwortlich. Dieses Interaktionsmuster, das die Dimer-Konformation in der Lipiddoppelschicht stabilisiert, ist einzigartig. Das Muster unterscheidet sich von jedem anderen Muster, das in Transmembran-Helices identifiziert wurde und weist eine Reihe interessanter struktureller Implikationen in dem Dimeraufbau der schweren Immunglobulinkette (IgTMD) und damit in der Funktion des B-Zellrezeptors (BCR) auf.
WO 2014/153470 A2 offenbart Verfahren und Zusammensetzungen zur Modifizierung von TCR-Genen unter Verwendung von Nukleasen (Zinkfinger-Nukleasen oder TAL-Nukleasen), um TCR-Gene durch gezielte Zersetzung zu modifizieren.
WO 2014/083173 bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuartiger T-Zell-Rezeptoren, die ein geringeres Risiko unerwünschter Ereignisse in der Immuntherapie, insbesondere bei dem adoptiven T-Zell-Transfer, bieten.
WO 2016/071343 A1 bezieht sich auf modifizierte T-Zell-Rezeptoren (TCRs) und ihre Verwendung in der Adoptivzelltherapie (ACT), insbesondere für den Transfer von T-Lymphozyten. Die TCRs werden in den Transmembranregionen der alpha- und beta-Ketten mutiert, wobei die Mutationen die richtige TCR-Kettenpaarung begünstigen.
Obwohl er viel versprechend ist, haben mehrere Hindernisse, darunter die richtige Expression des exogenen TCR, die klinische Bedeutung dieses ACT-Ansatzes eingeschränkt. Klinische Reaktionen deuten darauf hin, dass noch viele Probleme zu lösen sind. Da die funktionelle Avidität der T-Zellen hauptsächlich durch die TCR-Affinität und die Anzahl der exprimierten TCR-Moleküle bestimmt wird, wurden große Anstrengungen unternommen, um diese biophysikalischen Eigenschaften in TCRmodifizierte Zellen durch zwei wichtige Ansätze zu verbessern: (a) die Verbesserung der TCR-Affinität und (b) die Verstärkung der TCR-Expression. Um die TCR-Affinität zu verbessern, wurden Versuche unternommen, Rezeptoren mit hoher Affinität zu selektieren oder die Affinität des transferierten Rezeptors durch Punktmutationen zu erhöhen. Alternativ wurden verschiedene Ansätze entwickelt, um die Anzahl der TCRs auf der Oberfläche transduzierter Zellen zu erhöhen. Dazu gehören die Entwicklung von Expressionsvektoren, die Verwendung von Codon-optimierten TCR-Sequenzen, die Eliminierung von Glykosylierungsstellen und die Verbesserung der Paarung der eingeführten TCR-Ketten.
Es ist jedoch nach wie vor notwendig, Ansätze zur Verfügung zu stellen, um TCR-Fehlbindungen effektiv zu vermeiden. Diese weiteren Ansätze sollten leicht einzuführen sein und das Auftreten von fehlgepaarten TCR-Heterodimeren effizient reduzieren und gleichzeitig die Anzahl korrekt gepaarter TCR-Heterodimere, d. h. Paare von transgenen alpha- und beta-Ketten in entsprechend modifizierten T-Zellen, erhöhen. Auch eine Methode, die eine minimale Manipulation von TCR-Ketten und Wirts-T-Zellen erfordert, wäre wünschenswert.
Diese und weitere Sachverhalte werden mit Verfahren und Mitteln nach den unabhängigen Ansprüchen der vorliegenden Erfindung erfüllt. Die abhängigen Ansprüche beziehen sich auf bestimmte Ausführungsformen.
Bevor die Erfindung genauer beschrieben wird, ist zu verstehen, dass sich diese Erfindung nicht auf die einzelnen Komponenten oder Strukturmerkmale der beschriebenen Vorrichtungen oder Zusammensetzungen beschränkt ist oder die Verfahrensschritte der als solche beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren voneinander abweichen können. Es ist auch so zu verstehen, dass die hier verwendete Terminologie nur der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und keine Einschränkung darstellen soll. Die bloße Tatsache, dass bestimmte Maßnahmen in voneinander abweichenden abhängigen Ansprüchen wiedergegeben werden, spricht nicht dafür, dass eine Kombination dieser Maßnahmen nicht zu ihrem Vorteil genutzt werden kann. Die Bezugszeichen in den Ansprüchen dürfen nicht als Beschränkung des Umfangs ausgelegt werden. Es ist darauf hinzuweisen, dass die Singularformen „ein“, „eine“ und „der (die, das)“, wie sie in der Spezifikation und den angefügten Ansprüchen verwendet werden, Singular- und/oder Pluralbezugsobjekte einschließen, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes festlegt. Darüber hinaus schließt das Wort „umfassend“ in den Ansprüchen andere Elemente oder Schritte nicht aus. Die bloße Tatsache, dass bestimmte Maßnahmen in voneinander abweichenden abhängigen Ansprüchen wiedergegeben werden, spricht nicht dafür, dass eine Kombination dieser Maßnahmen nicht zu ihrem Vorteil genutzt werden kann.
Im Übrigen ist zu verstehen, dass bei der Angabe von Parameterbereichen, die durch numerische Werte begrenzt sind, davon auszugehen ist, dass die Bereiche diese Grenzwerte einschließen.
Es ist ferner zu verstehen, dass die hierin offenbarten Ausführungsformen nicht als individuelle Ausführungsformen zu verstehen sind, die nicht miteinander in Beziehung stehen. Die in Bezug auf eine der Ausführungsformen diskutierten Merkmale sollen auch im Zusammenhang mit anderen Ausführungsformen offenbart werden. Wenn in einem Fall ein bestimmtes Merkmal nicht in Bezug auf eine Ausführungsform, sondern in Bezug auf eine andere offenbart wird, würde der Fachmann verstehen, dass dies nicht notwendigerweise bedeutet, dass dieses Merkmal nicht dazu bestimmt ist, mit der anderen Ausführungsform offenbart zu werden. Der Fachmann würde verstehen, dass es der Kern dieser Anmeldung ist, dieses Merkmal auch für die andere Ausführungsform zu offenbaren, aber nur aus Gründen der Klarheit und um die Spezifikation in einem überschaubaren Umfang zu halten, ist dies nicht geschehen.
Entsprechend dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine modifizierte α- oder β-Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) oder ein Fragment oder Derivat davon bereitgestellt, das die Fähigkeit behält, an einen Antigen-MHC-Komplex zu binden, wobei in der variablen Domäne der modifizierten α- oder β-Kette Q an Position 44 gemäß der IMGT-Nummerierung durch eine andere Aminosäure substituiert ist. Aminosäuren können sowohl natürliche Aminosäuren als auch nicht-natürliche oder modifizierte Aminosäuren umfassen. Bevorzugt sind natürliche Aminosäuren.
Die Nummerierung der Aminosäurereste in der TCR α-Kette und der TCR β-Kette entspricht dem IMGT-Standard, wie er in Lefranc et al (2003) veröffentlicht wurde. Der IMGT-Standard ist ein universelles Regelwerk zur eindeutigen Nummernvergabe von Aminosäureresten in Immunglobulinmolekülen, einschließlich variable TCR α- und β- Ketten. Siehe A bis C für einen Vergleich der IMGT-Nummerierung (fett) mit der Kabat-Nummerierung. In der ist Q44 in der α-Kette (TRAV) und β-Kette (TRBV) grau markiert. Die Nummerierung nach dem IMGT-Standard kann von der naiven Nummerierung einer gegebenen Aminosäuresequenz einer variablen TCR-Domäne abweichen, insbesondere durch Leerzeichen in den CDR-Sequenzen, wie in A - C zu sehen ist.
Q44 gemäß der IMGT-Nummerierung ist ein stark konservierter Rest im Gerüst 2 (FR2)-Region und wird von fast allen TCR α-Ketten mit Ausnahme von TRAV2, TRAV24, TRAV29/DV5 und TRAV40 geteilt und von allen TCR β-Genen mit Ausnahme von TRBV14 geteilt (Lefranc et al, 2001, Strong et al., 1999). Q Darüber hinaus ist Q44 sehr häufig ein Teil eines 4 AA-Motivs umfassend WYXQ, wobei X zum Beispiel R, V, K oder Q ist (Lefranc et al, 2001).
Es wurde festgestellt, dass eine Substitution von Q44 keine Auswirkungen auf die Zielspezifität oder Bindungseigenschaften der beiden Ketten hatte und sich ausschließlich auf das Paarungsverhalten der beiden Ketten auswirkte. Es wird davon ausgegangen, dass dies an der Position Q44 im FR2-Region liegt.
Knies et al. (2016) beschreiben, dass ein optimiertes scTCR/Ca die verbleibende TCR-Fehlpaarung hemmt, um eine sichere, adoptive Immuntherapie mit endogenen Bulk-TCR α/β-positiven T-Zellen zu erreichen. Die Vermeidung von verbleibenden Fehlpaarungen wurde durch eine neuartige künstliche Disulfidbindung zwischen der Va-Domäne und dem 3'-Ende des Linkers in der Nähe von Vß in einer 3-Domäne des scTCR erreicht.
Hoffmann et al. (2015) beschreiben eine systematische bioinformatische Analyse der strukturellen Eigenschaften von gebundenen und ungebundenen TCR-Molekülen mit Fokus auf den Vα/Vβ-Winkel. Ihre Ergebnisse demonstrierten die Bedeutung dieses Winkels für die Signalisierung, da mehrere unterschiedliche Va/Vß-Winkel-basierte strukturelle Cluster beobachtet werden konnten und größere Winkelflexibilitäten für ungebundene TCRs als für gebundene TCRs existieren, die einen quantitativen Nachweis für einen zweistufigen Blockiermechanismus bei der Epitoperkennung liefern. Es wurde ein einmaliger Rotationspunkt identifiziert und die Kernregion um diesen Punkt liegt im Zentrum zwischen den beiden Va- and Vß-Domänen.
Substitutionen im Kontext der vorliegenden Erfindung können mit Standardmethoden der Proteinmutagenese erzeugt werden, wie z. B. ortsgerichtete Mutagenese oder zufällige Mutagenese der kodierenden DNA oder cDNA, oder Genombearbeitungstechnologien, wie CRISPR Cas, TALEN, ZFN, Argonaute (NgAgo) oder CRISPR Cpf1. Eine solche Substitution kann darüber hinaus auch einfach durch die Synthese des kodierenden Gens, der cDNA oder mRNA erfolgen. Dienstleister bieten heute die Synthese einer Nukleinsäure aus einer gegebenen Sequenz an.
Verfahren der zufälligen Mutagenese oder ortsbezogenen Mutagenese, die zu standortspezifischen Aminosäuresubstitutionen führen, sind dem Fachmann gut bekannt und werden beispielsweise in Labrou et al (2010) und Trehan et al (2016) veröffentlicht.
Verfahren der Genombearbeitung zur Modifikation einer gegebenen Aminosäuresequenz sind dem Fachmann gut bekannt (z. B. CRISPR Cas, TALEN, ZFN, Argonaute (NgAgo) oder CRISPR Cpf1) und werden z. B. in Maeder & Gersbach (2016) offenbart. Die Verfahren der Gensynthese sind dem Fachmann gut bekannt und werden beispielsweise in Hughes et al. (2011) offenbart. Die Offenlegung dieser Referenzen gilt als durch Bezugnahme auf die hinreichende Offenbarung, Befähigung und schriftliche Beschreibung inkorporiert.
Wie oben beschrieben, schlagen einige Verfahren des Standes der Technik die Modifikation der α- und/oder β-Kette durch Einführung von murinen konstanten Ketten vor. Dieser Ansatz birgt das Risiko einer erhöhten Immunogenität gegenüber nichthumanen Sequenzen, die die Methode der vorliegenden Erfindung vermeidet.
Weiterhin zeigen die Erfinder, dass die Q44-Substitution die Bindung des Zielpeptids (d. h. die Affinität zum Zielantigen/MHC-Komplex) nicht beeinflusst, was darauf zurückzuführen ist, dass Q44 in der tertiären Struktur der α und β variablen Domänen maximal distal von der Region ist, die von den CDRs gebildet wird.
Gemäß einer Ausführungsform haben die modifizierte α-Kette und β-Kette in ihren konstanten Domänen und/oder Transmembrandomänen im Vergleich zur jeweiligen keine Substitutionen. Da die konstante Domäne eine große und in hohem Maße konservierte Schnittstelle zwischen der TCR α- und β-Kette enthält, könnte eine Modifikation nur einzelner Positionen weniger vorteilhaft als die Ersetzung einzelner Positionen in der variablen Domäne im Hinblick auf ein verbessertes Paarungsverhalten sein.
Gemäß einer Ausführungsform paart eine α-Kette mit Q44-Substitution vorzugsweise mit einer β-Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR), deren Q an Position 44 in der variablen Domäne durch eine andere Aminosäure substituiert ist. Entsprechend einer weiteren Ausführungsform paart eine β-Kette mit Q44-Substitution vorzugsweise mit einer α-Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR), in deren variablen Domäne an Position 44 Q durch eine andere Aminosäure substituiert ist.
Wie im Folgenden gezeigt wird, haben die Erfinder gezeigt, dass diese Substitutionen die Paarungsspezifität der so modifizierten TCR α- und β-Ketten beibehalten und gleichzeitig die Paarung mit nicht modifizierten Ketten reduzieren.
Daher ist in einer T-Zelle, die modifiziert wurde, um eine zweite, heterologe oder transgene TCR zu exprimieren, der die beanspruchten Substitutionen trägt, die Fehlbindung zwischen einer transgenen α-Kette und einer endogenen β-Kette oder vice versa reduziert oder verhindert.
Auf diese Weise kann ein erhöhter Oberflächenvorkommen an korrekt gepaarten transgenen TCR α/β-Heterodimeren sichergestellt werden, was die Avidität der modifizierten T-Zellen insgesamt verbessert und wodurch unerwünschte Nebenwirkungen wie Induktion einer Graft-versus-Host-Krankheit vermieden werden (Bendle et al., 2009).
Gemäß einer Ausführungsform der α-Kette oder β-Kette ist Q an Position 44 in der variablen Domäne beispielsweise durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R, D, E, K, L, W oder V, substituiert.
In einer weiteren Ausführungsform, weist die α-Kette eine variable Domänensequenz auf, die mindestens die Gerüstregione einer Sequenz umfasst, welche mindestens 95 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO 1 oder 3 teilt (aufweist), wobei Q an Position 44 in der variablen Domäne durch eine andere Aminosäure substituiert ist, oder weist die β-Kette eine variable Domänensequenz auf, die mindestens die Gerüstregionen einer Sequenz umfasst, welche mindestens 95 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO 2 oder 4 teilt (aufweist), wobei Q an Position 44 in der variablen Domäne durch eine andere Aminosäure substituiert ist.
Vorzugsweise besitzen die genannten α- oder β-Ketten eine variable Domänensequenz, die mindestens die Gerüstregionen einer Sequenz umfasst, welche mindestens 96 %, mehr bevorzugt 97 %, noch bevorzugter mindestens 98 %, noch bevorzugter mindestens 99 % oder am meisten bevorzugt 100 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 1 oder 3 bzw. SEQ ID NO: 2 oder 4 teilt (aufweist).
SEQ ID NO: 1 ist die Aminosäuresequenz der variablen Domäne der TCR α-Kette des TCRs R7P1D5 (auch bekannt als TRAV5, Lefranc et al. 2001). SEQ ID NO: 2 ist die Aminosäuresequenz der variablen Domäne der TCR β-Kette des TCRs R7P1D5 (auch bekannt als TRBV12-4, Lefranc et al. 2001). R7P1D5 wird in der provisorischen Anwendung 62/308 944 der USA offengelegt, deren Inhalt durch Verweis in die vorliegende Beschreibung aufgenommen wird. R7P1D5 erkennt ein Peptid, bezeichnet als MAG-003, wenn es an den MHC, z. B. einer antigenpräsentierenden Zelle, gebunden ist. MAG-003 enthält eine Aminosäuresequenz gemäß der folgenden allgemeinen Formel I: X₁X₂LEHVVRX₃ worin X₁ aus den Aminosäuren K und Y ausgewählt ist, X₂ aus den Aminosäuren V, L und A ausgewählt ist und X₃ aus V, L, A und I ausgewählt ist.
SEQ ID NO: 3 ist die Aminosäuresequenz der variablen Domäne der TCR α-Kette TRAV8-6 (Lefranc et al. 2001). SEQ ID NO: 4 ist die Aminosäuresequenz der variablen Domäne der TCR α-Kette TRBV6-5 (Lefranc et al. 2001).
Es ist zu beachten, dass in den und die Sequenzen mit der IMGT-Nummerierung dargestellt werden, die von der naiven Nummerierung der jeweiligen Sequenzen im Sequenzprotokoll abweicht. Die welligen Unterstriche in zeigen Leerzeichen, die bei der IMGT-Nummerierung berücksichtigt werden, obwohl sie nicht mit Aminosäureresten besetzt sind. Es ist zu verstehen, dass sich Q44 auf die IMGT-Nummerierung gemäß und bezieht und nicht auf die aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll ableitbare Nummerierung.
R7P1D5 mit einer α- und β-Kette (TRAV5 und TRBV12-4) sowie TRAV 8-6 und TRBV 6-5 sind nur vier Beispiele für variable Domänen des TCRs, die im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Weitere TRAV- und TRBV-Untergruppen sind auf der IGMT-Website veröffentlicht. Es ist zu beachten, dass TRAV und TRBV insbesondere durch geeignete Adaption der CDR-Sequenzen die Spezifität für verschiedene Zielepitop/MHC-Komplexe übernehmen können.
Zu beachten ist auch, dass die oben genannten Sequenzen ohne Signalsequenzen dargestellt werden und dass die Sequenzdatenbanken manchmal leicht abweichende Sequenzen aufweisen. So fehlt z. B. in der Uniprot-Datenbank bei TRAV8-6 das N-terminale A in SEQ ID NO 3 sowie in , während bei TRBV6-5 das N-terminale N und A in SEQ ID NO 4 fehlt, sowie in .
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein rekombinantes T-Zell-Rezeptor (TCR)-Heterodimer bereitgestellt, das eine modifizierte α-Kette und eine modifizierte β-Kette oder Fragmente oder Derivate davon umfasst, die die Fähigkeit zur Bindung an einen Antigen-MHC-Komplex aufrecht erhalten, wobei in den variablen Domänen beider Ketten Q an Position 44 in der variablen Domäne gemäß der IMGT-Nummerierung durch eine andere Aminosäure substituiert ist.
Gemäß einer Ausführungsform des rekombinanten T-Zell-Rezeptor (TCR)-Heterodimers in mindestens der α- oder β-Kette ist Q an Position 44 in der variablen Domäne durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R, D, E, K, L, W und V, substituiert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des rekombinanten T-Zell-Rezeptor (TCR)-Heterodimers weist das TCR eines der Substitutionspaare, die in der folgenden Liste aufgeführt sind, auf:

αQ44R / βQ44D
αQ44E / βQ44K
αQ44L / βQ44W
αQ44V / βQ44W
αQ44D / βQ44R
αQ44K / βQ44E
αQ44W / βQ44L
αQ44W / βQ44V

Somit bedeutet z. B. „αQ44R /βQ44D“, dass Q44 in der variablen Domäne der α-Kette durch R substituiert ist, während Q44 in der variablen Domäne der β-Kette durch D substituiert ist.
Daher wird in einer T-Zelle, die modifiziert wurde, um eine zweite, heterologe oder transgene TCR zu exprimieren, die die beanspruchte Substitutionen trägt, eine Fehlpaarung zwischen einer transgenen α-Kette und einer endogenen β-Kette, oder vice versa, reduziert oder sogar vermieden.
Auf diese Weise kann ein erhöhter Oberflächenvorkommen an korrekt gepaarten transgenen TCR α/β-Heterodimeren sichergestellt werden, was die Avidität der modifizierten T-Zellen insgesamt verbessert und wodurch unerwünschte Nebenwirkungen wie Induktion einer Graft-versus-Host-Krankheit vermieden werden (Bendle et al., 2009).
Gemäß den spezifischen Ausführungsformen des rekombinanten T-Zellrezeptor (TCR)-Heterodimers

a) paart die modifizierten α-Kette vorzugsweise mit der modifizierten β-Kette im Vergleich zu einer nicht modifizierten β-Kette mit Q an Position 44 in der variablen Domäne, und/oder
b) paart die modifizierten β-Kette vorzugsweise mit der modifizierten α-Kette im Vergleich zu einer nicht modifizierten α-Kette mit Q an Position 44 in der variablen Domäne.

Gemäß den weiteren Ausführungsformen des rekombinanten T-Zell-Rezeptor (TCR)-Heterodimers

a) weist die α-Kette des TCRs eine Sequenz der variablen Domäne auf, die mindestens die Gerüstregione einer Sequenz umfasst, die 95 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO 1 oder 3 teilt, wobei Q an Position 44 in der variablen Domäne durch eine andere Aminosäure substituiert ist, und/oder
b) weist die β-Kette des TCRs eine Sequenz der variablen Domäne auf, die mindestens die Gerüstregione einer Sequenz umfasst, die 95 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO 2 oder 4 teilt, wobei Q an Position 44 in der variablen Domäne durch eine andere Aminosäure substituiert ist.

Vorzugsweise weisen die α- oder β-Ketten eine Sequenz der variablen Domäne auf, die mindestens die Gerüstregione einer Sequenz umfasst, die 96 %, vorzugsweise 97 %, noch bevorzugter 98 %, noch bevorzugter 99 % oder, am meisten bevorzugt 100 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO 1 oder 3 bzw. SEQ ID NO 2 oder 4 teilt.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Nukleinsäuremolekül kodierend für
eine modifizierte α- oder β-Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) gemäß obiger Beschreibung und/oder
einen rekombinanten T-Zell-Rezeptor (TCR)-Heterodimer gemäß obiger Beschreibung
zur Verfügung gestellt.
In einer Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure ferner mindestens eines der folgenden Bestandteile
einen Promotor, der funktionsfähig mit dem einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen verbunden ist, und/oder
eine Signalsequenz, die funktionsfähig mit dem einen oder mehreren Nukleinsäuremolekülen verknüpft ist.
Die Signalsequenz kodiert für ein Signalpeptid, das die α- oder β-Kette auf die Zelloberfläche der T-Zellen lenkt, wo sie mittels ihrer Transmembrandomäne verankert wird, wobei die α- und β-Kette auf der äußeren Zelloberfläche gezeigt wird. Signalsequenzen für verschiedene Subtypen der variablen Domäne der α- und β-Ketten sind im Stand der Technik offenbart.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Plasmid oder Vektor bereitgestellt, das/der mindestens eines der oben dargelegten Nukleinsäuremoleküle enthält.
In einer Ausführungsform ist der Vektor vorzugsweise ein viraler Vektor, vorzugsweise ein retroviraler Vektor oder ein lentiviraler Vektor. Verfahren zur Transduktion der α oder β T-Zell-Rezeptor (TCR)-Gene in T-Zellen mit viralen Vektoren werden beispielsweise in Pogulis und Pease (1998) oder Zong et al (2010) offenbart. Die Verwendung von lentiviralen Vektoren für den Gentransfer in humane T-Zellen ist in Verhoeyen et al (2009) offenbart.
In einer anderen Ausführungsform umfasst der Vektor einen Transposon, wie Piggyback oder Sleeping Beauty, das seinerseits in der Lage ist, die jeweilige Nukleinsäure in die T-Zelle zu übertragen. Verfahren zur Verwendung von Transposons für die gentechnisch veränderten T-Zellen werden beispielsweise in Huang et al (2008) offenbart.
In einer weiteren Ausführungsform kann die T-Zelle, z. B. durch Einführung einer oder mehrerer RNAs, die für die Ketten α und β kodieren, z. B. durch Elektroporation, vorübergehend transfiziert werden. Solche Verfahren werden z. B. in Kim und Eberwine (2010) offenbart.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer modifizierten T-Zelle zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
Gewinnung eine T-Zelle von einem Subjekt und Transduktion oder Transfektion der T-Zelle mit einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen gemäß der vorliegenden Erfindung oder einem Plasmid oder Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde die T-Zelle von einem HLA-Allelnegativen Spender erhalten. Sollte die modifizierte T-Zelle beispielsweise Antigene, die durch APC des HLA-A*02-Serotyps präsentiert werden, nachweisen, wird die zu modifizierende Quelle vorzugsweise von einem HLA-A*02-Serotyp-negativen Spender gewonnen. Auf diese Weise wird die Kreuzreaktivität des endogenen TCRs mit dem Zielantigen/MHC-Komplex reduziert oder sogar vermieden.
Die so erhaltene modifizierte T-Zelle eignet sich vorzugsweise für die autologe T-Zellbehandlung des Patienten.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist eine modifizierte T-Zelle mit einem Satz von Nukleinsäuren bereitgestellt, die für die α- und β-Ketten eines rekombinanten T-Zell-Rezeptor (TCR)-Heterodimers gemäß der obigen Beschreibung kodieren.
In einer Ausführungsform wurde die Zelle durch ein Verfahren gemäß der obigen Beschreibung hergestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung einer modifizierten T-Zelle gemäß obiger Beschreibung für die Behandlung eines Patienten, der an einer neoplastischen, entzündlichen, infektiösen Erkrankung oder einer Autoimmunerkrankung leidet,
davon gefährdet ist und/oder
bei welchem diese Erkrankung diagnostiziert ist, zur Verfügung gestellt, wobei die Verwendung die Bereitstellung oder Verabreichung eines Präparats, das die modifizierte T-Zelle umfasst, an einen Patienten, der darauf angewiesen ist, umfasst.
Alternativ wird ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der an einer neoplastischen, entzündlichen, infektiösen Erkrankung oder einer Autoimmunerkrankung leidet,
davon gefährdet ist und/oder bei welchem diese Erkrankung diagnostiziert ist, mit einer modifizierten T-Zelle gemäß obiger Beschreibung zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren die Bereitstellung oder Verabreichung eines Präparats, das die modifizierte T-Zelle umfasst, an einen Patienten, der darauf angewiesen ist, umfasst.
In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu verstehen, dass die Spezifität der jeweiligen modifizierten TCR bzw. der jeweiligen modifizierten T-Zelle von CDR-Sequenzen in den variablen Domänen der α- und β-Ketten abhängig ist, um Antigene, die vom MHC einer Antigen-präsentierenden Zelle präsentiert werden, nachzuweisen.
Wie in Løset et al (2014) beschrieben, können T-Zell-Rezeptoren für einen spezifischen Antigen-MHC-Komplex durch T-Zell-bezogenes Phagen-Display gewonnen werden. Bei diesem Ansatz können die Q44-Substitutionen in den variablen Domänen der α- und β-Kette entweder in allen Bibliothekselementen durchgeführt werden, die die Grundlage für das Phagendisplay bilden, oder können nachträglich eingeführt werden, d. h. wenn ein spezifischer TCR gefunden wurde, der einen spezifischen Antigen-MHC-Komplex nachweist.
Gemäß weiteren Aspekten der Erfindung ist die Verwendung, Verfahren, T-Zell- oder T-Zell-Rezeptor (TCR)-Heterodimer gemäß der obigen Beschreibung bereitgestellt, wobei das durch den vom T-Zellrezeptor nachgewiesenen MHC-Komplex präsentierte Antigen aus einem krebsspezifischen Peptidepitopen des tumorassoziierten Antigens (TAA)- ausgewählt ist. Diese Peptide sind im Stand der Technik bekannt und umfassen als Beispiel das Peptid MAGEA-003, wie es in den Beispielen verwendet wird. Diese Peptide können in der Literatur gefunden werden, z. B. in der Epitopendatenbank (http://www.iedb.org/) oder bevorzugt in einem der WO2016177784 ; WO2016170139 ; WO2016156230 ; WO2016156202 ; WO2016146751 ; WO2016102272 ; WO2016107740 ; WO2015193359 ; , WO2015169945 ; WO2015063302 ; WO2015018805 ; WO2012069462 ; WO2012079878 ; WO2012038463 ; WO2011151403 ; WO2011128448 ; WO2011113882 ; WO2011113872 ; WO2011113819 ; WO2011073215 ; WO2010037514 ; WO2009138236 ; WO2007028574 ; WO2007028573 ; WO2006114307 ; WO2005116051 ; WO2005076009 ; WO2004085461 ; WO03100432 ; WO03102023 ; WO2009015843 ; WO2009015842 ; WO2009015841 ; PCT/ EP2016/063976 ; PCT/ EP2016/064317 ; PCT/ EP2016/065166 ; PCT/ EP2016/065812 ; PCT/ EP2016/068727 ; PCT/ EP2016/070146 ; PCT/ EP2016/073416 ; PCT/ EP2016/073587 ; PCT/ EP2016/078718 ; PCT/ EP2016/079737 ; PCT/ EP2016/079059 ; oder PCT/ EP2016/066706 (alles unter Bezugnahme auf die veröffentlichten Peptide).
Obwohl die Erfindung in den Zeichnungen und vorstehenden Beschreibungen ausführlich illustriert und beschrieben ist, sind diese Illustrationen und Beschreibungen als illustrativ oder exemplarisch und nicht einschränkend anzusehen; die Erfindung beschränkt sich nicht auf die offenbarten Ausführungsformen. Andere Variationen zu den offenbarten Ausführungsformen können von Fachmännern, die die beanspruchten Erfindung praktizieren, aus einem Studium der Zeichnungen, der Offenbarung und der beiliegenden Ansprüche verstanden werden. Alle in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Aminosäuresequenzen werden vom N-Terminus bis zum C-Terminus angezeigt; alle in der vorliegenden Beschreibung offenbarten Nukleinsäuresequenzen werden 5'->3' angezeigt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist zitierte Literatur durch Referenz vollständig eingeschlossen. Dies gilt insbesondere für Dokumente nach dem Stand der Technik, die Standard- oder Routineverfahren offenbaren. In diesem Fall hat die Aufnahme durch Bezugnahme hauptsächlich den Zweck, eine ausreichende Offenlegung zu ermöglichen und langwierige Wiederholungen zu vermeiden.
In den Abbildungen und dem beigefügten Sequenzprotokoll, zeigen die bis C die Nummerierung der Aminosäurereste in den variablen Domänen der TCR α-Kette und der β-Kette. Abbildung entnommen und modifiziert aus Lefranc et al (2003). Die Sequenzen sind am Beispiel von TRAV8-6 dargestellt (Gen-ID: 28680) (alpha-Kette) und TRBV6-5 (Gen-ID: 28602) (beta-Kette)dargestellt. Die Nummerierung der Aminosäurereste in der α-Kette und der β-Kette entspricht dem IMGT-Standard (fett), verglichen mit der Kabat-Nummerierung. In ist Q44 in der α-Kette (TRAV) und der β-TRBV-Kette (TRBV) mit einer grauen Markierung gekennzeichnet. Q44 gemäß der IMGT-Nummerierung ist ein stark konservierter Rest in der Gerüstregion 2 (FR2) und wird von ca. 80% aller TCR-Gene (Strong et al., 1999), einschließlich 1G4 (pdb ID: 2BNR (Chen et al., 2005)); TRAV8-6 (Gene ID: 28680) (α-Kette) und TRBV6-5 (Gen-ID: 28602), (β-Kette) und R7P1D5 (umfassend TRAV5 und TRBV12-4, Lefranc et al. 2001) geteilt. Q44 ist sehr häufig Bestandteil eines 4 AA-Motivs bestehend aus WYXQ, wobei X eine beliebige Aminosäure ist, beispielsweise R, V oder K. W41 ist noch mehr konserviert (>95 %) in TCR α- und β-Ketten (Strong et al., 1999).
zeigt das strukturelle Motiv des aQ44/ßQ44 aus der variablen Domäne des TCRs 1G4 (pdb ID: 2BNR (Chen et al., 2005)). zeigt in silico Doppelmutanten basierend auf der Kristallstruktur des 1G4 TCR. Aus dem Wildtyp-Paar aQ44/ßQ44 haben die Erfinder manuell mögliche Paare ausgewählt und konstruiert, die ein hohes Maß an molekularen Kontakten (polar oder apolar) aufrecht erhalten und dabei die sterische und/oder Ladungssymmetrie brechen. Die Mutanten wurden mit UCSF-Chimera erzeugt (Pettersen et al., 2004). Die TCR α- und β-Ketten sind auf allen Abbildungen durchweg in dunkelblauen bzw. blaugrünen Bändern dargestellt. Die interessanten Seitenketten sind in Magenta hervorgehoben und alle schweren Atome sind dargestellt.
zeigt die Sequenzen der TCR-Varianten R7P1D5 α- und β-Ketten (TRAV5 und TRBV12-4), erkannt wird ein Peptid mit der Bezeichnung MAG-003, wenn es an den MHC gebunden ist; TRAV8-6 (variable Domäne der α-Kette); und TRBV6-5 (variable Domäne der β-Kette). Die graue Markierung kennzeichnet die ungefähren Positionen von CDR1, CDR2 und CDR3 mit den Gerüstregionen FR1, FR2 und FR3. Wie man sehen kann, befindet sich Q44 in FR2. Es ist zu beachten, dass Q44 auch in anderen TCR-Varianten konserviert wird, genau wie in TRAV8-6 und TRBV6-5. Wie in Letzterem ist Q44 in R7P1D5 Bestandteil eines 4 AA-Motivs bestehend aus WYXQ. Abhängig vom jeweiligen Antigen, das angegriffen wird, können die CDR-Sequenzen natürlich variieren.
zeigt die berechneten Mutationsenergien für in silico-konstruierte Mutanten. Für jedes vorgeschlagene Paar komplementärer Mutationen testeten die Erfinder die Doppelmutante (grün) sowie jede einzelne Einzelmutante (orange), um die Paarung einer modifizierten Kette mit einer Wildtypkette nachzuahmen. Mutationsenergien über 0,5 kcal/mol gelten als destabilisierend, Mutationsenergien unter -0,5 kcal/mol - als stabilisierend, Mutationsenergien zwischen -0,5 und 0,5 kcal/mol - als neutral (zwischen den roten Linien - Standardparameter der Software). Die Mutationen wurden auf der variablen Domäne des 1G4 TCRs (Chen et al., 2005) mit dem Discovery Studio (Dassault Systemes, BIOVIA, 2017) und dem von Spassov et al. (Spassov & Yan, 2013) beschriebenen Mutationsenergie-Algorithmus durchgeführt.
zeigt MAG-003 (exemplarisches Peptid): HLA-A*02 Tetramer bzw. NYESO1-001 (Kontrollpeptid): HLA-A*02 Tetramer-Färbung von CD8+ T-Zellen, elektroporiert mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R7P1D5 des Wildtyps und Mutantenvarianten. R7P1D5 erkennt ein MAG-003-Peptid, wenn es an den MHC gebunden ist, aber kein NYESO1-Peptid. Mock-elektroporierte CD8+ Zellen (kein TCR) dienten als Kontrolle. Spender (linkes Schaubild: Spender A, rechtes Schaubild: Spender B).
BEISPIELE
Zu beachten ist ferner, dass die Nummerierung nach IMGT-Standard von der naiven Nummerierung einer gegebenen Aminosäuresequenz einer variablen Domäne des TCRs abweichen kann, insbesondere durch Leerzeichen in den CDR-Sequenzen, wie in A - C zu sehen ist. Dies gilt z. B. für TRAV8-6 und TRBV6-5, wo die welligen Unterstreichungen Leerzeichen aufzeigen, die bei der IMGT-Nummerierung berücksichtigt werden, obwohl sie nicht mit Aminosäureresten besetzt sind.
Diese Sequenzen sind nur beispielhaft und beschränken die Ansprüche nicht auf bestimmte Ausführungsformen. Dies bedeutet, dass die Lehre der vorliegenden Erfindung auf andere TCR α- und β-Ketten oder TCR aß-Heterodimere mit anderen Sequenzen, insbesondere in der variablen Domäne, und dort insbesondere in den CDRs anwendbar ist.
Darüber hinaus ist die Lehre der vorliegenden Erfindung auch auf andere TCR α- und β-Ketten oder TCR aß-Heterodimere anwendbar, die an andere Zielantigen/MHC-Komplexe binden, ebenfalls, sofern sie die Q44-Aminosäure besitzen, vorzugsweise solange sie das WYXQ-Motiv je nach dem jeweiligen Antigen, das angestrebt wird, aufweisen, können die CDR-Sequenzen natürlich variieren.
Im Allgemeinen wurden in Wälchli et al. (2011) Verfahren der Klonierung und Expression von T-Zellrezeptoren offenbart. Verfahren der zufälligen Mutagenese oder Site-spezifischen Mutagenese, die zu standortspezifischen AminosäureSubstitutionen führen, sind dem Fachmann gut bekannt und werden z. B. in Labrou (2010) und Trehan et al. (2016) veröffentlicht.
Verfahren der Genombearbeitung zur Modifikation einer gegebenen Aminosäuresequenz sind dem Fachmann gut bekannt (z. B. CRISPR Cas, TALEN, ZFN, Argonaute (NgAgo) oder CRISPR Cpf1) und werden z. B. in Maeder & Gersbach (2016) offenbart. Die Verfahren der Gensynthese sind dem Fachmann gut bekannt und werden beispielsweise in Hughes et al. (2011) offenbart. Die Offenlegung dieser Verweise gilt als durch Verweis in Bezug auf die hinreichende Offenbarung, Befähigung und schriftliche Beschreibung aufgenommen,
In silico-Methoden
Durch die visuelle Untersuchung der variablen Domäne des 1G4 TCR (pdb ID: 2BNR (Chen et al., 2005)) wählten die Erfinder manuell Paare von Mutationen für das aQ44/ßQ44-Motiv aus, die möglicherweise ein hohes Maß an molekularen Kontakten (polar oder apolar) aufrechterhalten und gleichzeitig die sterische und/oder Ladungssymmetrie brechen würden. Mutationspaare wurden so ausgewählt, dass (i) die Gesamtladung des Paares neutral bleibt, (ii) die beiden Aminosäuren möglicherweise eine gute Formkomplementarität und/oder Wasserstoffbrückenbindung(en) aufweisen würden und (iii) die beiden Aminosäuren ein unterschiedliches Molekulargewicht (d. h. eine große Aminosäure und eine kleine Aminosäure) hätten.
Mit der Software Discovery Studio (Dassault Systemes, BIOVIA, 2017) wurde der Einfluss der konstruierten Positionen auf die aß-Paarung des TCRs untersucht. Die Mutationsenergien wurden unter Verwendung des von Spassov et al. beschriebenen Algorithmus (Spassov & Yan, 2013) berechnet, um in silico Design von Antikörpern durchzuführen. Es wurde erwartet, dass Mutationsenergien die Wirkung einer Mutation, verglichen mit dem Wildtyp-Motiv aQ44/ßQ44, widerspiegeln. Die Erfinder testeten Doppelmutanten sowie jede einzelne Mutante, gepaart mit einer Wildtypkette:

- bei Doppelmutanten sollte die Mutationsenergie gemäß den Erwartungen neutral oder stabilisierend sein
- bei Einzelmutanten, die mit einer Wildtypkette gekoppelt sind, sollte die Mutationsenergie gemäß den Erwartungen für mindestens eine der beiden Seiten destabilisierend wirken.

Menschliche primäre CD8+ T-Zellen wurden ohne RNA (keine TCR) oder mit der gleichen Menge an peptidspezifischer RNA elektroporiert (MAG-003 als Beispiel, Peptid „p286“, wie z. B. durch Wu et al. Scandinavian journal of immunology 74:6 2011 Dec pages 561-7) offenbart. T-Zell-Rezeptorketten α und β in ihrer Wildtyp-Form (R7P1D5 TCR wt) oder in einer mutierten Form (R7P1D5 TCRaQ44D/ßQ44R), die eine Q44D-Mutation in der TCR alpha-variablen-Domäne und eine Q44R-Mutation in der TCR beta-variablen-Domäne enthält. Nach einer Kultivierung über Nacht wurden die T-Zellen auf Bindung von MAG-003: HLA-A*02-Tetramere ( , obere Reihe) und Bindung des nicht verwandten Peptids NYESO1-001: HLA-A*02-Kontrolltetramere ( , untere Reihe) (Peptid NYESO-001; Epitope ID 59283 in der Epitope-Datenbank wie oben) untersucht. Der Anteil der Tetramer-positiven T-Zellen wird für zwei einzelne Spender gezeigt ( linkes Schaubild: Spender A, rechtes Schaubild: Spender B).
Der TCR R7P1D5, der für eine tumorspezifische TCR-alpha und TCR-beta-Kette kodiert, wurde aus T-Zellen eines gesunden Spenders isoliert und amplifiziert. Zellen von gesunden Spendern wurden in vitro nach einem zuvor beschriebenen Verfahren stimuliert (Walter et al., 2003) und zielspezifische Zellen wurden mit HLA-A*02-Multimeren einzelzellig sortiert und dann für die anschließende TCR-Isolierung verwendet. TCR-Sequenzen wurden über 5'-RACE durch Standardverfahren, wie z. B. in Molecular Cloning a laboratory manual fourth edition by Green and Sambrook beschrieben, isoliert. Die alpha- und beta-variablen Regionen des TCRs R7P1D5 wurden sequenziert und für eine weitere funktionelle Charakterisierung kloniert. TCR R7P1D5 ist von einem HLA-A*02-positiven Spender erhalten.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Modifizierte α- oder β-Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) oder ein Fragment oder Derivat davon, das die Fähigkeit behält, an einen Antigen-MHC-Komplex zu binden, wobei gemäß der IMGT-Nummerierung Q an Position 44 durch eine andere Aminosäure substituiert ist.
Modifizierte α- oder β-Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) nach Anspruch 1, wobei die α-Kette vorzugsweise mit einer β-Kette eines T-Zell-Rezeptors (TCR) paart, in der Q an Position 44 durch eine andere Aminosäure substituiert ist, oder die β-Kette vorzugsweise mit einer α-Kette eines T-Zell-Rezeptors (TCR) paart, in der Q an Position 44 durch eine andere Aminosäure substituiert ist, oder
Modifizierte α- oder β-Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) nach Anspruch 1, wobei Q an Position 44 in der variablen Domäne durch eine Aminosäure substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus R, D, E, K, L, W und V besteht.
Modifizierte α- oder β-Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die modifizierte α-Kette eine Sequenz der variablen Domäne aufweist, die mindestens die Gerüstregione einer Sequenz mit mindestens 95 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 1 oder 3 umfasst, und/oder wobei die modifizierte β-Kette eine Sequenz der variablen Domäne- aufweist, die die Gerüstregione einer Sequenz mit mindestens 95 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO 2 oder 4 umfasst.
Rekombinanter T-Zell-Rezeptor (TCR)-Heterodimer, umfassend eine modifizierte α-Kette und/oder eine modifizierte β-Kette oder Fragmente oder Derivate davon nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der TCR die Fähigkeit behält, an einen Antigen-MHC-Komplex zu binden.
Rekombinanter T-Zell-Rezeptor (TCR)-Heterodimer nach Anspruch 5, wobei die Modifikation der α- und/oder β-Kette aus einer Substitution von Q an Position 44 durch mindestens eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R, D, E, K, L, W und V ausgewählt ist.
Rekombinanter T-Zell-Rezeptor (TCR)-Heterodimer nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Modifikation der α- und β-Kette ein Substitutionspaar ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus αQ44R / βQ44D; αQ44E / βQ44K; αQ44L / βQ44W; αQ44V / βQ44W; αQ44D / βQ44R; αQ44K / βQ44E; αQ44W / βQ44L; und αQ44W / βQ44V, vorzugsweise ein Substitutionspaar ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus αQ44R / βQ44D; αQ44D / βQ44R; αQ44E / βQ44K; und αQ44K / βQ44E umfasst.
Rekombinanter T-Zell-Rezeptor (TCR)-Heterodimer nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die α-Kette des TCRs eine Sequenz der variablen Domäne aufweist, die mindestens die Gerüstregione einer Sequenz mit mindestens 95 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 1 oder 3 umfasst, und/oder die β-Kette des TCRs eine Sequenz der variablen Domäne-aufweist, die die Gerüstregione einer Sequenz mit mindestens 95 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 2 oder 4 umfasst.
Nukleinsäuremolekül, das für eine modifizierte α- oder β-Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder ein rekombinantes T-Zell-Rezeptor (TCR)-Heterodimer nach einem der Ansprüche 5 bis 8 kodiert.
Plasmid oder Expressionsvektor, umfassend mindestens eines der Nukleinsäuremoleküle nach Anspruch 9.
Verfahren zur Herstellung einer modifizierten T-Zelle, wobei das Verfahren das Transduzieren oder Transfizieren einer T-Zelle, die aus einem Trägerhilfsmittel erhalten wurde, mit einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen nach Anspruch 9 oder einem Plasmid oder Expressionsvektor nach Anspruch 10 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die modifizierte T-Zelle zur Verwendung für eine Behandlung des Subjekts mit autologen T-Zellen bestimmt ist.
Eine modifizierte T-Zelle, hergestellt nach Anspruch 11 oder 12.
Modifizierte T-Zelle nach Anspruch 13 zur Verwendung bei der Behandlung eines Subjekts, der diese Behandlung benötigt, der an einer neoplastischen, entzündlichen, infektiösen Erkrankung oder einer Autoimmunerkrankung leidet, davon gefährdet ist, diese zu entwickeln; und/oder bei welchem diese Erkrankung diagnostiziert wird, umfassend das Bereitstellen oder Verabreichen eines Präparats, das die modifizierte T-Zelle umfasst, an den Patienten, der es benötigt.
Rekombinanter T-Zellrezeptor (TCR)-Heterodimer nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der TCR spezifisch an ein Antigen bindet, das durch einen MHC-Komplex präsentiert wird, wobei das Antigen aus einem TAA-Epitop ausgewählt ist.