ES2528739T3 - Métodos para eliminar la manosilfosforilación de glucanos en la producción de glucoproteínas - Google Patents

Abstract

Un hospedador fúngico que comprende una disrupción, una deleción o una mutación combinadas de los genes MNN4B y PNO1 en donde el hospedador fúngico es Pichia pastoris y es capaz de producir menos del 1 % de glucoproteínas manosilfosforiladas de los N-glucanos totales en donde el gen de MNN4B en el que hay que provocar una disrupción, suprimir o mutar codifica un ARN mensajero que se corresponde con un ADNc que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en (a) SEC ID Nº: 3; (b) una secuencia de ácido nucleico que es una variante degradada de SEC ID Nº: 3; (c) una secuencia de ácido nucleico al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 99,9 % idéntica a SEC ID Nº: 3; (d) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4; y (e) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 99,9 % idéntico a SEC ID Nº: 4.

Description

Métodos para eliminar la manosilfosforilación de glucanos en la producción de glucoproteínas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la eliminación de la transferencia de manosilfosfato en glucanos de glucoproteínas, y se refiere además a eliminar genes responsables de la adición de restos de manosilfosfato en glucanos en Pichia pastoris.

En particular, la invención se refiere a modificar por ingeniería genética células hospedadoras de P. pastoris para producir glucanos sin restos de manosilfosfato.

Antecedentes de la invención

La capacidad para producir proteínas humanas recombinantes ha conducido a avances importantes en el cuidado de la salud humana y sigue siendo un área activa de descubrimiento de fármacos. Muchas proteínas terapéuticas requieren la adición cotraduccional de glucanos a restos de asparagina específicos (N-glucosilación) de la proteína para asegurar la actividad de función estructural apropiada y posterior estabilidad en suero humano. Para el uso terapéutico en seres humanos, las glucoproteínas requieren N-glucosilación de tipo humano. Las líneas celulares de mamífero (células de ovario de hámster Chino (CHO) así como células retinianas humanas) que pueden imitar el procesamiento de glucoproteína de tipo humano tiene varios inconvenientes incluyendo bajos títulos de proteínas, largos tiempo de fermentación, productos heterogéneos y problemas de contenimiento viral continuados. Por lo tanto, el uso de sistemas de expresión de levadura y hongos filamentosos que tienen procesamiento más económico, menos obstáculos de seguridad y que producen rendimientos de proteína heteróloga más robustos se han investigado exhaustivamente como células hospedadoras para productos terapéuticos humanos.

En levadura y hongos filamentosos, se producen glucoproteínas que tienen oligosacáridos que son diferentes de los de glucoproteínas derivadas de mamífero. Específicamente en levadura, los oligosacáridos de cadena externa son hipermanosilados que consisten en 30-150 restos de manosa (Kukuruzinska et al., 1987, Annu. Rev. Biochem. 56: 915-944). Además, el manosilfosfato se transfiere con frecuencia tanto al núcleo como a las cadenas de azúcares externas de glucoproteínas producidas en levadura (Ballou, 1990, Method Enzymol. 185: 440-470). Es más importante que se ha mostrado que estos glucanos manosilfosforilados de glucoproteínas producidas en la levadura, Saccharomyces cerevisiae, inducen una respuesta inmunitaria en conejos (Rosenfeld y Ballou, 1974, JBC, 249: 2319-2321). Por lo tanto, la eliminación de la manosilfosforilación en levadura y hongos filamentosos es esencial para la producción de glucoproteínas terapéuticas no inmunogénicas.

En S. cerevisiae hay al menos dos genes que participan en la transferencia de manosilfosfato. Los dos genes, MNN4 y MNN6 se han clonado, y los análisis de los productos génicos sugieren que actúan en la transferencia del manosilfosfato (para una revisión véase Jigami y Odani, 1999, Biochim. Biophys. Acta, 1426: 333-345). MNN6 codifica una proteína de membrana de tipo II homóloga de la familia Kre2p/Mnt1p de proteínas que se ha caracterizado como α-1,2 manosiltransferasas del Golgi implicadas en la O-manosilación y N-glucosilación (Lussier et al., 1997, JBC, 272: 15527-15531). El mutante Δmnn6 no muestra un defecto en la manosilfosforilación de los glucanos principales in vivo, pero muestra una reducción de la actividad manosilfosfato transferasa in vitro (Wang et al., 1997, JBC, 272: 18117-18124). Mnn4p también es una proteína de membrana de tipo n potencial que es 33 % idéntica a la Yjr061p de S. cerevisiae (Odani et al., 1996, Glycobiology, 6: 805-810; Hunter y Plowman, 1997, Trends in Biochem. Sci., 22: 18-22). Los mutantes tanto de Δmnn6 como de Δmnn4 reducen la transferencia de manosilfosfato. Sin embargo, el mutante doble Δmnn6 Δmnn4 no reduce adicionalmente esta actividad. Estas observaciones sugieren la presencia de manosiltransferasas adicionales que añaden manosilfosfato a los glucanos principales.

Por lo tanto, a pesar de la reducción de la manosilfosforilación en S. cerevisiae con la disrupción de MNN4, MNN6 o ambos en combinación, no hay pruebas de que la eliminación completa de la actividad manosilfosfato transferasa sea posible. Otros genes que afectan a los niveles de manosilfosfato se han identificado en S. cerevisiae. Estos genes incluyen PMR1, VRG4, MNN2 y MNN5. PMR1 codifica una Ca2+/Mn2+-ATPasa localizada en el Golgi requerida para la función normal del aparato de Golgi (Antebi y Fink, 1992, Mol. Biol. Cell, 3: 633-654); Vrg4p está implicado en el transporte del azúcar nucleotídico en el Golgi (Dean et al., 1997, JBC, 272: 31908-31914), y Mnn2p y Mnn5p son α1,2-manosiltransferasas responsables del inicio de la ramificación en la cadena externa de glucanos ligados a N (Rayner y Munro, 1998, JBC, 273: 23836-23843). Para las cuatro proteínas, la reducción en los grupos de manosilfosfato unidos a los glucanos ligados a N parece ser una consecuencia de la disfunción del Golgi o una reducción en el tamaño de los glucanos ligados a N en lugar de un defecto específico en la actividad de transferencia de los grupos de manosilfosfato. El documento US-A 2002/0137134 describe la provisión de células eucariotas inferiores, en particular Pichia pastoris, que tienen una ruta de glucosilación modificada genéticamente que imita el procesamiento de las glucoproteínas en seres humanos. Las modificaciones pueden implicar la eliminación de manosilfosfato transferasas (MNN4, MNN6, o genes que complementan a los mutantes lbd).

Las proteínas expresadas en la levadura metilotrópica, Pichia pastoris, contienen glucanos manosilfosforilados (Miele, et al., 1997, Biotech. Appl Biochem., 2: 79-83). Miura et al., presentaron la identificación del gen PNO1 (Fosforil manosilación de Oligosacáridos ligados a N) que tras su disrupción confiere una atenuación de la manosilfosforilación en glucoproteínas (documento WO 01/88143; Miura et al., 2004, Gene, 324: 129-137). El gen PNO1 codifica una proteína implicada en la transferencia de manosilfosfato a glucanos en P. pastoris. Su función específica, sin embargo, se desconoce. Como se ha mencionado, el mutante Δpnol reduce pero no anula la manosilfosforilación en N-glucanos en relación con un cepa de P. pastoris que tiene Pnolp de tipo silvestre.

En la actualidad, no existen métodos para eliminar la manosilfosforilación en glucoproteínas producidas en hospedadores fúngicos. Una cantidad residual de manosilfosforilación en glucoproteínas aún puede ser inmunogénica y, por lo tanto, es indeseable como productos terapéuticos humanos.

Lo que se necesita, por lo tanto, es un sistema de expresión basado en levadura u hongos filamentosos que produzca glucoproteínas que estén esencialmente sin glucanos manosilfosforilados.

Sumario de la invención

La presente divulgación proporciona un método para eliminar restos de manosilfosfato en glucanos de glucoproteínas en un hospedador fúngico de P. pastoris.

La presente invención proporciona un hospedador fúngico que produce de forma normal glucoproteínas manosilfosforiladas o una fracción de las mismas, modificándose dicho hospedador fúngico para producir glucoproteínas esencialmente sin restos de manosilfosfato. En particular, la presente invención proporciona un hospedador fúngico que comprende una disrupción, una deleción o una mutación combinadas de los genes MNN4B y PNO1 en el que el hospedador fúngico es Pichia pastoris y es capaz de producir menos del 1 % de glucoproteínas manosilfosforiladas de N-glucanos totales en el que el gen MNN4B en el que hay que provocar una disrupción, suprimir o mutar codifica un ARN mensajero que se corresponde con un ADNc que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en

(a)

SEC ID Nº: 3;

(b)

una secuencia de ácido nucleico que es una variante degradada de SEC ID Nº: 3;

(c)

una secuencia de ácido nucleico al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 99,9 % idéntica a SEC ID Nº: 3;

(d)

una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 99,9 % idéntica a SEC ID Nº: 4.

Además, la presente invención proporciona un método para producir composiciones de glucoproteínas en el hospedador fúngico de la invención que comprende propagar dicho hospedador fúngico y aislar los productos de glucoproteínas.

La presente divulgación proporciona además composiciones de glucoproteínas que están esencialmente sin glucoproteínas manosilfosforiladas. Dichas composiciones de glucoproteínas comprenden N-glucanos complejos que pueden usarse para aplicaciones terapéuticas.

La presente divulgación también proporciona polinucleótidos aislados que comprenden o consisten en secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en las secuencias codificantes de los MNN4A, MNN4B y MNNC de P. pastoris; secuencias de ácido nucleico que son variantes degradadas de estas secuencias; y secuencias y fragmentos de ácido nucleico relacionados. La divulgación también proporciona polipéptidos aislados que comprenden o consisten en secuencias polipeptídicas seleccionadas del grupo que consiste en secuencias codificadas por los MNN4A, MNN4B, MNN4C de P. pastoris; secuencias polipeptídicas relacionadas, fragmentos y fusiones. También se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente con los polipéptidos aislados desvelados.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa la secuencia de ácido nucleico y aminoácidos de MNN4A de P. pastoris. La Figura 2 representa la secuencia de ácido nucleico y aminoácidos de MNN4B de P. pastoris. La Figura 3 representa la secuencia de ácido nucleico y aminoácidos de MNN4C de P. pastoris. La Figura 4 ilustra la estrategia de anulación por PCR de fusión de MNN4B de P. pastoris usando un marcador de resistencia a fármacos. La Figura 5A muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para el control experimental negativo usando H2O como la muestra. B. muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para la muestra que contiene glucanos ligados a N de K3 purificado del sobrenadante de P. pastoris YSH-44. Los glucanos con manosilfosfato se eluyen entre 20 y 30 minutos. C. muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para una muestra que

contiene glucanos ligados a N de K3 purificado del sobrenadante de P. pastoris YSH-49 (ΔpnoI). Los glucanos con manosilfosfato se eluyen entre 20 y 30 minutos. D. muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para una muestra que contiene glucanos ligados a N de K3 purificado del sobrenadante de P. pastoris YAS-130 (Δpno1 Δmnn4B). Obsérvese la ausencia de glucanos manosilfosforilados entre 20 y 30 minutos.

5 La Figura 6A muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para la muestra que contiene glucanos ligados a N de K3 purificado del sobrenadante de P. pastoris YSH-1 (Δ och1). Los glucanos con manosilfosfato se eluyen entre 20 y 30 minutos B. muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para una muestra que contiene glucanos ligados a N de K3 purificado del sobrenadante de P. pastoris YAS-164 (Δ och1 Δmnn4A Δpno1). Los glucanos con manosilfosfato se eluyen entre 20 y 30 minutos C. muestra un cromatograma líquido

10 de alto rendimiento para una muestra que contiene glucanos ligados a N de K3 purificado del sobrenadante de P. pastoris YAS-174 (Δ ochl Δmnn4A Δpnol Δmnn4B). Obsérvese la ausencia de glucanos manosilfosforilados entre 20 y 30 minutos. La Figura 7A muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para la muestra de control experimental negativo que contiene H2O. B. muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para la muestra que

15 contiene glucanos ligados a N de eritropoyetina expresada a partir de pBK291 (His-EPO) producido en la cepa de P. pastoris BK248. C. muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para la muestra que contiene glucanos ligados a N de His-EPO producido en la cepa de P. pastoris BK244. D. muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para la muestra que contiene glucanos ligados a N de CD40 expresado de pJC33 (His-CD40) producido en la cepa de P. pastoris YJC12. E. muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento

20 para la YAS252. Nota: los glucanos con manosilfosfato se eluyen entre 20 y 30 minutos. La Figura 8 A. muestra un cromatograma líquido de alto rendimiento para la muestra que contiene glucanos ligados a N de invertasa expresada de pPB147 producida en la cepa de P. pastoris YAS252. La Figura 9 muestra un alineamiento de homólogos de MNN4/PNO1 en P. pastoris (Pp), S. cerevisiae (Sc), Neurospora crassa (Nc), Aspergillus nidulans (An), Candida albicans (Ca) y Pichia angusta (Hansenula

25 polymorpha) (Pa) usando Clustal W de DNAStar.

Descripción detallada de la invención

A no ser que se defina de otro modo en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en

30 relación con la presente invención tendrán los significados que entienden habitualmente los expertos habituales en la materia. Además, a no ser que se requiera de otro modo por el contexto, los términos singulares incluirán el plural y los términos plurales incluirán el singular. En general, las nomenclaturas usadas en relación con, y las técnicas de bioquímica, enzimología, molecular y biología celular, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en el presente documento son las que se conocen bien y se usan habitualmente en

35 este campo. Los métodos y técnicas de la presente invención se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en este campo y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva a no ser que se indique de otro modo. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green

40 Publishing Associates (1992, y Suplementos hasta 2002); Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990); Taylor y Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I, CRC Press (1976); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II, CRC. Press (1976); Essential of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999).

45 Se entenderá que los siguientes términos, a no ser que se indique de otro modo, tendrán los siguientes significados:

La expresión “polinucleótido” o “molécula de ácido nucleico” se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud. La expresión incluye moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico sintético)

50 y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm o ARN sintético), así como análogos de ADN o ARN que contienen análogos de nucleótidos no naturales, enlaces internucleosídicos no nativos, o ambos. El ácido nucleico puede estar en cualquier conformación topológica. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser monocatenario, bicatenario, tricatenario, cuádruple, parcialmente bicatenario, ramificado, en horquilla, circular o en conformación de candado.

55 A no ser que se indique de otro modo, un “ácido nucleico que comprende SEC ID Nº: X” ser refiere a un ácido nucleico, al menos una parte del cual tiene (i) la secuencia de SEC ID Nº: X, o (ii) una secuencia complementaria de SEC ID Nº: X. La elección entre los dos se dicta por el contexto. Por ejemplo, si el ácido nucleico se usa como una sonda, la elección entre las dos se dicta por el requisito de que la sonda sea complementaria de la diana deseada.

60 Un ácido nucleico o polinucleótido “aislado” o “sustancialmente puro” (por ejemplo, un ARN, ADN o un polímero mixto) es uno que está sustancialmente separado de otros componentes celulares que acompañan de forma natural al polinucleótido nativo en su célula hospedadora natural, por ejemplo, ribosomas, polimerasas y secuencias genómicas con las que se asocia de forma natural. La expresión abarca un ácido nucleico o polinucleótido que (1) se ha retirado de su ambiente de origen natural, (2) no está asociado con todo o una parte de un polinucleótido en el

65 que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, (3) está unido operativamente con un polinucleótido con

el que no está unido en la naturaleza o (4) no aparece en la naturaleza. La expresión “aislado” o “sustancialmente puro” también puede usarse en referencia a aislados de ADN recombinantes o clonados, análogos polinucleotídicos sintetizados químicamente o análogos polinucleotídicos que se sintetizan biológicamente por sistemas heterólogos.

Sin embargo, “aislado” no requiere necesariamente que el ácido nucleico o polinucleótido descrito de este modo se haya retirado físicamente en sí mismo de su ambiente nativo. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico endógena en el genoma de un organismo se considera “aislada” en el presente documento si se coloca una secuencia heteróloga adyacente a la secuencia de ácido nucleico endógena, de modo que la expresión de esta secuencia de ácido nucleico endógena está alterada. En este contexto, una secuencia heteróloga es una secuencia que no está adyacente de forma natural a la secuencia de ácido nucleico endógena, independientemente de si la secuencia heteróloga es en sí misma endógena o no (se origina de la misma célula hospedadora o descendencia de la misma) o exógena (se origina de una célula hospedadora diferente o descendencia de la misma). Como ejemplo, una secuencia promotora puede sustituir (por ejemplo, por recombinación homóloga) al promotor nativo de un gen en el genoma de una célula hospedadora, de modo que este gen tenga un patrón de expresión alterado. Este gen se volvería “aislado” porque está separado de al menos algunas de las secuencias que lo flanquean de forma natural.

Un ácido nucleico también se considera “aislado” si contiene cualquier modificación que no aparezca de forma natural en el ácido nucleico correspondiente en un genoma. Por ejemplo, una secuencia codificante endógena se considera “aislada” si contiene una inserción, deleción o una mutación puntual introducida de forma artificial, por ejemplo, por la intervención humana. Un “ácido nucleico aislado” también incluye un ácido nucleico integrado en un cromosoma de la célula hospedadora en un sitio heterólogo y una construcción de ácido nucleico presente como un episoma. Además, un “ácido nucleico aislado” puede estar sustancialmente sin otro material celular, o sustancialmente sin medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente sin precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Como se usa en el presente documento, la frase “variante degradada” de una secuencia de ácido nucleico de referencia abarca secuencias de ácido nucleico que pueden traducirse, de acuerdo con el código genético convencional, para proporcionar una secuencia de aminoácidos idéntica a la traducida de la secuencia de ácido nucleico de referencia. La expresión “oligonucleótido degradado” o “cebador degradado” se usa para indicar un oligonucleótido capaz de hibridar con secuencias de ácido nucleico diana que no son necesariamente idénticas en secuencia pero que son homólogas entre sí dentro de uno o más segmentos particulares.

La expresión “porcentaje de identidad de secuencia” o “idéntico” en el contexto de secuencias de ácido nucleico se refiere a los restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para máxima correspondencia. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser sobre un tramo de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más habitualmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más normalmente al menos aproximadamente 32 nucleótidos y preferentemente al menos aproximadamente 36 o más nucleótidos. Hay varios algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, pueden compararse secuencias polinucleotídicas usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en el Paquete de Wisconsin Versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda. Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990). Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de ácido nucleico puede determinarse usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor de NOPAM para la matriz de puntuación) o usando Gap con sus parámetros por defecto como se proporciona en GCG Versión 6.1, incorporado en el presente documento por referencia. Como alternativa, pueden compararse secuencias usando el programa informático, BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Gish y States, Nature Genet. 3: 266-272 (1993); Madden et al., Meth. Enzymol. 266: 131-141 (1996); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997); Zhang y Madden, Genome Res. 7: 649-656 (1997)), especialmente blastp o tblastn (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)).

La expresión “homología sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), hay identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 50 %, más preferentemente el 60 % de las bases nucleotídicas, habitualmente al menos aproximadamente el 70 %, más habitualmente al menos aproximadamente el 80 %, preferentemente, al menos aproximadamente el 90 % y más preferentemente al menos aproximadamente el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, como se mide por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tales como FASTA, BLAST o Gap, como se analizado anteriormente.

Como alternativa, existe homología o similitud sustancial cuando un ácido nucleico o fragmento del mismo hibrida con otro ácido nucleico, con una cadena de otro ácido nucleico o con la cadena complementaria del mismo, en condiciones de hibridación rigurosas. Las “condiciones de hibridación rigurosas” y “condiciones de lavado rigurosas” en el contexto de los experimentos de hibridación de ácido nucleico dependen de varios parámetros físicos diferentes. La hibridación de ácido nucleico se verá afectada por condiciones tales como la concentración salina, la

temperatura, los disolventes, la composición básica de las especies que hibridan, la longitud de las regiones complementarias y el número de desapareamientos de bases nucleotídicas entre los ácidos nucleicos que hibridan, como se apreciará fácilmente por los expertos en la materia. Un experto habitual en la materia conoce cómo variar estos parámetros para conseguir una rigurosidad particular de hibridación.

En general, la “hibridación rigurosa” se realiza a aproximadamente 25 ºC por debajo del punto de fusión térmico (Tm) para el híbrido de ADN específico en un conjunto de condiciones particular. El “lavado riguroso” se realiza a temperaturas aproximadamente 5 ºC menores que la Tm para el híbrido de ADN específico en un conjunto de condiciones particular. La Tm es la temperatura a la que el 50 % de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), página 9.51.

Para fines del presente documento, las “condiciones rigurosas” se definen para hibridación en fase de solución como hibridación acuosa (es decir, sin formamida) en SCC 6X (en la que SSC 20X contiene NaCl 3,0 M y citrato sódico 0,3 M), SDS 1 % a 65 ºC durante 8-12 horas, seguido de dos lavados en SSC 0,2X, SDS 0,1 % a 65 ºC durante 20 minutos. Se apreciará por el experto en la materia que la hibridación a 65 ºC sucederá a diferentes velocidades dependiendo de varios factores incluyendo la longitud y el porcentaje de identidad de las secuencias que se hibriden.

Los ácidos nucleicos (también denominados polinucleótidos) de la presente divulgación pueden incluir cadenas tanto con sentido como antisentido de ARN, ADNc, ADN genómico y formas sintéticas y polímeros mixtos de los anteriores. Pueden modificarse de forma química o bioquímica o pueden contener bases nucleotídicas no naturales

o derivatizadas, como se apreciará fácilmente por los expertos en la materia. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como enlaces sin carga (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), enlaces con carga (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos pendientes (por ejemplo, polipéptidos), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes, alquilantes y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). También se incluyen moléculas sintéticas que imitan los polinucleótidos en su capacidad para unirse con una secuencia designada mediante enlaces de hidrógeno y otras interacciones químicas. Dichas moléculas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, en las que los enlaces peptídicos sustituyen enlaces fosfato en la cadena principal de la molécula. Otras modificaciones pueden incluir, por ejemplo, análogos en los que el anillo de ribosa contiene un resto de enlace u otra estructura tal como las modificaciones halladas en ácidos nucleicos “bloqueados”.

El término “mutado” cuando se aplica a secuencias de ácido nucleico significa que los nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico pueden insertarse, suprimirse o cambiarse en comparación con una secuencia de ácido nucleico de referencia. Puede realizarse una única disrupción en un locus (una mutación puntual) o pueden insertarse, suprimirse o cambiarse múltiples nucleótidos en un único locus. Además, pueden realizarse una o más alteraciones en cualquier variedad de loci dentro de una secuencia de ácido nucleico. Una secuencia de ácido nucleico puede mutarse por cualquier método conocido en la técnica incluyendo pero sin limitación técnicas de mutagénesis tales como “PCR propensa a errores” (un proceso para realizar PCR en condiciones en las que la fidelidad de copia de la ADN polimerasa es baja, de modo que se obtenga una alta tasa de mutaciones puntuales a lo largo de la longitud completa del producto de PCR; véase, por ejemplo Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989) y Caldwell y Joyce, PCR Methods Applic. 2: 28-33 (1992)); y “mutagénesis dirigida a oligonucleótidos” (un proceso que permite la generación de mutaciones específicas en cualquier segmento de ADN clonado de interés; véase, por ejemplo, Reidhaar-Olson y Sauer, Science 241: 53-57 (1988)).

Se entiende que el término “vector” como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico con el que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otros vectores incluyen cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de levadura (YAC). Otro tipo de vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral (analizado en más detalle posteriormente). Ciertos vectores tienen capacidad de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se han introducido (por ejemplo, vectores que tienen un origen de replicación que actúa en la célula hospedadora). Otros vectores pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora tras su introducción en la célula hospedadora, y por lo tanto se replican junto con el genoma hospedador. Además, ciertos vectores preferidos son capaces de dirigir la expresión de genes con los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresión recombinante” (o simplemente, “vectores de expresión”).

La expresión “secuencia marcadora” o “gen marcador” se refiere a la secuencia de ácido nucleico capaz de expresar una actividad que permite la selección positiva o negativa con respecto a la presencia o ausencia de la secuencia dentro de una célula hospedadora. Por ejemplo, el gen URA5 de P. pastoris es un gen marcador porque su presencia puede seleccionarse por la capacidad de las células que contienen el gen para crecer en ausencia de uracilo. Su presencia también puede seleccionarse frente a la incapacidad de las células que contienen el gen para crecer en presencia de 5-FOA. Las secuencias marcadoras o genes no tienen que presentar necesariamente

capacidad de selección positiva y negativa. Los ejemplos no limitantes de secuencias o genes marcadores de P. pastoris incluyen ADE1, ARG4, HIS4 y URA3.

Las secuencias de control de la expresión “unidas operativamente” se refieren a un enlace en el que la secuencia de control de la expresión es contigua con el gen de interés para controlar el gen de interés, así como las secuencias de interés de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés.

La expresión “secuencia de control de la expresión” como se usa en el presente documento se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para afectar a la expresión de secuencias codificantes con las que están unidas operativamente. Las secuencias de control de la expresión son secuencias que controlan la transcripción, acontecimientos postranscripcionales y traducción de secuencias de ácido nucleico. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias de inicio de la transcripción, terminación, promotoras y potenciadoras apropiadas; las señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de corte y empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la eficacia de traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosoma); secuencias que potencian la estabilidad proteica; y cuando se desee secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen un promotor, sitio de unión a ribosoma y secuencia de terminación de la transcripción. Se entiende que la expresión “secuencias de control” incluye, al menos, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias compañeras de fusión.

Se entiende que la expresión “célula hospedadora recombinante” (o simplemente “célula hospedadora”), como se usa en el presente documento, se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector recombinante. Debería entenderse que se pretende que dichas expresiones se refieran no solamente a la célula objeto particular sino también a la descendencia de dicha célula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha descendencia puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero aún se incluyen dentro del alcance de la expresión “célula hospedadora” como se usa en el presente documento. Una célula hospedadora recombinante puede ser una célula aislada o línea celular que ha crecido en cultivo o puede ser una célula que reside en un tejido u organismo vivo.

El término “péptido” como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido corto, por ejemplo, uno que es normalmente de menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud y más normalmente de menos de aproximadamente 30 aminoácidos de longitud. El término como se usa en el presente documento abarca análogos y miméticos que imitan la función estructural y por lo tanto biológica.

El término “polipéptido” abarca proteínas tanto de origen natural como de origen no natural, y fragmentos, mutantes, derivados y análogos de los mismos. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. Además, un polipéptido puede comprender varios dominios diferentes cada uno de los cuales tiene una o más actividades distintas.

La expresión “proteína aislada” o “polipéptido aislado” es una proteína o un polipéptido que en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociado con componentes asociados de forma natural que lo acompañan en su estado nativo, (2) existe en una pureza no hallada en la naturaleza, pudiendo valorarse la pureza con respecto a la presencia de otro material celular (por ejemplo, está sin otras proteínas de la misma especie), (3) se expresa por una célula de diferente especie o (4) no aparece en la naturaleza (por ejemplo, es un fragmento de un polipéptido hallado en la naturaleza o incluye análogos de aminoácidos o derivados no hallados en la naturaleza o enlaces distintos de los enlaces peptídicos convencionales). Por lo tanto, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula de la que se origina de forma natural estará “aislado” de sus componentes asociados de forma natural. Puede hacerse que un polipéptido o proteína esté sustancialmente sin componentes asociados de forma natural por aislamiento, usando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en este campo. Como se ha definido de este modo, “aislado” no requiere necesariamente que la proteína, polipéptido, péptido u oligopéptido descrito de este modo se haya retirado físicamente de su ambiente nativo.

La expresión “fragmento polipeptídico” como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una deleción, por ejemplo, una deleción amino terminal y/o carboxilo terminal en comparación con un polipéptido de longitud completa. En una realización preferida, el fragmento polipeptídico es una secuencia contigua en la que la secuencia de aminoácidos del fragmento es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural. Los fragmentos son normalmente de al menos 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de longitud, preferentemente de al menos 12, 14, 16 o 18 aminoácidos de longitud, más preferentemente al menos 20 aminoácidos de longitud, más preferentemente al menos 25, 30, 35, 40 o 45 aminoácidos, y aún más preferentemente al menos 50 o 60 aminoácidos de longitud, y aún más preferentemente al menos 70 aminoácidos de longitud.

Un “derivado modificado” se refiere a polipéptidos o fragmentos de los mismos que son sustancialmente homólogos en secuencia estructural primaria pero que incluyen, por ejemplo, modificaciones químicas y bioquímicas in vivo o in vitro o que incorporan aminoácidos que no se encuentran en el polipéptido nativo. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, glucosilación, ubiquitinización, marcaje, por ejemplo, con

radionúclidos, y diversas modificaciones enzimáticas, como se apreciará fácilmente por los expertos en la materia. Se conoce bien en la técnica diversos métodos para marcar polipéptidos y de sustituyentes o marcadores útiles para dichos fines, e incluyen isótopos radiactivos tales como 125I, 32P, 35S y 3H, ligandos que se unen con antiligandos marcados (por ejemplo, anticuerpos), fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y antiligandos que pueden actuar como miembros de un par de unión específico para un ligando marcado. La elección del marcador depende de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación con el cebador, los requisitos de estabilidad y la instrumentación disponible. Se conocen bien en la técnica métodos para marcar polipéptidos. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, y Suplementos hasta 2002).

La expresión “proteína de fusión” se refiere a un polipéptido que comprende un polipéptido o fragmento acoplado con secuencias de aminoácidos heterólogas. Las proteínas de fusión son útiles porque pueden construirse de modo que contengan dos o más elementos funcionales deseados de dos o más proteínas diferentes. Una proteína de fusión comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de un polipéptido de interés, más preferentemente al menos 20 o 30 aminoácidos, aún más preferentemente al menos 40, 50 o 60 aminoácidos, aún más preferentemente al menos 75, 100 o 125 aminoácidos. Las fusiones que incluyen la totalidad de las proteínas de la presente invención tienen utilidad particular. El polipéptido heterólogo incluido dentro de la proteína de fusión de la presente invención es de al menos 6 aminoácidos de longitud, con frecuencia al menos 8 aminoácidos de longitud, y de forma útil al menos 15, 20 y 25 aminoácidos de longitud. Las fusiones que incluyen polipéptidos mayores, tales como una región Fc IgG e incluso proteínas completas, tales como la proteína verde fluorescente (“GFP”), proteínas que contienen cromóforos, tienen utilidad particular. Las proteínas de fusión pueden producirse de forma recombinante restringiendo una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido o fragmento del mismo en fase con una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína o péptido diferente y expresando después la proteína de fusión. Como alternativa, puede producirse una proteína de fusión de forma química reticulando el polipéptido o un fragmento del mismo con otra proteína.

La expresión “análogos no peptídicos” se refiere a un compuesto con propiedades que son análogas a las de un polipéptido de referencia. Un compuesto no peptídico también puede denominarse un “mimético peptídico” o un “peptidomimético”. Véase, por ejemplo, Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press (1992); Jung, Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries: A Handbook, John Wiley (1997); Bodanszky et al., Peptide Chemistry-A Practical Textbook, Springer Verlag (1993); Synthetic Peptides: A Users Guide, (Grant, ed., W. H. Freeman and Co., 1992); Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987); Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber y Freidinger, Trends Neurosci., 8: 392-396 (1985); y referencias citadas en cada una de las anteriores.

Dichos compuestos se desarrollan con frecuencia con la ayuda de modelos moleculares computarizados. Los miméticos peptídicos que son estructuralmente similares a péptidos útiles de la invención pueden usarse para producir un efecto equivalente y se prevé por lo tanto que sean parte de la invención.

Un “mutante polipeptídico” o una “muteína” se refieren a un polipéptido cuya secuencia contiene una inserción, duplicación, deleción, reordenamiento o sustitución de uno o más aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa o de tipo silvestre. Una muteína puede tener una o más sustituciones puntuales de aminoácidos, en las que se ha cambiado un único aminoácido en una posición por otro aminoácido, una o más inserciones y/o deleciones, en las que se han insertado o suprimido uno o más aminoácidos, respectivamente, en la secuencia de la proteína de origen natural y/o truncamientos de la secuencia de aminoácidos en uno o ambos de los extremos carboxilo o amino terminales. Una muteína puede tener la misma actividad biológica pero preferentemente tiene una diferente en comparación con la proteína de origen natural.

Una muteína tiene al menos 50 % de homología de secuencia general con su homólogo de tipo silvestre. Se prefieren aún más muteínas que tengan al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % de homología de secuencia general con la proteína de tipo silvestre. En una realización aún más preferida, una muteína muestra al menos 95 % de identidad de secuencia, aún más preferentemente 98 %, aún más preferentemente 99 % y aún más preferentemente 99,9 % de identidad de secuencia general. La homología de secuencia puede medirse por cualquier algoritmo de análisis de secuencia habitual, tal como Gap o Bestfit.

Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir las que: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran la afinidad de unión o actividad enzimática, y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos.

Como se usa en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology -A Synthesis (Golub y Gren eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass., 2ª ed. 1991).

Los estereoisómeros (por ejemplo, aminoácidos D) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos α disustituidos, aminoácidos N-alquilo, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de

aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetillisina, ε-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la anotación polipeptídica usada en el presente documento, el extremo izquierdo corresponde al extremo amino terminal y el extremo derecho corresponde al extremo carboxilo terminal, de acuerdo con el uso convencional y la convención.

Una proteína tiene “homología” o es “homóloga” de una segunda proteína si la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína tiene una secuencia similar a la secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda proteína. Como alternativa, una proteína tiene homología con una segunda proteína si las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos “similares”. (Por lo tanto, se define que la expresión “proteínas homólogas” significa que las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos similares). En una realización preferida, una proteína homóloga es una que muestra al menos 65 % de homología de secuencia con la proteína de tipo silvestre, más preferentemente al menos 70 % de homología de secuencia. Se prefieren aún más proteínas homólogas que muestran al menos 75 %, 80 %, 85 % o 90 % de homología de secuencia con la proteína de tipo silvestre. En una realización aún más preferida, una proteína homóloga muestra al menos 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de identidad de secuencia. Como se usa en el presente documento, se interpreta que la homología entre dos regiones de secuencias de aminoácidos (especialmente con respecto a similitudes estructurales predichas) implica similitud de función.

Cuando se usa “homólogo” en referencia a proteínas o péptidos, se reconoce que las posiciones de restos que no son idénticas con frecuencia difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Una “sustitución de aminoácidos conservativa” es una en la que un resto de aminoácido se sustituye por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieran entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de homología puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los expertos en la materia conocen bien medios para realizar este ajuste. Véase, por ejemplo, Pearson, 1994, Methods Mol. Biol. 24: 307-31 y 25: 365-89.

Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido Aspártico (D), Ácido Glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Alanina (A), Valina (V) y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

La homología de secuencia para polipéptidos, que también se denomina porcentaje de identidad de secuencia, se mide normalmente usando software de análisis de secuencia. Véase, por ejemplo, el Paquete de Software de Análisis de Secuencia del Genetics Computer Group (GCG), Centro Biotecnológico de la Universidad de Wisconsin, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. El software de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando una medida de homología asignada a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como “Gap” y “Bestfit” que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1.

Un algoritmo preferido cuando se compara una secuencia polipeptídica particular con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST (Altschul et al.,

J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Gish y States, Nature Genet. 3: 266-272 (1993); Madden et al., Meth. Enzymol.

266: 131-141 (1996); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997); Zhang y Madden, Genome Res. 7: 649-656 (1997)), especialmente blastp o tblastn (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)).

Son parámetros preferidos para BLASTp:

Valor de expectativa: 10 (defecto); Filtro: segundos (defecto); Coste para abrir un hueco: 11 (defecto); Coste para extender un hueco: 1 (defecto); Alineamientos máximos: 100 (defecto); Tamaño de palabra: 11 (defecto); Nº de descripciones: 100 (defecto); Matriz de Penalización: BLOWSUM62.

La longitud de las secuencias polipeptídicas comparadas con respecto a homología generalmente será de al menos aproximadamente 16 restos de aminoácidos, habitualmente al menos aproximadamente 20 restos, más habitualmente al menos aproximadamente 24 restos, normalmente al menos aproximadamente 28 restos y preferentemente más de aproximadamente 35 restos. Cuando se busca en una base de datos que contiene secuencias de un gran número de organismos diferentes, es preferible comparar secuencias de aminoácidos. La búsqueda en base de datos usando secuencias de aminoácidos puede medirse por algoritmos distintos de blastp conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias polipeptídicas pueden compararse usando FASTA, un programe en GCG Versión 6.1. FASTA proporciona alineamientos y el porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda. Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990).

Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de aminoácidos puede determinarse usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 2 y la matriz de puntuación PAM250), como se proporciona en GCG Versión 6.1.

El término “región” como se usa en el presente documento se refiere a una parte físicamente contigua de la estructura primaria de una biomolécula. En el caso de proteínas, una región se define por una parte contigua de la secuencia de aminoácidos de esa proteína.

El término “dominio” como se usa en el presente documento se refiere a una estructura de una biomolécula que contribuye a una función conocida o sospechada de la biomolécula. Los dominios pueden ser coextensivos con regiones o partes de los mismos; los dominios también pueden incluir regiones distintas, no contiguas de una biomolécula. Los ejemplos de dominios proteicos incluyen, pero sin limitación, un dominio Ig, un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático.

Como se usa en el presente documento, el término “molécula” significa cualquier compuesto, incluyendo, pero sin limitación, una molécula pequeña, péptido, proteína, azúcar, nucleótido, ácido nucleico, lípido, etc., y dicho compuesto puede ser natural o sintético.

El término “eliminación” como se usa con respecto a manosilfosforilación se refiere a niveles de detección de glucanos manosafosforilados que no indican restos de manosilfosfato detectables aparentes usando HPLC con el ajuste indicado.

A no ser que se defina de otro modo, todas las expresiones técnicas y científicas usadas en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Se describen posteriormente métodos y materiales ejemplares.

En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo definiciones, prevalecerá. Los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

Métodos para producir una cepa hospedadora fúngica que carece de manosilfosforilación en glucoproteínas

La presente divulgación proporciona métodos para eliminar la transferencia de manosilfosfato en glucanos de glucoproteínas en levadura o células hospedadoras fúngicas filamentosas que normalmente producen glucoproteínas que tienen manosilfosforilación. En una realización, la levadura o célula hospedadora fúngica filamentosa que normalmente produce glucoproteínas que tienen manosilfosforilación se modifica por ingeniería genética de modo que esté esencialmente sin manosilfosforilación en glucanos de glucoproteínas. En otra realización, los hospedadores fúngicos se modifican genéticamente para tener alterado, atenuado o mutado al menos un gen que codifica una proteína que participa en la manosilfosfato transferasa. Preferentemente, el método implica disrupción, atenuación o mutación de uno o más genes seleccionados de MNN4A, MNN4B, MNN4C y PNO1.

Usando genes conocidos que codifican manosilfosfato transferasas, se aislaron nuevos genes que codificaban manosilfosfato transferasa en P. pastoris. La secuencia génica de MNN4 de S. cerevisiae (referencia de Genbank Nº P36044) se sometió a blast frente al genoma de P. pastoris (Integrated Genomics, Chicago, IL). Esta búsqueda dio como resultado la identificación de tres ORF previamente desconocidas además del gen PNO1. Las tres ORF se designaron MNN4A (SEC ID Nº: 1), MNN4B (SEC ID Nº: 3)y MNN4C (SEC ID Nº: 5). Estas ORF se amplificaron y posteriormente se secuenciaron y se muestran respectivamente en las Figuras 1-3 (Ejemplo 1). Las secuencias de aminoácidos codificadas para MNN4A (SEC ID Nº: 2), MNN4B (SEC ID Nº: 4), MNN4C (SEC ID Nº: 6) también se exponen en las Figuras 1-3.

Secuencias de ácido nucleico

En un aspecto, la presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia que es una variante del gen MNN4 A de P. pastoris que tiene al menos 50 % de identidad con SEC ID Nº:1. La secuencia de ácido nucleico puede tener preferentemente al menos 65 %, 70 %, 75 % u 80 % de identidad con el gen de tipo silvestre. Aún más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico puede tener 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,9 % o aún mayor identidad con la SEC ID Nº: 1. La presente divulgación también proporciona un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia que es una variante del gen MNN4A de P. pastoris que tiene al menos 50 % de identidad con SEC ID Nº: 2. La secuencia de aminoácidos puede tener preferentemente al menos 65 %, 70 %, 75 % u 80 % de identidad con el gen de tipo silvestre. Aún más preferentemente, la secuencia de aminoácidos puede tener 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,9 % o aún mayor identidad con la SEC ID Nº: 2.

En relación con la presente invención, el gen MNN4B de P pastoris es particularmente útil en la eliminación de la transferencia de manosilfosfato en glucanos de glucoproteínas en una cepa de levadura. La presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia que es una variante del

gen MNN4 B de P. pastoris que tiene al menos 50 % de identidad con SEC ID Nº: 3. La secuencia de ácido nucleico puede tener preferentemente al menos 65 %, 70 %, 75 % u 80 % de identidad con el gen de tipo silvestre. Aún más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico puede tener 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,9 % o aún mayor identidad con la SEC ID Nº: 3. La presente divulgación también proporciona un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia que es una variante del gen MNN4B de P. pastoris que tiene al menos 50 % de identidad con SEC ID Nº: 4. La secuencia de aminoácidos puede tener preferentemente al menos 65 %, 70 %, 75 % u 80 % de identidad con el gen de tipo silvestre. Aún más preferentemente, la secuencia de aminoácidos puede tener 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,9 % o aún mayor identidad con la SEC ID Nº:4.

La presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia que es una variante del gen MNN4 C de P. pastoris que tiene al menos 50 % de identidad con SEC ID Nº: 5. La secuencia de ácido nucleico puede tener preferentemente al menos 65 %, 70 %, 75 % u 80 % de identidad con el gen de tipo silvestre. Aún más preferentemente, la secuencia de ácido nucleico puede tener 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,9 % o aún mayor identidad con la SEC ID Nº: 5. La presente divulgación también proporciona un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia que es una variante del gen MNN4C de P. pastoris que tiene al menos 50 % de identidad con SEC ID Nº: 6. La secuencia de aminoácidos puede tener preferentemente al menos 65 %, 70 %, 75 % u 80 % de identidad con el gen de tipo silvestre. Aún más preferentemente, la secuencia de aminoácidos puede tener 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,9 % o aún mayor identidad con la SEC ID Nº:6.

También se proporcionan vectores, incluyendo vectores de expresión y vectores de anulación que comprenden las moléculas de ácido nucleico anteriores. Un vector de anulación que comprende un MNN4A, MNN4B o MNN4C puede usarse para alterar el locus del gen MNN4A, MNN4B o MNN4C. Como alternativa, un vector de integración que comprende un marcador de resistencia a fármacos o un marcador auxotrófico se usa para alterar el locus del gen MNN4.

Combinación de anulaciones génicas de manosilfosforilación

Cada uno de los tres genes de P. pastoris de nueva identificación, MNN4A, MNN4B, MNN4C, se altera usando la estrategia de solapamiento de PCR como se muestra en la Figura 4 para determinar el efecto en la manosilfosforilación. Los mutantes individuales, Δmnn4A, Δmnn4B y Δmnn4C no mostraron una reducción significativa en la actividad de transferencia de manosilfosforilación en glucanos del dominio kringle 3 de la proteína plasminógeno humana (K3), mientras que el mutante ΔpnoI (YSH-49) presentó solamente una atenuación en la transferencia de manosilfosforilación reducida al 6 % (Figura 5C), pero no a los niveles descritos previamente en Miura et al. (documento WO 01/88143). Se ha postulado que diferentes glucoproteínas pueden presentar diversos grados y tipos de glucosilación en la misma célula hospedadora (Montesino et al, 1998, Prot. Expr. Purif. 14: 197207). En una realización de la presente invención, se construyeron combinaciones de mutantes nulos, uno de los cuales, los mutantes dobles Δpno Δmm4b en P. pastoris dio como resultado niveles indetectables de manosilfosforilación en glucanos de la proteína indicadora K3 (Figura 5D). De forma similar, otras glucoproteínas (por ejemplo, CD40 e invertasa) producidas a partir del mutante doble Δpnol Δmnn4b en P. pastoris también dieron como resultado falta de manosilfosforilación. El mutante doble, por lo tanto, produce diversas glucoproteínas de interés que no tienen manosilfosforilación en glucanos. En consecuencia, se proporciona un método para alterar una combinación de genes implicados en la transferencia de restos de manosilfosfato en glucanos de glucoproteínas en un hospedador (por ejemplo, Pichia sp.). Preferentemente, la combinación incluye la disrupción de MNN4B y PNO1.

En caso de que la disrupción del locus de MNN4B de P. pastoris solamente no confiera eliminación de manosilfosforilación en glucanos, se altera una combinación de genes de manosilfosforilación. La disrupción del locus MNN4B puede ser en combinación con al menos un segundo gen implicado en la transferencia de manosilfosfato, tal como MNN4A, MNN4B, MNN4C o PNO1. De acuerdo con la presente invención, el segundo gen es el gen PNO1 de P. pastoris (referencia de Genbank Nº BD105434). Se contempla que un experto en la materia puede alterar o mutar cualquier gen implicado en la síntesis de oligosacáridos o un fragmento del mismo en combinación con un MNN4B alterado o mutado, que daría como resultado la eliminación de la transferencia de manosilfosfato a glucanos en otros hospedadores fúngicos.

En otra realización, el método posibilita la disrupción de un gen que codifica MNN4B (SEC ID Nº: 3) en un hospedador (por ejemplo, P. pastoris) que ya tiene actividad manosilfosfato transferasa atenuada. Adicionalmente, se contempla que la eliminación de la transferencia de manosilfosfato a glucanos en otras especies de Pichia implica la disrupción o mutación de cualquier combinación de genes que tengan homología con MNN4A, MNN4B, MNN4C o PNO1.

En otro aspecto más de la invención cada uno de los tres genes de P. pastoris de nueva identificación, MNN4A, MNN4B, MNN4C, se alteró usando una estrategia de supresión de fusión como se describe en el Ejemplo 3 para determinar si cualquier combinación de anulaciones de genes tiene un efecto en la manosilfosforilación de glucoproteínas expresadas en esta cepa mutante. Los mutantes Δmnn4A, Δmnn4B y Δmnn4C individuales como con la estrategia de anulación de solapamiento de PCR (Figura 4) no mostraron una reducción de la actividad de transferencia de manosilfosforilación en glucanos del dominio kringle 3 de proteína de plasminógeno humano (K3)

(datos no mostrados). Sin embargo, la proteína indicadora K3 expresada en un mutante nulo doble Δpnol Δmnn4b (YAS174) está esencialmente sin ninguna manosilfosforilación (Figura 6C, compárese con Figura 6A, B). Obsérvese la ausencia de glucanos manosilfosforilados entre 20 y 30 minutos.

Sistema de expresión de glucoproteínas heterólogas

Usando técnicas establecidas para expresar glucoproteínas heterólogas en levadura y hongos filamentosos, se expresa un gen que codifica una glucoproteína terapéutica. Un sistema de expresión de proteínas recombinantes fúngico puede incluir normalmente promotores tales como AOXI, AOX2, u otros promotores inducibles, terminadores de la transcripción tales como CYC, marcadores seleccionables tales como URA3, URA5, G418, ADE1, ARG4, HIS4, Zeocina y señales de secreción tales como αMF de S. cerevisiae. En una realización, este sistema de expresión se modifica para ser al menos un mutante de mnn4B. De acuerdo con la invención, las glucoproteínas se producen en P. pastoris que tiene una disrupción, deleción o mutación combinada de los genes de MNN4B y PNO1 como se define en las reivindicaciones. Pueden producirse glucoproteínas de interés por cualquier medio mediante el uso de los métodos desvelados en el presente documento. Puede proporcionarse producción de glucoproteínas por cualquier medio en una célula hospedadora, incluyendo acumulación en un compartimento intracelular o secreción de la célula a un sobrenadante de cultivo. Las células hospedadoras de la presente invención pueden propagarse o cultivarse por cualquier método conocido o contemplado en la técnica, incluyendo pero sin limitación tubos de cultivo, matraces, frascos rotatorios, matraces de agitación o fermentadores. Puede realizarse aislamiento y/o purificación de los productos de glucoproteínas por cualquier medio conocido o contemplado en la técnica tal como fraccionamiento, intercambio iónico, filtración en gel, cromatografía hidrófoba y cromatografía de afinidad. Se desvela un ejemplo de la producción y purificación del glucoproteínas en el Ejemplo 7.

Las glucoproteínas expresadas sin glucanos manosilfosforilados usando los métodos descritos en el presente documento pueden incluir pero sin limitación: eritropoyetina, citocinas tales como interferón α, interferón β, interferón γ, interferón ω, TNF-α, CSF de granulocitos, GM-CSF, interleucinas tales como IL-1α, factores de coagulación tales como factor VIII, factor IX, proteína C humana, antitrombina III y anticuerpos de trombopoyetina; IgG, IgA, IgD, IgE, IgM y fragmentos de los mismos, regiones Fc y Fab, cadena a del receptor de IgE soluble, uroquinasa, quimasa e inhibidor de tripsina de urea, proteína de unión a IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de hormonas del crecimiento, FSH, proteína de fusión de anexina V, angiostatina, factor de crecimiento endotelial vascular 2, factor inhibidor progenitor mieloide 1, osteoprotegerina, antitripsina α 1, DNasa II, α-feto proteínas y glucocerebrosidasa.

Producción de glucoproteínas complejas sin manosilfosforilación

En otro aspecto de la invención, la presente divulgación proporciona métodos para producir glucanos ligados a N complejos en hongos y levadura (por ejemplo, P. pastoris) que comprende eliminar la transferencia de manosilfosfato a glucanos en glucoproteínas. Dicho método proporciona una composición de glucoproteína que está esencialmente sin restos manosilfosfato en glucoproteínas. La célula hospedadora de la invención proporciona menos del 1 % de glucoproteínas manosilfosforiladas de N-glucanos totales. En una realización más preferida, la invención proporciona menos del 0,5 % de glucoproteínas manosilfosforiladas de N-glucanos totales.

En otro aspecto de la presente invención, las composiciones de glucoproteína están esencialmente sin restos de manosilfosfato en N-glucanos complejos. El método para producir dichos glucanos implica alterar los genes PNO1 y MNN4B en una cepa hospedadora que expresa N-glucanos complejos (por ejemplo, P. pastoris YSH-44 que expresa la proteína indicadora K3) (Hamilton et al., 2003, Science, 301: 1244-124). La cepa modificada por ingeniería genética que comprende alteraciones de pno1 mnn4B, designada YAS-130, carece de restos de manosilfosfato en glucanos de glucoproteínas (Ejemplo 5). Aunque una disrupción genética del gen PNO1 en YSH44 (designada YSH-49) reduce el % molar de glucanos que muestra manosilfosforilación (fracción ácida), aún permanecen restos de manosilfosfato (Figura 5C). El tratamiento de los glucanos de YSH-44 con hidrólisis ácida suave seguida de alcalina fosfatasa demuestra que la fracción ácida está comprendida por aproximadamente 5-15 % de glucanos totales. Esta cepa YSH-49 muestra una fracción ácida de aproximadamente el 6 %, que se compara favorablemente con la fracción ácida de aproximadamente el 9 % de la YSH-44 (Figura 5B).

Por el contrario, la Figura 5D muestra la eliminación de la transferencia de manosilfosfato a glucanos en P. pastoris YAS-130 (Δpno1 Δmnn4B) en comparación con la Figura 5A de control (H2O), Figura 5B YSH-44 con aproximadamente 9 % de manosilfosforilación, y Figura 5C YSH-49 (Δpnol) con aproximadamente 6 % de manosilfosforilación. En el presente documento se describe por primera vez una cepa de levadura modificada por ingeniería genética para estar esencialmente sin glucanos manosilfosforilados.

Glucoproteínas terapéuticas producidas en levadura (P. pastoris)

Diferentes glucoproteínas pueden presentar diversos grados y tipos de glucosilación en la misma célula hospedadora (Montesino et al, 1998). La presente invención proporciona métodos para producir diversas glucoproteínas en una cepa de levadura de P. pastoris recombinante que esencialmente carece de

manosilfosforilación. En consecuencia, el método implica modificar por ingeniería genética la expresión de una glucoproteína heteróloga en P. pastoris Δpno1 Δmnn4B. Como tal, la presente invención demuestra la eliminación de manosilfosforilación de glucanos en diversas glucoproteínas terapéuticas (Figura 7A-E, Figura 8).

Aunque la proteína indicadora K3 contiene un único sitio de glucosilación ligado a N, la proteína indicadora Hiseritropoyetina (EPO) desvelada en el presente documento contiene tres sitios de glucosilación ligados a N, la proteína indicadora His-CD40 desvelada en el presente documento contiene dos sitios de glucosilación y la proteína His-invertasa desvelada en el presente documento contiene hasta 24 sitios de glucosilación. La eritropoyetina marcada con His (His-EPO) se expresa a partir de una cepa de P. pastoris que expresa manosilfosforilación en la Figura 7B y una cepa de P. pastoris Δpnol Δmnn4B que carece de manosilfosforilación en la Figura 7C. Se expresa CD40 marcada con His (His-CD40) de la cepa de P. pastoris que expresa manosilfosforilación en la Figura 7D y cepa de P. pastoris Δpnol Δmnn4b que carece de manosilfosforilación en la Figura 7E. Se expresa invertasa marcada con His de la cepa de P. pastoris que carece de manosilfosforilación en la Figura 8. La construcción de cepas para cada una de estas glucoproteínas se desvela en el Ejemplo 6.

Identificación de homólogos de MNN4

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para identificar los homólogos de un gen MNN4 en cualquier levadura preferentemente en Pichia sp. u hongos filamentosos. Un experto en la materia puede realizar una búsqueda de base de datos BLAST usando la secuencia de aminoácidos de MNN4A, MNN4B, MNN4C

o PNO1 (referencia de Genbank Nº BD105434) frente al genoma de cualquier levadura, preferentemente Pichia y obtener los homólogos de cualquiera de estos genes. Con la identificación de los homólogos de MNN4/PNO1 en levadura Pichia, un experto en la materia puede alterar o mutar posteriormente cualquier combinación de estos genes homólogos. Se muestra un alineamiento en la Figura 9 de los homólogos de MNN4/PNO1 en P. pastoris, S. cerevisiae, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, Candida albicans y Pichia angusta (Hansenula polymorpha). Tras explorar con respecto a la presencia de glucanos manosilfosforilados en proteínas expresadas de la cepa de Pichia (Ejemplo 7), un experto en la materia puede determinar el gen o la combinación de genes, que tras la disrupción confieren la expresión de glucoproteínas del hospedador de Pichia que están esencialmente sin manosilfosforilación.

Los genes alterados o genes que codifican proteínas que participan en la transferencia de manosilfosfato a glucanos de glucoproteínas son preferentemente de una cepa de levadura que pertenece al género Pichia. Las levaduras que pertenecen al género Pichia de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin limitación: Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichi salictaria, Pichia guercum, Pichia pijperi, Pichia stiptis,y Pichia angusta (Hansenula pylymorpha). Pichia pastoris se usa preferentemente entre estos. Otras levaduras y hongos filamentosos incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces sp. Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Candida sp., Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

Los siguientes son ejemplos que ilustran las composiciones y métodos de la presente invención. Estos ejemplos no deberían interpretarse como limitantes, los ejemplos se incluyen solamente para fines de ilustración.

Ejemplo 1

Identificación y secuenciación de MNN4A, MNN4B, MNN4C en P. pastoris (Figuras 1-3)

La secuencia proteica de MNN4 de Saccharomyces cerevisiae (referencia de Genbank Nº P36044) se sometió a blast frente a una secuencia genómica de Pichia pastoris (Integrated Genomics, Chicago, IL) para fases abiertas de lectura que codifican proteínas con homología. Esta búsqueda identificó tres ORF con regiones de homología con MNN4p. Estas ORF se designaron MNN4A, MNN4B y MNN4C. Cada uno de estos tres genes se secuenció posteriormente. Se descubrió que el gen MNN4A contenía una fase abierta de lectura que contenía 2580 bases de nucleótidos que codificaban 860 aminoácidos (Figura 1). Se descubrió que el gen MNN4B contenía una fase abierta de lectura que contenía 1956 bases de nucleótidos que codificaban 652 aminoácidos (Figura 2) y se descubrió que el gen MNN4C contenía una fase abierta de lectura que contenía 2289 bases de nucleótidos que codificaban 763 aminoácidos (Figura 3).

Ejemplo 2

Construcción de las cepas de P. pastoris: YSH-44 y YSH-1

P. pastoris YSH-44 e YSH-1 se obtuvieron por ingeniería genética a partir de BK64-1, un mutante de deleción de Δochl que secretaba K3, una proteína indicadora con un único sitio de glucosilación ligado a N (Choi et al., 2003, PNAS, 100: 5022-5027; Hamilton et al., 2003, Science, 301: 1244-1246). YSH-1 expresa glucoproteínas que tienen predominantemente N-glucanos GlcNAcMan5GlcNAc2 e YSH-44 expresa glucoproteína que tiene

predominantemente N-glucanos GlcNAc2Man3 GlcNAc2.

Deleción del gen PNO1 para la cepa YSH-44

El alelo de deleción de pnol (pnoI::HygR) en YSH-44 se generó por el método de solapamiento de PCR (Davidson et al., 1999, Microbiol. 148: 2607-2615). Los cebadores PNK1 (5’-CATAGCCCACTGCTAAGCC-AGAATTCTAATATG3’) (SEC ID Nº:7) emparejado con PNK2 (5’-GCAGCGTACGAAGCTTCAGCTAGAATTGTAAAGTGAATTATCAAG-TCT TTC-3’) (SEC ID Nº: 8), PNK3 (5’-CAGATCCACTAGTGGCCTATGCAACAA-TATAGCACCTCTCAAATACAC GTTG-3’) (SEC ID Nº:9) emparejado con PNK4 (5’-TCITGAAGTAGATTTGGAGA-TTTTGCGCTATG-3’) (SEC ID Nº: 10) se usaron para amplificar las regiones flanqueantes 5’ y 3’ del gen PNO1 del ADN genómico (NRRL-Y11430). Los cebadores KAN1 (5’-AGCTGAAGCT-TCGTACGCTGC-3’) (SEC ID Nº: 11) emparejado con KAN2 (5’-GCATAGGCCACTAGTGGATCTG-3’) (SEC ID Nº: 12) se usaron para amplificar el marcador de resistencia a Hyg del vector pAG32 (Goldstein y McCusker, 1999, Yeast 14: 1541-1553). Después se usaron los cebadores PNK1 y PNK4 en una segunda reacción con los tres productos del primer ciclo de reacciones de PCR para generar un producto de solapamiento. El producto de PCR de fusión resultante se usó para transformar la cepa YSH-44, una cepa de P. pastoris obtenida por ingeniería genética que expresa predominantemente GlcNAc2Man3GlcNAc2. Los transformantes se seleccionaron en medio YPD (extracto de levadura 1 %, peptona 2 %, dextrosa 2 %) que contenía higromicina B 200 mg/ml. La integración apropiada del alelo de deleción pnoI::HygR se confirmó por PCR. Esta cepa Δpno1 se designó YSH-49.

Ejemplo 3

Estrategia de anulación de PNO1/MNN4B en la cepa de P. pastoris YSH-49 (Figura 4)

Se consiguió una cepa de doble mutante YAS-130 (Δpno1 Δmnn4b) por solapamiento de PCR en YSH-49. Se usaron los cebadores TAS54 (TTCAACGAGTGACCAATGTAGA) (SEC ID Nº: 13) y TAS51 (CCAT-CCAGTGTCGAAAACGAGCTGGCGAACTTITCTGGGTCGAAG) (SEC ID Nº: 14) para amplificar el fragmento de ADN de 521 pb 5’ del codón de partida predicho de ADN genómico de Pichia pastoris (NRRL-Y 11430). TAS51 contiene un saliente de 22 pb que es complementario del extremo 5’ de un marcador de resistencia a fármacos. TAS49 (TGAAGACGTCCCCTTTGAACA) (SEC ID Nº: 15) y TAS52 (ACGAGGCAAGCTAAACAGATCTAGTTGTTTTTTCTAT ATAAAAC) (SEC ID Nº: 16) se usaron para amplificar el fragmento de ADN de 503 pb 3’ del codón de parada predicho. TAS52 también contiene un saliente de 22 pb que es complementario del extremo 3’ del marcador de resistencia a fármacos. La PCR del marcador de resistencia a fármacos usó pAG29 (contiene el ORF de pat) como la fuente de ADN (Goldstein y McCuster, 1999). El marcador de resistencia a fármacos se amplificó usando los cebadores TAS53 (CTTCGACCCAGAAAAGTTCGCCAGCTCG-TTTTCGACACTGGATGG) (SEC ID Nº: 17) y TAS50 (GTTTTATATAG-AAAAAACAACTAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGT) (SEC ID Nº: 14). TAS53 tiene un saliente de 22 pb que es complementario de los 22 pb 5’ del codón de inicio de MNN4B predicho. TAS50 tiene un saliente de 22 pb que es complementario de los 22 pb 3’ del codón de parada de MNN4B predicho. El fragmento de MNN4B 5’, fragmento de MNN4B 3’ y el gen que confiere resistencia a un marcador seleccionable se combinaron en una relación equimolar y se usaron como un ADN molde con los cebadores TAS54 y TAS49 para la reacción de solapamiento de PCR.

Estrategia de anulación de PNO1/MNN4B en la cepa de P. pastoris YSH-1

YSH-1 se transformó por electroporación con pJN503b digerido con SfiI(Δmnn4A Δpno1::URA3) para producir la cepa Δoch1 Δmnn4A Δpno1 YAS159. El marcador seleccionable de URA3 se recuperó en esta cepa por contraselección con 5-FOA. La cepa resultante, YAS164 (Δoch1 Δmm4A Δpnol; ura3;his4;ade1;arg4), se transformó con pAS16 digerido con SfiI(Δ mnn4B::URA3) dando lugar a la cepa Δoch1 Δmnn4A Δpno1 Δmnn4B YAS170. La cepa YAS170 se contraseleccionó posteriormente en 5-FOA para producir la cepa YAS174 (Δoch1 Δmnn4A Δpno1 Δmnn4B;ura3;his4;ade1;arg4). YAS174 representa por lo tanto una cepa de Pichia pastoris que es deficiente en la formación de cadena externa de manosa y desprovista de manosilfosfato en glucanos ligados a N.

Ejemplo 4

Amplificación por PCR

Se usó un Mastercycler de Eppendorf para todas las reacciones de PCR. Las reacciones de PCR contenían ADN molde, dNTP 125 mM, 0,2 mM de cada uno de los cebadores directo e inverso, tampón de Taq polimerasa Ex (Takara Bio Inc.) y Taq polimerasa Ex. Los fragmentos de ADN 5’ de la ORF de MNN4B predicha, 3’ de la ORF de MNN4B predicha, y el marcador de resistencia a fármacos se amplificaron con 30 ciclos de 15 segundos a 97 ºC, 15 segundos a 55 ºC y 90 segundos a 72 ºC con una etapa de desnaturalización inicial de 2 minutos a 97 ºC y una etapa de extensión final de 7 minutos a 72 ºC. Se separaron las muestras de PCR por electroforesis en gel de agarosa y las bandas de ADN se extrajeron y se purificaron usando un Kit de Extracción en Gel de Qiagen. Todas la purificaciones de ADN se eluyeron en Tris 10 mM, pH 8,0 excepto por la PCR final (solapamiento de los tres fragmentos) que se eluyeron en H2O desionizada.

Ejemplo 5

Transformaciones de ADN, condiciones de cultivo para producción de glucanos complejos en P. pastoris para análisis de manosilfosforilación

Se preparó ADN para transformación añadiendo acetato de sodio a una concentración final de 0,3 M. Se añadió después etanol helado cien por cien a una concentración final de 70 % a la muestra de ADN. El ADN se sedimentó por centrifugación (12000 g x 10 min) y se lavó dos veces con etanol helado al 70 %. El ADN se secó y después se resuspendió en 50 ml de Tris 10 mM, pH 8,0. Se prepararon YSH-49 e YAS-130 expandiendo un cultivo de levadura en BMGY (glicerol mínimo tamponado: fosfato potásico 100 mM, pH 6,0; base nitrogenada de levadura 1,34 %; biotina 4 x 10-5 %; glicerol 1 %) a una D.O. de ∼2-6. La levadura se hizo electrocompetente lavando 3 veces en sorbitol 1 M y resuspendiendo en ∼1-2 ml de sorbitol 1 M. Se mezcló ADN (1-2 mg) con 100 ml de levadura competente y se incubó en hielo durante 10 minutos. La levadura se sometió después a electroporación con un BTX Electrocell Manipulator 600 usando los siguientes parámetros; 1,5 kV, 129 ohmios y 25 mF. Se añadió un mililitro de YPDS (extracto de levadura 1 %, peptona 2 %, dextrosa 2 %, sorbitol 1 M) a las células sometidas a electroporación. La levadura transformada se sembró posteriormente en placas de agar selectivo. Las células transformadas con construcciones de anulación que contenían el gen de resistencia hph se extendieron en placas de agar YPD Y+ (extracto de levadura 1 %, peptona 2 %, dextrosa 2 %, base nitrogenada de levadura sin aminoácidos 1,34 %) que contenían higromicina B 0,4 mg/ml. Las células transformadas con construcciones de anulación que contenían el gen de resistencia pat se extendieron en placas de agar con medio definido (base nitrogenada de levadura sin aminoácidos y NH4SO4 1,34 %, dextrosa 2 %, L-prolina 0,1 %, biotina 4 x 10-5 %) que contenían glufosinato 0,6 mg/ml. Las colonias se pasaron en manchas a otra placa que contenía la misma selección farmacológica. El ADN se aisló de estas manchas y se analizó por PCR con respecto al reemplazo de la ORF de MNN4B de tipo silvestre con el marcador de resistencia a fármacos.

Se realizó exploración para anulaciones por amplificación por PCR (Ejemplo 4) de las partes tanto 5’ como 3’ de la construcción de anulación. Se usaron los cebadores TAS81 (TAGTCCAAGTACGA-AACGACACTATCG) (SEC ID Nº: 19) y TAS08 (AGGTGCGCACGTCAAGAC-TGTCAAGG) (SEC ID Nº: 20) para explorar la parte 5’ de la construcción de anulación mientras que se usaron los cebadores TAS82 (ACGACGGTGAGTTCAAACAGTTTGGTT) (SEC ID Nº: 21) y TAS07 (TCGCTATACTGCTGTCGATTCGATAC) (SEC ID Nº: 22) para explorar la parte 3’ de la construcción de anulación. La observación de un producto de PCR en ambas exploraciones es indicativa de una anulación exitosa de la ORF MNN4B ya que los cebadores TAS08 y TAS07 se hibridan en los extremos 5’ y 3’ de la secuencia del marcador de resistencia a fármacos, respectivamente y TAS81 y TAS82 son complementarios de secuencias en el genoma que flanquea las regiones 5’ y 3’ de ADN usado en la construcción de anulación. Se exploraron noventa y seis transformantes dando cuatro resultados positivos como una anulación de MNN4B. Las cuatro cepas Δpno1 Δmnn4b expresaron la proteína indicadora K3 sin niveles detectables de manosilfosfato. Se muestra un ejemplo de esto en la Figura 5D.

Ejemplo 6

Construcción de cepas para proteínas EPO, CD40 e invertasa marcadas con His Figuras 7.8

Para eritropoyetina marcada con His (EPO), se amplificaron los primeros 166 aminoácidos de EPO de una biblioteca de ADNc de riñón humano (Clontech) e insertaron en el plásmido pPICZA 6 His C terminal (Invitrogen) en los sitios EcoRI y Kpnl. Este plásmido (pBK291) se transformó en dos cepas de P. pastoris, dando como resultado la siguientes cepas que expresan EPO-6His: BK248 (ura3, his4, ade1, arg4, Δoch1::URA3) y BK244 [YSH44 transformado con pBK116 y pBK284 que tiene las anulaciones pnolmnn4b (pno1::Hyg R)(mnn4b::KanR) como se describe y se muestra en el Ejemplo 2, Figura 4. pBK116 resulta de un fragmento de ADN 3’UTR de AOX1 de 1551 pb aislado de NRRL11430 (ATCC) insertado en el plásmido de Invitrogen pPIC6A en el sitio AfIIII y un fragmento de ADN 5’UTR de AOX1 de 1952 pb aislado de NRRL11430 insertado en el mismo plásmido pPIC6A en los sitios BglII y BamHI con la retirada del fragmento de ADN PmeI/BamHI de 573 pb. Este pBK116 se digirió después con NotI y los fragmentos de NotI resultantes se transformaron en YSH44 para anular la proteína K3 indicadora. pBK284 resulta de un fragmento de ADN de 3196 pb que incluye el promotor de AOX1, ORF de AOX1 y secuencia de terminación de AOX1 aislada de NRRL11430 (ATCC) y clonada en el sitio de clonación múltiple del plásmido de Invitrogen pCR2.1-TOPO. Este plásmido se digirió después con MscI y BssHI para suprimir el gen de kanamicina. Esto dio como resultado pBK284 que se digirió con PmeI antes de la transformación en la cepa YSH44 transformada con pBK116 para integración en el locus del promotor de AOXI. Se muestra el análisis de glucanos de HPLC de EPO-6His en BK248 y BK244 en la Figura 7B, C. Para CD40 marcado con His, el ADN de CD40 humano se amplificó por PCR de phCD40/GemT (Pullen et al., 1999, JBC, 274: 14246-14254) usando un cebador de EcoRI 5’ y un cebador de His10-KpnI 3’ para clonar en pPICZ aA dando como resultado pJC33. pJC33 se expresó en la cepa de P. pastoris YJC12 (ura3, his4, adel, arg4)e YAS252-2 (YAS-130 transformada con pBK116, pBK284 y pRCD465 (USSN 60/562424) que contiene galactosiltransferasa) dando como resultado YAS252. Se muestra el análisis de glucanos de HPLC de CD49-6His en YJC12 e YAS252 en la Figura 7D, E. Para invertasa marcada con His, se amplificó la secuencia de invertasa de longitud completa por PCR de ADN genómico de Kluyveromyces lactis, cepa CBS683, obtenida de Centraalbureau voor Schimmelcultures. La ORF de invertasa se amplificó usando cebadores 5’ y 3’ de extremos romos para inserción en el plásmido pPICZA (proporcionando el marcador 6His C terminal) en el

sitio PmlI. Este pPB147 se transformó en la cepa de P. pastoris YAS245-2 (YAS130 transformada con pBK116, pBK284 y pRCD465 (USSN 60/562424) que da como resultado YAS253). Se muestra el análisis de glucanos de HPLC de invertasa-6His en YAS253 en la Figura 8.

5 Ejemplo 7

Determinación de manosilfosforilación en P. pastoris

El alcance de la transferencia de manosilfosfato a glucanos ligados a N en las cepas mostradas en las Figuras 5-8

10 se determinó secretando una proteína indicadora marcada con His (proteína kringle 3 en las Figuras 5,6; proteína eritropoyetina y proteína CD40 en la Figura 7 y proteína invertasa en la Figura 8) expresada bajo el control del promotor de AOX1 inducible por metanol. Brevemente, se inoculó un matraz de agitación que contenía BMGY con un cultivo de levadura nuevo (por ejemplo, YAS-130) y se cultivó hasta una D.O. de ∼20. El cultivo se centrifugó y el sedimento celular se lavó con BMMY (metanol mínimo tamponado: igual que BMGY excepto metanol 0,5 % en lugar

15 de glicerol 1 %). El sedimento celular se resuspendió en BMMY hasta un volumen 1/5 del cultivo de BMGY original y se colocó en un agitador durante 24 h. La proteína secretada se recogió por sedimentación de la biomasa por centrifugación y transfiriendo el medio de cultivo a un tubo nuevo. Las proteínas K3, EPO, CD40 e invertasa marcadas con His se purificaron después en una columna de afinidad de Ni y se digirieron con PNGasa (Choi et al., 2003). Se separó el glucano de la proteína y después se marcó con 2-amino-benzamida (2-AB). El glucano marcado

20 con 2-AB se liofilizó, se resuspendió en agua de uso para HPLC y se sometió a HPLC usando una columna GlycoSep C (Glyco, Novato, CA). Este análisis permite la separación de glucanos neutros y ácidos. Se determinó que estos glucanos estaban fosforilados a partir de experimentos con hidrólisis ácida suave que retira el grupo de manosa terminal, exponiendo el fosfato. Con tratamiento de fosfatasa alcalina posterior, el grupo de fosfato terminal puede escindirse, dejando un glucano neutro. Experimentos posteriores mostraron que los glucanos ligados a N

25 fosforilados (glucanos ácidos) en todas las cepas migraban entre 20 y 30 minutos. Las condiciones de línea basal se evaluaron usando dH2O como un blanco. El porcentaje de fosforilación se calculó dividiendo las áreas de picos ácidos por la suma de los picos neutros y ácidos. Este análisis de HPLC se realizó en las condiciones posteriores.

Análisis de HPLC

30 Las condiciones de HPLC son la siguientes: disolvente A (acetonitrilo), disolvente B (acetato de amonio 500 mM, 500 mM, pH 4,5) y disolvente C (agua). El caudal fue de 0.4 ml/minuto durante 50 minutos. Después de eluir de forma isocrática (A 20 %:C 80 %) durante 10 min se empleó un gradiente de disolvente lineal (A 20 %:B 0 %:C 80 % a A 20 %:B 50 %:C 30 %) durante 30 minutos para eluir los glucanos. La columna se equilibró con el disolvente (A

35 20 %:C 80 %) durante 20 min entre ciclos.

Texto de la lista de secuencias

SEC ID Nº:1 MNN4A (Figura 1)

40 SEC ID Nº:2 MNN4A AA (Figura 1) SEC ID Nº:3 MNN4B (Figura 2) SEC ID Nº:4 MNN4B AA (Figura 2) SEC ID Nº:5 MNN4C (Figura 3) SEC ID Nº:6 MNN4C AA (Figura 3)

45 SEC ID Nº:7 PNK1: CATAGCCCACTGCTAAGCCAGAATTCTAATATG

SEC ID Nº: 10 PNK4: TCTTGAAGTAGATTTGGAGATTTTGCGCTATG SEC ID Nº: 11 KAN1: AGCTGAAGCTTCGTACGCTGC SEC ID Nº: 12 KAN2: GCATAGGCCACTAGTGGATCTG SEC ID Nº: 13 TAS54: TTCAACGAGTGACCAATGTAGA

SEC ID Nº: 15 TAS49: TGAAGACGTCCCCTTTGAACA

SEC ID Nº: 19 TAS81: TAGTCCAAGTACGAAACGACACTATCG SEC ID Nº: 20 TAS08: AGCTGCGCACGTCAAGACTGTCAAGG 5 SEC ID Nº: 21 TAS82: ACGACGGTGAGTTCAAACAGTTTGGTT SEC ID Nº: 22 TAS07: TCGCTATACTGCTGTCGATTCGATAC

LISTADO DE SECUENCIAS

10 <110> GlycoFi. Inc. Terrance Stadheim Piotr, Bobrowicz Wildt, Stefan

15 <120> Métodos para eliminar la manosilfosforilación de glucanos en la producción de glucoproteínas

<130> GFI-10

<160> 29 20

<170> Patentin versión 3.3

<210> 1

<211> 2583 25 <212> ADN

<213> Pichia pastoris

<400> 1

<210> 2

<211> 860

<212> PRT

<213> Pichia pastoris

<400> 2

<210> 3

<211> 1959

<212> ADN

<213> Pichia pastoris

<400> 3

<210> 4

<211> 652

<212> PRT

<213> Pichia pastoris

<400> 4

<210> 5

<211> 2292

<212> ADN

<213> Pichia pastoris

<400> 5

<210> 6

<211> 763

<212> PRT

<213> Pichia pastoris

<400> 6

5

<210> 7 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico degradado

10

<400> 7 catagcccac tgctaagcca gaattctaat atg 33

15

<210> 8 <211> 51 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico degradado

5

<400> 8 gcagcgtacg aagcttcagc tagaattgta aagtgaatta tcaagtcttt c 51

10

<210> 9 <211> 52 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico degradado

15

<400> 9 cagatccact agtggcctat gcaacaatat agcacctctc aaatacacgt tg 52

20

<210> 10 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial

25

<220> <223> Cebador oligonucleotídico degradado <400> 10 tcttgaagta gatttggaga ttttgcgcta tg 32

30

<210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

35

<220> <223> Cebador oligonucleotídico degradado

<400> 11 agctgaagct tcgtacgctg c

21

40

<210> 12 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

45

<220> <223> Cebador oligonucleotídico degradado

50 55

<400> 12 gcataggcca ctagtggatc tg 22 <210> 13 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico degradado

60

<400> 13 ttcaacgagt gaccaatgta ga 22

65

<210> 14 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico degradado

5

<400> 14 ccatccagtg tcgaaaacga gctggcgaac ttttctgggt cgaag 45

10

<210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico degradado

15

<400> 15 tgaagacgtc ccctttgaac a 21

20

<210> 16 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial

25

<220> <223> Cebador oligonucleotídico degradado <400> 16 acgaggcaag ctaaacagat ctagttgttt tttctatata aaac 44

30

<210> 17 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial

35

<220> <223> Cebador oligonucleotídico degradado

<400> 17 cttcgaccca gaaaagttcg ccagctcgtt ttcgacactg gatgg

45

40

<210> 18 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial

45

<220> <223> Cebador oligonucleotídico degradado

50 55

<400> 18 gttttatata gaaaaaacaa ctagatctgt ttagcttgcc tcgt <210> 19 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico degradado 44

60

<400> 19 tagtccaagt acgaaacgac actatcg 27

65

<210> 20 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico degradado

<400> 20 5 acgacggtga gttcaaacag tttggtt 27

<210> 21

<211> 26

<212> ADN 10 <213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico degradado

15 <400> 21 tcgctatact gctgtcgatt cgatac 26

<210> 22

<211> 777 20 <212> PRT

<213> Pichia pastoris

<400> 22

<210> 23

<211> 1178

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 23

<210> 24

<211> 346

<212> PRT

<213> Neurospora crassa

<400> 24

<210> 25

<211> 217

<212> PRT

<213> Neurospora crassa

<400> 25

<210> 26

<211> 311

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 26

<210> 27

<211> 261

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 27

<210> 28

<211> 997

<212> PRT

<213> Candida albicans

<400> 28

<210> 29

<211> 303

<212> PRT

<213> Fichia angusta

<400> 29

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un hospedador fúngico que comprende una disrupción, una deleción o una mutación combinadas de los genes MNN4B y PNO1 en donde el hospedador fúngico es Pichia pastoris y es capaz de producir menos del 1 % de

   5 glucoproteínas manosilfosforiladas de los N-glucanos totales en donde el gen de MNN4B en el que hay que provocar una disrupción, suprimir o mutar codifica un ARN mensajero que se corresponde con un ADNc que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en

   (a)

   SEC ID Nº: 3; 10 (b) una secuencia de ácido nucleico que es una variante degradada de SEC ID Nº: 3;

   (c) una secuencia de ácido nucleico al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 99,9 % idéntica a SEC ID Nº: 3;

   (d)

   una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC 15 IDNº:4;y

   (e) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 99,9 % idéntico a SEC ID Nº: 4.

   20 2. Un método para producir composiciones de glucoproteínas en un hospedador fúngico de la reivindicación 1 que comprende propagar dicho hospedador fúngico y aislar los productos de glucoproteínas.