KR20140091018A - 재조합 단백질 발현을 위한 조작된 하등 진핵 숙주 균주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이종 단백질을 발현하기 위한 신규 조작된 하등 진핵 숙주 세포 및 그러한 균주를 생성하는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 단백질 발현을 위한 조작된 하등 진핵 숙주 균주 {ENGINEERED LOWER EUKARYOTIC HOST STRAINS FOR RECOMBINANT PROTEIN EXPRESSION}

본 발명은 이종 단백질을 발현하기 위한 신규 조작된 하등 진핵 숙주 세포 및 그러한 균주를 생성하는 방법에 관한 것이다.

하등 진핵 숙주 세포는 이종 단백질을 생산하도록 조작될 수 있다. 또한, 하등 진핵 숙주 세포는 N- 또는 O-연결된 글리코실화가 그들의 천연 형태로부터 변형된 당단백질을 생산하도록 당-조작될 수 있다.

조작된 피키아 (Pichia) 균주는 인간-유사 글리코실화를 갖는 재조합 당단백질을 생산하기 위한 대체 숙주 시스템으로서 사용되었다. 그러나, 광범위한 유전자 변형은 또한 많은 당-조작된 효모 균주에서 세포벽 구조에 근본적인 변화를 일으켜, 일부 이들 균주를 발효 동안 세포 용해 및 세포 강건성 (robustness) 감소에 취약하도록 하였다. 특정 당-조작된 균주는 세포 생존성의 실질적인 감소 및 발효 브로쓰 내로 세포내 프로테아제 누출의 뚜렷한 증가를 가져서, 재조합 생성물 수율 및 품질 둘 모두의 감소를 일으킨다.

강건한 당-조작된 생산 균주를 확인하기 위한 현재의 전략은 대규모 (40L 이상) 발효 공정에 적합한 클론을 실험에 의해 확인하기 위해 다양한 플랫폼 (platform), 예컨대 96-딥 (deep)-웰 플레이트, 5 ml 미니 규모 발효기 및 1L-규모 생물반응기를 사용한 매우 많은 수의 클론 스크리닝에 의존한다 (문헌 [Barnard et al. 30 2010]). 1 g/L을 초과하는 수득량으로 재조합 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 몇몇 피키아 숙주를 확인하기 위해 고효율 (high-throughput) 스크리닝이 성공적으로 사용되었다는 사실에도 불구하고 (문헌 [Potgieter et al. 2009]; [Zhang et al. 2011]), 이들 대규모 스크리닝 방안은 매우 많은 자원을 필요로 하고, 시간이 많이 소요되며, 종종 세포-강건성이 증가한 클론만을 확인한다.

따라서, 개선된 강건성을 가지며 인간-유사 글리칸을 갖는 고품질 단백질을 생산하는 능력을 갖는 하등 진핵 숙주 균주는 가치가 있고, 관련 분야에서 관심을 받고 있다. 본원에서, 본 발명자들은 관련 생물공정 조건 하에서 개선된 생존성, 안정성, 및 단백질 생산을 보이는 신규한 유전자 ATT1 (내열성 획득)에 결실, 말단절단 또는 무의미 (nonsense) 돌연변이를 갖는 조작된 피키아 숙주 균주를 제시한다. 놀랍게도, 관련 생물공정 조건 하에 ATT1 또는 그의 단편을 과다발현하는 조작된 피키아 숙주 균주는 또한 개선된 생존성, 안정성, 및 단백질 생산을 보인다. 이들 균주는 이종 유전자 발현에 특히 유용하다.

본 발명은 ATT1 유전자의 활성을 감소시키거나 제거하도록 변형된, 조작된 하등 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. ATT1 유전자의 활성은 임의의 수단에 의해 감소될 수 있다. 한 실시양태에서, ATT1 유전자의 활성은 ATT1 유전자의 발현을 감소시키거나 제거함으로써 (예를 들어, 간섭 RNA 또는 안티센스 RNA를 사용함으로써) 감소하거나 제거된다. 또 다른 실시양태에서, ATT1 유전자의 활성은 ATT1 유전자 또는 그의 생성물을 돌연변이시킴으로써 감소하거나 제거된다. 또 다른 실시양태에서, ATT1 유전자의 활성은 ATT1 폴리펩티드를 분해함으로써 감소하거나 제거된다. 또 다른 실시양태에서, ATT1 유전자의 활성은 ATT1의 억제제, 예를 들어 소분자 억제제 또는 항체 억제제를 사용함으로써 감소하거나 제거된다. 본 발명은 전사, 번역, 또는 번역후 수단 (예를 들어, 억제가능 프로모터, 간섭 RNA, 안티센스 RNA, 유도성 단백질 분해 등의 사용)을 비롯하여 ATT1 유전자 또는 그의 단백질을 불활성화하는 임의의 수단을 포함한다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 당-조작된 하등 진핵 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 하등 진핵 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 진균 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 진균 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 효모 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 효모 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 피키아 종이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 피키아 종 숙주 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)이고, ATT1 유전자는 서열 7의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 다형체를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha)이고, ATT1 유전자는 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 다형체를 코딩한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 ATT1 유전자의 돌연변이된 형태를 발현하도록 변형된, 조작된 하등 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 돌연변이는 단일 뉴클레오티드 돌연변이, 하나 이상의 뉴클레오티드의 프레임-시프트 (frame-shift) 돌연변이, 삽입, 말단절단 또는 결실일 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 돌연변이는 전체 ATT1 유전자의 결실이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 돌연변이는 ATT1 유전자의 단편의 결실이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 당-조작된 하등 진핵 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 하등 진핵 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 진균 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 진균 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 효모 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 효모 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 피키아 종이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 피키아 종 숙주 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스이고, ATT1 유전자는 서열 7의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 다형체를 코딩한다. 실시양태에서, ATT1 유전자의 상기 돌연변이된 형태는 서열 7의 아미노산 32-995를 포함하는 단편의 결실이다. 한 실시양태에서, ATT1 유전자의 상기 돌연변이된 형태는 서열 7의 아미노산 165-995를 포함하는 단편의 결실이다. 또 다른 실시양태에서, ATT1 유전자의 상기 돌연변이된 형태는 서열 7의 아미노산 277-995를 포함하는 단편의 결실이다. 또 다른 실시양태에서, ATT1 유전자의 상기 돌연변이된 형태는 서열 7의 아미노산 540-995를 포함하는 단편의 결실이다. 또 다른 실시양태에서, ATT1 유전자의 상기 돌연변이된 형태는 서열 7의 아미노산 729-995를 포함하는 단편의 결실이다. 또 다른 실시양태에서, ATT1 유전자의 상기 돌연변이된 형태는 서열 7을 코딩하는 핵산 내의 삽입 또는 프레임-시프트 돌연변이이다. 또 다른 실시양태에서, ATT1 유전자의 상기 돌연변이된 형태는 서열 7을 코딩하는 핵산 서열 내의 단일 뉴클레오티드 돌연변이이다. 또 다른 실시양태에서, ATT1 유전자의 상기 돌연변이된 형태는 서열 7 내의 단일 아미노산 변화를 유발한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 한세눌라 폴리모르파이고, ATT1 유전자는 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 다형체를 코딩한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 유사한 배양 조건 하에 ATT1 나이브 (naive) 모 숙주 세포에 비해 배양 안정성, 내열성 및/또는 개선된 발효 강건성의 증가를 보인다. 한 실시양태에서, 상기 조작된 숙주 세포는 최소 세포 용해를 보이면서 32℃에서 적어도 80시간의 발효 동안 배양액 내에서 생존할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 조작된 숙주 세포는 최소 세포 용해를 보이면서 유도 (예를 들어, 메탄올 유도) 후에 32℃에서 적어도 80시간의 발효 동안 배양액 내에서 생존할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 조작된 숙주 세포는 최소 세포 용해를 보이면서 32℃에서 적어도 100시간의 발효 동안 배양액 내에서 생존할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 조작된 숙주 세포는 최소 세포 용해를 보이면서 유도 후에 32℃에서 적어도 100시간의 발효 동안 배양액 내에서 생존할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 하나 이상의 기능성 유전자 생성물의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 프로테아제 활성, 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제 활성, 알파-1,2-만노실트랜스퍼라제 활성, 만노실포스페이트 트랜스퍼라제 활성, β-만노실트랜스퍼라제 활성, O-만노실트랜스퍼라제 (PMT) 활성, 및/또는 돌리콜-P-Man 의존성 알파(1-3) 만노실트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 OCH1 유전자에 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 BMT1, BMT2, BMT3, 및 BMT4 유전자에 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 PNO1, MNN4, 및 MNN4L1 유전자에 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 PEP4 및 PRB1 유전자에 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 ALG3 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다 (미국 특허 공개 US2005/0170452에 설명됨). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 다음과 같은 모든 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함한다: OCH1, BMT1, BMT2, BMT3, BMT4, PNO1, MNN4, 및 MNN4L1. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 다음과 같은 모든 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함한다: OCH1, BMT1, BMT2, BMT3, BMT4, PNO1, MNN4, MNN4L1, PEP4 및 PRB1. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 다음과 같은 모든 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함한다: OCH1, BMT1, BMT2, BMT3, BMT4, PNO1, MNN4, MNN4L1, ALG3, PEP4 및 PRB1. 한 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 SSK2, RRT12, SDS23, NOT5, DRS1, CRZ1, CTK1, RGD2, AVO2, YMR196W, PEX1, TYW1, POM152, YPR84W, MAK5, AZF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함한다.

또 다른 추가의 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 하나 이상의 관심있는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 관심있는 핵산 서열은 하나 이상의 글리코실화 효소를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 글리코실화 효소는 글리코시다제, 만노시다제, 포스포만노시다제, 포스파타제, 뉴클레오티드 당 수송체, 뉴클레오티드 당 에피머라제, 만노실트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제, CMP-시알산 신타제, N-아세틸뉴라미네이트-9-포스페이트 신타제, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 및 올리고사카릴트랜스퍼라제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 하나 이상의 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 단백질은 치료 단백질이다. 치료 단백질은 올리고당을 함유할 수 있거나 결여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 항체 (IgA, IgG, IgM 또는 IgE), 항체 단편, 인간 플라스미노겐의 크링글 (kringle) 도메인, 에리트로포이에틴, 시토카인, 응고 인자, 가용성 IgE 수용체 α-쇄, 우로키나제, 키마제, 우레아 트립신 억제제, IGF-결합 단백질, 표피 성장 인자, 성장 호르몬-방출 인자, 아넥신 V 융합 단백질, 안지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자-2, 골수성 전구세포 억제 인자-1, 오스테오프로테게린, α-1 항트립신, DNase II, α-페토 단백질, 인슐린, Fc-융합체, HSA-융합체, 바이러스 항원 및 세균 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 치료 단백질은 항체 또는 그의 단편이다. 한 실시양태에서, 치료 단백질은 N-글리칸을 포함하는 항체 또는 항체 단편 (Fc-함유 폴리펩티드)이다. 한 실시양태에서, N-글리칸은 우세하게 NANA_(1-4)Gal_(1-4)Man₃GlcNAc₂를 포함한다. 한 실시양태에서, N-글리칸은 우세하게 NANA₂Gal₂Man₃GlcNAc₂를 포함한다.

본 발명은 게놈 DNA에 ATT1 유전자의 파괴, 결실 또는 돌연변이를 포함하고 ATT1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 조작된 하등 진핵 숙주 세포를 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 당-조작된다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 진균 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 진균 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 효모 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 효모 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 피키아 종이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 피키아 종 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 단편은 ATT1의 "기능성 단편" 또는 ATT1의 "우성-음성 (dominant-negative) 단편"이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, ATT1 유전자 또는 폴리펩티드의 "기능성 단편"은 ATT1 활성을 갖는 단편을 의미한다. ATT1 유전자 또는 폴리펩티드의 "우성-음성 단편"은 내인성 나이브 ATT1 유전자의 존재 하에서도 상기 단편이 숙주 세포의 세포 배양 안정성, 내열성 및/또는 개선된 발효 강건성을 증가시킬 수 있도록 무손상 ATT1 유전자 또는 그의 폴리펩티드 생성물의 기능을 유해하게 방해하는 단편을 의미한다 (예를 들어, 실시예 11의 단편 1-31aa 및 1-164aa). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스이고, ATT1 폴리펩티드는 서열 7의 아미노산 서열 또는 그의 다형체를 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스이고, 기능성 단편은 서열 7의 아미노산 1-296을 포함하거나 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스이고, 우성-음성 단편은 서열 7의 아미노산 1-31을 포함하거나 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스이고, 우성-음성 단편은 서열 7의 아미노산 1-164를 포함하거나 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 에이치. 폴리모르파 (H. polymorpha)이고, ATT1 폴리펩티드는 서열 23의 아미노산 서열 또는 그의 다형체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 숙주 세포는 서열 7 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체 (다형체)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 과다발현 카세트를 포함한다.

본 발명은 또한 ATT1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 서열의 발현을 증가시키도록 변형된, 조작된 하등 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 당-조작된다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 진균 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 진균 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 효모 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 효모 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 피키아 종이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 피키아 종 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스이고, ATT1 폴리펩티드는 서열 7의 아미노산 서열 또는 그의 다형체를 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스이고, 기능성 단편은 서열 7의 아미노산 1-296을 포함하거나 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스이고, 우성-음성 단편은 서열 7의 아미노산 1-31을 포함하거나 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스이고, 우성-음성 단편은 서열 7의 아미노산 1-164를 포함하거나 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 에이치. 폴리모르파이고, ATT1 폴리펩티드는 서열 23의 아미노산 서열 또는 그의 다형체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 숙주 세포는 서열 7 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체 (다형체)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 과다발현 카세트를 포함한다.

특정 실시양태에서, ATT1 또는 그의 단편의 발현을 증가시키도록 변형된 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 하나 이상의 기능성 유전자 생성물의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 프로테아제 활성, 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제 활성, 알파-1,2-만노실트랜스퍼라제 활성, 만노실포스페이트 트랜스퍼라제 활성, β-만노실트랜스퍼라제 활성, O-만노실트랜스퍼라제 (PMT) 활성, 및/또는 돌리콜-P-Man 의존성 알파(1-3) 만노실트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 OCH1 유전자에 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 BMT1, BMT2, BMT3, 및 BMT4 유전자에 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 PNO1, MNN4, 및 MNN4L1 유전자에 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 PEP4 및 PRB1 유전자에 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 ALG3 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다 (미국 특허 공개 US2005/0170452에 설명됨). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 다음과 같은 모든 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함한다: OCH1, BMT1, BMT2, BMT3, BMT4, PNO1, MNN4, 및 MNN4L1. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 다음과 같은 모든 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함한다: OCH1, BMT1, BMT2, BMT3, BMT4, PNO1, MNN4, MNN4L1, PEP4 및 PRB1. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 다음과 같은 모든 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함한다: OCH1, BMT1, BMT2, BMT3, BMT4, PNO1, MNN4, MNN4L1, ALG3, PEP4 및 PRB1. 한 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 SSK2, RRT12, SDS23, NOT5, DRS1, CRZ1, CTK1, RGD2, AVO2, YMR196W, PEX1, TYW1, POM152, YPR84W, MAK5, AZF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함한다. 또 다른 추가의 실시양태에서, ATT1 또는 그의 단편의 발현을 증가시키도록 변형된 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 하나 이상의 관심있는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 관심있는 핵산 서열은 하나 이상의 글리코실화 효소를 코딩한다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 글리코실화 효소는 글리코시다제, 만노시다제, 포스포만노시다제, 포스파타제, 뉴클레오티드 당 수송체, 만노실트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제, UDP-N-아세틸글루코사민 수송체, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 및 올리고사카릴트랜스퍼라제로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 추가의 실시양태에서, 관심있는 핵산 서열은 하나 이상의 재조합 단백질을 코딩한다. 한 실시양태에서, 재조합 단백질은 치료 단백질이다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 항체 (IgA, IgG, IgM 또는 IgE), 항체 단편, 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인, 에리트로포이에틴, 시토카인, 응고 인자, 가용성 IgE 수용체 α-쇄, 우로키나제, 키마제, 우레아 트립신 억제제, IGF-결합 단백질, 표피 성장 인자, 성장 호르몬-방출 인자, 아넥신 V 융합 단백질, 안지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자-2, 골수성 전구세포 억제 인자-1, 오스테오프로테게린, α-1 항트립신, DNase II, α-페토 단백질, 인슐린, Fc-융합체, HSA-융합체, 바이러스 항원 및 세균 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 치료 단백질은 항체 또는 그의 단편이다. 한 실시양태에서, 치료 단백질은 N-글리칸을 포함하는 항체 또는 항체 단편 (Fc-함유 폴리펩티드)이다. 한 실시양태에서, N-글리칸은 우세하게 NANA_(1-4)Gal_(1-4)Man₃GlcNAc₂를 포함한다. 한 실시양태에서, N-글리칸은 우세하게 NANA₂Gal₂Man₃GlcNAc₂를 포함한다.

또 다른 추가의 실시양태에서, ATT1 또는 그의 단편의 발현을 증가시키도록 변형된 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 유사한 배양 조건 하의 ATT1 나이브 모 숙주 세포에 비해 배양 안정성, 내열성 또는 개선된 발효 강건성의 증가를 보인다. 한 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 최소 세포 용해를 보이면서 32℃에서 적어도 80시간의 발효 동안 배양액 내에서 생존할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 최소 세포 용해를 보이면서 유도 (예를 들어, 메탄올 유도) 후에 32℃에서 적어도 80시간의 발효 동안 배양액 내에서 생존할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 최소 세포 용해를 보이면서 32℃에서 적어도 100시간의 발효 동안 배양액 내에서 생존할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 최소 세포 용해를 보이면서 유도 후에 32℃에서 적어도 100시간의 발효 동안 배양액 내에서 생존할 수 있다.

본 발명은 또한 서열 23의 ATT1 유전자의 활성을 감소시키거나 제거하도록 변형된, 조작된 에이치. 폴리모르파 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 23, 그의 천연 변이체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형된 에이치. 폴리모르파 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 23을 코딩하는 ATT1 유전자의 돌연변이된 형태를 발현하도록 변형된 에이치. 폴리모르파 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 23, 그의 천연 변이체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산의 발현을 증가시키도록 변형된, 조작된 에이치. 폴리모르파 숙주 세포를 제공한다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 또한 ATT1 유전자의 코딩 서열, ATT1 유전자의 프로모터 영역, ATT1의 3' 비-번역 영역 (UTR), 피. 파스토리스 ATT1 유전자의 코딩 서열의 축중성 (degenerate) 변이체인 핵산 서열 및 관련 핵산 서열 및 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열의 파괴, 결실 또는 돌연변이 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 돌연변이, 삽입 돌연변이, 또는 결실 돌연변이)를 포함하는 조작된 하등 진핵 숙주 세포를 제공하고, 상기 숙주 세포는 파괴, 결실 또는 돌연변이가 존재하지 않는 숙주 세포에 비해 증가된 배양 안정성, 내열성 또는 개선된 발효 강건성을 갖는다.

본 발명은 또한 이종 폴리펩티드 및 다른 대사물질을 생산하기 위해 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 상기 설명된 임의의 피키아 종 숙주 세포를 이종 폴리펩티드의 발현에 유리한 조건 하에 배양하고; 임의로 숙주 세포로부터 이종 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함하는, 상기 숙주 세포에서 이종 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 (a) 이종 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 피키아 파스토리스 ATT1 유전자에 오르토로그 (ortholog)인 ATT1 유전자의 활성을 감소시키거나 제거하도록 변형된, 조작된 숙주 세포 내로 도입하고; (b) 상기 숙주 세포를 이종 폴리펩티드의 발현에 유리한 조건 하에 배양하고; 임의로 (c) 숙주 세포로부터 이종 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함하는, 조작된 하등 진핵 숙주 세포에서 이종 폴리펩티드를 생산하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 당-조작된다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 진균 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 진균 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 효모 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 효모 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 피키아 종이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 피키아 종 숙주 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스이고, ATT1 유전자는 서열 7의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 다형체를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 한세눌라 폴리모르파이고, ATT1 유전자는 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 다형체를 코딩한다.

본 발명은 또한 (a) 이종 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 서열 7의 피키아 파스토리스 ATT1 유전자의 오르토로그인 ATT1 유전자를 과다발현하도록 변형된, 조작된 숙주 세포 내로 도입하고; (b) 상기 숙주 세포를 이종 폴리펩티드의 발현에 유리한 조건 하에 배양하고; 임의로 (c) 숙주 세포로부터 이종 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함하는, 조작된 하등 진핵 숙주 세포에서 이종 폴리펩티드를 생산하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 폴리펩티드는 메탄올 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 숙주 세포는 메탄올의 존재 하에 이종 폴리펩티드의 발현에 유리한 조건 하에 배양된다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 당-조작된다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 하등 진핵 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 진균 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 진균 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 효모 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 효모 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 피키아 종이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 세포는 OCH1 활성이 결여된 피키아 종 숙주 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스이고, ATT1 유전자는 서열 7의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 다형체를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 한세눌라 폴리모르파이고, ATT1 유전자는 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 다형체를 코딩한다.

본 발명은 또한 (a) 이종 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 서열 23, 그의 천연 변이체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형된, 조작된 에이치. 폴리모르파 숙주 세포 내로 도입하고; (b) 상기 세포를 이종 폴리펩티드의 발현에 유리한 조건 하에 배양하고; 임의로 (c) 숙주 세포로부터 이종 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함하는, 조작된 에이치. 폴리모르파 숙주 세포에서 이종 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 (a) 이종 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 서열 23, 그의 천연 변이체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산의 발현을 증가시키도록 변형된, 조작된 에이치. 폴리모르파 숙주 세포 내로 도입하고; (b) 상기 세포를 이종 폴리펩티드의 발현에 유리한 조건 하에 배양하고; 임의로 (c) 숙주 세포로부터 이종 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함하는, 조작된 에이치. 폴리모르파 숙주 세포에서 이종 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 이종 폴리뉴클레오티드를, 내인성 ATT1 유전자와 상동성 재조합하고 내인성 ATT1 유전자를 부분적으로 또는 완전히 제거하거나 또는 내인성 ATT1 유전자를 파괴시키는 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 본 발명의 임의의 숙주 세포의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 숙주 세포의 게놈 DNA에 ATT1 유전자의 파괴, 결실 또는 돌연변이를 포함하는 숙주 세포 내로의 이종 핵산 서열의 유전자 통합 방법을 제공한다. 이들 방법은 피. 파스토리스 ATT1 유전자의 코딩 서열, 피. 파스토리스 ATT1 유전자의 코딩 서열의 축중성 변이체인 핵산 서열 및 관련 핵산 서열 및 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로부터 유래된 파괴, 결실 또는 돌연변이된 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포 내로 관심있는 서열을 도입하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 피. 파스토리스 ATT1 유전자, 또는 피. 파스토리스 ATT1 유전자의 단편, 또는 피. 파스토리스 ATT1 유전자의 오르토로그 또는 다형체 (천연 변이체)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 ATT1 유전자의 돌연변이체 (단일 뉴클레오티드 돌연변이, 프레임-시프트 돌연변이, 삽입, 말단절단 또는 결실)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 이들 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이들 폴리뉴클레오티드의 단편을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 피. 파스토리스 ATT1 유전자, 피. 파스토리스 ATT1 유전자의 단편, 또는 피. 파스토리스 ATT1 유전자의 오르토로그 또는 다형체에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 단리된 폴리펩티드를 추가로 제공한다. 본 발명의 단리된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체도 본원에 포함된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열 7 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 서열 8 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 서열 9 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 서열 10 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 서열 23 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 야생형 또는 돌연변이된 ATT1 유전자를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열 7의 잔기 1-296, 1-31 또는 1-164를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 24 또는 그의 단편, 서열 25 또는 그의 단편, 서열 26 또는 그의 단편, 서열 27 또는 그의 단편, 서열 28 또는 그의 단편, 서열 29 또는 그의 단편, 서열 30 또는 그의 단편, 서열 31 또는 그의 단편, 및 서열 32 또는 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 야생형 또는 돌연변이된 ATT1 유전자를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 핵산을 발현하는 단리된 숙주 세포는 유사한 조건 하의 ATT1 나이브 모 숙주 세포에 비해 배양 안정성, 내열성 및/또는 개선된 발효 강건성의 증가를 보인다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 이들 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다.

도 1a-b는 사카로미세스 세레비지아에 (Saccharyomyces cerevisiae) GAL4와 피키아 파스토리스 ATT1 아미노산 서열 사이의 서열 정렬을 보여준다.
도 2a-d는 4개의 균주 YGLY17108 (도 2a), YGLY17177 (도 2b), YGLY22835 (도 2c), 및 YGLY17159 (도 2d)로부터 분비된 및 전세포 단백질을 사용한 N-글리칸 MALDI-TOF 질량 분광측정법 트레이스(trace)를 보여준다.
도 3a-b는 pGLY8045 및 pGLY6391의 플라스미드 맵을 보여준다.
도 4a-g는 pGLY5933-5936 (각각 도 4a-d) 및 pGLY5947-pGLY5949 (각각 도 4e-g)의 플라스미드 맵을 보여준다.
도 5는 온도-내성 및 발효 강건성 표현형을 시험하기 위해서 비-돌연변이된 피키아 균주 내의 내인성 ATT1 유전자를 교체하기 위해 사용된 DNA 구축물 및 통합 전략을 보여준다.
도 6a-c는 대조군 숙주 세포의 성장에 비해 피키아 파스토리스 ATT1 돌연변이체의 개선된 성장을 제시하는 사진 (도 6a-b) 및 연관성을 보여주는 표 (도 6c)를 보여준다.
도 7은 yGLY6903으로부터 yGLY17108까지의 균주 계통 (lineage)을 보여준다.
도 8은 yGLY17108 (GFI5.0) 배경으로부터의 ATT1 돌연변이체 계통을 보여준다.
도 9는 yGLY6903으로부터 yGLY22835 및 yGLY17159까지의 균주 계통을 보여준다.
도 10은 pGLY8369의 플라스미드 맵을 보여준다.
도 11은 pGLY9959의 플라스미드 맵을 보여준다.
도 12는 pGLY5883의 플라스미드 맵을 보여준다.
도 13은 NRRL 11430으로부터 yGLY13979까지의 균주 계통을 보여준다.
도 14a-h는 플라스미드 맵을 보여준다. 도 14a-d는 각각 pGLY9955-pGLY9958의 플라스미드 맵을 보여주고; 도 14e-h는 각각 pGLY9960-pGLY9963의 플라스미드 맵을 보여준다.
도 15는 ATT1이 결실된 피키아 균주에 대한 감소된 용해를 제시하는 그래프를 보여준다.
도 16은 피키아 ATT1 과다발현 균주 yGLY13979+ TEF-ATT1 1-655에 대한 단백질 역가를 제시하는 그래프를 보여준다.
도 17은 다양한 ATT1 조작된 피키아 숙주 균주에 대한 유도 시간, 균주 용해, 및 단백질 역가를 제시하는 표를 보여준다.
도 18은 에스. 세레비지아에 (S. cerevisiae) Gal4, 피. 파스토리스 ATT1 및 에이치. 폴리모르파 ATT1의 정렬을 보여준다.
도 19a 및 19b는 세포 강건성 및 생성물 역가에 대한 상이한 ATT1 말단절단의 효과를 보여준다.
도 20은 15L 생물반응기에서 세포 용해에 대한 상이한 ATT1 변형의 효과를 보여준다.
도 21은 플라스미드 pGLY5952의 제한 맵을 보여준다. 이. 콜라이 (E. coli)/피. 파스토리스 셔틀 벡터는 이. 콜라이 내에 유지되기 때문에 환상으로 도시된다. 플라스미드는 세균 유지를 위한 pUC19 서열, 및 선택가능 마커로서 에스. 세레비지아에 ARR3 유전자 (피. 파스토리스 RPL10 프로모터에 의해 유도됨)에 인접하는 피. 파스토리스 ATT1 유전자의 5' 및 3' 영역을 함유한다. 피. 파스토리스 내로의 도입을 위해, 플라스미드는 pUC19 영역을 선형화하고 제거하기 위해 SfiI으로 소화되고, 1-3 mM 아비산나트륨을 함유하는 배지에서 선택되고, 따라서 ATT1 유전자좌에서의 교체 통합을 촉진하고, 적절한 통합체 (즉, att1Δ 균주)는 PCR에 의해 스크리닝된다.
도 22는 GFI2.0 ATT1 야생형 및 att1Δ 발효 상청액의 SDS-PAGE를 보여준다. GFI2.0 ATT1 야생형 및 att1Δ 균주의 발효 샘플을 ~24h마다 채취하고, 청정화된 상청액은 13000 x g에서 원심분리에 의해 얻었다. 샘플을 SDS-PAGE 상에서 분리하고, 겔을 쿠마시 (Coomassie) 블루에 의해 염색하였다. MW 마커, 바이오라드 브로드 레인지 (Biorad Broad Range) SDS-PAGE 표준.
도 23은 GFI2.0 ATT1 야생형 및 att1Δ 발효 상청액의 상청액 DNA 정량을 보여준다. GFI2.0 ATT1 야생형 및 att1Δ 균주의 발효 샘플을 ~24h마다 채취하고, 청정화된 상청액은 13000 x g에서 원심분리에 의해 얻었다. 세포 용해는 상청액 DNA 로드 (load)를 결정함으로써 측정하였다. 피코그린 (Picogreen) (인비트로젠 (Invitrogen)) 형광 DNA 염색을 사용하여 샘플을 분석하고, 이전에 보고된 바와 같이 (Barnard, 2010) 플레이트 판독기를 사용하여 정량하였다.
도 24는 GFI2.0 ATT1 야생형 및 att1Δ 발효 상청액의 SDS-PAGE를 보여준다. GFI1.0 ATT1 야생형 및 att1Δ 균주의 발효 샘플을 ~24h마다 채취하고, 청정화된 상청액은 13000 x g에서 원심분리에 의해 얻었다. 샘플을 SDS-PAGE 상에서 분리하고, 겔을 쿠마시 블루에 의해 염색하였다. MW 마커, 바이오라드 브로드 레인지 SDS-PAGE 표준.
도 25는 GFI1.0 ATT1 야생형 및 att1Δ 발효 상청액의 상청액 DNA 정량을 보여준다. GFI1.0 ATT1 야생형 및 att1Δ 균주의 발효 샘플을 ~24h마다 채취하고, 청정화된 상청액은 13000 x g에서 원심분리에 의해 얻었다. 세포 용해는 상청액 DNA 로드를 결정함으로써 측정하였다. 피코그린 (인비트로젠) 형광 DNA 염색을 사용하여 샘플을 분석하고, 이전에 보고된 바와 같이 (Barnard, 2010) 플레이트 판독기를 사용하여 정량하였다.

분자 생물학

본 발명에 따라, 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 및 당업계의 기술 내의 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 본원에서 달리 규정되지 않으면, 본 발명과 관련하여 사용되는 학술 및 기술 용어 및 문구는 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않으면, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에 공지되어 있고, 통상적으로 사용되는 것이다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 당업계에 잘 공지되고 달리 나타내지 않으면 본원 명세서 전체에 걸쳐서 인용되고 논의되는 다양한, 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 통상적인 방법에 따라 수행된다. 예를 들어, 문헌 [James M. Cregg (Editor), Pichia Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press (2010)], [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002)]; [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)]; [Taylor and Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003)]; [Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, N.J.]; [Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I, CRC Press (1976)]; [Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II, CRC Press (1976)]; [Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)], [Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)]); [Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)]); [B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)]을 참조한다.

"폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 단일 가닥 형태, 이중-가닥 형태 등의 DNA 및 RNA를 포함한다.

"폴리뉴클레오티드 서열" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA 내의 일련의 뉴클레오티드 염기 ("뉴클레오티드"로도 불림)이고, 일련의 2개 또는 그 초과의 뉴클레오티드를 의미한다. 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 본 발명의 프로모터)는 본 발명의 일부를 형성한다.

"코딩 서열" 또는 발현 생성물, 예컨대 RNA 또는 폴리펩티드를 "코딩하는" 서열은 발현될 때 생성물 (예를 들어, 서열 7 또는 서열 7의 단편을 포함하는 폴리펩티드)의 생산을 유도하는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 이종 폴리뉴클레오티드)이다.

"단백질", "펩티드" 또는 "폴리펩티드" (예를 들어, 이종 폴리펩티드, 상기 서열 7 또는 이뮤노글로불린 중쇄 및/또는 경쇄)는 2개 또는 그 초과의 아미노산의 인접한 스트링 (string)을 포함한다.

"단백질 서열", "펩티드 서열" 또는 "폴리펩티드 서열" 또는 "아미노산 서열"은 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 내의 일련의 2개 또는 그 초과의 아미노산을 의미한다.

용어 "단리된 폴리뉴클레오티드" 또는 "단리된 폴리펩티드"는 세포 또는 재조합 DNA 발현 시스템에서 통상 발견되는 다른 성분 또는 임의의 다른 오염물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 각각 포함한다. 이들 성분은 세포막, 세포벽, 리보좀, 중합효소, 혈청 성분 및 외래 게놈 서열을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 범위는 본원에 제시된 단리된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 본원에 제시된 프로모터; 및 예를 들어 본원에서 논의되는 바와 같은 그와 관련된 방법을 포함한다.

단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 바람직하게는 본질적으로 균질한 분자 조성을 가질 것이지만, 일부 이질 성분도 함유할 수 있다.

일반적으로, "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 세포 내의 RNA 중합효소에 결합하고 (예를 들어, 직접 또는 다른 프로모터-결합 단백질 또는 물질을 통해), 프로모터가 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 전사를 개시시킬 수 있는 DNA 조절 영역이다.

코딩 서열 (예를 들어, 이종 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 리포터 유전자 또는 이뮤노글로불린 중쇄 및/또는 경쇄의)은, 제어 서열이 코딩 서열의 RNA, 바람직하게는 mRNA로의 RNA 중합효소 매개된 전사를 지시하고, 이어서 전사체가 RNA 스플라싱되고 (인트론을 포함하는 경우에), 임의로 코딩 서열에 의해 코딩되는 단백질로 번역될 수 있다면, 전사 및 번역 제어 서열 (예를 들어, 본 발명의 프로모터)"에 작동가능하게 연결된", 이 서열"의 제어 하에 존재하는", 이 서열"과 기능적으로 연관된" 또는 이 서열"과 작동가능하게 연관된" 것이다.

본 발명은 야생형 ATT1 또는 돌연변이된 ATT1 코딩 영역 (ATT1 유전자 내의 단일 뉴클레오티드 돌연변이, 프레임-시프트 돌연변이, 삽입, 말단절단 및 결실 포함)을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 카세트를 포함한다. 본 발명은 또한 과다발현될 때 배양 안정성, 내열성, 및/또는 개선된 발효 강건성을 증가시킬 수 있는 ATT1 또는 ATT1의 단편의 과다발현을 유도하는 벡터를 포함한다. 용어 "벡터"는 숙주를 형질전환시키고 임의로, 도입된 서열의 발현 및/또는 복제를 촉진하기 위해 DNA 또는 RNA 서열이 그에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 운반체 (예를 들어, 플라스미드)를 포함한다. 본원에서 사용하기 적합한 벡터는 핵산의 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 파스토리스)의 게놈 내로의 도입을 용이하게 할 수 있는 플라스미드, 통합가능한 DNA 단편, 및 다른 운반체를 포함한다. 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이지만, 유사한 기능을 수행하고 당업계에 공지된 다른 모든 형태의 벡터가 본원에서 사용하기 적합하다. 예를 들어, 문헌 [Pouwels, et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 and Supplements, Elsevier, N.Y.], 및 [Rodriguez et al. (eds.), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, MA]을 참조한다.

프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 이뮤노글로불린 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드)는 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 용어 "발현 시스템"은 숙주 세포 및 적합한 조건 하에 단백질을 발현할 수 있는 적합한 벡터 또는 벡터에 의해 운반되어 숙주 세포에 도입된 핵산을 의미한다. 통상적인 발현 시스템은 진균 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 파스토리스) 및 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포 및 바큘로바이러스 (Baculovirus) 벡터, 및 포유동물 숙주 세포 및 벡터를 포함한다.

일반적으로, "유도 조건"은 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 이종 폴리뉴클레오티드)의 향상된 발현을 유발하는 성장 조건을 의미한다. 용어 메탄올-유도는 숙주 세포를 메탄올에 노출시킴으로써 본 발명의 숙주 세포에서 메탄올-유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 이종 폴리뉴클레오티드)의 발현을 증가시킴을 의미한다.

BLAST 알고리즘에 대한 다음 참고문헌은 본원에 참조로 포함된다: 문헌 [BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.F., et al, J. Mol. Biol. (1990) 215:403-410]; [Gish, W., et al, Nature Genet. (1993) 3:266-272]; [Madden, T.L., et al, Meth. Enzymol. (1996) 266:131-141]; [Altschul, S.F., et al, Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402]; [Zhang, J., et al, Genome Res. (1997) 7:649-656]; [Wootton, J.C., et al., Comput. Chem. (1993) 17:149-163]; [Hancock, J.M., et al, Comput. Appl. Biosci. (1994) 10:67-70]; [ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., et al, "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure. (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC]; [Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure. (1978) vol. 5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC]; [Altschul, S.F., J. Mol. Biol. (1991) 219:555-565]; [States, D.J., et al., Methods (1991) 3:66-70]; [Henikoff, S., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992)89:10915-10919]; [Altschul, S.F., et al, J. Mol. Evol. (1993) 36:290-300]; [ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:2264-2268]; [Karlin, S., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:5873-5877]; [Dembo, A., et al, Ann. Prob. (1994) 22:2022-2039]; 및 [Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York].

숙주 세포

본 발명은 ATT1 유전자의 활성을 감소시키거나 제거하도록 변형된, 조작된 하등 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 당-조작된다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 OCH1 활성이 결여된다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 진균 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 OCH1 활성이 결여된 진균 숙주 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 효모 숙주 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 OCH1 활성이 결여된 효모 숙주 세포이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 피키아 종이다. 한 실시양태에서, 하등 진핵 숙주 세포는 OCH1 활성이 결여된 피키아 종이다. 한 실시양태에서, 진균 숙주 세포는 피키아 파스토리스, 피키아 안구스타 (Pichia angusta) (한세눌라 폴리모르파), 피키아 핀란디카 (Pichia finlandica), 피키아 트레할로필라 (Pichia trehalophila), 피키아 코클라마에 (Pichia koclamae), 피키아 멤브라나에파시엔스 (Pichia membranaefaciens), 피키아 미누타 (Pichia minuta) (오가타에아 미누타 (Ogataea minuta), 피키아 린드네리 (Pichia lindneri)), 피키아 오푼티아에 (Pichia opuntiae), 피키아 써모톨레란스 (Pichia thermotolerans), 피키아 살릭타리아 (Pichia salictaria), 피키아 구에르쿰 (Pichia guercuum), 피키아 피이페리 (Pichia pijperi), 피키아 스티피티스 (Pichia stipitis), 피키아 메타놀리카 (Pichia methanolica), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 클루이베로미세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 지고사카로미세스 로욱시이 (Zygosaccharomyces rouxii), 지고사카로미세스 바일리이 (Zygosaccharomyces bailii), 슈와니오미세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis), 클루이베로미세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus), 아스페르길루스 니거 (Aspergillus niger), 아르술라 아데니니보란스 (Arxula adeninivorans), 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 웬티이 (Aspergillus wentii), 아스페르길루스 아우레우스 (Aspergillus aureus), 아스페르길루스 플라부스 (Aspergillus flavus), 아쉬비아 고시피이 (Ashbya gossypii), 메틸로필루스 메틸로트로푸스 (Methylophilus methylotrophus), 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 칸디다 보이디니이 (Candida boidinii), 칸디다 우틸리스 (Candida utilis), 리조푸스 오리자에 (Rhizopus oryzae), 데바리오미세스 한세니이 (Debaromyces hansenii) 및 사카로미세스 세레비지아에로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 진균 숙주 세포는 피키아 파스토리스이다. 또 다른 실시양태에서, 진균 숙주 세포는 한세눌라 폴리모르파이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 감소된 ATT1 유전자 활성을 갖거나 ATT1 유전자 활성이 결여된 숙주 세포는 유사한 배양 조건 하의 ATT1 나이브 모 숙주 세포에 비해 배양 안정성, 내열성 및/또는 개선된 발효 강건성의 증가를 갖는 세포를 의미한다. 유전자가 ATT1 활성을 갖는지 결정하기 위해, 유전자는 당-조작된 숙주 세포 (예를 들어, OCH1 결여된 하등 진핵 숙주 세포)에서 검출될 수 있고, 세포 (ATT1 유전자가 결실된)가 생물반응기 내에서 32℃에서 배양액 내에서 생존하는 능력이 결정되고, 세포가 ATT1 나이브 세포에 비해 배양 안정성, 내열성 및/또는 개선된 강건성을 갖는다면, 유전자는 ATT1 활성을 갖는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "ATT1 나이브 숙주 세포"는 야생형 ATT1 유전자를 그의 천연 게놈 상태로 포함하는 숙주 세포를 의미한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, ATT1 나이브 숙주 세포는 서열 7의 폴리펩티드 또는 그의 천연 변이체 (다형체)를 코딩하는 ATT1 유전자를 그의 천연 게놈 상태로 포함하는 피키아 파스토리스 균주를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "조작된 세포"는 유전자 조작 기술을 사용하여 변경된 세포를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "당-조작된" 세포는 유전자의 불활성화 또는 결실을 통해 또는 글리코실트랜스퍼라제 또는 글리코시다제의 이종 발현을 통해 N- 또는 O-연결된 글리코실화가 그의 천연 형태로부터 변형된 당단백질을 생산하도록 유전자 조작된 세포를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "내열성"은 온도 내성의 증가 (즉, 적어도 약 32℃의 온도까지 배양액에서 성장하는 능력)를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "개선된 발효 강건성"은 발효 동안 세포 생존성의 증가 또는 세포 용해의 감소를 의미한다.

본 발명은 피키아 파스토리스 ATT1 유전자의 오르토로그인 ATT1 유전자의 활성을 감소시키거나 제거하도록 변형된 임의의 조작된 하등 진핵 숙주 세포를 포함하고, 여기서 세포는 ATT1 나이브 모 숙주 세포에 비해 배양 안정성, 내열성 및/또는 개선된 발효 강건성의 증가를 보인다.

본 발명은 또한 (i) 피키아 파스토리스 ATT1 유전자의 오르토로그인 ATT1 유전자 또는 폴리펩티드의 발현을 감소시키거나 제거하도록, (ii) 피키아 파스토리스 ATT1 유전자의 오르토로그인 ATT1 유전자의 돌연변이된 형태를 발현하도록, 또는 (iii) 피키아 파스토리스 ATT1 유전자의 오르토로그인 ATT1 유전자 또는 상기 유전자의 단편을 과다발현하도록 변형된, 조작된 하등 진핵 숙주 세포에 관한 것이고; 여기서 상기 세포는 ATT1 나이브 모 숙주 세포에 비해 배양 안정성, 내열성 및/또는 개선된 발효 강건성의 증가를 보인다. 한 실시양태에서, 본 발명은 피키아 파스토리스 ATT1 유전자의 오르토로그인 ATT1 유전자 또는 폴리펩티드의 발현을 감소시키거나 제거하도록 또는 피키아 파스토리스 ATT1 유전자의 오르토로그인 ATT1 유전자의 돌연변이된 형태를 발현하도록 변형된, 조작된 하등 진핵 숙주 세포에 관한 것이고; 여기서 상기 세포는 ATT1 나이브 모 숙주 세포에 비해 배양 안정성, 내열성 및/또는 개선된 발효 강건성의 증가를 보인다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 피키아 파스토리스 ATT1 유전자의 오르토로그인 ATT1 유전자, 또는 상기 유전자의 기능성 또는 우성-음성 단편을 과다발현하도록 변형된 하등 진핵 숙주 세포에 관한 것이고, 여기서 상기 세포는 ATT1 나이브 모 숙주 세포에 비해 배양 안정성, 내열성 및/또는 개선된 발효 강건성의 증가를 보인다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 피키아 파스토리스 ATT1 유전자에 대한 오르토로그는 피키아 파스토리스 ATT1 유전자에 대한 서열 유사성을 갖고 ATT1 활성을 갖는 유전자이다. 한 실시양태에서, 서열 유사성은 적어도 25%일 것이다. 당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 상기 오르토로그를 확인할 수 있을 것이다. 예를 들어, 에이치. 폴리모르파 ATT1 오르토로그가 실시예 9에서 설명되는 바와 같이 확인되었다. 다른 진균/효모 오르토로그는 예를 들어 상호간 (reciprocal) BLAST 분석의 사용에 의해 유사하게 확인될 수 있다. 다음 유전자가 피키아 파스토리스 ATT1 유전자의 잠재적인 오르토로그로서 확인되었다:

진균 숙주 세포 서열/ 진뱅크 ( GenBank ) 등록 번호

피키아 스티피티스 서열 24 (XP_001385092.2)

피키아 귈리에르몬디이 서열 25 (XP_001482364.1)

(Pichia guilliermondii)

클루이베로미세스 락티스 서열 26 (XP_453627.1)

아스페르길루스 니거 서열 27 (EHA19999.1)

아스페르길루스 니둘란스 서열 28 (CBF76786.1)

아스페르길루스 플라부스 서열 29 (XP_002378619.1)

데바리오미세스 한세니이 서열 30 (XP_458171.2)

지고사카로미세스 로욱시이 서열 31 (XP_002499285.1)

사카로미세스 세레비지아에 서열 32 (CAA97969.1)

본 발명의 숙주 세포는 반수체, 이배체, 또는 다배수체 상태로 존재할 수 있다. 또한, 본 발명은 하나의 내인성 염색체 ATT1 유전자만이 돌연변이, 파괴, 말단절단 또는 결실된 이배체 세포를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 피키아 파스토리스, 피키아 안구스타 (한세눌라 폴리모르파), 피키아 핀란디카, 피키아 트레할로필라, 피키아 코클라마에, 피키아 멤브라나에파시엔스, 피키아 미누타 (오가타에아 미누타, 피키아 린드네리), 피키아 오푼티아에, 피키아 써모톨레란스, 피키아 살릭타리아, 피키아 구에르쿰, 피키아 피이페리, 피키아 스티피티스, 피키아 메타놀리카, 야로위아 리폴리티카, 클루이베로미세스 락티스, 지고사카로미세스 로욱시이, 지고사카로미세스 바일리이, 슈와니오미세스 옥시덴탈리스, 클루이베로미세스 마르시아누스, 아스페르길루스 니거, 아르술라 아데니니보란스, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 웬티이, 아스페르길루스 아우레우스, 아스페르길루스 플라부스, 아쉬비아 고시피이, 메틸로필루스 메틸로트로푸스, 쉬조사카로미세스 폼베, 칸디다 보이디니이, 칸디다 우틸리스, 리조푸스 오리자에 및 데바리오미세스 한세니이로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 실시양태에서, 숙주 세포는 임의의 피키아 세포, 예컨대 피키아 파스토리스, 피키아 안구스타 (한세눌라 폴리모르파), 피키아 핀란디카, 피키아 트레할로필라, 피키아 코클라마에, 피키아 멤브라나에파시엔스, 피키아 미누타 (오가타에아 미누타, 피키아 린드네리), 피키아 오푼티아에, 피키아 써모톨레란스, 피키아 살릭타리아, 피키아 구에르쿰, 피키아 피이페리, 피키아 스티피티스, 및 피키아 메타놀리카로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 조작된 피키아 파스토리스 숙주 세포이고, ATT1 유전자는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 조작된 에이치. 폴리모르파 숙주 세포이고, ATT1 유전자는 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체를 코딩한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 조작된 피키아 스티피티스 숙주 세포이고, ATT1 유전자는 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 조작된 피키아 귈리에르몬디이 숙주 세포이고, ATT1 유전자는 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 조작된 클루이베로미세스 락티스 숙주 세포이고, ATT1 유전자는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 조작된 아스페르길루스 니거 숙주 세포이고, ATT1 유전자는 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 조작된 아스페르길루스 니둘란스 숙주 세포이고, ATT1 유전자는 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 조작된 아스페르길루스 플라부스 숙주 세포이고, ATT1 유전자는 서열 29의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 조작된 데바리오미세스 한세니이 숙주 세포이고, ATT1 유전자는 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 조작된 지고사카로미세스 로욱시이 숙주 세포이고, ATT1 유전자는 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 조작된 사카로미세스 세레비지아에 숙주 세포이고, ATT1 유전자는 서열 32의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체를 코딩한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 하나 이상의 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 프로테아제 활성, 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제 활성, 알파-1,2-만노실트랜스퍼라제 활성, 만노실포스페이트 트랜스퍼라제 활성, β-만노실트랜스퍼라제 활성, O-만노실트랜스퍼라제 (PMT) 활성, 및/또는 돌리콜-P-Man 의존성 알파(1-3) 만노실트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 OCH1 유전자 내에 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 BMT1, BMT2, BMT3, 및 BMT4 유전자에 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 PNO1, MNN4, 및 MNN4L1 유전자에 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 PEP4 및 PRB1 유전자에 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 ALG3 유전자에 돌연변이, 파괴 또는 결실을 포함한다 (미국 특허 공개 US2005/0170452에 기재된 바와 같이). 한 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 다음과 같은 모든 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함한다: OCH1, BMT1, BMT2, BMT3, BMT4, PNO1, MNN4 및 MNN4L1. 한 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 다음과 같은 모든 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함한다: OCH1, BMT1, BMT2, BMT3, BMT4, PNO1, MNN4, MNN4L1, PEP4 및 PRB1. 한 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 다음과 같은 모든 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함한다: OCH1, BMT1, BMT2, BMT3, BMT4, PNO1, MNN4, MNN4L1, ALG3, PEP4 및 PRB1. 일부 실시양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 하나 이상의 Pmtp 억제제를 포함하는 배지에서 배양될 수 있다. Pmtp 억제제는 벤질리덴 티아졸리딘디온을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 벤질리덴 티아졸리딘디온의 예는 5-[[3,4비스(페닐메톡시) 페닐]메틸렌]-4-옥소-2-티옥소-3-티아졸리딘아세트산; 5-[[3-(1-25 페닐에톡시)-4-(2-페닐에톡시)]페닐]메틸렌]-4-옥소-2-티옥소-3-티아졸리딘아세트산; 및 5-[[3-(1-페닐-2-히드록시)에톡시)-4-(2-페닐에톡시)]페닐]메틸렌]-4-옥소-2-티옥소-3-티아졸리딘아세트산이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 OCH1 활성이 결여된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (i) ATT1 유전자 또는 폴리펩티드의 발현을 감소시키거나 제거하도록, (ii) ATT1 유전자의 돌연변이된 형태를 발현하도록, 또는 (iii) ATT1 유전자 또는 ATT1의 단편을 과다발현하도록 변형된 하등 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 종)을 포함하고, 여기서 세포는 OCH1 활성이 결여된다. OCH1 활성이 결여된 하등 진핵 세포는 당업계에 설명되어 있고, 온도 감수성인 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌 [Choi et al., 2003]; [Bates et al., J. Biol. Chem. 281(1):90-98 (2006)]; [Woog Kim et al., J. Biol. Chem. 281(10):6261-6272 (2006)]; [Yoko-o et al., FEBS Letters 489(1):75-80 (2001)]; 및 [Nakayama et al., EMBO J 11(7):2511-2519 (1992)]을 참조한다. 따라서, OCH1 활성이 결여된 세포를 내열성이 되도록 변형하는 것이 바람직하다.

본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 분비를 위해 그를 유도하는 신호 펩티드를 갖는 알파-1,2-만노시다제를 코딩하는 핵산을 포함하도록 추가로 유전자 조작된다. 예를 들어, 본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 최적 pH가 5.1 내지 8.0, 바람직하게는 5.9 내지 7.5인 외인성 알파-1,2-만노시다제 효소를 발현하도록 조작된다. 본 발명의 실시양태에서, 외인성 효소는 숙주 세포의 소포체 또는 골지 장치로 표적화되고, 여기서 N-글리칸, 예컨대 Man₈GlcNAc₂를 트리밍 (trimming)하여 Man₅GlcNAc₂를 생성한다. 미국 특허 7,029,872를 참조한다. 상기 알파-1,2-만노시다제 활성을 발현하는 하등 진핵 숙주 세포는 당업계에서 설명되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Choi et al., 2003]을 참조한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 당-조작된 하등 진핵 숙주 세포는 OCH1 활성이 결여되고, 알파1,2 만노시다제를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, (i) ATT1 유전자 또는 폴리펩티드의 발현을 감소시키거나 제거하도록, (ii) ATT1 유전자의 돌연변이된 형태를 발현하도록, 또는 (iii) ATT1 유전자 또는 ATT1의 단편을 과다발현하도록 변형된 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 종)는 하나 이상의 베타-만노실트랜스퍼라제 유전자 (예를 들어, BMT1, BMT2, BMT3, 및 BMT4) (미국 특허 7,465,577 참조)를 제거하거나 파괴시킴으로써 또는 간섭 RNA, 안티센스 RNA 등을 사용하여 하나 이상의 베타-만노실트랜스퍼라제를 코딩하는 RNA의 번역을 방지함으로써 알파-만노시다제-내성 N-글리칸을 갖는 당단백질을 제거하도록 추가로 유전자 조작된다.

일부 실시양태에서, (i) ATT1 유전자 또는 폴리펩티드의 발현을 감소시키거나 제거하도록, (ii) ATT1 유전자의 돌연변이된 형태를 발현하도록, 또는 (iii) ATT1 유전자 또는 ATT1의 단편을 과다발현하도록 변형된 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 종)는 하나 이상의 포스포만노실트랜스퍼라제 유전자 (즉, PNO1, MNN4 및 MNN4L1 (예를 들어, 미국 특허 7,198,921 및 7,259,007) 참조)를 제거하거나 파괴시킴으로써 또는 간섭 RNA, 안티센스 RNA 등을 사용하여 하나 이상의 포스포만노실트랜스퍼라제를 코딩하는 RNA의 번역을 방지함으로써 포스포만노스 잔기를 갖는 당단백질을 제거하도록 추가로 유전자 조작된다.

추가로, (i) ATT1 유전자 또는 폴리펩티드의 발현을 감소시키거나 제거하도록, (ii) ATT1 유전자의 돌연변이된 형태를 발현하도록, 또는 (iii) ATT1 유전자 또는 ATT1의 단편을 과다발현하도록 변형된 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 종)는 리슈마니아 (Leishmania) 종 단일-서브유닛 올리고사카릴트랜스퍼라제 STT3A 단백질, STT3B 단백질, STT3C 단백질, STT3D 단백질, 또는 이들의 조합, 예컨대 WO2011/06389에 기재된 것을 코딩하는 핵산을 포함하도록 추가로 유전자 조작된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 이종 폴리펩티드 (예를 들어, 리포터 또는 이뮤노글로불린 중쇄 및/또는 경쇄)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 본 발명은 본 발명의 숙주 세포의 사용 방법, 예를 들어 숙주 세포에서 이종 폴리펩티드의 발현 방법을 추가로 포함한다. 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포는 또한 상기 세포에서 발현되는 폴리펩티드에 특정 글리코실화 패턴을 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 숙주 세포는 N-글리칸을 포함하는 폴리펩티드를 생산하도록 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 고 만노스, 하이브리드 또는 복합-타입 N-글리칸을 생산하도록 조작될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "N-글리칸" 및 "글리코형"은 교환가능하게 사용되고, N-연결된 올리고당, 예를 들어 아스파라긴-N-아세틸글루코사민 연결에 의해 폴리펩티드의 아스파라긴 잔기에 부착된 것을 의미한다. N-연결된 당단백질은 단백질 내의 아스파라긴 잔기의 아미드 질소에 연결된 N-아세틸글루코사민 잔기를 함유한다. 당단백질에서 발견되는 우세한 당은 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, N-아세틸갈락토사민 (GalNAc), N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 및 시알산 (예를 들어, N-아세틸-뉴라민산 (NANA))이다.

N-글리칸은 Man₃GlcNAc₂의 공통적인 오당류 코어를 갖는다 ("Man"은 만노스를; "Glc"는 글루코스를; "NAc"는 N-아세틸을; GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 의미한다). N-글리칸은 "트리만노스 코어", "오당류 코어" 또는 "소수 (pauci) 만노스 코어"로도 언급되는 Man₃GlcNAc₂ ("Man₃") 코어 구조에 부가되는 주변 (peripheral) 당 (예를 들어, GlcNAc, 갈락토스, 푸코스 및 시알산)을 포함하는 가지 (안테나 (antennae))의 수에서 상이하다. N-글리칸은 그의 분지된 구성분에 따라 분류된다 (예를 들어, 고 만노스, 복합 또는 하이브리드). "고 만노스" 타입 N-글리칸은 5개 이상의 만노스 잔기를 갖는다. "복합" 타입 N-글리칸은 일반적으로 "트리만노스" 코어의 1,3 만노스 아암 (arm)에 부착된 적어도 하나의 GlcNAc 및 1,6 만노스 아암에 부착된 적어도 하나의 GlcNAc를 갖는다. 복합 N-글리칸은 또한 임의로 시알산 또는 유도체 (예를 들어, "NANA" 또는 "NeuAc" (여기서 "Neu"는 뉴라민산이고, "Ac"는 아세틸임))로 변형된 갈락토스 ("Gal") 또는 N-아세틸갈락토사민 ("GalNAc") 잔기를 가질 수 있다. 복합 N-글리칸은 또한 "양분하는" GlcNAc 및 코어 푸코스 ("Fuc")를 포함하는 쇄내 치환을 가질 수 있다. 복합 N-글리칸은 또한 종종 "다중 안테나 글리칸"으로 불리는 "트리만노스 코어" 상의 다중 안테나를 가질 수 있다. "하이브리드" N-글리칸은 트리만노스 코어의 1,3 만노스 아암의 말단 상에 적어도 하나의 GlcNAc 및 트리만노스 코어의 1,6 만노스 아암 상에 0 또는 그 초과의 만노스를 갖는다. 다양한 N-글리칸은 또한 "글리코형"으로도 언급된다. "PNGase" 또는 "글리카나제"는 펩티드 N-글리코시다제 F (EC 3.2.2.18)를 의미한다.

본 발명의 실시양태에서, (i) ATT1 유전자 또는 폴리펩티드의 발현을 감소시키거나 제거하도록, (ii) ATT1 유전자의 돌연변이된 형태를 발현하도록, 또는 (iii) ATT1 유전자 또는 ATT1의 단편을 과다발현하도록 변형된 본 발명의 조작된 하등 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 종)는 복합 N-글리칸, 하이브리드 N-글리칸, 및 고 만노스 N-글리칸으로 이루어진 군으로부터 선택되는 N-글리칸을 우세하게 갖는 당단백질을 생산하도록 추가로 유전자 조작된다. 한 실시양태에서, 고 만노스 N-글리칸은 Man₆GlcNAc₂, Man₇GlcNAc₂, Man₈GlcNAc₂, 및 Man₉GlcNAc₂로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 우세하게 Man_{8 -10}GlcNAc₂ N-글리칸을 갖는 당단백질을 생산하도록 조작된다 (실시예 13). 한 실시양태에서, N-글리칸은 Man₅GlcNAc₂ (실시예 13), GlcNAcMan₅GlcNAc₂, GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂, 및 NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, N-글리칸은 Man₃GlcNAc₂, GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂, NANA_(1-4)GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂, 및 NANA_(1-4)Gal_(1-4)Man₃GlcNAc₂로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, N-글리칸은 우세하게 Man₃GlcNAc₂ 구조를 포함한다. 한 실시양태에서, N-글리칸은 우세하게 NANA_(1-4)Gal_(1-4)Man₃GlcNAc₂를 포함한다. 한 실시양태에서, N-글리칸은 우세하게 NANA₂Gal₂Man₃GlcNAc₂를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 갈락토실화된 N-글리칸을 갖는 당단백질을 생산하도록 조작된다 (실시예 1). 한 실시양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 시알릴화된 N-글리칸을 갖는 당단백질을 생산하도록 조작된다 (실시예 2 및 WO2011/149999).

피키아 파스토리스 ATT1 의 특성화

신규한 피키아 파스토리스 유전자 ATT1 (서열 1, acquiring thermal tolerance, 에스. 세레비지아에 GAL4 전사 인자에 오르토로그임) 내의 돌연변이는 ATT1 단백질 생성물의 조기 말단절단을 야기하고, 증가된 내열성을 보인 피키아 돌연변이체의 세트에서 확인되었다. 이들 돌연변이는 이들 돌연변이를 보유하는 피키아 숙주 균주에 대해 온도 내성의 유의한 향상 (즉, 적어도 약 35℃의 온도까지 배양액 내의 안정성) 및 개선된 발효 강건성을 유도하였다 (즉, ATT1 돌연변이체 피키아 균주는 감소된 용해, 연장된 유도/생산기를 보였고, 감소된 단백질 분해에 의한 (proteolytic) 분해 및 요구되는 글리코실화 패턴을 갖는 이종 단백질 생성물을 생산하였다).

균주 품질을 크게 개선하기 위해, 유의하게 개선된 발효 강건성을 갖는 여러 온도-내성 피. 파스토리스 돌연변이체 균주를 온도-내성 돌연변이체의 세트로부터 확인하였다. 비-돌연변이된 당-조작된 모 균주는 일반적으로 페트리 디시 상에서 성장될 때 온도-감수성 표현형을 보이고 (문헌 [Choi et al. 2003]), 생물반응기 내에서 배양될 때 일반적으로 32℃에서 MeOH 유도 24시간 내에 높은 수준의 세포 용해를 보이지만, 본원에서 설명되는 ATT1 돌연변이체 균주는 생물반응기 내에서 배양될 때 32℃에서 유도 후 100시간 초과 동안 세포-용해의 분명한 징후를 보이지 않으면서 생존가능하다. 상기 연장된 유도 기간은 이종 단백질, 예컨대 항체 및 비-항체 치료제의 생산을 위한 바람직한 특질인 다수의 재조합 단백질의 유의하게 증가된 수율 및 품질을 허용한다.

임의의 효모 숙주 균주 내로 조작될 때 상기 ATT1 내의 돌연변이는 발효 강건성을 개선하고, 재조합 단백질 수율을 개선하고, 단백질 생성물 단백질 분해에 의한 분해를 감소시키는 기능을 수행할 수 있다.

실험 방법

유가식 (fed-batch) 발효, IgG 정제, N-글리칸 특성화, 및 다른 모든 분석적 검정은 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Barnard et al. 2010]; [Jiang et al. 2011]; [Potgieter et al. 2009]; [Winston F 2008]). 달리 명시한 경우를 제외하면, 본원에 설명된 모든 1L 생물반응기 발효 실행은 100-120시간의 MeOH 유도 후에 끝나도록 일정을 잡는다. 그러나, 과량의 세포 용해가 관찰되면 발효 실행은 일찍 종결될 것이다. 세포 용해는 현미경 검사에 의해, 또는 상청액 내로 방출된 핵 DNA의 양을 측정함으로써 결정한다 (Barnard, 2010). 상기 적용을 위해, 과량의 세포 용해는 80% 초과의 세포가 현미경 검사에 의해 용해되거나, 또는 상청액 내에 30 마이크로그램/ml 초과의 DNA 농도가 피코그린 검정에 의해 결정된 것으로 정의된다. UV 돌연변이유발을 문헌 (Winston 2008)에 설명된 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, 피키아 균주를 40 ml YSD 액체 배지 내에서 24℃에서 밤새 성장시켰다. 5의 OD₆₀₀에 도달할 때, 10⁶ 내지 10⁷개 세포의 분취액을 100 mm YSD 아가 페트리 디시의 표면 상에 옮기고, 덮개를 벗긴 상태에서 5 mJ/cm²의 UV 방사선으로 처리하였다. UV 처리 후에, 페트리 디시를 알루미늄 호일로 즉시 덮고 (광-유도 DNA 복구를 방지하기 위해), 돌연변이된 세포를 24℃에서 18시간 동안 암소에서 회수하였다. 이어서, 이들 회수한 세포를 온도-내성 돌연변이체에 대해 선택하기 위해 35℃ 인큐베이터에 옮겼다. 35℃에서 7-10일 인큐베이션 후에, 콜로니를 집어내고, 신선한 YSD 플레이트에 재스트리킹하고, 35℃에서 인큐베이션하고, 재스트리킹시에 온도-내성 표현형을 보이는 클론만을 온도-내성 돌연변이체로서 유지하였다.

실시예 1

온도-내성 돌연변이체는 실질적으로 향상된 발효 강건성 및 생산성을 보였다.

2개의 온도-감수성의 당-조작된 빈 (empty) 숙주 균주인 YGLY17108 및 YGLY22835를, 증가된 발효 강건성을 갖는 피키아 숙주 균주를 확인하기 위해 본원에서 설명되는 바와 같이 UV 돌연변이유발에 적용하였다. 숙주 균주 YGL17108은 우세하게 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸을 갖는 갈락토실화된 당단백질을 생산하도록 조작되었다 (문헌 [Bobrowicz et al. 2004], 및 미국 특허 7,795,002). 숙주 균주 YGL22835는 우세하게 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸을 갖는 시알릴화된 당단백질을 생산하도록 조작되었다 (문헌 [Hamilton et al. 2006] 및 WO2012/115904). 당-조작된 숙주 균주 YGLY17108은 본래 균주 YGLY7965를 생성하기 위해 WO2011/06389에 기재된 바와 같이 일련의 변형을 통해 NRRL-Y11430 균주로부터 유도되었다. YGLY6903으로 시작하여 숙주 균주 YGLY17108로 종료되는 추가로 변형된 균주에 대한 유전자 배경 및 균주 계통을 도 7에 제시한다. YGLY6903으로부터 YGLY22835 및 YGLY17159로 이어지는 유전자 배경 및 균주 계통을 도 9에 제시한다. UV 돌연변이유발 실험으로부터 얻은 균주에 대한 개요를 도 8에 제시한다.

온도-내성 콜로니를 선택하고, 발효 공정 동안 균주 강건성을 평가하기 위해 1.0L DasGip 생물반응기에서 표준 MeOH 유가식 실행을 사용하여 발효시켰다 (문헌 [Hopkins et al. 2011]). 광범위한 발효 스크리닝 후에, 급격히 향상된 발효 강건성을 보이는 4개의 돌연변이체 YGLY17172, YGLY17177, YGLY17178, 및 YGLY17159를 확인하였다 (표 1). 비-돌연변이된 모 균주 YGLY17108 및 YGLY22835 둘 모두는 32℃에서 유도 24시간 내에 심한 용해 및 세포 생존성의 큰 상실을 겪었다 (표 1에 5의 용해 점수로 표시되고, 이것은 매우 다량의 세포 용해를 나타냄). 이와 반대로, 4개의 온도-내성 돌연변이체 (YGLY17172, YGLY17177, YGLY17178, 및 YGLY17159)는 모두 급격히 개선된 발효 강건성을 보였고, 32℃에서 유도 후 100시간 초과 동안 생존가능하였고, 세포-용해는 거의 관찰되지 않았다 (표 1에 제시된 바와 같이 용해 점수 5에서 벗어난 2 미만). 0.5-5.0의 용해 점수는 현미경 검사를 기초로 하여 지정되었다. 0.5의 용해 점수는 최소 용해 (95% 초과의 무손상 세포)를 나타내고, 5의 용해 점수는 높은 용해 (10% 미만의 무손상 세포)를 나타낸다.

실시예 2

향상된 내열성 및 발효 강건성을 담당하는 원인 ( causative ) 돌연변이(들)을 확인하기 위한 게놈 서열분석

증가된 내열성 및 발효 강건성을 담당하는 돌연변이를 확인하고 특성화하기 위해 4개의 독립적으로 단리된 돌연변이체 및 모 균주에 대한 게놈 서열분석을 수행하였다. 돌연변이체 및 대응하는 모체 사이의 게놈 전체에 걸친 비교 후에, 1 내지 9개의 비-동의 (non-synonymous) 뉴클레오티드 변경 (표 2에 "+"로 표시됨)을 각각의 이들 4개의 돌연변이체에서 확인하였다. 대부분의 이들 비-동의 돌연변이는 YGLY17159 돌연변이체에서 발견되는 5 bp 삽입이라는 하나의 예외를 제외하고 단일-뉴클레오티드 변이체에 의해 야기된다. 하나의 돌연변이체, 즉 YGLY17178은 ATT1 (내열성 획득)로 명명된 비특성화된 전사 인자 내의 단일 무의미 돌연변이인 하나의 비-동의 SNV만을 함유하였다. ATT1 유전자 내의 무의미 또는 프레임-시프트 돌연변이가 또한 다른 3개의 돌연변이체에서 확인되었고, 이것은 상기 전사 인자 내의 돌연변이가 온도 내성 및 발효 강건성 표현형과 연관됨을 나타낸다.

4개의 모든 돌연변이 (3개의 무의미 돌연변이 및 하나의 프레임-시프트 삽입)는 아미노산 31, 107, 164, 또는 655 다음에서 조기 유전자-생성물 말단절단을 야기하였다 (도 1a-b). 도 1a-b는 ScGAL4와 PpATT1 사이의 서열 상동성을 보여준다. 아미노산 31의 기호 "#"은 YGLY17159에서 발견되는 5 bp 삽입의 위치를 나타내고, 기호 "@"는 YGL17178 (아미노산 107의), YGL17177 (아미노산 164) 및 YGLY17172 (아미노산 655)로부터 확인된 중지 코돈 돌연변이를 나타낸다. ScGAL4는 빵 효모에서 갈락토스 대사 효소의 조절에 관여하는 핵심 전사 인자이다 (문헌 [Traven et al. 2006]). 피키아 파스토리스는 갈락토스를 대사하지 않고, 따라서 피키아 내의 상기 ATT1 유전자의 생물학적 기능은 본원이 출원되었을 때 여전히 알려지지 않았다.

피키아 ATT1 유전자 (서열 1)은 995개 아미노산의 단백질 생성물 (서열 7)을 코딩하고, 이것은 도 1a-b의 정렬에서 제시된 바와 같이 에스. 세레비지아에 GAL4 DNA-결합 도메인에 고도로 상동성인 N-말단 도메인 (아미노산 잔기 39 내지 114), 아미노산 잔기 351-519의 보존된 진균 특이적 전사 인자 도메인, 및 에스. 세레비지아에 GAL4 유전자 생성물의 C-말단에 대한 낮은 수준의 보존을 공유하는 C-말단 영역을 함유한다.

3개의 돌연변이체, 즉 YGL17172, YGL17177, 및 YGL17178은 말단 갈락토스를 갖는 복합 N-글리칸 형태를 생산하도록 조작된 모 숙주 균주 YGL17108로부터 유래된 것이다 (문헌 [Bobrowicz et al. 2004], 및 미국 특허 7,795,002). 제4 돌연변이체인 YGL17159는 숙주 균주 YGL22835로부터 유래되고, 이는 완전히 시알릴화된 N-글리칸을 생산할 수 있다 (문헌 [Hamilton et al. 2006], 및 미국 특허 출원 61/446,853). 단리된 돌연변이체로부터 얻은 N-글리칸 프로파일과 그의 각각의 모체의 프로파일의 비교는 돌연변이체로부터의 단리된 N-글리칸 조성이 그의 비-돌연변이된 모 균주로부터 얻은 N-글리칸 프로파일과 실질적으로 구별하기 어려움을 보여주었고, 이것은 모든 4개의 돌연변이체가 복합 인간 글리칸을 제조하는 그의 능력을 보유함을 확인해준다. YGL17108, YGL17177, YGLY22835, 및 YGLY17159의 대표적인 N-글리칸 MALDI 트레이스를 도 2a-d에 제시한다. 돌연변이체 YGLY17172 및 YGLY17178의 N-글리칸 프로파일은 돌연변이체 YGL17177의 것과 구별하기 어렵다.

실시예 3

돌연변이체 YGLY17159 에서 재조합 단백질 발현

증가된 발효 강건성 표현형이 재조합 단백질 생산 (예를 들어, 이종 단백질 생산) 동안 보유됨을 입증하기 위해, 2개의 상이한 재조합 단백질 (IgG4 mAb 및 Fc-융합 단백질)로 돌연변이체 균주 YGLY17159를 형질전환시켰다. mAb-발현 균주는 AOX1-프로모터의 제어 하에 1F11 IgG4 중쇄 및 카파 경쇄 둘 모두를 갖는 플라스미드 pGLY8045 (도 3a)를 YGLY17159의 TRP2 유전자좌 내로 전기천공에 의해 통합시킴으로써 구축하였다. 유사하게, Fc-융합체 발현 균주는 AOX1p-유도 TNFR-Fc 융합 유전자를 보유하는 플라스미드 pGLY6391 (도 3b)을 YGL17159의 THR1 유전자좌 내로 통합시킴으로써 생성하였다. 1L DasGip 생물반응기에서 24℃ 및 32℃에서 표준 플랫폼 조건 하에 발효 후에 (문헌 [Hopkins et al, 2011]), 모체 및 돌연변이체 둘 모두로부터 분비된 재조합 단백질 생성물을 정제하고 평가하였다.

표 3의 결과는 재조합 단백질 발현 돌연변이체가 모 균주에 비해 유도 기간 동안 우수한 강건성 및 연장된 균주 안정성을 보유함을 보여주고, 이것은 유의한 생성물 수율 개선으로 해석되었다. 24℃에서, 돌연변이체 균주는 유사한 조건 하에 모 대조군 세포에서의 발현에 비해 돌연변이체 균주에서 IgG4 항체에 대해 약 100%의 역가 증가, 및 Fc-융합체에 대해 약 70%의 역가 증가를 보였다.

실시예 4

유도된 균주 조작에 의한 표현형의 확인

각각의 돌연변이체에서 동일한 유전자 내의 독립적인 돌연변이는 상기 ATT1 전사 인자의 말단 절단이 관찰된 온도-내성 및 발효 강건성 표현형을 담당함을 강하게 나타내었다. 상기 결론을 확인하기 위해서, ATT1 ORF를 완전하게 제거하거나, 또는 내인성 ATT1 유전자를, 5FOA 역선택에 의해 YGLY17108로부터 유래된 비-돌연변이된 ura5 영양요구체 피키아 균주인 YGLY21203에서 도 5에 도시된 말단절단된 버전으로 교체하였다.

플라스미드 pGLY5933 (도 4a)은 ALG3 종결인자 (terminator) 앞에 ATT1 ORF의 바로 상류의 2 kb 게놈 DNA 단편, 이어서 lacZ-URA5-lacZ URAblaster를 클로닝한 후, ATT1 ORF (서열 1)의 마지막 285 bp + 하류 영역의 1.6kb를 함유하는 1.9kb 게놈 DNA 단편에 연결함으로써 구축하였다. SfiI 소화 후에, 상기 ATT1-상류-URAblaster-ATT1-하류 DNA 단편으로 비-돌연변이된 숙주 균주 (예를 들어, YGLY17108)를 형질전환시켰다. ATT1 상류 및 하류 영역 둘 모두에서의 상동성 재조합에 의해, 상기 URAblaster-카세트는 내인성 ATT1 유전자를 교체하고, 90%의 ATT1의 코딩 영역을 제거하고, 따라서 완전한 ATT1 녹아웃 (knock-out) 돌연변이체를 생성하였다. ATT1 ORF의 적절한 교체를 확인하기 위해서, 게놈 DNA 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 검정을 PCR 프라이머로서 다음 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행하였다: "TTTCGAAAGTGGCTTGGAAT" (서열 12, ATT1 출발 위치의 2370 bp 상류) 및 "TGGGGAGAAGGTACCGAAG" (서열 13, ALG3 종결인자 내) - 유전자-교체의 5' 연결 확인; "CACTACGCGTACTGTGAGCC" (서열 14, lacZ 내) 및 "GCTTGGTACGGTAGCCTCAA" (서열 15, ATT1 중지 코돈의 2014 bp 하류) - 유전자-교체의 3' 연결; + "AGTCTGCGCTTTCCATGTCT" (서열 16, ATT1 출발 위치의 365 bp 상류) 및 "GGCCTGGAGATATTGGGATT" (서열 17, ATT1 ORF 내, 1070 bp 뒤) - 야생형 ATT1 ORF의 부재 확인.

플라스미드 pGLY5947 (도 4e)은 ALG3 종결인자 서열 앞의 2.3 kb DNA 단편 (2.0 kb 상류 영역, ATT1 ORF의 처음 321 bp + 2개의 중지 코돈), 이어서 lacZ-URA5-lacZ URAblaster를 클로닝한 후, ATT1 ORF의 마지막 285 bp + 하류 영역의 1.6kb를 함유하는 1.9kb 게놈 DNA 단편에 연결함으로써 구축하였다.

pGLY5947의 SfiI-단편 (도 4e)과 염색체 ATT1 영역 사이의 상동성 재조합-매개 이중-교차는 내인성 ATT1 ORF를 처음 107개의 아미노산 잔기만을 갖는 ATT1의 말단절단된 버전으로 교체하였다. 유사하게, 플라스미드 pGLY5948 (도 4f) 및 pGLY5949 (도 4g)는 각각 ATT1 ORF (서열 1)의 처음 492 bp 또는 1965 bp를 함유하고, 상동성 재조합-매개 이중-교차는 내인성 ATT1 ORF를 말단절단체 1-164 (서열 10) 또는 1-655 아미노산 (서열 11)을 코딩하는 ATT1의 말단절단된 영역으로 교체할 것이다.

플라스미드 pGLY5934 (도 4b)는 ATT1 ORF의 31번째 아미노산 잔기 다음에 5 bp (TGAATC, 서열 18) 프레임-시프트 삽입을 또한 함유한다는 점을 제외하고 pGLY5947에 거의 동일하고; 플라스미드 pGLY5935 (도 4c)는 ATT1 단편 (서열 8)을 코딩하는, ATT1 (서열 7)의 31번째 아미노산 다음에 동일한 5 bp (TGAATC, 서열 18) 프레임-시프트 삽입을 또한 함유한다는 점을 제외하고 pGLY5948 (도 4f)에 거의 동일하다.

DNA 구축물이 내인성 ATT1 유전자를 상응하는 결실 또는 말단절단체로 정확하게 교체함을 확인한 후, 35℃에서 성장하는 능력을 조사하였다. 이들 ATT1Δ 말단절단 및 결실 돌연변이체는 UV 돌연변이유발에 의해 단리된 원래의 돌연변이체로부터 관찰되는 것과 매우 유사한 온도-내성 표현형을 보임이 확인되었다 (도 6a-c).

다음으로, 말단절단 및 결실 돌연변이체를 증가된 발효 강건성을 또한 보이는지 결정하기 위해서 표준 DasGip MeOH 유가식 발효 실행에 적용하였다 (문헌 [Hopkins et al., 2011]). 이들 균주의 발효 강건성을 결정하기 위해, 그의 용해 점수를 32℃에서 소정 기간의 유도 후에 측정하였다. 0.5-5.0의 용해 점수는 현미경 검사를 기초로 하여 지정되었다. 0.5의 용해 점수는 최소 용해 (95% 초과의 무손상 세포)를 나타내고, 5의 용해 점수는 높은 용해 (10% 미만의 무손상 세포)를 나타낸다. 이전에 관찰된 바와 같이, YGLY17108 대조군 균주는 심한 용해를 보였고, 32℃에서 MeOH 유도 24시간 내에 생존가능하지 않았다. 이와 대조적으로, ATT1 유전자의 완전한 결실 및 다양한 말단절단을 보유하는 균주는 발효 강건성의 현저한 증가를 보였고, 4일의 MeOH 유도를 성공적으로 완료하였다 (표 4). ATT1 (1-164aa, 서열 10) 및 ATT1 (1-655aa, 서열 11) 말단절단 돌연변이체는 유도기의 보다 늦은 단계 동안 약간 더 높은 정도의 세포 용해 (용해 점수 2.5 또는 3)를 보였다 (표 3 참조). 완전한 결실 및 ATT1 프레임-시프트 (31aa에 5bp 삽입) 돌연변이체를 포함하는 균주는 최고 수준의 발효 강건성을 보였고, 용해 점수가 4일의 유도기 내내 0.5이었다. 31aa에 5bp 삽입을 보유하는 균주가 ATT1 결실 돌연변이체와 동일한 강건성을 보인다는 발견은 5bp 프레임-시프트 돌연변이가 ATT1 유전자 생성물의 기능을 완전히 파괴할 가능성을 나타내었다. 다른 한편으로, ATT1의 ATT1 (1-164aa, 서열 4에 의해 코딩되는 서열 10) 및 ATT1 (1-655aa, 서열 5에 의해 코딩되는 서열 1l) 말단절단된 형태는 전사 활성의 일부의 잔류 수준을 계속 보유할 수 있었고, 그 이유는 이들 말단절단을 보유하는 돌연변이체가 모 대조군보다 급격히 더 강력하지만 결실 돌연변이체만큼은 강하지 않은 중간 표현형을 보이기 때문이다. 이들 유도된 유전자-교체 균주가 보인 표현형은 상응하는 UV-유도 돌연변이체가 보인 것과 매우 유사하였고 (예를 들어, 표 4 및 도 6a-c에서 YGLY27601을 YGLY17159와; YGLY27608을 YGLY17177과; YGLY27610을 YGLY17172와 비교), 이것은 ATT1 유전자 내의 돌연변이가 UV-유도 돌연변이체로부터 관찰된 개선된 내열성 및 발효 강건성을 담당함을 보여준다.

실시예 5

피. 파스토리스 ATT1 ORF 및 말단절단된 대립유전자를 과다발현하기 위한 플라스미드의 구축

피. 파스토리스 TEF 프로모터 (서열 6)을 올리고뉴클레오티드 및 젠스크립트 (Genscript, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)에 설명된 바와 같은 제조자의 방법을 사용하여 합성하고, 제한 부위 BglII/EcoRI을 사용하여 플라스미드 pGLY8369 (도 10) 내로 클로닝하여 플라스미드 pGLY9959 (도 11)를 생성하였다. 플라스미드 pGLY8369는 피. 파스토리스 AOX1 프로모터 및 아비산염에 대한 내성을 부여하는 선택가능 마커로서 에스. 세레비지아에 ARR3 유전자를 함유하는 롤-인 (roll-in) 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)/피. 파스토리스 셔틀 플라스미드이다. 피. 파스토리스 야생형 ATT1 개방 리딩 프레임 (Pp01g00680, 서열 1)을 젠스크립트 및 제조자의 방법에 의해 올리고뉴클레오티드를 사용하여 합성하고, 제한 부위 EcoRI/FseI를 사용하여 pGLY8369 (도 10) 및 pGLY9959 (도 11) 내로 삽입하여 각각 플라스미드 pGLY9955 (도 14a) 및 pGLY9960 (도 14e)을 생성하였다. 서열 7의 처음 107개 아미노산 (1-107 aa, 서열 3), 서열 7의 처음 164개 아미노산 (1-164 aa, 서열 4) 및 서열 7의 처음 655개 아미노산 (1-655 aa, 서열 5)을 코딩하는 ATT1의 말단절단된 버전 또는 단편을, 각각 pGLY9956 (도 14b), pGLY9957 (도 14c), pGLY9958 (도 14d)로 명명된 AOX1-유도 ATT1 말단절단된 대립유전자 함유 플라스미드를 생성하기 위해 pGLY9955 (도 14a)로부터, 및 pGLY9961 (도 14f), pGLY9962 (도 14g), pGLY9963 (도 14h)으로 명명된 TEF-유도 ATT1 말단절단된 대립유전자 함유 플라스미드를 생성하기 위해 pGLY9960 (도 14e)으로부터 후속적으로 생성하였다.

실시예 6

당-조작된 피. 파스토리스 균주 내에서 항- Her2 모노클로날 항체의 생성

플라스미드 pGLY5883을 트라스투주맙 항-HER2 모노클로날 항체의 κ 및 γ 쇄을 코딩하는 DNA 서열 (Carter, 1992)을 개별적으로 피. 파스토리스 AOX1 프로모터에 융합시킴으로써 생성하고, 도 12에 제시한다. 상기 플라스미드로부터의 DNA를 SpeI으로 소화시켜 DNA를 선형화하고, 표준 전기천공 방법 (피키아 키트, 인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드)에 의해, 말단 β-1,4-갈락토스를 갖는 복합-타입 인간 N-글리칸을 생산하도록 변형된 피. 파스토리스 당-조작된 균주 YGLY8316 (GFI5.0에 설명됨; 데이비드슨 (Davidson) 미국 특허 7,795,002)을 형질전환시켰다 (균주 계통을 도 13에 제시한다). 클론을 제오신을 함유하는 배지에서 선택하고, 96 딥 웰 플레이트 및 0.5L 식스포스 (Sixfors) 다중발효 발효기 (ATR 바이오테크 (ATR Biotech, 미국 메릴랜드주 로렐); [Barnard, 2010])에서의 표준 배양에 의해 추가로 스크리닝하였다. 1개의 양성 발현 클론을 선발하여 YGLY13979로 명명하였다 (균주 계통을 도 13에 제시한다).

실시예 7

피. 파스토리스 ATT1 개방 리딩 프레임 및 말단절단된 대립유전자의 과다발현은 개선된 균주 생존 및 단백질 역가를 유도한다.

플라스미드 pGLY9955, pGLY9956, pGLY9957, pGLY9958, pGLY9960, pGLY9961, pGLY9962, 및 pGLY9963 (각각 도 14a-h)을 SpeI로 선형화하고, 전기천공 (피키아 키트, 인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드)에 의해 균주 YGLY13979 내로 형질전환시키고, 클론을 1 mM 및 3 mM 아비산나트륨을 함유하는 YSD 배지 상에서 선택하였다. ATT1의 전장 및 다양한 말단절단을 과다발현하는 클론은 YSD 배지 상에서 추가로 단리한 후, AOX1-유도 구축물에 대해 프라이머 RCD1019 (서열 19: 5'-CAGATCTTCCAACATTCGTACACG-3') 및 AOX1seq (서열 20: 5'-GCTTACTTTCATAATTGCGACTGGTTCC-3'), 및 TEF-유도 구축물에 대해 RCD1019 및 TEFseq (서열 21: 5'-CGCAGTCCCACACGCACTCGTACATG-3')를 사용하는 PCR에 의해 목적하는 ATT1 발현 구축물을 함유하는지 확인하였다.

PCR 양성 클론을 선택하고 모 균주 YGLY13979 (도 13, 또한 동일한 항-HER2 mAb를 발현하는)와 함께 애플리콘 (Applikon, 미국 캘리포니아주 포스터 시티) micro24 5 ml 미니-발효기 장치의 변형된 버전 내에서 배양하였다. 접종 배양액은 YSD 플레이트로부터 균주를 인산칼륨 완충제로 pH 6.0으로 완충시킨 3.5 ml의 4% BMGY 배지 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 담은 와트만 (Whatman) 24-웰 유니플레이트 (10 ml, 천연 폴리프로필렌)에 접종함으로써 제조하였다. 접종 배양액을 24℃ 및 650 rpm 교반에서 온도 제어된 진탕기 내에서 약 65-72시간 동안 성장시켰다. 이어서, 1 ml의 24 웰 플레이트에서 성장시킨 접종 배양액 및 4.0 ml의 4% BMGY 배지를 사용하여 Micro24 플레이트 (타입: REG2)의 각각의 웰에 접종하였다. 30 ㎕의 안티포움 (Antifoam) 204 (1:25 희석, 시그마 알드리치)를 각각의 웰에 첨가하였다. Micro24를 Microaerobic1 모드로 작동시키고, 발효를 200% 용존 산소, pH 6.5, 온도 24℃ 및 교반 800 rpm으로 제어하였다. 유도기는 아침에 50 ㎕ 및 오후에 125 ㎕의 메탄올 공급물 용액 (100% [w/w] 메탄올, 5 mg/l 비오틴 및 12.5 ml/l PTM2 염)의 볼러스 샷 (bolus shot)을 첨가함으로써 성장기 후에 용존 산소 (DO) 스파이크 (spike)의 준수 시에 개시되었다. 대략 72시간의 메탄올 유도 후에, 세포 비함유 배양 상청액을 베크만 (Beckman) 스윙잉 버켓 (swinging bucket) 원심분리기에서 2500 x g에서 원심분리에 의해 수거하고, 표준 방법 (Jiang, 2011)에 의해 단백질 A 정제로 처리하였다. 항체를 역상 HPLC에 의해 정량하고, 리터당 단위로 계산하였다. 상청액을 또한 세포 파괴 또는 용해를 정량적으로 측정하는 방법으로서 피코그린 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드) 이중 가닥 DNA 정량 검정으로 처리하였다.

야생형 전장 ATT1 대 1-655aa ATT1 말단절단의 과다 발현을 비교하는 실험에서, 1-655 ATT1 말단절단의 TEF 및 AOX1 프로모터 버전을 비롯한 각각의 6개의 클론을 평가하였다. 6개의 야생형 ATT1 과다발현 균주 중 2개가 YGLY13979 대조군 균주보다 유의하게 더 많은 항체를 생산하였다 (도 16). 대조군 균주는 587.5+/-70 mg/L의 항체를 생산한 반면, 2개의 AOX1-ATT1 전장 과다발현 균주는 각각 806 및 934 mg/L을 생산하였다 (도 16). 유사하게, 2개의 AOX1-ATT1 1-655 과다발현 균주는 또한 각각 906 및 1098 mg/L의 유의하게 더 많은 분비된 mAb를 생산하였다. 더욱이, 모든 AOX1-ATT1 전장 및 AOX1-ATT1 1-655 과다발현 균주에서, 피코그린 검정에 의해 결정할 때 용해는 대조군 균주에 비해 감소하였다 (도 15). 마지막으로, 1-655 ATT1 말단절단은 TEF 프로모터의 제어 하에 발현될 때, 용해는 영향을 받지 않거나 잠재적으로 증가한 반면 (도 15), 모든 클론은 여전히 증가된 수준의 분비된 mAb를 생산하였다 (도 16-17).

실시예 8

단백질 생산성 및 용해에 대한 ATT1 전장 과다발현의 영향은 규모변경가능하다.

항체 생산성에 대한 ATT1 전장 ORF의 과다발현의 영향은 마이크로발효 모델에서 명백하게 입증할 수 있다. 그러나, 이들 모델은 용기 크기, 세포에 대한 전단 및 산화 스트레스, 및 탄소 공급원 공급 방법 (볼러스 대 제한 또는 과잉 공급)을 비롯한 여러 핵심 측면에서 전체 규모 발효 배양과 상이하다. ATT1 과다발현의 규모변경성을 입증하기 위해, 모 (YGLY13979) 및 ATT1 녹아웃 (YGLY27638) 대조군 항-HER2 발현 균주와 함께 ATT1 전장 ORF (FL로서 지정함)를 과다 발현하는 6개의 피키아 균주: (YGLY27927, YGLY27928, YGLY27929, YGLY27930, YGLY27931, 및 YGLY27932)를 이전에 설명된 바와 같이 (문헌 [Hopkins et al., 2011]) 글리세롤 유가식 배양에 이어 24℃에서 제한-메탄올 공급 유도 공정을 사용하여 1L 유가식 Pro 발효기 (DASGIP 바이오툴즈 (DASGIP Biotools, 매국 매사추세츠주 쉬류스베리)) 내에서 배양하였다. 메탄올 유도는 용해가 각각의 균주에 대해 지속하기에는 너무 심각해질 때까지 (113h까지) 지속시켰고, 그 후 세포 비함유 배양 상청액을 베크만 스윙잉 버켓 원심분리기에서 2500 x g에서 원심분리에 의해 수거하고, 표준 방법 (Jiang, 2011)에 의한 단백질 A 정제로 처리하였다. 항체를 역상 HPLC에 의해 정량하고, 리터당 단위로 계산하였다. YGLY13979 모 대조군 균주는 671 mg/L의 분비된 mAb를 생산하였지만, 66 h의 유도 후에 매우 높은 용해를 가졌다 (도 17).

이와 반대로, ATT1 녹아웃 균주는 최소 용해를 가지면서 106 h의 유도에서 1256 mg/L을 생산하였고 (도 17), 이것은 이전의 결과와 일치한다. 유사하게 및 보다 작은 규모 micro24 발효 결과에 일치하게, 2개의 AOX1-ATT1 과다발현 클론은 112 h의 유도에서 각각 1974 및 1960 mg/L을 생산하였고, 이것은 놀랍게도 ATT1 ORF의 과다발현이 보다 큰 규모에서 연장된 유도에서 강건성 및 생산성에 긍정적으로 영향을 미칠 수 있음을 입증한다 (도 17). 추가로, 6개의 ATT1 과다발현 클론 중 3개는 YGLY13979 대조군에 비해 감소된 용해를 보인 한편, 또 다른 클론은 단지 100 h 초과의 유도 후에 용해를 보였다 (도 17). 이들 결과는 재조합 단백질-생산 피키아 균주에서 mAb 생산성에 대한 ATT1 과다발현의 영향이 규모에 비의존성이고, 배양 및 유도 프로토콜의 표준 변동에 의해 영향을 받지 않음을 입증한다.

당-조작된 균주 강건성에 대한 AOX-ATT1 과다발현의 영향을 추가로 설명하기 위해, 2개의 높은 mAb 발현 균주인 YGLY27929 및 YGLY27930을 24℃ 대신에 32℃에서 동일한 프로토콜을 사용하여 동일한 1L 유가식 Pro 발효기 내에서 다시 배양하였다. 이전의 실험에 기반하여, 모 균주 YGLY13979는 대개 메탄올 유도의 24-48 h에 발생하는 발포 및 심각한 세포 용해로 인한 완전한 상실을 가지면서 승온에서 발효할 수 없다. 32℃에서 50h의 메탄올 유도 후에, 2개의 과다발현 균주인 YGLY27929 및 YGLY27930은 ATT1 녹아웃 균주에 대한 842 mg/L에 비해 (73시간의 유도) 473 및 458 mg/L의 항-HER2 mAb를 생산하였다. 과다발현 균주의 용해는 ATT1 녹아웃 균주에 비해 약간 상승하였지만, 중등도의 용해를 하면서 50 h의 유도까지 생존은 당-조작된 항-HER2 발현 모 균주에 비해 유의한 개선을 나타내고, 상기 유전자의 결실/말단절단에 추가로 ATT1의 과다발현의 유용성을 나타낸다.

실시예 6 내지 8에 기재된 균주는 모두 여전히 무손상 상태의 ATT1의 염색체 카피를 갖는다. 그들의 내인성 ATT1 ORF이 결실된 균주 내에서 전장 ATT1 또는 ATT1 말단절단의 과다발현 (둘 모두 AOX1- 및 TEF-프로모터 유도된)은 실시예 6 내지 8에 제시된 바와 같이 세포 강건성 및 생산성에서 유사한 개선을 일으키는 것으로 예상된다.

실시예 9

한세눌라 폴리모르파 ATT1 오르토로그는 피키아 파스토리스에서 ATT1 눌 ( null ) 돌연변이를 기능적으로 보완한다.

에이치. 폴리모르파 ATT1 오르토로그 (진뱅크 EFW98022.1)를 진뱅크 비-중복성 단백질 데이터베이스에 대해 BLAST 서열 유사성 탐색을 수행함으로써 확인하였다. 도 18은 에스. 세레비지아에 Gal4, 피. 파스토리스 ATT1 및 에이치. 폴리모르파 ATT1의 정렬을 보여준다.

에이치. 폴리모르파 (오가태아 파라폴리모르파 (Ogataea parapolymorpha) 또는 피키아 안구스타로도 공지됨)는 이종 재조합 단백질을 발현하기 위해 흔히 사용되는 메틸 요구성 효모이다. 피. 파스토리스와 유사하게, 에이치. 폴리모르파는 또한 갈락토스 대사에 관여하는 대부분의 유전자를 상실했기 때문에 탄소 공급원으로서 갈락토스를 이용하는 그의 능력을 상실하였다. BLAST에 의해 진뱅크 비-중복성 단백질 데이터베이스를 탐색할 때, 단백질의 전체 길이에 걸쳐 41% 아미노산 서열 동일성을 보이는 에이치. 폴리모르파 ATT1 오르토로그 (진뱅크 EFW98022.1)를 확인하였다. 에이치. 폴리모르파 ATT1 오르토로그 (HpATT1)가 PpATT1과 유사한 기능을 수행할지 평가하기 위해, 천연 PpATT1 프로모터의 하류의 HpATT1 개방 리딩 프레임 (ORF)을 클로닝하고, 상기 DNA 구축물을 그의 내인성 ATT1이 이미 결실된 YGLY30547의 URA6 유전자좌에서 안정하게 통합시켰다. 비교를 위해, 에스. 세레비지아에 ATT1 오르토로그 (ScGAL4) ORF를 YGL30547의 URA6 유전자좌에서 또한 유사하게 통합시켰다. 이들 ATT1 오르토로그가 PpATT1 유전자 결실에 의해 유발된 온도-내성 표현형에 대해 어떠한 효과를 갖는지 시험하기 위해, HpATT1 또는 ScGAL4 유전자를 함유하는 독립적인 형질전환체를 무작위로 집어내어, 이들을 정규 YPD 아가 플레이트 상에 붙이고, 허용적 24C 및 비-허용적 35C에서 그들의 성장을 모니터링하였다.

모든 ScGAL4-함유 클론은 모 YGLY27611와 같이 온도 저항성으로 남았다. 이들 결과는 본 실험에서 사용된 시험 조건 하에, ScGAL4가 피. 파스토리스에서 PpATT1의 기능을 대체할 수 없음을 나타냈다. 이와 반대로, HpATT1-함유 형질전환체는 35C에서 성장하지 못하였고, 따라서 YGLY30547의 온도-내성 표현형을 다시 온도-감수성으로 복귀시켰다. 이들 결과는 HpATT1이 생체 내에서 PpATT1의 활성을 기능적으로 대체할 수 있음을 입증하였다.

실시예 10

개선된 발효 강건성을 위한 PpATT1 말단절단 스크리닝

세포 강건성에 대한 ATT1 말단절단의 효과를 추가로 탐구하기 위해, 내인성 ATT1 ORF가 결실되고 ATT1 유전자의 다양한 길이의 N-말단 부분을 코딩하는 DNA 카세트로 교체된 일련의 새로운 균주를 구축하였다. DNA 카세트는 그들의 5' 교차 영역 내에, 서열 7의 ATT1 단백질의 N-말단 1-143aa, 1-196aa, 1-216aa, 1-276aa, 1-296aa, 1-341aa, 1-539aa, 1-622aa, 1-655aa, 1-728aa, 1-802aa, 또는 1-828aa를 코딩하는 DNA 단편을 함유한 것을 제외하고는, 실시예 4에 기재된 pGLY5948 또는 pGLY5949와 매우 유사하게 구축하였다. 비교를 위해, 완전한 ATT1 결실 균주, 및 실시예 4에 설명된 ATT1의 N-말단 1-31aa, 1-164aa 단편을 보유하는 균주를 또한 시험하였다.

또한 이들 말단절단된 ATT1 단편이 생성물 역가에 어떻게 영향을 미치는지 검사하기 위해, 이들 DNA 구축물을 항-HER2 mAb를 발현하는 상기 설명된 YGLY13979 균주의 URA5-결여된 유도체인 YGLY19315 내로 형질전환시켰다. ATT1 결실 또는 말단절단을 보유하는 이들 균주를 실시예 4에 설명된 바와 같이 메탄올-제한 유가식 발효 공정을 이용하여 32℃에서 1L 생물반응기 내에서 배양하였다. 세포 용해를 현미경으로 매일 모니터링하고, 과잉의 용해가 관찰될 때 발효를 종결시켰다. 세포 용해 수준이 낮으면, 발효를 100 내지 120시간의 메탄올 유도까지 진행시켰다. 각각의 발효 실행의 끝에, 세포 비함유 상청액을 수집하고, mAb 역가를 실시예 7에 설명된 바와 같이 단백질 A 기반 HPLC 방법을 이용하여 결정하였다.

이들 실험의 결과를 도 19a 및 19b에 제시한다. 전장 ATT1 유전자를 함유한 대조군 균주는 단지 32℃에서 ~40시간의 메탄올 유도에 생존하였다 (도 19a). ATT1 결실 균주는 80시간 초과의 유도로 지속하였고, 이것은 ATT1 활성을 불활성화시키면 발효 동안 발효 강건성을 극적으로 개선하였음을 입증한다. 놀랍게도, ATT1 (1-296 aa) 단편은 발효 동안 임의의 강건성 보호를 제공하지 않았다. 다른 모든 ATT1 말단절단은 발효 강건성을 상이한 정도로 명백하게 개선시켰고, 여기서 1-216aa, 1-341aa, 1-655aa, 1-802aa, 및 1-828aa 단편은 소소한 수준의 개선을 제공하고, 1-31aa, 1-143aa, 1-164aa, 1-196aa, 1-276aa, 1-539aa, 1-622aa 및 1-728aa 단편은 강한 개선을 제공하였다. 모든 말단절단 사이에서, ATT1 (1-164aa) 단편을 함유하는 균주가 이들 발효 실행 동안 최고 수준의 강건성을 보이는 것으로 나타났다. 생성물 역가에 대해 (도 19b), 단지 1-828aa ATT1 단편만이 mAb 역가를 ~100 mg/리터로 유의하게 감소시킨 한편, 다른 ATT1 단편을 함유하는 균주는 ~600 내지 1200 mg/리터 mAb를 생성하였고, 이것은 임의의 ATT1-변형이 없는 균주로부터 관찰된 ~1000 mg/리터 역가와 유의하게 상이하지 않다.

실시예 11

ATT1 (1-31 aa ) 및 (1-164 aa ) 단편은 전장 ATT1 유전자의 존재 하에 우성이다.

실시예 10에서와 같이, ATT1 (1-164aa) 단편을 함유하는 균주는 가장 강건한 표현형을 보였다. 1-164aa 단편은 완전한 DNA-결합 및 이량체화 영역을 함유하지만 단백질의 임의의 전사 활성화 영역이 없기 때문에, 1-164aa 단편은 비-활성 이량체로서 표적 유전자의 프로모터에 결합하고, 이들 표적 유전자를 활성화시킬 수 있는 다른 전사 인자가 결합하는 것을 방지하여, 전사 억제를 일으킬 수 있다. 이러한 경우라면, 1-164aa ATT1 단편이 또한 프로모터-결합을 위해 전장 ATT1 단백질과 경쟁하고 ATT1 정상 전사 활성을 방해할 것으로 예측할 수 있다. 상기 가설을 입증하기 위해, ATT1 (1-164aa)-함유 DNA 구축물을 전장 ATT1 유전자를 보유하는 균주 YGLY13979 내로 도입하고, 1L 생물반응기를 사용하는 발효 동안 세포 강건성에 대한 그의 효과를 검사하였다. 대조군으로서, ATT1 (1-31aa)-함유 DNA 구축물을 YGLY13979 내로 또한 형질전환시켰다. 1-31aa ATT1 단편은 DNA-결합 및 이량체화 도메인의 상류에 있기 때문에 (그리고 ScGAL4 단백질에 부재하기 때문에), YGLY13979 숙주 내에 존재하는 전장 ATT1 유전자의 DNA-결합 및 전사 기능을 방해하지 않을 것으로 예상하였다. 도 19a 및 19b (저변 2개의 막대)에서 보이는 바와 같이, (1-164aa 단편 + ATT1 전장) 및 (1-31aa 단편 + ATT1 전장)을 함유하는 균주는 32℃에서 100시간 초과의 메탄올 유도로 지속하였고, 이것은 1-164aa 및 1-31aa 단편은 둘 모두 우성-방식으로 (즉, 야생형 전장 ATT1의 존재 하에) 세포 강건성 보호를 제공하였음을 입증한다. 1-164aa ATT1 단편의 우성 특성은 상기 설명된 가설과 일치한다. 그러나, 1-31aa 단편은 또한 야생형 ATT1 전장 유전자에 비해 우성-음성 효과를 보인다는 관찰은 놀라운 것이었다.

실시예 12

ATT1 결실 및 말단절단은 15L 생물반응기에서 균주 강건성을 개선하였다.

이전의 모든 실시예에 대해, 1 리터 실험실-규모 생물반응기를 사용하여 발효 강건성을 모두 평가하였다. ATT1-변형이 보다 큰 생물반응기 내에서 동일한 강건성 개선을 제공할지 알아보기 위해, 완전한 ATT1 결실 또는 별개의 ATT1 말단절단을 함유하는 몇몇 균주를 선택하고, 문헌 [Potgieter et al. 2009]에 설명된 바와 같이 24℃에서 15L 생물반응기 내에서 메탄올-제한된 유가식 발효를 수행하였다. 세포 용해, 세포 성장, 및 생성물 역가를 발효 공정 내내 모니터링하고, 일단 세포 성장이 중지되고 세포 용해가 과도해지면 발효 실행을 종결하였다.

도 20에 제시된 바와 같이, 무손상 야생형 ATT1 유전자를 함유하는 대조군 균주 (YGLY13979)는 보통 약 120시간의 유도까지 지속하였고, 이 시점에서 세포 용해가 너무 높아서 지속하지 못하였다.

ATT1 (1-164aa) 단편 및 전장 ATT1 유전자를 동시에 함유하는 YGLY30539는 대조군 균주보다 유의하게 더 강건해졌고, 150시간 초과의 유도에서 생존할 수 있었다. 상기 발견은 1-164aa 단편이 심지어 전장 ATT1 유전자의 존재 하에서도 세포 강건성을 개선할 수 있음을 확인하였다.

전장 ATT1 과다발현 카세트를 함유하는 균주는 또한 대략 동일한 수준의 강건성 개선을 보여주었고, 유도 후 약 170시간 동안 생존가능하였다.

1-655aa ATT1 단편을 함유하는 균주는 보다 뚜렷한 발효 강건성을 갖고, 유도 후 200시간 초과 동안 생존가능하였다.

완전한 ATT1 결실 또는 1-31aa 단편을 보유하는 균주는 훨씬 더 큰 강건성 보호를 제공하였고, 둘 모두 250시간 초과의 유도에서 생존하였다.

놀랍게도, 1-164aa 단편 함유 균주가 최고 수준의 세포 강건성을 보였고, 24℃에서 15L 생물반응기 내에서 340시간 초과의 유도를 마쳤다.

종합적으로, 이들 결과는 상기한 바와 같이 ATT1-결실, 말단절단, 및 선택된 형태의 과다발현이 1L 소규모 생물반응기뿐만 아니라, 15L-규모 생물반응기에서도 또한 발효 실행 동안 세포 강건성을 극적으로 개선할 수 있음을 입증하였다. 이들 발견은 세포 강건성에 대한 이들 ATT1-변형의 효과가 쉽게 규모변경가능하고, 아마도 보다 큰 발효 규모 (즉, 파일럿-플랜트 (pilot-plant) 또는 생산-규모)에서도 또한 동일하게 유지될 것임을 강하게 제안한다.

실시예 13

ATT1 결실은 또한 다른 피키아 균주에서 세포 강건성을 개선한다.

피. 파스토리스 당-조작된 균주 YGLY23506은 GFI2.0 균주이고, 이것은 우세하게 Man₅GlcNAc₂ N-글리칸을 갖는 단백질을 분비한다. (Man₅GlcNAc₂를 분비할 수 있는 다른 피키아 균주의 구축은 문헌 [Choi et al., 2003]에서 이전에 설명되었다). 상기 숙주 균주 계통은 효모 OCH1 유전자뿐만 아니라, 4개의 BMT β-만노실 트랜스퍼라제 유전자 및 포스포만노실 트랜스퍼라제를 비롯한 만노실 트랜스퍼라제 패밀리의 몇몇 다른 구성원의 녹아웃에 의해 순차적으로 변형되었다. 상기 균주 조작은 또한 알파-1,2-만노시다제의 발현을 포함하고, 이것은 균일형 Man₅GlcNAc₂ 형태로 코어 Man₈GlcNAc₂ N-글리칸의 트리밍을 일으킨다. 상기 특정 균주는 또한 에스. 세레비지아에 알파 인자 프레프로 신호 펩티드에 융합된 아미노산 33-556을 함유하는 균주 JR-FL로부터의 N-말단 H9G3 히스티딘-태그부착된 (tagged) 가용성 형태의 HIV gp120을 분비하도록 조작되었다 (문헌 [Varadarajan, 2005]; [Pang, 1991]; 진뱅크 AAB05604.1).

이어서, 균주 YGLY23506을 표준 전기천공을 이용하여 플라스미드 pGLY5952 (Ppatt1::ArsR 녹아웃 플라스미드; 도 21)로 형질전환시키고, 1 mM 아비산나트륨을 함유하는 YSD 배지 상에서 클론을 선택하였다. 양성 녹아웃 클론을 상기 설명된 바와 같이 PCR에 의해 확인하였다. PCR에 의해 균주 YGLY30447, YGLY30448, YGLY30449, 및 YGLY30450이 YGLY23506으로부터 유래한 GFI2.0 att1Δ 클론으로서 저장된 것을 확인하였다.

피. 파스토리스 당-조작된 균주 YGLY23512는 GFI1.0 균주이고, 이것은 우세하게 Man_{8 -10}GlcNAc₂ N-글리칸을 갖는 단백질을 분비한다. (Man_{8 -10}GlcNAc₂를 분비할 수 있는 다른 피키아 균주의 구축은 문헌 [Choi et al., 2003]에서 이전에 설명되었다). 상기 숙주 균주 계통은 YGLY23506에 유사한 효모 N-글리코실화 기구의 녹아웃에 의해 변형되었지만, 상기 균주는 알파- 만노시다제를 발현하지 않는다. 상기 특정 균주는 또한 본 경우에 에스. 세레비지아에 알파 인자 프레 신호 펩티드에 융합된, 균주 YGLY23506에 유사하게 N-말단 H9G3 히스티딘-태그부착된 가용성 형태의 HIV gp120를 분비하도록 조작되었다. 균주 YGLY23512를 표준 전기천공을 이용하여 플라스미드 pGLY5952 (도 21, Ppatt1::ArsR 녹아웃 플라스미드)로 형질전환시키고, 1 mM 아비산나트륨을 함유하는 YSD 배지 상에서 클론을 선택하였다. 양성 녹아웃 클론을 상기 설명된 바와 같이 PCR에 의해 확인하였다. PCR에 의해 균주 YGLY30451, YGLY30452, YGLY30453, 및 YGLY30454가 YGLY23512의 GFI1.0 att1Δ 클론으로서 저장된 것을 확인하였다.

이들 GFI2.0 및 GFI1.0 당-조작된 균주의 강건성을 평가하기 위해, 균주 YGLY23506, YGLY23512 및 이들 균주의 att1Δ 버전을 1L 발효로 배양하였다.

발효 실행을 1L (0.75L 작업 부피) 생물반응기 (사르토리우스 (Sartorius)) 내에서 수행하였다. 1L 시스템을 pH, 온도, 및 용존 산소 농도의 닫힌 루프 제어를 갖는 사르토리우스 바이오스탓 (Biostat) Q 제어기에 의해 제어하였다. 진탕 플라스크 배양액을 48h 동안 진탕하면서 24℃에서 1.0L 배플이 장치된 플라스크 내에서 4% BSGY 배지 내에서 성장시켰다. 이어서, 진탕 플라스크 배양액을 2의 초기 OD600에서 0.75L의 BSGY 배지를 담은 1.0L 사르토리우스 용기 내로 무균적으로 옮겼다. 표준 피키아 배지 성분을 포함하는 표준 글리세롤-대-메탄올 유가식 공정을 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Potgieter et al, 2008]). 전이기의 끝에, 2.5 mg/mL 펩스타틴 A 및 1.59 mg/mL 키모스타틴, 0.64 mg/mL PMTi4를 함유하는 1.33 mL/L의 메탄올의 용량을 메탄올 유도 전에 첨가하였다. 배양 온도를 pt100 센서에 의해 측정하고, 24±0.5℃로 제어하였다. 30% NH₄OH를 사용하여 pH를 배치 및 유가식 배양 동안 6.0±0.1에서 제어하고, 유도기 동안 5.0±0.1에서 유지하였다. 산을 첨가하지 않고, 30% NH₄OH를 사용하여 접종 전에 pH를 설정값에 도달하도록 하였다. 공기 유동을 1L를 위해 0.7 vvm에서 제어하였다. 고정된 공기 유동 속도로 O₂ 첨가까지 단계적인 교반 속도 (450 - 1200 rpm)에 의해 20%의 DO 설정값 (대기 조건에서 공기로 포화된 값의, 1.7 mg/L)을 실행 전체에서 유지하였다. 발포는 초기 배치 배지 내에 소포제 (안티포움 204, 시그마-알드리치)의 첨가에 의해 제어하였다. 0.128 g/L의 소포제의 초기 충전을 접종 전에 배지에 첨가하였다. PTM2 및 비오틴을 함유하는 100% 메탄올의 일정한 공급을 전이기 후에 일정한 공급 속도 (1.5 g/l/hr)로 개시하였다. pH는 120 min 내에 6에서 5로 점차 감소시켰다 (60 min 내에 6.5로, 한편 추가의 60 min 내에 7로 직선 증분). 온도는 24℃에서 유지하였다. 유도 24시간마다, 2.5 mg/mL 펩스타틴 A 및 1.59 mg/mL의 키모스타틴을 함유하는 1.33 mL/L의 메탄올을 첨가하였다. 유도의 끝에, 모든 제어 및 펌프를 중지하였다. 수거는 실온에서 수행하였다. 이어서, 일차 청정화를 원심분리에 의해 수행하였다. 전세포 브로쓰를 800 ml 원심분리병에 옮기고, 4℃에서 30분 동안 13,000xg (8500RPM)에서 원심분리하였다.

5 ml의 브로쓰를 제거하고, 테이블탑 원심분리기에서 원심분리하고, 분석을 위해 상청액을 제거함으로써 유도 전에 시작하여 대략 24 h마다 각각의 발효기로부터 샘플을 취하였다.

균주 YGLY23506, 분비형 HIV gp120을 발현하는 모 ATT1 WT GFI2.0, 및 균주 YGLY30447, YGLY30448, YGLY30449, 및 YGLY30450, YGLY23506의 att1Δ 클론으로부터의 발효 배양된 상청액을 표준 수단에 의해 SDS-PAGE 상에서 분리하고 쿠마시 염색하였다. 염색된 SDS-PAGE 겔을 도 22에 제시한다. att1 녹아웃 균주에서 가시적인 상청액 단백질은 18 h의 유도 후에 상청액 단백질의 무거운 부하 (burden)로부터 명백한 바와 같이 모 균주가 광범하게 용해하기 시작할 때 특히 메탄올 유도가 개시된 후에 모 GFI2.0 균주에 비해 유의하게 감소한다. 상기 발효는 66 h의 유도 후에 광범위한 용해 때문에 끝났다. 이와 반대로, att1Δ 균주는 18 h에서 YGLY23506 모 균주에 비해 80 h 초과의 유도 후에 여전히 단지 소소한 상청액 단백질 부하를 보여주었다 (도 22).

SDS-PAGE에 추가로, 발효 상청액을 이전에 설명된 바와 같이 피코그린 시약 (인비트로젠)을 사용하여 상청액 DNA의 정량에 의해 분석하였다 (Barnard, 2010). SDS-PAGE 결과와 유사하게, 상청액 DNA 검정은 YGLY23506이 att1Δ 클론에 비해 유사한 시점에 유의하게 더 많은 DNA를 축적함을 밝혔다. 더욱이, att1Δ 클론은 192 h의 발효 (159 h의 유도) 후에 중등도의 상청액 DNA 로드를 유지하였고, 이것은 GFI2.0 att1Δ 클론이 표준 피키아 발효 공정 동안 모 ATT1 야생형 GFI2.0 비교체보다 유의하게 더 강건함을 나타낸다 (도 23).

상기 GFI2.0 균주와 유사하게, 균주 YGLY23512, 분비형 HIV gp120을 발현하는 모 ATT1 WT GFI1.0, 및 YGLY30451, YGLY30452, YGLY30453, 및 YGLY30454, YGLY23512의 att1Δ 클론으로부터의 발효 배양된 상청액을 표준 수단에 의해 SDS-PAGE 상에서 분리하고 쿠마시 염색하였다. 염색된 SDS-PAGE 겔을 도 24에 제시한다. att1 녹아웃 균주에서 가시적인 상청액 단백질은 상청액 단백질의 무거운 부하)로부터 명백한 바와 같이 모 균주가 광범하게 용해하기 시작할 때 특히 메탄올 유도가 개시된 후에 모 GFI1.0 균주에 비해 유의하게 감소한다. 상기 발효는 49 h의 메탄올 유도 후에 광범위한 용해 때문에 끝났다. 이와 반대로, att1Δ 균주는 90 h의 유도 후에 매우 이른 유도 시점에 YGLY23512 모 균주에 비해 매우 낮은 내지 소소한 상청액 단백질 부하를 계속하여 보여준다 (도 24).

GFI2.0 균주처럼, SDS-PAGE에 추가로, 상청액 DNA의 정량에 의해 발효 상청액을 분석하였다. 피코그린 검정으로 모 ATT1 야생형 균주 YGLY23512가 att1Δ 클론에 비해 유사한 시점에 유의하게 더 많은 상청액 DNA를 축적함을 밝혔다 (도 25). 더욱이, att1Δ 클론은 193 h의 발효 (165 h의 유도) 후에 중등도의 상청액 DNA 로드를 유지하였고, 이것은 GFI1.0 att1Δ 클론이 표준 피키아 발효 공정 동안 모 ATT1 야생형 GFI1.0 비교체보다 유의하게 더 강건함을 나타낸다 (도 25).

요약

나이브 피키아 온도-감수성 균주에서 ATT1에서의 결실 또는 말단절단은 열-내성 및 발효 강건성 모두에서 유의한 향상을 일으켰다. 실시예 1-4에 기재된 결과는 피키아 ATT1 유전자의 기능 상실이 이들 당-조작된 피키아 균주에서 개선된 열-내성 및 발효 강건성을 위한 유전학적 기초임을 설명한다. ATT1 유전자는 임의의 피키아 균주에서 결실되거나 말단절단되고, 발효 유도기 동안 수여체 균주를 매우 강건하게 만들 수 있어서, 요구되는 속성이 발효 동안 균주 강건성 및 생존성의 증가, 생성물 수율의 개선, 또는 재조합 생성물의 단백질 분해에 의한 분해 감소를 포함하는 경우에 임의의 이종 단백질-발현 피키아 숙주 균주에 대해 넓은 유용성을 제공한다.

놀랍게도, 실시예 5-8 및 11은 관련 생물공정 조건 하에 ATT1을 과다발현하는 조작된 피키아 숙주 균주가 또한 개선된 생존성, 안정성, 및 단백질 생산을 보임을 설명한다 (도 15-17).

현재, 대부분의 시판 생물학적 치료제는 포유동물 세포 숙주를 사용하여 생산된다. 지난 30년에 걸쳐, 생명공학 및 생물제약 산업에서의 총체적인 노력에도 불구하고, 포유동물 세포 배양의 구체적인 생산성은 mAb 생산에 대해 ~50 mg/l 내지 ~5 g/l 범위의 100배 초과에 대해 개선되었다. 그러한 수율 개선에 대한 기여 인자는 포유동물 세포 배양액을 매우 높은 세포 밀도 (10⁵ 내지 10⁷ 세포/ml)로 성장시키는 발전, 및 보다 중요하게는 연장된 기간 (~100시간 내지 ~400시간) 동안 높은 수준의 세포 생존성을 유지하는 능력 때문이었다 (Wurm 2004). ATT1 과다발현, 결실 또는 말단절단을 조작함으로써 피키아 숙주 균주 내에서 세포 강건성 및 생존성을 개선하는 것은 재조합 단백질 치료제에 대한 보다 높은 생산 수율을 가능하게 하고, 재조합-단백질 생산 플랫폼으로서 당-조작된 피키아의 사용을 용이하게 한다.

용어 설명

ScSUC2: 에스. 세레비지아에 인버타제

OCH1: 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제

KlMNN2-2: 케이. 락티스 UDP-GlcNAc 수송체

BMT1: 베타-만노스-전달 (베타-만노스 제거)

BMT2: 베타-만노스-전달 (베타-만노스 제거)

BMT3: 베타-만노스-전달 (베타-만노스 제거)

BMT4: 베타-만노스-전달 (베타-만노스 제거)

MNN4L1: MNN4-유사 1 (전하 제거)

MmSLC35A3: UDP-GlcNAc 수송체의 마우스 오르토로그

PNO1: N-연결된 올리고당의 포스포만노실화 (전하 제거)

MNN4: 만노실트랜스퍼라제 (전하 제거)

ScGAL1O: UDP-글루코스 4-에피머라제

XB33: ScKRE2 리더에 융합된 말단절단된 HsGalT1

DmUGT: UDP-갈락토스 수송체

KD53; ScMNN2 리더에 융합된 말단절단된 DmMNSII

TC54: ScMNN2 리더에 융합된 말단절단된 RnGNTII

NA10: PpSEC12 리더에 융합된 말단절단된 HsGNTI

FB8: ScSEC12 리더에 융합된 말단절단된 MmMNS1A

CiMNS1: 분비된 콕시디오이데스 이미티스 (Coccidioides immitis) 만노시다제 I

STE13: 골지 디펩티딜 아미노펩티다제

DAP2: 액포 디펩티딜 아미노펩티다제

ALG3: 돌리콜-P-Man 의존성 알파(1-3) 만노실트랜스퍼라제

POMGNT1: 단백질 O-만노스 베타-1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제

LmSTT3D: 리슈마니아 주요 올리고사카릴 트랜스퍼라제 서브유닛 D

참고문헌

특허, 특허 출원, 공개문, 제품 설명, 및 프로토콜은 본원 전체에 인용되어 있고, 그 개시내용은 모든 목적을 위해 전문을 본원에 참조로 포함된다. 본원에 인용된 모든 참조문은 각각의 개별 공개문, 데이터베이스 엔트리 (entry) (예를 들어, 진뱅크 서열 또는 GeneID 엔트리), 특허 출원, 또는 특허가 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 참조로 포함된다는 상기 언급은 각각의 및 모든 개별 공개문, 데이터베이스 엔트리 (예를 들어, 진뱅크 서열 또는 GeneID 엔트리), 특허 출원, 또는 특허에 대해 관련되도록 37 C.F.R. §1.57(b)(1)에 따라 본 출원인이 의도한 것이고, 그 각각은 상기 인용이 참조로 포함된다는 전용 언급에 바로 인접하지 않더라도 37 C.F.R. §1.57(b)(2)에 따라 명백하게 확인된다. 명세서 내에, 존재하는 경우에, 참조로 포함된다는 전용 언급을 포함하는 것은 어떠한 방식으로 참조로 포함된다는 상기 일반적인 언급을 약화시키지 않는다. 본원에서 참조문의 인용은 참조문이 관련 선행 기술임을 인정하는 것으로서 의도되지 않고, 또한 이들 공개문 또는 문헌의 내용 또는 일자에 관한 임의의 인정으로 간주되지 않는다.

본 발명은 본원에 설명된 구체적인 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않아야 하고; 본원에 구체적으로 제시된 실시양태는 반드시 완전한 것으로 의도되지는 않는다. 실제로, 본원에서 설명되는 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형이 상기한 상세한 설명 및 첨부한 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 그러한 변형은 첨부된 특허청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

상기한 서면 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 여겨진다. 본원에 제시하고 설명한 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형이 상기한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이고, 첨부된 특허청구항의 범위 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Merck Sharp & Dohme Corp. Jiang, Bo Argvros, Rebecca Nelson, Stephanie Davidson, Robert Chen, Ronghua Zhuang, Jun <120> ENGINEERED LOWER EUKARYOTIC HOST STRAINS FOR RECOMBINANT PROTEIN EXPRESSION <130> 23132-US-PSP <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2985 <212> DNA <213> Pichia pastoris <400> 1 atgcatcata aagaaagact catagatcat atttcttcgg agtctaactt ctccctttcc 60 acttcgtcga tgccgtcctt cagccatgaa tcaaatcaat cgccgaaccc aatgctgatc 120 gaacaagctt gcgattcctg tcgtaagcgc aaattaaggt gttctaagga atacccaaag 180 tgttccaaat gtgtcaccca caaatggagt tgcgtttatt caccaaggac agtgagatct 240 ccgttgacga gagctcatct gaccaaagtg gaaaatcgtg tacgaatgtt ggaagatctg 300 ttggaacgag ttttccctac tcagagtgtc gaccagttac tggaaaagag aaccagtcta 360 tccggcaact ccacggggca ttctccatct tatccaaata gtaattccgt ttccccccag 420 aattcctccc caaaagttag cgactcttcc tcaacgactg ctgaacccgc tccagtcctt 480 ccatccaaac ccaaatcttc attccgtcca atagttccag atgactactt cctgaatgat 540 gaaatcaacg gtttcgattg ggaggaggaa gacaccccag atcaattgtt ggtaatgcag 600 caacctccga 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Ala Ile Gln Arg Cys Phe Asp Ala Ala Arg Glu Ser Val Glu 565 570 575 Leu Ile Ser Ser Phe Trp Ala Gln His Gln Lys Thr Thr Met Ala Cys 580 585 590 Trp Tyr Gly Val Tyr Phe Leu Phe Gln Ala Ile Leu Ile Pro Val Ile 595 600 605 Cys Leu Arg Asn Asn Pro Ser Asp Pro Ala Ala His Gly Trp Arg Glu 610 615 620 Gln Ile Phe Gln Ala Val Asn Thr Leu Glu Ser Met Val Pro Leu Asn 625 630 635 640 Ala Asn Ala Glu Arg Phe Leu Arg Val Ile Gln Ser Leu Cys Gly Cys 645 650 655 Tyr Leu Tyr Pro Arg Ser Asn Gly Trp Glu Gly Pro Ile Gln Glu Ser 660 665 670 Pro Glu Thr Gln Ile Ala Asn Leu Tyr Pro Leu Met Trp Pro Thr Leu 675 680 685 Glu Met Ala Gln Leu Asp Gly Val Asp Ser Ala Leu 690 695 700 <210> 30 <211> 773 <212> PRT <213> Debaryomyces hansenii <400> 30 Met Lys Tyr Glu Glu Arg Gly Ser Ser Val Gln Gln Ala Cys Asp Ser 1 5 10 15 Cys Arg Leu Arg Lys Leu Lys Cys Ser Lys Gly Ser Pro Gln Cys His 20 25 30 Asn Cys Lys Glu His Ser Trp Lys Cys Val Tyr Ser Pro Lys Ala Val 35 40 45 Arg Thr Pro Leu Thr Arg Ala Tyr Leu Thr Arg Val Glu Lys Arg Val 50 55 60 Lys Gly Leu Glu Ser Leu Leu Lys Arg Leu Leu Pro Glu Asp Val Glu 65 70 75 80 Ile Asn Glu Leu Leu Arg Thr Ile Glu Ile Asn Lys Ser His Ser Ile 85 90 95 Asp Gly Asp Ser Gly Gly Gly Val Asp Asp Val Ser Gln Gln Phe Tyr 100 105 110 Lys Gln Ile Asn Leu Thr Ser Asn Glu Leu Ser Glu Ile Pro Ile Thr 115 120 125 Leu Lys Asn Ile Asn Arg Ile Ser Gln Arg Lys Ala Lys Asp Ser Ala 130 135 140 Thr Glu Lys Lys Arg Glu Phe Gln Pro Glu Asp Tyr Leu Ile Asn Ile 145 150 155 160 Glu Lys Ser Asp Leu Asn Ser Phe Asp Glu Arg Asp Asp Phe Asn Ser 165 170 175 Asn Ser Gln Ile Leu Tyr Asp Ser Ser Ile Asp Gly Met Ala Ala Leu 180 185 190 Ser Asn Asp Ile Gly Leu Asn Phe Asp Asn Ser Asn Gly Tyr Phe Gly 195 200 205 Ile Asn Ser Ser Asn Gly Leu Leu Lys Phe Leu Gln Ala Lys Ser Arg 210 215 220 Gln Asn Gly Asn Gly Ile Leu Lys Leu Asn Asn Tyr Asn Tyr Asp Phe 225 230 235 240 Asn Asn Glu Glu Asn Asp Asn Asp His Ile Leu Asp Asp Glu Ile Asn 245 250 255 Asn Ile Trp Lys Ser Ile Asn Ser Gly Lys Ile Glu Asp Leu Leu Asp 260 265 270 Asn Leu Asn Phe Gln Ser Ile Met Val Asn Ser Phe Phe Glu Asn Tyr 275 280 285 Tyr Lys Val Tyr Pro Phe Ile Asn Lys Lys Lys Phe Leu Ser Glu Tyr 290 295 300 Ser Ala Phe Ile Glu Arg Gln Glu Ser Arg Tyr Asn Glu Tyr Asp Leu 305 310 315 320 Asp Leu Asp Ile Asn Glu Asp Asp Asn Lys Val Leu Ser Phe Gln Val 325 330 335 Leu Leu Asn Thr Val Leu Ala Ile Gly Val Trp Cys Lys Val Gly Glu 340 345 350 Asn Ser Lys Ile His Thr Phe Tyr Tyr Gln Arg Val Lys Gly Phe Ile 355 360 365 Gln Leu Leu Asn Ile Phe Glu Tyr Ser Asp Thr Gln Leu Leu Glu Ser 370 375 380 Phe Val Leu Leu Ser Asn Tyr Val Gln Lys Thr Asn Lys Pro Asn Thr 385 390 395 400 Gly Trp Ser Tyr Leu Gly Leu Ser Thr Arg Ile Ala Thr Ser Leu Gly 405 410 415 Leu His Lys Glu Val Arg Ile Asp Lys His Asp Phe Asn Ser Ala Asp 420 425 430 Lys Leu Gly Leu Phe Glu Asp Ile Glu Ile Arg Lys Arg Leu Trp Trp 435 440 445 Gly Met Tyr Phe Phe Asp Val Gly Thr Thr Leu Thr Phe Gly Arg Pro 450 455 460 Leu Thr Ile Pro Pro Leu Gly Thr Ile Asp Leu Glu Pro Val Ser Asn 465 470 475 480 Ile Asp Asp Asn Leu Leu His Gly Ser Lys Asn Ile Glu Glu Cys Ile 485 490 495 Val Thr Tyr Pro Thr Ile Tyr Thr Thr Leu Ile Tyr Glu Ser Glu Leu 500 505 510 Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ile Tyr Asn Tyr Asn Ser Ser Val Leu Lys 515 520 525 Leu Lys Asn Asp Lys Ser Lys Met Ile Gly Leu Leu Asp Met Asn Glu 530 535 540 Leu Leu Glu Asn Phe Val Lys Asn Leu Pro Ser Cys Phe Asp Glu Asn 545 550 555 560 Asp Glu Lys Ser Tyr Ala Tyr Val Leu Asn Ser Trp Ser Ser Asn His 565 570 575 Tyr His Asn Asp Asn Gln Ser Ile Pro Lys Trp Phe Ala Val Ser Arg 580 585 590 Leu Arg Leu Ile Cys Arg Tyr Lys Asn Leu Gln Met Leu Ile Phe Arg 595 600 605 Tyr Ile Leu Trp Glu Ser Thr Asn Asp Asn Ser Phe Asp Leu Ser Tyr 610 615 620 Leu Asn Leu Ile Lys Lys Cys Arg Lys Ala Cys Phe Lys Ser Ser Val 625 630 635 640 Glu Thr Val Ile Leu Ile Asp Asn Phe Ile Lys Arg Asn Glu Leu Asp 645 650 655 Tyr Leu Ser Ser Trp Tyr Ala Thr Tyr Phe Leu Phe Gln Ala Ile Leu 660 665 670 Ile Pro Ile Leu Lys Leu Val Ile Asn Asp Lys Ser Glu Gly Ser Val 675 680 685 Asp Asp Glu Tyr Tyr Ser Asn Asp Glu Glu Leu Phe Asn Tyr Ile Glu 690 695 700 Leu Ser Arg Leu Ser Phe Asp Lys Leu Lys Asn Phe Asn Lys Leu Ala 705 710 715 720 Gly Lys Phe Ser Lys Leu Ile Asp Thr Leu Ile Tyr Asp Lys Lys Asn 725 730 735 Ala Val Asp Phe Met Ser Gln Trp Asn Asp Asp Asn Ile Ser Asn Leu 740 745 750 Asp Ser Val Asn Asn Leu Asp Asp Leu Phe Gln Phe Asp Thr Lys Ile 755 760 765 Phe Asn Leu Asn Ser 770 <210> 31 <211> 794 <212> PRT <213> Zygosaccharomyces rouxii <400> 31 Met Lys Arg Leu Asn Thr Ile Asp His Ala Cys Asp Ser Cys Arg Gln 1 5 10 15 Lys Lys Leu Arg Cys Ser Lys Glu Glu Pro Lys Cys Ala Lys Cys Ile 20 25 30 Gln Asn Gly Trp Glu Cys Cys Tyr Ser Pro Lys Ala Asn Arg Thr Pro 35 40 45 Leu Thr Arg Ala His Met Thr Lys Val Glu Thr Lys Leu Asp Arg Leu 50 55 60 Glu Gln Leu Phe Arg Glu Leu Phe Pro Glu Glu Asp Leu Asp Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Asp Arg Asn Thr Gly Gln Leu Lys Glu Arg Leu Lys Arg Phe 85 90 95 Leu Val Arg Arg Ala Lys Gly Val Gly Asn Asp Arg Met Asp Asp His 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310 315 320 Tyr His Gly His Ala Leu Arg Met Ala Ile Ser Leu Gly Leu His Arg 325 330 335 Asp Leu Pro Pro Glu Gly Ile Pro Asp Val Ile Lys Glu Arg Arg Arg 340 345 350 Arg Ile Trp Thr Cys Leu Tyr Ser His Glu Val His Ser Ala Leu Leu 355 360 365 Asp Gly Arg Pro Leu Gln Tyr Met Phe Phe Asp Asp Gln Val Thr Ile 370 375 380 Ser Leu Pro Asn Ser Val Glu Asp Glu Asn Thr Trp Thr Lys Gly Pro 385 390 395 400 Ser Ile Tyr Met Gly Ala Ile Glu Thr Ala Lys Leu Leu Lys Glu Phe 405 410 415 Gly Tyr Val Trp Phe Val Asp Ser Lys Ile Thr Thr Ser Arg Cys Leu 420 425 430 Gln Leu Cys Gln Arg Leu Asp Ala Cys Gln Lys Ala Met Pro Lys Tyr 435 440 445 Leu Gln Ala Asp Glu His Leu Thr Gly Leu Thr Tyr Tyr Leu Lys Lys 450 455 460 Tyr Pro Trp Ile Ser Phe Ile Arg Phe Tyr Leu Arg Trp Glu Arg Gln 465 470 475 480 Trp Leu Gln Ile Tyr Val Leu Arg Arg Leu Leu Gln Ser Glu Gly Ala 485 490 495 Leu Lys Val Glu Pro Asn Ser Glu Leu Asp Lys Cys Ala Thr Met Leu 500 505 510 Ser Asp Ile Ala Gln Lys Thr Ile Trp Gly Val Ala Asn Tyr Leu Asn 515 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Arg Gln Leu 130 135 140 Thr Val Ser Ile Asp Ser Ala Ala His His Asp Asn Ser Thr Ile Pro 145 150 155 160 Leu Asp Phe Met Pro Arg Asp Ala Leu His Gly Phe Asp Trp Ser Glu 165 170 175 Glu Asp Asp Met Ser Asp Gly Leu Pro Phe Leu Lys Thr Asp Pro Asn 180 185 190 Asn Asn Gly Phe Phe Gly Asp Gly Ser Leu Leu Cys Ile Leu Arg Ser 195 200 205 Ile Gly Phe Lys Pro Glu Asn Tyr Thr Asn Ser Asn Val Asn Arg Leu 210 215 220 Pro Thr Met Ile Thr Asp Arg Tyr Thr Leu Ala Ser Arg Ser Thr Thr 225 230 235 240 Ser Arg Leu Leu Gln Ser Tyr Leu Asn Asn Phe His Pro Tyr Cys Pro 245 250 255 Ile Val His Ser Pro Thr Leu Met Met Leu Tyr Asn Asn Gln Ile Glu 260 265 270 Ile Ala Ser Lys Asp Gln Trp Gln Ile Leu Phe Asn Cys Ile Leu Ala 275 280 285 Ile Gly Ala Trp Cys Ile Glu Gly Glu Ser Thr Asp Ile Asp Val Phe 290 295 300 Tyr Tyr Gln Asn Ala Lys Ser His Leu Thr Ser Lys Val Phe Glu Ser 305 310 315 320 Gly Ser Ile Ile Leu Val Thr Ala Leu His Leu Leu Ser Arg Tyr Thr 325 330 335 Gln Trp Arg Gln Lys Thr Asn Thr Ser Tyr Asn Phe His Ser Phe Ser 340 345 350 Ile Arg Met Ala Ile Ser Leu Gly Leu Asn Arg Asp Leu Pro Ser Ser 355 360 365 Phe Ser Asp Ser Ser Ile Leu Glu Gln Arg Arg Arg Ile Trp Trp Ser 370 375 380 Val Tyr Ser Trp Glu Ile Gln Leu Ser Leu Leu Tyr Gly Arg Ser Ile 385 390 395 400 Gln Leu Ser Gln Asn Thr Ile Ser Phe Pro Ser Ser Val Asp Asp Val 405 410 415 Gln Arg Thr Thr Thr Gly Pro Thr Ile Tyr His Gly Ile Ile Glu Thr 420 425 430 Ala Arg Leu Leu Gln Val Phe Thr Lys Ile Tyr Glu Leu Asp Lys Thr 435 440 445 Val Thr Ala Glu Lys Ser Pro Ile Cys Ala Lys Lys Cys Leu Met Ile 450 455 460 Cys Asn Glu Ile Glu Glu Val Ser Arg Gln Ala Pro Lys Phe Leu Gln 465 470 475 480 Met Asp Ile Ser Thr Thr Ala Leu Thr Asn Leu Leu Lys Glu His Pro 485 490 495 Trp Leu Ser Phe Thr Arg Phe Glu Leu Lys Trp Lys Gln Leu Ser Leu 500 505 510 Ile Ile Tyr Val Leu Arg Asp Phe Phe Thr Asn Phe Thr Gln Lys Lys 515 520 525 Ser Gln Leu Glu Gln Asp Gln Asn Asp His Gln Ser Tyr Glu Val Lys 530 535 540 Arg Cys Ser Ile Met Leu Ser Asp Ala Ala Gln Arg Thr Val Met Ser 545 550 555 560 Val Ser Ser Tyr Met Asp Asn His Asn Val Thr Pro Tyr Phe Ala Trp 565 570 575 Asn Cys Ser Tyr Tyr Leu Phe Asn Ala Val Leu Val Pro Ile Lys Thr 580 585 590 Leu Leu Ser Asn Ser Lys Ser Asn Ala Glu Asn Asn Glu Thr Ala Gln 595 600 605 Leu Leu Gln Gln Ile Asn Thr Val Leu Met Leu Leu Lys Lys Leu Ala 610 615 620 Thr Phe Lys Ile Gln Thr Cys Glu Lys Tyr Ile Gln Val Leu Glu Glu 625 630 635 640 Val Cys Ala Pro Phe Leu Leu Ser Gln Cys Ala Ile Pro Leu Pro His 645 650 655 Ile Ser Tyr Asn Asn Ser Asn Gly Ser Ala Ile Lys Asn Ile Val Gly 660 665 670 Ser Ala Thr Ile Ala Gln Tyr Pro Thr Leu Pro Glu Glu Asn Val Asn 675 680 685 Asn Ile Ser Val Lys Tyr Val Ser Pro Gly Ser Val Gly Pro Ser Pro 690 695 700 Val Pro Leu Lys Ser Gly Ala Ser Phe Ser Asp Leu Val Lys Leu Leu 705 710 715 720 Ser Asn Arg Pro Pro Ser Arg Asn Ser Pro Val Thr Ile Pro Arg Ser 725 730 735 Thr Pro Ser His Arg Ser Val Thr Pro Phe Leu Gly Gln Gln Gln Gln 740 745 750 Leu Gln Ser Leu Val Pro Leu Thr Pro Ser Ala Leu Phe Gly Gly Ala 755 760 765 Asn Phe Asn Gln Ser Gly Asn Ile Ala Asp Ser Ser Leu Ser Phe Thr 770 775 780 Phe Thr Asn Ser Ser Asn Gly Pro Asn Leu Ile Thr Thr Gln Thr Asn 785 790 795 800 Ser Gln Ala Leu Ser Gln Pro Ile Ala Ser Ser Asn Val His Asp Asn 805 810 815 Phe Met Asn Asn Glu Ile Thr Ala Ser Lys Ile Asp Asp Gly Asn Asn 820 825 830 Ser Lys Pro Leu Ser Pro Gly Trp Thr Asp Gln Thr Ala Tyr Asn Ala 835 840 845 Phe Gly Ile Thr Thr Gly Met Phe Asn Thr Thr Thr Met Asp Asp Val 850 855 860 Tyr Asn Tyr Leu Phe Asp Asp Glu Asp Thr Pro Pro Asn Pro Lys Lys 865 870 875 880 Glu

Claims (40)

1. ATT1 유전자의 활성을 감소시키거나 제거하도록 변형된, 조작된 하등 진핵 숙주 세포.
2. 제1항에 있어서, ATT1 유전자의 활성이, (i) ATT1 유전자 또는 폴리펩티드의 발현을 감소시키거나 제거하거나 또는 (ii) ATT1 유전자의 돌연변이된 형태를 발현함으로써 감소하거나 제거되는 것인 숙주 세포.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로테아제 활성, 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제 활성, 알파-1,2-만노실트랜스퍼라제 활성, 만노실포스페이트 트랜스퍼라제 활성, β-만노실트랜스퍼라제 활성, O-만노실트랜스퍼라제 (PMT) 활성, 및/또는 돌리콜-P-Man 의존성 알파(1-3) 만노실트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함하는 숙주 세포.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코시다제, 만노시다제, 포스포만노시다제, 포스파타제, 뉴클레오티드 당 수송체, 뉴클레오티드 당 에피머라제, 만노실트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제, CMP-시알산 신타제, N-아세틸뉴라미네이트-9-포스페이트 신타제, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 및 올리고사카릴트랜스퍼라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 글리코실화 효소를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 추가로 포함하는 숙주 세포.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 숙주 세포.
6. 제5항에 있어서, 재조합 단백질이 항체 (IgA, IgG, IgM 또는 IgE), 항체 단편, 인간 플라스미노겐의 크링글(kringle) 도메인, 에리트로포이에틴, 시토카인, 응고 인자, 가용성 IgE 수용체 α-쇄, 우로키나제, 키마제, 우레아 트립신 억제제, IGF-결합 단백질, 표피 성장 인자, 성장 호르몬-방출 인자, 아넥신 V 융합 단백질, 안지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자-2, 골수성 전구세포 억제 인자-1, 오스테오프로테게린, α-1 항트립신, DNase II, α-페토 단백질, 인슐린, Fc-융합체 및 HSA-융합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 유사한 배양 조건 하의 ATT1 나이브 모 숙주 세포에 비해 배양 안정성, 내열성 및/또는 개선된 발효 강건성의 증가를 보이는 숙주 세포.
8. 제7항에 있어서, 최소 세포 용해를 보이면서 32℃에서 적어도 80시간의 발효 동안 배양액 내에서 생존할 수 있는 숙주 세포.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 당-조작되는 숙주 세포.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, OCH1 활성이 결여되는 숙주 세포.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 진균 숙주 세포인 숙주 세포.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 효모 숙주 세포인 숙주 세포.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 피키아 종(Pichia sp.) 숙주 세포인 숙주 세포.
14. 제13항에 있어서, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)인 숙주 세포.
15. 제14항에 있어서, ATT1 유전자가 서열 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체 (다형체)를 코딩하는 것인 숙주 세포.
16. 제13항에 있어서, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)인 숙주 세포.
17. 제16항에 있어서, ATT1 유전자가 서열 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체 (다형체)를 코딩하는 것인 숙주 세포.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, ATT1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 서열을 발현하도록 추가로 변형된 숙주 세포.
19. 야생형 ATT1 유전자를 그의 천연 게놈 상태로 갖고, ATT1 폴리펩티드 또는 그의 단편의 발현을 증가시키도록 변형된, 조작된 하등 진핵 숙주 세포.
20. 제19항에 있어서, 프로테아제 활성, 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제 활성, 알파-1,2-만노실트랜스퍼라제 활성, 만노실포스페이트 트랜스퍼라제 활성, β-만노실트랜스퍼라제 활성, O-만노실트랜스퍼라제 (PMT) 활성, 및/또는 돌리콜-P-Man 의존성 알파(1-3) 만노실트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 돌연변이, 파괴 또는 결실을 추가로 포함하는 숙주 세포.
21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 글리코시다제, 만노시다제, 포스포만노시다제, 포스파타제, 뉴클레오티드 당 수송체, 만노실트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제, UDP-N-아세틸글루코사민 수송체, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 및 올리고사카릴트랜스퍼라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 글리코실화 효소를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 추가로 포함하는 숙주 세포.
22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 숙주 세포.
23. 제22항에 있어서, 재조합 단백질이 항체 (IgA, IgG, IgM 또는 IgE), 항체 단편, 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인, 에리트로포이에틴, 시토카인, 응고 인자, 가용성 IgE 수용체 α-쇄, 우로키나제, 키마제, 우레아 트립신 억제제, IGF-결합 단백질, 표피 성장 인자, 성장 호르몬-방출 인자, 아넥신 V 융합 단백질, 안지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자-2, 골수성 전구세포 억제 인자-1, 오스테오프로테게린, α-1 항트립신, DNase II, α-페토 단백질, 인슐린, Fc-융합체 및 HSA-융합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 유사한 배양 조건 하의 ATT1 나이브 모 숙주 세포에 비해 배양 안정성, 내열성 및/또는 개선된 발효 강건성의 증가를 보이는 숙주 세포.
25. 제24항에 있어서, 최소 세포 용해를 보이면서 32℃에서 적어도 80시간의 발효 동안 배양액 내에서 생존할 수 있는 숙주 세포.
26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 당-조작되는 숙주 세포.
27. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, OCH1 활성이 결여되는 숙주 세포.
28. 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 효모 숙주 세포인 숙주 세포.
29. 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 피키아 종 숙주 세포인 숙주 세포.
30. 제29항에 있어서, 피키아 파스토리스인 숙주 세포.
31. 제30항에 있어서, ATT1 유전자가 서열 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체 (다형체) 또는 상기 폴리펩티드의 단편을 코딩하는 것인 숙주 세포.
32. 제30항에 있어서, 상기 단편이 서열 7의 아미노산 1-31 및 1-164로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
33. 제29항에 있어서, 한세눌라 폴리모르파인 숙주 세포.
34. 제32항에 있어서, ATT1 유전자가 서열 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 천연 변이체 (다형체)를 코딩하는 것인 숙주 세포.
35. (a) 이종 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 숙주 세포 내로 도입하고; (b) 상기 숙주 세포를 이종 폴리펩티드의 발현에 유리한 조건 하에 배양하고; 임의로 (c) 숙주 세포로부터 이종 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함하는, 조작된 하등 진핵 숙주 세포에서 이종 폴리펩티드를 생산하는 방법.
36. 야생형 또는 돌연변이된 ATT1 유전자 또는 그의 단편을 코딩하는 단리된 핵산.
37. 제36항에 있어서, 상기 핵산을 발현하는 단리된 숙주 세포가 유사한 조건 하의 ATT1 나이브 모 숙주 세포에 비해 배양 안정성, 내열성 및/또는 개선된 발효 강건성의 증가를 보이는 것인 단리된 핵산.
38. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    a. 서열 7 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열,
    b. 서열 8 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열,
    c. 서열 9 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열,
    d. 서열 10 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및
    e. 서열 23 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 핵산.
39. 제37항에 있어서, 상기 단편이 서열 7의 잔기 1-31 또는 1-164를 포함하는 것인 핵산.
40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 단리된 벡터.

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