MX2012009802A

MX2012009802A - Metodo para incrementar la ocupacion del sitio de n-glucosilacion en glucoproteinas terapeuticas producidas en pichia pastoris.

Info

Publication number: MX2012009802A
Application number: MX2012009802A
Authority: MX
Inventors: Natarajan Sethuraman; Terrance A Stadheim; Byung-Kwon Choi; Michael Meehl; Bianka Prinz
Original assignee: Merck Sharp & Dohme
Priority date: 2010-02-24
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2012-09-12
Also published as: EP2539430A4; JP2013520205A; CN102858949B; CN102858949A; US20140227290A1; KR101930961B1; AU2011220878A1; EP2539430B1; JP5976549B2; EP2539430A1; US8715963B2; US20120328626A1; RU2012140429A; WO2011106389A1; KR20120134116A; BR112012020882A2; CA2788992A1

Abstract

Se describe un método para incrementar la ocupación del sitio de N-glucosilación de una glucoproteína terapéutica producida en células hospederas recombinantes modificadas como se describe en la presente, y genéticamente diseñadas para expresar la glucoproteína en comparación con la ocupación del sitio de N-glucosilación de la glucoproteína terapéutica producida en una célula hospedera recombinante no modificada como se describe en la presente; en particular, el método provee células hospederas recombinantes que sobreexpresan una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga, la cual en modalidades particulares es capaz de suprimir funcionalmente el fenotipo letal de una mutación de por lo menos una proteína esencial del complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) de levadura, por ejemplo, la proteína STT3D de Leishmania major, en presencia de la expresión de los genes de la célula hospedera que codifican para el complejo de OTasa endógeno; el método es útil para producir glucoproteínas terapéuticas con ocupación incrementada del sitio de N-glucosilación en células eucarióticas inferiores tales como hongos filamentosos y levaduras, y en células eucarióticas superiores tales como células de planta e insecto y células de mamífero.

Description

MÉTODO PARA INCREMENTAR LA OCUPACIÓN DEL SITIO DE N- GLUCOSILACIÓN EN GLUCOPROTEÍNAS TERAPÉUTICAS PRODUCIDAS EN PICHIA PASTORIS REFERENCIA RECÍPROCA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIAS PRESENTADO ELECTRÓNICAMENTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para incrementar la ocupación del sitio de N-glucosilación de una glucoproteina heteróloga producida en una célula hospedera recombinante modificada de conformidad con la presente invención y genéticamente diseñada para expresar la glucoproteina, en comparación con la ocupación del sitio de N-glucosilación de la glucoproteina terapéutica producida en una célula hospedera recombinante no modificada de conformidad con la presente invención. En particular, la presente invención provee células hospederas recombinantes que sobreexpresan una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga, la cual en modalidades particulares es capaz de suprimir funcionalmente el fenotipo letal de una mutación de por lo menos una proteína esencial del complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) de la levadura en presencia del complejo de OTasa endógeno de la célula hospedera, y métodos para usar estas células hospederas para producir glucoproteínas heterólogas.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA La capacidad para producir proteínas humas recombinantes ha llevado a avances importantes en el cuidado de la salud humana, y continúa siendo un área activa de descubrimiento de fármacos. Muchas proteínas terapéuticas requieren la adición post-traducción de glucanos a residuos de asparagina específicos (N-glucosilación) de la proteína, para asegurar actividad adecuada de estructura-función y estabilidad subsiguiente en el suero humano. Para uso terapéutico en humanos, las glucoproteínas requieren N-glucosilación tipo humano. Las líneas de células de mamífero (por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), células de la retina humana) que pueden imitar el procesamiento de glucoproteínas tipo humano, tienen varios inconvenientes que incluyen bajos títulos de proteína, largos tiempos de fermentación, productos heterogéneos, y contención viral continua. Es por lo tanto deseable usar un sistema de expresión que no sólo produzca altos títulos de proteína con cortos tiempos de fermentación, sino también pueda producir glucoproteínas tipo humano.

Hongos hospederos tales como Saccharomyces cerevisiae o levaduras metilotróficas tales como Pichia pastoris, tienen distintas ventajas para la expresión de proteínas terapéuticas, por ejemplo, no secretan altas cantidades de proteínas endógenas, están disponibles fuertes promotores inducibles para producir proteínas heterólogas, pueden crecer en medios químicos definidos y sin el uso de suero de animales, y pueden producir altos títulos de proteínas recombinantes (Cregg et al., FEMS Microbiol. Rev. 24: 45-66 (2000)). Sin embargo, las proteínas glucosiladas expresadas en levaduras contienen generalmente otros azúcares mañosa que resultan en glucanos de "alto contenido de mañosa". Debido a que estos N-glucanos de alto contenido de mañosa pueden resultar en respuestas adversas cuando se administran a ciertos individuos, no se han usado generalmente levaduras para producir glucoproteínas terapéuticas destinadas para uso en humanos. Sin embargo, métodos para diseñar genéticamente levaduras para producir N-glucanos tipo humano se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 7,029,872 y 7,449,308, junto con los métodos descritos en la solicitud publicada de E.U.A. Nos. 20040230042, 20050208617, 20040171826, 20050208617 y 20060286637. Estos métodos se han usado para construir levaduras recombinantes que pueden producir glucoproteínas terapéuticas que tienen predominantemente N-glucanos híbridos o complejos tipo humano en las mismas en lugar de N-glucanos tipo levadura.

Se ha encontrado que mientras que las levaduras genéticamente diseñadas puede producir glucoproteínas que tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero, la ocupación de los sitios de unión del N-glucano en las glucoproteínas varía ampliamente, y es generalmente menor que la ocupación de estos mismos sitios en las glucoproteínas producidas en células de mamífero. Esto se ha observado para varios anticuerpos recombinantes producidos en Pichia pastorís. Sin embargo, se ha observado también variabilidad de la ocupación de los sitios de unión del N-glucano en células de mamífero. Por ejemplo, Gawlitzek et al., Identification of cell culture conditions to control N-glycosilation site-occupancy of recombinant glycoproteins expressed in CHO cells, Biotechnol. Bioengin. 103: 1 164-1 175 (2009), describieron que la ocupación del sitio de N-glucosilación puede variar para sitios particulares para glucoproteínas particulares producidas en células CHO, y que pueden hacerse modificaciones en las condiciones de crecimiento para controlar la ocupación en estos sitios. La solicitud internacional publicada No. WO 2006107990 describe un método para mejorar la N-glucosilación de proteínas de células eucarióticas usando la vía de síntesis de oligosacáridos enlazados a dolicol. El control de la ocupación del sitio de N-glucosilación ha sido revisado por Jones et al., Biochim. Biophys. Acta. 1726: 121-137 (2005). Sin embargo, existe aún la necesidad de métodos para incrementar la ocupación del sitio de N-glucosilación de proteínas terapéuticas producidas en células hospederas recombinantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un método para producir glucoproteínas terapéuticas en células hospederas recombinantes modificadas como se describe en la presente, en donde la ocupación del sitio de N-glucosilación de las glucoproteínas producidas en células hospederas modificadas como se describe en la presente, es incrementada sobre la ocupación del sitio de N-glucosilación de las mismas glucoproteínas producidas en células hospederas no modificadas como se describe en la presente. Por ejemplo, en células hospederas de levadura modificadas como se describe en la presente, la ocupación del sitio de N-glucosilación de las glucoproteínas producidas en la presente será igual o más similar que la ocupación de sitio de N-glucosilación de las mismas glucoproteínas producidas en células recombinantes de humano o de mamífero.

Para incrementar la ocupación del sitio de N-glucosilación en una glucoproteína producida en una célula hospedera recombinante, una o más oligosacariltransferasas (OTasas) de una sola subunidad heterólogas son sobreexpresadas en la célula hospedera recombinante antes o simultáneamente con la expresión de la glucoproteína en la célula hospedera. En aspectos particulares, por lo menos una de las oligosacariltransferasas de una sola subunidad heterólogas es capaz de complementar funcíonalmente una mutación letal de una o más subunidades esenciales que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno hetero-oligomérico de la célula hospedera. La proteína STT3D de Leishmania major es un ejemplo de una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga que se ha mostrado suprime una mutación letal en el locus STT3 y por lo menos un locus seleccionado de WBP1, OST1, SWP1 y OST2 en Saccharomyces cerevisiae (Naseb et a/., Molec. Biol. Cell 19: 3758-3768 (2008)). En general, las una o más oligosacariltransferasas de una sola subunidad heterólogas son sobreexpresadas constitutivamente o induciblemente en presencia de las proteínas que comprenden el complejo de OTasa endógeno de la célula hospedera, incluyendo la proteína STT3 endógena de la célula hospedera. Cassettes de expresión que codifican para el gen de oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga, pueden ser integrados en cualquier sitio dentro del genoma de la célula hospedera o localizados en el espacio extracromosómico de la célula hospedera, es decir, replicando en forma autónoma elementos genéticos tales como plásmidos, virus, plásmido de 2 µ?t?, minicromosomas, y similares.

En modalidades particulares, una o más de las oligosacariltransferasas de una sola subunidad son la proteína STT3A, proteína STT3B, proteína STT3C, proteína STT3D, o combinaciones de las mismas, de Leishmania sp. En modalidades particulares, las una o más oligosacariltransferasas de una sola subunidad son la proteína STT3A, proteína STT3B, proteína STT3C, proteína STT3D, o combinaciones de las mismas, de Leishmania major. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para las oligosacariltransferasas de una sola subunidad no son sobreexpresadas en lugar de la expresión de los genes endógenos que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de OTasa de la célula hospedera, incluyendo la proteína STT3 de la célula hospedera. Más bien, las moléculas de ácido nucleico que codifican para las oligosacariltransferasas de una sola subunidad son sobreexpresadas constitutivamente o induciblemente en presencia de la expresión de los genes que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno de la célula hospedera, que incluye la expresión del gen endógeno que codifica para la proteína STT3 de la célula hospedera. Cada cassette de expresión que codifica para una OTasa de una sola subunidad puede ser integrado en cualquier sitio dentro del genoma de la célula hospedera, o puede localizarse en el espacio extracromosómico de la célula hospedera, es decir, replicando en forma autónoma elementos genéticos tales como plásmidos, virus, plásmido de 2 µ?t?, minicromosomas, y similares.

La presente invención se ha ejemplificado en la presente usando células hospederas de Pichia pastoris genéticamente diseñadas para producir N-glucanos complejos tipo humano o de mamífero; sin embargo, la presente invención puede aplicarse a otras células hospederas de hongos filamentosos o levaduras, en particular, hongos filamentosos o levaduras genéticamente diseñados para producir N-glucanos híbridos o complejos tipo humano o de mamífero, para mejorar la ocupación del sitio de N-glucosilación general de las glucoproteínas producidas en la célula hospedera de los hongos filamentosos o levaduras. En otros aspectos, las células hospederas son hongos filamentosos o levaduras que producen proteínas heterólogas recombinantes que tienen patrones de N-glucosilación endógenos o de tipo silvestre de la célula hospedera, por ejemplo, N-glucanos hipermanosilados o de alto contenido de mañosa. En otros aspectos, las células hospederas son hongos filamentosos o levaduras que carecen de actividad de alfa-1 ,6-manosiltransferasa (por ejemplo, actividad de ochl p en el caso de varias cepas de levadura tales como, pero no limitadas a, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris), y producen de esta manera proteínas heterólogas recombinantes que tienen N-glucanos de alto contenido de mañosa. Además, la presente invención puede aplicarse también a sistemas de expresión de plantas y mamíferos para mejorar la ocupación del sitio de N-glucosiladón general de las glucoproteínas producidas en estos sistemas de expresión de plantas o mamíferos, en particular glucoproteínas que tienen más de dos sitios de N-glucosilación N-enlazados.

Por lo tanto, en un aspecto de lo anterior, se provee un método para producir una glucoproteína heteróloga en una célula hospedera recombinante, que comprende proveer una célula hospedera recombinante que incluye una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para una o más oligosacariltransferasas de una sola subunidad heterólogas y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína heteróloga; y cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que exprese la glucoproteína heteróloga para producir la glucoproteína heteróloga.

En otro aspecto de lo anterior, se provee un método para producir una glucoproteína heteróloga con N-glucanos híbridos o complejos tipo humano o de mamífero en una célula hospedera, que comprende proveer una célula hospedera que incluye una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para una o más oligosacariltransferasas de una sola subunidad heterólogas y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína heteróloga; y cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que exprese la glucoproteína heteróloga para producir la glucoproteína heteróloga.

En general, en los aspectos anteriores, los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno, son expresados.

En otros aspectos del método anterior, la célula hospedera se selecciona del grupo que consiste de Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polyrnorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa. En otros aspectos, la célula hospedera es una célula hospedera de insecto, planta o mamífero.

En otro aspecto de lo anterior, se provee un método para producir una glucoproteína heteróloga en una célula hospedera eucariótica inferior, que comprende proveer una célula hospedera eucariótica inferior recombinante que incluye por lo menos una molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariitransferasa de una sola subunidad heteróloga y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína heteróloga, y en donde los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariitransferasa (OTasa) endógeno, son expresados; y cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que exprese la glucoproteína heteróloga para producir la glucoproteína heteróloga.

En otros aspectos del método anterior, la célula hospedera eucariótica inferior se selecciona del grupo que consiste de Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaría, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindnerí), Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polyrnorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

En otro aspecto de lo anterior, se provee un método para producir una glucoproteína heteróloga en una célula hospedera de levadura recombinante, que comprende proveer una célula hospedera de levadura recombinante que incluye por lo menos una molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariitransferasa de una sola subunidad heteróloga y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína heteróloga, y en donde los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno, son expresados; y cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que exprese la glucoproteína heteróloga para producir la glucoproteína heteróloga.

En los métodos anteriores, la célula hospedera de levadura recombinante produce la glucoproteína con un patrón de N-glucanos de levadura, o la levadura ha sido genéticamente diseñada para producir glucoproteínas con un patrón de levadura pero la cual carece de hipermanosilación pero la cual produce N-glucanos de alto contenido de mañosa. Por ejemplo, la levadura puede ser genéticamente diseñada para carecer de actividad de a1 ,6-manosiltransferasa, por ejemplo, actividad de Ochl p. En otros aspectos, la levadura es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero.

En modalidades particulares, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3A, proteína STT3B, proteína STT3C, proteína STT3D, o combinaciones de las mismas, de Leishmania sp. En modalidades particulares, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3A, proteína STT3B, proteína STT3C, proteína STT3D, o combinaciones de las mismas, de Leishmania major. En otras modalidades, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es capaz de suprimir funcionalmente el fenotipo letal de una mutación de por lo menos una proteína esencial de un complejo de OTasa, por ejemplo, un complejo de OTasa de levadura. En otros aspectos, la proteína esencial del complejo de OTasa es codificada por el locus STT3, locus WBP1, locus OST1, locus SWP1 o locus OST2, u homólogo del mismo, de Saccharomyces cerevisiae y/o Pichia pastorís. Por ejemplo, en otros aspectos, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3D de Leishmania major, la cual es capaz de suprimir (o de rescatar o complementar) funcionalmente el fenotipo letal de por lo menos una proteína esencial del complejo de OTasa de Saccharomyces cerevisiae.

En otros aspectos del método anterior, la célula hospedera de levadura se selecciona del grupo que consiste de Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polyrnorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis y Candida albicans.

En otro aspecto de lo anterior, se provee un método para producir una glucoproteína heteróloga en una célula hospedera de levadura recombinante, que comprende proveer una célula hospedera de levadura recombinante que incluye por lo menos una molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga capaz de suprimir funcionalmente el fenotipo letal de una mutación de por lo menos una proteína esencial de un complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) de levadura, y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína heteróloga, y en donde los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno, son expresados; y cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que exprese la glucoproteína heteróloga para producir la glucoproteína heteróloga.

En los métodos anteriores, la célula hospedera de levadura recombinante produce la glucoproteína con un patrón de N-glucanos de levadura, o la levadura ha sido genéticamente diseñada para producir glucoproteínas con un patrón de levadura que incluye N-glucanos de alto contenido de mañosa pero la cual carece de hipermanosilación. Por ejemplo, la levadura puede ser genéticamente diseñada para carecer de actividad de a1 ,6-manosiltransferasa, por ejemplo, actividad de Ochl p. En otros aspectos, la levadura es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero.

En modalidades particulares, la célula hospedera incluye además una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para la proteína STT3A, proteína STT3B, proteína STT3C, proteína STT3D, o combinaciones de las mismas, de Leishmania sp. En modalidades particulares, la célula hospedera incluye además una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para la proteína STT3A, proteína STT3B, proteína STT3C, o combinaciones de las mismas, de Leishmania major.

En otro aspecto de lo anterior, se provee un método para producir una glucoproteína heterologa en una célula hospedera de hongo filamentoso, que comprende proveer una célula hospedera de hongo filamentoso que incluye por lo menos una molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacanltransferasa heterologa de una sola subunidad y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína heterologa, y en donde los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacanltransferasa (OTasa) endógeno, son expresados; y cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que exprese la glucoproteína heterologa para producir la glucoproteína heterologa. La célula hospedera de hongo filamentoso produce la glucoproteína en la cual los N-glucanos tienen un patrón de hongo filamentoso, o es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero.

En modalidades particulares, la oligosacanltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3A, proteína STT3B, proteína STT3C, proteína STT3D, o combinaciones de las mismas, de Leishmania sp. En modalidades particulares, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3A, proteina STT3B, proteína STT3C, proteína STT3D, o combinaciones de las mismas, de Leishmania major. En otras modalidades, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es capaz de suprimir funcionalmente el fenotipo letal de una mutación de por lo menos una proteína esencial de un complejo de OTasa, por ejemplo, un complejo de OTasa de levadura. En otros aspectos, la proteína esencial del complejo de OTasa es codificada por el locus STT3, locus WBP1, locus OST1, locus SWP1 o locus OST2, u homólogo del mismo, de Saccharomyces cerevisiae y/o Pichia pastoris. Por ejemplo, en otros aspectos, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3D de Leishmania major, la cual es capaz de suprimir (o de rescatar o complementar) funcionalmente el fenotipo letal de por lo menos una proteína esencial del complejo de OTasa de Saccharomyces cerevisiae.

En otros aspectos de lo anterior, la célula hospedera de hongo filamentoso se selecciona del grupo que consiste de Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

En otras modalidades de cualquiera de los métodos anteriores, la célula hospedera es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que comprenden uno o más N-glucanos complejos tipo humano o de mamífero seleccionados de GO, G1 , G2, A1 o A2. En otras modalidades, la célula hospedera es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que comprenden uno o más N-glucanos complejos tipo humano o de mamífero que tienen N-glucanos bisectados o N-glucanos multiantenarios. En otras modalidades, la célula hospedera es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que comprenden uno o más N-glucanos híbridos tipo humano o de mamífero seleccionados de GlcNAcMan3GlcNAc2; GalGlcNAcMan3GlcNAc2; NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2; Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, GalGlcNAcMan5GlcNAc2 y NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2. En otras modalidades, la estructura de N-glucano consiste de la estructura G-2 Man3GlcNAc2.

En modalidades particulares de cualquiera de los métodos anteriores, la glucoproteína heteróloga puede ser, por ejemplo, eritropoyetina (EPO); citocinas tales como interferón a, interferón ß, ¡nterferón ? e interferón ?; y factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF); factor estimulador de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF); factores de coagulación tales como el factor VIII, el factor IX y la proteína C humana; antitrombina III; trombina; cadena a del receptor de IgE soluble; inmunoglobulinas tales como IgG, fragmentos de IgG, fusiones de IgG, e IgM; inmunoadhesinas y otras proteínas de fusión de Fe tales como las proteínas de fusión de Fc-receptor del FNT soluble; proteínas de fusión de Fc-RAGE; interleucinas; urocinasa; quimasa; inhibidor de urea tripsina; proteína de unión al IGF; factor de crecimiento epidérmico; factor liberador de hormona de crecimiento; proteína de fusión de anexina V; angiostatina; factor 2 de crecimiento endotelial vascular; factor 1 inhibidor del progenitor mieloide; osteoprotegerina; a-1-antitripsina; a-feto proteínas; desoxirríbonucleasa II; kringle 3 del plasminógeno humano; glucocerebrosidasa; proteína 1 de unión al FNT; hormona foliculoestimulante; antígeno 4 asociado con linfocitos T citotóxícos-Ig; activador de transmembrana y modulador de calcio y ligando de ciclofilína; proteína 1 tipo glucagon; o agonista del receptor de IL-2.

En otras modalidades de cualquiera de los métodos anteriores, la proteína heteróloga es un anticuerpo, ejemplos del cual incluyen, pero no están limitados a, un anticuerpo anti-Her2, anticuerpo anti-RSV (virus sincicial respiratorio), anticuerpo anti-FNTa, anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo del receptor antí-CD3, anticuerpo 7E3 anti-CD41 , anticuerpo anti-CD25, anticuerpo anti-CD52, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-lgE, anticuerpo anti-CD1 1a, anticuerpo del receptor anti-EGF o anticuerpo anti-CD20.

En aspectos particulares de cualquiera de los métodos anteriores, la célula hospedera incluye una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para uno o más dominios catalíticos de una actividad de glucosidasa, manosidasa o glucosiltransferasa derivada de un miembro del grupo que consiste de UDP-GIcNAc transferasa (GnT) I, GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI, UDP-galactosiltransferasa (GaIT), fucosiltransferasa y sialiltransferasa. En modalidades particulares, la manosidasa se selecciona del grupo que consiste de manosidasa IA de C. elegans, manosidasa IB de C. elegans, manosidasa IA de D. melanogaster, manosidasa IB de H. sapiens, manosidasa I de P. citrinum, manosidasa IA de ratón, manosidasa IB de ratón, manosidasa IA de A. nidulans, manosidasa IB de A. nidulans, manosidasa IC de A. nidulans, manosidasa II de ratón, manosidasa II de C. elegans, manosidasa II de H. sapiens y manosidasa III.

En ciertos aspectos de cualquiera de los métodos anteriores, por lo menos un dominio catalítico se localiza formando una proteína de fusión que comprende el dominio catalítico y un péptido de señal de determinación del blanco celular. La proteína de fusión puede ser codificada por cuando menos una construcción genética formada mediante la ligación en el marco de lectura de un fragmento de ADN que codifica para un péptido de señal de determinación del blanco celular con un fragmento de ADN que codifica para un dominio catalítico que tiene actividad enzimática. Ejemplos de péptidos de señal de determinación del blanco incluyen, pero no están limitados a, proteínas unidas a la membrana del ER o el aparato de Golgi, señales de recuperación, proteínas de membrana tipo II, proteínas de membrana tipo I, transportadores de azúcar de nucleótidos que abarcan la membrana, manosidasas, sialiltransferasas, glucosidasas, manosiltransferasas y fosfo-manosiltransferasas.

En aspectos particulares de cualquiera de los métodos anteriores, la célula hospedera incluye además una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de transportador de UDP-GIcNAc, transportador de UDP-galactosa, transportador de GDP-fucosa, transportador de CMP-ácido siálico y nucleótido difosfatasas.

En otros aspectos de cualquiera de los métodos anteriores, la célula hospedera incluye una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para una actividad de a1 ,2-manosidasa, una actividad de UDP-GIcNAc transferasa (GnT) I, una actividad de manosidasa II y una actividad de GnT II.

En otros aspectos de cualquiera de los métodos anteriores, la célula hospedera incluye una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para una actividad de a1 ,2-manosidasa, una actividad de UDP-GIcNAc transferasa (GnT) I, una actividad de manosidasa II, una actividad de GnT II y una actividad de UDP-galactosiltransferasa (GaIT).

En otros aspectos de cualquiera de los métodos anteriores, la célula hospedera es deficiente en la actividad de una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de manosiltransferasas y fosfomanosiltransferasas. En otros aspectos, la célula hospedera no expresa una enzima seleccionada del grupo que consiste de 1 ,6 manosiltransferasa, 1 ,3 manosiltransferasa y 1 ,2 manosiltransferasa.

En un aspecto particular de cualquiera de los métodos anteriores, la célula hospedera es un muíante och1 de Pichia pastorís.

Se provee además una célula hospedera, que comprende (a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga; y (b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica para una glucoproteína heteróloga; y los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de ollgosacariltransferasa (OTasa) endógeno son expresados, que incluye la expresión del gen STT3 endógeno de la célula hospedera.

Se provee además una célula hospedera eucariótica inferior, que comprende (a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica para una ollgosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga; y (b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica para una glucoproteína heteróloga; y los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de ollgosacariltransferasa (OTasa) endógeno son expresados.

Se provee además una célula hospedera de levadura, que comprende (a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica para una ollgosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga; y (b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica para una glucoproteína heteróloga; y los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de ollgosacariltransferasa (OTasa) endógeno son expresados.

Se provee además una célula hospedera de levadura, que comprende (a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica para una ollgosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga capaz de suprimir funcionalmente el fenotipo letal de una mutación de por lo menos una proteína esencial de un complejo de ollgosacariltransferasa (OTasa) de levadura; y (b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica para una glucoproteína heteróloga; y los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno, son expresados.

Se provee además una célula hospedera de hongo filamentoso, que comprende (a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga; y (b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica para una glucoproteína heteróloga; y los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno, son expresados.

Se provee además una célula hospedera de hongo filamentoso, que comprende (a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga capaz de suprimir funcionalmente el fenotipo letal de una mutación de por lo menos una proteína esencial de un complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) de levadura u hongo filamentoso; y (b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica para una glucoproteína heteróloga; y los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno, son expresados.

En modalidades particulares, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3A, proteína STT3B, proteína STT3C, proteína STT3D, o combinaciones de las mismas, de Leishmania sp. En modalidades particulares, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3A, proteína STT3B, proteína STT3C, proteína STT3D, o combinaciones de las mismas, de Leishmania major. En otras modalidades, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es capaz de suprimir funcionalmente el fenotipo letal de una mutación de por lo menos una proteína esencial de un complejo de OTasa, por ejemplo, un complejo de OTasa de levadura. En otros aspectos, la proteína esencial del complejo de OTasa es codificada por el locus STT3, locus WBP1, locus OST1, locus SWP1 o locus OST2, u homólogo del mismo, de Saccharomyces cerevisiae y/o Pichia pastoris. Por ejemplo, en otros aspectos, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3D de Leishmania major, la cual es capaz de suprimir (o de rescatar o complementar) funcionalmente el fenotipo letal de por lo menos una proteína esencial del complejo de OTasa de Saccharomyces cerevisiae.

En otros aspectos, las células hospederas anteriores incluyen además una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína STT3A, proteína STT3B, proteína STT3C, proteína STT3D, o combinaciones de las mismas, de Leishmania sp.

En otras modalidades de cualquiera de las células hospederas anteriores, la célula hospedera es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que comprenden uno o más N-glucanos complejos tipo humano o de mamífero seleccionados de G0, G1 , G2, A1 o A2. En otras modalidades, la célula hospedera es genéticamente diseñada para producir glucoproteinas que comprenden uno o más N-glucanos complejos tipo humano que N-glucanos bisectados, o tienen N-glucanos multiantenarios. En otras modalidades, la célula hospedera es genéticamente diseñada para producir glucoproteinas que comprenden uno o más N-glucanos híbridos tipo humano o de mamífero seleccionados de GlcNAcMan3GlcNAc2; GalGlcNAcMan3GlcNAc2; NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2; Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, GalGlcNAcMan5GlcNAc2 y NANAGalGlcNAcMansGlcNAc2. En otras modalidades, la estructura de N-glucano consiste de la estructura G-2 Man3GlcNAc2.

En modalidades particulares de cualquiera de las células hospederas anteriores, la glucoproteína heterologa puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste de eritropoyetina (EPO); citocinas tales como interferón a, interferón ß, interferón ? e interferón ?; y factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF); factor estimulador de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF); factores de coagulación tales como el factor VIII, el factor IX y la proteína C humana; antitrombina III; trombina; cadena a del receptor de IgE soluble; inmunoglobulinas tales como IgG, fragmentos de IgG, fusiones de IgG, e IgM; inmunoadhesinas y otras proteínas de fusión de Fe tales como las proteínas de fusión de Fc-receptor del FNT soluble; proteínas de fusión de Fc-RAGE; interleucinas; urocinasa; quimasa; inhibidor de urea tripsina; proteína de unión al IGF; factor de crecimiento epidérmico; factor liberador de hormona de crecimiento; proteína de fusión de anexina V; angiostatina; factor 2 de crecimiento endotelial vascular; factor 1 inhibidor del progenitor mieloide; osteoprotegerina; a-1-antitripsina; a-feto proteínas; desoxirribonucleasa II; kringle 3 del plasminógeno humano; glucocerebrosidasa; proteína 1 de unión al FNT; hormona foliculoestimulante; antígeno 4 asociado con linfocitos T citotóxicos-Ig; activador de transmembrana y modulador de calcio y ligando de ciclofilina; proteína 1 tipo glucagon; o agonista del receptor de IL-2.

En otras modalidades de cualquiera de las células hospederas anteriores, la proteína heteróloga es un anticuerpo, ejemplos del cual incluyen, pero no están limitados a, un anticuerpo anti-Her2, anticuerpo anti-RSV (virus sincicial respiratorio), anticuerpo anti-FNTa, anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo del receptor anti-CD3, anticuerpo 7E3 anti-CD41 , anticuerpo anti-CD25, anticuerpo anti-CD52, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-lgE, anticuerpo anti-CD1 1 a, anticuerpo del receptor anti-EGF o anticuerpo anti-CD20.

En aspectos particulares de las células hospederas anteriores, la célula hospedera incluye una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para uno o más dominios catalíticos de una actividad de glucosidasa, manosidasa o glucosiltransferasa derivada de un miembro del grupo que consiste de UDP-GIcNAc transferasa (GnT) I, GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI, UDP-galactosiltransferasa (GaIT), fucosiltransferasa y sialiltransferasa. En modalidades particulares, la manosidasa se selecciona del grupo que consiste de manosidasa IA de C. elegans, manosidasa IB de C. elegans, manosidasa IA de D. melanogaster, manosidasa IB de H. sapiens, manosidasa I de P. citrinum, manosidasa IA de ratón, manosidasa IB de ratón, manosidasa IA de A. nidulans, manosidasa IB de A. nidulans, manosidasa IC de A. nidulans, manosidasa II de ratón, manosidasa II de C. elegans, manosidasa II de H. sapiens y manosidasa III.

En ciertos aspectos de cualquiera de las células hospederas anteriores, por lo menos un dominio catalítico se localiza formando una proteína de fusión que comprende el dominio catalítico y un péptido de señal de determinación del blanco celular. La proteína de fusión puede ser codificada por cuando menos una construcción genética formada mediante la ligación en el marco de lectura de un fragmento de ADN que codifica para un péptido de señal de determinación del blanco celular con un fragmento de ADN que codifica para un dominio catalítico que tiene actividad enzimática. Ejemplos de péptidos de señal de determinación del blanco incluyen, pero no están limitados a, proteínas unidas a la membrana del ER o el aparato de Golgi, señales de recuperación tales como HDEL o KDEL, proteínas de membrana tipo II, proteínas de membrana tipo I, transportadores de azúcar de nucleótidos que abarcan la membrana, manosidasas, sialiltransferasas, glucosidasas, manosiltransferasas y fosfo-manosiltransferasas.

En aspectos particulares de cualquiera de las células hospederas anteriores, la célula hospedera incluye además una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de transportador de UDP-GIcNAc, transportador de UDP-galactosa, transportador de GDP-fucosa, transportador de CMP-ácido siálico y nucleótido difosfatasas.

En otros aspectos de cualquiera de las células hospederas anteriores, la célula hospedera incluye una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para una actividad de a1 ,2-manosidasa, una actividad de UDP-GlcNAc transferasa (GnT) I, una actividad de manosidasa II y una actividad de GnT II.

En otros aspectos de cualquiera de las células hospederas anteriores, la célula hospedera incluye una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para una actividad de a1 ,2-manosidasa, una actividad de UDP-GIcNAc transferasa (GnT) I, una actividad de manosidasa II, una actividad de GnT II y una actividad de UDP-galactosiltransferasa (GaIT).

En otros aspectos de cualquiera de las células hospederas anteriores, la célula hospedera se selecciona del grupo que consiste de Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces . sp., Hansenula polyrnorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusaríum sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora crassa, células de plantas, células de insectos y células de mamíferos.

En otros aspectos de cualquiera de las células hospederas anteriores, la célula hospedera es deficiente en la actividad de una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de manosiltransferasas y fosfomanosiltransferasas. En otros aspectos, la célula hospedera no expresa una enzima seleccionada del grupo que consiste de 1 ,6 manosiltransferasa, 1 ,3 manosiltransferasa y 1 ,2 manosiltransferasa.

En un aspecto particular de cualquiera de las células hospederas anteriores, la célula hospedera es Pichia pastoris. En otro aspecto, la célula hospedera es un mutante och1 de Pichia pastoris.

Los métodos y las células hospederas de la presente pueden usarse para producir composiciones de glucoproteína en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de los sitios de N-glucosilación de las glucoproteinas en la composición, están ocupados.

Además, los métodos y las células hospederas de la presente pueden usarse para producir composiciones de glucoproteína en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de los sitios de N-glucosilación de las glucoproteinas en la composición están ocupados, y en las cuales en otros aspectos tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero que carecen de fucosa.

Además, los métodos y las células hospederas de hongo filamentoso o levadura que son genéticamente diseñadas para producir N-glucanos tipo humano o tipo mamífero, pueden usarse para producir composiciones de glucoproteína en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de los sitios de N-glucosilación de las glucoproteinas en la composición están ocupados, y en las cuales en otros aspectos tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero que carecen de fucosa.

En algunos aspectos, las células hospederas de hongo filamentoso o levadura genéticamente diseñadas para producir N-glucanos tipo humano o de mamífero fucosilados, pueden usarse para producir composiciones de glucoproteína en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de los sitios de N-glucosilación de las glucoproteínas en la composición están ocupados, y en las cuales en otros aspectos tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero que tienen fucosa.

Los métodos y las células hospederas de la presente pueden usarse para producir composiciones de anticuerpo en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las moléculas de anticuerpo en las composiciones, tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados.

Además, los métodos y las células hospederas de la presente pueden usarse para producir composiciones de anticuerpo en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las moléculas de anticuerpo en las composiciones tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y los N-glucanos carecen de fucosa.

Además, los métodos y las células hospederas de hongo filamentoso o levadura de la presente pueden usarse para producir composiciones de anticuerpo en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las moléculas de anticuerpo en las composiciones tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y los N- glucanos carecen de fucosa.

Además, los métodos y las células hospederas de hongo filamentoso o levadura genéticamente diseñadas para producir N-glucanos tipo humano o tipo mamífero, pueden usarse para producir composiciones de anticuerpo en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las moléculas de anticuerpo en las composiciones tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados, y los anticuerpos tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero que carecen de fucosa. En algunos aspectos, las células hospederas de hongo filamentoso o levadura genéticamente diseñadas para producir N-glucanos tipo humano o de mamífero fucosilados, pueden usarse para producir composiciones de anticuerpo en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las moléculas de anticuerpo en las composiciones tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y los anticuerpos tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero con fucosa.

Se provee además una composición de glucoproteína que comprende una pluralidad de anticuerpos en donde aproximadamente 70% a aproximadamente 99% de las moléculas de anticuerpo intactas en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 50 a 70% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G0, 15 a 25% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , 4 a 12% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G2, 5 a 17% en moles de los N-glucanos tienen una estructura Man5, y 3 a 15% en moles de los N- glucanos tienen una estructura híbrida, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Se provee además una composición de glucoproteína que comprende una pluralidad de anticuerpos en donde aproximadamente 70% a 99% de las moléculas de anticuerpo intactas en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 53 a 58% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G0, 20 a 22% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , y aproximadamente 16 a 18% en moles de los N-glucanos comprenden una estructura central de Man5GlcNAc2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En modalidades particulares, los anticuerpos comprenden un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de anticuerpo anti-Her2, anticuerpo anti-RSV (virus sincicial respiratorio), anticuerpo anti-FNTa, anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo del receptor anti-CD3, anticuerpo 7E3 anti-CD41 , anticuerpo anti-CD25, anticuerpo anti-CD52, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-lgE, anticuerpo anti-CD 1a, anticuerpo del receptor anti-EGF o anticuerpo anti-CD20.

Se proveen además composiciones que comprenden una o más glucoproteínas producidas por las células hospederas y mediante los métodos descritos en la presente.

En modalidades particulares, las composiciones de glucoproteína provistas en la presente comprenden glucoproteínas que tienen N-glucanos complejos e híbridos fucosilados y no fucosilados, incluyendo especies bisectadas y multiantenarias que incluyen, pero no están limitadas a, N-glucanos tales como GlcNAC(i.4)Man3GlcNAc2; Gal(i-4)GlcNAc(-|. 4)Man3GlcNAc2; y NANA(i_4)Gal(i-4)GlcNAC(i-4)Man3GlcNAc2.

En modalidades particulares, las composiciones de glucoproteina provistas en la presente comprenden glucoproteínas que tienen por lo menos un N-glucano híbrido seleccionado del grupo que consiste de GlcNAcMan3GlcNAc2; GalGlcNAcMan3GlcNAc2; NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2; GlcNAcMan5GlcNAc2; GalGlcNAcMan5GlcNAc2; y NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2. En aspectos particulares, el N-glucano híbrido es la especie de N-glucano predominante en la composición. En otros aspectos, el N-glucano híbrido es una especie de N-glucano particular que comprende aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% de los N-glucanos híbridos en la composición.

En modalidades particulares, las composiciones de glucoproteina provistas en la presente comprenden glucoproteínas que tienen por lo menos un N-glucano complejo seleccionado del grupo que consiste de GlcNAc2Man3GlcNAc2; GalGlcNAc2Man3GlcNAc2; Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; y NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2. En aspectos particulares, el N-glucano complejo es la especie de N-glucano predominante en la composición. En otros aspectos, el N-glucano complejo es una especie de N-glucano particular que comprende aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% de los N- glucanos complejos en la composición.

En modalidades particulares, el N-glucano es fucosilado. En general, la fucosa está en un enlace a1 ,3 con GIcNAc en el extremo reductor del N-glucano, un enlace a1 ,6 con GIcNAc en el extremo reductor del N-glucano, un enlace a1 ,2 con Gal en el extremo no reductor del N-glucano, un enlace a1 ,3 con GIcNAc en el extremo no reductor del N-glucano, o un enlace a1 ,4 con GIcNAc en el extremo no reductor del N-glucano.

Por lo tanto, en aspectos particulares de las composiciones de glucoproteina anteriores, la glucoforma está en una fucosa con enlace a1 ,3 o con enlace a1 ,6 para producir una glucoforma seleccionada del grupo que consiste de GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc), GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc) y NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc); en una fucosa con enlace a1 ,3 o con enlace a1 ,4 para producir una glucoforma seleccionada del grupo que consiste de GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2, GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2, GlcNAc2(Fuci-2)Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2(Fuci.2)Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2(Fuc -2)Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2(Fuci-2)Man3GlcNAc2 y NANA2Gal2GlcNAc2(Fuci-2)Man3GlcNAc2; o en una fucosa con enlace a1 ,2 para producir una glucoforma seleccionada del grupo que consiste de Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2 y NANA2Gal2(Fuci. 2)GlcNAc2Man3GlcNAc2.

En otros aspectos de lo anterior, los N-glucanos complejos incluyen además especies bisectadas y multiantenarias fucosiladas y no fucosiladas.

En otros aspectos, las glucoproteínas comprenden N-glucanos de alto contenido de ma osa que incluyen, pero no están limitados a, Man5GlcNAc2, o N-glucanos que consisten de la estructura de N-glucano Man3GlcNAc2.

Definiciones Como se usa en la presente, los términos "N-glucano" y "glucoforma" se usan reciprocamente, y se refieren a un oligosacárido N-enlazado, por ejemplo, uno que es unido por un enlace de asparagina-N-acetilglucosamina a un residuo de asparagina de un polipéptido. Las glucoproteínas N-enlazadas contienen un residuo de N-acetilglucosamina enlazado al nitrógeno de la amida de un residuo de asparagina en la proteína. Los azúcares predominantes encontrados en las glucoproteínas son glucosa, galactosa, mañosa, fucosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), N-acetilglucosamina (GIcNAc) y ácido siálico (por ejemplo, ácido N-acetil-neuramínico (NANA)). El procesamiento de los grupos azúcar ocurre por medio de co-traducción en el lumen del ER, y continúa post-traducción en el aparato de Golgi para las glucoproteínas N-enlazadas.

Los N-glucanos tienen un núcleo de pentasacárido común de Man3GlcNAc2 ("Man" se refiere a mañosa; "Glc" se refiere a glucosa; y "NAc" se refiere a N-acetilo; GIcNAc se refiere a N-acetilglucosamina). Usualmente, las estructuras de N-glucano se presentan con el extremo no reductor hacia la izquierda y el extremo reductor a la derecha. El extremo reductor del N-glucano es el extremo que está unido al residuo de Asn que comprende el sitio de glucosilación en la proteína. Los N-glucanos difieren con respecto al número de ramas (antenas) que comprenden azúcares periféricos (por ejemplo, GIcNAc, galactosa, fucosa y ácido siálico) que se añaden a la estructura central de Man3GlcNAc2 ("Man3"), la cual es referida también como el "núcleo de trimanosa", el "núcleo de pentasacárido" o el "núcleo de paucimanosa". Los N-glucanos se clasifican de acuerdo con sus constituyentes ramificados (por ejemplo, de alto contenido de mañosa, complejos o híbridos). Un N-glucano del tipo de "alto contenido de mañosa" tiene cinco o más residuos de mañosa. Un N-glucano de tipo "complejo" tiene típicamente por lo menos una GIcNAc unida al brazo de 1 ,3-manosa y por lo menos una GIcNAc unida al brazo de 1 ,6-manosa de un núcleo de "trimanosa". Los N-glucanos complejos pueden tener también residuos de galactosa ("Gal") o N-acetilgalactosamina ("GalNAc") que son opcionalmente modificados con ácido siálico o derivados (por ejemplo, "NANA" o "NeuAc", en donde "Neu" se refiere a ácido neuramínico, y "Ac" se refiere a acetilo). Los N-glucanos complejos pueden tener también sustituciones intracadena que comprenden "bisectar" la GIcNAc, y fucosa central ("Fue"). Los N-glucanos complejos pueden tener también antenas múltiples en el "núcleo de trimanosa", referidos con frecuencia como "glucanos antenarios múltiples o multiantenarios". Un N-glucano "híbrido" tiene por lo menos una GIcNAc en la terminal del brazo de 1,3-manosa del núcleo de trimanosa, y cero o más mañosas en el brazo de 1 ,6-manosa del núcleo de trimanosa. Los varios N-glucanos son referidos también como "glucoformas".

Con respecto a los N-glucanos complejos, los términos "G-2", "G- 1", "GO", "G1 ", "G2", "A1" y "A2" significan lo siguiente: "G-2" se refiere a una estructura de N-glucano que puede caracterizarse como Man3GlcNAc2; el término "G-1 " se refiere a una estructura de N-glucano que puede caracterizarse como GlcNAcMan3GlcNAc2; el término "GO" se refiere a una estructura de N-glucano que puede caracterizarse como GlcNAc2Man3GlcNAc2; el término "G1" se refiere a una estructura de N-glucano que puede caracterizarse como GalGlcNAc2Man3Glc Ac2; el término "G2" se refiere a una estructura de N-glucano que puede caracterizarse como Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; el término "A1 " se refiere a una estructura de N-glucano que puede caracterizarse como NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; y el término "A2" se refiere a una estructura de N-glucano que puede caracterizarse como NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2. A menos que se indique de otra manera, los términos "G-2", "G-1", "GO", "G1 ", "G2", "A1" y "A2" se refieren a especies de N-glucano que carecen de fucosa unida al residuo de GIcNAc en el extremo reductor del N-glucano. Cuando el término incluye una "F", la "F" indica que la especie de N-glucano contiene un residuo de fucosa en el residuo de GIcNAc en el extremo reductor del N-glucano. Por ejemplo, GOF, G1 F, G2F, A1 F y A2F indican que el N-glucano incluye además un residuo de fucosa unido al residuo de GIcNAc en el extremo reductor del N-glucano. Eucariontes inferiores tales como las levaduras y los hongos filamentosos, no producen normalmente N-glucanos que producen fucosa.

Con respecto a los N-glucanos multiantenarios, el término "N-glucano multiantenario" se refiere a N-glucanos que comprenden además un residuo de GIcNAc en el residuo de mañosa que comprende el extremo no reductor del brazo 1 ,6 o el brazo 1 ,3 del N-glucano, o un residuo de GIcNAc en cada uno de los residuos de mañosa que comprenden el extremo no reductor del brazo 1 ,6 y el brazo 1 ,3 del N-glucano. De esta manera, los N-glucanos multiantenarios pueden caracterizarse mediante las fórmulas GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2, Gal(i-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2 o NANA( -4)Gal(1- 4)GlcNAC(2-4)Man3GlcNAc2. El término "1-4" se refiere a 1 , 2, 3 ó 4 residuos.

Con respecto a los N-glucanos bisectados, el término "N-glucano bisectado" se refiere a N-glucanos en los cuales un residuo de GIcNAc está enlazado al residuo de mañosa en el extremo reductor del N-glucano. Un N-glucano bisectado puede caracterizarse mediante la fórmula GlcNAc3Man3GlcNAc2, en donde cada residuo de mañosa está enlazado en su extremo no reductor a un residuo de GIcNAc. En contraste, cuando un N-glucano multiantenario se caracteriza como GlcNAc3Man3GlcNAc2, la fórmula indica que dos residuos de GIcNAc están enlazados al residuo de mañosa en el extremo no reductor de uno de los dos brazos de los N-glucanos, y un residuo de GIcNAc está enlazado al residuo de mañosa en el extremo no reductor del otro brazo del N-glucano.

Las abreviaturas usadas en la presente son de uso común en la técnica; véase, por ejemplo, las abreviaturas de azúcares anteriores. Otras abreviaturas comunes incluyen "PNGasa" o "glucanasa" o "glucosidasa", las cuales se refieren todas al péptido N-glucosidasa F (EC 3.2.2.18).

Como se usa en la presente, el término "glucoproteina" se refiere a cualquier proteína que tiene uno o más N-glucanos unidos a la misma. De esta manera, el término se refiere a proteínas que se reconocen generalmente en la técnica como una glucoproteina, y a proteínas que han sido genéticamente diseñadas para contener uno o más sitios de glucosilación N-enlazados.

Como se usa en la presente, una "glucoproteina humanizada" o una "glucoproteina tipo humano" se refiere en forma alternativa a una proteína que tiene unida a la misma N-glucanos que tienen menos de cuatro residuos de mañosa, e intermediarios de glucoproteina sintéticos (los cuales son útiles también y pueden ser manipulados in vitro o in vivo) que tienen por lo menos cinco residuos de mañosa. De preferencia, las glucoproteínas producidas de conformidad con la invención contienen por lo menos 30% en moles, de preferencia por lo menos 40% en moles, y más preferiblemente 50, 60, 70, 80, 90 o incluso 100% en moles del intermediario Man5GlcNAc2, por lo menos transitoriamente. Esto puede lograrse, por ejemplo, diseñando una célula hospedera de la invención para expresar una "mejor" enzima de glucosilación, es decir, una enzima de glucosilación más eficiente. Por ejemplo, se selecciona una manosidasa tal que tendrá actividad óptima bajo las condiciones presentes en el sitio en la célula hospedera en donde las proteínas son glucosiladas, y es introducida en la célula hospedera de preferencia dirigiendo la enzima hacia un organelo de la célula hospedera en donde se desea la actividad.

Se pretende que el término "célula hospedera recombinante" ("célula hospedera de expresión", "sistema de hospedero de expresión", "sistema de expresión" o simplemente "célula hospedera"), como se usa en la presente, se refiera a una célula en la cual un vector recombinante ha sido introducido. Debe entenderse que se pretende que dichos términos se refieran no sólo a la célula sujeto particular, sino a la progenie de dicha célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula progenitora, pero se incluye aún dentro del alcance del término "célula hospedera", como se usa en la presente. Una célula hospedera recombinante puede ser una célula aislada o linea de células mantenida en cultivo, o puede ser una célula que reside en un tejido u organismo vivo. Células hospederas preferidas son levaduras y hongos.

Cuando se hace referencia al "por ciento en moles" de un glucano presente en una preparación de una glucoproteína, el término significa el por ciento molar de un glucano particular presente en el grupo de oligosacáridos N-enlazados liberados cuando la preparación de proteína se trata con PNGasa, y entonces se cuantifica mediante un método que no es afectado por la composición de la glucoforma (por ejemplo, marcación de un grupo de glucanos liberados de PNGasa con un marcador fluorescente tal como 2-aminobenzamida, y entonces separación por cromatografía de líquidos de alto rendimiento o electroforesis capilar, y luego cuantificación de los glucanos por la intensidad de la fluorescencia). Por ejemplo, 50 por ciento en moles de GlcNAc2Man3Glc Ac2Gal2NANA2 significa que 50 por ciento de los glucanos liberados son GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2, y el 50% restante comprenden otros olígosacáridos N-enlazados. En otras modalidades, el por ciento en moles de un glucano particular en una preparación de glucoproteína estará entre 20% y 100%, de preferencia arriba de 25%, 30%, 35%, 40% o 45%, más preferiblemente arriba de 50%, 55%, 60%, 65% o 70%, y muy preferiblemente arriba de 75%, 80% 85%, 90% o 95%.

El término secuencias de control de la expresión "enlazadas operablemente", se refiere a un enlace en el cual la secuencia de control de la expresión es contigua con el gen de interés para controlar el gen de interés, así como secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés.

Los términos "secuencia de control de la expresión" o "secuencia reguladora" se usan recíprocamente, y como se usan en la presente, se refieren a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para afectar la expresión de secuencias codificantes a las cuales están enlazadas operablemente. Las secuencias de control de la expresión son secuencias que controlan la transcripción, eventos post-transcripcíón y traducción de secuencias de ácido nucleico. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias de inicio de la transcripción, terminación, de promotor e intensificador adecuadas; señales de procesamiento del ARN eficientes, tales como señales de empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que mejoran la eficiencia de la traducción (por ejemplo, sitios de unión del ribosoma); secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas; y, cuando se desee, secuencias que mejoran la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere, dependiendo del organismo hospedero; en procariontes, dichas secuencias de control incluyen generalmente promotor, sitio de unión ribosomal y secuencia de terminación de la transcripción. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, a un mínimo, todos los componentes cuya presencia sea esencial para la expresión, y pueden incluir también componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias guía y secuencias de miembros de fusión.

El término "transfecta", transfección", "transfectar", y similares, se refiere a la introducción de un ácido nucleico heterólogo en células eucarióticas, es decir, células eucarióticas inferiores y superiores. Históricamente, el término "transformación" se ha usado para describir la introducción de un ácido nucleico en una célula de hongo o levadura; sin embargo, en la presente, el término "transfección" se usa para referirse a la introducción de un ácido nucleico en cualquier célula eucariótica que incluye células de hongos y levaduras.

El término "eucariótico" se refiere a una célula u organismo nucleado, e incluye células de insectos, células de plantas, células de mamíferos, células animales y células eucarióticas inferiores.

El término "células eucarióticas inferiores" incluye levaduras y hongos filamentosos. Las levaduras y hongos filamentosos incluyen, pero no están limitados a, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta {Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polyrnorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens y Neurospora crassa, Pichia sp., cualquier Saccharomyces sp., Hansenula polyrnorpha, cualquier Kluyveromyces sp., Candida albicans, cualquier Aspergillus sp., Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, cualquier Fusarium sp. y Neurospora crassa.

Como se usa en la presente, los términos "anticuerpo", "inmunoglobulina", "inmunoglobulinas" y "molécula de inmunoglobulina", se usan recíprocamente. Cada molécula de inmunoglobulina tiene una estructura única que le permite unirse a su antigeno especifico, pero todas las inmunoglobulinas tienen la misma estructura general como se describe en la presente. Se sabe que la unidad estructural básica de inmunoglobulina comprende un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero tiene dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par teniendo una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50 a 70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 1 10 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

Las cadenas ligeras y pesadas se subdividen en regiones variables y regiones constantes (véase en general, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2a. ed. Raven Press, N.Y., 1989), capítulo 7). Las regiones variables de cada par de cadenas ligeras/pesadas forman el sitio de unión del anticuerpo. De esta manera, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Salvo en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son los mismos. Todas las cadenas exhiben la misma estructura general de regiones de estructura (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, denominadas también regiones determinantes de complementan'edad o CDRs. Las CDRs de las dos cadenas de cada par son alineadas por las regiones de estructura, permitiendo la unión a un epítope específico. Los términos incluyen formas de ocurrencia natural, así como fragmentos y derivados. Incluidas dentro del alcance del término, son las clases de inmunoglobulinas (Igs), a saber, IgG, IgA, IgE, IgM e IgD. Incluidas también dentro del alcance de los términos, son los subtipos de IgGs, a saber, lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4. El término se usa en el sentido más amplio, e incluye anticuerpos monoclonales sencillos (incluyendo anticuerpos agonistas y antagonistas), así como composiciones de anticuerpo que se unirán a epítopes o antígenos múltiples. Los términos abarcan específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecífícos) y fragmentos de anticuerpo, en tanto contengan o sean modificados para contener por lo menos la porción del dominio CH2 de la región constante de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende un sitio de glucosilación N-enlazado del dominio CH2, o una variante del mismo. Incluidas dentro de los términos son moléculas que comprenden sólo la región Fe, tales como inmunoadhesinas (véase la solicitud de patente publicada de E.U.A. No. 2004/0136986, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia), fusiones de Fe, y moléculas tipo anticuerpo.

El término "fragmento Fe" se refiere a la región C-terminal "cristalizada del fragmento" del anticuerpo, que contiene a los dominios CH2 y CH3. El término "fragmento Fab" se refiere a la región de "unión al antígeno del fragmento" del anticuerpo que contiene a los dominios VH, CH1 , VL y CL.

El término "anticuerpo monoclonal" (mAb), como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, salvo por mutaciones de ocurrencia natural posibles que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un sitio antigénico individual. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), las cuales incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada mAb es dirigido contra un determinante individual en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden producirse, por ejemplo, mediante el cultivo de hibridomas, no contaminados por otras inmunoglobulinas. El término "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se considerará que requiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán de conformidad con la presente invención pueden obtenerse por el método de hibridomas descrito primero por Kohier et al., (1975) Nature, 256: 495, o pueden obtenerse por métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,816,567, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia).

El término "fragmentos" dentro del alcance de los términos "anticuerpo" o "inmunoglobulina", incluye los producidos por la digestión con varias proteasas, los producidos por desdoblamiento químico y/o disociación química y los producidos en forma recombinante, en tanto el fragmento siga siendo capaz de unirse específicamente a una molécula objetivo. Entre dichos fragmentos están los fragmentos Fe, Fab, Fab', Fv y F(ab')2, y los fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv). En lo sucesivo, el término "inmunoglobulina" incluye también el término "fragmentos".

Las inmunoglobulinas incluyen además inmunoglobulinas o fragmentos que han sido modificados en secuencia, pero que siguen siendo capaces de unirse específicamente a una molécula objetivo, e incluyen: anticuerpos quiméricos y humanizados interespecie; fusiones de anticuerpos; complejos de anticuerpos y fusiones de anticuerpos heteroméricos, tales como cuerpos completos (anticuerpos biespecíficos), cuerpos completos de cadena sencilla e intracuerpos (véase, por ejemplo, Intracellular Antibodies: Research and Disease Applications (Marasco, ed., Springer-Verlag New York, Inc., 1998).

El término "anticuerpo catalítico" se refiere a moléculas de inmunoglobulina que son capaces de catalizar una reacción bioquímica. Los anticuerpos catalíticos son bien conocidos en la técnica, y se han descrito en la solicitud de patente de E.U.A. Nos. 7,205,136; 4,888,281 ; y 5,037,750 a Schochetman et al., y en la solicitud de patente de E.U.A. Nos. 5,733,757; 5,985,626; y 6,368,839 a Barbas, III ef al. (cuya descripción se incorpora en la presente como referencia).

La interacción de anticuerpos y complejos de anticuerpo-antígeno con células del sistema inmune y la variedad de respuestas, que incluyen citotoxicídad mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), depuración de inmunocomplejos (fagocitosis), producción de anticuerpos por células B y vida media de la IgG en suero, se definen respectivamente en las siguientes citas: Daeron et al., Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997); Ward y Ghetie, Therapeutic Immunol. 2: 77-94 (1995); Cox y Greenberg, Semin. Immunol. 13: 339-345 (2001); Heyman, Immunol. Lett. 88: 157-161 (2003); y Ravetch, Curr. Opin. Immunol. 9: 121-125 (1997).

Como se usa en la presente, se entenderá que el término "que consiste esencialmente de" implica la inclusión de un entero o grupo de enteros establecido; mientras que excluye modificaciones u otros enteros que materialmente afectarían o alterarían el entero establecido. Con respecto a las especies de N-glucanos, se entenderá que el término "que consiste esencialmente de" un N-glucano establecido, incluirá el N-glucano, sea o no que el N-glucano sea fucosilado en la /V-acetilglucosamina (GIcNAc), la cual está enlazada directamente al residuo de asparagina de la glucoproteína.

Como se usa en la presente, se entenderá que el término "predominantemente" o variaciones tales como "la predominante" o "la cual es predominante", significa la especie de glucano que tiene el más alto por ciento (%) en moles del total de N-glucanos neutros después de que la glucoproteína ha sido tratada con PNGasa y glucanos liberados analizados por espectroscopia de masa, por ejemplo, MS MALDI-TOF o CLAR. En otras palabras, la frase "predominantemente" se define como una entidad individual, de modo que una glucoforma específica está presente en mayor por ciento en moles que cualquier otra entidad individual. Por ejemplo, si una composición consiste de la especie A en 40 por ciento en moles, la especie B en 35 por ciento en moles y la especie C en 25 por ciento en moles, la composición comprende predominantemente la especie A, y la especie B sería la siguiente especie más predominante. Algunas células hospederas pueden producir composiciones que comprenden N-glucanos neutros y N-glucanos cargados tales como fosfato de manosilo. Por lo tanto, una composición de glucoproteínas puede incluir una pluralidad de N-glucanos neutros o N-glucanos cargados y no cargados. En la presente invención, está dentro del contexto de la pluralidad total de N-glucanos neutros en la composición en la cual el N-glucano predominante es determinado. De esta manera, como se usa en la presente, el "N-glucano predominante" significa que la pluralidad total de N-glucanos neutros en la composición, el N-glucano predominante es de una estructura particular.

Como se usa en la presente, el término "esencialmente libre de" un residuo de azúcar particular tal como fucosa o galactosa, y similares, se usa para indicar que la composición de glucoproteína está sustancialmente carente de N-glucanos que contienen dichos residuos. Expresado en términos de pureza, esencialmente libre significa que la cantidad de estructuras de N-glucano que contienen dichos residuos de azúcar no exceden 10%, y de preferencia es menor de 5%, más preferiblemente menor de 1%, muy preferiblemente menor de 0.5%, en donde los porcentajes son en peso o en por ciento en moles. De esta manera, sustancialmente todas las estructuras de N-glucano en una composición de glucoproteina de conformidad con la presente invención están libres de, por ejemplo, fucosa, o galactosa, o ambas.

Como se usa en la presente, una composición de glucoproteina "carece" o "está careciendo" de un residuo de azúcar particular, tal como fücosa o galactosa, cuando ninguna cantidad detectable de dicho residuo de azúcar está presente en las estructuras de N-glucano en algún momento. Por ejemplo, en modalidades preferidas de la presente invención, las composiciones de glucoproteina son producidas por organismos eucarióticos inferiores, como se definió anteriormente, incluyendo levaduras (por ejemplo, Pichia sp.; Saccharomyces sp.; Kluyveromyces sp.¡ Aspergillus sp.), y "carecerán de fucosa" debido a que las células de estos organismos no tienen las enzimas necesarias para producir estructuras de N-glucano fucosiladas. De esta manera, el término "esencialmente libre de fucosa" abarca el término "que carece de fucosa". Sin embargo, una composición puede estar "esencialmente libre de fucosa", incuso si la composición en un momento contenía estructuras de N-glucano fucosiladas, o contiene cantidades limitadas pero detectables de estructuras de N-glucano fucosiladas como se describió anteriormente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1 G muestran la genealogía de la cepa YGLY13992 (figura 1 F) y la cepa YGLY14401 (figura 1 G) de P. pastoris, comenzando de la cepa de tipo silvestre NRRL-Y1 1430 (figura 1A).

La figura 2 muestra un mapa del plásmido pGLY6301 que codifica para el ORF de la L/77STT3D bajo el control del promotor de la alcohol oxidasa I (AOX1 ) de Pichia pastorís y la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El plásmido es un vector enrollable que elige como objetivo el locus URA6. La selección de transformantes usa resistencia a arsénico codificada por el ORF de ARR3 de S. cerevisiae bajo el control del promotor RPL10 de P. pastorís y la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae.

La figura 3 muestra un mapa del plásmido pGLY6294 que codifica para el ORF de la L/77STT3D bajo el control del promotor GAPDH de P. pastorís y la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El plásmido es un vector KINKO que elige como objetivo el locus TRP1: el extremo 3' del ORF de TRP1 está adyacente a la secuencia de terminación de la transcripción ALG3 de P. pastorís. La selección de transformantes usa resistencia a nourseotricina codificada por el ORF de nourseotricina acetiltransferasa (NAT) de Streptomyces noursei bajo el control del promotor TEF1 (PTEF) de Ashbya gossypii y la secuencia de terminación de la transcripción TEF1 (TTEF) de Ashbya gossypii.

La figura 4 muestra un mapa del plásmido pGLY6. El plásmido pGLY6 es un vector de integración que elige como objetivo el locus URA5, y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen de invertasa o la unidad de transcripción (ScSUC2) de S. cerevisiae flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen URA5 de P. pastoris (PpURA5-5'), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen URA5 de P. pastoris (PpURA5-3').

La figura 5 muestra un mapa del plásmido pGLY40. El plásmido pGLY40 es un vector de integración que elige como objetivo el locus OCH1, y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris flanqueados por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ (repetición de lacZ) que a su vez es flanqueada en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen OCH1 (PpOCH1-5'), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen OCH1 (PpOCHI-3').

La figura 6 muestra un mapa del plásmido pGLY43a. El plásmido pGLY43a es un vector de integración que elige como objetivo el locus BMT2, y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen del transportador de UDP-A/-acetilglucosamina (UDP-GIcNAc) o la unidad de transcripción (KIGIcNAc Transp.) de K. lactis adyacente a una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris (PpURA5) flanqueados por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ (repetición de lacZ). Los genes adyacentes son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen BMT2 (PpPBS2-5'), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen BMT2 (PpPBS2-3").

La figura 7 muestra un mapa del plásmido pGLY48. El plásmido pGLY48 es un vector de integración que elige como objetivo el locus MNN4L1, y contiene un cassette de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el homólogo del marco de lectura abierto (ORF) del transportador de UDP-GIcNAc (MmGIcNAc Transp.) de ratón enlazado operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris (PpGAPDH Prom), y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae (ScCYC TT) adyacente a una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris (PpURA5) flanqueados por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ), y en la cual los cassettes de expresión en conjunto son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen MNN4L1 de P. pastoris (?????4?_1-5'), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen MNN4L1 (?????4?_1-3').

La figura 8 muestra un mapa del plásmido pGLY45. El plásmido pGLY45 es un vector de integración que elige como objetivo los loci PN01/MNN4, y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris (PpURA5) flanqueados por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ (repetición de lacZ), la cual a su vez es flanqueada en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen PN01 (????01-5'), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen MNN4 (?????4-3').

La figura 9 muestra un mapa del plásmido pGLY1430. El plásmido pGLY1430 es un vector de integración KINKO que elige como objetivo el locus ADE1 sin que perturbe la expresión de locus, y contiene cuatro cassettes de expresión en tándem que codifican para (1) el dominio catalítico de GlcNAc transferasa I (optimizado en codones) de humano fusionado en el extremo N-terminal al péptido guía SEC12 de P. pastoris (CO-NA10), (2) el homólogo del transportador de UDP-GIcNAc (MmTr) de ratón, (3) el dominio catalítico de manosidasa IA (FB) de ratón fusionado en el extremo N-terminal al péptido guía SEC12 (FB8) de S. cerevisiae, y (4) el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris (PpURA5) flanqueados por repeticiones de lacZ (lacZ), todos flanqueados por la región 5' del gen ADE1 y el ORF (ADE1 5' y ORF) y la región 3' del gen ADE1 (PpADE1-3'). PpPMAl prom es el promotor PMA1 de P. pastoris; PpPMAl TT es la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de P. pastoris; SEC4 es el promotor SEC4 de P. pastoris; OCH1 TT es la secuencia de terminación de la transcripción 0CH1 de P. pastoris; ScCYC TT es la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae; PpOCHI Prom es el promotor OCH1 de P. pastoris; PpALG3 TT es la secuencia de terminación de la transcripción ALG3 de P. pastoris; y PpGAPDH es el promotor GADPH de P. pastoris.

La figura 10 muestra un mapa del plásmido pGLY582. El plásmido pGLY582 es un vector de integración que elige como objetivo el locus HIS1, y contiene cuatro cassettes de expresión en tándem que codifican para (1) la UDP-glucosa epimerasa de S. cerevisiae (ScGALI O), (2) el dominio catalítico de galactosiltransferasa I (hGaIT) de humano fusionado en el extremo N-terminal al péptido guia KRE2-S de S. cerevisiae (33), (3) el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris (PpURA5) flanqueados por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ), y (4) el transportador de UDP-galactosa de D. melanogaster (DmUGT), todos flanqueados por la región 5' del gen HIS1 (PpHIS1-5') y la región 3' del gen HIS1 (PpHIS1-3'). PMA1 es el promotor PMA1 de P. pastoris; PpPMAl TT es la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de P. pastoris; GAPDH es el promotor GADPH de P. pastoris, y ScCYC TT es la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae; PpOCHI Prom es el promotor OCH1 de P. pastoris, y PpALG12 TT es la secuencia de terminación de la transcripción ALG12 de P. pastoris.

La figura 1 1 muestra un mapa del plásmido pGLY167b. El plásmido pGLY167b es un vector de integración que elige como objetivo el locus ARG1, y contiene tres cassettes de expresión en tándem que codifican para (1) el dominio catalítico de manosidasa II (optimizado en codones) de D. melanogaster fusionado en el extremo N-terminal al péptido guía MNN2 (CO-KD53) de S. cerevisiae, (2) el gen HIS1 o la unidad de transcripción de P. pastoris, y (3) el dominio catalítico de /V-acetilglucosamina (GIcNAc) transferasa II (optimizado en codones) de rata fusionado en el extremo N-terminal al péptido guía MNN2 (CO-TC54) de S. cerevisiae, todos flanqueados por la región 5' del gen ARG1 (PpARG1-5') y la región 3' del gen ARG1 (PpARG1-3'). PpPMAl prom es el promotor PMA1 de P. pastoris, PpPMAl TT es la secuencia de terminación de la transcripción PMA 1 de P. pastoris; PpGAPDH es el promotor GADPH de P. pastoris; ScCYC TT es la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae; PpOCHI Prom es el promotor OCH1 de P. pastoris; y PpALG12 TT es la secuencia de terminación de la transcripción ALG12 de P. pastoris.

La figura 12 muestra un mapa del plásmido pGLY3411 (pSH1092). El plásmido pGLY341 1 (pSH1092) es un vector de integración que contiene el cassette de expresión que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris (PpURA5) flanqueados por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ) flanqueados en un lado por la secuencia de nucleótidos 5' del gen BMT4 de P. pastoris (PpPBS4 5'), y en el otro lado por la secuencia de nucleótidos 3' del gen BMT4 de P. pastoris (PpPBS4 3').

La figura 13 muestra un mapa del plásmido pGLY3419 (pSH1110). El plásmido pGLY3430 (pSH11 5) es un vector de integración que contiene un cassette de expresión que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris (PpURA5) flanqueados por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ) flanqueados en un lado por la secuencia de nucleótidos 5' del gen BMT1 de P. pastoris (PBS1 5'), y en el otro lado por la secuencia de nucleótidos 3' del gen BMT1 de P. pastoris (PBS1 3').

La figura 14 muestra un mapa del plásmido pGLY3421 (pSH1 106). El plásmido pGLY4472 (pSH1 186) contiene un cassette de expresión que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris (PpURA5) flanqueados por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ) flanqueados en un lado por la secuencia de nucleótidos 5' del gen BMT3 de P. pastoris (PpPBS3 5'), y en el otro lado por la secuencia de nucleótidos 3' del gen BMT3 de P. pastoris (PpPBS3 3').

La figura 15 muestra un mapa del plásmido pGLY3673. El plásmido pGLY3673 es un vector de integración KINKO que elige como objetivo el locus PR01 sin que perturbe la expresión del locus, y contiene cassettes de expresión que codifican para el dominio catalítico de s-1 ,2-manosidasa de T. reesei fusionado en el extremo N-terminal al péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae (aMATTrMan) que dirige la proteína quimérica hacia la vía secretoria y secreción de la célula.

La figura 16 muestra un mapa del plásmido pGLY6833 que codifica para las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo anti-Her2. El plásmido es un vector enrollable que elige como objetivo el locus TRP2. Los ORFs que codifican para las cadenas ligera y pesada están bajo el control de un promotor AOX1 de P. pastoris y la secuencia de terminación de la transcripción CIT1 3UTR de P. pastoris. La selección de transformantes usa la resistencia a zeocina codificada por el ORF de la proteína de resistencia a zeocina (ZeocinR) bajo el control de promotor TEF1 de P. pastoris y la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae.

La figura 17 muestra un mapa del plásmido pGLY6564 que codifica para las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo anti-RSV. El plásmido es un vector enrollable que elige como objetivo el locus TRP2. El ORF que codifica para la cadena pesada está bajo el control de un promotor AOX1 de P. pastoris y la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El ORF que codifica para la cadena ligera está bajo el control de un promotor AOX1 de P. pastoris y la secuencia de terminación de la transcripción AOX1 de P. pastoris. La selección de transformantes usa la resistencia a zeocina codificada por el ORF de la proteína de resistencia a zeocina (ZeocinR) bajo el control del promotor TEF1 de P. pastoris y la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae.

La figura 18 muestra el por ciento de ocupación del sitio de N-glucosilación de anticuerpos anti-Her2 y anti-RSV producidos en cepas control, contra cepas en las cuales la LmSTT3D es expresada constitutivamente (promotor GAPDH) o expresada induciblemente (promotor AOX1).

Las figuras 19A-19C muestran una comparación de la ocupación del sitio de N-glucosilación del anticuerpo anti-Her2 producido en la cepa YGLY13992 y la cepa YGLY17351 , en comparación con la ocupación del sitio de N-glucosilación de un anticuerpo anti-Her2 disponible comercialmente producido en células CHO (HERCEPTIN). La cepa YGLY13992 no incluye un cassette de expresión que codifica para la L T?STT3D, mientras que la cepa YGLY17351 incluye un cassette de expresión que codifica para la LmSTT3 bajo el control del promotor PpAOXI inducible.

La figura 20 muestra que el por ciento de ocupación del sitio de N-glucosilación de anticuerpos anti-Her2 producidos en la cepa YGLY17351 cultivada en varios biorreactores, fue consistente sin considerar la escala del biorreactor.

Las figuras 2 A y 21 B muestran los resultados de una CE y análisis Q-TOF de un lote comercial de anticuerpo anti-Her2 (HERCEPTIN).

Las figuras 22A y 22B muestran los resultados dé una CE y análisis Q-TOF para el mismo lote comercial que se usó para las figuras 21A y 21 B, pero después de tratamiento con PNGasa F por un período.

La figura 23A-23D muestra la genealogía de la cepa YGLY12900 de P. pastoris, comenzando de YGLY7961.

La figura 24 muestra un mapa del plásmido pGLY2456. El plásmido pGLY2456 es un vector de integración KINKO que elige como objetivo el locus TRP2 sin que perturbe la expresión del locus, y contiene seis cassettes de expresión que codifican para (1) el transportador de CMP-ácido siálico optimizado en codones de ratón (CO mCMP-Sia Transp), (2) el codón de UDP-GIcNAc 2-epimerasa/A/-acetilmanosamina cinasa optimizado de humano (CO hGNE), (3) el gen ARG1 o la unidad de transcripción de Pichia pastoris, (4) el codón de CMP-ácido siálico sintasa optimizado de humano (CO hCMP-NANA S), (5) el codón de N-acetilneuraminato-9-fosfato sintasa optimizado de humano (CO hSIAP S), y (6) el dominio catalítico de a-2,6-sialiltransferasa optimizado en codones de ratón fusionado en el extremo N-terminal al péptido guía KRE2 de S. cerevisiae (comST6-33), todos flanqueados por la región 5' del gen TRP2 y el ORF (PpTRP2 5') y la región 3' del gen TRP2 (PpTRP2-3'). PpPMAl prom es el promotor PMA 1 de P. pastoris; PpPMAl TT es la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de P. pastoris; CYC TT es la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae; PpTEF Prom es el promotor TEF1 de P. pastoris; PpTEF TT es la secuencia de terminación de la transcripción TEF1 de P. pastoris; PpALG3 TT es la secuencia de terminación de la transcripción ALG3 de P. pastoris; y pGAP es el promotor GAPDH de P. pastoris.

La figura 25 muestra un mapa del plásmido pGLY5048. El plásmido pGLY5048 es un vector de integración que elige como objetivo el locus STE13, y contiene cassettes de expresión que codifican para (1) el dominio catalítico de a-1 ,2-manosidasa de T. reesei fusionado en el extremo N-terminal al péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae (aMATTrMan) que dirige la proteína quimérica hacia la vía secretoria y secreción de la célula, y (2) el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris.

La figura 26 muestra un mapa del plásmido pGLY5019. El plásmido pGLY5019 es un vector de integración que elige como objetivo el locus DAP2, y contiene un cassette de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de resistencia a nourseotricina (NATR) enlazado operablemente al promotor TEF1 de Ashbya gossypii y secuencias de terminación de la transcripción TEF1 de A. gossypii flanqueados en un lado por la secuencia de nucleótidos 5' del gen DAP2 de P. pastoris, y en el otro lado por la secuencia de nucleótidos 3' del gen DAP2 de P. pastoris.

La figura 27 muestra un mapa del plásmido pGLY5085. El plásmido pGLY5085 es un plásmido KINKO para introducir un segundo juego de los genes implicados en la producción de N-glucanos sialilados en P. pastoris. El plásmido es similar al plásmido YGLY2456, salvo que el gen ARG1 de P. pastoris ha sido reemplazado con un cassette de expresión que codifica para resistencia a higromicina (HygR), y el plásmido elige como objetivo el locus TRP5 de P. pastoris. Los seis cassettes en tándem son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' y el ORF del gen TRP5 que termina en el codón de detención seguido de una secuencia de terminación de la transcripción ALG3 de P. pastoris, y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen TRP5.

La figura 28 muestra un mapa del plásmido pGLY7240. El plásmido es un vector de integración que elige como objetivo el locus TRP2, y contiene un ORF que codifica para la proteína de resistencia a zeocina (ZeocinR) bajo el control del promotor TEF1 de P. pastoris y la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El plásmido codifica para la proteína de fusión GM-CSF/CWP1 enlazada operablemente en el extremo 5' al promotor AOX1 de Pichia pastoris y en el extremo 3' a la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae.

La figura 29 muestra un Western blot del GM-CSF producido en la cepa YGLY16349, la cual co-expresa LmSTT3D, que la mayor parte del GM-CSF (campos 2 a 8) es glucosilado con sitios 2N-enlazados, en contraste con la cepa control (YGLY15560, campo 9) en donde el GM-CSF es predominantemente N-glucosilado con 1 sitio junto con las porciones menores de sitios 2 N y no glucosilados.

Las figuras 30A y 30B muestran un análisis Q-TOP del GM-CSF expresado de YGLY15560 (A) e YGLY16349 (B), respectivamente. No se detectó GM-CSF no glucosilado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un método para producir una glucoproteína terapéutica en una célula hospedera en la cual la ocupación del sitio de N-glucosilación de la glucoproteína es incrementada, sobre la ocupación del sitio de N-glucosilación de la misma glucoproteína producida en una célula hospedera no modificada como se describe en la presente. Cuando la presente invención se pone en práctica en una célula hospedera eucariótica inferior, por ejemplo, células hospederas de levadura o células hospederas de hongo filamentoso, la ocupación del sitio de N-glucosilación de las glucoproteínas recombinantes producidas en la célula hospedera es la misma que, o más similar a, la ocupación del sitio de N-glucosilación de las mismas glucoproteínas recombinantes producidas en células hospederas de humano o mamífero.

Para incrementar la ocupación del sitio de N-glucosilación en una glucoproteína producida en una célula hospedera recombinante, por lo menos una molécula de ácido nucleico que codifica para por lo menos una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga, la cual en modalidades particulares por lo menos una es capaz de suprimir funcionalmente una mutación letal de una o más subunidades esenciales que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno hetero-oligomérico de la célula hospedera, es sobreexpresada en la célula hospedera recombinante ya sea antes o simultáneamente con la expresión de la glucoproteína en la célula hospedera.

La proteína STT3A de Leishmania major, proteína STT3B de Leishmania major y proteína STT3D de Leishmania major, son oligosacariltransferasas de una sola subunidad que se ha mostrado suprimen el fenotipo letal de una deleción del locus STT3 en Saccharomyces cerevisiae (Naseb et al., Molec. Biol. Cell 19: 3758-3768 (2008)). Naseb et al. (ibid.) mostraron además que la proteína STT3D de Leishmania major podría suprimir el fenotipo letal de una deleción de los loci WBP1, OST1, SWP1 u OST2. Hese et al. (Glycobiology 19: 160-171 (2009)) enseñan que las proteínas STT3A (STT3-1), STT3B (STT3-2) y STT3D (STT3-4) de Leishmania major pueden complementar funcionalmente deleciones de los loci OST2, SWP1 y WBP1. La proteína STT3D de Leishmania major (LmSTT3D) es una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heterologa que es capaz de suprimir un fenotipo letal de una mutación Astt3, y por lo menos un fenotipo letal de una mutación Awbpl, Aostl, Aswpl y Aost2 que se muestra en los ejemplos en la presente, es capaz de incrementar la ocupación del sitio de N-glucosilación de las glucoproteinas heterólogas, por ejemplo anticuerpos, producidos por la célula hospedera.

Las una o más oligosacariltransferasas de una sola subunidad heterólogas son sobreexpresadas constitutivamente o induciblemente en presencia de las proteínas que comprenden el complejo de OTasa endógeno de la célula hospedera, incluyendo la proteína STT3 de la célula hospedera. Un cassette de expresión que codifica para cada gen de oligosacariltransferasa de una sola subunidad heterologa, puede ser integrado en cualquier sitio dentro del genoma de la célula hospedera o localizado en el espacio extracromosómico de la célula hospedera, es decir, replicando en forma autónoma elementos genéticos tales como plásmidos, virus, plásmido de 2 µ??, minicromosomas, y similares. En general, las oligosacariltransferasas de una sola subunidad heterólogas son provistas a la célula hospedera en cassettes de expresión, cada uno comprendiendo una molécula de ácido nucleico que codifica para un marco de lectura abierto (ORF) de oligosacariltransferasa de una sola subunidad enlazado operablemente a un promotor constitutivo o inducible heterólogo y otros elementos reguladores de la transcripción o traducción heterólogos adecuados para la expresión de las proteínas heterólogas en una célula hospedera particular. Una o más copias de cada cassette de expresión son integradas en uno o más sitios en el genoma de la célula hospedera, ya sea mediante determinación del blanco específica del sitio de un locus particular para integración, o integrando aleatoriamente el cassette de expresión en el genoma. El locus para la integración dirigida puede seleccionarse con base en la conveniencia del locus para la expresión constitutiva o inducible ectópica de la oligosacariltransferasa de una sola subunidad en el cassette de expresión. Métodos para integrar moléculas de ácido nucleico heterólogas en el genoma de una célula hospedera mediante técnicas tales como recombinación homologa de cruzamiento sencillo o de doble cruzamiento, y similares, son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la solicitud publicada de E.U.A. No. 20090124000 y la solicitud internacional publicada No. WO2009085 35, cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia). En forma alternativa, o además de la integración de una o más copias del cassette de expresión en el genoma de la célula hospedera, una o más copias del cassette de expresión son localizadas en el espacio extracromosómico de la célula hospedera usando un plásmido de 2 µ, vector viral, minicromosoma, u otro vector genético que se replique en forma autónoma.

Mientras que la presente invención se ha ejemplificado en la presente con células hospederas de Pichia pastoris genéticamente diseñadas para producir patrones de glucosilación tipo humano o de mamífero que comprenden N-glucanos complejos, la presente invención incrementa la cantidad general de ocupación del sitio de N-glucosilación de las glucoproteinas producidas en la célula hospedera, en comparación con la de las glucoproteinas producidas en el hospedero no modificado como se describe en la presente, y para expresar el gen de oligosacariltransferasa de una sola subunidad, puede aplicarse también a células hospederas de Pichia pastoris que no son genéticamente diseñadas para producir glucoproteinas que tienen patrones de glucosilación tipo humano o de mamífero, sino más bien expresan glucoproteinas que tienen patrones de glucosilación de tipo silvestre o endógenos, por ejemplo, N-glucosilación hipermanosilada, o cuando la célula hospedera carece de actividad de alfa-1 ,6-manosiltransferasa (ochl p), N-glucosilación de alto contenido de mañosa. La presente invención puede aplicarse también a otras células hospederas de levaduras u hongos filamentosos o a células hospederas de plantas o algas, las cuales expresan glucoproteinas que tienen patrones de glucosilación de tipo silvestre o endógenos, por ejemplo, N-glucosilación hipermanosilada, o cuando la célula hospedera carece de actividad de alfa- ,6-manosiltransferasa (ochlp), N-glucosilación de alto contenido de mañosa, o las cuales han sido genéticamente diseñadas para producir N-glucanos híbridos o complejos tipo humano o de mamífero, para incrementar la cantidad general de ocupación del sitio de N-glucosilación de las glucoproteinas producidas en la célula hospedera, en comparación con la de las glucoproteínas producidas en el hospedero no modificado como se describe en la presente para expresar el gen de oligosacariltransferasa de una sola subunidad. La presente invención puede aplicarse también a sistemas de expresión de mamífero para incrementar la ocupación del sitio de N-glucosilación general de glucoproteínas que tienen más de dos sitios N-enlazados, en comparación con la de las glucoproteínas producidas en la célula hospedera no modificada como se describe en la presente para expresar el gen de oligosacariltransferasa de una sola subunidad.

El complejo de OTasa de animales, plantas y hongos, es un complejo de proteínas hetero-oligoméricas. En el organismo modelo bien estudiado Saccharomyces cerevisiae, el complejo de OTasa parece consistir comúnmente de por lo menos ocho subunidades diferentes: Ostlp, Ost2p, Wbp1 , Stt3p, Swpl p, Ost4p, Ost5p y Ost3p/Ost6p (Silberstein y Gilmore, FASEB J. 10: 849-858 (1996); Knauer y Lehle, Biochim. Biophys. Acta. 1426: 259-273 (1999); Dempski e Imperiali, Curr. Opin. Chem. Biol. 6: 844-850 (2002); Yan y Lennarz, J. Biol. Chem. 277: 47692-47700 (2005); Kelleher y Gilmore, Glycobiol. 16: 47R-62R (2006); Weerapana e Imperiali, Glycobiol. 16: 91 R-101 R (2006)). En Pichia pastoris, el complejo de OTasa parece incluir por lo menos a Ostl p, Ost2p, Ost3p, Ost4p, Ost6p, Wbp1 , Swpl p y Stt3p (véase Shutter et al., Nat. Biotechnol. 27: 561-566 (2009)).

Se ha formulado la hipótesis de que la proteína ST73 es la subunidad catalítica en el complejo de OTasa (Yan y Lennarz, J. Biol. Chem. 277. 47692^7700 (2002); Kelleher ef al., Mol. Cell. 12: 101-1 11 (2003); Nilsson et al., J. Cell Biol. 161 : 715-725 (2003)). El apoyo de esta hipótesis proviene de experimentos que muestran que el homólogo procariótico de Stt3p de levadura es una oligosacariltransferasa activa en ausencia de cualquier otra proteína accesoria (Wacker et al., Science 298: 1790-1793 (2002); Kowarik et al., Science 314: 1 148-1150 (2006)). Proteínas homologas a Stt3p de levadura son codificadas en casi todos los genomas eucarióticos (Kelleher y Gilmore, Glycobiol. 16: 47R-62R (2006)). Sin embargo, el análisis comparativo del genoma sugiere que la composición de la OTasa llegó a ser cada vez más compleja durante la divergencia evolutiva de los eucariontes.

Oligosacariltransferasas de una sola subunidad están presentes en Giardia y los cinetoplastos, mientras que oligosacariltransferasas de cuatro subunidades que consisten de los homólogos de STT3, OST1 , OST2 y WBP1 se encuentran en diplomónados, entamoebas y especies de apicomplexanos. Además, formas múltiples de las proteínas STT3 putativas pueden ser codificadas en el genoma de tripanosomátidos: tres homólogos de STT3 se encuentran en Trypanosoma brucei y cuatro en Leishmania major (McConville et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66: 122-154 (2002); Berriman et al., Science. 309: 416-422 (2005); Ivens ef al., Science. 309: 436-442 (2005); Samuelson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102: 1548-1553 (2005); Kelleher y Gilmore, Glycobiol. 16: 47R-62R (2006)).

En los parásitos tripanosomátidos, la glucosilación N-enlazada sigue principalmente la vía descrita para las células de hongos o animales, pero con diferentes estructuras de oligosacáridos transferidas a la proteína (Parodi, Glycobiology 3: 193-199 (1993); McConville et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66: 122-154 (2002)). Se ha mostrado que, dependiendo de la especie, Man6GlcNAc2 o Man7GlcNAc2 es el glucano más grande transferido a la proteína en el género Leishmania (Parodi, Glycobiology 3: 193-199 (1993). A diferencia de las oligosacariltransferasas de levaduras y mamíferos que usan de preferencia Glc3Man9GlcNAc2, la oligosacariltransferasa de los tripanosomas no es selectiva y transfiere diferentes oligosacáridos enlazados a lípidos a la misma velocidad (Bosch et al., J. Biol. Chem. 263: 17360-17365 (1988)). Por lo tanto, la oligosacariltransferasa eucariótica más simple es una proteína STT3 de una sola subunidad, similar a la oligosacariltransferasa encontrada en los sistemas de N-glucosilación bacterianos. Naseb et al., Molecular Biology of the Cell 19: 3758-3768 (2008) expresaron cada una de las cuatro proteínas STT3 de Leishmania major individualmente en Saccharomyces cerevisiae, y encontraron que tres de ellas, la proteína LmSTT3A, la proteína L/r?STT3B y la proteína LmSTT3D, fueron capaces de complementar una deleción del locus STT3 de la levadura. Además, la expresión de LmSTT3D suprimió el fenotipo letal de deleciones simples y dobles en genes que codifican para varias subunidades de OTasa esenciales. Las proteínas LmSTT3 no incorporaron en la levadura el complejo de OTasa, sino más bien formaron una enzima homodimérica, capaz de reemplazar la enzima multimérica endógena de la célula de levadura. Los resultados indican que mientras que estas oligosacariltransferasas de una sola subunidad pueden parecerse a las enzimas procarióticas, usan substratos típicos para la glucosilación en eucariontes: es decir, el sitio de reconocimiento de N-glucosilación N-X-S/T y oligosacáridos de alto contenido de mañosa enlazados a pirofosfato de dolicol.

La ocupación del sitio de N-glucosilación en levaduras se ha discutido también en reportes, por ejemplo, por Schultz y Aebi, Molec. Cell. Proteomics 8: 357-364 (2009); Hese et al., en la obra citada) y Naseb et al., (en la obra citada). Se ha mostrado que la expresión de la proteína STT3 de Toxoplasma gondii o Trypanosoma cruzi en Saccharomyces cerevisiae, complementa el fenotipo letal de una deleción de stt3 (Shams-Eldin et al., Mol. Biochem. Parasitol. 143: 6-11 (2005); Castro et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 103: 14756-14760 (2006), y mientras que la proteína STT3 de Trypanosoma cruzi se integra en el complejo de OTasa de levaduras, las proteínas STT3 de Leishmania major parecen más bien formar homodímeros (Naseb et al., en la obra citada). Sin embargo, en estos reportes, la proteína LmSTT3D se había puesto a prueba por su supresión funcional de una mutación letal del locus STT3 endógeno de levadura y otros componentes esenciales del complejo de OTasa de levadura en estudios que midieron la ocupación del sitio de N-glucosilación de proteínas endógenas. Además, las cepas de levadura que se usaron en los estudios produjeron glucoproteínas que tuvieron un patrón de glucosilación de levadura, no un patrón de glucosilación tipo humano o de mamífero que comprendía N-glucanos híbridos o complejos.

En contraste con los reportes anteriores, en la presente invención el marco de lectura abierto que codifica para una proteína oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga (como se ejemplifica en la presente con el marco de lectura abierto que codifica para la proteína LmSTT3D) es sobreexpresado constitutivamente o induciblemente en la célula hospedera recombinante en la cual la célula hospedera expresa además los genes endógenos que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) de la célula hospedera, que incluye la expresión del gen STT3 endógeno de la célula hospedera. De esta manera, la célula hospedera expresa la oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga y el complejo de OTasa endógeno de la célula hospedera, incluyendo la proteína SST3 endógena de la célula hospedera. Además, con respecto a células hospederas recombinantes de levaduras, hongos filamentosos, algas o plantas, las células hospederas pueden ser además genéticamente diseñadas para producir glucoproteínas que comprenden un patrón de glucosilación tipo humano o de mamífero que comprenden N-glucanos híbridos y/o complejos, y no glucoproteínas que tienen el patrón de glucosilación endógeno de la célula hospedera.

La presente invención se ha ejemplificado en la presente usando células hospederas de Pichia pastoris genéticamente diseñadas para producir N-glucanos complejos tipo humano o de mamífero; sin embargo, la presente invención puede aplicarse a otras células hospederas de levadura (que incluyen, pero no están limitadas a, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Ogataea minuta y Pichia pastoris) u hongos filamentosos (que incluyen, pero no están limitados a, Tríchoderma reesei), que producen glucoproteínas que tienen N-glucanos de hongos o levaduras (ya sea N-glucanos hipermanosilados o N-glucanos de alto contenido de mañosa), o genéticamente diseñadas para producir glucoproteínas que tienen N-glucanos híbridos o complejos de alto contenido de mañosa tipo humano o de mamífero, para mejorar la ocupación del sitio de N-glucosilación general de las glucoproteínas producidas en la célula hospedera. Además, la presente invención puede aplicarse también a sistemas de expresión de plantas y mamíferos para mejorar la ocupación del sitio de N-glucosilación general de las glucoproteínas producidas en estos sistemas de expresión de plantas o mamíferos, en particular glucoproteínas que tienen más de dos sitios de glucosilación N-enlazados.

Por lo tanto, en un aspecto de lo anterior, se provee un método para producir una glucoproteína heteróloga en una célula hospedera, que comprende proveer una célula hospedera que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para por lo menos una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína heteróloga, y en donde los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno, son expresados; y cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que exprese la glucoproteína heteróloga para producir la glucoproteína heteróloga.

En otro aspecto de lo anterior, se provee un método para producir una glucoproteína heteróloga con N-glucanos híbridos o complejos tipo humano o de mamífero en una célula hospedera, que comprende proveer una célula hospedera que es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que tienen N-glucanos tipo humano e incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para por lo menos una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína heteróloga, y en donde los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno, son expresados; y cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que exprese la glucoproteína heteróloga para producir la glucoproteína heteróloga.

La expresión de los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa), incluye la expresión del gen endógeno de la célula hospedera que codifica para la proteína STT3 endógena o su homólogo. En el caso de células hospederas de levadura, los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de OTasa son expresados, lo cual incluye la expresión del gen STT3 endógeno. Actualmente, se sabe que los genes que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de OTasa de Saccharomyces cerevisiae, incluyen a OST1, OST2, OST3, OST4, OS 75, OST6, WBP1, SWP1 y STT3 (véase, por ejemplo, Spirig et al., Molec. Gen. Genet. 256: 628-637 (1997), y en Pichia pastoris, el complejo de OTasa parece incluir por lo menos a Ostl p, Ost2p, Ost3p, Ost4p, Ost6p, Wbp1 , Swpl p y Stt3p (véase Shutter et al., en la obra citada).

En general, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga es capaz de suprimir funcionalmente el fenotipo letal de una mutación de por lo menos una proteina esencial de un complejo de OTasa, por ejemplo, un complejo de OTasa de levadura. De esta manera, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga es capaz de rescatar o de complementar funcionalmente una mutación letal de por lo menos una proteína esencial de un complejo de OTasa. En otros aspectos, la proteína esencial del complejo de OTasa es codificada por el locus STT3, locus WBP1, locus OST1, locus SWP1 o locus OST2, u homólogo de mismo, de Saccharomyces cerevisiae y/o Pichia pastoris. En general, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga que puede usarse en los métodos de la presente para incrementar la ocupación del sitio de N-glucosilación, es una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga que en modalidades particulares es capaz de suprimir (o de rescatar o complementar) funcionalmente el fenotipo letal de por lo menos una proteína esencial del complejo de OTasa de Saccharomyces cerevisiae y/o Pichia pastoris. Por ejemplo, en otros aspectos, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga es la proteína STT3D de Leishmania major, la cual es capaz de suprimir (o de rescatar o complementar) funcionalmente el fenotipo letal de por lo menos una proteína esencial del complejo de OTasa de Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris. Por lo tanto, para una célula hospedera particular, una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heterologa particular es adecuada para expresión en la célula hospedera particular, siempre que la oligosacariltransferasa de una sola subunidad heterologa sea capaz de suprimir el fenotipo letal de por lo menos una proteína esencial del complejo de OTasa de levadura. En otro aspecto, se selecciona una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heterologa para expresión en una célula hospedera particular, siempre que la oligosacariltransferasa de una sola subunidad heterologa sea capaz de suprimir el fenotipo letal de por lo menos una proteína esencial del complejo de OTasa de Saccharomyces cerevisiae y/o Pichia pastoris. Las proteínas esenciales incluyen a OST1, OST2, WBP1, SWP1 y STT3.

Como se usa en la presente, una mutación letal incluye una deleción o perturbación del gen que codifica para la proteína esencial del complejo de OTasa, o una mutación en la secuencia codificante que hace que la proteína esencial sea no funcional. El término puede incluir además mutaciones para expresión abatible, en donde la producción de una proteína esencial funcional es anulada usando ARNsh o ARNi.

Se provee además una célula hospedera, que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica para por lo menos una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heterologa; y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica para una glucoproteína heterologa; y la célula hospedera expresa sus genes endógenos que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno, que incluye expresar el gen endógeno de la célula hospedera que codifica para la proteína STT3 de la célula hospedera, que en levaduras es el gen STT3. En otros aspectos de una célula hospedera de levadura, la célula hospedera expresa los genes endógenos que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de OTasa.

En aspectos particulares de cualquiera de lo anterior, la célula hospedera comprende además una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para oligosacariltransferasas heterólogas adicionales, que pueden incluir oligosacariltranferasas multiméricas o de una sola subunidad. Por ejemplo, la célula hospedera puede comprender una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para una o más oligosacariltransferasas de una sola subunidad seleccionadas del grupo que consiste de la proteína LmSTT3A, proteína LmSTT3B y proteína LmSTT3D. En otros aspectos, la célula hospedera puede incluir además una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína LmSTT3C. En otros aspectos de cualquiera de lo anterior, la célula hospedera puede incluir una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para una o más oligosacariltransferasas seleccionadas del grupo que consiste de la proteína STT3 de Toxoplasma gondii, proteína STT3 de Trypanosoma cruzi, proteína STT3 de Trypanosoma brucei y proteína STT3 de C. elegans. En otros aspectos de cualquiera de lo anterior, la célula hospedera puede incluir además una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína STT3 de Pichia pastoris.

Eucariontes inferiores tales como levaduras u hongos filamentosos se usan con frecuencia para la expresión de glucoproteínas recombinantes, debido a que pueden cultivarse económicamente, dan altos rendimientos, y cuando son adecuadamente modificados, son capaces de mostrar glucosilación adecuada. Las levaduras en particular ofrecen genética establecida que permite transfecciones rápidas, estrategias de localización de proteínas puestas a prueba y técnicas de expresión bloqueada fácil de genes. Los vectores adecuados tienen secuencias de control de la expresión, tales como promotores, que incluyen 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, y un origen de replicación, secuencias de terminación de la transcripción, y similares, según se desee.

Células hospederas eucarióticas inferiores útiles incluyen, pero no están limitadas a, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa. Varias levaduras, tales como K. lactis, Pichia pastoris, Pichia methanolica y Hansenula polymorpha, son particularmente adecuadas para el cultivo de células, debido a que son capaces de crecer a altas densidades de células y secretan grandes cantidades de proteína recombinante. Asimismo, hongos filamentosos tales como Aspergillus niger, Fusarium sp, Neurospora crassa y otros, pueden usarse para producir las glucoproteínas de la invención a una escala industrial. En el caso de eucariontes inferiores, se cultivan habitualmente células de entre aproximadamente 1.5 días y 3 días.

Por lo tanto, se provee un método para producir una glucoproteina heteróloga en una célula hospedera eucariótica inferior, que comprende proveer una célula hospedera eucariótica inferior que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteina heteróloga; y cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que exprese la glucoproteina heteróloga para producir la glucoproteina heteróloga.

Se provee además una célula hospedera eucariótica inferior, que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga; y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica para una glucoproteina heteróloga; y en donde los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa), son expresados.

Se provee además una célula hospedera de hongo filamentoso o levadura, que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga; y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica para una glucoproteína heteróloga; y en donde los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa), son expresados. Esto incluye la expresión del gen STT3 endógeno, que en levaduras es el gen STT3.

En aspectos particulares, la célula hospedera de hongo filamentoso o de levadura anterior, puede ser una célula hospedera que produce glucoproteínas que tienen un patrón de glucosilación tipo hongo filamentoso o tipo levadura. El patrón de glucosilación de levadura puede incluir N-glucanos hipermanosilados, o la levadura puede ser genéticamente diseñada para carecer de actividad de a1 ,6-manosíltransferasa, es decir, la célula hospedera es genéticamente diseñada para carecer de actividad de ochl p, en cuyo caso la levadura produce glucoproteínas que tienen N-glucanos de alto contenido de mañosa que no son además hipermanosilados.

En modalidades particulares de los métodos y células hospederas anteriores, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga es capaz de suprimir funcionalmente el fenotipo letal de una mutación de por lo menos una proteína esencial del complejo de OTasa. En otros aspectos, la proteína esencial del complejo de OTasa es codificada por el locus STT3, locus WBP1, locus OST1, locus SWP1 o locus OST2, u homólogo del mismo. En otros aspectos, por ejemplo, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3D de Leishmania major.

Los métodos y las células hospederas de la presente proveen un medio para producir glucoproteínas heterólogas en una célula hospedera, en donde la ocupación del sitio de N-glucosilación de una composición de las glucoproteínas heterólogas es mayor que la ocupación del sitio de N-glucosilación para el heterólogo producido en la célula hospedera no modificada como se describe en la presente, para expresar una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga y los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa). Para una célula hospedera eucariótica inferior tal como una levadura, cuando la ocupación del sitio de N-glucosilación de una glucoproteína heteróloga es menor que la obtenida para la glucoproteína heteróloga cuando se produce en células de humano o de mamífero, puede hacerse que la ocupación del sitio de N-glucosilación de la glucoproteína producida en la célula hospedera sea la misma que, o más similar a, la ocupación del sitio de N-glucosilación de la glucoproteína en la célula de humano o de mamífero, produciendo la glucoproteína en una célula hospedera que expresa una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga y los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa). Como se muestra en los ejemplos, las células hospederas de Pichia pastoris que expresan una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga y los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa), son capaces de producir anticuerpos en donde la ocupación del sitio de N-glucosilación de los anticuerpos es similar al de los anticuerpos producidos en células de ovario de hámster chino (CHO) (véase también las figuras 19A-19C).

Un método para medir la ocupación del sitio de N-glucosilación, consiste en separar y medir la cantidad de proteína glucosilada y proteína no glucosilada, y determinar la ocupación del sitio de N-glucosilación usando la fórmula: (Moles de proteína glucos¡lada)/(moles de proteína glucosilada + moles de proteína no glucosilada) x 100 = por ciento de ocupación del sitio de N- glucosilación Cuando se mide la ocupación del sitio de N-glucosilación de los anticuerpos en una composición de anticuerpo, los anticuerpos en la composición son reducidos, y se determinan los moles de las cadenas pesadas glucosiladas y no glucosiladas. Cada cadena pesada tiene un sitio de N-glucosilación en Asn-297. El por ciento de ocupación del sitio de N-glucosilación se determina con base en el total de moles de N-glucanos liberados y el total de moles de cadenas pesadas del anticuerpo. Por ejemplo, una ocupación del sitio de N-glucosilación de 94% indicaría que 94% de las cadenas pesadas en la composición tienen un N-glucano n Asn-297, y 6% de las cadenas pesadas carecerían de un N-glucano. Los anticuerpos consisten de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. En el ejemplo anterior, los anticuerpos en la composición pueden tener ambas cadenas pesadas enlazadas a un N-glucano, una de las dos cadenas pesadas con un N-glucano, o ninguna cadena con un N-glucano. Por lo tanto, una ocupación del sitio de N-glucosilación de 94% de las cadenas pesadas, sugeriría que aproximadamente 88% de los anticuerpos en la composición tendrían ambas cadenas pesadas N-glucosiladas, y 11.4% de los anticuerpos tendrían sólo una de las dos cadenas pesadas N-glucosilada. Para obtener una indicación cualitativa de que lo anterior es correcto, se analizan anticuerpos enteros mediante un método tal como Q-TOF (espectrómetro de masa de cuadripolo híbrido-tiempo de vuelo con capacidad de MS/MS).

Un método general para medir la ocupación del sitio de N-glucosilación de los anticuerpos puede usar el siguiente método, el cual se ejemplifica en el ejemplo 3. Los anticuerpos son reducidos a cadenas pesadas (HC) y cadenas ligeras (LC), y se determina la cantidad de cadenas pesadas glucosiladas (GHC) y cadenas pesadas no glucosiladas (NGHC), mediante un método tal como la electroforesis capilar. La ocupación del sitio de N-glucosilación se determina usando la fórmula: Moles de GHC)/(moles de GHC + moles de NGHC) x 100 = por ciento de ocupación de las HC del sitio de N-glucosilación Para cualquier sitio de N-glucosilación, el sitio es ocupado o no. Por lo tanto, una ocupación de 100% del N-glucano sería equivalente a una relación de 1 :1 (1 mol de N-glucano por 1 mol de sitio de N-glucosilación, por ejemplo, cadena pesada de anticuerpo reducido) o 2:1 (2 moles de N-glucano por 1 mol de proteína con dos sitios de N-glucosilación, por ejemplo, anticuerpo no reducido). Una ocupación de 80% del N-glucano sería equivalente a una relación de 0.8:1 (0.8 moles de N-glucano por 1 mol de sitio de N-glucosilación, por ejemplo, cadena pesada de anticuerpo reducido) o 1.6:1 (1.6 moles de N-glucano por mol de proteína con dos sitios de N-glucosilación, por ejemplo, anticuerpo no reducido).

Puede llegarse a una estimación de la proporción de anticuerpos enteros en los cuales ambas cadenas pesadas son glucosiladas, mediante la fórmula (fracción de GHC)2 x 100 = anticuerpos completamente ocupados (anticuerpos enteros no reducidos, en los cuales ambos sitios de N-glucosilación son ocupados). El ejemplo 3 muestra que los métodos de la presente permiten la producción de composiciones de anticuerpo, en donde aproximadamente 70% a aproximadamente 98% de las moléculas de anticuerpo enteras no reducidas en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados. Puesto que la medición de la ocupación del sitio de N-glucosilación se determinó usando moléculas de anticuerpo reducidas, los resultados de la presente muestran que para composiciones que comprenden moléculas de glucoproteína que contienen un sólo sitio de glucosilación, más de 84% a por lo menos 99% de las moléculas de glucoproteína fueron N-glucosiladas. Por lo tanto, los métodos y las células hospederas de la presente permiten la producción de composiciones de glucoproteína en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de los sitios de N-glucosilación de las glucoproteínas en la composición son ocupados.

Otro método para medir la ocupación del sitio de N-glucosilación de glucoproteínas en una composición de glucoproteína, puede lograrse liberando los N-glucanos de las glucoproteínas en la composición, y midiendo la cantidad molar de los N-glucanos liberados y la cantidad molar de glucoproteína veces el número de sitios de glucosilación en la glucoproteína. Puede usarse la siguiente fórmula: (Total de moles de A/-glucanos)/(total de moles de glucoproteína x No. de sitios) x100 = por ciento de ocupación del sitio de N-glucosilación La fórmula anterior dará el por ciento del total de sitios de N-glucosilación que son ocupados.

Eucariontes inferiores, en particular las levaduras, pueden ser genéticamente modificados de modo que expresen glucoproteínas en las cuales el patrón de glucosilación sea de tipo humano o de mamífero o humanizado. De esta manera, pueden producirse composiciones de glucoproteína en las cuales una glucoforma deseada específica sea predominante en la composición. Esto puede lograrse eliminando enzimas de glucosilación endógenas seleccionadas y/o diseñando genéticamente las células hospederas y/o suministrando enzimas exógenas que imiten la totalidad o parte de la vía de glucosilación de mamíferos, como se describe en la solicitud publicada de E.U.A. No. 2004/0018590, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. Si se desea, puede llevarse a cabo el diseño genético adicional de la glucosilación, de modo que la glucoproteína pueda producirse con o sin fucosilación del núcleo.

Eucariontes inferiores tales como las levaduras pueden ser genéticamente modificados de modo que expresen glucoproteínas en las cuales el patrón de glucosilación sea de tipo humano o de mamífero o humanizado. Esto puede lograrse eliminando enzimas de glucosilación endógenas seleccionadas y/o suministrando enzimas exógenas como se describe en Gerngross et al., patente de E.U.A. No. 7,449,308, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. De esta manera, en aspectos particulares de la invención, la célula hospedera es una levadura, por ejemplo, una levadura metilotrófica tal como Pichia pastoris u Ogataea minuta, y mutantes de las mismas, y variantes genéticamente diseñadas de las mismas. De esta manera, pueden producirse composiciones de glucoproteína en las cuales una glucoforma deseada específica sea predominante en la composición. Esto puede lograrse eliminando enzimas de glucosilación endógenas seleccionadas y/o diseñando genéticamente las células hospederas y/o suministrando enzimas exógenas que imiten la totalidad o parte de la vía de glucosilación de mamíferos, como se describe en la patente de E.U.A. No. 7,449,308, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. Si se desea, puede llevarse a cabo el diseño genético adicional de la glucosilación, de modo que la glucoproteína pueda producirse con o sin fucosilación del núcleo. El uso de células hospederas eucarióticas inferiores tales como las levaduras es además ventajoso, porque estas células son capaces de producir composiciones de glucoproteína relativamente homogéneas, de modo que la glucoforma predominante de la glucoproteína puede estar presente como más de 30% en moles de la glucoproteína en la composición. En aspectos particulares, la glucoforma predominante puede estar presente en más de 40% en moles, 50% en moles, 60% en moles, 70% en moles y, más preferiblemente, más de 80% en moles de la glucoproteína presente en la composición. Esto puede lograrse eliminando enzimas de glucosilación endógenas seleccionadas y/o suministrando enzimas exógenas como se describe en Gerngross et al., patente de E.U.A. No. 7,029,872 y patente de E.U.A. No. 7,449,308, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. Por ejemplo, puede seleccionarse o puede diseñarse una célula hospedera para que esté agotada en actividades de 1 ,6-manosil transferasa, lo cual de otra manera añadiría residuos de mañosa en el N-glucano en una glucoproteína.

En una modalidad, la célula hospedera incluye además un dominio catalítico de a1 ,2-manosidasa fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico y seleccionado para dirigir la actividad de a1 ,2-manosidasa hacia el ER o el aparato Golgi de la célula hospedera. El paso de una glucoproteína recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteína recombinante que comprende una glucoforma Man5GlcNAc2, por ejemplo, una composición de glucoproteína recombinante que comprende predominantemente una glucoforma Man5GlcNAc2. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 7,029,872, la patente de E.U.A. No. 7,449,308 y la solicitud de patente publicada de E.U.A. No. 2005/0170452, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia, describen células hospederas eucarióticas inferiores capaces de producir una glucoproteína que comprende una glucoforma Man5GlcNAc2.

En otra modalidad, la célula hospedera inmediatamente anterior incluye además un dominio catalítico de /V-acetilglucosaminiltransferasa I (GIcNAc transferasa I o GnT I) fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico y seleccionado para dirigir la actividad de GIcNAc transferasa I hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. El paso de la glucoproteína recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteína recombinante que comprende una glucoforma GlcNAcMan5GlcNAc2, por ejemplo, una composición de glucoproteína recombinante que comprende predominantemente una glucoforma GlcNAcMan5GlcNAc2. La patente de E.U.A. No, 7,029,872, la patente de E.U.A. No. 7,449,308 y la solicitud de patente publicada de E.U.A. No. 2005/0170452, cuya descripción se incorpora enteramente en la presente como referencia, describen células hospederas eucarióticas inferiores capaces de producir una glucoproteína que comprende una glucoforma GlcNAcMan5GlcNAc2. La glucoproteína producida en las células anteriores puede tratarse in vitro con una hexaminidasa para producir una glucoproteína recombinante que comprende una glucoforma Man5GlcNAc2.

En otra modalidad, la célula hospedera inmediatamente anterior incluye además un dominio catalítico de manosidasa II fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico y seleccionado para dirigir la actividad de manosidasa II hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. El paso de la glucoproteina recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteina recombinante que comprende una glucoforma GlcNAcMan3GlcNAc2, por ejemplo, una composición de glucoproteina recombinante que comprende predominantemente una glucoforma GlcNAcMan3GlcNAc2. La patente de E.U.A. No. 7,029,872 y la patente de E.U.A. No. 7,625,756, cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente como referencia, describen células hospederas eucarióticas inferiores que expresan enzimas manosidasa II, y son capaces de producir glucoproteínas que tienen predominantemente una glucoforma GlcNAc2Man3GlcNAc2. La glucoproteina producida en las células anteriores puede tratarse in vitro con una hexaminidasa para producir una glucoproteina recombinante que comprende una glucoforma Man3GlcNAc2.

En otra modalidad, la célula hospedera inmediatamente anterior incluye además un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa II (GlcNAc transferasa II o GnT II) fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico y seleccionado para dirigir la actividad de GlcNAc transferasa II hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. El paso de la glucoproteina recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteina recombinante que comprende una glucoforma GlcNAc2Man3GlcNAc2, por ejemplo, una composición de glucoproteína recombinante que comprende predominantemente una glucoforma GlcNAc2Man3GlcNAc2. Las patentes de E.U.A. Nos. 7,029,872 y 7,449,308 y la solicitud de patente publicada de E.U.A. No. 2005/0170452, cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente como referencia, describen células hospederas eucarióticas inferiores capaces de producir una glucoproteína que comprende una glucoforma GlcNAc2Man3GlcNAc2- La glucoproteína producida en las células anteriores puede tratarse in vitro con una hexaminidasa para producir una glucoproteína recombinante que comprende una glucoforma Man3GlcNAc2.

En otra modalidad, la célula hospedera inmediatamente anterior incluye además un dominio catalítico de galactosiltransferasa fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico y seleccionado para dirigir la actividad de galactosiltransferasa hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. El paso de la glucoproteína recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteína recombinante que comprende una glucoforma GalGlcNAc2Man3GlcNAc2 o Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, o mezcla de la misma, por ejemplo, una composición de glucoproteína recombinante que comprende predominantemente una glucoforma GalGlcNAc2Man3GlcNAc2 o glucoforma Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, o mezcla de la misma. La patente de E.U.A. No. 7,029,872 y la solicitud de patente publicada de E.U.A. No. 2006/0040353, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia, describen células hospederas eucarióticas inferiores capaces de producir una glucoproteina que comprende una glucoforma Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2. La glucoproteína producida en las células anteriores puede tratarse in vitro con una galactosidasa para producir una glucoproteína recombinante que comprende una glucoforma GlcNAc2Man3GlcNAc2, por ejemplo, una composición de glucoproteína recombinante que comprende predominantemente una glucoforma GlcNAc2Man3GlcNAc2.

En otra modalidad, la célula hospedera inmediatamente anterior incluye además un dominio catalítico de sialiltransferasa fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico y seleccionado para dirigir la actividad de sialiltransferasa hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. El paso de la glucoproteína recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteína recombinante que comprende predominantemente una glucoforma NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 o glucoforma NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, o mezcla de la misma. Para células hospederas eucarióticas inferiores tales como levaduras y hongos filamentosos, es útil que la célula hospedera incluya además un medio para proveer CMP-ácido siálico para transferencia al N-glucano. La solicitud de patente publicada de E.U.A. No. 2005/0260729, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia, describe un método para diseñar genéticamente eucariontes inferiores para que tengan una vía de síntesis de C P-ácído siálico, y la solicitud de patente publicada de E.U.A. 2006/0286637, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia, describe un método para diseñar genéticamente eucariontes inferiores para producir glucoproteínas sialiladas. La glucoproteína producida en las células anteriores puede tratarse in vitro con una neuraminidasa para producir una glucoproteína recombinante que comprende predominantemente una glucoforma Gal2Glc Ac2 an3GlcNAc2 o glucoforma GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, o mezcla de la misma.

Cualquiera de las células hospederas anteriores puede incluir además una o más GIcNAc transferasas seleccionadas del grupo que consiste de GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI y GnT IX, para producir glucoproteínas que tienen estructuras de N-glucano bisectadas (GnT III) y/o multiantenarias (GnT IV, V, VI y IX), tal como se describe en la patente de E.U.A. No. 7,598,055 y la solicitud de patente publicada de E.U.A. No. 2007/0037248, cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente como referencia.

En otras modalidades, la célula hospedera que produce glucoproteínas que tienen predominantemente N-glucanos de GlcNAcMan5GlcNAc2, incluye además un dominio catalítico de galactosiltransferasa fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico y seleccionado para dirigir la actividad de galactosiltransferasa hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. El paso de la glucoproteína recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteina recombinante que comprende predominantemente la glucoforma GalGlcNAcMan5GlcNAc2.

En otra modalidad, la célula hospedera inmediatamente anterior que produce glucoproteínas que tienen predominantemente los N-glucanos de GalGlcNAcMan5GlcNAc2, incluye además un dominio catalítico de sialiltransferasa fusionado con un péptido de señal de determinación del blanco celular no normalmente asociado con el dominio catalítico y seleccionado para dirigir la actividad de sialiltransferasa hacia el ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera. El paso de la glucoproteina recombinante a través del ER o el aparato de Golgi de la célula hospedera, produce una glucoproteina recombinante que comprende una glucoforma NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2.

En otros aspectos de cualquiera de las células hospederas mencionadas anteriormente, la célula hospedera es modificada además para incluir una fucosiltransferasa y una vía para producir fucosa y para transportar fucosa en el ER o el aparato de Golgi. Ejemplos de métodos para modificar a Pichia pastoris para hacerla capaz de producir glucoproteínas en las cuales uno o más de los N-glucanos en las mismas son fucosilados, se describen en la solicitud internacional publicada No. WO 20081 12092, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. En aspectos particulares de la invención, la célula hospedera de Pichia pastoris es modificada además para incluir una vía de fucosilación que comprende una GDP-manosa-4,6- deshidratasa, GDP-ceto-desoxi-manosa-epimerasa/GDP-ceto-desoxi-galactosa-reductasa, transportador de GDP-fucosa y una fucosiltransferasa. En aspectos particulares, la fucosiltransferasa se selecciona del grupo que consiste de a1 ,2-fucosiltransferasa, a1 ,3-fucosiltransferasa, a1 ,4-fucosiltransferasa y a1 ,6-fucosiltransferasa.

Varias de las células hospederas anteriores incluyen además uno o más transportadores de azúcar tales como transportadores de UDP-GIcNAc (por ejemplo, los transportadores de UDP-GIcNAc de Kluyveromyces lactis y Mus musculus), transportadores de UDP-galactosa (por ejemplo, el transportador de UDP-galactosa de Drosophila meianogaster), y transportador de CMP-ácido siálico (por ejemplo, transportador de ácido siálico de humano). Debido a que células hospederas eucarióticas inferiores tales como las levaduras y los hongos filamentosos carecen de los transportadores anteriores, es preferible que células hospederas eucarióticas inferiores tales como levaduras y hongos filamentosos sean genéticamente diseñados para que incluyan los transportadores anteriores.

Las células hospederas incluyen además células de Pichia pastoris que son genéticamente diseñadas para eliminar glucoproteínas que tienen residuos de fosfomanosa, deletando o perturbando uno de los genes de fosfomanosiltransferasa, o ambos, es decir, PN01 y MNN4B (véase por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 7,198,921 y 7,259,007; cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente como referencia), que en otros aspectos puede incluir también deletar o perturbar el gen MNN4A. La perturbación incluye perturbar el marco de lectura abierto que codifica para las enzimas particulares, o perturbar la expresión del marco de lectura abierto o anular la traducción de las moléculas de ARN que codifican para una o más de las ß-manosiltransferasas y/o fosfomanosiltransferasas usando ARN de interferencia, ARN antisentido, o similares. Las células hospederas pueden incluir además cualquiera de las células hospederas mencionadas anteriormente modificadas para producir estructuras de N-glucano particulares.

Las células hospederas incluyen además células eucarióticas inferiores (por ejemplo, levaduras tales como Pichia pastorís) que son genéticamente modificadas para controlar la O-glucosilación de la glucoproteína, deletando o perturbando uno o más de los genes de la proteína O-manosiltransferasa (Dol-P-Man:proteína (Ser/Thr) manosil transferasa) (PMTs) (véase la patente de E.U.A. No. 5,714,377; cuya descripción se incorpora en la presente como referencia), o cultivadas en presencia de inhibidores de Pmtp y/o una a1 ,2 manosidasa como se describe en la solicitud internacional publicada No. WO 2007061631 , cuya descripción se incorpora en la presente como referencia), o ambas. La perturbación incluye perturbar el marco de lectura abierto que codifica para la Pmtp, o perturbar la expresión del marco de lectura abierto o anular la traducción de las moléculas de ARN que codifican para una o más de las Pmtps, usando ARN de interferencia, ARN antisentido, o similares. Las células hospederas pueden incluir además cualquiera de las células hospederas mencionadas anteriormente modificadas para producir estructuras de N-glucano particulares.

Los inhibidores de Pmtp incluyen, pero no están limitados a, las bencilideno tiazolidinodionas. Ejemplos de bencilideno tiazolidinodionas que pueden usarse, son ácido 5-[[3,4-bis(fenilmetoxi)fenil]metilen]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinoacético; ácido 5-[[3-(1 -feniletoxi)-4-(2-feniletoxi)]fenil]metilen]-4-oxo-2-tíoxo-3-tiazolidinoacético; y ácido 5-[[3-(1-fenil-2-hidroxi)etoxi)-4-(2-feniletoxi)]fenil]metilen]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinoacético.

En modalidades particulares, la función o expresión de por lo menos un gen PMT endógeno, es reducida, perturbada o deletada. Por ejemplo, en modalidades particulares, la función o expresión de por lo menos un gen PMT endógeno seleccionado del grupo que consiste de los genes PMT1, PMT2, PMT3 y PMT4, es reducida, perturbada o deletada; o las células hospederas se cultivan en presencia de uno o más inhibidores de PMT. En otras modalidades, las células hospederas incluyen una o más deleciones o perturbaciones del gen PMT, y las células hospederas se cultivan en presencia de uno o más inhibidores de Pmtp. En aspectos particulares de estas modalidades, las células hospederas expresan también una a-1 ,2-manosidasa secretada.

Las deleciones o perturbaciones de PMT y/o los inhibidores de Pmtp controlan la O-glucosilación, reduciendo la ocupación de la O-glucosilación; es decir, reduciendo el número total de sitios de O-glucosilación en la glucoproteína que son glucosilados. La adición posterior de una a-1 ,2-manosidasa que es secretada por la célula, controla la O-glucosilación reduciendo la longitud de la cadena de mañosa de los O-glucanos que están en la glucoproteína. De esta manera, la combinación de deleciones o perturbaciones de PMT y/o los inhibidores de Pmtp con la expresión de una a-1 ,2-manosidasa secretada, controla la O-glucosilación reduciendo la ocupación y la longitud de la cadena. En circunstancias particulares, la combinación particular de deleciones o perturbaciones de PMT, inhibidores de Pmtp y a-1 ,2-manosidasa, se determina empíricamente, ya que glucoproteínas heterólogas particulares (anticuerpos, por ejemplo) pueden ser expresadas y transportadas a través del aparato de Golgi con diferentes grados de eficiencia, y pueden requerir de esta manera una combinación particular de deleciones o perturbaciones de PMT, inhibidores de Pmtp y a-1 ,2-manosidasa. En otro aspecto, genes que codifican para una o más enzimas manosiltransferasa endógenas, son deletados. Las deleciones pueden ser en combinación con la provisión de la a-1 ,2-manosidasa secretada y/o los inhibidores de PMT, o puede ser en lugar de la provisión de la a-1 ,2-manosidasa secretada y/o los inhibidores de PMT.

De esta manera, el control de la O-glucosilación puede ser útil para producir glucoproteínas particulares en las células hospederas descritas en la presente en mejor rendimiento total o en rendimiento de glucoproteína adecuadamente ensamblada. La reducción o eliminación de la O-glucosilación parece tener un efecto benéfico sobre el ensamble y el transporte de glucoproteínas tales como anticuerpos enteros, conforme atraviesan la vía secretoria y son transportados hacia la superficie de la célula. De esta manera, en células en las cuales la O-glucosilación es controlada, el rendimiento de glucoproteinas adecuadamente ensambladas tales como fragmentos de anticuerpo, es incrementado sobre el rendimiento obtenido en células hospederas en las cuales la O-glucosilación no es controlada.

Para reducir o eliminar la probabilidad de N-glucanos y O-glucanos con residuos de mañosa ß-enlazados, los cuales son resistentes a las a-manosidasas, las células hospederas de Pichia pastorís glucodiseñadas recombinantes son genéticamente diseñadas para eliminar glucoproteinas que tienen N-glucanos resistentes a la a-manosidasa, deletando o perturbando uno o más de los genes de ß-manosiltransferasa (por ejemplo, BMT1, BMT2, BMT3 y BMT4) (véase, la patente de E.U.A. No. 7,465,577 y la patente de E.U.A. No. 7,713,719). La deleción o perturbación de BMT2 y uno o más de BMT1, BMT3 y BMT4, reduce o elimina también la reactividad cruzada detectable con anticuerpos contra la proteína de la célula hospedera.

El rendimiento de glucoproteinas puede mejorarse en algunas situaciones, sobreexpresando moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas chaperones de humano o de mamífero, o reemplazando los genes que codifican para una o más proteínas chaperones endógenas, con moléculas de ácido nucleico que codifican para una o más proteínas chaperones de humano o de mamífero. Además, la expresión de las proteínas chaperones de humano o de mamífero en la célula hospedera, parece también controlar la O-glucosilación en la célula. De esta manera, se incluyen además en la presente células hospederas en donde la función de por lo menos un gen endógeno que codifica para una proteína chaperón ha sido reducida o eliminada, y un vector que codifica para por lo menos un homólogo de la proteína chaperón de humano o de mamífero, es expresado en la célula hospedera. Se incluyen también células hospederas en las cuales los chaperones endógenos de las células hospederas y las proteínas chaperones de humano o de mamífero, son expresados. En otros aspectos, la célula hospedera eucaríótica inferior es una célula hospedera de levadura u hongo filamentoso. Ejemplos del uso de chaperones de células hospederas en las cuales las proteínas chaperones de humano son introducidas para mejorar el rendimiento y reducir o controlar la O-glucosilación de proteínas recombinantes, se han descrito en la solicitud internacional publicada No. WO 2009105357 y WO2010019487 (cuya descripción se incorpora en la presente como referencia). Al igual que anteriormente, se incluyen además células hospederas eucarióticas inferiores en donde, además del reemplazo de los genes que codifican para una o más de las proteínas chaperones endógenas con moléculas de ácido nucleico que codifican para una o más proteínas chaperones de humano o de mamífero o que sobreexpresan una o más proteínas chaperones de humano o de mamífero como se describió anteriormente, la función o expresión de por lo menos un gen endógeno que codifica para una proteína O-manosiltransferasa (PMT), es reducida, perturbada o deletada. En modalidades particulares, la función de por lo menos un gen PMT endógeno seleccionado del grupo que consiste de los genes PMT1, PMT2, PMT3 y PMT4, es reducida, perturbada o deletada.

Por lo tanto, los métodos descritos en la presente pueden usar cualquier célula hospedera que haya sido genéticamente modificada para producir glucoproteinas en donde el N-glucano predominante se seleccione del grupo que consiste de N-glucanos complejos, N-glucanos híbridos y N-glucanos de alto contenido de mañosa, en donde los N-glucanos complejos pueden seleccionarse del grupo que consiste de GlcNAC(2- )Man3GlcNAc2, Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2 y NANA(1 -4)Gal(i-4)GlcNAC(2-4) an3GlcNAc2; los N-glucanos híbridos pueden seleccionarse del grupo que consiste de GlcNAcMan3GlcNAc2; GalGlcNAcMan3GlcNAc2; NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, GalGlcNAcMan5GlcNAc2 y NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2; y los N-glucanos de alto contenido de mañosa pueden seleccionarse del grupo que consiste de Man5GlcNAc2, Man6GlcNAc2l Man7GlcNAc2, Man8GlcNAc2 y Man9GlcNAc2. Se incluyen además glucoproteinas que tienen N-glucanos que consisten de la estructura de N-glucano Man3GlcNAc2, por ejemplo, como se muestra en la solicitud publicada de E.U.A. No. 20050170452.

Por lo tanto, se provee un método para producir una glucoproteína heteróloga con N-glucanos híbridos o complejos tipo humano o de mamífero en una célula hospedera eucariótica inferior, que comprende proveer una célula hospedera eucariótica inferior que es genéticamente diseñada para producir glucoproteinas que tienen N-glucanos tipo humano, e incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína heteróloga; y cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que expresa la glucoproteína heteróloga para producir la glucoproteína heteróloga.

En otro aspecto de lo anterior, se provee un método para producir una glucoproteína heteróloga con N-glucanos híbridos o complejos tipo humano o de mamífero en una célula hospedera de hongo filamentoso o levadura, que comprende proveer una célula hospedera de hongo filamentoso o levadura que es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que tienen N-glucanos tipo humano, e incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína heteróloga; y cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que exprese la glucoproteína heteróloga para producir la glucoproteína heteróloga.

Se provee además una célula hospedera de hongo filamentoso o levadura genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero, que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga; y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica para una glucoproteína heteróloga; y en donde los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa), son expresados. Esto incluye la expresión del gen STT3 endógeno, que en levaduras es el gen STT3.

En general, en los métodos y células hospederas anteriores, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es capaz de suprimir funcionalmente el fenotipo letal de una mutación de por lo menos una proteína esencial del complejo de OTasa. En otros aspectos, la proteína esencial del complejo de OTasa es codificada por el locus STT3, locus WBP1, locus OST1, locus SWP1 o locus OST2, u homólogo del mismo. En otros aspectos, por ejemplo, la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3D de Leishmania major.

Los promotores son elementos de secuencia de ADN para el control de la expresión génica. En particular, los promotores especifican los sitios de inicio de la transcripción y pueden incluir una caja TATA y elementos de promotor hacia el extremo 5'. Los promotores seleccionados son aquellos que se esperaría sean operables en el sistema hospedero particular seleccionado. Por ejemplo, se usan promotores de levadura cuando una levadura tal como Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Ogataea minuta o Pichia pastoris es la célula hospedera, mientras que se usarían promotores de hongos en células hospederas tales como Aspergillus niger, Neurospora crassa o Trichoderma reesei. Ejemplos de promotores de levadura incluyen, pero no están limitados a, los promotores GAPDH, AOX1, SEC4, HH1, PMA1, OCH1, GAL1, PGK, GAP, TPI, CYC1, ADH2, PH05, CUP1, MFcri, FLD1, PMA1, PDI, TEF, RPL10 y GUT1. Romanos ef al., Yeast 8: 423-488 (1992), proveen una revisión de promotores y vectores de expresión de levaduras. Hartner et al., Nucí. Acid Res. 36: e76 (publicación en línea, 6 de junio de 2008), describen una colección de promotores para la expresión fina de proteínas heterólogas en Pichia pastoris.

Los promotores que son enlazados operablemente a las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente, pueden ser promotores constitutivos o promotores inducibles. Un promotor inducible, por ejemplo, el promotor AOX1, es un promotor que dirige la transcripción a una velocidad incrementada o disminuida tras la unión de un factor de transcripción en respuesta a un inductor. Los factores de transcripción, como se usan en la presente, incluyen cualquier factor que pueda unirse a una región reguladora o de control de un promotor, y de esta manera afectan la transcripción. La síntesis de ARN o la capacidad de unión de un factor de transcripción al promotor dentro de la célula hospedera puede controlarse exponiendo el hospedero a un inductor, o removiendo un inductor del medio de la célula hospedera. Por consiguiente, para regular la expresión de un promotor inducible, se añade o se remueve un inductor del medio de crecimiento de la célula hospedera. Dichos inductores pueden incluir azúcares, fosfato, alcohol, iones de metal, hormonas, calor, frío, y similares. Por ejemplo, inductores comúnmente usados en levaduras, son glucosa, galactosa, alcohol, y similares.

Las secuencias de terminación de la transcripción que se seleccionan, son aquellas que son operables en la célula hospedera particular seleccionada. Por ejemplo, se usan secuencias de terminación de la transcripción de levadura en vectores de expresión, cuando una célula hospedera de levadura tal como Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis o Pichia pastoris es la célula hospedera, mientras que se usarían secuencias de terminación de la transcripción de hongos en células hospederas tales como Aspergillus niger, Neurospora crassa o Trichoderma reesei. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen, pero no están limitadas a, la secuencia de terminación de la transcripción CYC de Saccharomyces cerevisiae {ScCYC TT), la secuencia de terminación de la transcripción ALG3 de Pichia pastoris (ALG3 TT), la secuencia de terminación de la transcripción ALG6 de Pichia pastoris {ALG6 TT), la secuencia de terminación de la transcripción ALG12 de Pichia pastoris (ALG12 TT), la secuencia de terminación de la transcripción AOX1 de Pichia pastoris {AOX1 TT), la secuencia de terminación de la transcripción OCH1 de Pichia pastoris (OCH1 TT), y la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de Pichia pastoris (PMA 1 TT). Otras secuencias de terminación de la transcripción pueden encontrarse en los ejemplos y en la técnica.

Para diseñar genéticamente levaduras, pueden usarse marcadores seleccionables para construir las células hospederas recombinantes, e incluyen marcadores de resistencia a fármacos y funciones genéticas que permiten que la célula hospedera de levadura sintetice nutrientes celulares esenciales, por ejemplo, aminoácidos. Los marcadores de resistencia a fármacos que se usan comúnmente en levaduras, incluyen cloranfenicol, kanamicina, metotrexato, G418 (geneticina), zeocina, y similares. Funciones genéticas que permiten que la célula hospedera de levadura sintetice nutrientes celulares esenciales, se usan con cepas de levadura disponibles que tienen mutaciones auxotróficas en la función genómica correspondiente. Marcadores seleccionabas de levadura comunes proveen funciones genéticas para la síntesis de leucina (LEU2), triptófano (TRP1 y TRP2), prolina (PR01 ), uracilo (URA3, URA5, URA6), histidina (HIS3), lisina (LYS2), adenina (ADE1 o ADE2), y similares. Otros marcadores seleccionares de levadura incluyen el gen ARR3 de S. cerevisiae, que confiere resistencia a arsenito a células de levadura que se cultivan en presencia de arsenito (Bobrowicz et al., Yeast, 13: 819-828 (1997); Wysocki et al., J. Biol. Chem. 272: 30061-30066 (1997)). Muchos sitios de integración adecuados incluyen los enumerados en la patente de E.U.A. No. 7,479,389 (cuya descripción se incorpora en la presente como referencia), e incluyen homólogos de loci conocidos para Saccharomyces cerevisiae y otras levaduras u hongos. Métodos para integrar vectores en levaduras son bien conocidos (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 7,479,389, patente de E.U.A. No. 7,514,253, solicitud publicada de E.U.A. No. 2009012400 y documento WO2009/085135; cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente como referencia). Ejemplos de sitios de inserción incluyen, pero no están limitados a, genes ADE de Pichia; genes TRP de Pichia (incluyendo TRP1 y TRP2); genes MCA de Pichia; genes CYM de Pichia; genes PEP de Pichia; genes PRB de Pichia; y genes LEU de Pichia. Los genes ADE1 y ARG4 de Pichia se han descrito en Lin Cereghino et al., Gene 263: 159-169 (2001) y en la patente de E.U.A. No. 4,818,700 (cuya descripción se incorpora en la presente como referencia), los genes HIS3 y TRP1 se han descrito en Cosano et al., Yeast 14: 861-867 (1998), y HIS4 se ha descrito en el No. de acceso del GenBank X56180.

Los métodos descritos en la presente pueden adaptarse para su uso en células de mamíferos, plantas e insectos. Ejemplos de células animales incluyen, pero no están limitados a, células SC-I, células LLC-MK, células CV-I, células CHO, células COS, células de murino, células humanas, células HeLa, células 293, células VERO, células MDBK, células MDCK, células MDOK, células CRFK, células RAF, células TCMK, células LLC-PK, células PK15, células WI-38, células MRC-5, células T-FLY, células BHK, células SP2/0, células NSO, y derivados de las mismas. Las células de insecto incluyen células originadas de Drosophila melanogaster. Estas células pueden ser genéticamente diseñadas para hacer que las células sean capaces de producir inmunoglobulinas que tengan N-glucanos particulares o predominantemente particulares. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 6,949,372 describe métodos para producir glucoproteinas en células de insecto que son sialiladas. Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol. Bioeng. 87: 614-622 (2004), Kanda er a/., Biotechnol. Bioeng. 94: 680-688 (2006), Kanda er a/., Glycobiol. 17: 104-1 18 (2006), y la solicitud publicada de E.U.A. Nos. 2005/0216958 y 2007/0020260 (cuya descripción se incorpora en la presente como referencia), describen células de mamífero que son capaces de producir inmunoglobulinas en las cuales los N-glucanos en las mismas carecen de fucosa o tienen fucosa reducida. La solicitud de patente publicada de E.U.A. No. 2005/0074843 (cuya descripción se incorpora en la presente como referencia), describe la producción de anticuerpos en células de mamífero que tienen N-glucanos bisectados.

Los promotores regulables seleccionados para regular la expresión de los cassettes de expresión en células de mamífero, insecto o planta, deben seleccionarse para funcionalidad en el tipo de célula elegido. Ejemplos de promotores regulables adecuados incluyen, pero no están limitados a, los promotores regulables por tetraciclina (véase, por ejemplo, Berens y Hillen, Eur. J. Biochem. 270: 3109-3121 (2003)), los promotores inducibles por RU 486, los promotores inducibles por ecdisona, y los sistemas regulables por kanamicina. Estos promotores pueden reemplazar a los promotores ejemplificados en los cassettes de expresión descritos en los ejemplos. La porción de captura puede ser fusionada a una proteína de anclaje de la superficie de la célula adecuada para su uso en el tipo de célula elegido. Proteínas de anclaje de la superficie de la célula que incluyen a las proteínas GPI, son bien conocidas para células de mamífero, insecto y planta. Proteínas de fusión ancladas a GPI han sido descritas por Kennard et al., Methods Biotechnol. Vol. 8: Animal Cell Biotechnology (ed. Jenkins. Human Press, Inc., Totowa, NJ) pp. 187-200 (1999). Las secuencias de determinación del blanco del genoma para integrar los cassettes de expresión en el genoma de la célula hospedera para producir recombinantes estables, pueden reemplazar a las secuencias de integración y de determinación del blanco del genoma ejemplificadas en los ejemplos. Métodos de transfección para producir células hospederas de mamífero, insecto y planta estables y transitoriamente transfectadas, son bien conocidos en la técnica. Una vez que las células hospederas transfectadas se han construido como se describe en la presente, las células pueden examinarse para la expresión de la inmunoglobulina de interés, y pueden seleccionarse como se describe en la presente.

Por lo tanto, en otro aspecto de lo anterior, se provee un método para producir una glucoproteína heteróloga en una célula hospedera de insecto o de mamífero, que comprende proveer una célula hospedera de insecto o de mamífero que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga (por ejemplo, la proteína STT3 de Leishmania major), y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína heteróloga; y cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que exprese la glucoproteína heteróloga para producir la glucoproteína heteróloga. En otros aspectos, la célula hospedera es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas con N-glucanos tipo humano o N-glucanos no normalmente endógenos para la célula hospedera.

En otro aspecto de lo anterior, se provee un método para producir una glucoproteína heteróloga, en donde la ocupación del sitio de N-glucosilación de la glucoproteína heteróloga es mayor de 83% en una célula hospedera de insecto o de mamífero, que comprende proveer una célula hospedera de insecto o de mamífero que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga (por ejemplo, la proteína STT3 de Leishmania major), y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteina heteróloga; y cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que exprese la glucoproteina heteróloga para producir la glucoproteina heteróloga, en donde la ocupación del sitio de N-glucosilación de la glucoproteina heteróloga es mayor de 83%. En otros aspectos, la célula hospedera es genéticamente diseñada para producir glucoproteinas con N-glucanos tipo humano o N-glucanos no normalmente endógenos para la célula hospedera.

En otra modalidad de los métodos anteriores, los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa), son expresados.

En modalidades particulares de los métodos anteriores, la ocupación del sitio de N-glucosilación es de por lo menos 94%. En otras modalidades, la ocupación del sitio de N-glucosilación es de por lo menos 99%.

Se provee además una célula hospedera de insecto o de mamífero, que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga (por ejemplo, la proteína STT3D de Leishmania major); y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica para una glucoproteina heteróloga; y en donde los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno de la célula hospedera, son expresados.

En modalidades particulares, la célula, tejido u organismo eucariótico superior puede ser también del reino vegetal, por ejemplo, trigo, arroz, maíz, tabaco, y similares. En forma alternativa, pueden seleccionarse células de briofitas, por ejemplo, de especies de los géneros Physcomitrella, Fuñaría, Sphagnum, Ceratodon, Marchantía y Sphaerocarpos. Un ejemplo de célula de una planta, es la célula de la briofita Physcomitrella patens, la cual se ha descrito en los documentos WO 2004/057002 y WO2008/006554 (cuya descripción se incorpora enteramente en la presente como referencia). Sistemas de expresión que usan células de plantas pueden manipularse adicionalmente para que tengan vías de glucosilación alteradas que permitan que las células produzcan ¡nmunoglobulinas con N-glucanos predominantemente particulares. Por ejemplo, las células pueden ser genéticamente diseñadas para tener una fucosiltransferasa central disfuncional o no, y/o una xilosiltransferasa disfuncional o no, y/o una ß1 ,4-galactosiltransferasa disfuncional o no. En forma alternativa, la galactosa, fucosa y/o xilosa pueden ser removidas de la inmunoglobulina mediante tratamiento con enzimas que remuevan los residuos. Puede usare cualquier enzima que resulte en la liberación de los residuos de galactosa, fucosa y/o xilosa de los N-glucanos que se conocen en la técnica, por ejemplo, a-galactosidasa, ß-xilosidasa y a-fucosidasa. En forma alternativa, puede usarse un sistema de expresión que sintetice N-glucanos modificados que no puedan ser usados como substratos por una 1 ,3-fucosiltransferasa y/o 1 ,2-xilosiltransferasa y/o 1 ,4-galactosiltransferasa. Métodos para modificar vías de glucosilación en células de plantas, se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 7,449,308, 6,998,267 y 7,388,081 (cuya descripción se incorpora en la presente como referencia), que describen métodos para diseñar genéticamente plantas para producir glucoproteínas recombinantes que tengan N-glucanos tipo humano. El documento WO 2008006554 (cuya descripción se incorpora en la presente como referencia), describe métodos para producir glucoproteínas tales como anticuerpos en plantas genéticamente diseñadas, para obtener glucoproteínas sin xilosa o fucosa. El documento WO 2007006570 (cuya descripción se incorpora en la presente como referencia), describe métodos para diseñar genéticamente briofitas, ciliados, algas y levaduras, para producir glucoproteínas con patrones de glucosilación tipo humano o de animal.

Por lo tanto, en otro aspecto de lo anterior, se provee un método para producir una glucoproteína heteróloga con N-glucanos híbridos o complejos tipo humano o de mamífero en una célula hospedera de planta, que comprende proveer una célula hospedera de planta que es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero, e incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga (por ejemplo, la proteína STT3D de Leishmania major) y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína heteróloga; y cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que exprese la glucoproteína heteróloga para producir la glucoproteína heteróloga.

En otro aspecto de lo anterior, se provee un método para producir una glucoproteína heterologa con N-glucanos híbridos o complejos tipo humano o de mamífero, en donde la ocupación del sitio de N-glucosilación de la glucoproteína heterologa es mayor de 83% en la célula hospedera de la planta, que comprende proveer una célula hospedera de planta que es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero, e incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heterologa (por ejemplo, la proteína STT3D de Leishmania major) y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína heterologa; y cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que exprese la glucoproteína heterologa para producir la glucoproteína heterologa con N-glucanos tipo humano o de mamífero, en donde la ocupación del sitio de N-glucosilación de la glucoproteína heterologa, es mayor de 83%.

En otra modalidad de los métodos anteriores, los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno de la célula hospedera, son expresados.

Se provee además una célula hospedera de planta, que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga (por ejemplo, la proteína STT3D de Leishmania major); y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica para una glucoproteína heteróloga; y en donde los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno de la célula hospedera, son expresados.

Las células hospederas y métodos de la presente son útiles para producir una amplia gama de proteínas y glucoproteínas recombinantes. Ejemplos de proteínas y glucoproteínas recombinantes que pueden producirse en las células hospederas descritas en la presente incluyen, pero no están limitados a, eritropoyetina (EPO); citocinas tales como ¡nterferón a, interferón ß, ¡nterferón ? e interferón ?; y factor estimulador de colonias de granulocítos (GCSF); factor estimulador de colonias de macrófagos granulocítos (GM-CSF); factores de coagulación tales como el factor VIII, el factor IX y la proteína C humana; antitrombina III; trombina; cadena a del receptor de IgE soluble; inmunoglobulinas tales como IgG, fragmentos de IgG, fusiones de IgG, e IgM; inmunoadhesinas y otras proteínas de fusión de Fe tales como las proteínas de fusión de Fc-receptor del FNT soluble; proteínas de fusión de Fc-RAGE; interleucinas; urocínasa; quimasa; inhibidor de urea tripsina; proteína de unión al IGF; factor de crecimiento epidérmico; factor liberador de hormona de crecimiento; proteína de fusión de anexina V; angiostatina; factor 2 de crecimiento endotelial vascular; factor 1 inhibidor del progenitor mieloíde; osteoprotegerina; a-1 -antitripsina; a-feto proteínas; desoxirribonucleasa II; kringle 3 del plasminógeno humano; glucocerebrosidasa; proteína 1 de unión al FNT; hormona foliculoestimulante; antígeno 4 asociado con linfocitos T citotóxicos-lg; activador de transmembrana y modulador de calcio y ligando de ciclofilina; proteína 1 tipo glucagon; y agonista del receptor de IL-2.

Las células hospederas recombinantes y los métodos descritos en la presente, son particularmente útiles para producir anticuerpos, proteínas de fusión de Fe, y similares, en donde sea deseable proveer composiciones de anticuerpo o de proteína de fusión de Fe en donde el por ciento de N-glucanos que contienen galactosa es incrementado, en comparación con el por ciento de galactosa obtenible en las células hospederas antes de la modificación como se enseña en la presente. Ejemplos de anticuerpos que pueden producirse en las células hospederas en la presente incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos de cadena pesada (por ejemplo, de camello o llama). Anticuerpos específicos incluyen, pero no están limitados a, los siguientes anticuerpos citados bajo su nombre genérico (objetivo): Muromonab-CD3 (anticuerpo del receptor anti-CD3), Abciximab (anticuerpo 7E3 anti-CD41 ), Rituximab (anticuerpo anti-CD20), Daclizumab (anticuerpo anti-CD25), Basiliximab (anticuerpo anti-CD25), Palivizumab (anticuerpo anti-RSV (virus sincicial respiratorio)), Infliximab (anticuerpo anti-FNTa), Trastuzumab (anticuerpo anti-Her2), Gemtuzumab ozogamicina (anticuerpo anti-CD33), Alemtuzumab (anticuerpo anti-CD52), Ibritumomab tiuxeten (anticuerpo anti-CD20), Adalimumab (anticuerpo anti-FNTa), Omalizumab (anticuerpo anti-lgE), Tositumomab-131! (derivado yodado de un anticuerpo anti-CD20), Efalizumab (anticuerpo anti-CD1 1 a), Cetuximab (anticuerpo del receptor anti-EGF), Golimumab (anticuerpo anti-FNTa), Bevacizumab (anticuerpo anti-VEGF-A), y variantes de los mismos. Ejemplos de proteínas de fusión de Fe que pueden producirse en las células hospederas descritas en la presente incluyen, pero no están limitados a, etanercept (proteína de fusión FNTR-Fc), proteínas de fusión FGF-21-Fc, proteínas de fusión GLP-1-Fc, proteínas de fusión RAGE-Fc, proteínas de fusión EPO-Fc, proteínas de fusión ActR11A-Fc, proteínas de fusión ActRIIB-Fc, fusiones de glucagon-Fc, fusiones de oxintomodulina-Fc, y análogos y variantes de los mismos.

De esta manera, los métodos y las células hospederas de la presente pueden usarse para producir composiciones de glucoproteína en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de los sitios de N-glucosilacíón de las glucoproteínas en la composición están ocupados, y las glucoproteínas tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero.

Además, los métodos y las células hospederas de la presente pueden usarse para producir composiciones de glucoproteína en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de los sitios de N-glucosilación de las glucoproteínas en la composición están ocupados, y las glucoproteínas tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero que carecen de fucosa.

Además, los métodos y las células hospederas de hongo filamentoso o levadura que son genéticamente diseñadas para producir N-glucanos tipo humano o tipo mamífero, pueden usarse para producir composiciones de glucoproteína en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de los sitios de N-glucosilación de las glucoproteínas en la composición están ocupados, y las glucoproteínas tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero que carecen de fucosa.

En algunos aspectos, las células hospederas de hongo filamentoso o levadura genéticamente diseñadas para producir N-glucanos tipo humano o de mamífero fucosilados, pueden usarse para producir composiciones de glucoproteína en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de los sitios de N-glucosilación de las glucoproteínas en la composición están ocupados, y las glucoproteínas tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero que tienen fucosa.

Las células recombinantes descritas en la presente pueden usarse para producir anticuerpos y fragmentos Fe adecuados para conjugación química con un péptido heterólogo o molécula de fármaco. Por ejemplo, los documentos WO2005047334, WO2005047336, WO2005047337 y WO2006107124 (cuya descripción se incorpora en la presente como referencia), describen la conjugación química de péptidos o moléculas de fármaco con fragmentos Fe. Los documentos EP1 180121 , EP1 105409 y US6593295 (cuya descripción se incorpora en la presente como referencia), describen la conjugación química de péptidos y similares con componentes sanguíneos, que incluyen anticuerpos enteros.

De esta manera, los métodos y las células hospederas de la presente pueden usarse para producir composiciones de anticuerpo en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados, y los anticuerpos tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero.

Además, los métodos y las células hospederas de la presente pueden usarse para producir composiciones de anticuerpo en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados, y los anticuerpos tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero que carecen de fucosa.

Además, los métodos y las células hospederas de hongo filamentoso o levadura genéticamente diseñadas para producir N-glucanos tipo humano o de mamífero, pueden usarse para producir composiciones de anticuerpo en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados, y los anticuerpos tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero que carecen de fucosa.

En algunos aspectos, las células hospederas de hongo filamentoso o levadura genéticamente diseñadas para producir N-glucanos tipo humano o de mamífero fucosilados, pueden usarse para producir composiciones de anticuerpo en las cuales por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados, y los anticuerpos tienen N-glucanos tipo humano o de mamífero que tienen fucosa.

Como se muestra en el ejemplo 3, la composición de N-glucosilación de los anticuerpos producidos en las cepas de Pichia pastoris, las cuales han sido genéticamente diseñadas para producir N-glucanos terminados en galactosa, parecen variar de aproximadamente 50 a 60% en moles de G0, 18 a 24% en moles de G1 , 3 a 8% en moles de G2, 12 a 17% en moles de Man5, y 3 a 6% en moles de híbridos.

Por lo tanto, se provee una composición de glucoproteína que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 70% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 50 a 70% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G0, 15 a 25% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , 4 a 12% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G2, 5 a 17% en moles de los N-glucanos tienen una estructura Man5, y 5 a 15% en moles de los N-glucanos tienen una estructura híbrida, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se provee además una composición de glucoproteína que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 70% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 53 a 58% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G0, 20 a 22% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , y aproximadamente 16 a 18% en moles de los N-glucanos comprenden una estructura central de Man5GlcNAc2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otros aspectos de lo anterior, los N-glucanos incluyen además fucosa.

Por lo tanto, se provee una composición de glucoproteína que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 75% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 50 a 70% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G0, 15 a 25% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , 4 a 12% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G2, 5 a 17% en moles de los N-glucanos tienen una estructura Man5, y 5 a 15% en moles de los N-glucanos tienen una estructura híbrida, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se provee además una composición de glucoproteína que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 75% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 53 a 58% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G0, 20 a 22% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , y aproximadamente 16 a 18% en moles de los N-glucanos comprenden una estructura central de Man5GlcNAc2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otros aspectos de lo anterior, los N-glucanos incluyen además fucosa.

Más aún, se provee una composición de glucoproteína que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 80% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N- glucosilación ocupados y aproximadamente 50 a 70% en moles de los N-glucanos tienen una estructura GO, 15 a 25% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , 4 a 12% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G2, 5 a 17% en moles de los N-glucanos tienen una estructura Man5, y 5 a 15% en moles de los N-glucanos tienen una estructura híbrida, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se provee además una composición de glucoproteína que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 80% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 53 a 58% en moles de los N-glucanos tienen una estructura GO, 20 a 22% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , y aproximadamente 16 a 18% en moles de los N-glucanos comprenden una estructura central de Man5GlcNAc2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otros aspectos de lo anterior, los N-glucanos incluyen además fucosa.

Por lo tanto, se provee una composición de glucoproteína que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 85% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 50 a 70% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G0, 15 a 25% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , 4 a 12% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G2, 5 a 17% en moles de los N-glucanos tienen una estructura Man5, y 5 a 15% en moles de los N-glucanos tienen una estructura híbrida, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se provee además una composición de glucoproteína que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 85% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 53 a 58% en moles de los N-glucanos tienen una estructura GO, 20 a 22% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , y aproximadamente 16 a 18% en moles de los N-glucanos comprenden una estructura central de Man5GlcNAc2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otros aspectos de lo anterior, los N-glucanos incluyen además fucosa.

Más aún, se provee una composición de glucoproteína que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 90% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 50 a 70% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G0, 15 a 25% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , 4 a 12% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G2, 5 a 17% en moles de los N-glucanos tienen una estructura Man5, y 5 a 15% en moles de los N-glucanos tienen una estructura híbrida, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se provee además una composición de glucoproteína que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 90% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 53 a 58% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G0, 20 a 22% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , y aproximadamente 16 a 18% en moles de los N-glucanos comprenden una estructura central de Man5GlcNAc2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otros aspectos de lo anterior, los N-glucanos incluyen además fucosa.

Por lo tanto, se provee una composición de glucoproteina que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 95% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 50 a 70% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G0, 15 a 25% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , 4 a 12% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G2, 5 a 17% en moles de los N-glucanos tienen una estructura Man5, y 5 a 15% en moles de los N-glucanos tienen una estructura híbrida, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se provee además una composición de glucoproteina que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 95% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 53 a 58% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G0, 20 a 22% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , y aproximadamente 16 a 18% en moles de los N-glucanos comprenden una estructura central de Man5GlcNAc2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otros aspectos de lo anterior, los N-glucanos incluyen además fucosa.

Más aún, se provee una composición de glucoproteina que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 98% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 50 a 70% en moles de los N- glucanos tienen una estructura GO, 15 a 25% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , 4 a 12% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G2, 5 a 17% en moles de los N-glucanos tienen una estructura Man5, y 5 a 15% en moles de los N-glucanos tienen una estructura híbrida, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se provee además una composición de glucoproteína que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 98% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 53 a 58% en moles de los N-glucanos tienen una estructura GO, 20 a 22% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , y aproximadamente 16 a 18% en moles de los N-glucanos comprenden una estructura central de Man5GlcNAc2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otros aspectos de lo anterior, los N-glucanos incluyen además fucosa.

Por lo tanto, se provee una composición de glucoproteína que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 99% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 50 a 70% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G0, 15 a 25% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , 4 a 12% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G2, 5 a 17% en moles de los N-glucanos tienen una estructura Man5, y 5 a 15% en moles de los N-glucanos tienen una estructura híbrida, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se provee además una composición de glucoproteína que comprende una pluralidad de anticuerpos, en donde por lo menos 99% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados y aproximadamente 53 a 58% en moles de los N-glucanos tienen una estructura GO, 20 a 22% en moles de los N-glucanos tienen una estructura G1 , y aproximadamente 16 a 18% en moles de los N-glucanos comprenden una estructura central de Man5GlcNAc2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otros aspectos de lo anterior, los N-glucanos incluyen además fucosa.

En modalidades particulares, los anticuerpos comprenden un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de anticuerpo anti-Her2, anticuerpo anti-RSV (virus sincicial respiratorio), anticuerpo anti-FNTa, anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo del receptor anti-CD3, anticuerpo 7E3 anti-CD41 , anticuerpo anti-CD25, anticuerpo anti-CD52, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-lgE, anticuerpo anti-CD1 1 a, anticuerpo del receptor anti-EGF y anticuerpo anti-CD20.

Todas las patentes y publicaciones referidas o mencionadas en la presente son indicativas de los niveles de aptitud de los expertos en la técnica a la cual la invención pertenece, y cada una de dichas patentes o publicaciones referidas se incorpora de esta manera en la presente como referencia, al mismo grado como si hubiese sido incorporada en su totalidad como referencia individualmente o como se expone en la presente en su totalidad.

Se pretende que los siguientes ejemplos promuevan un mejor entendimiento de la presente invención.

EJEMPLO 1 Plásmidos que comprenden cassettes de expresión que codifican para el marco de lectura abierto (ORF) de STT3D de Leishmania major (LmSTT3D) enlazado operablemente a un promotor inducible o constitutivo, se construyeron como sigue: El marco de lectura abierto que codifica para la LmSTT3D (SEQ ID NO: 12) fue optimizado en codones para expresión óptima en P. pastoris, y sintetizado por GeneArt AG, Brandenburg, Alemania. La molécula de ácido nucleico optimizada en codones que codifica para la LmSTT3D se designó como pGLY6287, y tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 1.

El plásmido pGLY6301 (figura 2) es un plásmido de integración enrollable que elige como objetivo el locus URA6 en P. pastoris. El cassette de expresión que codifica para la LmSTT3D comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de LmSTT3D optimizado en codones para expresión efectiva en P. pastoris, enlazado operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia del promotor AOX1 inducible de P. pastoris (SEQ ID NO: 23), y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 24). Para la selección de transformantes, el plásmido comprende un cassette de expresión que codifica para el ORF de ARR3 de S. cerevisiae, en el cual la molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF (SEQ ID NO: 32) está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia del promotor RPL10 de P pastoris (SEQ ID NO: 25), y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de terminación de la transcripción CVC de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 24). El plásmido incluye además una molécula de ácido nucleico para determinar como blanco el locus URA6 (SEQ ID NO: 33). El plásmido pGLY6301 se construyó clonando el fragmento de ADN que codifica para el ORF de LmSTT3D optimizado en codones (pGLY6287) flanqueado por un sitio EcoRI en el extremo 5' y un sitio Fse\ en el extremo 3' en el plásmido pGFI30t, el cual había sido digerido con EcoRI y sel.

El plásmido pGLY6294 (figura 3) es un vector de integración KINKO que elige como objetivo el locus TRP1 en P. pastoris sin que perturbe la expresión del locus. Los vectores de integración KINKO (expresión reemplazada con poca o ninguna expresión bloqueada), permiten la inserción de ADN heterólogo en un locus elegido como objetivo sin que perturbe la expresión del gen en el locus elegido como objetivo, y se han descrito en la solicitud publicada de E.U.A. No. 20090124000. El cassette de expresión que codifica para la LmSTT3D comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de LmSTT3D enlazado operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia constitutiva del promotor GAPDH de P. pastoris (SEQ ID NO: 26), y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 24). Para la selección de transformantes, el plásmido comprende un cassette de expresión que codifica para el ORF de resistencia a nourseotricina (NATR) (originalmente de pAG25 de EROSCARF, Scientific Research and Development GmbH, Daimierstrasse 13a, D-61352 Bad Homburg, Alemania, véase Goldstein et al., Yeast 15: 1541 (1999)); en donde la molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF (SEQ ID NO: 34) está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia del promotor TEF1 de Ashbya gossypii (SEQ ID NO: 86), y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de terminación de la transcripción TEF1 de Ashbya gossypii (SEQ ID NO: 87). Los dos cassettes de expresión son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del ORF que codifica para Trpl p que termina en el codón de detención (SEQ ID NO: 30) enlazada a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de terminación de la transcripción ALG3 de P. pastoris (SEQ ID NO: 29), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen TRP1 (SEQ ID NO: 31 ). El plásmido pGLY6294 se construyó clonando el fragmento de ADN que codifica para el ORF de Z.AT7STT3D optimizado en codones (pGLY6287) flanqueado por un sitio Not\ en el extremo 5' y un sitio Pací en el extremo 3' en el plásmido pGLY597, el cual había sido digerido con Not\ y sel. Un cassette de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de resistencia a nourseotricina (NAT), está enlazado operablemente al promotor TEF1 de Ashbya gossypii (PTEF) y la secuencia de terminación de la transcripción TEF1 de Ashbya gossypii (TTEF).

Los plásmidos anteriores pueden usarse para introducir los cassettes de expresión de LmSTT3D en P. pastoris, para incrementar la ocupación del sitio de N-glucosilación en las glucoproteínas producidas en la presente como se muestra en los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 2 La cepa YGLY13992 de Pichia pastoris genéticamente diseñada es una cepa que produce anticuerpos anti-Her2 de humano recombinantes, y la cepa YGLY14401 de Pichia pastoris es una cepa que produce anticuerpos anti-RSV de humano recombinantes. La construcción de las cepas se ilustra esquemáticamente en las figuras 1A-1G. En resumen, las cepas se construyeron como sigue: La cepa YGLY8316 se construyó a partir de la cepa NRRL-Y 1430 de Pichia pastoris de tipo silvestre, usando los métodos descritos en un principio (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 7,449,308; patente de E.U.A. No. 7,479,389; solicitud publicada de E.U.A. No. 20090124000; solicitud del PCT publicada No. WO2009085135; Nett y Gerngross, Yeast 20: 1279 (2003); Choi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100: 5022 (2003); Hamilton er a/., Science 301: 1244 (2003)). Todos los plásmidos se obtuvieron en un plásmido pUC19 usando procedimientos estándar de biología molecular. Para las secuencias de nucleótidos que fueron optimizadas para expresión en P. pastoris, las secuencias de nucleótidos nativas se analizaron con el software GENEOPTIMIZER (GeneArt, Regensburg, Alemania), y los resultados se usaron para generar secuencias de nucleótidos en las cuales los codones fueron optimizados para expresión en P. pastoris. Las cepas de levadura fueron transformadas mediante electroporación (usando técnicas estándar, como es recomendado por el fabricante del electroporador BioRad).

El plásmido pGLY6 (figura 4) es un vector de integración que elige como objetivo el locus URA5. Contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen de invertasa o la unidad de transcripción de S. cerevisiae (ScSUC2; SEQ ID NO: 38) flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen URA5 de P. pastoris (SEQ ID NO: 39), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen URA5 de P. pastoris (SEQ ID NO: 40). El plásmido pGLY6 fue linealizado, y el plásmido linealizado transformado en la cepa de tipo silvestre NRRL-Y 11430, para producir muchas cepas en las cuales el gen ScSUC2 fue insertado en el locus URA5 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY1-3 se seleccionó de las cepas producidas, y es auxotrófica para uracilo.

El plásmido pGLY40 (figura 5) es un vector de integración que elige como objetivo el locus OCH1, y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris (SEQ ID NO: 41 ) flanqueados por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ (SEQ ID NO: 42), que a su vez es flanqueada en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen OCH1 (SEQ ID NO: 43), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen OCH1 (SEQ ID NO: 44). El plásmido pGLY40 fue linealizado con Sfi\, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY1-3 para producir muchas cepas en las cuales el gen URA5 flanqueado por las repeticiones de lacZ, ha sido insertado en el locus OCH1 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY2-3 se seleccionó de las cepas producidas, y es prototrófica para URA5. La cepa YGLY2-3 se contraseleccionó en presencia de ácido 5-fluoroorótico (5-FOA), para producir muchas cepas en las cuales el gen URA5 se ha perdido y sólo las repeticiones de lacZ permanecen en el locus OCH1. Esto hace que la cepa sea auxotrófica para uracilo. Se seleccionó la cepa YGLY4-3.

El plásmido pGLY43a (figura 6) es un vector de integración que elige como objetivo el locus BMT2, y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen del transportador de UDP-/V-acetilglucosamina (UDP-GIcNAc) o la unidad de transcripción (KIMNN2-2, SEQ ID NO: 45) de K. lactis, adyacentes a una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris flanqueados por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ. Los genes adyacentes son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' de gen BMT2 (SEQ ID NO: 46), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen BMT2 (SEQ ID NO: 47). El plásmido pGLY43a fue linealizado con Sfi\, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY4-3, para producir muchas cepas en las cuales el gen KIMNN2-2 y el gen URA5 flanqueados por repeticiones de lacZ, han sido insertados en el locus BMT2 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. El gen BMT2 se ha descrito en Mille et al., J. Biol. Chem. 283: 9724-9736 (2008) y en la patente de E.U.A. No. 7,465,557. La cepa YGLY6-3 se seleccionó de las cepas producidas, y es prototrófica para uracilo. La cepa YGLY6-3 se contraseleccionó en presencia de 5-FOA, para producir cepas en las cuales el gen URA5 se ha perdido y sólo las repeticiones de lacZ permanecen. Esto hace que la cepa sea auxotrófica para uracilo. Se seleccionó la cepa YGLY8-3.

El plásmido pGLY48 (figura 7) es un vector de integración que elige como objetivo el locus MNN4L1, y contiene un cassette de expresión que comprende un molécula de ácido nucleico que codifica para el homólogo del marco de lectura abierto (ORF) del transportador de UDP-GIcNAc (SEQ ID NO: 48) de ratón enlazado operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris (SEQ ID NO: 26), y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 24) adyacentes a una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 de P. pastoris flanqueados por repeticiones de lacZ, y en la cual los cassettes de expresión en conjunto son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5" del gen MNN4L1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 49), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen MNN4L1 (SEQ ID NO: 50). El plásmido pGLY48 fue linealizado con Sfi\, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY8-3, para producir muchas cepas en las cuales el cassette de expresión que codifica para el transportador de UDP-GIcNAc y el gen URA5 de ratón, ha sido insertado en el locus MNN4L1 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. El gen MNN4L1 (referido también como MNN4B) se ha descrito en la patente de E.U.A. No. 7,259,007. La cepa YGLY10-3 se seleccionó de las cepas producidas, y se contraseleccionó entonces en presencia de 5-FOA, para producir muchas cepas en las cuales el gen URA5 se ha perdido y sólo las repeticiones de lacZ permanecen. Se seleccionó la cepa YGLY12-3.

El plásmido pGLY45 (figura 8) es un vector de integración que elige como objetivo los loci PN01/MNN4, y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris flanqueados por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ, que a su vez es flanqueada en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen PN01 (SEQ ID NO. 51), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen MNN4 (SEQ ID NO: 52). El plásmido pGLY45 fue linealizado con Sfñ, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY12-3, para producir muchas cepas en las cuales el gen URA5 flanqueado por las repeticiones de lacZ, ha sido insertado en los loci PN01IMNN4 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. El gen PN01 se ha descrito en la patente de E.U.A. No. 7,198,921 , y el gen MNN4 (referido también como MNN4B) se ha descrito en la patente de E.U.A. No. 7,259,007. La cepa YGLY14-3 se seleccionó de las cepas producidas y se contraseleccionó entonces en presencia de 5-FOA, para producir muchas cepas en las cuales el gen URA5 se ha perdido y sólo las repeticiones de lacZ permanecen. Se seleccionó la cepa YGLY16-3.

El plásmido pGLY1430 (figura 9) es un vector de integración KINKO que elige como objetivo el locus ADE1 sin que perturbe la expresión del locus, y contiene cuatro cassettes de expresión en tándem que codifican para (1) el dominio catalítico de GlcNAc transferasa I (NA) de humano fusionado en el extremo N-terminal al péptido guía SEC12 de P. pastoris (10) que dirige la enzima quimérica hacia el ER o el aparato de Golgi, (2) el homólogo del transportador de UDP-GIcNAc de ratón (MmTr), (3) el dominio catalítico de manosidasa IA (FB) de ratón fusionado en el extremo /V-terminal al péptido guía SEC12 de S. cerevisiae (8) que dirige la enzima quimérica hacia el ER o el aparato de Golgi, y (4) el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris. Los vectores de integración KINKO (expresión reemplazada con poca o ninguna expresión bloqueada) permiten la inserción de ADN heterólogo en un locus elegido como objetivo, sin que perturben la expresión del gen en el locus elegido como objetivo, y se han descrito en la solicitud publicada de E.U.A. No. 20090124000. El cassette de expresión que codifica para NA10 comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio catalítico de GlcNAc transferasa I optimizado en codones de humano para expresión en P. pastorís (SEQ ID NO: 53), fusionado en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido guía SEC12 10 (SEQ ID NO: 54), la cual está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor PMA1 de P. pastorís, y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción PMA 1 de P. pastorís. El cassette de expresión que codifica para MmTr, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el homólogo del ORF del transportador de UDP-GIcNAc de ratón enlazado operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor SEC4 de P. pastorís (SEQ ID NO: 55), y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias de terminación de la transcripción OCH1 de P. pastorís (SEQ ID NO: 56). El cassette de expresión que codifica para FB8 comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio catalítico de manosidasa IA de ratón (SEQ ID NO: 57) fusionado en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido guía SEC12-m 8 (SEQ ID NO: 58), la cual está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GADPH de P. pastoris, y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El cassette de expresión URA5 comprende una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris flanqueados por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ. Los cuatro cassettes en tándem son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' y el ORF completo del gen ADE1 (SEQ ID NO: 59) seguidos de una secuencia de terminación de la transcripción ALG3 de P. pastoris (SEQ ID NO: 29), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen ADE1 (SEQ ID NO: 60). El plásmido pGLY1430 fue linealizado con Sfi\, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY16-3, para producir muchas cepas en las cuales los cuatro cassettes de expresión en tándem han sido insertados en el locus ADE1 inmediatamente después del ORF de ADE1 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY2798 se seleccionó de las cepas producidas, y es auxotrófica para arginina y ahora prototrófica para uridina, histidina y adenina. La cepa se contraseleccionó entonces en presencia de 5-FOA, para producir muchas cepas ahora auxotróficas para uridina. La cepa YGLY3794 se seleccionó, y es capaz de producir glucoproteínas que tienen N-glucanos predominantemente terminados en galactosa.

El plásmido pGLY582 (figura 10) es un vector de integración que elige como objetivo el locus HIS1, y contiene cuatro cassettes de expresión en tándem que codifican para (1) la UDP-glucosa epimerasa de S. cerevisiae (ScGALIO), (2) el dominio catalítico de galactosiltransferasa I (hGaIT) de humano fusionado en el extremo N-terminal al péptido guía KRE2-S de S. cerevisiae (33), que dirige la enzima quimérica hacia el ER o el aparato de Golgi, (3) el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris flanqueados por repeticiones de lacZ, y (4) el transportador de UDP-galactosa de D. melanogaster (DmUGT). El cassette de expresión que codifica para ScGALIO comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de ScGALIO (SEQ ID NO: 61) enlazado operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor PMA1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 88), y enlazado operablemente en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 62). El cassette de expresión que codifica para la galactosiltransferasa I quimérica, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio catalítico de hGaIT optimizado en codones para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 63) fusionado en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido guía KRE2-S 33 (SEQ ID NO: 64), la cual está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris, y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El cassette de expresión URA5 comprende una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris flanqueados por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ. El cassette de expresión que codifica para DmUG T comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de DmUGT (SEQ ID NO: 65) enlazado operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor OCH1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 66), y enlazado operablemente en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción ALG12 de P. pastoris (SEQ ID NO: 67). Los cuatro cassettes en tándem son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen HIS1 (SEQ ID NO: 68), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen HIS1 (SEQ ID NO: 69). El plásmido pGLY582 fue linealizado, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY3794, para producir muchas cepas en las cuales los cuatro cassettes de expresión en tándem han sido insertados en el locus HIS1 mediante recombinación homologa. La cepa YGLY3853 se seleccionó, y es auxotrófica para histidina y prototrófica para uridina.

El plásmido pGLY167b (figura 1 1) es un vector de integración que elige como objetivo el locus ARG1, y contiene tres cassettes de expresión en tándem que codifican para (1 ) el dominio catalítico de manosidasa II de D. melanogaster (KD) fusionado en el extremo N-terminal al péptido guía MNN2 de S. cerevisiae (53), que dirige la enzima quimérica hacia el ER o el aparato de Golgi, (2) el gen HIS1 o la unidad de transcripción de P. pastoris, y (3) el dominio catalítico de N-acetilglucosamina (GlcNAc) transferasa II (TC) de rata fusionado en el extremo N-terminal al péptido guía MNN2 de S. cerevisiae (54) que dirige la enzima quimérica hacia el ER o el aparato de Golgi. El cassette de expresión que codifica para KD53 comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio catalítico de manosidasa II de D. melanogaster optimizado en codones para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 70) fusionada en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido guía MNN2 53 (SEQ ID NO:71), la cual está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris, y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El cassette de expresión HIS1 comprende una molécula de ácido nucleico que comprende el gen HIS1 o la unidad de transcripción de P. pastoris (SEQ ID NO: 72). El cassette de expresión que codifica para TC54 comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio catalítico de GlcNAc transferasa II de rata optimizado en codones para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 73) fusionada en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido guía MNN2 54 (SEQ ID NO: 74), la cual está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor PMA 1 de P. pastoris, y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de P. pastoris. Los tres cassettes de expresión en tándem son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen ARG1 (SEQ ID NO: 75), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3" del gen ARG1 (SEQ ID NO: 76). El plásmido pGLY167b fue linealizado con Sfi\, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY3853, para producir muchas cepas en las cuales los tres cassettes de expresión en tándem han sido insertados en el locus ARG1 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY4754 se seleccionó de las cepas producidas, y es auxotrófica para arginina y prototrófica para uridina e histidina. La cepa se contraseleccionó entonces en presencia de 5-FOA, para producir muchas cepas ahora auxotróficas para uridina. Se seleccionó la cepa YGLY4799.

El plásmido pGLY341 1 (figura 12) es un vector de integración que contiene el cassette de expresión que comprende el gen URA5 de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ flanqueadas en un lado por la secuencia de nucleótidos 5' del gen BMT4 de P. pastoris (SEQ ID NO: 77), y en el otro lado por la secuencia de nucleótidos 3' del gen BMT4 de P. pastoris (SEQ ID NO: 78). El plásmido pGLY3411 fue linealizado, y el plásmido linealizado transformado en YGLY4799, para producir muchas cepas en las cuales el cassette de expresión URA5 ha sido insertado en el locus BMT4 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY6903 se seleccionó de las cepas producidas, y es prototrófica para uracilo, adenina, histidina, prolina, arginina y triptófano. La cepa se contraseleccionó entonces en presencia de 5-FOA, para producir muchas cepas ahora auxotróficas para uridina. Se seleccionaron las cepas YGLY7432 e YGLY7433.

El plásmido pGLY3419 (figura 13) es un vector de integración que contiene un cassette de expresión que comprende el gen URA5 de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ flanqueadas en un lado por la secuencia de nucleótidos 5' del gen BMT1 de P pastoris (SEQ ID NO: 79), y en el otro lado por la secuencia de nucleótidos 3' del gen BMT1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 80). El plásmido pGLY3419 fue linealizado, y el plásmido linealizado transformado en las cepas YGLY7432 e YGLY7433, para producir muchas cepas en las cuales el cassette de expresión URA5 ha sido insertado en el locus BMT1 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. Las cepas YGLY7656 e YGLY7651 se seleccionaron de las cepas producidas, y son prototróficas para uracilo, adenina, histidina, prolina, arginina y triptófano. Las cepas se contraseleccionaron entonces en presencia de 5-FOA, para producir muchas cepas ahora auxotróficas para uridina. Se seleccionaron las cepas YGLY7930 e YGLY7940.

El plásmido pGLY3421 (figura 14) es un vector de integración que contiene un cassette de expresión que comprende el gen URA5 de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ flanqueadas en un lado por la secuencia de nucleótidos 5' del gen BMT3 de P. pastoris (SEQ ID NO: 81 ), y en el otro lado por la secuencia de nucleótidos 3' del gen BMT3 de P. pastoris (SEQ ID NO: 82). El plásmido pGLY3419 fue linealizado, y el plásmido linealizado transformado en las cepas YGLY7930 e YGLY7940, para producir muchas cepas en las cuales el cassette de expresión URA5 ha sido insertado en el locus BMT1 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. Las cepas YGLY7965 e YGLY7961 se seleccionaron de las cepas producidas, y son prototróficas para uracilo, adenina, histidina, prolina, arginina y triptófano.

El plásmido pGLY3673 (figura 15) es un vector de integración de KINKO que elige como objetivo el locus PR01 sin que perturbe la expresión del locus, y contiene cassettes de expresión que codifican para el dominio catalítico de a-1 ,2-manosidasa de T. reesei fusionado en el extremo N-terminal al péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae (aMATTrMan), que dirige la proteína quimérica hacia la vía secretoria y secreción de la célula. El cassette de expresión que codifica para aMATTrMan comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio catalítico de T. reesei (SEQ ID NO: 83) fusionado en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 13), la cual está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor AOX1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 23), y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 24). El cassette es flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' y el ORF completo del gen PR01 (SEQ ID NO: 89) seguidos de una secuencia de terminación de la transcripción ALG3 de P. pastoris, y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen PR01 (SEQ ID NO: 90). El plásmido contiene el gen PpARGL El plásmido pGLY3673 fue transformado en las cepas YGLY7965 e YGLY7961 , para producir muchas cepas de las cuales las cepas YGLY78316 e YGLY8323 se seleccionaron de las cepas producidas.

El plásmido pGLY6833 (figura 16) es un plásmido de integración enrollable que codifica para las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo anti-Her2, y elige como objetivo el locus TRP2 en P. pastoris. El cassette de expresión que codifica para la cadena pesada anti-Her2 comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de la cadena pesada optimizado en codones para expresión efectiva en P. pastoris (SEQ ID NO: 15), enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que codifica para la secuencia de pre-señal del factor de acoplamiento de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 14), que a su vez está fusionada en el extremo N-terminal a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia del promotor AOX1 inducible de P. pastoris (SEQ ID NO: 23), y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de terminación de la transcripción CIT1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 85). El cassette de expresión que codifica para la cadena ligera anti-Her2 comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de la cadena ligera optimizado en codones para expresión efectiva en P. pastoris (SEQ ID NO: 17), enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que codifica para la secuencia de pre-señal del factor de acoplamiento de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 14), que a su vez está fusionada en su extremo N-terminal a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia del promotor AOX1 inducible de P. pastoris (SEQ ID NO: 23), y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de terminación de la transcripción CIT1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 85). Para la selección de transformantes, el plásmido comprende un cassette de expresión que codifica para el ORF de zeocina en el cual la molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF (SEQ ID NO: 35), está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia del promotor TEF de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 37), y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 24). El plásmido incluye además una molécula de ácido nucleico para determinar como blanco el locus TRP2 (SEQ ID NO: 91 ).

El plásmido pGLY6564 (figura 17) es un plásmido de integración enrollable que codifica para las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo anti-RSV que elige como objetivo el locus TRP2 en P. pastoris. El cassette de expresión que codifica para la cadena pesada anti-RSV, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de la cadena pesada optimizado en codones para expresión efectiva en P. pastoris (SEQ ID NO: 19), enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que codifica para la secuencia de pre-señal del factor de acoplamiento de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 14), que a su vez está fusionada en su extremo N-terminal a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia del promotor AOX1 inducible de P. pastoris (SEQ ID NO: 23), y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 24). El cassette de expresión que codifica para la cadena ligera anti-RSV, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de la cadena ligera optimizado en codones para expresión efectiva en P. pastoris (SEQ ID NO: 21 ) enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que codifica para la secuencia de pre-señal del factor de acoplamiento de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 14), que a su vez está fusionada en su extremo N-terminal a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia del promotor AOX1 inducible de P. pastoris (SEQ ID NO: 23), y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de terminación de la transcripción AOX1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 36). Para la selección de transformantes, el plásmido comprende un cassette de expresión que codifica para el ORF de zeocina en el cual la molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF (SEQ ID NO: 35) está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia del promotor TEF de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 37), y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 24). El plásmido incluye además una molécula de ácido nucleico para determinar como blanco el locus TRP2 (SEQ ID NO: 91 ).

La cepa YGLY13992 se generó transformando a pGLY6833, que codifica para el anticuerpo anti-Her2, en YGLY8316. La cepa YGLY13992 se seleccionó de las cepas producidas. En esta cepa, los cassettes de expresión que codifican para las cadenas pesada y ligera anti-Her2, son dirigidos hacia el locus TRP2 de Pichia pastoris (PpTRP2). Esta cepa no incluye el cassette de expresión de LmSTT3D. La cepa YGLY14401 se generó transformando a pGLY6564, que codifica para el anticuerpo anti-RSV, en YGLY8323. La cepa YGLY14401 se seleccionó de las cepas producidas. En esta cepa, los cassettes de expresión que codifican para las cadenas pesada y ligera anti-RSV son dirigidos hacia el locus TRP2 de Pichia pastoris (PpTRP2). Esta cepa no incluye el cassette de expresión de Z_mSTT3D.

La transformación de las cepas adecuadas descritas en la presente con los vectores del plásmido de integración/expresión de LmSTT3D anteriores, se realizó esencialmente como sigue. Se cultivaron cepas de Pichia pastoris adecuadas en 50 mL de medio YPD (extracto de levadura (1 %), peptona (2%) y dextrosa (2%)) durante la noche a una concentración de oxígeno disuelto (OD) de aproximadamente 0.2 a 6. Después de incubación sobre hielo por 30 minutos, las células fueron convertidas a pellas mediante centrifugación a 2500-3000 rpm por cinco minutos. Se removió el medio, y las células se lavaron tres veces con sorbitol 1 M estéril enfriado sobre hielo antes de la resuspensión en 0.5 mL de sorbitol 1 M estéril enfriado sobre hielo. Diez µ?_ de ADN linealizado (5 a 20 pg) y 100 µ?_ de la suspensión de células, se combinaron en un recipiente de electroporación y se incubaron por 5 minutos sobre hielo. La electroporación se realizó en un GenePulser Xcell de Bio-Rad siguiendo el protocolo preestablecido para Pichia pastoris (2 kV, 25 pF, 200 O), seguida inmediatamente por la adición de 1 ml_ de medio de recuperación YPDS (medio YPD más sorbitol 1 M). Se dejó que las células transformadas se recuperaran por cuatro horas hasta la noche a temperatura ambiente (24°C), antes de sembrar las células en un medio selectivo.

Cada una de las cepas YGLY13992 e YGLY14401 fue transformada entonces con pGLY6301 , que codifica para la LmSTT3D bajo el control del promotor AOX1 inducible, o pGLY6294, que codifica para la /./77STT3D bajo el control del promotor GAPDH constitutivo, como se describió anteriormente, para producir las cepas descritas en el ejemplo 3.

EJEMPLO 3 El plásmido de integración/expresión pGLY6301 , el cual comprende el cassette de expresión en el cual el ORF que codifica para la LmSTT3D está enlazado operablemente al promotor PpAOXI inducible, o pGLY6294, que comprende el cassette de expresión en el cual el ORF que codifica para la LmSTT3D está enlazado operablemente al promotor PpGAPDH constitutivo, fue linealizado con Spel o Sfí\, respectivamente, y los plásmidos linealizados transformados en la cepa YGLY13992 o YGLY1 401 de Pichia pastoris, para producir las cepas YGLY17351 , YGLY17368, YGLY17319 e YGLY 7354 mostradas en el cuadro 1. Las transformaciones se realizaron esencialmente como se describió en el ejemplo 2.

CUADRO 1 La integración genómica de pGLY6301 en el locus URA6 se confirmó mediante la PCR (cPCR) de las colonias, usando los iniciadores PpURA6out/UP (5'-CTGAGGAGTCAGATATCAGCTCAATCTCCAT-3'; SEQ ID NO: 1 ) y Puc19/LP (5'-TCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGT-3'; SEQ ID NO: 2) o ScARR3/UP (5'-GGCAATAGTCGCGAGAATCCTTAAACCAT-3'¡ SEQ ID NO: 3) y PpURA6out/LP (5- CTGGATGTTTGATGGGTTCAGTTTCAGCTGGA-S'; SEQ ID NO: 4).

La integración genómica de pGLY6294 en el locus TRP1 se confirmó mediante la cPCR, usando los iniciadores PpTRP-5'out/UP (5 -CCTCGTAAAGATCTGCGGTTTGCAAAGT-3'; SEQ ID NO: 5) y PpALG3TT/LP (5 -CCTCCCACTGGAACCGATGATATGGAA-3'; SEQ ID NO: 6) o PpTEFTT/UP ^'-GATGCGAAGUAAGTGCGCAGAAAGTAATATCA-S'; SEQ ID NO: 7) y PpTRP1-3'out/LP (5 - CGTGTGTACCTTGAAACGTCAATGATACTTTGA-3'; SEQ ID NO: 8). La integración del cassette de expresión que codifica para la LmSTT3D en el genoma se confirmó usando los iniciadores de cPCR LmSTT3D/iUP (5'-GCGACTGGTTCCAATTGACAAGCTT-3' (SEQ ID NO: 9) y LmSTT3D/iLP (5'-CAACAGTAGAACCAGAAGCCTCGTAAGTACAG-3' (SEQ ID NO: 10). Las condiciones de la PCR fueron un ciclo de 95°C por dos minutos, 35 ciclos de 95°C por 20 segundos, 55°C por 20 segundos y 72°C por un minuto; seguidos de un ciclo de 72°C por 10 minutos.

Las cepas se cultivaron en un termentador SixFors, para producir los anticuerpos para el análisis de la ocupación del sitio de N-glucosilación. Las condiciones de crecimiento de las células de las cepas transformadas para la producción de anticuerpos, fueron generalmente como sigue: La expresión de las proteínas para las cepas de levadura transformadas, se llevó a cabo en matraces de agitación a 24°C con medio complejo de glicerol regulado en su pH (BMGY) que consistía de extracto de levadura a 1 %, peptona a 2%, regulador de pH de fosfato de potasio 100 mM, pH 6.0, base nitrogenada de levadura a 1.34%, biotina a 4 x 10"5% y glicerol a 1 %. El medio de inducción para la expresión de las proteínas fue medio complejo de metanol regulado en su pH (BMMY) que consistía de metanol a 1 % en lugar de glicerol en BMGY. El inhibidor de Pmt Pmt¡-3 en metanol se añadió al medio de crecimiento a una concentración final de 18.3 µ? al mismo tiempo que se añadió el medio de inducción. Las células se cosecharon y se centrifugaron a 2,000 rpm por cinco minutos.

El protocolo de examen del fermentador SixFors, siguió los parámetros mostrados en el cuadro 2: CUADRO 2 Al tiempo de aproximadamente 18 horas post-inoculación, los recipientes SixFors que contenían 350 mL de medio A (véase el cuadro 3 más adelante) más glicerol a 4%, se inocularon con la cepa de interés. Se añadió con el inoculo una pequeña dosis (0.3 mL de 0.2 mg/mL en metanol a 100%) de Pmti-3, ácido (5-[[3-(1-fenil-2-hidroxi)etoxi)-4-(2-feniletoxi)]fenil]metilen]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinoacético) (véase la solicitud internacional publicada No. WO 2007061631). Al tiempo de aproximadamente 20 horas, se añadió por recipiente un bolo de 17 mL de solución de glicerol a 50% (suministro intermitente de glicerol, véase el cuadro 4 más adelante) más una dosis más grande (0.3 mL de 4 mg/mL) de Pmti-3. A aproximadamente 26 horas, cuando el glicerol se había consumido, indicado por una espiga positiva en la concentración de oxígeno disuelto (OD), se inició un suministro de metanol (véase el cuadro 5 más adelante) a 0.7 mL/hr continuamente. Al mismo tiempo, se añadió por recipiente otra dosis de Pmti-3 (repuesto de 0.3 mL de 4 mg/mL). Al tiempo de aproximadamente 48 horas, se añadió por recipiente otra dosis (0.3 mL de 4 mg/mL) de Pmti-3. Los cultivos se cosecharon y se procesaron al tiempo de aproximadamente 60 horas post-inoculación.

CUADRO 3 Composición del medio A CUADRO 4 Suministro intermitente de glicerol CUADRO 5 Suministro de metanol CUADRO 6 Sales de PMT1 La ocupación del N-glucano en los anticuerpos anti-Her2 o anti-RSV se determinó usando electroforesis capilar (CE), como sigue. Los anticuerpos se recuperaron del medio de cultivo de células, y se purificaron mediante cromatografía en columna de proteína A. La muestra purificada de proteína A (100-200 pg) se concentró a aproximadamente 100 pL, y entonces se intercambió regulador de pH con Tris-HCI 100 mM, pH 9.0 con SDS a 1 %. Entonces, la muestra junto con 2 pL del estándar interno de 10 kDa provisto por Beckman fue reducida por la adición de 5 pL de ß-mercaptoetanol, y se hirvió por cinco minutos. Aproximadamente 20 µ?_ de la muestra reducida se resolvieron entonces sobre un capilar de sílice fusionada desnudo (aproximadamente 70 mm, D.l. de 50 pm), de acuerdo con el método recomendado por Beckman Coulter.

La figura 18 muestra la ocupación del sitio de N-glucosilación de las cadenas pesadas a partir del análisis de la CE. La figura muestra que para ambos anticuerpos, la cantidad de especies de cadenas pesadas N-enlazadas se incrementó de aproximadamente 80% a aproximadamente 94% cuando la Z./77STT3D fue expresada constitutivamente a aproximadamente 99% cuando la expresión de la L T7STT3D fue inducida al mismo tiempo que se indujo la expresión de los anticuerpos.

El cuadro 7 muestra que la ocupación del sitio de N-glucosilación de los anticuerpos anti-HER2 y anti-RSV se incrementó para composiciones en las cuales los anticuerpos se obtuvieron de células hospederas en las cuales la LmSTT3D fue sobreexpresada en presencia del complejo de oligosacariltransferasa (OST) endógeno. Para determinar la ocupación del sitio de N-glucosilación, los anticuerpos fueron reducidos, y se determinó la ocupación del N-glucano de las cadenas pesadas. El cuadro muestra que en general, la sobreexpresión de la L/77STT3D bajo el control de un promotor inducible, efectuó un incremento de la ocupación del sitio de N-glucosilación de aproximadamente 82 a 83% a aproximadamente 99% para ambos anticuerpos puestos a prueba (un incremento de aproximadamente 19% sobre la ocupación del sitio de N-glucosilación en ausencia de sobreexpresión de la L/77STT3D). La expresión de la Z.mSTT3D y los anticuerpos estuvo bajo el control del mismo promotor inducible. Cuando la sobreexpresión de la LmSTT3D estuvo bajo el control de un promotor constitutivo, el incremento en la ocupación del sitio de N-glucosilación se elevó hasta aproximadamente 94% para ambos anticuerpos puestos a prueba (un incremento de aproximadamente 13% sobre la ocupación del sitio de N-glucosilación en ausencia de sobreexpresión de la LmSTT3D).

CUADRO 7 El cuadro 8 muestra la ocupación del sitio de N-glucosilación para composiciones que comprenden anticuerpos anteros obtenidos de células hospederas en las cuales la LmSTT3D fue sobreexpresada en presencia del complejo de oligosacariltransferasa (OST) endógeno, con base en la determinación de la ocupación del sitio de N-glucosilación de las cadenas pesadas individuales a partir de preparaciones de anticuerpo reducidas. La fórmula (fracción de GHC)2 x 100 proveerá una estimación o aproximación del por ciento de anticuerpos completamente ocupados con base en la determinación de la fracción de cadenas pesadas que son N-glucosiladas.

CUADRO 8 Análisis Q-TOF El sistema de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (CLAR) usado consistió de un Agilent 1200 equipado con un autoinyector, un compartimiento calefactor de la columna y un detector UV detectando a 210 y 280 nm. Todos los experimentos de LC-MS realizados con este sistema se emprendieron a 1 mL/min. La magnitud de flujo no se dividió para la detección de la MS. Se llevó a cabo el análisis espectrométrico de masa en el modo de ión positivo en Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 6520 (tecnología de Agilent). La temperatura de la fuente de ESI doble se ajustó a 350°C. Las magnitudes de flujo de nitrógeno gaseoso se ajustaron a 13 L/h para el cono y 350 l/h, y el nebulizador se ajustó a 3.1635 kg/cm2 con 4500 voltios aplicados al capilar. Se preparó la masa de referencia de 922.009 a partir de HP-0921 , de acuerdo con el kit de solución de la masa de referencia API-TOF para la calibración de la masa y las mediciones de la masa de proteínas. Los datos para la escala del espectro de iones de 300-3000 m/z se adquirieron y se procesaron usando un Masshunter de Agilent.

La preparación de la muestra fue como sigue. Se preparó una muestra de anticuerpos intactos (50 pg) de 50 pL con NH4HCO3 25 mM, pH 7.8. Para el anticuerpo desglucosilado, una alícuota de 50 pL de la muestra de anticuerpos intactos se trató con PNGasa F (10 unidades) por 18 horas a 37°C. Se preparó el anticuerpo reducido añadiendo DTT 1 M a una concentración final de 10 mM, a una alícuota del anticuerpo intacto o el anticuerpo desglucosilado, y se incubó por 30 minutos a 37°C.

Tres microgramos de la muestra de anticuerpo intacto o desglucosilado se cargaron sobre una columna Poroshell 300SB-C3 (2.1 mm x 75 mm, 5 pm) (Agilent Technologies) mantenida a 70°C. La proteína se enjuagó primero en el cartucho por 1 minuto con solvente A a 90% (HCOOH a 0.1 %), solvente B a 5% (acetonitrílo a 90% en HCOOH a 0.1 %). Se realizó entonces la elución usando un gradiente de 5 a 100% de B durante 26 minutos, seguida de una regeneración por tres minutos a 100% de B y mediante un período de equilibrio final de 10 minutos a 5% de B.

Para el anticuerpo reducido, una muestra de tres microgramos se cargó sobre una columna Poroshell 300SB-C3 (2.1 mm x 75 mm, 5 µ?t?) (Agilent Technologies) mantenida a 40 C. La proteína se enjuagó primero en el cartucho por tres minutos con solvente A a 90% y solvente B a 5%. Se realizó entonces la elución usando un gradiente de 5 a 80% de B durante 20 minutos, seguida de una regeneración por 7 minutos a 80% de B y mediante un período de equilibrio final de 10 minutos a 5% de B.

Las figuras 19A-19C muestran los resultados de un análisis Q-TOF en el cual la ocupación del sitio de N-glucosilación del anticuerpo anti-Her2 no reducido producido en YGLY17351 , se comparó con la ocupación del sitio de N-glucosilación del anticuerpo anti-Her2 no reducido disponible comercialmente producido en células CHO (HERCEPTIN). La figura muestra que el anticuerpo anti-Her2 producido en la cepa YGLY17351 , tiene una ocupación del sitio de N-glucosilación que es similar a la ocupación del sitio de N-glucosilación del anticuerpo ant¡-Her2 obtenido en células CHO. La figura muestra que la cantidad de anticuerpos en los cuales sólo un sitio de N-glucosilación fue ocupado disminuyó, y la cantidad de anticuerpos en los cuales ambos sitios de N-glucosilación fueron ocupados se incrementó cuando los anticuerpos fueron producidos por la cepa YGLY17351. Los resultados mostrados para el anticuerpo anti-Her2 producido en YGLY17351 , fueron consistentes con la ocupación aproximada mostrada en el cuadro 8.

La figura 20 demuestra el aumento a escala de la ocupación del sitio de N-glucosilación de anticuerpos anti-Her2 producidos en YGLY17351.

Para evaluar el aumento a escala de la ocupación de N-glucanos, se puso a prueba YGLY17351 en biorreactores variando de 5 ml_ a 40 L. En general, se ha observado que la ocupación del sitio de N-glucosilación de las glucoproteínas en la levadura P. pastoris glucodiseñada, varía con las condiciones del procedimiento usadas para producir las glucoproteínas. Sin embargo, las cepas que sobreexpresan a LmSTT3D mostraron ocupación del sitio de N-glucosilación muy consistente (99%), sin considerar la escala de los biorreactores y las condiciones del procedimiento. De esta manera, la presente invención provee un método en el cual la ocupación del sitio de N-glucosilación de glucoproteínas en P. pastoris glucodiseñada cultivada bajo condiciones a pequeña escala, se mantiene cuando se cultiva bajo condiciones a gran escala.

Las figuras 21A, 21 B, 22A y 22B se proveen para propósitos ilustrativos. Las figuras 21 A y 21 B muestran los resultados de una CE y el análisis Q-TOF para un lote comercial de anticuerpo anti-Her2 producido en células CHO (HERCEPTIN). Las figuras 22A y 22B muestran los resultados de una CE y el análisis Q-TOF para el mismo lote comercial de anticuerpo anti-Her2, después del tratamiento con PNGasa F por un tiempo. La CE muestra un incremento en la cadena pesada no glucosilada, y el análisis Q-TOF muestra la presencia de anticuerpos no glucosilados después del tratamiento con PNGasa F (compárense las figuras 21 A y 21 B con las figuras 22A y 22B).

El cuadro 9 muestra la composición de N-glucanos de los anticuerpos anti-Her2 y anti-RSV producidos en cepas que sobreexpresan a L TJSTT3D, en comparación con cepas que no sobreexpresan la misma. La figura confirma que la calidad de los N-glucanos de los anticuerpos de las cepas que sobreexpresan a LmSTT3D, es comparable a la de las cepas que no sobreexpresan la misma. Se produjeron anticuerpos de SixFors (biorreactor de 0.5L), y los N-glucanos de los anticuerpos purificados con proteína A se analizaron con marcación de 2AB. En general, la sobreexpresión de LmSTT3D no pareció afectar significativamente la composición de los N-glucanos de los anticuerpos. La composición de glucosilación puede variar como una función de las condiciones de fermentación; por lo tanto, la composición de glucosilación de los anticuerpos producidos en las cepas de Pichia pastoris, puede variar de aproximadamente 50 a 70% en moles de GO, 15 a 25% en moles de G1 , 4 a 12% en moles de G2, 5 a 17% en moles de an5, y 3 a 15% en moles de híbridos.

CUADRO 9 El cuadro 10 muestra una comparación del patrón de glucosilación del anticuerpo anti-RSV producido en la cepa YGLY14401 , en comparación con varios lotes comerciales de un anticuerpo anti-RSV producido en células CHO y vendido como palivizumab bajo el nombre comercial SYNAGIS.

CUADRO 10 Este ejemplo muestra entonces que la presente invención permite la producción de glucoproteínas recombinantes en Pichia pastoris, en las cuales la ocupación del sitio de N-glucosilación de las glucoproteínas recombinantes es comparable a la ocupación del sitio de N-glucosilación de las glucoproteínas recombinantes producidas en sistemas de expresión de mamífero tales como las células CHO.

EJEMPLO 4 La proteína STT3A de Leishmania major, proteína STT3B de Leishmania major y proteína STT3D de Leishmania major, son todos ejemplos de oligosacariltransferasas de una sola subunidad heterólogas que se ha mostrado suprimen el fenotipo letal de una deleción del locus STT3 en Saccharomyces cerevisiae (Naseb et al., Molec. Biol. Cell 19: 3758-3768 (2008)). Naseb ef al. (ibid.), mostraron además que la proteína STT3D de Leishmania major podía suprimir el fenotipo letal de una mutación de los locí WBP1, OST1, SWP1 u OST2 en Saccharomyces cerevisiae. Hese et al. (Glycobiology 19: 160-171 (2009)), proveen datos que sugieren que las proteínas STT3A, STT3B y STT3D de Leishmania major, pueden complementar funcionalmente mutaciones de los loci WBP1, OST1, SWP1 y OST2. Otras oligosacariltransferasas de una sola subunidad heterólogas incluyen, pero no están limitadas a, las proteínas STT3 de una sola subunidad del cinetoplasto o de Giardia, por ejemplo, la proteína STT3 de Caenorhabditis elegans, la proteína STT3 de Trypanosoma brucei, la proteína STT3 de Trypanosoma cruzi, y la proteína STT3 de Toxoplasma gondii. En contraste con la proteína STT3D de Leishmania major, que Naseb ef al. (en la obra citada) enseñan no se incorpora en el complejo de OTasa de Saccharomyces cerevisiae, Castro et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 103: 14756-14760 (2006)) enseñan que la proteína STT3 de Trypanosoma cruzi parece integrarse en el complejo de OTasa de Saccharomyces cerevisiae.

En este ejemplo, las células hospederas construidas similares a las células hospederas en el ejemplo previo, fueron transformadas con vectores de plásmido que contenían cassettes de expresión que codificaban para la proteína STT3 de Caenorhabditis elegans y Trypanosoma cruzi y la proteína STT3C de Leishmania major enlazados operablemente al promotor AOX1. Un vector que contiene un cassette de expresión que codifica para la proteína Stt3p de Pichia pastoris, se incluyó en el experimento. Como se muestra en el cuadro 1 1 , la expresión de las varias proteínas STT3 concurrentemente con la expresión del anticuerpo anti-Her2, no pareció reclutar en un incremento en la ocupación del sitio de N-glucosilación. Sin embargo, varias proteínas STT3 pueden exhibir especificidad por el substrato. Por ejemplo, las proteínas STT3 A, B, C y D de Leishmania major, difieren en la especificidad por el substrato al nivel de la glucosilación, lo cual sugiere que además del sitio de unión N-X-S/T esencial, otras características del substrato pueden influir sobre la glucosilación N-enlazada en un sitio de unión particular (Naseb et al., en la obra citada). Los resultados mostrados en el cuadro 9 usaron el anticuerpo anti-Her2 como substrato. El dominio CH2 de cada cadena pesada de un anticuerpo contiene un sólo sitio para la glucosilación N-enlazada: este está usualmente en el residuo de asparagina 297 (Asn-297) (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5a. ed., U.S. Department of Health and Human Services, publicación de NIH No. 91-3242). De esta manera, los resultados mostrados en el cuadro 9 sugieren que el por ciento de ocupación del sitio de N-glucosilación podría ser influenciado por la especificidad por el substrato que exhibe la oligosacariltransferasa de una sola subunidad particular que está siendo usada.

CUADRO 11 EJEMPLO 5 Una cepa capaz de producir N-glucanos sialilados, se construyó como sigue. La cepa fue transfectada con un vector de plásmido que codifica para el GM-CSF humano, y un vector de plásmido que codifica para la STT3D de Leishmania major. La construcción de las cepas se ilustra esquemáticamente en la figura 23A-23D. En resumen, las cepas se construyeron como sigue: El plásmido pGLY2456 (figura 24) es un vector de integración KINKO que elige como objetivo el locus TRP2 sin que perturbe la expresión del locus, y contiene seis cassettes de expresión que codifican para (1) el transportador de CMP-ácido siálico de ratón (mCMP-Sia Transp), (2) la UDP-GIcNAc 2-epimerasa/A -acetilmanosamina cinasa (hGNE) de humano, (3) el gen ARG1 o la unidad de transcripción de Pichia pastoris, (4) la CMP-ácido siálico sintasa de humano (hCSS), (5) la N-acetilneuraminato-9-fosfato sintasa (hSPS) de humano, (6) el dominio catalítico de a-2,6-sialiltransferasa de ratón (mST6) fusionado en el extremo N-terminal al péptido guía KRE2 de S. cerevisiae (33) que dirige la enzima quimérica hacia el ER o el aparato de Golgi, y el gen ARG1 o la unidad de transcripción de P. pastoris. El cassette de expresión que codifica para el transportador de CMP-ácido siálico de ratón comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el codón del ORF del transportador de CMP-ácido siálico de ratón optimizado en codones para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 92), la cual está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor PMA1 de P. pastoris, y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de P. pastoris. El cassette de expresión que codifica para la UDP-GIcNAc 2-epimerasa//V-acetilmanosam¡na cinasa de humano, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de hGNE optimizado en codones para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 93), la cual está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris, y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El cassette de expresión que codifica para el gene ARG1 de P. pastoris comprende la secuencia SEQ ID NO: 94. El cassette de expresión que codifica para la CMP-ácido siálico sintasa de humano comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de hCSS optimizado en codones para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 95), la cual está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris, y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El cassette de expresión que codifica para la N-acetilneuraminato-9-fosfato sintasa de humano comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el ORF de hSIAP S optimizado en codones para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 96), la cual está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor PMA 1 de P. pastoris, y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de P pastoris. El cassette de expresión que codifica para la a-2,6-sialiltransferasa quimérica de ratón, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio catalítico de mST6 optimizado en codones para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 97) fusionada en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido de señal KRE2 de S. cerevisiae, la cual está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor TEF de P pastoris, y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción TEF de P. pastoris. Los seis cassettes de expresión en tándem son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' y el ORF del gen TRP2 que termina en el codón de detención (SEQ ID NO: 98) seguida de una secuencia de terminación de la transcripción ALG3 de P. pastoris, y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen TRP2 (SEQ ID NO: 99). El plásmido pGLY2456 fue linealizado con S /'l, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY7961 , para producir muchas cepas en las cuales los seis cassettes de expresión han sido insertados en el locus TRP2 inmediatamente después del ORF de TRP2 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY8146 se seleccionó de las cepas producidas. La cepa se contraseleccionó entonces en presencia de 5-FOA, para producir muchas cepas ahora auxotróficas para uhdina. Se seleccionó la cepa YGLY9296.

El plásmido pGLY5048 (figura 25) es un vector de integración que elige como objetivo el locus STE13, y contiene cassettes de expresión que codifican para (1) el dominio catalítico de a-1 ,2-manosidasa de T. reesei fusionado en el extremo N-terminal al péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae (aMATTrMan) para dirigir la proteína quimérica hacia la vía secretoria y secreción de la célula, y (2) el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris. El cassette de expresión que codifica para aMATTrMan comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio catalítico de T. reesei (SEQ ID NO: 83) fusionado en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido de señal aMATpre de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 13), la cual está enlazada operablemente en el extremo 5' a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor AOX1 de P. pastoris, y en el extremo 3' a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El cassette de expresión URA5 comprende una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o la unidad de transcripción de P. pastoris flanqueados por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ. Los dos cassettes de expresión en tándem son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen STE13 (SEQ ID NO: 100), y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen STE13 (SEQ ID NO: 101). El plásmido pGLY5048 fue linealizado con Sfi\, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY9296, para producir muchas cepas. La cepa YGLY9469 se seleccionó de las cepas producidas. Esta cepa es capaz de producir glucoproteínas que tienen O-glucosilación de una sola mañosa (véase la solicitud publicada de E.U.A. No. 20090170159).

El plásmido pGLY5019 (figura 26) es un vector de integración que elige como objetivo el locus DAP2, y contiene un cassette de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el cassette de expresión de resistencia a nourseotricina (NATR) (originalmente de pAG25 de EROSCARF, Scientific Research and Development GmbH, Daimierstrasse 13a, D-61352 Bad Homburg, Alemania; véase Goldstein et al., Yeast 15: 1541 (1999)). El cassette de expresión NATR (SEQ ID NO: 34) es regulado operablemente por el promotor TEF1 de Ashbya gossypii y secuencias de terminación de la transcripción TEF1 de A. gossypii flanqueadas en un lado por la secuencia de nucleótidos 5' del gen DAP2 de P. pastoris (SEQ ID NO: 102), y en el otro lado por la secuencia de nucleótidos 3' del gen DAP2 de P. pastoris (SEQ ID NO: 103). El plásmido pGLY5019 fue linealizado, y el plásmido linealizado transformado en la cepa YGLY9469, para producir muchas cepas en las cuales el cassette de expresión NATR ha sido insertado en el locus DAP2 mediante recombinación homologa de doble cruzamiento. La cepa YGLY9797 se seleccionó de las cepas producidas.

El plásmido pGLY5085 (figura 27) es un plásmido KINKO para la introducción de un segundo juego de los genes implicados en la producción de N-glucanos sialilados en P. pastoris. El plásmido es similar al plásmido YGLY2456, salvo que el gen ARG1 de P. pastoris ha sido reemplazado con un cassette de expresión que codifica para resistencia a higromicina (HygR), y el plásmido elige como objetivo el locus TRP5 de P. pastoris. El cassette de resistencia HYGR es SEQ ID NO: 104. El cassette de expresión HYGR (SEQ ID NO: 104) es regulado operablemente por el promotor TEF1 de Ashbya gossypii y secuencias de terminación de la transcripción TEF1 de A. gossypii (véase Goldstein et al., Yeast 15: 1541 (1999)). Los seis cassettes de expresión en tándem son flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 5' y el ORF del gen TRP5 que termina en el codón de detención (SEQ ID NO: 105) seguidos de una secuencia de terminación de la transcripción ALG3 de P. pastoris, y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región 3' del gen TRP5 (SEQ ID NO: 106). El plásmido pGLY5085 fue transformado en la cepa YGLY9797, para producir muchas cepas de las cuales se seleccionó la cepa YGLY1200.

El plásmido pGLY7240 (figura 28), que elige como objetivo el locus TRP2 de Pichia pastoris (PpTRP2), codifica para una proteína de fusión que comprende el GM-CSF humano fusionado a la proteína CWP1 de Pichia pastoris mediante un enlazador que contiene un sitio de desdoblamiento Kex2. La proteína CWP1 es removida del GM-CSF en el Golgi posterior por la endoproteasa Kex2, de modo que el GM-CSF libre es secretado en el sobrenadante de fermentación. El GM-CSF humano tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 108, y es codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 108. La proteína de fusión (SEQ ID NO: 109) es codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 110. La secuencia de señal de CWP1 consiste de los aminoácidos 1 a 18, la secuencia de aminoácidos de CWP1 consiste de los aminoácidos 19 a 289, la secuencia de aminoácidos del enlazador Kex2 GGGSLVKR (SEQ ID NO: 11 1) consiste de los aminoácidos 290 a 297, y la secuencia de aminoácidos del GM-CSF consiste de los aminoácidos 298 a 424. La expresión de la proteína de fusión está enlazada operablemente al promotor AOX1 de P. pastoris y las secuencias de terminación de la transcripción ScCYC. El plásmido pGLY7240 fue transformado en la cepa YGLY12900, para producir muchas cepas de las cuales se seleccionó la cepa YGLY15660. La cepa YGLY15660 fue transformada con el plásmido pGLY6301 (que codifica para la proteína STT3D de Leishmania major), para producir muchas cepas de las cuales se seleccionó la cepa YGLY16349.

La figura 29 muestra que la proteína LmSTT3D mejoró también la ocupación de los N-glucanos de la glucoproteína no anticuerpo, el GM-CSF. El GM-CSF contiene 2 sitios N-enlazados, y en Pichia de tipo silvestre, un sitio N-enlazado en el GM-CSF es predominantemente glucosilado. Para investigar el impacto de LmSTT3D sobre la ocupación de los N-glucanos del GM-CSF, la LmSTT3D inducible con metanol fue sobreexpresada en la cepa que produce el GM-CSF, yGLY15560. Se evaluó la ocupación de los N-glucanos usando el biorreactor Micro24 (M24). Los sobrenadantes libres de células de M24 se analizaron para la ocupación de los N-glucanos usando Western blot y SDS-PAGE a 15%. Como se muestra en el Western blot detectado con anticuerpos específicos del GM-CSF, la mayor parte del GM-CSF (campos 2 a 8) es glucosilada con sitios 2N-enlazados, en contraste con la cepa control (yGLY 5560, campo 9), en donde el GM-CSF es predominantemente N-glucosilado con un sitio junto con las porciones menores de 2 sitios N y no glucosilados. Considerados en conjunto, esto indica que la LmSTT3D puede mejorar la ocupación de los N-glucanos de las glucoproteínas que poseen sitios N-enlazados múltiples.

Las figuras 30A y 30B muestran el análisis Q-TOP del GM-CSF expresado de yGLY15560 (A) e yGLY16349 (B), respectivamente. Este análisis confirma que la mayor parte del GM-CSF es glucosilado con sitios 2N-enlazados en presencia de LmSTT3D, como se muestra en la figura 29. No se detectó GM-CSF no glucosilado.

LC-ESI-TOF El sistema de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (CLAR) usado en este estudio consistió de un Agilent 1200 equipado con un autoinyector, un compartimiento calefactor de la columna y un detector UV detectando a 210 y 280 nm. Todos los experimentos de LC-MS realizados con este sistema se emprendieron a 1 mL/min. La magnitud de flujo no se dividió para la detección de la MS. Se llevó a cabo el análisis espectrométrico de masa en el modo de ión positivo en Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 6520 (tecnología de Agilent). La temperatura de la fuente de ESI doble se ajustó a 350°C. Las magnitudes de flujo de nitrógeno gaseoso se ajustaron a 13 l/h para el cono y 350 l/h, y el nebulizador se ajustó a 3.1635 kg/cm2 con 4500 voltios aplicados al capilar. Se preparó la masa de referencia de 922.009 a partir de HP-0921 , de acuerdo con el kit de solución de la masa de referencia API-TOF para la calibración de la masa y las mediciones de la masa de proteínas. Los datos para la escala del espectro de iones de 300-3000 m/z se adquirieron y se procesaron usando un Masshunter de Agilent.

Preparación de la muestra Se preparó una muestra de anticuerpos intactos (50 pg) de 50 µ? con NH4HC0325 mM, pH 7.8. Para el anticuerpo desglucosilado, una alícuota de 50 µ? de la muestra de anticuerpos intactos se trató con PNGasa F (10 unidades) por 18 horas a 37°C. Se preparó el anticuerpo reducido añadiendo DTT 1 a una concentración final de 10 mM, a una alícuota del anticuerpo intacto o el anticuerpo desglucosilado, y se incubó por 30 minutos a 37°C.

Tres microgramos de la muestra de anticuerpo intacto o desglucosilado se cargaron sobre una columna Poroshell 300SB-C3 (2.1 mm x 75 mm, 5 µ?t?) (Agilent Technologies) mantenida a 70°C. La proteína se enjuagó primero en el cartucho por 1 minuto con solvente A a 90% (HCOOH a 0.1 %), solvente B a 5% (acetonitrilo a 90% en HCOOH a 0.1 %). Se realizó entonces la elución usando un gradiente de 5 a 100% de B durante 26 minutos, seguida de una regeneración por 3 minutos a 100% de B y mediante un período de equilibrio final de 10 minutos a 5% de B.

Para el anticuerpo reducido, una muestra de tres microgramos se cargó sobre una columna Poroshell 300SB-C3 (2.1 mm x 75 mm, 5 µ??) (Agilent Technologies) mantenida a 40 C. La proteína se enjuagó primero en el cartucho por 3 minutos con solvente A a 90% y solvente B a 5%. Se realizó entonces la elución usando un gradiente de 5 a 80% de B durante 20 minutos, seguida de una regeneración por 7 minutos a 80% de B y mediante un período de equilibrio final de 10 minutos a 5% de B.

Secuencias Las secuencias que se usaron para producir algunas de las cepas descritas en los ejemplos 1 a 4, se proveen en el cuad CUADRO 12 Breve descripción de las secuencias AGCTTTGGCTGCTGCTGGAATGCCAATGTCCTTGAACAATG TTTGTGTTTTGATGCCAGCTTGGTTTGGTGCTATCGCTACTG CTACTTTGGCTTTCTGTACTTACGAGGCTTCTGGTTCTACTG TTGCTGCTGCTGCAGCTGCTTTGTCCTTCTCCATTATCCCT GCTCACTTGATGAGATCCATGGCTGGTGAGTTCGACAACGA GTGTATTGCTGTTGCTGCTATGTTGTTGACTTTCTACTGTTG GGTTCGTTCCTTGAGAACTAGATCCTCCTGGCCAATCGGTG TTTTGACAGGTGTTGCTTACGGTTACATGGCTGCTGCTTGG GGAGGTTACATCTTCGTTTTGAACATGGTTGCTATGCACGC TGGTATCTCTTCTATGGTTGACTGGGCTAGAAACACTTACA ACCCATCCTTGTTGAGAGCTTACACTTTGTTCTACGTTGTTG GTACTGCTATCGCTGTTTGTGTTCCACCAGTTGGAATGTCT CCATTCAAGTCCTTGGAGCAGTTGGGAGCTTTGTTGGTTTT GGTTTTCTTGTGTGGATTGCAAGTTTGTGAGGTTTTGAGAG CTAGAGCTGGTGTTGAAGTTAGATCCAGAGCTAATTTCAAG ATCAGAGTTAGAGTTTTCTCCGTTATGGCTGGTGTTGCTGC TTTGGCTATCTCTGTTTTGGCTCCAACTGGTTACTTTGGTCC ATTGTCTGTTAGAGTTAGAGCTTTGTTTGTTGAGCACACTAG AACTGGTAACCCATTGGTTGACTCCGTTGCTGAACATCAAC 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Quienes tengan aptitud ordinaria en la técnica y acceso a las enseñanzas de la presente, reconocerán modificaciones y modalidades adicionales dentro del alcance de la misma. Por lo tanto, la presente invención es limitada sólo por las reivindicaciones anexas en la presente.

Glosario: ScSUC2 Invertasa de S. cerevisiae OCH1 Alfa-1 ,6-manosiltransferasa K1 MNN2-2: Transportador de UDP-GIcNAc de K. lactis BMT1 : Transferencia de beta-manosa (eliminación de beta-manosa) BMT2: Transferencia de beta-manosa (eliminación de beta-manosa) BMT3: Transferencia de beta-manosa (eliminación de beta-manosa) BMT4: Transferencia de beta-manosa (eliminación de beta-manosa) MNN4L1: NN4 tipo 1 (eliminación de la carga) MmSLC35A3 Homólogo del transportador de UDP-GIcNAc de ratón PN01 : Fosfomanosilación de N-glucanos (eliminación de la carga) NN4: Manosiltransferasa (eliminación de la carga) ScGAL.10 UDP-glucosa 4-epimerasa XB33 HsGalTI truncada fusionada con el péptido guía ScKRE2 DmUGT Transportador de UDP-galactosa KD53 DmMNSII truncado fusionado con el péptido guía ScMNN2 TC54 RnGNTII truncado fusionado con el péptido guía ScMNN2 NA10 HsGNTI truncado fusionado con el péptido guía PpSEC12 FB8: Mm NSIA truncado fusionado con el péptido guía ScSEC12 TrMDSI : MNS1 secretada de T. reesei Sh ble: Marcador de resistencia a zeocina ScSUC2 Invertasa de S. cerevisiae OCH1 Alfa-1 ,6-manosiltransferasa K1 MNN2-2: Transportador de UDP-GlcNAc de K. lactis BMT1 : Transferencia de beta-manosa (eliminación de beta-manosa) BMT2: Transferencia de beta-manosa (eliminación de beta-manosa) BMT3. Transferencia de beta-manosa (eliminación de beta-manosa) BMT4: Transferencia de beta-manosa (eliminación de beta-manosa) MNN4L1 : MNN4 tipo 1 (eliminación de la carga) MmSLC35A3 Homólogo del transportador de UDP-GlcNAc de ratón PN01 : Fosfomanosilación de oligosacáridos N-enlazados (eliminación de la carga) MNN4: Manosiltransferasa (eliminación de la carga) ScGAU O UDP-glucosa 4-epimerasa XB33 HsGalTI truncada fusionada con el péptido guia Sc RE2 DmUGT Transportador de UDP-galactosa KD53 DmMNSII truncado fusionado con el péptido guía ScMNN2 TC54 RnGNTII truncado fusionado con el péptido guía ScMNN2 NA10 HsGNTI truncado fusionado con el péptido guía PpSEC12 FB8: MmMNSIA truncado fusionado con el péptido guía ScSEC12 MmCST Transportador de CMP-ácido siálico de ratón HsGNE UDP-GlcNAc 2-epimerasa/N-acetilmanosamina cinasa de humano HsCSS CMP-ácido siálico sintasa de humano HsSPS N-acetilneuraminato-9-fosfato sintasa de humano MmST6-33 Alfa-2,6-sialiltransferasa truncada de ratón fusionada con el péptido guía ScKRE2 TrMDSI : MNS1 secretada de T. reesei STE13 Dipeptidil aminopeptidasa del aparato de Golgi DAP2 Dipeptidil aminopeptidasa vacuolar NatR Marcador de resistencia a nourseotricina HygR Marcador de resistencia a higromicina

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para producir una glucoproteina heteróloga, que comprende: (a) proveer una célula hospedera que incluye por lo menos una molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteina heteróloga, y en donde los genes endógenos de la célula hospedera que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de OTasa endógeno, son expresados; y (b) cultivar la célula hospedera bajo condiciones para que exprese la glucoproteina heteróloga para producir la glucoproteina heteróloga.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3A, proteína STT3B, proteína STT3C, proteína STT3D o combinaciones de las mismas, de Leishmania sp.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3D de Leishmania major.

4 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque por lo menos 70% de las glucoproteínas heterólogas producidas por la célula hospedera, tienen sitios de N- glucosilación completamente ocupados.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la célula hospedera es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que comprenden uno o más N-glucanos tipo humano o de mamífero.

6 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la proteína heteróloga es eritropoyetina (EPO); citocínas tales como interferón a, ¡nterferón ß, interferón ? e interferón ?; y factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF); factor estimulador de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF); factores de coagulación tales como el factor VIII, el factor IX y la proteína C humana; antítrombina III; trombina; cadena a del receptor de IgE soluble; inmunoglobulinas tales como IgG, fragmentos de IgG, fusiones de IgG, e IgM; inmunoadhesinas y otras proteínas de fusión de Fe tales como las proteínas de fusión de Fc-receptor del FNT soluble; proteínas de fusión de Fc-RAGE; interleucinas; urocinasa; quimasa; inhibidor de urea tripsina; proteína de unión al IGF; factor de crecimiento epidérmico; factor liberador de hormona de crecimiento; proteína de fusión de anexina V; angiostatina; factor 2 de crecimiento endotelial vascular; factor 1 inhibidor del progenitor mieloide; osteoprotegerina; a-1-antitripsina; a-feto proteínas; desoxirribonucleasa II; kringle 3 del plasminógeno humano; glucocerebrosidasa; proteína 1 de unión al FNT; hormona foliculoestimulante; antígeno 4 asociado con linfocitos T citotóxicos- lg; activador de transmembrana y modulador de calcio y ligando de ciclofilina; proteína 1 tipo glucagon; o agonista del receptor de IL-2.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la proteína heteróloga es un anticuerpo anti-Her2, anticuerpo anti-RSV (virus sincicial respiratorio), anticuerpo anti-FNTa, anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo del receptor anti-CD3, anticuerpo 7E3 anti-CD41 , anticuerpo anti-CD25, anticuerpo anti-CD52, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-lgE, anticuerpo anti-CD1 1a, anticuerpo del receptor anti-EGF o anticuerpo anti-CD20.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la célula hospedera se selecciona del grupo que consiste de Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polyrnorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora crassa, y células de planta, células de insecto y células de mamífero.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la célula hospedera es un mutante och1 de P. pastoris.

10. - Un método para producir una composición de glucoproteína en la cual por lo menos 70% de los sitios de N-glucosilación en las glucoproteínas en la composición son ocupados con un N-glucano, que comprende: (a) proveer una célula hospedera recombinante que incluye por lo menos una molécula de ácido nucleico que codifica para una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heterologa y una molécula de ácido nucleico que codifica para la glucoproteína, y en donde los genes de la célula hospedera que codifican para el complejo de OTasa endógeno, son expresados; y (b) cultivar la célula hospedera recombinante bajo condiciones para que exprese la glucoproteína para producir las composiciones en las cuales por lo menos 70% de los sitios de N-glucosilación en las glucoproteínas en la composición son ocupados con el N-glucano.

11. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3A, proteína STT3B, proteína STT3C, proteína STT3D o combinaciones de las mismas, de Leishmania sp.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3D de Leishmania major.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la proteína heterologa es eritropoyetina (EPO); citocinas tales como interferón a, interferón ß, interferón ? e interferón ?; y factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF); factor estimulador de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF); factores de coagulación tales como el factor VIII, el factor IX y la proteína C humana; antitrombina III; trombina; cadena a del receptor de IgE soluble; inmunoglobulinas tales como IgG, fragmentos de IgG, fusiones de IgG, e IgM; inmunoadhesinas y otras proteínas de fusión de Fe tales como las proteínas de fusión de Fc-receptor del FNT soluble; proteínas de fusión de Fc-RAGE; interleucinas; urocinasa; quimasa; inhibidor de urea tripsina; proteína de unión al IGF; factor de crecimiento epidérmico; factor liberador de hormona de crecimiento; proteína de fusión de anexina V; angiostatina; factor 2 de crecimiento endotelial vascular; factor 1 inhibidor del progenitor míeloide; osteoprotegerina; a-1-antitripsina; a-feto proteínas; desoxirribonucleasa II; kríngle 3 del plasminógeno humano; glucocerebrosidasa; proteína 1 de unión al FNT; hormona foliculoestimulante; antígeno 4 asociado con linfocitos T citotóxícos-Ig; activador de transmembrana y modulador de calcio y ligando de cíclofilina; proteína 1 tipo glucagon; o agonista del receptor de IL-2.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la proteína heteróloga es un anticuerpo anti-Her2, anticuerpo anti-RSV (virus sincicial respiratorio), anticuerpo anti-FNTa, anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo del receptor anti-CD3, anticuerpo 7E3 anti-CD41 , anticuerpo anti-CD25, anticuerpo anti-CD52, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-lgE, anticuerpo anti-CD1 a, anticuerpo del receptor anti-EGF o anticuerpo anti-CD20.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la célula hospedera recombinante es una célula hospedera de hongo filamentoso o levadura.

16. - Una célula hospedera, que comprende: (a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica para por lo menos una oligosacariltransferasa de una sola subunidad heteróloga; y (b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica para una glucoproteína heteróloga; y la célula hospedera expresa los genes que codifican para las proteínas que comprenden el complejo de oligosacariltransferasa (OTasa) endógeno.

17. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3A, proteína STT3B, proteína STT3C o proteína STT3D, de Leishmania sp.

18. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la oligosacariltransferasa de una sola subunidad es la proteína STT3D de Leishmania major.

19. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la célula hospedera es genéticamente diseñada para producir glucoproteínas que comprenden uno o más N-glucanos tipo humano o de mamífero.

20. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la glucoproteína heteróloga es eritropoyetina (EPO); citocinas tales como interferón a, interferón ß, interferón ? e interferón ?; y factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF); factor estimulador de colonias de macrofagos granulocitos (GM-CSF); factores de coagulación tales como el factor VIII, el factor IX y la proteína C humana; antitrombina III; trombina; cadena a del receptor de IgE soluble; inmunoglobulinas tales como IgG, fragmentos de IgG, fusiones de IgG, e IgM; inmunoadhesinas y otras proteínas de fusión de Fe tales como las proteínas de fusión de Fc-receptor del FNT soluble; proteínas de fusión de Fc-RAGE; interleucinas; urocinasa; quimasa; inhibidor de urea tripsina; proteína de unión al IGF; factor de crecimiento epidérmico; factor liberador de hormona de crecimiento; proteína de fusión de anexina V; angiostatina; factor 2 de crecimiento endotelial vascular; factor 1 inhibidor del progenitor mieloide; osteoprotegerina; a-1 -antitripsina; a-feto proteínas; desoxirribonucleasa II; kringle 3 del plasminógeno humano; glucocerebrosidasa; proteína 1 de unión al FNT; hormona foliculoestimulante; antígeno 4 asociado con linfocitos T citotóxicos-lg; activador de transmembrana y modulador de calcio y ligando de ciclofilina; proteína 1 tipo glucagon; o agonista del receptor de IL-2.

21.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la glucoproteína heteróloga es un anticuerpo anti-Her2, anticuerpo anti-RSV (virus sincicial respiratorio), anticuerpo anti-FNTa, anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo del receptor anti-CD3, anticuerpo 7E3 anti-CD41 , anticuerpo anti-CD25, anticuerpo anti-CD52, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-lgE, anticuerpo anti-CD1 1a, anticuerpo del receptor anti-EGF o anticuerpo anti-CD20.

22. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la célula hospedera se selecciona del grupo que consiste de Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polyrnorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora crassa, y células de planta, células de insecto y células de mamífero.

23. - Una composición de glucoproteína que comprende: una pluralidad de anticuerpos en donde por lo menos 70% de las moléculas de anticuerpo en la composición tienen ambos sitios de N-glucosilación ocupados, y aproximadamente 50 a 70% en moles de los N-glucanos son G0, 15 a 25% en moles de los N-glucanos son G1 , y aproximadamente 5 a 15% en moles de los N-glucanos comprenden una estructura central de Man5GlcNAc2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

24.- La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque los anticuerpos comprenden un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de anticuerpo anti-Her2, anticuerpo anti-RSV (virus sincicial respiratorio), anticuerpo anti-FNTa, anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo del receptor anti-CD3, anticuerpo 7E3 anti-CD41 , anticuerpo anti-CD25, anticuerpo anti-CD52, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-lgE, anticuerpo anti-CD1 1a, anticuerpo del receptor anti-EGF y anticuerpo anti-CD20.

25. - Una célula hospedera de Pichia pastoris recombinante que tiene un genotipo que es el mismo que el genotipo de la cepa YGLY14401 de Pichia pastoris recombinante.

26. - El uso de la Pichia pastoris recombinante para producir una composición de anticuerpo que comprende anticuerpos anti-RSV que tienen el patrón de N- y O-glucosilación: Man5, aproximadamente 9.5%; GO, aproximadamente 59.9%; GOF, 0%; G1 , aproximadamente 20%; G1 F, 0%; G2, aproximadamente 2.8%; G2F, 0%; A2, 0%; híbrido, aproximadamente 7.8%; ocupación de O-glucanos (mol/mol), aproximadamente 3.0%; mañosa (un sólo residuo de mañosa), aproximadamente 96%; manobiosa (dos residuos de mañosa), aproximadamente 4%; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.