ES2515170T3 - Gen de fusión EML4-ALK - Google Patents

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ES2515170T3 ES09006058.3T ES09006058T ES2515170T3 ES 2515170 T3 ES2515170 T3 ES 2515170T3 ES 09006058 T ES09006058 T ES 09006058T ES 2515170 T3 ES2515170 T3 ES 2515170T3
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Sadao Kuromitsu
Nobuaki Shindo
Takatoshi Soga
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Abstract

Polipéptido seleccionado del grupo que consiste en (1) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa, (2) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 con la deleción, sustitución y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa, (3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa, y (4) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130.

Description

Gen de fusión EML4-ALK
5 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Campo de la invención
[0001] La presente invención se refiere a un polipéptido como proteína de fusión novedosa, a un polinucleótido
10 que codifica el polipéptido, a un vector que comprende el polinucleótido, a una célula transformada que comprende el vector, a un procedimiento para detectar la proteína de fusión o polinucleótido, a un procedimiento para cribar un agente terapéutico para el cáncer y a un agente terapéutico para el cáncer.
Técnica anterior
15 [0002] Hasta ahora se conocen varios genes relacionados con el cáncer. En particular, se ha mostrado que los genes de tirosina cinasa, que codifican importantes enzimas que regulan directamente el crecimiento celular, se activan incluso por sustitución o deleción en secuencias de aminoácidos y así provocan carcinogénesis.
20 [0003] Por ejemplo, NPM-ALK, los genes de fusión que codifican NPM fusionada con la tirosina cinasa ALK, se observan en más de la mitad de los casos de linfoma anaplásico de células grandes (LACG) y se ha mostrado que la activación de la cinasa ALK es importante para el crecimiento de células tumorales por NPM-ALK (documentos de no patente 25 y 14).
25 [0004] Se ha informado la presencia de un nuevo tipo de cinasa anormal que se encuentra en aproximadamente el 10% de los casos de cáncer de pulmón y, sin embargo, este informe no ha hecho referencia a moléculas específicas (documento que no es patente 2).
[0005] En 2000 se informó EML4 (proteína 4 similar a proteína asociada a microtúbulos de equinodermo)
30 (documento que no es patente 3). La proteína EML4 tiene una región básica en el extremo amino, y adicionalmente tiene dominios WD en el extremo carboxilo (documento que no es patente 8). Se conocen poco las funciones fisiológicas de EML4.
[0006] Por otra parte, la ALK (cinasa de linfoma anaplásico) (documento que no es patente 4) es tirosina cinasa 35 receptora (documento que no es patente 5).
[0007] La expresión de ALK de longitud completa se ha informado hasta ahora en algunas células cancerosas de origen ectodérmico tales como neuroblastoma, glioblastoma, cáncer de mama y melanoma (no se ha observado la expresión de ALK de longitud completa en células cancerosas de orígenes endodérmicos y mesodérmicos) (documento 40 que no es patente 13). La ALK de longitud completa se expresa en muchas líneas celulares de neuroblastoma. Sin embargo, la autofosforilación de ALK no se observa en estas líneas celulares de neuroblastoma. Además, a partir del análisis de cohorte de pacientes con neuroblastoma se ha informado que la expresión de ALK está débilmente asociada al cáncer. Se ha sugerido que la expresión de ALK en neuroblastoma puede reflejar su expresión en diferenciación neural normal, en vez de su asociación a cáncer (documento que no es patente 10). Por otra parte, en casos
45 informados, ligandos tales como pleiotrofina y midcina, además de la amplificación génica de la propia ALK, aumentan la autofosforilación de ALK y movilizan señales intracelulares. También se ha informado que la ALK puede contribuir al crecimiento de células cancerosas (documento que no es patente 12).
[0008] En algunos casos de linfoma maligno humano y tumor miofibroblástico inflamatorio se ha informado que el 50 gen ALK está fusionado a otros genes (NPM, CLTCL, TFG, CARS, SEC31L1, etc.) como resultado de translocalización
o inversión cromosómica y así forma un tipo de fusión de tirosina cinasa (documentos de no patente 9, 11, 14 a 19 y 26 a 28). Además, se ha informado un procedimiento para identificar una proteína como componente de fusión para ALK usando anticuerpos de ALK (documento que no es patente 6). Por otra parte, no se ha informado de un gen de fusión de EML4 y ALK. Debido a que la mayoría de las moléculas tienen un dominio de formación de complejos, no se ha 55 pensado que la propia proteína de fusión forme un complejo. Se ha considerado que esta formación de complejos produce la pérdida de control de la actividad de tirosina cinasa de ALK e induce carcinogénesis con señales intracelulares anormalmente activadas (documento que no es patente 10). De hecho, se ha informado que el uso de ARNhc de ALK o compuesto inhibidor de cinasa ALK para células de linfoma que expresan proteínas de fusión de ALK puede inducir inhibición del crecimiento celular y muerte celular. Por tanto, se ha sugerido que la proteína de fusión ALK
60 puede servir de diana terapéutica para linfoma y tumor miofibroblástico inflamatorio (documentos de no patente 20 a 22). También se ha sugerido que la ALK puede servir de diana terapéutica para otros cánceres cuyo crecimiento implica ALK como se describe anteriormente (documentos de no patente 21 a 22).
[0009] Marzec y col. han informado que WHI-P131 y WHI-P154 (ambos, EMD Biosciences), que se han utilizado
como sustancias inhibidoras de tirosina cinasa JAK3, inhiben la actividad de
[0010] NPM-ALK (documento que no es patente 22). Otro grupo ha informado que el inhibidor de ALK de bajo peso molecular induce la muerte celular de líneas celulares de linfoma que expresan NPM-ALK (documento que no es 5 patente 21). Además, hasta ahora se han notificado varios compuestos de bajo peso molecular que tienen una actividad
inhibitoria contra ALK (documentos de no patente 23 y 24 y documentos de patente 1 a 3). [Documento de patente 1] Panfleto de documento WO 2004/080980 [Documento de patente 2] Panfleto de documento WO 2005/009389 [Documento de patente 3] Panfleto de documento WO 2005/016894
10 [Documento que no es patente 1] “The New England journal of medicine”, (EE.UU.), 2005, vol. 353, pág. 172-187 [Documento que no es patente 2] Proceedings of the 65th Annual Meeting of the Japanese Cancer Association, O324 (concedida el 28 de agosto de 2006) [Documento que no es patente 3] número de registro de GenBank: NM_019063 [Documento que no es patente 4] número de registro de GenBank: AB209477
15 [Documento que no es patente 5] Oncogene. 30 de enero de 1997; 14 (4): 439-49 [Documento que no es patente 6] PNAS 2006 103, 7402-7407 [Documento que no es patente 7] “Seminars in oncology”, (EE.UU.), 1993, vol. 20, pág. 105-127 [Documento que no es patente 8] “Genomics”, (EE.UU.), 2000, vol. 68, pág. 348-350 [Documento que no es patente 9] Oncogene 9: 1567-1574, 1994
20 [Documento que no es patente 10] “Cellular and molecular life sciences”, (Suiza), 2004, vol. 61, pág. 2939-2953 [Documento que no es patente 11] Am J Patol 160: 1487-1494, 2002 [Documento que no es patente 12] “Journal of cellular physiology”, (EE.UU.), 2004, vol. 199, pág. 330-358 [Documento que no es patente 13] “International journal of cancer”, (EE.UU.), 2002, vol. 100, pág. 49-56 [Documento que no es patente 14] “Science”, (EE.UU.), 1994, vol. 263, pág. 1281-1284
25 [Documento que no es patente 15] “Blood”, (EE.UU.), 1995, vol. 86, pág. 1954-1960 [Documento que no es patente 16] “Blood”, (EE.UU.), 2000, vol. 95, pág. 3204-3207 [Documento que no es patente 17] “Blood”, (EE.UU.), 1999, vol. 94, pág. 3265-3268 [Documento que no es patente 18] “Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology”, (EE.UU.), 2003, vol. 83, pág. 1255-1265
30 [Documento que no es patente 19] “International journal of cancer”, (EE.UU.), 2006, vol. 118, pág. 1181-1186 [Documento que no es patente 20] “Blood”, (EE.UU.), 2006, vol. 107, pág. 689-697 [Documento que no es patente 21] “Blood”, (EE.UU.), 2006, vol. 107, pág. 1617-1623 [Documento que no es patente 22] “Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology”, (EE.UU.), 2005, vol. 85, pág. 1544-1554
35 [Documento que no es patente 23] “Journal of medicinal chemistry”, (EE.UU.), 2006, vol. 49, pág. 1006-1015 [Documento que no es patente 24] J Comb Chem. 8: 401-409, 2006 [Documento que no es patente 25] “Science”, (EE.UU.), 1997, vol. 278, pág. 1309-1312 [Documento que no es patente 26] Am J Patol 157: 377-384, 2000 [Documento que no es patente 27] Blood 90: 2901-2910, 1997
40 [Documento que no es patente 28] Am J Patol. 2000 Mar; 156 (3): 781-9
CARACTERÍSTICAS RESUMIDAS DE LA INVENCIÓN
[0011] Los presentes inventores aislaron satisfactoriamente, a partir de muestras obtenidas de pacientes con
45 cáncer de pulmón, el ADNc y el ADN genómico de un novedoso polinucleótido de fusión de un gen EML4 parcial fusionado con un gen ALK parcial como cinasa (denominado en lo sucesivo un polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1), que se produce por inversión cromosómica (Ejemplos 1, 2, y 4(1)). Los presentes inventores también aislaron satisfactoriamente el ADNc y el ADN genómico de un novedoso polinucleótido de fusión (denominado en lo sucesivo un polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2, polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3) cuyas regiones fusionadas son
50 diferentes de las del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 (Ejemplos 4(1), 3(3), 11(1) y (7)). El análisis usando muestras clínicas mostró que el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 o el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3 está presente en algunos pacientes con cáncer de pulmón (Ejemplo 3 y 11(1)). Por otra parte, debido a que el polinucleótido de fusión de EML4-ALK es un oncogén que presenta tumorigenicidad dependiendo de su actividad de cinasa (Ejemplo 6,10(3) y 11(2)), se reveló que el polipéptido de fusión
55 de EML4-ALK es una herramienta para cribar un agente terapéutico para cáncer que se muestra que es positivo para el polinucleótido de fusión. Basándose en estos hallazgos, los presentes inventores construyeron un procedimiento para detectar el polinucleótido de fusión o proteína de fusión en una muestra obtenida de un sujeto de prueba (Ejemplos 3, 4(2), 5(2), 9, y 11(3)) y, posteriormente, un procedimiento para cribar un inhibidor del polinucleótido de fusión y/o el polipéptido de fusión (es decir, un agente terapéutico para cáncer que se muestra que es positivo para el polinucleótido
60 de fusión) causante del cáncer (Ejemplos 7, 10(2), 11(4), 11(5) y 11(8)), y se confirmó que los compuestos obtenidos mediante cribado presentan un efecto antitumoral (Ejemplos 8(3), 8(7), 8(8),11(6) y 11(9)). Como resultado, un sujeto de prueba en el que se ha detectado el polinucleótido de fusión puede recibir tratamiento contra el cáncer usando el inhibidor del polinucleótido de fusión y/o el polipéptido codificado por el mismo. Según el procedimiento de detección pueden seleccionarse los sujetos a los que puede administrarse el agente terapéutico. Como resultado, el cuidado
médico hecho a medida esperado puede llevarse a cabo como tratamiento altamente eficaz usando el inhibidor.
[0012] Basándose en estos hallazgos, los presentes inventores proporcionan un polinucleótido y polipéptido novedosos útiles como herramientas de cribado, y una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que se
5 muestra que es positivo para el gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK. Los presentes inventores describen adicionalmente un procedimiento de cribado y un procedimiento de detección útil en la detección del cáncer que se muestra que es positivo para el gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK.
[0013] Específicamente, la presente invención proporciona polipéptidos, polinucleótidos codificantes, vectores de 10 expresión, células transformadas y procedimientos de producción, todos tal como se definen en las reivindicaciones.
[0014] La presente invención también proporciona medios, tal como se define en las reivindicaciones, para el tratamiento del cáncer de pulmón que se muestra positivo para un gen de fusión del gen de proteína 4 similar a la proteína asociada a microtúbulos de equinodermo (EML4) y el gen de cinasa de linfoma anaplásico (ALK).
15 [0015] Ninguno de los documentos anteriormente mencionados ha informado de la formación de un gen de fusión mediante el gen EML4 y el gen ALK, y mucho menos la expresión del gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK en algunos pacientes con cáncer. La formación de un gen de fusión mediante el gen EML4 y el gen ALK y la expresión de este gen de fusión en algunos pacientes con cáncer fue encontrada por primera vez por los presentes inventores. El
20 procedimiento de cribado usando un gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK es una invención que se hizo por primera vez por los presentes inventores. Además, el procedimiento para detectar el gen de fusión útil en la detección de cáncer que se muestra que es positivo para el gen de fusión, el conjunto de cebadores útiles en esta detección y el kit para la detección son invenciones que se proporcionaron por primera vez por los hallazgos de los presentes inventores. Se ha informado de diversos inhibidores de ALK (documentos de patente 3 a 4 y documentos de no patente 20 a 22 y 34) que
25 incluyen 5-cloro-N4-[2-(isopropilsulfonil)fenil]-N2-{2-metoxi-4-[4-(4-metilpiperazin-1-il)piperidin-1-il]fenil}pirimidina-2,4diamina y 2-[(5-bromo-2-{[2-metoxi-4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil]amino)pirimidin-4-il)amino]-N-metilbencenosulfonamida. Además, se ha informado que los inhibidores de ALK inducen inhibición del crecimiento y muerte celular en células de linfoma que expresan proteínas de fusión de NPM-ALK (documentos de no patente 20 a 22) e inhiben linfoma (PNAS, 2 de enero de 2007, 104 (1), 270-275 Epub2006 Dec). Sin embargo, se desconoce totalmente que estos inhibidores de
30 ALK tengan aplicaciones terapéuticas para el cáncer (particularmente, cáncer de pulmón) que se muestra que es positivo para un gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK. La composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer (particularmente, cáncer de pulmón) que se muestra que es positivo para un gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK es una invención que se proporcionó por primera vez por los hallazgos de los presentes inventores.
35 [0016] El polipéptido, polinucleótido, vector de expresión y célula de la presente invención pueden usarse en el cribado de una sustancia que inhibe el polipéptido de la presente invención (particularmente, un agente terapéutico para cáncer de pulmón que se muestra que es positivo para un gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK). Los sujetos para los que un gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK es positivo (particularmente, pacientes con cáncer de pulmón) pueden detectarse usando la presencia del polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención como índice. Según el
40 procedimiento de cribado de la presente divulgación, puede cribarse un agente terapéutico para cáncer (particularmente, un agente terapéutico para cáncer de pulmón) que se muestra que es positivo para un gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK. El cebador y el kit para la detección de la presente divulgación pueden utilizarse para detectar un cáncer que se muestra que es positivo para un gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK. El procedimiento de detección de la presente divulgación puede utilizarse como un procedimiento para detectar cáncer (particularmente,
45 cáncer de pulmón) que se muestra que es positivo para el gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK de la presente invención. Además, según el procedimiento de detección de la presente divulgación, puede determinarse si el agente terapéutico de la presente invención puede o no administrarse a sujetos. La sustancia que inhibe el polipéptido de la presente invención es útil como agente terapéutico para el cáncer, particularmente cáncer de pulmón, que se muestra que es positivo para un gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK.
50
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0017]
FIG. 1. Muestra los resultados de PCR. El carril izquierdo (46, XX) muestra el resultado cuando se usó el ADN genómico
55 de un sujeto sano normal como sustrato, y el carril derecho (ID #33) muestra el resultado cuando se usó el ADN genómico de un paciente con cáncer como sustrato; FIG. 2. Muestra los resultados del cribado para el polinucleótido de fusión de EML4-ALK en especímenes de pacientes con cáncer de pulmón. El carril “46, XX” muestra el resultado de usar monocitos periféricos de un sujeto hembra sano normal, y “ID #2” a “ID #42” muestran el resultado de usar muestras obtenidas de especímenes extirpados de pacientes
60 con cáncer de pulmón. Además, el carril “NTC” muestra el resultado sin ADNc de sustrato añadido. El carril “marcador” es el carril en el que se sometió a electroforesis el ADN marcador de tamaño (sección superior). Los resultados de la amplificación de ADNc de GAPDH se muestran en la sección inferior. El sexo (M, masculino; F, femenino), la patología (S, carcinoma de células escamosas; A, adenocarcinoma; AS, carcinoma adenoescamoso; B, carcinoma bronquioloalveolar) y la presencia o ausencia de mutación de EGFR y la presencia o ausencia de historial de fumador
se muestran en la parte superior de la figura; FIG. 3. Muestra la tumorigenicidad de los genes. La sección superior de la figura (3T3) muestra células de fibroblastos 3T3 cuando se introdujeron un vector blanco (Vector) y plásmido de expresión tal como ALK/pMXS de longitud completa (ALK), EML4-ALKv1/pMXS (EML4-ALK) o EML4-ALK (K589M)/pMXS. La barra de escala representa 100 µm. La
5 sección inferior de la figura (ratones desnudos) muestra el resultado de la inoculación de cada línea de células de fibroblastos 3T3 a ratones desnudos; FIG. 4. Muestra el efecto inhibitorio de un inhibidor del polipéptido de fusión de EML4-ALK (compuesto A) sobre la autofosforilación intracelular. “KM” indica cuándo se usaron las células que expresan EML4-ALK (K589M) y “EA” muestra cuándo se usaron las células BA/F3 que expresan v1. “αp-ALK” (panel superior) muestra el resultado de la
10 inmunotransferencia cuando se usó anticuerpo anti-ALK fosforilada y “αFLAG” (panel inferior) muestra el resultado de la inmunotransferencia cuando se usó anticuerpo anti-FLAG; FIG. 5. Muestra el potencial de crecimiento de células que expresan proteína CD8 sola (CD8) o coexpresan CD8 y ALK (ALK), CD8 y polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 (EA) o CD8 y EML4-ALK (K589M) (KM) en presencia (+IL-3) o ausencia (-IL-3) de IL-3. El eje horizontal de la figura es el transcurso de tiempo (días) y el eje vertical es el número de
15 células; FIG. 6(a). Muestra el cambio dependiente del tiempo del número de células cuando se añadieron concentraciones respectivas del compuesto A a células BA/F3 que sólo expresan CD8 y se cultivaron en presencia de IL-3. (b) Muestra el cambio dependiente del tiempo del número de células cuando células BA/F3 que expresan v1 se cultivaron con la concentración respectiva del compuesto A en ausencia de IL-3. El eje horizontal de la figura es el transcurso de tiempo
20 (días) y el eje vertical es el número de células; y FIG. 7. Muestra ARNip-1-ARNip-9.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS
25 [0018] En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle. Las técnicas de manipulación de genes descritas en este documento pueden practicarse según técnicas conocidas en la técnica tales como “Molecular Cloning”, Sambrook, J y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, a menos que se especifique lo contrario. Las técnicas de manipulación de proteínas descritas en este documento pueden practicarse según técnicas conocidas en la técnica tales como “Experimental Protocol on Proteins”, Shujunsha Co. Ltd. 1997, a menos que se especifique lo contrario.
30
[0019] La frase “el polipéptido de la presente invención se inhibe” descrita en este documento engloba tanto las frases “la expresión del polipéptido de la presente invención se inhibe” como “la actividad del polipéptido de la presente invención se inhibe”. Una “sustancia que inhibe el polipéptido de la presente invención” engloba tanto una “sustancia que inhibe la expresión del polipéptido de la presente invención” como una “sustancia que inhibe la actividad del
35 polipéptido de la presente invención”.
<Polipéptido, polinucleótido, vector de expresión, célula transformada y procedimientos para producir el polipéptido de la presente invención>
40 [0020] El polipéptido de la presente invención engloba:
(1)
un polipéptido que está constituido por o que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó130;
(2)
(a)
un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 y que tiene una
45 actividad de cinasa, o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 con la sustitución, deleción y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa (denominado en lo sucesivo un polipéptido modificado funcionalmente equivalente a v1);
(b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 7 y que tiene una actividad de cinasa, o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de
50 aminoácidos representada por SEQ ID NO: 7 con la sustitución, deleción y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa (denominado en lo sucesivo un polipéptido modificado funcionalmente equivalente a v2); y (en lo sucesivo, el polipéptido modificado funcionalmente equivalente a v1 y el polipéptido modificado funcionalmente equivalente a v2 se denominan en conjunto como un polipéptido modificado funcionalmente equivalente); y
(3)
55 (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 y que tiene una actividad de cinasa (denominado en lo sucesivo un polipéptido homólogo a v1); y
(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 7 y que tiene una actividad de cinasa (denominado en lo sucesivo un
60 polipéptido homólogo a v2); y (en lo sucesivo el polipéptido homólogo a v1, el polipéptido homólogo a v2 se denominan en conjunto como un polipéptido homólogo).
[0021] El “polipéptido modificado funcionalmente equivalente” es el “polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 con la sustitución, deleción y/o inserción de 1 a 10, preferentemente 1 a varios, más preferentemente 1 a 7, lo más preferentemente 1 a 5 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa”. Más preferentemente, el polipéptido es el “polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa”.
5
[0022] El “polipéptido homólogo” es un “polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa”. Preferentemente, el polipéptido homólogo tiene una secuencia de aminoácidos con el 95% o más, más preferentemente el 98% o más de identidad a ella.
10 [0023] La “identidad” descrita en este documento significa un valor identidad obtenido por el programa de búsqueda NEEDLE (J Mol Biol 1970; 48: 443-453) usando parámetros disponibles por defecto. Los parámetros son del siguiente modo: Penalización por hueco = 10
15 Penalización de extensión = 0,5 Matriz = EDNAFULL
[0024] La frase “que tiene una actividad de cinasa” significa que tiene una actividad como una enzima que fosforila tirosina. Si un cierto polipéptido “tiene una actividad de cinasa” se confirma mediante un procedimiento del
20 Ejemplo 7(2). Más preferentemente, el polipéptido modificado funcionalmente equivalente y el polipéptido homólogo tienen actividad de cinasa y tumorigenicidad combinadas. Si un cierto polipéptido “tiene una tumorigenicidad” se confirma mediante un procedimiento del Ejemplo 6(1).
[0025] Hasta este punto se ha descrito el polipéptido de la presente invención. En lo sucesivo, el polipéptido que
25 está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130, el polipéptido modificado funcionalmente equivalente y el polipéptido homólogo se denominan en conjunto en lo sucesivo un “polipéptido de la presente invención”. De los polipéptidos de la presente invención, el polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, el polipéptido modificado funcionalmente equivalente a v1 y el polipéptido homólogo a v1 se denominan en conjunto en lo sucesivo un “tipo de polipéptido v1 de la presente invención”. El
30 polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 7, el polipéptido modificado funcionalmente equivalente a v2 y el polipéptido homólogo a v2 se denominan en conjunto en lo sucesivo un “tipo de polipéptido v2 de la presente invención”. El polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 130 se denomina como un “tipo de polipéptido v3 de la presente invención”. Una proteína como el polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 se denomina
35 en lo sucesivo un “polipéptido de fusión de EML4-ALK v1”. Una proteína como el polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 7 se denomina en lo sucesivo un “polipéptido de fusión de EML4-ALK v2”. Una proteína como el polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 130 se denomina en lo sucesivo un “polipéptido de fusión de EML4-ALK v3”. El “polipéptido de fusión de EML4-ALK v1”, el “polipéptido de fusión de EML4-ALK v2” y el “polipéptido de fusión de EML4-ALK v3” se denominan
40 en conjunto en lo sucesivo un “polipéptido de fusión de EML4-ALK”.
[0026] El polipéptido de la presente invención es, preferentemente, el “polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa”, más preferentemente el “polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una
45 actividad de cinasa y tumorigenicidad”, lo más preferentemente el “polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130”.
[0027] Un polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente invención (denominado en lo sucesivo un “polinucleótido de la presente invención”) es un polinucleótido representado por una secuencia de nucleótidos que
50 codifica el polipéptido de fusión de EML4-ALK, el polipéptido modificado funcionalmente equivalente o el polipéptido homólogo. El polinucleótido de la presente invención es, preferentemente, un polinucleótido que está constituido por una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130, más preferentemente un polinucleótido que está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1 (particularmente preferentemente, las posiciones 271 a 3447 en SEQ ID NO: 1), 6 ó 129.
55 [0028] De los polinucleótidos de la presente invención, un gen que codifica el tipo de polipéptido v1 de la presente invención se denomina en lo sucesivo un “tipo de polinucleótido v1 de la presente invención”. Un gen que codifica el tipo de polipéptido v2 de la presente invención se denomina en lo sucesivo un “tipo de polinucleótido v2 de la presente invención”. Un gen que codifica el tipo de polipéptido v3 de la presente invención se denomina en lo sucesivo
60 un “tipo de polinucleótido v3 de la presente invención”.
[0029] Un “gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK” descrito en este documento se refiere al polinucleótido de la presente invención. Un gen que codifica el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1, que es un tipo de polinucleótido v1 de la presente invención, se denomina en lo sucesivo un “polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1”. Un gen que
codifica el polipéptido de fusión de EML4-ALK v2, que es un tipo de polinucleótido v2 de la presente invención, se denomina en lo sucesivo un “polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2”. Un gen que codifica el polipéptido de fusión de EML4-ALK v3, que es un tipo de polinucleótido v3 de la presente invención, se denomina en lo sucesivo un “polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3”. El polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, el polinucleótido de fusión de
5 EML4-ALK v2 y el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3 se denominan en conjunto en lo sucesivo un “polinucleótido de fusión de EML4-ALK”.
[0030] La frase “cáncer que se muestra que es positivo para un gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK” descrita en este documento significa cáncer positivo para el polinucleótido de la presente invención (es decir, el
10 polinucleótido de la presente invención está presente) y, preferentemente significa cáncer positivo para el polinucleótido de fusión de EML4-ALK (es decir, cáncer positivo para el polinucleótido de fusión de EML4-ALK) (es decir, el polinucleótido de fusión de EML4-ALK está presente).
[0031] Los procedimientos para producir el polinucleótido de la presente invención incluyen, pero no se limitan
15 particularmente a, (1) un procedimiento que usa la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (2) un procedimiento que usa una aproximación de ingeniería genética estándar (es decir, un procedimiento que comprende seleccionar una cepa transformada que comprende la secuencia de aminoácidos deseada de cepas transformadas con una biblioteca de ADNc) y (3) un procedimiento de síntesis química. Cada procedimiento puede practicarse de la misma forma que en el documento WO 01/34785. Sin embargo, la “proteína novedosa de la presente invención” descrita en este documento
20 puede interpretarse como una proteína que está constituida por el polipéptido de la presente invención descrito en este documento, y el “gen de la presente invención” descrito en este documento puede interpretarse como el polinucleótido de la presente invención descrito en este documento.
[0032] En el procedimiento que usa PCR, el polinucleótido de la presente invención puede producirse, por
25 ejemplo, según procedimientos descritos en 1) Procedimiento de producción del gen de proteína, a) Primer procedimiento de producción en “Realizaciones de la invención” del documento de patente. El ARNm se extrae de células o tejidos que tienen la capacidad de producir la proteína de la presente invención, por ejemplo, de tejidos de pulmón derivados de un paciente humano con cáncer de pulmón. Posteriormente, este ARNm puede someterse a reacción de la transcriptasa inversa en presencia de cebadores al azar u oligo dT cebadores para sintetizar ADNc
30 monocatenario. El ADNc monocatenario obtenido puede someterse a PCR usando 2 cebadores que interponen una región parcial del gen de interés para obtener el polinucleótido de la presente invención o una parte del mismo. Más específicamente, el polinucleótido de la presente invención puede producirse, por ejemplo, mediante un procedimiento descrito en el Ejemplo 4(1), 11 (1) o 11 (7).
35 [0033] Alternativamente, el polinucleótido de la presente invención puede producirse sintetizando artificialmente el polinucleótido de la presente invención como fragmentos separados mediante transcripción inversa (RT)-PCR y luego fusionando estos fragmentos obtenidos. Por ejemplo, (a) 1489 bases localizadas del exón 1 al exón 13 en EML4 (para el tipo de polinucleótido v1 de la presente invención) o 2242 bases localizadas del exón 1 al exón 20 en EML4 (para el tipo de polinucleótido v2 de la presente invención) se amplifican por RT-PCR usando como molde ARNm extraído de células
40 (por ejemplo, células HeLa) o tejidos que expresan endógenamente EML4 y usando 2 cebadores que interponen la región génica de interés. Por otra parte, por ejemplo, (b) 1691 bases localizadas del exón 21 al exón 30 en ALK (para tanto el tipo de polinucleótido v1 de la presente invención como el tipo de polinucleótido v2 de la presente invención) se amplifican por RT-PCR usando como molde ARNm extraído de células (por ejemplo, células Rh30 o U-87MG) o tejidos que expresan endógenamente ALK y usando 2 cebadores que interponen la región génica de interés. Los productos de
45 PCR amplificados de (a) y (b) pueden fusionarse para obtener el polinucleótido de la presente invención. Esta fusión puede practicarse ideando los cebadores usados en la RT-PCR de (a) y (b). Por ejemplo, un cebador se crea añadiendo aproximadamente 10 bases de la secuencia de nucleótidos antisentido del extremo 5' del exón 21 en ALK al extremo 5' de un cebador antisentido para la amplificación por RT-PCR del fragmento de (a), y este cebador creado se usa como cebador antisentido para amplificar el fragmento de (a). Además, un cebador se crea añadiendo aproximadamente 10
50 bases de la secuencia de nucleótidos sentido del extremo 3' del exón 13 en EML4 (para el tipo de polinucleótido v1 de la presente invención) o aproximadamente 10 bases de la secuencia de nucleótidos sentido del extremo 3' del exón 20 en EML4 (para el tipo de polinucleótido v2 de la presente invención) al extremo 5' de un cebador sentido para la amplificación por RT-PCR del fragmento de (b), y este cebador creado se usa como cebador sentido para amplificar el fragmento de (b). El polinucleótido de la presente invención puede obtenerse por PCR usando como moldes estos 2
55 tipos de productos de PCR obtenidos y usando un cebador sentido que comprende el codón de iniciación de EML4 y un cebador antisentido que comprende el codón de terminación de ALK. Alternativamente, el polinucleótido de la presente invención también puede obtenerse mediante reacciones de hibridación y extensión usando sólo estos 2 tipos de productos de PCR obtenidos sin usar el cebador sentido que comprende el codón de iniciación de EML4 y el cebador antisentido que comprende el codón de terminación de ALK.
60 [0034] El vector de expresión de la presente invención, la célula transformada de la presente invención y el procedimiento para producir el polipéptido de la presente invención puede practicarse, por ejemplo, según procedimientos descritos en 2) Procedimientos para la producción del vector de la invención, la célula huésped de la invención y la proteína recombinante de la invención en “Modo para llevar a cabo la invención” del documento WO
01/34785. El polinucleótido aislado de la presente invención puede incorporarse de nuevo en el ADN de vector apropiado para así transformar una célula huésped eucariota o procariota con él. Alternativamente, un promotor apropiado y una secuencia que participa en la expresión fenotípica pueden introducirse en el vector para así hacer que cada célula huésped transformada con él exprese el polinucleótido.
5
[0035] El vector de expresión de la presente invención no está particularmente limitado mientras que comprenda el polinucleótido de la presente invención y exprese el polipéptido de la presente invención. Ejemplos de los mismos pueden incluir un vector de expresión obtenido insertando el polinucleótido de la presente invención en un vector de expresión conocido en la técnica, que se selecciona apropiadamente según una célula huésped usada.
10 [0036] Asimismo, la célula de la presente invención no está particularmente limitada mientras que comprenda el polinucleótido de la presente invención como resultado de la transferencia de ácido nucleico mediante transfección o infección con el vector de expresión de la presente invención. Por ejemplo, la célula de la presente invención es una célula huésped que comprende el polinucleótido de la presente invención incorporado en el cromosoma o es una célula
15 que comprende el vector de expresión que comprende el polinucleótido de la presente invención. La célula de la presente invención se obtiene, por ejemplo, transfectando o infectando una célula deseada con el vector de expresión de la presente invención. Más específicamente, por ejemplo, el vector de expresión que comprende el polinucleótido de la presente invención y un plásmido para encapsidar (por ejemplo, pGP o pE-eco) pueden introducirse en una célula BOSC23 usando un reactivo de transfección comercialmente disponible, lipofectamina, como se describe en el Ejemplo
20 1, para así producir un retrovirus de expresión. Una célula BA/F3 puede infectarse con este retrovirus para así producir la célula transformada de la presente invención.
[0037] La célula transformada deseada así obtenida puede cultivarse según un procedimiento estándar. Una proteína que está constituida por el polipéptido de la presente invención se produce mediante este cultivo. Un medio
25 usado en el cultivo puede seleccionarse apropiadamente según una célula huésped usada de entre una variedad de medios rutinarios. Por ejemplo, un medio RPMI1640 complementado con componentes de suero tales como suero bovino fetal (SBF) se usa para la célula BA/F3.
[0038] Por tanto, el polipéptido de la presente invención producido por la célula transformada puede separarse y
30 purificarse mediante una variedad de técnicas de operaciones de separación conocidas en la técnica usando las propiedades físicas o bioquímicas del polipéptido.
[0039] El polipéptido de la presente invención puede fusionarse en el marco con una secuencia marcadora y expresarse para así conseguir la confirmación de la expresión de la proteína, además de la purificación de la proteína.
35
<Conjunto de cebadores de la presente divulgación>
[0040] La presente divulgación engloba un conjunto de cebadores útiles en la detección de la presencia del polinucleótido de la presente invención.
40
[0041] Específicamente, la presente divulgación engloba:
(1) un conjunto de cebadores para detectar el polinucleótido de la presente invención que comprende un cebador antisentido que está constituido por moléculas de ácidos nucleicos con al menos 16 bases consecutivas que se hibridan bajo condiciones restrictivas (preferentemente, condiciones más restrictivas) a i) un tipo de polinucleótido v1 de la 45 presente invención (preferentemente, polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, más preferentemente un polinucleótido que está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1), un tipo de polinucleótido v2 de la presente invención (preferentemente, polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2, más preferentemente un polinucleótido que está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 6), un tipo de polinucleótido v3 de la presente invención (preferentemente, polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3, más preferentemente un polinucleótido 50 que está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 129), ii) un polinucleótido que está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 4 que es una secuencia genómica que comprende el punto de fusión de un polinucleótido que pertenece al polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, y/o iii) un polinucleótido que está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 5 que es una de las secuencias que comprenden el punto de fusión de un polinucleótido que pertenece al polinucleótido de fusión de EMK4
55 ALK v2, y un cebador sentido que está constituido por una molécula de ácido nucleico con al menos 16 bases consecutivas que se hibridan bajo condiciones restrictivas (preferentemente, condiciones más restrictivas) a cadenas complementarias a cualquiera de los anteriores i) a iii);
(2) un conjunto de cebadores de un cebador sentido que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 1759 (preferentemente, nº de base 271 a 1759) en SEQ ID NO: 1
60 y un cebador antisentido que comprende un oligonucleótido complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 1760 a 3926 (preferentemente, nº de base 1760 a 3447) en SEQ ID NO: 1, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas complementarias de los mismos, en el que la separación entre las posiciones seleccionadas de los cebadores sentido y antisentido en SEQ ID NO: 1 es 1 kb o menos, o en el que los cebadores sentido y antisentido dan productos de amplificación de 1 kb o menos de tamaño;
(3) un conjunto de cebadores de un cebador sentido que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 2242 en SEQ ID NO: 6 y un cebador antisentido que comprende un oligonucleótido complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 2243 a 3933 en SEQ ID NO: 6, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas
5 complementarias de los mismos, en el que la separación entre las posiciones seleccionadas de los cebadores sentido y antisentido en SEQ ID NO: 6 es 1 kb o menos, o en el que los cebadores sentido y antisentido dan productos de amplificación de 1 kb o menos de tamaño;
(4) un conjunto de cebadores de un cebador sentido que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 3629 en SEQ ID NO: 4 y un cebador antisentido que comprende
10 un oligonucleótido complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 3630 a 3979 en SEQ ID NO: 4, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas complementarias de los mismos, en el que la separación entre las posiciones seleccionadas de los cebadores sentido y antisentido en SEQ ID NO: 4 es 1 kb o menos, o en el que los cebadores sentido y antisentido dan productos de amplificación de 1 kb o menos de tamaño;
15 (5) un conjunto de cebadores de un cebador sentido que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 579 en SEQ ID NO: 5 y un cebador antisentido que comprende un oligonucleótido complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 580 a 853 en SEQ ID NO: 5, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas complementarias de los mismos; y
20 (6) un conjunto de cebadores de un cebador sentido que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 700 en SEQ ID NO: 129 y un cebador antisentido que comprende un oligonucleótido complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 701 a 1691 en SEQ ID NO: 129, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas complementarias de los mismos, en el que los cebadores sentido y antisentido dan productos de amplificación de 1 kb o
25 menos de tamaño. Ejemplos de un conjunto de cebadores preferible incluyen:
(7) el conjunto de cebadores o el conjunto de cebadores que está constituido por cadenas complementarias de los mismos según cualquiera de (3) a (6), en el que los cebadores sentido y antisentido están representados por (i) SEQ ID NO: 8 y 9, (ii) SEQ ID NO: 15 y 16, 17 y 18, 19 y 20, 21 y 22, 23 y 24, 25 y 26, 27 y 28, 29 y 30, 31 y 32, o 33 y 34, (iii) SEQ ID NO: 35 y 36, 37 y 38, 39 y 18, 41 y 20, 43 y 22, 45 y 24, 47 y 26, 49 y 28, 51 y 52, 53 y 54, o 55 y 34, (iv) SEQ
30 ID NO: 61 y 62, 63 y 64, 65 y 66, 67 y 68, 69 y 70, 71 y 72, 73 y 74, 75 y 76, 77 y 78, o 79 y 80, (v) SEQ ID NO: 81 y 62, 83 y 84, 85 y 68, 87 y 88, 89 y 70, 91 y 92, 93 y 74, 95 y 96, 97 y 98, o 99 y 100, o (vi) SEQ ID NO: 131 y 82, 132 y 62, 133 y 64,134y 66, 135 y 68,136 y 70,137y 72, 138 y 74,139 y 76,140y 78, o141y 80.
[0042] Los conjuntos de cebadores (7) (i) (en el Ejemplo 3(1)), (7) (ii) (en el Ejemplo 3(2)), (7) (iii) (en el Ejemplo
35 3(3)), y (7) (iv) y (v) (en el Ejemplo 4(2)), y (7) (vi) (en el Ejemplo 11(3)) se usaron para detectar la presencia del polinucleótido de la presente invención.
[0043] Punto de fusión en esta memoria descriptiva significa un punto en el que se fusionan una parte derivada del gen EML4 y una parte derivada del gen ALK. El punto de fusión en SEQ ID No: 1 es el punto en el que se fusionan 40 un nucleótido de posición de base 1759 y un nucleótido de posición de base 1760. El punto de fusión en SEQ ID No: 6 es el punto en el que se fusionan un nucleótido de posición de base 2242 y un nucleótido de posición de base 2243. El punto de fusión en SEQ ID No: 129 es el punto en el que se fusionan un nucleótido de posición de base 700 y un nucleótido de posición de base 701. El punto de fusión en SEQ ID No: 4 es el punto en el que se fusionan un nucleótido de posición de base 3629 y un nucleótido de posición de base 3630. El punto de fusión en SEQ ID No: 5 es el punto en
45 el que se fusionan un nucleótido de posición de base 579 y un nucleótido de posición de base 580.
[0044] Las “condiciones restrictivas” en esta memoria descriptiva comprenden condiciones de hibridación en el orden de “5 x SSPE, 5 × disolución de Denhardt, SDS al 0,5%, formamida al 50%, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón, 42ºC durante la noche” y condiciones de lavado en el orden de “0,5 × SSC, SDS al 0,1%, 42ºC”. Las
50 “condiciones más restrictivas” comprenden condiciones de hibridación en el orden de “5 x SSPE, 5 × disolución de Denhardt, SDS al 0,5%, formamida al 50%, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón, 42ºC durante la noche” y condiciones de lavado en el orden de “0,2 x SSC, SDS al 0,1%, 65ºC”.
[0045] Los conjuntos de cebadores pueden utilizarse como conjuntos de cebadores para amplificar y detectar el
55 polinucleótido de la presente invención. Para el uso de cebadores, su longitud de cadena es normalmente de 15 a 40 bases, preferentemente de 16 a 24 bases, más preferentemente de 18 a 24 bases, particularmente preferentemente de 20 a 24 bases.
[0046] Los procedimientos para producir cebadores no están particularmente limitados. Los cebadores pueden
60 producirse mediante el procedimiento de síntesis química usado para el procedimiento para producir el polinucleótido de la presente invención.
<Procedimiento de detección y kit para la detección de la presente divulgación>
[0047] La presente invención engloba un procedimiento para detectar el polinucleótido de la presente invención y un procedimiento para detectar una proteína de fusión que está constituida por el polipéptido de la presente invención. Específicamente, a continuación se ejemplifica un aspecto que comprende la etapa. Específicamente, el procedimiento para detectar el polinucleótido de la presente invención comprende la etapa de
5 (1) detectar la presencia del polinucleótido de la presente invención en una muestra obtenida de un sujeto de prueba.
[0048] Una muestra recogida de un sujeto de prueba (una muestra separada del cuerpo), específicamente cualquier fluido corporal recogido (preferentemente, sangre), fluido de lavado broncoalveolar, muestra de biopsia o muestra de esputo, se usa como la muestra obtenida de un sujeto de prueba. Preferentemente se usa una muestra de
10 biopsia de la parte afectada del pulmón del sujeto de prueba o una muestra de esputo del sujeto de prueba. Puede usarse ADN genómico extraído de la muestra o un producto de transcripción (producto como resultado de la transcripción y traducción del genoma; por ejemplo ARNm, ADNc, o una proteína) del mismo. Particularmente preferentemente, para uso se prepara ARNm o ADNc.
15 [0049] En el procedimiento para detectar el polinucleótido de la presente invención, la “etapa de detectar la presencia del polinucleótido” puede practicarse detectando la presencia del polinucleótido representado por SEQ ID NO: 4 (secuencia genómica que comprende el punto de fusión) o SEQ ID NO:5 (secuencia genómica que comprende el punto de fusión) en el genoma de la muestra obtenida de un sujeto de prueba o detectando la presencia de ARNm o ADN correspondiente al tipo de polinucleótido v1 de la presente invención (preferentemente, el polinucleótido de fusión
20 de EML4-ALK v1), el tipo de polinucleótido v2 de la presente invención (preferentemente, el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2) o el tipo de polinucleótido v3 de la presente invención (preferentemente, el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3) preparando un producto de transcripción (por ejemplo, ARNm o ADNc) de ADN genómico extraído de la muestra obtenida de un sujeto de prueba.
25 [0050] La extracción de ADN genómico puede realizarse mediante un procedimiento conocido en la técnica y puede realizarse convenientemente con un kit de extracción de ADN comercialmente disponible.
[0051] La etapa de detección en la etapa (1) puede practicarse según un procedimiento de análisis de genes conocido en la técnica (por ejemplo, PCR comúnmente usada como procedimiento de detección de genes, LCR 30 (reacción en cadena de la ligasa), SDA (amplificación por desplazamiento de cadenas), NASBA (amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos), ICAN (amplificación isoterma y quimérica de ácidos nucleicos iniciada por cebadores), LAMP (amplificación isoterma mediada por bucles), TMA (sistema TMA de sondas de genes) y procedimientos muy conocidos tales como una micromatriz). Por ejemplo, se utiliza una técnica de hibridación usando como sonda un ácido nucleico que se hibrida con el polinucleótido de la presente invención o una técnica de 35 amplificación de genes usando como cebadores ADN que se hibrida con el polinucleótido de la presente invención. Específicamente, para la medición se usa un ácido nucleico, por ejemplo, ARNm, derivado de la muestra obtenida de un sujeto de prueba. El nivel de ARNm se mide por un procedimiento de reacción de amplificación de genes que usa cebadores diseñados para amplificar específicamente la secuencia de polinucleótidos de la presente invención. Los cebadores usados en el procedimiento de detección de la presente invención o los cebadores contenidos en el kit para 40 la detección de la presente invención no están particularmente limitados mientras amplifiquen específicamente la secuencia de polinucleótidos de la presente invención. Estos cebadores se diseñan basándose de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de la presente invención. El diseño de cebadores para un procedimiento de monitorización de la amplificación por PCR puede lograrse utilizando el software de diseño de cebadores Primer Express (PE Biosystems). Los productos de PCR con un tamaño grande reducen la eficiencia de amplificación. Por tanto, es 45 apropiado que los cebadores sentido y antisentido puedan diseñarse para dar productos de amplificación de 1 kb o menos de tamaño en la amplificación de ARNm o ADNc. Más específicamente, un cebador sentido (cebador de 5') y un cebador antisentido (cebador de 3') se diseñan a partir de una parte que codifica EML4 (por ejemplo, cualquier parte dentro de la región del gen EML4 del polinucleótido de fusión de EML4-ALK (particularmente, ADNc)) y de una parte que codifica ALK (por ejemplo, cualquier parte dentro de la región del gen ALK del polinucleótido de fusión de EML450 ALK (particularmente, ADNc)), respectivamente. Preferentemente se usan los cebadores contenidos en el kit para la detección de la presente invención, más preferentemente, los cebadores más adecuados contenidos en el kit para la detección de la presente invención. Tanto si el gen de interés (la secuencia completa o su parte específica) se amplifica como no, puede confirmarse mediante un procedimiento adecuado para cada técnica de amplificación. Por ejemplo, para PCR, los productos de PCR pueden someterse a análisis por electroforesis en gel de agarosa y tinción con
55 bromuro de etidio para así confirmar si un fragmento de amplificación con el tamaño de interés se obtiene o no. Si se obtiene el fragmento de amplificación con el tamaño de interés, entonces el polinucleótido de la presente invención está presente en la muestra obtenida de un sujeto de prueba. De esta forma puede detectarse la presencia del polinucleótido de la presente invención.
60 [0052] La detección usando la técnica de hibridación se realiza, por ejemplo, por una hibridación de Northern, transferencia por puntos o procedimiento de micromatrices de ADN. Para detectar el polinucleótido en la hibridación puede usarse una sonda que comprende una molécula de ácido nucleico con al menos 32 bases consecutivas que se hibridan bajo condiciones restrictivas (preferentemente, condiciones más restrictivas) con un polinucleótido de la presente invención; o cadenas complementarias del mismo, y que comprenden las posiciones 1744 a 1775 de la
secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1, las posiciones 2227 a 2258 de la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 6, las posiciones 685 a 716 de la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 129, las posiciones 3614 a 3645 de la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 4, las posiciones 564 a 595 de la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 5; o cadenas complementarias del mismo. Además, 5 puede utilizarse una técnica de amplificación de genes tal como RT-PCR. En el procedimiento de RT-PCR, la presencia del polinucleótido de la presente invención puede analizarse más cuantitativamente usando un procedimiento de monitorización de la amplificación por PCR (PCR en tiempo real) (Genome Res. 6 (10), 986, 1996) en el procedimiento de amplificación de genes. Por ejemplo, puede usarse ABI PRISM 7900 (PE Biosystems) como procedimiento de monitorización de amplificación por PCR. La PCR a tiempo real es un procedimiento conocido en la técnica y puede
10 realizarse convenientemente utilizando un aparato comercialmente disponible y un kit para PCR en tiempo real.
[0053] Un procedimiento para detectar una proteína de fusión codificada por el polinucleótido de la presente invención comprende la etapa de
(2) detectar la presencia del polipéptido de la presente invención en una muestra obtenida de un sujeto de prueba.
15 [0054] Una etapa de detección tal puede practicarse preparando una disolución solubilizada derivada de una muestra obtenida de un sujeto de prueba (por ejemplo, un tejido o célula canceroso obtenido del sujeto de prueba) y detectando el polipéptido de la presente invención (particularmente, el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1) contenido en la misma por una medición inmunológica o procedimiento de medición de actividad enzimática usando anticuerpos
20 anti-EML4 y anti-ALK en combinación. Preferentemente puede usarse una aproximación usando un anticuerpo monoclonal o policlonal específico para el polipéptido de la presente invención (particularmente, el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1) tal como inmunoensayo enzimático, ELISA de tipo sándwich con dos anticuerpos, fluoroinmunoensayo, radioinmunoensayo o transferencia de Western.
25 [0055] Más preferentemente, la presencia del polipéptido de la presente invención puede detectarse, como se muestra en el Ejemplo 9, sometiendo los extractos de células de una célula que probablemente tiene el polipéptido de la presente invención a inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-EML4 y realizando la detección usando un anticuerpo anti-ALK para los precipitados. En el procedimiento del Ejemplo 9 también puede usarse la inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-ALK y la detección con el anticuerpo anti-EML4. Por tanto, después de realizar la inmunoprecipitación y
30 la detección, se prefiere confirmar adicionalmente que la proteína detectada por el anticuerpo de detección tiene el tamaño del polipéptido de la presente invención de interés. Los anticuerpos usados en esta detección pueden ser cualquier anticuerpo que pueda unirse específicamente a una secuencia de polipéptidos del exón 1 al exón 20 (preferentemente, del exón 1 al exón 13; más preferentemente del exón 1 al exón 6) de EML4 o una secuencia de polipéptidos del exón 21 al exón 30 de ALK, y pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales.
35 [0056] Si el polinucleótido de la presente invención o el polipéptido de la presente invención se detecta en la muestra obtenida de un sujeto de prueba, el sujeto de prueba es una diana (paciente) que tiene cáncer que se muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente invención y sirve de diana a la que puede administrarse la composición farmacéutica de la presente invención.
40 [0057] El kit para la detección de la presente divulgación comprende al menos cebadores sentido y antisentido diseñados para amplificar específicamente el polinucleótido de la presente invención. El conjunto de cebadores sentido y antisentido son un conjunto de polinucleótidos que actúan de cebadores para la amplificación del polinucleótido de la presente invención. Ejemplos de los mismos incluyen los conjuntos de cebadores (1) a (7) descritos en el párrafo
45 <Conjunto de cebadores de la presente invención>. Los conjuntos de cebadores preferibles son los conjuntos de cebadores (2) a (7). Los conjuntos de cebadores más preferibles son los conjuntos de cebadores (7).
[0058] Ejemplos de otros reactivos que pueden estar contenidos en el kit para la detección pueden incluir reactivos (por ejemplo, Taq polimerasa, sustratos nucleotídicos y disoluciones de tampón) necesarios para la PCR.
50
<Procedimiento de cribado de la presente divulgación>
[0059] El procedimiento de cribado de la presente divulgación engloba [1] un procedimiento para cribar una sustancia que inhibe el polipéptido de la presente invención y [2] un procedimiento para cribar un agente terapéutico
55 para cáncer (preferentemente, cáncer de pulmón) que se muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente invención.
[1] Procedimiento para cribar una sustancia que inhibe el polipéptido de la presente invención (que inhibe la actividad y/o expresión del polipéptido de la presente invención).
60 [0060] El procedimiento para cribar una sustancia que inhibe el polipéptido de la presente invención no está particularmente limitado mientras que comprenda las siguientes etapas (i) a (iii):
(i) poner sustancias de prueba en contacto con el polipéptido de la presente invención o una célula que expresa el polipéptido de la presente invención;
(ii) analizar si el polipéptido se inhibe o no, y
(iii) seleccionar una sustancia que inhibe el polipéptido.
[0061] Preferentemente, la sustancia que inhibe el polipéptido de la presente invención puede cribarse mediante 5 procedimientos descritos en los Ejemplos 7(3), 7(4), 8(3), 8(5) -8(9), 10(3), 11(4) -(6), 11(8), y 11(9).
[0062] El procedimiento de cribado [1] engloba los siguientes procedimientos (a), (b) o (c):
(a) procedimiento de cribado in vitro; un procedimiento para cribar una sustancia que inhibe la actividad del polipéptido de la presente invención que
10 comprende las etapas de (1) poner sustancias de prueba en contacto con el polipéptido de la presente invención, (2) analizar si la actividad del polipéptido se inhibe o no y (3) seleccionar una sustancia que inhibe la actividad del polipéptido;
(b) procedimiento de cribado basado en células; un procedimiento para cribar una sustancia que inhibe la actividad del polipéptido de la presente invención que
15 comprende las etapas de (1) poner sustancias de prueba en contacto con una célula que expresa el polipéptido de la presente invención, (2) analizar si la actividad del polipéptido se inhibe o no, y (3) seleccionar una sustancia que inhibe la actividad del polipéptido; y
(c) procedimiento de cribado basado en la inhibición de la expresión; un procedimiento para cribar una sustancia que inhibe la expresión del polipéptido de la presente invención que
20 comprende las etapas de (1) poner sustancias de prueba en contacto con una célula que expresa el polipéptido de la presente invención, (2) analizar si la expresión del polipéptido se inhibe o no, y (3) seleccionar una sustancia que inhibe la expresión del polipéptido.
[0063] Cada procedimiento de cribado (a)-(c) se describirá más adelante. La célula que expresa el polipéptido de
25 la presente invención comprende una célula que expresa de forma natural el polipéptido de la presente invención (por ejemplo NCI-H2228) y una célula provocada para expresar el polipéptido de la presente invención mediante su transformación con un vector que comprende el polinucleótido de la presente invención. La célula preferible es la célula provocada para expresar el polipéptido de la presente invención mediante su transformación con un vector que comprende el polinucleótido de la presente invención.
30
(a) Procedimiento de cribado in vitro
[0064] El procedimiento de cribado in vitro comprende: poner sustancias de prueba en contacto con el polipéptido purificado de la presente invención mediante adición (etapa de contacto); analizar si la actividad del
35 polipéptido de la presente invención se inhibe o no por la(s) sustancia(s) de prueba en comparación con la actividad del polipéptido de la presente invención que no se ha puesto en contacto con la sustancia de prueba (etapa de análisis); y seleccionar una sustancia que inhibe la actividad del polipéptido de la presente invención (es decir, un agente terapéutico para cáncer, particularmente, un agente terapéutico para cáncer de pulmón).
40 [0065] En el procedimiento de cribado de la presente invención, cada etapa puede practicarse específicamente, por ejemplo, como se describe más adelante. Las sustancias de prueba se ponen en contacto con el polipéptido purificado de la presente invención mediante adición. Después de la adición de ATP, la actividad del polipéptido se mide. Los disolventes (por ejemplo, DMSO) para la sustancia de prueba se ponen en contacto como control con el polipéptido purificado mediante mezcla. Después de la adición de ATP, la actividad del polipéptido se mide. Como
45 control de ruido puede ponerse una condición sin la adición de ATP. Se analiza si la actividad del polipéptido de la presente invención se inhibe o no por la(s) sustancia(s) de prueba. Si la actividad (es decir, la actividad de fosforilación) del polipéptido de la presente invención se inhibe o no por la(s) sustancia(s) de prueba puede determinarse analizando un cambio inducido por la sustancia de prueba en el nivel de fosforilación de tirosina del polipéptido de la presente invención. Específicamente, cuando la adición (es decir, el contacto) de una sustancia de prueba inhibe la actividad (es
50 decir, la actividad de fosforilación) del polipéptido de la presente invención en comparación con la adición (es decir, el contacto) del control de disolvente, esta sustancia de prueba se selecciona como una sustancia que inhibe la actividad del polipéptido de la presente invención, (es decir, un agente terapéutico para cáncer, particularmente, un agente terapéutico para cáncer de pulmón). El procedimiento de cribado in vitro de la presente invención comprende un procedimiento de cribado llevado a cabo de un modo similar al anterior, excepto que en las etapas anteriores el sustrato
55 peptídico se añade y se mezcla antes de la adición de ATP, y la actividad del polipéptido de la presente invención se determina analizando la actividad de fosforilación en el sustrato peptídico por el polipéptido de la presente invención (es decir, analizando un cambio en el nivel de fosforilación en el sustrato peptídico por el polipéptido de la presente invención con el fin de determinar si una sustancia de prueba inhibe la actividad del polipéptido de la presente invención). De los procedimientos de cribado de la presente invención, preferentemente se practica el procedimiento de
60 cribado in vitro en las condiciones descritas en el Ejemplo 7(3) o 11(4). Una sustancia que puede inhibir el 50% o más de actividad por este procedimiento a una concentración de 10 µM o inferior, preferentemente 1 µM o inferior, más preferentemente 0,1 µM o inferior, se selecciona como una sustancia que inhibe la actividad del polipéptido de la presente invención.
(b) Procedimiento de cribado basado en células
[0066] El procedimiento de cribado basado en células comprende: poner sustancias de prueba en contacto con una célula que expresa el polipéptido de la presente invención mediante mezcla (es decir, adición) (etapa de contacto);
5 analizar si la actividad del polipéptido de la presente invención se inhibe o no por la(s) sustancia(s) de prueba en comparación con la actividad del polipéptido de la presente invención que no se ha puesto en contacto con la sustancia de prueba (etapa de análisis); y seleccionar una sustancia que inhibe la actividad del polipéptido de la presente invención (es decir, un agente terapéutico para cáncer, particularmente, un agente terapéutico para cáncer de pulmón). Este procedimiento de cribado puede practicarse específicamente, por ejemplo, como se describe a continuación.
10 [0067] Primero, las sustancias de prueba o controles de disolvente (por ejemplo, DMSO) se ponen en contacto con una célula que expresa el polipéptido de la presente invención. Las células se cultivan durante un tiempo dado. La actividad (es decir, la actividad de autofosforilación) del polipéptido de la presente invención se mide usando lisados de células preparados a partir de las células cultivadas por disolución, por electroforesis en SDS conocida en la técnica e
15 inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-ALK fosforilada (por ejemplo, tecnología de señalización de células) para así analizar si la actividad del polipéptido de la presente invención se inhibe o no por la(s) sustancia(s) de prueba. Si la actividad del polipéptido de la presente invención se inhibe o no por la(s) sustancia(s) de prueba puede determinarse analizando un cambio inducido por la sustancia de prueba en el nivel de fosforilación de tirosina (es decir, autofosforilación) del polipéptido de la presente invención. Específicamente, cuando la adición (es decir, el contacto) de
20 una sustancia de prueba inhibe la actividad del polipéptido de la presente invención en comparación con la adición (es decir, el contacto) del control de disolvente, esta sustancia de prueba se selecciona como una sustancia que inhibe la actividad del polipéptido de la presente invención (es decir, un agente terapéutico para cáncer, particularmente, un agente terapéutico para cáncer de pulmón). De los procedimientos de cribado de la presente invención, preferentemente, el procedimiento de cribado basado en células se practica en las condiciones descritas en el Ejemplo
25 7(4), 10(3), 11(5) o 11(8). Se selecciona una sustancia que puede inhibir el 50% o más de actividad por este procedimiento a una concentración de 10 µM o inferior, preferentemente 1 µM o inferior, más preferentemente 0,1 µM o inferior.
(c) Procedimiento de cribado basado en la inhibición de la expresión
30 [0068] El procedimiento de cribado basado en la inhibición de la expresión comprende: poner sustancias de prueba en contacto con una célula que expresa el polipéptido de la presente invención mediante mezcla (es decir, adición) (etapa de contacto); analizar si la expresión del polipéptido de la presente invención se inhibe o no por la(s) sustancia(s) de prueba en comparación con la expresión del polipéptido de la presente invención que no se ha puesto
35 en contacto con la sustancia de prueba (etapa de análisis); y seleccionar una sustancia que inhibe la expresión del polipéptido de la presente invención (es decir, un agente terapéutico para cáncer, particularmente, un agente terapéutico para cáncer de pulmón, que se muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente invención). Este procedimiento de cribado puede practicarse específicamente, por ejemplo, como se describe a continuación.
40 [0069] Las sustancias de prueba o controles de disolvente (por ejemplo, DMSO) se ponen en contacto con cualquier célula que expresa el polipéptido de la presente invención. Después del cultivo, los extractos se preparan a partir de las células y posteriormente se usan para analizar si la expresión del polipéptido de la presente invención se inhibe o no por la(s) sustancia(s) de prueba. Si la expresión del polipéptido de la presente invención se inhibe o no puede analizarse analizando si el ARNm o la expresión de proteínas del polipéptido de la presente invención se inhibe o
45 no. Más específicamente, el ARNm o el nivel de proteínas del polipéptido de la presente invención presente en los extractos de células se identifica por un procedimiento de análisis del nivel de expresión conocido en la técnica, por ejemplo, transferencia de Northern, PCR cuantitativa, inmunotransferencia o ELISA. Más específicamente, la inhibición del ARNm o la expresión de proteínas del polipéptido de la presente invención puede analizarse mediante un procedimiento descrito en el Ejemplo 8(5) o 8(6). Si la expresión del polipéptido de la presente invención se inhibe o no
50 por la(s) sustancia(s) de prueba puede determinarse analizando un cambio inducido por la sustancia de prueba en el nivel de expresión del polipéptido de la presente invención. Específicamente, cuando el contacto de una sustancia de prueba inhibe el nivel de expresión (es decir, nivel de ARNm o de proteínas) del polipéptido de la presente invención en comparación con el contacto del control de disolvente, esta sustancia de prueba se selecciona como una sustancia que inhibe la expresión del polipéptido de la presente invención (es decir, un agente terapéutico para cáncer,
55 particularmente, un agente terapéutico para cáncer de pulmón). De los procedimientos de cribado de la presente invención, preferentemente, el procedimiento de cribado basado en la inhibición de la expresión se practica en las condiciones descritas en el Ejemplo 8(5) o 8(6). Se selecciona una sustancia que puede inhibir el 50% o más de actividad por este procedimiento a una concentración de 10 µM o inferior, preferentemente 1 µM o inferior, más preferentemente 0,1 µM o inferior. Preferentemente, la sustancia de prueba seleccionada tiene una actividad inhibitoria
60 en todas las células usadas. Sin embargo, también puede seleccionarse una sustancia de prueba que tiene una actividad inhibitoria en una célula.
[2] Procedimiento para cribar un agente terapéutico para cáncer que se muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente invención
[0070] Se reveló que el polinucleótido de fusión de EML4-ALK es un oncogén (Ejemplo 6 y 11 (2)) y la presencia del polinucleótido de fusión de EML4-ALK se detectó en algunos pacientes con cáncer de pulmón. Adicionalmente, se reveló que el crecimiento celular independiente del anclaje fue inhibido (es decir, se muestra un efecto anticancerígeno) 5 por la inhibición de la actividad y/o expresión del polipéptido de la presente invención (Ejemplo 8, 11). Se mostró que la sustancia que inhibe el polipéptido de la presente invención (que inhibe la actividad y/o expresión del polipéptido de la presente invención) tiene un efecto terapéutico sobre el cáncer. Específicamente, el procedimiento para cribar una sustancia que inhibe el polipéptido de la presente invención (que inhibe la actividad y/o expresión del polipéptido de la presente invención) mencionado anteriormente [1] puede utilizarse como procedimiento para cribar un agente
10 terapéutico para cáncer (preferentemente, cáncer de pulmón) que se muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente invención.
[0071] El procedimiento de cribado [2] de la presente invención comprende adicionalmente, además de analizar si el polipéptido de la presente invención se inhibe o no y seleccionar una sustancia que inhibe el polipéptido de la
15 presente invención, la etapa de confirmar que la sustancia de prueba seleccionada tiene una actividad terapéutica contra el cáncer (particularmente, cáncer de pulmón) que se muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente invención.
La etapa de confirmar que la sustancia de prueba seleccionada tiene una actividad terapéutica contra el cáncer
20 [0072] Ejemplos de la etapa de confirmar que la sustancia seleccionada tiene una actividad terapéutica contra el cáncer (particularmente, cáncer de pulmón) que se muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente invención incluyen una etapa de practicar un procedimiento de evaluación conocido en la técnica o un procedimiento modificado del mismo, por ejemplo, un procedimiento que comprende analizar la actividad terapéutica de la sustancia
25 seleccionada contra el cáncer (particularmente, cáncer de pulmón) tratando con la sustancia células cultivadas o animales de modelo de tumor que expresan el polipéptido de la presente invención (Clinical Oncology, 2ª ed., Cancer and Chemotherapy Publishers, Inc.).
[0073] La etapa de confirmar que la sustancia de prueba seleccionada tiene una actividad terapéutica contra el
30 cáncer (particularmente, cáncer de pulmón) que se muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente invención es, preferentemente, la etapa de confirmar que la sustancia de prueba seleccionada presenta el efecto inhibitorio del crecimiento y/o efecto inductor de muerte celular en las células usando células cancerosas derivadas de cáncer humano (particularmente, derivadas de cáncer de pulmón) que expresan endógenamente el polipéptido de la presente invención (por ejemplo, NCI-H2228), la etapa de confirmar que la sustancia de prueba seleccionada tiene el
35 efecto inhibitorio en el crecimiento independiente del anclaje de células transformadas por la expresión del polipéptido de la presente invención y/o la etapa de confirmar que la sustancia de prueba seleccionada tiene el efecto inhibitorio sobre el crecimiento de tumor formado en ratón desnudo inoculado con una célula que expresa el polinucleótido de la presente invención.
40 [0074] Puede usarse un animal de modelo portador de cáncer que sirve de animal de modelo de tumor en el que las células cancerosas que expresan endógenamente el polipéptido de la presente invención (por ejemplo, NCI-H2228)
o las células transformadas por la expresión del polipéptido de la presente invención se trasplantan subcutáneamente, intradérmicamente o intraperitonealmente o a cada órgano (por ejemplo, un ratón desnudo al que se trasplantan las células NIH3T3 que producen la expresión del polipéptido de la presente invención). Además, también puede usarse un
45 animal que produce la expresión del polinucleótido de fusión de EML4-ALK.
[0075] Ejemplos de sustancias de prueba usadas en el procedimiento de cribado de la presente invención pueden incluir, pero no se limitan particularmente a, compuestos comercialmente disponibles (incluyendo péptidos), una variedad de compuestos (incluyendo péptidos) conocidos en la técnica y registrados en archivos químicos, grupos de
50 compuestos obtenidos por una técnica de química combinatoria (N. Terrett y col., Drug Discov. Today, 4 (1): 41, 1999), sobrenadantes de cultivos de microorganismos, componentes naturales derivados de organismos vegetales o marinos, extractos de tejidos animales, ácidos nucleicos bicatenarios, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y compuestos (incluyendo péptidos) químicamente o biológicamente modificados a partir de compuestos (incluyendo péptidos) seleccionados por el procedimiento de cribado de la presente invención.
55 <Uso para la preparación de composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer que se muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente invención, y ácido nucleico bicatenario>
[0076] La presente invención engloba una composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer que se
60 muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente invención que comprende como principio activo una sustancia obtenida por el procedimiento de cribado de la presente invención. La presente invención engloba el uso de una sustancia que inhibe el polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una sustancia obtenida por el procedimiento de cribado de la presente invención [por ejemplo, un ácido nucleico bicatenario (incluyendo ARNip), proteína (incluyendo un anticuerpo o fragmento de anticuerpo), péptido u otros compuestos]) para la preparación de una
composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer que se muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente invención.
[0077] El principio activo en la composición farmacéutica puede seleccionarse por el procedimiento de cribado de
5 la presente divulgación. Ejemplos de la sustancia seleccionada por el procedimiento de cribado de la presente divulgación pueden incluir los compuestos A a D y un ácido nucleico bicatenario descrito en los Ejemplos 7 y 8 más adelante, respectivamente. Alternativamente, un compuesto seleccionado por el procedimiento de cribado de la presente divulgación de un compuesto de bajo peso molecular con una actividad inhibitoria contra ALK (inhibidor de ALK) conocido en la técnica puede usarse como principio activo en la composición farmacéutica. El inhibidor de ALK
10 puede ejemplificarse por inhibidores de ALK descritos en los documentos WO 2005/097765 y WO 2005/016894 (particularmente, derivados de 2,4-pirimidinadiamina). Particularmente puede usarse un compuesto descrito en Wan W y col., Blood 107: 1617-1623, 2006, además de WHI-P131 (4-(4'-hidroxifenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina) y WHI-P154 (4-[(3'-bromo-4'-hidroxifenil)amino]-6,7-dimetoxiquinazolina); denominado en lo sucesivo un compuesto A; Marzec M y col., Lab Invest 85: 1544-1554, 2005) (ambos, EMD Biosciences). Alternativamente, como inhibidor de ALK puede
15 usarse N-[2-(3-clorofenil)etil]-2-[({[4-(trifluorometoxi)fenoxi]acetil}amino)metil]-1,3-tiazol-4-carboxamida (documento WO 2005/097765; denominado en lo sucesivo un compuesto B), 5-cloro-N4-[2-(isopropilsulfonil)fenil]-N2-{2-metoxi-4-[4-(4metilpiperazin-1-il)piperidin-1-il]fenil}pirimidina-2,4-diamina (documento WO 2005/016894; denominado en lo sucesivo un compuesto C) o 2-[(5-bromo-2-{[2-metoxi-4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil]amino}pirimidin-4-il)amino]-Nmetilbencenosulfonamida (documento WO 2005/016894; denominado en lo sucesivo un compuesto D).
20 [0078] El ácido nucleico bicatenario ejemplificado como principio activo en la composición farmacéutica comprende una parte de ácido nucleico bicatenario (ARN o ADN) y, preferentemente, nucleótidos protuberantes del extremo 3' de las cadenas de transcripción y complementaria e induce iARN. La iARN es un fenómeno evolutivamente conservado que se produce por un ácido nucleico bicatenario con 21 a 23 bases producido por la endonucleasa RNasa
25 III (Genes Dev. 15, 485-490, 2001). Los nucleótidos protuberantes del extremo 3' son respectivamente cualquier ácido nucleico con 1 ó 2 bases, preferentemente 2 bases. El número de bases (21 a 23 bases) descrito anteriormente es el número de bases de la cadena de transcripción o complementaria incluyendo su nucleótido protuberante. Las cadenas de transcripción y complementaria pueden tener el mismo número de bases o un número de bases diferente y, preferentemente, tener el mismo número de bases.
30 [0079] Por ejemplo, U (uridina), A (adenosina), G (guanosina) o C (citidina) pueden usarse como ácidos ribonucleicos que constituyen los nucleótidos protuberantes del extremo 3' del ácido nucleico bicatenario. Por ejemplo, dT (desoxitimidina), dA (desoxiadenosina), dG (desoxiguanosina) o dC (desoxicitidina) pueden usarse como ácidos desoxirribonucleicos que constituyen los nucleótidos protuberantes del extremo 3' de los mismos.
35 [0080] El ácido nucleico bicatenario que puede usarse como principio activo en la composición farmacéutica comprende una parte bicatenaria diseñada basándose en las bases en las posiciones 1743 a 1761, 1744 a 1762, 1750 a 1768, 1753 a 1771, 1756 a 1774, o 1757 a 1775 en SEQ ID NO: 1 y tiene una actividad inhibitoria sobre la expresión del polipéptido de la presente invención (denominado en lo sucesivo un ácido nucleico bicatenario de la presente
40 divulgación). Ejemplos de aspectos preferibles de un ácido nucleico bicatenario tal incluyen los ARNip-1 a ARNip-6 descritos en el ejemplo 8 (es decir, un ácido nucleico bicatenario en el que una cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 111 y la otra cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 112; un ácido nucleico bicatenario en el que una cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 113 y la otra cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos
45 representada por SEQ ID NO: 114; un ácido nucleico bicatenario en el que una cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 115 y la otra cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 116; un ácido nucleico bicatenario en el que una cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 117 y la otra cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 118; un ácido nucleico bicatenario en el que una cadena está constituida por la secuencia
50 de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 119 y la otra cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 120; y un ácido nucleico bicatenario en el que una cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 121 y la otra cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 122). El ácido nucleico bicatenario de la presente invención puede producirse por procedimientos estándar (por ejemplo, J. Am. Chem. Soc. 120, 11820-11821, 1998; y Methods, 23, 206-217, 2001).
55 Alternativamente, un fabricante por contrato de ácidos nucleicos bicatenarios (por ejemplo, RNAi Co. Ltd.) es muy conocido por aquellos expertos en la materia y puede utilizarse en la producción del ácido nucleico bicatenario. Se confirmó por un sistema de diseño de secuencias de ARNip (versión comercial siDirect (marca registrada), RNAi Co. Ltd.) que las secuencias diana de los ARNip-1 a ARNip-6 eran específicas para el polipéptido de la presente invención.
60 [0081] El ácido nucleico bicatenario de la presente invención puede diseñarse basándose en secuencias de nucleótidos de ADN (bases en las posiciones 1743 a 1761, 1744 a 1762, 1750 a 1768, 1753 a 1771, 1756 a 1774, o 1757 a 1775 en SEQ ID NO: 1) elegidas como diana por los ARNip-1 a ARNip-6. Un ácido nucleico bicatenario tal inhibe el polipéptido de la presente invención, como con los ARNip-1 a ARNip-6. Por ejemplo, el ARNip puede diseñarse teniendo un parte bicatenaria que está constituida por una secuencia de nucleótidos de ARN directamente convertida a
partir de la secuencia de nucleótidos de ADN diana completa. Alternativamente, el ácido nucleico bicatenario quimérico ADN-ARN (que comprende tanto ARN como ADN en la cadena idéntica) puede diseñarse teniendo una secuencia de ARN convertida a partir de cualquier parte de la secuencia de nucleótidos de ADN diana. Además, puede diseñarse un ácido nucleico bicatenario híbrido en el que una cadena es ADN y la otra cadena es ARN y se produce para uso. La
5 conversión de la secuencia de nucleótidos de ARN a partir de la secuencia de nucleótidos de ADN descrita en este documento significa que la dT en la secuencia de nucleótidos de ADN se convierte en U y otras bases, es decir, dA, dG y dC se convierten en A, G y C, respectivamente.
[0082] El ácido nucleico bicatenario de la presente invención presentó un efecto inhibitorio sobre el crecimiento
10 independiente del anclaje de una célula que expresa el polipéptido de la presente invención (Ejemplo 8(7)). Por tanto, el ácido nucleico bicatenario de la presente invención puede utilizarse para preparar la composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer que se muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente invención.
[0083] Un efecto terapéutico sobre el cáncer que se muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente
15 invención puede confirmarse mediante el uso de un procedimiento generalmente conocido por aquellos expertos en la materia o un procedimiento modificado del mismo (véase “La etapa de confirmar que la sustancia de prueba seleccionada tiene una actividad terapéutica contra el cáncer”).
[0084] Una preparación que comprende como principio activo una sustancia que inhibe el polipéptido de la
20 presente invención (por ejemplo, una sustancia [por ejemplo, un ácido nucleico bicatenario, proteína (incluyendo un anticuerpo o fragmento de anticuerpo), péptido u otros compuestos] obtenida por el procedimiento de cribado de la presente invención) puede prepararse como una composición farmacéutica usando vehículos, excipientes y/u otros aditivos farmacológicamente aceptables normalmente usados en la producción de la preparación según el tipo del principio activo.
25 [0085] Ejemplos de administración puede incluir: administración por vía oral usando comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, gránulos finos, polvos o agentes líquidos orales; y administración parenteral usando inyecciones para inyección intravenosa (incluyendo goteo intravenoso), inyecciones intramusculares o inyección subcutánea, supositorios, agentes de administración percutánea o agente de administración transmucosa. Particularmente se
30 prefiere la administración parenteral tal como inyección intravenosa para péptidos que son digeridos en el estómago.
[0086] Para preparar una composición sólida para administración por vía oral, 1 o más sustancias activas pueden mezclarse con al menos un diluyente inactivo, por ejemplo, lactosa, manitol, glucosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa, almidón, polivinilpirrolidona o aluminometasilicato de magnesio. La composición puede contener
35 aditivos distintos del diluyente inactivo, por ejemplo, lubricantes, disgregantes, estabilizadores o disolventes o solubilizantes según un procedimiento estándar. Los comprimidos o píldoras pueden recubrirse, si es necesario, con un recubrimiento de azúcar o con una película tal como una sustancia gastrosoluble o entérica.
[0087] Una composición líquida para administración por vía oral puede comprender, por ejemplo, una emulsión,
40 disolución, suspensión, jarabe o elixir y puede contener un diluyente inactivo generalmente usado, por ejemplo, agua purificada o etanol. La composición puede contener aditivos distintos del diluyente inactivo, por ejemplo, humectantes, suspensiones, edulcorantes, aromas o antisépticos.
[0088] Una inyección parenteral puede comprender una disolución, suspensión o emulsión acuosa o no acuosa
45 aséptica. Una disolución o suspensión soluble en agua puede contener, por ejemplo, agua destilada o solución salina para inyección como diluyente. Una disolución o suspensión insoluble en agua puede contener, por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal (por ejemplo, aceite de oliva), alcoholes (por ejemplo, etanol) o polisorbato 80 como diluyente. La composición puede contener adicionalmente humectantes, emulsionantes, dispersantes, estabilizadores, disolventes o solubilizantes o antisépticos. La composición puede esterilizarse, por ejemplo, mediante
50 filtración usando un filtro impermeable a bacterias, formulación de germicidas en el mismo o irradiación. Alternativamente puede producirse una composición sólida aséptica y disolverse en agua aséptica u otros medios asépticos para inyección para uso.
[0089] Una dosis puede determinarse apropiadamente en consideración de la intensidad de actividad del
55 principio activo, es decir, la sustancia obtenida por el procedimiento de cribado de la presente invención, condiciones, la edad o sexo de un sujeto que recibe la administración, etc. Preferentemente, la dosis puede calcularse según una vía como una cantidad que proporciona una concentración en suero alrededor del tumor o concentración intratumoral de 3 a 30 veces, por ejemplo, 10 veces superior a una concentración de fármaco que inhibe el 50% de la actividad o expresión del polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, la dosis en la administración por vía oral en el adulto (60 kg de
60 peso corporal) es normalmente de aproximadamente 0,1 a 100 mg/día, preferentemente de 0,1 a 50 mg/día. La dosis en la administración parenteral es de 0,01 a 50 mg/día, preferentemente de 0,01 a 10 mg/día, en términos de una inyección.
[0090] Una diana terapéutica por la composición farmacéutica es un sujeto de prueba en el que se ha detectado
la presencia del polinucleótido de la presente invención y/o el polipéptido de la presente invención. La sustancia que inhibe el polipéptido de la presente invención mata células que se han transformado debido al polinucleótido de fusión de EML4-ALK. Por tanto, la sustancia que inhibe el polipéptido de la presente invención sirve de agente terapéutico eficaz para cáncer (particularmente, cáncer de pulmón) que se muestra que es positivo para el polinucleótido de la
5 presente invención.
[Ejemplos]
[0091] La presente invención se describirá en detalle a continuación mediante ejemplos, pero las presentes
10 invenciones no se limitan a estos ejemplos. Además, a menos que se indique lo contrario, el procedimiento de la presente invención puede llevarse a cabo según procedimientos públicamente conocidos. Por tanto, los reactivos y kits comercialmente disponibles pueden usarse según las instrucciones de los productos comerciales.
[0092] Un ADNc de ALK de longitud completa fue amablemente suministrado por el Dr. Steve Morris del St. Jude
15 Children's Research Hospital. Además, este proyecto de investigación fue aprobado por el comité ético para el estudio de análisis de genes en la Universidad de Medicina de Jichi.
[0093] El anticuerpo anti-ALK fosforilada y el anticuerpo anti-ALK usados fueron producidos por Cell Signaling Tecnology Inc. y NEOMARKERS Inc., respectivamente.
20
[Ejemplo 1]
Aislamiento del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1
25 (1) Construcción de la biblioteca de ADNc
[0094] Usando un kit de purificación de ARN (RNeasy Mini Column; Qiagen Inc.), el ARN se extrajo de un espécimen extirpado de adenocarcinoma de pulmón de un hombre de 62 años que dio consentimiento informado y el ADNc se sintetizó usando transcriptasa inversa (Power Script Reverse Transcriptase) y cebadores (un oligonucleótido 30 de SEQ ID NO: 42 y cebador CDS IIA) (todos de Clontech Inc.). Después de amplificar selectivamente el ADNc de longitud completa mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (17 ciclos de 98ºC durante 10 segundos y 68ºC durante 6 minutos) usando un cebador (5'-PCR primer IIA; Clontech Inc.) y una polimerasa (ADN polimerasa PrimeSTAR HS, Takara Bio Inc.), un adaptador BstX1 (Invitrogen Co.) se unió a ambos extremos del ADNc. El ADNc así obtenido se ligó a un plásmido de retrovirus y se construyó una biblioteca de plásmidos de retrovirus introduciendo
35 este plásmido en E. coli DH10B (Invitrogen Inc.). Como resultado se ha construido satisfactoriamente la biblioteca de plásmidos que contiene clones, más de 1.500.000 unidades formadoras de colonias en total.
(2) Ensayo de formación de focos
40 [0095] Se transfectaron 2 µg del plásmido de la biblioteca descrita anteriormente y 0,5 µg de un plásmido para encapsidación (pGP y pE-eco, que se obtuvieron ambos de Takara Bio Inc.) con células de encapsidación BOSC23 usando un reactivo de transfección. Dos días después de la transfección, el sobrenadante de cultivo se recuperó como una disolución de biblioteca de retrovirus recombinantes, se mezcló con polibreno (Sigama Inc.) a una concentración de 4 µg/ml y la mezcla se añadió a células 3T3 de ratón a MOI (multiplicidad de infección) de concentración 0,1. Dos días
45 después, el sobrenadante de cultivo de células 3T3 se cambió por medio DMEM-F12 (Invitrogen Inc.) complementado con suero bovino al 5% (Invitrogen Inc.) y L-glutamina 2 mM, y las células se cultivaron 2 semanas más para obtener 10
o más tipos de focos transformados. Después de aislar cada clon de células 3T3, el cultivo de los clones continuó por separado y el ADN genómico de cada clon se extrajo. El ADNc viral integrado en cada clon de 3T3 se amplificó y se recuperó llevando a cabo PCR (30 ciclos de 98ºC durante 10 segundos y 68ºC durante 6 minutos) usando 10 ng del
50 ADN genómico como molde, cebador 5'-PCR primer IIA y ADN polimerasa (ADN polimerasa PrimeStar HS; Takara Bio Inc.) y se clonó en el vector pT7Blue-2.
[0096] Uno de los ADNc así obtenidos tenía una longitud de 3926 pares de bases (SEQ ID NO: 1) y tenía un único marco de lectura abierto (de la base 271 a 3447 de SEQ ID NO: 1) que codificaba una proteína que tenía 1059 55 residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 2; una secuencia novedosa de longitud completa). Aproximadamente la mitad del extremo amino de SEQ ID NO: 2 (residuos de aminoácidos 1-496 de SEQ ID NO: 2) se apareó perfectamente con los residuos de aminoácidos 1-496 de la proteína 4 similar a proteína asociada a microtúbulos equinodermos; EML4 (nº de registro de GenBank NM_019063), y por otra parte, aproximadamente la mitad del extremo carboxilo (residuos de aminoácidos 497-1059 de SEQ ID NO: 2) se apareó perfectamente con la secuencia de aminoácidos de cinasa de 60 linfoma anaplásico; ALK (nº de registro de GenBank AB209477). Por tanto, en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, el 99,9% de las bases 35-1759 se aparearon con las bases 1-1725 del ADNc de EML4 humano informado, y las bases 1760-3677 de SEQ ID NO: 1 se aparearon con las bases 3613-5530 de ADNc de ALK humano al 99,9%. Aunque las secuencias respectivas son un poco diferentes de las secuencias de bases informadas, ninguna de estas diferencias conduce a la sustitución de aminoácidos y, por tanto, puede ser posible que sean polimorfismo de secuencias de genes.
De los resultados anteriores, se creyó que el ADNc presente era un ADNc fusionado entre una parte de ADNc de EML4 y una parte de ADNc de ALK. Además, el ADNc obtenido (SEQ ID NO: 1) contuvo un dominio de tirosina cinasa ALK.
[Ejemplo 2]
5
Confirmación del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1
[0097] El gen EML4 y el gen ALK en seres humanos están ambos mapeados en el brazo corto del segundo cromosoma en direcciones opuestas (dirección de cabeza a cabeza). Para producir el polinucleótido de fusión de EML410 ALK encontrado en el ejemplo 1 se necesita cortar los genomas respectivos en el intrón aguas abajo del exón 13 del gen EML4 y el intrón aguas arriba del exón 21 del gen ALK y religarlos con el gen en la dirección inversa. Para investigar esto directamente, la PCR (después de 94ºC durante 1 minuto, 40 ciclos de 98ºC durante 20 segundos y 68ºC durante 9 minutos) se llevó a cabo usando cebadores que tenían las secuencias de bases de SEQ ID NO: 40 (una secuencia diseñada en la cadena de transcripción del extremo 3' del exón 13 del gen EML4) y SEQ ID NO: 36 (una
15 secuencia diseñada en la cadena complementaria del exón 21 del gen ALK), moldes de ADN genómico de un paciente (ID 33) y el ADN genómico de control (el ADN genómico de monocitos periféricos de hembra sana normal (46, XX)) y ADN polimerasa (LA Taq polimerasa; Takara Bio Inc.).
[0098] Como resultado, como se muestra en la FIG. 1, se obtuvo un producto de PCR que tenía
20 aproximadamente 4 kpb de longitud sólo con el ADN genómico del presente paciente. Es decir, se confirmó como se esperaba que en el nivel genómico el gen EML4 y el gen ALK se cortaron en los intrones y se religaron en la dirección inversa. Además, este producto de PCR de aproximadamente 4 kpb se clonó en un vector pT7Blue-2 (Novagen Inc.) y se determinó la secuencia de bases total. Era evidente que los cortes se localizaron aproximadamente a 3,6 kpb aguas abajo del exón 13 del gen EML4 y 297 pb aguas arriba del exón 21 del gen ALK. La secuencia de bases se muestra en
25 SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 4 es una secuencia genómica que incluye el punto de fusión del gen EML4 y el gen ALK.
[Ejemplo 3]
Cribado del polinucleótido de fusión de EML4-ALK en especímenes clínicos
30
(1) Detección del polinucleótido de fusión de EML4-ALK usando ADNc
[0099] Los ADNc se sintetizaron a partir de 33 casos de especímenes clínicos (especímenes extirpados de cáncer de pulmón de células no pequeñas) incluyendo el caso (ID 33) usado en el presente Ejemplo 1 y 2 y de
35 monocitos periféricos de un caso de un sujeto sano normal (46, XX).
[0100] Para detectar el ADNc del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, la PCR (50 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto) se llevó a cabo usando un kit de PCR cuantitativa (QuantiTect SYBR Green; Qiagen Inc.), los ADNc como sustratos preparados a partir de los especímenes clínicos y el 40 sujeto sano normal descrito anteriormente y oligonucleótidos de SEQ ID NO: 8 y 9 como cebadores. Usando los mismos especímenes, las amplificaciones por PCR del ADNc de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (en lo sucesivo GAPDH) se probaron como control. Para detectar el ADNc de GAPDH, los oligonucleótidos que están constituidos por las secuencias de nucleótidos representadas por SEQ ID NO: 10 y 11 se usaron como cebadores. Las muestras respectivamente amplificadas se sometieron a electroforesis con un ADN marcador de tamaño (marcador: escala de 50 45 pb, Invitrogen Inc.). Como resultado, como se muestra en la parte superior de la Fig. 2, en los 3 casos en total que incluyen ID 33 se detectó el ADNc del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1. Además, en todos los casos analizados se confirmó claramente una amplificación del ADNc de GAPDH (parte inferior de la Fig. 2). Además, se analizó la secuencia de bases de los productos de PCR identificados en los casos de ID 20 y ID 39 y el resultado confirmó que la secuencia era idéntica a la de ID 33 (los 247 pb que incluyen el punto de fusión del gen EML4 y el gen ALK. SEQ ID
50 NO: 14). Es decir, el resultado de los análisis de los 33 casos de cáncer de pulmón de células no pequeñas confirmó que la fusión del gen EML4 y el gen ALK se produce en el 9,1% de los casos (3/33 casos).
[0101] Se ha sabido que la mutación en el gen EGFR es una de las causas de cáncer de pulmón. En los 33 especímenes de los casos analizados como se describe anteriormente, el análisis de la presencia de una anomalía en
55 la secuencia de bases del gen EGFR según el procedimiento conocido confirmó una deleción parcial del exón 19 en 6 casos. Los casos que tienen la mutación del gen EGFR y los casos positivos para el polinucleótido de fusión de EML4-ALK pertenecieron a diferentes subgrupos. Es decir, se espera que los agentes terapéuticos existentes para cáncer de pulmón, que son los agentes terapéuticos para el cáncer de pulmón producido por la mutación en el gen EGFR, no sean eficaces para los pacientes con cáncer de pulmón que son positivos para el polinucleótido de fusión de EML4-ALK.
60 [0102] Por tanto, los 33 cases analizados como se describe anteriormente se sometieron a la investigación tanto si existió como si no el gen ALK de longitud completa y se encontró que existía en 8 casos. Los especímenes de los 7 casos entre estos 8 casos no contenían el polinucleótido de fusión de EML4-ALK (es decir, el gen ALK de longitud completa no existía en 2 casos entre los 3 casos en los que era positivo el polinucleótido de fusión de EML4-ALK).
[0103] Además, los análisis de 42 casos de otros casos de cáncer de pulmón de células no pequeñas por un procedimiento similar como se describe anteriormente dieron productos de PCR de aproximadamente 1 kpb en el 4,8% de los casos (2/42 casos), que son más largos que los detectados en los casos de los casos ID 33, ID 20 y ID 39. Éstos 5 se clonaron en el vector pT7Blue-2 y se analizó la secuencia de bases. Los resultados indicaron que éstos no eran el exón 13 del gen EML4, pero sí un producto de fusión del exón 20 del gen EML4 y el exón 21 del gen ALK (SEQ ID NO: 3). Es decir, en estos productos el fragmento del gen ALK fusionado era el mismo, pero el punto de escisión en el EML4 era diferente. La secuencia de ADNc del gen de fusión del exón 1-20 del gen EML4 y el exón 21-30 del gen ALK, que contiene el punto de fusión del gen EML y el gen ALK encontrado en SEQ ID NO: 3, se muestra en SEQ ID NO: 6, y la
10 secuencia de aminoácidos del polipéptido así codificado se muestra en SEQ ID NO: 7. En la presente descripción, el polinucleótido que codifica la proteína constituida por el polipéptido representado por SEQ ID NO: 7 se llama el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2. El plásmido producido aquí en el que un fragmento parcial del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 se clona se designa EML4-ALKv2 parcial/pT7Blue-2.
15 (2) Detección del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 usando ADN genómico
[0104] Resultó que la presencia del polinucleótido de fusión de EML4-ALK puede detectarse en muestras obtenidas de los sujetos de prueba por PCR usando las muestras de ADN genómico extraídas de los especímenes clínicos (especialmente el tejido de pulmón) de los sujetos de prueba como Ejemplo 2. Por tanto, como se muestra más 20 adelante, la detección del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 se probó usando diversos cebadores. Usando 1 ng del vector pT7Blue-2 como molde, en el que se clonó el producto de PCR de aproximadamente 4 kpb producido como se describe anteriormente, y usando un conjunto de cebadores [SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y 25 SEQ ID NO: 32, o SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34], la PCR (30 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto) se llevó a cabo mediante una ADN polimerasa (ADN polimerasa rTaq; Takara Bio Inc.). Los resultados indicaron que en cada PCR se amplificó un fragmento de ADN monocatenario que tenía un tamaño esperado (de aproximadamente 270 a 380 pb). De los resultados anteriores es evidente que la detección del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 es posible llevando a cabo la PCR usando el ADN genómico extraído de los
30 especímenes clínicos como molde y diversos conjuntos de cebadores que se piensa que detectan específicamente la presencia del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1.
(3) Detección del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 usando ADN genómico
35 [0105] Se diseñaron un oligonucleótido que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 35 en el exón 20 de EML4 y un oligonucleótido que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 36 en el lado complementario del exón ALK 21 como cebador sentido y cebador antisentido, respectivamente. Usando éstos y usando el ADN genómico de un paciente (ID#KL-3121) como molde en el que se detectó el ADNc del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2, la PCR (después de 94ºC durante 1 minuto, 40 ciclos de 98ºC durante 20 segundos y 68ºC durante 6
40 minutos) se llevó a cabo con una ADN polimerasa (LA Taq polimerasa; Takara Bio Inc.). Como resultado se obtuvo un producto de PCR de aproximadamente 850 pb. El producto de PCR se clonó en el vector pT7Blue-2, la secuencia de bases se determinó y se obtuvo una secuencia de 853 pb mostrada en SEQ ID NO: 5. Los análisis de la secuencia revelaron que los 35 pb localizados en el extremo 3' del exón 20 de EML4 y los 544 pb de la secuencia de intrones aguas abajo del exón 20 de EML4 se ligaron a los 233 pb de la secuencia de intrones aguas arriba del exón 21 de ALK
45 y los 41 pb localizados en el extremo 5' del exón 21 de ALK. Es decir, es evidente que la escisión del genoma se produjo en una localización 544 pb aguas abajo del exón 20 de EML4 y en una localización 233 pb aguas arriba del exón 21 de ALK. Usando 1 ng de vector pT7Blue-2 como molde, en que se clonó el producto de PCR de 853 pb preparado como se describe anteriormente, y usando un conjunto de cebadores [SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 45 y SEQ
50 ID NO: 24, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54, o SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 34], la reacción de PCR se llevó a cabo bajo las mismas condiciones que las del Ejemplo 3(2). Como resultado, en cada PCR se amplificó un fragmento de ADN monocatenario que tenía el tamaño esperado (de aproximadamente 270 a 380 pb). De los anteriores resultados resulta que la detección de la presencia del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 es posible llevando a cabo la PCR usando el
55 ADN genómico extraído de los especímenes clínicos como molde y los conjuntos de cebadores que se piensa que detectan específicamente el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2.
[Ejemplo 4]
60 Procedimiento para detectar ARNm del polinucleótido de fusión de EML4-ALK
(1) Construcción del vector de expresión del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 y clonación del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2
[0106] A partir del clon en el que se clonó el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 en la dirección positiva (designado EML4-ALKv1/pT7Blue-2), el inserto se sacó digiriendo con enzimas de restricción EcoRI y SalI y se subclonó en los sitios EcoRI-SalI de pMXS (JBC 275, 24945-24952, 2000). Éste se designó EML4-ALKv1/pMS. Por tanto, el ADNc de las bases 277-3450 de la SEQ ID NO: 1 que tiene los sitios en ambos extremos que son reconocidos 5 por la enzima de restricción EcoRI se amplificó llevando a cabo la PCR (25 ciclos de 98ºC durante 10 segundos, 68ºC durante 5 minutos) usando el plásmido EML4-ALKv1/pT7Blue-2 como molde y oligonucleótidos que están constituidos por la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60 como cebadores y una ADN polimerasa (ADN polimerasa PrimeStar HS). Después de digerir con EcoRI, éste se introdujo en el sitio EcoRI de un vector de expresión pcDNA3, que se modifica de manera que el inserto pueda expresarse con una marca FLAG añadida al 10 extremo N para producir un plásmido de expresión (FLAG-EML4-ALKv1/pcDNA3) para el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 que tiene la marca FLAG en el extremo N (denominado en lo sucesivo FLAG-EML4-ALKv1). Además, el ADNc de FLAG-EML4-ALKv1 se sacó de este vector digiriendo con enzimas de restricción HindIII y XbaI, y después de convertir ambos extremos en romos, un adaptador EcoRI-NotI-BamHI (Takara Bio Inc.) se ligó a ambos extremos. El producto se introdujo en el sitio EcoRI de un vector de expresión, mediante el cual el ADNc insertado y el antígeno de
15 superficie celular CD8 pueden expresarse al mismo tiempo (vector bicistrónico pMX-iresCD8; J. Biol. Chem. 2001, vol. 276, p39012-39020) para producir un vector de expresión que expresa tanto FLAG-EML4-ALKv1 como CD8. Éste se designó FLAG-EML4-ALKv1/pMX-iresCD8.
[0107] El polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 se clonó del siguiente modo.
20 [0108] Usando un polinucleótido de longitud completa de EML4 clonado en pT7Blue-2 según “Genomics”, (EE.UU.), 2000, vol. 68, pág. 348-350, como molde para obtener un fragmento de polinucleótido que codifica EML4 del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2, y usando un oligonucleótido representado por SEQ ID NO: 57, en el que una secuencia de escisión de EcoRI está unida al extremo 5' del codón de iniciación ATG del exón 1 del gen EML4, y un
25 oligonucleótido representado por SEQ ID NO: 58, cuya secuencia está constituida por 10 bases del extremo 5' de la secuencia antisentido del exón 21 del gen ALK fusionado al extremo 5' de la secuencia antisentido a las 20 bases del 3' extremo del exón 20 del gen EML4, respectivamente, como cebadores sentido y antisentido, y usando una ADN polimerasa (ADN polimerasa Pyrobest; Takara Bio Inc.), la PCR (25 ciclos de 94ºC durante 20 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto) se llevó a cabo para obtener un producto de PCR de aproximadamente 2260 pb.
30 Este producto se designó producto de PCR A.
[0109] Mientras que se usa el EML-ALKv1/pTBlue-2 producido en el presente Ejemplo 4(1) como molde para obtener el fragmento de polinucleótido de ALK del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2, y usando un oligonucleótido representado por SEQ ID NO: 101, la secuencia que está constituida por las 10 bases de la secuencia 35 sentido en el extremo 3' del exón 20 del gen EML4 fusionado al extremo 5' de las 20 bases de la secuencia sentido en el extremo 5' del exón 21 del gen ALK y un oligonucleótido representado por SEQ ID NO: 102, en el que la secuencia de escisión Xba I está unida al extremo 5' del área de la secuencia antisentido que contiene el codón de terminación presente en el exón 30 del gen ALK como cebadores sentido y antisentido, respectivamente, la PCR se llevó a cabo bajo la misma condición que para obtener el producto de PCR A para obtener un producto de PCR de aproximadamente
40 1700 pb. Este se designó el producto de PCR B.
[0110] Los productos de PCR A y B descritos anteriormente se mezclaron y se llevaron a cabo reacciones de hibridación y extensión (3 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos y 30 segundos) usando una ADN polimerasa (ADN polimerasa Pyrobest; Takara Bio Inc.) para obtener un producto de
45 aproximadamente 4000 pb. Este producto se clonó por TA en el vector pCR2.1-TOPO usando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen Inc.) y se analizó la secuencia de bases. Se obtuvo, como se muestra en SEQ ID NO: 6, que estuvo constituida por 2242 bases desde el codón de iniciación ATG del gen EML4 hasta el exón 20 y 1691 bases desde el exón 21 del gen ALK hasta el codón de terminación del exón 30.
50 (2) Procedimiento para detectar ARNm de polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 y v2
[0111] Usando 1 ng de FLAG-EML4-ALKv1/pMX-iresCD8 descrito en (1) como molde de polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 y 1 ng de EML4-ALKv2 parcial/ pT7Blue-2 en el ejemplo 3 como molde para el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2, y usando un conjunto de cebadores [conjunto de cebadores para el polinucleótido de fusión de EML455 ALK v1; (SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, o SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 80) y el conjunto de cebadores para el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2; (SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 y SEQ ID 60 NO: 70, SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 95 y SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97 y SEQ ID NO: 98, o SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 100)], la PCR (30 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto) se llevó a cabo por una ADN polimerasa (ADN polimerasa rTaq; Takara Bio Inc.). Como resultado, en todo el conjunto de cebadores se amplificó un fragmento de ADN monocatenario, teniendo cada uno el fragmento esperado (aproximadamente de 260 a 350 pb). De los resultados anteriores se confirmó que la
detección de la presencia del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 y/o v2 es posible llevando a cabo RT-PCR según el presente ejemplo usando ARNm extraído de las muestras de sujetos de prueba como molde.
[0112] Los resultados del Ejemplo 3 y 4(2) descritos anteriormente indicaron que la presencia del polinucleótido
5 de fusión de EML4-ALK v1 y v2 puede detectarse usando tanto ADNc como ADN genómico preparado a partir de los especímenes clínicos obtenidos de sujetos de prueba. Este hecho sugiere que los pacientes que tienen el polinucleótido de fusión de EML4-ALK pueden seleccionarse y que puede practicarse un tratamiento hecho a medida por lo que los pacientes que van a tratarse mediante la administración de inhibidores del polinucleótido de fusión de EML4-ALK y/o polipéptido se seleccionan de antemano y luego se tratan.
10
[Ejemplo 5]
Detección del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 en esputo
15 (1) Producción de células BA/F3 de ratón que expresan FLAG-EML4-ALKv1
[0113] Se produjo un retrovirus recombinante mediante un procedimiento similar al que se describe anteriormente usando FLAG-EML4-ALKv1/pMX-iresCD8 y un vector blanco (pMX-iresCD8) y con él se infectaron células BA/F3 de la línea celular linfática de ratón. Las células que expresan CD8 en la superficie celular se purificaron
20 simplemente usando reactivo de perlas magnéticas para la separación de células y una columna de purificación (perlas magnéticas unidas a anticuerpo monoclonal anti-CD8 y columna de purificación MiniMACS, ambas de Miltenyi Biotec Inc.).
(2) Detección del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 en esputo
25 [0114] Después de mezclar muestras de esputo de sujetos sanos normales con las células BA/F3 que expresan polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 (denominadas en lo sucesivo células BA/F3 que expresan v1) a 0/ml, 10 células/ml, 100 células/ml, 1000 células/ml y 10.000 células/ml, el ADNc se sintetizó por el procedimiento estándar. La presencia del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 en esputo se examinó llevando a cabo una reacción de PCR
30 (50ºC durante 2 minutos, 95 minutos durante 15 minutos y adicionalmente 40 ciclos de la siguiente reacción (94ºC durante 15 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto)) usando el ADNc descrito anteriormente como sustrato, y los oligonucleótidos que están constituidos por la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 como cebadores y un kit de PCR cuantitativa (QuantiTect SYBR Green; Qiagen Inc.), y se obtuvieron productos de PCR. Como resultado, en cada caso, excepto a 0/ml, pudo confirmarse la presencia del polinucleótido de
35 fusión de EML4-ALK v1.
[0115] Convencionalmente, el examen citopatológico usando muestras de esputo ha sido un importante procedimiento de diagnóstico para el diagnóstico de cáncer de pulmón. Este diagnóstico para cáncer de pulmón se basa en la presencia de células atípicas en esputo, pero no puede hacerse un diagnóstico fidedigno a menos que en el
40 esputo existan muchas células cancerosas de pulmón. Sin embargo, la mayor parte de las veces, tales casos ya estaban en el estado avanzado y fue casi imposible practicar un diagnóstico precoz eficaz para cáncer de pulmón. Según la presente invención, si el polinucleótido de fusión de EML4-ALK está presente en esputo, es evidente que puede detectarse por PCR incluso si hay una cantidad mínima.
45 [Ejemplo 6]
Investigación de la transformabilidad y tumorigenicidad del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1.
(1) Análisis del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1
50 [0116] El EML4-ALK (K589M)/pMXS, en el que el aminoácido 589 (sitio de unión a ATP), un residuo de lisina, del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se sustituyó con metionina, se produjo usando EML4-ALKv1/pMXS como sustrato y usando un kit de introducción de mutaciones (kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange; Stratagene Inc.). En la reacción se usaron oligonucleótidos de SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104. El ADNc de ALK (Morris, SW y
55 col., Science. 4 de marzo de 1994; 263 (5151):1281-4) se clonó con un vector de retrovirus pMXS según el procedimiento estándar (designado ALK/pMXS).
[0117] El EML4-ALKv1/pMXS descrito anteriormente, ALK/pMXS, un plásmido que expresa EML4-ALK (K589M)/pMXS y un vector blanco sin ADNc insertado (pMXS) se transfectaron en células de fibroblasto 3T3 mediante
60 el procedimiento de fosfato de calcio y se cultivaron durante 21 días. Como se muestra en la parte superior de la Fig. 3, sólo se observaron muchos focos de transformación cuando se transfectó el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 que expresa el vector. La barra de escala indica 100 µm. Además, las mismas células 3T3 transfectadas se inocularon subcutáneamente a ratones desnudos a 5 x 105 células/ratón y se observaron durante 20 días. También resultó que el tumor sólo se formó cuando se inoculó el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 que expresa células. Los números de
formación de tumores (el número de sitios de inoculación de células 3T3 y el número de formación de tumores entre ellas) son del siguiente modo. El número de formación de tumores de la expresión de longitud completa de ALK fue 0 entre 8, mientras que el número de formación de tumores en el polipéptido de fusión EML.4-ALK v1 que expresa células era 8 entre 8. Además, el número de formación de tumores de EML4-ALK (K589M) que expresa células era 0 entre 8.
5 Estos resultados demuestran que desde que la expresión del polipéptido de ALK de longitud completa no induce tumor, pero el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 es tumorigénico, el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 es el gen causal del cáncer. Por tanto, debido a que la tumorigenicidad de EML4-ALK no se observó en EML4-ALK (K589M), parecería que la tumorigenicidad dependía de la actividad de cinasa. En lo sucesivo, las células 3T3 en las que el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se expresa se designan células 3T3 que expresan v1.
10
(2) Análisis de diversos mutantes de deleción del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1
[0118] Los diversos mutantes de deleción (mutante de deleción ∆Basic (se delecionaron los aminoácidos 31-140 del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1), mutante de deleción ∆HELP (se delecionaron los aminoácidos 220-296 del 15 polipéptido de fusión de EML4-ALK v1), mutante de deleción ∆WD (se delecionaron los aminoácidos 305-475 del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1)) de la parte de EML4 del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 se prepararon mediante reacción de PCR usando FLAG-EML4-ALKv1/ pMX-iresCD8 como molde y usando un kit de clonación (mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR ExSite; Stratagene Inc.). Usando estos plásmidos de mutantes de deleción se prepararon disoluciones de retrovirus usando un procedimiento similar al del Ejemplo 1 para obtener 20 células 3T3 infectadas. Estas células infectadas respectivas se inocularon subcutáneamente a ratones desnudos para investigar la tumorigenicidad y se encontró que los tumores se formaron por células 3T3 que expresan el mutante de deleción ∆HELP y el mutante de deleción ∆WD. El número formador de tumores de células 3T3 respectivas que expresan el mutante de deleción ∆Basic, el mutante de deleción ∆HELP y el mutante de deleción ∆WD fue 0 entre 8, 7 entre 8 y 8 entre 8, respectivamente. Como no se observó formación de tumores en el mutante de deleción ∆Basic, se
25 demuestra que los aminoácidos 31-140 del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 son importantes en la tumorigénesis. Como parece que el polipéptido de fusión de EML4-ALK v2, al igual que el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1, contiene los aminoácidos 31-140 anteriormente mencionados y la región de cinasa ALK, se considera que el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2, al igual que el polinucleótido de fusión de EML4-ALK, es el gen causal del cáncer que codifica el polipéptido que tiene la transformabilidad y tumorigenicidad para células 3T3.
30
[Ejemplo 7]
Procedimiento de cribado para los inhibidores del polipéptido de fusión de EML4-ALK
35 (1) Preparación del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1
[0119] Las células BA/F3 que expresan v1 (Ejemplo 5(1)) se cultivaron en medio RPM1640 que contenía 10% de suero bovino fetal para obtener 2,7 × 109 células. Después de lavar 3 veces con PBS, las células se lisaron en una disolución de lisis (Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, Triton X100 al 1%, EDTA 5 mM, EGTA 5 mM, NaVO4 1 mM, 40 DTT 1 mM y mezcla completa de inhibidor de proteasa). El polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 presente en el sobrenadante obtenido después de una centrifugación se purificó usando gel de afinidad ANTI-FLAG M2 (SIGMA-ALDRICH Inc.) según el procedimiento descrito en el documento de información del producto. Para el lavado y la elución se usaron la disolución de lavado (Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 250 mM, Brij35 al 0,05%, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaVO4 1 mM, DTT 1 mM, completo) y la disolución de elución (Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, Brij35 al 0,05%,
45 DTT 1 mM, 0,5 mg/ml de péptido FLAG), respectivamente. La inmunotransferencia usando anticuerpo anti-ALK y anticuerpo anti-FLAG M2 (SIGMA-ALDRICH Inc.) y la tinción con plata se llevaron a cabo para el eluato para detectar el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1. Se demostró que el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 puede prepararse por este procedimiento.
50 (2) Detección de la actividad de cinasa in vitro del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1
[0120] El polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 purificado como se describe anteriormente se diluyó en una disolución de reacción (Tris-HCl 15 mM (pH 7,4), MgCl2 0,25 mM, Tween-20 al 0,01%, DTT 2 mM) y luego no se añadió ATP o se añadió ATP 20 µM. Las mezclas respectivas se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. 55 Después de la reacción, el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 autofosforilado y el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se detectaron por inmunotransferencia usando anticuerpo anti-ALK fosforilada que reconoce específicamente el producto fosforilado en el residuo de tirosina 1604 de ALK, y anticuerpo anti-ALK, y se cuantificaron por un sistema de análisis de imágenes (VersaDoc Imaging System; Bio-Rad Inc.). La cantidad de fosforilación se calibró dividiendo el recuento del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 autofosforilado entre el recuento del polipéptido de fusión de EML4
60 ALK v1. Como resultado, la banda del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 autofosforilado se detectó en la localización de aproximadamente 130 kDa bajo la condición de la adición de ATP, y la cantidad de fosforilación aumentó aproximadamente 205 veces en comparación con la no adición de ATP.
[0121] Además, la actividad de fosforilación frente a un sustrato peptídico se investigó usando un kit de detección
de actividad de cinasa (HTRF KinEASE-TK; Cisbio Inc.). Usando TK sustrate 1, que se incluyó en el kit, como sustrato y después de no añadir ATP o añadir ATP 100 µM, las mezclas se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora y el recuento de HTRF se detectó como se recomienda por el fabricante del kit. Como resultado es evidente que el recuento de HTRF (es decir, la fosforilación del sustrato peptídico) aumentó aproximadamente 12 veces mediante la
5 adición de ATP en comparación con la no adición de ATP. Como se muestra anteriormente, la actividad de cinasa in vitro del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 puede detectarse usando anticuerpo anti-ALK fosforilada y el kit de detección de actividad de cinasa.
(3) Efecto inhibitorio de compuestos frente a la actividad de cinasa in vitro del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1
10 [0122] El efecto inhibitorio del compuesto A-D contra la actividad de cinasa in vitro del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se investigó usando anticuerpo anti-ALK fosforilada y el kit de detección de actividad de cinasa. Los compuestos respectivos se añadieron a la disolución de reacción que contenía el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 a una concentración final de 10 µM o 10 nM, y luego la reacción se llevó a cabo con o sin la adición de ATP. El resto de
15 las operaciones se llevaron a cabo según el procedimiento (2) descrito anteriormente. En ausencia del compuesto se supuso que el recuento de fosforilación sin la adición de ATP y con la adición de ATP era el 100% de inhibición y el 0% de inhibición, respectivamente. La inhibición (%) de la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 por un compuesto se calculó por la siguiente fórmula.
20 [Inhibición de la actividad de cinasa (%) por un compuesto = (1-[recuento de fosforilación cuando se añadieron el compuesto y ATP – recuento de fosforilación cuando no se añadió el compuesto y no se añadió ATP]/[recuento de fosforilación cuando no se añadió el compuesto y se añadió ATP -recuento de fosforilación cuando no se añadió el compuesto y no se añadió ATP]) x 100
25 [0123] Como resultado se encontró que el compuesto A-D inhibió la actividad de fosforilación del polipéptido purificado de fusión EML4-ALK v1 de sí mismo y el sustrato peptídico (Tabla 1). El compuesto A y B podrían seleccionarse como sustancias que inhibieron la actividad del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 el 50% o más a una concentración de 10 µM o menos, y el compuesto C y D podrían seleccionarse como sustancias que inhibieron la actividad del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 el 50% o más a una concentración de 0,1 µM o menos.
30 Tabla 1
Compuesto
Concentración final Inhibición de la autofosforilación Inhibición del sustrato peptídico
A
10 µM 104% 99%
B
10 µM 68% 56%
C
10 nM 102% 99%
D
10 nM 96% 99%
[0124] Los resultados anteriores indicaron que el cribado (un cribado de tipo in vitro) de una sustancia que inhibe la actividad del polipéptido de la presente invención podría realizarse preparando el polipéptido de fusión de EML4-ALK y usando la actividad de cinasa in vitro como índice.
35 (4) Efecto inhibidor de los inhibidores del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 sobre la autofosforilación intracelular
(4-1) Células BA/F3
[0125] El compuesto A (1 µM, 5 µM y 10 µM) se añadió al medio de cultivo de células BA/F3 que expresan v1
40 (Ejemplo 5(1)) o no se añadió, y se cultivó durante 3 horas. Además, las células BA/F3 que expresan FLAG-EML4-ALKv1(K589M) se produjeron usando el vector pMX-iresCD8 en el que se integró EML4-ALK (K589M) de manera que pudiera añadirse FLAG, y se cultivaron. Después del cultivo, las células se contaron y el nivel de fosforilación de tirosina del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se midió mediante inmunotransferencia usando anticuerpo anti-ALK fosforilada. Además, para la misma membrana de transferencia se llevó a cabo el análisis de inmunotransferencia por
45 anticuerpo anti-marca FLAG (Eastman Kodak Inc.) y se midió la cantidad de proteína total del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 unido a FLAG. Como se muestra en la parte superior de la Fig. 4, el nivel de fosforilación de la tirosina del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se detectó en células BA/F3 que expresan v1, pero no se detectó la fosforilación de tirosina cuando se expresó EML4-ALK (K589M). Este hecho indica que la fosforilación de tirosina del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 detectada en células BA/F3 es una autofosforilación por el propio polipéptido de fusión de
50 EML4-ALK v1. Por tanto, se ha confirmado que el compuesto A inhibe la autofosforilación intracelular del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 en un modo dependiente de la concentración. Además, se ha mostrado que la cantidad de expresión de la propia proteína del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 ha sido casi constante en todas las muestras (FIG. 4, parte inferior).
55 [0126] El efecto inhibitorio del compuesto B-D sobre la autofosforilación intracelular se examinó en un modo similar como se describe anteriormente. Sin embargo, el tiempo de cultivo después de la adición de los compuestos fue 6 horas, y la cantidad de proteína total del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se midió usando anticuerpo anti-ALK. Además, la cantidad de fosforilación se calculó cuantificando como en el Ejemplo 7(2). Por tanto, para el compuesto A,
la cantidad de fosforilación se calculó cuantificando en el experimento bajo esta condición. La velocidad de inhibición se calculó a partir de la cantidad de fosforilación cuando el compuesto se añadió, usando como control el valor cuando el compuesto no se añadió (se añadió el disolvente del compuesto, DMSO) (0% de inhibición). Cada compuesto inhibió claramente la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 en células BA/F3 (Tabla 2). El compuesto A
5 y B pueden seleccionarse como la sustancia que inhibe la actividad del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 el 50% o más a una concentración de 10 µM o menos, y el compuesto C y D pueden seleccionarse como la sustancia que inhibe la actividad del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 el 50% o más a una concentración de 0,1 µM o menos, y se ha demostrado que las sustancias que inhiben la actividad del polipéptido de la presente invención pueden cribarse (cribado basado en células).
(4-2) células 3T3
[0127] En un modo similar a en (4-1), excepto que los compuestos A-D se añadieron a células 3T3 que expresan v1 (Ejemplo 6(1)) a 10 µM o 10 nM y se cultivaron durante 4 horas, se midieron la cantidad de fosforilación de tirosina 15 del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 y la cantidad de proteína total del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 y se calculó la velocidad de inhibición de los compuestos respectivos en la actividad de cinasa intracelular. Cada compuesto inhibió claramente la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 en las células 3T3 que expresaban v1 (Tabla 2). Es evidente que pueden usarse diversas células tales como células BA/F3, células 3T3 y similares como células que expresan el polipéptido de la presente invención en el procedimiento de cribado basado en células de la
20 presente invención.
Tabla 2
Compuesto
Concentración final Inhibición de la autofosforilación (células BA/F3) Inhibición de la autofosforilación (células 3T3)
A
10 µM 74% 82%
B
10 µM 77% 49%
C
10 nM 84% 77%
D
10 nM 90% 86%
[Ejemplo 8]
25 Efecto inhibitorio del crecimiento de los inhibidores del polipéptido de fusión de EML4-ALK sobre células que expresan el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1
(1) Potencial de crecimiento de BA/F3 que expresan v1
30 [0128] Para el crecimiento de células BA/F3 que sólo expresan la proteína CD8 (Ejemplo 5(1)), las células BA/F3 que expresan CD8, además de ALK, el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 (Ejemplo 5(1)) o la EML4-ALK (K589M) deficiente en actividad de cinasa, se contó el cambio en el número de células empezando en 8 × 105 células en el transcurso de tiempo en presencia o ausencia de un factor de crecimiento IL-3. Los resultados se muestran en la FIG. 5.
35 Las células BA/F3 que expresan v1 pueden crecer con o sin IL-3. Sin embargo, las células BA/F3 que sólo expresan CD8 crecieron en presencia de IL-3, pero murieron rápidamente cuando se eliminó la IL-3. Este hecho indica que el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 tiene una actividad como oncogén. Además, las células que expresan la ALK humana de longitud completa y las células BA/F3 que expresan EML4-ALK (K589M) que carecen de actividad de cinasa murieron similarmente en ausencia de IL-3. Estos resultados indican que las células obtienen el potencial de
40 crecimiento, incluso en ausencia del factor de crecimiento, expresando el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 y que el potencial de crecimiento depende de la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1. Las células BA/F3 que expresan la ALK de longitud completa se obtuvieron según el Ejemplo 5 (1).
(2) Efecto inhibidor del crecimiento de los inhibidores del polipéptido de fusión de EML4-ALK sobre células BA/F3 que 45 expresan v1
[0129] A continuación, el compuesto A, que es una sustancia que inhibe el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1, se añadió a células BA/F3 que obtuvieron el potencial de crecimiento independiente de IL-3 expresando el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1, y se investigó su efecto sobre el crecimiento celular. Cuando el compuesto A se
50 añadió a 1 µM, 5 µM o 10 µM, o no se añadió (0 µM) al control, se midieron las células BA/F3 que expresan CD8, que crecen en presencia de IL-3, y el crecimiento celular, las células pudieron crecer aunque se observó una ligera inhibición del crecimiento como se muestra en la FIG. 6(a). Por otra parte, cuando el compuesto A se añadió a células BA/F3 que expresan v1 que estaban en crecimiento en ausencia de IL-3, el crecimiento celular se inhibió marcadamente por la dependencia de la concentración del compuesto A y se indujo muerte celular como se muestra en la FIG. 6(b). Es decir,
55 se confirmó que las células, que crecen independientemente en el polinucleótido de fusión de EML4-ALK (oncogén), fueron destruidas por un inhibidor del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1.
(3) Efecto inhibitorio de los inhibidores del polipéptido de fusión de EML4-ALK sobre el crecimiento independiente del
anclaje de células que expresan el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 y el polipéptido de ALK de longitud completa
[0130] Se sabe que la medición del crecimiento celular independiente del anclaje (procedimiento de colonias, etc.) es un sistema para investigar un efecto antitumoral (efecto farmacológico) de compuestos (Clinical Oncology, 5 segunda edición, Cancer and Chemotherapy Publishers Inc.). En lugar del procedimiento de colonias, hay un siguiente procedimiento que usa placas esferoides para medir el crecimiento de células no unidas.
[0131] Las células 3T3 que expresan v1 (Ejemplo 6(1)) y una de las células de glioma humano que expresan el polipéptido de ALK de longitud completa y que no expresan el polinucleótido de fusión de EML4-ALK endógenamente, 10 células U-87MG, se sembraron en una placa esferoide de 96 pocillos (Sumilon Celltight Spheroid 96U, Sumitomo Bakelite Inc.) a 3000 células por pocillo en un medio que contenía 10% de suero bovino fetal (DMEM para células 3T3 que expresan v1 y RPMI 1640 para U-87MG). Bajo 5% de CO2, las células se cultivaron durante la noche a 37ºC y luego se añadió el compuesto A o B a una concentración final de 10 µM, el compuesto C o D se añadió a una concentración final de 10 nM y como control negativo se añadió el disolvente de los compuestos, DMSO, para dar la 15 misma concentración que los compuestos. Al mismo tiempo, las células se contaron antes de la adición de los fármacos (día 0). Entonces, las células se cultivaron bajo 5% de CO2, a 37ºC durante 3 días, se mezclaron con un reactivo para medir el número de células (ensayo de viabilidad luminiscente CellTiter-Glo ™; Promega Inc.), se agitaron durante 20 minutos y las mediciones (día 3) se llevaron a cabo usando un luminómetro (luminómetro de placas de microtitulación ML3000; Dynatech Laboratories Inc.). Los resultados muestran que todos los compuestos tenían actividad inhibitoria del
20 crecimiento en células 3T3 que expresan v1, pero casi no tenían actividad inhibitoria en células U-87MG. La velocidad de inhibición de los compuestos se calculó suponiendo que el número de células en el día 0 y el día 3 era el 100% de la inhibición y el 0% de la inhibición, respectivamente (Tabla 3).
Tabla 3
Compuesto
Concentración final Células 3T3 que expresan v1 Célula U-87MG
A
10 µM 106% 15%
B
10 µM 91% 34%
C
10 nM 131% -2%
D
10 nM 135% -2%
25 [0132] Los resultados anteriores indican que el compuesto A-D inhibió el crecimiento celular independiente del anclaje de células 3T3 que expresan v1 inhibiendo la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1. Además, es evidente que estos compuestos no pudieron inhibir el crecimiento celular independiente del anclaje de células U-87MG que expresan el polipéptido de ALK de longitud completa. Estos resultados indican que los inhibidores del polipéptido de fusión de EML4-ALK pueden inhibir el crecimiento de células cancerosas y tumores que expresan el
30 polipéptido de fusión de EML4-ALK.
(4) Preparación de ARNip para el polinucleótido de fusión de EML4-ALK-v1
[0133] Los ARNip, que estuvieron compuestos por una cadena de transcripción que está constituida por las
35 secuencias de bases representadas por SEQ ID NO: 111, 113, 115, 117, 119 ó 121 y una cadena complementaria que está constituida por las secuencias de bases representadas por SEQ ID NO: 112, 114, 116, 118, 120 ó 122, se prepararon como los ARNip (ARNip-1 a ARNip-6) que tenían el 100% de homología con el área de fusión del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 y se espera que tengan actividad inhibitoria sobre la expresión del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1. Además, los ARNip compuestos por una cadena de transcripción que está constituida por las secuencias
40 de bases representadas por SEQ ID NO: 123 ó 125 y una cadena complementaria que está constituida por la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 124 ó 126 se diseñaron y se prepararon como los ARNip (ARNip-7, ARNip-8) que muestran el 100% de homología con el área de ALK del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 y se espera que tengan un efecto inhibitorio sobre la expresión del gen ALK, usando un sistema de diseño de secuencias de ARNip (Commercial siDirect (marca registrada) RNAi Inc.). Se ha confirmado por el sistema de diseño de secuencias de ARNip
45 (Commercial siDirect (marca registrada) RNAi Inc.) que las secuencias de bases correspondientes a los ARNip-1 a siRN-8 no muestran el 100% de homología con el gen distinto del polinucleótido de fusión de EML4-ALK y los genes ALK. Para los experimentos de control para investigar la influencia de ARNip no específica, el ARNip compuesto por una cadena de transcripción que está constituida por una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 127 y una cadena complementaria que está constituida por una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 128 se preparó
50 como ARNip (ARNip-9) correspondiente a una secuencia de bases no presente en células de mamífero. El ARNip-1 es un producto de hibridar SEQ ID NO: 111 (cadena de transcripción) y SEQ ID NO: 112 (cadena complementaria), y el ARNip-2 y otros son los mismos (FIG. 7).
(5) Efecto inhibitorio de ARNip sobre la expresión de ARNm del polinucleótido de fusión de EML4-ALK y el gen ALK en 55 células que expresan el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 y ALK de longitud completa
[0134] Las células 3T3 que expresan v1 y las células U-87MG se sembraron en placas de 12 pocillos (IWAKI; Asahi techno glass corp.) a 50.000 células y 150.000 células, respectivamente. Cuatro horas después, usando un reactivo de transfección (Lipofectamine RNAiMax; Invitrogen Inc.), los ARNip-1 a ARNip-9 se prepararon a una
concentración final de 20 nM y se transfectaron en células según la instrucción adjunta. Además, como control se prepararon muestras de transfección sin ARNip. Después de 72 horas, el ARN total se extrajo y se preparó ADNc.
[0135] La cantidad de ARNm expresado del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 en células 3T3 que
5 expresan v1 y la cantidad de ARNm del gen ALK en células U-87MG se cuantificaron usando un reactivo de PCR cuantitativa (Power SYBR Green PCR Master Mix; Applied Biosystems Inc.) La reacción de PCR se llevó a cabo del siguiente modo: después de 10 minutos de incubación a 95ºC, 45 ciclos de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 60 segundos, y luego un ciclo de 95ºC durante 15 segundos, 60ºC durante 15 segundos y 95ºC durante 15 segundos hasta completar la reacción. Además, para calibrar la cantidad de expresión, la cantidad de expresión del gen de
10 ciclofilina B de ratón y el gen GAPDH humano se cuantificó similarmente para las células 3T3 que expresan v1 y las células U-87MG, respectivamente. Los análisis se llevaron a cabo usando un detector de secuencias (sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7900; Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc.).
[0136] Los oligonucleótidos que están constituidos por las secuencias de bases representadas por SEQ ID NO:
15 44 y 48, SEQ ID NO: 50 y 56, SEQ ID NO: 44 y 48 y SEQ ID NO: 12 y 13 se usaron como conjuntos de cebadores que reconocen específicamente el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, el gen de ciclofilina B de ratón, el gen ALK humano y el gen GAPDH humano. Por tanto, para obtener una curva patrón para calcular la cantidad de ARNm respectivo, la PCR se realizó usando ADN genómico humano (Clontech) como molde para el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, el gen ALK humano y el gen GAPDH humano, y usando ADN genómico de ratón (Clontech) como molde
20 para la ciclofilina B de ratón y los conjuntos de cebadores anteriormente mencionados bajo la misma condición. Como se usó un conjunto de cebadores correspondiente al exón 29 del polinucleótido de ALK humano para detectar el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, la curva patrón puede obtenerse usando ADN genómico humano. La cantidad de expresión del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 y el gen ALK humano en muestras respectivas se calibró con la cantidad de expresión del gen de ciclofilina B de ratón y el gen GAPDH humano para obtener la cantidad de
25 expresión calibrada. Además, suponiendo que la cantidad de expresión calibrada respectiva del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 y el gen ALK humano en ausencia de ARNip fuera del 100%, se determinó la cantidad de expresión relativa de la cantidad de expresión calibrada del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 y el gen ALK humano y se calculó la velocidad de inhibición para la expresión cuando se transfectaron los ARNip respectivos (Tabla 4). [0137] Como resultado, los ARNip-1 a ARNip-8, que se corresponden con el polinucleótido de fusión de EML4
30 ALK v1, inhibieron la expresión del polinucleótido de fusión de EML4-ALK el 50% o más. Para el gen ALK humano, los ARNip-7 y ARNip-8, que se corresponden con el gen ALK humano, inhibieron el 50% o más. El control negativo, ARNip9, no demostró un fuerte efecto inhibitorio de la expresión sobre el polinucleótido de fusión de EML4-ALK y el gen ALK humano. Estos resultados demuestran que pueden cribarse las sustancias que inhiben la expresión del polinucleótido de fusión de EML4-ALK.
35
Tabla 4
ARNip
Velocidad de inhibición de la expresión del gen EML4-ALK (células 3T3 que expresan v1) Velocidad de inhibición de la expresión del gen ALK (células U87MG)
ARNip-1
80% -12%
ARNip-2
66% 11%
ARNip-3
62% 10%
ARNip-4
86% 22%
ARNip-5
76% -22%
ARNip-6
69% 15%
ARNip-7
67% 66%
ARNip-8
70% 58%
ARNip-9
29% -31%
No se introdujo ARNip
0% 0%
(6) Efecto inhibitorio de ARNip sobre la expresión y la autofosforilación del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 en células 3T3 que expresan v1.
[0138] Mediante el procedimiento similar descrito antes, las células 3T3 que expresan v1 se sembraron en placas de 12 pocillos a 50.000 células por pocillo y 4 horas después se transfectaron ARNip-1 a ARNip-9. Además, las células en las que no se transfectó ARNip se prepararon como control. Después de 72 horas de la transfección, el medio se eliminó y la autofosforilación del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 intracelular y la cantidad de proteína del
45 polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se cuantificaron por el procedimiento similar al del Ejemplo 7(4). Por tanto, para confirmar que la cantidad de proteína total en cada muestra era la misma para la medición, la proteína de actina se cuantificó usando anticuerpo anti-actina (SIGMA-ALDRICH Inc.). Los ARNip-1 a ARNip-8 inhibieron claramente la expresión del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 y la actividad de cinasa en las células 3T3 que expresan v1.
(7) Efecto inhibitorio del crecimiento de ARNip sobre células 3T3 que expresan v1 y células que expresan ALK de 50 longitud completa
[0139] La velocidad de inhibición del crecimiento celular se calculó con o sin transfectar ARNip mediante el procedimiento similar al del Ejemplo 8(3), excepto que cada ARNip se añadió de antemano a placas esferoides de 96 pocillos y luego se sembraron células 3T3 que expresan v1 y células U-87MG y se cultivaron durante 3 días.
5 [0140] Los resultados de estos experimentos se muestran en la Tabla 5. Cada ARNip (ARNip-1 a ARNip-8), que había demostrado que tenía efecto inhibitorio sobre la expresión y la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 en el Ejemplo 8(5) (6), inhibió fuertemente el crecimiento independiente del anclaje de células 3T3 que expresan v1. Debido a que el número de células de células 3T3 que expresan v1, en las que se transfectaron ARNip-1, 3, 4 y 5, era inferior en el momento de la medición (día 3) que cuando se transfectó el ARNip (día 0) dando como
10 resultado que la tasa de inhibición del crecimiento fuera superior al 100%, se cree que se ha inducido muerte celular. Por otra parte, se mostró que ARNip-7 y ARNip-8 inhibían la expresión del gen ALK en el Ejemplo 8(5), pero no inhibían el crecimiento de células U-87MG que expresan la ALK de longitud completa. ARNip-1 a ARNip-6 no mostraron inhibición del crecimiento en células U-87MG y el control negativo, ARNip-9, no inhibió el crecimiento de células 3T3 que expresan v1 y células U-87MG.
15 Tabla 5
ARNip
Velocidad de inhibición del crecimiento de células 3T3 que expresan v1 Velocidad de inhibición del crecimiento de células U-87MG
ARNip-1
110% -13%
ARNip-2
94% 25%
ARNip-3
108% -21%
ARNip-4
120% -8%
ARNip-5
110% -13%
ARNip-6
97% 16%
ARNip-7
87% 15%
ARNip-8
94% -21 %
ARNip-9
-35% -16%
No se introdujo ARNip
0% 0%
[0141] De los resultados anteriores es evidente que, transfectando ARNip que es contra el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 a células cancerosas que expresan el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, la expresión del ARNm del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 se inhibe dando como resultado la reducción del polipéptido de fusión de EML4-ALK y la inhibición de la autofosforilación causando la inhibición del crecimiento de células cancerosas.
20 Por tanto, para células cancerosas que expresan la ALK de longitud completa, la inhibición del crecimiento no se produjo cuando se inhibió la expresión de ALK. De los resultados anteriores es evidente que el ARNip contra el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, por ejemplo, ARNip-1 a ARNip-8, es útil como agente terapéutico contra el tumor que expresa el polinucleótido de fusión de EML4-ALK para los pacientes positivos para el polinucleótido de fusión de EML4-ALK.
25
(8) Prueba antitumoral para inhibidores del polipéptido de fusión de EML4-ALK contra células 3T3 que expresan v1
[0142] Se inocularon subcutáneamente 3 × 106 células de células 3T3 que expresan v1 suspendidas en PBS mediante inyección en el lomo de ratones desnudos BALB/c macho de 5 semanas de edad (Japan Charles River Inc.). 7 30 días después de la inoculación se inició la administración del compuesto C, un inhibidor del polipéptido de fusión de EML4-ALK (Tabla 1 a 3). La prueba se realizó en el grupo de disolvente y el grupo de compuesto C, 4 animales por grupo. El compuesto C se disolvió en un disolvente compuesto por 10% de 1-metil-2-pirrolidinona (SIGMA-ALDRICH Inc.)/90% de polietilenglicol 300 (Fluka Inc.) y se administró por vía oral a la dosis de 10 mg/kg. Las administraciones se realizaron una vez al día durante 14 días y cada dos días se midieron el peso corporal y el tamaño de tumor. El volumen
35 de tumor se calculó usando la siguiente fórmula.
[Volumen de tumor (mm3)]= [eje mayor del tumor (mm)] x [eje menor del tumor (mm)]2 x 0,5
[0143] La velocidad de inhibición del compuesto C se calculó suponiendo que el volumen de tumor del grupo de
40 disolvente en el día de empezar y el día de terminar la administración era del 100% de inhibición y del 0% de inhibición, respectivamente. Los resultados indicaron que el compuesto C inhibió el crecimiento de células 3T3 que expresan v1 (tumor) el 103%.
[0144] El efecto antitumoral del compuesto D se investigó por el procedimiento similar con las siguientes
45 excepciones. La administración del compuesto D empezó 6 días después de la inoculación y se llevó a cabo una vez al día durante 10 días, y luego se midió el tamaño del tumor. El compuesto D inhibió el crecimiento de células 3T3 que expresan v1 (tumor) el 101%.
(9) Efecto inhibitorio de cinasas mediante administraciones repetidas de los inhibidores del polipéptido de fusión de 50 EML4-ALK al tumor de 3T3 que expresan v1
[0145] El efecto inhibitorio de cinasas del compuesto C se observó mediante un modo similar al del Ejemplo 8(8)
con las siguientes excepciones. Se inocularon 1 × 106 células de células 3T3 que expresan v1 y la administración del compuesto C se inició 13 días después de la inoculación. La prueba se realizó en el grupo de disolvente y el grupo del compuesto C, 3 animales por cada grupo. Las administraciones se llevaron a cabo una vez al día durante 3 días. Los animales se diseccionaron 4 horas después de la última administración y el tumor se extirpó. Entonces, los extractos de
5 proteína se prepararon a partir de los tejidos y la inmunotransferencia se llevó a cabo usando anticuerpo anti-ALK fosforilada. Los resultados indican que en el grupo del compuesto C, la autofosforilación de tirosina del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 en el tumor disminuyó significativamente en comparación con el grupo de disolvente. A partir de este resultado se confirmó que el efecto antitumoral del compuesto C en el modelo animal descrito anteriormente se basó en el efecto inhibitorio de cinasas del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 en el tumor.
10
[Ejemplo 9]
Detección del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1
15 [0146] Se construyó un procedimiento para detectar el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 en células del siguiente modo. Se cultivaron células 3T3 que expresan v1 y células U-87MG. Después de lavar 3 veces con PBS, las células se lisaron con la disolución de lisis (Ejemplo 7(1)). A 4 mg del sobrenadante obtenido después de la centrifugación se añadió anticuerpo anti-EML4 (Cell Signaling Inc.) y se hizo reaccionar durante la noche a 4ºC. Entonces, se añadieron perlas de proteína G (Protein G Sepharose 4 Fast Flow; GE Healthcare Inc.) y la
20 inmunoprecipitación se llevó a cabo durante 2 horas. Después de la centrifugación, los precipitados se lavaron 3 veces con la disolución de lavado (Ejemplo 7(1)) y se suspendieron en una disolución que disolvía SDS. El sobrenadante se sometió a inmunotransferencia usando anticuerpo anti-ALK. Como resultado, el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se detectó en los inmunoprecipitados de células 3T3 que expresan v1, pero no se detectó en células U-87MG. De los resultados descritos anteriormente fue posible detectar la presencia del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 en
25 células cancerosas y tejidos cancerosos que expresan el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 usando anticuerpo anti-EML4 y anticuerpo anti-ALK en combinación, y es evidente que pueden determinarse los pacientes con cáncer positivos para el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1.
[Ejemplo 10]
30
Análisis del polipéptido de fusión de EML4-ALK v2
(1) Construcción de un vector de expresión del polipéptido de fusión de EML4-ALK v2
35 [0147] El vector en el que se integró la secuencia de escisión de la enzima de restricción HindIII en el lado del extremo 5' del codón de iniciación del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 (EML4-ALKv2/pCR2.1) se produjo usando el vector pCR2.1-TOPO en que se clonó el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 en el Ejemplo 4(1).
[0148] El EML4-ALKv2/pCR2.1 se digirió con enzima de restricción HindIII, el polinucleótido de fusión de EML4
40 ALK v2 se escindió, ambos extremos se volvieron romos, entonces un adaptador (adaptador EcoRI-NotI-BamHI; Takara Bio Inc.) se ligó a ambos extremos y el fragmento se introdujo en el sitio EcoRI de un vector de retrovirus pMXS. Éste se designó EML4-ALKv2/pMXS.
[0149] Por tanto, el EML4-ALKv2/pCR2.1 se digirió con enzima de restricción HindIII y XbaI, el polinucleótido de
45 fusión de EML4-ALK v2 se escindió y se insertó en el sitio HindIII/XbaI de un vector de expresión pcDNA3.1/Zeo (Invitrogen Inc.) que se modificó de manera que la marca FLAG se uniera al extremo N en la expresión para producir un plásmido de expresión para el polipéptido de fusión de EML4-ALK v2 al que se unió la marca FLAG al extremo N (FLAG-EML4-ALKv2/pcDNA3).
50 (2) Investigación de tumorigenicidad del polipéptido de fusión de EML4-ALK v2
[0150] El FLAG-EML4-ALKv2/pcDNA3 (Ejemplo 10(1)) se transfectó en células 3T3 usando un reactivo de transfección (FuGENE HD; Roche Diagnostics Inc.) según la instrucción adjunta. Las células 3T3 que expresan establemente el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 se establecieron mediante resistencia a 80 µg/ml de zeocina. 55 La expresión del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 en las células 3T3 se confirmó por inmunotransferencia usando anticuerpo anti-ALK y anticuerpo anti-ALK fosforilada. Las células 3T3 en las que se expresa el polipéptido de fusión de EML4-ALK v2 se designan células 3T3 que expresan v2. Las células 3T3 que expresan v2 se inocularon subcutáneamente a ratones desnudos BALB/c macho de 5 semanas de edad (Japan Charles River Inc.) a 2 × 106 células/ratón y se observaron durante 15 días. Como en el caso de las células que expresan v1 (la sección inferior de la
60 figura 3), resultó que el tumor también se formó en células 3T3 que expresan el polipéptido de fusión de EML4-ALK v2. El número de formación de tumores era 4 entre 4.
[0151] De los resultados anteriores se confirmó que el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2, al igual que el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, también es un oncogén que codifica los polipéptidos que tienen
tumorigenicidad para células 3T3.
(3) Cribado de las sustancias que inhiben la actividad de autofosforilación intracelular del polipéptido de fusión de EML4-ALK v2
5
[0152] A células 293EBNA (Invitrogen Inc.) sembradas en placas de 24 pocillos recubiertas de colágeno I (IWAKI; Asahi techno glass corp.) a 1 × 105 células por pocillo en medio DMEM que contenía 10% de suero bovino fetal se introdujo 100 ng de FLAG-EMLA-ALKv2/pcDNA3 (Ejemplo 10(1) o pcDNA3 (vector blanco) como control usando un reactivo de transfección (lipofectamina 2000; Invitrogen Inc.). Después de cultivar durante 20 horas, se añadió cada uno
10 de los compuestos C o D o DMSO y el cultivo se incubó durante 4 horas y luego se recuperaron las células. La expresión del polipéptido de fusión de EML4-ALK v2 y el nivel de fosforilación de la tirosina se midieron por inmunotransferencia usando anticuerpo anti-ALK y anticuerpo anti-ALK fosforilada.
[0153] Como resultado, en la inmunotransferencia usando anticuerpo anti-ALK se confirmó una banda en la
15 localización de aproximadamente 160 kDa en la que se esperaba que estuviera presente el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2, y se demostró que la cantidad de expresión de la propia proteína del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 era casi constante en todas las muestras. Además, se confirmó una banda en la misma localización en la inmunotransferencia usando anticuerpo anti-ALK fosforilada. La cantidad de fosforilación se calculó cuantificando en un modo similar como en el Ejemplo 7(2). La velocidad de inhibición de la fosforilación por un compuesto se calculó a partir
20 de la cantidad de fosforilación cuando el compuesto se añadió, suponiendo que el valor cuando no se añadió compuesto (se añadió el disolvente del compuesto, DMSO) era del 0% de velocidad de inhibición, y que el valor cuando el vector blanco, pcDNA3, se introdujo era del 100% de velocidad de inhibición. Los resultados indican que cada compuesto inhibió claramente la actividad de cinasa del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 en células 293EBNA (Tabla 6). En un modo similar al del Ejemplo 7(4-2), excepto que el compuesto A a D o DMSO se añadieron a células 3T3 que
25 expresan v2 (Ejemplo 10(2-2)) a 10 µM o 10 nM, se midieron la cantidad de fosforilación de tirosina del polipéptido de fusión de EML4-ALK v2 y la cantidad de proteína total del polipéptido de fusión de EML4-ALK v2 y se calculó la velocidad de inhibición de compuestos respectivos en la actividad de cinasa intracelular. Cada compuesto inhibió claramente la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de EML4-ALK v2 en las células 3T3 que expresan v2 (Tabla 6).
30 [0154] El compuesto A y B podrían seleccionarse como sustancias que inhibieron la actividad del polipéptido de fusión de EML4-ALK v2 el 50% o más a una concentración de 10 µM o menos, y el compuesto C y D podrían seleccionarse como sustancias que inhibieron la actividad del polipéptido de fusión de EML4-ALK v2 el 50% o más a una concentración de 0,1 µM o menos. Se confirma que el cribado de las sustancias que inhiben la actividad del
35 polipéptido de la presente invención (cribado basado en células) puede realizarse usando el polipéptido de fusión de EML4-ALK v2, además del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1.
Tabla 6
Compuesto
Concentración final Inhibición de la autofosforilación (células 293EBNA) Inhibición de la autofosforilación (células 3T3 que expresan v2)
A
10 µM No se probó 68%
B
10 µM No se probó 55%
C
10 nM 90% 73%
D
10 nM 95% 88%
40 (4) Efecto inhibitorio de los inhibidores del polipéptido de fusión de EML4-ALK sobre el crecimiento independiente del anclaje de células 3T3 que expresan v2
[0155] Mediante un modo similar descrito como en el Ejemplo 8(3), el efecto inhibitorio de los inhibidores del polipéptido de fusión de EML4-ALK sobre el crecimiento celular independiente del anclaje se investigó usando células
45 3T3 que expresan v2 (Ejemplo 10(2-2)). Los resultados mostraron que todos los compuestos tenían actividad inhibitoria del crecimiento en células 3T3 que expresan v2. La velocidad de inhibición de los compuestos se calculó suponiendo que el número de células en el día 0 y el día 3 eran del 100% de inhibición y el 0% de inhibición, respectivamente (Tabla 7). Tabla 7
Compuesto
Concentración final Células que expresan v2
A
10 µM 157%
B
10 µM 121%
C
10 nM 76%
D
10 nM 157%
[0156] Los resultados indicaron que los compuestos A-D inhibieron el crecimiento celular independiente del anclaje de células 3T3 que expresan v2 inhibiendo la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de EML4-ALK v2.
[Ejemplo 11]
Análisis del polipéptido de fusión de EML4-ALK v3
5
(1) Detección del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3 en especímenes clínicos y clonación del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3
[0157] La PCR (después de 50ºC durante 2 minutos y 95ºC durante 15 minutos, 50 ciclos de 94ºC durante 15
10 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 90 segundos) se llevó a cabo usando 75 ADNc separados de los especímenes clínicos y un kit de PCR cuantitativa como la del Ejemplo 3(1) y oligonucleótidos de SEQ ID NO: 131 y 82 como cebadores. Como resultado, en dos casos se confirmó una secuencia de 515 pb (SEQ ID NO:86) o 548 pb (SEQ ID NO:90) hecha por la fusión de una parte de EML4 y una parte de ALK, que tiene un punto de fusión diferente del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 y polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2, se amplificó usando el ADNc de
15 un paciente que se muestra que es positivo para un producto de PCR descrito anteriormente como molde y oligonucleótidos de SEQ ID NO: 94 y 46 como cebadores, la PCR (35 ciclos de 98ºC durante 10 segundos y 68ºC durante 6 minutos) se llevó a cabo con una ADN polimerasa (ADN polimerasa PrimeStar HS, Takara Bio Inc.). El producto de PCR se clonó en el vector pT7Blue-2. Como resultado se obtuvo el nuevo polinucleótido (SEQ ID NO: 129) que estuvo constituido por 700 bases desde el codón de iniciación ATG del gen EML4 hasta la porción de intrón 6 y
20 1691 bases desde el exón 21 del gen ALK hasta el codón de terminación del exón 30. El plásmido en el que se clonó el ADNc de SEQ ID NO: 129 se designó EML4-ALKv3/pT7Blue-2.
(2) Investigación de tumorigenicidad del polipéptido de fusión de EML4-ALK v3
25 [0158] Usando el EML4-ALKv3/pT7Blue-2, el vector de expresión del polipéptido de fusión de EML4-ALK v3 (designado EML4-ALKv3/pMXS) se construyó según un procedimiento del Ejemplo 4(1). Por tanto, usando el EML4ALKv3/pT7Blue-2, un vector de expresión (designado FLAG-EML4-ALKv3/pMX-iresCD8) que expresa tanto el polipéptido de fusión de EML4-ALK v3 que tiene la marca FLAG en el extremo N como CD8, se construyó usando un procedimiento similar del Ejemplo 4(1). Las células 3T3 transfectadas con el EML4-ALKv3/pMXS descrito anteriormente
30 se inocularon subcutáneamente a ratones desnudos a 5 × 106 células/ratón y se observaron después de 20 días. Resultó que se formó el tumor. Debido a que el polipéptido de fusión de EML4-ALK v3 era tumorigénico, se indicó que el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3 es el gen causal del cáncer al igual que v1 y v2. En lo sucesivo, las células 3T3 en las que se expresa el polipéptido de fusión de EML4-ALK v3 se designan células 3T3 que expresan v3.
35 (3) Procedimiento para detectar ARNm del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3
[0159] Usando 1 ng del plásmido que expresa el EML4-ALK v3 como molde, y (SEQ ID NO: 132 y SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 133 y SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 134 y SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 135 y SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 136 y SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 137 y SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 138 y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 139 y 40 SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 78, y SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 80) como conjunto de cebadores, la PCR (30 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto) se llevó a cabo mediante una ADN polimerasa (ADN polimerasa rTaq; Takara Bio Inc.). Como resultado, en todo el conjunto de cebadores se amplificó un fragmento de ADN monocatenario, teniendo cada uno el tamaño esperado. De los resultados anteriores se probó que la detección de la presencia del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3 es posible llevando a
45 cabo RT-PCR según el presente ejemplo usando ARNm extraído de las muestras de sujetos de prueba como molde.
(4) Procedimiento de cribado para los inhibidores del polipéptido de fusión de EML4-ALK v3
[0160] Según el procedimiento del Ejemplo 1, Ejemplo 5(1) y Ejemplo 7(1), el polipéptido de fusión de EML4-ALK
50 v3 se preparó usando FLAG-EML4-ALKv3/pMX-iresCD8. La actividad de cinasa in vitro del polipéptido de fusión de EML4-ALK v3 purificado como se describe anteriormente puede detectarse usando un procedimiento del Ejemplo 7(2). El efecto inhibitorio de los compuestos A-D contra la actividad de cinasa in vitro del polipéptido de fusión de EML4-ALK v3 se investigó usando el procedimiento según procedimiento del Ejemplo 7(3). Como resultado, se encontró que los compuestos A-D inhibieron la autofosforilación y la actividad de fosforilación en el sustrato peptídico por el polipéptido
55 de fusión de EML4-ALK v3 purificado (Tabla 8). Estos compuestos podrían seleccionarse como sustancias que inhibieron la actividad del polipéptido de fusión de EML4-ALK v3. Tabla 8
Compuesto
Concentración final Inhibición de la autofosforilación Inhibición del sustrato peptídico
A
10 µM 100% 98%
B
10 µM 100% 77%
C
10 nM 103% 100%
D
10 nM 107% 98%
Los resultados anteriores indicaron que el cribado (un cribado de tipo in vitro) para una sustancia que inhibe la actividad
30
del polipéptido de la presente invención podría realizarse preparando el polipéptido de fusión de EML4-ALK v3 y usando la actividad de cinasa in vitro como índice.
(5) Cribado de las sustancias que inhiben una actividad de autofosforilación intracelular del polipéptido de fusión de 5 EML4-ALK v3
[0161] Se añadió DMSO (control) o el compuesto A-D a células 3T3 que expresan v3 (Ejemplo 11(2)) a 10 µM o 10 nM y se midieron la cantidad de fosforilación de tirosina del polipéptido de fusión de EML4-ALK v3 y la cantidad de proteína total del polipéptido de fusión de EML4-ALK v3 y la velocidad de inhibición de compuestos respectivos en la
10 actividad de cinasa intracelular se calculó en un modo similar al del Ejemplo 7(4-2). Como resultado, en la inmunotransferencia usando anticuerpo anti-ALK, las bandas se confirmaron en la localización de aproximadamente 90 kDa en las que se esperaba el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3 en el nivel casi constante en todas las muestras. Además, las bandas se confirmaron en la misma localización en la inmunotransferencia usando anticuerpo anti-ALK fosforilada.
15 [0162] Cada compuesto inhibió claramente la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de EML4-ALK v3 en las células 3T3 que expresan v3 (Tabla 9). Se confirmó que el cribado de las sustancias que inhiben la actividad del polipéptido de la presente invención (cribado basado en células) puede realizarse usando el polipéptido de fusión de EML4-ALK v3.
20 Tabla 9
Compuesto
Concentración final Inhibición de la autofosforilación (células 3T3 que expresan v3)
A
10 µm 94%
B
10 µm 76%
C
10 nM 95%
D
10 nM 106%
(6) Efecto inhibitorio de los inhibidores del polipéptido de fusión de EML4-ALK sobre el crecimiento independiente del anclaje de las células 3T3 que expresan v3
25 [0163] Mediante un modo similar descrito como en el Ejemplo 8(3), el efecto inhibitorio de los inhibidores (compuesto A-D) del polipéptido de fusión de EML4-ALK sobre el crecimiento independiente del anclaje de células se investigó usando células 3T3 que expresan v3 (Ejemplo 11 (2)). Los resultados mostraron que todos los compuestos tenían actividad inhibitoria del crecimiento sobre células 3T3 que expresan v3 (Tabla 10).
30 Tabla 10
Compuesto
Concentración final Células que expresan v2
A
10 µm 172%
B
10 µm 53%
C
30 nM 182%
D
30 nM 206%
Los resultados anteriores indican que el compuesto A-D inhibió el crecimiento celular independiente del anclaje de células 3T3 que expresan v3 inhibiendo la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de EML4-ALK v3.
(7) La expresión y la clonación de ARNm del polipéptido de fusión de EML4-ALK v3 en células NCI-H2228
35 [0164] Usando el ADNc que se preparó por la transcripción inversa del ARN total de células NCI-H2228, una línea de células de cáncer de pulmón de células no pequeñas humano (Colección americana de cultivos tipo) como molde, la PCR (35 ciclos de 98ºC durante 10 segundos, 68ºC durante 4 minuto) se llevó a cabo usando oligonucleótidos representados por la SEQ ID NO: 94 y la SEQ ID NO: 46 como cebadores y una ADN polimerasa (ADN polimerasa
40 primeSTAR HS, Takara Bio Inc.). Usando una parte del producto de PCR como molde, la PCR (35 ciclos de 98ºC durante 10 segundos, 68ºC durante 4 minuto) se llevó a cabo usando un oligonucleótido representado por la SEQ ID NO: 105 que se proporcionó con la secuencia de escisión de la enzima de restricción HindIII en el lado del extremo 5' del codón de iniciación ATG del gen EML4 y un oligonucleótido representado por SEQE ID NO:106 que se proporcionó con la secuencia de escisión de la enzima de restricción Xba I en el lado del extremo 3' del codón de terminación TGA
45 del gen ALK como cebadores y una ADN polimerasa (ADN polimerasa Pyrobest; Takara Bio Inc.). Se obtuvo el producto de PCR de aproximadamente 2400 pb. Este producto se clonó por TA en el vector pCR2.1-TOPO usando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen Inc.) y se analizó la secuencia de ADN. Como resultado se identificaron dos tipos de polinucleótido. Uno era una secuencia de 2391 pb (SEQ ID NO: 107) que era diferente en 4 bases, concretamente, las bases 685, 903, 2000 y 2115 de la SEQ ID NO: 129 (Ejemplo 11(1)). La otra era la secuencia de 2358 pb (SEQ ID NO:
50 109) que estuvo constituida por 667 bases desde el codón de iniciación ATG del gen EML4 hasta el exón 6 y 1691 bases desde el exón 21 del gen ALK hasta el codón de terminación del exón 30. La porción correspondiente a este gen ALK era diferente aproximadamente 1 base de la secuencia (4080-5770) de NM_004304 registrada en Genbank, sin la variación de aminoácidos. Por tanto, se sugirió que las diferencias en la porción del gen ALK entre el polinucleótido
(SEQ ID NO: 129) identificado en pacientes con cáncer de pulmón y el polinucleótido (SEQ ID NO: 107) clonado a partir de NCI-H2228 eran el polimorfismo.
[0165] Ni el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 ni el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 se 5 expresaron endógenamente en células NCI-H2228.
(8) Cribado de las sustancias que inhiben una actividad de autofosforilación intracelular del polipéptido de fusión de EML4-ALK en células NCI-H2228
10 [0166] Se añadió DMSO (control) o compuesto C a células NCI-H2228 a 100 nM como concentración final y se calcularon la cantidad de fosforilación de tirosina del polipéptido de fusión de EML4-ALK y la velocidad de inhibición de compuesto C en la actividad de autofosforilación en un modo similar al del Ejemplo 11(5). El compuesto C inhibió la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de EML4-ALK en las células NCI-H2228 al 81%. Se confirma que el cribado de las sustancias que inhiben la actividad del polipéptido de fusión de EML4-ALK de la presente invención (cribado de
15 tipo células) puede realizarse usando como índice la autofosforilación en las células NCI-H2228.
(9) Efecto inhibitorio de los inhibidores del polipéptido de fusión de EML4-ALK sobre el crecimiento independiente del anclaje de NCI-H2228 células.
20 [0167] Se añadió DMSO (control) o compuesto A-D a las células NCI-H2228 a 10 µM o 10 nM y esta investigación se realizó de un modo similar al descrito en el Ejemplo 8(3), excepto que las células se cultivaron durante 5 días después de la adición de fármacos. Los resultados mostraron que el compuesto A-D tenía actividad inhibitoria del crecimiento sobre las células NCI-H2228. La velocidad de inhibición de los compuestos se calculó suponiendo que el número de células en el día 0 y el día 5 era el 100% de inhibición y el 0% de inhibición, respectivamente (Tabla 11).
25 Tabla 11
Compuesto
Concentración final Células NCI-H2228
A
10 µm 164%
B
1,0 µM 102%
C
30 nM 137%
D
30 nM 141%
[0168] Los resultados anteriores indican que el compuesto A-D inhibió el crecimiento celular independiente del anclaje de NCI-H2228, células de cáncer de pulmón de células no pequeñas, inhibiendo la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de EML4-ALK. De los resultados anteriores es evidente que el inhibidor contra el polinucleótido de fusión de EML4-ALK es útil como agente terapéutico para pacientes con cáncer de pulmón positivos para el
30 polinucleótido de fusión de EML4-ALK.
LISTA DE SECUENCIAS
[0169]
<110> Astellas Pharma Inc. CureGene K.K. 35 <120> Gen de fusión EML4-ALK
<130> CMDFP6623946
<150> JP 2006-277718
<151>
<150> JP 2007-120670 40 <151>
< 150> CA 2.598.893
<151>
<160> 141
<170> PatentIn versión 3.4 45 <210> 1
<211> 3900
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
50 <223> Inventor: MANO, HIROYUKI Inventor: KUROMITSU, SADAO Inventor: SHINDO, NOBUAKI Inventor: SOGA, TAKATOSHI Inventor: FURUTANI, TAKASHI
55 <220>
<221> CDS
<222> (271).. (3447)
<400> 1
<210> 2
<211> 1059
<212> PRT 5 <213> Homo sapiens
<400> 2
<210>
<211> 942
<212> ADN 5 <213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 3979
<212> ADN 5 <213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 853
<212> ADN 5 <213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 3933
<212> ADN 5 <213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (3930)
<400> 6
<210> 7
<211> 1310
<212> PRT 5 <213> Homo sapiens
<400> 7
<210> 8 <211> 24
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 24
<212> ADN
<213> Homo sapiens 10 <400> 9
<210> 10
<211> 20
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 10
<210> 11
<211> 20 20 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 11
<210> 12 25 <211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 12
30 <210> 13
<211> 17
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 13
<210> 14
<211> 247
<212> ADN
<213> Homo sapiens 40 <400> 14
<210> 15
<211> 16
<212> ADN 45 <213> Homo sapiens
<400> 15 <210> 16
<211> 16
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 16
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 17
<210> 18
<211> 16
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 18
<210> 19
<211> 17
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 19
<210> 20
<211> 17
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 20
<210> 21
<211> 17
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 21
<210> 22
<211> 17
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 22
<210> 23
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 23
<210> 24
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 24
<210> 25
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 25
<210> 26
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 26
<210> 27
<211> 19
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 27
<210> 28
<211> 19
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 28
<210> 29
<211> 19
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 29
<210> 30 <211) 19
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 30
<210> 31
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 31
<210> 32
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 32
<210> 33
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 33
<210> 34
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 34
<210> 35
<211> 24
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 35
<210> 36
<211> 24
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 36
<210> 37
<211> 16
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 37
<210> 38
<211> 16
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 38
<210> 39
<211> 16
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 39
<210> 40
<211> 224
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 40
<210> 41
<211> 17
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 41
<210> 42
<211> 23
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 42
<210> 43
<211> 17
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 43
<210> 44
<211> 22
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 44
<210> 45
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 45
<210> 46
<211> 23
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 46
<210> 47
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 47
<210> 48
<211> 23
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 48
<210> 49
<211> 19
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 49
<210> 50
<211> 24
<212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 50
<210> 51
<211> 19
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 51
<210> 52
<211> 19
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 52
<210> 53
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 53
<210> 54
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 54
<210> 55
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 55
<210> 56
<211> 21
<212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 56
<210> 57
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
<400> 57
<211> 30
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 58
<210> 59
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
<400> 59
<210> 60
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
<400> 60
<210> 61
<211> 16
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 61
<210> 62
<211> 16
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 62
<210> 63
<211> 16
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 63
<210> 64
<211> 16
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 64
<210> 65
<211> 17
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 65
<210> 66
<211> 17
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 66
<210> 67
<211> 17
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 67
<210> 68
<211> 17
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 68
<210> 69
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 69
<210> 70
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 70
<210> 71
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 71
<210> 72
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 72
<210> 73
<211> 19
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 73
<210> 74
<211> 19
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 74 <210> 75
<211> 19
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 75
<210> 76
<211> 19
<212> ADN
<213> Homo sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 77
<210> 78
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 78
<210> 79
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 79
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<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 80
<210> 81
<211> 16
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<213> Homo sapiens
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<210> 82
<211> 24
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 82
<210> 83
<211> 16
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 83
<210> 84
<211> 16
<212> ADN
<213> Homo Sapiens
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<210> 85
<211> 17
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<211> 515
<212> ADN
<213> Homo sapiens 10 <400> 86
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<211> 17
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<211> 17 20 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 88
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<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 89
30 <210> 90
<211> 548
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 90
<210> 91
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 91
<210> 92
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 92
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<211> 19
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 93
<210> 94
<211> 24
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 94
<210> 95
<211> 19
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 95
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<211> 19
<212> ADN
<213> Homo sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
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<211> 20
<212> ADN
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<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
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<211> 20
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<211> 30
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 101
<210> 102
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
<400> 102
<211> 35
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
<400> 103
<210> 104
<211> 35
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
<400> 104
<210> 105
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
<400> 105
<210> 106
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial 10 <220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
<400> 106
<210> 107 15 <211> 2391
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 20 <222> (1).. (2388)
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<212> PRT
<213> Homo sapiens 5 <400> 108
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<211> 2358
<212>
ADN 5 <213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
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<400> 109
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<211> 785
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
<210> 111
<211> 21
<212>
ADN/ARN 5 <213> Artificial
89
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de ARNip-1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1).. (13)
<223> ARN
<220>
<221> misc_feature
<222> (14).. (21)
<223> ADN
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<210> 112
<211> 21
<212> ADN/ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de ARNip-1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) .. (6)
<223> ADN
<220>
<221> misc_feature
<222> (7).. (21)
<223> ARN
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<210> 113
<211> 21
<212> ADN/ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de ARNip-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1).. (13)
<223> ARN
<220>
<221> misc_feature
<222> (14).. (21)
<223> ADN
<400> 113
<210> 114
<211> 21
<212> ADN/ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de ARNip-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1).. (6)
<223> ADN
<220>
<221> misc_feature
<222> (7) .. (21)
<223> ARN
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<211> 21
<212> ADN/ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de ARNip-3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)... (13)
<223> ARN
<220>
<221> misc_feature
<222> (14) .. (21)
<223> ADN
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de ARNip-3
<220>
<221> misc_feature
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<223> ADN
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<221> misc_feature
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<223> ARN
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<211> 21
<212> ADN/ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de ARNip-4
<220>
<221> misc_feature
<222> (1).. (13)
<223> ARN
<220>
<221> misc_feature
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<223> ADN
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<211> 21
<212> ADN/ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de ARNip-4
<220>
<221> misc_feature
<222> (1).. (6)
<223> ADN
<220>
<221> misc_feature
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<223> ARN ...
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<211> 21
<212> ADN/ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de ARNip-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (1).. (13)
<223> ARN
<220>
<221> misc_feature
<222> (14).. (21)
<223> ADN
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<210> 120
<211> 21
<212> ADN/ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de ARNip-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) .. (6)
<223> ADN
<220>
<221> misc_feature
<222> (7).. (21)
<223> ARN
<400> 120
<210> 121
<211> 21
<212> ADN/ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de ARNip-6
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) .. (13)
<223> ARN
<220>
<221> misc_feature
<222> (14) .. (21)
<223> ADN
<400> 121
<210> 122
<211> 21
<212> ADN/ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de ARNip-6
<220>
<221> mist_feature
<222> (1).. (6)
<223> ADN
<220>
<221> misc_feature
<222> (7).. (21)
<223> ARN
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<210> 123
<211> 21
<212> ADN/ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de ARNip-7
<220>
<221> misc_feature
<222> (1).. (13)
<223> ARN
<220>
<221> misc_feature
<222> (14) .. (21)
<223> ADN
<400> 123
<210> 124
<211> 21
<212> ADN/ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de ARNip-7
<220>
<221> misc_feature
<222> (1).. (6)
<223> ADN
<220>
<221> misc_feature
<222> (7).. (21)
<223> ARN
<400> 124
<210> 125
<211> 21
<212> ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de ARNip-8
<400> 125
<210> 126
<211> 21
<212> ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de ARNip-8
<400> 126
<210> 127
<211> 21
<212> ADN/ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de ARNip-9
<220>
<221> misc_feature
<222> (1).. (13)
<223> ARN
<220>
<221> misc_feature
<222> (14).. (21)
<223> ADN
<400> 127
<210> 128
<211> 21
<212> ADN/ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de ARNip-9
<220>
<221> misc_feature 5 <222> (1).. (6)
<223> ADN
<220>
<221> misc_feature
<222> (7) .. (21) 10 <223> ARN
<400> 128
<210> 129
<211> 2391 15 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (2388) 20 <400> 129
<210> 130
<211> 796
<212> PRT 5 <213> Homo sapiens
<400> 130
<210> 131
<211> 24
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 131 24
<210> 132
<211> 16
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 132 16
<210> 133
<211> 16
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 133
<210> 134
<211> 17
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 134
<210> 135
<211> 17
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 135
<210> 136
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 136
<210> 137
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 137
<210> 138
<211> 19
<212> ADN.
<213> Homo sapiens
<400> 138
<210> 139
<211> 19
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 139
<210> 140
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 140
<210> 141
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 141

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Polipéptido seleccionado del grupo que consiste en
    (1)
    un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa,
    (2)
    un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 con la deleción, sustitución y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa,
    (3)
    un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa, y
    (4)
    un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130.
  2. 2.
    Polipéptido, según la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 y que tiene una actividad de cinasa.
  3. 3.
    Polipéptido, según la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 7 y que tiene una actividad de cinasa.
  4. 4.
    Polipéptido, según la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 130 y que tiene una actividad de cinasa.
  5. 5.
    Polipéptido, según la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con el 90%
    o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa.
  6. 6.
    Polipéptido, según la reivindicación 1, en el que el polipéptido está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2.
  7. 7.
    Polipéptido, según la reivindicación 1, en el que el polipéptido está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 7.
  8. 8.
    Polipéptido, según la reivindicación 1, en el que el polipéptido está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 130.
  9. 9.
    Polinucleótido que codifica el polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  10. 10.
    Vector de expresión que comprende el polinucleótido, según la reivindicación 9.
  11. 11.
    Célula transformada con el vector de expresión, según la reivindicación 10.
  12. 12.
    Procedimiento para producir el polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende cultivar la célula transformada, según la reivindicación 11, en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido y la recogida del polipéptido de la célula.
  13. 13.
    Uso de 5-cloro-N4-[2-(isopropilsulfonil)fenil]-N2-{2-metoxi-4-[4-(4-metilpiperazin-1-il)piperidin-1-il]fenil}pirimidin-2,4diamina ó 2-[(5-bromo-2-{[2-metoxi-4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil]amino)pirimidin-4-il)amino]-N-metilbencenosulfonamida para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer de pulmón que se muestra positivo para un gen de fusión del gen de la proteína 4 similar a proteína asociada a microtúbulos de equinodermo (EML4) y el gen de cinasa de linfoma anaplásico (ALK).
  14. 14.
    Sustancia para utilizar en el tratamiento del cáncer de pulmón que se muestra positivo para un gen de fusión del gen de EML4 y el gen de ALK, en la que la sustancia es 5-cloro-N4-[2-(isopropilsulfonil)fenil]-N2-{2-metoxi-4-[4-(4metilpiperazin-1-il)piperidin-1-il]fenil}pirimidin-2,4-diamina ó 2-[(5-bromo-2-{[2-metoxi-4-(4-metilpiperazin-1il)fenil]amino)pirimidin-4-il)amino]-N-metilbencenosulfonamida.
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