ES2576061T3 - Mutaciones de BRAF que confieren resistencia a inhibidores de BRAF - Google Patents

Mutaciones de BRAF que confieren resistencia a inhibidores de BRAF Download PDF

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de BRAF mutante que tiene una actividad de BRAF, en la que dicho polipéptido de BRAF mutante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una sustitución de aminoácido en comparación con un polipéptido de BRAF V600E (SEQ ID NO: 4), confiriendo la al menos una sustitución de aminoácido resistencia a uno o más inhibidores de BRAF en el polipéptido de BRAF mutante, el inhibidor de BRAF seleccionado de RAF-265 o PLX4720, en el que la al menos una sustitución de aminoácido sucede en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748.

Description

DESCRIPCION
Mutaciones de BRAF que confieren resistencia a inhibidores de BRAF Solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad del documento USSN 61/308.275, presentado el 25 de febrero de 2010.
Apoyo del Gobierno
La presente invencion se realizo con apoyo del Gobierno bajo la Subvencion n.° K08 CA115927, otorgada por el Instituto Nacional de la Salud. El Gobierno tiene ciertos derechos en la invencion.
Antecedentes de la invencion
El tratamiento del cancer es uno de los mayores retos de la medicina moderna. Aunque los agentes quimioterapeuticos son tlpicamente un medio eficaz para tratar o reducir los slntomas asociados con el cancer, en algunos casos, durante el tratamiento se manifiesta resistencia a uno o mas agentes quimioterapeuticos. Como resultado, un agente quimioterapeutico dado puede volverse ineficaz en ciertos individuos. Los mecanismos moleculares responsables del desarrollo de resistencia en diversos tipos de cancer apenas se entienden. El esclarecimiento de los mecanismos que subyacen a la resistencia a agentes especlficos es esencial para descubrir enfoques de tratamiento que eviten eficazmente la resistencia farmacologica.
Heidorn et al (2010) Cell, Vol. 140, numero 2 pp. 209-221 ensena un mecanismo de tumorigenesis mediada por BRAF sin actividad quinasa en presencia de RAS oncogenico.
El documento WO2008/079903 ensena compuestos activos en protelna quinasas, as! como metodos para usar dichos compuestos para tratar enfermedades y afecciones asociadas con actividad aberrante de protelna quinasas.
Emery et al (2009) PNAS, Vol. 106, n.° 48, pp. 20411-20416 ensena una investigacion sobre la relevancia cllnica de la dependencia de MEK en melanoma secuenciando en paralelo de forma masiva clones resistentes generados a partir de una exploracion de mutagenesis aleatoria de MEK1 in vitro, as! como tumores obtenidos de pacientes con recalda despues del tratamiento con AZD6244, un inhibidor de EK alosterico.
Whittaker et al (2010) Sci Transl Med, Vol. 2, n.° 35, p35RA41 ensena la generacion de versiones resistentes a farmacos de BRAF oncogenico mutando el resto guardian.
Sumario de la invencion
La presente invencion se refiere a resistencia mediada por mutacion al tratamiento quimioterapeutico del cancer. En realizaciones especlficas, la presente invencion se refiere a mutaciones identificadas en polipeptidos de RAF (por ejemplo, polipeptidos de BRAF), y en moleculas de acido nucleico que codifican los polipeptidos de RAF. Estas mutaciones confieren resistencia a inhibidores de RAF actualmente en uso terapeutico. La identification de estas mutaciones permite el desarrollo de inhibidores de RAF de segunda generacion que muestran actividad contra un polipeptido de RAF que contiene una o mas mutaciones, tales como las mutaciones descritas en el presente documento. Dichos inhibidores de RAF de segunda generacion son utiles en muchas aplicaciones cllnicas y terapeuticas, incluyendo el tratamiento del cancer.
En consecuencia, la invencion presenta, en un primer aspecto, una molecula de acido nucleico aislada que codifica un polipeptido de BRAF mutante que tiene actividad de BRAF, en el que dicho polipeptido de BRAf mutante comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una sustitucion de aminoacido en comparacion con un polipeptido de BRAF V600E mostrado como SEQ ID NO: 4, confiriendo la al menos una sustitucion de aminoacido resistencia a uno o mas inhibidores de BRAF en el polipeptido de BRAF mutante, el inhibidor de BRAF seleccionado de RAF-265 o PLX4720 en el que la al menos una sustitucion de aminoacido se produce en una o mas posiciones de aminoacidos seleccionadas del grupo que consiste en: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En realizaciones ejemplares, la al menos una sustitucion de aminoacido es una o mas de las siguientes: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
En una realization del aspecto anterior, el polipeptido de BRAF mutante tiene de una a cinco sustituciones de aminoacidos en comparacion con el polipeptido de BRAF V600E. En realizaciones ejemplares, el polipeptido de BRAF mutante tiene una sustitucion de aminoacido. En otra realizacion ejemplar, el polipeptido de BRAF mutante es un BRAF que comprende una sustitucion en una o mas de las siguientes posiciones de aminoacidos de SEQ ID NO: 4: V528, t521, y/o P686. En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, el inhibidor de BRAF es RAF-265.
Las moleculas de acido nucleico aisladas que codifican polipeptidos de RAF mutantes pueden insertarse en un vector de expresion y expresarse en una celula hospedadora. En consecuencia, en otro aspecto, la invencion presenta un vector de expresion que comprende una molecula de acido nucleico expuesta en el presente documento. En otro aspecto, la invencion presenta una celula hospedadora que comprende el vector de expresion anterior. En otro aspecto, la invencion presenta un metodo para producir un polipeptido de BRAF mutante, que comprende cultivar una celula hospedadora que contiene un vector de expresion que codifica un polipeptido de BRAF mutante, de modo que se produzca un polipeptido de BRAF mutante por la celula.
En otras realizaciones, la invencion presenta polipeptidos de BRAF mutantes aislados, en los que los polipeptidos de BRAF mutantes comprenden una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una sustitucion de aminoacido en comparacion con un polipeptido de BRAF V600E mostrado como SEQ ID NO: 4, confiriendo la al menos una sustitucion de aminoacido resistencia a uno o mas inhibidores de BRAF en el polipeptido de BRAF mutante, el inhibidor de BRAF seleccionado de RAF-265 o PLX4720 en el que la al menos una sustitucion de aminoacido sucede en una o mas posiciones de aminoacidos seleccionadas del grupo que consiste en: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En realizaciones preferidas, los polipeptidos de BRAF mutantes aislados tienen una actividad de un polipeptido de BRAF de tipo silvestre. En realizaciones ejemplares, la al menos una sustitucion de aminoacido se selecciona de las siguientes: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F. En algunas realizaciones, el polipeptido de BRAF mutante tiene de una a cinco sustituciones de aminoacidos en comparacion con el polipeptido de BRAF V600E. En ensenanzas ejemplares, el polipeptido de BRAF mutante tiene una sustitucion de aminoacido en comparacion con el polipeptido de BRAF de tipo silvestre. En otras realizaciones ejemplares del aspecto anterior, el inhibidor de BRAF es RAF-265.
En otro aspecto, la invencion presenta un metodo para identificar un compuesto que es util en el tratamiento del cancer, que comprende (a) proporcionar una composicion de ensayo que comprende un polipeptido de BRAF mutante de la invencion y un sustrato de BRAF; (b) poner en contacto la composicion de ensayo con un compuesto de ensayo en condiciones que permitan la fosforilacion del sustrato de BRAF en ausencia del compuesto de ensayo; y (c) determinar el efecto del compuesto en la fosforilacion del sustrato de BRAF, en el que la modulation negativa de la fosforilacion del sustrato de BRAF en comparacion con un control adecuado identifica el compuesto como un compuesto que es util en el tratamiento del cancer. En algunas realizaciones, la composicion de ensayo es un extracto celular.
En otro aspecto, la invencion presenta un metodo para identificar un compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generation, que comprende (a) proporcionar una composicion de ensayo que comprende un polipeptido de BRAF mutante de la invencion y un sustrato de BRAF; (b) poner en contacto la composicion de ensayo con un compuesto de ensayo en condiciones que permitan la fosforilacion del sustrato de BRAF en ausencia del compuesto de ensayo; y (c) determinar el efecto del compuesto en la fosforilacion del sustrato de BRAF, en el que la modulacion negativa de la fosforilacion del sustrato de BRAF en comparacion con un control adecuado identifica el compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generacion. En algunas realizaciones, la composicion de ensayo es un extracto celular.
En otro aspecto, la invencion presenta un metodo para identificar un compuesto que es util en el tratamiento del cancer, que comprende (a) proporcionar una celula que comprende un polipeptido de BRAF mutante de la invencion; (b) poner en contacto la celula con un compuesto de ensayo; y (c) determinar el efecto del compuesto en la fosforilacion de un sustrato de BRAF o en la proliferation celular, en el que la modulacion negativa de la fosforilacion del sustrato de BRAF o reduction en la proliferacion celular en comparacion con un control adecuado identifica el compuesto como un compuesto que es util en el tratamiento del cancer.
En otro aspecto, la invencion presenta un metodo para identificar un compuesto que es un inhibidor de BRAF de segundo generacion que comprende proporcionar una celula que comprende un polipeptido de BRAF mutante, poner en contacto la celula con un compuesto de ensayo y determinar el efecto del compuesto en la fosforilacion de un sustrato de BRAF, en el que la modulacion negativa de la fosforilacion del sustrato de BRAF en comparacion con un control adecuado identifica el compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generacion.
En una realization de los aspectos anteriores, el sustrato de BRAF es MEK1 o MEK2. En una realization ejemplar, la fosforilacion de MEK1 o MEK2 se determina usando un anticuerpo de MEK fosfo-especlfico. En otra realizacion ejemplar, la fosforilacion de MEK1 o MEK2 se determina midiendo la fosforilacion de la protelna basica de mielina (MBP). En otra realizacion ejemplar, la fosforilacion de MEK1 o MEK2 se determina midiendo la fosforilacion de ERK1 o ERK2.
En otro aspecto, la invencion presenta un metodo para identificar un compuesto que es un inhibidor de BRAF de segunda generacion, que comprende proporcionar una celula que comprende un polipeptido de BRAF mutante, poniendo en contacto la celula con un compuesto de ensayo y determinar el efecto del compuesto en la proliferacion celular, en el que la reduccion de la proliferacion celular en comparacion con un control adecuado identifica el compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generacion.
En otro aspecto, la invencion presenta un metodo de exploracion basado en celulas para identificar un compuesto de ensayo como un inhibidor de BRAF de segunda generacion, comprendiendo el metodo poner en contacto una celula hospedadora de la invencion con un compuesto de ensayo, en el que la sensibilidad de la celula hospedadora para el compuesto de ensayo en comparacion con un control adecuado identifica el compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generacion. En una realizacion, la sensibilidad de las celula hospedadora para el compuesto de ensayo se mide usando un ensayo seleccionado del grupo que consiste en un ensayo de proliferation celular, un ensayo de viabilidad celular, y un ensayo de fosforilacion de MEK, en el que una reduction de la proliferacion celular, viabilidad celular o fosforilacion de MEK en presencia del compuesto de ensayo identifica el compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generacion.
Se ensena en el presente documento un metodo para identificar un inhibidor de BRAF de segunda generacion, que comprende seleccionar un farmaco potencial usando modelizacion asistida por ordenador con una estructura cristalina tridimensional o en solution de un polipeptido de BRAF mutante, en el que dicho polipeptido de BRAF mutante comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una sustitucion de aminoacido en comparacion con un polipeptido de BRAF de tipo silvestre o un polipeptido de BRAF V600E, la al menos una sustitucion de aminoacido que confiere resistencia a uno o mas inhibidores de BRAF en el polipeptido de BRAF mutante; poner en contacto dicho farmaco potencial con el polipeptido de BRAF mutante; y detectar la interaction de dicho farmaco potencial con el polipeptido de BRAF mutante; en el que un compuesto que es capaz de interaccionar con el polipeptido de BRAF mutante se identifica como un inhibidor de BRAF de segunda generacion. En ensenanzas adicionales, el compuesto de ensayo es un miembro de una biblioteca de compuestos.
Se desvela en el presente documento un compuesto aislado que es un inhibidor de BRAF de segunda generacion o un compuesto que es util en el tratamiento de un cancer, en el que el compuesto se identifica como un inhibidor de BRAF de segunda generacion o un compuesto que es util en el tratamiento de cancer de acuerdo con un metodo descrito en el presente documento.
Se desvela en el presente documento un metodo para inhibir la actividad de un polipeptido de BRAF mutante, que comprende poner en contacto un polipeptido de BRAF mutante con un compuesto que es un inhibidor de BRAF de segunda generacion. Tambien se ensena que el compuesto inhibe ademas la actividad de un polipeptido de BRAF de tipo silvestre y/o un polipeptido de BRAF V600E. Se desvela en el presente documento que la puesta en contacto del polipeptido de BRAf mutante con el inhibidor de BRAF de segunda generacion sucede in vitro. Tambien se desvela que la puesta en contacto sucede in vivo. En algunas ensenanzas, el contacto sucede en un sujeto, por ejemplo, en un sujeto que tiene cancer. En algunas divulgaciones, el sujeto ha recaldo desde el tratamiento con RAF-265. En ensenanzas ejemplares, el cancer es un melanoma.
Se ensena en el presente documento un metodo para tratar el cancer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un compuesto que es un inhibidor de BRAF de segunda generacion. En ensenanzas ejemplares, el cancer contiene una o mas mutaciones en BRAF, en el que la o las mutaciones confieren resistencia a RAF-265 en un polipeptido de BRAF. En divulgaciones adicionales el compuesto inhibe ademas la actividad de un polipeptido de BRAF de tipo silvestre y/o un polipeptido de BRAF V600E. En algunas divulgaciones el sujeto ha recaldo desde el tratamiento con RAF-265. En divulgaciones ejemplares, el cancer es un melanoma.
Se desvela en el presente documento un metodo para explorar a un sujeto que tiene cancer con respecto a una mutation de BRAF que confiere resistencia al tratamiento con un inhibidor de RAF, que comprende obtener una muestra que contiene celulas cancerosas del sujeto, e identificar en la muestra una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF que contiene una o mas mutaciones con respecto a una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) o un polipeptido de BRAF V600E (SEQ ID NO: 3), apareciendo las mutaciones en posiciones que codifican uno o mas aminoacidos en el polipeptido de BRAF seleccionado del grupo que consiste en A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748, en el que la presencia de la molecula de acido nucleico en la muestra que contiene celulas cancerosas identifica al sujeto como resistente al tratamiento con un inhibidor de RAF. En divulgaciones ejemplares, la molecula de acido nucleico codifica un polipeptido de BRAF que tiene uno o mas sustituciones de aminoacidos con respecto a un polipeptido de BRAF de tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) o un polipeptido de BRAF V600E (SEQ ID NO: 4) seleccionado del grupo que consiste en A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F. En algunas divulgaciones, la presencia de la molecula de acido nucleico en la muestra que contiene celulas cancerosas identifica que el sujeto tiene un riesgo relativamente alto de recalda durante el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generacion. Se ensena que la presencia de la molecula de acido nucleico en la muestra que contiene celulas cancerosas identifica al sujeto como insensible al tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generacion. Se ensena que el inhibidor de BRAF de primera generacion es RAF-265. Tambien se ensena que la presencia de la molecula de acido nucleico en la muestra que contiene celulas cancerosas estratifica el sujeto para el tratamiento con un inhibidor de BRAF de segunda generacion. En ensenanzas ejemplares, la presencia de la molecula de acido nucleico en la muestra que contiene celulas cancerosas se determina por un metodo que comprende determinar la secuencia de una molecula de acido nucleico que codifica el polipeptido de BRAF. En otras ensenanzas, la presencia de la molecula de acido nucleico en la muestra que contiene celulas cancerosas se
determina detectando un polipeptido codificado por la molecula de acido nucleico usando un anticuerpo que reconoce especlficamente un polipeptido de BRAF que contiene una mutacion en una posicion seleccionada del grupo que consiste en A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. Tambien se ensenan en el presente documento metodos que comprenden ademas administrar un inhibidor de BRAF de segunda generacion a un sujeto en el que se detecto la presencia de una o mas mutaciones de BRAF.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 representa la secuencia de nucleotidos de BRAF humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) (n.° de Secuencia de Referencia de NCBI: NM_004333.4; gi 187608632).
La Figura 2 representa la secuencia de nucleotidos de BRAF humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) (n.° de Secuencia de Referencia de NCBI: NP_004324.2; gi 33188459).
La Figura 3 representa la secuencia de nucleotidos de BRAF V600E humano (SEQ ID NO: 3). La transversion de timidina a adenosina que explica la sustitucion de aminoacidos V600E con respecto a la secuencia de BRAF de tipo silvestre esta subrayada.
La Figura 4 representa la secuencia polipeptldica de BRAF V600E humano (SEQ ID NO: 4). La sustitucion de V600E con respecto a la secuencia de BRAF de tipo silvestre esta subrayada.
La Figura 5 representa el paisaje mutacional de BRAF despues de la seleccion de RAF265. Se muestran sustituciones de aminoacidos que suceden como resultado de mutaciones de alta frecuencia.
La Figura 6 representa el paisaje mutacional de BRAF despues de seleccion de PLX4720. Se muestran sustituciones de aminoacidos que suceden como resultado de mutaciones de alta frecuencia.
La Figura 7 representa la localizacion estructural de tres sustituciones de aminoacidos comunes para las exploraciones tanto de RAF265 como de PLX4720.
La Figura 8 representa los resultados de estudios de inmunotransferencia de BRAF, los niveles de p-MEK1/2 y p- ERK1/2 despues del tratamiento con concentraciones crecientes de PLX4720 en celulas que contienen BRAF de tipo silvestre, BRAF-V600E, BRAF-V600E-T521K, BRAF-V600E-V528F o BRAF-V600E-P686Q.
Descripcion detallada de la invencion
1. Actividad biologica de BRAF
La familia de protelnas de RAF contiene tres miembros: BRAF, ARAF y CRAF (tambien conocido como RAF-1). Cada una de las protelnas de RAF contiene un dominio regulador amino terminal, un bucle de activacion y un dominio quinasa C terminal. La regulacion de RAF implica la fosforilacion de los dominios reguladores y catallticos. Una vez activadas, las moleculas RAF actuan como serina/treonina quinasas capaces de activar moleculas de senalizacion corriente abajo por fosforilacion.
RAF esta implicada en la promotion de la proliferation celular por asociacion con la ruta de senalizacion de protelna quinasa activada por mitogeno (MAPK). En particular, las protelnas de RAF son los principales efectores de senalizacion mediada por Ras. Ras activada interacciona directamente con RAF y recluta RAF a la membrana celular del citoplasma. Tras la traslocacion a la membrana celular, RAF unida a Ras experimenta una serie de acontecimientos de fosforilacion y cambios conformacionales que actuan para activar la actividad serina/treonina quinasa de RAF. RAF tambien puede activarse mediante rutas independientes de Ras que implican interferon beta, protelna quinasa C (PKC) alfa, protelnas anti-apoptoticas tales como Bcl-2, diversas protelnas de armazon, luz ultravioleta, radiation ionizante, retinoides, eritropoyetina y dimerization entre isoformas de RAF.
Una vez activada, RAF media en la senalizacion corriente abajo por fosforilacion de las quinasas MEK1 y MEK2, que contienen una secuencia rica en prolina que permite el reconocimiento por RAF. BRAF es un activador mucho mas potente de MEK1 y MEK2 que ARAF o RAF-1. MEK1 y MEK2, a su vez, fosforilan y activan ERK1 y ERK2, que despues se traslocan al nucleo. ERK1 y ERK2 nucleares activan factores de transcription tales como Elk-1, Fos, Jun, AP-1 y Myc, induciendo en ultima instancia transcripcion de genes implicados en la proliferacion celular, desdiferenciacion y supervivencia, incluyendo, por ejemplo, ciclina D1, ciclina E y fosfatasa activadora de cdc 25.
La regulacion positiva de senalizacion de RAF, que resulta de la presencia de mutaciones de activacion en RAF o senalizacion aberrante mediante Ras, promueve la oncogenesis activando la cascada de senalizacion anterior dando como resultado proliferacion y supervivencia celular aumentadas. Se han asociado mutaciones de activacion en polipeptidos de RAF, especialmente en BRAF, con una alta frecuencia de canceres humanos. Una de dichas mutaciones de BRAF es una transversion individual de timidina a adenosina, que convierte valina en el aminoacido
600 a glutamato. Aproximadamente dos tercios de los casos de melanoma albergan esta mutacion de BRAF V600E oncogenica, que contribuye a la transformacion de melanocitos mediante activacion de serialization de MAPK. Muchos otros tipos de cancer, incluyendo pero sin limitation cancer de colon, de ovario y de tiroides, albergan de forma similar la mutacion de BRAF V600E. En consecuencia, la direction de RAF y, en particular, la direction de BRAF V600E, es un enfoque prometedor para la terapia de cancer. BRAF es una diana atractiva para la terapia debido al alto grado de especificidad presentado para sus sustratos de MEK1 y MEK2. Varios inhibidores de BRAF estan actualmente en desarrollo cllnico. Uno de dichos inhibidores es el compuesto RAF-265, que es eficaz contra las tres isoformas de RAF as! como contra BRAF V600E. RAF-265 ha sido prometedor en la cllnica, lo que indica que la direccion de RAF es un metodo viable de terapia de cancer.
Como se usa de forma intercambiable en el presente documento, las expresiones “actividad de RAF”, “actividad biologica de RAF” y “actividad funcional de RAF” incluyen actividades ejercidas por una protelna RAF, por ejemplo, BRAF, en una celula o tejido sensible a RAF, por ejemplo, una celula cancerosa o un cancer, o una molecula diana de RAF, como se determina in vivo o in vitro, de acuerdo con tecnicas convencionales. La actividad de RAF puede ser una actividad directa, tal como una asociacion con una molecula diana de RAF, por ejemplo, MEK1 o MEK2, o fosforilacion de un sustrato de RAF, por ejemplo, MEK1 o MEK2. Como alternativa, una actividad de RAF puede ser una actividad indirecta, tal como un acontecimiento biologico corriente abajo mediado por la interaction de la protelna RAF con una molecula diana de RAF, por ejemplo, MEK1 o MEK2. Como rAf esta en una ruta de transduction de senal que implica MEK1 y MEK2, dichos acontecimientos biologicos corriente abajo incluyen pero sin limitacion, por ejemplo, fosforilacion de MBP, fosforilacion de ERK1 o ERK2, cambios en la regulation de los genes diana de ERK1 o ERK2, y alteraciones en la proliferation o viabilidad celular.
II. Mutaciones de resistencia de BRAF
Aunque el tratamiento de cancer con inhibidores de RAF, por ejemplo, inhibidores de BRAF, es un enfoque terapeutico prometedor, los pacientes que reciben dicha terapia pueden recaer o no responder, y como resultado la enfermedad de los pacientes progresa. Como se describe en el presente documento, la presente invention se refiere al descubrimiento de mutaciones en BRAF que confieren resistencia a inhibidores de RAF actualmente en desarrollo cllnico. La adquisicion de dichas mutaciones en celulas cancerosas hace a los pacientes resistentes al tratamiento con ciertos inhibidores de RAF. En realizaciones ejemplares, la invencion se refiere al desarrollo de resistencia al inhibidor de RAF RAF-265.
(A) Identification de mutaciones de BRAF que confieren resistencia a inhibidores de RAF
En diversas realizaciones, la presente invencion se refiere a metodos para identificar mutaciones en un polipeptido de BRAF, o mutaciones en una molecula de acido nucleico que codifica el polipeptido de BRAF, que confiere resistencia del polipeptido de BRAF a farmacos que inhiben la actividad de RAF. Un “polipeptido de BRAF mutante”, como se hace referencia en el presente documento, incluye un polipeptido de BRAF que contiene una o mas mutaciones que confieren resistencia a uno o mas inhibidores de BRAF conocidos. Ademas de la o las mutaciones que confieren resistencia a un inhibidor de BRAF, un polipeptido de BRAF mutante puede contener una sustitucion V600E. No se considera que un polipeptido de BRAF que contenga solamente la sustitucion V600E sin ninguna otra mutacion con respecto a la secuencia polipeptldica de BRAF de tipo silvestre sea un “polipeptido de BRAF mutante” como se define en el presente documento. Una “molecula de acido nucleico de BRAF mutante”, como se hace referencia en el presente documento, incluye una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF mutante. Las moleculas de acido nucleico que codifican polipeptidos de BRAF que contienen una o mas mutaciones pueden crearse usando cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, mutagenesis aleatoria o mutagenesis dirigida de una secuencia de acido nucleico de BRAF de tipo silvestre o una secuencia de acido nucleico de BRAF V600E, que pueden realizarse en E. coli. En realizaciones ejemplares, la secuencia de acido nucleico de BRAF de tipo silvestre es una secuencia de acido nucleico de BRAF de tipo silvestre humana (SEQ ID NO: 1), y la secuencia de acido nucleico de BRAF V600E es una secuencia de acido nucleico de BRAF V600E humana (SEQ ID NO: 3). Las moleculas de acido nucleico de BRAF mutante pueden despues explorarse en celulas de otro modo sensibles al tratamiento con un inhibidor de BRAF para identificar un acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF mutante que es resistente al tratamiento con el inhibidor de RAF.
Pueden usarse varios metodos adecuados para explorar acidos nucleicos de BRAF mutante y polipeptidos de BRAF mutante con respecto a resistencia al tratamiento con un inhibidor de RAF, por ejemplo, RAF-265. En todos los casos, un polipeptido de BRAF mutante que es resistente al tratamiento con un inhibidor de RAF muestra mayor actividad de BrAf en presencia del inhibidor de RAF que un polipeptido de BRAF de tipo silvestre o un polipeptido de BRAF V600E en presencia del inhibidor de RAF. En un metodo ejemplar, una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF mutante puede expresarse en celulas de otro modo sensibles a tratamiento con un inhibidor de RAF. Una llnea celular ejemplar util para este fin es la llnea celular de melanoma A375. Despues de la expresion del polipeptido de BRAF mutante, las celulas pueden tratarse con un inhibidor de RAF. Una actividad del polipeptido de BRAF mutante puede despues medirse y compararse con la actividad de un polipeptido de BRAF de tipo silvestre (o un polipeptido de BRAF V600E) expresado y tratado de forma similar con el inhibidor de RAF.
La actividad de un polipeptido de BRAF puede determinarse, por ejemplo, midiendo la proliferacion o viabilidad celular despues del tratamiento con el inhibidor de BRAF, en el que la proliferacion o viabilidad se correlacionan positivamente con la actividad de BRAF. El crecimiento, la proliferacion o la viabilidad celulares pueden determinarse usando cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica. En una realizacion, el crecimiento celular puede determinarse usando ensayos de proliferacion/viabilidad celular basados en pocillos tales como MTS o Cell Titer GLo, en los que el crecimiento celular en presencia de un inhibidor de RAF se expresa como un porcentaje del observado en celulas no tratadas cultivadas en ausencia del inhibidor de RAF. En ciertas realizaciones, la resistencia se define como un desplazamiento en el valor de GI50 de al menos 2 veces, mas preferentemente al menos 3 veces, mas preferentemente al menos 4-5 veces, con respecto a un control adecuado. En otras realizaciones, la resistencia se define como un valor de GI50 de ~1 pM). La actividad de un polipeptido de BRAF tambien puede medirse, por ejemplo, determinando la cantidad relativa de MEK1/2 o ERK1/2 fosforilada presente en la celula despues del tratamiento con el inhibidor de BRAF. La actividad de un polipeptido de BRAF de tipo silvestre o mutante tambien puede determinarse usando un ensayo de fosforilacion in vitro, en el que la actividad de BRAF se determina midiendo la proporcion de MEK1/2 o ERKl/2 fosforilada en el ensayo despues del tratamiento con el inhibidor de BRAF. Como se ha observado anteriormente, MEK1/2 es un sustrato de BRAF, mientras que ERK1/2 es un sustrato de MEK1/2, y actua como un indicador corriente abajo de la actividad de BRAF. Se identifica que un polipeptido de BRAF mutante que tiene mayor actividad que un polipeptido de BRAF de tipo silvestre o un polipeptido de BRAF V600E despues del tratamiento con un inhibidor de RAF contiene una mutacion que confiere resistencia a un inhibidor de rAf. La mutacion que confiere resistencia a un inhibidor de RAF puede despues identificarse secuenciando el acido nucleico que codifica el polipeptido de BRAF mutante, o secuenciando el polipeptido de BRAF mutante directamente.
(B) Mutaciones de BRAF que confieren resistencia a RAF-265
De la manera anterior, se identificaron varios restos de aminoacidos del polipeptido de BRAF humano que, cuando se mutan, confieren resistencia al inhibidor de RAF RAF-265. Estos restos de aminoacidos incluyen uno o mas de los siguientes: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En ciertas realizaciones de la invention, los polipeptidos de BRAF mutante contienen una mutacion con respecto a la secuencia polipeptldica de BRAF V600E en uno o mas de estos restos de aminoacidos. En realizaciones relacionadas, las moleculas de acido nucleico de BRAF mutantes contienen una mutacion con respecto a la secuencia polipeptldica de BRAF V600E en uno o mas nucleotidos que codifican uno o mas de estos restos de aminoacidos. En realizaciones ejemplares, los polipeptidos de BRAF mutantes presentados en el presente documento contienen una o mas de las siguientes mutaciones de resistencia: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F. En otras realizaciones ejemplares, las moleculas de acido nucleico de BRAF mutante presentadas en el presente documento codifican un polipeptido de BRAF mutante que contiene una o mas de las siguientes mutaciones de resistencia: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
Las moleculas de acido nucleico de BRAF mutante y polipeptidos de BRAF mutante de la invencion pueden contener otras mutaciones ademas de las descritas en el presente documento. Por ejemplo, un polipeptido de BRAF mutante de la invencion puede contener mutaciones en otros restos de aminoacidos ademas de una o mas mutaciones en los restos de aminoacidos A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En todos los casos, los polipeptidos de BRAF mutante de la invencion tienen actividad de BRAF, y las moleculas de acido nucleico de BRAF mutante de la invencion codifican polipeptidos que tienen actividad de BRAF. En una realizacion ejemplar, una molecula de BRAF mutante de la invencion tiene una mutacion en el resto de aminoacido V600, ademas de una o mas mutaciones en los restos de aminoacidos A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En una realizacion, la mutacion en V600 es una mutacion de activation, por ejemplo, una mutacion V600E. Se ha mostrado que el inhibidor de RAF RAF-265 inhibe eficazmente la actividad de BRAF que contiene una mutacion de activacion V600E. Esta mutacion esta presente en un alto porcentaje de tumores, incluyendo aproximadamente dos tercios de melanomas. Las mutaciones de resistencia de BRAF descritas en el presente documento confieren resistencia a inhibidores de RAF tales como RAF-265 sobre el alelo de BRAF-V600E. En consecuencia, los pacientes que tienen un tumor que contiene BRAF-V600E estan en riesgo de recalda durante el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generation tal como RAF-265 debido a la adquisicion de una segunda mutacion de BRAF en cualquiera de los siguientes sitios: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748.
Como se describe en el presente documento, la identification de mutaciones en BRAF que confieren resistencia a inhibidores de BRAF permite el diseno y la exploration de “inhibidores de RAF de segunda generacion” que son eficaces en la inhibition de una protelna de BRAF que tiene una o mas mutaciones de resistencia. Dichos inhibidores de RAF de segunda generacion son utiles en muchas aplicaciones cllnicas y terapeuticas, por ejemplo, en el tratamiento del cancer. La identificacion de mutaciones de resistencia en el polipeptido de BRAF tambien permite la exploracion de pacientes que tienen un cancer para determinar la presencia o ausencia de una o mas
mutaciones de resistencia de BRAF en el cancer. La determinacion de la presencia o ausencia de una o mas mutaciones de resistencia de BRAF en un cancer permite la alteracion de la estrategia de tratamiento de un paciente de cancer. Por ejemplo, la identificacion de una o mas de las mutaciones de resistencia de BRAF descritas en el presente documento en una muestra que contiene celulas cancerosas de un paciente que tiene un cancer puede usarse para estratificar el paciente con respecto al tratamiento con un inhibidor de RAF de segunda generacion. De forma similar, la identificacion de una o mas de las mutaciones de resistencia de BRAF descrita en el presente documento en una muestra que contiene celulas cancerosas de un paciente que tienen un cancer puede usarse para estratificar al paciente con respecto al tratamiento con un inhibidor de MEK. La identificacion de mutaciones de resistencia de BRAF tambien permite la exploration e identificacion de pacientes que tienen un alto riesgo de recalda o falta de respuesta a tratamiento con ciertos inhibidores de RAF.
III. Metodos para identificar inhibidores de BRAF de segunda generacion
La identificacion de mutaciones de resistencia de BRAF permite el desarrollo y/o la identificacion de “inhibidores de RAF de segunda generacion”. Como se usa en el presente documento, un inhibidor de RAF de segunda generacion es un agente que inhibe eficazmente la actividad de un polipeptido de RAF, por ejemplo, un polipeptido de BRAF, que contiene una o mas mutaciones descritas en el presente documento. Un inhibidor de RAF de segunda generacion puede inhibir o no la actividad de un polipeptido de RAF de tipo silvestre ademas de un polipeptido de RAF mutante. En una realization preferida, un inhibidor de RAF de segunda generacion inhibe la actividad de un polipeptido de BRAF V600E (SEQ ID NO: 4), as! como un polipeptido de BRAF V600E que tiene adicionalmente una o mas de las mutaciones de resistencia descritas en el presente documento. En una realizacion ejemplar, un inhibidor de RAF de segunda generacion inhibe la actividad de un polipeptido de BRAF que contiene mutaciones en uno o mas de los siguientes restos de aminoacidos: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748.
En consecuencia, la presente invention proporciona metodos para identificar un compuesto de ensayo como un inhibidor de RAF de segunda generacion de acuerdo con la revindication 8. En una realizacion, un compuesto puede identificarse como un inhibidor de RAF de segunda generacion determinando la actividad de RAF relativa de un polipeptido de BRAF mutante en presencia o ausencia del compuesto, con respecto a un polipeptido de BRAF no mutante (por ejemplo, un polipeptido de BRAF de tipo silvestre, o un polipeptido de BRAF V600E). Cuando este en presencia de un compuesto que sea un inhibidor de RAF de segunda generacion, un polipeptido de BRAF mutante tiene un menor nivel de actividad de RAF que en ausencia del compuesto. Cuando este en presencia de un compuesto que no sea un inhibidor de RAF de segunda generacion, un polipeptido de BRAF mutante tiene un nivel equivalente o mayor de actividad de RAF que en ausencia del compuesto. En ciertas realizaciones, la actividad de rAf puede medirse en un ensayo in vitro usando polipeptidos de BRAF recombinantes. En otras realizaciones, la actividad de RAF puede medirse en un ensayo in vivo usando celulas cultivadas o animales experimentales que expresan polipeptidos de BRAF.
Cualquier indicador de actividad de BRAF es adecuado para determinar si un compuesto es o no un inhibidor de RAF de segunda generacion. En una realizacion ejemplar, la actividad de BRAF se determina midiendo la fosforilacion del sustrato de RAF MEK1/2, en el que una reduction en la fosforilacion de MEK1/2 indica una reduction de la actividad de RAF. En una realizacion, la fosforilacion de MEK1/2 se mide en una celula o un extracto celular. En una realizacion alternativa, la fosforilacion de MEK1/2 se mide en un ensayo de fosforilacion in vitro usando protelnas purificadas o recombinantes. Los metodos para detectar fosforilacion de MEK1/2 conocidos en la tecnica son adecuados para medir la fosforilacion de MEK1/2 como un indicio de la actividad de un polipeptido de BRAF o un polipeptido de BRAF mutante. Dichos metodos incluyen, pero sin imitation, transferencia de Western y espectroscopia de masas. En ciertas relaciones, puede realizarse un ensayo de fosforilacion de MEK1/2 in vitro usando protelnas recombinantes. En otras realizaciones, puede realizarse un ensayo de fosforilacion de MEK1/2 in vivo usando celulas cultivadas o animales experimentales.
En otra realizacion ejemplar, la actividad de BRAF se determina midiendo la fosforilacion del sustrato de MEK ERK1/2, en el que una reduccion en la fosforilacion de ERK1/2 indica una reduccion en la actividad de BRAF. En una realizacion, la fosforilacion de ERK1/2 se mide en una celula o un extracto celular. En una realizacion alternativa, la fosforilacion de ERK1/2 se mide en un ensayo de fosforilacion in vitro usando protelnas purificadas o recombinantes. Metodos de detection de fosforilacion de ERK1/2 conocidos en la tecnica son adecuados para medir la fosforilacion de ERK1/2 como un indicio de la actividad de un polipeptido de BRAF o un polipeptido de BRAF mutante. Dichos metodos incluyen, pero sin limitation, espectroscopia de masas y transferencia de Western. En ciertas realizaciones, un ensayo de fosforilacion de ERK1/2 puede realizarse in vitro usando protelnas recombinantes. En otras realizaciones, un ensayo de fosforilacion de ERK1/2 puede realizarse in vivo usando celulas cultivadas o animales experimentales.
En una realizacion, una celula hospedadora que expresa un polipeptido de BRAF mutante se usa en la identificacion de un inhibidor de RAF de segunda generacion, en el que la sensibilidad de la celula hospedadora a un compuesto de ensayo identifica el compuesto de ensayo como un inhibidor de RAF de segunda generacion. Como se usa en el presente documento, se pretende que la expresion “sensibilidad de la celula hospedadora a un compuesto de ensayo” signifique que el compuesto de ensayo tiene un efecto medible en uno o mas parametros incluyendo el
crecimiento celular, la proliferacion celular, la viabilidad celular y/o la transduccion de senal intracelular (por ejemplo, transduccion de senal mediada por BRAF como se demuestra, por ejemplo, por fosforilacion de uno o mas sustratos de BRAF, tales como MEK1/2, o una o mas moleculas de senalizacion corriente abajo, tales como ERK1/2).
Un compuesto puede identificarse como un inhibidor de RAF de segunda generation determinando la viabilidad o tasa de proliferacion de celulas que expresan un polipeptido de BRAF mutante en presencia o ausencia del compuesto. La llnea celular usada en dicho ensayo deberla ser sensible a un inhibidor de RAF cuando la llnea celular exprese un polipeptido de BRAF de tipo silvestre, y deberla ser resistente al inhibidor de RAF (es decir, un inhibidor de RAF de primera generacion) cuando la llnea celular expresa un polipeptido de BRAF mutante. Una llnea celular ejemplar util para la identification de un inhibidor de RAF de segunda generacion es la llnea celular de melanoma A375. Las celulas A375 son sensibles al inhibidor de RAF RAF-265 cuando expresan un polipeptido de BRAF de tipo silvestre, pero son resistentes a RAF-265 cuando expresan un polipeptido de BRAF mutante, por ejemplo, un polipeptido de BRAF que contiene una o mas de las siguientes mutaciones de resistencia: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
Cuando este en presencia de un compuesto que es un inhibidor de RAF de segunda generacion, una llnea celular que expresa un polipeptido de BRAF mutante tiene una menor viabilidad o tasa de proliferacion que en ausencia del compuesto. Cuando este en presencia de un compuesto que no sea un inhibidor de RAF de segunda generacion, una llnea celular que expresa un polipeptido de BRAF mutante tiene una viabilidad o tasa de proliferacion equivalente o mayor que en ausencia del compuesto. Metodos para medir la viabilidad celular y/o tasa de proliferacion conocidos en la tecnica son adecuados para determinar la sensibilidad de una llnea celular que expresa un polipeptido de BRAF o un polipeptido de BRAF mutante a un compuesto de ensayo. Dichos metodos incluyen, pero sin limitation, medicion de la exclusion de azul de Tripano, metabolismo de compuestos de tetrazolio, incorporation de timidina tritiada, incorporation de BrdU, captation de glucosa, concentration de ATP y nivel de apoptosis. En una realization, la proliferacion celular puede determinarse usando ensayos de viabilidad/proliferacion celular basados en pocillos tales como MTS o Cell Titer GLo. En ciertas realizaciones, la sensibilidad se define como un desplazamiento en el valor de GI50 de al menos 2 veces, mas preferentemente al menos 3 veces, mas preferentemente al menos 4-5 veces, con respecto a un control adecuado.
En consecuencia, en una realizacion, la invention proporciona un metodo para identificar un compuesto que es util en el tratamiento del cancer que comprende proporcionar una composition de ensayo que comprende un sustrato de BRAF y un polipeptido de BRAF de la presente invencion, poner en contacto la composicion de ensayo con un compuesto de ensayo en condiciones que permitan la fosforilacion del sustrato de BRAF en ausencia del compuesto de ensayo, y determinar el efecto del compuesto en la fosforilacion del sustrato de BRAF, en el que la modulation negativa de la fosforilacion del sustrato de BRAF en comparacion con un control adecuado identifica el compuesto como un inhibidor de RAF de segunda generacion. Un compuesto identificado de este modo es un compuesto util para tratar un cancer, por ejemplo, un cancer en el que se ha detectado un polipeptido de RAF mutante. Un polipeptido de BRAF util en los metodos anteriores es un polipeptido de BRAF que contiene una o mas mutaciones que confieren resistencia al inhibidor de RAF RAF-265, por ejemplo, un polipeptido de BRAF que contiene una o mas de las mutaciones descritas en el presente documento. Un sustrato de BRAF util en los metodos anteriores es, por ejemplo, MEK1/2. Una disminucion, reduction o modulacion negativa de fosforilacion de MEK1/2 es un indicio de que el compuesto es un inhibidor de RAF. De forma similar, una molecula de senalizacion de RAF corriente abajo util en los metodos anteriores es, por ejemplo, ERK1/2. Una disminucion, reduccion o modulacion negativa de fosforilacion de ERK1/2 es un indicio de que el compuesto es un inhibidor de RAF. Los metodos anteriores pueden realizarse in vitro en los que los polipeptidos de BRAF y los sustratos de BRAF son protelnas aisladas o purificadas. Los metodos anteriores tambien pueden realizarse in vitro en los que los polipeptidos de BRAF y los sustratos de BRAF son componentes de un extracto celular. En esta realizacion, una composicion de ensayo es un extracto celular. Un control adecuado es cualquier control que resultarla evidente para un experto en la materia que realiza el metodo, e incluye, por ejemplo, una composicion de ensayo similar o identica no tratada con un compuesto de ensayo o tratada con un compuesto de control, o una composicion de ensayo analoga o extracto celular que comprende un polipeptido de BRAF “de tipo silvestre” o un polipeptido de BRAF V600E.
En otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para identificar un compuesto que es un inhibidor de RAF de segunda generacion, que comprende proporcionar una celula que comprende un polipeptido de BRAF mutante, poner en contacto la celula con un compuesto ensayo, y determinar el efecto del compuesto en la fosforilacion de MEK1/2, fosforilacion de ERK1/2 o proliferacion celular, en el que una disminucion, reduccion o modulacion negativa de fosforilacion de MEK1/2, fosforilacion de ERK1/2 o proliferacion celular en comparacion con un control apropiado identifica el compuesto como un inhibidor de RAF de segunda generacion. Un compuesto identificado de este modo es un compuesto util para tratar un cancer, por ejemplo, un cancer en el que se ha detectado un polipeptido de BRAF mutante. Un control adecuado es cualquier control que resultarla evidente para un experto en la materia que realice el metodo, e incluye, por ejemplo, una celula similar o identica no tratada con un compuesto de ensayo o tratada con un compuesto control, o una celula o un extracto celular analogo en el que se expreso BRAF recombinante “de tipo silvestre” o BRAF V600E.
En una realizacion, el compuesto de ensayo usado en los metodos anteriores es un inhibidor de RAF que inhibe una actividad biologica de un polipeptido de bRaF V600E. En una realizacion, los inhibidores de RAF que pueden usarse como compuestos de ensayo para determinar si son inhibidores de RAF de segunda generacion incluyen PLX4032, PLX5568, XL281, y los derivados de imidazol-2-carboxamida descritos en el documento US2008/0108615.
En otra realizacion, el compuesto de ensayo es un miembro de una biblioteca de compuestos de ensayo. Una “biblioteca de compuestos de ensayo” se refiere a un panel que comprende multiples compuestos de ensayo. Se ha descrito un enfoque para la slntesis de bibliotecas moleculares de moleculas organicas pequenas (Carell et al. (1994). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061). Los compuestos de la presente invencion pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos enfoques en metodos de bibliotecas combinatorias conocidas de la tecnica, incluyendo: bibliotecas biologicas; bibliotecas de fase en solucion o fase solida paralela abordables espacialmente, metodos de bibliotecas sinteticas que requieren desconvolucion, el metodo de la biblioteca de “una perla un compuesto”, y metodos de bibliotecas sinteticas usando seleccion de cromatografla de afinidad. El enfoque de biblioteca biologica se limita a bibliotecas peptldicas, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de compuestos de peptidos, oligomeros no peptldicos, o moleculas pequenas (Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145). Otros metodos ejemplares para la slntesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la tecnica, por ejemplo, en: Erb et al. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Horwell et al. (1996) Immunopharmacology 33:68- ; y en Gallop et al, (1994); J. Med. Chem. 37: 1233-. Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solucion (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421), o en perlas (Lam (1991) Nature 354: 82-84), microplacas (Fodor (1993) Nature 364: 555-556), bacterias (Ladner USP 5.223.409), esporas (Ladner USP '409), plasmidos (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865-1869) o en fagos (Scott y Smith (1990) Science 249: 386-390); (Devlin (1990) Science 249: 404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310). En otra realizacion mas, los polipeptidos combinatorios se producen a partir de una biblioteca de ADNc. Los compuestos ejemplares que pueden explorarse con respecto a actividad incluyen, pero sin limitacion, peptidos, acidos nucleicos, carbohidratos, moleculas organicas pequenas y bibliotecas de extractos de productos naturales.
Los inhibidores de RAF de segunda generacion tambien pueden disenarse racionalmente basandose en la estructura de alelos de BRAF que contienen una o mas de las mutaciones de resistencia descritas en el presente documento. Como se describe en el presente documento, los restos de BRAF que confieren resistencia a inhibidores de RAF se localizan en la misma region de BRAF con la que se une el inhibidor de RAF de primera generacion RAF- 265. La identificacion de alelos mutantes de BRAF que confieren resistencia a inhibidores de RAF permite la comparacion entre la estructura de los alelos mutantes y el BRAF de tipo silvestre, o a BRAF V600E. El conocimiento de las caracterlsticas estructurales alteradas que confieren resistencia a inhibidores de RAF de primera generacion permite el diseno racional y la construccion de ligandos, incluyendo inhibidores, que se uniran con e inhibiran los alelos mutantes. Dichos inhibidores pueden disenarse de modo que se unan con ambos alelos de BRAF mutantes, no conteniendo BRAF V600E una mutacion secundaria descrita en el presente documento, y BRAF de tipo silvestre. Los inhibidores disenados para unirse con un alelo de BRAF que contiene una o mas mutaciones descritas en el presente documento son inhibidores de RAF de segunda generacion. La capacidad de dichos inhibidores disenados racionalmente para inhibir una actividad biologica de un polipeptido de BRAF mutante puede confirmarse usando los ensayos in vitro y/o in vivo descritos en el presente documento.
La estructura de un polipeptido de BRAF que contiene una o mas de las mutaciones de resistencia descritas en el presente documento puede determinarse por modelizacion asistida por ordenador, o determinando la estructura cristalina o en solucion del polipeptido de BRAF mutante. Puede usarse cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica para determinar la estructura de un polipeptido de BRAF mutante.
Los metodos de modelizacion asistidos por ordenador ejemplares incluyen el uso de programas de software tales como PYMOL, CAVITY (descrito en J. Comp. Aided. Mol. Des. (1990) 4: 337-354) y Discovery Studio® (Accelrys, San Diego, CA). Se describen tecnicas adicionales utiles para modelizacion molecular asistida por ordenador en J BUON. (2007) 12 Supl 1: S101-18. Tambien puede usarse analisis basado en ordenador de una protelna con una estructura conocida para identificar moleculas que se uniran con la protelna. Dichos metodos clasifican moleculas basandose en su forma complementaria a un sitio de receptor. Por ejemplo, usando una base de datos tridimensional, puede usarse un programa tal como DOCK para identificar moleculas que se uniran con XBP-1, IRE- 1 alfa, y/o EdEm. Vease DesJarlias et al. (1988) J. Med. Chem. 31:722; Meng et al. (1992) J. Computer Chem. 13:505; Meng et al. (1993) Proteins 17: 266; Shoichet et al. (1993) Science 259: 1445. Ademas, la complementariedad electronica de una molecula con una protelna diana tambien puede analizarse para identificar moleculas que se unan con la diana. Esto puede determinarse usando, por ejemplo, un campo de fuerza de mecanica molecular como se describe en Meng et al. (1992) J. Computer Chem. 13: 505 y Meng et al. (1993) Proteins 17: 266. Otros programas que pueden usarse incluyen CLIX que usa un campo de fuerza de GRID en el acoplamiento de ligandos potenciales (vease, por ejemplo, Lawrence et al. (1992) Proteins 12: 31; Goodford et al. (1985) J. Med. Chem. 28: 849; y Boobbyer et al. (1989) J. Med. Chem. 32: 1083).
Puede realizarse cristalizacion por cualquier metodo de cristalizacion, incluyendo, pero sin limitacion, metodos discontinuos, de dialisis y de difusion por vapor (por ejemplo, gota en reposo y gota colgante). Tambien pueden realizarse microsiembra, macrosiembra y/o siembra en estrlas de cristales para facilitar la cristalizacion. Pueden
formarse cristales que comprenden alelos mutantes de BRAF por una diversidad de diferentes metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, pueden realizarse cristalizaciones por metodos discontinuos, de dialisis y de difusion de vapor (gota en reposo y gota colgante). Puede encontrarse una descripcion detallada de preparaciones de cristalizacion de protelnas basicas en McRee, D., Practical Protein Crystallography, 2a Ed. (1999), Academic Press Inc. Se proporcionan descripciones adicionales con respecto a la realizacion de experimentos de cristalizacion en Stevens et al. (2000) Curr. Opin. Struck. Biol.: 10(5): 558-63, y Patentes de Estados Unidos N.° 6.296.673; 5.419.278; y 5.096.676. Dichos cristales pueden usarse para realizar analisis de difraccion de Rayos X o neutrones para determinar la estructura tridimensional de alelos mutantes de BRAF. Puede identificarse una estructura en solucion de un polipeptido de BRAF o polipeptido de BRAF mutante usando espectroscopia de resonancia magnetica nuclear usando tecnicas conocidas en este campo. Se describen metodos adecuados para determinacion de la estructura polipeptldica por cristalografla de Rayos X o espectroscopia de RMN en Brunger et al., (1998) “Crystallography & NMR system (CNS): A new software system for macromolecular structure determination”, Acta Crystallogr D54, 905-921; Brunger et al. (1987) “Solution of a Protein Crystal Structure with a Model Obtained From NMR Interproton Distance Restraints”, Science 235, 1049-1053; Drenth, “Principles of Protein X-ray Crystallography”, (1994), Springer-Verlag. pp. 1-19; y Narula et al. (1995) “Solution structure of the C terminal SH2 domain of the human tyrosine kinase Syk complexed with a phosphotyrosine pentapeptide” Structure 3, 1061-1073. Tras la identification de la estructura cristalina o en solucion de un polipeptido de RAF mutante, pueden identificarse inhibidores del polipeptido de BRAF mutante usando los enfoques de modelizacion asistidos por ordenador descritos anteriormente.
Los inhibidores de RAF de segunda generation identificados por los metodos anteriores son utiles para tratar una enfermedad o afeccion asociadas con la expresion de un polipeptido de RAF de tipo silvestre y/o mutante. Por ejemplo, los inhibidores de RAF de segunda generacion son utiles para tratar un cancer en un sujeto, particularmente un cancer en el que se ha identificado un polipeptido de BRAF mutante. Como se ensena en el presente documento, los inhibidores de RAF de segunda generacion son utiles para tratar un cancer que contiene un polipeptido de BRAF que tiene una mutation en uno o mas de los siguientes restos de aminoacidos: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. Tambien se ensena que los inhibidores de RAF de segunda generacion son utiles para tratar un cancer que contiene un polipeptido de BRAF que tiene una o mas de las siguientes mutaciones: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
IV. Moleculas de acido nucleico aisladas
La presente invention se refiere a polinucleotidos o moleculas de acido nucleico relacionadas con el gen de BRAF y su producto genico respectivo. Estos polinucleotidos o moleculas de acido nucleico son aislables y purificables desde celulas de mamlfero. En aspectos particulares de la invencion, las moleculas de acido nucleico de BRAF aisladas descritas en el presente documento comprenden una o mas mutaciones que confieren resistencia a un inhibidor de BRAF. Una “molecula de acido nucleico de BRAF mutante”, como se hace referencia en el presente documento, incluye una molecula de acido nucleico de BRAF que codifica un polipeptido de BRAF mutante, es decir, un polipeptido de BRAF que contiene una o mas mutaciones que confieren resistencia a uno o mas inhibidores de BRAf conocidos.
Se contempla que una molecula de acido nucleico de BRAF aislada y purificada, por ejemplo, una molecula de acido nucleico de BRAF mutante, puede tomar la forma de ARN o ADN. Como se usa en el presente documento, la expresion “transcrito de ARN” se refiere a una molecula de ARN que es el producto de la transcription de una molecula de acido nucleico de ADN. Dicho transcrito puede codificar uno o mas polipeptidos.
Como se usa en la presente solicitud, el termino “polinucleotido” se refiere a una molecula de acido nucleico, ARN o ADN, que se ha aislado, tal como que esta libre de acido nucleico genomico total. Por lo tanto, un “polinucleotido que codifica BRAF” se refiere a un segmento de acido nucleico que contiene secuencias codificantes de BRAF, pero esta aislado de, o purificado y libre de, ADN genomico total y protelnas. Cuando la presente solicitud se refiere a la funcion o actividad de un polinucleotido o acido nucleico que codifica BRAF, se entiende que el polinucleotido codifica una molecula que es capaz de realizar una actividad de un polipeptido de BRAF de tipo silvestre, por ejemplo, fosforilacion de los sustratos MEK1 o MEK2.
Se entiende que el termino “ADNc” se refiere a ADN preparado usando ARN como un molde. La ventaja de usar un ADNc, a diferencia de ADN genomico o un transcrito de ARN es la estabilidad y la capacidad de manipular la secuencia usando tecnologla de ADN recombinante (Vease Sambrook, 1989; Ausubel, 1996). Puede haber ocasiones en las que se prefiera la secuencia genomica completa o parcial. Como alternativa, el ADNc puede ser ventajoso porque representa regiones codificantes de un polipeptido y elimina intrones y otras regiones reguladoras.
Tambien se contempla que un acido nucleico que codifica BRAF dado o gen de BRAF de una celula dada puede representarse por variantes naturales o cepas que tienen secuencias de acido nucleico ligeramente diferentes pero, no obstante, codifican un polipeptido de BRAF activo. En una realizacion preferida, el polipeptido de BRAF activo es un polipeptido de BRAF humano activo. En realizaciones particularmente preferidas, el polipeptido de BRAF activo
es un polipeptido de BRAF mutante que tiene una actividad de un polipeptido de BRAF de tipo silvestre, pero que es resistente a uno o mas inhibidores de BRAF conocidos. En consecuencia, ciertos aspectos de la presente invencion abarcan derivados de BRAF con cambios de aminoacidos mlnimos, pero que poseen la misma funcion biologica.
El termino “gen” se usa para mayor simplicidad para hacer referencia a una protelna, un polipeptido o una unidad codificante de peptidos funcional. Como se entendera por los expertos en la materia, este termino funcional incluye secuencias genomicas, secuencias de ADNc y segmentos genicos modificados tecnicamente mas pequenos que expresan, o pueden adaptarse para expresar, protelnas, polipeptidos, dominios, protelnas de fusion y protelnas mutantes. La molecula de acido nucleico que codifica BRAF puede comprender una secuencia de acido nucleico contigua de las siguientes longitudes: al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,

110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330,

340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550,

560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780,
790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, I050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900,

2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700,

3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500,

5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100, 7200, 7300,

7400, 7500, 7600, 7700, 7800, 7900, 8000, 8100, 8200, 8300, 8400, 8500, 8600, 8700, 8800, 8900, 9000, 9100,
9200, 9300, 9400, 9500, 9600, 9700, 9800, 9900, 10000, 10100, 10200, 10300, 10400, 10500, 10600, 10700, 10800, 10900, 11000, 11100, 11200, 11300, 11400, 11500, 11600, 11700, 11800, 11900, 12000 o mas nucleotidos, nucleosidos o pares de bases, dichas secuencias pueden ser identicas o complementarias de, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma.
Diversas realizaciones de la invencion se refieren a mutaciones geneticas en BRAF. Como se usa en el presente documento, una mutacion se refiere a una adicion, supresion o sustitucion de un unico nucleotido en un sitio en una molecula de acido nucleico de BRAF. En una realizacion ejemplar, una molecula de acido nucleico de BRAF mutante contiene una o mas mutaciones que confieren resistencia a una terapia particular, tal como un inhibidor de BRAF, por ejemplo, RAF-265. En una realizacion relacionada, una molecula de acido nucleico de BRAF mutante contiene uno o mas mutaciones de modo que la molecula de acido nucleico de BRAF mutante codifique un polipeptido de BRAF mutante, en el que el polipeptido de BRAF mutante contiene una o mas mutaciones que confieren resistencia a una terapia particular, tal como un inhibidor de BRAF, por ejemplo, RAF-265. Por lo tanto, en aspectos particulares de la invencion, una alteracion en una secuencia da como resultado un cambio que afecta a las propiedades de un polipeptido codificado por la secuencia de modo que se produzca como resultado al menos algo de resistencia a la terapia, tal como terapia con un inhibidor de BRAF.
“Sustancialmente aislado de otras secuencias codificantes” significa que el gen de interes forma parte de la region codificante del segmento de acido nucleico, y que el segmento no contiene partes grandes de acido nucleico codificante de origen natural, tal como fragmentos cromosomicos grandes u otros genes funcionales o regiones codificantes de ADNc. Por supuesto, esto se refiere al segmento de acido nucleico como se aislo originalmente, y no excluye genes o regiones codificantes anadidas posteriormente al segmento por manipulacion humana.
En realizaciones particulares, la invencion se refiere a segmentos de acido nucleico aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que codifican polipeptidos o peptidos de BRAF mutantes de acuerdo con la presente invencion que incluyen dentro de su secuencia de aminoacidos una secuencia de aminoacidos contigua de acuerdo con, o esencialmente correspondiente a polipeptidos de BRAF mutante. En realizaciones ejemplares, la invencion se refiere a segmentos de ADN aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que codifican una protelna, un polipeptido o un peptido de BRAF de acuerdo con la presente invencion que incluye dentro de su secuencia de aminoacidos una secuencia de aminoacidos contigua de un polipeptido de BRAF que comprende una o mas mutaciones que confieren resistencia a un inhibidor de BRAF. La o las mutaciones aparecen en las posiciones A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En otras realizaciones, la o las mutaciones tambien incluyen lo siguiente: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
Los segmentos de acido nucleico usados en la presente invencion, independientemente de la longitud de la secuencia codificante en si misma, pueden combinarse con otras secuencias de ADN o ARN, tales como promotores, senales de poliadenilacion, sitios de enzimas de restriction adicionales, sitios de donation multiples, otros segmentos codificantes y similares, de modo que su longitud global pueda variar considerablemente. Se contempla por lo tanto que puede emplearse un fragmento de acido nucleico de casi cualquier longitud, estando la longitud total preferentemente limitada por la facilidad de preparation y el uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido.
Se contempla que las construcciones de acido nucleico de la presente invencion codifican un polipeptido de BRAF o un polipeptido de BRAF mutante. Una secuencia “heterologa” se refiere a una secuencia que es ajena o exogena a
la secuencia restante. Un gen heterologo se refiere a un gen que no se encuentra en la naturaleza adyacente a las secuencias con las que se coloca ahora.
En un ejemplo no limitante, puede prepararse una o mas construcciones de acido nucleico que incluyen un tramo contiguo de nucleotidos identicos a o complementarios de todo o parte de un gen de BRAF. Una construccion de acido nucleico puede comprender al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000,
2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 20.000,
30.000, 50.000, 100.000, 250.000, aproximadamente 500.000, 750.000, hasta aproximadamente 1.000.000 de nucleotidos de longitud, as! como construcciones de mayor tamano, hasta e incluyendo tamanos cromosomicos (incluyendo todas las longitudes intermedias e intervalos intermedios), ya que la aparicion de construcciones de acidos nucleicos tales como un cromosoma artificial de levadura se conoce por los expertos habituales en la materia. Se entendera facilmente que “longitudes intermedias” e “intervalos intermedios”, como se usa en el presente documento, significa cualquier longitud o intervalo incluyendo o entre los valores indicados (es decir, todos los numeros enteros incluyendo y entre dichos valores). Los ejemplos no limitantes de longitudes intermedias incluyen aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, etc.; aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, etc.; aproximadamente 31, aproximadamente 32, etc.; aproximadamente 51, aproximadamente 52, aproximadamente 53, etc.; aproximadamente 101, aproximadamente 102, aproximadamente 103, etc.; aproximadamente 151, aproximadamente 152, aproximadamente 153, aproximadamente 97001, aproximadamente 1.001, aproximadamente 1002, aproximadamente 50.001, aproximadamente 50.002, aproximadamente 750.001, aproximadamente 750.002, aproximadamente 1.000.001, aproximadamente 1.000.002, etc. Los ejemplos no limitantes de intervalos intermedios incluyen de aproximadamente 3 a aproximadamente 32, de aproximadamente 150 a aproximadamente 500.001, de aproximadamente 3.032 a aproximadamente 7.145, de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 15,000, de aproximadamente 20.07 a aproximadamente 1.000.003, etc.
Ciertas realizaciones de la presente invencion se refieren a diversos acidos nucleicos, incluyendo vectores, promotores, acidos nucleicos terapeuticos y otros elementos de acidos nucleicos implicados en la transformacion y expresion en celulas. En ciertos aspectos, un acido nucleico comprende un acido nucleico de tipo silvestre o mutante. En aspectos particulares, un acido nucleico codificada o comprende un acido nucleico transcrito.
La expresion “acido nucleico” se conoce bien en la tecnica. Un “acido nucleico” como se usa en el presente documento generalmente se referira a una molecula (es decir, una cadena) de ADN, ARN o un derivado o analogo de la misma, que comprende una nucleobase. Una nucleobase incluye, por ejemplo, una base de purina o pirimidina de origen natural hallada en el ADN (por ejemplo, una adenina “A”, una guanina “G”, una timina “T” o una citosina “C”) o ARN (por ejemplo, una A, una G, un uracilo “U” o una C). La expresion “acido nucleico” abarca los terminos “oligonucleotido” y “polinucleotido”, cada uno como un subgenero de la expresion “acido nucleico”. El termino “oligonucleotido” se refiere a una molecula de entre aproximadamente 3 y aproximadamente 100 nucleobases de longitud. El termino “oligonucleotido” se refiere a al menos una molecula de mas de aproximadamente 100 nucleobases de longitud. Un “gen” se refiere a secuencia codificante de un producto genico, as! como intrones y el promotor del producto genico. Ademas del gen de BRAF, otras regiones reguladoras tales como potenciadores para BRAF se contemplan como acidos nucleicos para uso con composiciones y metodos de la invencion reivindicada.
Estas definiciones se refieren en general a una molecula monocatenaria, pero en realizaciones especlficas tambien abarcaran una cadena adicional que es parcialmente, sustancialmente o completamente complementaria de la molecula monocatenaria. Por lo tanto, un acido nucleico puede abarcar una molecula bicatenaria o una molecula tricatenaria que comprende una o mas cadenas complementarias o “complemento o complementos” de una secuencia particular que comprende una molecula. Como se usa en el presente documento, un acido nucleico monocatenario puede indicarse por el prefijo “mc”, un acido nucleico bicatenario por el prefijo “bc”, y un acido nucleico tricatenario por el prefijo “tc”.
Un acido nucleico puede prepararse por cualquier tecnica conocida por los expertos en la materia, por ejemplo, por slntesis qulmica, o por produccion enzimatica o produccion biologica. Los ejemplos no limitantes de un acido nucleico sintetico (por ejemplo, un cebador de BRAF sintetico que facilita la identificacion de una mutacion que confiere resistencia a un inhibidor de BRAF), incluyen un acido nucleico compuesto por slntesis qulmica in vitro usando qulmica de fosfotriester, fosfito o fosforamidita y tecnicas de fase solida tales como las descritas en el documento EP 266.032 o mediante intermedios de desoxinucleosido H-fosfonato como se describe en Froehler et al., 1986 y Patente de Estados Unidos n.° 5.705.629. En los metodos de la presente invencion, pueden usarse uno o mas oligonucleotidos. Se han desvelado diversos mecanismos diferentes de slntesis de oligonucleotidos, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos n.° 4.659.774, 4.816.571, 5.141.813, 5.264.566, 4.959.463, 5.428.148, 5.554.744, 5.574.146, 5.602.244.
Un ejemplo no limitante de un acido nucleico producido de forma enzimatica incluye uno producido por enzimas en reacciones de amplification tales como PCR (vease por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.° 4.683.202 y 4.682.195, o una producida por slntesis de oligonucleotidos, como se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 5.645.897. Un ejemplo no limitante de un acido nucleico producido de forma biologica incluye un acido nucleico recombinante producido (es decir, replicado) en una celula viva, tal como un vector de ADN recombinante replicado
en bacterias (vease por ejemplo, Sambrook et al. 1989).
Un acido nucleico puede purificarse en geles de poliacrilamida, gradientes de centrifugacion de cloruro de cesio o por cualquier otro medio conocido por un experto en la material como parte de la evaluacion de una mutacion que confiere resistencia a BRAF (vease, por ejemplo, Sambrook et al., 1989). En aspectos preferidos, un acido nucleico es un acido nucleico farmacologicamente aceptable. Los expertos en la materia conocen composiciones farmacologicamente aceptables, y se describen en el presente documento.
En ciertos aspectos, la presente invention se refiere a un acido nucleico que es un acido nucleico aislado. Como se usa en el presente documento, la expresion “acido nucleico aislado” se refiere a una molecula de acido nucleico (por ejemplo, una molecula de ARN o ADN) que se ha aislado de, o esta de otro modo libre de, el volumen de los acidos nucleicos transcritos y genomicos totales de una o mas celulas. En ciertas realizaciones, “acido nucleico aislado” se refiere a un acido nucleico que se ha aislado de, o esta de otro modo libre de, el volumen de componentes celulares o componentes de reaction in vitro, incluyendo, por ejemplo, macromoleculas tales como llpidos o protelnas, moleculas biologicas pequenas y similares.
V. Vectores de expresion y celulas hospedadoras
La presente invencion abarca composiciones del vector de expresion y el uso de dichos vectores para codificar un polipeptido de BRAF, por ejemplo, un polipeptido de BRAF mutante, as! como composiciones de celulas hospedadoras en las que se han introducido dichos vectores de expresion. El termino “vector” se usa para hacer referencia a una molecula de acido nucleico transportadora en la que puede insertarse una secuencia de acido nucleico para la introduction en una celula en la que puede replicarse. Una secuencia de acido nucleico puede ser “exogena”, lo que significa que es ajena a la celula en la que se introduce el vector o que la secuencia es homologa de una secuencia en la celula pero esta en una position dentro del acido nucleico de la celula hospedadora en la secuencia no se encuentra habitualmente. Los vectores incluyen plasmidos, cosmidos, virus (bacteriofagos, virus animales y virus vegetales), y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC). Un experto en la materia estarla bien equipado para construir un vector mediante tecnicas recombinantes convencionales, que se describen en Sambrook et al., 1989 y Ausubel et al., 1996.
La expresion “vector de expresion” o “construction de expresion” se refiere a un vector que contiene una secuencia de acido nucleico que codifica al menos parte de un producto genico capaz de transcribirse. En algunos casos, las moleculas de ARN se traducen despues a una protelna, un polipeptido o un peptido. En otros casos, estas secuencias no se traducen, por ejemplo, en la production de moleculas antisentido o ribozimas. Los vectores de expresion pueden contener una diversidad de “secuencias de control”, que se refieren a secuencias de acido nucleico necesarias para la transcription y posiblemente traduction de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular. Ademas de controlar secuencias que gobiernan la transcripcion y la traduccion, los vectores y vectores de expresion pueden contener secuencias de acido nucleico que cumplen otras funciones tambien y se describen posteriormente.
1. Promotores y potenciadores
Un “promotor” es una secuencia de control que es una region de una secuencia de acido nucleico en la que se controlan el inicio y la tasa de transcripcion. Puede contener elementos geneticos en los que las protelnas y moleculas reguladoras pueden unirse tal como ARN polimerasa y otros factores de transcripcion. Las expresiones “situado operativamente”, “unido operativamente”, “bajo control” y “bajo control transcripcional” significan que un promotor esta en una localization y/u orientation funcionales correctas en relation con una secuencia de acido nucleico para controlar el inicio de la transcripcion y/o la expresion de esa secuencia. Un promotor puede usarse o no junto con un “potenciador”, que se refiere a una secuencia reguladora de action en cis implicada en la activation transcripcional de una secuencia de acido nucleico.
Un promotor puede ser uno asociado de forma natural con un gen o una secuencia, como puede obtenerse aislando las secuencias 5' no codificantes localizadas cadena arriba del segmento codificante y/o exon. Dicho promotor puede denominarse “endogeno”. De forma similar, un potenciador puede ser uno asociado de forma natural con una secuencia de acido nucleico, localizado bien cadena abajo o bien cadena arriba de esa secuencia. Como alternativa, se obtendran ciertas ventajas situando el segmento de acido nucleico codificante bajo el control de un promotor recombinante o heterologo, que se refiere a un promotor que no esta normalmente asociado con una secuencia de acido nucleico en su ambiente natural. Un potenciador recombinante o heterologo se refiere tambien a un potenciador no asociado normalmente con una secuencia de acido nucleico en su ambiente natural. Dichos promotores o potenciadores pueden incluir promotores o potenciadores de otros genes, y promotores o potenciadores aislados de cualquier otra celula procariota, viral, o eucariota, y promotores o potenciadores no “de origen natural”, es decir, que contienen diferentes elementos de diferentes regiones reguladoras de la transcripcion, y/o mutaciones que alteran la expresion.
De forma natural, sera importante emplear un promotor y/o potenciador que dirija eficazmente la expresion del segmento de acido nucleico en el tipo celular, organulo y organismo elegido para expresion. Los expertos en la
material de la biologla molecular generalmente conocen el uso de promotores, potenciadores y combinaciones de tipos celulares para expresion de protelnas, por ejemplo, vease Sambrook et al. (1989). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, especlficos de tejido, inducibles y/o utiles en las condiciones apropiadas para dirigir la expresion de alto nivel del segmento de ADN introducido. El promotor puede ser heterologo o exogeno, por ejemplo, un promotor no BRAF con respecto a la secuencia codificante de BRAF. En algunos ejemplos, se emplea un promotor procariota para su uso con transcripcion in vitro de una secuencia deseada. Los promotores procariotas para uso con muchos sistemas disponibles en el mercado incluyen T7, T3, y SP6
2. Senales de inicio y sitios de union de ribosomas internos
Tambien puede requerirse una senal de inicio especlfica para traduccion eficaz de secuencias codificantes. Estas senales incluyen el codon de inicio ATG o secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar senales de control de la traduccion exogenas, incluyendo el codon de inicio ATG. Un experto en la materia serla capaz facilmente de determinar esto y proporcionar las senales necesarias. Se conoce bien que el codon de inicio debe estar “en fase” con la fase de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traduccion del inserto completo. Las senales de control de la traduccion exogenas y codones de inicio pueden ser naturales o sinteticos. La eficacia de expresion puede estar potenciada por la inclusion de elementos potenciadores de la transcripcion apropiados. En ciertas realizaciones de la invencion, el uso de elementos de sitios de entrada de ribosomas internos (IRES) se emplea para crear mensajes multigenicos, o policistronicos.
3. Sitios de clonacion multiple
Los vectores pueden incluir un sitio de clonacion multiple (MCS), que es una region de acido nucleico que contiene multiples sitios de enzimas de restriction, cualquiera de los cuales puede usarse junto con tecnologla recombinante convencional para digerir el vector (vease, por ejemplo, Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, y Cocea, 1997). “Digestion con enzimas de restriccion” se refiere a la escision catalltica de una molecula de acido nucleico con una enzima que actua solamente en localizaciones especlficas en una molecula de acido nucleico. Muchas de estas enzimas de restriccion estan disponibles en el mercado. El uso de dichas enzimas se entiende ampliamente por los expertos en la materia. Frecuentemente, un vector se linealiza o fragmenta usando una enzima de restriccion que corta dentro del MCS para permitir que se liguen secuencias exogenas con el vector. “Ligamiento” se refiere al proceso de formar enlaces fosfodiester entre dos fragmentos de acido nucleico, que pueden estar o no contiguos entre si. Los expertos en la materia de la tecnologla recombinante conocen bien tecnicas que implican enzimas de restriccion y reacciones de ligamiento.
4. Sitios de corte y empalme
La mayorla de las moleculas de ARN eucariotas transcritas experimentaran corte y empalme de ARN para retirar intrones de los transcritos primarios. Los vectores que contienen secuencias eucariotas genomicas pueden requerir sitios de corte y empalme donantes y/o aceptores para asegurar el procesamiento apropiado del transcrito para expresion de protelnas (vease, por ejemplo, Chandler et al., 1997).
5. Senales de termination
Los vectores o construcciones de la presente invencion generalmente comprenderan al menos una senal de terminacion. Una “senal de terminacion” o un “terminador” esta comprendido por las secuencias de ADN implicadas en la terminacion especlfica de una transcrito de ARN por una ARN polimerasa. Por lo tanto, en ciertas realizaciones se contempla una senal de terminacion que termina la production de un transcrito de ARN. Un terminador puede ser necesario in vivo para conseguir niveles de mensaje deseables.
6. Senales de poliadenilacion
Para expresion, particularmente expresion eucariota, se debe incluir tlpicamente una senal de poliadenilacion para efectuar la poliadenilacion apropiada del transcrito. No se cree que la naturaleza de la senal de poliadenilacion sea crucial para la practica exitosa de la invencion, y/o puede emplearse cualquiera de dichas secuencias. Las realizaciones preferidas incluyen la senal de poliadenilacion de SV40 y/o la senal de poliadenilacion de la hormona de crecimiento bovina, convenientes y/o que se sabe que actuan bien en diversas celulas diana. La poliadenilacion puede aumentar la estabilidad del transcrito o puede facilitar el transporte citoplasmatico.
7. Origenes de replication
Para preparar un vector en una celula hospedadora, puede contener uno o mas origenes de sitios de replicacion (con frecuencia denominados “ori”), que es una secuencia de acido nucleico especlfica en la que se inicia la replicacion. Como alternativa puede emplearse una secuencia de replicacion autonoma (ARS) si la celula hospedadora es levadura.
8. Marcadores seleccionables y explorables
En ciertas realizaciones de la invencion, las celulas que contienen una construction de acido nucleico de la presente invention pueden identificarse in vitro o in vivo incluyendo un marcador en el vector de expresion. Dichos marcadores conferirlan un cambio identificable a la celula permitiendo la identification facil de celulas que contienen el vector de expresion. En general, un marcador seleccionable es uno que confiere una propiedad que permite la selection. Un marcador seleccionable positivo es uno en el que la presencia del marcador permite su selection, mientras que un marcador seleccionable negativo es uno en el que su presencia evita su seleccion. Un ejemplo de un marcador seleccionable positivo es un marcador de resistencia a farmacos.
Habitualmente la inclusion de un marcador de seleccion de farmacos ayuda en la donation e identificacion de transformantes, por ejemplo, genes que confieren resistencia a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores seleccionables utiles. Ademas de marcadores que confieren un fenotipo que permite la diferenciacion de transformantes basandose en la implementation de condiciones, tambien se contemplan otros tipos de marcadores incluyendo marcadores explorables, tales como GFP, que se basan en el analisis calorimetrico. Como alternativa, pueden utilizarse enzimas explorables tales como timidina quinasa (tk) de virus del herpes simple o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Un experto en la materia tambien sabrla como emplear marcadores inmunologicos, posiblemente junto con analisis de FACS. No se cree que el marcador usado sea importante, siempre que sea capaz de expresarse simultaneamente con el acido nucleico que codifica un producto genico. Se conocen bien por los expertos en la materia ejemplos adicionales de marcadores seleccionables y explorables.
9. Celulas hospedadoras
Como se usa en el presente documento, las expresiones “celula”, “llnea celular” y “cultivo celular” pueden usarse indistintamente. Puede emplearse en la invencion una celula que comprende un polinucleotido de BRAF, bien mutado o bien de tipo silvestre. Todos estos terminos incluyen tambien su descendencia, que se refiere a todas y cada una de las generaciones posteriores. Se entiende que toda la descendencia puede no ser identica debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. En el contexto de la expresion de una secuencia de acido nucleico heterologa, “celula hospedadora” se refiere a una celula procariota o eucariota, e incluye cualquier organismo transformable que sea capaz de replicar un vector y/o expresar un gen heterologo codificado por un vector. Una celula hospedadora puede usarse, y se ha usado, como un receptor para vectores. Una celula hospedadora puede “transfectarse” o “transformarse”, lo que se refiere a un proceso por el que se transfiere o introduce en la celula hospedadora acido nucleico exogeno. Una celula transformada incluye la celula objeto primaria y su descendencia. Una “celula hospedadora recombinante” se refiere a una celula hospedadora que porta un acido nucleico recombinante, es decir un acido nucleico que se ha manipulado in vitro o que es una copia replicada de un acido nucleico que se ha manipulado de este modo.
Una celula hospedadora puede derivar de procariotas o eucariotas, dependiendo de si el resultado deseado es replication del vector, expresion de parte de o todas las secuencias de acido nucleico codificadas por vector, o production de partlculas virales infecciosas. Estan disponibles para su uso como una celula hospedadora numerosas llneas celulares y cultivos, y pueden obtenerse a traves de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC), que es una organization que actua como un archivo para cultivos vivos y materiales geneticos. Un hospedador apropiado puede determinarse por un experto en la materia basandose en la cadena principal del vector y el resultado deseado. Puede introducirse un plasmido o cosmido, por ejemplo, en una celula hospedadora procariota para replicacion de muchos vectores. Las celulas bacterianas usadas como celulas hospedadoras para la replicacion del vector y/o expresion incluyen DH5a, JM109 y KC8, as! como varios hospedadores bacterianos disponibles en el mercado tales como Celulas competentes SURE™ y Celulas Solopack™ Gold (Strategene. RTM., La Jolla). Como alternativa, podrlan usarse celulas bacterianas tales como E. coli LE392 como celulas hospedadoras para virus fagos.
Una celula hospedadora eucariota preferida de la invencion es la llnea celular de melanoma A375, en la que la celula se ha transformado con un vector de expresion que codifica un polipeptido de BRAF, por ejemplo, un polipeptido de BRAF mutante de la invencion.
10. Sistemas de expresion
Existen numerosos sistemas de expresion que comprenden al menos una parte de o todas las composiciones analizadas anteriormente. Pueden emplearse sistemas basados en procariotas y/o eucariotas para su uso con la presente invencion para producir secuencias de acido nucleico de BRAF, o sus polipeptidos, protelnas y peptidos afines. Muchos de dichos sistemas estan disponibles en el mercado y ampliamente.
El sistema de celulas de insecto/baculovirus puede producir un alto nivel de expresion de protelnas de un segmento de acido nucleico heterologo, tal como se describe en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.871.986, 4.879.236 y que puede obtenerse, por ejemplo, bajo el nombre MaxBac™ 2.0 de Invitrogen™ y sistema de expresion de baculovirus BacPack™ de Clontech™.
Otros ejemplos de sistemas de expresion incluyen Sistema de Expresion de Mamlfero Inducible Complete Control™ de Stratagene, que implica un receptor inducible por ecdisona sintetico, o su sistema de expresion de pET, un sistema de expresion de E. coli. Otro ejemplo de un sistema de expresion inducible esta disponible de Invitrogen, que porta el sistema T-Rex™ (expresion regulada por tetraciclina), un sistema de expresion de mamlfero inducible que usa el promotor de CMV de longitud completa. Los sistemas de Tet-On™ y Tet-Off™ de Clontech™ pueden usarse para regular la expresion en un hospedador mamlfero usando tetraciclina o sus derivados. La implementacion de estos sistemas se describe en Gossen et al., 1992 y Gossen et al., 1995, y Patente de Estados Unidos n.° 5.650.298.
Invitrogen tambien proporciona un sistema de expresion de levadura denominado el Sistema de Expresion de Pichia methanolica, que se disena para produccion de alto nivel de protelnas recombinantes en la levadura metilotropica Pichia methanolica. Un experto en la materia sabrla como expresar un vector, tal como una construction de expresion, para producir una secuencia de acido nucleico o su polipeptido, protelna o peptido afln.
VI. Moleculas polipeptldicas aisladas
Otro aspecto de la invention se refiere a protelnas de BRAF aisladas y/o purificadas, y partes biologicamente activas de las mismas. En aspectos particulares de la invencion, los polipeptidos de BRAf descritos en el presente documento comprenden una o mas mutaciones que confieren resistencia a un inhibidor de BRAF. Un “polipeptido de BRAF mutante”, como se hace referencia en el presente documento, incluye un polipeptido de BRAF que contiene una o mas mutaciones que confieren resistencia a uno o mas inhibidores de BRAF conocidos.
Una protelna “aislada” o “purificada” o parte biologicamente activa de la misma esta sustancialmente libre de material celular cuando se produce por tecnicas de ADN recombinantes, o precursores qulmicos u otros productos qulmicos cuando se sintetizan qulmicamente. La expresion “sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de protelnas de BRAF en las que la protelna se separa de componentes celulares de las celulas en las que se produce de forma natural o recombinante. En una realization, la expresion “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de protelna de BRAF tienen menos de aproximadamente 30 % (en peso seco) de protelna no BRAF (tambien denominada en el presente documento “protelna contaminante”), mas preferentemente menos de aproximadamente 20 % de protelna no BRAF, aun mas preferentemente menos de aproximadamente 10 % de protelna no BRAF, y mas preferentemente menos de aproximadamente 5 % de protelna no BRAF. Cuando la protelna de BRAF o parte biologicamente activa de la misma se produce de forma recombinante, tambien esta preferentemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20 %, mas preferentemente menos de aproximadamente el 10 %, y mas preferentemente menos de aproximadamente el 5 % del volumen de la preparation de protelna. La expresion “sustancialmente libre de precursores qulmicos u otros productos qulmicos” incluye preparaciones de protelna de BRAF en las que la protelna se separa de precursores qulmicos u otros productos qulmicos que estan implicados en la slntesis de la protelna. En una realizacion, la expresion “sustancialmente libre de precursores qulmicos u otros productos qulmicos” incluye preparaciones de protelna de BRAF que tienen menos de aproximadamente 30 % (en peso seco) de precursores qulmicos o productos qulmicos no BRAF, mas preferentemente menos de aproximadamente 20 % de precursores qulmicos o productos qulmicos no BRAF, aun mas preferentemente menos de aproximadamente 10 % de precursores qulmicos o productos qulmicos no BRAF, y mas preferentemente menos de aproximadamente 5 % de precursores qulmicos o productos qulmicos no BRAF.
Las partes biologicamente activas de una protelna de BRAF incluyen peptidos que comprenden secuencias de aminoacidos derivadas de la secuencia de aminoacidos de una protelna de BRAF, por ejemplo, la secuencia de aminoacidos mostrada en SEQ ID NO: 2, o la secuencia de aminoacidos de una protelna homologa de una protelna de BRAF, que incluyen menos aminoacidos que una protelna de BRAF de longitud completa o la protelna de longitud completa que es homologa a una protelna de BRAF, y muestran al menos una actividad de una protelna de BRAF. Tlpicamente, las partes biologicamente activas (peptidos, por ejemplo, peptidos que son, por ejemplo, de 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 , 600, 700 o mas aminoacidos de longitud) comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de una protelna de BRAF. Ademas, otras partes biologicamente activas, en las que otras regiones de la protelna se suprimen, pueden prepararse por tecnicas recombinantes y evaluarse con respecto a una o mas de las actividades descritas en el presente documento. Preferentemente, las partes biologicamente activas de una protelna BRAF incluyen uno o mas dominios/motivos seleccionados o partes de los mismos que tienen actividad biologica. En realizaciones preferidas, las partes biologicamente activas de una protelna de BRAF comprenden una o mas mutaciones con respecto a una secuencia de BRAF de tipo silvestre, en las que dichas una o mas mutaciones, cuando estan presentes en un polipeptido de BRAF mutante de longitud completa, confiere resistencia del polipeptido de BRAF mutante a inhibidores de BRAF conocidos. En realizaciones ejemplares, las mutaciones suceden en aminoacidos correspondientes a una o mas de las siguientes posiciones en una protelna de BRAF de tipo silvestre: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En una realizacion relacionada, las mutaciones incluyen uno o mas de los siguientes restos de BRAF: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
Se producen preferentemente protelnas de BRAF por tecnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, una molecula de acido nucleico que codifica la protelna se clona en un vector de expresion (como se ha descrito anteriormente), el vector de expresion se introduce en una celula hospedadora (como se ha descrito anteriormente) y la protelna de BRAF se expresa en la celula hospedadora. La protelna de BRAF puede despues aislarse de las celulas por un esquema de purificacion apropiado usando tecnicas de purificacion de protelnas convencionales. Como alternativa a la expresion recombinante, una protelna, un polipeptido o un peptido de BRAF puede sintetizarse qulmicamente usando tecnicas de slntesis de peptidos convencionales. Ademas, una protelna de BRAF nativa y/o una protelna de BRAF mutante pueden aislarse de celulas (por ejemplo, celulas cancerosas), por ejemplo usando un anticuerpo anti BRAF, que puede producirse por tecnicas convencionales utilizando una protelna de BRAF o fragmento de la misma de la presente invencion.
La invencion tambien proporciona protelnas de fusion o quimericas de BRAF. Como se usa en el presente documento, una “protelna quimerica” o “protelna de fusion” de BRAF comprende un polipeptido de BRAF unido operativamente a un polipeptido no BRAF. Un “polipeptido de BRAF” se refiere a un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos correspondiente a una protelna de BRAF, mientras que un “polipeptido no BRAF” se refiere a un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos correspondiente a una protelna que no es sustancialmente homologa de la protelna de BRAF, por ejemplo, una protelna que es sustancialmente diferente de la protelna de BRAF, que no presenta una actividad de BRAF y deriva del mismo organismo o uno diferente. Dentro de la protelna de fusion, se pretende que la expresion “unido operativamente” indique que el polipeptido de BRAF y el polipeptido no BRAF estan fusionados en fase entre si. El polipeptido no BRAF puede fusionarse con el extremo N o C terminal del polipeptido de BRAF. Por ejemplo, en una realizacion la protelna de fusion es una protelna de fusion GST-BRAF en la que las secuencias de BRAF se fusionan con el extremo C terminal de las secuencias de GST. Dichas protelnas de fusion pueden facilitar la purificacion de protelnas de BRAF recombinantes. En otra realizacion, la protelna de fusion es una protelna de BRAF que contiene una secuencia senal heterologa en su extremo N terminal. En ciertas celulas hospedadoras (por ejemplo, celulas hospedadoras mamlferas), la expresion y/o secrecion de una protelna de BRAF puede aumentarse mediante el uso de una secuencia senal heterologa.
Preferentemente, una protelna de fusion o quimerica de BRAF de la invencion se produce por tecnicas de ADN recombinante convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptldicas se ligan entre si en fase de acuerdo con tecnicas convencionales, por ejemplo empleando extremos romos o escalonados para ligamiento, digestion con enzimas de restriccion para proporcionar extremos apropiados, relleno de los extremos cohesivos segun sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar union indeseable, y ligamiento enzimatico. En otra realizacion, el gen de fusion puede sintetizarse por tecnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automaticos. Como alternativa, la amplification por PCR de fragmentos genicos puede llevarse a cabo usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos genicos consecutivos que pueden posteriormente hibridarse y reamplificarse para generar una secuencia genica quimerica (vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Ademas, estan disponibles en el mercado muchos vectores de expresion que ya codifican un resto de fusion (por ejemplo, un polipeptido de GST). Un acido nucleico que codifica BRAF puede clonarse en dicho vector de expresion de modo que el resto de fusion se una en fase con la protelna de BRAF.
Se ensena en el presente documento un polipeptido de BRAF aislado de la invencion que contiene una o mas mutaciones (por ejemplo, sustituciones o supresiones) con respecto a una secuencia polipeptldica de BRAF de tipo silvestre. Se desvela en el presente documento un polipeptido de BRAF mutante que contienen una o mas mutaciones con respecto a una secuencia polipeptldica de BRAF de tipo silvestre humana (SEQ ID NO: 2). En una realizacion particularmente preferida, la o las mutaciones confieren resistencia a un inhibidor de BRAF. En una realizacion ejemplar, el inhibidor de BRAF es RAF-265. Una protelna de BRAF mutante de la invencion muestra una actividad biologica caracterlstica de una protelna de BRAF de tipo silvestre. Dicha actividad biologica puede incluir, por ejemplo, fosforilacion de MEK1 o MEK2. Los polipeptidos de BRAF mutantes ejemplares de la invencion incluyen polipeptidos de BRAF que comprenden una mutation en uno o mas de los siguientes restos de aminoacidos con respecto al polipeptido de BRaF humano de tipo silvestre: A29, H72, S113, S124, P162, C 194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, o C748. Los polipeptidos de BRAF mutantes ejemplares de la invencion tambien incluyen polipeptidos de BRAF que comprenden una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos con respecto a la protelna de BRAF humana de tipo silvestre: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
Pueden generarse protelnas de BRAF mutantes por mutagenesis de una protelna de BRAF de tipo silvestre, o de la molecula de acido nucleico que codifica una protelna de BRAF de tipo silvestre. Tambien pueden identificarse protelnas de BRAF mutantes explorando bibliotecas combinatorias de mutantes de BRAF con respecto a una protelna de BRAF mutante que tenga una actividad deseada, por ejemplo, resistencia a un inhibidor de BRAF. Se conocen en este campo varias tecnicas para explorar productos genicos de bibliotecas combinatorias realizadas por mutaciones puntuales o truncamiento, y para explorar bibliotecas de ADNc con respecto a productos genicos que tengan una propiedad seleccionada. Dichas tecnicas son adaptables para exploration rapida de las bibliotecas genicas generadas por mutagenesis combinatoria. Las tecnicas mas ampliamente usadas, que son susceptibles de analisis de alto rendimiento, para explorar bibliotecas genicas grandes tlpicamente incluyen clonar la biblioteca
genica en vectores de expresion replicables, transformar celulas apropiadas con la biblioteca de vectores resultante, y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la deteccion de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detecto
VIII. Deteccion de mutaciones
Se desvelan en el presente documento metodos para detectar la presencia de una protelna de BRAF mutante en una muestra (por ejemplo, una muestra biologica de un paciente de cancer). Puede usarse una diversidad de metodos de exploracion para detectar la presencia de una protelna de BRAF mutante de la invencion en una muestra, por ejemplo, una muestra de acido nucleico y/o una muestra polipeptldica. En divulgaciones especlficas, la muestra contiene una celula o un extracto celular. En divulgaciones ejemplares, la muestra se obtiene de un sujeto, por ejemplo, un sujeto que tiene cancer.
Se ensenan en el presente documento metodos para detectar la presencia de mutaciones de resistencia en ADN genomico, ADNc y ARN (es decir, ARNm) que contienen una secuencia que codifica una protelna de BRAF, o parte biologicamente activa de la misma, de forma similar, se desvelan tambien en el presente documento metodos para detectar la presencia de mutaciones de resistencia en polipeptidos de BRAF, o partes biologicamente activas de los mismos. Pueden usarse metodos incluyendo, pero sin limitacion, los siguientes para detectar la presencia de un polipeptido de BRAF, o una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF, que tiene una mutacion en uno o mas de los siguientes restos de aminoacidos: A29, H72, S 113, Sl24, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738, o C748. Se desvela ademas que pueden usarse metodos que incluyen, pero sin limitacion, lo siguiente para detectar la presencia de un polipeptido de BRAF, o una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF, que tiene una o mas de las siguientes mutaciones: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738Ly C748F.
Puede detectarse mutaciones puntuales usando metodos que incluyen electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (“DGGE”), analisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccion (“RALPH”), metodos de escision qulmica o enzimatica, secuenciacion directa de regiones diana amplificadas por PCR (vease anteriormente), analisis de polimorfismo de conformacion monocatenario (“SSCP”), reaccion en cadena de la polimerasa, secuenciacion, hibridacion, “captura hlbrida” seguido de pirosecuenciacion o secuenciacion de moleculas individuales, y otros metodos conocidos en la tecnica. Un metodo para explorar las mutaciones puntuales se basa en la escision por RNasa de desapareamientos de pares de bases en heteroduplex ARN/ADN o ARN/ARN. Como se usa en el presente documento, el termino “desapareamiento” se define como una region de uno o mas nucleotidos desparejados o emparejados de forma erronea en una molecula de ARN/ARN, ARN/ADN o ADN/ADN bicatenaria. Esta definicion incluye por lo tanto desapareamientos debidos a mutaciones de insercion/supresion, as! como mutaciones puntuales de bases individuales o multiples. La Patente de Estados Unidos n.° 4.946.773 describe un ensayo de escision de desapareamiento de RNasa A que implica la hibridacion de muestras de ensayo monocatenarias de ADN o ARN con una sonda de ARN, y posterior tratamiento de las dobles cadenas de acido nucleico con RNasa A. Para la deteccion de desapareamientos, los productos monocatenarios del tratamiento con RNasa A, separados electroforeticamente segun el tamano, se comparan con dobles cadenas de control tratadas de forma similar. Las muestras que contienen fragmentos mas pequenos (productos de escision) no vistos en la doble cadena de control se puntuan como positivas.
Otros investigadores han descrito el uso de RNasa I en ensayos de desapareamiento. Por ejemplo, Promega comercializa un kit que contiene RNasa I que se ha indicado que escinde tres de cuatro desapareamientos conocidos. Otros han descrito el uso de la protelna MutS u otras enzimas de reparacion de ADN para la deteccion de desapareamientos de una unica base.
Se desvelan metodos alternativos para la deteccion de mutaciones de supresion, insercion o sustitucion que pueden usarse en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.849.483, 5.851.770, 5.866.337, 5.925.525 y 5.928.870.
Pueden realizarse metodos de exploracion para explorar un individuo con respecto a la aparicion de las mutaciones identificadas anteriormente. Por ejemplo, se ensena en el presente documento que se toma una muestra (tal como sangre u otro fluido corporal o muestra celular o tisular) de un paciente para analisis genotlpico. En una ensenanza ejemplar, el paciente es un paciente de cancer. La presencia o ausencia de una o mas mutaciones descritas en el presente documento determina la capacidad de los individuos explorados para resistir la terapia con un inhibidor de BRAF de primera generation. Tambien se ensena que estos resultados se usaran para ajustar y/o alterar la dosis del inhibidor de BRAF de primera generacion, o para seleccionar un ciclo de tratamiento usando un inhibidor de BRAF de segunda generacion. El tratamiento eficaz de un sujeto que tiene cancer puede comprender la eradication de una celula cancerosa, el cese o la reduction de la velocidad de crecimiento del cancer (tal como un tumor solido), o el alivio de al menos un slntoma de cancer.
Las mutaciones de resistencia en polipeptidos de BRAF, o en moleculas de acido nucleico que codifican polipeptidos de BRAF, pueden detectarse usando cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica, o modificaciones de los
mismos, incluyendo los metodos descritos posteriormente. Dichos metodos incluyen el uso de reaccion en cadena de la polimerasa especifica de alelos, secuenciacion directa o indirecta del sitio, el uso de enzimas de restriccion en el que los alelos respectivos del sitio crean o destruyen un sitio de restriccion, el uso de sondas de hibridacion especificas de alelo, el uso de anticuerpos que son especificos para polipeptidos de BRAF mutantes, o cualquier otra interpretacion bioquimica.
1. Secuenciacion de ADN
El metodo mas habitualmente usado para caracterizar una mutacion es secuenciacion de ADN directa del locus genetico que flanquea e incluye el polimorfismo. Dicho analisis puede conseguirse usando bien el “metodo de termination de cadena mediada por didesoxi”, tambien conocido como el “Metodo de Sanger” (Sanger, F., et al., 1975) o el “metodo de degradation quimica”, tambien conocido como “metodo de Maxam-Gilbert” (Maxam, A. M., et al., 1977). La secuenciacion en combination con tecnologias de amplification especificas de secuencia genomica, tales como la reaccion en cadena de la polimerasa, puede utilizarse para facilitar la recuperation de los genes deseados (Mullis, K. et al, 1986., Solicitud de Patente Europea 50.424; Solicitud de Patente Europea 84.796, Solicitud de Patente Europea 258.017, Solicitud de Patente Europea 237.362; Solicitud de Patente Europea 201.184; Patentes de Estados Unidos n.° 4.683.202; 4.582.788 y 4.683.194). Tambien puede conseguirse secuenciacion de muestras agrupadas usando secuenciacion de Solexa/Illumina (Illumina® San Diego, CA), pirosecuenciacion u otros enfoques de secuenciacion de moleculas individuales.
2. Resistencia a exonucleasa
Otros metodos que pueden emplearse para determinar la identidad de un nucleotido presente en un sitio mutado utilizan un derivado de nucleotidos resistente a exonucleasa especializado (Patente de Estados Unidos n.° 4.656.127). Un cebador complementario de una secuencia alelica inmediatamente 3' del sitio polimorfico se hibrida con el ADN que se investiga. Si el sitio polimorfico en el ADN contiene un nucleotido que es complementario del derivado de nucleotidos resistente a exonucleotido particular presente, entonces ese derivado se incorporara por una polimerasa en el extremo del cebador hibridado. Dicha incorporation hace al cebador resistente a escision por exonucleasa y de este modo permite su detection. Como se conoce la identidad del derivado resistente a exonucleotido, se puede determinar el nucleotido especifico presente en el sitio polimorfico del ADN.
3. Metodos de microsecuenciacion
Se han descrito varios otros procedimientos de incorporacion de nucleotidos guiados por cebador para ensayar sitios mutados en ADN (Komher, J. S. et al, 1989; Sokolov, B. P., 1990; Syvanen 1990; Kuppuswamy et al., 1991; Prezant et al., 1992; Ugozzoll, L. et al., 1992; Nyren et al., 1993). Estos metodos se basan en la incorporacion de desoxinucleotidos marcados para diferenciar entre bases en un sitio mutado. Como la senal es proporcional al numero de desoxinucleotidos incorporados, las mutaciones que suceden en procesamientos del mismo nucleotido dan como resultado una senal que es proporcional a la longitud del procesamiento (Syvanen et al., 1993).
4. Extension en solution
La Patente Francesa 2.650.840 y la Solicitud de PCT n.° WO91/02087 analizan un metodo basado en solucion para determinar la identidad del nucleotido de un sitio mutado. De acuerdo con estos metodos, se usa un cebador complementario de secuencias alelicas inmediatamente 3' de un sitio polimorfico. La identidad del nucleotido de ese sitio se determina usando derivados de didesoxinucleotidos marcados que se incorporan en el extremo del cebador si son complementarios del nucleotido del sitio polimorfico.
5. Analisis por Genetic Bit™ o extension de fase solida
La Solicitud de PCT n.° 92/15712 describe un metodo que usa mezclas de terminadores marcados y un cebador que es complementario de la secuencia 3' de un sitio polimorfico. El terminador marcado que se incorpora es complementario del nucleotido presente en el sitio polimorfico de la molecula diana que se evalua y esta por lo tanto identificado. Aqui, el cebador de la molecula diana se inmoviliza en una fase solida.
6. Ensayo de ligamiento de oligonucleotidos (OLA)
El ensayo de ligamientos de oligonucleotidos es un metodo de fase solida que usa diferente metodologia que la descrita anteriormente (Landegren et al., 1988). Se utilizan dos oligonucleotidos capaces de hibridar con secuencias adyacentes de una unica cadena de un ADN diana. Uno de estos oligonucleotidos esta biotinilado mientras que el otro esta marcado de forma detectable. Si se encuentra la secuencia complementaria precisa en una molecula diana, los oligonucleotidos hibridaran de modo que sus extremos esten adyacentes, y crean un sustrato de ligamiento. El ligamiento permite la recuperacion del oligonucleotido marcado usando avidina. Tambien se describen otros ensayos de deteccion de acido nucleico, basandose en este metodo, combinado con PCR (Nickerson et al., 1990). Aqui, se usa PCR para conseguir la amplificacion exponencial de ADN diana, que despues se detecta usando el OLA.
7. Analisis por Genetic Bit mediado por ligasa/polimerasa
La Patente de Estados Unidos n.° 5.952.174 describe un metodo que tambien implica dos cebadores capaces de hibridar con secuencias adyacentes de una molecula diana. El producto hibridado se forma en un soporte solido en el que se inmoviliza la diana. Aqul la hibridacion sucede de modo que los cebadores se separen entre si por un espacio de un unico nucleotido. La incubacion de este producto hibridado en presencia de una polimerasa, una ligasa y una mezcla de nucleosidos trifosfato que contiene al menos un desoxinucleosido trifosfato permite el ligamiento de cualquier par de oligonucleotidos hibridados adyacentes. La adicion de una ligasa da como resultado dos acontecimientos requeridos para generar una senal, extension y ligamiento. Esto proporciona una mayor especificidad y menor “ruido” que los metodos que usan extension o ligamiento solamente, y a diferencia de los ensayos basados en polimerasa, este metodo potencia la especificidad de la etapa de polimerasa combinandola con una segunda etapa de hibridacion y una de ligamiento para unir una senal a la fase solida.
8. Metodos de transferencia de acido nucleico
Para algunos metodos de la presente invencion, pueden emplearse metodos de transferencia de acido nucleico. Se cree que los metodos adecuados para suministro de acido nucleico para efectuar la expresion de composiciones de la presente invencion incluyen practicamente cualquier metodo por el que puede introducirse un acido nucleico (por ejemplo, ADN, incluyendo vectores virales y no virales) en un organulo, una celula, un tejido o un organismo, como se describe en el presente documento o como se conocerla por un experto habitual en la materia. Dichos metodos incluyen, pero sin limitacion, suministro directo de ADN tal como por inyeccion (Patentes de Estados Unidos n.° 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859, incluyendo microinyeccion (Harlan y Weintraub, 1985; Patente de Estados Unidos n.° 5.789.215); por electroporacion (Patente de Estados Unidos n.° 5.384.253); por precipitacion de fosfato calcico (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); usando DEAE-dextrano seguido de polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga sonica directa (Fechheimer et al., 1987); por transfeccion mediada por liposomas (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980;. Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991); por bombardeo de microproyectiles (Solicitudes de PCT n.° WO 94/09699 y 95/06128; Patentes de Estados Unidos n.° 5.610.042; 5.322.783, 5.563.055, 5.550.318, 5.538.877 y 5.538.880); por agitacion con fibras de carburo de silicio (Kaeppler et al., 1990; Patentes de Estados Unidos n.° 5.302.523 y 5.464.765); por transformacion mediada por Agrobacterium (Patentes de Estados Unidos n.° 5.591.616 y 5.563.055); por transformacion de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh et al., 1993; Patentes de Estados Unidos n.° 4.684.611 y 4.952.500); o por captacion de ADN mediada por inhibicion/desecacion (Potrykus et al., 1985). Mediante la aplicacion de tecnicas tales como estas, pueden transformarse de forma estable o transitoria organulo u organulos, celula o celulas, tejido o tejidos u organismo u organismos.
9. Anticuerpos especificos de alelos
Pueden detectarse polipeptidos de BRAF que tienen una o mas mutaciones de resistencia descritas en el presente documento usando anticuerpos que reconocen especlficamente los polipeptidos de BRAF mutantes, pero no reconocen polipeptidos de BRAF de tipo silvestre. Pueden inducirse anticuerpos contra una o mas formas alelicas de los polipeptidos de BRAF que tienen una o mas mutaciones de resistencia. Se conocen bien tecnicas para usar una protelna especlfica o un oligopeptido como un antlgeno para inducir anticuerpos que reconozcan especlficamente epltopos en el peptido o la protelna. En una realizacion, la secuencia de ADN de la forma alelica deseada del gen diana puede clonarse por insercion en un vector de expresion apropiado y traducirse a una protelna en una celula hospedadora procariota o eucariota. La protelna puede recuperarse y usarse como un antlgeno para inducir la produccion de anticuerpos especificos. En otra realizacion, el ADN de la forma alelica deseada del gen diana se amplifica por tecnologia de PCR y se traduce posteriormente in vitro a proteina para usar como el antlgeno para inducir la produccion de anticuerpos especificos. Una tercera realizacion es para usar la secuencia de ADN de los alelos alternativos como base para la generacion de peptidos sinteticos que representen la secuencia de aminoacidos de los alelos para su uso como antlgeno para inducir la produccion de anticuerpos especificos.
Pueden generarse anticuerpos bien por tecnicas de anticuerpos monoclonales convencionales o generarse mediante sistemas de expresion basados en recombinantes. Vease, en general, Abbas, Lichtman y Pober, Cellular and Molecular Immunology, W. B. Saunders Co. (1991). Se entiende que el termino “anticuerpos” incluye moleculas de anticuerpos intactas asi como fragmentos o derivados de anticuerpos, tales como Fab y F(ab')2, que son capaces de unirse especlficamente con un antlgeno. Los anticuerpos producidos de este modo se uniran preferentemente solamente con la proteina mutante producida en forma alelica que se uso como un antigeno para crear el anticuerpo. Tambien se describen metodos para generar anticuerpos especificos de alelos en la Patente de Estados Unidos n.° 6.200.754 y Patente de Estados Unidos n.° 6.054.273.
Dichos anticuerpos especificos para polipeptidos de BRAF mutantes pueden usarse para detectar la presencia de un polipeptido de BRAF que tenga una o mas mutaciones de resistencia en una muestra, por ejemplo, una muestra de ensayo, una muestra celular, un extracto celular, una muestra biologica, o una muestra de paciente, usando tecnicas conocidas en la materia. Estas tecnicas incluyen, por ejemplo, transferencia de Western, inmunohistoqulmica, inmunofluorescencia indirecta, y micromatrices de anticuerpos. Los anticuerpos que reconocen especlficamente
polipeptidos de BRAF mutantes tambien pueden ser inhibidores de BRAF de segunda generacion. La capacidad de un anticuerpo que reconoce especlficamente un polipeptido de BRAF mutante para inhibir la actividad biologica del polipeptido de BRAF mutante puede determinarse usando los metodos descritos en el presente documento para identificar inhibidores de BRAF de segunda generacion.
IX. Aplicaciones de diagnostico y exploracion
Las tecnicas anteriores pueden usarse para determinar la presencia o ausencia de una mutacion de resistencia previamente identificada en una molecula de acido nucleico o polipeptido de BRAF en una muestra obtenida de un paciente. La identificacion de una molecula de acido nucleico o polipeptido de BRAF mutante en una muestra de paciente puede ser util para caracterizar una enfermedad o afeccion en el paciente. Por ejemplo, en un paciente que tenga una enfermedad asociada con expresion o activacion aberrante de BRAF (por ejemplo, un cancer), la identificacion de una molecula de acido nucleico o polipeptido de BRAF mutante en la muestra (por ejemplo, una muestra que contiene celulas cancerosas) obtenida del paciente indica que el paciente tiene un riesgo relativamente alto de recalda o falta de respuesta al tratamiento con un inhibidor de BRAF. Se ensena en el presente documento que la identificacion de una molecula de acido nucleico o polipeptido de BRAF que contiene una o mas mutaciones descritas en el presente documento en una muestra que contiene celulas cancerosas obtenida de un paciente indica que el paciente tiene un riesgo relativamente alto de recalda o falta de respuesta al tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generacion, por ejemplo, RAF-265.
Un paciente que tiene una mutacion de resistencia a BRAF descrita en el presente documento tiene un mayor riesgo de recalda del tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generacion que un paciente en el que no pueda detectarse una mutacion de resistencia a BRAF. En consecuencia, como se usa en el presente documento, la expresion “riesgo relativamente alto de recalda” esta en relacion con un paciente en el que no puede detectarse una molecula de acido nucleico o polipeptldica de BRAF mutante. Es decir, un paciente que tiene un “riesgo relativamente alto de recalda” es un paciente que tiene un mayor riesgo de recalda en comparacion con un paciente en el que no puede detectarse una molecula de acido nucleico o polipeptldica de BRAF mutante.
Como se ensena en el presente documento, la identificacion de un polipeptido de BRAF, o un acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF, que tiene una mutacion en uno o mas de los siguientes restos indica que el paciente tiene un riesgo relativamente alto de recalda o falta de respuesta al tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generacion, por ejemplo, RAF-265: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En divulgaciones ejemplares, la identificacion de un polipeptido de BRAF, o un acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF, que tiene una o mas de las siguientes mutaciones de resistencia indica que el paciente tiene un riesgo relativamente alto de recalda o falta de respuesta al tratamiento con un inhibidor de BRAF, por ejemplo, RAF-265: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L o C748F
La determinacion de la presencia o ausencia de una molecula de acido nucleico o polipeptldica de BRAF mutante en una muestra de paciente tambien permite la seleccion de un regimen de tratamiento optimizado para el paciente, o estratificacion del paciente a un cierto grupo de tratamiento. Se ensena en el presente documento un regimen de tratamiento que comprende el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generacion que se selecciona para un paciente en el que una muestra que contiene celulas cancerosas del paciente no contiene una molecula de acido nucleico o polipeptldica de BRAF mutante. Dicho paciente puede estratificarse en un regimen de tratamiento que comprende un inhibidor de BRAF de primera generacion. El inhibidor de BRAF puede proporcionarse a dicho paciente a una dosificacion convencional, a intervalos de dosificacion convencionales.
Tambien se ensena en el presente documento un regimen de tratamiento que comprende el tratamiento sin un inhibidor de BRAF que se selecciona para un paciente en el que una muestra que contiene celulas cancerosas del paciente contiene una molecula de acido nucleico o polipeptldica de BRAF mutante, por ejemplo, una molecula de acido nucleico o polipeptldica de BRAF que contiene una o mas de las mutaciones descritas en el presente documento. Dicho paciente puede estratificarse en un regimen de tratamiento que no comprende un inhibidor de BRAF.
Tambien se desvela un regimen de tratamiento que comprende tratamiento con una dosificacion elevada de un inhibidor de BRAF de primera generacion que se selecciona para un paciente en el que una muestra que contiene celulas cancerosas del paciente contiene una molecula de acido nucleico o polipeptldica de BRAF mutante. Dicho paciente puede estratificarse en un regimen de tratamiento que comprende una dosificacion elevada de un inhibidor de BRAF de primera generacion. En una ensenanza ejemplar, el inhibidor de BRAF de primera generacion es RAF- 265.
En una ensenanza alternativa, la identificacion de una molecula de acido nucleico o polipeptldica de BRAF mutante en una muestra que contiene celulas cancerosas obtenidas de un paciente indica que el paciente probablemente responda al tratamiento con un inhibidor de BRAF de segunda generacion. En consecuencia, se ensena en el presente documento un regimen de tratamiento que comprende el tratamiento con un inhibidor de BRAF de segunda
generacion que se selecciona para un paciente en el que una muestra que contiene celulas cancerosas del paciente contiene una molecula de acido nucleico o polipeptldica de BRAF mutante. Dicho paciente puede estratificarse en un regimen de tratamiento que comprende un inhibidor de BRAF de segunda generacion.
En aspectos particulares de las realizaciones anteriores, el polipeptido de BRAF mutante tiene una mutacion en uno o mas de los siguientes restos: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En realizaciones ejemplares el polipeptido de BRAF mutante tiene una o mas de las siguientes mutaciones: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F. En una realizacion preferida, una molecula de acido nucleico de BRAF mutante codifica un polipeptido de BRAF mutante que contiene una mutacion en uno o mas de los restos de aminoacidos anteriores.
En consecuencia, se ensena en el presente documento un metodo para optimizar el tratamiento de un sujeto que tiene cancer, que comprende extraer acido nucleico de celulas del cancer; y secuenciar una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF; en el que la presencia de nucleotidos que alteran la identidad de un resto de aminoacido en uno o mas aminoacidos del polipeptido de BRAF codificado en relacion con el aminoacido en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en A29, H72, S113, S124, P162 , C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, indica la necesidad de tratar al sujeto con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generacion.
Tambien se ensena en el presente documento un metodo para optimizar el tratamiento de un sujeto que tiene cancer, que comprende extraer acido nucleico de celulas del cancer; y someter la muestra a PCR e identificar la secuencia de nucleotidos de una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF; en el que la presencia de nucleotidos que alteran la identidad de un resto de aminoacido en uno o mas aminoacidos del polipeptido de BRAF codificado en relacion con el aminoacido en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en A29, H72, S113, S124, P162 , C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, indica la necesidad de tratar al sujeto con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generacion.
Tambien se desvela en el presente documento un metodo para tratar a un sujeto que tiene cancer, que comprende extraer acido nucleico de celulas del cancer; secuenciar una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF; y administrar un inhibidor de MEK o un inhibidor de BRAF de segunda generacion a un sujeto cuando la molecula de acido nucleico contiene nucleotidos que alteran la identidad de un resto de aminoacido en uno o mas aminoacidos del polipeptido de BRAF codificado en relacion con el aminoacido en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Tambien se desvela en el presente documento un metodo para tratar a un sujeto que tiene cancer, que comprende extraer acido nucleico de celulas del cancer; someter la muestra a PCR e identificar la secuencia de nucleotidos de una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF; y administrar un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generacion al sujeto cuando la molecula de acido nucleico contiene nucleotidos que alteran la identidad de un resto de aminoacido en uno o mas aminoacidos del polipeptido de BRAF codificado en relacion con el aminoacido en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Se ensena ademas en el presente documento un metodo para identificar un sujeto que tiene cancer que probablemente se beneficie del tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generacion, que comprende: ensayar una muestra de acido nucleico obtenida del cancer con respecto a la presencia de una o mas mutaciones en una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF que alteran la identidad de uno o mas restos de aminoacidos del polipeptido de BRAF codificado en relacion con el aminoacido en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; y correlacionar la presencia de la o las mutaciones en una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF con un sujeto que probablemente se beneficie del tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generacion.
Se desvela en el presente documento un metodo para identificar un sujeto que tiene cancer que probablemente se beneficie del tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generacion, que comprende ensayar una muestra de acido nucleico obtenida del cancer con respecto a la presencia de una o mas mutaciones en una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF que altera la identidad de uno o mas restos de aminoacidos del polipeptido de BRAF codificado en relacion con el aminoacido en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en A29, H72, S113, S124, P162, C194 , L227, P231, C251, V291, Q329,
K483, L485, T521, V528, D587, P655, 5657, 5683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; y correlacionar la presencia de la o las mutaciones en una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF con un sujeto que probablemente se beneficie del tratamiento con un inhibidor de MEK o un inhibidor de RAF de segunda generacion.
En diversas realizaciones de los aspectos anteriores, el inhibidor de MEK es CI-1040, AZD6244, PD 318088, PD98059, PD334581, RDEA119, 6-metoxi-7-(3-morfolin-4-il-propoxi)-4-(4-fenoxi-fenilamino)-quinolina-3-carbonitrilo o 4-[3-cloro-4-(1-metil-1H-imidazol-2-ilsulfanil)-fenilamino]-6-metoxi-7-(3-morfolin-4-il-propoxi)-quinolina-3-
carbonitrilo, o combinaciones de los mismos.
Se ensena en el presente documento un metodo para identificar que un sujeto que tiene cancer tiene un alto riesgo de recalda durante el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generacion, que comprende extraer acido nucleico de celulas del cancer; y secuenciar una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF; en el que la presencia de nucleotidos que alteran la identidad de un resto de aminoacido en uno o mas aminoacidos del polipeptido de BRAF codificado en relacion con el aminoacido en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en A29, H72, S113, S124, P162 , C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, identifica que el sujeto tiene un alto riesgo de recalda durante el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generacion.
Tambien se ensena un metodo para identificar que un sujeto que tiene cancer es insensible a tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generacion, que comprende extraer acido nucleico de celulas del cancer; y secuenciar una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF; en el que la presencia de nucleotidos que alteran la identidad de un resto de aminoacido en uno o mas aminoacidos del polipeptido de BRAF codificado en relacion con el aminoacido en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en A29, H72, S113, S124, P162 , C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID No: 4, identifica al sujeto como insensible a tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generacion.
En diversas realizaciones de los aspectos anteriores, el inhibidor de RAF es RAF265 o PLX 4720. En algunas ensenanzas el cancer se selecciona del grupo que consiste en leucemias, linfomas, mielomas, carcinomas, carcinomas metastasicos, sarcomas, adenomas, canceres del sistema nervioso y canceres genitourinarios. En otras realizaciones, el cancer es melanoma.
X. Metodos de Tratamiento
Se ensenan en el presente documento metodos para tratar a un sujeto que tiene un cancer. En divulgaciones ejemplares, el sujeto tiene un cancer que contiene un polipeptido de BRAF que tiene una o mas mutaciones, por ejemplo, una o mas de las mutaciones de resistencia descritas en el presente documento. En divulgaciones relacionadas, el sujeto tiene un cancer que contiene una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF que tiene una o mas mutaciones, por ejemplo, una o mas de las mutaciones de resistencia descritas en el presente documento. El termino “tratado”, “tratando” o “tratamiento” incluye la disminucion o alivio de al menos un slntoma asociado con la afeccion que se trate. Por ejemplo, el tratamiento puede ser disminucion de uno o varios slntomas de un trastorno o erradicacion completa de un trastorno, tal como cancer. De forma similar, una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto es una cantidad suficiente para disminuir o aliviar al menos un slntoma asociado con las afecciones que se tratan.
En consecuencia, se ensenan en el presente documento metodos para tratar a un sujeto que tiene un cancer que comprenden administrar al sujeto un inhibidor de RAF de segunda generacion. Tambien se ensenan metodos para tratar a un sujeto que tiene un cancer que comprenden administrar al sujeto un inhibidor de MEK. En algunas ensenanzas se identificaron en el cancer una o mas mutaciones en un polipeptido de BRAF, o en una molecula de acido nucleico que codificaba un polipeptido de BRAF, lo que confiere resistencia a uno o mas inhibidores de BRAF como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se ensena en el presente documento un metodo para tratar un cancer que contiene sustituciones de aminoacidos en una o mas de las siguientes posiciones en BRAF, opcionalmente ademas de tener una mutacion de BRAF en V600E: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, comprendiendo dicho metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de un inhibidor de BRAF de segunda generacion. Tambien se ensena un metodo para tratar un cancer que contiene sustituciones de aminoacidos en una o mas de las siguientes posiciones en BRAF, opcionalmente ademas de tener una mutacion de BRAF en V600E: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748 de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, comprendiendo dicho metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de un inhibidor de MEK. Como MEK se activa corriente abajo de RAF, un inhibidor de MEK puede inhibir con exito la senalizacion de RAF en celulas que tienen una o mas de las mutaciones de resistencia a REF descritas en el presente documento.
Los inhibidores de MEK adecuados para practicar la invencion incluyen, pero sin limitacion, I-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RdEa119, 6-metoxi-7-(3-morfolin-4-il-propoxi)-4-(4-fenoxi-fenilamino)-quinolina-3- carbonitrilo, 4-[3-cloro-4-(1-metil-1H-imidazol-2-ilsulfanil)-fenilamino]-6-metoxi-7-(3-morfolin-4-il-propoxi)-quinolina-3- carbonitrilo y el compuesto de Roche RG7420. Los inhibidores de MEK adicionales adecuados para practicar la invencion incluyen, pero sin limitacion, los compuestos descritos en los documentos WO 2008076415, US
20080166359, WO 2008067481, WO 2008055236, US 20080188453, US 20080058340, WO 2007014011, WO
2008024724, US 20080081821, WO 2008024725, US 20080085886, WO 2008021389, WO 2007123939, US
20070287709, WO 2007123936, US 20070287737, US 20070244164, WO 2007121481, US 20070238710, WO
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Se conocen en la tecnica dosificaciones, formulaciones y modos de administracion de los compuestos anteriores. Los modos ejemplares de administracion incluyen, pero sin limitacion, oral, subcutanea, intravenosa o parenteral. Las formas de dosificacion llquida para administracion oral pueden incluir, pero sin limitacion, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmaceuticamente aceptables. Ademas de los compuestos activos, las formas de dosificacion llquida pueden contener diluyentes inertes habitualmente usados en la tecnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etllico, alcohol isopropllico, etil carbonato, etil acetato, alcohol bencllico, benzil benzoato, propilenglicol, 1,3- butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodon, de cacahuete, de malz, de germen, de oliva, de ricino y de sesamo), cremafor, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurllico, polietilenglicoles y esteres de acidos grasos de sorbitan, y mezclas de los mismos. Ademas de diluyentes inertes, las composiciones orales tambien pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspension, edulcorantes, saporlferos y agentes perfumantes. Las formas de dosificacion solida para administracion oral incluyen capsulas, comprimidos, plidoras, polvos y granulos. En dichas formas de dosificacion solida, el compuesto activo se mezcla con al menos un excipiente o vehlculo inerte, farmaceuticamente aceptable, tal como citrato sodico o fosfato dicalcico y/o a) cargas o extensores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y acido sillcico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arabiga, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes disgregantes tales como agar-agar, carbonato calcico, almidon de patata o tapioca, acido alglnico, ciertos silicatos y carbonato sodico, e) agentes retardantes de solucion tales como parafina, f) acelerantes de la absorcion tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetllico y glicerol monoestearato, h) absorbentes tales como caolln y arcilla de bentonita, e i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles solidos, lauril sulfato sodico y mezclas de los mismos, y (j) potenciadores de la tasa de disolucion como polietilenglicoles de alto peso molecular o polivinilpirrolidona en mezclas flsicas o en forma de dispersiones solidas. En el caso de capsulas, comprimidos y plldoras, la forma de dosificacion tambien puede comprender agentes tamponantes.
Debido a que las mutaciones en BRAF potencial ampliamente la resistencia en varios tipos de cancer, los metodos e inhibidores de BRAF de segunda generacion descritos en el presente documento son utiles en el tratamiento de un amplio espectro de canceres, incluyendo tumores solidos y tumores malignos hematologicos. Los ejemplos de dichos tumores incluyen pero sin limitacion leucemias, linfomas, mielomas, carcinomas, carcinomas metastasicos, sarcomas, adenomas, canceres del sistema nervioso y canceres genitourinarios. Se ensena en el presente documento que los metodos anteriores son utiles en el tratamiento de leucemia linfoblastica aguda pediatrica y del adulto, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, canceres relacionados con SIDA, cancer anal, cancer de apendice, astrocitoma, carcinoma de celulas basales, cancer de conducto biliar, cancer de vejiga, cancer de hueso, osteosarcoma, histiocitoma fibroso, cancer de cerebro, glioma del tronco encefalico, astrocitoma cerebelar, glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, glioma hipotalamico, cancer de mama, cancer de mama masculino, adenomas bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, carcinoma de origen desconocido, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebelar, glioma maligno, cancer de cuello uterino, canceres de la infancia, leucemia linfocltica cronica, leucemia mielogena cronica, trastornos mieloproliferativos cronicos, cancer colorrectal, linfoma de linfocitos T cutaneo, cancer endometrial, ependimoma, cancer esofagico, tumores de la familia de Ewing, tumor de celulas germinales extracraneales, tumor de celulas germinales extragonadales, cancer del conducto biliar extrahepatico, melanoma intraocular, retinoblastoma, cancer de la veslcula biliar, cancer gastrico, tumor del estroma gastrointestinal, tumor de celulas germinales extracraneales, tumor de celulas germinales extragonadales, tumor de celulas germinales ovaricas, tumor trofoblastico gestacional, glioma, leucemia por tricoleucitos, cancer de cabeza y cuello, cancer hepatocelular, linfoma de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin, cancer hipofarlngeo, glioma de la ruta visual e hipotalamico, tumores de celulas de islotes, sarcoma de Kaposi, cancer de rinon, cancer de celulas renales, cancer larlngeo, cancer de cavidad oral y labios, cancer de pulmon microcltico, cancer de pulmon no microcltico, linfoma del sistema nervioso central primario, macroglobulinemia de Waldenstrom, histiocitoma fibroso maligno, meduloblastoma, melanoma, carcinoma de celulas de Merkel, mesotelioma maligno, cancer de cuello escamoso, slndrome de neoplasia endocrina multiple, mieloma multiple, micosis fungoide, slndromes mielodisplasicos, trastornos mieloproliferativos, trastornos mieloproliferativos cronicos, cavidad nasal y cancer del seno paranasal, cancer nasofarlngeo, neuroblastoma, cancer orofarlngeo, cancer ovarico, cancer pancreatico, cancer de paratiroides, cancer peneano, cancer farlngeo, feocromocitoma, pineoblastoma y tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, cancer de la hipofisis, neoplasias de celulas plasmaticas, blastoma pleuropulmonar, cancer de prostata, cancer rectal, rabdomiosarcoma, cancer de las glandulas salivales, sarcoma de tejido blando, sarcoma uterino, slndrome de Sezary, cancer de piel no melanoma, cancer del intestino delgado, carcinoma de celulas escamosas, cancer de cuello escamoso, tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, cancer testicular, cancer de garganta, timoma y carcinoma tlmico, cancer de tiroides, cancer de celulas transicionales, tumores trofoblasticos, cancer uretral, cancer uterino, sarcoma uterino, cancer vaginal, cancer vulvar y tumor de Wilms.
XI. Kits
Pueden ensamblarse diversos kits como se ensena en el presente documento. Un kit puede contener componentes para ensayar con respecto a mutaciones en BRAF para evaluar a un paciente particular con respecto al riesgo de desarrollar resistencia a terapia usando un inhibidor de BRAF, y permitir de este modo que un especialista cllnico determine si es necesario un tratamiento alternativo para el paciente. Dichos kits pueden contener reactivos que permiten evaluar mutaciones, tales como conjuntos de cebadores para evaluar mutaciones correlacionadas con manifestaciones fenotlpicas relevantes con respecto a la resistencia a un inhibidor de BRAF (por ejemplo, RAF-265). Se contempla que los cebadores (o pares de cebadores) que son complementarios de o identicos a toda o parte de SEQ ID NO: 1, por ejemplo, pueden ser parte de un kit. Como se desvela en el presente documento, los cebadores pueden usarse para detectar especlficamente o amplificar una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF mutante que contiene una mutacion en uno o mas de los siguientes restos de aminoacidos: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. En divulgaciones ejemplares, los cebadores detectan especlficamente o amplifican una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de BRAF que contiene una o mas de las siguientes mutaciones: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F. Tambien se ensena que los kits contienen instrucciones para usar cebadores que son complementarios o identicos de toda o parte de SEQ ID NO: 1 para amplificar una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de BRAF.
Se ensena ademas que los kits comprenden composiciones para detectar una mutacion que comprende un polipeptido de BRAF, tal como un anticuerpo que reconoce especlficamente un polipeptido de BRAF mutante que contiene una o mas mutaciones de resistencia. Los polipeptidos ejemplares incluyen un polipeptido de BRAF mutante que contiene una mutacion en uno o mas de los siguientes restos de aminoacidos: A29, H72, S 113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748. Se ensena ademas que el polipeptido de BRAF mutante contiene una o mas de las siguientes mutaciones: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
Todos los materiales esenciales y reactivos requeridos para ensayar con respecto a mutaciones de BRAF por un metodo particular analizado anteriormente pueden ensamblarse tambien juntos en un kit. Cuando los componentes del kit se proporcionan en una o mas soluciones llquidas, la solucion llquida es preferentemente una solucion acuosa, siendo una solucion acuosa esteril particularmente preferida.
Los componentes del kit tambien pueden proporcionarse en formas secas o liofilizadas. Cuando se proporcionan reactivos o componentes como una forma seca, la reconstitucion generalmente es mediante la adicion de un disolvente adecuado. Se preve que el disolvente tambien puede proporcionarse en otro medio contenedor.
Los kits ensenados en el presente documento tambien tlpicamente incluiran un medio para contener los viales en confinamiento estrecho para venta comercial tal como, por ejemplo, inyeccion o recipientes de plastico o moldeados por soplado en los que se conservan los viales deseados. Independientemente del numero o tipo de recipientes, los kits de la invencion tambien pueden comprender, o envasarse con, un instrumento para ayudar a la recogida y evaluacion de muestras. Dicho instrumento puede ser, por ejemplo, un inhalante, una jeringa, una pipeta, un forceps, una cuchara medida, un frasco para colirio o cualquier otro vehlculo de suministro medicamente aprobado.
Los kits ensenados en el presente documento tambien pueden incluir una hoja de instrucciones que perfile terapias alternativas sugeridas cuando se identifiquen en un paciente mutaciones particulares. Por ejemplo, una hoja de instrucciones incluida con los kits de la invencion puede recomendar que un paciente que tenga un trastorno, por ejemplo, un cancer, en el que se ha identificado un polipeptido de BRAF mutante, interrumpa el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generation, se supervise con respecto a recalda durante el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generacion, continue el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generacion a una dosificacion elevada, o inicie el tratamiento con un inhibidor de BRAF de segunda generacion. Una hoja de instrucciones incluida con los kits ensenados en el presente documento puede recomendar de forma similar que un paciente que tenga un trastorno en el que no sea detectable un polipeptido de BRAF mutante continue con el tratamiento con un inhibidor de BRAF de primera generacion a una dosificacion convencional. En ensenanzas ejemplares, el inhibidor de BRAF de primera generacion es RAF-265.
La presente invencion se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos, que no deberla interpretarse como limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Exploration de mutagenesis aleatoria de BRAF-VE600E (RAF265 y PLX4720)
Se consiguio generacion de bibliotecas mutadas usando una modification de metodos publicados. Brevemente, se realizo mutagenesis propagando un plasmido de expresion de BRAF(V600E) (pWZL-Blast-BRAF(V600E)) en E. coli
deficiente para los genes de reparacion de ADN MutS, MutD5- y MutT- DNA (XL1-Red; Stratagene). Se extrajo ADN piasmldico de estas bacterias y se amplifico en E. coliXL1-Blue (Stratagene). El plasmido de BRAF(V600E) mutado o control no mutado se uso para infectar celulas de un melanoma A375. Despues de seleccion con blasticidina, las celulas se sembraron en placas de 15 cm y se cultivaron en presencia de inhibidores de RAF (RAF265 o PLX4720; 2 mM o 1,5 mM respectivamente) durante 5 semanas hasta que surgieron clones resistentes. Se secuenciaron clones resistentes para identificar mutaciones que apareclan con alta frecuencia. Los resultados se muestran en la Figura 5 (exploracion de RAF265) y la Figura 6 (exploracion de PLX4720). La Figura 7 representa las localizaciones de tres mutaciones de BRAF que surgieron con alta frecuencia en ambas exploraciones.
Ejemplo 2: Analisis de transferencia de Western de activacion de pMEK1/2 y pERK1/2 en celulas que contienen mutantes de BRAF
Se transfectaron celulas 293 T con 6 mg de pWZL(BLAST)-BRAF para cada alelo de resistencia potencial y posteriormente se trataron con una serie de concentraciones del inhibidor de BRAF(V600E) PLX4720 (0, 0,08, 0,4, 2, 5 y 10 mM) durante 16 horas. Se realizaron estudios de inmunotransferencia usando procedimientos convencionales. Brevemente, las celulas tratadas se lisaron con tampon de TNN que contenla inhibidor de proteasa (Roche), NaF y NaVO3 (1 mM cada uno). Los lisados se cuantificaron (ensayo de Bradford), se desnaturalizaron (95 °C) y se resolvieron por electroforesis en gel de SDS. Las protelnas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se exploraron con anticuerpos primarios que reconoclan BRAF (Santa Cruz; dilucion 1:10.000), p-ERK1/2, p-MEK1/2 (Ser-217/221), y a-tubulina (Cell Signaling Technology; dilucion 1:1.000). Despues de incubar con el anticuerpo secundario apropiado (IgG anti-conejo o anti-raton, ligado a HRP; dilucion 1:1.000) (Cell Signaling Technology), se detectaron protelnas usando quimioluminiscencia (Pierce). Los resultados se muestran en la Figura 8. Como se muestra en la misma, los niveles de MEK1/2 y ERK1/2 fosforiladas aumentan en celulas que contienen BRAF- V600E, BRAF-V600E-T521K, y BRAF V600E-P686Q. El aumento de MEK1/2 y ERK1/2 fosforiladas se mantiene en celulas BRAF-V600E-T521K y BRAF V600E-P686Q en presencia de concentraciones crecientes de PLX4720.
Ejemplo 3: Ensayo de quinasa de BRAF
Se transfectaron celulas 293T (confluyentes al 70 %) con 15 mg de pc-DNA-DEST40 que contenla alelos de resistencia potenciales de BRAF(V600E), BRAF sin actividad quinasa o de tipo silvestre. A las 48 h despues de la infeccion, se generaron lisados por metodos convencionales. Se realizo precipitacion usando perlas de cobalto durante 30 min a 4 °C en 1 mg de extracto celular. Las perlas de cobalto unidas a protelnas se incubaron con 20 ml de mezcla de ATP/magnesio (Mops 20 mM pH 7,2, b-glicerofosfato 25 mM, EGTA 5 mM, Na3VO4 1 mM, DTT 1 mM, MgCl2 75 mM y ATP 0,5 mM), 20 ml de tampon de dilucion (Mops 20 mM pH 7,2, b-glicerofosfato 25 mM, EGTA 5 mM, ortovanadato sodico 1 mM, DTT 1 mM) y 1 mg de MEK1 inactiva (obtenida de Millipore) durante 30 min a 30 °C. El producto de MEK1 fosforilada se detecto por inmunotincion usando un anticuerpo de p-MEK1/2 (Cell Signaling Technology).
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> DANA-FARBER CANCER INSTITUTE, INC.
<120> MUTACIONES DE BRAF QUE CONFIEREN RESISTENCIA A INHIBIDORES DE BRAF
<130> 52930/09137
<140> Nueva solicitud
<141> Simultaneamente con la presente
<150> 61/308.275 <151 >
<160>4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211 > 2949 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 1

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una molecula de acido nucleico aislada que codifica un polipeptido de BRAF mutante que tiene una actividad de BRAF, en la que dicho polipeptido de BRAF mutante comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una sustitucion de aminoacido en comparacion con un polipeptido de BRAF V600E (SEQ ID NO: 4), confiriendo la al menos una sustitucion de aminoacido resistencia a uno o mas inhibidores de BRAF en el polipeptido de BRAF mutante, el inhibidor de BRAF seleccionado de RAF-265 o PLX4720, en el que la al menos una sustitucion de aminoacido sucede en una o mas posiciones de aminoacidos seleccionadas del grupo que consiste en A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748.
  2. 2. Un polipeptido de BRAF mutante aislado que tiene una actividad de BRAF, en el que dicho polipeptido de BRAF mutante comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una sustitucion de aminoacido en comparacion con un polipeptido de BRAF V600E (SEQ ID NO: 4), confiriendo la al menos una sustitucion de aminoacido resistencia a uno o mas inhibidores de BRAF en el polipeptido de BRAF mutante, el inhibidor de BRAF seleccionado de RAF-265 o PLX4720,
    en el que la al menos una sustitucion de aminoacido sucede en una o mas posiciones de aminoacidos seleccionadas del grupo que consiste en A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 y C748.
  3. 3. La molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1 o el polipeptido de BRAF mutante de la reivindicacion 2, en el que la al menos una sustitucion de aminoacido se selecciona del grupo que consiste en A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L y C748F.
  4. 4. La molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1 o el polipeptido de BRAF mutante de la reivindicacion 2, en el que el polipeptido de BRAF mutante es un polipeptido de BRAF que comprende una sustitucion en una o mas de las posiciones de aminoacidos T521K, V528F o p686q.
  5. 5. Un vector de expresion que comprende el acido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
  6. 6. Una celula hospedadora que comprende el vector de expresion de la reivindicacion 5.
  7. 7. Un metodo para producir un polipeptido de BRAF mutante que comprende cultivar la celula hospedadora de la reivindicacion 6 de modo que la celula produzca un polipeptido de BRAF mutante.
  8. 8. Un metodo para identificar un compuesto que es util en el tratamiento del cancer, que comprende:
    (a) proporcionar una composicion de ensayo que comprende un polipeptido de BRAF mutante de la reivindicacion 2 y un sustrato de BRAF;
    (b) poner en contacto la composicion de ensayo con un compuesto de ensayo en condiciones que permitan la fosforilacion del sustrato de BRAF en ausencia del compuesto ensayo; y
    (c) determinar el efecto del compuesto en la fosforilacion del sustrato de BRAF;
    en el que la modulacion negativa de fosforilacion del sustrato de BRAF en comparacion con un control adecuado identifica el compuesto como un compuesto que es util en el tratamiento del cancer, y preferentemente la modulacion negativa de la fosforilacion del sustrato de BRAF en comparacion con un control adecuado identifica al compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generacion.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que el sustrato de BRAF es MEK1 o MEK2 y en el que la fosforilacion de MEK1 o MEK2 se determina usando un anticuerpo de MEK fosfo-especlfico o midiendo la fosforilacion de protelna basica de mielina (MBP).
  10. 10. Un metodo para identificar un compuesto que es util en el tratamiento del cancer, que comprende:
    a) proporcionar una celula que comprende un polipeptido de BRAF mutante de la reivindicacion 2;
    b) poner en contacto la celula con un compuesto de ensayo; y
    c) determinar el efecto del compuesto en la fosforilacion de un sustrato de BRAF o en la proliferation celular;
    en el que la modulacion negativa de la fosforilacion del sustrato de BRAF o reduction de la proliferacion celular en comparacion con un control adecuado identifica el compuesto como un compuesto que es util en el tratamiento del cancer.
  11. 11. Un metodo de exploration basado en celulas para identificar un compuesto de ensayo como un inhibidor de BRAF de segunda generacion, comprendiendo el metodo poner en contacto la celula hospedadora de la reivindicacion 6 con un compuesto de ensayo, en el que la sensibilidad de la celula hospedadora al compuesto de
    ensayo identifica el compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generacion.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, en el que la sensibilidad de la celula hospedadora al compuesto de ensayo, se mide usando un ensayo seleccionado del grupo que consiste en un ensayo de proliferacion celular, un ensayo de viabilidad celular, y un ensayo de fosforilacion de MEK, en el que una reduccion en la proliferacion celular, la viabilidad celular o la fosforilacion de MEK en presencia del compuesto de ensayo, identifica el compuesto como un inhibidor de BRAF de segunda generacion.
    (Secuencia de referenda de NCBI: NM_004333.4; gi 187608632)
    CGCCTCCCTTCCCCCTCCCCGCCCGACAGCGGCCGCTCGGGCCCCGGCTCTCGGTTATAAGAT GGCGGCGCTGAGCGGTGGCGGTGGTGGCGGCGCGGAGCCGGGCCAGGCTCTGTTCAACGGG GACATG G AGCCCGAGGCCG GCGCCGGCGCCGGCGCCGCG GCCTCTTCG GCTGCG GACCCTG CC ATT CCGG AGG AGGTGTGG AATATC AAACAAATG ATT AAGTTG ACAC AGGA AC AT ATAG AGGC CCTATTGGACAAATTTGGTGGGGAGCATAATCCACCATCAATATATCTGGAGGCCTATGAAGAAT ACACCAGCAAGCTAGATGCACTCCAACAAAGAGAACAACAGTTATTGGAATCTCTGGGGAACGG AACTGATTTTTCTGTTTCTAGCTCTGCATCAATGGATACCGTTACATCTTCTTCCTCTTCTAGCCT TT CAGTGCT ACCTT CAT CT CTTT CAGTTTTT CAA AAT CCC AC AGATGTGGC ACGG AGCA ACCCC A AGTCACC ACAAAAACCT AT CGTT AGAGT CTT CCTGCCCAACA AACAG AGGACAGTGGT ACCTGC AAGGTGTGGAGTTACAGTCCGAGACAGTCTAAAGAAAGCACTGATGATGAGAGGTCTAATCCCA GAGTGCTGTGCTGTTTACAGAATTCAGGATGGAGAGAAGAAACCAATTGGTTGGGACACTGATA TTT CCTGGCTTACTGG AG AAG AATTGCATGTGG AAGTGTTGG AGA ATGTTCC ACTT ACAAC AC AC AACTTT GT ACG AAAAACGTTTTTCACCTTAGC ATTTTGTG ACTTTTGTCG AA AGCTGCTTTTCCAG GGTTTCCGCTGTCAAACATGTGGTTATAAATTTCACCAGCGTTGTAGTACAGAAGTTCCACTGAT GTGTGTTAATTAT GACCAACTTG ATTTGCT GTTTGT CTCCAAGTTCTTTGAACACCACCCAATACC ACAGG AAG AGGCGT CCTT AGC AG AG ACTGCCCT AACATCT G G AT CATCCCCTT CCGC ACCCGC CT CGG ACT CT ATTGGGCCCC A AATT CTC ACC AGTCCGT CTCCTTC AAAATCC ATTCCAATT CCAC AG CCCTT CCGACCAGCAGATG AAG AT CAT CG AAAT CAATTTGGGCAACGAG ACCG AT CCT CAT C AG CTCCCAATGTG CAT ATAAACACAAT AG AACCTGT CAATATT GATG ACTTG ATTAGAGACCAAG GATTTCGTGGT GATGG AGG ATC AACCAC AGGTTTGTCT GCT ACCCCCCCTGCCTC ATT ACCTGG CT CACTA ACT AACGTG AAAGCCTT ACAG AA ATCTCCAGG ACCT CAGCG AG AAAG G AAGTC ATCTT CATCCTCAGAAGACAGGAATCGAATGAAAACACTTGGTAGACGGGACTCGAGTGATGATTGGGA GATTCCT GATGGGCAGATTAC AGTG GG AC AA AG AATTGG ATCTGG AT CATTTGG AACAGTCT AC A AG GG AAAGTGGCATG GTG ATGTGGCAGTGAAAATGTTG AATGTG ACAGCACCTACACCTCAG CA GTTACAAGCCTTCAAAAATGAAGTAGGAGTACTCAGGAAAACACGACATGTGAATATCCTACTCT TC ATG GG CTATTCC ACAAAG CCACA ACTG GCTATTGTTACCCAGTGGTGTGAGGGCTCCAGCTT GT ATC ACCAT CT CC AT ATC ATTG AG ACCA AATTTG AG ATG ATCA AACTTAT AG AT ATTGCACG ACA GACTGCACAG GG CATG GATTACTTACACG CCAAGTCAATCATCCACAGAGACCTCAAGAGTAAT AATATATTT CTT CATG AAG ACCT CACAGT AAAAATAGGTG ATTTTGGTCT AG CTACAGT GAAAT CT CGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGCACCAGAAG TCATCAGAATGCAAGATAAAAATCCATACAGCTTTCAGTCAGATGTATATGCATTTGGAATTGTTC TGTATGAATTGATGACTGGACAGTTACCTTATTCAAACATCAACAACAGGGACCAGATAATTTTTA TGGTGGGACGAGGATACCTGTCTCCAGATCTCAGTAAGGTACGGAGTAACTGTCCAAAAGCCAT GA AG AG ATT A ATGGC AG AGTGCCT CAA AA AG AAAAG AG ATG AG AG ACCACT CTTTCCCCAAATT C TCGCCT CTATTG AGCTGCTGGCCCGCTCATTGCCAAAA ATT CACCGC AGTGCAT CAGA ACCCT C CTTG AATCG GG CTGGTTTCCAAACAG AGG ATTTTAGTCTATATGCTTGTG CTTCTCCAAAAACAC CCATCCAGGCAGGGGGATATGGTGCGTTTCCTGTCCACTGAAACAAATGAGTGAGAGAGTTCAG GAG AGT AGCA AC AAAAG GAAAAT A AATG A ACAT ATGTTTGCTT AT ATGTT AAATTG AAT AAAAT AC T CT CTTTTTTTTT AAGGTG AACC AAAGA AC ACTTGTGTGGTT AAAGACT AG AT AT AATTTTT CCCC AAACTAAAATTT ATACTTAACATTGGATTTTTAACATCCAAG GGTTAAAAT ACAT AG ACATT GCT AA AAATT G GCAGAGCCT CTT CT AGAGG CTTTACTTT CT GTT CCGGGTTT GTAT CATT CACTTGGTTAT TTT AAGT AGTA AACTT CAGTTTCTCATGCAACTTTTGTTGCC AGCT AT CACATGTCCACT AGG G AC TCCAG AAG AAG ACCCT ACCT ATG CCTGTGTTTGCAGGTG AG AAGTTG GCAGTCGGTT AGCCTGG GTT AGAT AAGGCAAACTG AACAG AT CT AATTTAGG AAGTC AG TAG AATTT AATAATT CTATTATT AT TCTTAATAATTTTTCTATAACTATTTCTTTTTATAACAATTTGGAAAATGTGGATGTCTTTTATTTCC TTG AAGC AAT AA ACT AAGTTTCTTTTT AT AA AAA
    (Secuencia de referenda de NCBI: NP_004324.2; gi 33188459 )
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    SASEPSLNRAGFGTEDFSLYACASPKTPIQAGGYGAFPVH
    Frecuencia (%)
    imagen1
    FRECUENCIA DE CLONES AGRUPADOS (%)
    imagen2
    POSICION DE AMINOACIDO DE BRAF
    * Tambien idenficado en exploracion de RAF265
    Figura 7: Mutaciones de BRAF comun a exploracion tanto de RAF265 como de PLX4720
    imagen3
    Bisag ra Bucle A
    Tsai et a/.,
    PNAS (2008)
    imagen4
    Krishna Vijayendran pgg0
    Figura 8: Estudios de inmunotransferencia de niveles de BRAF, p-MEK1/2 y p-ERK1/2 despues de tratamiento con concentraciones crecientes de PLX4720
    CD
    RLX472G pMEK 1/2
    pERK 1/2 BRAF
    a Tubulina
    BRAF-wt
    0 0,08 0,4 ? 5 10
    imagen5
    BRAF-V600E
    imagen6
    imagen7
    a- Or i*5 £o &
    & 8 $
    £ £ £ £
    $ j? j? g g
    imagen8
    V600E-T521K V600E-V528F V600E-P686Q
    imagen9
    RLXZTiXiyM o 0,03 0,4 2 3 10
    pMEK 1/2 pERK 1/2
    braf
    a Tubulina
    imagen10
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