CN101631856A - 由棒状杆菌属表达的***糖异构酶和使用其制造塔格糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种嗜热性***糖异构酶和使用该酶制备塔格糖的方法，更精确地说，本发明涉及来自新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)DSM 5068的编码***糖异构酶的基因、含有该基因的重组表达载体，通过所述表达载体转化的重组食品级GRAS(Generally Recognized As Safe)菌株制备食品级嗜热性***糖异构酶的方法，以及使用所述酶由半乳糖制备塔格糖的方法。

Description

由棒状杆菌属表达的***糖异构酶和使用其制造塔格糖的方法
技术领域
本发明涉及一种在棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)菌株中表达的***糖异构酶基因和使用该基因制备塔格糖的方法，更具体地说，本发明提供了来自新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)DSM 5068的编码***糖异构酶的基因、含有该基因的重组表达载体，通过在由重组表达载体转染的食品级GRAS棒状杆菌属菌株中表达基因制备嗜热性***糖异构酶的方法，以及使用该酶由半乳糖制备塔格糖的方法。
背景技术
随着对舒适或者健康生活的兴趣日益增加，塔格糖已经被建议作为糖的替代物，因为其具有更小的副作用，并且糖是引起各种成人疾病的主要因素之一。塔格糖是半乳糖的异构体并且已知具有与果糖类似的生理化学性质。塔格糖是天然的低热量糖，并且近来已经由美国FDA批准为GRAS(通常认为是安全的，Generally Recognized As Safe)，于是目前其被允许作为加甜剂被加入到食品、饮料、保健品、饮食添加剂等中。
GRAS表示通常被认可为安全的物质，所述安全由具有足够经验和技能的专业人员通过科学程序并在指示条件和使用目的下检查来进行判断。GRAS是仅在美国使用来评估食品和食品化学物质的安全性(在一定条件下)的独特***，但其在世界范围内被认可。
塔格糖还能通过半乳糖的异构化来生产，该异构化为使用催化剂制造异构体的化学方法，或者使用异构酶对半乳糖进行酶转化的生物学方法来生产。
本领域技术人员公知的一种生物学方法是使用酶将醛糖或醛糖衍生物转化成酮糖或酮糖衍生物。使用***糖异构酶将半乳糖异构化成塔格糖一般在高温下通过热动力学来进行，并表现出成比例的高转化率。因此，开发在高温下作用稳定的酶和使用其制备塔格糖的方法对于其基于使用异构酶进行塔格糖的生物转化的工业应用来说是关键技术。通过筛选源自***糖异构酶的嗜热性菌，来尝试获得工业上可应用的嗜热性异构酶，并且已经由许多研究团队付出了许多努力使用这种方法来建立异构化工艺。
在韩国，使用***糖异构酶的酶异构化方法已经由Tong YangConfectionery Corp开发。根据该方法，来自大肠杆菌的***糖异构酶在大肠杆菌中通过重组技术同种表达。该重组异构酶在30℃下反应24小时，将半乳糖转化成塔格糖，此时转化率为25％，表明热稳定性和转化产量两者都非常低(申请号为99-16118的韩国专利申请)。Oh，Deok-keun教授和他的同事们(Sejong大学)成功地在大肠杆菌中进行了来自嗜热脂肪土芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的***糖异构酶的表达，并基于此他们提出了在高温下将半乳糖转化成塔格糖的异构化过程。本发明的发明人成功地从新阿波罗栖热袍菌克隆了新的***糖异构酶基因，并在大肠杆菌中生产***糖，进一步发展了在超嗜热性条件下使用酶制备塔格糖的方法(韩国专利10-0443865)。
使用来自嗜热性菌得到的***糖异构酶的塔格糖的生产仍然依赖于使用在重组大肠杆菌中大量表达的重组酶的方法，或者依赖于使用含有重组酶的宿主将半乳糖异构化成塔格糖的方法。但是，这种使用重组大肠杆菌的塔格糖的生物学生产不适于作为食物成分的塔格糖生产。为了生产作为食物成分的塔格糖，在适于作为食物成分的塔格糖的大量生产的GRAS微生物的宿主中表达的***糖异构酶是必须的。
棒状杆菌是工业微生物，其已经被用于化学物质的生产，所述化学物质可应用于各种领域，包括含L-赖氨酸、L-苏氨酸和各种核酸的饲料、医疗用品和食品。棒状杆菌是GRAS(Generally Recognized As Safe)菌株，其有利于基因操作和大量生产。另外，该菌株在各种工艺条件下均高度稳定，并且与其他细菌相比具有较稳定的细胞膜。因此，该菌株甚至在由高浓度的半乳糖产生的高渗透压下也保持稳定。
本发明的发明人发现，来自超嗜热新阿波罗栖热袍菌的嗜热性***糖异构酶在GRAS棒状杆菌属菌株中以活性形式过表达，并进一步通过发展新的技术完成本发明，通过使用来自棒状杆菌属的表达的重组酶诱导来自高浓度的半乳糖的塔格糖异构化。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供通过利用在棒状杆菌属菌株中大量生产的重组酶制备GRAS菌株的方法，所述菌株在高温和高浓度半乳糖条件下在它们的细胞中稳定地表达***糖异构酶。
技术方案
为了克服常规方法中酶仅能在大肠杆菌中表达的限制，本发明的另一目的在于提供制备塔格糖的方法，其中来自热袍菌(Thermotoga)的***糖异构酶在GRAS棒状杆菌菌株中被表达为活性形式，相应地，通过使用表达的重组酶或者含有该重组酶的宿主由半乳糖生产食品级塔格糖。
本发明的上述和其他目的通过本发明的下列实施方式来实现。
此后，将详细描述本发明。
本发明提供了通过从微生物中将***糖异构酶基因引入食品级宿主中生产重组酶的方法以及使用该重组酶由半乳糖生产塔格糖的方法，所述微生物非常难以从直接细胞培养物中得到，因为用于该微生物的最佳生长条件为至少80℃或者厌氧条件。
***糖异构酶优选来自最佳反应温度在70-90℃范围的热袍菌属、栖热菌属(Thermus sp.)或者硫化叶菌属(Sulforobus sp.)菌种。
本发明的***糖异构酶基因优选来自超嗜热菌和更优选来自超嗜热新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)DSM 5068，其具有由序列号：3表示的氨基酸序列。
本发明的***糖异构酶基因可由本领域技术人员使用常规基因突变方法诸如定向进化(directed evolution)和定点基因突变来修饰。因此，与GRAS宿主具有一定同源性水平的任何宿主细胞，例如与GRAS宿主具有至少70％的同源性，但优选为至少80％，更优选为至少90％，和在宿主中以活性形式表达的重组酶和含有该酶的任何宿主细胞都包括在本发明的标准中。
本发明还提供了含有编码本发明的***糖异构酶的基因的载体。本发明的载体是用于克隆或基因表达的典型载体。载体不限于特定载体，并且本领域技术人员已知的任何载体都是可接受的。
在本发明中，在棒状杆菌中具有活性的启动子被用作载体来表达活性形式的嗜热性异构酶。与在工业微生物诸如大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中使用的其他启动子不同，在棒状杆菌中用于基因表达的启动子还没有被鉴定。这里，来自流行的工业微生物棒状杆菌的并能够在大肠杆菌中表达的强启动子已经被开发。tac启动子已知为最强的启动子之一。tac启动子通过将大肠杆菌的色氨酸操纵子启动子的-35区与大肠杆菌的乳糖操纵子启动子的-10区序列的融合来制备。在本发明中由CJ-1～CJ-7组成的启动子被认为在棒状杆菌属细菌细胞中表达目标基因比tac启动子更为有效(韩国专利公开10-2006-0068505)。
本发明的棒状杆菌启动子不仅在棒状杆菌属微生物中显示了启动子活性，而且在大肠杆菌细菌和大肠杆菌细胞中也显示了启动子活性。特别是，本发明的启动子在大肠杆菌细菌细胞中显示了比tac启动子的活性至少高两倍的活性。
本发明的食品级菌株(即GRAS菌株)包括棒状杆菌，更具体包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KCTC 13032。
根据本发明的实施例，重组菌株通过使用载体转化棒状杆菌来制备，转化菌株然后被培养以提供食品级***糖异构酶。培养基和培养条件取决于宿主的种类。
本发明提供了重组***糖异构酶和通过固定含有重组酶的宿主细胞由半乳糖制备塔格糖的方法。
附图说明
本发明的优选实施例的应用参照附图被最佳理解，在附图中：
图1是示出含有编码来自新阿波罗栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)DSM 5068菌株的嗜热性***糖异构酶的基因的重组表达载体pCJ-1-TNAI和pCJ-7-TNAI的构建的示意图；
图2是示出重组棒状杆菌的时间依赖性培养物生长的图形，特别是，重组棒状杆菌在优化培养基中在30℃下培养24小时；
图3是示出在由重组棒状杆菌表达的***糖异构酶的每个步骤的分离和纯化的粗酶溶液中观察到的总蛋白表达模式的SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)结果的照片，每个蛋白带表示如下：
M：宽范围蛋白质标记物(Bio-Rad，美国)
1：粗酶溶液
2：经热处理的酶上清液
3：阴离子交换色谱(HiTrap Q column，GE Healthcare，美国)之后的酶片段
4：在粒度排阻色谱(Superdex 200pg column，GE Healthcare，美国)之后纯化的酶片段；
图4是示出***糖异构酶的量的图示，其中含有以活性形式表达的***糖异构酶的重组棒状杆菌和大肠杆菌在含有0％、10％、20％、30％和40％的不同半乳糖浓度的PBS(磷酸缓冲盐)中在高温(70℃)搅拌下反应2小时，然后测定缓冲液中酶的表达水平。
具体实施方式
本发明的实际和现有优选实施方式如在下列实施例中显示的那样被示出。
但是，本领域技术人员应当理解，在考虑公开内容的基础上，可在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
[实施例]
在本发明的优选实施例中来自超嗜热新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)DSM 5068的编码嗜热性***糖异构酶的基因被***到pCJ-1和pCJ-7(大肠杆菌-棒状杆菌穿梭载体，韩国专利公开10-2006-0068505)。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KCTC 13032用上述载体转染，其中所述蛋白质最终被过表达。重组菌株谷氨酸棒杆菌CJ-1-TNAI(KCCM10786P)和CJ-7-TNAI(KCCM10787P)被培养并且从细胞培养物的每个阶段得到细胞抽提物。塔格糖的生产活性被测定，也就是说活性重组蛋白的量逐阶段被测定。最佳表达的合成培养物被分离并通过细胞裂解、热处理、离子交换树脂和凝胶色谱纯化。最后，氨基末端的氨基酸序列被检查并且通过测定蛋白质的活性来确认塔格糖的生产活性。
实施例1：***糖异构酶的克隆
在厌氧条件下培养新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)DSM 5068。在8000xg下离心10分钟以回收培养的细胞。通过使用细胞培养物DNA Midi Kit(Qiagen，美国)从得到的细胞提取基因组DNA。通过使用具有EcoRV和PstI限制酶位点序列***的寡核苷酸5′-CCCGATATCATGATCGATCTCAAACAGTATGAG-3′(序列号：1)和5′-TGCACTGCAGTCATCT TTTTAAAAGTCCCC-3′(序列号：2)作为引物，使用基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)。PCR产物通过扩增含有新阿波罗栖热袍菌***糖异构酶基因的1509bp的DNA得到。为了大量生产由扩增基因编码的***糖异构酶，两种显示出极佳的蛋白质过表达能力的棒状杆菌载体被选择。载体被引入到大肠杆菌DH5α，其于2004年11月6日被保藏在国际保藏单位(IDA)Korean Culture Center ofMicroorganisms(KCCM)(保藏号：KCCM-10611和KCCM-10617)(表1)。
表1
  启动子  载体   保藏号   源自蛋白质
  pCJ1  pECCG117   KCCM-10611   热休克蛋白hsp60
  pCJ7  pECCG117   KCCM-10617   超氧化锰歧化酶
使用限制酶EcoRV和PstI消化的PCR产物被***到使用同样的酶消化的穿梭载体pCJ-1和pCJ-7中，导致重组表达载体pCJ-1-TNAI和pCJ-7-TNAI的构建(见图1)。谷氨酸棒杆菌KCTC 13032使用重组表达载体pCJ-1-TNAI和pCJ-7-TNAI转染以制备重组菌株，其被命名为谷氨酸棒杆菌CJ-I-TNAI和谷氨酸棒杆菌CJ-7-TNAI。重组菌株于2006年10月18日被保藏在地址为#361-221，Hongje 1-Dong，Seodaemun-Gu，Seoul，Korea的国际保藏单位(IDA)Korean Culture Center ofMicroorganisms(KCCM)(保藏号：KCCM10786P和KCCM10787P)。
实施例2：***糖异构酶在棒状杆菌中的表达
在实施例1中制备的重组菌株谷氨酸棒杆菌CJ-I-TNAI和谷氨酸棒杆菌CJ-7-TNAI(保藏号：KCCM10786P和KCCM 10787P)被接种在含有10μg/mL的浓度为OD＝0.1的卡那霉素的MB培养基(Bacto-胰蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，大豆胨5g/L)中，接着在30℃下培养24小时以诱导重组***糖异构酶的表达。为了测定所表达的***糖异构酶的酶活性，培养物溶液在8000xg下离心10分钟，并回收细胞。细胞被悬浮在50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，接着超声(ultrasonification)裂解细胞。获得上清液作为粗酶溶液，半乳糖异构化使用该上清液进行。特别是，为了异构化，含有40mM半乳糖作为底物的100μl的酶溶液与1ml反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.0)混合。此时，将5mM MnCl2和1mM CoCl2加入到反应混合物中。粗酶反应混合物通过半胱氨酸-咔唑-硫酸法(Dische，Z.和E.Borenfreund.，A NewSpectrophotometric Method for the Detection and Determination of KetoSugars and Trioses，J.Biol.Chem.，192：583-587，195)测定。粗酶溶液中含有的蛋白质使用Bradford测定试剂盒(Biorad，美国)定量。结果，异构酶活性为2.050(mg-塔格糖/mg-蛋白质·h)，表明半乳糖异构化产物塔格糖成功地被生产。
实施例3：用于重组菌株的大量生产的培养条件的优化
将实施例2中制备的重组菌株接种到含有10μg/mL的浓度为OD600＝0.6的的卡那霉素的MB培养基(Bacto-胰蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，大豆胨5g/L)中。棒状杆菌菌株在两种基本培养基，即MB培养基(Bacto-胰蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，大豆胨5g/L)和改良培养基(Bacto-蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl 2.5g/L，牛肉膏5g/L)中的生长被研究。比较了两种培养基中的温度依赖型(25℃，30℃，37℃)、pH依赖型、葡萄糖(碳源)和蔗糖浓度依赖型生长。另外，在各种条件下的生长和酶的表达的水平由此每小时被测定以判断用于重组***糖异构酶的大量生长的最佳表达条件(表2和表3)。
表2
Figure A20078004400000111
表3
Figure A20078004400000112
为了测定重组***糖异构酶的酶活性，酶以实施例2中描述的相同方式被处理并定量。当细胞在30℃在需氧条件下加入2.5％的蔗糖、塔格糖培养时，半乳糖异构酶的产生显示大约为85.1mU/ml的酶活性，比在标准培养物中观察到的(60.9mU/ml)高1.4倍，表明酶活性随着细胞生长的增加而增加。在最佳培养基中得到的细胞生长在图2中显示。
实施例4：重组***糖异构酶的分离和纯化以及由N-端氨基酸序 列确认活性蛋白的表达
2L重组菌株的培养在上述实施例3中确定的最佳培养条件下进行。将培养液在8000xg下离心10分钟并回收细胞。将细胞悬浮在50mMTris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，并用于蛋白质纯化。使用高压细胞匀浆器T-series(4.0kW；Constant systems，英国)将细胞悬浮物进行裂解，然后在80℃下热处理20分钟。在10000xg下离心10分钟以分离表达的重组嗜热性***糖异构酶。分离的重组酶溶液通过阴离子交换色谱(Hiprep Q16/10，Amersham Bioscience，美国)、超滤(Centriprep 30，Amicon，德国)和粒度排阻色谱(Superdex 200pg，Amersham Bioscience，美国)纯化(表4)。每个步骤的酶溶液的蛋白成分通过SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析(图3)。
表4
  纯化阶段   总蛋白质(mg)     总活性(AU)     纯化(％)     产量(％)
  粗酶溶液   665     410.4     1.0     100
  热处理   480     364.3     1.2     89
  阴离子交换色谱 63.5 201.5 5.1 49
  凝胶色谱   28.1     136.3     7.7     33
分离和纯化的重组蛋白最终由N-端氨基酸序列来确定。通过凝胶色谱纯化的蛋白质通过SDS-PAGE分析，结果，确认蛋白质大约55kDa的分子量，这与新阿波罗栖热袍菌属***糖异构酶的分子量相同。蛋白带被转移到PVDF膜上用于韩国基础科学研究所(Korean Basic ScienceInstitute)进一步的研究。结果，分离的重组蛋白的氨基端的10个氨基酸被鉴别为′Met-Ile-Asp-Leu-Lys-Gln-Tyr-Glu-Phe-Trp′，这正是新阿波罗栖热袍菌属***糖异构酶的N-端蛋白序列的序列。因此，该序列被确认与来自新阿波罗栖热袍菌属***糖异构酶的氨基酸序列相同(序列号.NO：3)
实施例5：对于在高温和高浓度下酶表达的重组菌株的反应稳定性
棒状杆菌是在各种生产条件下高度稳定的菌株，并且具有相对较硬的细胞膜，因此其即便是在由高浓度蔗糖引起的高渗透压条件下也保持稳定。该菌株的这些特征有利于在高浓度底物中反应稳定性的增强。因此，利用这种特征，本发明的发明人在棒状杆菌表达了超嗜热性***糖异构酶。
将在实施例3中制备的培养基中培养的重组棒状杆菌菌株和在LB培养基(5g/L酵母膏，10g/L Bacto-胰蛋白胨，10g/L氯化钠)中培养的重组大肠杆菌菌株分别在8000xg下离心10分钟以得到细胞。细胞被悬浮在PBS(磷酸缓冲盐)用于进一步的实验。为了比较高底物浓度下菌株的稳定性，将0％、10％、20％、30％和40％的半乳糖加入到溶液中，接着在70℃下搅拌反应0小时、1小时和2小时。为了定量在每个反应产物中的细胞中表达的蛋白质，在13000xg下离心10分钟，并得到上清液。然后，表达的蛋白质通过BCA(bicinchonic acid protein assay method)定量。通过根据重组大肠杆菌细胞与重组棒状杆菌细胞之间的底物浓度的蛋白质表达比较，确定在棒状杆菌中的蛋白质表达水平与大肠杆菌中的表达水平相比明显较低。在重组大肠杆菌中，随着反应的进行半乳糖浓度显著增加，而在棒状杆菌中蛋白质的表达大约增加20％。甚至是在该实验以40％的最高半乳糖浓度开始之后也是如此(图40)。
上述结果表明，与在大肠杆菌中相比，蛋白质洗脱在高底物浓度下在细胞中显著降低。也就是说，与常规大肠杆菌宿主不同，其中含有表达的酶的棒状杆菌宿主在高糖含量下显示出降低的细胞内蛋白质洗脱。
与大肠杆菌相比，棒状杆菌宿主也被确认在较差的反应条件下非常稳定，包括高温和高底物浓度。这种稳定性有利于细胞固定化反应器中反应的稳定性增加，因此导致细胞固定化反应器的半衰期增加。
工业实用性
如此前解释的那样，来自超热袍菌(Thermotoga sp.)的***糖异构酶的稳定表达在棒状杆菌中被观察，因此固定化的连续反应在本发明的优选实施例中通过使用含有活性形式的酶的棒状杆菌有效地进行。为了使用微生物酶生产生物技术的食品材料，添加剂必须符合GRAS食品级的要求。通过本发明的方法制备的来自食品级热袍菌的***糖异构酶可被稳定地应用于连续反应以增加酶的工业化稳定性。
本领域技术人员将会理解，前述说明书中公开的构思和特定实施例可以很容易作为基础被利用以便修改或重新设计其他实施例来实现本发明的相同目的。本领域技术人员还将会理解，这些等同实施例都不偏离在所附的权利要求数中阐明的本发明的精神和范围。
序列表
<110>CJ第一制糖株式会社
<120>由棒状杆菌属表达的***糖异构酶和使用其制造塔格糖的方法
<130>FP09KR817
<160>3
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer 1
<400>1
cccgatatca tgatcgatct caaacagtat gag    33
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer 2
<400>2
tgcactgcag tcatcttttt aaaagtcccc        30
<210>3
<211>496
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>3
Met Ile Asp Leu Lys Gln Tyr Glu Phe Trp Phe Leu Val Gly Ser Gln
  1               5                  10                  15
Tyr Leu Tyr Gly Leu Glu Thr Leu Lys Lys Val Glu Gln Gln Ala Ser
             20                  25                  30
Arg Ile Val Glu Ala Leu Asn Asn Asp Pro Ile Phe Pro Ser Lys Ile
         35                  40                  45
Val Leu Lys Pro Val Leu Lys Asn Ser Ala Glu Ile Arg Glu Ile Phe
     50                  55                  60
Glu Lys Ala Asn Ala Glu Pro Lys Cys Ala Gly Val Ile Val Trp Met
 65                  70                  75                  80
His Thr Phe Ser Pro Ser Lys Met Trp Ile Arg Gly Leu Ser Ile Asn
                 85                  90                  95
Lys Lys Pro Leu Leu His Leu His Thr Gln Tyr Asn Arg Glu Ile Pro
            100                 105                 110
Trp Asp Thr Ile Asp Met Asp Tyr Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala His
        115                 120                 125
Gly Asp Arg Glu His Gly Phe Ile His Ala Arg Met Arg Leu Pro Arg
    130                 135                 140
Lys Val Val Val Gly His Trp Glu Asp Arg Glu Val Arg Glu Lys Ile
145                 150                 155                 160
Ala Lys Trp Met Arg Val Ala Cys Ala Ile Gln Asp Gly Arg Thr Gly
                165                 170                 175
Gln Ile Val Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Glu Val Ala Ser Thr Glu
            180                 185                 190
Asp Asp Lys Val Glu Ala Gln Ile Lys Leu Gly Trp Ser Ile Asn Thr
        195                 200                 205
Trp Gly Val Gly Glu Leu Ala Glu Gly Val Lys Ala Val Pro Glu Asn
    210                 215                 220
Glu Val Glu Glu Leu Leu Lys Glu Tyr Lys Glu Arg Tyr Ile Met Pro
225                 230                 235                 240
Glu Asp Glu Tyr Ser Leu Lys Ala Ile Arg Glu Gln Ala Lys Met Glu
                245                 250                 255
Ile Ala Leu Arg Glu Phe Leu Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ala Phe Thr
            260                 265                 270
Thr Thr Phe Glu Asp Leu His Asp Leu Pro Gln Leu Pro Gly Leu Ala
        275                 280                 285
Val Gln Arg Leu Met Glu Glu Gly Tyr Gly Phe Gly Ala Glu Gly Asp
    290                 295                 300
Trp Lys Ala Ala Gly Leu Val Arg Ala Leu Lys Val Met Gly Ala Gly
305                 310                 315                 320
Leu Pro Gly Gly Thr Ser Phe Met Glu Asp Tyr Thr Tyr His Leu Thr
                325                 330                 335
Pro Gly Asn Glu Leu Val Leu Gly Ala His Met Leu Glu Val Cys Pro
            340                 345                 350
Thr Ile Ala Lys Glu Lys Pro Arg Ile Glu Val His Pro Leu Ser Ile
        355                 360                 365
Gly Gly Lys Ala Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Asp Gly Gln Glu Gly
    370                 375                 380
Pro Ala Val Asn Ala Ser Ile Val Asp Met Gly Asn Arg Phe Arg Leu
385                 390                 395                 400
Val Val Asn Arg Val Leu Ser Val Pro Ile Glu Arg Lys Met Pro Lys
                405                 410                 415
Leu Pro Thr Ala Arg Val Leu Trp Lys Pro Leu Pro Asp Phe Lys Arg
            420                 425                 430
Ala Thr Thr Ala Trp Ile Leu Ala Gly Gly Ser His His Thr Ala Phe
        435                 440                 445
Ser Thr Ala Val Asp Val Glu Tyr Leu Ile Asp Trp Ala Glu Ala Leu
    450                 455                 460
Glu Ile Glu Tyr Leu Val Ile Asp Glu Asn Leu Asp Leu Glu Asn Phe
465                 470                 475                 480
Lys Lys Glu Leu Arg Trp Asn Glu Leu Tyr Trp Gly Leu Leu Lys Arg
                485                 490                 495
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Claims (5)

1、一种在棒状杆菌菌株中表达的***糖异构酶。
2、根据权利要求1所述的***糖异构酶，其特征在于，***糖异构酶来自最佳反应温度在70-90℃范围的热袍菌属、栖热菌属或者硫化叶菌属菌种。
3、根据权利要求2所述的***糖异构酶，其特征在于，***糖异构酶来自新阿波罗栖热袍菌DSM 5068。
4、根据权利要求1所述的***糖异构酶，其特征在于，***糖异构酶含有由序列号：3表示的氨基酸序列。
5、一种使用权利要求1的***糖异构酶由半乳糖制备塔格糖的方法。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103555646A (zh) * 2013-10-29 2014-02-05 南京工业大学 一种共表达l-***糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌
CN104011200A (zh) * 2011-12-23 2014-08-27 Cj第一制糖株式会社 使用聚乙二醇类非离子型表面活性剂对微生物细胞进行杀菌的方法
CN106062188A (zh) * 2014-03-05 2016-10-26 Cj第制糖株式会社 具有提高的转化活性的l‑***糖异构酶变异体及利用该变异体生产d‑塔格糖的方法
CN107208084A (zh) * 2015-10-02 2017-09-26 博努莫斯生化有限责任公司 D‑塔格糖的酶促合成
CN109666620A (zh) * 2018-05-29 2019-04-23 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生产塔格糖的工程菌株，其构建方法及应用
CN111073879A (zh) * 2013-11-19 2020-04-28 Cj第一制糖 包含来源于嗜热菌的糖-差向异构酶的非磷酸己糖的差向异构化用组合物
CN113677803A (zh) * 2018-12-21 2021-11-19 绿光生物科技股份有限公司 阿洛酮糖的无细胞生产

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8137946B2 (en) 2006-11-27 2012-03-20 Cj Cheiljedang Corporation Recombinant GRAS strains expressing thermophilic arabinose isomerase as an active form and method of preparing food grade tagatose by using the same
KR20100001209A (ko) * 2008-06-26 2010-01-06 한국화학연구원 갈락토오스 이용이 억제된 미생물을 이용한 타가토오즈제조방법
KR20110035805A (ko) * 2009-09-30 2011-04-06 씨제이제일제당 (주) 사이코스-에피머화 효소의 고정화 및 이를 이용한 사이코스의 제조방법
CN101845429B (zh) * 2010-04-21 2011-08-31 南京工业大学 一种耐高温l-***糖异构酶及其应用
WO2013150069A1 (en) 2012-04-04 2013-10-10 Nutrilab N.V. Improved galactose isomerases and use thereof in the production of tagatose
KR101507031B1 (ko) 2012-05-17 2015-03-31 씨제이제일제당 (주) 효소 고정화 비드의 제조 장치 및 이를 이용한 효소 고정화 비드의 제조 방법
KR20140015795A (ko) 2012-07-25 2014-02-07 씨제이제일제당 (주) 낙엽송으로부터 갈락토스를 제조하는 방법 및 상기 갈락토스를 이용한 타가토스의 제조 방법
KR101488844B1 (ko) * 2013-11-29 2015-02-03 씨제이제일제당(주) 커피추출후 잔여물로부터 타가토스를 제조하는 방법
KR101785300B1 (ko) * 2015-12-23 2017-11-15 대상 주식회사 미생물 균체 고정화 장치 및 이를 이용한 미생물 균체 고정화 방법
JP7115904B2 (ja) 2017-06-07 2022-08-09 矢崎エナジーシステム株式会社 ケーブルグリップおよびリング状部材
JP7256019B2 (ja) 2018-08-29 2023-04-11 矢崎エナジーシステム株式会社 ケーブルグリップ
KR102124317B1 (ko) 2019-02-20 2020-06-19 고려대학교산학협력단 아가레이즈-3,6-안하이드로-l-갈락토시데이즈-아라비노오즈 아이소머레이즈 효소복합체 및 이를 이용한 한천으로부터의 타가토오즈 생산방법
CN111057698B (zh) * 2019-12-28 2021-10-15 浙江工业大学 L-***糖异构酶、突变体及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH022A (ja) * 1984-06-20 1990-01-05 Tomio Konno 真空フアイバー電子通信の方法とその装置
KR100435262B1 (ko) 1997-08-13 2004-07-16 삼성전자주식회사 다층 배선 구조를 갖는 반도체 소자 및 그 제조방법
US20030235894A1 (en) * 1999-05-06 2003-12-25 Tongyang Confectioner Co. Biological tagatose production by recombinant Escherichia coli
US20020102329A1 (en) * 2000-07-22 2002-08-01 Michael Lanahan Methods for high-temperature hydrolysis of galactose-containing oligosaccharides in complex mixtures
KR100443865B1 (ko) * 2000-12-22 2004-08-09 씨제이 주식회사 호열성 아라비노스 이성화효소 및 그를 이용한 타가토스의 제조방법
WO2002052021A1 (en) * 2000-12-22 2002-07-04 Yu Ryang Pyun Thermostable l-arabinose isomerase and process for preparing d-tagatose thereby
US7052898B2 (en) * 2001-07-16 2006-05-30 Bioneer A/S Thermostable isomerase and use hereof, in particular for producing tagatose
KR100620092B1 (ko) * 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
KR100872695B1 (ko) 2006-11-27 2008-12-10 씨제이제일제당 (주) Ｇｒａｓ 미생물로부터 발현된 식품안전형 호열성아라비노스 이성화효소 및 그를 이용한 타가토스의제조방법

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107177526B (zh) * 2011-12-23 2021-02-26 Cj第一制糖株式会社 使用聚乙二醇类非离子型表面活性剂对微生物细胞进行杀菌的方法
CN104011200B (zh) * 2011-12-23 2017-12-12 Cj第一制糖株式会社 使用聚乙二醇类非离子型表面活性剂对微生物细胞进行杀菌的方法
CN107177526A (zh) * 2011-12-23 2017-09-19 Cj第制糖株式会社 使用聚乙二醇类非离子型表面活性剂对微生物细胞进行杀菌的方法
CN104011200A (zh) * 2011-12-23 2014-08-27 Cj第一制糖株式会社 使用聚乙二醇类非离子型表面活性剂对微生物细胞进行杀菌的方法
US9504271B2 (en) 2011-12-23 2016-11-29 Cj Cheiljedang Corporation Method for sterilizing microbial cells using polyethylene glycol-based nonionic surfactant
CN103555646B (zh) * 2013-10-29 2016-08-31 南京工业大学 一种共表达l-***糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌
CN103555646A (zh) * 2013-10-29 2014-02-05 南京工业大学 一种共表达l-***糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌
CN111073879A (zh) * 2013-11-19 2020-04-28 Cj第一制糖 包含来源于嗜热菌的糖-差向异构酶的非磷酸己糖的差向异构化用组合物
CN111073879B (zh) * 2013-11-19 2024-04-02 Cj第一制糖 包含来源于嗜热菌的糖-差向异构酶的非磷酸己糖的差向异构化用组合物
CN106062188A (zh) * 2014-03-05 2016-10-26 Cj第制糖株式会社 具有提高的转化活性的l‑***糖异构酶变异体及利用该变异体生产d‑塔格糖的方法
CN106062188B (zh) * 2014-03-05 2019-11-08 Cj第一制糖株式会社 具有提高的转化活性的l-***糖异构酶变异体及利用该变异体生产d-塔格糖的方法
CN107208084B (zh) * 2015-10-02 2019-02-15 博努莫斯有限责任公司 D-塔格糖的酶促合成
CN107208084A (zh) * 2015-10-02 2017-09-26 博努莫斯生化有限责任公司 D‑塔格糖的酶促合成
CN109666620A (zh) * 2018-05-29 2019-04-23 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生产塔格糖的工程菌株，其构建方法及应用
CN109666620B (zh) * 2018-05-29 2022-05-10 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生产塔格糖的工程菌株，其构建方法及应用
CN113677803A (zh) * 2018-12-21 2021-11-19 绿光生物科技股份有限公司 阿洛酮糖的无细胞生产

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