ES2430590T3 - Predictores de la respuesta de pacientes al tratamiento con inhibidores del receptor del EGF - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para predecir una probabilidad de que un paciente humano con un cáncer colorrectal queexpresa EGFR presente una respuesta beneficiosa a un inhibidor del EGFR usando un modelo de 4 genes basadoen niveles de expresión de AREG, EREG, DUSP6 y SLC26A3, que comprende: medir, en una muestra tumoral obtenida del paciente, niveles de transcritos de ARN, o sus productos deexpresión, de AREG, EREG, DUSP6 y SLC26A3, normalizar los niveles de los transcritos de ARN, o sus productos de expresión, de AREG, EREG, DUSP6 ySLC26A3, para obtener niveles de expresión normalizados de AREG, EREG, DUSP6 y SLC26A3; y usar los niveles de expresión normalizados de AREG, EREG, DUSP6 y SLC26A3 para determinar laprobabilidad de que el paciente presente una respuesta beneficiosa a un inhibidor del EGFR, en el que los niveles de expresión normalizados aumentados de AREG, EREG y SLC26A3 se correlacionanpositivamente con la probabilidad de que el paciente presente una respuesta beneficiosa al inhibidor del EGFR;y en el que el nivel de expresión normalizado aumentado de DUSP6 se correlaciona negativamente con laprobabilidad de que el paciente presente una respuesta beneficiosa al inhibidor del EGFR.

Description

Predictores de la respuesta de pacientes al tratamiento con inhibidores del receptor del EGF

Campo técnico

La presente divulgación proporciona genes y conjuntos de genes cuyos niveles de expresión son útiles para predecir la respuesta de pacientes con cáncer a un tratamiento con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

Introducción

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), también conocido como ERBB y HER1, es un gen que codifica un proteína receptora que se encuentra sobre la superficie de algunas células y a la que se une un factor de crecimiento epidérmico, provocando la división de la célula. El EGFR es un miembro de la familia de receptores HER, y la dimerización del EGFR y el homólogo 2 del oncogén de la leucemia eritroblástica vírica v-erb-b2 (ERBB2), también conocido como HER2, es un estímulo importante para el crecimiento del cáncer de mama en cánceres de mama positivos para ERBB2. En un subconjunto de cánceres de mama los niveles de expresión del EGFR están amplificados y la sobreexpresión resultante del receptor contribuye a la etiología del cáncer de mama.

Debido a que el cáncer se caracteriza por células que proliferan rápidamente, la mayoría de los fármacos antineoplásicos atacan de manera indiscriminada a las células que se dividen rápidamente y, como consecuencia, con frecuencia presentaban un alto grado de toxicidad. En la mayoría de los casos, se sabe poco sobre los mecanismos de acción de estos fármacos citotóxicos. Lo inhibidores del EGFR dirigidos, p. ej., han demostrado actividad contra una serie de tipos de cáncer. Los anticuerpos monoclonales anti-EGFR han mostrado actividad antitumoral en cáncer colorrectal avanzado, en carcinomas de células escamosas de la cabeza y el cuello, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) y carcinomas de células renales (Baselga J y Arteaga CL (2005) J Clin Oncol 24452459. Existen ensayos clínicos en marcha en cáncer en etapas tempranas y en otros tipos de tumores y se espera que muestren actividad en tipos de cáncer donde se expresa el EGFR y donde los ligandos del EGFR promueven el crecimiento y la progresión de tumores.

Dada la importancia de la selección del tratamiento, se ha realizado un esfuerzo para desarrollar fármacos en concierto con las pruebas de diagnóstico que los acompañan, que pueden identificar pacientes sensibles. Estos diagnósticos abordarían las situaciones donde algunos pacientes que se podrían beneficiar del tratamiento no reciben el fármaco y otros pacientes que es poco probable que se beneficien se exponen innecesariamente a efectos secundarios tóxicos, incurren en gastos innecesarios y/o experimentan un retraso para ser tratados con fármacos alternativos que podrían resultar más eficaces. El documento WO 2007/025044 divulga 39 marcadores y conjuntos de los mismos para predecir la respuesta a un inhibidor del EGFR.

Sumario

La presente divulgación proporciona procedimientos y composiciones para facilitar la determinación de si un cáncer que expresa el EGFR en un individuo es un cáncer que responde a inhibidores del EGFR, así como procedimientos para determinar la probabilidad de que un paciente que tiene un cáncer que expresa el EGFR presente una respuesta beneficiosa a un tratamiento inhibidor del EGFR. En general, los procedimientos implican determinar un nivel de expresión normalizado del producto de un gen que se correlaciona con el grado de respuesta a inhibidores del EGFR. Los procedimientos de la invención se divulgan en las reivindicaciones 1-15 adjuntas.

La divulgación proporciona procedimientos para predecir la probabilidad de que un paciente humano con un cáncer que expresa el EGFR presente una respuesta beneficiosa a un tratamiento antineoplásico inhibidor del EGFR basado en los niveles de expresión de uno o más genes indicadores de respuesta en un muestra biológica obtenida de un tumor del paciente. Específicamente, el procedimiento conlleva medir un nivel de expresión de al menos un gen indicador de respuesta, o su producto de expresión. El gen indicador de respuesta es uno o más seleccionados de un grupo que consiste en ATP5E, TITF1, CLTC, BRCA1, AREG, PTP4A3, EREG, VAV3, SATB2, CEACAM6, EGFR, CHN2, FGFR3, C13orf18, QPRT, AMACR1, CKMT2, ID1, SORBS1, SLC26A3, ErbB3, DUSP6, VDAC2, ANXA2P2, SERPINA B1, NT5E, GPC3, DUSP4, PHLDA1, K-ras, DR5, VIL2, LAMC2, SFN, ANXA1, EPHA2, P14ARF, CA9, KRT17, p14ARF, maspina, PLAUR, LAMA3 y GCNT3. Se normaliza el nivel de expresión y se usa el nivel de expresión normalizado para determinar o predecir la probabilidad de una respuesta beneficiosa, en la que se miden niveles de expresión normalizados aumentados de uno o más de los siguientes: ATP5E, TITF1, CLTC, BRCA1, AREG, PTP4A3, EREG, VAV3, SATB2, CEACAM6, EGFR, CHN2, FGFR3, C13orf18, QPRT, AMACR1, CKMT2, ID1, SORBS1, SLC26A3 y ErbB3 se correlacionan de positivamente con la probabilidad de que el paciente presente una respuesta beneficiosa al tratamiento antineoplásico inhibidor del EGFR; y los niveles de expresión normalizados aumentados de DUSP6, VDAC2, ANXA2P2, SERPINA B1, NT5E, GPC3, DUSP4, PHLDA1, K-ras, DR5, VIL2, LAMC2, SFN, ANXA1, EPHA2, P14ARF, CA9, KRT17, p14ARF, maspina, PLAUR, LAMA3 y GCNT3 se correlacionan negativamente con la probabilidad de que el paciente presente una respuesta beneficiosa al

tratamiento antineoplásico inhibidor del EGFR. Se genera un informe basado en la probabilidad de respuesta determinada.

La divulgación proporciona procedimientos para predecir una probabilidad de que un paciente humano con un cáncer que expresa el EGFR, negativo para KRAS presente una respuesta beneficiosa a un tratamiento antineoplásico inhibidor del EGFR basado en los niveles de expresión de uno o más genes indicadores de respuesta en un muestra biológica obtenida de un tumor del paciente. Específicamente, el procedimiento conlleva medir un nivel de expresión de al menos un gen indicador de respuesta, o su producto de expresión, seleccionado de un grupo que consiste en EGF, ADAM17, PTP4A3, ADAM15, QPRT, SATB2, RASSF1, VAV3, CEACAM6, EREG, AREG, TITF1, SORBS1, C13orf18, CKMT2, BTC, ATP5E, catenina B, CCNE1, EGFR, Bclx, BRCA1, CDC25B, CHN2, ID1, SLC26A3, VDAC2, SERPINA B1, PHLDA1, ANXA2P2, KRT17, EPHA2, DUSP4, CGA, CA9, maspina, NEDD8, DUSP6, GPC3, NT5E, VIL2 y P14ARF. Se normaliza el nivel de expresión y se usa el nivel de expresión normalizado para determinar o predecir la probabilidad de una respuesta beneficiosa, en la que se miden niveles de expresión normalizados aumentados de uno o más de los siguientes: EGF, ADAM17, PTP4A3, ADAM15, QPRT, SATB2, RASSF1, VAV3, CEACAM6, EREG, AREG, TIT1, SORBS1, C13orf18, CKMT2, BTC, ATP5E, catenina B, CCNE1, EGFR, Bclx, BRCA1, CDC25B, CHN2, ID1 y SLC26A3 se correlacionan positivamente con la probabilidad de que el paciente presente una respuesta beneficiosa al tratamiento antineoplásico inhibidor del EGFR; y los niveles de expresión normalizados aumentados de VDAC2, SERPINA B1, PHLDA1, ANXA2P2, KRT17, EPHA2, DUSP4, CGA, CA9, maspina, NEDDB, DUSP6, GPC3, NT5E, VIL2 y P14ARF se correlacionan negativamente con la probabilidad de que el paciente presente una respuesta beneficiosa al tratamiento antineoplásico inhibidor del EGFR.

Los procedimientos de la presente divulgación contemplan el uso de un nivel de expresión normalizado para determinar o predecir la probabilidad de respuesta beneficiosa, basándose en el/los nivel(es) de expresión normalizado(s) para genes indicadores de respuesta individuales y/o conjuntos de varios genes. Se divulgan conjuntos de varios genes ejemplares. Los valores de expresión se normalizan con respecto a un nivel de expresión de uno o más genes de referencia. La divulgación permite la medida de nivel(es) de expresión normalizado(s) del producto de al menos un gen indicador de respuesta. Para todos los aspectos de la presente divulgación, los procedimientos pueden incluir además la determinación de los niveles de expresión de al menos dos de dichos genes, o sus productos de expresión. Se contempla además que los procedimientos de la presente divulgación pueden incluir adicionalmente la determinación de los niveles de expresión de al menos tres de dichos genes, o sus productos de expresión. Se contempla que los procedimientos de la presente divulgación pueden incluir adicionalmente la determinación de los niveles de expresión de al menos cuatro de dichos genes, o sus productos de expresión. Se contempla que los procedimientos de la presente divulgación pueden incluir adicionalmente la determinación de los niveles de expresión de al menos cinco de dichos genes, o sus productos de expresión. Se contempla que los procedimientos de la presente divulgación pueden incluir adicionalmente la determinación de los niveles de expresión de al menos seis de dichos genes, o sus productos de expresión. Se contempla que los procedimientos de la presente divulgación pueden incluir adicionalmente la determinación de los niveles de expresión de al menos siete de dichos genes, o sus productos de expresión. Se contempla que los procedimientos de la presente divulgación pueden incluir adicionalmente la determinación de los niveles de expresión de al menos ocho de dichos genes, o sus productos de expresión. Se contempla que los procedimientos de la presente divulgación pueden incluir adicionalmente la determinación de los niveles de expresión de al menos nueve de dichos genes, o sus productos de expresión. Los procedimientos pueden implicar la determinación de los niveles de expresión of de al menos diez (10) o al menos quince (15) de los genes enumerados anteriormente o sus productos.

Un(os) nivel(es) de expresión normalizado(s), generados como se analiza anteriormente, se usa para determinar o predecir la probabilidad de respuesta beneficiosa. El/los nivel(es) de expresión normalizado(s) es/son indicativos de la probabilidad de que el paciente presente una respuesta beneficiosa a un tratamiento inhibidor del EGFR, tal como un anticuerpo o una molécula pequeña específicos del EGFR. Se puede calcular una puntuación de probabilidad (p. ej., una puntuación que predice la probabilidad de respuesta beneficiosa a un tratamiento inhibidor del EGFR) basándose en el/los nivel(es) de expresión normalizado(s). Se puede calcular una puntuación usando valores ponderados basados en un nivel de expresión normalizado de un gen indicador de respuesta y su contribución a la respuesta al tratamiento antineoplásico inhibidor del EGFR.

Además, la divulgación proporciona matrices para llevar a cabo los procedimientos divulgados en el presente documento, o para analizar si una combinación matemática de los niveles de expresión normalizados de cualquier combinación de los genes indicadores de respuesta es más indicativa de una probabilidad de que un paciente va a responder al tratamiento con un inhibidor del EGFR. Las matrices pueden incluir, por ejemplo, sondas que hibridan con una secuencia de ácidos nucleicos de un gen indicador de respuesta o una mutación activadora de KRAS.

La determinación del nivel de expresión de uno o más genes se puede conseguir, por ejemplo, por un procedimiento de realización de perfiles de expresión génica. El procedimiento de realización de perfiles de expresión génica puede ser, por ejemplo, un procedimiento basado en PCR. El nivel de expresión de dichos genes se puede determinar, por ejemplo, por RT-PCR (PCR con transcriptasa inversa), RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) u otros procedimientos basados en PCR, inmunohistoquímica, técnicas de proteómica, un procedimiento basado en matrices o cualquier otro procedimiento conocido en la técnica o sus combinaciones. En un aspecto, se fragmentan los transcritos de ARN.

La detección de un transcrito de ARN de un gen indicador de respuesta se puede lograr sometiendo a ensayo una 5 secuencia para detectar una secuencia basada en exones o una secuencia basada en intrones, cuya expresión se correlacione con la expresión de una secuencia exónica correspondiente.

En un modo de realización ejemplar, el ensayo para la medida de genes indicadores de respuesta, o sus productos génicos, y/o la activación de mutaciones KRAS se proporciona en forma de un kit o kits.

10 Los niveles de expresión de los genes se pueden normalizar con respecto a los niveles de expresión de uno o más genes de referencia, o sus productos de expresión.

La muestra tumoral puede ser, por ejemplo, una muestra de tejido que contiene células cancerosas, o una parte o

15 partes de células cancerosas, donde el tejido puede ser tejido fijado incluido en parafina o fresco o congelado. Por ejemplo, el tejido puede ser de una biopsia (con aguja fina, con aguja gruesa u otros tipos de biopsia) u obtenerse por aspiración con aguja fina, o mediante la obtención de fluido corporal que contenga una célula cancerosa, p. ej., orina, sangre, etc.

20 Para todos los aspectos de los procedimientos de la presente divulgación, se contempla que, para cada aumento de un aumento del nivel de uno o más genes o sus productos de expresión, se identifica que el paciente muestra un aumento gradual de la respuesta clínica.

En la puesta en práctica de los procedimientos divulgados en el presente documento se puede producir la 25 determinación de más de un nivel de expresión a la vez.

Los procedimientos pueden incluir además la etapa de crear un informa basado en la probabilidad de respuesta beneficiosa determinada o predicha. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona informes para un paciente que contienen un sumario de los niveles de expresión de los uno o más genes indicadores de respuesta, o sus

30 productos de expresión, en una muestra tumoral obtenida de dicho paciente. En un aspecto, el informe está en formato electrónico.

En un modo de realización, el inhibidor del EGFR es un anticuerpo específico para el EGFR. En otro, el inhibidor del EGFR es una molécula pequeña, por ejemplo, un inhibidor de tirosina cinasa selectivo para EGFR.

35 Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra las secuencias de sondas y cebadores usados para someter a ensayo cada gen identificado en los estudios.

40 La figura 2 muestra las secuencias de amplicones esperadas a partir del uso de los cebadores y sondas mostrados en la figura 1.

Las figuras 3A-10D proporcionan conjunto de gráficas que muestran curvas de probabilidad. Cada gráfica contiene

45 tres líneas (una línea oscura central y dos líneas más claras por encima y por debajo de la línea oscura central). Cada gráfica tiene una línea oscura central que representa la relación predicha por el modelo entre la expresión génica normalizada en el eje x y la probabilidad de respuesta beneficiosa a un inhibidor del EGFR en el eje y (curva de probabilidad predicha). Las líneas grises más claras por encima y por debajo de la línea negra representan el intervalo de confianza del 95 % para la probabilidad predicha, es decir, a un valor de expresión en particular para el

50 gen, existe una probabilidad del 95 % de que las líneas grises superior e inferior incluyan la probabilidad de respuesta real. Los intervalos de confianza para las curvas de probabilidad se calcularon usando el procedimiento de aproximación normal. El nombre del gen analizado se indica debajo de cada gráfica por el texto que precede al punto; por ejemplo, "AREG.2" se refiere a AREG. A continuación, se describe cada una de las figuras 3A-10D en más detalle.

55 Las figuras 3A-3D muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la tabla 1A para el análisis de la TRG en todos los pacientes (negativos para K-ras y positivos para K-ras); cociente de probabilidades >1.

60 Las figuras 4A-4F muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la tabla 1B para el análisis de la TRG en todos los pacientes (negativos para K-ras y positivos para K-ras); cociente de probabilidades >1.

Las figuras 5A-5E muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la tabla 2A para el 65 análisis del CE en todos los pacientes (negativos para K-ras y positivos para K-ras); cociente de probabilidades >1.

Las figuras 6A-6F muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la tabla 2B para el análisis del CE en todos los pacientes (negativos para K-ras y positivos para K-ras); cociente de probabilidades <1.

Las figuras 7A-7C muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la tabla 6A para el análisis de la TRG en pacientes negativos para K-ras; cociente de probabilidades >1.

Las figuras 8A-8C muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la tabla 6B para el análisis de la TRG en pacientes negativos para K-ras; cociente de probabilidades <1.

Las figuras 9A-9E muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la tabla 7A para el análisis del CE en pacientes negativos para K-ras; cociente de probabilidades >1.

Las figuras 10A-10D muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la tabla 7B para el análisis del CE en pacientes negativos para K-ras; cociente de probabilidades <1.

Cada una de las tablas 1A, 1B, 2A, 2B, 6A, 6B, 7A y 7B proporciona un cociente de probabilidades para cada indicador de respuesta y gen enumerado en la tabla. El cociente de probabilidades comunicada para un gen se refiere a la pendiente global de la curva de probabilidad mostrada en la figura correspondiente y es una medida del cambio de la probabilidad de respuesta predicha por el modelo para cada cambio de unidad en la expresión génica normalizada. Como se muestra, los genes con cocientes de probabilidad mayores (más alejados de 1) en las tablas se representan con pendientes más pronunciadas en las figuras.

Descripción detallada

Definiciones

A menos que se indique lo contrario, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology y Molecular Biology 2ª ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994) y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms y Structure 4ª ed., John Wiley & Sons (Nueva York, NY 1992), proporcionan a un experto en la técnica una guía general de muchos de los términos usados en la presente solicitud.

Un experto en la técnica reconocerá muchos procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, que se podrían usar en la puesta en práctica de la presente invención. De hecho, la presente invención no se limita en modo alguno a los procedimientos y materiales descritos. Para los propósitos de la presente invención, se definen a continuación los términos siguientes.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "k-ras" y "KRAS" (incluido en tablas y figuras) se usan indistintamente y se refieren al gen KRAS identificado en el momento de esta presentación en la base de datos Entrez del NCBI con el n. º de acceso NM_004985.3 (base d datos Entrez, NCBI) y/o sus productos de expresión.

Tal como se usa en el presente documento, el término "estado de KRAS", se refiere a si el cáncer de un paciente es negativo para una mutación activadora de KRAS (negativo para KRAS) o positivo para una mutación activadora de KRAS (positivo para KRAS).

Tal como se usa en el presente documento, el término "mutación activadora de KRAS" se refiere a una mutación en un gen k-ras que da lugar a una activación constitutiva de una proteína codificada por k-ras, es decir, la proteína kras activa moléculas aguas abajo en su cascada de señalización en ausencia de ligando unido al receptor. Como ejemplo, la proteína k-ras podría activar la señalización aguas abajo en ausencia de EGF, anfirregulina o epirregulina unidos al EGFR.

Tal como se usa en el presente documento, el término "cáncer que expresa EGFR" se refiere a un tumor canceroso con células que expresan un polipéptido del receptor de superficie celular del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

Tal como se usa en el presente documento, el término "receptor del factor de crecimiento epidérmico" ("EGFR") se refiere a un gen que codifica un polipéptido de membrana que se une, activándose de ese modo, al factor de crecimiento epidérmico (EGF). El EGFR también es conocido en la literatura como ERBB, ERBB 1 y HER 1. Un EGFR ejemplar es el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (véase Ullrich et al. (1984) Nature 309:418-425; número de acceso de Genbank NP_005219.2). La unión de un ligando de EGF activa el EGFR (p. ej., dando lugar a la activación de la señalización mitógena intracelular, la autofosforilación de EGFR). Un experto en la técnica apreciará que, además del EGF, otros ligandos se pueden unir a y activar el EGFR. Los ejemplos de estos ligandos incluyen, pero sin limitación, anfirregulina, epirregulina, TGF-a, betacelulina y EGF de unión a heparina (HB-EGF) (Strawn y Shawver (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4)553-573 y "The Protein Kinase Facts Book:

Protein Tyrosine Kinases" (1995) Hardie, et al. (eds.), Academic Press, NY, NY). Véanse también, Oda et al. ((2005) Molec. Systems Biol. 1:2005.0010; y Moulder et al. ((2001) Cancer Res. 61:8887.

Tal como se usa en el presente documento, un "gen de EGFR" se refiere a un ácido nucleico que codifica el producto de un gen de EGFR, p. ej., un ARNm de EGFR, un polipéptido de EGFR y similares.

Tal como se usa en el presente documento, "inhibidor del EGFR" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir directa o indirectamente la activación de un EGFR. Los inhibidores del EGFR incluyen agentes que se unen a un EGFR e inhiben su activación. Los inhibidores del EGFR incluyen anticuerpos que se unen a un EGFR e inhiben la activación del EGFR; así como inhibidores de tirosina cinasa de molécula pequeña que inhiben la activación de un EGFR. Los anticuerpos frente al EGFR incluyen IgG; IgM; IgA; fragmentos de anticuerpo que mantienen la capacidad de unión al EGFR, p. ej., Fv, Fab, F(ab)2, anticuerpos monocatenarios y similares; anticuerpos quiméricos; etc. Los inhibidores de tirosina cinasa de molécula pequeña del EGFR incluyen inhibidores de tirosina cinasa selectivos para el EGFR. Los inhibidores de tirosina cinasa de molécula pequeña del EGFR pueden tener un peso molecular en un intervalo de desde aproximadamente 50 Da hasta aproximadamente 10.000 Da.

Tal como se usa en el presente documento, el término "tumor" se refiere a cualquier crecimiento y proliferación celular neoplásicos, ya sea maligno o benigno, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a, o describen, una afección fisiológica de los mamíferos que, típicamente, se caracteriza en parte por una proliferación celular desregulada. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de las vías urinarias, cáncer de tiroides, cáncer renal, carcinoma, melanoma, cáncer cerebral, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de células escamosas de la cabeza y el cuello, cáncer del endometrio, mieloma múltiple, cáncer rectal y cáncer de esófago. En un modo de realización ejemplar, el cáncer es cáncer colorrectal.

Tal como se usa en el presente documento, el término "patología" del cáncer incluye todos los fenómenos que alteran el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, proliferación celular anómala o incontrolable, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citocinas u otros productos de secreción en cantidades anómalas, supresión o agravación de la respuesta inflamatoria o inmunológica, neoplasia, neoplasia pre-maligna, neoplasia maligna, invasión de tejidos u órganos circundantes o alejados, tales como ganglios linfáticos, etc.

En el presente documento, se usan indistintamente los términos "sujeto", "individuo" y "paciente" para hacer referencia a un mamífero que se está evaluando para su tratamiento y/o se está tratando. En un modo de realización, el mamífero es un ser humano. Por tanto, los términos "sujeto", "individuo" y "paciente" engloban individuos que tienen cáncer (p. ej., cáncer colorrectal u otro cáncer al que se haga referencia en el presente documento), incluidos los que se han sometido o son candidatos para una extirpación (intervención quirúrgica) para eliminar el tejido canceroso (p. ej., tejido colorrectal canceroso u otro cáncer al que se haga referencia en el presente documento).

Tal como se usan en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratar" y similares, se refieren a administrar un agente o llevar a cabo un procedimiento (p. ej., radiación, un procedimiento quirúrgico, etc.), con el propósito de obtener un efecto. El efecto puede ser profiláctico en términos de evitar completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de efectuar una cura parcial o completa de una enfermedad y/o síntomas de la enfermedad. Tal como se usa en el presente documento, "tratamiento" cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en particular en un ser humano, e incluye: (a) evitar que se produzca la enfermedad o un síntoma de una enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que todavía no se le ha diagnosticado que la tiene (p. ej., incluidas enfermedades que pueden estar asociadas con, o provocadas por, una enfermedad primaria); (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su avance; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad.

Tal como se usa en el presente documento, en el contexto de la respuesta del paciente a un tratamiento inhibidor del EGFR, los términos "respuesta beneficiosa", "respuesta beneficiosa del paciente" y "respuesta clínicamente beneficiosa", "beneficio clínico" y similares, se usan indistintamente y se refieren a la respuesta favorable de un paciente a un fármaco en contraposición con respuestas desfavorables, es decir, acontecimientos adversos. En pacientes individuales, se puede expresar la respuesta beneficiosa en términos de una serie de parámetros clínicos, incluida la pérdida de tumor detectable (respuesta completa, RC), la disminución del tamaño del tumor y/o el número de células cancerosas (respuesta parcial, RP), la detención del crecimiento del tumor (enfermedad estable, EE), la potenciación de la respuesta inmunitaria antitumoral, que puede dar lugar a la regresión o al rechazo del tumor; el alivio, en cierta medida, de uno o más síntomas asociados con el tumor; el aumento de la duración de la supervivencia después del tratamiento; y/o la disminución de la mortalidad en un punto dado del tiempo después del tratamiento. El aumento continuo del tamaño del tumor y/o del número de células cancerosas y/o de la metástasis tumoral es indicativo de la falta de respuesta beneficiosa al tratamiento.

En una población se puede evaluar el beneficio clínico de un fármaco, es decir, su eficacia, sobre la base de uno o más criterios de valoración. Por ejemplo, el análisis de la tasa de respuesta global (TRG) clasifica como con respuesta a los pacientes que experimentan RC o RP después del tratamiento con un fármaco. El análisis del control de la enfermedad (CE) clasifica como con respuesta a los pacientes que experimentan RC, RP o EE después del tratamiento con un fármaco.

Tal como se usa en el presente documento, el término "supervivencia sin progresión" se refiere al intervalo de tiempo desde el tratamiento del paciente hasta la progresión del cáncer o la muerte del paciente, lo que ocurra primero.

Tal como se usa en el presente documento, el término "con respuesta" se refiere a un paciente que tiene un cáncer que expresa el EGFR y que presenta una respuesta clínica beneficiosa después del tratamiento con un inhibidor del EGFR.

Tal como se usa en el presente documento, el término "sin respuesta" se refiere a un paciente que tiene un cáncer que expresa el EGFR y que no ha mostrado una respuesta beneficiosa después del tratamiento con un inhibidor del EGFR.

Tal como se usa en el presente documento, el término "se correlaciona" o "se correlaciona con" y términos similares, se refiere a una asociación estadística entre casos de dos eventos, donde los eventos incluyen números, conjuntos de datos y similares. Por ejemplo, cuando los eventos incluyen números, una correlación positiva (también denominada en el presente documento "correlación directa") significa que, a medida que uno aumenta, el otro aumenta también. Una correlación negativa (también denominada en el presente documento "correlación inversa") significa que, a medida que uno aumenta, el otro disminuye. La correlación no es necesariamente una correlación lineal y no se aplica necesariamente en todo el intervalo de las variables.

Tal como se usa en el presente documento, el término "muestra tumoral" significa una muestra que comprende material tumoral obtenido de un paciente canceroso. El término engloba muestra clínicas, por ejemplo, tejido obtenido por extirpación quirúrgica y tejido obtenido por biopsia, tal como, por ejemplo, una biopsia con aguja gruesa

o una biopsia con aguja fina. El término también engloba muestras que comprenden células tumorales obtenidas de sitios distintos del tumor primario, p. ej., de células tumorales circulantes. El término engloba células que son la progenie de las células tumorales del paciente, p. ej., muestras de cultivo celular derivadas de células tumorales primarias o células tumorales circulantes. El término engloba muestras que pueden comprender material proteínico o de ácido nucleico recogido de células tumorales in vivo, p. ej., médula ósea, sangre, plasma, suero y similares. El término también engloba muestras que se han enriquecido en células tumorales o se han manipulado de otro modo después de su obtención y muestras que comprenden polinucleótidos y/o polipéptidos que se obtienen del material tumoral de un paciente.

En el presente documento, los términos "producto génico" y "producto de expresión" se usan indistintamente en referencia a una molécula producida usando la información de un gen. Por ejemplo, un producto génico o producto de expresión incluiría productos de transcripción de ARN (transcritos) del gen, incluido ARNm, y los productos de traducción polipeptídicos de tales transcritos de ARN, tanto si dicho producto está modificado postraduccionalmente como si no (p. ej., ARN sin ayuste, una variante de ayuste del ARNm, un fragmento de ARN, etc.). Además, un producto génico o producto de expresión incluye los productos de traducción polipeptídicos de dicho ARN, tanto si dicho producto está modificado postraduccionalmente como si no (p. ej., una variantes de ayuste de polipéptido, etc.)

Tal como se usa en el presente documento, el término "nivel de expresión normalizado" se refiere a un nivel de expresión de un gen indicador de respuesta con relación al nivel de un producto de expresión de un(os) gen(es) de referencia.

Tal como se usa en el presente documento, el término "gen indicador de respuesta" se refiere a un gen cuya expresión se correlaciona positiva o negativamente con la respuesta beneficiosa del paciente al tratamiento inhibidor del EGFR. La expresión de un gen indicador de respuesta se puede medir mediante la determinación del nivel de expresión de un producto de expresión del gen indicador de respuesta.

El término "aumento de la expresión" o "aumento de la expresión normalizada" con respecto a un gen o un transcrito de ARN (u otro producto de expresión, p. ej., una proteína) se usa para hacer referencia al nivel del transcrito (o ARN fragmentado) determinado por normalización con el nivel de uno o más ARNm de referencia, que podrían ser todos los transcritos medidos en el espécimen, un único ARNm de referencia o un conjunto de ARNm de referencia en particular. Un gen presenta "aumento de la expresión" en una subpoblación de sujetos cuando el nivel de expresión normalizado de un transcrito de ARN (o su producto génico) es superior en una subpoblación de pacientes clínicamente relevante (p. ej., pacientes que responden a un inhibidor del EGFR) que en una subpoblación relacionada (p. ej., pacientes que no responden a dicho inhibidor del EGF). En el contexto de un análisis de un nivel de expresión normalizado de un gen en tejido obtenido de un sujeto individual, un gen presenta un "aumento de la

expresión" cuando el nivel de expresión normalizado del gen tiende hacia o se aproxima más estrechamente al nivel de expresión normalizado característico de tal subpoblación de pacientes clínicamente relevante. Así, por ejemplo, cuando el gen analizado es un gen que muestra un aumento de la expresión en sujetos que responden en comparación con sujetos que no responden, si el nivel de expresión del gen en la muestra del paciente tiende hacia un nivel de expresión característico de un sujeto que responde, entonces el nivel de expresión del gen respalda la determinación de que es probable que el paciente individual responda. Análogamente, cuando el gen analizado es un gen que muestra un aumento de la expresión en sujetos que no responden en comparación con sujetos que responden, si el nivel de expresión del gen en la muestra del paciente tiende hacia un nivel de expresión característico de un sujeto que no responde, entonces el nivel de expresión del gen respalda la determinación de que es probable que el paciente individual no responda. Por tanto, tal como se divulga en el presente documento, la expresión normalizada de un gen dado se puede describir como positivamente correlacionada con un aumento de la probabilidad de una respuesta clínica positiva a la quimioterapia o como positivamente correlacionada con una disminución de la probabilidad de una respuesta clínica positiva a la quimioterapia.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "marca" y "marca detectable" se refieren a una molécula que se puede detectar, donde dichas moléculas incluyen, pero sin limitación, isótopos radioactivos, fluorescentes (fluoróforos), quimioluminiscentes, cromóforos, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, cromóforos, tintes, iones metálicos, soluciones metálicas, ligandos (p. ej., biotina, avidina, estreptavidina o haptenos), tintes intercalantes y similares. El término "fluorescente" o "fluoróforo" se refiere a una sustancia o una parte de la misma que puede presentar fluorescencia en un intervalo detectable.

Tal como se usa en el presente documento, el término "región de ácido nucleico objetivo" o "ácido nucleico objetivo" se refiere a un ácido nucleico con una "secuencia objetivo" que se quiere detectar (p. ej., en un procedimiento que implica hibridación y/o amplificación de ácidos nucleicos). El ácido nucleico objetivo puede ser monocatenario o bicatenario y puede incluir o no otras secuencias además de la secuencia objetivo (p. ej., el ácido nucleico objetivo puede incluir o no secuencias de ácidos nucleicos aguas arriba o que flanquean la secuencia en 5', y pueden incluir

o no una secuencia aguas abajo o que flanquea 3'. Cuando la detección es por amplificación, estas otras secuencias además de la secuencia objetivo pueden amplificarse o no con la secuencia objetivo.

Tal como se usa en el presente documento, el término "cebador" o "cebador oligonucleotídico" se refiere a un oligonucleótido que actúa para iniciar la síntesis de una hebra de ácidos nucleicos complementaria cuando somete a condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión de cebador, p. ej., en presencia de nucleótidos y un agente inductor de la polimerización tal como una polimerasa de ADN o ARN y a temperatura, pH, concentración de iones metálicos y concentración salina adecuados. En general, los cebadores son de una longitud compatible con su uso en la síntesis de productos de extensión de cebador y pueden estar en el intervalo de entre aproximadamente 8 nucleótidos y aproximadamente 100 nucleótidos (nt) de longitud, tal como de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 75 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 18 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 21 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 22 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 25 nt a aproximadamente 40 nt, etc., p. ej., en el intervalo de entre aproximadamente 18 nt y aproximadamente 40 nt, de entre aproximadamente 20 nt y aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 21 y aproximadamente 30 nt de longitud, inclusive, y cualquier longitud entre los intervalos indicados. Los cebadores pueden estar en el intervalo de entre aproximadamente 10-50 nucleótidos de largo, tal como aproximadamente 15-45, aproximadamente 18-40, aproximadamente 20-30, aproximadamente 21-25 nt, etc., y cualquier longitud entre los intervalos indicados. En algunos modos de realización, los cebadores no tienen más de aproximadamente 10, 12, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 nucleótidos de longitud. En este contexto, se puede interpretar que el término "aproximadamente" significa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos más en 5' o 3' desde cualquiera o desde ambos extremos.

En muchos modos de realización, los cebadores son monocatenarios para que la eficacia en la amplificación sea máxima, pero, de forma alternativa, pueden ser bicatenarios. Si es bicatenario, en muchos modos de realización se trata en primer lugar el cebador para separar sus hebras antes de usarlo para preparar productos de extensión. Típicamente, esta etapa de desnaturalización se efectúa por calor, pero, de forma alternativa, se puede llevar a cabo usando una base, seguida de neutralización. Por tanto, un "cebador" es complementario a un molde y forma un complejo por enlaces de hidrógeno o hibridación con el molde para dar un complejo de cebador/molde para la iniciación de la síntesis por una polimerasa, que se extiende por la adición covalente de bases en su extremo 3'.

Tal como se usa en el presente documento, un "par cebador" se refiere a unos cebadores primero y segundo que tienen una secuencia de ácidos nucleicos adecuada para una amplificación basada en ácidos nucleicos de un ácido nucleico objetivo. Estos pares cebadores incluyen, por lo general, un primer cebador que tiene una secuencia que es igual o similar a la de la primera parte de un ácido nucleico objetivo, y un segundo cebador que tiene una secuencia que es complementaria a una segunda parte de un ácido nucleico objetivo para permitir la amplificación del ácido nucleico objetivo o un fragmento del mismo. En el presente documento las referencias a los cebadores "primero" y "segundo" es arbitraria, a menos que se indique lo contrario específicamente. Por ejemplo, se puede diseñar el primer cebador como un "cebador directo" (que inicia la síntesis del ácido nucleico desde un extremo 5' del ácido nucleico objetivo) o como "cebador inverso" (que inicia la síntesis del ácido nucleico desde un extremo 5' de

producto de extensión producido a partir de la síntesis iniciada desde el cebador directo). Del mismo modo, se puede diseñar el segundo cebador como un cebador directo o un cebador inverso.

Tal como se usa en el presente documento, el término "sonda" o "sonda oligonucleotídica", usados indistintamente en el presente documento, se refiere a una estructura que comprende un polinucleótido, como se define anteriormente, que contiene una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos presente en el analito de ácido nucleico objetivo (p. ej., un producto de amplificación de ácido nucleico). Las regiones polinucleotídicas de las sondas pueden estar compuestas de ADN y/o ARN y/o análogos nucleotídicos sintéticos. En general, las sondas tienen una longitud compatible con su uso en la detección específica de la totalidad o una parte de una secuencia objetivo de un ácido nucleico objetivo y, en muchos modos de realización, están en el intervalo de entre aproximadamente 8 nt y aproximadamente 100 nt de longitud, tal como de aproximadamente 8 a aproximadamente 75 nt, de aproximadamente 10 a aproximadamente 74 nt, de aproximadamente 12 a aproximadamente 72 nt, de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 18 a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 21 a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 22 a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 nt de longitud, etc.,

p. ej., en el intervalo de entre aproximadamente 18-40 nt, aproximadamente 20-35 nt o aproximadamente 21-30 nt de longitud, y cualquier longitud entre los intervalos indicados. En algunos modos de realización, una sonda está en el intervalo de entre aproximadamente 10-50 nucleótidos de largo, tal como aproximadamente 15-45, aproximadamente 18-40, aproximadamente 20-30, aproximadamente 21-28, aproximadamente 22-25, etc., y cualquier longitud entre los intervalos mencionados. En algunos modos de realización, los cebadores no tienen más de aproximadamente 10, 12, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 nucleótidos de longitud. En este contexto, se puede interpretar que el término "aproximadamente" significa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos más en 5' o 3' desde cualquiera o desde ambos extremos.

Cuando se dice que un ácido nucleico hibrida un una secuencia de ácidos nucleicos mencionada, la hibridación es en condiciones rigurosas. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación a 50 °C o más y con SSC 0,1× (cloruro de sodio 15 mM/citrato de sodio 1,5 mM). Otro ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la incubación durante la noche a 42 °C en una solución: formamida al 50 %, SSC 5× (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5×, sulfato de dextrano al 10 % y 20 μg/ml de ADN esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en SSC 0,1× a aproximadamente 65 °C. Las condiciones de hibridación rigurosas son condiciones de hibridación que son al menos tan rigurosas como las condiciones representativas anteriores, donde las condiciones se consideran al menos igual de rigurosas si son al menos aproximadamente el 80 % de rigurosas, p. ej., al menos aproximadamente el 90 % de rigurosas que las condiciones rigurosas específicas anteriores.

Tal como se usa en el presente documento, el término "sistema informático" se refiere al soporte físico, el soporte lógico y el sistema de almacenamiento de datos usados para analizar información. El soporte físico mínimo de un sistema informático para pacientes comprende una unidad central de procesamiento (CPU), un dispositivo de entrada, un dispositivo de salida y un dispositivo de almacenamiento de datos. Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que muchos de los sistemas informáticos disponibles actualmente son adecuados para su uso en la presente invención y se pueden programar para realizar las funciones de cálculo/medida específicas de los procedimientos divulgados en el presente documento.

"Registrar" datos, programación u otra información en un medio de lectura por ordenador se refiere a un procedimiento para almacenar información, usando cualquier de los procedimientos de este tipo conocidos en la técnica. Se puede escoger cualquier estructura de almacenamiento de datos conveniente, basándose en el procedimiento y/o el dispositivo usado para acceder a la información almacenada. Se pueden usar una variedad de programas y formatos de procesamiento de datos para el almacenamiento, p. ej., archivos de texto de procesamiento de palabras, formato de base de datos, etc.

Un "procesador" o "sistema informático" o "dispositivo informático" hace referencia a cualquier combinación de soporte físico y/o soporte lógico que realice las funciones que de ella se requieren. Por ejemplo, cualquier procesador del presente documento puede ser un microprocesador digital programable tal como disponible en forma de un controlador electrónico, ordenador central, servidor u ordenador personal (de sobremesa o portátil). Cuando el procesador es programable, se puede comunicar una programación adecuada desde una ubicación remota al procesador, o se puede grabar previamente en un producto de programa informático (tal como un medio de lectura por ordenador portátil o fijo, ya sea un dispositivo magnético, óptico o en estado sólido). Por ejemplo, un medio magnético o disco óptico puede llevar la programación y se puede leer con un lector adecuado comunicado con cada procesador en su estación correspondiente.

Antes de describir la presente invención y los modos de realización específicos de la invención, se debe entender que la presente invención no se limita a los modos de realización particulares descritos, ya que, por supuesto, éstos pueden variar. También se debe entender que la terminología usada en el presente documento es con el único propósito de describir modos de realización particulares y no se pretende que sea limitante, dado que el alcance de la presente invención quedará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor que intervenga, hasta un décimo de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese intervalo, y cualquier otro valor indicado o que intervenga en el intervalo indicado, se engloba dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse de forma independiente en los intervalos más pequeños y también se engloban dentro de la invención, sujetos a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de dichos límites incluidos también se incluyen en la invención.

Tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto establezca claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un gen de referencia" incluye una pluralidad de dichos genes y la referencia a "el inhibidor del EGFR" incluye la referencia uno o más inhibidores del EGFR, etc. Cabe destacar además que se pueden redactar las reivindicaciones para que excluyan cualquier elemento opcional. Así, se pretende que esta afirmación sirva como base antecedente para el uso de terminología exclusiva tal como "exclusivamente", "únicamente" y similares en relación con la mención de los elementos de la reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".

Las publicaciones analizadas en el presente documento se proporcionan exclusivamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. No hay nada en el presente documento que deba interpretarse como una admisión de que la presente invención no está facultada para preceder en el tiempo a tal publicación en virtud de una invención anterior. Adicionalmente, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales, que puede ser necesario confirmar de forma independiente.

Descripción general

En la puesta en práctica de los procedimientos y composiciones de la presente divulgación se emplearán, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas técnicas recombinantes), microbiología, biología celular y bioquímica, que están dentro del conocimiento de la técnica. Estas técnicas se explican con detalle en la literatura, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology", 4ª edición (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); y "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994).

Basándose en las pruebas de la expresión diferencial de un gen (p. ej., detectada realizando un ensayo para un transcrito de ARN) en células cancerosas que responden positivamente a un inhibidor del EGFR y células cancerosas que no responden, la presente divulgación proporciona genes y módulos de genes indicadores de respuesta. Estos genes y/o módulos de genes indicadores de respuesta y la información relacionada proporcionada por la presente divulgación permiten que los médicos tomen decisiones de tratamiento más inteligentes y que adapten el tratamiento del cáncer que expresa EGFR a las necesidades de los pacientes individuales, aumentando al máximo de este modo el beneficio del tratamiento y reduciendo al mínimo la exposición de los pacientes a tratamientos innecesarios, que no proporcionan ningún beneficio significativo y, con frecuencia, conllevan graves riesgos debidos a efectos secundarios tóxicos.

Los genes y/o módulos de genes indicadores de respuesta y la información relacionada proporcionada por la presente divulgación tienen utilidad en el desarrollo de tratamientos para tratar el cáncer que expresa EGFR y la criba de pacientes para su inclusión en ensayos clínicos que prueban la eficacia de inhibidores del EGFR. Dichos genes y/o módulos de genes y la información relacionada se pueden usar también para diseñar o producir un reactivo que modula el nivel o la actividad del transcrito del gen (es decir, el transcrito de ARN) o su producto de expresión. Dichos reactivos pueden incluir, pero sin limitación, un ARN antisentido, un ARN inhibidor pequeño, una ribozima, un anticuerpo monoclonal o policlonal.

En diversos modos de realización de los procedimientos de la presente divulgación, están disponible diversos enfoques tecnológicos para la determinación de los niveles de expresión de los genes divulgados, incluidos, sin limitación, RT-PCR, micromatrices, análisis en serie de la expresión génica (SAGE) y secuenciación de ácidos nucleicos, que se analizarán con detalle más adelante. En modos de realización en particular, se puede determinar el nivel de expresión de cada gen con relación a diversas características de los productos de expresión del gen, incluidos exones, intrones, epítopos proteicos y actividad proteica.

Tratamiento inhibidor del EGFR

La presente divulgación proporciona procedimientos para predecir la probabilidad de que un paciente que tiene un cáncer que expresa EGFR presente una respuesta beneficiosa a un tratamiento inhibidor del EGFR. Los pacientes sometidos a tal evaluación incluyen: 1) pacientes que tienen un cáncer que expresa EGFR y que todavía no se han sometido a ningún tratamiento para el cáncer; 2) pacientes que tienen un cáncer que expresa EGFR y que se han

sometido a la extirpación total o parcial del cáncer, p. ej., que se han sometido a la retirada quirúrgica de tejidos cancerosos en la medida de lo clínicamente posible; y 3) pacientes que tienen un cáncer que expresa EGFR y que han sido tratados con una pauta de tratamiento distinta de una pauta de tratamiento inhibidor del EGFR. Los pacientes que se someten a una evaluación de la probabilidad como se divulga en el presente documento incluyen también aquellos cuyo cáncer es negativo para KRAS (p. ej., pacientes que tienen un tumor (KRAS -)).

Se apreciará que se puede usar la misma muestra del paciente, es incluso el mismo ensayo, para determinar tanto si un cáncer es un cáncer que expresa EGFR como para evaluar la probabilidad de que el paciente que tiene un cáncer que expresa EGFR presente una respuesta beneficiosa a un tratamiento antineoplásico inhibidor del EGFR. Por ejemplo, el/los ensayo(s) usado(s) para determinar si el cáncer es un cáncer que expresa EGFR se pueden llevar a cabo al mismo tiempo que el/los ensayo(s) usado(s) para evaluar la probabilidad de que el paciente que tiene un cáncer que expresa EGFR presente una respuesta beneficiosa a un inhibidor del EGFR. De forma alternativa, el resultado del/de los ensayo(s) usado(s) para determinar si el cáncer es un cáncer que expresa EGFR pueden guiar la decisión de si se ha de aplicar y cómo un(os) ensayo(s) adicional(es) usado(s) para evaluar la probabilidad de que el paciente que tiene un cáncer que expresa EGFR presente una respuesta beneficiosa a un inhibidor del EGFR.

Los cánceres que expresan EGFR incluyen cánceres que comprenden células que expresan un EGFR sobre su superficie celular. Los cánceres de este tipo incluyen, pero sin limitación, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer cerebral, cáncer de hígado, cáncer pancreático y cáncer del cuello y la cabeza.

Un paciente al que se está evaluando usando el procedimiento divulgado en la presente divulgación es uno que se puede tener en cuenta para el tratamiento con un inhibidor del EGFR. Los inhibidores del EGFR incluyen, p. ej., anticuerpos que se unen a e inhiben el EGFR, inhibidores de tirosina cinasa selectivos para EGFR, y similares. Los inhibidores del EGFR incluyen, pero sin limitación, cetuximab (Erbitux®) y panitumumab (Vectibix®), ambos anticuerpos monoclonales que bloquean el EGFR y la proliferación celular dependiente del EGFR; gefitinib (Iressa®; N-(3-cloro-4-fluoro-fenil)-7-metoxi-6-(3-morfolin-4-ilpropoxi)quinazolin-4-amina); OSI774 (erlotinib, Tarceva®; N-(3etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi) quinazolin-4-amina); y alfa-ciano-beta-metil-N-[(trifluorometoxi)fenil]-propenamida (LFM-A12), todos inhibidores de tirosina cinasa de molécula pequeña; y similares. Erbitux es una marca registrada de Bristol-Myers Squibb Co. Vectibix es una marca registrada de Amgen, Inc. Iressa es una marca registrada de AstraZeneca. Tarceva es una marca registrada de Genentech, Inc.

Los inhibidores del EGFR incluyen también inhibidores de tirosina cinasa del EGFR tales como quinazolinas, tales como PD 153035 (Fry et al. (1994) Science 265:1093; y Traxler et al. (1997) J. Pharm. Belg. 52:1997), 4-(3cloroanilino)quinazolina, o CP-358,774; pirrolopirimidinas, tales como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706 (Traxler et al. (1997) J. Pharm. Belg. 52:1997); pirazolopirimidinas (Strawn y Shawver (Abril 1998) Exp. Opin. Invest, Drugs 7:553-573); 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidinas (Traxler et al., (1996) J. Med. Chem 39:2285-2292); curcumina (diferuloílmetano) (Laxminarayana, et al., (1995), Carcinogen 16:1741-1745); 4,5-bis (4fluoroanilino)ftalimida (Buchdunger et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1:813-821; Dinney et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3:161-168); tirfostinas que contienen restos nitrotiofeno (Brunton et al. (1996) Anti Cancer Drug Design 11:265-295); el inhibidor de proteína cinasa ZD-1839 (AstraZeneca) (en la patente de EE. UU. 5.770.599; Strawn y Shawver (Abril 1998) Exp. Opin. Invest. Drugs 7:553-573; y Woodburn et al. (1997) Resumen n. º 4251, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 38:633); CP-358774 (Pfizer, Inc.) (Moyer et al. (1997) Cancer Res. 57:4838); PD-0183805 (Warner-Lambert); inhibidores como los descritos en la solicitud de patente internacional WO99/09016 (American Cyanamid); en el documento WO98/43960 (American Cyanamid); en el documento WO97/38983 (Warner Lambert); en el documento WO99/06378 (Warner Lambert); en el documento WO99/06396 (Warner Lambert); en el documento WO96/30347 (Pfizer, Inc.); en el documento WO96/33978 (AstraZeneca); en el documento WO96/33977 (AstraZeneca); y en el documento WO96/33980 (AstraZeneca).

Procedimientos para predecir la probabilidad de respuesta al tratamiento inhibidor del EGFR

La presente divulgación proporciona procedimientos para predecir la probabilidad de que un paciente que tiene un cáncer que expresa EGFR presente una respuesta beneficiosa a un tratamiento inhibidor del EGFR. En general, los procedimientos implican determinar un nivel de expresión normalizado de un gen o producto génico que se correlaciona con el grado de respuesta a inhibidores del EGFR. En el presente documento, los genes que se correlacionan con el grado de respuesta a inhibidores del EGFR se denominan "genes indicadores de respuesta".

Como se analiza más detalladamente a continuación, se puede determinar un nivel normalizado de uno o más genes indicadores de respuesta.

Mutaciones concretas en un gen k-ras dan lugar a la activación constitutiva de proteínas codificadas por k-ras. La presencia de tales mutaciones activadoras se correlaciona con la respuesta del paciente al tratamiento inhibidor del EGFR. Khambata-Ford et al. (2007) Clin. Oncol. 25:3230; Lièvre et al. (2008) J. Clin. Oncol. 26:374; documento WO 2006/086777; y documento WO 2007/001868. En el presente documento, las mutaciones en un gen k-ras que dan lugar a la activación constitutiva de la proteína codificada por k-ras se denominan "mutaciones de KRAS" o

"mutaciones activadoras de KRAS". La detección de mutaciones activadoras de KRAS se puede llevar a cabo junto con la determinación de niveles normalizados de uno o más genes indicadores de respuesta. Por tanto, la presente divulgación proporciona procedimientos para predecir la probabilidad de que un paciente presente una respuesta beneficiosa al tratamiento con un inhibidor del EGFR, cuando el procedimiento implica: a) detectar una mutación de KRAS en una muestra tumoral obtenida del paciente; y b) determinar un nivel normalizado de un(os) gen(es) indicador(es) de respuesta.

Al llevar a cabo un procedimiento de este tipo, se somete a ensayo un nivel de un gen indicador de respuesta, o su producto génico, en una muestra tumoral de un paciente. El nivel del gen indicador de respuesta, o su producto génico, se "normaliza" después, generando un nivel de expresión normalizado. Se identificaron una serie de genes indicadores de respuesta. Los niveles de expresión normalizados de estos genes indicadores de respuesta se correlacionan, positiva o negativamente, con la respuesta beneficiosa del paciente al tratamiento inhibidor del EGFR. Por tanto, se pueden determinar los niveles de expresión normalizados de uno o más de estos genes indicadores de respuesta para evaluar la probabilidad de que un paciente que tiene un cáncer que expresa EGFR presente una respuesta beneficiosa a un tratamiento inhibidor del EGFR. Los genes indicadores de respuesta se identifican como se describe con detalle a continuación y en los ejemplos.

Los genes indicadores de respuesta de la presente divulgación incluyen: ATP5E, TITF1, CLTC, BRCA1, AREG, PTP4A3, EREG, VAV3, SATB2, CEACAM6, EGFR, CHN2, FGFR3, C13orf18, QPRT, AMACR1, CKMT2, ID1, SORBS1, SLC26A3 y ErbB3, y se pueden medir uno o más de éstos con el fin de evaluar la probabilidad de respuesta beneficiosa. Los niveles de expresión normalizados de cada uno de estos genes se correlacionan positivamente con la respuesta beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR. En otras palabras, los niveles de expresión normalizados de estos genes se correlacionan con la probabilidad de que un paciente presente una respuesta beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR.

Los genes indicadores de respuesta de la presente divulgación incluyen: DUSP6, VDAC2, ANXA2P2, SERPINA B1, NT5E, GPC3, DUSP4, PHLDA1, K-ras, DR5, VIL2, LAMC2, SFN, ANXA1, EPHA2, P14ARF, CA9, KRT17, p14ARF, maspina, PLAUR, LAMA3 y GCNT3, y se pueden medir uno o más de éstos con el fin de evaluar la probabilidad de respuesta beneficiosa. Los niveles de expresión normalizados de cada uno de estos genes se correlacionan negativamente con la respuesta beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR. En otras palabras, los niveles de expresión normalizados de estos genes indican una disminución de la probabilidad de que un paciente presente una respuesta beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR.

Los genes indicadores de respuesta de la presente divulgación incluyen: EGF, ADAM17, PTP4A3, ADAM15, QPRT, SATB2, RASSF1, VAV3, CEACAM6, EREG, AREG, TITF1, SORBS1, C13orf18, CKMT2, BTC, ATP5E, catenina B, CCNE1, EGFR, Bclx, BRCA1, CDC25B, CHN2, ID1 y SLC26A3, y se pueden medir uno o más de éstos con el fin de evaluar la probabilidad de respuesta beneficiosa. Los niveles de expresión normalizados de cada uno de estos genes se correlacionan positivamente con la respuesta beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR. En otras palabras, los niveles de expresión normalizados de estos genes se correlacionan con la probabilidad de que un paciente presente una respuesta beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR. Estos genes indicadores de respuesta pueden ser de especial interés en la evaluación de pacientes con tumores negativos para KRAS.

Los genes indicadores de respuesta de la presente divulgación incluyen: VDAC2, SERPINA B1, PHLDA1, ANXA2P2, KRT17, EPHA2, DUSP4, CGA, CA9, maspina, NEDD8, DUSP6, GPC3, NT5E, VIL2 y P14ARF, y se pueden medir uno o más de éstos con el fin de evaluar la probabilidad de respuesta beneficiosa. Los niveles de expresión normalizados de cada uno de estos genes se correlacionan negativamente con la respuesta beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR. En otras palabras, los niveles de expresión normalizados de estos genes indican una disminución de la probabilidad de que un paciente presente una respuesta beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR. Estos genes indicadores de respuesta pueden ser de especial interés en la evaluación de pacientes con tumores negativos para KRAS.

Evaluación de la probabilidad de respuesta beneficiosa de un paciente individual al tratamiento inhibidor del EGFR

Como se describe anteriormente, se identificaron una serie de genes indicadores de respuesta en estudios con varios pacientes. Después, se pueden determinar los niveles normalizados de estos productos de genes indicadores en un paciente individual que tiene cáncer y para quien se contempla el tratamiento con un inhibidor del EGFR. En función del resultado de la evaluación, puede estar indicado el tratamiento con un inhibidor del EGFR o puede estar indicada una pauta de tratamiento alternativa.

Al llevar a cabo una evaluación de este tipo, se somete a ensayo una muestra tumoral que comprende un gen indicador de respuesta para determinar un nivel de un gen o producto(s) génico(s) indicadores de respuesta. La muestra tumoral se puede obtener de un tumor sólido, p. ej., por medio de una biopsia, o por un procedimiento quirúrgico llevado a cabo para retirar un tumor; o de un tejido o fluido corporal que contiene células cancerosas.

Un nivel de expresión de un gen indicador de respuesta se normaliza con relación al nivel de un producto de expresión de un(os) gen(es) de referencia. La evaluación de la probabilidad de respuesta se lleva a cabo comparando el nivel de expresión normalizado con un intervalo de valores de niveles de expresión normalizados de uno o más genes de referencia en una célula cancerosa que expresa EGFR.

Análisis de gen indicador de respuesta

El nivel de expresión normalizado de uno o más genes indicadores de respuesta se puede llevar a cabo para evaluar la probabilidad de que un paciente responda al tratamiento inhibidor del EGFR. Así, la presente divulgación permite el uso del nivel de expresión normalizado de uno solo o de varios genes indicadores de respuesta para evaluar la probabilidad de que un paciente responda al tratamiento inhibidor del EGFR. El análisis puede ser más riguroso, p. ej., se puede evaluar la probabilidad de que un paciente presente una respuesta beneficiosa a un tratamiento inhibidor del EGFR al presentar una respuesta parcial o una respuesta completa. El análisis puede ser menos riguroso, p. ej., se puede evaluar la probabilidad de que un paciente presente una respuesta beneficiosa a un tratamiento inhibidor del EGFR al presentar enfermedad estable (EE).

Análisis de varios genes

Se apreciará que se puede llevar a cabo la evaluación de la probabilidad de respuesta beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR mediante la determinación de los niveles de expresión normalizados de un conjunto de genes indicadores de respuesta, es decir, dos o más genes indicadores de respuesta (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más genes indicadores de respuesta), o cualquier combinación de uno o más conjuntos de genes indicadores de respuesta. La evaluación puede implicar el análisis de los niveles de expresión de una combinación de genes indicadores de respuesta y la determinación de los niveles de expresión normalizados de la combinación de genes indicadores de respuesta, donde los productos de los genes indicadores de respuesta pueden incluir productos génicos que se correlacionan positivamente con el beneficio clínico y los productos génicos que se correlacionan negativamente con el beneficio clínico. Por ejemplo, se pueden determinar un nivel normalizado de un primer gen que se correlaciona positivamente con la respuesta beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR y un nivel normalizado de un segundo gen que se correlaciona negativamente con la respuesta beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR. Los siguientes son ejemplos no limitantes de genes indicadores de respuesta cuyos niveles normalizados se pueden usar en combinación, bien solos o en combinación con otros conjuntos de varios genes indicadores de respuesta, para evaluar la probabilidad de respuesta al tratamiento inhibidor del EGFR:

Conjuntos ejemplares de varios genes que incluyen dos genes: conjunto 1: PHLDA1; PTP4A3; conjunto 2: PHLDA1; AREG; conjunto 3: PHLDA1; EREG conjunto 4: CHN2; PTP4A3; conjunto 5: PTP4A3; SATB2; conjunto 6: EPHA2; AREG; conjunto 7: EPHA2; EREG; conjunto 8: EREG; PTP4A3 conjunto 9: PTP4A3; SLC26A3; conjunto 10: EREG; AREG; conjunto 11: DUSP6; AREG; conjunto 12: DUSP6; EREG; conjunto 13: EGFR; EREG; conjunto 14: SLC26A3; EREG; y conjunto 15: SFN; EREG.

Conjuntos ejemplares de varios genes que incluyen tres genes: conjunto 16: PHLDA1; PTP4A3; AREG; conjunto 17: EGFR; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 18: PHLDA1; PTP4A3; SATB2; conjunto 19: AREG; PHLDA1; PTP4A3; conjunto

20: EGFR; PHLDA1; AREG; conjunto 21: EREG; KRT17; PHLDA1; conjunto 22: EREG; PHLDA1; PTP4A3; conjunto

23: EREG; PHLDA1; SATB2; conjunto 24: EREG; PHLDA1; SORBS1; conjunto 25: KRT17; PHLDA1; AREG; conjunto 26: PHLDA1; SATB2; AREG; conjunto 27: AREG; CEACAM6; PHLDA 1; conjunto 28: AREG; EGFR; PHLDA 1; conjunto 29: DUSP6; PTP4A3; SORBS1; conjunto 30: EGFR; EPHA2; PTP4A3; conjunto 31: EGFR; EREG; PHLDA1; conjunto 32: EREG; KRT17; PTP4A3; conjunto 33: PHLDA1; PTP4A3; SORBS1; conjunto 34: DUSP6; SORBS1; AREG; y conjunto 35: AMACR1; EREG; AREG.

Conjuntos ejemplares de varios genes que incluyen cuatro genes: conjunto 36: EREG; KRT17; PHLDA1; SORBS1; conjunto 37: AREG; KRT17; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 38: EREG; KRT17; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 39: AREG; PHLDA1; PTP4A3; SATB2; conjunto 40: EREG; PHLDA1; PTP4A3; SATB2; conjunto 41: AREG; PHLDA1; PTP4A3; SORBS1; conjunto 42: EREG; PHLDA1; PTP4A3; SORBS1; conjunto 43: AREG; EGFR; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 44: KRT17; PHLDA1; SORBS1; AREG; conjunto 45: KRT17; PHLDA1; SORBS1; EREG; conjunto 46: CEACAM6; PHLDA1; PTP4A3; AREG; conjunto 47: CEACAM6; PHLDA1; PTP4A3; EREG; conjunto 48: EGFR; PHA2; PHLDA1; AREG; conjunto 49: EGFR; PHA2; PHLDA1; EREG; conjunto 50: EGFR; EREG; KRT17; PHLDA1; conjunto 51: EGFR; EREG; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 52: EREG; KRT17; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 53: EPHA12; PHLDA1; PTP4A3; AREG; conjunto 54: EPHA12; PHLDA1; PTP4A3; EREG; conjunto 55: EREG; PHLDA1; PLAUR; STAB2; conjunto 56: KRT17; PHLDA1; PTP4A3; SATB2; conjunto 57: DUSP6; EREG; ID1; AREG; conjunto 58: DUSP6; EPHA2; NT5E; AREG; conjunto 59: DUSP6; EPHA2; NT5E; EREG; conjunto 60: DUSP6; EREG; VIL2; AREG; conjunto 61: DUSP6; EREG; VIL2; EREG; conjunto 62: EPHA2; EREG; GPC3; AREG; conjunto 63: EPHA2; EREG; ID1; AREG; y conjunto 64: DUSP6; EREG; maspina; AREG.

En las tablas 3 y 4 se muestran conjuntos ejemplares de varios genes adicionales. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden determinar los niveles normalizados de cualquier combinación de dos o más genes indicadores de respuesta (p. ej., dos o más genes indicadores de respuesta como enumerados en las tablas 1A, 1B,

2A, 2B, 6A, 6B, 7A y 7B). Cabe destacar que, para cualquiera de los conjuntos ejemplares de varios genes que incluyen AREG o EREG, se puede sustituir AREG o EREG por el promedio del valor de AREG normalizado y el valor de EREG normalizado.

Otros conjuntos ejemplares de varios genes incluyen los siguientes conjuntos (p. ej., los conjuntos de varios genes 65-167) que incluyen dos o más genes. Estos conjuntos ejemplares de varios genes son de especial utilidad cuando se tiene en cuenta el estado de mutación de KRAS del sujeto.

Conjuntos ejemplares de varios genes que incluyen dos genes: conjunto 65: PHLDA1; PTP4A3; conjunto 66: KRT17; PTP4A3; conjunto 67: EREG; PHLDA1; conjunto 68: AREG; PHLDA1; conjunto 69: EREG; KRT17; conjunto 70: AREG; KRT17; conjunto 71: KRT17; SERPINA B1; conjunto 72: CEACAM6; PTP4A3; conjunto 73: EREG; PTP4A3; conjunto 74: KRT17; SORBS1; conjunto 75: PHLDA1; SORBS1; conjunto 76: SATB2; SERPINA B 1; conjunto 77: aregereg; PHLDA1; conjunto 78: SLC26A3; AREG; conjunto 79: SLC26A3; EREG; conjunto 80: DUSP6; AREG; conjunto 81: DUSP6; EREG; conjunto 81: VIL2; AREG; conjunto 82: VIL2; EREG; conjunto 83: DR5; AREG; conjunto

84: DR5; EREG; conjunto 85: EPHA2; AREG; conjunto 86: EPHA2; EREG; conjunto 87: EREG; NT5E; conjunto 88: SATB2; AREG; y conjunto 89: SATB2; EREG.

Otros conjuntos ejemplares de varios genes incluyen los siguientes conjuntos que incluyen tres genes: conjunto 90: DUSP6; EREG; SLC26A3; conjunto 91: DUSP6; SLC26A3; EREG; conjunto 92: DUSP6; SLC26A3; AREG; conjunto

93: CA9; EREG; NT5E; conjunto 94: CLTC; DUSP6; AREG; conjunto 95: CLTC; DUSP6; EREG; conjunto 96: DR5; SLC26A3; AREG; conjunto 97: DR5; SCL26A3; EREG; conjunto 98: DUSP6; VIL2; AREG; conjunto 99: DUSP6; VIL2; EREG; conjunto 100: EPHA2; EREG; SLC26A3; conjunto 101: EREG; SLC26A3; VIL2; conjunto 102: KIRT17; SLC26A3; EREG; conjunto 103: KIRT17; SLC26A3; AREG; conjunto 104: SLC26A3; VIL2; AREG; conjunto 105: SLC26A3; VIL2; EREG; conjunto 106: AREG; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 107: AREG; KRT17; PHLDA1; conjunto

108: EREG; PHLDA1; SORBS1; conjunto 109: EGFR; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 110: KRT17; PTP4A3; SORBS1; conjunto 111: EREG; KRT17; PHLDA1; conjunto 112: PHLDA1; PTP4A3; SORBS1; conjunto 113: ERGF; EREG; PHLDA1; conjunto 114: EREG; PHLDA1; SATB2; conjunto 115: AREG; KRT17; PHLDA1; conjunto 116: CEACAM6; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 117: EGFR; EHHA1; EREG; conjunto 118: EREG; KRT17; SLC26A3; conjunto 119: EREG; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 120: EREG; PHLDA1; QPRT; y conjunto 121: PHLDA1; PTP4A3; SATB2.

Otros conjuntos ejemplares de varios genes incluyen los siguientes conjuntos que incluyen cuatro genes: conjunto

122: EREG; KRT17; PHDLA1; SORBS1; conjunto 123: AREG; KRT17; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 124: DUSP6; EREG; KRT17; SORBS1; conjunto 125: AREG; KRT17; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 126: AREG; KRT17; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 127: AREG; PHLDA1; PTP4A3; SORBS1; conjunto 128: AREG; EGFR; EPHA2; PHLDA1; conjunto 129: AREG; CEACAM6; KRT17; SORBS1; conjunto 130: AREG; CEACAM6; KRT17; SORBS1; conjunto

131: AREG; EGFR; KRT17; PHLDA1; conjunto 132: AREG; KRT17; PHLDA1; SORBS1; conjunto 133: AREG; KRT17; PTP4A3; SORBS1; conjunto 134: CEACAM6; EREG; PHDLA1; SORBS1; conjunto 135: CEACAM6; KRT17; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 136: CEACAM6; KRT17; PTP4A3; SORBS1; conjunto 137: EGFR; EPHA2; PHLDA2; PTP4A3; conjunto 138: EGFR; EREG; KRT17; PHLDA1; conjunto 139: EGFR; KRT17; PHLDA1; PTP4A3; conjunto

140: EREG; KRT17; PTP4A3; SORBS1; conjunto 141: EREG; LAMA3; PHLDA2; QPRT; conjunto 142 EREG; PHLDA1; PTP4A3; QPRT; conjunto 143: KRT17; PHLDA1; PTP4A3; SORBS1; conjunto 144: KRT17; PTP4A3; SORBS1; VDAC2; conjunto 145: AREG; DR5; DUSP6; SLC26A3; conjunto 146: EREG; DR5; DUSP6; SLC26A3; conjunto 147: AMACR1; AREG; DUSP6; SATB2; conjunto 148: AREG, EREG, SLC26A3, DUSP6; conjunto 149: AREG; CLTC; DUSP6; SLC26A3; conjunto 150: EREG; CLTC; DUSP6; SLC26A3; conjunto 151: AREG; DUSP6; KRT17; SLC26A3; conjunto 152: EREG; DUSP6; KRT17; SLC26A3; y conjunto 153: EGFR; EREG; SLC26A3; VIL2.

Otros conjuntos ejemplares de varios genes incluyen los siguientes conjuntos que incluyen cinco genes: conjunto

154: AREG; EGFR; KRT17; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 155: AREG; KRT17; PHLDA1; PTP4A3; SORBS1; conjunto

156: AREG; CEACAM6; KRT17; PHLDA1; SORBS1; conjunto 157: EREG; CEACAM6; KRT17; PHLDA1; SORBS1; conjunto 158: AREG; EGFR; KRT17; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 159: EREG; EGFR; KRT17; PHLDA1; PTP4A3; conjunto 160: CEACAM6; KRT17; PHLDA1; PTP4A3; SORBS1 conjunto 161: EREG; KRT17; HLDA1; PLAUR; SORBS1. conjunto 162: DUSP6; EREG; QPRT; SLC26A3; VIL2.

Conjuntos ejemplares de varios genes que incluyen seis genes: conjunto 163: AREG; EPHA2; KRT17; LAMC2; PHLDA1; PTP4A3.

Conjuntos ejemplares de varios genes que incluyen siete genes: conjunto 164: ANXA1; BRCA1; CHN2; PHLDA1; PTP4A3; SORBS1; AREG; conjunto 165: ANXA1; BRCA1; CHN2; PHLDA1; PTP4A3; SORBS1; EREG; conjunto

166: CEACAM6; KRT17; LAMA3; PHLDA1; PTP4A3; SORBS1; AREG; y conjunto 167: CEACAM6; KRT17; LAMA3; PHLDA1; PTP4A3; SORBS1; EREG.

Los conjuntos de varios genes enumerados anteriormente (p. ej., los conjuntos de varios genes 65-167) son especialmente útiles en combinación con el estado de KRAS, p. ej., cuando el individuo es negativo para una mutación activadora de KRAS. Se pretende que los conjuntos de varios genes enumerados anteriormente sean únicamente ejemplares. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden determinar los niveles normalizados de cualquier combinación de dos o más genes indicadores de respuesta (p. ej., dos o más genes indicadores de

respuesta como enumerados en las tablas 1A, 1B, 2A, 2B, 6A, 6B, 7A y 7B). En las tablas 8 y 9 se muestran conjuntos ejemplares de varios genes. Cabe destacar que, para cualquiera de los conjuntos ejemplares de varios genes que incluyen AREG o EREG, se puede sustituir AREG o EREG por el promedio del valor de AREG normalizado y el valor de EREG normalizado.

Estado de mutación de K-Ras

Como se destaca anteriormente, la presencia de una mutación activadora en un gen k-ras (una "mutación de KRAS") indica una disminución de la probabilidad de una respuesta clínicamente beneficiosa a un inhibidor del EGFR. La presencia o ausencia de una mutación activadora de KRAS se puede someter a ensayo junto con el ensayo de un nivel de expresión de un gen indicador de respuesta, o su producto génico, y determinar un nivel de expresión normalizado de un gen indicador de respuesta. Así, la presente divulgación proporciona procedimientos para evaluar la probabilidad de que un paciente presente una respuesta beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR, donde el procedimiento implica, en general: a) determinar un nivel normalizado de un gen indicador de respuesta, o su producto génico, en una muestra obtenida a partir de una muestra tumoral del paciente; y b) detectar la presencia o ausencia de una mutación activadora de KRAS. En algunos casos, el procedimiento incluirá una etapa de asignación de una probabilidad de respuesta basada en el/los nivel(es) de expresión normalizado(s) de los uno o más genes indicadores de respuesta. Por ejemplo, un procedimiento de este tipo puede implicar: a) determinar un nivel de expresión normalizado de uno o más genes indicadores de respuesta en una muestra obtenida a partir de células cancerosas de un paciente; b) determinar un estado de mutación de KRAS en una célula cancerosa del paciente; y, opcionalmente, c) asignar una probabilidad de respuesta basada en el/los nivel(es) de expresión normalizado(s) de los uno o más genes indicadores de respuesta.

La detección de una mutación activadora de KRAS se puede llevar a cabo junto con la determinación de un nivel normalizado de un gen indicador de respuesta, o su producto génico, donde "junto con" incluye en la misma muestra

o en una diferente, y al mismo tiempo o en un momento y/o ubicación diferentes. Por ejemplo, se puede detectar la presencia o ausencia de una mutación activadora de KRAS en una muestra (p. ej., una muestra que comprenda un polinucleótido obtenido a partir de una célula cancerosa del paciente; o una muestra que comprenda una célula cancerosa del paciente); y se puede detectar un nivel de un gen indicador de respuesta, o su producto génico, en la misma muestra sustancialmente al mismo tiempo en la misma ubicación (p. ej., en el mismo laboratorio). De forma alternativa, se puede detectar la presencia o ausencia de una mutación activadora de KRAS en una muestra (p. ej., una muestra que comprenda un polinucleótido obtenido a partir de una célula cancerosa del paciente; o una muestra que comprenda una célula cancerosa del paciente); y se puede detectar un nivel de un gen indicador de respuesta,

o su producto génico, en la misma muestra sustancialmente al mismo tiempo y en ubicaciones diferentes (p. ej., en laboratorios diferentes). Como otro ejemplo, se puede detectar la presencia o ausencia de una mutación activadora de KRAS en una primera muestra (p. ej., una muestra que comprenda un polinucleótido obtenido a partir de una célula cancerosa del paciente) en un primer momento; y se puede detectar un nivel de un gen indicador de respuesta, o su producto génico en una segunda muestra (p. ej., una muestra que comprenda un polinucleótido obtenido a partir de una célula cancerosa del paciente; o una muestra que comprenda una célula cancerosa del paciente) en un segundo momento, donde las muestras primera y segunda se someten a ensayo en la misma ubicación. Como otro ejemplo, de forma alternativa, se puede detectar la presencia o ausencia de una mutación activadora de KRAS en una primera muestra (p. ej., una muestra que comprenda un polinucleótido obtenido a partir de una célula cancerosa del paciente) en un primer momento; y se puede detectar un nivel de un gen indicador de respuesta, o su producto génico en una segunda muestra (p. ej., una muestra que comprenda un polinucleótido obtenido a partir de una célula cancerosa del paciente; o una muestra que comprenda una célula cancerosa del paciente) en un segundo momento, donde las muestras primera y segunda se someten a ensayo en ubicaciones diferentes.

Por ejemplo, una célula cancerosa "positiva para KRAS" es una que comprende una mutación activadora en un gen k-ras; y un paciente "positivo para KRAS" es uno que tiene una célula cancerosa positiva para KRAS. Por el contrario, una célula cancerosa "negativa para KRAS" es una que no comprende una mutación activadora en un gen k-ras. Por ejemplo, un tumor "negativo para KRAS" es uno en el que no hay mutaciones activadoras de KRAS detectables. Un paciente "negativo para KRAS" es uno que tiene un tumor negativo para KRAS.

La detección de un mutación de KRAS en una muestra tumoral del paciente o en una muestra obtenido a partir de una célula cancerosa del paciente implica detectar una mutación de KRAS en un ácido nucleico de una célula cancerosa presente en el paciente. Es posible, aunque no necesario, que todas las células cancerosas del paciente comprendan una mutación de KRAS, p. ej., un tumor puede ser heterogéneo con respecto al estado de mutación de KRAS. Por ejemplo, la mutación de KRAS puede estar presente en menos del 100 %, menos del 95 %, menos del 80 %, menos del 70 %, menos del 50 % o menos del 25 %, de las células cancerosas presentes en la muestra y/o en el paciente. La presencia o de una mutación activadora de KRAS en cualquier proporción de las células cancerosas de la muestra indicará que no es probable que el paciente responda al tratamiento inhibidor del EGFR.

La presencia o ausencia de una mutación activadora de KRAS en un gen k-ras de una célula cancerosa se correlaciona negativamente con una respuesta clínicamente beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR. En la

tabla 5 se muestran mutaciones activadoras ejemplares. Otras mutaciones activadoras de KRAS se encuentra, p. ej., en los documentos WO 2006/086777 y WO 2007/001868.

Como ejemplo, las mutaciones activadoras de KRAS incluyen: 1) una mutación G -T en la posición 216 de una secuencia de nucleótidos de k-ras (p. ej., la secuencia de nucleótidos descrita en el n. º de acceso de GenBank NM_033360.2); 2) una mutación G-A en la posición 216 de una secuencia de nucleótidos de k-ras; 3) una mutación G-C en la posición 216 de una secuencia de nucleótidos de k-ras ; 4) una mutación G-T en la posición 215 de una secuencia de nucleótidos de k-ras; 5) una mutación G-A en la posición 215 de una secuencia de nucleótidos de kras; 6) una mutación G-C en la posición 215 de una secuencia de nucleótidos de k-ras; y 7) una mutación G-A en la posición 219 de una secuencia de nucleótidos de k-ras. Un ejemplo de un tumor negativo para KRAS es uno que no incluye ninguna de las 7 mutaciones enumeradas anteriormente y que se muestran en la tabla 5.

La presencia o ausencia de una mutación activadora de KRAS en un gen k-ras de una célula cancerosa se correlaciona inversamente con una respuesta clínicamente beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR.

Como se destaca anteriormente, la detección de la presencia o ausencia de una mutación activadora de KRAS se puede llevar a cabo en combinación con la evaluación de un nivel normalizado del producto de un único gen indicador de respuesta, o del producto de uno o más genes de respuesta, o del producto de uno o más conjuntos de genes indicadores de respuesta. Los siguientes son ejemplos no limitantes de combinaciones posibles: 1) estado de mutación de KRAS; detección del nivel de expresión normalizado de PHLDA 1; 2) estado de mutación de KRAS; detección del nivel de expresión normalizado de KRT17; 3) estado de mutación de KRAS; detección del nivel de expresión normalizado de SERPINA B1; 4) estado de mutación de KRAS; detección del nivel de expresión normalizado de DUSP4; 5) estado de mutación de KRAS; detección del nivel de expresión normalizado de ANXA2P2; 6) estado de mutación de KRAS; detección del nivel de expresión normalizado de EPHA2; 7) estado de mutación de KRAS; detección del nivel de expresión normalizado de PTP4A3; 8) estado de mutación de KRAS; detección del nivel de expresión normalizado de EREG; 9) estado de mutación de KRAS; detección del nivel de expresión normalizado de AREG; 10) estado de mutación de KRAS; detección del nivel de expresión normalizado de QPRT; 11) estado de mutación de KRAS; detección del nivel de expresión normalizado de VAV3; 12) estado de mutación de KRAS; detección del nivel de expresión normalizado de STAB2; y 13) estado de mutación de KRAS; detección del nivel de expresión normalizado de CKMT2.

En las tablas 6A, 6B, 7A y 7B se muestran combinaciones posibles adicionales.

Como se destaca anteriormente, la detección de la presencia o ausencia de una mutación activadora de KRAS (p. ej., evaluación del estado de mutación de KRAS) se puede llevar a cabo en combinación con el ensayo del nivel normalizado de los productos de varios (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más) genes indicadores de respuesta. En las tablas 8 y 9 se representan diversa combinaciones posibles.

La detección de una mutación activadora de KRAS se puede llevar a cabo usando cualquiera de una variedad de procedimientos. En la técnica se conocen numerosos procedimientos para la detección de variaciones de secuencia (polimorfismos y mutaciones) en muestras de ácido nucleico, y se pueden usar para detectar una mutación activadora de KRAS. Tales procedimientos incluyen procedimientos basados en secuenciación de novo de ácidos nucleicos, así como procedimientos diseñados para detectar variantes de secuencia (p. ej., variantes conocidas) en una posición objetivo de la secuencia de ácidos nucleicos. La variantes de secuencia se detectan usando como sondas o cebadores oligonucleótidos que hibridan diferencialmente con cada variante. Se han desarrollado muchos enfoques para aumentar la selectividad de la hibridación de las sondas específicas de secuencia con las variantes objetivo; frecuentemente, el grado de hibridación de las sondas específicas de secuencia se detecta basándose en la detección y/o cuantificación de la cantidad de producto formado en una reacción en cadena de la polimerasa posterior.

Determinación del grado de respuesta a inhibidores del EGFR de un cáncer que expresa EGFR

La presente divulgación proporciona procedimientos para determinar si un cáncer que expresa EGFR es un cáncer que responde a inhibidores del EGFR o que no responde a inhibidores del EGFR. Los procedimientos implican, en general: a) someter a ensayo una muestra de prueba obtenida a partir de una muestra de un tumor que expresa EGFR del paciente y determinar un nivel de expresión normalizado de: i) un gen indicador de respuesta, o su producto génico, que se correlaciona positivamente con el grado de respuesta a inhibidores del EGFR, en el que el gen indicador de respuesta que se correlaciona positivamente es uno o más de ATP5E, TITF1, CLTC, BRCA1, AREG, PTP4A3, EREG, VAV3, SATB2, CEACAM6, EGFR, CHN2, FGFR3, C13orf18, QPRT, AMACR1, CKMT2, ID1, SORBS1, SLC26A3 y ErbB3; y/o ii) un gen indicador de respuesta, o su producto génico, que se correlaciona negativamente con el grado de respuesta a inhibidores del EGFR, en el que el indicador de respuesta que se correlaciona negativamente es uno o más de DUSP6, VDAC2, ANXA2P2, SERPINA B1, NT5E, GPC3, DUSP4, PHLDA1, K-ras, DR5, VIL2, LAMC2, SFN, ANXA1, EPHA2, P14ARF, CA9, KRT17, p14ARF, maspina, PLAUR, LAMA3 y GCNT3, en el que el nivel de expresión normalizado de los uno o más genes indicadores de respuesta indica que es probable que el cáncer que expresa EGFR en un paciente presente sensibilidad o resistencia al tratamiento con un inhibidor del EGFR.

Los procedimientos de la presente divulgación son particularmente útiles cuando el cáncer que expresa EGFR es un cáncer negativo para KRAS. Los procedimientos implican, en general: a) someter a ensayo una muestra de prueba obtenida a partir de una muestra de un tumor que expresa EGFR del paciente y determinar un nivel de expresión normalizado de: i) un gen indicador de respuesta, o su producto génico, que se correlaciona positivamente con el grado de respuesta a inhibidores del EGFR, en el que el gen indicador de respuesta que se correlaciona positivamente es un producto de uno o más de EGF, ADAM17, PTP4A3, ADAM15, QPRT, SATB2, RASSF1, VAV3, CEACAM6, EREG, AREG, TIT1, SORBS1, C13orf18, CKMT2, BTC, ATP5E, catenina beta (también denominada en el presente documento "catenina B"), CCNE1, EGFR, Bclx, BRCA1, CDC25B, CHN2, ID1 y SLC26A3; y/o ii) un gen indicador de respuesta, o su producto génico, que se correlaciona negativamente con el grado de respuesta a inhibidores del EGFR, en el que el gen indicador de respuesta que se correlaciona negativamente es uno o más de VDAC2, SERPINA B1, PHLDA1, ANXA2P2, KRT17, EPHA2, DUSP4, CGA, CA9, maspina, NEDD8, DUSP6, GPC3, NT5E, VIL2 y P14ARF, en el que el nivel de expresión normalizado de los uno o más genes indicadores de respuesta indica que es probable que el cáncer que expresa EGFR en un paciente presente sensibilidad o resistencia al tratamiento con un inhibidor del EGFR.

El procedimiento puede implicar determinar un nivel de expresión normalizado de un conjunto of genes indicadores de respuesta, donde se describen conjuntos ejemplares anteriormente. También como se describe anteriormente, el procedimiento puede incluir además determinar la presencia o la ausencia de una mutación activadora de KRAS en el ácido nucleico obtenido a partir de una muestra de un tumor que expresa EGFR.

Procedimientos de ensayo de los niveles de expresión de un producto génico

Los procedimientos y composiciones de la presente divulgación emplearán, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas técnicas recombinantes), microbiología, biología celular y bioquímica, que están dentro del conocimiento de la técnica. En la literatura se explican con detalle técnicas ejemplares, tal como en, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology", 4ª edición (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); y "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994).

Los procedimientos de generación de perfiles de expresión génica incluyen procedimientos basados en el análisis de la hibridación de polinucleótidos, procedimientos basados en la secuenciación de polinucleótidos y procedimientos basados en la proteómica. Los procedimientos ejemplares conocidos en la técnica para la cuantificación de la expresión de ARNm en una muestra incluyen transferencia de bandas northern e hibridación in situ (Parker y Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)); ensayos de protección de ARNasas (Hod, Biotechniques 13:852-854 (1992)); y procedimientos basados en PCR, tales como PCR de transcripción inversa (RT-PCR) (Weis et al., Trends in Genetics 8:263-264 (1992)). Se pueden emplear anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos de secuencia, incluidos dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los procedimientos representativos para el análisis de la expresión génica basado en la secuenciación incluyen el análisis de serie de la expresión génica (SAGE) y el análisis de la expresión génica por secuenciación masiva de firmas en paralelo (MPSS).

PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR)

Típicamente, se aísla el ARNm a partir de una muestra de prueba. Típicamente, el material de partida es ARN total aislado a partir de un tumor humano, habitualmente de un tumor primario. Opcionalmente, se pueden usar tejidos sanos del mismo paciente como control interno. Se puede extraer el ARNm de una muestra de tejido, p. ej., de una muestra fresca, congelada (p. ej. congelada fresca) o incluida en parafina y fijada (p. ej. fijada en formalina).

En la técnica se conocen bien los procedimientos generales para la extracción de ARNm y se divulgan en manuales de biología molecular corrientes, incluidos Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Se divulgan procedimientos para la extracción de ARN a partir de tejidos incluidos en parafina, por ejemplo, en Rupp y Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987) y De Andrés et al., BioTechniques 18:42044 (1995). En particular, se puede realizar el aislamiento de ARN usando un kit de purificación, un conjunto de soluciones tamponadoras y proteasa de fabricantes comerciales, tal como Qiagen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, se puede aislar ARN total a partir de células en cultivo usando minicolumnas RNeasy de Qiagen. Otros kits de aislamiento de ARN disponibles comercialmente incluyen el kit de purificación de ADN y ARN completo MasterPure™ (EPICENTRE®, Madison, WI) y el kit de aislamiento de ARN de bloques de parafina (Ambion, Inc.). Se puede aislar el ARN total de muestras de tejido usando el RNA Stat-60 (Tel-Test). Se puede aislar ARN preparado a partir del tumor, por ejemplo, por centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio.

La muestra que contiene el ARN se somete después a transcripción inversa para producir ADNc a partir del molde de ARN, seguido de la amplificación exponencial en una reacción de PCR. Las enzimas transcriptasa inversa

usadas más comúnmente son la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV-RT) y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV-RT). Típicamente, la etapa de transcripción inversa se ceba usando cebadores específicos, hexámeros aleatorios o cebadores oligo-dT, en función de las circunstancias y del objetivo de la realización de los perfiles de expresión. Por ejemplo, el ARN extraído se puede someter a transcripción inversa usando el kit de PCR de ARN GeneAmp (Perkin Elmer, CA, EE. UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Después, se puede usar el ADNc obtenido como molde en la reacción de PCR posterior.

Los procedimientos basados en PCR usan una polimerasa de ADN termoestable dependiente de ADN, tal como una polimerasa de ADN Taq. Por ejemplo, la PCR TaqMan® utiliza típicamente la actividad nucleasa de 5' de la polimerasa Taq o Tth para hidrolizar una sonda de hibridación unida a su amplicón objetivo, pero se puede usar cualquier enzima con una actividad nucleasa de 5' equivalente. Se usan dos cebadores oligonucleotídicos para generar un amplicón típico de un producto de reacción de PCR. Se puede diseñar un tercer oligonucleótido, o sonda, para facilitar la detección de una secuencia de nucleótidos del amplicón situada entre los sitios de hibridación de los dos cebadores de PCR. Se puede marcar la sonda de forma detectable, p. ej., con un tinte indicador, y se puede dotar además tanto de un tinte fluorescente como de un tinte fluorescente desactivador, como en una configuración de sonda Taqman®. Cuando se usa una sonda Taqman®, durante la reacción de amplificación, la enzima polimerasa de ADN Taq escinda la sonda de manera dependiente del molde. Los fragmentos de sonda resultantes se separan en disolución y la señal del tinte indicador liberado queda libre del efecto desactivador del segundo fluoróforo. Se libera una molécula de tinte indicador para cada nueva molécula sintetizada, y la detección del tinte indicador no desactivado proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

La RT-PCR TaqMan® se puede realizar usando equipos disponibles comercialmente, tales como, por ejemplo, el ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) o el Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En un modo de realización preferente, el procedimiento de nucleasa de 5' se realiza en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real tal como el ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™. El sistema consiste en un termociclador, un láser, un dispositivo acoplado a carga (CCD), una cámara y un ordenador. El sistema amplifica muestras es un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, se recoge una señal fluorescente inducida por el láser en tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 96 pocillos y se detecta en el CCD. El sistema incluye un programa informático para hacer funcionar el instrumento y para analizar los datos.

Inicialmente, los datos del ensayo de nucleasa de 5' se expresa como un ciclo umbral ("Ct"). Los valores de fluorescencia se registran durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificado hasta ese punto de la reacción de amplificación. En general, se describe el ciclo umbral (Ct) como el punto donde la señal fluorescente se registra por primera vez como estadísticamente significativa.

Para reducir al mínimo los errores y el efecto de la variación entre muestras, habitualmente se realiza la RT-PCR usando un patrón interno. El gen de patrón interno ideal (también denominado gen de referencia) se expresa a un nivel constante en tejido canceroso y no canceroso del mismo origen (es decir, a un nivel que no es significativamente diferente entre tejidos sanos y cancerosos), y o se ve afectado significativamente por el tratamiento experimental (es decir, no presente una diferencia significativa en el nivel de expresión en el tejido pertinente como consecuencia de la exposición a la quimioterapia). Por ejemplo, los genes de referencia útiles en los procedimientos divulgados en el presente documento no deberían presentar niveles de expresión significativamente diferentes en tejido de colon canceroso en comparación con el de colon sano. Los ARN usados más frecuentemente para normalizar los patrones de expresión génica son ARNm de los genes constitutivos de gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa (GAPDH) y �-actina. Los genes de referencia ejemplares usados para la normalización comprenden uno o más de los genes siguientes: ATP5E, GPX1, PGK1, UBB y VDAC2. La medidas de la expresión génica se pueden normalizar con relación a la media de uno o más (p. ej., 2, 3, 4, 5 o más) genes de referencia. Las medidas de expresión normalizadas con las de referencia pueden variar desde 0 hasta 15, donde un aumento de una unidad se refleja, en general, en un aumento de doble de la cantidad de ARN.

La PCR en tiempo real es compatible tanto con una PCR cuantitativa competitiva, donde para la normalización se usa el competidor interno para cada secuencia objetivo, y con la PCR cuantitativa comparativa que usa para la RT-PCR un gen de normalización contenido en la muestra o un gen constitutivo. Para más detalles, véase, p. ej. Held et al., Genome Res. 6:986-994 (1996).

Las etapas de un protocolo representativo para su uso en los procedimientos de la presente divulgación usan tejidos fijados incluidos en parafina como la fuente de ARN. El aislamiento, la purificación, la extensión de cebador y la amplificación del ARNm se pueden realizar de acuerdo con procedimientos disponibles en la técnica. (véanse, p. ej., Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). Brevemente, un procedimiento representativo comienza con el corte de secciones de aproximadamente 10 μm de grosor de muestras de tejido tumoral incluidas en parafina. Después, se extrae el ARN y se eliminan las proteínas y el ADN de la muestra que contiene ARN. Después del análisis de la concentración de ARN, se somete el ARN a transcripción inversa usando cebadores específicos de gen seguidos de RT-PCR para proporcionar productos de amplificación de ADNc.

Diseño de sondas y cebadores de PCR basados en intrones

Se pueden diseñar sondas y cebadores de PCR basados en secuencias de exones o intrones presentes en el transcrito de ARNm del gen de interés. El diseño de sondas/cebadores se puede realizar usando programas informáticos disponibles públicamente, tales como el programa informático de ADN BLAT desarrollado por Kent, W.J., Genome Res. 12(4):656-64 (2002) o por el programa informático BLAST, incluidas sus variaciones.

Cuando sea necesario o se desee, se pueden enmascarar secuencias repetidas de la secuencia objetivo para mitigar las señales inespecíficas. Las herramientas ejemplares para lograr esto incluyen el programa enmascarador de repeticiones disponible en línea a través del Baylor College of Medicine, que criba secuencias de ADN frente a una colección de elementos repetitivos y devuelve una secuencia de consulta en la que los elementos repetitivos están enmascarados. Después, se pueden usar las secuencias de intrón enmascaradas para diseñar secuencias de sonda y cebador usando cualquier paquete de diseño de sondas/cebadores disponible públicamente, comercialmente o de otro modo, tal como el Primer Express (Applied Biosystems); el MGB assay-by-design (Applied Biosystems); el Primer3 (Steve Rozen y Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 en Internet para usuarios generales y para programadores biólogos. En: Rrawetz S, Misener S (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, págs. 365-386).

Otros factores que pueden influir en el diseño de cebadores de PCR incluyen la longitud del cebador, la temperatura de fusión (Tf) y el contenido en G/C, la especificidad, las secuencias de cebador complementarias y la secuencia del extremo 3'. En general, los cebadores de PCR óptimos tienen 17-30 bases de longitud y contienen aproximadamente el 20-80 %, tal como, por ejemplo, aproximadamente el 50-60 %, de bases G+C y presentan Tf de entre 50 y 80 °C, p. ej., de aproximadamente 50 a 70 °C.

Para directrices adicionales para el diseño de sondas y cebadores de PCR véanse, p. ej., Dieffenbach, CW. et al., "General Concepts for PCR Primer Design" en: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1995, págs. 133-155; Innis y Gelfand, "Optimization of PCRs" en: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, Londres, 1994, págs. 5-11; y Plasterer, T.N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70:520-527 (1997), cuya divulgación completa se incorpora expresamente en el presente documento por referencia.

Las tablas A y B proporcionan información adicional relativa a las secuencias de cebadores, sondas y amplicones relacionadas con los ejemplos divulgados en el presente documento.

Sistema MassARRAY®

En los procedimientos basados en el MassARRAY, tales como el procedimiento ejemplar desarrollado por Sequenom, Inc. (San Diego, CA), después del aislamiento del ARN y la transcripción inversa, se añade al ADNc obtenido una molécula de ADN sintético (competidor), que coincide con la región objetivo del ADNc en todas las posiciones, excepto en una única, y sirve como patrón interno. La mezcla de ADNc/competidor se amplifica por PCR y se somete a un tratamiento post-PCR con enzima fosfatasa alcalina de gamba (SAP), que da lugar a la desfosforilación de los nucleótidos restantes. Después de la inactivación de la fosfatasa alcalina, se someten los productos de PCR del competidor y el ADNc a extensión de cebador, lo que genera señales de masa distintas para los productos de PCR derivados del competidor y del ADNc. Después de la purificación, se disponen estos productos sobre una matriz de chips, que está precargada con componentes necesarios para el análisis con análisis de espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS). El ADNc presente en la reacción se cuantifica después mediante el análisis de las proporciones de las áreas de los picos del espectro de masas generado. Para más detalles véase, p. ej. Ding y Cantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3059-3064 (2003).

Otros procedimientos basados en PCR

Otras técnicas basadas en PCR que pueden ser útiles en los procedimientos divulgados en el presente documento incluyen, por ejemplo, la tecnología BeadArray® (Illumina, San Diego, CA; Oliphant et al., Discovery of Markers for Disease (suplemento de Biotechniques), junio de 2002; Ferguson et al., Analytical Chemistry 72:5618 (2000)); BeadsArray for Detection of gen Expression® (BADGE), usando el sistema Luminex 100 LabMAP® disponible comercialmente y varias microesferas con código de color (Luminex Corp., Austin, TX) en un ensayo rápido para expresión génica (Yang et al., Genome Res. 11:1888-1898 (2001)); y un análisis de perfiles de expresión de alta cobertura (HiCEP) (Fukumura et al., Nucl. Acids. Res. 31(16) e94 (2003).

Micromatrices

Los niveles de expresión de un gen de interés también se pueden evaluar usando la técnica de las micromatrices. En este procedimiento, se disponen en matrices sobre un sustrato las secuencias polinucleotídicas de interés (incluidos ADNc y oligonucleótidos). Después, en condiciones adecuadas para la hibridación específica, se ponen en

contacto las secuencias dispuestas en matrices con ADNc marcado de forma detectable generado a partir de ARNm de una muestra de prueba. Como en el procedimiento de RT-PCR, típicamente, la fuente de ARNm es ARN total aislado a partir de una muestra tumoral y, opcionalmente, a partir de tejido sano del mismo paciente como control interno o líneas celulares. El ARNm se puede extraer, por ejemplo, de muestras de tejido congeladas o incluidas en parafina y fijadas (p. ej. fijadas en formalina) archivadas.

Por ejemplo, los insertos amplificados por PCR de clones de ADNc de un gen que se quiere someter a ensayo se aplican en un sustrato en una matriz densa. Habitualmente, se aplican al menos 10.000 secuencias de nucleótidos al sustrato. Por ejemplo, los genes dispuestos en micromatrices, inmovilizados sobre el microchip a 10.000 elementos cada uno, son adecuados para la hibridación en condiciones rigurosas. Se pueden generar sondas de ADNc marcadas de forma fluorescente mediante la incorporación de nucleótidos fluorescentes por transcripción inversa de ARN extraído de tejidos de interés. Las sondas de ADNc marcado aplicadas al chip hibridan con especificidad con cada mancha de ADN de la matriz. Después de lavarlo en condiciones rigurosas para eliminar las sondas unidas de forma inespecífica, se somete el chip a un barrido por microscopía confocal láser o por otro procedimiento de detección, tal como una cámara de CCD. La cuantificación de la hibridación de cada elemento dispuesto en la matriz permite la evaluación de la abundancia de ARNm correspondiente.

Con fluorescencia de doble color, se hibridan por parejas con la matriz las sondas de ADNc marcadas por separado generadas a partir de dos fuentes de ARN. Por tanto, la abundancia relativa de los transcritos de las dos fuentes correspondientes a cada gen especificado se determina de forma simultánea. La escala en miniatura de la hibridación proporciona una evaluación cómoda y rápida del patrón de expresión para grandes cantidades de genes. Se ha demostrado que los procedimientos de este tipo tienen la sensibilidad necesaria para detectar transcritos raros, que se expresan con pocas copias por célula, y para detectar de forma reproducible diferencias de al menos aproximadamente el doble en los niveles de expresión (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(2):106-149 (1996)). Los análisis de micromatrices se pueden realizar mediante equipos disponibles comercialmente, siguiendo los protocolos del fabricante, tal como mediante el uso de la tecnología GenChip® de Affymetrix.

Análisis en serie de la expresión génica (SAGE)

El análisis en serie de la expresión génica (SAGE) es un procedimiento que permite el análisis simultáneo y cuantitativo de un gran número de transcritos de genes, sin la necesidad de proporcionar una sonda de hibridación individual para cada transcrito. En primer lugar, se genera una marca de secuencia corta (aproximadamente 10-14 pb) que contiene información suficiente para identificar de forma unívoca un transcrito, con la condición de que la marca se obtiene a partir de una posición única dentro de cada transcrito. Después, se enlazan juntos muchos transcritos para formar largas moléculas en serie que se pueden secuenciar, revelando la identidad de las múltiples marcas simultáneamente. Se puede evaluar cuantitativamente el patrón de expresión de cualquier población de transcritos mediante la determinación de la abundancia de marcas individuales, e identificando el gen correspondiente a cada marca. Para más detalles, véanse, p. ej. Velculescu et al., Science 270:484-487 (1995); y Velculescu et al., Cell 88:243-51 (1997).

Análisis de la expresión génica por secuenciación de ácidos nucleicos

Las tecnologías de secuenciación de ácidos nucleicos son procedimientos adecuados para el análisis de la expresión génica. El principio subyacente a estos procedimientos es que el número de veces que se detecta una secuencia de ADNc en una muestra está directamente relacionado con la expresión relativa del ARNm correspondiente a esa secuencia. En ocasiones, se hace referencia a estos procedimientos con el término expresión génica digital (DGE) para reflejar la propiedad numérica discreta de los datos resultantes. Los primeros procedimientos en aplicar este principio fueron el análisis en serie de la expresión génica (SAGE) y la secuenciación masiva de firmas en paralelo (MPSS). Véase, p. ej., S. Brenner, et al., Nature Biotechnology 18(6):630-634 (2000). Más recientemente, la aparición de las tecnologías de secuenciación de "siguiente generación" ha hecho la DGE más sencilla, de mayor rendimiento y más accesible. Como consecuencia, más laboratorios pueden utilizar la DGE para cribar la expresión de más genes en más muestras de pacientes individuales de lo que era posible anteriormente. Véanse, p. ej., J. Marioni, Genome Research 18(9):1509-1517 (2008); R. Morin, Genome Research 18(4):610-621 (2008); A. Mortazavi, Nature Methods 5(7):621-628 (2008); N. Cloonan, Nature Methods 5(7):613-619 (2008).

Aislamiento de ARN a partir de fluidos corporales

Se han descrito procedimientos de aislamiento de ARN para análisis de expresión a partir de sangre, plasma y suero (véanse, por ejemplo, Tsui NB et al. (2002) 48,1647-53 y la referencias citadas en el mismo) y de orina (véanse, por ejemplo, Boom R et al. (1990) J Clin Microbiol. 28, 495-503 y las referencias citadas en el mismo).

Procedimientos inmunoquímicos

Los procedimientos inmunoquímicos (también denominados en el presente documento "inmunológicos") también son adecuados para detectar los niveles de expresión de genes y se aplican al procedimiento divulgado en el presente

documento. En estos procedimientos se pueden usar anticuerpos (p. ej., anticuerpos monoclonales) que se unen específicamente a un producto génico de un gen de interés. Los anticuerpos se pueden detectar por marcaje directo de los propios anticuerpos, por ejemplo, con marcas radioactivas, marcas fluorescentes, marcas de hapteno tales como, biotina, o una enzima tal como la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina. De forma alternativa, se puede usar un anticuerpo primario sin marcar junto con un anticuerpo secundario marcado específico para el anticuerpo primario. En la técnica se conocen bien los protocolos y kits inmunoquímicos y están disponibles comercialmente. Los procedimientos inmunoquímicos adecuados ejemplares incluyen ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas, radioinmunoensayos, procedimientos de transferencia de bandas de proteínas (denominados procedimiento de transferencia de bandas "western") e inmunoensayos enzimáticos.

Proteómica

El término "proteoma" se define como la totalidad de las proteínas presentes en una muestra (p. ej., un tejido, un organismo o un cultivo celular) en un punto temporal determinado. La proteómica incluye, entre otras cosas, el estudio de los cambios globales de la expresión de las proteínas de una muestra (también denominada "proteómica de la expresión"). Típicamente, la proteómica incluye las siguientes etapas: (1) separación de las proteínas individuales de una muestra por electroforesis en gel en 2-D (PAGE 2-D); (2) identificación de las proteínas individuales recuperadas del gel, p. ej., por espectroscopía de masas o secuenciación del extremo N-terminal y (3) análisis de los datos mediante el uso de bioinformática.

Descripción general del aislamiento, la purificación y la amplificación del ARNm

Las etapas de un protocolo representativo para realizar perfiles de expresión génica usando tejidos fijados incluidos en parafina como fuente de ARN, que incluyen el aislamiento, la purificación, la extensión de cebador y la amplificación del ARNm, se proporcionan en diversos artículos publicados en revistas. (Véanse, p. ej., T.E. Godfrey et al.,. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001), M. Cronin, et al., Am J Pathol 164:35-42 (2004)). Brevemente, un procedimiento representativo comienza con el corte de una sección de muestra de tejido (p. ej., secciones de aproximadamente 10 μm de grosor de una muestra de tejido tumoral incluida en parafina). Después, se extrae el ARN y se eliminan las proteínas y el ADN. Después del análisis de la concentración de ARN, se realiza la reparación del ARN si se desea. Después, se puede someter la muestra a análisis, p. ej., por transcripción inversa usando promotores específicos de gen seguido de RT-PCR.

Determinación de un nivel normalizado de un producto génico

Como se analiza anteriormente, se normaliza el nivel de expresión de un gen indicador de respuesta, proporcionando de este modo un valor normalizado. El nivel de expresión de un gen indicador de respuesta se puede normalizar con relación al nivel de un producto de expresión de un(os) gen(es) de referencia.

Por ejemplo, el nivel de expresión de un gen indicador de respuesta se puede normalizar con relación al nivel medio de los productos génicos de uno o más genes de referencia. Como ejemplo, el nivel de expresión de un gen indicador de respuesta se puede normalizar con relación al nivel medio de los productos génicos de todos los genes sometidos a ensayo, o de un subconjunto de los genes sometidos a ensayo, donde un subconjunto de los genes sometidos a ensayo puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más genes sometidos a ensayo.

El nivel de expresión de un gen indicador de respuesta se puede normalizar con relación al nivel medio de los productos génicos de todos los genes, o de un subconjunto de los genes, enumerados es una o más de la tabla 1A, la tabla 1B, la tabla 2A, la tabla 2B, la tabla 6A, la tabla 6B, la tabla 7A y la tabla 7B. Como ejemplo no limitante, el nivel de expresión de un gen indicador de respuesta se puede normalizar con el nivel de expresión medio de los siguientes genes de referencia: ATP5E, PGK1, UBB, VDAC2 y GPX1. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que se pueden usar otras combinaciones de genes como genes de referencia para el propósito de determinar un nivel normalizado de un gen indicador de respuesta, o su producto génico.

Los genes de referencia adecuados adicionales incluyen, pero sin limitación, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (véase, p. ej., el n. º de acceso de GenBank NM_002046); fosfoglicerato cinasa 1 (véase,

p. ej., el n. º de acceso de GenBank NM_000291); lactato deshidrogenasa A (véase, p. ej., el n. º de acceso de GenBank NM_005566); proteína ribosómica L32 (véase, p. ej., el n. º de acceso de GenBank NM_000994); proteína ribosómica S18 (véase, p. ej., el n. º de acceso de GenBank NM_022551); polipéptido beta de la tubulina (TUBB) (véase, p. ej., el n. º de acceso de GenBank NM_001069); y actina beta (véase, p. ej., el n. º de acceso de GenBank NM_001101). Para una lista de genes de referencia adecuados adicionales, véase, p. ej., Eisenberg y Levanon (2003) Trends in Genetics 19:362.

El nivel de un transcrito de ARN medido por TaqMan® RT-PCR se refiere al valor del umbral del ciclo (Ct). Cuanto más bajo sea el Ct, mayor será la cantidad de ARNm presente en la muestra (Relative Quantitation Using Comparative Ct; Getting Started Guide, Applied Biosystems, Inc., Part Number 4364016 Rev. C, 11/2007). El valor de la expresión de un transcrito de ARN en una muestra se normaliza, p. ej., determinando en primer lugar el valor medio de la expresión en el Ct de genes designados de referencia en una muestra (CtRef). El valor de expresión

normalizado para un gen (CtGen) se calcula después como CtGen-CtRef. Opcionalmente, se pueden ajustar los valores de expresión normalizados para todos los genes, p. ej., de tal forma que todos los Ct normalizados ajustados tenga un valor >0.

Determinación de una probabilidad de respuesta beneficiosa

Se puede comparar un nivel normalizado de un gen indicador de respuesta, o su producto génico, determinado para un paciente individual con los valores de niveles de expresión normalizados para dicho gen indicador de respuesta determinados en una población de pacientes para los que ya se conoce la respuesta clínica con el fin de determinar la probabilidad de un paciente individual de respuesta beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR. Se pueden usar valores de niveles de expresión normalizados (p. ej., expresados como Ct) correlacionados con una probabilidad. Por ejemplo, como se muestra en las figuras 3A-10D, se puede comparar gráficamente un nivel normalizado de un gen indicador de respuesta, o su producto génico, para determinar la probabilidad de respuesta beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR.

Los análisis y determinaciones descritos en el presente documento con relación a un procedimiento de este tipo para evaluar la probabilidad de respuesta se pueden realizar sin necesidad de evaluar ningún cambio en el nivel de gen indicador de respuesta a lo largo del tiempo.

Información de los resultados del análisis

Como se analiza anteriormente, la probabilidad de que un paciente presente una respuesta beneficiosa a un inhibidor del EGFR se evalúa mediante la determinación de un nivel de expresión normalizado de un gen indicador de respuesta o conjunto genes indicadores de respuesta. La probabilidad de respuesta al tratamiento inhibidor del EGFR del paciente se proporciona en un informe. El informe puede incluir además información relativa a la probabilidad de respuesta del paciente. Por ejemplo, un procedimiento de este tipo puede incluir además una etapa de generación o emisión de un informe que proporcione los resultados de una evaluación de la probabilidad de respuesta de este tipo, informe que se puede proporcionar en forma de un medio electrónico (p. ej., una pantalla electrónica en un monitor de ordenador) o en forma de un medio tangible (p. ej., un informe impreso en papel u otro medio tangible).

Una evaluación de la probabilidad de que un paciente que tiene un cáncer que expresa EGFR responda al tratamiento con un inhibidor del EGFR se denomina más adelante una "evaluación de la probabilidad de respuesta" o, simplemente, "evaluación de la probabilidad". Una persona o entidad que prepara un informe ("generador del informe") también realiza la evaluación de la probabilidad. El generador del informe puede realizar también uno o más de la recogida de las muestras, el procesamiento de las muestras y la generación de datos, p. ej., el generador del informe puede realizar también uno o más de: a) la recogida de las muestras; b) el procesamiento de las muestras; c) la medida de un nivel del/de los producto(s) de un gen indicador de respuesta; d) la medida de un nivel del/de los producto(s) de un gen de referencia; e) la detección de la presencia o ausencia de una mutación activadora de KRAS; y f) la determinación de un nivel normalizado de un gen indicador de respuesta, o su(s) producto(s) génico(s). De forma alternativa, una entidad distinta de la generadora del informe puede realizar uno o más de la recogida de las muestras, el procesamiento de las muestras y la generación de datos.

La persona o entidad a quienes se transmite un informe pueden ser la misma persona o entidad que realizan uno o más de los siguientes: a) recoge una muestra; b) procesa una muestra; c) proporciona una muestra o una muestra procesada; y d) genera datos (p. ej., nivel de un gen indicador de respuesta, o su(s) producto(s) génico(s); nivel del/de los producto(s) de un gen de referencia; nivel normalizado de un gen indicador de respuesta, o su(s) producto(s) génico(s)) para su uso en la evaluación de la probabilidad. En algunos casos, la(s) persona(s) o entidad(es) que proporcionan la recogida de las muestras y/o el procesamiento de las muestras y/o la generación de datos, y la persona que recibe los resultados y/o el informe pueden ser personas diferentes, pero en el presente documento ambas se denominan "usuarios" o "clientes" para evitar confusiones.

En los modos de realización donde el usuario ejecuta únicamente una parte del procedimiento, el individuo que revisa los datos de salida después del procesamiento informático de los datos de acuerdo con los procedimientos de la invención (p. ej., resultados antes de la publicación para proporcionar un informe completo, o revisa un informe "incompleto" y permite la intervención manual y la finalización de un informe interpretativo) se denomina en el presente documento "revisor". El revisor puede estar ubicado en una ubicación alejada del usuario (p. ej., en un servicio que se proporciona independiente de un centro de atención médica donde puede estar ubicado un usuario).

Informe

Tal como se describe en el presente documento, un "informe" es un documento electrónico o tangible que incluye elementos de informe que proporcionan información de interés relativa a una evaluación de la probabilidad de este tipo y sus resultados. Un informe de este tipo incluye al menos una evaluación de la probabilidad, p. ej., una indicación en cuanto a la probabilidad de que un paciente que tiene un cáncer que expresa EGFR presente una respuesta clínica beneficiosa a una pauta de tratamiento de inhibición del EGFR. Un informe de este tipo se puede

generar total o parcialmente de forma electrónica. Un informe de este tipo puede incluir además uno o más de: 1) información relativa a las instalaciones de las pruebas; 2) información sobre el proveedor del servicio; 3) datos del paciente; 4) datos de las muestras; 5) un informe interpretativo, que puede incluir información diversa, incluidos: a) instrucciones; b) datos de las pruebas, donde los datos de las pruebas pueden incluir: i) el nivel normalizado del producto de uno o más genes indicadores de respuesta; y/o ii) recomendaciones sobre la presencia o ausencia de una mutación activadora de KRAS; y 6) otras características.

Donde son aplicables las normativas gubernamentales u otras restricciones (p. ej., requisitos sanitarios, mala praxis

o seguros de responsabilidad), todos los resultados, generados total o parcialmente de forma electrónica, se someten a un control de calidad rutinario antes de proporcionárselos al usuario.

Información sobre las instalaciones de las pruebas

El informe puede incluir información sobre las instalaciones de las pruebas, información pertinente al hospital, la clínica o el laboratorio en los que se llevó a cabo la recogida de las muestras y/o la generación de datos. La recogida de las muestras puede incluir obtener una muestra de célula cancerosa a partir de una biopsia, un tumor extirpado quirúrgicamente, un tejido extirpado quirúrgicamente que comprende un tumor, u otro tejido o fluido corporal de un paciente. La generación de datos puede incluir uno o más de: a) medir un nivel del/de los producto(s) de un gen (p. ej., el/los producto(s) de un gen indicador de respuesta, el/los producto(s) de un gen de referencia); b) detectar la presencia o ausencia de una mutación activadora de KRAS; y c) determinar un nivel normalizado del producto de un gen indicador de respuesta. Esta información puede incluir uno o más detalles relativos a, por ejemplo, el nombre y la ubicación de las instalaciones de las pruebas, la identidad del técnico de laboratorio que llevó a cabo el ensayo y/o que introdujo los datos de entrada, la fecha y la hora en las que se llevó a cabo y/o se analizó el ensayo, la ubicación en la que se almacenaron la muestra y/o los datos de los resultados, el número de lote de los reactivos (p. ej., el kit, etc.) usados en el ensayo y similares. En general, los campos del informe con esta información se pueden rellenar usando información proporcionada por el usuario.

Información del proveedor del servicio

El informe puede incluir información sobre el proveedor del servicio, que puede estar ubicado fuera del centro de atención médica en el que está ubicado el usuario, o dentro del centro de atención médica. Los ejemplos de este tipo de información pueden incluir el nombre y la ubicación del proveedor del servicio, el nombre del revisor y, cuando sea necesario o se desee, el nombre del individuo que llevó a cabo la recogida de las muestras y/o la generación de datos. En general, los campos del informe con esta información se pueden rellenar usando datos introducidos por el usuario, que se puede seleccionar de entre selecciones previamente escritas (p. ej., usando un menú desplegable). Otra información del proveedor del servicio del informe puede incluir información de contacto para la información técnica sobre el resultado y/o sobre el informe interpretativo.

Datos del paciente

Los datos del paciente pueden incluir los antecedentes médicos del paciente (que pueden incluir, p. ej., datos sobre tratamientos antineoplásicos anteriores), los antecedentes personales; datos administrativos del paciente (es decir, datos que no son esenciales para la evaluación de la probabilidad), tales como información para identificar al paciente (p. ej., nombre, fecha de nacimiento del paciente (FDN), sexo, dirección de correo y/o domicilio, número de historia clínica (NHC), número de habitación y/o de cama en un centro de atención médica), información del seguro y similares), el nombre del médico del paciente u otro profesional sanitario que solicitara la evaluación de la probabilidad de respuesta y, si fuera diferente el médico que la solicita, el nombre de un médico de la plantilla que sea responsable del cuidado del paciente (p. ej., un médico de atención primaria). En general, los campos del informe con esta información se pueden rellenar usando datos introducidos por el usuario.

Datos de la muestra

Los datos de la muestra pueden proporcionar información sobre la muestra biológica analizada en la evaluación de la probabilidad, tal como el origen de la muestra biológica obtenida a partir del paciente (p. ej., biopsia tumoral, tumor extirpado quirúrgicamente, desconocido, etc.) y la fecha y la hora en que se recogió. En general, los campos del informe con esta información se pueden rellenar usando datos introducidos por el usuario, algunos de los cuales se pueden proporcionar como selecciones previamente escritas (p. ej., usando un menú desplegable).

Informe interpretativo

La parte de informe interpretativo del informe incluye información generada después del procesamiento de los datos como se describe en el presente documento. El informe interpretativo puede incluir una indicación de la probabilidad de que el paciente responda al tratamiento con un inhibidor del EGFR. El informe interpretativo puede incluir, por ejemplo, una indicación (p. ej., tipo de cáncer que expresa EGFR, etc.); el resultado del cribado para detectar la mutación de KRAS (p. ej., "negativo para las mutaciones sometidas a prueba"); el resultado del nivel normalizado

del/de los gen(es) indicador(es) de respuesta (p. ej., "nivel normalizado del/de los gen(es) indicador(es) de respuesta"); la interpretación; y, opcionalmente, una(s) recomendación/recomendaciones.

La parte del informe de interpretación puede incluir una(s) recomendación/recomendaciones. Cuando los resultados indican una probabilidad de respuesta beneficiosa a un tratamiento inhibidor del EGFR, la recomendación puede incluir una recomendación de que está indicado un tratamiento inhibidor del EGFR. Cuando los resultados indican que no es probable una respuesta beneficiosa a un tratamiento inhibidor del EGFR, la recomendación puede incluir una recomendación de una pauta de tratamiento alternativa.

Se apreciará fácilmente que el informe puede incluir la totalidad o algunos de los elementos anteriores, con la condición de que, en general, el informe incluya al menos los elementos suficientes para proporcionar el análisis requerido por el usuario (p. ej., la evaluación de la probabilidad).

Características adicionales

También se apreciará fácilmente que el informe puede incluir elementos adicionales o elementos modificados. Por ejemplo, cuando es electrónico, el informe puede contener enlaces hipertextuales que dirigen a bases de datos internas o externas que proporcionan información más detallada sobre elementos seleccionados del informe. Por ejemplo, el elemento de los datos del paciente puede incluir un enlace hipertextual a una historia clínica electrónica del paciente, o a una página web para acceder a dicha historia clínica del paciente, historia clínica del paciente que se aloja en una base de datos confidencial. Este último modo de realización puede ser de interés en un sistema intrahospitalario o en un entorno interno de una clínica.

Sistemas y procedimientos informáticos

Los procedimientos y sistemas descritos en el presente documento se pueden implementar de numerosas maneras. En un modo de realización de especial interés, los procedimientos implican el uso de una infraestructura de comunicación, por ejemplo, Internet. A continuación se analizan varios modos de realización de la invención. Se ha de entender asimismo que la presente invención se puede implementar en diversas formas de soporte físico, soporte lógico, microcódigo inalterable, procesadores o una combinación de los mismos. Los procedimientos y sistemas descritos en el presente documento se pueden implementar como una combinación de soporte físico y soporte lógico. El soporte lógico se puede implementar como un programa de aplicación incorporado de forma tangible en un dispositivo de almacenamiento de programas, o se pueden implementar diferentes partes del soporte lógico en el entorno informático de usuario (p. ej., como un subprograma) y en el entorno informático del revisor, donde el revisor puede estar ubicado en un sitio remoto asociado (p. ej., en las instalaciones de un proveedor de servicios).

Por ejemplo, durante o después de que el usuario introduzca los datos, se pueden realizar parte del procesamiento de los datos en el entorno informático del lado del usuario. Por ejemplo, se puede programar el entorno informático del lado del usuario para que permita que códigos de prueba definidos indiquen una "puntuación" de probabilidad, donde la puntuación se transmite como respuestas procesadas o parcialmente procesadas al entorno informático del revisor en forma de código de prueba para la ejecución posterior de uno o más algoritmos para proporcionar resultados y/o generar un informa en el entorno informático del revisor. La puntuación puede ser una puntuación numérica (que representa un valor numérico) o una puntuación no numérica que representa un valor numérico o intervalo de valores numéricos (p. ej., "A" representa un 90-95 % de probabilidad de un resultado).

El programa de aplicación para ejecutar los algoritmos descritos en el presente documento se puede cargar y ejecutar en una máquina que comprenda cualquier arquitectura adecuada. En general, la máquina implica una plataforma informática que tiene un soporte físico, tal como una o más unidades centrales de procesamiento (CPU), una memoria de acceso aleatorio (RAM) y una(s) interfaz/interfaces de entrada/salida (I/O). La plataforma informática incluye también un sistema operativo y un código de microinstrucciones. Los diversos procedimientos y funciones descritos en el presente documento pueden ser parte del código de microinstrucciones o parte del programa de aplicación (o una combinación de los mismos) que se ejecutan por medio del sistema operativo. Además, se pueden conectar otros diversos dispositivos periféricos a la plataforma informática, tales como un dispositivo de almacenamiento de datos adicional y un dispositivo de impresión.

Como sistema informático, el sistema incluye, por lo general, una unidad de procedimiento. La unidad de procesamiento funciona para recibir información, que puede incluir datos de prueba (p. ej., el nivel de un gen de respuesta, el nivel del/ de los producto(s) de un gen de referencia; el nivel normalizado de un gen de respuesta; y puede incluir también otros datos, tales como datos del paciente. Se puede almacenar esta información recibida al menos temporalmente en una base de datos, y analizar los datos para generar un informe como se describe anteriormente.

También se pueden enviar parte o la totalidad de los datos de forma electrónica; se pueden enviar determinados datos de salida de forma electrónica o telefónica (p. ej., por fax, p. ej., usando dispositivos tales como un dispositivo de envío de fax). Los dispositivos de recepción de salida ejemplares pueden incluir un elemento de pantalla, una impresora, un dispositivo de fax y similares. Las formas electrónicas de transmisión y/o presentación pueden incluir

correo electrónico, televisión interactiva y similares. En un modo de realización de especial interés, se alojan la totalidad o una parte de los datos de entrada y/o la totalidad o una parte de los datos de salida (p. ej., habitualmente al menos el informe final) en un servidor de páginas web para acceder a ellos, preferentemente con un acceso confidencial, con buscadores típicos. Se puede acceder a los datos o enviarlos a profesionales sanitarios según se desee. Los datos de entrada y salida, incluida la totalidad o una parte del informe final, se pueden usar para rellenar la historia clínica de un paciente que puede existir en una base de datos confidencial en el centro de atención médica.

Un sistema para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento incluye, en general, al menos un procesador informático (p. ej., cuando el procedimiento se lleva a cabo en su totalidad en un único sitio) o al menos dos procesadores informáticos en red (p. ej., cuando el usuario (también denominado en el presente documento "cliente") ha de introducir datos y se transmiten a un sitio remoto a un segundo ordenador para su análisis, donde los procesadores del primer y el segundo ordenador están conectados por una red, p. ej., por medio de una red interna

o por Internet). El sistema puede incluir también un(os) componente(s) de usuario para la introducción; y un(os) componente(s) de revisor para la revisión de los datos, los informes generados y la intervención manual. Los componentes adicionales del sistema pueden incluir un(os) componente(s) de servidor; y una(s) base(s) de datos para almacenar datos (p. ej., como en una base de datos de elementos de informe, p. ej., elementos de informe interpretativo, o una base de datos relacional (BDR) que puede incluir datos introducidos por el usuario y datos de salida. Los procesadores informáticos pueden ser procesadores que se encuentran típicamente en ordenadores personales de sobremesa (p. ej., IBM, Dell, Macintosh), ordenadores portátiles, ordenadores centrales, miniordenadores u otros dispositivos informáticos.

La arquitectura en red de cliente/servidor se puede seleccionar como se desee y puede ser, por ejemplo, un modelo clásico de cliente y servidor de dos o tres niveles. Un sistema de gestión de bases de datos relacionales (SGBDR), bien como parte de un componente del servidor de la aplicación o como un componente independiente (máquina de BDR), proporciona la interfaz de la base de datos.

En un ejemplo, se proporciona la arquitectura como una arquitectura de cliente/servidor centrada en la base de datos, en la que la aplicación del cliente, por lo general, requiere servicios del servidor de la aplicación que realiza la petición a la base de datos (o al servidor de la base de datos) para rellenar el informe con los diversos elementos de informe requeridos, en particular los elementos de informe interpretativo, especialmente las alertas y el texto de interpretación. El/los servidor(es) (p. ej., bien como parte de la máquina del servidor de la aplicación o como una máquina de base de datos relacional/BDR) responde(n) a las peticiones del cliente.

Los componentes de entrada del cliente pueden ser ordenadores personales completos autónomos que ofrecen una amplia variedad de potencias y características para ejecutar aplicaciones. El componente del cliente funciona habitualmente en cualquier sistema operativo deseado e incluye un elemento de comunicación (p. ej., un módem u otro soporte físico para conectar a la red), uno o más dispositivos de entrada (p. ej., un teclado, un ratón, un teclado numérico u otro dispositivo usado para transferir información o comandos), un elemento de almacenamiento (p. ej., un disco duro u otro medio de almacenamiento de lectura por ordenador y escritura por ordenador) y un elemento de pantalla (p. ej., un monitor, una televisión, un LCD, un LED u otro dispositivo de pantalla que transmita información al usuario). El usuario introduce comandos de entrada en el procesador informático a través de un dispositivo de entrada. En general, la interfaz de usuario es una interfaz de usuario gráfica (IUG) escrita para aplicaciones de buscadores de páginas web.

El/los componente(s) puede(n) ser un ordenador personal, un miniordenador o un ordenador central y ofrece(n) gestión de datos, intercambio de información entre clientes, administración de la red y seguridad. La aplicación y cualquier base de datos usada pueden estar en el mismo o en diferentes servidores.

Se contemplan otras disposiciones informáticas para el cliente y el/los servidor(es), que incluyen el procesamiento en una única máquina tal como un ordenador central, una colección de maquinas u otra configuración adecuada. En general, las máquinas del cliente y del servidor trabajan conjuntamente para llevar a cabo el procesamiento de la presente invención.

Cuando se usa(n), la(s) base(s) de datos se conecta(n) habitualmente con el componente de servidor de base de datos y puede(n) ser cualquier dispositivo que aloje datos. Por ejemplo, la base de datos puede ser cualquier dispositivo de almacenamiento magnético u óptico para un ordenador (p. ej., un CDROM, un disco duro interno, una unidad de cinta). La base de datos puede estar ubicada lejos del componente de servidor (con acceso por medio de una red, un módem, etc.) o próximo al componente de servidor.

Cuando se usa en el sistema y los procedimientos, la base de datos puede ser una base de datos relacional que está organizada y a la que se accede de acuerdo con relaciones entre elementos de datos. En general, la base de datos relacional está compuesta por una pluralidad de tablas (entidades). Las filas de la tabla representan registros (colecciones de información sobre elementos independientes) y las columnas representan campos (cualidades particulares de un registro). En su concepción más sencilla, la base de datos relacional es una colección de entradas de datos que "se refieren" unos a otros a través de al menos un campo común.

Se pueden usar puestos de trabajo adicionales equipados con ordenadores e impresoras en el punto de servicio para introducir datos y, en algunos modos de realización, generar informes apropiados, si se desea. El/los ordenador(es) pueden tener un acceso directo (p. ej., en el escritorio) para iniciar la aplicación para facilitar el inicio de la entrada de datos, la transmisión, el análisis, la recepción del informe, etc. según se desee.

Medios de almacenamiento de lectura por ordenador

La presente divulgación también contempla un medio de almacenamiento de lectura por ordenador (p. ej. un CD-ROM, un lápiz de memoria, una tarjeta de memoria ultrarrápida, un disquete, etc.) que tienen almacenado en su interior un programa que, cuando se ejecuta en un entorno informático, permite implementar algoritmos para llevar a cabo la totalidad o una parte de los resultados de una evaluación de la probabilidad de respuesta como se describe en el presente documento. Cuando el medio de lectura por ordenador contiene un programa completo para llevar a cabo los procedimientos descritos en el presente documento, el programa incluye instrucciones de programa para recoger, analizar y generar resultados y, en general, incluye dispositivos de código de lectura por ordenador para interaccionar con un usuario como se describe en el presente documento, procesar esos datos junto con información analítica y generar medios impresos o electrónicos exclusivos para ese usuario.

Cuando el medio de almacenamiento proporciona un programa que permite implementar una parte de los procedimientos descritos en el presente documento (p. ej., el aspecto de los procedimientos del lado del usuario (p. ej., introducción de datos, prestaciones de recepción del informe, etc.)), el programa permite la transmisión de datos introducidos por el usuario (p. ej., a través de Internet, a través de una red interna, etc.) a un entorno informático en un sitio remoto. En el sitio remoto se lleva a cabo el procesamiento o la finalización del procesamiento de los datos para generar un informe. Después de la revisión del informe, y de la finalización de cualquier intervención manual necesaria para proporcionar un informe completo, el informe completo se transmite entonces de vuelta al usuario como un documento electrónico o un documento impreso (p. ej., un informe en papel enviado por fax o por correo postal). El medio de almacenamiento que contiene un programa de acuerdo con la invención puede incluir en el embalaje instrucciones (p. ej., para la instalación del programa, su uso, etc.) grabadas en un soporte adecuado o una dirección de una página web donde se pueden obtener dichas instrucciones. El medio de almacenamiento de lectura por ordenador se puede proporcionar también en combinación con uno o más reactivos para llevar a cabo la evaluación de la probabilidad de respuesta (p. ej., cebadores, sondas, matrices u otros componentes de kit de este tipo).

Construcción del modelo multivariable

Los niveles de expresión normalizados de genes indicadores de respuesta se pueden usar para llevar a cabo un análisis multivariable con el fin de construir un modelo de varios genes útil para la evaluación de la probabilidad de un paciente de respuesta al tratamiento inhibidor del EGFR. Así, la presente divulgación proporciona un procedimiento para llevar a cabo un análisis multivariable y/o construir un modelo de varios genes.

En general, el procedimiento implica: a) reunir valores de niveles de expresión normalizados de dos o más productos de genes indicadores de respuesta; b) determinar si una combinación matemática de los niveles de expresión normalizados de cualquier combinación de los genes indicadores de respuesta es más indicativa de una probabilidad de que un paciente responda al tratamiento con un inhibidor del EGFR que el nivel de expresión normalizado de uno cualquiera de los genes indicadores de respuesta individualmente; y c) usar la combinación matemática para evaluar la probabilidad de que un paciente responda al tratamiento con un inhibidor del EGFR (Ambroise C y McLachlan GJ (2002) Proc Nat Acad Sci USA 99, 6562-6566).

Procedimientos de tratamiento y clasificación

La presente divulgación proporciona procedimientos de tratamiento, procedimientos de tratamiento que, por lo general, implican tratar a un individuo que tiene un cáncer que expresa EGFR con una pauta de tratamiento que se selecciona basándose en los resultados de una evaluación de la probabilidad de respuesta como se describe en el presente documento.

La presente divulgación proporciona también un procedimiento para clasificar a un paciente como "con respuesta" o "sin respuesta" basándose en los resultados de una evaluación de la probabilidad de este tipo. Por ejemplo, el procedimiento implica someter a ensayo una muestra de prueba obtenida a partir de una célula cancerosa que expresa EGFR de un paciente; y determinar un nivel normalizado de un producto génico de un gen indicador de respuesta, como se describe anteriormente. El nivel normalizado del/de los producto(s) génico(s) indica si es probable que el paciente presente una respuesta clínicamente beneficiosa al tratamiento con un inhibidor del EGFR, permitiendo de este modo la clasificación del paciente como "con respuesta" o "sin respuesta".

Matrices y otra composiciones para su uso en procedimientos de predicción

La presente divulgación proporciona matrices para su uso en la realización de un procedimiento de este tipo para predecir la probabilidad de respuesta beneficiosa del paciente al tratamiento inhibidor del EGFR.

Matrices (conjuntos de genes)

La presente divulgación proporciona una matriz para su uso en un procedimiento de este tipo. Una matriz de este tipo incluye una pluralidad de polinucleótidos inmovilizados sobre la superficie de un soporte insoluble. Los polinucleótidos inmovilizados comprenden secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con un gen indicador de respuesta o un gen de referencia. Tal como se usa en el presente documento, el término "hibridar" se refiere a la interacción de apareamiento de bases complementarias de un ácido nucleico con otro ácido nucleico que da lugar a la formación de un dúplex, un tríplex u otra estructura de orden superior. Típicamente, la interacción principal es específica de base, p. ej., A/T y G/C, por puentes de hidrógeno de Watson/Crick. El apilamiento de bases y las interacciones hidrófobas también pueden contribuir a la estabilidad del dúplex. En la técnica se conocen las condiciones para hibridar cebadores y sondas de detección con secuencias objetivo complementarias y sustancialmente complementarias (véanse, p. ej., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, B. Hames y S. Higgins, eds., IRL Press, Washington, D.C. (1985) y Wetmur J y Davidson N (1968) Mol Biol 31, 349-37.

Por ejemplo, un polinucleótido inmovilizado comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida con un gen indicador de respuesta seleccionado de un gen enumerado en una de la tabla 1A, la tabla 1B, la tabla 2A, la tabla 2B, la tabla 6A, la tabla 6B, la tabla 7A y la tabla 7B, anteriores. En la técnica se conocen secuencias de nucleótidos de los genes indicadores de respuesta mencionados anteriormente. Como tal, la generación de sondas que hibridan en condiciones de hibridación adecuadas (p. ej., condiciones de hibridación rigurosas) está dentro del nivel de conocimiento de los expertos en la técnica.

Como ejemplo, una matriz de este tipo puede comprender una sonda que permita la detección de uno o más productos(s) génico(s) codificados por un gen indicador de respuesta seleccionado de entre: ATP5E, TITF1, CLTC, BRCA1, AREG, PTP4A3, EREG, VAV3, SATB2, CEACAM6, EGFR, CHN2, FGFR3, C13orf18, QPRT, AMACR1, CKMT2, ID1, SORBS1, SLC26A3 y ErbB3. Como otro ejemplo, una matriz de este tipo puede comprender una sonda que permita la detección de uno o más productos(s) génico(s) codificados por un gen indicador de respuesta seleccionado de entre: DUSP6, VDAC2, ANXA2P2, SERPINA B1, NT5E, GPC3, DUSP4, PHLDA1, K-ras, DR5, VIL2, LAMC2, SFN, ANXA1, EPHA2, P14ARF, CA9, KRT17, p14ARF, maspina, PLAUR, LAMA3 y GCNT3. Como otro ejemplo más, una matriz de este tipo puede comprender una sonda que permita la detección de uno o más producto(s) génico(s) codificados por un gen indicador de respuesta seleccionado de entre ATP5E, TITF1, CLTC, BRCA1, AREG, PTP4A3, EREG, VAV3, SATB2, CEACAM6, EGFR, CHN2, FGFR3, C13orf18, QPRT, AMACR1, CKMT2, ID1, SORBS1, SLC26A3, ErbB3, DUSP6, VDAC2, ANXA2P2, SERPINA B1, NT5E, GPC3, DUSP4, PHLDA1, K-ras, DR5, VIL2, LAMC2, SFN, ANXA1, EPHA2, P14ARF, CA9, KRT17, p14ARF, maspina, PLAUR, LAMA3 y GCNT3.

Como otro ejemplo más, una matriz de este tipo puede comprender una sonda que permita la detección de uno o más producto(s) génico(s) codificados por un gen indicador de respuesta seleccionado de entre EGF, ADAM17, PTP4A3, ADAM15, QPRT, SATB2, RASSF1, VAV3, CEACAM6, EREG, AREG, TITF1, SORBS1, C13orf18, CKMT2, BTC, ATP5E, catenina B, CCNE1, EGFR, Bclx, BRCA1, CDC25B, CHN2, ID1, SLC26A3, VDAC2, SERPINA B1, PHLDA1, ANXA2P2, KRT17, EPHA2, DUSP4, CGA, CA9, maspina, NEDD8, DUSP6, GPC3, NT5E, VIL2 y P14ARF. Una matriz de este tipo es particularmente útil para predecir la probabilidad de que un paciente que tiene un cáncer que expresa EGFR, negativo para KRAS, presente una respuesta beneficiosa a un tratamiento inhibidor del EGFR.

Como otro ejemplo más, una matriz de este tipo puede comprender sondas que permitan la detección de los productos génicos de genes incluidos en los conjuntos de varios genes enumerados anteriormente, o cualquier combinación de conjuntos de varios genes (p. ej., los conjuntos de varios genes 1-64 y 65-167, anteriores).

Como se destaca anteriormente, en algunos casos, se detectará la presencia o ausencia de una mutación activadora de KRAS. En estos casos, se incluyen en la matriz una o más sondas que permitan la detección de mutaciones activadoras de KRAS conocidas.

Los genes indicadores de respuesta están representados en la matriz por sondas inmovilizadas sobre un soporte insoluble. Los genes indicadores de respuesta (representados por sondas inmovilizadas) representan al menos aproximadamente el 25 % de los genes representados en la matriz. Por ejemplo, los genes indicadores de respuesta representan al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 % o al menos aproximadamente el 95 % de los genes representados en la matriz.

En el presente documento, una sonda que hibrida con un gen indicador de respuesta se denomina "sonda de gen indicador de respuesta ". Las sondas de genes indicadores de respuesta son ácidos nucleicos monocatenarios, que

tienen una longitud de desde aproximadamente 10 nucleótidos (nt) hasta aproximadamente 100 nt, p. ej., desde aproximadamente 15 nt hasta aproximadamente 50 nt, desde aproximadamente 15 nt hasta aproximadamente 20 nt, desde aproximadamente 20 nt hasta aproximadamente 25 nt o desde aproximadamente 25 nt hasta aproximadamente 30 nt. En este contexto, se puede interpretar que el término "aproximadamente" significa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos más en 5' o 3' desde cualquiera o desde ambos extremos.

Una matriz de este tipo comprende una o más sondas de genes indicadores de respuesta inmovilizadas sobre una superficie de un soporte sólido (insoluble). Una matriz de este tipo puede incluir dos o más ("una pluralidad") de sondas de genes indicadores de respuesta inmovilizadas sobre la superficie de un soporte sólido. Por ejemplo, una matriz de este tipo puede incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7-10, 10-12, 12-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50 o más de 50, sondas de genes indicadores de respuesta distintas inmovilizadas sobre una superficie de un soporte sólido.

Una sonda puede ser "dirigible", p. ej., se puede determinar la secuencia de nucleótidos, o quizás otras características físicas o químicas, de una sonda a partir de su dirección, es decir una correspondencia unívoca entre la secuencia u otra propiedad de la sonda y una ubicación espacial sobre, o característica del soporte en fase sólida al que está unida. Por ejemplo, una dirección de una sonda puede ser una ubicación espacial, p. ej., las coordenadas en el plano de una región en particular que contiene copias de la sonda.

Una matriz de este tipo incluye un soporte en fase sólida, que puede ser plano o una colección de micropartículas, que lleva o llevan sondas como se describe anteriormente fijadas o inmovilizadas, p. ej., covalentemente, en ubicaciones dirigibles específicas. Por ejemplo, una matriz de este tipo incluye un soporte en fase sólida que tiene una superficie plana, que lleva una pluralidad de ácidos nucleicos, comprendiendo cada miembro de la pluralidad copias idénticas de una sonda oligonucleotídica o polinucleotídica inmovilizadas en una región fija, que no solapa con la de otros miembros de la pluralidad. Típicamente, las sondas de ácido nucleico son monocatenarias y están unidas covalentemente al soporte en fase sólida en ubicaciones conocidas, determinables o dirigibles. Típicamente, la densidad de regiones no solapantes que contienen ácidos nucleicos en una micromatriz es mayor de 100 por cm2,

p. ej., mayor de 1.000 por cm2.

Los sustratos de las matrices de este tipo se pueden fabricar de una variedad de materiales. Los materiales de los que se fabrica el sustrato deberían presentar, idealmente, un nivel bajo de unión inespecífica durante acontecimientos de hibridación. En muchas situaciones, también será preferente emplear un material que sea transparente a la luz visible y/o UV. Para sustratos flexibles, los materiales de interés incluyen: nailon, tanto modificado como no modificado, nitrocelulosa, polipropileno y similares, donde, en este modo de realización, es de especial interés una membrana de nailon, así como derivados del mismo. Para sustratos rígidos, los materiales específicos de interés incluyen: vidrio; plástico, p. ej., politetrafluoroetileno, polipropileno, poliestireno, policarbonato y mezclas de los mismos, y similares; metales, p. ej., oro, platino y similares; etc. Son también de interés materiales compuestos tales como vidrio o plástico recubiertos con una membrana, p. ej., de nailon o nitrocelulosa, etc.

La hibridación entre una sonda y un ácido nucleico de prueba (donde un ácido nucleico de prueba incluye una muestra de ácido nucleico obtenida a partir de una célula cancerosa de un paciente) da lugar a una "lectura", donde "lectura" se refiere a un parámetro o parámetros que se miden y/o detectan que se pueden convertir en un número o valor. En algunos contextos, lectura se puede referir a una representación numérica real de dicha colección de datos registrados. Por ejemplo, una lectura de señales de intensidad de la fluorescencia de una matriz es la dirección y la intensidad de la fluorescencia de una señal generada en cada sitio de hibridación de la matriz; por tanto, dicha lectura se puede registrar o almacenar de diversas formas, por ejemplo, como una imagen de la matriz, como una tabla de números, o similar.

El número total de manchas en el sustrato variará en función del número de manchas de sondas oligonucleotídicas diferentes (composiciones de sondas oligonucleotídicas) que se deseen mostrar sobre la superficie, así como el número de manchas que no son de sondas, p. ej., manchas de control, manchas de orientación, manchas de calibrado y similares, según se desee, en función de la aplicación en particular en la que se van a emplear las matrices de este tipo. El patrón presente sobre la superficie de la matriz puede incluir al menos 2 manchas de sondas de ácido nucleico distintas, al menos aproximadamente 5 manchas de sondas de ácido nucleico distintas, al menos aproximadamente 10 manchas de sondas de ácido nucleico distintas, al menos aproximadamente 20 manchas de sondas de ácido nucleico distintas o al menos aproximadamente 50 manchas de sondas de ácido nucleico distintas.

En algunos casos, puede ser deseable presentar cada mancha de sonda distinta o composición de sondas por duplicado, es decir, de tal forma que, para un objetivo dado, se muestren en la matriz dos manchas de sondas duplicadas. En algunos casos, cada objetivo representado en la superficie de la matriz está representado sólo por un único tipo de sonda oligonucleotídica. En otras palabras, todas las sondas oligonucleotídicas de la matriz para un objetivo dado representadas sobre la misma tienen la misma secuencia. En determinados modos de realización, el número de manchas variará desde aproximadamente 200 hasta 1.200. El número de manchas de sondas presentes en la matriz puede constituir una proporción sustancial del número total de manchas de ácidos nucleicos de la

matriz, donde, en muchos modos de realización, el número de manchas de sondas es de al menos aproximadamente el 25 % en número, al menos aproximadamente el 50 % en número, al menos aproximadamente el 80 % en número o al menos aproximadamente el 90 % en número del número total de manchas de ácidos nucleicos de la matriz.

Se puede preparar una matriz de este tipo usando cualquier procedimiento y composiciones convencionales. Por ejemplo, un procedimiento de preparación de una matriz es sintetizar en primer lugar los oligonucleótidos para cada mancha y depositar después los oligonucleótidos como una mancha sobre la superficie del soporte. Los oligonucleótidos se pueden preparar usando cualquier metodología conveniente, donde los procedimientos de síntesis química en los que se usa fosforamidita o protocolos análogos en los que se añaden bases individuales secuencialmente sin el uso de una polimerasa, p. ej., tales como los que se encuentran en los protocolos de síntesis en fase sólida automatizados, donde los expertos en la técnica conocen bien estas técnicas.

Se pueden generar objetivos (p. ej., una muestra de ácido nucleico de una célula cancerosa de un paciente) por procedimientos conocidos en la técnica. se puede marcar ARNm y usarlo directamente como objetivo, o convertirlo en un objetivo de ADNc marcado. Se puede marcar ARNm de forma inespecífica (al azar) directamente usando compuestos de marcaje química, fotoquímica o enzimáticamente activados. Un objetivo de ARNm se puede marcar específicamente en las secuencias que son complementarias a las sondas. Este marcaje específico se puede llevar a cabo usando la unión covalente o no covalente de oligonucleótidos marcados adicionales a las secuencias objetivo que flanquean la secuencia complementaria de la sonda o la secuencia de la sonda complementaria. Se puede purificar la fracción hibridada de oligonucleótidos marcados con el ARNm o separarla de la fracción no hibridada y después hibridarla con la matriz. En la técnica se conocen procedimientos para generar sondas de ADNc marcadas e incluyen el uso de cebadores oligonucleotídicos y de nucleótido(s) trifosfato marcado(s). Los cebadores que se pueden emplear incluyen cebadores oligo(dT) aleatorios, p. ej., hexámeros aleatorios y cebadores específicos de genes.

Tras la preparación del ácido nucleico objetivo a partir del tejido o la célula de interés, después se pone en contacto el ácido nucleico objetivo con la matriz en condiciones de hibridación, donde se pueden ajustar dichas condiciones, según se desee, para proporcionar un nivel óptimo de especificidad a la vista del ensayo en particular que se está realizando. Las condiciones de hibridación adecuadas las conocen bien los expertos en la técnica y se revisan en Maniatis et al., supra, y en el documento WO 95/21944. En muchos modos de realización es de especial interés el uso de condiciones rigurosas durante la hibridación, es decir, condiciones que son óptimas en términos de velocidad, rendimiento y estabilidad para la hibridación específica sonda-objetivo y que proporcionan un mínimo de interacción inespecífica sonda/objetivo. Los expertos en la técnica conocen las condiciones rigurosas.

Tras la hibridación, se retira el ácido nucleico marcado no hibridado de la superficie del soporte, convenientemente por lavado, generando un patrón de ácido nucleico hibridado sobre la superficie del sustrato. Se pueden usar una variedad de soluciones de lavado y los expertos en la técnica las conocen. Los procedimientos de detección de la hibridación entre un ácido nucleico sonda y un ácido nucleico objetivo incluyen recuento de centelleo, autorradiografía, medidas de fluorescencia, medidas colorimétricas, medidas de emisión de luz, dispersión lumínica y similares.

Los ejemplos no limitantes de sondas que serían adecuadas para su inclusión en una matriz de este tipo incluyen las secuencias de sondas descritas en las tablas que se proporcionan en las figuras 1 y 2.

Se puede usar una matriz de este tipo en un procedimiento de este tipo para predecir la probabilidad de que un paciente responda a un tratamiento inhibidor del EGFR. Por tanto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para predecir la probabilidad de que un paciente que tiene un cáncer que expresa EGFR presente una respuesta beneficiosa a un tratamiento con un inhibidor del EGFR, donde el procedimiento implica: (a) poner en contacto una matriz que comprende una pluralidad de sondas de ácido nucleico de genes indicadores de respuesta distintas inmovilizadas sobre una superficie de un soporte sólido con una muestra de ácido nucleico de una célula cancerosa del paciente, para producir una matriz en contacto con la muestra; y (b) detectar la hibridación entre las sondas inmovilizadas y los ácidos nucleicos del paciente. La detección de la hibridación permite la determinación de un nivel normalizado de un gen indicador de respuesta, o su producto génico y, por lo tanto, permite una evaluación en cuanto a la probabilidad de que el paciente presente una respuesta beneficiosa al tratamiento inhibidor del EGFR.

La presente divulgación proporciona también procedimientos de preparación de una matriz de este tipo. En general, los procedimientos implican inmovilizar sobre un soporte sólido una o más sondas que permitan la detección de productos de ácido nucleico de al menos dos genes seleccionados de entre: ATP5E, TITF1, CLTC, BRCA1, AREG, PTP4A3, EREG, VAV3, SATB2, CEACAM6, EGFR, CHN2, FGFR3, C13orf18, QPRT, AMACR1, CKMT2, ID1, SORBS1, SLC26A3 y ErbB3 y/o al menos un gen seleccionado de entre: DUSP6, VDAC2, ANXA2P2, SERPINA B1, NT5E, GPC3, DUSP4, PHLDA1, K-ras, DR5, VIL2, LAMC2, SFN, ANXA1, EPHA2, P14ARF, CA9, KRT17, p14ARF, maspina, PLAUR, LAMA3 y GCNT3, donde los genes comprenden al menos el 25 % de los genes representados en la matriz.

En algunos casos, un procedimiento de preparación de una matriz de este tipo implica inmovilizar sobre un soporte sólido una o más sondas que permitan la detección de productos de ácido nucleico de al menos dos genes seleccionados de entre: EGF, ADAM17, PTP4A3, ADAM15, QPRT, SATB2, RASSF1, VAV3, CEACAM6, EREG, AREG, TITF1, SORBS1, C13orf18, CKMT2, BTC, ATP5E, catenina B, CCNE1, EGFR, Bclx, BRCA1, CDC25B, CHN2, ID1, SLC26A3, VDAC2, SERPINA B1, PHLDA1, ANXA2P2, KRT17, EPHA2, DUSP4, CGA, CA9, maspina, NEDD8, DUSP6, GPC3, NT5E, VIL2 y P14ARF, donde los genes comprenden al menos el 25 % de los genes representados en la matriz.

Kits

Los materiales para su uso en los procedimientos de la presente invención como se divulga en las reivindicaciones 1-15 adjuntas son adecuados para la preparación de kits producidos de acuerdo con procedimientos bien conocidos. Por tanto, la divulgación proporciona kits que comprenden reactivos, que pueden incluir sondas y/o cebadores específicos de genes o selectivos de genes útiles para someter a ensayo la expresión de genes divulgados en el presente documento y para evaluar la probabilidad de respuesta al tratamiento con inhibidores del EGFR.

Por ejemplo, un kit de este tipo puede incluir una o más sondas de ácido nucleico que hibridan específicamente con productos de ácido nucleico de genes indicadores de respuesta. Un kit de este tipo puede incluir, p. ej., una o más sondas de ácido nucleico, donde cada una de las una o más sondas hibrida específicamente con un producto de un gen indicador de respuesta diferente. Por ejemplo, un kit de este tipo puede incluir sondas que hibridan específicamente con productos de ácido nucleico de genes indicadores de respuesta descritos en una o más de las tablas 1A, 1B, 2A, 2B, 6A, 6B, 7A y 7B. Como otro ejemplo, un kit de este tipo puede incluir un conjunto de dos o más sondas de ácido nucleico, donde cada sonda del conjunto hibrida con un producto de ácido nucleico de un gen indicador de respuesta diferente. Por ejemplo, un kit de este tipo puede incluir un conjunto de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más sondas de ácido nucleico, donde cada sonda del conjunto hibrida con un producto de ácido nucleico de un miembro diferente de un conjunto de genes indicadores de respuesta, donde los conjuntos ejemplares de genes indicadores de respuesta se representan en las tablas 8 y 9. Por ejemplo, un kit de este tipo puede comprender sondas que permitan la detección de los productos génicos de genes incluidos en los conjuntos de varios genes enumerados anteriormente (p. ej., los conjuntos de varios genes 1-64 y 65-167, anteriores).

En algunos casos, un kit de este tipo incluirá, además de una sonda que hibrida específicamente con un producto de ácido nucleico de un gen indicador de respuesta, una o más sondas que hibridan específicamente con un producto de un gen de referencia. Estas sondas se pueden usar en la determinación de los niveles de expresión normalizados de un gen indicador de respuesta.

Un kit de este tipo puede incluir uno o más pares de cebadores de ácido nucleico, donde los pares de cebadores, cuando se usan como cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa, amplifican un producto de ácido nucleico objetivo de un gen indicador de respuesta o una región objetivo de un producto de ácido nucleico de un gen indicador de respuesta. Un kit de este tipo puede incluir pares de cebadores para varios genes indicadores de respuesta. Por ejemplo, un kit de este tipo puede incluir pares de cebadores que permitan la amplificación de los productos génicos de genes incluidos en los conjuntos de varios genes enumerados anteriormente (p. ej., los conjuntos de varios genes 1-64 y 65-167, anteriores).

En las tablas que se proporcionan en las figuras 1 y 2 se describen secuencias ejemplares de sondas y cebadores de ácido nucleico. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que también son posibles otras secuencias de sondas y cebadores, y se obtienen fácilmente basándose en secuencias de nucleótidos conocidas de genes indicadores de respuesta y/o basándose en secuencias de nucleótidos conocidas de genes de referencia.

Un kit de este tipo puede incluir además una o más sondas de ácido nucleico que hibridan con ácidos nucleicos objetivo (p. ej., ácido nucleico de una célula cancerosa obtenida de un paciente) que pueden incluir una o más mutaciones activadoras de KRAS.

Además de los cebadores y sondas mencionados anteriormente, un kit de este tipo puede comprender reactivos para la extracción y/o el aislamiento de ARN a partir de muestras tumorales, en particular, muestras de tejido fijadas incluidas en parafina, y/o reactivos para preparar una copia de ADNc de un ARNm y/o reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos.

Se pueden diseñar cebadores y sondas basándose en secuencias conocidas de genes indicadores de respuesta y se pueden sintetizar fácilmente por técnicas ordinarias, p. ej., síntesis en fase sólida mediante la química de la fosforamidita, como se divulga en las patentes de EE. UU. N. º 4.458.066 y 4.415.732, incorporadas en el presente documento por referencia; Beaucage et al. (1992) Tetrahedron 48:2223-2311; y en el boletín de usuarios de Applied Biosystems N. º 13 (1 de abril de 1987). Otros procedimientos de síntesis química incluyen, por ejemplo, el procedimiento de fosfotriéster descrito por Narang et al., Meth. Enzymol. (1979) 68:90 y el procedimiento de fosfodiéster divulgado por Brown et al., Meth. Enzymol. (1979) 68:109. Usando estos mismos procedimientos, se pueden incorporar en las sondas extensiones de poli(A) o poli(C), u otras extensiones polinucleotídicas no complementarias. Se pueden acoplar extensiones de hexa(óxido de etileno) a las sondas por procedimientos

conocidos en la técnica. Cload et al. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113:6324-6326; en la patente de EE. UU. N. º

4.914.210 de Levenson et al.; Durand et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:6353-6359; y Horn et al. (1986) Tet. Lett. 27:4705-4708.

Una sonda o un cebador puede incluir una marca detectable. Las marcas ejemplares incluyen fluorocromos, p. ej., isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, rojo de Texas, ficoeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-2',4',7',4,7hexaclorofluoresceína (HEX), 5-carboxifluoresceína (5-FAM), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), Cy5, Cy3 y similares; y marcas radioactivas (p. ej., 32P, etc.).

Los cebadores y sondas útiles para su inclusión en un kit de este tipo incluyen aquellos útiles en diversos sistemas de amplificación y/o detección. Los sistemas de amplificación y/o detección ejemplares incluyen los sistemas basados en cebadores Sunrise™, Molecular Beacons, el sistema Taqman™, un sistema basado en cebadores de horquilla Amplifluor™, una tecnología Scorpions (p. ej., moléculas bifuncionales que contienen un elemento cebador de PCR unido covalentemente a un elemento de sonda) y un sistema Light Upon Extension o basado en LUX™. Otros sistemas de detección ejemplares incluyen los basados en un análisis de curva de fusión, y el uso de tintes intercalantes tales como el tinte fluorescente verde SYBR.

Opcionalmente, los kits pueden comprender reactivo(s) con una descripción identificativa o etiquetas o instrucciones relativas a su uso en los procedimientos de la presente invención. Los kits pueden comprender recipientes (incluidas placas de microvaloración adecuadas para su uso en una implementación automatizada del procedimiento), cada uno con uno o más de los diversos reactivos (típicamente en forma concentrada) utilizados en los procedimientos de la invención, incluidos, por ejemplo, micromatrices prefabricadas, tampones, los nucleótidos trifosfato apropiados (p. ej., dATP, dCTP, dGTP y dTTP; o rATP, rCTP, rGTP y UTP), transcriptasa inversa, polimerasa de ADN, polimerasa de ARN y uno o más cebadores y sondas de la presente invención (p. ej., cebadores poli(T) o aleatorios de longitud apropiada enlazados a un promotor que reacciona con la polimerasa de ARN). En un kit de este tipo también se pueden incluir instrucciones para el uso de algoritmos matemáticos usados para evaluar la probabilidad de respuesta del paciente al inhibidores del EGFR.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se proponen con el fin de proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y una descripción completas de cómo fabricar y usar la presente invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni se pretende que representen que los experimentos que figuran a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (p. ej., cantidades, temperaturas, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores experimentales y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es la atmosférica o cercana a ella. Se pueden usar abreviaturas ordinarias, p. ej., pb, par(es) de bases; kb, kilobase(s); pl, picolitro(s); s, segundo(s); min, minuto(s); h, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, kilobase(s); pb, par(es) de bases; nt, nucleótido(s); i.m., (por vía) intramuscular; i.p., (por vía) intraperitoneal s.c., (por vía) subcutánea; y similares.

Ejemplo 1: identificación de marcadores de respuesta a un inhibidor del EGFR en pacientes con cáncer

Se identificaron productos génicos que podían servir como predictores de la respuesta a un inhibidor del EGFR ("genes indicadores de respuesta") mediante el análisis de niveles normalizados de productos génicos de tumores obtenidos de pacientes que se habían sometido a tratamiento con cetuximab para el cáncer de colon. Se midieron los niveles de expresión de los productos génicos; y se determinaron los niveles normalizados con relación a los niveles de expresión de uno o más genes de referencia.

La identificación de un producto de un gen indicador de respuesta se llevó a mediante el análisis de los niveles de expresión del gen en células cancerosas de una serie de pacientes para los que se aplicaron los siguientes criterios: 1) los pacientes tenían cáncer y se les trató el cáncer con un inhibidor del EGFR ; y 2) se documentó el resultado del tratamiento, es decir, se documentó la respuesta del paciente al tratamiento.

Se analizó ácido nucleico de células cancerosas de los pacientes para medir el nivel de expresión de un(os) gen(es) de prueba y un(os) gen(es) de referencia. Después, se normalizó el nivel de expresión del/de los gen(es) de prueba con el nivel de expresión del/de los gen(es) de referencia, generando de este modo un nivel de expresión normalizado (un "valor de expresión normalizado") del gen de prueba. La normalización se llevó a cabo para corregir la variación del nivel absoluto de producto génico en una célula cancerosa.

Por último, se realizaron correlaciones estadísticas entre los valores de expresión normalizados de cada gen y una o más medidas de la respuesta clínica después del tratamiento inhibidor del EGFR que reflejan una probabilidad de respuesta al tratamiento con un inhibidor del EGFR. Dirigidos por este análisis multivariable, se usaron procedimientos estadísticos para construir modelos de varios genes que predicen la probabilidad de respuesta al inhibidor del EGFR. El modelo es un algoritmo (o ecuación) que se puede usar para producir una puntuación de recidivas o una puntuación de respuesta al tratamiento para un paciente individual que están estrechamente correlacionadas con la probabilidad de respuesta a un inhibidor del EGFR en el conjunto de muestras utilizadas para el análisis.

5 El algoritmo final puede utilizar diversas manipulaciones de los valores de expresión normalizados tales como aplicar umbrales al valor de expresión (asignación de valores máximos/mínimos a genes en particular), agrupar genes, tomar el valor promedio de los genes de un grupo o ponderar los genes de un grupo, ponderar el grupo en conjunto

o alguna combinación de los anteriores.

10 Criterios de inclusión y exclusión

Criterios de inclusión

1) Tejido de pacientes que dieron su consentimiento para participar en uno de los siguientes estudios: a) protocolo

15 clínico CA225045: "An Exploratory Pharmacogenomic Study of Erbitux Monotherapy in Patients with Metastatic Colorectal Carcinoma" (Khambata-Ford et al. (2007) 25: 3230-3237); b) IMCL CP02-0141: "Phase II Study of an Anti-Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Antibody, Cetuximab, in Patients with Irinotecan-Refractory, Stage IV Colorectal Carcinoma" (Saltz et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22: 1201-1208); c) IMCL CP02-0144: "A Phase II Multicenter Study of Erbitux (Cetuximab) in Patients with Metastatic Colorectal Carcinoma" (Lenz et al. (2006) J. Clin.

20 Oncol. 24: 4914-4921);

2) Tejido adecuado del sitio primario y/o metastásico, definido como un mínimo de tres secciones de 5 micrómetros sobre portaobjetos sin teñir.

25 Criterios de exclusión

a) Tumor en bloque insuficiente, evaluado mediante el estudio de portaobjetos H-E (<5 % del tejido total sobre el portaobjetos)

30 b) Se desconocen los datos de respuesta a inhibidores del EGFR del estudio clínico

c) Rendimiento insuficiente de ARN total (<400 ng) extraído de las secciones disponibles

Sondas y cebadores

35 Se sometieron a prueba un total de 65 amplicones que representaban genes relacionados con el cáncer, genes de referencia y ensayos de mutaciones de KRAS. Las secuencias de los cebadores y sondas usados para someter a ensayo cada amplicón se proporcionan en la tabla representada en la figura 1; y las secuencias de los amplicones resultantes se proporcionan en la tabla representada en la figura 2.

Identificación de genes que son indicadores de respuesta al tratamiento inhibidor del EGFR

Se recogieron una serie de muestras tumorales, p. ej., de pacientes incluidos en ensayos clínicos o estudios de casos donde estuviera disponible una respuesta clínica de curación buena.

45 Se tiñó con hematoxilina y eosina (H-E) una sección fina de cada muestra tumoral. Se usó el portaobjetos teñido para evaluar la cantidad de tumor presente. Si la cantidad de tumor era baja, entonces se llevaba a cabo una macrodisección usando el portaobjetos H-E como molde. También se usó la sección H-E para confirmar el diagnóstico del médico.

50 Se extrajo ARN de secciones finas del tumor adicionales.

Se llevaron a cabo las etapas de control de calidad (QC) para confirmar el ARN adecuado y para confirmar la ausencia de ADN contaminante.

55 Se sometió a ensayo un valor de expresión para cada gen de prueba (y de referencia) usando sondas y cebadores específicos de genes en una PCR de transcripción inversa cuantitativa. (p. ej., TaqMan®), dando lugar a valores de expresión (Ct) en bruto.

60 Se normalizaron los datos de Ct en bruto usando, p. ej., un conjunto de 5 genes de referencia, dando lugar a valor de expresión normalizados (Ct normalizados).

Se realizaron correlaciones estadísticas entre los valores de expresión normalizados de cada gen y una o más medidas de la respuesta clínica que reflejan la probabilidad de recidiva (análisis univariable) o la probabilidad de 65 respuesta al inhibidor del EGFR.

Dirigidos por los resultados del análisis univariable, se usaron procedimientos estadísticos para construir modelos de varios genes que predicen la probabilidad de respuesta al inhibidor del EGFR. El modelo es un algoritmo (o ecuación) que se puede usar para producir una puntuación de recidivas o una puntuación de respuesta al tratamiento para un paciente individual que están estrechamente correlacionadas con la probabilidad de respuesta a un inhibidor del EGFR en el conjunto de muestras utilizadas para el análisis.

Procedimientos estadísticos

Normalización de referencia

Para la normalización de efectos extraños, se normalizaron las medidas de umbral de ciclo (CT) obtenidas por RT-PCR con relación a la expresión medias de un conjunto de cinco genes de referencia: ATP5E, PGK1, UBB, VDAC2 y GPX1. En general, un aumento de una unidad de las medida de expresión génica normalizadas se refleja en un aumento del doble de la cantidad de ARN.

Análisis univariable

Para cada uno de los genes en estudio, se usaron modelos de regresión logística univariable (SAS versión 9.1.3) para examinar la relación entre la expresión génica y la tasa de respuesta global (TRG). Para cada modelo de regresión logística, se generó un valor de p bajo la prueba del cociente de verosimilitud de la hipótesis de que el cociente de probabilidades es significativamente distinto de uno. También se calculó la tasa de descubrimiento falso (FDR) mínima a la que se podría rechazar cada hipótesis nula usando el procedimiento de Benjamini y Hochberg (Benjamini, Y. y Hochberg, Y. (1995) J.R. Statist. Soc. B57:289) como un ajuste estadístico conservador de la multiplicidad. Se repitieron todos los análisis para el criterio de valoración alternativo: enfermedad estable (EE). Para examinar la relación entre la expresión génica y la supervivencia sin progresión (SSP), se usaron modelos de regresión de Cox univariable (SAS versión 9.1.3). Al examinar estas relaciones, se trataron los niveles de expresión génica como variables continuas. Se definió la SSP como el tiempo desde la entrada en el estudio hasta la fecha de la primera prueba de progresión para pacientes con enfermedades progresivas documentadas, o la fecha de la muerte para pacientes que murieron en un plazo de 90 días desde la última evaluación del tumor sin progresión documentada. Aquellos que no progresaron o que murieron se censaron en la fecha de la última evaluación del tumor. Todas las pruebas de hipótesis se registraron usando valores de p bilaterales y se consideraron estadísticamente significativos los valores de p sin ajustar de < 0,05.

Obtención de gráficas de la probabilidad predicha

Otra medida útil de la magnitud del efecto la proporcionan las gráficas de las probabilidades de control de la enfermedad predichas, estimadas usando modelos de regresión logística, como función de las medidas de expresión génica. Como ejemplos, las figuras 3A-10D muestran gráficas de la probabilidad de control de la enfermedad predicha (en el eje y) por expresión génica normalizada en unidades de CT (en el eje x).

Análisis multivariable

Debido a que el estado de mutación de KRAS está fuertemente asociado con la TRG, se optó por construir modelos de varios genes de dos maneras 1) utilizando todos los pacientes en la construcción del modelo pero incluyendo términos de interacción entre el estado de mutación de KRAS y la expresión génica individual y 2) usando el subconjunto de pacientes de referencia (n=144) para identificar genes más allá del estado de mutación de KRAS que serían predictivos de la respuesta al tratamiento con cetuximab. En la primera situación, se capturó cómo modifica el estado de mutación de KRAS la relación de la expresión génica y el resultado mediante la inclusión de todos los términos de interacción unilateral posibles entre cada gen individual y el estado de mutación de KRAS. Se siguió un enfoque supervisado usando únicamente un subconjunto de genes que se identificaron como significativamente asociados con resultados basados en análisis univariable en todos los pacientes para la situación

1. Análogamente, se utilizó un enfoque supervisado usando únicamente un subconjunto de genes que se identificaron como significativamente asociados con resultados basados en análisis univariable en el subconjunto de pacientes de referencia para la situación 2. Para construir estos modelos, se realizó una validación cruzada 5 veces de dos capas por separado para las situaciones 1 y 2 como sigue:

Obtención de modelos multivariable

La obtención de modelos multivariable se llevó a cabo de acuerdo con las siguientes etapas:

1) Se repartieron los datos aleatoriamente en 5 subconjuntos iguales A-E (capa externa).

2) Se agruparon los datos de 4 subconjuntos de la capa externa (subconjuntos B-E en el ejemplo siguiente) y se repartieron estos datos en 5 subconjuntos iguales a1-e1 (capa interna), reservando un subconjunto de la capa externa (subconjunto A en el ejemplo siguiente).

3) Para cada uno de los 5 subconjuntos de la capa interna, se realizó la validación cruzada de modelos de regresión logística por pasos hacia delante, en la que el número máximo de genes permitidos en el modelo final es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 genes. La validación cruzada se realiza como sigue (usando el ejemplo siguiente):

5 a. Conjunto de entrenamiento (a1-d1) Conjunto de prueba (e1)

b. Conjunto de entrenamiento(b1-e1) Conjunto de prueba (a1)

c. Conjunto de entrenamiento(c1-a1) Conjunto de prueba (b1) 10

d.

Conjunto de entrenamiento(d1-b1) Conjunto de prueba (c1)

e.

Conjunto de entrenamiento(e1-c1) Conjunto de prueba (d1)

15 4) Esto dio lugar a 5 modelos con 1 gen, 5 modelos con 2 genes, etc.

5) A partir de cada uno de estos modelos, se obtuvo la siguiente medida del comportamiento del modelo del conjunto de prueba: ABC (área bajo la curva de eficacia diagnóstica - usada para evaluar la sensibilidad y la especificidad combinadas del modelo).

20 6) Se obtuvo la mediana del ABC de los conjuntos de prueba de los 5 modelos para cada uno de los modelos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

7) Con la clasificación en orden ascendente por el número de genes del modelo, se escogió la primera mediana del 25 ABC máxima para identificar el número óptimo de genes del modelo.

8) Con el uso del número óptimo de genes identificado por medio de la capa interna, se realizó la regresión logística por pasos hacia delante en la totalidad de la capa interna (a1-e1), fijando el número de genes del modelo final en el número óptimo de genes identificado en la etapa 7. 8a) Con el uso del modelo estimado a partir de la capa interna

30 completa, se sometió a prueba el modelo en la capa externa reservada (subconjunto A en el ejemplo siguiente). 8b) Se obtuvieron las siguientes medidas de comportamiento del modelo: ABC, sensibilidad y especificidad.

Reparto N. º 1

35 Capa externa (n=114 muestras)

Capa interna (n=116 muestras)

9) Este procedimiento se repitió 4 veces más, reservando los subconjuntos B, C, D y E de la capa externa de manera análoga. Este procedimiento de 2 capas dio lugar a 5 modelos que se probaron en la capa externa con el 45 reparto aleatorio inicial de los datos. Cada uno de los 5 modelos tenía un número de genes diferente y diferentes genes con diferentes coeficientes.

El enfoque entero descrito en las etapas 1-9 se repitió cincuenta veces con diferentes repartos aleatorios de los datos de la capa externa. Esto dio lugar a 250 modelos. Los modelos obtenidos para cada uno de los cuatro análisis 50 se muestran en la tabla 3 (todos los pacientes, TRG), en la tabla 4 (todos los pacientes, CE), en la tabla 7 (pacientes negativos para KRAS, TRG) y en la tabla 9 (pacientes negativos para KRAS, CE).

Ejemplo 2: identificación de marcadores génicos de respuesta a un inhibidor del EGFR en pacientes con cáncer de colon (criterio de valoración TRG)

55 Las tablas 1A y 1B muestran genes cuya expresión normalizada se correlaciona (análisis univariable) positivamente (tabla 1A) o negativamente (tabla 1B) con la tasa de respuesta global (TRG) en pacientes con cáncer de colon tratados con cetuximab. Las figuras 3A-3D muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la tabla 1A; las figuras 4A-4F muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la

60 tabla 1B.

Tabla 1A:

Gen

N Cociente de verosimilitud Chi-cuadrado Cociente de verosimilitud Valor de p Cociente de probabilidades IC de Wald del 95 % para la RG

SATB2

226 18,9637 <0,0001 2,9534 (1,68,5,20)

PTP4A3

225 26,0286 <0,0001 2,8221 (1,84,4,33)

QPRT

226 23,0849 <0,0001 2,7047 (1,62,4,52)

VAV3

226 20,3475 <0,0001 2,4744 (1,58,3,88)

CEACAM6

226 9,733 0,0018 2,3749 (1,33,4,26)

EREG

226 24,8105 <0,0001 2,0472 (1,48,2,82)

ErbB3

226 4,5578 0,0328 2,0275 (1,04,3,97)

EGFR

226 7,5416 0,006 2,015 (1,20,3,38)

AREG

226 20,3261 <0,0001 2,0087 (1,44,2,81)

BRCA1

226 5,1436 0,0233 1.955 (1,08,3,55)

TITF1

226 9,245 0,0024 1,8605 (1,25,2,76)

SORBS1

226 7,7284 0,0054 1,7668 (1,17,2,66)

CHN2

226 7,7635 0,0053 1,5934 (1,15,2,21)

C13orf18

226 7,664 0,0056 1,5249 (1,11,2,10)

CKMT2

226 7,8393 0,0051 1,4147 (1,11,1,80)

SLC26A3

226 7,4754 0,0063 1,304 (1,07,1,58)

Tabla 1B:

Gen

N Cociente de verosimilitud Chi-cuadrado Cociente de verosimilitud Valor de p Cociente de probabilidades IC de Wald del 95 % para la RG

VDAC2

226 8,5381 0,0035 0,2000 (0,06,0,62)

SERPINA B1

226 19,1870 <0,0001 0,2276 (0,11,0,48)

PHLDA1

226 29,6796 <0,0001 0,2467 (0,14,0,44)

K-ras

226 10,8371 0,0010 0,2577 (0,11,0,60)

ANXA2P2

226 13,9775 0,0002 0,2578 (0,12,0,55)

GPC3

226 4,7438 0,0294 0,2591 (0,06,1,17)

DUSP6

226 12,2004 0,0005 0,3275 (0,17,0,63)

KRT17

226 18,7538 <0,0001 0,4037 (0,24,0,67)

DUSP4

226 18,6992 <0,0001 0,4284 (0,28,0,66)

EPHA2

226 10,3795 0,0013 0,4435 (0,26,0,75)

DR5

226 6,1028 0,0135 0,4919 (0,28,0,88)

PLAUR

226 4,7090 0,0300 0,5990 (0,38,0,96)

LAMA3

226 6,8684 0,0088 0,6103 (0,42,0,89)

LAMC2

226 5,3802 0,0204 0,6338 (0,43,0,94)

ANXA1

226 3,8575 0,0495 0,6395 (0,41,1,01)

CA9

226 8,3394 0,0039 0,6671 (0,49,0,90)

maspina

226 6,9632 0,0083 0,6891 (0,52,0,92)

GCNT3

226 4,0035 0,0454 0,7833 (0,62,1,00)

Ejemplo 3: identificación de marcadores génicos de respuesta a un inhibidor del EGFR en pacientes con cáncer de colon (criterio de valoración CE)

Las tablas 2A y 2B muestran genes cuya expresión normalizada se correlaciona (análisis univariable) positivamente (tabla 2A) o negativamente (tabla 2B) con la tasa de control de la enfermedad en pacientes con cáncer de colon tratados con cetuximab. Las figuras 5A-5E muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la tabla 2A; las figuras 6A-6F muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la tabla 2B.

Tabla 2A:

Gen

N Cociente de verosimilitud Chi-cuadrado Cociente de verosimilitud Valor de p Cociente de probabilidades IC de Wald del 95 % para la RG

ATP5E

226 6,8380 0,0089 2,6122 (1,25,5,46)

TITF1

226 14,1821 0,0002 2,6063 (1,33,5,11)

CLTC

226 3,9206 0,0477 2,2407 (1,00,5,04)

BRCA1

226 13,3432 0,0003 2,1392 (1,39,3,29)

AREG

226 38,6000 <0,0001 1,9568 (1,55,2,48)

PTP4A3

225 18,2969 <0,0001 1,8994 (1,39,2,60)

EREG

226 43,3856 <0,0001 1,8979 (1,54,2,34)

VAV3

226 25,3219 <0,0001 1,8784 (1,43,2,46)

SATB2

226 18,0834 <0,0001 1,8534 (1,36,2,53)

CEACAM6

226 10,7223 0,0011 1,8100 (1,24,2,63)

EGFR

226 7,9284 0,0049 1,7682 (1,16,2,69)

CHN2

226 9,2413 0,0024 1,4595 (1,14,1,87)

EGFR3

226 4,8531 0,0276 1,4321 (1,03,1,98)

C13orf18

226 12,3329 0,0004 1,4219 (1,16,1,75)

QPRT

226 11,3648 0,0007 1,4045 (1,14,1,73)

AMACR1

226 7,3968 0,0065 1,3774 (1,09,1,75)

CKMT2

226 10,4841 0,0012 1,3646 (1,12,1,66)

ID1

226 6,6866 0,0097 1,3422 (1,07,1,69)

SORBS1

226 4,0375 0,0445 1,3366 (1,00,1,78)

SLC26A3

226 12,3503 0,0004 1,2744 (1,11,1,46)

Tabla 2B:

Gen

N Cociente de verosimilitud Chi-cuadrado Cociente de verosimilitud Valor de p Cociente de probabilidades IC de Wald del 95 % para la RG

DUSP6

226 28,9122 <0,0001 0,2867 (0,18,0,47)

VDAC2

226 8,8433 0,0029 0,3326 (0,16,0,70)

ANXA2P2

226 15,7199 0,0001 0,3762 (0,23,0,63)

SERPINA B1

226 17,4287 <0,0001 0,4071 (0,26,0,64)

NT5E

226 25,7449 <0,0001 0,4798 (0,35,0,65)

GPC3

226 5,5891 0,0181 0,4926 (0,25,0,96)

DUSP4

226 25,0584 <0,0001 0,5403 (0,42,0,70)

PHLDA1

226 14,7168 0,0001 0,5431 (0,39,0,75)

Tabla 2B:

Gen

N Cociente de verosimilitud Chi-cuadrado Cociente de verosimilitud Valor de p Cociente de probabilidades IC de Wald del 95 % para la RG

K-ras

226 4,7480 0,0293 0,5510 (0,32,0,95)

DR5

226 8,2890 0,0040 0,5640 (0,38,0,84)

VIL2

226 5,4978 0,0190 0,5898 (0,38,0,93)

LAMC2

226 11,8210 0,0006 0,6184 (0,46,0,82)

SFN

226 7,5520 0,0060 0,6232 (0,44,0,88)

ANXAI

226 7,5088 0,0061 0,6433 (0,46,0,89)

EPHA2

226 6,0724 0,0137 0,6641 (0,48,0,93)

P14ARF

226 7,2707 0,0070 0,6889 (0,52,0,92)

CA9

226 11,8606 0,0006 0,7375 (0,62,0,88)

KRT17

226 8,3190 0,0039 0,7385 (0,60,0,92)

p14ARF

226 3,9325 0,0474 0,7580 (0,57,1,00)

maspina

226 7,9126 0,0049 0,7589 (0,62,0,92)

Ejemplo 4 - modelos de varios genes de respuesta a un inhibidor del EGFR en pacientes con cáncer de colon (criterio de valoración TRG)

5 La tabla 3 presenta una tabla que muestra genes y combinaciones de genes cuyos niveles de expresión se pueden combinar en modelos de varios genes que se correlacionan significativamente con la tasa de respuesta global en pacientes con cáncer de colon tratados con cetuximab. Nota: "aregereg" es el promedio del valor de AREG normalizado y el valor de EREG normalizado. Nota: "MutInd" es la variable de indicador de estado de mutación de K-Ras que se incluye como variable de interacción con cada gen.

Tabla 3 (TRG) Genes N. º de modelos % de modelos Media ABC DE ABC Mediana ABC

Modelos de 1 gen

PTP4A3 18 64 % 0,71 0,11 0,74

PHLDA1 6 21 % 0,71 0,06 0,73

Aregereg 2 7 % 0,67 0,05 0,67

EREG 2 8 % 0,81 0,07 0,81

Total 28 11 % 0,72 0,07 0,74

Modelos de 2 genes

PHLDA1 PTP4A3 64 52 % 0,82 0,08 0,83

PHLDA1 aregereg 31 25 % 0,86 0,05 0,85

EREG PHLDA1 18 15 % 0,83 0,06 0,84

AREG PHLDA1 2 2 % 0,84 0,10 0,84

CHN2 PTP4A3 2 2 % 0,69 0,02 0,69

PTP4A3 SATB2 2 2 % 0,66 0,03 0,66

EPHA2 aregereg 1 1 % 0,76 . 0,76

EREG PTP4A3 1 1 % 0,70 . 0,70

PTP4A3 SLC26A3 1 1 % 0,74 . 0,74

Total 122 49 % 0,77 0,06 0,77

Modelos de 3 genes

Tabla 3 (TRG) Genes N. º de modelos % de modelos Media ABC DE ABC Mediana ABC

PHLDA1 PTP4A3 aregereg 10 19 % 0,87 0,04 0,89

EGFR PHLDA1 PTP4A3 5 9 % 0,83 0,06 0,85

PHLDA1 PTP4A3 SATB2 5 9 % 0,76 0,03 0,77

AREG PHLDA1 PTP4A3 3 6 % 0,91 0,04 0,89

EGFR PHLDA1 aregereg 3 6 % 0,81 0,11 0,87

EREG KRT17 PHLDA1 3 6 % 0,81 0,08 0,79

EREG PHLDA1 PTP4A3 3 6 % 0,86 0,04 0,88

EREG PHLDA1 SATB2 3 6 % 0,79 0,09 0,82

EREG PHLDA1 SORBS1 3 6 % 0,82 0,02 0,81

KRT17 PHLDA1 aregereg 3 6 % 0,82 0,05 0,79

MutInd_PTP4A3 PHLDA1 PTP4A3 2 4 % 0,78 0,02 0,78

PHLDA1 SATB2 aregereg 2 4 % 0,75 0,00 0,75

AREG CEACAM6 PHLDA1 1 2 % 0,74 . 0,74

AREG EGFR PHLDA1 1 2 % 0,79 . 0,79

DUSP6 PTP4A3 SORBS1 1 2 % 0,52 . 0,52

EGFR EPHA2 PTP4A3 1 2 % 0,76 . 0,76

EGFR EREG PHLDA1 1 2 % 0,86 . 0,86

EREG KRT17 PTP4A3 1 2 % 0,81 . 0,81

MutInd_DUSP6 MutInd_EGFR PTP4A3 1 2 % 0,79 . 0,79

PHLDA1 PTP4A3 SORBS1 1 2 % 0,82 . 0,82

Total 53 21 % 0,80 0,05 0,80

Modelos de 4 genes

AREG EGFR PHLDA1 PTP4A3 3 13 % 0,87 0,02 0,88

AREG MutInd_PTP4A3 PHLDA1 PTP4A3 3 13 % 0,74 0,01 0,74

PHLDA1 PTP4A3 SATB2 aregereg 3 13 % 0,81 0,12 0,84

PHLDA1 PTP4A3 SORBS1 aregereg 3 13 % 0,79 0,07 0,79

KRT17 PHLDA1 SORBS1 aregereg 2 8 % 0,82 0,05 0,82

CEACAM6 PHLDA1 PTP4A3 aregereg 1 4% 0,74 . 0,74

EGFR EPHA2 PHLDA1 aregereg 1 4 % 0,73 . 0,73

EGFR EREG KRT17 PHLDA1 1 4 % 0,76 . 0,76

EGFR EREG PHLDA1 PTP4A3 1 4 % 0,82 . 0,82

EGFR KRT17 PHLDA1 PTP4A3 1 4 % 0,73 . 0,73

EPHA2 PHLDA1 PTP4A3 aregereg 1 4 % 0,69 . 0,69

EREG KRT17 PHLDA1 SORBS1 1 4 % 0,79 . 0,79

EREG PHLDA1 PLAUR SATB2 1 4 % 0,74 . 0,74

KRT17 MutInd_PTP4A3 PHLDA1 aregereg 1 4 % 0,75 . 0,75

KRT17 PHLDA1 PTP4A3 SATB2 1 4 % 0,83 . 0,83

Total 24 10 % 0,77 0,06 0,78

Modelos de 5 genes

CEACAM6 KRT17 PHLDA1 SORBS1 aregereg 2 13 % 0,84 0,10 0,84

Tabla 3 (TRG) Genes N. º de modelos % de modelos Media ABC DE ABC Mediana ABC

PHLDA1 PTP4A3 SATB2 SORBS1 aregereg 2 13 % 0,86 0,04 0,86

AREG EGFR EPHA2 PHLDA1 PTP4A3 1 7 % 0,89 . 0,89

CEACAM6 EGFR KRT17 PHLDA1 aregereg 1 7 % 0,80 . 0,80

CEACAM6 KRT17 PHLDA1 PTP4A3 1 7 % 0,81 . 0,81

SORBS1 EGFR EPHA2 EREG PHLDA1 SATB2 1 7 % 0,73 . 0,73

EGFR EREG KRT17 PHLDA1 SATB2 1 7 % 0,81 . 0,81

EGFR EREG KRT17 PHLDA1 SORBS1 1 7 % 0,77 . 0,77

EGFR KRT17 PHLDA1 PTP4A3 aregereg 1 7 % 0,79 . 0,79

EGFR KRT17 PHLDA1 PTP4A3 SATB2 1 7 % 0,71 . 0,71

EGFR PHLDA1 PTP4A3 SORBS1 aregereg 1 7 % 0,83 . 0,83

EREG PHLDA1 QPRT SATB2 SORBS1 1 7 % 0,57 . 0,57

KRT17 PHLDA1 SORBS1 aregereg mutant_ind 1 7 % 0,75 . 0,75

Total 15 6 % 0,78 0,07 0,78

Modelos de 6 genes

AREG EGFR EPHA2 LAMA3 PHLDA1 PTP4A3 1 20 % 0,88 . 0,88

AREG EGFR KRT17 PHLDA1 PTP4A3 SORBS1 1 20 % 0,85 . 0,85

EGFR EPHA2 EREG PHLDA1 PLAUR SATB2 1 20 % 0,72 . 0,72

KRT17 MutInd_DUSP6 MutInd_EGFR PTP4A3 SORBS1 aregereg 1 20 % 0,92 . 0,92

KRT17 MutInd_PTP4A3 PHLDA1 PTP4A3 SORBS1 aregereg 1 20 % 0,77 . 0,77

Total 5 2 % 0,83 . 0,83

Ejemplo 5 - modelos de varios genes de respuesta a un inhibidor del EGFR en pacientes con cáncer de colon (criterio de valoración CE)

5 La tabla 4 presenta una tabla que muestra genes y combinaciones de genes cuyos niveles de expresión se pueden combinar en modelos de varios genes que se correlacionan significativamente con la tasa de control de la enfermedad en pacientes con cáncer de colon tratados con cetuximab. Nota: "aregereg" es el promedio del valor de AREG normalizado y el valor de EREG normalizado. Nota: "MutInd" es la variable de indicador de estado de mutación de K-Ras que se incluye como variable de interacción con cada gen.

Tabla 4 (CE) Genes N. º de modelos % de modelos Media ABC DE ABC Mediana ABC

Modelos de 1 gen

aregereg 22 65 % 0,70 0,06 0,71

EREG 12 35 % 0,72 0,05 0,72

Total 34 14 % 0,71 0,05 0,71

Modelos de 2 genes

MutInd_EREG aregereg 73 61 % 0,78 0,07 0,80

EREG_MutInd_EREG 28 24 % 0,78 0,06 0,80

DUSP6 aregereg 4 3 % 0,73 0,03 0,73

DUSP6 EREGjh 3 3 % 0,75 0,08 0,71

MutInd_EPHA2 aregereg 3 3 % 0,78 0,05 0,75

Tabla 4 (CE) Genes N. º de modelos % de modelos Media ABC DE ABC Mediana ABC

EREG MutInd_EPHA2 2 2 % 0,76 0,07 0,76

EPHA2 aregereg 1 1 % 0,84 . 0,84

EREG MutInd_EGFR 1 1 % 0,73 . 0,73

EREG MutInd_SLC26A3 1 1 % 0,73 . 0,73

MutInd_EGFR aregereg 1 1 % 0,91 . 0,91

MutInd_SFN aregereg 1 1 % 0,79 . 0,79

MutInd_SLC26A3 aregereg 1 1 % 0,80 . 0,80

Total 119 48 % 0,78 0,06 0,78

Modelos de 3 genes

DUSP6 MutInd_EREG aregereg 27 42 % 0,79 0,06 0,80

MutInd_EREG VIL2 aregereg 7 11 % 0,80 0,02 0,81

DUSP6 EREG MutInd_EREG 6 9 % 0,81 0,05 0,78

EPHA2 MutInd_EREG aregereg 5 8 % 0,79 0,09 0,77

EREG MutInd_EREG MutInd_ID1 4 6 % 0,80 0,05 0,81

EPHA2 EREG MutInd_EREG 2 3 % 0,73 0,01 0,73

DR5 MutInd_EREG aregereg 1 2 % 0,71 . 0,71

DUSP4 MutInd_EREG aregereg 1 2 % 0,83 . 0,83

DUSP6 MutInd_SORBS1 aregereg 1 2 % 0,82 . 0,82

EREG MutInd_AMACR1 MutInd_EREG 1 2 % 0,71 . 0,71

EREG MutInd_BRCA1 MutInd_EREG 1 2 % 0,74 . 0,74

EREG MutInd_EREG MutInd_GPC3 1 2 % 0,63 . 0,63

EREG MutInd_EREG MutInd_PHLDA1 1 2 % 0,71 . 0,71

EREG MutInd_EREG MutInd_SERPINA B1 1 2 % 0,77 . 0,77

EREG MutInd_EREG SFN 1 2 % 0,78 . 0,78

EREG MutInd_EREG VIL2 1 2 % 0,76 . 0,76

MutInd_AMACR1 MutInd_EREG aregereg 1 2 % 0,69 . 0,69

MutInd_EREG MutInd_ID1 aregereg 1 2 % 0,74 . 0,74

MutInd_EREG NT5E aregereg 1 2 % 0,70 . 0,70

Total 64 26 % 0,75 0,05 0,75

Modelos de 4 genes

DUSP6 MutInd_EREG MutInd_ID1 5 18 % 0,78 0,09 0,79

MutInd_EREG MutInd_ID1 VIL2 aregereg 3 11 % 0,82 0,02 0,82

DUSP6 MutInd_AMACR1 MutInd_EREG 2 7 % 0,87 0,04 0,87

DUSP6 MutInd_EREG MutInd_FGFR3 2 7 % 0,76 0,01 0,76

DUSP6 MutInd_EREG MutInd_SERPINA B1 2 7 % 0,76 0,03 0,76

MutInd_EREG MutInd_SERPINA B1 VIL2 2 7 % 0,84 0,07 0,84

CA9 DUSP6 MutInd_EREG aregereg 1 4 % 0,86 . 0,86

DUSP6 EPHA2 NT5E aregereg 1 4 % 0,69 . 0,69

DUSP6 EREG ID1 MutInd_EREG 1 4 % 0,83 . 0,83

DUSP6 EREG MutInd_AMACR1 1 4 % 0,86 . 0,86

Tabla 4 (CE) Genes N. º de modelos % de modelos Media ABC DE ABC Mediana ABC

DUSP6 EREG MutInd_EREG 1 4 % 0,82 . 0,82

DUSP6 EREG MutInd_EREG 1 4 % 0,83 . 0,83

DUSP6 EREG MutInd_EREG 1 4 % 0,76 . 0,76

DUSP6 MutInd_EREG MutInd_LAMC2 1 4 % 0,70 . 0,70

DUSP6 MutInd_EREG MutInd_maspina 1 4 % 0,69 . 0,69

DUSP6 MutInd_EREG VIL2 aregereg 1 4 % 0,78 . 0,78

EPHA2 MutInd_EREG MutInd_GPC3 1 4 % 0,72 . 0,72

EPHA2 MutInd_EREG MutInd_ID1 1 4 % 0,74 . 0,74

Total 28 11 % 0,78 0,04 0,78

Modelos de 5 genes

AMACR1 DUSP6 MutInd_EREG 1 33 % 0,89 . 0,89

CA9 DUSP6 MutInd_EREG 1 33 % 0,82 . 0,82

DUSP6 MutInd_EGFR MutInd_EREG 1 33 % 0,79 . 0,79

Total 3 1 % 0,83 . 0,83

Modelos de 6 genes

AMACR1 DUSP6 EREG MutInd_EREG 1 50 % 0,67 . 0,67

DUSP6 EREG MutInd_EREG 1 50 % 0,66 . 0,66

Total 2 1 % 0,66 0,66

Ejemplo 6 - determinación del estado de mutación de KRAS

Se estimó una probabilidad de cada variante de SNP de K-Ras para cada muestra usando un modelo logístico. El

5 modelo se diseñó usando muestras de un conjunto externo de datos de entrenamiento en el que se conocía el estado de mutación de KRAS de cada muestra. Después, se aplicó el modelo al conjunto de datos de colon con cetuximab. Cuando la probabilidad predicha de una mutación era mayor de 0,5, se clasificaba la muestra como positiva para la mutación de la variante de mutación de KRAS en particular. En general, se observaron mutaciones de KRAS en 82 de los 226 casos del estudio (36,3 %).

10 La tabla 5 presenta una tabla que representa mutaciones activadoras de KRAS. Los tumores que dieron resultados positivos en las pruebas para una o más de estas mutaciones se clasificaron como positivos para KRAS y todos los demás tumores se clasificaron como negativos para KRAS.

Tabla 5 - Mutaciones activadoras de KRAS sometidas a prueba

Nombre

Exón Posición en NM_033360 Codón de KRAS Codón natural Acontecimiento Codón mutante

snp1

2 216 12 GGT G->T GTT

snp2

2 216 12 GGT G->A GAT

snp3

1 219 13 GGC G->A GAC

snp4

2 215 12 GGT G->A AGT

snp5

2 215 12 GGT G->T TGT

snp6

2 215 12 GGT G->C CGT

snp7

2 216 12 GGT G->C GCT

Ejemplo 7 - identificación de marcadores génicos de respuesta a un inhibidor del EGFR en pacientes con cáncer de colon negativo para KRAS (criterio de valoración TRG)

Las tablas 6A y 6B presentan tablas que muestran genes para los que la expresión normalizada se correlaciona 20 (análisis univariable) positivamente (tabla 6A) o negativamente (tabla 6B) con la tasa de respuesta global (TRG) en pacientes con cáncer de colon negativo para KRAS tratados con cetuximab. Las figuras 7A-7C muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la tabla 6A; las figuras 8A-8C muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la tabla 6B.

Tabla 6A

Gen

N Cociente de verosimilitud Chi-cuadrado Cociente de verosimilitud Valor de p Cociente de probabilidades IC de Wald del 95 % para la RG

EGF

144 9,4751 0,0021 9,2269 (2,05,41,48)

ADAM17

144 6,4427 0,0111 3,0131 (1,22,7,42)

PTP4A3

143 18,1613 <0,0001 2,5136 (1,59,3,97)

ADAM15

144 6,1496 0,0131 2,3126 (1,17,4,58)

QPRT

144 13,2414 0,0003 2,2400 (1,32,3,79)

SATB2

144 8,3216 0,0039 2,1358 (1,21,3,75)

RASSF1

144 4,7588 0,0291 2,0634 (1,04,4,11)

VAV3

144 9,8051 0,0017 1,9745 (1,24,3,15)

CEACAM6

144 6,0508 0,0139 1,9605 (1,10,3,50)

EREG

144 16,2494 0,0001 1,8354 (1,32,2,56)

AREG

144 13,6972 0,0002 1,8113 (1,28,2,57)

TITF1

144 5,7005 0,0170 1,6256 (1,09,2,42)

SORBS1

144 4,2346 0,0396 1,5921 (1,01,2,50)

C13orf18

144 4,1806 0,0409 1,3947 (1,00,1,95)

CKMT2

144 6,3844 0,0115 1,3876 (1,08,1,79)

Tabla 6B

Gen

N Cociente de verosimilitud Chi-cuadrado Cociente de verosimilitud Valor de p Cociente de probabilidades IC de Wald del 95 % para la RG

VDAC2

144 5,3929 0,0202 0,2638 (0,08,0,85)

SERPINA B1

144 13,1397 0,0003 0,2651 (0,12,0,59)

PHLDA1

144 18,6782 <0,0001 0,2794 (0,14,0,54)

ANXA2P2

144 8,3899 0,0038 0,3144 (0,14,0,72)

KRT17

144 14,1475 0,0002 0,4140 (0,24,0,72)

EPHA2

144 6,8218 0,0090 0,4954 (0,28,0,86)

DUSP4

144 10,6961 0,0011 0,5045 (0,32,0,80)

CGA

144 4,6113 0,0318 0,6350 (0,40,1,02)

CA9

144 4,6837 0,0304 0,7263 (0,53,0,99)

maspina

144 4,1275 0,0422 0,7325 (0,54,1,00)

Ejemplo 8 - identificación de marcadores génicos de respuesta a un inhibidor del EGFR en pacientes con cáncer de colon negativo para KRAS (criterio de valoración CE)

10 Las tablas 7A y 7B presentan tablas que muestran genes para los que la expresión normalizada se correlaciona (análisis univariable) positivamente (tabla 7A) o negativamente (tabla 7B) con la tasa de control de la enfermedad en pacientes con cáncer de colon negativo para KRAS tratados con cetuximab. Las figuras 9A-9E muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la tabla 7A; las figuras 10A-10D muestran curvas de probabilidad que corresponden a los datos recogidos en la tabla 7B.

Tabla 7A:

Gen

N Cociente de verosimilitud Chi-cuadrado Cociente de verosimilitud Valor de p Cociente de probabilidades IC de Wald del 95 % para la RG

BTC

144 5,3672 0,0205 6,1503 (1,07,35,43)

ATP5E

144 9,0584 0,0026 3,9235 (1,55,9,94)

ADAM17

144 10,1802 0,0014 3,0447 (1,49,6,24)

Catenina B

144 8,5174 0,0035 2,7911 (1,36,5,72)

EREG

144 47,5095 <0,0001 2,4680 (1,82,3,34)

AREG

144 40,8964 <0,0001 2,4514 (1,77,3,40)

CCNE1

144 4,0422 0,0444 2,4162 (0,95,6,13)

SATB2

144 16,5332 <0,0001 2,3352 (1,49,3,66)

EGFR

144 9,6293 0,0019 2,3261 (1,30,4,17)

VAV3

144 21,8405 <0,0001 2,2939 (1,55,3,40)

TITF1

144 8,0228 0,0046 2,2678 (1,05,4,88)

PTP4A3

143 17,1734 <0,0001 2,2669 (1,47,3,48)

CEACAM6

144 9,2498 0,0024 1,9068 (1,22,2,97)

Bclx

144 5,5095 0,0189 1,8321 (1,09,3,09)

BRCA1

144 5,0594 0,0245 1,7790 (1,06,2,98)

C13orf18

144 13,0916 0,0003 1,6136 (1,23,2,13)

CKMT2

144 11,7838 0,0006 1,5504 (1,18,2,04)

CDC25B

144 5,0597 0,0245 1,4596 (1,04,2,04)

CHN2

144 5,2658 0,0217 1,4339 (1,04,1,97)

QPRT

144 5,7732 0,0163 1,3853 (1,05,1,82)

ID1

144 5,1205 0,0236 1,3698 (1,04,1,81)

SLC26A3

144 11,8812 0,0006 1,3611 (1,13,1,64)

Tabla 7B:

Gen

N Cociente de verosimilitud Chi-cuadrado Cociente de verosimilitud Valor de p Cociente de probabilidades IC de Wald del 95 % para la RG

NEDD8

144 7,4988 0,0062 0,2196 (0,07,0,67)

VDAC2

144 8,6138 0,0033 0,2504 (0,10,0,65)

SERPINA B1

144 16,9744 <0,0001 0,3055 (0,17,0,56)

DUSP6

144 13,8060 0,0002 0,3191 (0,17,0,61)

GPC3

144 6,6733 0,0098 0,3497 (0,13,0,94)

ANXA2P2

144 7,6631 0,0056 0,4116 (0,21,0,79)

NT5E

144 16,6993 <0,0001 0,4617 (0,31,0,69)

DUSP4

144 17,4132 <0,0001 0,5194 (0,37,0,72)

VIL2

144 4,1446 0,0418 0,5608 (0,32,0,99)

PHLDA1

144 7,4036 0,0065 0,5656 (0,37,0,86)

P14ARF

144 7,2519 0,0071 0,6121 (0,42,0,89)

Tabla 7B:

Gen

N Cociente de verosimilitud Chi-cuadrado Cociente de verosimilitud Valor de p Cociente de probabilidades IC de Wald del 95 % para la RG

KART17

144 8,3225 0,0039 0,6501 (0,48,0,88)

CA9

144 6,8230 0,0090 0,7422 (0,59,0,93)

maspina

144 5,3058 0,0213 0,7451 (0,58,0,96)

Ejemplo 9 - modelos de varios genes de respuesta a un inhibidor del EGFR en pacientes con cáncer de colon negativo para KRAS (criterio de valoración TRG)

La tabla 8 muestra genes y combinaciones de genes cuyos niveles de expresión se pueden combinar en modelos de varios genes que se correlacionan con la tasa de respuesta global en pacientes con cáncer de colon negativo para KRAS tratados con cetuximab. Nota: "aregereg" es el promedio del valor de AREG normalizado y el valor de EREG normalizado.

Tabla 8 (TRG)

1 gen

N. º de modelos % de modelos Media ABC DE ABC Mediana ABC

PTP4A3

40 71 % 0,69 0,07 0,68

EREG

8 14 % 0,62 0,08 0,64

PHLDA1

5 9 % 0,65 0,11 0,65

aregereg

3 5 % 0,70 0,10 0,70

Total

56 100 % 0,66 0,09 0,67

2 genes

PHLDA1 PTP4A3

45 46 % 0,77 0,08 0,78

KRT17 PTP4A3

13 13 % 0,72 0,09 0,76

EREG PHLDA1

10 10 % 0,77 0,06 0,78

aregereg PHLDA1

9 9 % 0,76 0,06 0,77

EREG KRT17

6 6 % 0,75 0,08 0,74

aregereg KRT17

5 5 % 0,68 0,16 0,73

AREG PHLDA1

3 3 % 0,76 0,01 0,76

KRT17 SERPINA B1

2 2 % 0,58 0,04 0,58

CEACAM6 PTP4A3

1 1 % 0,58 . 0,58

EREG PTP4A3

1 1 % 0,70 . 0,70

KRT17 SORBS1

1 1 % 0,60 . 0,60

PHLDA1 SORBS1

1 1 % 0,53 . 0,53

SATB2 SERPINA B1

1 1 % 0,52 . 0,52

Total

98 100 % 0,67 0,07 0,68

3 genes

AREG PHLDA1 PTP4A3

7 13 % 0,80 0,06 0,80

aregereg KRT17 PHLDA1

7 13 % 0,85 0,06 0,86

aregereg PHLDA1 PTP4A3

5 10 % 0,79 0,07 0,77

EREG PHLDA1 SORBS1

5 10 % 0,69 0,06 0,71

EGFR PHLDA1 PTP4A3

4 8 % 0,59 0,09 0,62

KRT17 PTP4A3 SORBS1

4 8 % 0,62 0,12 0,58

Tabla 8 (TRG)

1 gen

N. º de modelos % de modelos Media ABC DE ABC Mediana ABC

aregereg KRT17 PTP4A3

3 6 % 0,80 0,06 0,79

EREG KRT17 PHLDA1

3 6 % 0,69 0,14 0,70

EREG PHLDA1 SATB2

2 4 % 0,62 0,01 0,62

AREG KRT17 PHLDA1

1 2 % 0,63 . 0,63

CEACAM6 PHLDA1 PTP4A3

1 2 % 0,73 . 0,73

EGFR EPHA2 EREG

1 2 % 0,65 . 0,65

EREG KRT17 SLC26A3

1 2 % 0,47 . 0,47

EREG PHLDA1 PTP4A3

1 2 % 0,71 . 0,71

EREG PHLDA1 QPRT

1 2 % 0,58 . 0,58

PHLDA1 PTP4A3 SATB2

1 2 % 0,66 . 0,66

Total

52 100 % 0,68 0,08 0,68

4 genes

EREG KRT17 PHLDA1 SORBS1

6 19 % 0,76 0,10 0,74

AREG KRT17 PHLDA1 PTP4A3

2 6 % 0,92 0,05 0,92

aregereg KRT17 PHLDA1 PTP4A3

2 6 % 0,80 0,03 0,80

aregereg PHLDA1 PTP4A3 SATB2

2 6 % 0,72 0,06 0,72

aregereg PHLDA1 PTP4A3 SORBS1

2 6 % 0,84 0,12 0,84

DUSP6 EREG KRT17 SORBS1

2 6 % 0,60 0,05 0,60

AREG EGFR EPHA2 PHLDA1

1 3 % 0,74 . 0,74

aregereg CEACAM6 KRT17 SORBS1

1 3 % 0,79 . 0,79

aregereg EGFR KRT17 PHLDA1

1 3 % 0,78 . 0,78

aregereg KRT17 PHLDA1 SORBS1

1 3 % 0,80 . 0,80

aregereg KRT17 PTP4A3 SORBS1

1 3 % 0,84 . 0,84

CEACAM6 EREG PHLDA1 SORBS1

1 3 % 0,81 . 0,81

CEACAM6 KRT17 PHLDA1 PTP4A3

1 3 % 0,73 . 0,73

CEACAM6 KRT17 PTP4A3 SORBS1

1 3 % 0,78 . 0,78

EGFR EPHA2 PHLDA1 PTP4A3

1 3 % 0,63 . 0,63

EGFR EREG KRT17 PHLDA1

1 3 % 0,74 . 0,74

EGFR KRT17 PHLDA1 PTP4A3

1 3 % 0,69 . 0,69

EREG KRT17 PTP4A3 SORBS1

1 3 % 0,57 . 0,57

EREG LAMA3 PHLDA1 QPRT

1 3 % 0,57 . 0,57

EREG PHLDA1 PTP4A3 QPRT

1 3 % 0,66 . 0,66

KRT17 PHLDA1 PTP4A3 SORBS1

1 3 % 0,85 . 0,85

KRT17 PTP4A3 SORBS1 VDAC2

1 3 % 0,77 . 0,77

Total

32 100 % 0,74 0,07 0,74

5 genes

AREG EGFR KRT17 PHLDA1 PTP4A3

1 11 % 0,79 . 0,79

AREG KRT17 PHLDA1 PTP4A3 SORBS1

2 22 % 0,87 0,10 0,87

aregereg CEACAM6 KRT17 PHLDA1

2 22 % 0,76 0,10 0,76

Tabla 8 (TRG)

1 gen

N. º de modelos % de modelos Media ABC DE ABC Mediana ABC

aregereg EGFR KRT17 PHLDA1 PTP4A3

1 11 % 0,80 . 0,80

aregereg EPHA2 KRT17 PTP4A3 SORBS1

1 11 % 0,81 . 0,81

CEACAM6 KRT17 PHLDA1 PTP4A3

1 11 % 0,69 . 0,69

EREG KRT17 PHLDA1 PLAUR SORBS1

1 11 % 0,72 . 0,72

Total

9 100 % 0,78 0,10 0,78

6 genes

AREG EPHA2 KRT17 LAMC2 PHLDA1

1 100 % 0,74 . .

7 genes

ANXA1 BRCA1 CHN2 PHLDA1 PTP4A3

1 50 % 0,44 . .

CEACAM6 KRT17 LAMA3 PHLDA1 PTP4A3

1 50 % 0,76 . .

Total

2 100 % 0,60

Ejemplo 10 - modelos de varios genes de respuesta a un inhibidor del EGFR en pacientes con cáncer de colon negativo para KRAS (criterio de valoración CE)

La tabla 9 presenta una tabla que muestra genes y combinaciones de genes cuyos niveles de expresión se pueden combinar en modelos de varios genes que se correlacionan con la tasa de control de la enfermedad en pacientes con cáncer de colon negativo para KRAS tratados con cetuximab. Nota: "aregereg" es el promedio del valor de AREG normalizado y el valor de EREG normalizado.

Tabla 9 (CE)

Modelos de 1 gen

Aregereg 96 53 % 0,81 0,08 0,82

EREG 84 47 % 0,8 0,07 0,81

Total 180 100 % 0,8 0,08 0,81

Modelos de 2 genes

SLC26A3 aregereg 12 29 % 0,8 0,05 0,81

DUSP6 EREG 10 24 % 0,78 0,08 0,76

DUSP6 aregereg 8 19 % 0,84 0,05 0,84

EREG SLC26A3 5 12 % 0,84 0,04 0,83

VIL2 aregereg 2 5 % 0,83 0,07 0,83

DR5 aregereg 1 2 % 0,78 . 0,78

EPHA2 aregereg 1 2 % 0,71 . 0,71

EREG NT5E 1 2 % 0,72 . 0,72

KRT17 aregereg 1 2 % 0,84 . 0,84

SATB2 aregereg 1 2 % 0,63 . 0,63

Total 42 100 % 0,78 0,06 0,77

Modelos de 3 genes

DUSP6 EREG SLC26A3 7 33 % 0,8 0,06 0,82

DUSP6 SLC26A3 aregereg 6 29 % 0,81 0,07 0,83

CA9 EREG NT5E 1 5 % 0,59 . 0,59

CLTC DUSP6 aregereg 1 5 % 0,68 . 0,68

Tabla 9 (CE)

DR5 SLC26A3 aregereg 1 5 % 0,79 . 0,79

DUSP6 VIL2 aregereg 1 5 % 0,82 . 0,82

EPHA2 EREG SLC26A3 1 5 % 0,65 . 0,65

EREG SLC26A3 VIL2 1 5 % 0,75 . 0,75

KRT17 SLC26A3 aregereg 1 5 % 0,8 . 0,8

SLC26A3 VIL2 aregereg 1 5 % 0,95 . 0,95

Total 21 100 % 0,76 0,07 0,77

Modelos de 4 genes

aregereg DR5 DUSP6 SLC26A3 1 20 % 0,93 . .

AMACR1 aregereg DUSP6 SATB2 1 20 % 0,69 .

aregereg CLTC DUSP6 SLC26A3 1 20 % 0,84 . .

aregereg DUSP6 KRT17 SLC26A3 1 20 % 0,76 . .

EGFR EREG SLC26A3 VIL2 1 20 % 0,92 . .

Modelo de 5 genes

DUSP6 EREG QPRT SLC26A3 VIL2

Total 1 100 % 0,74 . .

Ejemplo 11 - TRG observada frente a la predicha usando un modelo logístico de 4 genes AREG, EREG, SLC26A3 y DUSP6

5 La tabla 10 presenta una tabla que compara la respuesta del paciente observada (criterio de valoración CE) al tratamiento con cetuximab y la respuesta predicha usando un modelo de 4 genes basado en los niveles de expresión de AREG, EREG, SLC26A3 y DUSP6. El umbral para el modelo de 4 genes se determinó mediante la identificación del punto de corte que proporcionaba el mayor número de verdaderos negativos más tres positivos en el criterio de valoración CE. La tabla 10 ilustra el número de pacientes que se clasificarían como con respuesta

10 frente a sin respuesta usando el modelo de 4 genes. Los porcentajes son porcentajes por fila, que resumen el número de pacientes con estado de CE observado dado el estado de CE predicho a partir del modelo de 4 genes.

Tabla 10

Estado de CE observado

No Sí CE predicho total

Estado de CE predicho usando un modelo logístico de 4 genes

No 44 (36, 50) 16 (10,24) 60 (42 %)

73 % (60 %, 84 %)

27 % (16 %, 40 %)

Sí

13 (8, 21) 71 (61, 77) 84 (58 %)

15 % (9 %, 25 %)

85 % (75 %, 92 %)

CE observado total 57 (40 %) 87 (60 %) 144

La tabla 11 presenta una tabla que compara el tiempo de supervivencia sin progresión para pacientes para todos los

15 pacientes positivos para KRAS, para todos los pacientes negativos para KRAS, para pacientes para los que se predice mediante el clasificador de cuatro genes que tienen una alta probabilidad de respuesta al tratamiento con un inhibidor del EGFR y para pacientes para los que se predice mediante el clasificador de cuatro genes que tienen una baja probabilidad de respuesta al tratamiento con un inhibidor del EGFR. El clasificador de cuatro genes identifica un subconjunto de pacientes negativos para KRAS que tienen una probabilidad más alta de respuesta al tratamiento

20 con un inhibidor del EGFR (supervivencia sin progresión (SSP) más prolongada que los pacientes negativos para KRAS sin clasificar. El clasificador de cuatro genes identifica también un subconjunto de pacientes negativos para KRAS que tienen una probabilidad de respuesta más baja (supervivencia sin progresión más corta) que los pacientes negativos para KRAS sin clasificar; en estos pacientes, la SSP es similar a la observada en pacientes positivos para KRAS, que por lo general son resistentes al tratamiento.

Tabla 11

N. º de pacientes Mediana de la supervivencia (IC del 95 %)

Positivos para KRAS

82 41 (40,51)

Negativos para KRAS con probabilidad de respuesta predicha baja

60 40 (38,46)

Negativos para KRAS con probabilidad de respuesta predicha alta

84 163 (126,180)

Todos negativos para KRAS

144 103 (78,126)

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para predecir una probabilidad de que un paciente humano con un cáncer colorrectal que

   5 expresa EGFR presente una respuesta beneficiosa a un inhibidor del EGFR usando un modelo de 4 genes basado en niveles de expresión de AREG, EREG, DUSP6 y SLC26A3, que comprende:

   medir, en una muestra tumoral obtenida del paciente, niveles de transcritos de ARN, o sus productos de expresión, de AREG, EREG, DUSP6 y SLC26A3,

   10 normalizar los niveles de los transcritos de ARN, o sus productos de expresión, de AREG, EREG, DUSP6 y SLC26A3, para obtener niveles de expresión normalizados de AREG, EREG, DUSP6 y SLC26A3; y

   usar los niveles de expresión normalizados de AREG, EREG, DUSP6 y SLC26A3 para determinar la 15 probabilidad de que el paciente presente una respuesta beneficiosa a un inhibidor del EGFR,

   en el que los niveles de expresión normalizados aumentados de AREG, EREG y SLC26A3 se correlacionan positivamente con la probabilidad de que el paciente presente una respuesta beneficiosa al inhibidor del EGFR; y

   20 en el que el nivel de expresión normalizado aumentado de DUSP6 se correlaciona negativamente con la probabilidad de que el paciente presente una respuesta beneficiosa al inhibidor del EGFR.
2. 2. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el cáncer colorrectal que expresa EGFR 25 es un cáncer colorrectal que expresa EGFR negativo para KRAS.
3. 3. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, en el que la muestra tumoral se obtiene a partir de una biopsia de tejido.

   30 4. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3, en el que el inhibidor del EGFR es un anticuerpo específico para el EGFR.

4. 5. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 4, en el que el inhibidor del EGFR es cetuximab.

   35 6. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3, en el que el inhibidor del EGFR es una molécula pequeña.

5. 7. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 6, en el que la molécula pequeña es un inhibidor

   tirosina cinasa selectivo de EGFR. 40
6. 8. Un procedimiento como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en el que se determinan los niveles de expresión normalizados con relación a un nivel de expresión de al menos un gen de referencia.
7. 9. Un procedimiento como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en el que se mide el nivel de los 45 transcritos de ARN de AREG, EREG, DUSP6 y SLC26A3.
8. 10. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 9, en el que se mide el nivel de los transcritos de ARN de AREG, EREG, DUSP6 y SLC26A3 mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
9. 11. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que se miden los niveles de proteína de AREG, EREG, DUSP6 y SLC26A3.
10. 12. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 11, en el que los niveles de proteína se miden por 55 técnicas de inmunohistoquímica o proteómica.
11. 13. Un procedimiento como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en el que la respuesta beneficiosa se expresa en términos de tasa de respuesta global (TRG) o control de la enfermedad (CE).

    60 14. Un procedimiento como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en el que se pondera el nivel de expresión normalizado por su contribución a la respuesta al inhibidor del EGFR.
12. 15. Un procedimiento como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, que comprende además la etapa de

    crear un informe que resume dicha predicción. 65