CN106148533B

CN106148533B - 用于食管鳞癌诊治的标志物

Info

Publication number: CN106148533B
Application number: CN201610609711.8A
Authority: CN
Inventors: 杨承刚; 宋宏涛
Original assignee: Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2016-07-28
Filing date: 2016-07-28
Publication date: 2019-06-11
Anticipated expiration: 2036-07-28
Also published as: CN106148533A

Abstract

本发明公开了用于食管鳞癌诊治的标志物，该标志物为CKMT2。本发明发现CKMT2基因在食管鳞癌中差异表达，其与食管鳞癌的发生发展相关，基于此，CKMT2可作为可能的检测靶标应用于食管鳞癌的诊断。本发明证明上调CKMT2的表达可以抑制癌细胞的增殖和促进癌细胞的凋亡，据此可将CKMT2用于开发治疗食管鳞癌的药物。

Description

用于食管鳞癌诊治的标志物

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及用于食管鳞癌诊治的标志物，具体地该标志物为CKMT2。

背景技术

食管癌是人类常见的十大恶性肿瘤之一。全球食管癌每年新增病例超过48万，死亡病例超过40万。2014年美国癌症协会(ACS)报道的数据显示，在过去二十年中癌症死亡率稳步下降，整个生命期内死于癌症的整体风险下降了20％，但食管癌依然是美国40-59岁男性的第五大致死性肿瘤。中国是世界食管癌的高发地区，尤以男性高发，组织类型主要为鳞状细胞癌(简称鳞癌)。国家癌症中心2014年的最新数据显示，我国食管癌居恶性肿瘤发病第五位、死亡第四位，对人民的生活质量甚至生命安全构成了严重威胁。

食管鳞癌的发生经历从正常食管粘膜、炎症、食管粘膜上皮异型增生、原位癌、粘膜内癌、早期***、晚期癌的过程。食管癌起病隐匿，许多患者早期阶段无任何症状，50％以上患者在确诊时已无法切除或已出现影像学可见的转移灶，多年来，中晚期患者术后5年整体生存率一直徘徊在10％左右。如能找到精确的诊断方法，将能够指导临床上的个性化治疗，对一定的患者及时进行干预，并防止对其他患者的过度治疗，从而提高患者的生存质量。现有技术发现，早期切除食管鳞癌组织的患者，可大大提高患者的5年生存率。因此，早诊早治对于降低食管鳞癌的死亡率具有重要的意义。

目前可应用于食管癌早期诊断的影像学方法有食管钡餐造影、计算机断层扫描(CT)和核磁共振成像(MRI)，内镜技术有高放大倍数高分辨率内镜、色素内镜(卢戈氏碘液染色法、甲苯胺蓝染色法和甲苯胺蓝一卢戈氏碘液染双重染色法)、窄谱成像内镜、自体荧光成像内镜、激光共聚焦内镜、光学连续X线断层扫描内镜、以及影像学与内镜相结合的内镜超声(EUS)，病理细胞学方法有食管拉网脱落细胞学检查。这些方法各具优点，但同时也各显示有某方面的不足。由于技术水平所造成的诊断不明确，很可能会导致部分早期食管癌患者失去最佳的治疗机会。

针对食管鳞癌的诊断方法，尤其是对术后患者的预后风险分层、早期癌精确诊断以及癌前病变癌变风险预警，需要更准确的指标进行补充。运用分子生物学方法研究鉴定有效的分子标志物，是辅助现有临床诊断、指导临床干预和癌前预警的关键手段。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种诊断产品，从而实现早期食管鳞癌的准确诊断。

本发明的目的之二，提供一种分子标志物，作为检测或治疗指标应用于临床。

本发明的目的之三，提供一种治疗手段和药物组合物，实现食管鳞癌的精准分子治疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测CKMT2基因的试剂在制备诊断食管鳞癌的产品中的应用。

进一步，所述产品通过检测样本中CKMT2基因的表达水平来判断患者是否患有食管鳞癌。其中，CKMT2基因在食管鳞癌患者中表达下调。

所述“样本”包括细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。在本发明的具体实施方式中，所述样本为组织。

进一步，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测CKMT2基因的表达水平以诊断食管鳞癌。

其中，所述用RT-PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增CKMT2基因的引物；所述用实时定量PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增CKMT2基因的引物；所述用免疫检测诊断食管鳞癌的产品包括：与CKMT2蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断食管鳞癌的产品包括：与CKMT2基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断食管鳞癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中蛋白芯片包括与CKMT2蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与CKMT2基因的核酸序列杂交的探针。

进一步，所述用实时定量PCR诊断食管癌的产品至少包括一对特异性扩增CKMT2基因的引物，所述引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明提供了一种诊断食管鳞癌的产品，所述产品能够通过检测样本中CKMT2基因的表达水平来诊断食管鳞癌。

进一步，所述产品包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒。所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测CKMT2基因转录水平的针对CKMT2基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的CKMT2蛋白的特异性抗体；所述基因检测试剂盒包括用于检测CKMT2基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括CKMT2蛋白的特异性抗体。

本发明中基因检测试剂盒或基因芯片可用于检测包括CKMT2基因在内的多个基因(例如，与食管鳞癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白免疫检测试剂盒或蛋白质芯片可用于检测包括CKMT2蛋白在内的多个蛋白质(例如与食管鳞癌相关的多个蛋白质)的表达水平。将食管鳞癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高食管鳞癌诊断的准确率。

本发明提供了CKMT2基因和/或其表达产物在制备治疗食管鳞癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括增加CKMT2基因表达、增强CKMT2表达功能、和/或增强CKMT2表达产物活性的试剂。所述试剂包括：含有能编码功能性CKMT2蛋白的核酸的试剂、CKMT2蛋白的激活剂、含有CKMT2蛋白质的试剂。

其中，所述含有能编码功能性CKMT2蛋白的核酸的试剂可以是在有利条件下翻译成活性形式的CKMT2蛋白的单链核酸(如mRNA)或双链核酸(如DNA)，所述的核酸可以连接在表达载体上或重组到宿主细胞里，只要能编码成活性CKMT2蛋白，任何一种CKMT2基因的携带方式均可。所述的CKMT2蛋白激活剂是指刺激CKMT2蛋白活性、增加CKMT2蛋白活性、促进CKMT2蛋白活性、增强CKMT2蛋白激活、使CKMT2蛋白活性敏感化或上调CKMT2蛋白活性的试剂，如去甲基化试剂、CKMT2启动子和/或增强子特异性的转录激活剂、CKMT2蛋白的激动剂(如激活抗体)等。

本发明提供了一种治疗食管鳞癌的药物组合物，所述药物组合物包括增加CKMT2基因表达、增强CKMT2表达功能、和/或增强CKMT2表达产物活性的试剂。

所述试剂包括但不限于含有能编码功能性CKMT2蛋白的核酸的试剂、CKMT2蛋白的激活剂、含有CKMT2蛋白质的试剂。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体，如缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐等。作为缓冲剂，能够使用磷酸盐、甘氨酸，山梨酸，山梨酸钟，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质例如硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂等。作为乳化剂，能够使用***树胶、海藻酸钠、西黄芪胶等。作为悬浮剂，能够使用单硬脂酸甘油、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为稳定剂，能够使用丙二醇、二亚乙基亚硫酸盐、抗坏血酸等。作为防腐剂，能够使用叠氮化钠、苯扎氯铵、对羟苯甲酸、氯丁醇等。本发明的药物组合物还可以包括离子交换剂如矾土，硬脂酸铝，卵磷脂，半乳化药物递送***(SEDDS)例如dα一生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐，在药物剂型中使用的表面活性剂例如吐温或其它类似聚合递送基质，血清蛋白例如人血清白蛋白，也可以使用环糊精例如α-环糊精、β-环糊精、和γ-环糊精，或化学修饰的衍生物例如是羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟基丙基-β-环糊精、或其它增溶衍生物来促进本发明化合物的递送。本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。

本发明的药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂，如含水乳糖或无水乳糖、淀粉、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、硅酸、微晶纤维素、羟甲基纤维素钠、淀粉甘醇酸钠及其衍生物等。

本发明的药物组合物还包含界面活性剂、乳化剂、扩散剂、消泡剂等。任何药学上或医学上可接受的界面活性剂、乳化剂、扩散剂、消泡剂等皆可被使用。

本发明的药物组合物还包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于)，快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散剂。常见快速分解涂层材料包括OPADRY；肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素；增塑剂包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。

在本发明中，“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明中所述CKMT2蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段、组合抗体等，只要它们展现出期望的生物学活性。

本发明中“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。

克隆抗体在本发明中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

“完整抗体”在本发明中指包含两个抗原结合区及Fc区的抗体。优选的是，完整抗体具有功能性Fc区。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)²和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。

本发明中检测CKMT2基因表达产物的抗体，可以选择适当的公知的方法来制备，如杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体法等单克隆抗体的制作方法等。使用结合有标记物质的抗体时，通过检测该标记，能够直接检测靶点蛋白质。作为标记物质，只要是能够与抗体结合、能够检测的物质即可，没有特别限定，例如，可以为过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、微过氧化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明异硫氰酸盐(RITC)、碱性磷酸酶、生物素及放射性物质。另外，除使用结合有标记物质的抗体直接检测靶点蛋白质的方法以外，也能够利用使用结合有标记物质的二次抗体、蛋白质G或蛋白质A等间接地检测靶点蛋白质的方法。

本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、***给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本文所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织，本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。

本发明药物组合物可以以任何口服剂型的形式口服给药，包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水悬浮液、分散剂和溶液。对于口服片剂，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。一般还加入润滑剂例如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服给药，适用的稀释剂包括乳糖和无水玉米淀粉。当口服施用水悬浮液和/或乳液时，可将活性组分悬浮或溶解在油相中，并与乳化剂和/或悬浮剂合并。如果需要的话，可加入一些甜味剂和/或矫味剂和/或着色剂。适当时，可将用于口服给药的剂量单位制剂包微囊。例如，通过在聚合物、蜡等中将颗粒物质包衣或包埋，也可制备所述制剂已延长或维持释放。本发明的药物组合物可以用于补充内源性的CKMT2蛋白的缺失或不足，通过提高CKMT2蛋白的表达或增强CKMT2蛋白的功能，从而治疗因CKMT2蛋白减少导致的食管鳞癌。

本发明的药物还可与其他治疗食管鳞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

本发明所述的药物组合物也可以脂质体输送***形式给药，如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可有多种磷脂形成，如胆甾醇、硬脂基胺或磷脂酰胆碱。

本发明药物组合物可以局部给药的药物组合物，可以配制成软膏、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因可具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2指定的编码序列或氨基酸序列。在一些实施方案中，其具有与所列的序列至少85％相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列，诸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列。

在本发明的上下文中，CKMT2基因表达产物包括人CKMT2蛋白以及CKMT2蛋白的部分肽。所述CKMT2蛋白的部分肽含有与食管鳞癌病相关的功能域。

“CKMT2蛋白”包括CKMT2蛋白以及CKMT2蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括CKMT2蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物或其突变体。突变体包括等位变异体、天然突变体、诱导突变体、其氨基酸序列通过缺失、替代、增加和/或***发生变异的突变体、在高或低的严紧条件下能与人CKMT2的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、***、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

氨基酸序列的修饰可以源自自发突变或遗传后修饰，也可以人工诱导天然基因产生。通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是CKMT2蛋白的融合蛋白。对于与CKMT2蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留CKMT2蛋白的生物学活性即可。

本发明的药物组合物可以按药剂学上有效的量进行给药，本发明的用语“药剂学上有效的量”指的是以可适用于医学治疗或预防的合理的受惠/危险比率足以治疗或预防疾病的量，可根据包括疾病的严重程度、药物的活性、患者的年龄、体重、健康、性别、患者对药物的敏感度、所使用的本发明组合物的给药时间、给药途径及排出比率、治疗时间、与所使用的本发明的组合物配合或同时使用的药物的要素及其它医学领域中公知的要素来决定有效用量水平。本发明的药物组合物可作为单独的治疗剂进行给药，或是与其它治疗剂并用地进行给药，可以与以往的治疗剂依次地或同时地进行给药。此外，可单次或多次地进行给药。重要的是，需要对上述要素均加以考虑，并且以无副作用的最少的量可取得最大效果的量进行给药。

术语“治疗”是指不以治愈为目的，而是减缓(减少)靶定的病理状况或病症或防止复发。如果接受治疗有效量的治疗剂之后,患者成功地被“治疗”，患者显示出可观测到的和/或可度量的一种或多种特定疾病的迹象和症状的减少或消失。例如，癌细胞数目显著减少或癌细胞消失，减少肿瘤尺寸；抑制(即，在某种程度上减缓，及优选地停止)肿瘤转移；某种程度上抑制肿瘤生长；使在一定程度上减少和/或减轻与特定癌症相关联的一种或多种症状的时间增加；减少的发病率和死亡率，以及改善生活质量。疾病的迹象或症状的减轻能够为患者感知。治疗可以实现完全反应—定义为癌症的所有迹象消失，或部分反应—肿瘤尺寸减小，优选减小的比例超过50％、更优选75％。如果患者感受到疾病稳定，患者也被视为得到治疗。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了CKMT2在食管鳞癌患者组织中差异表达，通过检测CKMT2的表达水平可以判断患者是否患有食管鳞癌或者患病风险的高低。

本发明提供了一种食管鳞癌的精准医疗手段，通过提高患者中CKMT2的表达水平，从而治疗食管鳞癌患者。

本发明提供了一种食管鳞癌的分子标记物，为食管鳞癌的机理研究以及临床应用提供理论基础。

附图说明

图1显示利用QPCR检测CKMT2基因在食管鳞癌组织中的表达情况；

图2显示利用QPCR检测CKMT2基因在食管细胞中的表达情况；

图3显示利用QPCR检测转染CKMT2基因在食管鳞癌细胞中的转染效率；

图4显示利用利用软琼脂克隆形成实验检测CKMT2基因表达对食管鳞癌细胞增殖能力的影响；

图5显示利用transwell小室检测CKMT2基因对食管鳞癌细胞侵袭的影响。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1筛选与食管鳞癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集6例周围正常食管粘膜组织和食管鳞癌组织，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备(利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行操作)

取出冻存于液氮中的组织样本，把组织样本放入已预冷的研钵中进行研磨，按照试剂盒中的说明书提取分离RNA。具体如下：

1)加入Trizol，室温放置5min；

2)加入氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5-10min；

3)12000rpm离心15min，将上层水相移到另一新的离心管中(注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质)，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；

4)12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入

75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混匀，4℃，12000rpm离心5min；

5)弃去乙醇液体，室温下放置5min，加入DEPC水溶解沉淀；

6)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃冰箱。

3、逆转录和标记

用Low RNA Input Linear Amplification Kit将mRNA逆转录成cDNA，同时用Cy3分别标记实验组和对照组。

4、杂交

基因芯片采用Aglient公司的人全基因组表达谱芯片,每张芯片包括45015个寡核苷酸，其中有43376个人基因探针和1639个实验控制探针。按芯片使用说明书的步骤进行，温度在65℃，经17h 10r/min滚动杂交，37℃洗片。

5、数据处理

杂交后芯片用Agilent扫描仪扫描,分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％PMT各扫描1次，2次结果Agilent软件自动合并。扫描图像数据采用FeatureExtraction进行处理分析，得到的原始数据应用Bioconductor程序包进行后续数据处理。最后Ratio值为实验组和对照组。差异基因筛选标准：ratio≥4为上调基因，ratio≤0.25为下调基因。

6、结果

与正常食管粘膜组织相比，CKMT2基因在食管鳞癌组织中的表达量显著低于正常食管粘膜组织中的表达量。

实施例2QPCR测序验证CKMT2基因的差异表达

1、对CKMT2基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择周围正常食管粘膜组织和食管鳞癌组织各50例。

2、RNA提取步骤同实施例1。

3、逆转录：

采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mM dNTP，0.1mM DTT，30μM Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

(3)QPCR扩增检验

引物设计

管家基因GAPDH的引物序列为：

正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.3)

反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)

CKMT2基因的引物序列为：

正向引物：5’-CTGGATAAATGAGGAGGAT-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-TTGGATTAACCGTTCTACT-3’(SEQ ID NO.6)

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl，正反向引物(5μM)各1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。

扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃45s)×30个循环。

以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

结果如图1所示，与周围正常食管粘膜组织相比，CKMT2基因在食管鳞癌组织中表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3CKMT2基因在食管癌细胞系中的差异表达

1、细胞培养

人食管鳞癌细胞株KYSE 150、KYSE450购自中科院肿瘤研究所，正常食管上皮细胞株Het-1a购自于广州吉尼欧公司。以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、RNA的提取

1)胰酶消化贴壁细胞，吹打获得的细胞经离心、重悬、清洗后，以1640培养基(10％小牛血清)重悬；

2)将重悬的细胞转移至6孔板(/孔)，添加培养基至2m1/孔，轻摇6孔板使细胞均匀重悬；

3)细胞贴壁生长48h，去培养基；

4)以1mlTrizol试剂裂解细胞，反复吹打6孔板壁，尽量使细胞完全裂解；

5)转移细胞裂解液至1.5ml DEPC处理过的EP管中，置于冰上。加入0.2m1氯仿，剩余操作步骤同组织中RNA提取过程。

3、逆转录

具体步骤同实施例2.

4、统计学方法

5、结果

结果如图2所示，与食管上皮细胞相比，CKMT2基因在食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450中表达均下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例4CKMT2基因的过表达

细胞培养

人食管鳞癌细胞株KYSE 150，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、CKMT2基因的过表达

2.1CKMT2基因表达载体的构建

根据CKMT2基因的编码序列(如SEQ ID NO.1所示)设计扩增引物，引物序列如下：

正向引物：5’-CCGGAATTCGCCACCATGGCCAGTA TCTTTTCTAA-3’(SEQ ID NO.7)

反向引物：5’-CGGCTCGAGCTTTTTGCCAAACTGAGGCAGAGG-3’(SEQ ID NO.8)

从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的CKMT2基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切后***到经限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-CKMT2用于后续实验。

2.2转染

将食管鳞癌细胞分为两组，分别为对照组(转染pcDNA3.1空载体)、和CKMT2过表达组(转染pcDNA3.1-CKMT2)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-CKMT2的转染浓度均为0.5μg/ml。

2.3RT-PCR检测

具体步骤同实施例2。

3、统计学方法

4、结果

如图3所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-CKMT2的细胞中CKMT2的含量显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例5CKMT2基因对食管鳞癌细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测CKMT2基因对细胞凋亡的影响。

1、细胞培养步骤同实施例3。

2、细胞转染步骤同实施例3。

3、步骤

细胞转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞，然后用0.25％胰酶消化细胞，中止消化，将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为1×10⁶个/ml，取200μl上述细胞悬液放置到Eppendorf管中，加入10μl Annexin-V-FITC混匀，室温暗处孵育染色15min，上机前5min加入10mg/L碘化丙锭(PI)染色5μl。未转染siRNA的细胞分别用Annexin-V-FITC和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果：

转染pcDNA3.1-CKMT2组的细胞凋亡率为(17.23±0.012)％，转染pcDNA3.1空载体组的细胞凋亡率为(6.41±0.013)％，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，CKMT2基因的过表达促进食管鳞癌细胞的凋亡。

实施例6软琼脂克隆形成实验

1、用0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，轻轻吹打使之成为单细胞悬液，离心收集细胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，适当稀释后计数，调整细胞浓度为5×10³个/ml。

3、制备两个浓度分别为1.2％和0.7％的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃水浴中。

4、1.2％的琼脂糖和2×DMEM培养基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直径6cm平皿中放置5min冷却凝固，作为底层琼脂置于CO2温箱中备用。

5、在无菌试管中1:1混合0.7％的琼脂糖和2×DMEM培养基，再向管中加入0.2ml浓度为5×10³个/ml的稳定感染细胞悬液，充分混匀，注入上述平皿中，逐渐形成双琼脂层，每个实验组重复4个样本。

6、待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO₂温箱中培养，每3天加培养基1.5ml。7、培养14天后取出培养皿，用1ml浓度为0.005％的龙胆紫染色90min。把平皿放置在倒置显微镜下观察，每组细胞随机选取10个低倍视野，镜下技术形成的细胞克隆数。

8、结果

结果如图4所示，与其他组相比，转染pcDNA3.1-CKMT2的细胞组单细胞克隆集落形成数显著降低。

实施例7Transwell细胞体外侵袭实验

1、向Transwell小室的上孔中加入100μl的无血清培养液Matrigel浸泡30min。

2、用胰酶消化处于对数生长期的稳定感染后各组细胞，PBS清洗细胞3次，用含有10％血清的培养液重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁵/ml。

3、向包被有Matrigel的Transwell小室的上室中加入细胞悬液200μl。

4、Transwell小室的下室中加入600μl含20％FBS的DMEM培养液。

5、37℃，5％CO₂温箱内培养24h。

6、除去上室和下室中的培养液，用棉签刮除上室中的Matrigel和存留的细胞，用PBS清洗2次。

7、用1％结晶紫染色液染色45min，PBS清洗1次。

8、随机选取4个100倍视野，在显微镜下分别计数侵袭细胞数，每种不同类型的细胞设3个复孔，共重复3次。

9、数据处理

用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为显著差异。

10、结果

结果如图5所示，KYSE150、pcDNA3.1空载、pcDNA3.1-CKMT2组细胞在transwell小室中培养24h后，pcDNA3.1-CKMT2组聚碳酸酯膜下室面的细胞数显著减少。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.检测CKMT2基因的试剂在制备诊断食管鳞癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品通过检测样本中CKMT2基因的表达水平来判断患者是否患有食管鳞癌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测CKMT2基因的表达水平以诊断食管鳞癌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断食管癌的产品至少包括一对特异性扩增CKMT2基因的引物，所述引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒。

6.CKMT2基因和/或其表达产物在制备治疗食管鳞癌的药物组合物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括增加CKMT2基因表达、增强CKMT2表达功能、和/或增强CKMT2表达产物活性的试剂。