ES2401965T3 - Modificación de Factor VIII - Google Patents

Modificación de Factor VIII Download PDF

Info

Publication number
ES2401965T3
ES2401965T3 ES10704152T ES10704152T ES2401965T3 ES 2401965 T3 ES2401965 T3 ES 2401965T3 ES 10704152 T ES10704152 T ES 10704152T ES 10704152 T ES10704152 T ES 10704152T ES 2401965 T3 ES2401965 T3 ES 2401965T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
factor viii
ethoxy
solution
acid
derivative
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10704152T
Other languages
English (en)
Inventor
Magali Zundel
Bernd Peschke
Ditte Maria Karpf
Kjeld Madsen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
Application granted granted Critical
Publication of ES2401965T3 publication Critical patent/ES2401965T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Derivado de Factor VIII de la fórmula (I): donde: B representa un alquileno C2 a C10; m representa 0 o un número entero de 1 a 19, n representa un número entero de 1 a 20 y la suma de m y n esde 1 a 20; P representa un mono o polirradical de Factor VIII obtenido por eliminación de los grupos de carbamoil m + n apartir de las cadenas laterales de los residuos de glutamina presentes en el Factor VIII; y M representa una fracción (M1) que aumenta la vida media en plasma del derivado de Factor VIII o una fracciónindicadora (M2); o una sal derivada farmacéuticamente aceptable.

Description

Campo de la invención
[0001] La presente invención se refiere a los derivados del Factor VIII, los procesos para preparar dichos derivados y el 10 uso de dichos derivados en tratamientos.
Antecedentes de la invención
[0002] El Factor VIII es una proteína importante en la cascada de coagulación sanguínea. Una deficiencia de Factor VIII
15 causa la enfermedad de la coagulación sanguínea hemofilia A. La hemofilia A se puede tratar mediante la administración de Factor VIII a un paciente cuando es necesario. El tratamiento profiláctico adecuado y efectivo de la hemofilia A con Factor VIII no es posible actualmente debido a que la vida media en plasma de Factor VIII es baja. Por lo tanto, es difícil mantener suficiente actividad de Factor VIII durante largos períodos de tiempo. Por lo tanto, la identificación de nuevos derivados de Factor VIII con vida media en plasma más larga podría ofrecer un tratamiento
20 profiláctico adecuado y seguro para la hemofilia A.
[0003] A veces es posible aumentar la vida media en plasma de una proteína introduciendo fracciones químicas adecuadas que protejan la proteína en posiciones importantes para la eliminación de la proteína de la sangre. También puede ser ventajoso introducir fracciones químicas que actúan como grupos indicadores en una proteína. No obstante,
25 si tales fracciones químicas se introducen de forma no selectiva, entonces la actividad biológica de la proteína puede reducirse o destruirse. La introducción regioselectiva de fracciones químicas en proteínas es, por lo tanto, deseable. No obstante, es difícil conseguir la introducción regioselectiva de fracciones químicas en proteínas grandes, tales como el Factor VIII.
30 [0004] Por lo tanto, existe la necesidad de técnicas nuevas para la introducción regioselectiva de fracciones químicas en el Factor VIII.
Resumen de la invención
35 [0005] Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que las enzimas de transglutaminasa se dirigen selectivamente a un número limitado de residuos de glutamina presentes en el Factor VIII. Así, el uso de una transglutaminasa en la síntesis de los derivados de Factor VIII permite la introducción regioselectiva de fracciones químicas en el Factor VIII. Estos métodos se han usado para preparar una nueva clase de derivados de Factor VIII.
40 [0006] Así, la presente invención se refiere a un derivado de Factor VIII de la fórmula (I):
donde:
45 B representa un alquileno de C2 a C10; m representa 0 o un número entero de 1 a 19, n representa un número entero de 1 a 20, y la suma de m y n es de 1 a 20; P representa un mono o polirradical de Factor VIII obtenido por eliminación de los grupos de carbamoil m + n de las cadenas laterales de residuos de glutamina presentes en el Factor VIII; y
50 M representa una fracción (M1) que aumenta la vida media en plasma del derivado de Factor VIII o una fracción indicadora (M2);
o una sal derivada farmacéuticamente aceptable.
[0007] La invención además proporciona: 55 - una composición farmacéutica que comprende un derivado de Factor VIII, tal y como se ha definido anteriormente, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable;
-
un derivado de Factor VIII, tal y como se ha definido anteriormente, para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o 5 animal mediante terapia;
- un derivado de Factor VIII, tal y como se ha definido anteriormente, para su uso en el tratamiento de la hemofilia A;
-
uso de un derivado de Factor VIII, tal y como se ha definido anteriormente, en la producción de un medicamento para 10 el tratamiento de la hemofilia A;
-
un método para tratar a un paciente con hemofilia A, este método comprende la administración a dicho paciente de un derivado de Factor VIII en una cantidad terapéuticamente eficaz, tal y como se ha definido anteriormente, o de una composición farmacéutica, tal y como se ha definido anteriormente;
-
un derivado de Factor VIII de la fórmula (II):
donde:
20 B representa un alquileno C2 a C10; q representa un número entero de 1 a 20 y P' representa un mono o polirradical de Factor VIII obtenido eliminando grupos de carbamoil q de las cadenas laterales de los residuos de glutamina presentes en el Factor VIII,
o una sal derivada farmacéuticamente aceptable; 25
-
un método para preparar un derivado de Factor VIII de la fórmula (II), tal y como se ha definido anteriormente, este método comprende reaccionar Factor VIII con un compuesto de la fórmula (III):
H2N-O-B-O-NH2 (III) 30 en presencia de una transglutaminasa, donde B es tal y como se ha definido anteriormente; y
-
un método para preparar un derivado de Factor VIII de la fórmula (I), tal y como se ha definido anteriormente, este
método comprende la reacción de un derivado de Factor VIII de la fórmula (II), tal y como se ha definido anteriormente, 35 con un aldehído de la fórmula (IV):
donde M es tal y como se ha definido anteriormente.
40 Descripción detallada de la invención
[0008] La presente invención proporciona nuevos derivados de Factor VIII que portan sustituyentes a un número limitado de sitios en la proteína. La sustitución regioselectiva del Factor VIII se controla mediante el método de preparación. Un paso importante del método de la invención es el uso de la enzima transglutaminasa (TGase). La
45 transglutaminasa también se conoce como proteína-glutamina-y-glutamiltransferasa. La transglutaminasa cataliza la reacción general:
[0009] El grupo -CH2-CH2-C(O)-NH2 de la proteína ilustrada anteriormente es la cadena lateral de un residuo de glutamina de la proteína.
5 [0010] Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la transglutaminasa se dirige de forma selectiva a un número limitado de residuos de glutamina presentes en el Factor VIII. Las secuencias de los derivados de Factor VIII contienen 64-70 residuos de glutamina. No obstante, la transglutaminasa sólo se dirige a una minoría de estos residuos de glutamina. Típicamente, la transglutaminasa se dirige a 1-20 residuos de glutamina, preferiblemente
10 de 1 a 15, más preferiblemente de 1 a 10 y de la forma más preferible de 1 a 7. De la forma más preferible, el derivado de FVIII es el compuesto de Factor VIII con el dominio B eliminado al que un péptido con la secuencia de SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR se fija al C-término de la cadena pesada. Este Factor VIII análogo tiene 66 residuos de glutamina. La transglutaminasa es la transglutaminasa de Streptomyces mobaraense y el número de residuos de glutamina previstos por la enzima está entre 1 y 20.
15 [0011] El primer paso del método de la presente invención implica la reacción del Factor VIII con un compuesto de dihidroxilamina de la fórmula (III):
H2N-O-B-O-NH2 (III)
20 en presencia de una transglutaminasa. La transglutaminasa cataliza la reacción de las cadenas laterales de los residuos de glutamina presentes en el Factor VIII con los grupos de amina en el compuesto de dihidroxilamina de la fórmula (III), para dar un derivado de Factor VIII de la fórmula (II):
donde: B representa un alquileno C2 a C10; q representa un número entero en el intervalo de 1 a 20 y
30 P' representa un mono o polirradical de Factor VIII obtenido por eliminación de los grupos de carbamoil q a partir de las cadenas laterales de los residuos de glutamina presentes en el Factor VIII.
[0012] En una forma de realización B es -CH2 -CH2 -CH2-.
35 [0013] Como será evidente para un experto en la técnica, la formación del derivado de Factor VIII de la fórmula (II) implica la reacción de las cadenas laterales "q" de los residuos de glutamina presentes en el Factor VIII. Cada molécula de Factor VIII reacciona, por lo tanto, con moléculas "q" del compuesto de dihidroxilamina.
[0014] Típicamente, este paso de reacción se lleva a cabo en una solución acuosa, preferiblemente una solución acuosa 40 tamponada. Las soluciones tampón adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica. La temperatura de dicha solución es típicamente de 0°C a 60°C, preferiblemente de 20°C a 40°C.
[0015] El número de residuos de glutamina modificados se pueden controlar por la concentración de cada uno de los reactivos que son, por un lado, FVIII o un análogo de FVIII y, por otro lado, el reactivo de bishidroxilamina. Asimismo, la 45 concentración de enzima (medida en actividad) y el origen de la transglutaminasa se pueden utilizar para controlar la extensión de la reacción, el sitio o sitios de modificación y la velocidad de reacción.
[0016] El producto bruto se purifica generalmente por técnicas conocidas, tales como el intercambio iónico y/o la ultrafiltración.
[0017] La segunda fase del método de la presente invención implica la reacción del derivado de Factor VIII de la fórmula
(II) con un aldehído de la fórmula (IV):
[0018] El aldehído de la fórmula (IV) y la fracción o fracciones -C(O)-NH-O-B-O-NH2 del derivado de Factor VII de la fórmula (II) reaccionan para formar un derivado de Factor VII de la fórmula (I):
10 [0019] Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las condiciones de reacción adecuadas para la fase anterior. Las condiciones de reacción exactas dependerán de la naturaleza del sustituyente M. Típicamente, dicha reacción ocurre en una solución acuosa, preferiblemente en una solución acuosa tamponada. Preferiblemente se usa un pH adecuado para la formación de oximas, donde el FVIII es estable, tal como por ejemplo pH 6,0-8,5, más
15 preferiblemente pH 6,3-7,5. Las soluciones tampón adecuadas son conocidas por los expertos en el técnica. La temperatura de dicha solución es típicamente de 0°C a 60°C, preferiblemente de 20°C a 40°C. La reacción se puede monitorizar por técnicas conocidas para determinar una reacción o período de incubación óptimos. El producto bruto se purifica generalmente mediante técnicas conocidas, tales como el intercambio iónico y/o la ultrafiltración, antes de las siguientes fases.
20 [0020] Los derivados de Factor VIII de la fórmula (II) son productos intermedios útiles para la formación de un derivado de Factor VIII de la fórmula (I).
[0021] La suma de m y n en el derivado de Factor VIII de la fórmula (I) es igual a q en el derivado de Factor VIII de la
25 fórmula (II) a partir de la que se obtiene. Así, (i) n de las fracciones q -C(O)-NH-O-B-O-NH2 presentes en el derivado de Factor VIII de la fórmula (II) reaccionan con el aldehído de fórmula (IV) y (ii) m de las fracciones q -C(O)-NH-O-B-O-NH2 presentes en el derivado de Factor VIII de la fórmula (II) no reaccionan con el aldehído de fórmula (IV). Cada molécula del derivado de Factor VIII de la fórmula (II), por lo tanto, reacciona con moléculas n del aldehído de la fórmula (IV).
30 [0022] En los compuestos de la fórmula (II), q representa un número entero de 1 a 20. Típicamente q representa un número entero de 1 a 15. Preferiblemente q representa un número entero de 1 a 10. Más preferiblemente q representa un número entero de 1 a 6.
[0023] En los compuestos de la fórmula (I), m representa 0 o un número entero de 1 a 19, n representa un número
35 entero de 1 a 20 y la suma de m y n es de 1 a 20. Preferiblemente m representa 0 o un número entero de 1 a 14, n representa un número entero de 1 a 15 y la suma de m y n es de 1 a 15. Más preferiblemente m representa 0 o un número entero de 1 a 9, n representa un número entero de 1 a 10 y la suma de m y n es de 1 a 10. De la forma más preferible m representa 0 o un número entero de 1 a 5, n representa un número entero de 1 a 6 y la suma de m y n es de 1 a 6.
40 [0024] Como se utiliza en este caso, una sal farmacéuticamente aceptable es una sal con un ácido o base farmacéuticamente aceptables. Los ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen tanto ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico sulfúrico, fosfórico, difosfórico, bromhídrico o nítrico y ácidos orgánicos tales como ácido cítrico, fumárico, maléico, málico, ascórbico, succínico, tartárico, benzoico, acético, metanosulfónico, etanosulfónico,
45 bencenosulfónico o p-toluenosulfónico. Las bases farmacéuticamente aceptables incluyen metal alcalino (p. ej. sodio o potasio) y metal alcalino térreo (p. ej. calcio o magnesio) hidróxidos y bases orgánicas tales como aminas de alquilo, aminas de aralquilo y aminas heterocíclicas.
[0025] La actividad de Factor VIII de los derivados mencionados anteriormente típicamente es sustancialmente la misma 50 que la actividad del Factor VIII humano activado. La "actividad de FVIII" se define como la capacidad para funcionar en
la cascada de coagulación, inducir la formación de Factor Xa vía interacción con el Factor IXa de una plaqueta activada y soportar la formación de un coágulo sanguíneo. La actividad de Factor VIII se puede evaluar in vitro por técnicas tales como el análisis de coágulo, según se describe en, por ejemplo, Manucci y Tripodi, "Factor VIII clotting activity". E. C. A.
T. assay procedures, London: Kluwer Academic Publishers, 1999; análisis del potencial de trombina endógeno, como se describe en Hemker et al., "The thrombogram: monitoring thrombin generation in platelet- rich plasma.", Thrombosis and haemostasis, vol. 83:589-591; y otras técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
[0026] Así, los derivados de Factor VIII de la invención se seleccionarán típicamente para valorar si han mantenido sustancialmente la misma actividad que el Factor VIII humano activado.
[0027] Como se utiliza en este caso, la actividad de Factor VIII sustancialmente igual a la actividad de Factor VIII humano activado significa que la actividad de Factor VIII es al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, así como al menos 100% de la del Factor VIII humano. La actividad de Factor VIII es, en particular, de aproximadamente el 50 a aproximadamente el 75%, de aproximadamente el 75 a aproximadamente el 85%, de aproximadamente el 85 a aproximadamente el 95% e incluso más del 100% de la del Factor VIII humano.
Transglutaminasa
[0028] El término "transglutaminasa", como se utiliza en este caso, se refiere a enzimas de la clase EC 2.3.2.13. Ejemplos de una transglutaminasa útil incluyen una transglutaminasa microbiana, típicamente de Streptomyces mobaraense, Streptomyces cinnamoneum y Streptomyces griseo-carneum (todas descritas en la patente de EEUU nº: 5.156.956, que se incorpora en el presente documento como referencia), Streptomyces lavendulae (descrita en la patente de EEUU nº: 5.252.469, que se incorpora en el presente documento como referencia) o Streptomyces ladakanum (JP-A-2003199569, que se incorpora en el presente documento como referencia). Debe observarse que los elementos del género anterior de Streptoverticillium están incluidos ahora en el género Streptomyces [Kaempfer, J. Gen. Microbiol., 137,1831-1892,1991].
[0029] Se han aislado otros ejemplos de una transglutaminasa útil microbiana a partir de Bacillus subtilis (descrito en la US 5.731.183, que se incorpora en el presente documento como referencia) y de varios Myxomycetes. Otros ejemplos de una transglutaminasa microbiana útil son las descritas en la WO 96/06931 (p. ej. transglutaminasa de Bacilus lydicus) y la WO 96/22366, ambas incorporadas como referencia.
[0030] Una transglutaminasa útil no microbiana incluye una transglutaminasa de hígado de conejillo de Indias, y una transglutaminasa de varias fuentes marinas tales como el pez plano Pagrus major (descrita en la EP-A-0555649, que se incorporado en el presente documento como referencia), y la ostra japonesa Crassostrea gigas (descrita en la patente de EEUU nº: 5.736.356, que se incorpora en el presente documento como referencia).
[0031] Otras transglutaminasas que se deberían mencionar son las transglutaminasas humanas TG2, TG3, TG7 o FXIII.
[0032] Otras transglutaminasas útiles no microbianas son las transglutaminasas humanas TG1 y TG6.
[0033] Se prefiere una transglutaminasa de Streptomyces mobaraense.
Factor VIII
[0034] La molécula de Factor VIII maduro consiste en 2332 aminoácidos que se pueden agrupar en tres dominios A homólogos, dos dominios C homólogos y un dominio B que se disponen en el siguiente orden: A1-A2-B-A3-C1-C2. Durante su secreción en el plasma, el Factor VIII se procesa intracelularmente en una serie de heterodímeros enlazados a ión de metal mientras el Factor VIII monocatenario se escinde en el límite B-A3 y en sitios diferentes dentro del dominio B. Este tratamiento conduce a una cadena pesada que consiste en el dominio A1, A2 y varias partes del dominio B, que tiene un tamaño molecular que varía de 90 kDa a 200 kDa. Las cadenas pesadas están ligadas vía un ión metálico a la cadena ligera, que consta del dominio A3, C1 y C2. En el plasma, este Factor VIII heterodimérico se enlaza con alta afinidad al Factor de von Willebrand (vWF), que lo protege de catabolismo prematuro. La vida media del Factor VIII no activado ligado a vWF es de aproximadamente 12 horas en plasma.
[0035] Durante el proceso de coagulación sanguínea, el Factor VIII se activa mediante escisión proteolítica por Factor Xa y trombina en los aminoácidos Arg372 y Arg740 dentro de la cadena pesada y en Arg1689 en la cadena ligera, dando como resultado la liberación del Factor de von Willebrand y generando el heterotrímero de Factor VIII activado que formará el complejo de tenasa en las superficies fosfolipídicas con Factor IXa y Factor X siempre que haya Ca2+. El heterotrímero consiste en el dominio A1, un fragmento de 50 kDa, el dominio A2, un fragmento de 43 kDa y la cadena ligera (A3-C1-C2), un fragmento de 73 kDa. Así, la forma activa de Factor VIII (Factor VIIIa) consiste en una subunidad A1 asociada a través del enlace de ión metálico bivalente a una cadena ligera A3-C1-C2 escindida por trombina y una subunidad A2 libre asociada de forma relativamente débil al dominio A1 y A3.
[0036] Una molécula de Factor VIII que consiste en la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) de Factor VIII conectada con un enlazador pequeño del dominio B (Factor VIII con el dominio B eliminado o BDD-FVIII) retiene la actividad biológica del Factor VIII de longitud total (nativo).
[0037] Como se utiliza en este caso, el término "Factor VIII" incluye cualquier polipéptido de Factor VIII que sea terapéuticamente útil, por ejemplo eficaz para la prevención o el tratamiento del sangrado. Esto incluye, sin limitación, Factor VIII humano tipo salvaje, Factor VIII híbrido humano/porcino, Factor VIII humano con el dominio B eliminado y Factor VIII humano con el dominio B parcialmente eliminado.
[0038] El término "Factor VIII" tiene el propósito de abarcar, sin limitación, los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos tal y como se describe en Toole et al., Nature 1984, 312: 342-347 (Factor VIII humano de tipo salvaje), al igual que el derivado de Factor VIII de tipo salvaje de otras especies, tales como, por ejemplo, Factor VIII bovino, porcino, canino, murino y de salmón. Además, abarca variaciones alélicas naturales de Factor VIII que pueden existir y ocurrir de un individuo a otro. También, el grado y la ubicación de la glicosilación u otras modificaciones postraduccionales pueden variar dependiendo de las células huésped elegidas y la naturaleza del entorno celular huésped. El término "Factor VIII" también tiene la intención de abarcar formas no divididas (zimógeno), al igual que las procesadas proteolíticamente para producir sus formas bioactivas respectivas, que se pueden denominar Factor VIIIa.
[0039] El término "Factor VIII" tiene la intención de abarcar polipéptidos con una secuencia de aminoácidos ligeramente modificada, por ejemplo, polipéptidos que tienen un extremo N-terminal que incluye deleciones o adiciones de aminoácido en el N-terminal, y/o polipéptidos que se han modificado químicamente con respecto al Factor VIII humano. El término "Factor VIII" tiene la intención de incluir variantes de Factor VIII, con independencia de que muestren sustancialmente la misma o mejorada bioactividad que el Factor VIII de tipo salvaje, o, alternativamente, que muestren bioactividad reducida o sustancialmente modificada con respecto al Factor VIII de tipo salvaje, incluyendo, de forma no limitativa, polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia del Factor VIII de tipo salvaje por inserción, eliminación o sustitución de uno o más aminoácidos.
[0040] Ejemplos no limitativos de Factor VIII incluyen Factor VIII humano derivado del plasma tal y como se describe, por ejemplo, en Fulcher et al.; Proc. Acad. Nat. Sci. USA 1982; 79:1648-1652, y Fulcher et al.; Proc. Acad. Nat. Sci. USA 1982; 79:1648-1652, y Factor VIII porcino derivado del plasma tal y como se describe, por ejemplo, en Fass et al.; Blood 1982; 59: 594-600 y Knutson et al.; Blood 1982; 59: 615-624. Ejemplos no limitativos de variantes de secuencia de Factor VIII se describen, por ejemplo, en Lollar et al.; Blood 2000; 95(2): 564-568 (hybrid porcine/human FVIII polypeptides) y Lollar et al.; Blood 2001; 97(1): 169-174.
[0041] La clonación del ADNc para Factor VIII (Wood, W.I., et al. (1984) Nature 312, 330-336; Vehar, G.A., et al. (1984) Nature 312, 337-342) hizo posible expresar Factor VIII de forma recombinante llevando al desarrollo de diferentes productos de Factor VIII recombinante, que fueron aprobados por las autoridades reguladoras entre 1992 y 2003. El hecho de que el dominio B central de la cadena polipeptídica de Factor VIII que reside entre los aminoácidos Arg-740 y Glu-1649 no parezca ser necesario para actividad biológica completa también ha llevado al desarrollo de un Factor VIII con el dominio B eliminado. Véase también Kjalke M, Heding A, Talbo G, Persson E, Thomsen J y Ezban M (1995), "Amino acid residues 721-729 are required for full Factor VIII activity". Eur. J. Biochem: 234: 773-779. El Factor VIII, tal y como se utiliza en este caso, incluye todas las variantes de Factor VIII, incluidas aquellas en las que se han eliminado uno o más dominios o regiones.
[0042] Las posiciones de los residuos de glutamina que reaccionan bajo catálisis de transglutaminasa se pueden determinar por asimilación directa con las enzimas adecuadas, tal como por ejemplo tripsina, seguida de mapeo peptídico o de mapeo peptídico con un grupo indicador, tal como por ejemplo biotina, o un grupo de fluorescencia, tal como por ejemplo Alexa 488. Típicamente, cuando el Factor VIII se reacciona con transglutaminasa de Streptomyces mobaraense, la mayor parte de los residuos de glutamina mostrados en la fórmula (I) pertenecen a las cadenas laterales de residuos de glutamina de la cadena pesada de Factor VIII. Preferiblemente, dichos residuos de glutamina están principalmente en el dominio A1.
[0043] Como se utiliza en este caso, el término "grupo de carbamoil" se refiere al radical -C(O)-NH2, tal y como se encuentra, por ejemplo, en la cadena lateral de un residuo de glutamina. Como se utiliza en este caso, el término "mono
o polirradical de Factor VIII obtenido por eliminación de los grupos de carbamoil n + m o q de las cadenas laterales de los residuos de glutamina presentes en el Factor VIII" significa que los grupos -C(O)-NH2 n + m o q se eliminan formalmente de las cadenas laterales de los residuos de glutamina. Como el experto en la materia entenderá, el uso de estos términos no indica que un enlace de carbono-carbono se rompa en los residuos de glutamina, simplemente que la definición de "mono o polirradical de Factor VIII" que se utiliza en este caso no incluye las partes de carbamoil de uno o más residuos de glutamina. Esto se ilustra a continuación:
[0044] El diagrama de la izquierda muestra la molécula de Factor VIII con una cadena lateral de glutamina. El diagrama a la derecha muestra un "mono de Factor VIII obtenido por eliminación de un grupo carbamoil de la cadena lateral de un residuo de glutamina presente en el Factor VIII".
Fracciones (M1) que aumentan la vida media en plasma del derivado de Factor VIII
[0045] La reacción del derivado de Factor VIII de la fórmula (II) con un aldehído de la fórmula (IV) introduce una fracción M en el Factor VIII. En una forma de realización, M es una fracción (M1) que aumenta la vida media en plasma del derivado de Factor VIII.
[0046] El Factor VIII tiene un número de sitios de aclaramiento. Como se utiliza en este caso, el término "sitio de aclaramiento" se define como una región en la molécula de Factor VIII que es reconocida por la maquinaria fisiológica responsable de la degradación de la proteína. Así, la vida media del Factor VIII se puede aumentar mediante la interrupción de dichos sitios de aclaramiento introduciendo un sustituyente M1. Un "sitio de aclaramiento interrumpido" se define como un sitio de aclaramiento en la molécula de Factor VIII que muestra unión reducida a su receptor cognado
o socio de interacción como resultado de la modificación anteriormente mencionada.
[0047] Así, la vida media en plasma de Factor VIII se puede mejorar introduciendo una o más fracciones en el Factor VIII que disgreguen los sitios de aclaramiento. Tales fracciones típicamente esconden, enmascaran o eclipsan uno o más sitios de aclaramiento en el Factor VIII. Así, en una forma de realización, la invención proporciona un derivado de Factor VIII con una vida media en plasma mejorada. La mejora es con respecto al Factor VIII correspondiente no modificado.
[0048] La vida media en plasma de Factor VIII o de un derivado de Factor VIII se determina midiendo la vida media en plasma in vivo. El Factor VIII humano tiene una vida media en plasma de aproximadamente 12-14 horas. La "vida media en plasma in vivo" es el tiempo en el que el 50% del Factor VIII o de un derivado de Factor VIII circula en el plasma o en el flujo sanguíneo antes de ser despejado. Determinar la vida media en plasma es típicamente más simple que determinar la vida media funcional y la magnitud de la vida media en plasma suele ser un buen indicio de la magnitud de la vida media in vivo funcional. Términos alternativos para vida media en plasma incluyen: vida media en suero, vida media circulante, vida media circulatoria, vida media de eliminación del suero, de eliminación del plasma y de eliminación.
[0049] El término "aumentado", tal y como se usa con respecto a la vida media en plasma, se utiliza para indicar que la vida media pertinente del derivado de Factor VIII ha aumentado de forma significativa estadísticamente con relación a la del Factor VIII no modificado, según se determina bajo condiciones comparables. Por ejemplo la vida media pertinente se puede aumentar en al menos aproximadamente 25%, tal como en aproximadamente 50%, por ejemplo, en al menos aproximadamente 100%, 150%, 200%, 250% o 500%. En una forma de realización, los derivados de Factor VIII de la presente invención muestran un aumento en la vida media de al menos aproximadamente 5 horas, preferiblemente al menos aproximadamente 24 horas, más preferiblemente al menos aproximadamente 72 horas y de la forma más preferible al menos aproximadamente 7 días, con respecto a la vida media del Factor VIII progenitor.
[0050] El término "Factor VIII progenitor", tal y como se utiliza en este caso, se refiere al Factor VIII específico del que se deriva el derivado de Factor VIII en cuestión.
[0051] La medición de la vida media en plasma in vivo se puede llevar a cabo de varias formas, tal y como se describe en la bibliografía. Un aumento de la vida media en plasma in vivo se puede cuantificar como una reducción en el aclaramiento (CL) o como un aumento en el periodo de permanencia medio (MRT). Los derivados de Factor VIII de la presente invención para los que el CL disminuye a menos del 70%, tal como a menos del 50%, tal como a menos del 20%, tal como a menos del 10% del CL del Factor VIII progenitor, tal y como se determina en un ensayo adecuado, se considera que tienen una vida media en plasma in vivo aumentada. Los derivados de Factor VIII de la presente invención para los que MRT aumenta a más del 130%, tal como a más del 150%, tal como a más del 200%, tal como a
más del 500% del MRT del Factor VIII progenitor en un ensayo adecuado, se considera que tienen una vida media en plasma in vivo aumentada. El aclaramiento y el periodo de permanencia medio se pueden evaluar en estudios farmacocinéticos estándar usando animales de ensayo adecuados. Está dentro de las capacidades de un experto en la técnica elegir un animal de ensayo adecuado para una proteína dada. Los ensayos en humanos, por supuesto, representan la prueba definitiva. Típicamente, y como un ejemplo, se inyecta a ratones, ratas, perros, simios o cerdos con el compuesto de interés. La cantidad inyectada depende del animal de ensayo. Posteriormente, se toman muestras de sangre durante un periodo de uno a cinco días, como sea apropiado, para la evaluación de CL y MRT. Las muestras de sangre se analizan de forma conveniente por técnicas de ELISA.
[0052] M1 comprende típicamente uno o más polímeros hidrofílicos o ligantes de proteína plasmática. El polímero puede ser un polímero químico, tal como por ejemplo una fracción de polietilenoglicol (PEG), o un biopolímero, tal como por ejemplo un polisacárido, fracciones de ácido polisiálico, fracciones de ácido hialurónico o polipéptidos. Un ejemplo de polisacárido es ácido polisiálico. Un ejemplo de polipéptido que consiste en un tipo de aminoácido es poli-Gly. Los polipéptidos que consisten en diferentes aminoácidos también se puede usar como ejemplos de la invención. Preferiblemente M1 comprende (a) una fracción de PEG, un polipéptido de ácido polisiálico o un aglutinante de proteína plasmática, (b) una fracción de PEG y un ligante de proteína plasmática, (c) una fracción de PEG y un polipéptido, (d) un polipéptido y un ligante de proteína plasmática, (e) una fracción de ácido polisiálico y un ligante de proteína plasmática,
o (f) una fracción de ácido polisiálico y un polipéptido.
[0053] El término "PEG", tal y como se utiliza en este caso, se refiere a poli(etileno glicol), también conocido como poli(etileno óxido) (PEO) o polioxietileno (POE), son poliéteres. El PEG se prepara por polimerización de óxido de etileno y está disponible comercialmente en una amplia variedad de pesos moleculares de 300 g/mol a 10.000.000 g/mol.
[0054] También existen diferentes formas de PEG dependiendo del iniciador usado para el proceso de polimerización. La forma más común de PEG es un éter metílico monofuncional PEG (metoxipoli(etileno glicol), abreviado mPEG.
[0055] Los PEGs también están disponibles con geometrías diferentes, tales como PEGs lineales y ramificados.
[0056] El PEG tiene la estructura HO-(CH2-CH2-O-)n-H, la fórmula molecular C2nH4n+2On+1, y el número de CAS [2532268-3]. La masa molar depende, por supuesto, de n.
[0057] Los números que se incluyen frecuentemente en los nombres de los PEGs indican sus pesos medios moleculares, por ejemplo, un PEG con n=80 tendría un peso molecular medio de aproximadamente 3500 daltones y se marcaría como PEG 3500.
[0058] Muchos PEGs incluyen moléculas con una distribución de pesos moleculares, es decir, son polidispersos. La distribución del tamaño se puede caracterizar estadísticamente por su peso molecular medio en peso (Mw) y su peso molecular medio en número (Mn), cuya proporción se denomina índice de polidispersidad (Mw/Mn) (véase, por ejemplo, "Polymer Synthesis and Characterization", J. A. Nairn, University of Utah, 2003). Mw y Mn se pueden medir por espectroscopia de masas.
[0059] El índice de polidispersidad es, por consiguiente, un número que es mayor o igual a uno, y también se puede estimar a partir de datos cromatográficos de permeación por gel. Cuando el índice de polidispersidad es 1, el producto es monodisperso y, de este modo, formado por compuestos con un único peso molecular. Cuando el índice de polidispersidad es mayor de 1, el polímero es polidisperso y el índice de polidispersidad muestra cuán amplia es la distribución de polímeros con diferentes pesos moleculares. El índice de polidispersidad aumenta típicamente con el peso molecular de PEG o mPEG.
[0060] Para los fines de la presente, los términos "PEG" y "Peg" se usan de forma intercambiable y básicamente se refieren a un radical o dirradical que comprende la estructura
donde n es un número entero mayor de 1.
[0061] El término PEG se pretende que indique poli(etileno glicol) al igual que éter de monoalquilo de poli(etileno glicol), donde alquilo indica alquilo C1-6, tal como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y hexilo. Por consiguiente, en una forma de realización preferida, el Peg para su uso según la invención se representa por la siguiente fórmula:
en la que n es un número entero mayor de 1, y S y T designan independientemente alquiloxi, hidroxil, o están ausentes. Como se ha explicado anteriormente, un compuesto de esta fórmula en el que S designa metiloxi y T está ausente también se denomina mPEG.
[0062] El peso molecular de PEG para su uso según la invención es preferible que sea entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 1.000.000 Da. El peso molecular de PEG en kDa se puede indicar entre paréntesis. Por ejemplo, mPEG(30k) indica éter de monometil de poli(etileno glicol) con un peso molecular de aproximadamente 30 kDa. Este polímero puede, por otro lado, estar compuesto por aproximadamente 680 ± 100 unidades de etilenglicol. En otro ejemplo, en mPEG(4k) n es 90 y el peso molecular es 3991 Da, es decir aprox 4 kDa. Asimismo, mPEG(20k) tiene un peso molecular medio de 20 kDa y un n medio de 454.
[0063] El PEG, para su uso según la presente invención, es lineal o ramificado. En formas de realización particulares el PEG, para su uso según la invención, es a) polidisperso o b) monodisperso. En formas de realización particulares, el índice de polidispersidad de PEG para su uso según la invención está i) por debajo de 1,06, ii) por debajo de 1,05, iii) por debajo de 1,04, iv) por debajo de 1,03 o v) entre 1,02 y 1,03.
[0064] El ácido polisiálico presente en M1 es preferiblemente un homopolímero de ácido N-acetilneuramínico con α(2→8) enlaces cetosídicos (ácido colomínico), con peso molecular de 8 a 100kD, preferiblemente de 20 a 40kD.
[0065] Los polipéptidos presentes en M1 son preferiblemente proteínas plasmáticas. El término "proteína plasmática", tal y como se utiliza en este caso, se refiere a albúminas, anticuerpos y fibrinógenos, preferiblemente albúminas y anticuerpos.
[0066] El término "albúmina", tal y como se utiliza en este caso, se refiere a albúmina de suero procedente de suero sanguíneo, e incluye albúmina de suero humano así como albúmina de suero de otras fuentes. El término "albúmina", tal y como se utiliza en este caso, incluye cualquier derivado de albúmina o versiones modificadas de albúmina.
[0067] El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico. Preferiblemente es un anticuerpo monoclonal. Preferiblemente el anticuerpo es un anticuerpo IgG1 (p. ej. IgG1, ☐), IgG3 (p. ej. IgG3, ☐y IgG4 (p. ej. IgG4,
☐). No obstante, otros isotipos de anticuerpos también están abarcados por la invención, incluyendo IgG2, IgM, IgA1, IgA2, IgA secretor, IgD, e IgE. Los fragmentos de unión al antígeno adecuados de tales anticuerpos incluyen Fab, F(ab')2, Fv, fragmentos de Fv monocatenario o anticuerpos biespecíficos. Además, los fragmentos de unión al antígeno incluyen proteínas de fusión de inmunoglobulina con dominio de unión que comprenden (i) un polipéptido de dominio de unión (tal como una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera) que se fusiona a un polipéptido de región de bisagra de inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con la región de bisagra, y (iii) una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con la región constante CH2. Tales proteínas de fusión de inmunoglobulina con dominio de unión se describen más en detalle en la US 2003/0118592 y la US 2003/0133939. Alternativamente, un fragmento puede comprender la región constante de un anticuerpo; de este modo, un fragmento puede ser un fragmento de Fc o parte del mismo.
[0068] El término "ligante de proteína plasmática", tal y como se utiliza en este caso, se refiere a cualquier fracción capaz de unirse a una proteína plasmática, particularmente albúmina. Una fracción que se une a la albúmina es un "ligante de albúmina". La capacidad de un compuesto para unirse a la albúmina se puede determinar según se describe en J. Med. Chem, 43, 2000, 1986-1992, que se incorpora en este caso como referencia. En el presente contexto, un compuesto se define como unión a la albúmina si Ru/Da está por encima de 0,05, tal como por encima de 0,10, tal como por encima de 0,12 o incluso por encima de 0,15. Los ligantes de albúminas son típicamente moléculas altamente hidrofóbicas, preferiblemente derivadas de ácidos grasos. Así, un ligante de albúmina comprenderá preferiblemente una fracción de -(CH2)12-.
[0069] Una fracción preferida (M1) que comprende una fracción de PEG es:
dónde mPEGyl es polidisperso y tiene un peso molecular de aproximadamente 20kDa. [0070] Una fracción preferida (M1) que comprende un ligante de albúmina es:
[0071] Una fracción preferida (M1) que comprende una fracción de PEG y un ligante de albúmina es:
Fracciones Indicadoras (M2)
[0072] La reacción del derivado de Factor VIII de la fórmula (II) con un aldehído de la fórmula (IV) introduce una fracción
10 M en el Factor VIII. En una forma de realización, M es una fracción indicadora (M2). Un derivado de Factor VIII de la fórmula (II) que porta una o más fracciones indicadoras (M2) tiene de forma típica sustancialmente la misma actividad que el Factor VIII humano activado. El término "sustancialmente la misma actividad que el Factor VIII humano activado" tiene el significado definido anteriormente.
15 [0073] Las fracciones indicadoras (M2) pueden comprender cualquier marcador adecuado que permita que se detecte el derivado de Factor VIII. Los expertos en la técnica conocen los marcadores adecuados, que incluyen biotina; marcadores fluorescentes tales como radicales de fluoresceína, radicales de rodamina, radicales de Texas Red ®, tintes de Alexa Fluor ® tales como Alex Fluor 488 y radicales de proteína de ficobili; radioisótopos, por ejemplo Cu-64, Ga67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99, Rh-105, Pd-109, In-111, I-123, I-125, I-131, Re-186, Re-188, Au-198, Pb-203, At-211, Pb
20 212 y Bi-212 y sustratos enzimáticos, tales como radical de acetato de p-nitrofenol. Se prefieren las fracciones indicadoras que comprenden biotina o marcadores fluorescentes.
[0074] Los marcadores de biotina pueden detectarse o reconocerse fácilmente utilizando ensayos conocidos por un experto en la técnica, usando típicamente estreptavidina, por ejemplo un ensayo de ALISA. Los marcadores
25 fluorescentes también pueden detectarse o reconocerse utilizando ensayos conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo usando citometría de flujo. Los radioisótopos también se pueden detectar o reconocer utilizando ensayos conocidos por un experto en la técnica.
[0075] Una fracción indicadora preferida (M2) que comprende biotina es: 30
[0076] Una fracción indicadora preferida (M2) son los tintes de la serie Alexa disponibles comercialmente en Invitrogen.
35 De los mismos, un tinte preferido es Alexa 488. Diferentes reactivos para la fijación de Alexa 488 están disponibles comercialmente en Invitrogen. Este tinte se puede detectar fácilmente con su fluorescencia, que se puede observar a una excitación de 495 nm y una emisión de 519 nm. La estructura general de Alexa 488 es:
Reactivos de dihidroxilamina
[0077] Los compuestos de dihidroxilamina usados en la presente invención son compuestos de la fórmula (III):
H2N-O-B-O-NH2 (III)
donde B representa un alquileno de C2 a C10. Dicho alquileno C2 a C10 es un alquileno ramificado o lineal, preferiblemente lineal. B representa típicamente un alquileno C2 a C6, preferiblemente un alquileno C2 a C4. B preferiblemente es un grupo de n-etileno, n-propileno o n-butileno, de la forma más preferible, un grupo de n-propileno. Así, un compuesto preferido de dihidroxilamina es 1,3- diaminoxipropano.
[0078] Los compuestos de dihidroxilamina de la fórmula (III) se obtienen fácilmente a partir de reactivos disponibles comercialmente mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica, por analogía con métodos conocidos.
Composiciones farmacéuticas
[0079] La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un derivado de Factor VIII de la fórmula (I). Típicamente, dicha composición farmacéutica comprende además un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
[0080] Un portadores o diluyente farmacéuticamente aceptable preferido es una solución acuosa tamponada. Así, la presente invención se refiere a una fórmula farmacéutica que comprende una solución acuosa de un derivado de Factor VIII y un tampón, donde el derivado de Factor VIII está presente en una concentración de 0,01 mg/ml o superior, y donde dicha fórmula tiene un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0.
[0081] Típicamente, el tampón se selecciona del grupo que consiste en acetato sódico, carbonato de sodio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrógeno fosfato de sodio, hidrógeno fosfato de disodio, fosfato sódico, y tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o mezclas derivadas. Cada uno de estos tampones específicos constituye una forma de realización alternativa de la invención.
[0082] Típicamente, la formulación comprende además un conservante farmacéuticamente aceptable. En otra forma de realización de la invención el conservante se selecciona del grupo que consiste en fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, phidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, alcohol bencílico, clorobutanol y tiomersal, bronopol, ácido benzoico, imidurea, clorhexidina, deshidroacetato de sodio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etilo, cloruro de bencetonio, clorfenesina (3p- clorofenoxipropano-1,2-diol) o mezclas derivadas. En otra forma de realización de la invención el conservante está presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el conservante está presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el conservante está presente en una concentración de 5 mg/ml a 10 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el conservante está presente en una concentración de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada uno de estos conservantes específicos constituye una forma de realización alternativa de la invención. El uso de un conservante en composiciones farmacéuticas es bien conocido por el experto en la materia. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
[0083] Típicamente, la fórmula comprende además un agente isotónico. En otra forma de realización de la invención el agente isotónico se selecciona del grupo que consiste en una sal (p. ej. cloruro sódico), un azúcar o alcohol de azúcar, un aminoácido (p. ej. L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), un alditol (p. ej. glicerol (glicerina), 1,2-propanediol (propileneglicol), 1,3-propanediol, 1,3-butanediol) polietilenoglicol (p. ej. PEG400),
o mezclas derivadas. Se puede utilizar cualquier azúcar, tal como mono-, di- o polisacáridos, o glucanos hidrosolubles, incluyendo, por ejemplo, fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano,
pululano, dextrina, ciclodextrina, almidón soluble, almidón de hidroxietilo y carboximetilcelulosa-Na. En una forma de realización el aditivo de azúcar es sacarosa. El alcohol de azúcar se define como un hidrocarburo C4 -C8 con al menos un grupo -OH e incluye, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En una forma de realización, el aditivo de alcohol de azúcar es manitol. Los azúcares o polialcoholes mencionados anteriormente se pueden utilizar individualmente o combinados. No hay un límite establecido para la cantidad usada, siempre y cuando el azúcar o el alcohol de azúcar sea soluble en la preparación líquida y no afecte de forma adversa a los efectos estabilizantes que se obtienen utilizando los métodos de la invención. En una forma de realización, la concentración de azúcar o de alcohol de azúcar está entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 150 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el agente isotónico está presente en una concentración de 1 mg/ml a 50 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el agente isotónico está presente en una concentración de 1 mg/ml a 7 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el agente isotónico está presente en una concentración de 8 mg/ml a 24 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el agente isotónico está presente en una concentración de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada uno de estos agentes específicos isotónicos constituye una forma de realización alternativa de la invención. El uso de un agente isotónico en composiciones farmacéuticas es bien conocido por el experto en la materia. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
[0084] Típicamente, la formulación comprende además un agente quelante. En otra forma de realización de la invención el agente quelante se selecciona de: sales de ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), ácido cítrico y ácido aspártico y sus mezclas derivadas. En otra forma de realización de la invención el agente quelante está presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el agente quelante está presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 2 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el agente quelante está presente en una concentración de 2 mg/ml a 5 mg/ml. Cada uno de estos agentes quelantes específicos constituye una forma de realización alternativa de la invención. El uso de un agente quelante en composiciones farmacéuticas es bien conocido por el experto en la materia. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
[0085] Típicamente, la formulación comprende además un estabilizador. El uso de un estabilizador en composiciones farmacéuticas es bien conocido por el experto en la materia. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
[0086] Típicamente, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender además una cantidad suficiente de una base de aminoácidos para reducir la formación de agregados por el polipéptido durante el almacenamiento de la composición. Por "base de aminoácidos" se entiende un aminoácido o una combinación de aminoácidos, donde cualquier aminoácido dado está presente bien en su forma de base libre bien en su forma de sal. Cuando se usa una combinación de aminoácidos, todos los aminoácidos pueden estar presentes en sus formas de base libre, todos pueden estar presentes en sus formas de sal o algunos pueden estar presentes en su forma de base libre mientras que otros están presentes en su forma de sal. En una forma de realización, los aminoácidos que se pueden usar para preparar las composiciones de la invención son los que portan una cadena lateral cargada, tal como arginina, lisina, ácido aspártico y ácido glutámico. Cualquier estereoisómero (es decir, isómero L, D o DL) de un aminoácido particular (p. ej. glicina, metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina y sus mezclas derivadas) o combinaciones de estos estereoisómeros, pueden estar presentes en las composiciones farmacéuticas de la invención mientras que el aminoácido particular esté presente ya sea en su forma de base libre o su forma de sal. En una forma de realización se usa el estereoisómero L. Las composiciones de la invención también se puede formular con análogos de estos aminoácidos. Por "análogo de aminoácido" se entiende un derivado del aminoácido de origen natural que provoca el efecto deseado de disminución de formación de agregados por el polipéptido durante el almacenamiento de las composiciones farmacéuticas líquidas de la invención. Los análogos de arginina adecuados incluyen, por ejemplo, aminoguanidina o nitina y N-monoetil L-arginina, los análogos de metionina adecuados incluyen etionina y butionina y los análogos de cisteína adecuados incluyen S-metil-L cisteína. Como con los otros aminoácidos, los análogos de aminoácidos se incorporan a las composiciones en su forma de base libre o su forma de sal. En otra forma de realización de la invención, los aminoácidos o análogos de aminoácidos se usan en una concentración que es suficiente para prevenir o retardar la agregación de la proteína.
[0087] En otra forma de realización de la invención, se puede agregar metionina (u otros aminoácidos sulfúricos o análogo de aminoácidos) para inhibir la oxidación de los residuos de metionina a sulfóxido de metionina cuando el polipéptido que actúa como agente terapéutico es un polipéptido que comprende al menos un residuo de metionina susceptible de tal oxidación. Por "inhibir" se entiende la acumulación mínima de especies oxidadas de metionina a lo largo del tiempo. La inhibición de la oxidación de metionina produce una mayor retención del polipéptido en su forma molecular apropiada. Se puede usar cualquier estereoisómero de metionina (isómero L, D o DL) o combinaciones de los mismos. La cantidad que hay que añadir debería ser una cantidad suficiente para inhibir la oxidación de los residuos de metionina de manera que la cantidad de sulfóxido de metionina sea aceptable para las agencias reguladores. Típicamente, esto significa que la composición contiene no más de aproximadamente 10% a aproximadamente 30% de sulfóxido de metionina. En general, esto se puede conseguir añadiendo metionina de manera que la proporción de metionina añadida a los residuos de metionina varíe de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1000:1, tal como de
10:1 a aproximadamente 100:1.
[0088] Típicamente, la formulación comprende además un estabilizador seleccionado del grupo de polímeros de alto peso molecular o compuestos de bajo peso molecular. En otra forma de realización de la invención el estabilizador se selecciona de polietilenglicol (p. ej. PEG 3350), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, carboxi/hidroxicelulosa o derivados de los mismo (p. ej. HPC, HPC-SL, HPC-L y HPMC), ciclodextrinas, sustancias que contienen azufre tales como monotioglicerol, ácido tioglicólico y 2-metiltioetanol y diferentes sales (p. ej. cloruro sódico). Cada uno de estos estabilizadores específicos constituye una forma de realización alternativa de la invención.
[0089] Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes estabilizantes adicionales, que además potencian la estabilidad de un polipéptido terapéuticamente activo de las mismas. Los agentes estabilizantes de interés particular para la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, metionina y EDTA, que protegen el polipéptido frente a la oxidación de metionina, y un surfactante no iónico, que protege el polipeptídico frente a la agregación asociada a la liofilización o cizalladura mecánica.
[0090] En otra forma de realización de la invención, la formulación comprende un surfactante. El surfactante puede ser un detergente, aceite de ricino etoxilado, glicéridos poliglicolizados, monoglicéridos acetilados, ésteres de ácido graso de sorbitán, polímeros en bloque de polioxipropileno-polioxietileno (por ejemplo, poloxámeros tales como Pluronic® F68, poloxámero 188 y 407, Tritón X-100), ésteres de ácido graso de sorbitán de polioxietileno, polioxietileno y derivados de polietileno tales como derivados alcoxilados y alkilados (tweens, por ejemplo Tween-20; Tween-40; Tween-80 y Brij-35), monoglicéridos o derivados etoxilados de los mismos, diglicéridos o derivados de polioxietileno de los mismos, alcoholes, glicerol, lectinas y fosfolípidos (por ejemplo, serina de fosfatidilo, colina de fosfatidilo, etanolamina de fosfatidilo, inositol de fosfatidilo, glicerol de difosfatidil y esfingomielina), derivados de fosfolípidos (por ejemplo, ácido dipalmitoil-fosfatídico) y liso-fosfolípidos (por ejemplo, palmitoil-lisofosfatidil-L-serina y ésteres de 1-acil-sn-glicero-3fosfato de etanolamina, colina, serina o treonina) y alquilo, alcoxilo (éster alquílico), derivados alcoxi (alquilo éter) de lisofosfatidilo y fosfatidilcolinas, por ejemplo derivados de lauroilo y miristoilo de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina y modificaciones del grupo de cabeza polar, es decir, colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol y los de carga positiva DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, lisofosfatidilserina y lisofosfatidiltreonina, y glicerofosfolípidos (por ejemplo, cefalinas), gliceroglicolípidos (por ejemplo, galactopiranósidos), esfingoglicolípidos (por ejemplo, ceramidas, gangliósidos), dodecilfosfocolina, lisolecitina de huevo de gallina, derivados de ácido fusídico (p. ej. taurodihidrofusidato de sodio etc.), ácidos grasos de cadena larga y sales derivadas C6 -C12 (por ejemplo, ácido oleico y ácido caprílico), acilcarnitinas y derivados, derivados Nα-acilados de lisina, arginina o histidina, o derivados acilados de cadena lateral de lisina o arginina o histidina, o derivados acilados de cadena lateral de lisina o arginina, derivados Nα-acilados de dipéptidos que comprenden cualquier combinación de lisina, arginina o histidina y un aminoácido neutro o acídico, derivado de Nα-acilado de un tripéptido que comprende cualquier combinación de un aminoácido neutro y dos aminoácidos cargados, DSS (docusato de sodio, registro CAS nº: [577-11-7]), docusato de calcio, registro CAS nº: [128-49-4]), docusato de potasio, registro CAS nº: [7491-09-0]), SDS (dodecilsulfato sódico o laurilsulfato sódico), caprilato sódico, ácido cólico o derivados de los mismos, ácidos biliares y sales de los mismos y conjugados de glicina o taurina, ácido ursodesoxicólico, colato sódico, deoxicolato sódico, taurocolato sódico, glicocolato sódico, N-Hexadecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato, tensioactivos monovalentes aniónicos (alquil-arilsulfonatos), tensioactivos de ión híbrido (p. ej. N-alquil-N,N-dimetilamonio-1-propanosulfonatos, 3-colamido-1propildimetilamonio-1-propanosulfonatos, tensioactivos catiónicos (bases de amonio cuaternarias) (p. ej. bromuro de cetiltrimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio) tensioactivos no iónicos (por ejemplo, dodecil beta-D-glucopiranósido), poloxaminas (por ejemplo, Tetronic), que son copolímeros en bloque tetrafuncionales derivados de la adición secuencial de óxido de propileno y óxido de etileno a etilenodiamina, o el tensioactivo se puede seleccionar del grupo de derivados de imidazolina, o mezclas de los mismos. Cada uno de estos tensioactivos específicos constituye una forma de realización alternativa de la invención.
[0091] El uso de un tensioactivo en composiciones farmacéuticas es bien conocido por el experto en la materia. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
[0092] En la fórmula farmacéutica de la presente invención pueden estar presentes otros ingredientes. Tales ingredientes adicionales pueden incluir agentes de humidificación, emulsionantes, antioxidantes, agentes de carga, modificadores de tonicidad, agentes quelantes, iones metálicos, vehículos oleaginosos, proteínas (p. ej., albúmina de suero humano, gelatina o proteínas) y un ión híbrido (p. ej., un aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Tales ingredientes adicionales, por supuesto, no deben afectar de forma adversa a la estabilidad total de la fórmula farmacéutica de la presente invención.
[0093] En una forma de realización, el derivado de Factor VIII es en forma seca, a la que el médico o el paciente añade solventes y/o diluyentes antes de usarla. Por "forma seca" se entiende que la composición o fórmula líquida farmacéutica se seca bien por criodesecación (es decir, liofilización; véase, por ejemplo, Williams y Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59), por atomización (véase Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; y Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20), o al aire (Carpenter y Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; y Roser (1991) Biopharm. 4:47-53).
Utilidad terapéutica [0094] Los derivados de Factor VIII de la presente invención son terapéuticamente útiles, típicamente en el tratamiento del trastorno hereditario de la sangre hemofilia A (hemofilia clásica). La hemofilia A está causada por una deficiencia relacionada con el cromosoma X del Factor VIII de coagulación sanguínea y afecta casi exclusivamente al sexo masculino, con una incidencia de entre uno y dos individuos por cada 10.000. La manifestación clínica de la hemofilia A
5 es una tendencia al sangrado aumentada.
[0095] Los derivados de Factor VIII de la invención pueden, por lo tanto, utilizarse para aliviar los síntomas asociados a la hemofilia A, o detener la progresión o empeoramiento de dichos síntomas. Típicamente, el tratamiento se refiere a una reducción en la tendencia a sangrar de un paciente que tiene hemofilia A.
10 [0096] Los métodos comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un derivado de Factor VIII o composición farmacéutica de la invención a un paciente con hemofilia A. Como se utiliza en este caso, "cantidad terapéuticamente eficaz" incluye las cantidades que reducen la tendencia a sangrar de un paciente con hemofilia A. La cantidad debería, de este modo, ser suficiente para causar una reducción detectable de la gravedad del trastorno, lo que
15 típicamente supone una reducción de la tendencia a sangrar. Preferiblemente los derivados de Factor VIII de la invención se administran como parte de un régimen de dosificación semanal.
[0097] Los derivados de Factor VIII de la invención se pueden administrar en una variedad de formas de dosificación. Así, se pueden administrar parenteralmente, ya sea por vía subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal,
20 transdérmica o por técnicas de infusión. Los derivados de Factor VIII también se puede administrar por pulverización pulmonar o nasal, utilizando una solución o suspensión del derivado de Factor VIII en forma de pulverización pulmonar o nasal. La administración transdérmica incluye la inyección sin aguja o el uso de un parche, tal como un parche iontoforético.
25 [0098] Una dosis típica es de aproximadamente 15-100 U por kg de peso corporal, preferiblemente aproximadamente 20-75 U por kg de peso corporal, más preferiblemente aproximadamente 25-50 U por kg de peso corporal y de la forma más preferible de aproximadamente 30-40 U por kg de peso corporal, según la actividad del compuesto específico, la edad, el peso y las condiciones del sujeto que se va a tratar, el tipo y gravedad de la enfermedad y la frecuencia y forma de administración.
30 [0099] La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos:
Ejemplos
35 [0100] Las siguientes soluciones tampón se prepararon y usaron para la preparación de los productos Intermedios y los Ejemplos:
-
tampón A: 20mM de tampón de imidazol pH 7.3 conteniendo 10mM de CaCl2, 0,02% de Tween 80, 1M de
glicerol y 0,15M de NaCl; 40
-
tampón B: 20mM de tampón de imidazol pH 7.3 conteniendo 10mM de CaCl2, 0,02% de Tween 80,1 M de glicerol y 0,5M de NaCl;
-
tampón C: 20mM de tampón de imidazol pH 7.3 conteniendo 10mM de CaCl2, 0,02% de Tween 80, 1 M de 45 glicerol;
-
tampón D: 20mM de tampón de imidazol pH 7.3 conteniendo 10mM de CaCl2, 0,02% de Tween 80, 1 M de glicerol y 1 M de NaCl.
50 - tampón E: 100mM de tampón de imidazol pH 6.5 conteniendo 0,02% de Tween 80, 10% v/v de glicerol, 10mM de CaCl2;
-
tampón F: 5% (p/v) de hidroxipropilo β-ciclodextrina; y
55 - tampón G: 100mM de tampón de imidazol pH 6.5 conteniendo 0,02% de Tween 80, 10% v/v de glicerol, 0,15M de NaCl, 10mM de CaCl2.
Intermedio 1: 1,3-Diaminoxipropano
60 [0101]
[0102] Se agregó 1,8-Diazabiciclo[5,4,0]undec-7-eno (7,9 ml, 53 mmol) gota a gota a una solución de hidroxiftalimida (8,68 g, 53 mmol) en N,N-dimetilformamida (50 ml). Se agregó 1,3-Dibromopropano (2,7 g, 26 mmol). La solución se
agitó a 85 °C durante 1 hora. Se enfrió a temperatura ambiente y se vertió sobre hielo (200 ml). La mezcla fue agitada. El precipitado formado se aisló por filtración y se lavó con agua fría (50 ml) y acetonitrilo frío (50 ml). El producto bruto se recristalizó a partir de butanol (150 ml) y se secó para dar 2,67 g de 1,3-bis-(1,3-dioxo-1,3-dihidroisoindol-2iloxi)propano.
[0103] 1H-NMR (CDCl3): ☐ 2,22 (quinteto, 2 H); 4,51 (t, 4 H); 7,75 (m, 4 H); 7,82 (m, 2 H).
10 [0104] Una mezcla de 1,3-bis-(1,3-dioxo-1,3-dihidroisoindol-2-iloxi)propano (2,5 g, 6,8 mmol) en ácido clorhídrico concentrado (10 ml) y ácido acético (15 ml) se agitó a 115°C durante 3 h. Los solventes se eliminaron in vacuo. Se añadió agua (15 ml). La precipitación se aisló por filtración. Se lavó con 6 M de ácido clorhídrico (15 ml). El producto bruto se recristalizó a partir de etanol para dar 480 mg de la sal de hidrocloruro de 1,3-diaminoxipropano.
15 [0105] 1H-NMR (D2O): ☐ 2,05 (quinteto, 2 H); 4,13 (t, 4 H).
Intermedio 2: transaminación de Factor VIII con Intermedio 1 para dar Factor VIII de NGln-(3-aminoxi propiloxi)
20 [0106] Se proporcionó transglutaminasa microbiana (TGase) de Streptoverticillium mobaraense (de Ajinomoto) como polvo con 1% p/p de proteína. Se hizo una solución (11,4µM) en el tampón A.
[0107] Se agregó a la solución del tampón A (11,67 ml) una solución de un compuesto de Factor VIII con el dominio B eliminado a la que se agregó un péptido con la secuencia SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR fijado al C-término de la
25 cadena pesada en el tampón B (5,4 mg/ml; 400 µl), seguido de la adición de una solución de 1,3-diaminoxipropano (Intermedio 1) en el tampón A (55 mg/ml, 6,97 ml). La reacción se inició por adición de la solución de la enzima TGase (11,4 µM, 950 µl). La mezcla reactiva se incubó a 27°C durante 4 horas. La reacción se detuvo por adición de una solución de N-Etilmaleimida (15,6 mg/ml en el tampón A, 86µl) e incubación durante 10 min a 27°C.
30 [0108] El producto se purificó por intercambio iónico de la siguiente manera. La mezcla reactiva se diluyó en el tampón C (104ml) y se aplicó en dos dispositivos Vivapure Q Maxi M de intercambio iónico (número de producto de VivaScience VS-IX20QM08, VivaScience AG, Alemania) que previamente se habían equilibrado con el tampón C. Después de dos fases de lavado con el mismo tampón, el producto de reacción se eluyó con el tampón de elución D (19ml por dispositivo). El eluato resultante se sobreconcentró por ultrafiltración en dispositivos Amicon Ultra (corte 50kDa)
35 (Millipore Corp., EEUU) hasta 1,3ml.
[0109] La concentración de proteína se estimó por medición de absorción en 280nm (E1%=14,6 Lg-1cm-1) (Nanodrop ND-1000, Nanodrop Technologies, Inc, EEUU) dando una recuperación de proteína estimada de 97%.
40 [0110] El producto (Intermedio 2) se usó como tal en las fases posteriores.
Productos intermedios 3 a 7: preparación de aldehídos
[0111] Se prepararon productos intermedios de aldehído utilizando la síntesis multifase como se explica a continuación.
45 Intermedio 3: 7-((omega-(2-(3-((4-(3-Formilpropil)-1,2,3-triazol-1-yl)metil) benzoilamino)etil)5 kDa PEGyl) carbamoil)ácido heptadecanóico
[0112] [0113] El Intermedio 3 contiene un grupo de PEG y un ligante de albúmina -(CH2)12-Fase 1: metilo 3-(azidometil)benzoato [0114]
[0115] Se agregó azida sódica (5,68 g, 87 mmol) a una solución de metilo 3-(bromometil)benzoato (5,00 g, 22 mmol) en N,N-dimetilformamida (50 ml). Se agregó yoduro de tetrabutilamonio (81 mg, 0.22 mmol). La mezcla reactiva se calentó
10 a 60°C durante 16 horas. Se enfrió a temperatura ambiente y vertió sobre agua (200 ml). Esta mezcla se extrajo con acetato de etilo (400 ml). La capa orgánica se lavó con agua (3 x 200 ml) y se secó sucesivamente sobre sulfato de sodio. El solvente se eliminó in vacuo para dar 4,11 g de metilo 3-(azidometil)benzoato crudo, que se usó sin purificación adicional.
15 [0116] MS: m/z = 192.
[0117] 1H-NMR (CDCl3):☐ 3,92 (s, 3 H); 4,40 (s, 2 H); 7,50 (m, 2 H); 8,00 (m, 2 H).
Fase 2: 3-(Azidometil)ácido benzoico 20 [0118]
[0119] Una solución de hidróxido de litio (3,81 g, 21,5 mmol) en agua (25 ml) se agregó a una solución de metilo 3
25 (azidometil)benzoato crudo (4,11 g, 21,5 mmol) en 1,4-dioxano (25 ml). Se agregó agua y 1,4-dioxano hasta que se obtuvo una solución clara. La mezcla reactiva se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. Se añadió 1M de solución acuosa de hidróxido sódico (100 ml). La mezcla reactiva se lavó con éter metil tert-butílico (2 x 100 ml). La fase acuosa se acidificó con un 10% de solución acuosa de hidrogenosulfato de sodio. Se extrajo con acetato de etilo (2 x 200 ml). Las fases de acetato de etilo combinadas se secaron sobre sulfato magnésico. El solvente se eliminó in vacuo
30 para dar 3,68 g de 3-(azidometil)ácido benzoico crudo, que se usó sin purificación adicional.
[0120] MS: m/z = 150
[0121] 1H-NMR (CDCl☐☐☐ 4,57 (s, 3 H); 7,55 (m, 2 H); 8,00 (m, 2 H); 13,10 (br, 1 H). 35 Fase 3: Pirrolidina-2,5-diona-1-il3-(azidometil)éster benzoico
[0122]
40 [0123] 2-Succinimido-1,1,3,3-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TSTU, 32, 52 g, 107 mmol) se añadió a una solución de 3-(azidometil)ácido benzoico (19,01 g, 107 mmol) y trietilamina (14,96 ml, 107 mmol) en N,N-dimetilformamida (50 ml). La mezcla reactiva se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. Se diluyó con acetato de etilo (250 ml) y se lavó con agua (3 x 120 ml). La capa orgánica se lavó con una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio
45 (150 ml) y se secó sobre sulfato de sodio. El solvente se eliminó in vacuo para dar 25,22 g de pirrolidina-2,5-diona-1-il 3(azidometil)éster benzoico.
[0124] 1H-NMR (CDCl3) ☐ 2,92 (m, 4 H); 4,45 (s, 2 H); 7,55 (t, 1 H), 7,65 (d, 2 H); 8,10 (m, 2 H).
50 Fase 4: éster mono-tert-butílico de ácido octadecanodioico [0125]
[0126] Se añadió N,N-dimetilformamida di-tert-butilacetal (35,2 ml, 147 mmol) gota a gota a una solución de ácido octadecanodioico (15,4 g, 49,0 mmol) en tolueno (250 ml) que se mantuvo a 95 °C. La mezcla reactiva se mantuvo a 95 °C durante 16 horas. Se enfrió a temperatura ambiente. El solvente se eliminó in vacuo. El residuo se disolvió en 10 diclorometano (150 ml).El solvente se eliminó in vacuo. El residuo se disolvió en diclorometano (150 ml). El solvente se eliminó in vacuo. El residuo se disolvió en diclorometano (150 ml). El solvente se eliminó in vacuo. El residuo se disolvió en diclorometano (85 ml). El material insoluble se eliminó por filtración. El solvente se eliminó in vacuo del filtrado. El residuo se disolvió en diclorometano (18 ml). Se agregó heptano (180 ml). La precipitación formada se eliminó por filtración. El solvente se eliminó in vacuo. Se agregó heptano (150 ml). Se formó una precipitación. Ésta se aisló por
15 filtración y se secó in vacuo. El solvente se eliminó in vacuo del agua madre. El sólido formado se aisló por filtración y se secó in vacuo. Los dos lotes de sólidos aislados se combinaron y disolvieron en la cantidad más pequeña posible de diclorometano refluyente. La solución se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió heptano (10 veces el volumen de diclorometano). La mezcla se mantuvo a 0 °C. La precipitación formada se aisló por filtración, se lavó con heptano (30 ml) y se secó in vacuo para dar 4,19 g de éster mono-tert-butílico de ácido octadecanodioico.
20 [0127] 1H-NMR (DMSO-d6) ☐ 1,23 (m, 24 H); 1,39 (s, 9 H); 1,47 (m, 4 H); 2,16 (m, 4 H).
Fase 5: éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico de éster tert-butílico de ácido octadecanodioico
25 [0128]
[0129] 2-Succinimido-1,1,3,3-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TSTU, 378 mg, 0,71 mmol) se añadió a una solución de éster mono-tert-butílico de ácido octadecanodioico (300 mg, 0,64 mmol) en diclorometano (10 ml). Etildiisopropilamina
30 (0,152 ml, 0,71 mmol) se añadió a la mezcla reactiva. Se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. Se lavó con un 10% de solución acuosa de hidrogenosulfato de sodio (2 x 10 ml), con una solución saturada de hidrogenocarbonato de sodio (10 ml) y finalmente con solución salina (10 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato magnésico. El solvente se eliminó in vacuo para dar éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico de éster tert-butílico de ácido octadecanodioico, que se usó sin purificación adicional.
35 [0130] 1H-NMR (CDCl3) ☐ 1,20-1,65 (m, 26 H); 1,44 (s, 9 H); 1,74 (quinteto, 2 H); 2,20 (t, 2 H); 2,60 (t, 2 H); 2,84 (m, 4 H).
Fase 6: Hex-5-inal 40 [0131]
[0132] Una solución de dimetilsulfóxido (0,13 ml, 2 mmol) se enfrió a -78°C. Una solución de cloruro de oxalilo (0,12 ml,
45 1,38 mmol) en diclorometano (1 ml) se añadió a esta solución. La mezcla se agitó a -78°C durante 20 min. Una solución de hex-5-in-1-ol (0,10 ml, 0,922 mmol) en diclorometano (0,5 ml) se añadió a esta solución. Se agitó durante 20 min a 78 °C. Se añadió trietilamina (0,51 ml, 3,69 mmol). La mezcla reactiva se agitó a -78 °C durante 10 min. La solución se dejó calentar a temperatura ambiente. Se diluyó con acetato de etilo (40 ml) y se lavó con un 10% de solución acuosa de hidrogenosulfato de sodio (2 x 20 ml). La capa orgánica se lavó con solución salina (20 ml) y se secó sobre sulfato
50 magnésico. El solvente se eliminó in vacuo para dar hex-5-inal.
[0133] 1H-NMR (CDCl3) ☐ 1,86 (quinteto, 2 H); 2,27 (t, 2 H); 2,62 (t, 2 H), 9,81 (s, 1 H). Fase 7: 3-(Azidometil)-N-(omega-(2-(tert-Butoxicarbonilamino)etil) 5 kDa PE-Gyl)amida benzoica [0134]
[0135] Pirrolidina-2,5-diona-1-il 3-(azidometil)éster benzoico (64 mg, 0,234 mmol) y etildiisopropilamina (0,10 ml, 0,585 mmol) se adicionaron posteriormente a una solución de tert-butilo 2-(omega-(amino)5 kDa PEGyl)etilcarbamato
10 disponible comercialmente (p. ej. Rapp, 1,00 g, 0,195 mmol). La mezcla reactiva se agitó durante 16 h a temperatura ambiente. El solvente se eliminó in vacuo. Se añadió éter (20 ml). La precipitación formada se aisló por filtración y se secó in vacuo para dar 3-(azidometil)-N-(omega-(2-(tert-Butoxicarbonilamino)etil) 5 kDa PEGyl)amida benzoica. El 1H-NMR en CDCl3 cumplió la expectativa.
15 Fase 8: tert-butilo 17-(2-(omega-(3-(azidometil)benzoilamino)5 kDa PE-Gyl)etilcarbamoil)heptadecanoato
[0136]
20 [0137] Se agregó ácido trifluoroacético (5 ml) a una solución de 3-(azidometil)-N-(omega-(2-(tert- butoxicarbonilamino)etil) 5 kDa PEGil)amida benzoica (1,03 g, 0,19 mmol) en diclorometano (5 ml). La mezcla reactiva se agitó durante 15 min a temperatura ambiente. El solvente se eliminó in vacuo. El residuo se disolvió en diclorometano (10 ml). El solvente se eliminó in vacuo. El residuo fue disuelto en el diclorometano (10 ml). El solvente se eliminó in
25 vacuo. El residuo se disolvió en diclorometano (10 ml). El solvente se eliminó in vacuo. El residuo se disolvió en diclorometano (10 ml). Una solución de éster 2,5- dioxopirrolidin-1-ílico de éster tert-butílico de ácido octadecanodioico (90 mg, 0,243 mmol) en diclorometano (5 ml) y etildiisopropilamina (0,83 ml, 4,86 mmol) se agregaron posteriormente. La mezcla reactiva se agitó durante 16 h a temperatura ambiente. Se diluyó con diclorometano (40 ml) y se lavó con un 10% de solución acuosa de hidrogenosulfato de sodio (2 x 30 ml) y solución salina (30 ml). La solución se secó sobre
30 sulfato magnésico. El solvente se eliminó in vacuo. El aceite restante se trató con éter (30 ml). El sólido formado se aisló por filtración. Se lavó con éter (10 ml) y se secó in vacuo para dar 783 mg de tert-butilo 17-(2-(omega-(3(azidometil)benzoilamino)5 kDa PE-Gyl)etilcarbamoil) heptadecanoato. 1H-NMR en CDCl3 cumplió la expectativa.
Fase 9: 17-(2-(omega-(3-(Azidometil)benzoilamino)5 kDa PE-Gyl)etilcarbamoil)ácido heptadecanóico 35 [0138]
40 [0139] Se añadió ácido trifluoroacético (5 ml) a una solución de tert-butilo 17-(2-(omega-(3-(azidometil)benzoilamino) 5 kDa PEGyl)etilcarbamoil)heptadecanoato (500 mg, 0,09 mmol) en diclorometano (5 ml). La mezcla reactiva se agitó durante 45 min a temperatura ambiente. El solvente se eliminó in vacuo. El residuo se disolvió en diclorometano (25 ml). Se lavó posteriormente con una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio (25 ml) y solución salina (25 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato magnésico. El solvente se eliminó in vacuo para dar 17-(2-(omega-(3
45 (azidometil)benzoilamino)5 kDa PEGyl)etilcarbamoil)ácido heptadecanóico.
Fase 10: 17-((omega-(2-(3-((4-(3-Formilpropil)-1,2,3-triazol-1-il)metil)benzoilamino)etil)5 kDa PEGyl)carbamoil)ácido heptadecanóico(Intermedio 3)
50 [0140] 17-(2-(omega-(3-(Azidometil)benzoilamino)5 kDa PE-Gyl)etilcarbamoil)ácido heptadecanóico (200 mg, 0,036 mmol) se disolvió en un tampón consistiendo en 2% 2,6-lutidina en agua (3,5 ml). Una solución de hex-5-inal (70 mg, 0,725 mmol) se agregó a etanol (0,5 ml). Una solución de pentahidrato de sulfato de cobre (II) (180 mg) en agua (2,50
ml) se añadió a una solución de ácido ascórbico (638 mg, 3,626 mmol) en una mezcla de agua (2,5 ml) y 2,6-lutidina (0,125 ml). Esta solución se mantuvo durante 45 segundos a temperatura ambiente antes de añadirla a la solución de 17-(2-(omega-(3- (azidometil)benzoilamino)5 kDa PEGyl)etilcarbamoil)ácido heptadecanóico y hexinal. La mezcla reactiva se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Se diluyó con agua (25 ml) y se extrajo con diclorometano (2 5 x 100 ml). La fase de diclorometano se lavó con un 10% de solución acuosa de hidrogenosulfato de sodio (2 x 100 ml) y solución salina (100 ml). Se secó sobre sulfato magnésico. El solvente se eliminó in vacuo. Se agregó éter (30 ml). La precipitación formada se aisló por filtración. Se disolvió en 50 mM de solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio (5 ml) filtrada y sometida a una cromatografía de gel utilizando una columna de desalación HiPrep 26/10 (GE Healthcare) y un tampón de 50 mM de hidrogenocarbonato de amonio. Las fracciones que contenían el material
10 deseado fueron agrupadas y liofilizadas para dar 17-((omega-(2-(3-((4-(3-formilpropil)-1,2,3-triazol-1il)metil)benzoilamino)etil)5 kDa PEGyl)carbamoil)ácido heptadecanóico (Intermedio 3).
[0141] El análisis 1H-NMR mostró aproximadamente 10% del aldehído que se esperaba (Intermedio 3).
15 Intermedio 4: 19-(((trans-4-((S)-3-((S)-1-(2-(2-((2-(2-(1-(formilmetilcarbamoil)-metilcarbamoil)metoxi)etoxi)etilcarbamoil) metoxi)etoxi)etilcarbamoil)-3-carboxipropilcarbamoil)-1-carboxipropilcarbamoil)-ciclohexil)metil)carbamoil)ácido nonadecanoico
Fase 1: éster mono-tert-butílico de ácido icosanedioico 25 [0143]
[0144] Se disolvió ácido icosanedioico (10 g, 29 mmol) en tolueno a 115°C. La solución se mantuvo a esta temperatura,
30 mientras se añadió gota a gota N,N-dimetilformamida di-tert-butilacetal más de 1 h. La mezcla reactiva se agitó a 115°C durante 16 h. Se enfrió a 0 °C. La precipitación formada se eliminó por filtración. El solvente se eliminó del filtrado para dar 7,49 g de éster mono-tert-butílico de ácido icosanedioico.
[0145] 1H-NMR (CDCl3): ☐ 1,25 (m, 28 H); 1,44 (s, 9 H); 1,59 (m, 4 H); 2,20 (t, 2 H); 2,34 (t, 2 H).
35 Fase 2: 19-(((trans-4-((S)-3-((S)-1-(2-(2-((2-(2-(((2,2-di-metoxietilcarbamoil)-metilcarbamoil)metoxi)etoxi)etilcarbamoil) metoxi)etoxi)etilcarbamoil)-3-carboxipropilcarbamoil)-1-carboxipropilcarbamoil)ciclohexil)metil)carbamoil) ácido noadecanoico
40 [0146] [0147] Una resina disponible comercialmente, resina de Boc-Gly-PAM (p. ej. Fluka, 0,25 mmol), se trató brevemente con ácido trifluoroacético (10 ml). El solvente se eliminó y la resina se lavó con N,N-dimetilformamida (3 x 10 ml). La resina
5 se transfirió sobre un sintetizador peptídico ABI433. Después se usaron programas estándar de acoplamiento, utilizando 1-hidroxibenzotriazole/2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3,-tetrametilurionio hexafluorofosfato como reactivo de acoplamiento. Se usaron los siguientes ácidos (cada uno de ellos 1 mmol) en el siguiente orden:
• FmocNH-CH2 -CH2 -O-CH2 -CH2 -O-CH2 –COOH 10 • FmocNH-CH2 -CH2 -O-CH2 -CH2 -O-CH2 –COOH
•
Fmoc-Glu(OtBu)-OH
•
Fmoc-Glu(OH)-OtBu
•
Ácido Fmoc-tranexámico
•
Éster mono-tert-butílico de ácido icosanedioico
15 [0148] La resina se trató posteriormente con una mezcla de ácido trifluoroacético (2 ml), triisopropisilano (0,050 ml) y agua (0,050 ml) durante 1 h. El solvente se eliminó. La resina se trató a 45 °C con una mezcla de cloroformo y aminoacetaldehídodimetil acetal en una proporción de 3:2 (2 ml) durante 20 h. La resina se eliminó por filtración. El solvente se eliminó del filtrado in vacuo. El residuo se disolvió en un 50% de solución de acetonitrilo en agua. Se
20 añadieron unas gotas de ácido acético hasta que se obtuvo una solución ligeramente acídica. El péptido se purificó por HPLC usando un gradiente de 40-60% de acetonitrilo en agua como eluyente, donde ambos solventes fueron tamponados con 0,1% de ácido trifluoroacético. Finalmente el péptido se aisló por liofilización.
Fase 3: 19-(((trans-4-((S)-3-((S)-1-(2-(2-((2-(2-(1-(formilmetilcarbamoil)etilcarbamoil)metoxi)etoxi)etilcarbamoil)metoxi) 25 etoxi)etilcarbamoil)-3-carboxipropilcarbamoil)-1-carboxipropilcarbamoil)-ciclohexil)metil)carbamoil)ácido nonadecanoico
[0149] El aldehído se obtuvo por tratamiento con TFA según Lelièvre et al. Tetr. Lett. 39 (1998), 9675. Brevemente, el dimetilacetal [19-(((trans-4-((S)-3-((S)-1-(2-(2-((2-(2-(((2,2-di-metoxietilcarbamoil)metilcarbamoil) metoxi)etoxi) etilcarbamoil)-metoxi)etoxi)etilcarbamoil)-3-carboxipropilcarbamoil)-1- carboxipropilcarbamoil)
30 ciclohexil)metil)carbamoil)ácido nonadecanoico] (2mg) se trató con TFA (50µl) durante 6min a temperatura ambiente y se evaporó hasta quedar seco in vacuo. El TFA restante se eliminó por adición de EtOH (50µl) y evaporación in vacuo (se repitió tres veces). El producto obtenido se disolvió en 5% (p/v) de hidroxipropilo β-ciclodextrina y se usó inmediatamente en el acoplamiento a FVIII de NGln-(3-(aminoxi)propiloxi) (Intermedio 2).
35 Intermedio 5: N-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(Biotinilamino)etoxi)etoxi)-etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi) etoxi)etoxi)etoxi) etoxi)etil)-4-formilbenzoico amida
[0150]
[0151] El Intermedio 5 contiene una fracción indicadora de biotina. Fase 1: éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico de ácido 4-formilbenzoico 45 [0152]
[0153] Trietilamina (2,04 ml, 14,65 mmol) y 2-succinimido-1,1,3,3-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TSTU, 4,44 g, 14,65
5 mmol) se añadieron sucesivamente a una solución de ácido 4-formilbenzoico (2,0 g, 13,3 mmol) en N,Ndimetilformamida (30 ml). La mezcla reactiva se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. Se diluyó con acetato de etilo (150 ml) y se lavó con un 10% de solución acuosa de sulfato de hidrógeno sódico (100 ml). La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 30 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con una mezcla de solución salina (50 ml) y agua (50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato magnésico. El solvente se eliminó in
10 vacuo. El producto bruto se recristalizó a partir de acetato de etilo para dar 1,89 g de éster 2,5-dioxopyrrolidin- 1-ílico de ácido 4-formilbenzoico.
[0154] 1H-NMR (CDCl3). ☐ 2,95 (s, 4 H); 8,04 (d, 2 H), 8,32 (d, 2 H); 10,15 (s, 1 H).
15 Fase 2: N-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(tert-Butoxicarbonilamino)etoxi)-etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi) etoxi)etoxi)etoxi) etoxi)etoxi)etil)-4-formilbenzoico amida
[0155]
20 [0156] Se añadió éster 2,5-dioxopyrrolidin- 1-ílico de ácido 4-formilbenzoico (0,767 g, 3,11 mmol) a una solución de tertbutilo disponible comercialmente 2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi) etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etilcarbamato (por ejemplo, Fluka, 2,0 g, 3,11 mmol) y etildiisopropilamina (0,64 ml, 3,72 mmol) en diclorometano (30 ml). La mezcla reactiva se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. La mezcla reactiva se diluyó
25 con diclorometano (70 ml). Se lavó con un 10% de solución acuosa de hidrogenosulfato de sodio (100 ml). La fase acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 30 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio (70 ml). Se secaron sobre sulfato magnésico. El solvente se eliminó in vacuo para dar 2,15 g de N-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2- (tert-butoxicarbonilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil)-4-formilbenzoico amida cruda, que se usó en la siguiente fase sin
30 purificación adicional.
[0157] 1H-NMR (CDCl3). ☐ 1,46 (s, 9 H); 3,33 (m, 2 H); 3,54-3,75 (m, 46 H); 5,08 (br, 1 H); 7,20 (br, 1 H); 7,97 (d, 2 H); 8,03 (d, 2 H); 10,10 (s, 1 H).
35 [0158] MS: m/z = 799,677 requerido para [M+Na]+: 799, requerido para [M+1-Boc] +: 677
Fase 3 N-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(Amino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi) etoxi)etoxi)etil)-4formilbenzoico amida
40 [0159]
[0160] Se añadió ácido trifluoroacético (15 ml) a una solución de N-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(tert- butoxicarbonilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil)-4-formilbenzoico amida cruda (2,15 g, 2,77 mmol) en diclorometano (15 ml). La mezcla reactiva se agitó a temperatura ambiente durante 75 min. El solvente se eliminó in vacuo. El residuo se disolvió en diclorometano (30 ml). El solvente se eliminó in vacuo. El residuo se disolvió en diclorometano (30 ml). El solvente se eliminó in vacuo. El residuo se disolvió en diclorometano (30 ml). El solvente se eliminó in vacuo. El producto bruto obtenido se purificó en HPLC, usando una columna C18 de fase inversa y un gradiente de 11-49% de acetonitrilo en agua, donde ambos solventes fueron tamponados por 0,1% de ácido trifluoroacético. Las fracciones que contenían el compuesto deseado se recombinaron y liofilizaron para dar 995 mg de la sal de ácido trifluoroacético de N-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(amino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil)-4-formilbenzoico amida.
[0161] 1H-NMR (CDCl3). ☐ 3,18 (m, 2 H), 3,50-380 (m, 46 H); 7,42 (br, 1 H); 7,61 (br, 3 H); 7,97 (d, 2 H); 8,02 (d, 2 H); 10,08 (s, 1 H).
[0162] MS: m/z = 677, 699, requerido para [M+1]+: 677, requerido para [M+Na]+: 699.
Fase 4: N-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(Biotinilamino)etoxi)etoxi)etoxi)-etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi) etil)-4-formilbenzoico amida
[0163] Se agregó biotina de succinimido disponible comercialmente (p. ej. Fluka, 302 mg, 0,886 mmol) a una solución de la sal de ácido trifluoroacético de N-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(amino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)- etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil)-4-formilbenzoico amida (545 mg, 0,805 mmol) y etildiisopropilamina (2,10 ml, 12,1 mmol) en diclorometano (10 ml). La mezcla reactiva se agitó durante 3 días a temperatura ambiente. El solvente se eliminó in vacuo. El producto bruto se purificó por HPLC, usando una columna C18 de fase inversa y un gradiente de 15- 50% de acetonitrilo en agua, donde ambos solventes fueron tamponados con 0,1 % de ácido trifluoroacético. Las fracciones que contenían el producto deseado en una pureza razonable - según se consideró por HPLC analítica - se combinaron y liofilizaron para dar 62 mg de N-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(biotinilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi) etoxi)etoxi)etil)-4-formilbenzoico amida.
[0164] 1H-NMR (CDCl3). ☐ 1,47 (m, 2 H); 1,70 (m, 4 H); 2,25 (oculto bajo agua (?), 2 H); 2,78 (d, 1 H); 2,93 (d, 1 H); 3,19 (d, 1 H); 3,40-3,75 (m, 46 H); 4,38 (d, 1 H); 4,56 (d, 1 H); 5,55 (br, 1 H); 6,03 (br, 1 H); 6,59 (br, 1 H); 7,31 (br, 1 H); 7,95 (d, 2 H); 8,02 (d, 2 H), 10,08 (s, 1 H).
[0165] MS: m/z = 903, requerido para [M+1]+: 903.
Intermedio 6: N-2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-Formilbenzoilamino)etoxi)-etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi) etoxi)etoxi)etoxi)etilAlexa 488 amida carboxílica
[0166] Una solución de éster succinimidílico de ácido carboxílico de Alexa 488 disponible comercialmente (Invitorogen, A20000,1 mg, 0,002 mmol) en una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio de 250 mM (0,50 ml) se añadió a una solución de N-(2- (2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(Amino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-etoxi)etoxi)etoxi) etoxi)etil)-4-formilbenzoico amida (1,89 mg, 0,003 mmol) en 250 mM de solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio (0,482 ml). La mezcla reactiva se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. Se añadió un 10% de solución acuosa de hidrogenosulfato de sodio (5 ml). La mezcla se sometió a una cromatografía de HPLC en una columna C18 de fase reversa, usando un gradiente de 15-45% de un 0,1 % de solución de ácido trifluoroacético en acetonitrilo en un 0,1% de solución de ácido trifluoroacético en agua. Las fracciones que contenían el compuesto deseado - según LC-MS
-
fueron combinadas y liofilizadas.
[0167] LC-MS: encontrado: m/z = 1193, requerido para [M+1]+: m/z = 1193.
Intermedio 7: S34-(1-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(3-((S)-2-amino-3-hydroxypropanoyl amino) propilcarbamoil) etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etilcarbamoil)etil)2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-3il)albúmina
Fase 1: [3-((S)-3-(tert-butoxi)-2-(tert-butoxicarbonilamino)propionilamino)propil] éster bencílico de ácido carbámico [0168]
[0169] Disponible comercialmente, Boc-Ser(tBu)-oh (1,14 g, 4,36 mmol) se disolvió en una mezcla de diclorometano (10 ml) y N,N-dimetilformamida (10 ml). Se agregaron sucesivamente 1-hidroxibenzotriazola (0,71 g, 5,23 mmol) y 1-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida hidrocloruro (0,92 g, 4,79 mmol). La mezcla reactiva se agitó durante 15 min a
10 temperatura ambiente. Éster bencílico de ácido (3-aminopropil)carbámico, disponible comercialmente, (2,13 g, 8,71 mmol) y etildiisopropilamina (3,73 ml, 21,77 mmol) se agregaron.
[0170] La mezcla reactiva se agitó durante 6 días a temperatura ambiente. Se diluyó con diclorometano (50 ml), se lavó con un 10% de solución acuosa de hidrogenosulfato de sodio (2 x 50 ml), con una solución acuosa saturada de
15 hidrogenocarbonato de sodio (2 x 50 ml) y finalmente con solución salina (50 ml). Se secó sobre sulfato magnésico. El solvente se eliminó in vacuo para dar 2,3 g de [3-((S)-3-(tert-butoxi)-2-(tert-butoxicarbonilamino)propionilamino) propil]éster bencílico de ácido carbámico crudo, que se usó sin purificación adicional en la siguiente fase.
[0171] MS: encontrado: m/z = 474, requerido para [M+Na]+: 474
20 [0172] 1H-NMR (CDC13). ☐ 1,16 (s, 9 H); 1,46 (s, 9 H); 1,64 (m, 2 H); 3,22 (m, 2 H); 3,39 (m, 2 H); 3,80 (m, 1 H); 4,16 (br, 1 H); 5,10 (s, 2 H); 5,42 (br, 1 H); 5,46 (br, 1 H); 6,76 (br, 1 H); 7,35 (m, 5 H).
Fase 2: [(S)-1-(3-Aminopropilcarbamoil)-2-(tert-butoxi)etil]éster tert-butílico de ácido carbámico 25 [0173]
30 [0174] El [3-((S)-3-(tert-butoxi)-2-(tert-butoxicarbonilamino)propionilamino) propil]éster bencílico de ácido carbámico crudo (2,3 g) de la fase 1 se disolvió en etanol (20 ml). Se agregó 5% de paladio en carbón, que estaba 50% mojado (1 g). La mezcla fue hidrogenada a temperatura ambiente a una presión de 100 psi. La mezcla reactiva se filtró a través de un tapón de celita. El solvente se eliminó in vacuo del filtrado. El residuo se disolvió en etanol (20 ml). Se agregó 5% de paladio en carbón, que estaba 50% mojado (1,7 g).
35 [0175] La mezcla fue hidrogenada a temperatura ambiente a una presión de 300 psi. Se filtró a través de un tapón de celita. El solvente se eliminó in vacuo del filtrado para dar [(S)-1-(3-aminopropilcarbamoil)-2-(tert-butoxi) etil]éster tertbutílico de ácido carbámico crudo (1,35 g), que se usó en la siguiente fase sin más purificación.
40 [0176] 1H-NMR (CDCl3). ☐1,17 (s, 9 H); 1,46 (s, 9 H); 2,05 (br, 2 H); 2,85 (br, 2 H); 3,49 (br, 2 H); 3,75 (m, 1 H); 4,22 (br, 1 H); 5,55 (br, 1 H); 7,47 (br, 1 H); 8,38 (br, 2 H).
Fase 3: (S)-3-(tert-Butoxi)-2-(tert-butoxicarbonilamino)-N-(3-((2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(3-(2,5-Dioxo-2,5- dihidropirrol-1-il)propionilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil)carbonilamino)
45 propil)amida propiónica [0177]
5 [0178] El [(S)-1-(3-aminopropilcarbamoil)-2-(tert-butoxi)etil]éster tert-butílico de ácido carbámico crudo (650 mg, 2,05 mmol), de la fase precedente, se disolvió en diclorometano (20 ml). El disponible comercialmente (p. ej. QunataBio Design) N-succinidil 3-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-pirrol-1-il)propionilamino)etoxi)etoxi) etoxi)etoxi)-etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi) propionato (1,20 g, 1,39 mmol) y etildiisopropilamina (0,45 ml, 2,63 mmol) se agregaron sucesivamente.
10 [0179] La mezcla reactiva se agitó durante 1,5 h a temperatura ambiente. Se lavó con un 10% de solución acuosa de hidrogenosulfato de sodio (2 x 30 ml), una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio (30 ml) y solución salina (30 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato magnésico. El solvente se eliminó in vacuo para dar 1,2 g de (S)3-(tert-butoxi)-2-(tert-butoxicarbonilamino)-N-(3-((2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro- pirrol-1
15 il)propionilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil)carbonilamino)propil)amida propiónica cruda, que se usó en la siguiente fase sin purificación adicional.
[0180] MS: m/z = 1068, requerido para [M+1]+: 1068.
20 Fase 4: (S)-2-Amino-N-(3-((2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino) etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil)carbonilamino)propil)-3-amida hidroxipropiónica
[0181]
[0182] Se agregó TFA (5 ml) a una solución de (S)-3-(tert-butoxi)-2-(tert-butoxicarbonilamino)-N-(3-((2-(2-(2-(2-(2- (2-(2(2-(2-(2-(2-(2-(2-(3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-etoxi)etoxi) etoxi)etoxi)etoxi)etil)carbonilamino)propil)amida propiónica (600 mg, 0,56 mmol) en diclorometano (5 ml). La mezcla se
30 agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h. El solvente se eliminó in vacuo. El residuo se redisolvió en diclorometano (20 ml). El solvente se eliminó in vacuo. Éste procedimiento se repitió. El residuo se disolvió en acetonitrilo (20 ml). El solvente se eliminó in vacuo.
[0183] Este procedimiento se repitió dos veces para dar (S)-2-amino-N-(3-((2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(3- (2,535 Dioxo-2,5-dihidro-pirrol-1-il)propionilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etil) carbonilamino)propil)-3-amida hidroxipropiónica.
[0184] MS: m/z = 912, requerido para [M+1]+: 912
S34
40 Fase 5: -(1-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(3-((s)-2-amino-3-hidroxipropanoilamino)propilcarbamoil)etoxi) etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etilcarbamoil)etil)2,5-dioxo-2,5- dihidropirrol-3-il)albúmina
[0185] [0186] Se disolvió albúmina recombinante con un grupo de cisteína libre (2,2 mg, 33 nmol, disponible comercialmente de, por ejemplo, New Century Pharmaceuticals Inc.) en agua (0,200 ml). Una solución de trietanolamina (0,0077 mg) en
5 agua (0,100 ml) y una solución de 3-metiltiopropan-1-ol (0,153 mg, 1025 nmol) en agua (0,1 mmol) fueron agregadas. Una solución de peryodato de sodio (0,019 mg, 88 nmol) se agregó en agua (0,100 ml). La mezcla reactiva se mantuvo a oscuras a temperatura ambiente durante 40 min. El tampón de la mezcla reactiva se cambió a una solución de trietanolamina (0,154 ml) en agua (0,200 ml) por ultracentrifugado repetido en un dispositivo de centrifugado Amicon Ultra con un corte molecular de 10 kDa a una velocidad de 4000 r.p.m. durante 6 min.
S34
Fase 6: Fase 5: -(1-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(3-(2-oxoacetilamino)propilcarbamoil)etoxi)etoxi) etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etilcarbamoil)etil)2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-3-il)albúmina (Intermedio 7)
15 [0187]
[0188] S34-(1-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(3-((s)-2-amino-3-hidroxipropanoilamino)propilcarbamoil) etoxi)etoxi)
20 etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-etoxi)etoxi)etoxi)etilcarbamoil)etil)2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-3-il)albúmina (21 mg, 312 nmol) se disolvió en agua (0,800 ml). Se agregó una solución de trietanolamina (0,077 mg) en agua (1,00 ml) y una solución de 3-metiltiopropan-1-ol (1,53 mg, 10250 nmol) en agua (1,0 ml). Se agregó una solución de peryodato de sodio (0,19 mg, 880 nmol) en agua (1,00 ml). La mezcla reactiva se mantuvo a oscuras a temperatura ambiente durante 40 min. El tampón de la mezcla reactiva se cambió por una solución de trietanolamina (0,77 ml) en agua (1,00 ml) por
25 ultracentrifugado repetido en un dispositivo de centrifugado Amicon Ultra con un corte molecular de 10 kDa a una velocidad de 4000 r.p.m. durante 6 min. El material se usó directamente en una reacción de formación de oxima.
Intermedio 8: ácido colomínico oxidado con peryodato
30 [0189] Fase 1: fraccionamiento de ácido colomínico
[0190] El ácido colomínico usado fue el compuesto comercial de Sigma-Aldrich (sal de sodio). Para obtener un material
5 más homogéneo (con relación a su peso molecular) se fraccionó en una columna de intercambio iónico según la WO 2008/074032. La fracción correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 20kD se usó en los experimentos posteriores.
Fase 2: oxidación de peryodato de sodio de ácido colomínico de 20kD:
10 [0191] A una solución de 20kD de ácido colomínico (obtenida según la fase 1 (40mg en 2,24ml de H2O) se le agregó una solución de peryodato de sodio (0,96mg en 2,244ml de H2O).
[0192] La reacción se incubó durante 15min a 23°C a oscuras. 15 [0193] El exceso de peryodato se aplacó por 3-metilio-1-propanol (4,7µl). La reacción se incubó más durante 2h a 23°C.
[0194] Los reactivos se eliminaron por ultrafiltración en el filtro Millipore Ultra, corte de 5kD. Se hicieron varios ciclos de dilución en agua. 20 [0195] El material resultante fue liofilizado.
Intermedio 9:
C34
25 [0196] -(1-(5-(2-(ω-(3-(4-(formil)benzoilamino)propilcarbamoilmetil)3 kDa PEGyl)-etilcarbamoil)pentil) 2,5dioxopirrolidin-3-il)albúmina
Fase 1:
30 N-[3-(tert-Butoxicarbonialamino)propil]-4-formilbenzamida [0197]
[0198] Se agregó éster 2,5-dioxopyrrolidin-1-ílico de ácido 4-formilbenzoico (1,56 g, 6,31 mmol) a una solución del
disponible comercialmente éster tert-butílico de ácido 3-aminopropilcarbámico (1,10 ml, 6,31 mmol) y
5 etildiisopropilamina (2,16 ml, 12,62 mmol) en diclorometano (25 ml). La mezcla reactiva se agitó a temperatura ambiente
durante 24 h. Se agregó diclorometano (100 ml). La mezcla se lavó con un 10% de solución acuosa de hidrogenosulfato
de sodio (70 ml). La fase acuosa se extrajo con diclorometano (50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con
solución salina (100 ml) y se secaron sobre sulfato magnésico. El solvente se eliminó in vacuo. El material se purificó
por cromatografía rápida en sílice (90 g), utilizando una mezcla de acetato/heptano de etilo (3:1) como eluyente para dar 10 1,05 g de N-[3-(tert-butoxicarbonialmaino)propil]-4-formilbenzamida.
[0199] MS: m/z = 329, requerido para [M+Na]+: 329.
[0200] 1H-NMR (CDCl3): δ 1,46 (s, 9 H); 1,75 (quinteto, 2 H); 3,28 (t, 2 H); 3,54 (t, 2 H); 4,84 (br, 1 H); 7,60 (br, 1 H); 7,96 15 (d, 2 H); 8,03 (d, 2 H); 10,09 (s, 1 H).
Fase 2:
N-[3-Aminopropil]-4-formilbenzamida 20
[0201]
[0202] Se agregó ácido trifluoroacético (10 ml) a una solución de N-[3-(tert-butoxicarbonialmaino)propil]-4-
25 formilbenzamida (1,1 g, 3,43 mmol) en diclorometano (10 ml). La mezcla reactiva se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h. El solvente se eliminó in vacuo. El residuo se redisolvió en diclorometano (50 ml). El solvente se eliminó in vacuo. El residuo se redisolvió en diclorometano (50 ml). El solvente se eliminó in vacuo. El residuo se redisolvió en diclorometano (50 ml). El solvente se eliminó in vacuo para dar 1,76 g de la sal de trifluoroacetato de N-[3-Aminopropil]4-formilbenzamida.
30 [0203] 1H-NMR (CDCl3): δ 1,46 (s, 9 H); 2,07 (br, 2 H); 3,71 (q, 2 H), 4,20 (br, 2 H); 7,95 (d, 2 H); 8,01 (d, 2 H); 10,11 (s, 1 H).
Fase 3:
35 N-(3-(ω-(2-(5-(2,5-Dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)hexanoilamino)etil)3 kDa PEGylacetilamino)propil)-4- formilbenzamida
[0204]
[0205] Se agregó sal de trifluoroacetato de N-[3-Aminopropil]-4-formilbenzamida (57 mg, 0,178 mmol) a una solución disponible comercialmente (p. ej. Rapp Polymere GmbH, Alemania) (ω-(2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il) hexanoilamino)etil)3 kDa PEGil)éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico de ácido acético (500 mg, 0,149 mmol) en diclorometano
(4 ml). Se agregó etildiisopropilamina (0,893 ml, 5,25 mmol). Se controló el pH para que fuera de aproximadamente pH 10-11 usando una tira de pH. La mezcla reactiva se agitó durante 1h. Se añadió éter (70 ml). La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 1 h para dejar que el precipitado formado se añejara. El precipitado se aisló por filtración. Se resuspendió en el éter (50 ml). El precipitado se aisló por filtración para dar 475 mg de N-(3-(ω-(2-(5-(2,5-dioxo-2,5dihidropirrol-1-il) hexanoilamino)etil)3 kDa PEGylacetilamino)propil)-4-formilbenzamida. De acuerdo con las expectativas para el producto deseado, el espectro de 1H-NMR en CDCl3 mostró la presencia de un grupo de maleimida al igual que un anillo aromático parasustituido y un grupo de aldehído.
Fase 4:
[0206] Una solución de N-(3-(ω-(2-(5-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)hexanoilamino)etil)3 kDa PEGylacetilamino) propil)4-formilbenzamida (1,6 mg, 452 nmol) en un tampón (1,6 ml) que consistía en 25 mM de HEPES que se ajustó a pH 7,00 por adición de hidróxido sódico 1 N se agregó a una solución de albúmina de suero humano recombinante (hSA, 15 mg, 226 nmol) con cisteína libre en un tampón (13,4 ml) que consistía en 25 mM de HEPES ajustado a pH 7,00 por adición de hidróxido sódico 1 N. La mezcla reactiva se agitó suavemente a 300 r.p.m. a 20-22 °C durante 16 h. El material se colocó en un dispositivo de ultracentrifugado de Amicon con un corte de 10 kDa. Se agregó un tampón (15 ml) que consistía en 25 mM de TRIS ajustado a pH 8,00 por adición de ácido clorhídrico 1 N. Esta solución se sometió a un centrifugado a 4000 r.p.m. durante 10 min. Se agregó un tampón (15 ml) que consistía en 25 mM de TRIS ajustado a pH 8,00 por adición de ácido clorhídrico 1 N. Esta solución se sometió a un centrifugado a 4000 r.p.m. durante 10 min. El material se sometió a una cromatografía de intercambio de anión en una columna MonoQ con un tamaño de lecho de aprox. 8 ml usando un gradiente de 0-75% de un tampón que consistía en 25 mM de TRIS y 2 M de NaCl ajustado a pH 8,00 en un tampón que consistía en 25 mM de TRIS ajustado a pH 8,00 sobre 30 CV a un flujo de 4 ml/min. La aplicación de la muestra a la columna se hizo con un flujo de 0,5 ml/min. Las fracciones que contenían material con
C34
análisis SDS-PAGE según -(1-(5-(2-(ω-(3-(4-(formil)benzoilamino)propilcarbamoilmetil)3 kDa PEGyl) etilcarbamoil)pentil)2,5-dioxopirrolidin-3-il)albúmina fueron combinadas. Las fracciones combinadas se sometieron a una cromatografía de exclusión por tamaño usando 53 ml de un material Superdex G25 y un tampón de 25 mM de hidrogenocarbonato de amonio a un flujo de 7 ml/min. Las fracciones con material cuyo análisis SDS-PAGE era
C34
conforme a -(1-(5-(2-(ω-(3-(4-(formil)benzoilamino)propilcarbamoilmetil)3 kDa PEGyl)etilcarbamoil)pentil)2,5- dioxopirrolidin-3-il)albúmina fueron recogidas, combinadas y sometidas a liofilización para dar 0,803 mg del compuesto del título. El rendimiento se determinó en un aparato de fotometría de Nanodrop a 280 nm usando una absorbancia molar de 4,11.
Reacción de NGln-(3-aminoxi propiloxi) Factor VIII (producto Intermedio 2) con aldehídos (productos intermedios 3, 4, 5, 6, 7,8 y 9)
[0207] El producto Intermedio 2, tal y como se preparó anteriormente, se reaccionó con varios aldehídos en reacciones de oximación, para formar derivados de Factor VIII.
NGln
Ejemplo 1 -oximación de producto Intermedio 2 con 3-(mPEGyl)propanal para dar -(3-(3-(mPEGyl)propilideneaminoxi)propiloxi)FVIII
[0208] El mPEGyl es polidisperso y tiene un peso molecular de aproximadamente 20kDa. Se prepararon las siguientes soluciones:
-
Solución de producto Intermedio 2: 1,74mg/ml en el tampón D;
-3-(mPEGyl)propanal (20kDa)(CH3O(CH2CH2O)n -CH2CH2CHO ME-200AL de NOF): 12,9mg/ml en el tampón E; y
- 4-hidroxibenzaldehído (MW=122,13). Solución 13,8mg/ml en el tampón E.
[0209] A la solución del producto Intermedio 2 (77,6µl; 135µg) se le agregó un tampón E (2,4µl) y la solución 3(mPEGyl)propanal al tampón E (595µl, 7,7mg). La mezcla reactiva se incubó durante 3h a 25°C. Después se agregó la solución de 4-hidroxibenzaldehído (32,8µl; 453µg) (recubrimiento de fracciones de hidroxilamina no-reaccionada). La mezcla reactiva se incubó de nuevo durante 3h a 25°C.
[0210] El producto se purificó por intercambio iónico de la siguiente manera. La mezcla reactiva se diluyó ocho veces en el tampón C, y se aplicó en dos dispositivos de intercambio iónico Vivapure Q Mini M (número de producto de VivaScience VS-IX01QM24, VivaScience AG, Alemania) que previamente se había equilibrado con el tampón C. Después de dos fases de lavado con el mismo tampón, el producto de reacción se eluyó con el tampón de elución D.
-
1
[0211] La concentración de proteína se estimó midiendo la absorción a 280nm (E1% =14,6 Lg-1cm )(Nanodrop ND1000, Nanodrop Technologies, Inc, EEUU) dando una recuperación de proteína estimada de 83%.
[0212] El producto se realizó en electroforesis en gel de poliacrilamida SDS usando NuPage 7% de gel de Tris- acetato (Invitrogen EA03555BOX) según las instrucciones del fabricante (70min a 150V). Los geles estaban teñidos con plata (Invitrogen LC6070). Las proteínas estándar eran de Invitrogen (HiMark HMW Standard LC5688).
[0213] El gel de SDS muestra que la cadena pesada es la más fuertemente modificada. Aparecieron varias bandas de MW más altos, como se esperaba. La banda de MW máximo aparece en aproximadamente 400kDa.
El producto se sometió a digestión de trombina:
[0214] La trombina (trombina humana, Roche diagnostica) se solubilizó en 20U/ml en H2O, y además se diluyó en 2U/ml en el tampón A. A una solución del producto del ejemplo 1 (2,9µl; 1,2µg) se agregó un tampón A (8,9µl) y la solución de trombina (0,24µl). La mezcla reactiva se incubó a 37°C durante 15min. Una digestión de trombina de FVIII se realizó en paralelo. Las mezclas de reacción se analizaron por HPLC en un Zorbax 300SB-C18, 0,21x15cm, 5µ. Los eluyentes fueron A: 0,1% de TFA en agua, y B: 0,07% de TFA en acetonitrilo. El flujo fue de 0,2ml/min, la temperatura de 40°C. El gradiente fue de la siguiente manera: de 0 a 15% más de 2min, de 15 a 80% más de 21 min, de 80 a 100%B más de 10min. La detección se hizo por UV (λ=280nm).
[0215] Los cromatogramas obtenidos mostraron que el valor máximo correspondiente al dominio A1 en el Factor VIII digerido por trombina (rastro azul) casi desapareció en la asimilación de trombina del FVIII pegilado de ejemplo 1 (rastro rojo). Así, el dominio A1 fue, de hecho, el más fuertemente modificado.
NGGln
Ejemplo 2 - oximación del Intermedio 2 con el Intermedio 3 para dar -(3-(4-(1-(3-((omega-(17-(carboxi) heptadecanoilamino)5 kDa PEGyl)carbamoil)bencilo)1,2,3-triazol-4-il)butilideneaminoxi)propiloxi)FVIII
[0216] Se prepararon las siguientes soluciones:
-
Intermedio 2: 2,36mg/ml en el tampón D;
-
Intermedio 3 (MW: 5600): 1,79mM en el tampón E;
-
Solución de 4-hidroxibenzaldehído: 17,3mg/ml en el tampón E; e
-
Hidrocloruro de metoxilamina: 11mg/ml en el tampón E.
[0217] A la solución del Intermedio 3 (500µl; 848nmoles) en el tampón E se le agregó tampón E (644,3µl) y la solución del Intermedio 2 en el tampón E (105,9µl, 250µg). La mezcla reactiva se incubó durante 3h a 25°C. Solución de 4hidroxibenzaldehído (50pl; 865µg) se agregó luego (recubriendo las fracciones de hidroxilamina no-reaccionada). La mezcla reactiva se incubó más durante 1 h a 25°C. El aldehído excedente se extinguió por adición de hidrocloruro de metoxilamina (62,5µl, 687µg). La mezcla reactiva se incubó de nuevo durante 30min a 25°C.
[0218] El producto se purificó por intercambio iónico de la siguiente manera. La concentración de sal se redujo a menos de 25mM de concentración de sal por dilución sucesiva (con tampón C) y fases de sobreconcentración en los dispositivos Amicon Ultra (corte 50kDa) (Millipore Corp., EEUU). La solución obtenida se aplicó en dos dispositivos de intercambio iónico Vivapure Q Mini M (número de producto de VivaScience VS-IX01QM24, VivaScience AG, Alemania) que previamente se había equilibrado con tampón C. Después de dos fases de lavado con el mismo tampón, el producto de reacción se eluyó con el tampón D de elución.
-
1
[0219] La concentración de proteína se estimó por medición de la absorción en 280nm (E1% =14,6 Lg-1cm )(Nanodrop ND-1 000, Nanodrop Technologies, Inc, EEUU) dando una recuperación de proteína estimada de 73%.
[0220] El producto se pasa por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS NuPage 7% de gel de Tris-acetato (Invitrogen EA03555BOX) según las instrucciones del fabricante (70min a 150V). Los geles eran teñidos con plata (Invitrogen LC6070). Las proteínas estándar eran de Invitrogen (HiMark HMW Standard LC5688).
[0221] El gel SDS mostró que la cadena pesada es de nuevo la más fuertemente modificada. Aparecieron varias bandas de MW más alto. La banda de MW máximo aparece en aproximadamente 120kDa.
[0222] El producto también se pasó por HPLC, en una columna C4, 0,21x5cm, 5µ (Vydac n°: 214TP5205).
[0223] Los eluyentes fueron A: 0,1 % de TFA en agua, y B: 0,07% de TFA en acetonitrilo. El flujo fue de 0,2ml/min, la temperatura 40°C. El gradiente fue de la siguiente manera: de 30 a 40% por encima de 3min, de 40 a 50% por encima de 60min, de 50 a 100%B por encima de 12,5min. La detección se realizó por UV (λ=280nm) y por fluorescencia λ Exc=280nm, Em=348nm).
[0224] Los cromatogramas obtenidos confirmaron que la cadena pesada fue, de hecho, la más fuertemente modificada.
Ejemplo 3 - oximación de Intermedio 2 con Intermedio 4
[0225] Se prepararon las siguientes soluciones:
-
Intermedio 2: 2,36mg/ml en tampón D
-
Intermedio 4 (MW= 122,1): 5,55mg/ml
-
Hidrocloruro de metilhidroxilamina (MW=83,5): 10,2mg/ml en tampón E
[0226] La solución del Intermedio 2 (106,7µl; 250µg) y la solución del Intermedio 4 reactivo de aldehído obtenida anteriormente (1,144ml, 833,8µg) se mezclaron e incubaron durante 3h a 25°C. Se recubrieron los grupos aminoxi libres posiblemente restantes mediante la adición de una solución de 4-hidroxi benzaldehído (63µl; 350µg), y la mezcla resultante se incubó durante 1 h a 25°C. El aldehído excedente se extinguió por adición de hidrocloruro de hidroxilamina de metilo (62,5µl, 638µg). La mezcla reactiva se incubó de nuevo durante 30min a 25°C.
[0227] El producto se purificó por intercambio iónico de la siguiente manera. La mezcla reactiva se diluyó mediante la adición de tampón C (9,625ml). La solución obtenida se aplicó en dos dispositivos de intercambio iónico Vivapure Q Maxi M (número de producto de VivaScience VS-IX20QM08, Vivascience AG, Alemania) que previamente se había equilibrado con tampón C. Después de dos fases de lavado con el mismo tampón, el producto de reacción se eluyó con el tampón de elución D.
-
1
[0228] La concentración de proteína se estimó por medición de absorción en 280nm (E1% =14,6 Lg-1cm )(Nanodrop ND-1 000, Nanodrop Technologies, Inc, EEUU) dando una recuperación de proteína estimada de 96%.
[0229] El producto se pasó por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS NuPage 7% de gel de Tris-acetato (Invitrogen EA03555BOX) según las instrucciones del fabricante (70min a 150V). Los geles estaban teñidos con plata (Invitrogen LC6070). Las proteínas estándar eran de Invitrogen (HiMark HMW Standard LC5688):
[0230] El producto se pasó por HPLC, en una columna C4, 0,21x5cm, 5µ (Vydac n°: 214TP5205). Los eluyentes fueron
A: 0,1% de TFA en agua, y B: 0,07% de TFA en acetonitrilo. El flujo fue de 0,2ml/min, la temperatura 40°C. El gradiente fue de la siguiente manera: de 30 a 40%B por encima de 3min, de 40 a 50%B por encima de 60min, de 50 a 100%B por encima de 12,5min. La detección se hizo por UV (λ=280nm) y por fluorescencia (λ Exc=280nm, Em=348nm).
[0231] Los cromatogramas obtenidos mostraron que la cadena pesada fue la más fuertemente modificada, como se esperaba.
Ejemplo 4 - oximación de Intermedio 2 con Intermedio 5 para dar
NGln
-
(3-(4-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(biotinilamino)etoxi)etoxi)etoxi)-etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi) etilcarbamoil)-benzilideneiminoxi)propiloxi)FVIII
[0232] Las siguientes soluciones fueron preparadas:
-
Intermedio 2: 1,74 mg/ml en 20mM tampón de imidazol conteniendo 0,02% Tween 80,10% v/v glicerol, 1 M NaCl, 10mM CaCl2, pH 7,4
-
Intermedio 5: 1,28mg/ml en el tampón G; e
-
Hidrocloruro de metilhidroxilamina: 2,84mg/ml en el tampón G
[0233] A la solución del Intermedio 2 (115µl; 200µg) se le agregó el tampón G (485µl) y la solución del Intermedio 5 (400µl, 513µg). La mezcla reactiva se incubó durante 3h a 25°C. El aldehído excedente se extinguió por adición de hidrocloruro de hidroxilamina metílica (25µl, 71 µg). La mezcla reactiva se incubó de nuevo durante 30min a 25°C.
[0234] La concentración de sal se redujo por debajo de 25mM de concentración de sal por dilución sucesiva (con tampón C) y fases de sobreconcentración en los dispositivos Amicon Ultra (corte 50kDa) (Millipore Corp., EEUU). La solución obtenida se aplicó en dos dispositivos de intercambio iónico Vivapure Q Mini M (número de producto de VivaScience VS-IX01QM24, Vivascience AG, Alemania) que previamente se había equilibrado con tampón C. Después de dos fases de lavado con el mismo tampón, el producto de reacción se eluyó con el tampón de elución D.
[0235] La concentración de proteína se estimó por medición de la absorción en 280nm (Nanodrop ND-1000, Nanodrop Technologies, Inc, EEUU) dando una recuperación de proteína estimada de 50%.
[0236] El producto se pasó por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS NuPage 7% gel de Tris-acetato (se usaron dos geles idénticos)(Invitrogen EA03555BOX) según las instrucciones del fabricante (70min a 150V). Las proteínas estándar eran de Invitrogen (HiMark HMW Standard LC5688).
[0237] Un gel estaba teñido con plata (Invitrogen LC6070), el otro gel estaba manchado con estreptavidina-HRP (Invitrogen 43-4323).
[0238] La banda más fuertemente teñida de la mancha correspondía a la cadena pesada, como se esperaba.
Ejemplo 5 - oximación de Intermedio 2 con Intermedio 7
[0239] Una solución de Intermedio 2 (1,00 mg, 5,60 nmol) en un tampón que consistía en 20 mM de imidazol, 10 mM de CaCl2, 10% de glicerol y 0,02% de Tween 80 se añadió al Intermedio 7. La mezcla reactiva se dejó a temperatura ambiente durante 16 h. Una solución acuosa de cloruro sódico de 5 M (0,046 ml). La mezcla reactiva se aplicó a una
columna, obtenida a partir de anticuerpos F25 (según se describe en, por ejemplo, la WO95/013301), que se había activado por CNBr. El material no unido se lavó. La columna se lavó con un tampón (5 ml) que consistía en 20 mM de imidazol, 10 mM de CaCl2, 0,02% de Tween 80 y 650 mM de NaCl, pH 7,35. Otra fracción se lavó con un tampón (5 ml) que consistía en 20 mM de imidazol, 10 mM de CaCl2, 0,02% de Tween 80 y 2,5 M de NaCl, 50 %v/v de etileneglicol, 5 pH 7,35. El análisis SDS indicó que un conjugado de albúmina-FVIII pudo haberse lavado de la columna usando el último tampón (20 mM de imidazol, 10 mM de CaCl2, 0,02% de Tween 80 y 2,5 M de NaCl, 50 %v/v de etileneglicol, pH 7,35). El conjugado de albúmina-FVIII se identificó en el gel de SDS por bandas en aprox. 70 kDa y 90 kDa, correspondientes a los pesos moleculares de la cadena pesada y ligera al igual que a bandas en aproximadamente 140 kDa, y 160 kDa, correspondiente a la masa prevista de conjugados de albúmina de la cadena ligera y la cadena pesada
10 respectivamente.
Ejemplo 6 - oximación de Intermedio 2 con Intermedio 6
NGln
para dar -(3-(4-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(Alexa 488-ilamino)etoxi)-etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi) 15 etoxi)etoxi)etoxi)-etilcarbamoil)benzilideneiminoxi)propiloxi)FVIII
Soluciones:
[0240] 20
-
NGln
-3-aminoxi propiloxi)FVIII: 1,74 mg/ml en 20mM de tampón de imidazol conteniendo 0,02% de Tween 80,10% v/v de glicerol, 1M de NaCl, 10mM de CaCl2, pH 7,4
-
Intermedio 6: 1,70mg/ml en el tampón G 25 Procedimiento: [0241] A la solución de N-(3-(aminoxi)propiloxi)FVIII (115µl; 200µg) se añadió el tampón G (485µl), y la solución del Intermedio 6 (400µl, 678µg). La mezcla reactiva se incubó durante 3h30 a 25°C.
30 [0242] El aldehído excedente se extinguió por adición de hidrocloruro de hidroxilamina metílica (25µl, 71µg). La mezcla reactiva se incubó de nuevo durante 45min a temperatura ambiente. Purificación:
35 [0243] La purificación se hizo como en el ejemplo 4. [0244] La concentración de proteína se estimó por medición de la absorción en 280nm [0245] (Nanodrop ND-1000, Nanodrop Technologies, Inc, EEUU) dando una recuperación de proteína estimada de 40%.
40 Ejemplo 7 - oximación de Intermedio 2 con Intermedio 8 Soluciones: 45 [0246]
-
Intermedio 2: 2,74 mg/ml en 20mM de tampón de imidazol conteniendo 0,02% de Tween 80, 10% v/v de glicerol, 1 M de NaCl, 10mM de CaCl2, pH 7,4
-
Hidrocloruro de metilhidroxilamina en solución en 100mM de tampón de imidazol pH 6,5 conteniendo 0,02% de Tween 50 80, 10% v/v de glicerol, 10mM de CaCl2
Procedimiento:
[0247] A la solución del Intermedio 2 (91 µl, 250µg) se le añadió la solución del Intermedio 7 en el tampón G (175µl, 55 15,7mg). La mezcla reactiva se incubó durante 2h a 27°C.
[0248] El aldehído excedente se extinguió por adición de hidrocloruro de metilhidroxilamina (12,5µl, 296µg). La mezcla reactiva se incubó de nuevo durante 30min a 27°C
60 Purificación:
[0249] La purificación se hizo como en el ejemplo 4. La concentración de proteína se estimó por medición de la absorción en 280nm (Nanodrop ND-1000, Nanodrop Technologies, Inc, EEUU) dando una recuperación de proteína estimada de 45%.
65 [0250] El producto se pasó por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS NuPage 7% de gel de Tris-acetato (Invitrogen EA03555BOX) según las instrucciones del fabricante (70min a 150V). Los geles estaban teñidos con plata (Invitrogen LC6070). Las proteínas estándar eran de Invitrogen (HiMark HMW Standard LC5688).
5 [0251] Nuevamente, la cadena pesada de FVIII fue la más fuertemente modificada, el conjugado colomínico de ácido-FVIII se identificó en el gel SDS por una amplia y difusa banda presente entre 93 y aproximadamente 140kD.
Ejemplo 8: oximación de Intermedio 2 con Intermedio 9
10 [0252] Al Intermedio 2 (210µg; 1,42nmol) en solución en el tampón E (44µl) se le agregó una solución de C34-(1-(5-(2(ω-(3-(4-(formil)benzoilamino)propilcarbamoilmetil)3 kDa PEGyl)-etilcarbamoil)pentil)2,5-dioxopirrolidin-3-il)albúmina (100µg, 1,41nmol) en solución en el tampón E (10µl). Una solución de anilina de 0,3M en el tampón E fue añadida (2µl). La reacción se incubó durante toda la noche a 30°C.
15 [0253] El exceso de Intermedio 2 se extinguió por adición de 4-hidroxibenzaldehído (1,46µg) en agua (2µl). La mezcla se dejó durante 1 h a 30°C.
[0254] La mezcla se diluyó 1:11 (v/v) con tampón C antes de purificación por intercambio de anión en el Vivapure Q mini M (VivaScience): tras la carga, el material se lavó con tampón C y se eluyó con tampón D. El eluato se sometió luego a
20 cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare). El flujo fue 0,5ml/min, y el eluyente fue un tampón que consistía en sacarosa (3g/l), histidina (1,5g/l), cloruro sódico (18g/l), Tween 80 (0,1g/l), cloruro de calcio (0,25g/l), pH7,3.
[0255] Un análisis SDS PAGE mostró la presencia de bandas en aproximadamente 166kD, 228kD y 332kD, que se
25 asignaron a modo de tentativa para acoplamiento de una, dos o tres fracciones de C34-(1-(5-(2-(ω-(3-(4(formil)benzoilamino)propilcarbamoilmetil)3 kDa PEGyl)etilcarbamoil)-pentil)2,5-dioxopirrolidin-3-il)albúmina respectivamente en la cadena pesada de FVIII.
Análisis de actividad cromogénica de FVIII - prueba de COA
30 [0256] La actividad de un FVIII conteniendo una muestra se puede determinar con una prueba de COA disponible comercialmente (COATEST® SP FVIII, Chromogenix Art. No.: 82 4086 63).
Determinación de parámetros farmacocinéticos
35 [0257] Se usaron 15 ratones KO FVIII criados en Taconic M&B con un peso aproximado de 21,8 g para el estudio. A los ratones se les dosificaron los compuestos en una única inyección en la vena de la cola y fueron anestesiados con Isofluran/O2/N2O para muestra de sangre. Se tomaron muestras de sangre de dos o tres ratones en puntos temporales a 0,08, 0,33, 1, 3, 7, 16, 24, 48, 64 h post administración del plexo orbital. Se tomaron muestras de 4 gotitas de sangre
40 del ojo usando un tubo de vidrio capilar de 10 µl. Después de la tercera muestra de sangre, los ratones fueron matados por dislocación cervical. 45 µl de sangre se transfirió a tubos de Eppendorf conteniendo 5 µl de citrato de sodio (0,13 M). 200 µl de tampón Coatest SP FVIII se agregó y la sangre diluida se centrifugó en 4000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se analizó mediante análisis de antígeno en ELISA y actividad cromogénica.
45 Tabla 1 compuestos y dosis
Descripción del compuesto Example nº Dosis Volumen dosis Conc.*
IU/kg (ml/kg) (IU/ml) Producto de reacción de Intermedio 2 e Intermedio 3 2 280 5 56 Producto de reacción de Intermedio 2 e Intermedio 4 3 280 5 56 Producto de reacción de Intermedio 2 con 3-(mPEGyl)propanal 1 280 4,30 65,1
Tabla 2 parámetros PK obtenidos según NCA
Ensayo
Ejemplo Cmax (IU/I) AUC (h*IU/I) AUC extrap (%) T½ (h) Cl (ml/h/kg) Vss (ml/kg) MRT (h)
COA de FVIII
1 2945 36751 1 11 7,6 116 15
COA de FVIII
2 2504 37258 5 13 6,9 137 20
COA de FVIII
3 4534 46025 2 9,3 10 121 12
COA de FVIII
BDD-FVIII 2740 26000 3 7,8 11 117 11
ELISA de FVIII
1 2557 30635 8 13 9,1 160 17
ELISA de FVIII
2 2750 39054 4 13 7,2 128 18
ELISA de FVIII
3 3020 27927 3 9,6 10 126 13
ELISA de FVIII
BDD-FVIII 1990 20000 10 8,2 14 159 12
[0258] Una prolongación o ligera prolongación de la vida media terminal (9,3-13 h) se observa después de administración i.v. de los tres compuestos en comparación con el FVIII con el dominio B eliminado (BDD-FVIII) (7,8-8,2 h) cuando se mide por actividad cromogénica de FVIII y ELISA de FVIII. El periodo de permanencia medio (MRT) aumentó de forma similar en los tres compuestos (12-20 h) en comparación con BDD-FVIII (11-12 h). Además, el aclaramiento de los compuestos se redujo (6,9-10 ml/h/kg) en comparación con BDD-FVIII (11-14 ml/h/kg).

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Derivado de Factor VIII de la fórmula (I):
    donde:
    10 B representa un alquileno C2 a C10; m representa 0 o un número entero de 1 a 19, n representa un número entero de 1 a 20 y la suma de m y n es de 1 a 20; P representa un mono o polirradical de Factor VIII obtenido por eliminación de los grupos de carbamoil m + n a
    15 partir de las cadenas laterales de los residuos de glutamina presentes en el Factor VIII; y M representa una fracción (M1) que aumenta la vida media en plasma del derivado de Factor VIII o una fracción indicadora (M2);
    o una sal derivada farmacéuticamente aceptable.
    20 2. Derivado de Factor VIII según la reivindicación 1, donde dicha fracción M1 comprende una o más fracciones de polietilenoglicol (PEG), polipéptidos o ligantes de proteína plasmática.
  2. 3. Derivado de Factor VIII según la reivindicación 2, donde dicho péptido es albúmina o un anticuerpo o fragmento de la
    misma. 25
  3. 4. Derivado de Factor VIII según la reivindicación 2, donde dicho ligante de proteína plasmática es un ligante de albúmina.
  4. 5. Derivado de Factor VIII según la reivindicación 2, donde dicha fracción M1 comprende una fracción de polietilenoglicol 30 (PEG).
  5. 6. Derivado de Factor VIII según la reivindicación 1, donde:
    B representa un alquileno C2 a C4;
    35 m representa 0 o un número entero de 1 a 5, n representa un número entero de 1 a 6 y la suma de m y n es de 1 a 6; y M representa una fracción (M1) que comprende una fracción de polietilenoglicol (PEG) y/o un ligante de albúmina.
    40 7. Derivado de Factor VIII según la reivindicación 1, donde:
    B representa un alquileno C2 a C4; m representa 0 o un número entero de 1 a 5, n representa un número entero de 1 a 6 y la suma de m y n es de 1 a 6 y
    45 M representa una fracción (M2) que comprende biotina o un marcador fluorescente.
  6. 8. Derivado de Factor VIII según la reivindicación 6 o 7 donde B representa un alquileno C3.
  7. 9. Composición farmacéutica que comprende un derivado de Factor VIII tal y como se define en cualquiera de las 50 reivindicaciones precedentes y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
  8. 10. Derivado de Factor VIII tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
    55 11. Derivado de Factor VIII según la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento de la hemofilia A.
  9. 12. Derivado de Factor VIII de la fórmula (II):
    5 donde:
    B representa un alquileno C2 a C10; q representa un número entero de 1 a 20 y 10 P' representa un mono o polirradical de Factor VIII obtenido por eliminación de los grupos de carbamoil q a partir de las cadenas laterales de los residuos de glutamina presentes en el Factor VIII;
    o una sal derivada farmacéuticamente aceptable.
  10. 13. Método para preparar un derivado de Factor VIII de la fórmula (II) tal y como se define en la reivindicación 12, este 15método comprende la reacción de Factor VIII con un compuesto de la fórmula (III):
    H2N-O-B-O-NH2 (III)
    en presencia de una transglutaminasa, donde B es tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 20
  11. 14.
    Método según la reivindicación 13, donde la transglutaminasa es transglutaminasa de Streptomyces mobaraense.
  12. 15.
    Método para preparar un derivado de Factor VIII de la fórmula (I), tal y como se define en cualquiera de las
    reivindicaciones 1 a 8, que comprende la reacción de un derivado de Factor VIII de la fórmula (II), tal y como se define 25 en la reivindicación 12, con un aldehído de la fórmula (IV):
    donde M es tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o 7.
ES10704152T 2009-02-19 2010-02-18 Modificación de Factor VIII Active ES2401965T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09153257 2009-02-19
EP09153257 2009-02-19
US16151009P 2009-03-19 2009-03-19
US161510P 2009-03-19
PCT/EP2010/052022 WO2010102886A1 (en) 2009-02-19 2010-02-18 Modification of factor viii

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2401965T3 true ES2401965T3 (es) 2013-04-25

Family

ID=40935766

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10704152T Active ES2401965T3 (es) 2009-02-19 2010-02-18 Modificación de Factor VIII

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20110306551A1 (es)
EP (1) EP2398822B1 (es)
JP (1) JP2012518029A (es)
CN (1) CN102333788A (es)
ES (1) ES2401965T3 (es)
WO (1) WO2010102886A1 (es)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101557830B (zh) 2006-12-15 2016-06-08 巴克斯特国际公司 具有延长的体内半衰期的因子VIIa-聚唾液酸结合物
WO2010015668A1 (en) * 2008-08-06 2010-02-11 Novo Nordisk A/S Conjugated proteins with prolonged in vivo efficacy
KR101759300B1 (ko) 2009-07-27 2017-07-31 리폭센 테크놀로지즈 리미티드 비혈액 응고 단백질의 글리코폴리시알화
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
ES2856055T3 (es) 2009-07-27 2021-09-27 Baxalta GmbH Glicopolisialilación de proteínas diferentes de las proteínas de coagulación de la sangre
EP2459226B1 (en) 2009-07-27 2016-06-29 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of proteins other than blood coagulation proteins
CN105963710A (zh) 2009-08-06 2016-09-28 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 具有延长的体内功效的生长激素
KR101813595B1 (ko) 2010-01-22 2017-12-29 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 장기적 생체 내 효능을 갖는 성장 호르몬
US9211342B2 (en) 2010-01-22 2015-12-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Stable growth hormone compounds resistant to proteolytic degradation
WO2011101242A1 (en) * 2010-02-16 2011-08-25 Novo Nordisk A/S Factor viii molecules with reduced vwf binding
JP2014501227A (ja) * 2010-12-16 2014-01-20 ノヴォ ノルディスク アー／エス 第ｖｉｉｉ因子水溶液
ES2800983T3 (es) 2010-12-22 2021-01-07 Baxalta GmbH Materiales y métodos para conjugar un derivado de ácido graso soluble en agua con una proteína
BR112014006684A2 (pt) 2011-09-23 2017-03-28 Novo Nordisk As análogos de glucagon
WO2013123409A1 (en) * 2012-02-17 2013-08-22 NVS Technologies, Inc. Polymer scaffolds for assay applications
EP2882457A1 (en) * 2012-08-13 2015-06-17 Novo Nordisk A/S Liquid factor viii formulations
WO2014107622A1 (en) 2013-01-07 2014-07-10 University Of Southern California Deoxyuridine triphosphatase inhibitors
EP2981282B1 (en) 2013-04-05 2020-11-04 Novo Nordisk Health Care AG Growth hormone compound formulation
JP6594856B2 (ja) 2013-04-18 2019-10-23 ノヴォ ノルディスク アー／エス 医療用の安定な遷延性ｇｌｐ−１／グルカゴン受容体コアゴニスト
KR20160029079A (ko) 2013-07-04 2016-03-14 노보 노르디스크 에이/에스 Glp-1 유사 펩티드의 유도체 및 그것의 사용
CA2918076A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Novartis Ag Site-specific chemoenzymatic protein modifications
WO2015103489A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 University Of Southern California Heteroatom containing deoxyuridine triphosphatase inhibitors
CN106536547A (zh) 2014-06-04 2017-03-22 诺和诺德股份有限公司 用于医疗用途的glp‑1/胰高血糖素受体共激动剂
BR112017002090B1 (pt) 2014-08-04 2021-06-01 Csl Limited Composição aquosa de fator viii de coagulação e método de estabilizar uma molécula de fviii
JP6682734B2 (ja) * 2015-01-27 2020-04-15 ビージーアイ シェンチェン 生体試料を保存するための安定化剤
EP3265483B1 (en) 2015-03-06 2019-12-11 CSL Behring Lengnau AG Modified von willebrand factor having improved half-life
WO2017006271A1 (en) 2015-07-08 2017-01-12 University Of Southern California Deoxyuridine triphosphatase inhibitors containing amino sulfonyl linkage
US10577321B2 (en) 2015-07-08 2020-03-03 University Of Southern California Deoxyuridine triphosphatase inhibitors
US10570098B2 (en) 2015-07-08 2020-02-25 Cv6 Therapeutics (Ni) Limited Hydantoin containing deoxyuridine triphosphatase inhibitors
WO2017006283A1 (en) 2015-07-08 2017-01-12 Cv6 Therapeutics (Ni) Limited Deoxyuridine triphosphatase inhibitors containing cyclopropano linkage
EP3423481B1 (en) 2016-03-03 2020-10-07 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives and uses thereof
US10858344B2 (en) 2016-11-23 2020-12-08 Cv6 Therapeutics (Ni) Limited Hydantoin containing deoxyuridine triphosphatase inhibitors
WO2018098208A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Cv6 Therapeutics (Ni) Limited Nitrogen ring linked deoxyuridine triphosphatase inhibitors
WO2018098209A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Cv6 Therapeutics (Ni) Limited Amino sulfonyl compounds
WO2018098204A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Cv6 Therapeutics (Ni) Limited 6-membered uracil isosteres
US11014924B2 (en) 2016-11-23 2021-05-25 Cv6 Therapeutics (Ni) Limited Hydantoin containing deoxyuridine triphosphatase inhibitors
WO2018128720A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Cv6 Therapeutics (Ni) Limited Uracil containing compounds
AR112760A1 (es) 2017-07-19 2019-12-11 Novo Nordisk As Compuestos bifuncionales que comprenden un análogo de glp-1 y un análogo de egf(a)
US20200165313A1 (en) 2017-07-19 2020-05-28 Novo Nordisk A/S Egf(a) analogues, preparation, formulations and uses thereof
WO2019229242A1 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Novo Nordisk A/S Derivatives comprising an apelin analogue and uses thereof
US20220389082A1 (en) 2019-07-04 2022-12-08 CSL Behring Lengnau AG A truncated von willebrand factor (vwf) for increasing the in vitro stability of coagulation factor viii
WO2021094344A1 (en) 2019-11-11 2021-05-20 CSL Behring Lengnau AG Polypeptides for inducing tolerance to factor viii
MX2023004672A (es) 2020-11-06 2023-07-20 Novo Nordisk As Profármacos de péptido tipo glucagón humano 1 (glp-1) y usos de los mismos.
WO2023285347A1 (en) 2021-07-12 2023-01-19 Novo Nordisk A/S Novel fatty acid modified urocortin 2 derivatives and the uses thereof
TW202346324A (zh) 2022-05-10 2023-12-01 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 前藥及其用途
WO2024094747A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 Novo Nordisk A/S Cnp compounds
WO2024133739A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Novo Nordisk A/S Amylin receptor agonists

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0665280B2 (ja) 1987-03-04 1994-08-24 味の素株式会社 タンパクゲル化剤及びそれを用いるタンパクのゲル化方法
JP2849773B2 (ja) 1990-08-27 1999-01-27 天野製薬株式会社 ストレプトミセス属由来のトランスグルタミナーゼの製造法
DE69333718T2 (de) 1992-01-14 2005-12-01 Ajinomoto Co., Inc. Gen, das für eine Fisch-Transglutaminase kodiert
DK128193D0 (da) 1993-11-12 1993-11-12 Novo Nordisk As Hidtil ukendte forbindelser
JP3758187B2 (ja) 1994-01-28 2006-03-22 味の素株式会社 マガキ由来のトランスグルタミナーゼ
WO1996006931A1 (en) 1994-08-26 1996-03-07 Novo Nordisk A/S Microbial transglutaminases, their production and use
ATE248219T1 (de) 1995-01-19 2003-09-15 Novozymes As Transglutaminasen aus oomyzeten
JP3669390B2 (ja) 1995-02-09 2005-07-06 味の素株式会社 バチルス属細菌由来のトランスグルタミナーゼ
AU7381098A (en) * 1997-05-16 1998-12-08 Novo Nordisk Biotech, Inc. Polypeptides having prolyl pipeptidyl aminopeptidase activity and nucleic acids encoding same
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
JP2003199569A (ja) 2001-12-17 2003-07-15 Food Industry Research & Development Inst ストレプトベルティシリウム・ラダカヌムのトランスグルタミナーゼ遺伝子及び該遺伝子によってコードされるトランスグルタミナーゼ
CN102139114A (zh) * 2003-02-26 2011-08-03 尼克塔治疗公司 聚合物-因子viii部分缀合物
EP2368579A1 (en) * 2004-01-21 2011-09-28 Novo Nordisk Health Care AG Transglutaminase mediated conjugation of peptides
US20070105770A1 (en) * 2004-01-21 2007-05-10 Novo Nordisk A/S Transglutaminase mediated conjugation of peptides
HUE033776T2 (en) * 2004-11-12 2018-01-29 Bayer Healthcare Llc FVIII site-specific modification
KR20080108147A (ko) * 2006-03-31 2008-12-11 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 페질화된 인자 ｖｉｉｉ
CN101557830B (zh) 2006-12-15 2016-06-08 巴克斯特国际公司 具有延长的体内半衰期的因子VIIa-聚唾液酸结合物

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010102886A1 (en) 2010-09-16
JP2012518029A (ja) 2012-08-09
EP2398822A1 (en) 2011-12-28
CN102333788A (zh) 2012-01-25
US20110306551A1 (en) 2011-12-15
EP2398822B1 (en) 2013-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2401965T3 (es) Modificación de Factor VIII
ES2434035T3 (es) Conjugados de polímero-factor von Willebrand
JP5702066B2 (ja) 解離可能な連結を有するフォンウィルブランド因子および第ｖｉｉｉ因子のポリマー共役体
JP5908401B2 (ja) 血液凝固タンパク質複合体
US8053561B2 (en) Pegylated factor VIII
ES2655639T3 (es) Conjugado de factor VIIa - ácido (poli)siálico que tiene una semivida in vivo prolongada
ES2541369T3 (es) Factor VIII recombinante modificado
JP7071093B2 (ja) 血液凝固タンパク質複合体
US8859731B2 (en) Selective modification of proteins
WO2015132724A1 (en) Improved muteins of clotting factor viii
US20190240295A1 (en) Factor viii with extended half-life and reduced ligand-binding properties