ES2389542T3 - Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna - Google Patents

Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna Download PDF

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Abstract

Virus recombinante del sarampión que expresa una secuencia heteróloga de aminoácidos de un antígeno delvirus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental, siendo dicho virus recombinante del sarampión el producto dela expresión en una célula de una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una molécula de ADNcque codifica la secuencia de nucleótidos del ARN antigenómico (+) de longitud completa de un virus del sarampión(MV) originaria de la cepa Schwarz, donde dicha molécula de ADNc se recombina con una secuencia heteróloga denucleótidos que codifica una secuencia heteróloga de aminoácidos de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o elvirus del Nilo occidental, y siendo capaz dicho virus recombinante del sarampión de provocar una respuesta inmunehumoral y/o a celular contra el virus del sarampión o contra dicho virus de la fiebre amarilla o virus del Nilo occidentalo tanto contra el virus del sarampión como contra dicho virus de la fiebre amarilla o virus del Nilo occidental.

Description

Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna
[0001] La invención se refiere a virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental y a su uso para la preparación de composiciones de vacuna.
[0002] El virus del sarampión es un miembro del orden mononegavirales, es decir, virus con un genoma ARN de cadena negativa no segmentado. El genoma no segmentado del virus del sarampión (MV del inglés "measles virus") tiene una polaridad antimensaje que produce un ARN genómico que no se traduce in vivo o in vitro ni es infeccioso cuando se purifica.
[0003] Se ha estudiado la transcripción y replicación de virus ARN de cadena (-) no segmentada y su ensamblaje como partículas virales y se ha presentado especialmente en Fields virology (3ª edición, vol. 1, 1996, Lippincott - Raven publishers - Fields BN et al.). La transcripción y replicación del virus del sarampión no implican el núcleo de las células infectadas sino que en cambio tiene lugar en el citoplasma de dichas células infectadas. El genoma del virus del sarampión comprende genes que codifican seis proteínas estructurales principales a partir de los seis genes (denominados N, P, M, F, H y L) y dos proteínas no estructurales adicionales a partir del gen P. El orden de los genes es el siguiente: 3'-I, N, P (incluyendo C y V), M, F, H, y la proteína polimerasa grande L en el extremo 5'. El genoma comprende adicionalmente regiones no codificantes en la región intergénica IWF; esta región no codificante contiene aproximadamente 1000 nucleótidos de ARN no traducido. Los genes citados codifican respectivamente el péptido líder (gen I), las proteínas de la nucleocápsida del virus, es decir, la nucleoproteína (N), la fosfoproteína (P), y la proteína grande (L) que se ensamblan alrededor del ARN genómico para proporcionar la nucleocápsida. Los otros genes codifican las proteínas de la envuelta viral incluyendo las proteínas hemaglutinina (H), de fusión (F) y de matriz (M).
[0004] Se ha aislado el virus del sarampión y se han obtenido vacunas vivas atenuadas del aislado del MV Edmonston en 1954 (Enders, J. F., y T. C. Peebles. 1954. Propagation in tissue cultures od cytopathogenic agents from patients with measles. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86:277-286.), por pases en serie en células renales o amnióticas humanas primarias. Las cepas usadas después se adaptaron para fibroblastos embrionarios de pollo (FEP) para producir semillas Edmonston A y B (Griffin, D., y W. Bellini. 1996. Measles virus, pág. 1267-1312. En B. Fields, D. Knipe, et al. (ed.), Virology, vol. 2. Lippincott - Raven Publishers, Filadelfia). Edmonston B se autorizó en 1963 como la primera vacuna contra el MV. Pases adicionales de Edmonston A y B en FEP produjeron los virus Schwarz y Moraten más atenuados (Griffin, D., y W. Bellini. 1996. Measles virus, pág. 1267-1312. En B. Fields, D. Knipe, et al. (ed.), Virology, vol. 2. Lippincott - Raven Publishers, Filadelfia) cuyas secuencias se ha demostrado recientemente que son idénticas (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, y S. A. Udem. 2001. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:921-933; Parks, C. L, R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, y S. A. Udem. 2001. Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:910-920). Como la vacuna Edmonston B era reactogénica, se abandonó en 1975 y se remplazó por la vacuna Schwarz/Moraten que es actualmente la vacuna contra el sarampión más ampliamente usada en el mundo (Hilleman, M. 2002. Current overview of the pathogenesis and prophylaxis of measles with focus on practical implications. Vaccine. 20: 651-665). También se usan otras varias cepas de vacuna: AIK-C, Schwarz F88, CAM70, TD97 en Japón, Leningrad-16 en Rusia, y Edmonston Zagreb. Las cepas chinas CAM70 y TD97 no se obtuvieron de Edmonston. Las vacunas Schwarz/Moraten y AIK-C se producen en FEP. La vacuna Zagreb se produce en células diploides humanas (WI38).
[0005] La vacuna viva atenuada obtenida de la cepa Schwarz está comercializada por Aventis Pasteur (Lyon Francia) con el nombre comercial Rouvax®.
[0006] En un trabajo notable y pionero, Martin Billeter y sus colegas clonaron el ADNc infeccioso correspondiente al antigenoma del MV Edmonston y establecieron un procedimiento genético original y eficaz para recuperar el virus correspondiente (Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dötsch, G. Christiansen, y M. Billeter., 1995. Rescue of measles viruses from cloned DNA. EMBO Journal. 14:5773-5784) y documento WO 97/06270. Desarrollaron un vector Edmonston para la expresión de genes foráneos (Radecke, F., y M. Billeter. 1997. Reverse genetics meets the nonsegmented negative-strand RNA viruses. Reviews in Medical Virology. 7:49-63.) y demostraron su gran capacidad de inserción (hasta 5 kb) y su alta estabilidad en la expresión de transgenes (Singh, M., y M. Billeter. 1999. A recombinant measles virus expressing biologically active human interleukin-12. J. Gen. Virol. 80:101-106; Singh, M., R. Cattaneo, y M. Billeter. 1999. A recombinant measles virus expressing hepatitis B virus surface antigen induces humoral immune responses in genetically modified mice. J. Virol. 73:4823-4828; Spielhofer, P., T. Bachi, T. Fehr, G. Christiansen, R. Cattaneo, K. Kaelin, M. Billeter, y H. Nairn. 1998. Chimeric measles viruses with a foreign envelope. J. Virol. 72:2150-2159); Wang, Z., T. Hangartner, L. Cornu, A. Martin, M. Zuniga, M. Billeter, y H. Nairn. 2001. Recombinant measles viruses expressing heterologus antigens of mumps and simian immunodeficiency viruses. Vaccine. 19:2329-2336. Este vector se clonó a partir de la cepa Edmonston B del MV propagado en células HeLa (Ballart, I., D. Eschle, R. Cattaneo, A. Schmid, M. Metzler, J. Chan, S. Pifko-Hirst, S.
A. Udem, y M. A. Billeter. 1990. Infectious measles virus from cloned cDNA. Embo J. 9:379-384).
[0007] Además, se ha producido virus recombinante del sarampión que expresa el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B y ha demostrado inducir respuestas inmunes humorales en ratones genéticamente modificados (Singh M. R. et al., 1999, J. virol. 73: 4823-4828).
[0008] La vacuna contra el MV induce una inmunidad muy eficaz, de por vida después de una única inyección de baja dosis (104 DICT50) (33,34). La protección está mediada tanto por anticuerpos como por células T CD4+ y CD8+. El genoma del MV es muy estable y nunca se ha observado reversión a patogenicidad con esta vacuna. El MV se replica exclusivamente en el citoplasma, descartando la posibilidad de integración en el ADN del hospedador. Además, se ha establecido un clon de ADNc infeccioso correspondiente al anti-genoma de la cepa Edmonston del MV y un procedimiento para recuperar el virus correspondiente (35). Este ADNc se ha creado en un vector para expresar genes foráneos (36). Puede albergar hasta 5 kb de ADN foráneo y es genéticamente muy estable (37, 38, 39).
[0009] A partir de la observación de que las propiedades del virus del sarampión y especialmente su capacidad de provocar elevados títulos de anticuerpos neutralizantes in vivo y su propiedad de ser un potente inductor de respuestas inmunes celulares de larga duración, los inventores han propuesto que puede ser un buen candidato para la preparación de composiciones que comprendan virus recombinantes infecciosos que expresen péptidos o polipéptidos antigénicos de determinados virus ARN, incluyendo especialmente retrovirus o flavivirus, para inducir anticuerpos neutralizantes contra dicho virus ARN y especialmente dichos retrovirus o flavivirus que podrían ser preferiblemente adecuados para conseguir al menos algún grado de protección contra dichos virus ARN, especialmente retrovirus o flavivirus, en animales y más preferiblemente en hospedadores humanos. Especialmente, las cepas de MV y en particular las cepas de vacuna se han elegido en la presente invención como vectores candidatos para inducir inmunidad tato contra el virus del sarampión como contra virus ARN cuyo constituyente se expresa en el MV recombinante diseñado, en poblaciones de bebés expuestos porque ellos no tienen inmunidad contra el MV. Las poblaciones adultas, incluso individuos ya inmunizados contra el MV, sin embargo, también pueden beneficiarse de la inmunización con MV recombinante porque la readministración del virus MV en forma recombinante de la presente invención puede provocar un refuerzo de anticuerpos anti-MV.
[0010] Entre los flavivirus de interés, los inventores han elegido el virus de la fiebre amarilla (YFV del inglés Yellow Fever Virus) y el virus del Nilo occidental (WNV del inglés West Nile Virus), que son patógenos importantes de los seres humanos.
[0011] El YFV y el WNV pertenecen a la familia Flaviviridae descrita en Fields virology (3ª edición, vol. 1, 1996, Lippincott - Raven publishers - Fields BN et al.).
[0012] La invención se refiere a un virus recombinante del sarampión que expresa una secuencia heteróloga de aminoácidos procedente de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental, siendo capaz dicho virus recombinante de provocar una respuesta inmune humoral y/o celular contra dicha secuencia heteróloga de aminoácidos incluyendo en individuos que tienen inmunidad preexistente contra el virus del sarampión.
[0013] La solicitud también describe un virus recombinante mononegavirales que expresa una secuencia heteróloga de aminoácidos, siendo capaz dicho virus recombinante de provocar una respuesta inmune humoral y/o celular contra dicha secuencia heteróloga de aminoácidos incluyendo en individuos que tienen inmunidad preexistente contra el virus del sarampión.
[0014] En una primera realización, la invención proporciona especialmente virus recombinantes del sarampión capaces de expresar antígenos y especialmente epítopos de antígenos del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental.
[0015] La solicitud también describe virus recombinantes del sarampión capaces de expresar antígenos y especialmente epítopos derivados de antígenos de virus ARN incluyendo retrovirus o flavivirus.
[0016] La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, especialmente a construcciones recombinantes de ácido nucleico que expresan los virus recombinantes del sarampión y que expresan con los mismos antígenos o epítopos de antígenos del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental.
[0017] La invención también se refiere a procesos para la preparación de dichos virus recombinantes del sarampión y especialmente se refiere a la producción dicho MV recombinante en sistemas de recuperación.
[0018] La invención también se refiere a composiciones que comprenden dichos virus recombinantes del sarampión como principios activos para la protección de hospedadores, especialmente hospedadores humanos, contra enfermedades relacionadas con infecciones por dicho virus de la fiebre amarilla o virus del Nilo occidental.
[0019] La solicitud también describe construcciones de ácido nucleico especialmente construcciones
recombinantes de ácido nucleico que expresan los virus recombinantes del sarampión y que expresan con los mismos antígenos o epítopos de antígenos de retrovirus o flavivirus.
[0020] La solicitud también describe procesos para la preparación de dichos virus recombinantes del sarampión y especialmente se refiere a la producción de dicho MV recombinante en sistemas de recuperación.
[0021] La solicitud también describe composiciones que comprenden dichos virus recombinantes del sarampión como principios activos para la protección de hospedadores, especialmente hospedadores humanos, contra enfermedades relacionadas con infecciones por dichos retrovirus, especialmente por retrovirus del SIDA, o dichos flavivirus.
[0022] Se han descrito secuencias de ácido nucleico en la solicitud de patente internacional WO 98/13501, especialmente una secuencia de ADN de 15.894 nucleótidos correspondiente a una copia de ADN del ARN mensajero con sentido de cadena positiva (antigenómica) de diversas cepas tipo silvestre de sarampión para vacunas, incluyendo la cepa de tipo silvestre Edmonston, la cepa Moraten y la cepa Schwarz que es idéntica a la capa Moraten excepto por las posiciones de los nucleótidos 4917 y 4924 en que la cepa Schwarz tiene una « C » en lugar de una « T ».
[0023] Para producir virus recombinantes del sarampión, se ha desarrollado un sistema de recuperación para la cepa del MV Edmonston y se ha descrito en la solicitud de patente internacional WO 97/06270. La descripción de dicho sistema de recuperación está contenida en el documento WO 97/06270, y se hace referencia especialmente a los ejemplos de esta solicitud internacional, incluyendo los ejemplos referidos a células y virus, a la generación de la línea celular 293-3-46, construcciones plasmídicas, la transfección de plásmidos y la recolección de productos génicos informadores, la configuración experimental para recuperar el MV, células auxiliares que expresan de forma estable las proteínas N y P del MV así como la ARN polimerasa T7, la recuperación del MV usando células auxiliares 293-3-46 y la caracterización del MV recuperado.
[0024] El sistema de recuperación descrito en el documento WO 97/06270 se ha desarrollado adicionalmente para incluir una etapa de choque térmico descrita en Parks C. L. et al., 1999, J. virol. 73: 3560-3566.
[0025] La invención por tanto se refiere a virus recombinantes del sarampión que expresan una secuencia heteróloga de aminoácidos procedente de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental, donde dicho virus recombinante del sarampión es capaz de provocar una respuesta inmune humoral y/o celular contra el virus del sarampión o contra dicho virus de la fiebre amarilla o virus del Nilo occidental o tanto contra el virus del sarampión como contra dicho virus de la fiebre amarilla o virus del Nilo occidental.
[0026] La solicitud también describe virus recombinantes del sarampión que expresan una secuencia heteróloga de aminoácidos derivada de un antígeno de un determinado virus ARN, especialmente de un retrovirus o flavivirus, donde dicho virus recombinante del sarampión es capaz de provocar una respuesta inmune humoral y/o celular contra el virus del sarampión o contra dicho virus ARN, especialmente retrovirus o flavivirus o tanto contra el virus del sarampión como contra dicho virus ARN, especialmente retrovirus o flavivirus.
[0027] La expresión « secuencia heteróloga de aminoácidos » se refiere a una secuencia de aminoácidos que no se obtiene de los antígenos de virus del sarampión, obteniéndose, por consiguiente, dicha secuencia heteróloga de aminoácidos de un virus ARN, especialmente de un retrovirus o flavivirus de interés para establecer una respuesta inmune en un hospedador, especialmente en un ser humano y preferiblemente para establecer protección contra una infección por dicho virus ARN, especialmente retrovirus o flavivirus.
[0028] La secuencia heteróloga de aminoácidos expresada en virus recombinantes del sarampión de acuerdo con la invención es tal que es capaz de provocar una respuesta inmune humoral y/o celular en un hospedador determinado, contra el virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental a partir los cuales se ha originado. Por consiguiente, esta secuencia de aminoácidos es una que comprende al menos un epítopo de un antígeno, especialmente un epítopo conservado, estando expuesto dicho epítopo de forma natural en el antígeno u obteniéndose o exponiéndose como resultado de una mutación o modificación o combinación de antígenos.
[0029] La secuencia heteróloga de aminoácidos expresada en los otros virus recombinantes del sarampión descritos en la solicitud es tal que es capaz de provocar una respuesta inmune humoral y/o celular en un hospedador determinado, contra el virus ARN, especialmente retrovirus o flavivirus a partir de los cuales se ha originado. Por consiguiente, esta secuencia de aminoácidos es una que comprende al menos un epítopo de un antígeno, especialmente un epítopo conservado, estando expuesto dicho epítopo de forma natural en el antígeno u obteniéndose o exponiéndose como resultado de una mutación o modificación o combinación de antígenos.
[0030] Los antígenos usados para la preparación de los virus recombinantes del sarampión de acuerdo con la invención son especialmente antígenos de envueltas de los virus de la fiebre amarilla o envueltas del virus del Nilo occidental. Sin embargo, pueden usarse ventajosamente otros antígenos del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental para obtener virus recombinantes del sarampión capaces de provocar anticuerpos contra dichos
virus, y la invención se refiere, en una realización particular, a antígenos a partir de los cuales pueden obtenerse secuencias de aminoácidos que provoquen la producción de anticuerpos neutralizantes contra el virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental. De acuerdo con otra realización de la invención, la secuencia de aminoácidos de estos antígenos alternativa o adicionalmente también provoca una respuesta inmune celular contra el virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental.
[0031] Los antígenos usados para la preparación de los otros virus recombinantes del sarampión descritos en este documento son especialmente antígenos de envuelta de virus ARN tales como retrovirus o flavivirus, especialmente de envueltas de virus del SIDA incluyendo HIV-1 o de envueltas del virus de la fiebre amarilla o envueltas del virus del Nilo occidental. Sin embargo, pueden usarse ventajosamente otros antígenos retrovirales o flavivirales para obtener virus recombinantes del sarampión capaces de provocar anticuerpos contra dichos retrovirus o flavivirus, y la solicitud describe en particular antígenos a partir de los cuales pueden obtenerse secuencias de aminoácidos que provocan la producción de anticuerpos neutralizantes contra los retrovirus o flavivirus. De acuerdo con otra realización, la secuencia de aminoácidos de estos antígenos alternativa o adicionalmente también provoca una respuesta inmune celular contra los retrovirus o flavivirus.
[0032] De forma ventajosa, el virus recombinante del sarampión de la invención también provoca una respuesta inmune humoral y/o celular contre el virus del sarampión. Esta respuesta, sin embargo, no proporciona obligatoriamente la respuesta inmune contra el virus ARN, de hecho se obtiene.
[0033] De acuerdo con una realización preferida de la invención, el virus recombinante del sarampión de la invención se obtiene dentro de un sistema de recuperación para la preparación de virus infecciosos del sarampión. Por consiguiente, el virus recombinante del sarampión es un virus infeccioso del sarampión recuperado de un sistema de recuperación.
[0034] Un virus recombinante del sarampión particular descrito en la solicitud se obtiene de la cepa Edmonston del virus del sarampión.
[0035] El virus recombinante del sarampión de acuerdo con la invención se obtiene de la cepa Schwarz y especialmente de una cepa Schwarz de vacuna aprobada tal como la producida con el nombre comercial Rouvax®, disponible en Aventis Pasteur (Francia).
[0036] La invención por tanto proporciona un virus recombinante del sarampión que se recupera a partir de células auxiliares transfectadas con un ADNc que codifica el ARN antigenómico (cadena (+)) del virus del sarampión, estando dicho ADNc recombinado con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia heteróloga de aminoácidos del YFV o el WNV.
[0037] La solicitud también describe un virus recombinante del sarampión que se recupera a partir de células auxiliares transfectadas con un ADNc que codifica el ARN antigenómico (cadena (+)) del virus del sarampión, estando dicho ADNc recombinado con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia heteróloga de aminoácidos de ARN viral, especialmente retroviral o flaviviral.
[0038] La expresión « codificante » en la definición anterior abarca la capacidad del ADNc de permitir la transcripción de un ARN antigenómico (+) de longitud completa, sirviendo dicho ADNc especialmente como molde para la transcripción. Por consiguiente, cuando el ADNc es una molécula bicatenaria, una de las cadenas tiene la misma secuencia de nucleótidos que el ARN de cadena antigenómica (+) del virus del sarampión, excepto en que los nucleótidos « U » están sustituidos por « T » en el ADNc. Dicho ADNc es, por ejemplo, el inserto correspondiente al virus del sarampión, contenido en el plásmido pTM-MVSchw depositado con el Nº I.2889 en el CNCM París, Francia) el 12 de junio de 2002. Este plásmido está representado en la figura 2A.
[0039] La expresión "ADNc" usada para la descripción de la secuencia de nucleótidos de la molécula de la invención simplemente se refiere al hecho de que originalmente dicha molécula se obtiene por transcripción inversa del genoma ARN genómico (-) de longitud completa de partículas virales del virus del sarampión.
[0040] Esto no debería considerarse como una limitación de los métodos usados para su preparación. La invención por tanto abarca, dentro de la expresión "ADNc", todos los ADN con la condición de que tenga la secuencia de nucleótidos definida anteriormente. Por tanto están incluidos ácidos nucleicos purificados, incluyendo ADN, dentro del significado de ADNc de acuerdo con la invención, con la condición de que dicho ácido nucleico, especialmente ADN cumpla las definiciones dadas anteriormente.
[0041] Las células auxiliares de acuerdo con el sistema de recuperación se transfectan con un vector de transcripción que comprende el ADNc que codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa del virus del sarampión, cuando dicho ADNc se ha recombinado con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia heteróloga de aminoácidos de interés (secuencia heteróloga de nucleótidos) y dichas células auxiliares se transfectan adicionalmente con un vector de expresión o varios vectores de expresión que proporcionan las funciones auxiliares que incluyen aquellas que posibilitan la expresión de proteínas de acción en trans del virus del
sarampión, es decir, las proteínas N, P y L y proporcionan la expresión de una ARN polimerasa para posibilitar la transcripción del ADNc recombinante y la replicación del ARN viral correspondiente.
[0042] La solicitud también describe la preparación de virus recombinantes del sarampión que albergan epítopos de antígenos de retrovirus HIV. Describe especialmente un virus recombinante del sarampión que expresa una secuencia heteróloga de aminoácidos que se obtiene de un antígeno de envuelta del HIV y que se obtiene especialmente de una proteína de envuelta o glicoproteína del HIV-1.
[0043] Los antígenos de interés a este respecto son especialmente gp160, gp120 y gp41 de HIV-1 o gp140, GAG
o TAT de HIV-1.
[0044] En una realización particular descrita en la solicitud, la secuencia heteróloga de aminoácidos se obtiene de una proteína recombinante gp160, gp120 de HIV-1 o gp140, GAG o TAT de HIV-1.
[0045] La solicitud describe en particular un virus recombinante del sarampión donde los bucles V1, V2 y/o V3 del antígeno gp120 (o gp160) están delecionados o delecionados en parte, individualmente o en combinación de tal modo que los epítopos conservados están expuestos en el antígeno gp120 recombinante obtenido.
[0046] Los bucles V1, V2 y V3 del antígeno gp120 (o gp160) de HIV-1 se han descrito especialmente en Fields virology (Fields B.N. et al. - Lippincott Raven publishers 1996, pág. 1953-1977).
[0047] La solicitud también describe un virus recombinante del sarampión que es tal que expresa una secuencia heteróloga de aminoácidos obtenida del antígeno gp120 (o gp160) de HIV-1, donde los bucles V1, V2 y/o V3 del antígeno gp120 (o gp160) están sustituidos o sustituidos en parte, individualmente o en combinación, de tal modo que los epítopos conservados estén expuestos en el antígeno gp120 (o gp160) recombinante obtenido.
[0048] La solicitud también describe un virus recombinante del sarampión que expresa una secuencia heteróloga de ADN obtenida de un antígeno de envuelta de HIV-1 que se obtiene del antígeno gp120 de tal modo que los bucles V1 y V2 están delecionados y el bucle V3 está sustituido por la secuencia AAELDKWASAA.
[0049] La solicitud también describe un virus recombinante del sarampión que expresa una secuencia heteróloga de aminoácidos seleccionada entre gp160LV3, gp160LV1V2, gp160LV1V2V3, gp140LV3, gp140LV1V2, gp140LV1V2V3, estando dichas secuencias heterólogas de aminoácidos esquemáticamente representadas en la figura 1.
[0050] La invención también se refiere a virus recombinantes del sarampión definidos de acuerdo con las afirmaciones anteriores, donde la secuencia de aminoácidos se obtiene de un antígeno del virus de la fiebre amarilla seleccionado entre las proteínas de envuelta (Env) o NS1 o mutantes inmunogénicos de las mismas.
[0051] La invención también se refiere a virus recombinantes del sarampión definidos de acuerdo con las afirmaciones anteriores, donde la secuencia de aminoácidos se obtiene de un antígeno del virus del Nilo occidental seleccionado entre la proteína de envuelta (E), premembrana (preM) o mutantes inmunogénicos de las mismas.
[0052] La invención también se refiere a virus recombinantes del sarampión o a partículas tipo virus (VLP del inglés "virus like particles") que expresan dos o múltiples antígenos recombinantes del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental, contra los que se busca una respuesta inmune.
[0053] La solicitud también describe virus recombinantes del sarampión o VLP que expresan dos o múltiples antígenos recombinantes, especialmente múltiples antígenos del HIV (incluyendo fragmentos de los mismos) o antígenos de flavivirus, contra los que se busca una respuesta inmune.
[0054] Dichos virus recombinantes del sarampión o VLP pueden expresar ventajosamente antígenos de diferentes virus y por tanto proporcionar inmunógenos contra diversos virus.
[0055] La invención se refiere adicionalmente a virus recombinantes del sarampión de acuerdo con una cualquiera de las definiciones anteriores, donde el ADNc necesario para la expresión de las partículas virales, que está comprendido dentro del vector pTM-MVSchw está recombinado con la secuencia ATU de la figura 8 o la secuencia ATU ilustrada en la figura 2C, estando dicha ATU insertada en una posición del vector pTM-MVSchw que aprovecha la ventaja del gradiente del genoma viral para permitir diversos niveles de expresión de la secuencia transgénica que codifica la secuencia heteróloga de aminoácidos insertada en dicha ATU. La invención posibilita ventajosamente la inserción de dichas secuencias heterólogas de ADN en una secuencia que se denomina Unidad de Transcripción Adicional (ATU del inglés Additional Transcription Unit) especialmente una ATU como se describe por Billeter et al. en el documento WO 97/06270.
[0056] Las propiedades inmunológicas ventajosas de los virus recombinantes del sarampión de acuerdo con la invención pueden mostrarse en un modelo animal que se elige entre animales susceptible a los virus del sarampión
y donde se determina la respuesta inmune humoral y/o celular contra el antígeno heterólogo y/o contra el virus del sarampión.
[0057] Entre dichos animales adecuados a usar como modelo para la caracterización de la respuesta inmune, los especialistas en la técnica pueden usar especialmente ratones y especialmente ratones recombinantes susceptibles a los virus del sarampión, o en monos.
[0058] En una realización preferida de la invención, el virus recombinante del sarampión de la invención es adecuado para provocar anticuerpos neutralizantes contra la secuencia heteróloga de aminoácidos en un modelo animal de mamífero susceptible al virus del sarampión. Especialmente, esta respuesta inmune que comprende provocar anticuerpos neutralizantes puede buscarse en ratones o monos recombinantes.
[0059] De acuerdo con otra realización particular de la invención, la respuesta se ensaya ventajosamente en células indicadoras tales como células P4-CCR5 disponibles en el NIH (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program). (Chameau P. et al. - 1994 - J. Mol. Biol. 241: 651-662).
[0060] De acuerdo con otra realización preferida, el virus recombinante del sarampión de acuerdo con la invención provoca anticuerpos neutralizantes contra la secuencia heteróloga de aminoácidos en un mamífero, con un título de al menos 1/40000 cuando se mide en ELISA, y un título neutralizante de al menos 1/20.
[0061] La invención también se refiere a una secuencia de nucleótidos del virus recombinante del sarampión que comprende un replicón que comprende (i) una secuencia de ADNc que codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa del virus del sarampión unido de forma funcional a (ii) un secuencia de control de la expresión y (iii) una secuencia heteróloga de ADN que codifica una determinada secuencia heteróloga de aminoácidos, estando dicha secuencia heteróloga de ADN clonada en dicho replicón en condiciones que permiten su expresión y en condiciones que no interfieren con la transcripción y la replicación de dicha secuencia de ADNc, teniendo dicho replicón una cantidad total de nucleótidos que es un múltiple de seis.
[0062] Una secuencia de ADNc particular es la secuencia del ADNc de la cepa Schwarz representada en la figura
11. Dicho ADNc puede obtenerse de pTM-MVSchw.
[0063] pTM-MVSchw es un plásmido derivado de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus del sarampión, la cepa de vacuna Schwarz, bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7. Su tamaño es de 18967 nt.
[0064] La invención también se refiere a un vector de virus recombinante del sarampión que comprende la secuencia de nucleótidos del virus recombinante del sarampión definida anteriormente.
[0065] La « regla de seis » se expresa en el hecho de que la cantidad total de nucleótidos presentes en el ADNc recombinante resultante de la recombinación de la secuencia de ADNc obtenida de la transcripción inversa del ARN antigenómico del virus del sarampión, y la secuencia heteróloga de ADN finalmente suman una cantidad total de nucleótidos que es un múltiplo de seis, una regla que permite la replicación eficaz del ARN genómico del virus del sarampión.
[0066] Un vector del virus recombinante del sarampión preferido de acuerdo con la definición anterior es tal que el vector viral de ADN heterólogo donde la secuencia heteróloga de ADN está clonada dentro de una Unidad de Transcripción Adicional (ATU) insertada en el ADNc correspondiente al ARN antigenómico del virus del sarampión.
[0067] La unidad de transcripción adicional (ATU) se describe en la figura 2A; puede modificarse con la condición de que finalmente posibilite que el replicón obtenido en el vector cumpla la regla de seis.
[0068] La localización de la ATU dentro del ADNc obtenido del ARN antigenómico del virus del sarampión puede variar a lo largo de dicho ADNc. Sin embargo está localizado en tal sitio que se beneficiará del gradiente de expresión del virus del sarampión.
[0069] Este gradiente corresponde con la abundancia de ARNm de acuerdo con la posición del gen relativa al extremo 3' del molde. Por consiguiente, cuando la polimerasa opera sobre el molde (el ARN genómico y antigenómico o los ADNc correspondientes), sintetiza más ARN creado a partir de genes corriente arriba que de genes corriente abajo. Este gradiente de abundancia de ARNm es, sin embargo, relativamente suave para el virus del sarampión. Por lo tanto, la ATU o cualquier sitio de inserción adecuado para clonar la secuencia heteróloga de ADN puede propagarse a lo largo del ADNc, con una realización preferida para un sitio de inserción y especialmente en una ATU, presente en la parte N-terminal de la secuencia y especialmente dentro de la región corriente arriba del gen L del virus del sarampión y ventajosamente corriente arriba del gen M de dicho virus y más preferiblemente corriente arriba del gen N de dicho virus.
[0070] Dependiendo del sitio de expresión y el control de la expresión del ADN heterólogo, el vector de la
invención permite la expresión de la secuencia heteróloga de aminoácidos como una proteína de fusión con una de las proteínas del virus del sarampión.
[0071] Como alternativa, el sitio de inserción de la secuencia de ADN en el ADNc del virus del sarampión puede elegirse de tal modo que el ADN heterólogo exprese la secuencia heteróloga de aminoácidos en una forma que no sea una proteína de fusión con una de las proteínas del virus del sarampión.
[0072] El vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con la invención contiene una secuencia heteróloga de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos del YFV o WNV.
[0073] La solicitud también describe un virus recombinante del sarampión que contiene ventajosamente una secuencia heteróloga de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos retroviral o flaviviral.
[0074] Como ejemplo, esta secuencia de aminoácidos se obtiene de un antígeno de un retrovirus seleccionado entre retrovirus HIV, o un flavivirus, especialmente el virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental.
[0075] En una realización particular descrita en la solicitud, la secuencia heteróloga de aminoácidos codificada por el vector del virus recombinante del sarampión se obtiene de un antígeno de envuelta de un retrovirus HIV, especialmente de HIV-1.
[0076] En una realización preferida descrita en la solicitud, esta secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia heteróloga de ADN se selecciona entre los antígenos gp160, gp120 o gp41 del HIV-1, o gp140 de HIV-1,
o una versión mutada de dichos antígenos.
[0077] Como resultado que se espera por la expresión del vector del virus recombinante del sarampión de la invención, es la producción de una respuesta inmune, especialmente una respuesta inmune humoral y/o celular, contra la secuencia heteróloga de aminoácidos codificada por el vector, se prefiere que la secuencia heteróloga de ADN usada sea una que codifique un antígeno o un antígeno mutado que posibilite la exposición de epítopos neutralizantes sobre el producto de expresión producido de dicho vector.
[0078] En una realización particular, la secuencia heteróloga de aminoácidos expresada, puede exponer epítopos que no son accesibles o no se forman en el antígeno nativo del que deriva la secuencia heteróloga de aminoácidos.
[0079] En una realización preferida descrita en la solicitud, la secuencia heteróloga de ADN codifica gp160LV3, gp160LV1V2, gp160LV1V2V3, gp140LV3, gp140LV1V2, gp140LV1V2V3.
[0080] Se describen secuencias heterólogas de aminoácidos especialmente en la figura 1 y pueden prepararse de acuerdo con métodos bien conocidos partiendo de secuencias de antígenos o secuencias de ADN correspondientes de dichos antígenos obtenidos de diversos aislados de HIV-1.
[0081] De acuerdo con la invención, el vector del virus recombinante del sarampión está diseñado de tal modo que las partículas producidas en células auxiliares transfectadas o transformadas con dicho vector que contiene el ADN que codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa del virus del sarampión, originado a partir de la cepa Schwarz del virus del sarampión adaptada para vacunación, posibilitan la producción de partículas virales para su uso en composiciones inmunogénicas, preferiblemente composiciones protectoras o incluso de vacuna.
[0082] La solicitud también describe un vector del virus recombinante del sarampión que está diseñado de tal modo que las partículas producidas en células auxiliares transfectadas o transformadas con dicho vector que contiene el ADN que codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa del virus del sarampión, originado a partir de una cepa del virus del sarampión adaptada para vacunación, posibilitan la producción de partículas virales para su uso en composiciones inmunogénicas, preferiblemente composiciones protectoras o incluso de vacuna.
[0083] Entre las cepas del virus del sarampión adaptadas para vacunación, se puede citar la cepa Edmonston B. y la cepa Schwarz, estando la última distribuida por la compañía Aventis Pasteur (Lyon Francia) como una cepa de vacunación aprobada del virus del sarampión.
[0084] Las secuencias de nucleótidos de la cepa Edmonston B. y de la cepa Schwarz, se han descrito en el documento WO 98/13505.
[0085] Para preparar el vector del virus recombinante del sarampión de la invención, los inventores han diseñado el plásmido pTM-MVSchw que contiene el ADNc resultante de la transcripción inversa del ARN antigenómico del virus del sarampión y una secuencia de control de la expresión adaptada que incluye un promotor y un terminador para la polimerasa T7.
[0086] El vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con la invención es preferiblemente un plásmido.
[0087] La solicitud describe vectores obtenidos con la secuencia de nucleótidos de la cepa Edmonston B. depositados el 12 de junio de 2002 especialmente:
pMV2(EdB)gp160[delta]V3HIV89.6P CNCM I-2883 pMV2(EdB)gp160HIV89.6P CNCM I-2884 pMV2(EdB)gp140HIV89.6P CNCM I-2885 pMV3(EdB)gp140[delta]V3HIV89.6P CNCM I-2886 pMV2(EdB)-NS1YFV17D CNCM I-2887 pMV2(EdB)-EnvYFV17D CNCM I-2888.
[0088] Los vectores preferidos de la invención, depositados en el CNCM el 26 de mayo de 2003 son:
pTM-MVSchw2-Es(WNV) CNCM I-3033 pTM-MVSchw2-GFPbis CNCM I-3034 pTM-MVSchw3-GFP CNCM I-3037 y pTM-MVSchw2-Es (YFV) CNCM I-3038.
[0089] La solicitud también describe otros vectores obtenidos con la secuencia de nucleótidos de la cepa Schwarz, depositados en el CNCM el 26 de mayo de 2003:
pTM-MVSchw2-p17p24[delta]myr(HIVB) CNCM I-3035 pTM-MVSchw3-Tat(HIV89-6p) CNCM I-3036 y
los vectores depositados en el CNCM el 19 de junio de 2003:
pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V1 V2 V3 (HIV89-6) CNCM I-3054 pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V3 (HIV89-6) CNCM I-3055 pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 V3 (HIV89-6) CNCM I-3056 pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 (HIV89-6) CNCM I-3057 pTM-MVSchw2-GagSIV239p17-p24[delta]myr-3-gp140 (HIV89-6) CNCM I-3058
[0090] I-2883 (pMV2(EdB)gp160[delta]V3HIV89.6P) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus del sarampión (cepa Edmonston B), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que contiene el gen de la gp160LV3 + ELDKWAS de la cepa 89.6P del virus SHIV insertado en una ATU en la posición 2 (entre los genes N y P del virus del sarampión). El tamaño del plásmido es de 21264 nt.
[0091] I-2884 (pMV2(EdB)gp160HIV89.6P) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus del sarampión (cepa Edmonston B), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que contiene el gen de la gp160 de la cepa 89.6P del virus SHIV insertado en una ATU en la posición 2 (entre los genes N y P del virus del sarampión). El tamaño del plásmido es de 21658 nt.
[0092] I-2885 (pMV2(EdB)gp140HIV89.6P) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus del sarampión (cepa Edmonston B), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que contiene el gen de la gp140 de la cepa 89.6P del virus SHIV insertado en una ATU en la posición 2 (entre los genes N y P del virus del sarampión). El tamaño del plásmido es de 21094 nt.
[0093] I-2886 (pMV3(EdB)gp140[delta]V3HIV89.6P) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus del sarampión (cepa Edmonston B), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que contiene el gen de la gp140LV3(ELDKWAS) de la cepa 89.6P del virus SHIV insertado en una ATU en la posición 2 (entre los genes N y P del virus del sarampión). El tamaño del plásmido es de 21058 nt.
[0094] I-2887 (pMV2(EdB)-NS1YFV17D) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus del sarampión (cepa Edmonston B), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que contiene el gen NS1 del virus de la fiebre amarilla (YFV 17D) insertado en una ATU en la posición 2 (entre los genes N y P del virus del sarampión). El tamaño del plásmido es de 20163 nt.
[0095] I-2888 (pMV2(EdB)-EnvYFV17D) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus del sarampión (cepa Edmonston B), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que contiene el gen Env del virus de la fiebre amarilla (YFV 17D) insertado en una ATU en la posición 2 (entre los genes N y P del virus del sarampión). El tamaño del plásmido es de 20505 nt.
[0096] I-3033 (pTM-MVSchw2-Es(WNV)) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus del sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que expresa el gen de la envuelta secretada (E) del virus del Nilo occidental (WNV), insertado en una ATU.
[0097] I-3034 (pTM-MVSchw2-GFPbis) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus del sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que expresa el gen de la GFP insertado en una ATU.
[0098] I-3035 (pTM-MVSchw2-p17p24[delta]myr(HIVB)) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus del sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que expresa el gen gag que codifica las proteínas p17p24Lmyr del virus HIVB insertado en una ATU.
[0099] I-3036 (pTMVSchw3-Tat(HIV89-6p)) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus del sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que expresa el gen Tat de la cepa viral 89.6P insertado en una ATU.
[0100] I-3037 (pTM-MVSchw3-GFP) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus del sarampión (cepa Schwarz) bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que expresa el gen de la GFP insertado en una ATU que tiene una deleción de un nucleótido.
[0101] I-3038 (pTM-MVSchw2-Es) (YFV) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus del sarampión (cepa Schwarz) bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que expresa el gen de la proteína secretada del virus de fiebre amarilla (YFV) insertado en una ATU.
[0102] I-3054 (pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V1 V2 V3 (HIV89-6)) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus del sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que expresa el gen que codifica gp140 [delta] V1 V2 (HIV 89-6) insertado en una ATU.
[0103] I-3055 (pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V3 (HIV89-6)) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus del sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que expresa el gen que codifica gp14 [delta] V3 (HIV 89-6) insertado en una ATU.
[0104] I-3056 (pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 V3 (HIV89-6)) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus del sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que expresa el gen que codifica gp160 [delta] V1 V2 V3 (HIV 89-6) insertado en una ATU.
[0105] I-3057 (pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 (HIV89-6)) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus del sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que expresa el gen que codifica gp160 [delta] V1 V2 (HIV 89-6) insertado en una ATU.
[0106] I-3058 (pTM-MVSchw2-Gag SIV239 p17-p24 [delta] myr-3-gp140 (HIV89-6)) es un plásmido derivado de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus del sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de la ARN polimerasa T7 y que expresa el gen que codifica Gag SIV239 p17p24 [delta] myr-3-gp140 (HIV89-6) insertado en una ATU.
[0107] Cuando la secuencia heteróloga de ADN presente en el vector del virus recombinante del sarampión de la invención se obtiene del virus de la fiebre amarilla (YFV), se selecciona ventajosamente entre YFV 17D 204 comercializada por Aventis Pasteur con el nombre comercial Stamaril®.
[0108] Cuando la secuencia heteróloga de ADN presente en el vector del virus recombinante del sarampión de la invención se obtiene del virus del Nilo occidental (WNV), se selecciona ventajosamente entre la cepa neurovirulenta IS 98-ST1.
[0109] La invención también se refiere a un sistema de recuperación para el ensamblaje del virus recombinante del sarampión que expresa una secuencia heteróloga de aminoácidos, que comprende una determinada célula auxiliar recombinada con al menos un vector adecuado para la expresión de la ARN polimerasa T7 y la expresión de las proteínas N, P y L del virus del sarampión transfectado con un vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las definiciones proporcionadas anteriormente.
[0110] Los virus recombinantes de la invención o las VLP también pueden producirse in vivo mediante una vacuna viva atenuada tipo MV.
[0111] Los virus recombinantes de la invención o las VLP pueden usarse en composiciones inmunogénicas o en composiciones de vacuna, para la protección contra virus ARN, estando expresados dichos antígenos en el virus
recombinante o en la VLP, como se ha descrito anteriormente y como se ilustra en los siguientes ejemplos.
[0112] La invención proporciona especialmente composiciones inmunogénicas o composiciones de vacuna útiles contra el virus del Nilo occidental o el virus de la fiebre amarilla.
[0113] La solicitud también describe composiciones inmunogénicas o composiciones de vacuna útiles contra el virus HIV.
[0114] La invención también se refiere al uso de los virus recombinantes de la invención o de las VLP de la invención, o de los vectores recombinantes de la invención, para la preparación de composiciones inmunogénicas o para la preparación de composiciones de vacuna.
[0115] La invención también se refiere a anticuerpos preparados contra dichos virus recombinantes o contra dichas VLP, especialmente a anticuerpos protectores y a anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o anticuerpos monoclonales.
[0116] Los virus recombinantes de la invención o las VLP pueden asociarse con cualquier adyuvante apropiado, o vehículo que pueda ser útil para la preparación de composiciones inmunogénicas.
[0117] Aparecerán diversos aspectos de la invención en los siguientes ejemplos y en los dibujos.
Leyenda de las figuras
[0118] Figura 1. Construcciones de la glicoproteína Env de HIV1. (A) Construcciones de gp160 de longitud completa y mutantes LV3-AAELDK-WASAA, LV1V2 y LV1V2V3 (de la parte superior a la inferior). Los sitios de restricción BbsI y MfeI usados para introducir la deleción LV3 en las otras construcciones están indicados. (B) Construcciones de gp140 que son iguales que gp160 excepto en que se han delecionado las regiones intracitoplasmática y transmembrana de gp41.
[0119] Figura 2A. Mapa esquemático del plásmido pTM-MV Schw. Para construir la secuencia completa, se generaron los seis fragmentos representados en la parte superior y se recombinaron paso a paso usando los sitios de restricción únicos indicados. T7 = promotor T7; hh = ribozima en cabeza de martillo; hAv = ribozima de la hepatitis delta (=8); T7t = terminador de la ARN polimerasa T7.
[0120] Figura 2B. Los vectores pMV(+) con ATU que contienen un gen de la proteína fluorescente verde (GFP del inglés "green fluorescent protein") en la posición 2 y la posición 3. Los genes del MV están indicados: N (nucleoproteína), PVC (fosfoproteína y proteínas V C), M (matriz), F (fusión), H (hemaglutinina), L (polimerasa). T7: promotor de la ARN polimerasa T7; T7t: terminador de la ARN polimerasa T7; 8: ribozima del virus de la hepatitis delta (DHV); ATU: unidad de transcripción adicional.
[0121] Figura 2C. Secuencia ATU: las letras minúsculas representan secuencias adicionales (copia de la región intergénica N-P del virus del sarampión) más sitios de clonación. Las letras mayúsculas corresponden a la secuencia GFP potenciada insertada. Esta secuencia se inserta en el sitio SpeI (posición 3373) de la secuencia de ADNc de la cepa Schwarz del virus del sarampión para ATU2 y en el sitio SpeI (posición 9174) para la ATU3. La mutación que distingue ATU normal de bis (en pTM-MVSchw2-gfp y pTM-MVSchw2-GFPbis) es una C sustituida (letra mayúscula) en el extremo de ATU.
[0122] Figura 3 (A): muestra que la expresión de ENVHIV89.6 fue similar para los pases 2 y 5, confirmando la estabilidad de la expresión de transgenes en este sistema.
[0123] Figura 3 (B): construcción de virus del sarampión Schwarz (MVSchw) que expresa antígenos de HIV-1. (I3054 a I-3058). Expresión de antígenos de HIV en pTM-MVSchw recombinante.
[0124] Fig. 3BA: Expresión de glicoproteínas de envuelta de HIV-1 en pTM-MVSchw recombinante. Se infectaron células Vero con los diferentes virus recombinantes durante 48 h y se determinó la expresión de Env de HIV por transferencia de western. Se resolvieron 30 !g de cada lisado celular en SDS-PAGE al 4-12%, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se sondearon con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-gp120 de HIV (Chessie, NIH). Se usó conjugado RPO anti-IgG de ratón como anticuerpo secundario y las proteínas se detectaron usando un kit de detección ECL.
Fig. 3BB: (1) Construcción del doble recombinante pTM-MVSchw2-Gag-3gp140
Se han construido algunos vectores recombinantes que expresan dos antígenos heterólogos diferentes. Se obtuvieron por ligamiento de dos plásmidos pTM-MVSchw recombinantes diferentes que contenían diferentes insertos en la posición 2 y la posición 3. Se muestra el plásmido pTM-MVSchw2-Gag-3-gp140. A partir de este plásmido, se recuperó un virus recombinante que expresaba las proteínas tanto Gag como gp140 (Fig. 3B(2) transferencia de Western). Usando construcciones apropiadas de los diferentes genes heterólogos insertados, dicho MV recombinante que expresa dos proteínas virales heterólogas puede producir « partículas tipo virus » (VLP)
ensambladas en células infectadas y secretadas: Gag-Env de retrovirus o prM/E de flavivirus. Dichas VLP son buenos inmunógenos. Producidas in vivo por una vacuna viva atenuada tipo MV, deberían ser incluso más inmunogénicas.
[0125] (2) Expresión de gp140 de HIV-1 y Gag de SIV239 en pTM-MVSchw2-GagSIV recombinante (p17-p24 [delta] myr)-3-gp140HIV. Se detectaron gp140 de HIV y Gag de SIV en lisados de células Vero infectadas. (A) Un anticuerpo monoclonal de ratón anti-gp120 de HIV y (B) suero de macaco infectado con SIVmac251.
[0126] Figura 3C: Expresión de Gag de HIV-1 (p17-p24 myr) en pTM-MVSchw2-GagHIV recombinante (p17p24 [delta] myr). Se detectó Gag de HIV en lisados de células Vero infectadas con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Gag de HIV.
[0127] Figura 3D: Expresión de proteína Tat de HIV-1 en pTM-MVSchw recombinante. Se infectaron células Vero con virus MVSchw-Tat HIV recombinante o MVSchw de control durante 48 h y se determinó la expresión de Tat de HIV por transferencia de western. Se resolvieron 30 !g de cada lisado celular en SDS-PAGE al 4-12%, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se sondearon con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Tat de HIV (BH10, NIH). Se usó conjugado RPO anti-IgG de ratón como anticuerpo secundario y las proteínas se detectaron usando un kit de detección ECL.
[0128] Figura 4. Cinética de crecimiento de virus MVEdB-EnvHIV recombinantes en células Vero. Se infectaron células en placas de 35 mm con virus recombinantes a diferentes MOI (indicadas). En cada momento puntual, las células se recogieron y se determinaron los títulos de virus asociados a células usando el método de DICT50 en células Vero. (A) Infecciones con MV EdB-tag y diferentes virus recombinantes MV-HIV a MOI = 0,0001. (B) Infecciones con MV2-gp160HIV a dos diferentes MOI (0,0001 y 0,01).
[0129] Figura 5. Respuestas inmunes humorales anti-HIV y anti-MV en ratones inoculados con virus recombinantes MVEdB-EnvHIV. A-B Se inmunizaron cuatro grupos de 3 ratones con 107 DICT50 de cada virus recombinante MV-HIV. Se determinaron los títulos de anticuerpos contra MV (A) y Env de HIV (B) por ELISA en sueros recogidos 28 días después de la inoculación. C-F: Títulos de anticuerpos anti-HIV y anti-MV en ratones IFNAR-/-CD46+/- inmunizados con virus MV-EnvHIV. (C) Títulos anti-MV y anti-HIV detectados 28 días después de la inyección de dosis crecientes de MVEdB-gp160 (3 ratones por grupo). (D) Títulos anti-MV (barras negras), anti-HIV (barras grises) y anti-ELDKWAS (barras blancas) detectados 28 días después de la inyección de 5 106 DICT50 de virus MV-EnvHIV (6 ratones por grupo). Los resultados se expresan como los valores medios ± SD.
[0130] Figura 6. Actividades neutralizantes contra Bx08 de sueros de ratones inmunizados con virus MV2gp140HIV89.6 y MV2-gp160HIV89.6. Se proporcionó aislado primario Bx08 por C. Moog (Estrasburgo, Francia) y se propagó una vez en PBMC estimuladas con PHA para obtener soluciones madre virales. Se incubaron 2 ng de virus durante 30 min. a 37ºC con 25 !l de cada suero de ratón (recogido un mes después de la infección) antes de la infección de células P4R5 en una placa de 96 pocillos. Las células después se cultivaron en DMEM que contenía suero de ternera fetal al 10% hasta 2 días después de la infección, momento en el cual se midió la actividad 1 galactosidasa con un ensayo de quimioluminiscencia (Roche, Alemania). Carril 1: suero de un ratón inmunizado con MVEdB-tag; Carril 2: suero de un ratón inmunizado con MV2-gp140HIV-1; Carril 3: suero de un ratón inmunizado con MV2-gp160HIV-1; Carril 4: células no infectadas. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
[0131] Figura 7. La vacuna candidata Edm-HIV Env estimula linfocitos específicos de env in vivo. Se inocularon dos grupos de 3 ratones con 107 DICT50 de virus MV2-gp160HIV, y se sacrificaron por eutanasia 7 días y 1 mes después de la inoculación. (A) Ensayos ELISpot realizados con esplenocitos de ratones inmunizados. Estimulación con proteína purificada HIV-gp120 (negro) o BSA irrelevante (blanco). (B) Los esplenocitos recogidos 7 días después de la inmunización se estimularon con medio solo (panel de la izquierda), gp120 de HIV (panel medio)
o virus EdB-tag (panel de la derecha). La citofluorometría de tres colores detectó linfocitos tanto CD8+ (panel superior) como CD4+ (panel inferior) productores de y-IFN después de estimulación con gp120 de HIV y virus del sarampión. Los porcentajes se san de acuerdo con las entradas totales de linfocitos CD8+ (panel superior) y CD4+ (panel inferior) respectivamente.
[0132] FIG. 7C, D. Títulos de anticuerpos anti-MV y anti-HIV en ratones y macacos inmunizados con virus MV2gp140HIV89.6 meses después de sensibilización con MV. (C) Se vacunaron ratones (3 por grupo) con 105 DICT50 de EdB-tag MV, después se inocularon dos veces con 5 106 DICT50 de virus MV2-gp140HIV89.6 como se indica (flechas).
(D)
Se vacunaron macacos cynomolgus (nº 432 y 404) con Rouvax, después se inocularon dos veces con 5 106 DICT50 de virus MV2-gp140HIV89.6 como se indica (flechas).
[0133] Figura 8. Representación esquemática de la unidad de transcripción adicional (ATU) y el plásmido del vector de MV Schwarz. (A) Elementos de acción en cis de la ATU insertada en la posición 2 entre las fases de lectura abierta de MV de fosfoproteína (P) y matriz (M). (B). Representación de las tres posiciones de inserción de ATU en el plásmido del vector de MV Schwarz.
[0134] Figura 9. Expresión de proteínas YFV por MV recombinante. Se infectaron células Vero por MV
recombinantes EdB-EnvYFV y EdB-NS1IFV a una MOI de 0,01. La inmunofluorescencia se realizó usando un suero de ratón policlonal anti-YFV y un anticuerpo secundario Cy3 anti-IgG de ratón. Todos los sincitios observados en células Vero infectadas fueron positivos.
[0135] Figura 10. Exposición con YFV. Se inocularon seis ratones de 4 semanas de edad con una mezcla de virus EdB-EnvYFV y EdB-NS1YFV (107 DICT50) y se inocularon 6 ratones de control con la misma dosis de virus EdB-tag convencional. Después de 1 mes, se determinaron las serologías anti-MV y se observó un nivel similar de anticuerpos en los dos grupos. Se expuso a los ratones y se observó la mortalidad.
[0136] Figura 11. Secuencia completa de nucleótidos del plásmido pTM-MVSchw (CNCM I-2889). La secuencia puede describirse del siguiente modo con referencia a la posición de los nucleótidos:
-1-8 sitio de restricción NotI
-9-28 promotor T7
-29-82 ribozima en cabeza de martillo
-83-15976 antigenoma de MV Schwarz
-15977-16202 ribozima del HDV y terminador T7
-16203-16210 sitio de restricción NotI
-16211-16216 sitio de restricción ApaI
-16220-16226 sitio de restricción KpnI
-16226-18967 plásmido pBluescript KS(+) (Stratagene)
[0137] Figura 12:
[0138] Las secuencias flavivirales que se han expresado en MV son las siguientes:
[0139] Figura 12A: sec YFV Env: Es la secuencia Env YFV 17D204 clonada por los inventores.
pos 1 a 3 codón INICIO pos 4 a 51 péptido señal de Env pos 52 a 1455 secuencia de Env pos 1456 a 1458 codón PARADA
[0140] Los codones parada e inicio se han añadido.
[0141] Figura 12B: sec YFV NS1: Es la secuencia NS1 YFV 17D204 clonada por los inventores
pos 1 a 3 codón INICIO pos 4 a 78 péptido señal de NS1 pos 79 a 1110 secuencia de NS1 pos 1111 a 1113 codón PARADA
[0142] Los codones parada e inicio se han añadido.
[0143] Figura 12C: sec WNV Env: Es la secuencia Env WNV clonada por los inventores.
pos 1 a 3 codón INICIO pos 4 a 51 péptido señal de env pos 52 a 1485 secuencia de Env pos 1486 a 1488 codón PARADA
[0144] Los codones parada e inicio se han añadido.
[0145] Figura 12D: sec WNV NS1: Es la secuencia NS1 WNV clonada por los inventores.
pos 1 a 3 codón INICIO pos 4 a 78 péptido señal de NS1 pos 79 a 1104 secuencia de NS1 pos 1105 a 1107 codón PARADA pos 1108 a 1110 codón PARADA (se añade un segundo para respetar la regla de seis.)
[0146] Los codones parada e inicio se han añadido.
[0147] Figura 13: Representación esquemática de pTM-MVSchw-sEWNV recombinante. Los genes de MV están indicados: N (nucleoproteína), PVC (fosfoproteína y proteínas V, C), M (matriz), F (fusión), H (hemaglutinina), L (polimerasa). T7: promotor de la ARN polimerasa T7; T7t: terminador de la ARN polimerasa T7; 8 ribozima del virus
de la hepatitis delta (HDV); ATU: unidad de transcripción adicional.
[0148] Después de la recuperación, el virus recombinante se cultivó en monocapas de células Vero. El procedimiento usado para preparar el virus recombinante fue similar a los procedimientos convencionales usados para preparar las vacunas vivas atenuadas contra el sarampión, excepto para la liofilización que no se usó.
[0149] La expresión de WNV sE en células Vero infectadas por el virus MV-WN sE se verificó usando ensayo de inmunofluorescencia indirecta como se muestra en la Figura 14.
[0150] Figura 14: Expresión de la proteína sE de WNV en sincitios inducidos por MV. Detección por inmunofluorescencia de la proteína secretada Env (sE) de WNV en sincitios inducidos por MV-WN sE recombinante en células Vero. (A, B) Proteína sE detectada en la superficie externa en todas partes de los sincitios inducidos por MV recombinante. (C, D) Proteína sE intracelular en sincitios inducidos por MV recombinante.
[0151] Figura 15: Serología anti-MV 1 mes después de la primera inyección.
[0152] Figura 16: Secuencias inmunogénicas de HIV-1 preparadas para su inserción en el plásmido pTM-MVSchw2 ilustrado en el Ejemplo II.
Ejemplo I: Virus recombinantes del sarampión que expresan la glicoproteína de envuelta nativa de HIV1 subtipo B, o envueltas con bucles variables delecionados, inducen respuestas inmunes humorales y celulares
[0153] La preparación de una vacuna contra HIV con su formidable capacidad de evadir las respuestas inmunes del hospedador es ciertamente una tarea desalentadora. Sin embargo, lo que hemos aprendido acerca de la inmunopatogénesis de la infección y los resultados ya obtenidos con modelos animales indican que puede ser posible (Mascola, J. R., y G. J. Nabel. 2001. Vaccines for prevention of HIV-1 disease. Immunology. 13:489-495). De forma ideal, una inmunización preventiva debería inducir 1) anticuerpos que neutralicen aislados primarios, evitando de este modo la entrada en células hospedadoras, y 2) CTL que eliminen las células que no obstante se infectaron. Los anticuerpos y CTL deberían estar dirigidos a epítopos conservados que son críticos para la entrada del virus y la replicación en células hospedadoras.
[0154] Varios estudios, en particular con diversas vacunas candidatas, muestran que una buena respuesta inmune celular podría ser capaz de controlar la carga viral, aunque no de eliminar el agente (Mascola, J. R., y G. J. Nabel. 2001. Vaccines for prevention of HIV-1 disease. Immunology. 13:489-495). Por otro lado, las respuestas inmunes humorales inducidas hasta ahora por vacunas de subunidad han sido decepcionantes, principalmente porque los anticuerpos inducidos no neutralizaron los aislados primarios de HIV. Por ejemplo, vacunas recombinantes que expresaba Env de SIV fueron capaces de proteger a macacos contra una exposición homóloga, pero no heteróloga (Hu, S., et al 1996. Recombinant subunit vaccines as an approach to study correlates of protection against primate lentivirus infection. Immunology Letters. 51:115-119). La inmunización con ADN combinada con refuerzo con gp recombinante soluble podría proteger a macacos contra una exposición heteróloga pero solamente contra una cepa de SIV genéticamente relacionada con la vacuna (Boyer, J. et al 1997. Protection of chimpanzees from high-dose heterologous HIV-1 challenge by DNA vaccination. Nature Medicine. 3:526-532). Más recientemente, diversos regímenes « sensibilización-refuerzo », usando combinaciones de ADN desnudo y vectores virales tales como MVA (Amara, R. et al. 2001. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Science. 292:69-74) o adenovirus (Shiver, J. W., et al 2002. Replication-incompetent adenoviral vaccine vector elicits effective anti-immunodeficiency-virus immunity. Nature. 415:331-335), dieron protección razonable contra una exposición con SHIV89.6P patogénico. La « sensibilización-refuerzo» podría no ser un requisito absoluto ya que el uso de vacuna atenuada viva recombinante contra el poliovirus protegió a macacos contra una exposición con SIV251 (Crotty, S., et al 2001. Protection against simian immunodeficiency virus vaginal challenge by using Sabin poliovirus vectors. J Virol. 75:7435-7452). Es interesante observar que en todos estos experimentos, incluso cuando los animales no estuvieron protegidos contra la infección, la inmunización causó un retardo en, o incluso anuló, la enfermedad clínica.
[0155] Como se muestra por cristalografía, los bucles V1 y V2 de gp120 enmascaran el sitio de unión a CD4 y el bucle V3 enmascara los sitios de unión para los co-receptores CXCR4 y CCR5 (Kwong, P. D., et al. 2000. Structures of HIV-1 gp120 envelope glicoproteins from laboratory-adapted and primary isolates. Structure Fold Des. 8:13291339; Kwong, P. D. et al. 1998. Structure of an HIV gp120 envelope glicoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody. Nature. 393:648-659; Kwong, P. D., et al. 2000. Oligomeric modeling and electrostatic analysis of the gp120 envelope glicoprotein of human immunodeficiency virus. J Virol. 74:1961-1972). A pesar de esto, están presentes anticuerpos contra el sitio de unión a CD4 de gp120 en los sueros de individuos seropositivos para HIV y son capaces de neutralizar varios aislados de HIV-1 en ensayos in vitro (Burton, D. 1997. A vaccine for HIV type 1: the antibody perspective. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94:10018-10023; Hoffman, T. L et al., 1999. Stable exposure of the coreceptor-binding site in a CD4-independent HIV-1 envelope protein. Proc Natl Acad Sci USA. 96:6359-6364). Además, algunos epítopos que están ocultos en la estructura 3-D de la glicoproteína pero llegan a exponerse después de unirse al co-receptor,
pueden inducir anticuerpos altamente neutralizantes (Muster, T., et al. 1993. A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1, J Virol. 67:6642-6647). Además, se han obtenido anticuerpos monoclonales neutralizantes de células B de pacientes (Parren, P. W., et al. 1997. Relevance of the antibody response against human immunodeficiency virus type 1 envelope to vaccine design: Immunol Lett. 57:105-112). Están dirigidos a los epítopos lineales gp41 (2F5) (Muster, T., F. et al. 1993. A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1, J Virol. 67:6642-6647), o a los epítopos conformacionales gp120 (2G12, 17b, 48db12) (Thali, M., et al. 1993, Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J Virol. 67:3978-3988; Trkola, A., et al. 1996. Human monoclonal antibody 2G12 defines a distinctive neutralization epitope on the gp120 glicoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 70:1100-1108). Usados en sinergia pueden neutralizar varios aislados primarios in vitro (Mascola, J. R. et al. 1997. Potent and synergistic neutralization of human immunodeficiency virus (HIV) type 1 primary isolates by hiperimmune anti-HIV immunoglobulin combined with monoclonal antibodies 2F5 and 2G12, J Virol. 71:7198-7206) y proteger a macacos contra una exposición en la mucosa con SHIV (Baba, T. W. et al. 2000. Human neutralizing monoclonal antibodies of the IgG 1 subtype protect against mucosal simian-human immunodeficiency virus infection. Nat Med. 6:200-206; Mascola, J. R., et al. 1999. Protection of Macaques against pathogenic simian/human immunodeficiency virus 89.6PD by passive transfer of neutralizing antibodies. J Virol. 73:4009-4018; Mascola, J. R., et al. 2000. Protection of macaques against vaginal transmission of a pathogenic HIV-1/SIV chimeric virus by passive infusion of neutralizing antibodies. Nat Med. 6:207-210). Sin embrago, en personas infectadas, todos estos anticuerpos están presentes en cantidades muy bajas, diluidos en grandes cantidades de anticuerpos no neutralizantes dirigidos principalmente a los bucles V1, V2 y V3 de gp120 antigénicamente variables. Por lo tanto, es de esperar que si se pudieran inducir elevados niveles de dichos anticuerpos de neutralización cruzada podría conseguirse al menos algún grado de protección. Un objetivo principal es diseñar un vector que favorezca la producción de dichos anticuerpos neutralizantes.
[0156] Por esta razón, diseñamos por ingeniería genética gp160 (anclada) y gp140 (soluble) mutantes delecionando los bucles hipervariables V1, V2 y V3 individualmente o en combinación para exponer los epítopos conservados e inducir anticuerpos capaces de neutralizar aislados primarios. En algunas de las construcciones, también remplazamos el bucle V3 por la secuencia AAELDKWASAA, especialmente la secuencia ELDKWAS flanqueada en ambos lados por dos alaninas para mantener la conformación de este epítopo conservado gp41 normalmente oculto en la proteína nativa pero capaz de inducir anticuerpos neutralizantes de amplio espectro (Muster, T., F. et al. 1993. A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 67:6642-6647; Binley, J. M., et al. 2000. A recombinant human immunodeficiency virus type 1 envelope glicoprotein complex stabilized by an intermolecular disulfide bond between the gp 120 and gp41 subunits is an antigenic mimic of the trimeric virion-associated structure. J Virol. 74:627-643; Sanders, R. W., et al. 2000. Variable-loop-deleted variants of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glicoprotein can be stabilized by an intermolecular disulfide bond between the gp120 and gp41 subunits. J Virol. 74:5091-5100). La estructura alfa helicoide normal de este péptido debe conservarse cuando se expone en nuestras construcciones en el extremo de un bucle V3 delecionado. Estas construcciones, en las que los "señuelos inmunológicos" se han eliminado y se han expuesto los epítopos neutralizantes, deberían ser buenos candidatos para la inducción de fuertes respuestas de anticuerpos neutralizantes.
[0157] Las construcciones de gp de HIV se introdujeron en un vector de vacuna contra el sarampión porque induce títulos muy elevados (1/80.000) de anticuerpos neutralizantes anti-sarampión. (Esto es probablemente porque se replica en una gran cantidad de células de diferentes tipos.) Se puede esperar, por lo tanto, que la respuesta de anticuerpos contra las gp de HIV diseñadas por ingeniería genética también sea potente. Además, la vacuna contra el sarampión también es un potente inductor de respuestas celulares de larga duración. Las vacunas recombinantes indujeron anticuerpos de neutralización cruzada así como respuestas inmunes celulares después de una única inyección en ratones CD46+/-IFN-a/1_R-/-. Además, indujeron respuestas inmunes contra HIV en ratones y macacos con inmunidad anti-MV preexistente.
Construcción de glicoproteínas de envuelta mutantes de HIV-1.
[0158] Las glicoproteínas de envuelta usadas en este estudio (Figura 1) se obtuvieron de SHIV89.6P, un virus quimérico de la inmunodeficiencia de simios/humana que contiene los genes tat, rev, vpu y env de HIV1 en un transfondo SIVmac239 (Reimann, K. A., et al. 1996. A chimeric simian/human immunodeficiency virus expressing a primary patient human immunodeficiency virus type 1 isolate env causes an AIDS- like disease after in vivo passage in rhesus monkeys. J Virol. 70:6922-6928). El gen env se obtiene de un aislado primario citopático de HIV1, 89.6, que tiene tropismo tanto por macrófagos como por células T (Collman, R., et al. 1992. An infectious molecular clone of an unusual macrophage-tropic and highly cytopathic strain of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 66:7517-7521). La secuencia de env se amplificó a partir del plásmido pSHIV-KB9 (NIH) que se clonó previamente después de pases in vivo del virus original (Karlsson, G. B., et al. 1997. Characterization of molecularly cloned simian-human immunodeficiency viruses causing rapid CD4+ lymphocyte depletion in rhesus monkeys. J Virol. 71:4218-4225). La env de longitud completa (gp160) se amplificó por PCR (polimerasa Pfu) usando cebadores que contienen los sitios BsiWI y BssHII únicos para la posterior clonación en el vector del sarampión: 160E5 (5'-TATCGTACGATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3') y 160E3 (5'ATAGCGCGCATCACAAGAGAGTGAGCTCAA-3'). La secuencia env correspondiente a la forma secretada (gp140) se amplificó usando los cebadores 160E5 y 140E3 (5'
TATGCGCGCTTATCTTATATACCACAGCCAGT-3'). Se añadieron un codón de inicio y un codón de parada en ambos extremos de los genes así como varios nucleótidos después del codón de parada para respetar la "regla de seis", que estimula que la cantidad de nucleótidos del genoma de MV debe ser un múltiplo de 6 (Calain, P., y L. Roux. 1993. The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J Virol. 67:4822-4830; Schneider, H., et al. 1997. Recombinant measles viruses defective for RNA editing and V protein synthesis are viable in cultured cells. Virology. 227:314-322). Ambos fragmentos gp160 y gp140 de env se clonaron en el plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenciaron para comprobar que no se habían introducido mutaciones.
[0159] Se generaron mutantes con deleciones de bucles por amplificación por PCR de dos fragmentos solapantes que flanqueaban la secuencia a delecionar e hibridando estos fragmentos por PCR. Para remplazar la secuencia V3 por la secuencia AAELDKWASAA que contenía el epítopo gp41 (Muster, T., F. et al. 1993. A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 67:6642-6647), se diseñaron cuatro cebadores en ambos lados de los sitios BbsI y MfeI que abarcan la secuencia V3: LV3A1 (5'-ATAAGACATTCAATGGATCAGGAC3'), LV3A2 (5'TGCCCATTTATCCAATTCTGCAGCATTGTTGTTGGGTCTTGTACAATT-3'), LV3B1 (5'-GATAAATGGGCAAGTGCTGCAAGACAAGCACATTGTAACATTGT-3'), y LV3B2 (5'-CTACTCCTATTGGTTCAATTCTTA-3'). Las secuencias subrayadas en LV3A2 y LV3B1 corresponden al epítopo AAELDKWASAA con un solapamiento de 12 nucleótidos. Las amplificaciones por PCR con los pares de cebadores LV3A1/LV3A2 y LV3B1/LV3B2 produjeron dos fragmentos de 218 y 499 pb respectivamente. Después de purificación en gel, estos fragmentos se hibridaron juntos por 15 ciclos de PCR sin cebadores y se amplificaron con los cebadores LV3A1/LV3B2. El fragmento resultante de 705 pb se clonó en el plásmido pCR2.1-TOPO y se secuenció. Después de digestión por BbsI y MfeI, se purificó el fragmento que carecía de la secuencia que codifica el bucle V3 (LV3-AAELDKWASAA) y se introdujo en lugar del fragmento correspondiente en la gp160 y gp140 en plásmidos pCR2.1-TOPO.
[0160] Los plásmidos resultantes se denominaron pMV2-gp160LV3 y pMV2-gp140LV3.
[0161] Los mutantes LV1V2 se produjeron usando el mismo procedimiento. Se amplificaron dos fragmentos en ambos lados del bucle V1 V2 usando los siguientes cebadores: 160E5 (5'-TATCGTACGATGAGAGTGAAGGAGAAA TAT-3'), LV1V2A1 (5'-ATTTAAAGTAACACAGAGTGGGGTTAATTT-3'), LV1V2B1 (5'-GTTACTTTAAATTGTAACAC CTCAGTCATTACACAGGCCTGT-3'), LV1V2B2 (5'-TTGCATAAAATGCTCTCCCTGGTCCTATAG-3'). Las secuencias subrayadas en LV1V2A1 y LV1V2B1 corresponden a un solapamiento de 12 nucleótidos generado entre los dos fragmentos. Las amplificaciones por PCR con los pares de cebadores 160E5/LV1V2A1 y LV1V2B1/LV1V2B2 produjeron dos fragmentos de 400 y 366 pb respectivamente. Después de purificación en gel, estos fragmentos se hibridaron juntos por ciclos de 15 PCR son cebadores y se amplificaron con los cebadores 160E5/LV1V2B2. El fragmento de 766 pb resultante se clonó en el plásmido pCR2.1-TOPO y se secuenció. Después de digestión con BsiWI (en el cebador 160E5) y BbsI, se purificó el fragmento que carecía de la secuencia que codifica el bucle V1V2 y se introdujo en lugar del fragmento correspondiente en la gp160 y gp140 en plásmidos pCR2.1-TOPO.
[0162] Para obtener los mutantes LV1V2V3, se introdujo el fragmento BsiWI/Bbsl que carece de la secuencia que codifica el bucle V1V2 en lugar del fragmento correspondiente en los plásmidos pCR2.1-TOPO-gp140LV3 y pCR2.1TOPO-gp160LV3.
[0163] Después de digestión con BsiWI/BssHII de los diferentes plásmidos pCR2.1-TOPO, se clonaron las secuencias nativa y mutante de gp160 y gp140 en el vector EdB-tag en la posición de ATU 2 y la posición de ATU 3 (Figura 2B). Los plásmidos resultantes se denominaron pMV2-gp160HIV, pMV2-gp140HIV.
[0164] Las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de ternera fetal (FCS) al 5% para células Vero (riñón de mono verde africano), o con FCS al 10%, 1 mg/ml de G418 para células auxiliares 293-3-46 (35) y para células P4-CCR5 (Hela-CD4-CXCR4-CCR5-HIVLTR-LacZ) (12).
Recuperación de virus MVEdB-EnvHIV89.6 recombinante.
[0165] Para recuperar los virus MVEdB-HIV recombinantes de los plásmidos, se usaron los diferentes plásmidos EdB-HIV Env para transfectar células auxiliares 293-3-46.
[0166] Para recuperar el virus del sarampión del ADNc de los plásmidos EdB-HIV-Env, se usó el sistema de recuperación basado en células auxiliares descrito por Radecke et al. (Radecke, F., et al. 1995. Rescue of measles virases from cloned DNA. EMBO Journal. 14:5773-5784) y modificado por Parks et al. (Parks, C. L, et al. 1999. Enhanced measles virus cDNA rescue and gene expression after heat shock. J Virol. 73:3560-3566). Se cotransfectaron células auxiliares humanas que expresaban de forma estable la ARN polimerasa T7 y las proteínas N y P del sarampión (células 293-3-46, descritas por Radecke et al.) usando el procedimiento de fosfato cálcico con los plásmidos EdB-HIV-Env (5 !g) y un plásmido que expresaba el gen L de la polimerasa de MV (pEMC-La, 20 ng, descrito por Radecke et al.). El virus se recuperó después de co-cultivo de células auxiliares 293-3-46 transfectadas a 37ºC con células Vero de primate (riñón de mono verde africano). En este caso, aparecieron sincitios
sistemáticamente en todas las transfecciones después de 2 días de cocultivo.
[0167] En un experimento adicional (Fig. 3C-D), después de incubación durante una noche a 37ºC, las células se sometieron a choque térmico a 43ºC durante 3 horas en medio fresco (40). Las células sometidas a choque térmico se incubaron a 37ºC durante 2 días, después se transfirieron a una capa de células Vero confluyente al 70% (placas Petri de 10 cm). Aparecieron sincitios en células Vero después de 2-5 días de co-cultivo. Se recogieron sincitios individuales y se transfirieron a células Vero cultivadas en pocillos de 35 mm. Las células infectadas se expandieron en matraces de 75 y 150 cm3. Cuando los sincitios alcanzaron una confluencia del 80-90%, se rasparon las células en un pequeño volumen de OptiMEM (Gibco BRL) y se congelaron y descongelaron una vez. Después de centrifugación, se almacenó el sobrenadante, que contenía virus, a -80ºC.
Expresión de glicoproteínas de HIV1 por MV recombinante.
[0168] Los virus recombinantes recuperados MV2-gp140, MV2-gp160, MV3-gp140LV3 y MV2-gp160LV3 se propagaron en células Vero y se analizó la expresión de las glicoproteínas Env de HIV por transferencia de western e inmunofluorescencia. La infección de células Vero por virus MV2 recombinantes (con la inserción de transgén en la posición 2) mostró una elevada expresión de las Env gp160 y gp140 de HIV. También se detectó la proteína Env recombinante escindida (gp120). El virus MV3 (con inserción de transgén en la posición 3) expresó niveles inferiores de transgén, como se esperaba debido al gradiente de transcripción observado en la expresión de MV. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la glicoproteína Env de HIV1 y el mutante LV3 se expresan de forma eficaz por los MV recombinantes.
[0169] Titulación de virus. Se determinaron los títulos de MV recombinante por un ensayo de dilución limitante de punto final en células Vero. La dosis infecciosa de cultivo tisular al 50% (DICT50) se calculó usando el método de Kärber.
Capacidad de crecimiento de los virus recombinantes MVEdB-EnvHIV89.6.
[0170] Para analizar la capacidad de crecimiento de virus MVEdB-EnvHIV89.6, se infectaron células Vero a diferentes MOI (0,01 y 0,0001), se incubaron a 37ºC, y se recogieron en diferentes momentos puntuales. Se determinaron los títulos de virus asociados a células para cada muestra usando el método de DICT50 en células Vero. La Figura 4 muestra que usando una MOI de 0,0001, se retardaba la cinética de crecimiento de virus MVEdB-EnvHIV89.6, en comparación con MVEdB-tag convencional. Sin embargo, usando una MOI de 0,01, la producción de virus recombinantes era comparable con la de virus convencionales, y se obtenían fácilmente títulos máximos de 107 DICT50/ml o incluso mayores.
[0171] En particular, se infectaron monocapas de células Vero (matraces T-25) a una MOI de 0,05 con los virus recombinantes. Cuando los sincitios alcanzaron una confluencia del 80-90%, las células se lisaron en NaCl 150 mM, Tris 50 mM pH=8, NP40 al 1%, PMSF 0,5 mM y 0,2 mg/ml de Pefabloc® (Interbiotech, Francia). La cromatina se retiró por centrifugación y se determinó la concentración de proteína en el sobrenadante con un ensayo de Bradford. Las proteínas (50 !g) se fraccionaron por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de celulosa (Amersham Pharmacia Biotech). Las transferencias se sondearon con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-gp120 de HIV (Chessie 13-39.1, NIH-AIDS Research & Reference Reagent Program) o con un anticuerpo monoclonal anti-N de MV (Chemicon, Temecula, EEUU). Se usó un conjugado anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-peroxidasa de rábano rusticano (HRP) (Amersham) como anticuerpo secundario. La actividad peroxidasa se visualizó con un kit de detección de quimioluminiscencia potenciada (Pierce).
Inmunizaciones de ratones
[0172] Se obtuvieron ratones susceptibles a infección por MV como se ha descrito previamente (21). Se cruzaron ratones FVB transgénicos heterocigóticos para CD46 (32), el receptor para las cepas de vacuna de MV (24), con ratones 129sv IFN-a/1R-/- que carecían del receptor de interferón tipo I (22). La descendencia F1 se exploró por PCR y los animales CD46 +/- se cruzaron de nuevo con ratones 129sv IFN-a/1R-/-. Los animales IFN-a/1R-/- CD46+/-se seleccionaron y usaron para experimentos de inmunización. Ya se ha demostrado que el mismo tipo de ratones es susceptible a infección por MV (20, 21).
[0173] Se inocularon ratones hembra CD46+/-IFN-a/1R-/- de seis semanas de edad por vía intraperitoneal con 107 DICT50 de virus recombinantes MV2-gp140, MV2-gp160, MV3-gp140LV3 o MV2-gp160LV3 preparados y titulados como se ha descrito anteriormente. Los ratones se sacrificaron por eutanasia 7 días y 1 mes después de la infección. Se recogieron los bazos y la sangre completa. Se extrajeron los esplenocitos de los bazos y se mantuvieron congelados en nitrógeno líquido hasta su uso. Se decantaron los sueros y se analizó la serología por ELISA para MV (Trinity Biotech, EEUU) y HIV (Sanofi Diagnostics, Francia).
Inmunización de monos
[0174] Se vacunaron dos macacos rhesus criados en colonia (Macaca mulatto) (seronegativos para el retrovirus de simios tipo D, el virus linfotrópico de células T de simios, el virus de la inmunodeficiencia de simios y MV) por vía subcutánea con 104 DICT50 de vacuna contra MV (Rouvax, Aventis Pasteur, Francia). Se reforzaron un año después por dos inyecciones de 5 106 DICT50 de virus recombinante MV2-gp140 realizadas a intervalos de 1 mes. Se recogieron muestras de sangre en diferentes momentos puntuales y se buscaron anticuerpos anti-MV y anti-HIV.
Respuesta inmune humoral contra virus recombinantes recuperados.
1er experimento
[0175] Las respuestas inmunes humorales contra MV y Env de HIV se analizaron por ELISA en sueros recogidos 1 mes después de la inmunización de ratones. Los títulos se determinaron por diluciones limitantes. Los resultados presentados en la Figura 5 muestran que todos los ratones vacunados respondieron al sarampión con elevados títulos de anticuerpos (1/50000 a 1/80000) y a Env de HIV con títulos entre 1/1000 y 1/5000 dependiendo de la secuencia insertada. Los títulos de anticuerpos entre MV y HIV no pueden compararse porque los ELISA usados no tienen la misma sensibilidad. El ELISA de MV (Trinity Biotech, EEUU) detectó la respuesta completa contra todas las proteínas de MV, mientras que el ELISA de HIV (Sanofi Diagnostics) detectó solamente los anticuerpos anti-Env de HIV. Se ensayó la capacidad de estos sueros de neutralizar un aislado primario de HIV subtipo B usando células indicadoras, P4R5, que expresan beta-galactosidasa cuando se infectan con HIV (células HeLa-CD4-CXCR4-CCR5-HIV LTR-LacZ). En experimentos preliminares, ensayamos sueros de ratones inmunizados con virus recombinantes MV-HIV que expresaban glicoproteínas de envuelta nativas (MV-gp160HIV-1 o MVEdB-gp140HIV89.6). Los resultados mostraron que estos sueros tenían actividad neutralizante al 70-50% contra un aislado primario, Bx08, cuando se usaban a una dilución 1/20 (Figura 6). La actividad neutralizante de los sueros creados contra las moléculas Env diseñadas por ingeniería genética está actualmente en estudio.
2o experimento
[0176] En otro experimento (Fig. 5C-F), se recogieron sueros un mes después de la inmunización y se inactivaron por calor. Se detectaron anticuerpos anti-MV (Trinity Biotech, EEUU) y anti-Env de HIV (Sanofi Diagnostic Pasteur, Biorad, Francia) usando kits ELISA comerciales. Se usó un conjugado anti-anticuerpo de ratón-HRP (Amersham) como anticuerpo secundario. Los títulos se determinaron por diluciones limitantes y se calcularon como la dilución más elevada de suero que da dos veces la absorbencia de una dilución 1/100 de una mezcla de sueros de control. Se usaron los mismos kits ELISA para sueros de monos macacos. Se usó un anticuerpo secundario anti-IgG de mono para detectar anticuerpos anti-HIV. Se detectaron anticuerpos anti-MV con anti-IgG humana para ser capaces de calibrar el ensayo con patrones suministrado en el kit ELISA de MV. Se expresaron en mUI/ ml. Se usó una mezcla de 5 muestras de monos negativos como control negativo. El título de anticuerpos anti-ELDKAS se determinó por ELISA usando placas NeutrAvidin de 96 pocillos (Pierce) recubiertos con el péptido biotinilado ELDKWAS (Neosystem, 5 !g/ml en NaHCO3 2 M, Na2CO3·H2O 2 M, pH 9,6). Se usaron sueros de ratones inmunizados con MV convencional como controles negativos. Se detectaron anticuerpos unidos a péptido con conjugado anti-anticuerpo de ratón-HRP.
[0177] Ensayos de neutralización de HIV-1. Se ensayó la sero-neutralización contra SHIV89.6p (A.M. Aubertin, Universite Louis Pasteur, Estrasburgo, H. Fleury, Burdeos, Francia), 92US660, 92US714, 92HT593 (NIH-AIDS Research & Reference Reagent Program), y un aislado primario de subtipo A: 3253 (G. Pancino, Institut Pasteur, París). Estos virus se propagaron en PBMC humanas estimuladas con PHA como ya se ha descrito (42). Se realizaron ensayos de neutralización de HIV-1 usando la línea celular indicadora P4-CCR5 (43). Se sembraron células P4-CCR5 en placas de 96 pocillos (20.000 células por pocillo) y se incubaron a 37ºC en DMEM, FCS al 10% durante 24 h. El medio se remplazó por 100 !l de DMEM, FCS al 10%, DEAE dextrano (100 !g/ml) y las células se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. El virus (0,5 o 1 ng de p24) se incubó con diluciones séricas en 50 !l de PBS a 37ºC durante 20 minutos y las mezclas virus-suero se añadieron a las células por triplicado. Después de 48 horas de incubación, se midió la actividad 1-galactosidasa usando un Ensayo de Gen Informador por Quimioluminescencia (Roche, EEUU).
Respuestas inmunes celulares contra virus recombinantes recuperados.
[0178] Se ensayó la capacidad de esplenocitos de ratones vacunados de secretar a-IFN después de estimulación in vitro por citometría de flujo y ensayos ELISpot. Se descongelaron células de ratones inmunizados 18 h antes de los ensayos funcionales y se incubaron en medio RPMI suplementado con FCS al 10% calentado a 56ºC (Gibco) y 10 U de rh-IL2 (Boehringer Mannheim). La viabilidad celular se evaluó por exclusión de azul de tripano.
[0179] Para realizar el ensayo ELISpot de y-IFN, se recubrieron placas multiscreen-HA de 96 pocillos con anticuerpo de captura anti-y-IFN de ratón (R4-6A2, Pharmingen) en solución de PBS (6 !g/ml). Después de
incubación durante una noche a 4ºC, los pocillos se lavaron 4 veces con PBS. Los sitios de unión a proteína restantes se bloquearon incubando los pocillos con 100 !l de RPMI/FCS al 10% durante 1 h a 37ºC. El medio se retiró justo antes de la adición de las suspensiones celulares (100 !l) y los agentes de estimulación (100 !l). Los esplenocitos de ratones inmunizados se sembraron en placas a 5.105 células por pocillo por duplicado en RPMI. Se usó concanavalina A (5 !g/ml, Sigma) como control positivo, y RPMI/IL2 (10 U/ml) como control negativo. Las células se estimularon con 1 !g/ml de gp120 de HIV1, 1 !g/ml de albúmina sérica bovina (Sigma), o virus Edm-Tag (MOI = 1). Después de incubación durante 2 h a 37ºC para la adsorción viral, se añadió FCS calentado (10 !l) en cada pocillo (concentración final del 10%) y las placas se incubaron durante 24-36 h a 37ºC. Para retirar las células, las placas se lavaron dos veces con PBS, 4 veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (Sigma), y 2 veces de nuevo con PBS. Para la detección, se añadió un anticuerpo biotinilado anti-y-IFN de ratón (XMG1.2, Pharmingen) a cada pocillo (100 !l, 4 !g/ml en PBS-FCS al 0,1%). Después de incubación durante 2 h a temperatura ambiente, las placas se lavaron 4 veces con PBS-tween 20 al 0,1% y dos veces con PBS. Se añadió conjugado estreptavidinafosfatasa alcalina (AP del inglés Alkaline Phosphatase) (Roche) (100 !l, dilución 1/2000 en PBS) y se incubó durante 1-2 horas a temperatura ambiente. La enzima se retiró por 4 lavados con PBS-Tween 20 al 0,1% y 2 lavados con PBS. Las manchas después se revelaron con sustrato de color BCIP/NBT (Promega) preparado en tampón AP pH 9,5 (Tris 1 M, NaCl 1,5 M, MgCl2 0,05 M). Los pocillos se controlaron para la formación de manchas a simple vista: después de una incubación de 15-30 minutos, la reacción se detuvo por lavado bajo un chorro de agua corriente. Después de secar al menos durante una noche a temperatura ambiente, las manchas coloreadas se contaron usando un sistema de análisis de imágenes automatizado ELISpot Reader (Bio-Sys).
[0180] Para ensayos de citometría de flujo, se estimularon 5 105 esplenocitos (diluidos en 100 !l de RPMI) en placas de 96 pocillos con fondo en V con 1 !g/ml de proteína gp120 de HIV1 (AbCys) en RPMI/IL2 (10 U/ml), o virus EdB-tag (MOI = 1) diluido en 100 !l de RPMI/IL2. Las células de control no estimuladas se incubaron con RPMI/IL2 (10 U/ml). Después de incubación durante 2 h a 37ºC para la adsorción viral, se añadieron 10 !l de FCS en cada pocillo (concentración final del 10%) y las placas se incubaron durante una noche a 37ºC. El medio después se remplazó por 150 !l de RPMI-FCS al 10% que contenía 10 U de rh-IL2 y 10 !g/ml de Brefeldina A (Sigma). Las células se incubaron durante 4 horas a 37ºC, se recogieron, se tiñeron con anticuerpo anti-CD8 de ratón-APC (Pharmingen) y anticuerpo anti-CD4 de ratón-CyCr (Pharmingen) durante 20 minutos a temperatura ambiente, se lavaron con PBS-BSA (0,5%), después se fijaron durante 5 minutos a 37ºC en CytoFix (Pharmingen). Después del lavado, las células se resuspendieron en 100 !l de PBS-BSA (0,5%) que contenía saponina al 0,1% (Sigma) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con anticuerpo anti-y-IFN de ratón-PE (Pharmingen). Las células se lavaron de nuevo y se analizaron las muestras usando un citómetro FACSCalibur (Becton Dickinson). Los datos se analizaron usando el software Cell Quest.
MV recombinante expresa glicoproteínas Env de HIV89.6 y se replica de forma eficaz.
[0181] Las formas anclada (gp160) y soluble (gp140) de la glicoproteína Env de HIV (cepa SHIV89.6p), con o sin deleción del bucle V3 e inserción de un epítopo adicional ELDKWAS, se insertaron en una de las ATU del vector p(+) MV (Fig. 2). Se obtuvieron los virus recombinantes MV2-gp140, MV2-gp160, MV3-gp140LV3 y MV2-gp160LV3 después de la transfección de los plásmidos en la línea de células auxiliares 293-3-46 y la propagación en células Vero. MV2- y MV3- se refiere al sitio de inserción, posición 2 ó 3 respectivamente, de la construcción EnvHIV89.6. La expresión de la proteína EnvHIV89.6 se analizó por transferencia de western de lisados de células infectadas (Fig. 3) e inmunofluorescencia (no mostrado). Los virus MV2-gp140 y MV2-gp160 mostraron un elevado nivel de expresión de la proteína EnvHIV89.6 (Fig. 3C, carriles 1, 2, 4). Como se esperaba, los virus MV2-gp160L expresaron el precursor env gp160 así como la proteína escindida gp120 (Fig. 3C, carriles 2, 4). En contraste, los virus MV2gp140 y MV3-gp140LV3 expresaron solamente la forma secretada y escindida gp140. El virus MV3-gp140LV3 expresó niveles ligeramente inferiores de transgén que los virus de la serie MV2, como se esperaba, debido al gradiente de transcripción observado en la expresión de MV (Fig. 3C, carril 3). Tomados en conjunto, estos resultados indican que EnvHIV89.6 y los mutantes LV3 se expresaron de forma eficaz y maduraron correctamente. El MV recombinante se pasó 5 veces en células Vero y se comparó la expresión del transgén con la de la nucleoproteína de MV. La Figura 3 muestra que la expresión de EnvHIV89.6 fue similar para los pases 2 y 5, lo que confirma la estabilidad de la expresión de transgenes en este sistema.
[0182] Se analizó el crecimiento de virus recombinantes MV-EnvHIV89.6 en células Vero usando una MOI de 0,0001
o 0,01. El crecimiento de los virus recombinantes estuvo sólo ligeramente retardado en comparación con el de MV EdB-tag convencional recuperado de p+(MV). Los virus que expresaba la gp140 secretada estuvieron menos afectados que los virus que expresaban la gp160 anclada. El recombinante gp140LV3 creció a la misma velocidad que el MV de control. El retardo observado con virus que expresaba la gp160 anclada puede deberse a una inferior tasa de replicación, a causa del mayor tamaño del transgén, o a una gemación reducida de MV a causa de la inserción de gp160 en la superficie de las células infectadas. No obstante, el rendimiento final de los virus recombinantes fue comparable con el de MV de control y se obtuvieron títulos máximos de aproximadamente 106 a 107 DICT50/ml de forma rutinaria.
Inducción de respuesta inmune humoral contra MV recombinante en ratones susceptibles.
[0183] Se ensayó la inmunogenicidad de virus MV-EnvHIV89.6 en ratones modificados genéticamente que expresaban el receptor de MV para CD46 humana y que carecían del receptor de IFN tipo I. Se ensayaron dosis crecientes de virus MV2-gp160 (103-107 DICT50) en 5 grupos de 3 ratones. Se buscaron anticuerpos contra MV y Env de HIV por ELISA en sueros recogidos 1 mes después de la inmunización (Fig. 5C). Los títulos de anticuerpos tanto anti-MV como anti-HIV aumentaron cuando aumentaba la dosis de MV recombinante. Como se obtuvieron elevados títulos anti-MV cuando los animales se inocularon con 106 a 107 DICT50, los ratones se inmunizaron con
5.106 DICT50 en todos los demás experimentos. A esta dosis, los títulos de anticuerpos anti-MV eran seis veces mayores que los anticuerpos anti-HIV. Hay que tener en mente que la inmunización fue contra Env de HIV solamente, mientras que se expresaron todas las proteínas de MV durante la infección. Para comparar la inmunogenicidad de las diferentes construcciones EnvHIV, se inocularon cuatro grupos de 6 ratones por vía intraperitoneal con diversos virus MV-EnvHIV89.6 (fig. 5B, 5E). Todos los ratones respondieron contra MV (título medio anti-MV: 5 104) y contra Env de HIV (título medio anti-HIV: 8 103). No se observaron diferencias en los títulos anti-MV
o anti-HIV o anti-HIV entre las cuatro construcciones ensayadas. De forma interesante, la expresión a partir de la posición de ATU 2 o ATU 3 del vector de MV no afectó a la respuesta de anticuerpos. Como las construcciones LV3 expresaban un epítopo adicional ELDKWAS, la respuesta de anticuerpos contra este epítopo gp41 se examinó por separado usando un ensayo ELISA específico (Fig. 5F). Los resultados mostraron que las construcciones LV3-ELDKWAS indujeron títulos mayores de anticuerpos anti-ELDKWAS. El título de 1/50.000 corresponde a la dilución de un suero inmune capaz de reconocer el antígeno administrado para la inmunización, en ensayo ELISA.
Virus MV-EnvHIV89.6 inducen anticuerpos neutralizantes anti-HIV.
[0184] Se ensayó la capacidad de estos sueros de neutralizar el virus homólogo SHIV89.6p o diversos aislados primarios heterólogos de HIV-1 usando un ensayo de infectividad viral de un único ciclo en células indicadoras P4-CCR5 (43). Las células P4-CCR5 expresan los receptores de HIV-1 para CD4, CXCR4 y CCR5 y se han transfectado de forma estable con un HIV LTR LacZ. Por lo tanto, son susceptibles a los aislados de HIV-1 y expresan 1-galactosidasa después de infección. El ensayo de seroneutralización se validó usando una combinación de anticuerpo anti-inmunoglobulina de HIV (HIVIG) y anticuerpos monoclonales (2F5 y 2G12) que previamente demostraron neutralizar de forma sinérgica aislados primarios de HIV (17). También usamos sueros de pacientes infectados que neutralizan aislados primarios de HIV (17). También usamos sueros de pacientes infectados que neutralizan aislados primarios de HIV usando un ensayo de neutralización convencional sobre PBMC humanas (42). La actividad neutralizante de un suero (Tabla 1) se expresa como la proporción de la reducción de infección obtenida con este suero sobre la reducción obtenida con sueros de control negativo usados a la misma dilución (sueros de individuos negativos para HIV y de pacientes infectados neutralizaron virus de subtipo B y A igual de bien en este ensayo).
[0185] Como se muestra en la Tabla 1, los anticuerpos inducidos en ratones por los cuatro virus MV-EnvHIV89.6 neutralizaron el SHIV89.6p homólogo a las dos diluciones ensayadas (1/30 y 1/60). No se observaron diferencias significativas entre los sueros obtenidos con las diferentes construcciones de Env, lo que indica que la forma secretada y anclada de la glicoproteína de HIV inducía anticuerpos neutralizantes contra el virus homólogo igual de bien cuando se expresa por MV. La deleción del bucle V3, que se sabe que contiene epítopos neutralizantes específicos de tipo, no tuvo efecto significativo sobre la inducción de anticuerpos que neutralizaban el virus homólogo. Esto sugiere que la deleción podría haberse compensado por la adición de un segundo epítopo neutralizante ELDKWAS gp41, o por la revelación de otros epítopos neutralizantes.
[0186] Los anticuerpos inducidos por los virus recombinantes neutralizaron aislados primarios heterólogos subtipo B, excepto el aislado 92HT593, así como un virus subtipo A. En cada caso, los anticuerpos inducidos por la gp160 anclada fueron ligeramente más neutralizantes que los anticuerpos inducidos por la gp140 secretada, especialmente contra el virus subtipo A 3253. Los anticuerpos inducidos por la EnvHIV89.6 LV3-ELDKWAS neutralizaron virus heterólogos de forma más eficaz que los inducidos por la envuelta nativa. Esto fue particularmente sorprendente para el virus Bx08 que pudo neutralizarse hasta un 90% por sueros de ratones inmunizados con MV2-gp160LV3 (dilución 1/30) pero no por sueros de ratones inmunizados con MV que expresaban la EnvHIV89.6 nativa. Esta neutralización fue exactamente tan eficaz como la neutralización por sueros de control positivo. Estos resultados muestran que remplazar el bucle V3 de EnvHIV89.6 por un epítopo adicional ELDKWAS gp41 y expresar la construcción con un vector de MV permitió la inducción de anticuerpos con actividad neutralizante cruzada contra aislados primarios de HIV-1 subtipos A y B, al menos en el contexto de infección con MV recombinante de ratones.
Tabla 1. Neutralización de aislados heterólogos primarios de HIV-1 por sueros de ratones inmunizados con MV-EnvHIV89.6a.
Aislado devirus (subtipo)
Sueros de ratones (1/60) Sueros de ratones (1/30) Controles positivosMab sueros humanos HIVc
Gp140 deMV2
Gp140LV3 deMV2 Gp160de MV2 Gp160LV3 deMV2 Gp140 deMV2 Gp140LV3 deMV2 Gp160 deMV2 Gp160LV3 deMV2 (2F5/2G12/HIV-IG 4 61/40) 33 -1/30)
SHIV 89.6 Bx08(B) 92 US 660 (B) 92 US 714 (B) 92 HT 593 (B) 3253 (A)
4002,54500 5031154900 5201345018 45401768030 760NDND00 5776NDND010 7218NDND043 6890NDND049 ND94NDNDND73 ND94NDNDND54 ND90NDNDND45
a El suero se evaluó para anticuerpos neutralizantes a dos diluciones. Los valores son el % de reducción en la infección de aislados primarios de HIV en células P4-CCR5 en presencia de sueros de ratones (tres ratones por punto). Las determinaciones se hicieron por triplicado y las desviaciones típicas fueron <10%.b Mezcla de HIVIG (2,5 mg/ml) y Mab 2F5 y 2G12 (25 !g/ml). c Los números corresponden a la nomenclatura usada en Burrer et al.
Inducción de respuesta inmune celular contra MV recombinante
[0187] Los resultados de estos experimentos realizados con esplenocitos de ratones inmunizados con virus MV2gp160HIV (Figura 7) demostraron que una única inmunización con virus MV2-gp160HIV fue capaz de sensibilizar linfocitos específicos de Env de HIV in vivo. El ensayo ELISpot de y-IFN es un método sensible para el recuento de células específicas de antígeno en células frescas después de inmunización in vivo. Este ensayo se usó para determinar si podía detectarse células secretoras de y-IFN específicas de Env de HIV después de una única inmunización con el virus MV2-gp160HIV. La Figura 7A muestra que estaba presente una cantidad significativa de células específicas de Env en 2/3 de los ratones ensayados, 7 días así como 1 mes después de la inmunización. (Para un ratón en cada grupo la cantidad de manchas fue la misma después de estimulación con BSA o gp120). La cantidad de manchas específicas de HIV detectadas (hasta 600/106 células) representa el 15-20% de las manchas específicas de MV detectadas en los mismos ratones (no mostrado), lo que indica que el MV recombinante es capaz de inmunizar de forma eficaz contra el gen foráneo expresado.
[0188] Para evaluar el fenotipo de estas células específicas de Env, se realizaron experimentos de citofluorometría de 3 colores en ratones sacrificados por eutanasia 7 días después de la inmunización, en un máximo teórico de proliferación de células efectoras. Se muestra un resultado representativo en la Figura 7B. En nivel de fondo y de producción de y-IFN para linfocitos tanto CD4+ como CD8+ se muestra en el panel de la izquierda. Para este animal, el 0,09% de los linfocitos CD8+ (media calculada para 3 ratones: 0,31%) y el 0,25% de los linfocitos CD4+ (media: 0,41%) eran espontáneamente productores de y-IFN. Las frecuencias de células T contra HIV-gp120 (panel medio) en los subconjuntos CD8+ y CD4+ fueron del 1,76% (media: 1,69%) y el 0,92% (media: 0,76%) respectivamente. Es interesante tener en cuenta que en el mismo ratón inmunizado, las frecuencias de células específicas del sarampión en los subconjuntos CD8+ y CD4+ fueron del 7,63% (media: 7,03%) y el 4,11% (media: 3,50%) respectivamente. De hecho, el virus recombinante MV2-gp160HIV expresa 6 proteínas del sarampión más una proteína foránea gp160. Por tanto, las frecuencias de linfocitos específicos de antígeno siguieron las proporciones de genes recombinantes. Como conclusión, la citofluorometría de 3 colores realizada 7 días después de la vacunación con virus MV2-gp160HIV mostró que se sensibilizaban linfocitos tanto CD8+ (Fig. 7B, panel superior) como CD4+ (Fig. 7B, panel inferior) específicos de gp120 de HIV y virus del sarampión in vivo.
Inducción de una respuesta anti-HIV en animales con inmunidad anti-MV preexistente.
[0189] Primero ensayamos la posibilidad de reforzar la respuesta anti-HIV por una segunda inyección de MV recombinante. Los ratones inmunizados con 5.106 DICT50 de virus recombinante MV2-gp140 (3 ratones por grupo) se reforzaron con una segunda inyección del mismo MV recombinante un mes después de la primera inyección. Los títulos medios de anticuerpos anti-MV y anti-HIV en el momento del refuerzo eran de 5 104 y 8 103 respectivamente. Estos títulos aumentaron hasta, respectivamente, 5 105 y 5 104 un mes después del refuerzo. Por tanto, las respuestas anti-MV y HIV pueden reforzarse 10 veces inyectando la misma dosis de MV recombinante un mes después de la primera inmunización.
[0190] Después ensayamos la capacidad de MV recombinante de inducir anticuerpos anti-HIV en ratones y monos en presencia de inmunidad anti-MV preexistente. Primero se inmunizaron ratones (3 ratones por punto) con 105 DICT50 de EdB-tag MV (sin un inserto de HIV). Se indujeron elevados niveles de anticuerpos anti-MV (Fig. 7C). El título disminuyó ligeramente después de 2 meses y permaneció estable durante los siguientes 9 meses. Los ratones después se inocularon con 5 106 DICT50 de MV2-gp140HIV89.6, y se reforzaron con la misma dosis un mes después. El título de anticuerpos anti-MV se aumentó 100 veces y se indujeron elevados títulos de anticuerpos anti-HIV (5 104). Estos títulos fueron similares a los obtenidos después de la inmunización de animales vírgenes con dos inyecciones.
[0191] Se realizó el mismo experimento con macacos rhesus (Fig. 7D). Se inmunizaron dos macacos con una dosis convencional (104 DICT50) de vacuna contra MV (Rouvax, Aventis Pasteur). Como para los ratones, se indujeron elevados niveles de anticuerpos anti-MV y permanecieron estables durante un año. Los macacos después se inocularon con 5 106 DICT50 de MV2-gp140HIV89.6 dos veces a intervalos de un mes. Los títulos anti-MV aumentaron 150 veces después de la primera inyección de MV-HIV, mientras que la segunda inyección tuvo ninguno
o poco efecto. Se indujeron anticuerpos anti-HIV por la primera inyección con MV2-gp140HIV89.6 a pesar de la presencia de inmunidad anti-MV preexistente. Un mes después de la segunda inyección con MV2-gp140HIV89.6, el nivel de anticuerpos anti-HIV había aumentado aproximadamente 10 veces y había alcanzado títulos similares a los obtenidos en ratones. Este nivel permaneció estable durante los siguientes 5 meses.
[0192] El objetivo principal del presente trabajo fue ensayar la inmunogenicidad de virus recombinantes MV-EnvHIV atenuados. Demostramos que dichos recombinantes eran genéticamente estables, expresaban la proteína Env de HIV a elevados niveles, e inducían elevados títulos de anticuerpos contra construcciones tanto de MV como de Env de HIV en ratones transgénicos. Los títulos de anticuerpos anti-HIV fueron aproximadamente el 15-20% de los de anticuerpos anti-MV. Esto corresponde aproximadamente a la proporción de proteínas HIV/MV expresadas por los virus recombinantes. Las construcciones de Env de HIV con un bucle V3 delecionado y un epítopo adicional ELDKWAS gp41 indujeron dos veces tantos anticuerpos anti-ELDKWAS como construcciones nativas, lo que sugiere que la confirmación nativa del péptido adicional se conservaba a pesar de su posición ectópica. También se
indujo un elevado nivel de células CD8+ y CD4+ específicas de HIV. Hasta el 1,5-2% de las células T CD8+ totales y el 0,9% de las células T CD4+ totales fueron específicas de HIV.
[0193] Sin embargo, el aspecto más importante de nuestros resultados es que estos anticuerpos anti-HIV fueron neutralizantes para el virus homólogo SHIV89.6p así como para varios aislados primarios heterólogos de HIV-1 de subtipo A y subtipo B. De forma interesante, la construcción de gp160 anclada LV3-ELDKWAS indujo anticuerpos que neutralizaron virus heterólogos de forma más eficaz que los inducidos por la envuelta nativa. Sus títulos neutralizantes fueron similares a los de sueros humanos neutralizantes de HIV. La capacidad neutralizantes más amplia de estos anticuerpos podría deberse a la adición de un segundo epítopo neutralizante ELDKWAS gp41, o a la exposición de epítopos neutralizantes conservados previamente enmascarados. Varios grupos han insertado el epítopo ELDKWAS en diversas moléculas inmunogénicas (44, 45, 46, 47). Estos estudios demostraron que el contexto conformacional en que se presenta el epítopo es esencial para la inducción de anticuerpos neutralizantes. Se demostró que una restricción tipo giro 1 es la estructura conformacional más probable del epítopo ELDKWAS reconocido por el anticuerpo neutralizante 2F5 (46). En nuestras construcciones, la inserción del corto epítopo AAELDKWASAA en lugar del bucle V3, que está flanqueado por cadenas 1 (28, 29), puede tener dicha confirmación tipo giro 1.
[0194] Ya se ha demostrado que la deleción de bucles hipervariables de Env de HIV puede potenciar su inmunogenicidad (3, 48, 39). Sin embargo, en estudios previos se obtuvieron anticuerpos neutralizantes solamente después de múltiples inyecciones de elevadas cantidades de proteína soluble (23), o con un régimen de "sensibilización-refuerzo" usando cantidades muy grandes de ADN y proteína pura (3, 39). En contraste, observamos los mismos niveles de anticuerpos neutralizantes en ratones inyectados con una única dosis de MVgp160LV3-ELDKWAS. La buena inmunogenicidad en nuestro sistema probablemente resulta del hecho de que la Env de HIV se expresa y procesa por el sistema inmune del mismo modo que proteínas de la vacuna viva de MV, un inmunógeno altamente potente. Puede esperarse que dichos niveles de anticuerpos neutralizantes podrían al menos inducir protección parcial en individuos vacunados. De acuerdo con los datos de otros (3, 39), podría ser posible aumentar la inmunogenicidad de recombinantes M-HIV Env incluso más delecionando los bucles V1 y V2 de gp120 de HIV, especialmente para inducir anticuerpos dirigidos contra el sitio de unión a CD4. Sin embargo, recientemente se ha informado de que este sitio de unión a receptor puede escapar de la respuesta inmune por enmascaramiento conformacional y antrópico (49).
[0195] La presencia de inmunidad anti-MV en casi toda la población humana adulta parecería restringir el uso de recombinantes MV a bebés, un objetivo ya meritorio en cualquier caso. Sin embargo, varios estudios demostraron que la revacunación de individuos ya inmunizados produjo un refuerzo de anticuerpos anti-MV, lo que sugiere que la vacuna viva atenuada replicaba y expresaba sus proteínas a pesar de la inmunidad preexistente (50). En dichas circunstancias, podría esperarse ser capaces de vacunar a adultos contra un antígeno foráneo con un MV recombinante. De hecho, nuestros resultados demuestras, tanto con ratones como con macacos, que pueden obtenerse elevados niveles de anticuerpos neutralizantes anti-HIV en presencia de inmunidad preexistente anti-MV.
[0196] Diversos regímenes de "sensibilización-refuerzo", usando combinaciones de ADN desnudo y vectores virales tales como un sMVA (1) o Adenovirus (29), dieron protección razonable contra una exposición con SHIV89.6p patogénico. En el presente estudio, demostramos que una única inyección de MV es capaz de combinar respuestas humorales y celulares a niveles similares a los inducidos por estas combinaciones complejas.
[0197] Los mismos recombinantes se han preparado usando la cepa clonada Schwarz como vector. Esto aumentaría su inmunogenicidad incluso más.
Ejemplo II: Construcción de virus del sarampión Schwarz (MVSchw) que expresan antígenos de HIV-1
[0198] Para ensayar su capacidad como candidatos de vacuna contra infección por HIV, construimos varios virus recombinantes del sarampión (MV) Schwarz que expresaban antígenos de HIV-1. Se construyeron diferentes genes de HIV-1 a partir de diferentes fases de lectura abierta y se introdujeron en unidades de transcripción adicionales en el ADNc de MV Schwarz que se había clonado previamente (pTM-MVSchw). Después de recuperar los diferentes virus recombinantes del sarampión Schwarz, se analizó la expresión de las diferentes proteínas de HIV-1 por transferencia de western de lisados de células infectadas (Fig. 3A-D).
[0199] Se construyeron diferentes inmunógenos a partir de la glicoproteína Env (a partir de ahora 1-8), la proteína Gag (a partir de ahora 9), y la proteína Tat (a partir de ahora 10) de HIV-1:
1.
Glicoproteína gp140 de HIV-1 89.6p
2.
Glicoproteína anclada gp160 de HIV-1 89.6p
3.
Glicoproteína secretada gp140 de HIV-1 89.6p delecionada de la región hipervariable V3 y epítopo adicional AAELDKWASAA (gp140HIV89.6 LV3-ELDKWAS)
4.
Glicoproteína anclada gp160 de HIV-1 89.6p delecionada de la región hipervariable V3 con un epítopo adicional AAELDKWASAA (gp160HIV89.6 LV3-ELDKWAS)
5.
Glicoproteína secretada gp140 de HIV-1 89.6p delecionada de las regiones hipervariables V1-V2
(gp140HIV89.6 LV1V2)
6.
Glicoproteína anclada gp160 de HIV-1 89.6p delecionada de las regiones hipervariables V1-V2 (gp160HIV89.6 LV1V2)
7.
Glicoproteína secretada gp140 de HIV-1 89.6p delecionada de las regiones hipervariables V1-V2-V3 (gp140HIV89.6 LV1V2V3)
8.
Glicoproteína anclada gp160 de HIV-1 89.6p delecionada de las regiones hipervariables V1-V2-V3 (gp160HIV89.6 LV1V2V3)
9.
Poliproteína Gag (p17p24, delta myr) de HIV-1 (subtipo B consenso) truncada de la ORF de la nucleoproteína en el extremo C-terminal (p17p248myrHIV-1B)
10.
Proteína Tat de HIV-1 89.6p (TatHIV89.6)
[0200] Los genes env de HIV que codifican las diferentes formas de la proteína Env se generaron por amplificación por PCR a partir del plásmido pSHIV-KB9 (NIH-AIDS Research & Reference Reagent Program). Las secuencias específicas se amplificaron usando la ADN polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) y cebadores específicos. Para generar las diferentes deleciones, se generaron fragmentos solapantes que flanqueaban las secuencias a delecionar y se hibridaron juntas por PCR. Después se introdujeron por clonación con enzimas de restricción en lugar del fragmento correspondiente en las secuencias de gp160 y gp140 ya clonadas en plásmidos pCR2.1-TOPO (Fig. 1A). Las diferentes secuencias generadas incluyen un codón de inicio y un codón de parada en ambos extremos y respetan la "regla de seis", que estipula que la cantidad de nucleótidos del genoma de MV debe ser divisible por 6 (7, 8). Después de digestión con BsiWI/BssHII, se introdujeron las diferentes secuencias de HIV en el vector pTM-MVSchw en la posición de ATU 2 ó 3 (Fig. 1B). Los plásmidos resultantes se denominaron:
1.
pTM-MVSchw2-gp140HIV
2.
pTM-MVSchw2-gp160HIV
3.
pTM-MVSchw2-gp140LV3HIV
4.
pTM-MVSchw2-gp160LV3HIV
5.
pTM-MVSchw2-gp140HIVLV1V2
5.
pTM-MVSchw2-gp160HIVLV1V2
6.
pTM-MVSchw2-gp140HIVLV1V2V3
7.
pTM-MVSchw2-gp160HIVLV1V2V3
8.
pTM-MVSchw2-GagHIV (p17-p24 Lmyr)
10. pTM-MVSchw3-TatHIV
[0201] Se produjo un virus recombinante que expresaba tanto Gag como gp140 en ambas posiciones 1 y 2 del vector Schwarz del sarampión.
11. pTM-MVSchw2-GagSIV239 (p17-p24 Lmyr)-3-gp140HIV
[0202] Este virus expresaba ambas proteínas (Fig. 3BB(1)). Dichas construcciones permiten la producción de "partículas tipo virus" de Gag-Env ensambladas de HIV, SHIV o SIV en células infectadas por virus recombinante del sarampión.
[0203] Se han generado las secuencias inmunogénicas de HIV-1 representadas en la figura 16:
Ejemplo III: Virus recombinantes del sarampión que expresan diferentes transgenes virales
[0204] Para demostrar las capacidades inmunizantes y protectoras de MV como vector pediátrico de vacunación, se construyó y estudió una serie de virus recombinantes del sarampión que expresaban diferentes transgenes virales (enumerados a continuación) a partir de otros virus. Los resultados presentados aquí se obtuvieron con el antiguo vector EdB-tag. Sin embargo, hemos demostrado que EdB-tag era 100 veces menos inmunogénico que la vacuna Schwarz. Por tanto, se inocularon virus recombinantes MVEdB a dosis más elevadas. Todas las secuencias insertadas con buenos registros inmunológicos pueden insertarse obviamente en el vector Schwarz.
[0205] Genes virales que ya se han insertado en los virus recombinantes del sarampión: SIV Mac 239 Nef
HIV subtipo B89.6P
gp160 gp160LV3 gp160LV1V2 gp160LV1V2V3 tat gp140 gp140LV3 gp140LV1V2 gp140LV1V2V3
[0206]
Gag de codones optimizados consenso de HIV subtipo B (p17-p24)
NefLMyr
Nef29-236
Tat
HTLV-I Env
Gag (P19-p24)
Tax
Ejemplo IV: Virus recombinantes del sarampión que expresan Env y NS1 del virus de la fiebre amarilla tienen capacidad inmune
[0207] Como una vacuna bivalente pediátrica contra el sarampión y la fiebre amarilla debe ser útil, construimos MV recombinante que expresaba las proteínas Env y NS1 del virus de la fiebre amarilla (YFV 17D204, cepa de vacuna Pasteur) y ensayamos su capacidad de proteger a ratones contra una exposición letal con YFV.
Construcción de plásmidos recombinantes MV-YFV.
[0208] El gen env se amplificó por PCR con la polimerasa Pfu usando cebadores que contienen sitios BsiWI y BssHII únicos para la posterior clonación en vector de MV: MV-YFVEnv5 (5'-TATCGTACGATGCGAGTCGTGATTG CCCTACTG-3') y MV-YFVEnv3 (5'-ATAGCGCGCTTATGTGTTGATGCCAACCCA-3'). La proteína Env generada de este modo (aminoácidos 270-753 en la poliproteína de YFV) contenía el péptido señal en el extremo N-terminal y una parte de la región transmembrana en el extremo C-terminal. La secuencia de NS1 se amplificó por PCR del mismo modo con la polimerasa Pfu usando los cebadores: MVYFVNS5 (5'-TATCGTACGATGAGAAACATGACAATG TCC-3') y MVYFVNS3 (5'-ATAGCGCGCTTAATGGCTTTCATGCGTTTTCC-3'). La proteína NS1 (aminoácidos 7541122 en la poliproteína de YFV) contenía su secuencia del péptido señal. Se añadieron un codón de inicio y uno de parada en ambos extremos de los genes así como varios nucleótidos después del codón de parada para respetar la "regla de seis", que estipula que la cantidad de nucleótidos del genoma de MV debe ser un múltiplo de 6 (7). Ambos fragmentos env y NS1 se clonaron en el plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenciaron para comprobar que no se habían introducido mutaciones. Después de digestión con BsiWI/BssHII de los plásmidos pCR2.1-TOPO, se clonaron las secuencias de env y NS1 en el vector EdB-tag en la posición ATU 2 dando los plásmidos: EdB-EnvYFV y EdB-NS1YFV.
Recuperación de los virus EdB-EnvYFV y EdB-NS1YFV recombinantes.
[0209] Se usaron los plásmidos EdB-EnvYFV y EdB-NS1YFV para transfectar células auxiliares 293-3-46 como se ha descrito anteriormente, y los virus recombinantes se recuperaron de las células transfectadas cocultivadas con célula Vero. Los virus recombinantes se pasaron dos veces en células Vero y se ensayaron para la expresión de transgenes.
Expresión de proteínas de YFV por MV recombinante.
[0210] Los virus recombinantes recuperados MV2-EnvYFV y MV2-NS1YFV se propagaron en células Vero y se analizó la expresión de proteínas de YFV por inmunofluorescencia. La Figura 9 muestra que sincitios de células Vero infectadas por virus recombinantes MV2-YFV mostraron una elevada expresión de las proteínas Env y NS1 de YFV detectadas con un suero policlonal de ratón anti-YFV. Para determinar si la expresión de los genes de YFV era estable, los virus recombinantes recuperados se pasaron en serie en células Vero. Después de 10 pases, todos los sincitios observados en células infectadas eran positivos para YFV (no mostrado). Tomados en conjunto, estos resultados indican que las proteínas Env y NS1 de YFV se expresan de forma eficaz y estable durante varios pases por los MV recombinantes.
Inmunización de ratones con virus recombinantes MV-YFV.
[0211] Se inoculó una mezcla de ambos virus MV2-EnvYFV y MV2-NS1YFV (107 DICT50) por vía intraperitoneal a seis ratones CD46+/-IFN-a/1R-/- como se ha descrito anteriormente (véanse los experimentos de MV-HIV gp). Como control, otros seis ratones recibieron la misma dosis de vacuna convencional contra el sarampión. Después de un mes, los ratones se expusieron por vía intracraneal con YFV 17D204 (10 DL50 determinada en ratones FVB). La Figura 10 muestra que el 65% de los animales inmunizados con MV-YFV estuvieron completamente protegidos contra la exposición, mientras que todos los animales vacunados con MV convencional murieron entre 6 y 7 días después de la exposición. Además, se observó un retardo de 4 días en la mortalidad en ratones inmunizados con MV-YFV, y estos ratones no murieron con los mismos síntomas clínicos encefálicos que los ratones vacunados con la vacuna convencional contra MV. La enfermedad se atenuó y constó de parálisis de las extremidades. Debe apreciarse que los ratones IFN-a/1R-/-son mucho más sensibles a infecciones virales que ratones inmunocompetentes (102-104 veces). Por esta razón, la dosis letal determinada en ratones inmunocompetentes fue probablemente demasiado elevada para ratones IFN-a/1R-/-. El mismo experimento está en marcha usando varias dosis decrecientes de virus de exposición YFV.
[0212] En conclusión, este experimento preliminar muestra que las respuestas inmunes inducidas por MV recombinante contra proteínas de YFV son capaces de proteger a ratones contra una exposición letal.
[0213] Las construcciones anteriores se crearon usando las secuencias descritas en la Figura 12A y 12B.
[0214] Se aplicarían los mismos principios para la preparación de construcciones con secuencias descritas en la Figura 12C y 12D.
Ejemplo V: Vacunación contra WNV con un virus vivo atenuado del sarampión (cepa Schwarz) que expresa la forma secretada de la glicoproteína E del WNV (virus del Nilo occidental).
[0215] Construimos un virus atenuado recombinante del sarampión Schwarz que expresaba la forma soluble de E de WNV y ensayamos su capacidad como vacuna candidata contra la encefalitis WN. El ADNc de WN correspondiente a la proteína sE de la cepa IS-98-ST1 de WNV se introdujo en una unidad de transcripción adicional en el ADNc de MV Schwarz (pTM-MVSchw CNCM I-2889). Después de recuperar el virus recombinante del sarampión Schwarz, se ensayó su capacidad de proteger a los ratones de una encefalitis letal por WNV después de exposición intraperitoneal.
A) Materiales y métodos
A.1 Células y virus WN
[0216] La cepa IS-98-ST1 del virus WN en células de mosquito Aedes AP61 de acuerdo con el protocolo descrito en Desprès et al. (51), Mashimo et al. (52) y Lucas et al. (53). El clon celular Vero-NK usado en este estudio se seleccionó por su capacidad de fusionarse después de infección con virus del sarampión y de amplificar el virus WN.
A.2 Titulación del WN en células de mosquito AP61 por inmunodetección de focos de replicación viral (Inmunoensayo de foco, FIA (del inglés Focus Immuno Assay)).
[0217] La titulación se realizó de acuerdo con el protocolo descrito en Desprès et al. (51), Mashimo et al. (52) y Lucas et al. (53).
[0218] El título infeccioso de virus WN en células AP61 se determinó como unidades formadoras de focos en células AP61 (AP61 UFF/ml).
A.3 Purificación de virus WN producido en células AP 61.
[0219] La purificación se realizó de acuerdo con el protocolo descrito en Desprès et al. (51), Mashimo et al. (52) y Lucas et al. (53).
[0220] En resumen, las partículas virales presentes en sobrenadantes de células AP61 infectadas durante 3 días con la cepa IS-98-ST1 del virus WN (MOI 0,4) se concentraron en PEG 6000 al 7% y después se purificaron en gradiente de sacarosa discontinuo del 30-60% y en gradiente de sacarosa lineal del 10-50%. Los viriones WN en sacarosa al 30% se almacenaron a - 80ºC. Los títulos infecciosos obtenidos fueron de aproximadamente 1010 AP61 FFU/ml.
A.4 Detección de anticuerpos anti-WN en ELISA
[0221] Los títulos de anticuerpos anti-WN de sueros diluidos (1:100) se determinaron por ELISA en una cantidad dada de 106 AP61 FFU de viriones WN IS-98-ST1 purificados en gradiente de sacarosa. El protocolo se describe en Desprès et al. (1993) y Mashimo et al. (2002).
A.5 Sueros inmunes anti-WN
[0222] Se recogieron sueros inmunes anti-WN en ratones adultos genéticamente resistentes a encefalitis vírica (Mashimo et al. 2002) que se ensayaron durante al menos un mes con inoculación intraperitoneal de 103 AP61 FFU de la cepa IS-98-ST1 del virus WN.
[0223] El título de anticuerpos anti-WN de sueros inmunes diluidos 1:100 se midieron en ELISA y fueron de aproximadamente 1,4 unidades DO. Los títulos neutralizantes (TNRF90) de sueros anti-WN fueron de aproximadamente 1600.
[0224] Se obtuvieron los fluidos ascíticos de ratones (HMAF) contra la cepa IS-98-ST1 de WN de animales que se habían hiperinmunizado con homogeneizados de cerebro de crías de ratón inoculadas con WN. Los títulos ELISA de HMAF anti-WN, diluidos a 1:1000 fueron de aproximadamente 1 unidad DO.
[0225] Los sueros inmunes anti-WN se usaron para inmunofluorescencia indirecta y para ensayos de seroprotección pasiva contra la enfermedad. Se usaron HMAF anti-WN para inmunodetección en membrana de proteínas virales.
5 A6. Construcción de virus recombinante del sarampión Schwarz que expresa sE de WN
[0226] Se generó el gen env de WNV que codificaba la forma secretada de la proteína por amplificación por RT-PCR del ARN viral purificado de partículas virales (cepa IS-98-ST1 de WNV). La secuencia específica se amplificó usando la ADN polimerasa PfuTurbo (Stratagene) y cebadores específicos que contienen sitios únicos para la
10 posterior clonación en el vector pTM-MVSchw:
MV-WNEnv5 5'-TATCGTACGATGAGAGTTGTGTTTGTCGTGCTA-3' (sitio BsiWI subrayado) y MV-WNEnv3 5'-ATAGCGCGCTTAGACAGCCTTCCCAACTGA-3' (sitio BssHII subrayado). Se añadieron un codón de inicio y una de parada en ambos extremos del gen. La secuencia completa generada es de 1380 nucleótidos de longitud,
15 incluyendo los codones de inicio y parada y respeta la "regla de seis", que estipula que la cantidad de nucleótidos del genoma de MV debe ser divisible por 6 [Calain, 1993 (7); Schneider, 1997 (28)]. La proteína Env generada de este modo contiene su péptido señal en el extremo N (18 aa) y sin región transmembrana. Por tanto, representa los aminoácidos 275-732 en la poliproteína de WNV y tiene la siguiente secuencia:
[0227] Después de purificación en gel de agarosa, se clonó el fragmento de PCR en el plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenció para comprobar que no se introdujeron mutaciones. Después de digestión con BsiWI/BssHII del plásmido pCR2.1-TOPO, se clonó el fragmento de ADN en el vector pTM-MVSchw en la posición ATU 2 dando el plásmido: pTM-MVSchw-sEWNV de acuerdo con la Figura 13.
A7. Producción de virus recombinante del sarampión que expresa sE de WN
[0228] Para recuperar MV recombinante del plásmido, usamos el sistema de recuperación basado en células auxiliares descrito por Radecke et al. [Radecke, 1995 (35)] y modificado por Parks et al. [Parks, 1999 (40)]. Se transfectaron células auxiliares humanas que expresaban de forma estable la ARN polimerasa T7 y las proteínas N y P del sarampión (células 293-3-46, un amable presente de MA Billeter, University of Zurich) usando el procedimiento de fosfato cálcico con el plásmido pTM-MVSchw-sEWNV (5 !g) y un plásmido que expresaba el gen L de la polimerasa de MV (pEMC-La, 20 ng). Después de incubación durante una noche a 37ºC, se remplazó el medio de transfección por medio fresco y se aplicó un choque térmico (43ºC durante dos horas) [Parks, 1999 (40)]. Después de dos días de incubación a 37ºC, las células transfectadas se transfirieron sobre una capa de células FEP y se incubaron a 32ºC para evitar la adaptación de la vacuna Schwarz que se seleccionó originalmente en células FEP y actualmente se cultiva en estas células. El virus infeccioso se recuperó entre 3 y 7 días después del cocultivo. El virus recombinante también se recuperó por la misma técnica después de cocultivo de células auxiliares 293-3-46 transfectadas a 37ºC con células Vero (riñón de mono verde africano, clon Vero-NK). Para aumentar el rendimiento de recuperación y como estos virus recombinantes se prepararon para usarse en experimentos con ratones, usamos células Vero como células productoras en lugar de los habituales fibroblastos embrionarios de pollo (FEP). Se recogieron sincitios individuales y se transfirieron a células Vero cultivadas en pocillos de 35 mm en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de ternera fetal al 5% (FCS). Las células infectadas se expandieron en matraces de 75 y 150 cm3. Cuando los sincitios alcanzaron una confluencia del 80-90% (habitualmente 36-48 horas después de la infección), las células se rasparon en un pequeño volumen de OptiMEM (Gibco BRL) y se congelaron y descongelaron una vez. Después de centrifugación a baja velocidad para sedimentar los desechos celulares, se almacenó el sobrenadante, que contenía el virus, a -80ºC. Hemos demostrado que dos pases del virus Schwarz en células Vero no cambiaba sus capacidades inmunogénicas en macacos.
A8. Titulación de virus MV-WN recombinante
[0229] Los títulos de MV recombinante se determinaron por un ensayo de dilución limitante de punto final en células Vero. Las dosis infecciosas en cultivo tisular al 50% (DICT50) se calcularon usando el método de Kärber [Kärber, 1931 (41)].
A9. Detección por inmunofluorescencia de sE de WNV expresada en células Vero infectadas por virus recombinante MV-WN sE.
[0230] La expresión de la proteína sE de WN en células infectadas por MV-WN sE recombinante se detectó por inmunofluorescencia. Se cultivaron células Vero en cubreobjetos recubiertos de poliornitina y se infectaron por MV-WN sE a una MOI de 0,05. Después de dos días de infección, los cubreobjetos se lavaron dos veces en PBS y se fijaron durante 15 minutos en paraformaldehído (4% en PBS). En algunos casos, las células se permeabilizaron por Triton X100 (0,1%, 5 min.). Después de dos lavados con PBS, los cubreobjetos se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en PBS con suero de cabra al 2%, después se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con sueros inmunes de ratón anti-WNV o HMAF de ratón anti-WNV (véase A5) diluidos en PBS con suero de cabra al 2%. Después de lavar en PBS, las células se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente con
anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con R-ficoeritrina (SBA, Birmingham). Después de lavar en PBS, los cubreobjetos se montaron en portaobjetos con fluoromount (Southern Biotech Associates inc., Birmingham, Alabama).
A10. Detección de anticuerpos anti-MV por ELISA
[0231] Los anticuerpos anti-MV se detectaron usando un kit ELISA convencional (Trinity Biotech, EEUU). Se usó un conjugado anti-anticuerpo de ratón-HRP (Amersham) como anticuerpos secundario. Los títulos se determinaron por diluciones limitantes y se calcularon como la dilución más elevada de suero que daba dos veces la absorbencia de una dilución 1/100 de una mezcla de sueros de control.
A.11 Ensayo de neutralización por reducción de los focos de replicación viral (TNRF90) en células VERO.
[0232] Se prepararon diluciones sucesivas de sueros para ensayar en DMEM Glutamax con FCS (suero de ternera fetal) descomplementado al 2% en tubos de 0,5 ml. Para 0,1 ml de suero diluido en DMEM Glutamax con FCS al 2%, se añadió 0,1 ml de DMEM Glutamax/FCS al 2% que contenía 100 AP61 UFF de la cepa IS-98-ST1 de virus WN. Célula de control: 0,2 ml de DMEM FCS al 0,2% Virus de control: 0,2 ml de DMEM Glutamax/FCS al 2% que contenía 100AP61 UFF de la cepa IS-98-ST1 de virus WN. 2 horas con rotación leve a 37ºC. Placas con 12 pocillos con ~ 150.000 células VERO HK por pocillo que se cultivan en monocapas durante 24 horas en DMEM Glutamax FCS al 5% 1 lavado en DMEM de las capas celulares. Añadir 0,2 ml de DMEM Glutamax/SVF al 2% Añadir 0,2 ml de una mezcla de suero/virus WN en las capas celulares. Incubar 2 horas a 37ºC en CO2. Retirar la mezcla de suero/virus WN de las capas de células infectadas. 1 lavado en DMEM de las capas de células infectadas. Añadir 1 ml de DMEM SVF al 2% por pocillo. Añadir 1 ml de CMC al 1,6% diluido en DMEM Glutamax/SVF al 2% Incubar 2 días a 37ºC en CO2.
[0233] Las placas se revelaron a través de la técnica FIA. Se determinó la última dilución de los sueros inmunes que neutraliza al menos 90 de 100 UFF del virus WN ensayados en células VERO (TNRF90: Ensayo de Neutralización por Reducción de los Focos de replicación viral al 90% (del francés Test de Neutralisation par Réduction de Foyers de replication virale à 90%)). El título de anticuerpos neutralizantes de los sueros se determinó por TNRF90.
A.12 Producción de pseudo-partículas de virus WN por la línea celular MEF/3T3.Tet-Off/pr ME.WN #h2.
[0234] Se secretaron pseudo-partículas de la cepa IS-98-ST1 del virus WN compuestas por glicoproteínas complejadas prME por la línea MEF/3T3.Tet-Off/pr ME.WN #h2 inducida para la expresión de proteínas virales (CNCM I-3018). Se purificaron de los sobrenadantes de cultivo celular de 3 días de acuerdo con el protocolo usado para la purificación del virus WN.
[0235] Ensayo de seroprotección pasiva contra el virus WN en ratones BALB/c adultos. El Janvier breeding Center proporcionó ratones BALB/c de 6 semanas de edad. La dosis para el ensayo viral es de 100 ap61 UFF, es decir, 10 DL 50 (Tomoshi et al. 2002) diluida en 100 !l de DPBS suplementado con BSA (albúmina sérica bovina) al 0,2% pH 7.5 (Sigma) que se inocula por vía intraperitoneal. El tiempo promedio para el efecto letal fue 10 días. Los animales se observaron durante 2 a 3 semanas. Los sueros a ensayar para seroprotección pasiva en ratones se diluyen en DPBS al 0,1%/BSA al 0,2% y se inoculan 24 horas antes del ensayo viral.
B) Resultados y conclusiones
B1. Producción de virus recombinante del sarampión que expresa sE de WN
[0236] Se insertó el ADNc que codifica la proteína E de la cepa IS-98-ST1 de WNV con su región de anclaje transmembrana delecionada en el genoma del virus del sarampión (cepa Schwarz) de acuerdo con la Figura 13.
B.2. Ensayos preliminares de seroprotección pasiva contra el virus WN en ratones
[0237] Los sueros inmunes anti-WN a ensayar se obtuvieron de ratones genéticamente resistentes a la enfermedad (52). Los sueros anti-WN, recién tomados, se inyectaron a diluciones 1:10 (16 TNRF90) y 1:40 (4 TNRF90) en un volumen final de 0,1 ml de DPBS/SAB al 0,2% por vía intraperitoneal en ratones BALB/c adultos
genéticamente sensibles.
[0238] Los anticuerpos se administraron solamente 24 horas antes del ensayo viral o 24 horas antes y 24 horas después del ensayo con 10 DL50 de la cepa IS-98-ST1 del virus WN. El control negativo fue la inyección de suero 5 normal en ratones a 1:10. La neurovirulencia del virus WN se devaluó en ratones ensayados con DPBS/SAB al 0,2%. Los resultados de protección pasiva después de dos semanas de ensayos virales son los siguientes:
Tabla 1: Seroprotección pasiva contra encefalitis por WNV en ratones BALB/c adultos. Transferencia pasiva Mortalidad MDOD* PBS/BSA (0,2%) 6\6 10,5 (±1,5) suero normal (1:10) 6\6 12,5 (±1,5) suero anti-WNV (1:10), 2 dosis** 0\6 NA suero anti-WNV (1:40), 2 dosis 0\6 NA suero anti-WNV (1:10), 1 dosis*** 1\6 12 suero anti-WNV (1:40), 1 dosis 0\6 NA (*Día medio de muerte ± SD) (**Día -1 y día +1 de exposición al virus) (*** Día -1 de exposición al virus)
10 [0239] Para concluir, una única inyección de anticuerpos anti-WN (2,5 a 10 !l de suero) obtenidos de ratones genéticamente resistentes al virus WN, realizándose dicha inyección por vía intraperitoneal en ratones adultos sensibles a encefalitis vírica, proporciona protección pasiva contra una dosis de ensayo.
[0240] Se observa que los sueros de ratones BALB/c que han recibido anticuerpos protectores anti-WN y
15 resistentes a infección vírica tienen títulos de anticuerpos anti-WN por ELISA que son de aproximadamente 1 unidad DO (para una dilución de suero de 1:100) después de un mes de ensayo. Esto indica que el virus WN inoculado para el ensayo ha conseguido replicarse en ratones protegidos, induciendo una respuesta humoral. Si la seroprotección pasiva protege contra la encefalitis letal debida al virus WN, no parece ser apropiada para prevenir la propagación vírica en individuos infectados.
B.3. Vacunación de ratones CD46+/-IFN-a/1R-/- con virus MV/WN sE
[0241] Se obtuvieron ratones susceptibles a infección MV como se ha descrito previamente [Mrkic, 1998 (21)]. Se cruzaron ratones FVB heterocigóticos para el transgén del receptor de CD46 de MV [Yannoutsos, 1996 (32)] con
25 ratones 129Sv IFN-a/1R-/- [Muller, 1994 (22)]. La descendencia F1 se exploró por PCR y se cruzaron los animales CD46+/- de nuevo con ratones 129Sv IFN-a/1R-/-. Se seleccionaron los animales IFN-a/1R-/- CD46+/-y se usaron para experimentos de inmunización. Se inocularon ratones CD46+/-IFN-a/1R-/- de seis semanas de edad por vía intraperitoneal con una única dosis de vacuna convencional contra MV (106 DICT50, 3 ratones) o virus recombinante MV-WN sE (104 o 106 DICT50, 6 ratones por dosis) en 300 !l de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
30 [0242] Se ha recogido un suero del ojo después de un mes de vacunación con una única dosis para determinar la producción de anticuerpos anti-MV, anti-E de WN y neutralizantes contra el virus de ensayo.
b) Sueros diluidos a 1:100 y ensayados para anticuerpos por ELISA sobre virión NV purificado, para: 35
[0243]
unidad DO Fluido ascítico de ratones anti-WN: 1 (control +) Suero de ratones anti-WN: 0,8 (control +)
40 Suero de ratones vacunados con MV: 0,110 ± 0,005 Suero de ratones vacunados con MV/WN sE, 104 DCIP50: 0,635 ± 0,040 (machos) Suero de ratones vacunados con MV/WN sE, 104 DCIP50: 0,815 ± 0,005 (hembras) Suero de ratones vacunados con MV/WN sE, 106 DCIP50: 0,800 ± 0,200 (machos) Suero de ratones vacunados con MV/WN sE, 106 DCIP50: 0,900 ± 0,195 (hembras)
45 c) Ensayo de seroneutralización in vitro para WNV en células VERO.
[0244]
50 TNRF90 de combinaciones de sueros en 100 AP61UFF de la cepa IS-98-ST1 del virus WN en células VERO:
TNRF90 Suero de ratones vacunados con MV: < 10 Suero de ratones vacunados con MV MV-WN sE, 104 DCIP50: 400 Suero de ratones vacunados con MV MV-WN sE, 106 DCIP50: 800
[0245] Para concluir, los anticuerpos dirigidos contra la glicoproteína E soluble del virus WN tienen la capacidad de neutralizar la cepa IS-98-ST1 usada para el ensayo por virus WN en ratones in vitro.
[0246] Se ha realizado un refuerzo de vacuna en ratones CD46+/-IFN-a/1R-/- inmunizados 1 mes después de empezar la vacunación con una dosis única, idéntica a la dosis de la primera inyección.
[0247] Después de 2 semanas de refuerzo, se ensayaron los sueros por ELISA y en TNRF90 como anteriormente: a) Sueros diluidos a 1:100 y ensayados para anticuerpos por ELISA sobre virión de WN purificado:
unidad DO Fluido ascítico de ratones anti-WN: 1,4 (control +) Suero de ratones anti-WN: 1 (control +) Suero de ratones vacunados con MV: 0,110 ± 0,005 Suero de ratones vacunados con MV/WN sE, 104 DCIP50: 0,810 ± 0,100 (machos) Suero de ratones vacunados con MV/WN sE, 104 DCIP50: 1,150 ± 0,015 (hembras) Suero de ratones vacunados con MV/WN sE, 106 DCIP50: 0,965 ± 0,230 (machos) Suero de ratones vacunados con MV/WN sE, 106 DCIP50: 1,075 ± 0,240 (hembras)
b) Ensayo de seroneutralización in vitro en células VERO
[0248] TNRF90 de combinaciones de sueros en 100 AP61UFF de la cepa IS-98-ST1 del virus WN en células VERO:
TNRF90 Suero de ratones reforzados con MV: < 10 Suero de ratones reforzados con MV-WN sE, 104 DCIP50: > 1600 Suero de ratones reforzados con MV-WN sE, 106 DCIP50: > 1600
[0249] Después de 4 semanas de refuerzo, se ensayaron los sueros por ELISA y en TNRF90 como anteriormente:
a) Sueros diluidos a 1:100 y ensayados para anticuerpos por ELISA sobre virión de WN purificado:
unidad DO Fluido ascítico de ratones anti-WN: 1,7 (control +) Suero de ratones anti-WN: 1,2 (control +) Suero de ratones vacunados con MV: 0,2 Suero de ratones vacunados con MV/WN sE, 104 DCIP50: 1,52 (± 0,15) Suero de ratones vacunados con MV/WN sE, 106 DCIP50: 1,76 (± 0,10)
b) Seroneutralización in vitro en células VERO
[0250] TNRF90 de combinaciones de sueros en 100 AP61UFF de la cepa IS-98-ST1 del virus WN en células VERO:
TNRF90 Suero de ratones vacunados con MV-WN sE, 104 DCIP50: 4000 (machos) Suero de ratones vacunados con MV-WN sE, 104 DCIP50: 8000 (hembras) Suero de ratones vacunados con MV-WN sE, 106 DCIP50: 10000-12000
[0251] Para concluir, después de un refuerzo con una dosis única, los títulos de anticuerpos anti-WNV y los títulos de anticuerpos neutralizantes anti-WNV se aumentaron significativamente por un factor 10 o más.
[0252] Se ensayan esplenocitos de ratones CD46+/-IFN-a/1R-/- inmunizados con dos inyecciones separadas por 4 semanas con el virus MV-WN sE con dosis de 104 o 106 DCIP50 en ELISpot y citometría de flujo para la respuesta T CD4 y CD8 después de estimulación in vitro con pseudo-partículas virales purificadas en gradientes de sacarosa partiendo de sobrenadantes de la línea celular inducida MEF/3T3.Tet-Off/prME.WN #h-2 (CNCM I-3018).
B.4. Ensayo de seroprotección pasiva anti-WN en BALB/c con anticuerpos anti-E
[0253] Se han recogido los sueros inmunes de ratones CD46+/-IFN-a/1R-/- vacunados con una dosis única de virus recombinante del sarampión después de un mes. Se han inyectado diversas diluciones de estos sueros en un volumen final de 0,1 ml en ratones BALB/c de 6 semanas de edad y solamente 24 horas antes de la inoculación de 100 AP61UFF de la cepa IS-98-ST1 del virus WN (10 DL50) por vía intraperitoneal (véase el protocolo en § B2).
[0254] Los resultados de protección pasiva después de dos semanas de ensayo viral son los siguientes:
Tabla 2: MV-WN sE recombinante induce anticuerpos que proporcionan protección completa contra la encefalitis por
WNV en ratones BALB/c Transferencia pasiva Mortalidad Día PBS/BSA (0,2%) 6\6 10 a 11 suero anti-WNV (1:10), 1 dosis* 0\6 NA suero anti-WNV (1:40), 1 dosis 1\6 20 anti-MV (1:10), 1 dosis 4\6 10 a 11 anti-MV-WN sE 10e4 (1:10), 1 dosis 3\6 8 a 10 anti-MV-WN sE 10e6 (1:10), 1 dosis 0\6 NA anti-MV-WN sE 10e6 (1:40), 1 dosis 0\6 NA anti-MV-WN sE 10e6 (1:100), 1 dosis 3\6 10 a 11 (*Día -1 de exposición al virus)
[0255] Para concluir, los anticuerpos dirigidos contra la glicoproteína E soluble del virus WN tienen la capacidad de
5 proteger in vivo contra la encefalitis por el virus WN. La vacunación de ratones CD46+/-IFN-a/1R-/-con una dosis de 106 DCIP50 del virus MV-WN sE como única inyección es necesaria para inducir una respuesta humoral anti-E de WN en un periodo de tiempo de cuatro semanas que es capaz de proteger contra la enfermedad por seroprotección pasiva. Un volumen mínimo de 2,5 !l de suero inmune de ratones vacunados con virus MV-WN sE, es suficiente para proporcionar una protección completa en ratones BALB/c adultos ensayados con una dosis letal de virus WN
10 (es decir, una proporción de aproximadamente 0,1 ml de suero inmune/kg). Se observa que los sueros anti-letales diluidos a 1:10 inducen una protección parcial (aproximadamente del 30%) contra la encefalitis por el virus del Nilo occidental. Los sueros obtenidos en ratones CD46+/-IFN-a/1R-/- vacunados que después se han reforzado con una dosis débil (104 DICT50) se ensayarán para su capacidad de proporcionar protección pasiva en ratones BALB/c.
15 B.5. Ensayo viral en ratones CD46+/-IFN-a/1R-/-vacunados con MV-WN sE
[0256] Se han ensayado ratones CD46+/-IFN-a/1R-/- vacunados 2 meses después de las 2 inyecciones de 106 DCIP50 de virus MV-WN sE, realizándose estas inyecciones a intervalos de 4 semanas, con 100 AP61UFF de la cepa IS-98-ST1 del virus WN administradas por vía intraperitoneal.
20 [0257] Los 2 ratones vacunos con virus del sarampión convencional murieron el tercer día del ensayo. No se observó morbilidad o letalidad para ratones vacunados con MV-WN sE en el séptimo día del ensayo. Para concluir, los ratones CD46+/-IFN-a/1R-/- inmunizados contra gpE soluble del virus WN están protegidos contra una dosis de ensayo letal del virus WN en ausencia de actividad anti-viral de alfa-interferón.
B6. Nuevo ensayo de vacunación anti-WN con un refuerzo de antígeno
[0258] Se vacunan ratones CD46+/- IFN-a/1R-/- adultos en un periodo de tiempo de 4 semanas con virus MV-WN sE a una dosis de 104 DCIP50 que se propone para seres humanos y se realiza un refuerzo con un antígeno con
30 pseudo-partículas purificadas de virus WN que se secretan por la línea celular MEF/3T3.Tet-Off/WN prME # h2.
Bibliografía
[0259]
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Claims (28)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Virus recombinante del sarampión que expresa una secuencia heteróloga de aminoácidos de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental, siendo dicho virus recombinante del sarampión el producto de la expresión en una célula de una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una molécula de ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos del ARN antigenómico (+) de longitud completa de un virus del sarampión (MV) originaria de la cepa Schwarz, donde dicha molécula de ADNc se recombina con una secuencia heteróloga de nucleótidos que codifica una secuencia heteróloga de aminoácidos de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental, y siendo capaz dicho virus recombinante del sarampión de provocar una respuesta inmune humoral y/o a celular contra el virus del sarampión o contra dicho virus de la fiebre amarilla o virus del Nilo occidental
    o tanto contra el virus del sarampión como contra dicho virus de la fiebre amarilla o virus del Nilo occidental.
  2. 2.
    Virus recombinante del sarampión de acuerdo con la reivindicación 1, que se recupera de células auxiliares transfectadas con una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos del ARN antigenómico (+) de longitud completa del virus del sarampión, estando dicho ADNc recombinado con una secuencia heteróloga de nucleótidos que codifica una secuencia heteróloga de aminoácidos de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental, y cumpliendo dicha secuencia de nucleótidos recombinante la regla de seis.
  3. 3.
    Virus recombinante del sarampión de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde la molécula de ADNc comprende el inserto contenido en el plásmido pTM-MVSchw depositado el 12 de junio de 2002 con el Nº I-2889, donde dicho inserto codifica la secuencia de nucleótidos de la cadena de ARN antigenómico (+) de longitud completa del virus del sarampión.
  4. 4.
    Virus recombinante del sarampión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la secuencia de nucleótidos recombinante es del inserto contenido en el plásmido pTM-MVSchw2-gfp depositado el 12 de junio de 2002 con el número I-2890 (CNCM), donde la secuencia del gen gfp está sustituida por una secuencia que codifica una determinada secuencia de aminoácidos de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental.
  5. 5.
    Virus recombinante del sarampión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4, donde la molécula de ADNc se selecciona entre las siguientes secuencias:
    -
    secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 83 hasta el nucleótido 15977 de la fig. 11
    -
    secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 29 hasta el nucleótido 15977 de la fig. 11
    -
    secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 29 hasta el nucleótido 16202 de la fig. 11
    -
    secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 26 hasta el nucleótido 15977 de la fig. 11
    -
    secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 26 hasta el nucleótido 16202 de la fig. 11
    -
    secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 9 hasta el nucleótido 15977 de la fig. 11
    -
    secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 9 hasta el nucleótido 16202 de la fig. 11
  6. 6.
    Virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la secuencia de aminoácidos es de un antígeno del virus de la fiebre amarilla seleccionado entre las proteínas de envuelta (Env) o NS1 o mutantes inmunogénicos de las mismas.
  7. 7.
    Virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la secuencia de aminoácidos es de un antígeno del virus del Nilo occidental seleccionado entre la envuelta (E), la premembrana (preM) o mutantes inmunogénicos de las mismas.
  8. 8.
    Virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, capaz de inducir protección contra VLP o proteínas pM/E heterólogas.
  9. 9.
    Virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que provoca una respuesta inmune humoral y/o celular en un modelo animal susceptible al virus del sarampión.
  10. 10.
    Virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que provoca anticuerpos neutralizantes contra la secuencia heteróloga de aminoácidos en un modelo animal de mamífero susceptible al virus del sarampión.
  11. 11.
    Virus recombinante del sarampión de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, que provoca anticuerpos neutralizantes contra la secuencia heteróloga de aminoácidos en un mamífero.
  12. 12.
    Vector del virus recombinante del sarampión que comprende un replicón que comprende (i) una secuencia de ADNc que codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa de un virus del sarampión unida de forma funcional a (ii) secuencias de control de la expresión y (iii) una secuencia heteróloga de ADN que codifica una determinada secuencia heteróloga de aminoácidos de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental,
    clonándose dicha secuencia heteróloga de ADN en dicho replicón en condiciones que permiten su expresión y teniendo dicho replicón una cantidad total de nucleótidos que cumple la regla de seis, donde la secuencia de nucleótidos que comprende el ADNc resultante de la transcripción inversa del ARN antigénico de MV es originaria de la cepa Schwarz.
  13. 13.
    Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con la reivindicación 12, donde la secuencia heteróloga de ADN se clona dentro de una Unidad de Transcripción Adicional (ATU) insertada en el ADNc que codifica el ARN antigenómico de dicho virus recombinante del sarampión.
  14. 14.
    Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con la reivindicación 12, donde el sitio de clonación de la ATU se elige corriente arriba del gen N del virus MV.
  15. 15.
    Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con la reivindicación 12, donde el sitio de clonación de la ATU se elige entre los genes P y M del virus MV.
  16. 16.
    Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con la reivindicación 12, donde el sitio de clonación de la ATU está entre los genes H y L del virus MV.
  17. 17.
    Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, donde la secuencia heteróloga de ADN se expresa como una proteína de fusión con una de las proteínas de MV.
  18. 18.
    Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, donde la secuencia heteróloga de ADN no se expresa como una proteína de fusión con una de las proteínas de MV.
  19. 19.
    Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, donde el antígeno mutado posibilita la exposición de epítopos neutralizantes.
  20. 20.
    Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, donde el ADNc que codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa del virus del sarampión y la secuencia de control de la expresión son de pTM-MVSchw depositado en el CNCM con el Nº I-2889.
  21. 21.
    Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20, que es un plásmido.
  22. 22.
    Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21, donde el replicón se diseña de acuerdo con el mapa de la figura 2 donde « inserto » representa la secuencia heteróloga de ADN.
  23. 23.
    Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 22, donde la secuencia heteróloga de ADN se selecciona entre YFV17D204.
  24. 24.
    Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 22, donde la secuencia heteróloga de ADN se selecciona entre la cepa neurovirulenta IS-98-ST1.
  25. 25.
    Vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con la reivindicación 20, que se selecciona entre los siguientes vectores depositados en el CNCM
    pTM-MVSchw2-Es WNV CNCM I-3033 pTM-MVSchw2-GFPbis - CNCM I-3034 pTM-MVschw3-GFP CNCM I-3037 pTM-MVSchw2-Es YFV CNCM I-3038.
  26. 26.
    Un sistema de recuperación para el ensamblaje de virus recombinante del sarampión que expresa una secuencia heteróloga de aminoácidos de un antígeno del virus de la fiebre amarilla o el virus del Nilo occidental, que comprende una determinada célula transfectada con un vector del virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 25, y una determinada célula auxiliar recombinada con al menos un vector adecuado para la expresión de la ARN polimerasa T7 y la expresión de las proteínas N, P y L del virus del sarampión.
  27. 27.
    Una composición inmunogénica que comprende un virus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o un vector recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 25.
  28. 28.
    Una composición de vacuna que comprende un virus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o un vector recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 25.
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