CN1688702A - 表达rna病毒抗原表位的重组麻疹病毒在制备疫苗组合物中的用途 - Google Patents

表达rna病毒抗原表位的重组麻疹病毒在制备疫苗组合物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及表达来自确定的RNA病毒的抗原的异源氨基酸序列的重组麻疹病毒，所述重组麻疹病毒能够引发针对麻疹病毒或针对所述RNA病毒或针对麻疹病毒和所述RNA病毒的体液和/细胞免疫应答。本发明还涉及所述重组麻疹病毒在制备免疫原性组合物中的用途。

Description

表达RNA病毒抗原表位的重组麻疹病毒在制备疫苗组合物中的用途
本发明涉及表达RNA病毒的抗原表位的重组麻疹病毒，特别包括逆转录病毒和黄病毒，以及它们在制备疫苗组合物中的用途。
麻疹病毒是单负链病毒目(order mononegavirales)，即具有非分节负链RNA基因组(non-segmented negative-strand RNA genome)的病毒。麻疹病毒(MV)的非分节基因组具有反信息极性(antimessage polarity)，产生纯化时既不会在体内或体外被翻译，也不具有感染性的基因组RNA。
非分节(-)链RNA病毒的转录和复制以及其组装为病毒颗粒在Fields病毒学(3d edition，voL 1，1996，Lippincott-Raven publishers-Fields BNetal)中尤其有研究和报道。麻疹病毒的转录和复制不涉及感染细胞的核，而是在所述感染细胞的细胞质中发生。麻疹病毒的基因组包含编码来自六种基因的六种主要结构蛋白的基因(命名为N，P，M，F，H和L)以及另外两种来自P基因的非结构蛋白。基因的顺序如下：3′-1，N，P(包括C和V)，M，F，H，和5’端的L大聚合酶蛋白。该基因组还包含基因间区M/F中的非编码区，该非编码区包含大约未翻译的RNA的1000个核苷酸。所述基因分别编码前导肽(1基因)，病毒核壳蛋白，即核蛋白(N)，磷蛋白(P)，和大蛋白(L)(其在基因组RNA周围组装以保护核壳)。编码病毒包膜蛋白的其他基因包括血凝素(H)，融合蛋白(F)和基质蛋白(M)。
麻疹病毒已经分离并且减毒活疫苗已经由1954年分离的EdmonstonMV(Enders，J.F.，and T.C.Peebles.1954.Propagation in tissue cultures odcytopathogenic agents from patients with measles.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.86：277-286.)制得，其是通过在原代人肾细胞或羊膜细胞上连续传代而来的。所用的毒株随后接种在鸡胚纤维母细胞(CEF)上制备EdmonstonA和B的毒种(seed)(Griffin，D.，and W.Bellini.1996.Measles virus，p.1267-1312.In B.Fields，D.Knipe，et al.(ed.)，Virology，vol.2.Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia)。Edmonston B在1963年批准为第一个MV疫苗。将Edmonston A和B在CEF上进一步传代产生毒性更弱的Schwarz和Moraten病毒(Griffin，D.，and W Bellini.1996.Measlesvirus，p.1267-1312.In B.Fields，D.Knipe，et al.(ed.)，Virology，vol.2.Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia)，最近发现其序列是相同的(Parks，C.L.，R.A.Lerch，P.Walpita，H.P.Wang，M.S.Sidhu，and S.A.Udem.2001.Analysis of the noncoding regions of measles virusstrains in theEdmonston vaccine lineage.J Virol.75：921-933；Parks，C.L.，R.A.Lerch，P.Walpita，H.P.Wang，M.S.Sidhu，and S.A.Udem.200 1.Comparison ofpredicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonstonvaccine lineage.J Virol.75：910-920)。由于Edmonston B疫苗是反应原性的，在1975年放弃了该疫苗，并用Schwarz/Moraten疫苗(其是目前世界上最广泛使用的麻疹病毒疫苗)(Hilleman，M.2002.Current overview ofthe pathogenesis and prophylaxis of measles with focus on practicalimplications.Vaccine.20：651-665)取而代之。还使用多种其它疫苗株：在日本使用AIK-C、Schwarz F88、CAM70、TD97，在俄罗斯使用Leningrad-16，和Edmonston Zagreb。CAM70和TD97的中国株不是来自Edmonston。Schwarz/Moraten和AIK-C疫苗是在CEF上制备的。Zagreg疫苗是在人二倍体细胞(WI-38)上制备的。
来自Schwarz毒株的减毒活疫苗是从Aventis Pasteur(Lyon France)(商标Rouvax)购得的。
在一项引人注目的前期工作中，Martin Billeter和同事们克隆了相当于Edmonston MV反基因组(antigenome)的感染性cDNA并建立了最早并有效的反求遗传学方法(reverse genetics procedure)来拯救(rescue)相应的病毒(Radecke，F.，P.Spielhofer，H.Schneider，K.Kaelin，M.Huber，K.Dtsch，G.Christiansen，and M.Billeter.，1995.Rescue of measlesvirusesfrom cloned DNA.EMBO Journal.14：5773-5784)，和WO 97/06270。他们发展出用于表达异源基因的Edmonston载体(Radecke，F.，and M.Billeter.1997.Reverse genetics meets thenonsegmented negative-strand RNA viruses.Reviews in Medical.Virology.7：49-63.)，并证实了其具有很大的***容量(达5kb)，以及其在表达转基因中的高度稳定性(Singh，M.，andM.Billeter.1999.A recombinantmeasles virus expressing biologically active humaninterleukin-12.J.Gen.Virol.80：101-106；Singh，M.，R.Cattaneo，and M.Billeter.1999.A recombinant measles virus expressing hepatitis8 virussurface antigen induces humoral immune responses in genetically modifiedmice.J.Virol.73：4823-4828；Spielhofer，P.，T.Bachi，T.Fehr，G.Christiansen，R.Cattaneo，K.Kaelin，M.Billeter，and H.Naim.1998.Chimeric measlesviruses with a foreign envelope.J.Virol.72：2150-2159；Wang，Z.，T.Hangartner，L.Cornu，A.Martin，M.Zuniga，M.Billeter和H.Naim.2001。Recombinant measles viruses expressing heterologus antigens of mumps andsimian immunodeficiency viruses.Vaccine.19：2329-2336.)。该载体克隆自在Hela细胞中增殖的MV的Edmonston B毒株(Ballart，I.，D.Eschle，R.Cattaneo，A.Schmid，M.Metzler，J.Chan，S.Pifko-Hirst，S.A.Udem，and M.A.Billeter.1990.Infectious measles virus from cloned cDNA.Embo J.9：379-384)。
此外，表达乙肝表面抗原的重组麻疹病毒已经制备并可在遗传修饰的小鼠中诱导体液免疫反应(Singh M.R.et al，1999，J.virol.73：4823-4828)。
MV疫苗单次低剂量注射后，诱导非常有效的终生免疫(104 TCID50)(33，34)。保护作用是由抗体和CD4+以及CD8+T细胞介导的。MV基因组非常稳定，并且从未观察到该疫苗恢复致病性。MV只在细胞质中复制，排除了在宿主DNA中整合的可能。此外，还建立了对应MV的Edmonston毒株的反基因组的感染性cDNA克隆以及拯救相应病毒的方法(35)。该cDNA被导入载体内以表达异源基因(36)。它还可容纳达5 kb的异源基因，并且在遗传上非常稳定(37，38，39)。
从对麻疹病毒的性质，尤其是其在体内引发高滴度的中和抗体的能力，以及其作为长时间持续免疫反应的有效诱导物的适合性这些观察来看，本发明人认为其可能是制备包含表达抗原肽或确定的RNA病毒多肽的重组感染性病毒的组合物的良好候选物，所述确定的RNA病毒尤其包括逆转录病毒或黄病毒，以诱导针对所述RNA病毒，尤其是所述逆转录病毒或黄病毒的中和抗体，所述抗体优选适宜在动物体内更优选在人宿主体内获得一定程度的对所述RNA病毒(尤其是逆转录病毒或黄病毒)的抵抗力。特别地，MV株尤其是疫苗株可以在本发明中选出，作为候选载体在暴露的婴儿群体中诱导针对麻疹病毒和RNA病毒(其组分在设计的重组MV中表达)的免疫，这是因为婴儿群体没有对MV的免疫力。成人群体，甚至已经经过MV免疫的个体，仍可从MV重组免疫中获益，这是因为本发明可增强抗MV抗体。
在目的逆转录病毒中，本发明人选择了AIDS逆转录病毒，包括HIV-1以及在黄病毒(其是重要的人病原)中进行选择，例如黄热病病毒(YFV)和西尼罗河病毒(WNV)。
YFV和WNV属于黄病毒属，如Fields病毒学所述(第3版，vol.1，1996，Lippincott-Raven publishers-Fields BN等)。
本发明涉及表达异源氨基酸序列的重组单负链病毒，所述重组病毒能够引发针对所述异源氨基酸序列的体液和/或细胞免疫反应，包括在已经具有麻疹病毒免疫力的个体中也如此。
在第一个实施方案中，本发明尤其提供了能表达抗原的重组麻疹病毒，尤其是来自包括逆转录病毒或黄病毒的抗原的表位。
本发明还涉及核酸构建体，尤其是表达重组麻疹病毒并表达逆转录病毒或黄病毒抗原或表位的重组核酸构建体。
本发明还涉及制备这种重组麻疹病毒的方法，尤其涉及这种重组MV在拯救***中的制备。
本发明还涉及一种组合物，其包含所述重组麻疹病毒作为保护宿主，尤其是人宿主的活性成分，其针对涉及所述逆转录病毒(尤其是AIDS逆转录病毒)或所述黄病毒(尤其是黄热病病毒或西尼罗河病毒)的感染的疾病。
麻疹病毒的核酸序列已经在国际专利申请WO 98/13501中公开，尤其是15,894个核苷酸的DNA序列，其对应多种野生型疫苗麻疹毒株的信使有义RNA的正链(反基因组的(antigenomic))的DNA拷贝，包括Edmonston野生型毒株，Moraten毒株和Schwarz毒株(Schwarz毒株除在核苷酸位置4917和4924具有C而不是T以外，其与Moraten相同)。
为制备重组麻疹病毒，发展出Edmonston MV毒株的拯救***，其描述见国际专利申请WO 97/06270。WO 97/06270中对所述拯救***的描述在此并入作为参考，并且尤其参考该国际申请的实施例部分，包括涉及以下内容的实施例：细胞和病毒，产生细胞系293-3-46，质粒构建体，转染质粒构建体并收获报道基因产物，拯救MV的实验设置，稳定表达MV的N和P蛋白的辅助细胞，以及T7 RNA聚合酶，使用辅助细胞293-3-46拯救MV以及被拯救的MV的表征。
WO 97/06270公开的拯救***还进一步发展包括Parks C.L.etal，1999，J.virol.73：3560-3566中所述的热休克步骤。这一增强的麻疹病毒cDNA拯救***的公开内容包含在文中作为参考。
本发明还涉及表达来自一种确定的RNA病毒(尤其是来自逆转录病毒或黄病毒)抗原的异源氨基酸序列的重组麻疹病毒，其中所述重组麻疹病毒能够引发针对麻疹病毒和/或针对所述RNA病毒(尤其是逆转录病毒或黄病毒)的体液和/或细胞免疫反应。
异源氨基酸序列的表达针对不源自麻疹病毒抗原的氨基酸序列，其中所述异源氨基酸序列相应地来自RNA病毒，尤其是来自目的逆转录病毒或黄病毒，从而在宿主尤其是人中产生免疫反应，优选对所述RNA病毒尤其是逆转录病毒或黄病毒的感染产生保护作用。
本发明重组麻疹病毒中表达的异源多肽能够引发确定宿主针对该多肽来源的RNA病毒尤其是逆转录病毒或黄病毒产生体液和/或细胞免疫应答。相应地，该氨基酸序列包含至少一个抗原表位，尤其是保守的表位，其天然暴露于抗原上或者由于抗原突变或修饰或重组而获得或暴露。
用于制备重组麻疹病毒的抗原尤其是RNA病毒例如逆转录病毒或黄病毒的包膜抗原，尤其是来自包括HIV-1的AIDS病毒的包膜或黄热病病毒包膜或西尼罗河病毒包膜。其它逆转录病毒或黄病毒抗原可优选使用以衍生出能够引发针对所述逆转录病毒或黄病毒的抗体的重组麻疹病毒，而且本发明的一个具体实施方案涉及抗原，其衍生可引发针对逆转录病毒或黄病毒的中和抗体的制备的氨基酸序列。根据本发明的另一实施方案，这些抗原的氨基酸序列可选或此外还引发针对逆转录病毒或黄病毒的细胞免疫反应。
优选，本发明的重组麻疹病毒还引发针对麻疹病毒的体液和/或细胞免疫反应。如果真正获得了对RNA病毒尤其是逆转录病毒或黄病毒的免疫应答，该反应不是必需的。
根据本发明优选的实施方案，本发明的重组麻疹病毒在用于制备感染性麻疹病毒的拯救***中获得。因此，所述重组麻疹病毒是从拯救***中回收的被拯救的感染性麻疹病毒。
本发明具体的重组麻疹病毒来自麻疹病毒Edmonston毒株。
本发明另一具体并优选的重组麻疹病毒来自Schwarz毒株，并特别来自许可的疫苗Schwarz毒株，例如商标为Rouvax的毒株，其获自Aventis Pasteur(法国)。
本发明因此提供从编码麻疹病毒反基因组RNA((+)链)的cDNA所转染的辅助细胞中回收的重组麻疹病毒，所述cDNA与编码RNA病毒特别是逆转录病毒或黄病毒的异源氨基酸序列进行重组。
上述定义中的术语“编码”指cDNA对全长反基因组(+)RNA进行转录的能力，所述cDNA具体作为转录的模板。因此，该cDNA是双链分子，其中的一条链具有的核苷酸序列与麻疹病毒反基因组(+)链RNA相比，cDNA中用T取代了麻疹病毒反基因组(+)链RNA中的U，其余部分二者相同。这种cDNA例如相应于麻疹病毒的***子，其包含在质粒pTM-MVSchw中，该质粒于2002年6月12日以编号I-2889保藏在CNCM巴黎，法国。所述质粒见图2A。
用于描述本发明分子的核苷酸序列的术语“cDNA”仅指最初所述的分子是通过对麻疹病毒的病毒颗粒的全长基因组(-)RNA进行反转录而获得的这一事实。
这不应理解为限制用于制备它的方法。本发明术语“cDNA”因此包括，具有上述定义的核苷酸序列的DNA。纯化的核酸，包括DNA包含在本发明cDNA的含义中，只要所述核酸尤其是DNA满足上述定义。
当所述cDNA与编码目的异源氨基酸序列的核苷酸序列(异源核苷酸序列)重组时，拯救***的辅助细胞由包含编码麻疹病毒全长反基因组(+)RNA的cDNA的转录载体转染，且如果辅助功能包括能使麻疹病毒反式激活蛋白例如N、P、和L蛋白表达并使得RNA聚合酶表达以对重组cDNA进行转录和使相应病毒RNA复制，所述辅助细胞进一步由一或多种表达载体转染。
本发明尤其涉及携带HIV逆转录病毒表位的重组麻疹病毒的制备。其特别包括重组麻疹病毒，该病毒表达来自HIV包膜抗原的异源氨基酸序列，特别是来自HIV-1包膜蛋白或糖蛋白的异源氨基酸序列。
本发明的目的抗原具体是HIV-1的gp160、gp120和gp41，或HIV-1的gp140、GAG或TAT。
本发明的具体实施方案中，所述异源氨基酸序列来自HIV-1的重组gp160、gp120或HIV-1的重组gp140、GAG或TAT。
本发明尤其涉及重组麻疹病毒，其中gp120(或gp160)抗原的V1，V2和/或V3环都单独或联合地缺失或部分缺失，使得保守表位暴露于获得的重组gp120抗原上。
HIV-1的gp120(或gp160)抗原的V1，V2和V3环在Fields病毒学中特别公开  (Fields B.N.etal-Lippincott Raven publishers 1996，p.1953-1977)。
根据本发明另一实施方案，重组麻疹病毒表达来自HIV-1的gp120(或gp160)抗原的异源氨基酸序列，其中所述gp120(或gp160)的V1、V2或V3环单独或联合被取代或部分取代，使得保守表位暴露于获得的重组gp120(或gp160)抗原上。
根据另一具体实施方案，表达来自HIV-1包膜抗原的异源DNA序列的重组麻疹病毒源自gp120抗原，其中V1和V2环被缺失而且V3环被序列AAELDKWASAA取代。
根据本发明另一具体实施方案，重组麻疹病毒表达选自gp160ΔV3，gp160ΔV1V2，gp160ΔV1V2V3，gp140ΔV3，gp140ΔV1V2，gp140ΔV1V2V3的异源氨基酸序列，如图1所示。
本发明还涉及上述内容所定义的重组麻疹病毒，其中所述氨基酸序列来自黄热病病毒抗原，其选自包膜(Env)或者NS1蛋白或其免疫原性突变体。
本发明还涉及上述内容所定义的重组麻疹病毒，其中所述氨基酸序列来自西尼罗河病毒抗原，其选自包膜(E)，未成熟膜(preM)或其免疫原性突变体。
本发明还涉及重组麻疹病毒或病毒样颗粒(VLP)，其表达免疫反应所针对的双或多重组抗原，尤其是多HIV抗原(包括其片段)或黄病毒抗原。这种重组麻疹病毒或VLP可优选表达来自不同病毒的抗原，并因此提供针对各种病毒的免疫原。
本发明还涉及上述定义之一的重组麻疹病毒，其中表达病毒颗粒所需的cDNA包含在EdB-tag病毒载体中或优选包含在pTM-MVSchw载体中，所述cDNA与图8的ATU序列或者图2C所示的ATU序列重组，所述ATU被***EdB-tag载体或pTM-MVSchw载体中，利用病毒基因组梯度，使得编码***所述ATU的异源氨基酸序列的转基因序列的以各种水平进行表达。所述***优选为将这种异源DNA序列***命名为附加转录单位(ATU)的序列中，尤其是Billeter等在WO 97/06270中公开的ATU。
本发明重组麻疹病毒的优选免疫特性可以在动物模型中显示，所述动物选自对麻疹病毒敏感的动物，并且再所述动物中检测到针对异源抗原和/或麻疹病毒的体液和/或细胞免疫反应。
在适宜用作定性免疫反应的模型的这些动物中，本领域熟练技术人员特别使用小鼠，并特别是对麻疹病毒敏感的重组小鼠，或者在猴子中。
在本发明优选的实施方案中，本发明的重组麻疹病毒适合在对麻疹病毒敏感的哺乳动物模型中引发针对异源氨基酸序列的中和抗体。特别地，该包含引发中和抗体的免疫反应可见于重组小鼠或猴子中。
根据本发明另一具体实施方式，特别是当所述异源氨基酸序列来自HIV-1的包膜蛋白之一，且其引发能够中和原代HIV分离株的抗体时，所述反应优选在指示细胞例如获自NIH的P4-CCR5细胞(NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program)上进行检测(Chameau P.etal-1994-J.Mol.Biol.241：651-662)。
根据另一优选实施方案，本发明的重组麻疹病毒引发哺乳动物体内针对异源氨基酸序列的中和抗体，ELISA检测其滴度至少1/40000，中和滴度至少1/20。
本发明还涉及包含一种复制子的重组麻疹病毒核苷酸序列，所述复制子包含(i)编码麻疹病毒全长反基因组(+)RNA的cDNA，所述cDNA与(ii)表达控制序列可操作地相连，以及(iii)编码一种确定的异源氨基酸序列的异源DNA序列，所述异源DNA序列被克隆在所述复制子中以使其能够表达而又不干扰所述cDNA序列的转录和复制，所述复制子具有的总核苷酸数目是6的倍数。
具体的cDNA序列是图11所示Schwarz毒株的cDNA序列。这种cDNA可以从pTM-MVSchw获得。pTM-MVSchw是来自含有麻疹病毒疫苗株Schwarz的完整序列的Bluescript，在T7 RNA聚合酶启动子的控制下。其大小是18967nt。
本发明还涉及包含上述定义的重组麻疹病毒核苷酸序列的重组麻疹病毒载体。
6倍规则(The rule of six)在来自麻疹病毒反基因组RNA反转录的cDNA序列的重组产生的重组cDNA中的总核苷酸数目这一事实中体现，且异源DNA序列最后的核苷酸总数是6的倍数，这一规则使得麻疹病毒基因组RNA有效复制。
上述定义的优选重组麻疹病毒载体是异源DNA病毒载体，其中异源DNA序列克隆到附加转录单位(ATU)中，所述ATU***对应麻疹病毒反基因组RNA的cDNA中。
附加转录单位(ATU)在图2A中公开，并可进行修饰，条件是其最终能使载体中获得的复制子遵守6倍规则。
ATU在源自麻疹病毒反基因组RNA的cDNA的位置可在所述cDNA上改变。但其位置使其从麻疹病毒表达梯度中获益。
根据模板3’末端相关基因的位置，该梯度对应mRNA的丰度。因此，当聚合酶对模板(基因组或反基因组RNA或相应的cDNA)进行操作时，其从上游基因合成的RNA比从下游基因合成的多。麻疹病毒mRNA丰度的这一梯度却相对缓和。因此，ATU或任何适宜异源DNA序列克隆的***位点可以沿cDNA分布，***位点的优选实施方案并特别是在ATU中是***序列的N末端部分且特别是在麻疹病毒的L基因上游区域，优选在所述病毒的M基因上游，更优选在所述病毒N基因上游。
根据表达位点和异源DNA的表达控制，本发明的载体使得异源氨基酸序列表达为与麻疹病毒蛋白之一的融合蛋白。
可选地，DNA序列***麻疹病毒cDNA的位点使得异源DNA表达异源氨基酸序列，但其形式不是与麻疹病毒蛋白之一的融合蛋白。
任何优选定义的重组麻疹病毒优选含有异源DNA序列，其编码逆转录病毒，黄病毒的氨基酸序列。
举例而言，该氨基酸序列来自选自HIV逆转录病毒或黄病毒的逆转录病毒的抗原，尤其是来自黄热病病毒或西尼罗河病毒的抗原。
本发明的具体实施方案中，重组麻疹病毒载体编码的异源氨基酸序列来自HIV的包膜抗原，尤其是来自HIV-1。
在优选的实施方案中，异源DNA序列编码的氨基酸序列选自HIV-1的gp160、gp120或gp41，或HIV-1的gp140，或所述抗原的突变体。
本发明的重组麻疹病毒载体表达的结果是引发针对该载体编码的异源氨基酸序列的免疫反应，尤其是体液和/或细胞免疫反应，优选所用异源DNA序列编码能够显示所述载体产生的表达产物上中和表位。
在具体实施方案中，所表达的异源氨基酸序列可以将不可接近的表位或者不在该异源氨基酸所来源的天然抗原中形成的表位暴露。在本发明优选的实施方案中，所述异源DNA序列编码gp160ΔV3，gp160ΔV1V2，gp160ΔV1V2V3，gp140ΔV3，gp140ΔV1V2，gp140ΔV1V2V3。
图1中具体公开了异源氨基酸序列，并可根据已知方法从抗原的序列或获自不同HIV-1分离株的相应DNA序列开始制备所述异源氨基酸序列。
根据本发明优选的实施方案，重组麻疹病毒载体的设计使得由含有编码麻疹病毒(来自适合接种疫苗的麻疹病毒株)全长反基因组(+)RNA的DNA转染或转化的辅助细胞中产生的颗粒，能产生用作免疫原性组合物的病毒颗粒，优选保护性甚至疫苗组合物。
在用于接种的麻疹病毒株中，其中一种为Edmonston B毒株和Schwarz毒株，后一种更优选并由Aventis Pasteur(法国，里昂)公司作为经批准的麻疹病毒疫苗毒株进行销售。
Edmonston B.毒株和Schwarz毒株的核苷酸序列在WO 98/13505中公开。
为制备本发明的重组麻疹病毒载体，本发明人设计了质粒pTM-MVSchw，其含有由麻疹病毒反基因组RNA反转录产生的cDNA，以及包含T7聚合酶启动子和终止子的适合的表达控制序列。
本发明的重组麻疹病毒载体优选是质粒。
优选的载体是得自Edmonston B.毒株的核苷酸序列的载体(2002年6月12日保藏)，具体是：
pMV2(EdB)gp160[delta]V3HIV89.6P        CNCM I-2883
pMV2(EdB)gp160HIV89.6P                 CNCM I-2884
pMV2(EdB)gp140HIV89.6P                 CNCM I-2885
pMV3(EdB)gp140[delta]V3HIV89.6P        CNCM I-2886
pMV2(EdB)-NS1YFV17D                    CNCM I-2887
pMV2(EdB)-EnvYFV17D                    CNCM I-2888。
其它优选载体是得自Schwarz毒株的核苷酸序列的载体(于2003年5月26日保藏在CNCM)，具体是：
pTM-MVSchw2-Es(WNV)                    CNCM I-3033
pTM-MVSchw2-GFPbis-                    CNCM I-3034
pTM-MVSchw2-p17p24[delta]myr(HIVB)     CNCM I-3035
pTM-MVSchw3-Tat(HIV89.6p)              CNCM I-3036
pTM-MVschw3-GFP                        CNCM I-3037
pTM-MVSchw2-Es(YFV)                    CNCM I-3038和
于2003年6月19日保藏在CNCM的载体：
pTM-MVSchw2-gp140[delta]V1 V2 V3(HIV89.6)CNCM I-3054
pTM-MVSchw2-gp140[delta]V3(HIV89.6)        CNCM I-3055
pTM-MVSchw2-gp160[delta]V1V2V3(HIV89.6)    CNCM I-3056
pTM-MVSchw2-gp160[delta]V1V2(HIV89.6)      CNCM I-3057
pTM-MVSchw2-GagSIV239p17-p24[delta]myr-3-gp140(HIV89.6)
                                            CNCM I-3058。
I-2883(pMV2(EdB)gp160[delta]V3HIV89.6P)是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Edmonston毒株B)的完整序列(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并含有***ATU位置2(麻疹病毒的N和P基因之间)的SVIH病毒株89.6P的gp160ΔV3+ELDKWAS的基因。该质粒的大小为21264nt。
I-2884(pMV2(EdB)gp160HIV89.6P)是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Edmonston毒株B)的完整序列(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并含有***ATU位置2(麻疹病毒的N和P基因之间)的SVIH病毒株89.6P的gp160的基因。该质粒的大小为21658nt。
I-2885(pMV2(EdB)gp140HIV89.6P)是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Edmonston毒株B)的完整序列(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并含有***ATU位置2(麻疹病毒的N和P基因之间)的SVIH病毒株89.6P的gp140的基因。该质粒的大小为21094nt。
I-2886(pMV3(EdB)gp140[delta]V3HIV89.6P)是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Edmonston毒株B)的完整序列(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并含有***ATU位置2(麻疹病毒的N和P基因之间)的SVIH病毒株89.6P的gp140ΔV3(ELDKWAS)的基因。该质粒的大小为21058nt。
I-2887(pMV2(EdB)-NS1YFV17D)是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Edmonston毒株B)的完整序列(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并含有***ATU位置2(麻疹病毒的N和P基因之间)的黄热病病毒(YFV 17D)的NS1基因。该质粒的大小为20163nt。
I-2888(pMV2(EdB)-EnvYFV17D)是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Edmonston毒株B)的完整序列(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并含有***ATU位置2(麻疹病毒的N和P基因之间)的黄热病病毒(YFV 17D)的Env基因。该质粒的大小为20505nt。
I-3033(pTM-MVSchw2-Es(WNV)是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Schwarz毒株)的完整感染基因组(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并表达***ATU的西尼罗河病毒(WNV)的分泌性包膜(E)基因。
I-3034(pTM-MVSchw2-GFPbis)是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Schwarz毒株)的完整感染基因组(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并表达***ATU的GFP基因。
I-3035(pTM-MVSchw2-p17p24[delta]myr(HIVB)是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Schwarz毒株)的完整感染基因组(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并表达***ATU的编码HIVB病毒的p17p24Amyr蛋白的gag基因的基因。
I-3036(pTMVSchw3-TatHIV89.6p)是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Schwarz毒株)的完整感染基因组的cDNA序列(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并表达***ATU的病毒株89.6P的Tat基因的基因。
I-3037(pTM-MVSchw3-GFP)是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Schwarz毒株)的完整感染基因组的cDNA序列(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并表达***ATU且缺失一个核苷酸的GFP基因的基因。
I-3038(pTM-MVSchw2-Es)(YFV)是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Schwarz毒株)的完整感染基因组的cDNA序列(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并表达***ATU的黄热病病毒(YFV)的分泌性蛋白的基因。
I-3054(pTM-MVSchw2-gp140[delta]V1V2V3(HIV89.6))是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Schwarz毒株)的完整感染基因组的cDNA序列(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并表达***ATU的编码gp140[delta]V1V2(HIV 89.6)的基因。
I-3055(pTM-MVSchw2-gp140[delta]V3(HIV89.6))是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Schwarz毒株)的完整感染基因组的cDNA序列(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并表达***ATU的编码gp14[delta]V3(HIV 89.6)的基因。
I-3056(pTM-MVSchw2-gp160[delta]V1V2V3(HIV89.6))是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Schwarz毒株)的完整感染基因组的cDNA序列(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并表达***ATU的编码gp160[delta]V1V2V3(HIV 89.6)的基因。
I-3057(pTM-MVSchw2-gp160[delta]V1V2(HIV89.6))是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Schwarz毒株)的完整感染基因组的cDNA序列(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并表达***ATU的编码gp160[delta]V1V2(HIV 89.6)的基因。
I-3058(pTM-MVSchw2-GagSIV239p17-p24[delta]myr-3-gp140(HIV89.6))是来自Bluescript的质粒，其含有麻疹病毒(Schwarz毒株)的完整感染基因组的cDNA序列(在T7 RNA聚合酶启动子的控制下)，并表达***ATU的编码Gag SIV239 p17-p24[delta]myr-3-gp140(HIV89.6)的基因。
在本发明具体的实施方案中，包含在重组麻疹病毒载体中的复制子是根据图2设计的，其中“***子”代表异源DNA序列。
当存在于本发明的重组麻疹病毒载体中的异源DNA序列来自黄热病病毒(YFV)时，其优选选自由Aventis Pasteur销售的商标为Stamaril的YFV17D 204。
当存在于本发明的重组麻疹病毒载体中的异源DNA序列来自西尼罗河病毒(WNV)时，其优选选自神经毒性株(neurovirulente strain)IS98-ST1。
本发明还涉及用于组装表达异源氨基酸序列的重组麻疹病毒的拯救***，其包含确定的辅助细胞，所述辅助细胞与至少一种适合表达T7RNA聚合酶和表达用上述任何定义中的重组麻疹病毒载体转染的麻疹病毒的N、P和L蛋白的载体进行重组。
本发明的重组病毒或VLP可通过例如MV的减毒活疫苗在体内制备。
本发明的重组病毒或VLP可用于免疫原性组合物中或用于疫苗组合物中，以防御RNA病毒(其抗原在重组病毒或VLP中表达)，如以上内容公开和以下实施例所示。
本发明特别提供了用作对抗HIV病毒，西尼罗河病毒或黄热病病毒的有用疫苗组合物的免疫原性组合物。
本发明还涉及公开的重组病毒或VLP或重组载体的用途，其用于制备免疫原性组合物或用于制备疫苗组合物。
本发明还涉及针对所述重组病毒或针对所述VLP的抗体，特别是保护性抗体和中和抗体。所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明的重组病毒或VLP可以和任何适当的可用于制备免疫原性组合物的佐剂或载体相连。
本发明的各方面将在附图以后的实施例中以及附图中显示。
附图说明
图1.HIV1 Env糖蛋白的构建体。(A)gp160构建体的全长和ΔV3-AAELDKWASAA、ΔV1V2以及ΔV1V2V3突变体(自上而下)。用于将ΔV3缺失导入其它构建体的Bbsl和Mfel限制位点被标出。(B)除了gp41的细胞质内区和跨膜区被缺失以外，gp140构建体与gp160相同。
图2A.pTM-MV Schw质粒图示。为构建完整序列，产生图中上半部分表示的六个片段，并使用显示的独特限制位点逐步重组。T7＝T7启动子；hh＝锤头核酶；hAv＝丁型肝炎核酶(＝δ)；T7t＝T7 RNA聚合酶终止子。δ
图2B.具有ATU的pMV(+)载体，其在位置2和位置3中含有绿色荧光蛋白(GFP)。MV基因表示为：N(核蛋白)，PVC(磷蛋白和VC蛋白)，M(基质)，F(融合)，H(血凝素)，L(聚合酶)。T7：T7 RNA聚合酶启动子；T7t：T7 RNA聚合酶终止子；δ：丁型肝炎病毒(HDV)核酶；ATU：附加转录单位。
图2C.ATU序列：小写字母代表附加序列(麻疹病毒N-P基因间区的拷贝)和克隆位点。大写字母对应***的增强GFP序列。该序列被***麻疹病毒Schwarz毒株的cDNA序列的Spel位点(位置3373)作为ATU2，并***Spel位点(位置9174)作为ATU3。区分正常ATU和bis(在pTM-MVSchw2-gfp和pTM-MVSchw2-GFPbis中)的突变是在ATU末端被替代的C(大写字母)。
图3(A)：显示ENVHIV89.6表达与第2和5代相似，证实了该***的转基因表达的稳定性。
图3(B)：表达HIV-1抗原的Schwarz麻疹病毒(MVSchw)的构建。(I-3054到I-3058)。重组pTM-MVSchw中HIV抗原的表达。
图3BA：重组pTM-MVSchw中HIV包膜糖蛋白的表达。Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)用不同的重组病毒感染48小时，并通过Western印迹检测HIV Env的表达。细胞裂解物各30μg溶解于4-12％SDS-PAGE，将印迹转移到硝化纤维素膜上，并用小鼠单克隆抗HIV gp120(Chessie，NIH)抗体检测。抗小鼠IgG RPO缀合物用作第二抗体，并用ECL检测试剂盒检测蛋白。
图3BB：(1)双重组pTM-MVSchw2-Gag-3gp140构建体
构建了一些表达两种不同异源抗原的重组载体。通过将两种不同重组pTM-MVSchw质粒偶联获得，所述质粒的位置2和位置3中含有的不同***子。显示了质粒pTM-MVSchw2-Gag-3-gp140。从该质粒拯救同时表达Gag和gp140的重组病毒(图3BB(2)Western印迹)。使用不同的***异源基因的适宜构建体，例如表达两种异源病毒蛋白的重组MV，可产生在感染细胞中组装并分泌的“病毒样颗粒(VLP)”：来自逆转录病毒的Gag-Env或来自黄病毒的prM/E。所述VLP是很好的免疫原。通过例如MV这样的减毒活疫苗在体内产生的VLP应更具免疫原性。
(2)HIV-1 gp140和SIV239 Gag在重组pTM-MVSchw2-Gagsgv(p17-p24[delta]myr)-3-gp140HIV中的表达。HIVgp140和SIV Gag在感染的Vero细胞裂解物中检测到。(A)小鼠单克隆抗HIV gp120和(B)来自SlVmac251感染的猕猴的血清。
图3C：HIV-1 Gag(p17-p24Δmyr)在重组pTM-MVSchw2-GagHav(p17-p24[delta]myr)中的表达。HIV Gag用小鼠单克隆抗HIV Gag抗体在感染的Vero细胞裂解物中检测到。
图3D：HIV-1 Tat蛋白在重组pTMMVSchw中的表达。Vero细胞用MVSchw-Tat HIV重组物或对照MVSchw病毒感染48小时，并通过Western印迹检测HIV Tat的表达。细胞裂解物各30μg溶解于4-12％SDS-PAGE，将印迹转移到硝化纤维素膜上，并用小鼠单克隆抗HIV Tat(BH10，NIH)抗体检测。抗小鼠IgG RPO缀合物用作第二抗体，并用ECL检测试剂盒检测蛋白。
图4.Vero细胞上重组MvEdB-EnvHlv病毒生长的动力学。35mm培养皿上的细胞用不同MOI(如所示)的重组病毒感染。在每个时间点，收集细胞并使用TCID 50法在Vero细胞上检测结合细胞的病毒滴度。(A)用MV EdB-tag以及MOI＝0.0001的不同MV-HIV进行感染。(B)用MV2-gp160HIV以不同MOI(0.0001和0.01)进行感染。
图5.用重组MVEdB-EnvHIV病毒接种的小鼠中的抗HIV和抗MV体液免疫反应。A-B使用107TCID50的各种MV-HIV重组病毒免疫4组(每组3只)小鼠。使用ELISA法测定接种后28天收集的血清中抗MV(A)和抗HIV Env(B)抗体的滴度。C-F：MV-EnvHIV病毒免疫的IFNAR-/-/CD46+/-小鼠中的抗-HIV和抗MV抗体滴度。(C)注射剂量渐增的MVEdB-gp160(每组3只小鼠)后28天检测到的抗MV和抗HIV滴度。(D)注射5 106TCID50的MV-EnvHIV病毒后28天检测到的抗MV(黑柱)，抗HIV(灰柱)和抗ELDKWAS(白柱)(每组6只小鼠)。结果处理为均值±SD。
图6.对用MV2-gp140HIV89.6和MV2-gp160HIV89.6病毒免疫的小鼠血清中对Bx08的中和活性。原代分离株Bx08由C.Moog(Strasbourg，France)提供，并在PHA刺激的PBMC上繁殖一次以获得病毒株。在37℃将2ng病毒与小鼠血清各25μl(感染后一个月收集)共同温育30分钟，然后在96孔板中感染P4R5细胞。随后在含有10％胎牛血清的DMEM中培养细胞直到感染后两天，并于此时用化学发光试验(Roche，Germany)测定β-半乳糖苷酶活性。道1：MVEdB-Tag免疫的小鼠的血清；道2：MV2-gp140HIV-1免疫的小鼠的血清；道3：MV2-gp160HIV-1免疫的小鼠的血清；道4：未感染的细胞。所有实验都重复三次。
图7.Edm-HIV Env候选疫苗在体内刺激的env特异性淋巴细胞。两组小鼠(每组3只)用107TCID50的MV2 gp160HIV病毒接种，并在接种后七天以及一个月对其进行安乐死术。(A)对来自免疫后小鼠的脾细胞进行ELISpot实验。并用HIV-gp120纯化蛋白(黑)或无关BVA(白)进行刺激。(B)免疫后7天收集脾细胞，并单独使用培养基(图左侧)，HIVgp120(图中部)或EdB-tag病毒(图右侧)进行刺激。三色细胞荧光计检测到HIV gp120和麻疹病毒刺激后产生γ-IFN的CD8+(图上部)和CD4+(图下部)淋巴细胞。根据总CD8+(图上部)和CD4+(图下部)淋巴细胞门(gates)分别给出百分比。
图7C、D.MV引发后数月MV2-gp140HIV89.6病毒免疫的小鼠和猕猴中抗MV和抗HIV抗体滴度。(C)小鼠(3只每组)用105TCID50的EdB-taq MV接种，随后用如图所示(箭头)的5 106 TCID50的MV2-gp140HIV89.6病毒接种两次。(D)Cynomolgus恒河猴(#432和404)用Rouvax接种，随后用如图所示(箭头)的5 106 TCID50的MV2-gp140HIV89.6病毒接种两次。
图8.附加转录单位(ATU)和Schwarz MV载体质粒的图示。(A)***磷蛋白(P)和基质(M)MV开放阅读框架之间的位置2的ATU顺式作用元件。(B)Schwarz MV载体质粒中的三个ATU***位点。
图9.重组MV表达的YFV蛋白。使用重组EdB-EnvYFV和EdB-NS1YFV MV以MOI为0.01感染Vero细胞。使用小鼠多克隆抗YFV血清和Cy3二级抗小鼠IgG抗体进行免疫荧光。在感染的Vero细胞中观察到的所有合胞体都是阳性的。
图10.YFV攻击。使用EdB-EnvYFv和EdB-NS1yFv病毒(107TCID50)的混合物接种6只4周大的小鼠，并且使用相等剂量的标准EdB-tag病毒接种6只对照小鼠。1个月后，测定血清抗MV，并且在两组中观察到相似水平的抗体。攻击小鼠，并观察死亡率。
图11.pTM-MVSchw质粒(CNCM I-2889)的完整序列。该序列可参照核苷酸位置作如下描述：
-1-8          Notl限制位点
-9-28         T7启动子
-29-82        锤头核酶
-83-15976     MV Schwarz反基因组
-15977-16202  HDV核酶和T7终止子
-16203-16210  Notl限制位点
-16211-16216  Apal限制位点
-16220-16226  Kpnl限制位点
-16226-18967  pBluescript KS(+)质粒(Stratagene)
图12：在MV中表达的黄病毒序列如下：
图12A：YFV Env seq：这是发明人克隆的Env YFV 17D204序列。
1-3位          起始密码子
4-51位         Env信号肽
52-1455位      Env序列
1456-1458位    终止密码子
已加入了终止和起始密码子。
图12B：YFV NS1 seq：这是发明人克隆的NS1 YFV 17D204序列。
1-3位          起始密码子
4-78位         NS1信号肽
79-1110位      NS1序列
1111-1113位    终止密码子
已加入了终止和起始密码子。
图12C：WNV Env seq：这是发明人克隆的Env WNV序列。
1-3位          起始密码子
4-51位         env信号肽
52-1485位      Env序列
1486-1488位    终止密码子
已加入了终止和起始密码子。
图12D：WNV NS1 seq：这是发明人克隆的NS1 WNV序列。
1-3位          起始密码子
4-78位         NS1信号肽
79-1104位      NS1序列
1105-1107位    终止密码子
1108-1110位    终止密码子(根据6的倍数规则已加入了第二终止密码子。)
已加入了终止和起始密码子。
图13：重组pTM-MVSchw-sEWNV的图示。MV基因为：N(核蛋白)，PVC(磷蛋白和V、C蛋白)，M(基质)，F(融合蛋白)，H(血凝素)，L(聚合酶)。T7：T7 RNA聚合酶启动子；T7t：T7 RNA聚合酶终止子；δ：丁型肝炎病毒(HDV)核酶；ATU：附加转录单位。
拯救以后，重组病毒在单层Vero细胞上生长。制备重组病毒的方法与用于制备减毒活麻疹疫苗的标准方法相似，但没有进行冻干。
WNV sE在MV-WN sE病毒感染的Vero细胞中的表达可通过使用间接免疫荧光实验检验，如图14所示。
图14：MV诱导的合胞体中sE蛋白从WNV的表达。
对Vero细胞中重组MV-WN sE诱导的合胞体中分泌的WNV Env(sE)蛋白进行的免疫荧光检测。(A、B)在重组MV诱导的合胞体的整个外表面检测到的sE蛋白。(C、D)在重组MV诱导的合胞体中的细胞内sE蛋白。
图15：首次注射后一个月后的抗MV血清学。
图16：实施例2举例说明的用来***质粒pTM-MVSchw2中的HIV-1免疫原性序列。
实施例
实施例1：表达HIV1分化体B的天然包膜糖蛋白或者表达缺失可变环的包膜的重组麻疹病毒诱导体液和细胞免疫应答
制备具有很强的逃避宿主免疫应答能力的HIV疫苗疫苗无疑是艰巨的任务。然而，我们对于感染的免疫发病机理的了解以及已经由动物模型获得的结果表明，制备上述疫苗是可能的(Mascola，J.R.，and G.J.Nabel.2001.Vaccines for prevention of HIV-1 disease.Immunology.13：489-495)。理想地，预防性免疫应诱导1)中和原代分离株的抗体，从而预防其进入宿主细胞，和2)消除那些仍然被感染了的细胞的CTL。抗体和CTL应针对对于病毒进入宿主细胞并在其中复制很重要的保守表位。
多项研究，尤其是对各种候选疫苗的研究，显示良好的细胞免疫应答可以控制病毒负荷，尽管不能消除它(the agent)(Mascola，J.R.，and G.J.Nabel.2001.Vaccines for prevention of HIV-1 disease.Immunology.13：489-495)。另一方面，目前由亚单位疫苗诱导的体液免疫应答已经是令人失望的，主要是由于所诱导的抗体不能中和HIV的原代分离株。例如，表达SIV Env的重组疫苗能保护猕猴免受同源攻击，但不能保护其免受异源攻击(Hu，S.，etal 1996.Recombinant subunit Vaccines as an approachto study correlates of protection against primate lentivirus infection.Immunology Letters.51：115-119)。DNA免疫联合用可溶的重组gp进行加强，可以保护猕猴免受异源攻击，但只针对与该疫苗遗传相关的毒株(Boyer，J.等1997.Protection of chimpanzees from high-doseheterologousHIV-1 challenge by DNA vaccination.Nature Medicine.3：526-532)。最近，各种引发-加强(prime-boost)方案，其利用裸露DNA和病毒载体例如MVA的组合(Amara，R.等2001.Control of amucosalchallenge and prevention of AIDS by a multiproteinDNAIMVA疫苗.Science.292：69-74)或腺病毒(Shiver，J.W.，等2002.Replication-incompetentadenoviralVaccine vector elicits effective anti-immunodeficiency-virusimmunity.Nature.415：331-335)，对病原性SHIV89.6P的攻击有合理的保护作用。引发-强化可能不是绝对需要的，这是由于使用重组减毒活脊髓灰质炎病毒保护猕猴免受SIV251的攻击(Crotty，S.，等2001.Protectionagainst simian immunodeficiency virus vaginal challenge by using Sabinpoliovirus vectors.J Virol.75：7435-7452)。有趣的是，在所有这些试验中，既便当不能保护动物免受感染时，免疫也可使得临床疾病的延缓甚或消失。
如结晶学所示，gp120的V1和V2环覆盖(mask)CD4结合位点，且V3环覆盖CXCR4和CCR5共同受体的结合位点(Kwong，P.D.，.etal 2000.Structures of HIV-1 gp120 envelope glycoproteins from laboratory-adaptedand primary isolates.Structure Fold Des.8：1329-1339；Kwong，P.D.等1998.Structure of an HIVgp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4receptor and a neutralizing human antibody.Nature.393：648-659；Kwong，P.D.，等2000.Oligomeric modeling and electrostatic analysis of the gp120envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus.J Virol.74：1961-1972)。尽管如此，gp120 CD4结合位点的抗体存在于HIV血清阳性个体的血清中，并且在体外实验中能中和多种HIV-1分离株(Burton，D.1997.A vaccine for HIV type 1：the antibody perspective.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America.94：10018-10023；Hoffman，T.L etal.，1999.Stable exposure of thecoreceptor-binding site in aCD4-independent HIV-1 envelope protein.ProcNatl Acad Sci U S A.96：6359-6364)。包埋在糖蛋白三维结构中，但在与共同受体结合以后被暴露的一些表位还可诱导高度中和性抗体(Muster，T.，etal 1993.A conserved neutralizing epitope on gp41 of humanimmunodeficiency virus type 1.J Virol.67：6642-6647)。此外，中和性单克隆抗体已经从病人的B细胞中获得(Parren，P.W.等1997.Relevance ofthe antibody response against human immunodeficiency virus type 1 envelopeto vaccine design.Immunol Lett 57：105-112)。它们针对gp4线形表位(2F5)(Muster，T.F.等，1993.A conserved neutralizing epitope on gp41 of humanimmunodeficiency virus type 1.J Virol.67：6642-6647)，或者针对gp120构象表位(2G12，17b，48db12)(Thali，M等1993.Characterization ofconserved human immunodeficiency virus type 1 gp 120 neutralizationepitopes exposed upon gp120-CD4 binding.J Virol.67：3978-3988；Trkola A等，1996.Human monoclonal antibody 2G12 defined a distinctiveneutralization epitope on the gp120 glycoprotein of human immunodeficiencyvirus type 1.J Virol.70：1100-1108)。协同使用它们可中和体内的多种原代分离株(Mascola J R等1997，Potent and synergistic neutralization ofhuman immunodeficiency virus(HIV)type 1 primary isolates byhyperimmune anti-HIV immunoglobulin combined with monoclonalantibodies 2F5 and 2G12.J Virol.71：7198-7206)并保护猕猴免受SHIV对粘膜的攻击(Baba，T W等，2000.Human neutralizing monoclonalantibodies of the IgG1 subtype protect against mucosal simian-humanimmunodeficiency virus infection.Nat Med 6：200-206；Mascola J R等，1999.Protection of Macaques against pathogenic simian/humanimmunodeficiency virus 89.6PD by passive transfer of neutralizing antibodies.J Virol 73：4009-4018；Mascola J R等，2000.Protection of macaques againstvaginal transmission of a pathogenic HIV-1/SIV chimeric virus by passiveinfusion of neutralizing antibodies.Nat Med.6：207-210)。然而，在感染的人中，所有这些抗体以非常低的量存在，稀释于大量主要针对抗体可变V1，V2和V3 gp120环的非中和抗体中。因此，希望如果可诱导高水平的这种交叉中和(cross-neutralizing)抗体，可以获得至少一定程度的保护。主要目的是设计有利于产生这种中和抗体的载体。
为此，我们通过单独缺失高变V1，V2和V3环或者联合暴露保守表位并诱导能够中和原代分离株的抗体来改造突变gp160(锚定的)和gp140(可溶的)。在一些构建体中，我们还用AAELDKWASAA序列(特别是通过两侧翼各有两个丙氨酸的ELDKWAS序列)取代了V3环，以保持该gp41保守表位(保持通常包埋于天然蛋白但能够诱导广谱中和抗体)的构象(Muster，T.，Fat al 1993.A conserved neutralizing epitope on gp41 ofhuman immunodeficiency virus type 1.J Virol.67：6642-6647；Binley，J.M.，等2000.A recombinant human immunodeficiency virus typel envelopeglycoprotein complex stabilized by an intermolecular disulfide bond betweenthe gp120 and gp41 subunits is an antigenic mimic of the trimericvirion-associated structure.J Virol.74：627-643；Sanders，R.W.，等2000.Variable-loop-deleted variants of the humanimmunodeficiency virus type 1envelope glycoprotein can be stabilized by an intermolecular disulfide bondbetween the gp120 and gp41 subunits.J Virol.74：5091-5100)。该肽的正常α螺旋结构在暴露于所述构建体中缺失V3环的尖端时是保守的。这些结构(其中“免疫诱饵(immunological decoys)”已经消除，并且中和表位已经暴露)应是诱导强中和抗体应答的良好候选物。
HIV gp结构已经导入麻疹疫苗载体，因为它诱导非常高滴度(1/80,000)的中和型抗麻疹抗体。(这可能是因为它在大量不同类型细胞中复制)。因此人们可期待，针对改造的HIV gp的抗体应答也是强的。此外，麻疹疫苗还是长期持续细胞应答的强诱导物。将重组疫苗在单次注入CD46+/-IFN-α/β_R-/-小鼠中后，所述疫苗诱导交叉中和抗体以及细胞免疫应答。此外，它们还诱针对具有预存在的抗MV免疫力的小鼠和猕猴体内的HIV的免疫应答。
构建突变HIV-1包膜糖蛋白。
本研究所用包膜糖蛋白(图1)来自SHIV89.6P，即在SlVmac239背景下含有HIV1的tat，rev，vpu和env基因的嵌合猴/人免疫缺陷病毒(Reimann，K.A.，等1996.A chimeric simian/human immunodeficiency virusexpressing a primary patient human immunodeficiency virus type 1 isolateenv causes an AIDS-like disease after in vivo passage in rhesus monkeys.JVirol.70：6922-6928)。Env基因来自致细胞病变的原代HIV1分离株，89.6，其对巨噬细胞和T细胞具有向性(Collman，R.，etal 1992.An infectiousmolecular clone of an unusual macrophage-tropic and highly cytopathic strainof human immunodeficiency virus type 1.J Virol.66：7517-7521)。env序列扩增自原始病毒体内传代后克隆的质粒dpSHIV-KB9(NIH)(Karlsson，G.B.，等1997.Characterization of molecularly cloned simian-humanimmunodeficiency viruses causing rapid CD4+ lymphocyte depletion inrhesus monkeys.J Virol.71：4218-4225)。全长env(gp160)使用含有独特BsiWI和BssHII位点(用于随后克隆到麻疹病毒载体中)的引物通过PCR(Pfu聚合酶)进行扩增：160E5(5′-TATCGTACGATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3′)和160E3(5′ATAGCGCGCATCACAAGAGAGTGAGCTCAA-3′)。对应分泌形式(gp140)的env序列使用引物160E5和140E3(5′-TATGCGCGCTTATCTTATATACCACAGCCAGT-3′)扩增。将起始和终止密码子加在基因两端，并在终止密码子后加入几个核苷酸以符合“6倍规则”，保证MV基因组的核苷酸数目一定是6的倍数(Calain，P.，and L.Roux.1993.The rule of six，a basic feature for efficient replication of Sendaivirus defective interfering RNA.J Virol.67：4822-4830；Schneider，H.，etal1997.Recombinant measles viruses defective for RNA editing and Vproteinsynthesis are viable in cultured cells.Virology.227：314-322)。gp160和gp140env片段都克隆在pCR2.1-TOPO质粒(Invitrogen)中，并对其进行测序以核实没有导入突变。
具有环缺失的突变体通过对两个侧接待缺失序列的重叠片段进行PCR扩增并通过PCR将这些片段退火而产生。为使用含有gp41表位的AAELDKWASAA序列来取代V3序列(Muster，T.，F.等1993.A conservedneutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1.JVirol67：6642-6647)，在Bbsl和Mfel位点的两端设计了四个包含V3序列的引物：ΔV3A1(5′-ATAAGACATTCAATGGATCAGGAC-3′)，ΔV3A2(5′ TGCCCATTTATCCAATTCTGCAGCATTGTTGTTGGGTCTTGTACAATT-3′)，ΔV3B1(5′- GATAAATGGGCAAGTGCTGCAAGACAAGCACATTGTAACATTGT-3′)，和ΔV3B2(5′-CTACTCCTATTGGTTCAATTCTTA-3′)。ΔV3A2和ΔV3B1中加下划线的序列对应具有12个核苷酸重叠的AAELDKWASAA表位。使用引物对ΔV3A1/ΔV3A2和ΔV3B1/ΔV3B2进行PCR扩增分别产生两个218和499bp的片段。凝胶纯化后，这些片段通过15个PCR循环(无引物)退火，并使用ΔV3A1/ΔV3B2引物扩增。产生的705bp的片段克隆在pCR2.1-TOPO质粒中并进行测序。由Bbsl和Mfel消化后，纯化缺乏编码V3环(ΔV3-AAELDKWASAA)的序列的片段，并将其导入pCR2.1-TOPO质粒的gp160和gp140中相应片段的位置。
产生的质粒命名为pMV2-gp160ΔV3和pMV2-gp140ΔV3。
ΔV1V2突变体用同样的方法获得。在V1V2环两端使用以下引物扩增两个片段：160E5 (5′-TAT CGTACGATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3′)，ΔV1V2A1(5′- ATTTAAAGTAACACAGAGTG GGGTTAATTT-3′)，ΔV1V2B1(5′- GTTACTTTAAATTGTAACACCTCAGTCATTACACAGGCCTGT-3′)，ΔV1V2B2(5′-TTGCATAAAATGCTCTCCCTGGTCCTATAG-3′)。ΔV1V2A1和ΔV1V2B1中加下划线的序列对应在这两个片段之间产生的12个核苷酸的重叠。使用引物对160E5/ΔV1V2A1和ΔV1V2B1/ΔV1V2B2进行PCR扩增分别产生两个400和366bp的片段。凝胶纯化后，这些片段通过15个PCR循环(无引物)退火，并使用160E5/ΔV1V2B2引物扩增。产生的766bp的片段克隆在pCR2.1-TOPO质粒中并进行测序。由BsiWI(160E5引物中)和BbsI消化后，纯化缺乏编码V1V2环的序列的片段，并将其导入pCR2.1-TOPO质粒的gp160和gp140中相应片段的位置。
为获得ΔV1V2V3突变体，将缺乏编码V1V2环的序列的BsiWI/BbsI片段导入pCR2.1-TOPO-gp140ΔV3和pCR2.1-TOPO-gp160ΔV3质粒中的相应片段。
使用BsiWI/BssHII消化不同的pCR2.1-TOPO质粒后，天然和突变gp160和gp140序列克隆到EdB-tag载体的ATU位置2和ATU位置3(图2B)中。产生的质粒命名为pMV2-gp160HIV，pMV2-gp140HIV。
细胞保持在Dubelbecco′s改良Eagle′s培养基中(DMEM)，所述培养基中加入5％胎牛血清(FCS)培养Vero细胞(非洲绿猴肾)，或加入10％FCS，1mg/ml G418培养辅助293-3-46细胞(35)和培养P4-CCR5细胞(Hela-CD4-CXCR4-CCR5-HIVLTR-LacZ)(12)。
回收重组MVEdB-EnvHIV89.6病毒。
为从质粒中回收重组MVEdB-EnvHIV89.6病毒，使用不同的EdB-HIVEnv质粒来转染293-3-46辅助细胞。
为从EdB-HIV-Env质粒cDNA中回收麻疹病毒，我们使用Radecke描述的基于辅助细胞的拯救***(Radecke，F.，等1995.Rescue of measlesviruses from cloned DNA.EMBO Journal.14：5773-5784)and modified byParks etal.(Parks，C.L.，et al 1999.Enhanced measles viruscDNA rescue andgene expression after heat shock.J Virol.73：3560-3566)。稳定表达T7 RNA聚合酶和麻疹N及P蛋白的人辅助细胞(293-3-46细胞，Radecke等公开)使用磷酸钙法与EdB-HIV-Env质粒(5ug)和表达MV聚合酶L基因的质粒(pEMC-La，20ng，Radecke等公开)共转染。将转染后的293-3-46辅助细胞与原代Vero(非洲绿猴肾)细胞在37℃共培养后拯救所述病毒。在这种情况下，共培养2天后，在所有转染中都***地出现了合胞体。
在进一步的实验中(图3C-D)，细胞在37℃共培养过夜后，在43℃于新鲜培养基(40)中对所述细胞进行热休克3小时。热休克后的细胞在37℃温育两天，随后转染到70％满底的Vero细胞层(10cm Peri皿)。共培养2-5天后，Vero细胞中出现合胞体。收集单合胞体(single syncytia)并转染到在35mm孔中生长的Vero细胞中。被转染的细胞在75和150cm3的烧瓶中扩增。当合胞体达到80-90％满底时，将细胞转移到小体积的OptiMEM(Gibco BRL)中，并冷冻-解冻一次。离心后，含有病毒的上清保存在-80℃。
重组MV表达HIV1糖蛋白。
拯救的重组病毒MV2-gp140、MV2-gp160、MV3-gp140ΔV3和MV2-gp160ΔV3在Vero细胞中增殖并且通过western印迹和免疫荧光分析HIV Env糖蛋白的表达。重组MV2病毒(在位置2具有转基因)对Vero细胞的感染显示HIV Env gp160和gp140的高表达。也检测到切割的重组Env蛋白(gp120)。MV3病毒(在位置3具有转基因)表达低水平的转基因，这是由于MV表达中观察到的转录梯度导致的。总体来看，这些结果表明，HIV1 Env糖蛋白和ΔV3突变体由重组MV有效地表达。
病毒滴度。重组MV的滴度通过对Vero细胞进行终点有限稀释实验而测定。50％组织培养物感染剂量(TCID50)使用Krber法计算。
MVEdB-EnvHIV89.6重组病毒的生长能力。
为分析MVEdB-EnvHIV89.6病毒的生长能力，以不同MOI(0.01和0.0001)感染Vero细胞，在37℃温育，并在不同的时间点收集。每个样品的细胞结合的病毒的滴度使用TCID50法在Vero细胞上测定。图4显示使用0.0001的MOI时，与标准MVEdB-tag相比，MVEdB-EnvHIV89.6病毒的生长动力学被延迟。然而，使用0.01的MOI时，重组病毒的产生与标准病毒相当，并且容易获得107TCID50/ml或更高的滴度。
具体地，以MOI为0.05的重组病毒感染Vero细胞单层(T-25烧瓶)。当合胞体达80-90％满底时，细胞溶解于150mM NaCI，50mM Tris pH＝8，1％NP40，0.5mM PMSF和0.2mg/ml Pefabloc(Interbiotech，France)中。通过离心去除染色质，并使用Bradford实验测定上清中的蛋白浓度。蛋白(50μg)通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分级，并转移到纤维素膜(Amersham Pharmacia Biotech)。所述印迹使用小鼠单克隆抗-HIV gp120抗体(Chessie 13-39.1，NIH-AIDS Research &Reference Reagent Program)或使用单克隆抗-MV N抗体(Chemicon，Temecula，USA)检测。山羊抗小鼠IgG抗体-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(Amersham)用作第二抗体。过氧化物酶活性通过增强的化学发光检测试剂盒(Pierce)显示。
小鼠免疫
对MV感染敏感的小鼠如上述获得(21)。将转基因FVB小鼠的CD46杂合子(32)，MV疫苗株(24)的受体与缺乏I型干扰素受体(22)的129sv IFN-α/βR-/-小鼠杂交。通过PCR筛选F1子代，并将CD46+/-动物再次与129sv IFN-α/βR-/-小鼠杂交。筛选IFN-α/βR-/-CD46+/-动物，并将其用于免疫实验。同类型小鼠已经显示对MV感染敏感(20，21)。
6周大雌性CD46+/-IFN-α/βR-/-小鼠用滴度的107TCID50的MV2-gp140，MV2-gp160，MV3-gp140ΔV3或MV2-gp160ΔV3重组病毒(如上制备并测定)接种。感染后七天和一个月对小鼠进行安乐死。收集脾和全血。从脾中提取脾细胞，并在液氮中冷冻直到使用时。倾析血清并通过ELISA分析MV(Trinity Biotech，USA)和HIV(Sanofi Diagnostics，France)的血清学。
猴免疫
两群群体喂养的恒河猴(two colony-bred Macaca mulattos)(猴D型逆转录病毒，猴T-细胞嗜淋巴细胞病毒，猴免疫缺陷病毒和MV血清阴性)同时用104TCID50的MV疫苗(Rouvax，Aventis Pasteur，France)免疫。一年后通过注入两次(间隔一个月)5 106TCID50的MV2-gp140重组病毒进行加强。在不同时间点收集血样，并寻找抗MV和抗HIV抗体。
对拯救的重组病毒的体液免疫应答。
第一个实验
通过ELISA分析采集自免疫后一个月的小鼠的血清中针对MV和HIV Env的体液免疫应答。通过限制性稀释测定滴度。图5的结果显示所有免疫过的小鼠都对麻疹病毒产生高滴度抗体(1/50000-1/80000)并对HIV Env产生滴度为1/1000和1/5000的抗体(根据***的序列而不同)。由于所用ELISA不具有相同的敏感性，无法比较MV和HIV之间的抗体滴度。MV ELISA(Trinity Biotech，USA)检测了对所有MV蛋白的总体应答，而HIV ELISA(Sanofi Diagnostics)只检测了抗HIV Env抗体。这些血清中和原代HIV分化体B分离株的能力使用指示细胞P4R5检测，所述指示细胞被HIV(HeLa-CD4-CXCR4-CCR5-HIV LTR-LacZ细胞)感染时，其表达β-半乳糖苷酶。在预备实验中，我们检测了用表达天然包膜糖蛋白(MV-gp160HIV-1或MVEdB-gp140HIV89.6)的重组MV-HIV病毒小鼠的血清。结果显示，当以1/20进行稀释时，这些血清对原代分离株Bx08具有70-50％的中和活性(图6)。针对遗传工程化的Env分子引发的血清的中和活性目前正在研究。
第二个实验
在另一实验(图5C-F)中，免疫后一个月采集血清，并进行热灭活。抗-MV(Trinity Biotech，USA)和抗-HIV Env(Sanofi Diagnostic Pasteur，Biorad，France)抗体用商品ELISA试剂盒检测。抗小鼠抗体-HRP缀合物(Amersham)用作第二抗体。通过有限稀释(limiting dilution)测定滴度，并计算为血清最高稀释度(为对照血清混合物的1/100稀释度时的两倍)。使用相同的ELISA试剂盒检测猕猴血清。抗猴IgG二级抗体用于检测抗HIV抗体。抗HIV抗体用抗人IgG检测以便能够用MV ELISA试剂盒中提供的标准值来校准实验。它们以mIU/ml表达。来自阴性猴的5个样品的混合物用作阴性对照。抗-ELDKAS抗体的滴度通过ELISA用以ELDKWAS生物素标记的ELDKWAS肽(Neosystem，5μg/ml在NaHCO32M，Na2CO3·H2O 2M中，pH9.6)包被的96孔NeutrAvidin板(Pierce)进行测定。来自标准MV免疫的小鼠的血清用作阴性对照。肽结合的抗体用抗小鼠抗体-HRP缀合物检测。
HIV-1中和试验。对SHIV89.6p(A.M.Aubertin，UniversitéLouisPasteur，Strasbourg，H.Fleury，Bordeaux，France)，92US660，92US714，92HT593(NIH-AIDS Research & Reference Reagent Program)，和分化体A原代分离株：3253(G.Pancino，Institut Pasteur，Paris)进行血清中和实验。这些病毒在PHA-刺激的人PBMC上的增殖已有描述(42)。HIV-1中和实验使用P4-CCR5指示细胞系进行(43)。P4-CCR5细胞种于96孔板(20000细胞/孔)并在37℃在DMEM，10％FCS中温育24h。培养基用100NIDMEM，10％FCS，DEAE葡聚糖(100μg/ml)置换，并在37℃保温细胞30分钟。病毒(0.5ir 1ng p24)与血清稀释液在50μl PBS在37℃一同保温20分钟，并将病毒-血清混合物加入细胞中，平行三次进行。温育48小时后，使用化学发光受体基因分析仪(Chemiluminescence ReporterGene Assay)(Roche，USA)检测β-半乳糖苷酶活性。
对拯救的重组病毒的细胞免疫应答
来自免疫后小鼠的脾细胞在体内刺激后分泌α-IFN的能力通过流式细胞仪和ELISpot分析检测。来自免疫后小鼠的冷冻细胞在功能试验后18小时解冻，并在补充了10％56℃热处理后的FCS(Gibco)和10U rh-IL2(Boehringer Mannheim)的RPMI培养基中温育。通过锥虫蓝排除法(trypan-blue exclusion)评估细胞生存力。
为进行γ-IFN ELISpot实验，使用捕获(capture)抗小鼠γ-IFN(R4-6A2，Pharmingen)在PBS溶液(6μg/ml)中包被Multiscreen-HA 96孔板。在4℃温育过夜后，使用PBS洗涤各孔4次。余下的蛋白结合位点通过将细胞和100μl RPMI/FCS 10％在37℃共同保温1小时而封闭。加入细胞悬液(100μl)前，立即取出培养基。来自免疫后小鼠的脾细胞以5.105细胞/孔双份置于RPMI中。伴刀豆球蛋白A(Concanavalin A)(5ug/ml，Sigma)用作阳性对照，而RPMI/IL2(10U/ml)作为阴性对照。细胞用1μg/ml HIV1 gp120，1ug/ml BSA(Sigma)，或Edm-Tag病毒(MOI＝1)刺激。在37℃保温2小时以进行病毒吸收后，加热的-FCS(10μl)加入每孔(10％终浓度)并在37℃保温所述板24-36h。为除去细胞，用PBS洗板两次，用含0.05％Tween 20(Sigma)的PBS洗板四次，然后再用PBS洗板两次。为进行检测，将生物素标记的抗小鼠γ-IFN抗体(XMG1.2，Pharmingen)加入各孔(100μl，4μg/ml，PBS-0.1％FCS中)。在室温保温2h后，使用PBS-0.1％tween 20洗板4次，并用PBS洗板2次。加入链霉抗生物素-碱性磷酸酶(AP)缀合物(Roche)(100p1，1/2000稀释于PBS)并在室温保温1-2小时。用PBS-0.1％Tween 20洗涤4次并用PBS洗涤2次以除去酶。随后用BCIP/NBT显色底物(Promega)(AP缓冲液pH9.5(1M Tris，1.5M NaCI，0.05MMgCl2)中)显示印迹点。由肉眼检测孔内的印迹形成：温育15-30分钟后，反应通过在流动自来水下洗涤而终止。在室温染色至少过夜后，有颜色的印迹用自动图像分析***ELISpot计数仪(Bio-Sys)计数。
对于流式细胞仪分析，5 105脾细胞(稀释于100μl RPMI)在V型底的96孔板中用1μg/ml HIV1 gp120蛋白(AbCys)(RPMI/IL2(10U/ml)中)，或EdB-tag病毒(MOI＝1)(稀释于100μl RPMI/IL2)刺激。非刺激的对照细胞和RPMI/IL2(10U/ml)一同温育。37℃温育2h以进行病毒吸收后，将10μl FCS加入各孔(10％终浓度)并在37℃保温该板过夜。随后用150μl RPMI-10％FCS(含10U rh-IL2和10μg/ml Brefeldin A(Sigma))置换培养基。细胞在37℃保温4小时，收集后用抗小鼠CD8-APC(Pharmingen)和抗小鼠CD4-CyCr(Pharmingen)在室温染色20分钟，用PBS-BSA(0.5％)洗涤，然后在37℃在CytoFix(Pharmingen)中固定5分钟。洗涤后，将细胞重悬于100μl PBS-BSA(0.5％)(含0.1％皂角苷(Sigma))，并在室温与抗小鼠γ-IFN-PE(Pharmingen)保温30分钟。再洗涤细胞，并用FACSCalibur细胞计数器(Becton Dickinson)分析样品。使用Cell Quest软件分析数据。
重组MV表达HIV89.6 Env糖蛋白并有效复制。
锚定的(anchored)(gp160)和可溶(gp140)形式的HIV Env糖蛋白(毒株SHIV89.6p)，其具有或不具有V3环缺失以及额外ELDKWAS表位的***，被***p(+)MV载体的ATU之一(图2)。将所述质粒转染到293-3-46辅助细胞系并在Vero细胞中增殖以后获得重组病毒MV2-gp140，MV2-gp160，MV3-gp140ΔV3和MV2-gp160ΔV3。MV2-和MV3-指***位点，分别为EnvHIV89.6结构的位置2或3。EnvHIV89.6蛋白的表达通过对感染后细胞裂解物进行western印迹(图3)和免疫荧光(未显示)进行分析。MV2-gp140和MV2-gp160病毒显示高EnvHIV89.6蛋白表达水平(图3C，泳道1，2，4)。如预期那样，MV2-gp160Δ病毒表达env gp160前体以及切割后的gp120蛋白(图.3C，泳道2，4)。反之，MV2-gp140和MV3-gp140ΔV3病毒只表达分泌的，非切割的gp140形式。如预期那样，MV3-gp140ΔV3病毒表达转基因水平比MV2系列的病毒略低，这是由于在MV表达中观察到的转录梯度(图3C，泳道3)。总的来看，这些结果表明EnvHIV89.6和ΔV3突变体有效表达并正确成熟。重组MV在Vero细胞上传代5次，并且将转基因的表达水平与MV核蛋白的表达水平相比较。图3显示EnvHIv89.6的表达与第2和5代相似，证实了转基因在该***中表达的稳定性。
MV-EnvHIV89.6重组病毒的生长使用0.0001或0.01的MOI在Vero细胞上分析。与从p+(MV)拯救的标准EdB-tag MV相比，重组病毒的生长略微延迟。表达分泌的gp140的病毒比表达固定gp160的病毒受的影响小。gp140ΔV3重组体与对照MV的生长速率相同。对表达固定gp160的病毒观察到的延迟可能由于较大的转基因造成的复制率较低，或者由于gp160在感染细胞表面的***导致的MV出芽减少。然而，重组病毒的最终产量与对照MV相当，且通常获得大约106-107TCID50/ml的峰值滴度。
在敏感小鼠中诱导对重组MV的体液免疫。
MV-EnVHIV89.6病毒的免疫原性在遗传修饰的小鼠中检测，所述小鼠表达人CD46 MV受体并缺乏I型IFN受体。在5组每组3只小鼠中检测剂量渐增的MV2-gp160病毒(103-107TCID50)。MV和HIV Env的抗体通过ELIA在免疫后一个月的血清中寻找(图5C)。当重组MV剂量增加时，抗MV和抗HIV抗体滴度都增加。由于高抗MV滴度可在用106-107TCID50接种动物时获得，在以后的所有实验中小鼠用5.106 TCID50免疫。在这一剂量，抗MV抗体滴度比抗HIV滴度高6倍。应理解免疫仅针对HIV Env，而所有MV蛋白在感染过程中表达。为比较不同Env HIV构建体的免疫原性，四组每组6只小鼠用各种Mv-EnvHIV89.6病毒在腹腔内进行接种(图5B，5E)。所有小鼠对MV(平均抗MV滴度：5 104)和HIV Env(平均抗HIV滴度：8 103)起反应。没有观察到被测四个构建体中抗MV或抗HIV或抗HIV滴度的差异。有趣的是，MV载体的ATU 2或ATU 3位置的表达不影响抗体应答。因为所述ΔV3结构表达额外的ELDKWAS表位，针对gp41表位的抗体应答分开使用特定ELISA实验检测(图5F)。结果显示ΔV3-ELDKWAS结构诱导更高滴度的抗ELDKWAS抗体。在ELISA实验中，1/50 000的滴度对应能够识别给药进行免疫的抗原的免疫血清稀释度。
MV-EnvHIV89.6病毒诱导中和型抗HIV抗体。
这些血清中和同源SHIV89.6p病毒或各种异源原代HIV-1分离株的能力，使用对P4-CCR5指示细胞的单循环病毒感染力实验进行检验(43)。P4-CCR5细胞表达CD4、CXCR4和CCR5HIV-1受体，并已经由HIV LTRLacZ稳定转染。因此，它们对HIV-1分离株敏感并且在感染后表达β-半乳糖苷酶。所示血清中和实验通过联合使用抗HIV免疫球蛋白(HIVIG)和单克隆抗体(2F5和2G12)证实，所述两种抗体已显示协同中和原代HIV分离株(17)。我们还使用了中和原代HIV分离株的感染病人的血清(17)。我们还使用了中和原代HIV分离株(利用对人PBMC的中和实验)的感染病人的血清(42)。血清的中和活性(表1)表达为使用该血清获得的感染的降低与使用相同稀释度的阴性对照血清获得的降低的比值(来自HIV阴性个体和来自感染病毒病人的中和的分化体B和A病毒的血清在该实验中均可用)。
如表1所示，小鼠体内由四种MV-EnvHIV89.6病毒诱导的抗体在两个检测的稀释度(1/30和1/60)均可中和同源SHIV89.6p。使用不同Env构建体获得的血清之间没有观察到显著差别，表明当由MV表达时，分泌和固定形式的HIV糖蛋白诱导对同源病毒的中和型抗体的效果均较好。缺失V3环(已知含有类型特异的中和型表位)对诱导中和同源病毒的抗体没有明显影响。这提示，所述缺失可能通过加入第二ELDKWASgp41中和型表位或者通过暴露其它中和型表位而补偿。
所述重组病毒诱导的抗体中和异源性原代分化体B分离株(除92HT593分离株外)，以及分化体A病毒。每种情况下，固定gp160诱导的抗体都比分泌的gp140诱导的抗体更稍具中和力，尤其是对于分化体A 3253病毒。ΔV3-ELDKWASEnvHIV89.6诱导的抗体比由天然包膜诱导的抗体更有效地中和异源病毒。这对Bx08病毒尤其明显，所述病毒可以被用MV2-gp160ΔV3(1/30稀释度)免疫的小鼠的血清中和达90％，但不能被用表达天然EnvHIV89.6的MV免疫的小鼠的血清中和。所述中和同阳性对照血清的中和一样有效。这些结果表明，用其它ELDKWAS gp41表位置换EnvHIV89.6的V3环，并用MV载体表达所述构建体可诱导对分化体A和BHIV-1原代分离株具有交叉中和活性的抗体，至少在小鼠的重组MV背景下是可能的。
表1.EnvHIV89.6免疫的小鼠a血清对HIV-1原代异源分离株的中和。
病毒分离株(亚型)            小鼠血清(1/60)            小鼠血清(1/30)   阳性对照Mab 人HIV血清e
 MV2Gp140 MV2Gp140ΔV3  MV2Gp160  MV2Gp160ΔV3  MV2Gp140  MV2Gp140ΔV3 MV2Gp160  MV2Gp160ΔV3 (2F5/2G12/HIV-IG 461/40) 33-1/30)
SHIV 89.6Bx08(B)92US 660(B)92US 714(B)92 HT 593(B)3253(A)   4002.54500   5031154900   5201345018   45401768030   760NDND00     5776NDND010     7218NDND043     6890NDND049     ND94NDNDND73   ND94NDNDND54   ND90NDNDND45
a在两个稀释度评估血清的中和抗体。所示值为在小鼠血清(每点三只小鼠)存在下，原代HIV分离株对P4-CCR5细胞感染的％降低。重复三次进行检测，并且标准差＜10％。
bHIVIG(2,5mg/ml)和Mab 2F5和2G12(25μg/ml)的混合物。
c对应Burrer等的命名法的数字。
诱导针对重组MV的细胞免疫应答
对用MV2-gp160HIV免疫的小鼠的脾细胞进行的这些实验的结果(图7)证明用MV2-gp160HIV病毒单次免疫能够引发体内HIV Env特异性淋巴细胞。γ-IFN-ELISpot实验是在体内免疫后在新鲜细胞中计数抗原特异性细胞的敏感方法。该实验用于测定HIV-Env-特异性γ-IFN-分泌性细胞是否可在用MV2-gp160HIV病毒单次免疫后检测。图7A显示，免疫后7天和1个月时，大量Env特异性细胞存在于检验小鼠的2/3中。(对于各组中的一只小鼠，印迹的数量在BSA或gp120刺激后是相同的)。检测到的HIV-特异性印迹(达600/106细胞)表示同一小鼠中15-20％的MV-特异性印迹(未显示)，表明重组MV能有效对表达的异源基因进行免疫。
为评估这些Env特异性细胞的基因型，对免疫后7天进行安乐死的小鼠(处于效应细胞增殖的理论峰值)进行3色细胞荧光测定实验。代表性结果显示于图7B。CD4+和CD8+淋巴细胞的背景γ-IFN产生水平显示于左图。对于该动物，0.09％的CD8+淋巴细胞(对3只小鼠计算的平均值：0.31％)和0.25％的CD4+淋巴细胞(均值：0.41％)自发产生γ-IFN。CD8+和CD4+子集中的HIV-gp120 T-细胞(中图)的频率分别是1.76％(均值：1.69％)和0.92％(均值：0.76％)。有趣的是，在同一免疫后小鼠中，CD8+和CD4+子集中的麻疹病毒特异性细胞的频率分别是7.63％(均值：7.03％)和4.11％(均值：3.50％)。实际上重组MV2-gp160HIV病毒表达6种麻疹蛋白和一种gp160异源蛋白。因此，抗原特异性淋巴细胞的频率与重组基因的比例有关。结论是，MV2 gp160HIV病毒接种后7天进行的3色细胞荧光测定实验显示对HIV gp120特异的CD8+(图7B，上图)和CD4+(图7B，下图)淋巴细胞以及麻疹病毒在体内被引发。
在预存在抗MV免疫力的动物中诱导抗HIV应答
我们首先检测了通过二次注入重组MV来强化抗HIV应答的可能性。使用5.106 TCID50的MV2-gp140重组病毒免疫的小鼠(3只小鼠/组)通过在首次注入后一个月第二次注入相同的重组MV进行强化。强化时平均抗MV和抗HIV抗体滴度分别是5 104和8 103。这些滴度在强化后一个月分别增加到5 105和5 104。因此，抗MV和HIV应答可通过在首次免疫后一个月注入相同剂量的重组MV加强10次。
我们随后检测了重组MV诱导预存在MV免疫力的小鼠和猴体内的抗HIV抗体的能力。小鼠(3只小鼠/点)首先用105 TCID50的EdB-tagMV(无HIV***子)免疫。高水平的抗MV抗体被诱导(图7C)。两个月后滴度稍增加，并在随后的9个月内保持稳定。随后用5 106 TCID50的MV2-gp140HIV89.6接种小鼠，并在一个月后使用相同的剂量强化。抗MV抗体的滴度增加了100倍，且诱导了高滴度的抗HIV抗体(5 104)。这些滴度与用两次注射免疫的纯真动物(
Figure A0381444500471
animals)所得滴度相似。
对恒河猴进行了相同的实验(图7D)。使用标准剂量(104 TCID50)的MV疫苗(Rouvax，Aventis Pasteur)免疫两只猕猴。对于小鼠，诱导了高抗MV抗体水平，并在一年中保持稳定。随后用5 106 TCID50的MV2-gμ140HIV89.6以一个月的间隔接种猕猴。首次接种MV-HIV后抗MV滴度升高150倍，而二次注射没有或有很小的效果。尽管预存在抗MV免疫力，抗HIV抗体通过首次MV2-gp140HIV89.6注射诱导。二次MV2-gp140HIV89.6注射后一个月，抗MV抗体水平大约增加10倍，并到达小鼠中所获得的滴度的类似水平。该水平在随后的5个月中保持稳定。
本工作的主要目的是检验减毒MV-EnvHIV重组病毒的免疫原性。我们显示这种重组病毒在转基因小鼠中遗传稳定，表达高水平的HIV Env蛋白，并诱导抗MV和抗HIV Env构建体的高滴度抗体。抗HIV抗体滴度大约是抗MV抗体滴度的15-20％。这大约相当于重组病毒表达的HIV/MV蛋白比例。缺失V3环并具有额外的ELDKWAS gp41表位的HIVEnv结构诱导的抗ELDKWAS抗体是天然结构诱导的两倍，表明附加肽的天然构象尽管位置异常但是保守的。也诱导高水平的HIV-特异性CD8+和CD4+细胞。1.5-2％的总CD8+T细胞和0.9％的总CD4+T细胞是HIV特异性的。
然而，我们的结果最重要的方面是这些抗HIV抗体是同源SHIV89.6p病毒以及多种异源分化体A和分化体B HIV-1原代分离株的中和抗体。有趣的是，锚定的gp160ΔV3-ELDKWAS结构诱导比天然包膜诱导的抗体更有效地中和异源病毒的抗体。它们的中和滴度与参考人HIV中和血清中的抗体滴度相似。这些抗体的广泛中和能力可以是由于加入了第二ELDKWAS gp41中和表位，或者是暴露了以前覆盖的保守中和表位。一些组已经将ELDKWAS表位***了各种免疫原性分子(44，45，46，47)。这些研究表明表位显示在其中的构象背景对于诱导中和抗体是必要的。β-转角样(β-turn-like)限制显示是2F5中和抗体可识别的最可能的ELDKWAS表位的构象结构(46)，在我们的结构中，将短AAELDKWASAA表位***替代V3环(其两侧为β链(28，29))可能具有这种β-转角样构象。
已经显示，缺失HIV Env的高变环能增强其免疫原性(3，48，39)。然而，在以前的研究中，中和抗体只在多次注入大量可溶蛋白以后才能获得(23)，或者使用非常大量的DNA和纯蛋白以“引发-强化”方案获得(3，39)。反之，我们观察到注入单剂量MV-gp160ΔV3-ELDKWAS的小鼠中的中和抗体的相同水平。我们的***中的良好免疫原性可能由于HIV Env以和来自活MV疫苗的蛋白(高效免疫原)相同的方式被免疫***表达和加工的事实。可预期这种中和抗体的水平可至少诱导接种后个体中的部分保护。根据其它数据(3，39)，可进一步通过缺失HIV gp120的V1和V2环来增强MV-HIV Env的免疫原性，特别诱导针对CD4结合位点的抗体。然而，最近报道该受体结合位点可通过构象和表位伪装(masking)来逃逸免疫应答(49)。
抗MV免疫力存在于几乎所有成人人群中，这似乎将MV重组体的应用仅限制在婴儿的范围，婴儿无论如何都早已是值得努力的目标。然而，一些研究表明，在接种已经免疫过的个体导致抗MV抗体升高，提示减毒活疫苗复制并在预存在免疫力的情况下表达其蛋白(50)。在这种情况下，可预期能使用MV重组体针对异源抗原免疫接种成人。事实上，我们的结果表明，对于小鼠和猕猴而言，高抗HIV中和抗体水平可在预存在抗MV免疫力时获得。
各种“引发-强化”方案(其使用裸DNA和病毒载体例如MVA(1)或腺病毒(29)的组合)对病原性SHIV89.6p的攻击有合理的保护。在本研究中，我们显示，单次注射MV能结合体液和细胞应答水平，使其以与这些复合物组合物诱导的水平相似。
相同的重组体已经使用克隆到Schwarz株作为载体而制备。这应进一步升高其免疫原性。
实施例2：构建表达HIV-1抗原的Schwarz麻疹病毒(MVSchw)
为了检验其作为HIV感染疫苗候选物的能力，我们构建了多种表达HIV-1抗原的Schwarz麻疹病毒(MVSchw)。构建来自不同开放阅读框架的不同HIV-1基因并将其导入我们以前克隆的Schwarz MVcDNA(pTM-MVSchw)中的附加转录单位。拯救不同重组Schwarz麻疹病毒后，不同HIV-1蛋白的表达通过对感染后细胞裂解物进行western印迹而分析(图3A-D)。
从HIV Env糖蛋白(以后为1-8)Gag蛋白(以后为9)，和Tat蛋白(以后为10)构建不同免疫原：
1.分泌的糖蛋白gp140，来自HIV-1 89.6p
2.锚定的糖蛋白gp160，来自HIV-1 89.6p
3.分泌的糖蛋白gp140，来自HIV-1 89.6p，缺失自高变区V3并添加AAELDKWASAA表位(gp140HIV89.6ΔV3-ELDKWAS)
4.锚定的糖蛋白gp160，来自HIV-1 89.6p，缺失自高变区V3并添加AAELDKWASAA表位(gp160HIV89.6ΔV3-ELDKWAS)
5.分泌的糖蛋白gp140，来自HIV-1 89.6p，缺失自高变区V1-V2(gp140HIV89.6ΔV1V2)
6.锚定的糖蛋白gp160，来自HIV-1 89.6p，缺失自高变区V1-V2(gp160HIV89.6 AV1 V2)
7.分泌的糖蛋白gp140，来自HIV-1 89.6p，缺失自高变区V1-V2-V3(gp140HIV89.6 AV1 V2V3)
8.锚定的糖蛋白gp160，来自HIV-1 89.6p，缺失自高变区V1-V2-V3(gp 160H IV89.6 AV1 V2V3)
9.Gag聚合蛋白(p17p24，delta myr)，来自HIV-1(分化体B共有序列)，从C末端核蛋白ORF截短而来(p17p24deltamyrHIV-1 B)
10.Tat蛋白，来自HIV-1 89.6p(TatHIV89.6)
编码不同形式Env蛋白的HIV env基因通过从质粒pSHIV-KB9进行PCR扩增产生(NIH-AIDS Research & Reference Reagent Program)。具体序列使用PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene)和特定引物进行扩增。为产生不同缺失，通过PCR产生位于待缺失序列两侧的重叠片段并使之退火。它们随后被限制性酶克隆导入已经克隆在pCR2.1-TOPO质粒中的gp160和gp140的相应位置中(图1A)。产生的不同序列两端包括起始和终止密码子并遵守“6倍规则”，以保证MV基因组的核苷酸数目可被6整除(7，8)。经过BsiWI/BssHII消化后，不同HIV序列导入pTM-MVSchw载体的ATU位置2或3(图1B)。产生的质粒命名为：
1.pTM-MVSchw2-gp140HIV
2.pTM-MVSchw2-gp160HIV
3.pTM-MVSchw2-gp140ΔV3HIV
4.pTM-MVSchw2-gp160ΔV3HIV
5.pTM-MVSchw2-gp140HIVΔV1V2
6.pTM-MVSchw2-gp160HIVΔV1V2
7.pTM-MVSchw2-gp140HIVΔV1V2V3
8.pTM-MVSchw2-gp160HIVΔV1V2V3
9.pTM-MVSchw2-GagHIV(p17-p24Δmyr)
10.pTM-MVSchw3-TatHIv
产生了在麻疹病毒Schwarz载体的位置1和2中表达Gag和gp140重组病毒。
11.pTM-MVSchw2-GagSIV239(p17-p24Δmyr)-3-gp140HIV
该病毒表达上述两种蛋白(图z)。这些构建体可在麻疹病毒感染的细胞中产生HIV、SHIV或SIV组装的Gag-Env“病毒样颗粒”。
已经产生了图16中表示的HIV-1免疫原性序列：
实施例3：表达不同病毒转基因的重组麻疹病毒
为证明MV作为儿科疫苗载体的免疫和保护能力，构建并研究了一系列表达来自其它病毒的不同病毒转基因(见下列)重组麻疹病毒。本文结果使用原来的EdB-tag载体获得的。然而，我们已经显示，EdB-tag比Schwarz疫苗的免疫原性弱100倍。MVEdB重组病毒以更高的剂量接种。所有具有良好免疫记录的***序列显然可***Schwarz载体。
已经***重组麻疹病毒的病毒基因：
HIV分化体B 89.6P    gp160            gp140
                    gp160ΔV3        gp140ΔV3
                    gp160ΔV1V2      gp140ΔV1V2
                    gp160ΔV1V2V3    gp140ΔV1V2V3
                    tat
HIV分化体B共有序列密码子优化的Gag(p17-p24)
SIVMac 239          Nef
                    NefΔmyr
                    Nef29-23 6
                    Tat
HTLV-I              Env
                    Gag(p19-p24)
                    Tax
实施例4：表达黄热病病毒Env和NS1的重组麻疹病毒具有免疫能力
由于针对麻疹病毒和黄热病病毒的儿科二价疫苗应有用，我们构建了表达黄热病病毒(YFV 17D204，Pasteur疫苗株)的Env和NS1蛋白的重组MV，并检验了其保护小鼠免受致命性YFV攻击的能力。
构建MV-YFV重组质粒
env基因用Pfu聚合酶通过PCR扩增，所用引物具有独特的BsiWI和BssHII位点以便随后在MV载体中进行克隆：MV-YFVEnv5(5′-TAT CGTACGATGCGAGTCGTGATTGCCCTACTG-3′)和MV-YFVEnv3 (5′-ATA GCGCGCTTATGTGTTGATGCCAACCCA-3′)。由此产生的Env蛋白(YEV聚合蛋白的氨基酸270-753)在N末端含有信号肽，并在C末端含有部分跨膜基因。NS1序列利用Pfu聚合酶以相同的方式进行PCR扩增，所用引物为：MVYFVNS5(5′-TAT CGTACGATGAGAAACATGACAATGTCC-3′)和MVYFVNS3(5′-ATA GCGCGCTTAATGGCTTTCATGCGTTT TCC-3′)。NS1蛋白(YFV聚合蛋白中的氨基酸754-1122)含有其信号肽序列。将起始和终止密码子加在基因两端，并在终止密码子后加入几个核苷酸以符合“6倍规则”，保证MV基因组的核苷酸数目必须是6的倍数(7)。Env和NS1片段都克隆在pCR2.1-TOPO质粒(Invitrogen)中，并对进行测序以核实没有导入突变。以BsiWI/BssHII消化pCR2.1-TOPO质粒后，将env和NS1序列克隆在EdB-tag载体的ATU位置2，产生质粒：EdB-EnvyFv和EdB-NS1YFV。
回收重组EdB-EnvYFV和EdB-NS1YFV病毒
EdB-EnvYFV和EdB-NS1YFV质粒用于如上述转染293-3-46辅助细胞，并从和Vero细胞共培养的转染细胞拯救重组病毒。重组病毒在Vero细胞上传代两次，并检验转基因表达。
通过重组MV表达YFV蛋白
拯救的重组病毒MV2-EnvYFV和MV2-NS1YFV在Vero细胞上增殖，并通过免疫荧光分析YFV蛋白的表达。图9显示，用小鼠抗YFN多克隆血清检测显示，重组MV2-YFV感染的Vero细胞合胞体显示高YFV Env和NS1蛋白表达。为测定YFN基因的表达是否稳定，将拯救的重组病毒在Vero细胞上连续传代。传代10次以后，感染细胞中观察到的所有合胞体对YFV阳性(未显示)。总体来看，结果表明YFV的Env和NS1蛋白在几次传代中由重组MV有效并稳定表达。
用MV-YFV重组病毒免疫小鼠
如上述，用MV2-EnvYFV和MV2-NS1YFV病毒混合物(107TCID50)在腹腔内接种6只CD46+/-IFN-α/βR-/-小鼠(见MV-HIV gp实验)。作为对照，另外6只小鼠接受相同剂量麻疹病毒疫苗。一个月以后，将YFV17D204(10LD50根据FVB小鼠确定)颅内注入攻击小鼠。图10显示65％的MV-YFV免疫的动物完全不受攻击，二所用接种标MV的动物在攻击后6和7天死亡。此外，在用MV-YFN免疫的小鼠中观察到死亡延迟4天，且这些小鼠死亡时不具有和标准MV疫苗接种小鼠相同的脑临床症状。所述疾病减轻并出现(consisted of)四肢麻痹。注意到IFN-α/βR-/-小鼠比免疫活性小鼠对病毒感染更敏感(102-104倍)。为此，对免疫活性小鼠的致死剂量可能对IFN-α/βR-/-小鼠过高。使用几个递增剂量YFV攻击病毒进行相同的实验。
结论是，这一预实验显示重组MV诱导的对YFN蛋白的免疫应答能保护小鼠不受致死攻击。
上述构建体通过使用图12A和12B公开的序列制备。
制备构建体的相同原则适用于图12C和12D公开的序列。
实施例5：用表达WNV(西尼罗河病毒)分泌型E糖蛋白的减毒麻疹活病毒(Schwarz毒株)针对WNV进行免疫接种
我们构建了表达WNV E可溶形式的重组Schwarz麻疹减毒病毒，并检测其作为针对WN脑炎的候选疫苗的能力。对应WNV的IS-98-ST1株的sE蛋白的WNcDNA导入Schwarz MVcDNA(pTM-MVSchw CNCMI-2889)中的附加转录单位。拯救重组Schwarz麻疹病毒以后，检验其在腹腔内攻击后保护小鼠不受致命性WNV脑炎的能力。
A)材料和方法
A.1细胞和WN病毒
在Aedes AP61蚊细胞上根据Despres等(51)，Mashimo等(52)HLucas等(53)描述的方案产生WN病毒的IS-98-ST1株(51)，本研究所用Vero-NK细胞克隆用于筛选其在麻疹病毒感染后进行融合的能力并扩增WN病毒。
A.2通过免疫检测病毒复制灶(Focus Immuno Assay，FIA)测定WN病毒在AP61蚊细胞上的滴度。
根据Desires等(51)，Mashimo等(52)和Lucas等(53)所述方案进行滴毒测定。
WN病毒在AP61细胞上的感染滴度确定为AP61细胞(AP61UFF/ml)上的灶形成单位。
A.3纯化在AP 61细胞上产生的WN病毒。
根据Desires等(51)，Mashimo等(52)and Lucas等(53)等所述方案进行纯化。
简言之，将AP61细胞(由WN病毒株IS-98-ST1(MOI 0.4)在3天内进行感染)上清中存在的病毒颗粒在7％PEG 6000上离心并在30-60％非连续蔗糖梯度和10-50％的线性蔗糖梯度中浓缩。30％蔗糖中的WN病毒保存在-80℃。获得的感染滴度约1010 AP61 FFU/ml。
A.4 ELISA中检测的抗WN抗体
稀释血清(1∶100)中抗WN抗体滴度通过ELISA对给定的106AP61FFU的WN IS-98-ST1病毒粒(在蔗糖梯度中纯化)进行测定。所述方案由Desires等(1993)和Mashimo等(2002)描述。
A.5抗WN免疫血清
在对病毒性脑炎遗传性抵抗的成年小鼠中采集抗WN免疫血清(Mashimo etal-2002)，所述血清在用103 AP61 FFU的WN病毒株IS-98-ST1腹腔内接种后至少一个月内检测。
1∶100稀释的免疫血清的抗WN抗体滴度在ELISA中测定，并大约1.4 DO单位。抗WN血清的中和滴度(TNRF90)为大约1600。
小鼠(HMAF)对WN毒株IS-98-ST1的腹水得自已经用接种WN的幼鼠脑匀浆超免疫的动物。抗WN HMAF的ELISA滴度(稀释到1∶1000)为大约1 DO单位。
抗WN免疫血清用于对疾病进行间接免疫荧光和被动血清保护实验。抗WN HMAF用于对病毒蛋白进行膜免疫检测。
A.6构建表达WN sE的重组Schwarz麻疹病毒
编码分泌型所述蛋白的WNV env基因通过对纯化自病毒颗粒(WNV IS-98-ST1毒株)病毒RNA进行RT-PCR扩增获得。具体序列用PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene)和特定引物扩增，所述引物含有用于随后在pTM-MVSchw载体中克隆的独特位点：MV-WNEnv55′TAT CGTACGATGAGAGTTGTGTTTGTCGTGCTA-3′(BsiWI位点加下划线)和MV-WNEnv35′-ATA GCGCGCTTAGACAGCCTTCCCAACTGA-3′(BssHII位点加下划线)。在基因两端加起始和终止密码子。整个产生的序列长1380核苷酸，包括起始和终止密码子并遵守“6倍规则”，保证MV基因组的核苷酸数目一定被6整除[Calain，1993(7)；Schneider，1997(28)]。由此产生的Env蛋白在N末端含有信号肽(18aa)且没有跨膜区。因此，其代表WNV聚合蛋白中的氨基酸275-732并具有以下序列：
◆atgagagttgtgtttgtcgtgctattgcttttggtggccccagcttacagcttcaactgccttggaatg
  agcaacagagacttcttggaaggagtgtctggagcaacatgggtggatttggttctcgaaggcg
  acagctgcgtgactatcatgtctaaggacaagcctaccatcgatgtgaagatgatgaatatggag
  gcggtcaacctggcagaggtccgcagttattgctatttggctaccgtcagcgatctctccaccaa
  agctgcgtgcccgaccatgggagaagctcacaatgacaaacgtgctgacccagcttttgtgtgc
  agacaaggagtggtggacaggggctggggcaacggctgcggattatttggcaaaggaagcat
  tgacacatgcgccaaatttgcctgctctaccaaggcaataggaagaaccatcttgaaagagaat
  atcaagtacgaagtggccatttttgtccatggaccaactactgtggagtcgcacggaaactactc
  cacacaggttggagccactcaggcagggagattcagcatcactcctgcggcgccttcatacac
  actaaagcttggagaatatggagaggtgacagtggactgtgaaccacggtcagggattgacac
  caatgcatactacgtgatgactgttggaacaaagacgttcttggtccatcgtgagtggttcatgga
  cctcaacctcccttggagcagtgctggaagtactgtgtggaggaacagagagacgttaatggag
  tttgaggaaccacacgccacgaagcagtctgtgatagcattgggctcacaagagggagctctg
  catcaagctttggctggagccattcctgtggaattttcaagcaacactgtcaagttgacgcgggt
  catttgaagtgtagagtgaagatggaaaaattgcagttgaagggaacaacctatggcgtctgttc
  aaaggctttcaagtttcttgggactcccgcagacacaggtcacggcactgtggtgttggaattgc
  agtacactggcacggatggaccttgcaaagttcctatctcgtcagtggcttcattgaacgacctaa
  cgccagtgggcagattggtcactgtcaacccttttgtttcagtggccacggccaacgctaaggtc
  ctgattgaattggaaccaccctttggagactcatacatagtggtgggcagaggagaacaacaga
  tcaatcaccattggcacaagtctggaagcagcattggcaaagcctttacaaccaccctcaaagg
  agcgcagagactagccgctctaggagacacagcttgggactttggatcagttggaggggtgttc
  acctcagttgggaaggctgtctaa
- MRVVFVVLLLLVAPAYSFNCLGMSNRDFLEGVSGATWVDLVLEGDSCVT
  IMSKDKPTIDVKMMNMEAVNLAEVRSYCYLATVSDLSTKAACPTMGEAH
  NDKRADPAFVCRQGVVDRGWGNGCGLFGKGSIDTCAKFACSTKAIGRTI
  LKENIKYEVAIFVHGPTTVESHGNYSTQVGATQAGRFSITPAAPSYTLKLG
  EYGEVTVDCEPRSGIDTNAYYVMTVGTKTFLVHREWFMDLNLPWSSAGS
  TVWRNRETLMEFEEPHATKQSVIALGSQEGALHQALAGAIPVEFSSNTVK
  LTSGHLKCRVKMEKLQIKGTTYGVCSKAFKFLGTPADTGHGTVVLELQY
  TGTDGPCKVPISSVASLNDLTPVGRLVTVNPFVSVATANAKVLIELEPPFG
  DSYIVVGRGEQQINHHWHKSGSSIGKAFTTTLKGAQRLAALGDTAWDFG
  SVGGVFTSVGKAV*
经过琼脂糖凝胶纯化后，PCR片段被克隆到pCR2.1-TOPO质粒(Invitrogen)中，并对其进行测序以核实没有导入突变。用BsiWI/BssHII消化pCR2.1-TOPO质粒后，DNA片段克隆到pTM-MVSchw载体的ATU位置2中产生质粒：pTM-MVSchw-sEWNV，见图13。
A.7制备表达WN sE的重组麻疹病毒
为从质粒回收重组MV，我们使用基于辅助细胞的拯救***，如Radecke等[Radecke，1995(35)]所述，并由Parks等[Parks，1999(40)]修饰。稳定表达T7 RNA聚合酶及麻疹病毒N和P蛋白的人辅助细胞(293-3-46细胞，由MA Billeter，University of Zurich赠与)，使用磷酸钙法用pTM-MVSchw-sEwnv质粒(5μg)和表达MV聚合酶的L基因的质粒(pEMC-La，20ng)转染。在37℃温育过夜后，转染培养基用新鲜培养基置换，并进行热休克(43℃，2小时)[Parks，1999(40)]。在37℃温育两天后，转染细胞被转移到CEF细胞层，并在32℃保温以防止最初在CEF细胞上选择而现在在这些细胞上生长的Schwarz疫苗产生适应。感染性病毒在共培养3和7天后回收。重组病毒也能通过相同的技术在37℃共培养转染的293-3-46辅助细胞和Vero细胞(非洲绿猴肾，克隆Vero-NK)来拯救。为增加拯救的产量，且由于制备这些重组病毒用于小鼠实验中，我们将Vero细胞用作制备细胞来取代常用的鸡胚纤维母细胞(CEF)。收集单合胞体并转移到Vero细胞，所述细胞生长在35mm皿上，位于补充了5％胎牛血清(FCS)Dulbebecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)中。感染细胞在75和150cm3的烧瓶中扩增。当合胞体达80-90％满底时(通常在感染后36-48小时)，这些细胞被转移到小体积的OptiMEM(GibcoBRL)中，并冷冻-解冻一次。低速率离心以沉淀细胞碎片后，含有病毒的上清保存在-80℃。我们已经显示在Vero细胞上传代两次的Schwarz病毒在猕猴中的免疫原性不改变。
A.8重组MV-WN病毒的滴度
重组MV-WN病毒的滴度通过对Vero细胞进行终点有限稀释实验测定。50％组织培养物感染剂量(TCID50)用Krber的方法计算[Krber，1931(41)]。
A.9免疫荧光检测在MV-WN sE重组病毒感染的Vero细胞中表达的WNV sE。
WN sE蛋白在重组MV-WN sE感染的细胞中的表达通过免疫荧光检测。Vero细胞生长在聚合鸟氨酸包被的盖玻片上生长，并用MV-WN sE以MOI＝0.05进行感染。感染两天后，在PBS中洗涤盖玻片两次，并在多聚甲醛(4％，PBS中)中固定15分钟。在一些情况下，细胞用TritonX100(0.1％，5分钟)可透过化。PBS洗涤两次后，在室温含2％山羊血清的PBS中保温盖玻片15分钟，然后在室温与小鼠抗WNV免疫血清或小鼠抗WNV HMAF(见A5)(稀释于含2％山羊血清的PBS中)一同保温1小时。在PBS中洗涤后，细胞在室温与R-藻红蛋白-偶联的山羊抗小鼠IgG(SBA，Birmingham)保温45分钟。在PBS中洗涤后，将盖玻片覆盖在具有fluoromount的载玻片(Southern Biotech Associates inc.，Birmingham，Alabama)上。
A.10通过ELISA检测抗MV抗体
抗MV抗体使用标准ELISA试剂盒(Trinity Biotech，USA)检测抗小鼠抗体-HRP缀合物(Amersham)用作第二抗体。通过限制性稀释测定滴度，并将产生的吸光度(absorbence)为对照血清混合物在1/100稀释率时的吸光度的两倍作为最高稀释率。
A.11通过降低VERO细胞上的病毒复制灶(TNRF90)进行中和测试
制备连续稀释血清用于在0.5ml的试管中，在具有2％去补体的FCS(胎牛血清)的DMEM Glutamax中进行实验。
对于含有2％FCS的DMEM Glutamax中的0.1ml稀释血清，加入0.1ml的DMEM Glutamax/2％FCS(含100AP61 UFF的WN病毒株IS-98-ST1)。
对照细胞：0.2ml的DMEM 0.2％FCS
对照病毒：0.2ml的DMEM Glutamax/2％FCS(含100AP61 UFF的WN毒株IS-98-ST1)
在37℃轻轻转动2小时
具有12杯(含150 000 VERO HK细胞/杯)的板，所述细胞以单层在DMEM Glutamax 5％FCS中生长24小时
在细胞层的DMEM中洗涤一次
加入0.2ml DMEMGlutamax/2％SVF
将0.2ml的混合血清/WN病毒加入细胞层上
在37℃，CO2中保温2小时
回收感染细胞层的血清/WN病毒混合物
在DMEM中洗涤感染细胞层一次
每杯加入1ml DMEM 2％SVF
加入1ml稀释于DMEMGlutamax/2％SVF中的CMC 1.6％
在37℃，CO2中温育2天。
噬斑通过FIA技术显示。测定免疫血清(其中和Vero细胞上检测的WN病毒的100 UFF的至少90)的最终稀释度(TNRF90：Test deNeutralisation par Reduction de Foyers de reμlication virale a 90％)。血清中和抗体的滴度通过TNRF90测定。
A.12通过细胞系MEF/3T3.TetOff/pr ME.WN#h2制备WN病毒假颗粒
含有prME复合糖蛋白的WN病毒株IS-98-ST1的假颗粒由MEF/3T3.Tet-Off/pr ME.WN#h2细胞系分泌，所述细胞系被诱导以表达病毒蛋白(CNCM I-3018)。纯化它们用于根据WN病毒纯化所用方案获得3天细胞培养的上清。
针对成年BALB/c小鼠中的MN病毒的被动血清保护实验
6周大的BALB/c小鼠由Janvier breeding Center提供。用于病毒实验的剂量为100 ap61 UFF，即10 DL 50(Tomoshi等2002)(稀释于补充了0.2％BSA(牛血清白蛋白)pH7.5(Sigma)的100μl DPBS中)，其接种于腹腔内。致命效应的平均时间为10天。观察动物2-3周。
待检测在小鼠中的被动血清保护的血清稀释于0.1％DPBS/0.2％BSA中，并在病毒检测前24小时接种。
B)结果和结论
B.1制备表达WN sE的重组麻疹病毒
编码缺失跨膜固定区的WNV毒株IS-98-ST1的E蛋白的cDNA***麻疹病毒(Schwarz毒株)的基因组中，如图13所示。
B.2针对小鼠中WN病毒的被动血清保护的预实验
待检测的抗WN免疫血清得自对疾病遗传抵抗的小鼠(52)。新采集的抗WN血清以1∶10(16 TNRF90)或1∶40(4 TNRF90)的稀释度以终体积为0.1ml的DPBS/0.2％SAB注入遗传敏感的成年BALB/c小鼠的腹腔中。
所述抗体仅在病毒测试前24小时或在用10 DL50的WN病毒IS-98-ST1毒株进行实验前24小时或实验后24小时给药。阴性对照为注入1∶10的正常血清的小鼠。WN病毒的神经毒力在用DPBS/0.2％SAB检测的小鼠中评估。病毒实验后两周被动保护的结果如下：
    被动转移     死亡率     MDOD*
PBS/BSA(0.2％)     6/6     10.5(±1.5)
正常血清(1∶10)     6/6     12.5(±1.5)
抗WNV血清(1∶10)，2剂**     0/6     NA
抗WNV血清(1∶40)，2剂     0/6     NA
抗WNV血清(1∶10)，1剂***     1/6     12
抗WNV血清(1∶40)，1剂     0/6     NA
(*死亡SD的平均天数)
(**病毒攻击的天-1和天+1)
(***病毒攻击的天-1)
表1：成年BALB/c小鼠中针对WNV脑炎的被动血清保护
结论，仅注入获自对WN病毒遗传抵抗的小鼠的抗WN抗体(2.5 a 10的血清)，所述注射在对病毒性脑炎敏感的成年小鼠的腹腔内进行，其提供了对实验剂量的被动保护。
注意到，试验后一个月，接受抗WN保护性抗体并对病毒感染有抵抗性的BALB/c小鼠的血清中，通过ELISA测定的抗WN抗体滴度大约为1DO单位(血清稀释度1∶100)。这表明，接种后用于实验的WN病毒在保护的小鼠中复制，诱导了体液应答。如果被动血清保护可保护由WN病毒造成的致命性脑炎，其不适合保护感染后个体内的病毒增殖。
B.3用MV/WN sE病毒接种CD46+/-IFN-α/βR-/-小鼠
如前述获得对MV感染敏感的小鼠[Mrkic，1998(21)]。对CD46 MV受体转基因异源的FVB小鼠[Yannoutsos，1996(32)]预129Sv IFN-α/βR-/-小鼠[Muller，1994(22)]杂交。F1子代通过PCR筛选，并将CD46+/-动物再次与129Sv IFN-α/βR-/-小鼠杂交。IFN-α/βR-/- CD46+/-动物被选出并用于免疫实验。6周大的CD46+/-IFN-α/β R-/-小鼠用单剂标准MV疫苗(106TCID50，3只小鼠)或MV-WN sE重组病毒(104或106 TCID50，6只小鼠每剂)在300μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在腹腔内接种。
用单剂量接种一个月后，从眼获得血清，来测定抗MV、抗WN E和对检测病毒的中和抗体的产生。
b)将血清稀释到1∶100并通过ELISA在纯化的NV病毒粒上检测抗体，所述实验对以下动物进行：
                                DO单位
抗WN小鼠腹水：                  1(对照+)
抗WN小鼠血清：                       0.8(对照+)
MV接种的小鼠血清：                   0.110±0.005
MV/WN sE接种的小鼠血清，104DCIP50：0.635±0.040(雄性)
MV/WN sE接种的小鼠血清，104DCIP50：0.815±0.005(雌性)
MV/WN sE接种的小鼠血清，106DCIP50：0.800±0.200(雄性)
MV/WN sE接种的小鼠血清，106DCIP50：0.900±0.195(雌性)
c)Vero细胞上对WNV的体外血清中和实验
混合血清(pools ofsera)对Vero细胞中WN病毒IS-98-ST1株的100AP61UFF的TNRF90：
                                         TNRF90
MV接种小鼠血清：                         ＜10
MV接种的小鼠MV-WN sE的血清，104DCIP50：400
MV接种的小鼠MV-WN sE的血清，106DCIP50：800
结果，针对可溶E糖蛋白WN病毒的抗体能中和用于在小鼠体外检测WN病毒的毒株IS-98-ST1。
免疫后CD46+/-IFN-α/βR-/-小鼠中疫苗强化以在用单剂量接种后进行了一个月，所用剂量与首次注射的剂量相同。
强化两周后，通过ELISA检测血清并显示为上述TNRF90
a)将血清稀释到1∶100并在纯化的WN病毒粒上通过ELISA检测抗体：
                                     DO单位
抗WN小鼠腹水：                       1.4(对照+)
抗WN小鼠血清：                       1(对照+)
MV接种的小鼠血清：                   0.110±0.005
MV/WN sE接种的小鼠血清，104DCIP50：0.810±0.100(雄性)
MV/WN sE接种的小鼠血清，104DCIP50：1.150±0.015(雌性)
MV/WN sE接种的小鼠血清，106DCIP50：0.965±0.230(雄性)
MV/WN sE接种的小鼠血清，106DCIP50：1.075±0.240(雌性)
b)对VERO细胞的体外血清中和测试
混合血清对Vero细胞中的WN病毒IS-98-ST1株的100 AP61UFF的TNRF90：
                                         TNRF90
MV接种小鼠血清：                         ＜10
MV接种的小鼠MV-WN sE的血清，104DCIP50：＞1600
MV接种的小鼠MV-WN sE的血清，106DCIP50：＞1600
强化4周后，通过ELISA检测血清并显示为上述TNRF90
a)将血清稀释到1∶100并在纯化的WN病毒粒上通过ELISA检测抗体：
                                         DO单位
抗WN小鼠腹水：                           1.7(对照+)
抗WN小鼠血清：                           1.2(对照+)
MV接种的小鼠血清：                       0.2
MV/WN sE接种的小鼠血清，104DCIP50：    1.52(±0.15)
MV/WN sE接种的小鼠血清，106DCIP50：    1.76(±0.10)(雄性)
b)对VERO细胞的体外血清中和测试
混合血清对Vero细胞中的WN病毒IS-98-ST1株的100 AP61UFF的TNRF90：
                                         TNRF90
MV接种的小鼠MV-WN sE的血清，104DCIP50：4000(雄性)
MV接种的小鼠MV-WN sE的血清，104DCIP50：  8000(雌性)
MV接种的小鼠MV-WN sE的血清，106DCIP50：  10 000-12 000
结论：在用单剂量强化后，抗WNV抗体滴度和抗WNV中和抗体的滴度显著升高10倍或更高。
两次(间隔4周)用MV-Wn sE病毒以104或106 DCIP50的剂量注射来免疫的CD46+/-IFN-α/βR-/-小鼠在ELISpot和流式细胞仪中检测其TCD4和CD8的应答，所述检测是在用在蔗糖梯度中纯化的假颗粒进行体外刺激(来自诱导的MEF/3T3.Tet-Off/prME.WN#h-2(CNCM I-3018)细胞系的上清)以后进行的。
B.4用抗E抗体在BALB/c中进行被动抗WN血清保护测试
用单剂重组麻疹病毒接种的CD46+/-IFN-α/βR-/-小鼠的免疫血清在一个月后采集。各种稀释度的各种血清以终体积为0.1ml注入6周大的BALB/c小鼠中，并且仅在腹腔内接种100 AP61UFF的WN病毒毒株IS-98-ST1(10 DL50)前24小时(见B.2中的方案)。
病毒实验两周后的被动保护的结果如下：
    被动转移     死亡率     天*
PBS/BSA(0.2％)     6/6     10-11
抗WNV血清(1∶10)，1剂*     0/6     NA
抗WNV血清(1∶40)，1剂**     1/6     20
抗MV(1∶10)，1剂     4/6     10-11
抗MV-WN sE 10e4(1∶10)，1剂     3/6     8-10
抗MV-WN sE 10e6(1∶10)，1剂     0/6     NA
抗MV-WN sE 10e6(1∶40)，1剂     0/6     NA
抗MV-WN sE 10e6(1∶100)，1剂     3/6     10-11
(病毒攻击*天-1)
表2：重组MV-WN sE诱导完全保护BALB/c小鼠体内的WNV脑炎的抗体
结论：针对WN病毒可溶性糖蛋白E的抗体具有在体内保护WN病毒脑炎攻击的能力。需要用剂量为106 DCIP50的MV-WN sE病毒单次注入来免疫CD46+/-IFN-α/βR-/-小鼠来诱导抗WN E体液应答，在4周的时间内能通过被动血清保护对抗疾病。用MV-WN sE病毒接种的小鼠的免疫血清最小体积2.5μl，足以在用致死剂量的WN病毒(例如大约0.1ml免疫血清/kg的比例)进行实验的成年BALB/c小鼠中提供完全保护。注意到稀释到1∶10的抗致死血清诱导对西尼罗河病毒脑炎的部分保护(大约30％)。在接种后的CD46+/-IFN-α/βR-/-小鼠(其用弱剂量(104 TCID50)强化中获得的血清将在BALB/c小鼠中测定其被动保护的能力。
B.5对接种MV-WN sE的CD46+/-IFN-α/βR-/-小鼠进行病毒测试
给CD46+/-IFN-α/βR-/-小鼠两次注入(间隔4周)106 DCIP50的MV-WN sE病毒，两个月以后，接种的CD46+/-IFN-α/βR-/-小鼠经腹腔内给予的100 AP61UFF的WN病毒IS-98-ST1毒株进行检测。
用标准麻疹病毒接种的2只小鼠在实验第三天死亡。用MV-WN sE接种的小鼠在实验的第七天没有发病或死亡。结论是：在缺乏α干扰素的抗病毒活性时，用WN病毒可溶性gpE免疫的CD46+/-IFN-α/βR-/-小鼠对致死实验剂量的WN病毒有保护作用。
B.6以抗原强化的抗WN疫苗的新测试
成年CD46+/-IFN-α/βR-/-小鼠用MV-WN sE病毒以104 DCIP50的剂量(该剂量建议用于人)接种4周，并用纯化WN病毒的假颗粒(由细胞系MEF/3T3.Tet-OffNVN prME#h2分泌)携带的抗原进行强化。
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Claims (51)

1.表达异源氨基酸序列的重组单负链病毒目病毒，所述重组病毒能引发针对所述异源氨基酸序列的体液和/或细胞免疫应答，包括在已经具有麻疹病毒免疫力的个体中引发上述免疫应答。
2.表达来自一种确定的RNA病毒抗原的异源氨基酸序列的重组麻疹病毒，所述重组麻疹病毒能引发针对麻疹病毒或针对所述RNA病毒或针对麻疹病毒和所述RNA病毒的体液和/或细胞免疫应答。
3.权利要求2的重组麻疹病毒，其是一种重组核苷酸序列在细胞中表达的产物，所述重组核苷酸序列包含编码麻疹病毒(MV)全长反基因组(+)RNA的cDNA分子，且还包含与所述cDNA分子重组的编码一种确定的逆转录病毒或黄病毒的异源氨基酸序列的序列。
4.权利要求1或2的重组麻疹病毒，其来自Schwarz疫苗株或来自Edmonston毒株。
5.权利要求2-4中任一项的重组麻疹病毒，其是从用一种重组核苷酸序列转染的辅助细胞中拯救的，所述重组核苷酸序列包含编码麻疹病毒全长反基因组(+)RNA的核苷酸序列的cDNA，所述cDNA与编码逆转录病毒的或黄病毒的异源氨基酸序列的核苷酸序列重组，且所述重组核苷酸序列符合6倍规则。
6.权利要求2-5中任一项的重组麻疹病毒，其中所述核苷酸序列包含于EdB-tag病毒载体中，所述序列与***EdB-tag病毒载体的一个位置中的ATU重组，所述ATU利用病毒基因组的梯度使得***所述ATU的编码异源氨基酸序列的转基因核苷酸序列以不同水平表达。
7.权利要求2-5中任一项的重组麻疹病毒，其是一种重组核苷酸序列的表达产物，所述核苷酸序列包含编码来自一种经批准的疫苗株的麻疹病毒(MV)的全长反基因组(+)RNA的核苷酸序列的cDNA分子，其中所述cDNA分子与一种异源核苷酸序列进行重组，所述异源核苷酸序列编码来自一种确定的异源逆转录病毒的或黄病毒的抗原的异源氨基酸序列。
8.权利要求7的重组麻疹病毒，其中所述cDNA分子包含2002年6月12日保藏的、保藏号为No.I-2889的质粒pTM-MVSchw中所含的***子，其中所述***子编码麻疹病毒全长反基因组(+)RNA链的核苷酸序列。
9.权利要求7或8的重组麻疹病毒，其中所述重组核苷酸序列来自2002年6月12日保藏的、保藏号为No.I-2890(CNCM)的质粒pTM-MVSchw2-gfp中所含的***子，其中gfp基因的序列被编码一种确定的氨基酸序列的序列取代。
10.权利要求7-9中任一项的重组麻疹病毒，其中所述cDNA分子选自以下序列：
-图11的核苷酸83至核苷酸15977的核苷酸序列
-图11的核苷酸29至核苷酸15977的核苷酸序列
-图11的核苷酸29至核苷酸16202的核苷酸序列
-图11的核苷酸26至核苷酸15977的核苷酸序列
-图11的核苷酸26至核苷酸16202的核苷酸序列
-图11的核苷酸9至核苷酸15977的核苷酸序列
-图11的核苷酸9至核苷酸16202的核苷酸序列。
11.权利要求2-10中任一项的重组麻疹病毒，其中所述异源氨基酸序列来自HIV逆转录病毒的逆转录病毒抗原，或来自黄病毒抗原。
12.权利要求2-9中任一项的重组麻疹病毒，其中所述异源氨基酸序列来自黄热病病毒或西尼罗河病毒的抗原。
13.权利要求2-11中任一项的重组麻疹病毒，其中所述异源氨基酸序列来自HIV逆转录病毒的包膜抗原。
14.权利要求13的重组麻疹病毒，其中所述异源氨基酸序列是HIV-1的重组gp160或重组gp120抗原。
15.权利要求14的重组麻疹病毒，其中gp120抗原的V1、V2和/或V3环被单独或联合地缺失或部分缺失，使得保守表位暴露于获得的重组gp120抗原上。
16.权利要求15的重组麻疹病毒，其中gp120抗原的V1、V2和/或V3环被单独或联合地取代或部分取代，使得保守表位暴露于获得的重组gp120抗原上。
17.权利要求16的重组麻疹病毒，其中所述V3环被gp41表位例如AAELDKWASAA取代。
18.权利要求11-16中任一项的重组麻疹病毒，其中所述异源氨基酸序列是gp160ΔV3、gp160ΔV1V2、gp160ΔV1V2V3、gp140ΔV3、gp140ΔV1V2、或gp140ΔV1V2V3。
19.权利要求2-12中任一项的重组麻疹病毒，其中所述氨基酸序列来自选自包膜(Env)蛋白或NS1蛋白或其免疫原性突变体的黄热病病毒抗原。
20.权利要求2-12的重组麻疹病毒，其中所述氨基酸序列来自选自包膜(E)或前膜(preM)或其免疫原性突变体的西尼罗河病毒抗原。
21.权利要求2-12的重组麻疹病毒，其能够诱导针对异源VLP或pM/E蛋白的保护。
22.权利要求2-21的重组麻疹病毒，其在对麻疹病毒敏感的动物模型中引发体液和/或细胞免疫应答。
23.权利要求2-22中任一项的重组麻疹病毒，其在对麻疹病毒敏感的哺乳动物模型中引发针对异源氨基酸序列的中和抗体。
24.权利要求2-23中任一项的重组麻疹病毒，其中所述异源氨基酸序列来自HIV-1包膜蛋白，且其在例如P4-CCR5细胞的指示细胞上检测时，引发能中和原代HIV分离株的抗体。
25.权利要求2-24中任一项的重组麻疹病毒，其在哺乳动物中引发针对所述异源氨基酸序列的中和抗体。
26.包含一种复制子的重组麻疹病毒载体，所述复制子包含(i)编码麻疹病毒全长反基因组(+)RNA的cDNA序列，所述cDNA可操作地连接于(ii)表达控制序列和(iii)编码一种确定的异源氨基酸序列的异源DNA序列，所述异源DNA序列在允许其表达的条件下克隆在所述复制子中，且所述复制子具有的核苷酸总数符合6倍规则。
27.权利要求26的重组麻疹病毒载体，其中所述异源DNA序列克隆在***对应于麻疹病毒的反基因组RNA的cDNA中的附加转录单位(ATU)中。
28.权利要求26的重组麻疹病毒载体，其中所述ATU的克隆位点选为位于MV病毒N基因上游。
29.权利要求26的重组麻疹病毒载体，其中所述ATU的克隆位点选为位于MV病毒P和M基因之间。
30.权利要求26的重组麻疹病毒载体，其中所述ATU的克隆位点位于MV病毒H和L基因之间。
31.权利要求26-29中任一项的重组麻疹病毒载体，其中所述异源DNA序列表达为与所述MV蛋白之一融合的融合蛋白。
32.权利要求26-29中任一项的重组麻疹病毒载体，其中所述异源DNA序列不表达为与所述MV蛋白之一融合的融合蛋白。
33.权利要求26-29中任一项的重组麻疹病毒载体，其中所述异源DNA序列编码一种逆转录病毒氨基酸序列。
34.权利要求26-32中任一项的重组麻疹病毒载体，其中所述异源DNA序列编码选自各种HIV逆转录病毒的逆转录病毒的抗原的逆转录病毒氨基酸序列。
35.权利要求26-32中任一项的重组麻疹病毒载体，其中所述异源DNA序列编码来自选自各种黄病毒的一种逆转录病毒的抗原的逆转录病毒氨基酸序列。
36.权利要求26-33中任一项的重组麻疹病毒载体，其中所述异源DNA序列编码来自HIV逆转录病毒的包膜抗原的逆转录病毒氨基酸序列。
37.权利要求26-33中任一项的重组麻疹病毒载体，其中所述异源DNA序列编码一种逆转录病毒氨基酸序列，所述氨基酸序列选自HIV-1的gp160、gap120或gp41、或HIV-1的gp140、或所述抗原的突变体形式。
38.权利要求26-36中任一项的重组麻疹病毒载体，其中所述突变抗原能够暴露中和表位。
39.权利要求26-37中任一项的重组麻疹病毒载体，其中所述异源DNA序列编码gp160ΔV3、gp160ΔV1V2、gp160ΔV1V2V3、gp140ΔV3、gp140ΔV1V2、或gp140ΔV1V2V3。
40.权利要求25-32中任一项的重组麻疹病毒载体，其中所述异源DNA序列编码一种黄病毒氨基酸序列，所述黄病毒氨基酸序列来自黄热病病毒或西尼罗河病毒的抗原。
41.权利要求26-40中任一项的重组麻疹病毒载体，其中所述包含由麻疹病毒的反基因组RNA逆转录产生的cDNA的核苷酸序列来自经许可作为疫苗的麻疹病毒毒株。
42.权利要求41的重组麻疹病毒载体，其中所述麻疹病毒株为Schwarz毒株。
43.权利要求42的重组麻疹病毒载体，其中所述编码麻疹病毒全长反基因组(+)RNA的cDNA和表达控制序列来自保藏号为No.I-2889的、保藏于CNCM的pTM-MVSchw。
44.权利要求26-42中任一项的重组麻疹病毒载体，其是质粒。
45.权利要求26-44中任一项的重组麻疹病毒载体，其中所述复制子根据图2所示进行设计，其中“***子”表示所述异源DNA序列。
46.权利要求26-45中任一项的重组麻疹病毒载体，其中所述异源DNA序列选自YFV17D204。
47.权利要求26-45中任一项的重组麻疹病毒载体，其中所述异源DNA序列选自神经毒性毒株IS-98-ST1。
48.权利要求43的重组麻疹病毒载体，其选自以下保藏在CNCM的载体：
pMV2(EdB)gp160[delta]V3HIV89.6P              CNCM I-2883
pMV2(EdB)gp160HIV89.6P                       CNCM I-2884
pMV2(EdB)gp140HIV89.6P                       CNCM I-2885
pMV3(EdB)gp140[delta]V3HIV89.6P              CNCM I-2886
pMV2(EdB)-NS1YFV17D                          CNCM I-2887
pMV2(EdB)-EnvYFV17D                          CNCM I-2888
pTM-MVSchw2-Es(WNV)                          CNCM I-3033
pTM-MVSchw2-GFPbis-                          CNCM I-3034
pTM-MVSchw2-p17p24[delta]myr(HIVB)           CNCM I-3035
pTM-MVSchw3-Tat(HIV89.6P)                    CNCM I-3036
pTM-MVSchw3-GFP                              CNCM I-3037
pTM-MVSchw2-Es(YFV)                          CNCM I-3038
pTM-MVSchw2-gp140[delta]V1V2V3(HIV89.6)      CNCM I-3054
pTM-MVSchw2-gp140[delta]V3(HIV89.6)          CNCM I-3055
pTM-MVSchw2-gp160[delta]V1V2V3(HIV89.6)      CNCM I-3056
pTM-MVSchw2-gp160[delta]V1V2(HIV89.6)        CNCM I-3057
pTM-MVSchw2-GagSIV239p17-p24[delta]myr-3-gp140(HIV89.6)
                                             CNCM I-3058。
49.用于组装表达异源氨基酸序列的重组麻疹病毒的拯救***，其包含用权利要求26-47中任一项的重组麻疹病毒载体转染的确定的细胞，并包含与至少一种适合表达T7 RNA聚合酶和表达麻疹病毒N、P和L蛋白的载体重组的确定的辅助细胞。
50.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1-26中任一项的重组病毒，或权利要求48中任一项的重组载体。
51.一种疫苗组合物，其包含权利要求1-26中任一项的重组病毒，或权利要求48中任一项的重组载体。
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