JP2003506039A - ｃＤＮＡからの流行性耳下腺炎ウイルスのレスキュー - Google Patents

ｃＤＮＡからの流行性耳下腺炎ウイルスのレスキュー

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、流行性耳下腺炎ウイルスのレスキューを介するセグメント化されない負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスの組換え的製造方法、およびそれから形成される免疫原組成物に関する。付加的態様は、弱毒および／もしくは感染性ウイルスとしての流行性耳下腺炎ウイルスの製造方法に関する。該組換えウイルスはｃＤＮＡクローンから製造し、そして、従って、ゲノムの代わりにヌクレオチド／ポリヌクレオチドの欠失、挿入、置換および再配列を包含する定義された変化を有するウイルスを得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、流行性耳下腺炎（ｍｕｍｐｓ）ウイルスすなわちセグメント化され
ない負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスの組換え的製造方法、およびそれから形成
される免疫原組成物に関する。付加的態様は、流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒お
よび／もしくは感染性ウイルスとしての製造方法に関する。該組換えウイルスは
ｃＤＮＡクローンから製造され、そして従って定義された変化をゲノム中に有す
るウイルスが得られる。本発明はまた、流行性耳下腺炎以外の病原体のための免
疫原性もしくは製薬学的組成物、遺伝子治療および細胞ターゲッティングを包含
する多くの用途のための外来遺伝情報、例えば外来遺伝子を発現するためのベク
ターとしてそれから形成される組換えウイルスの使用にも関する （発明の背景） エンベロープのある負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスは独特に組織かつ発現さ
れる。負センスの一本鎖ウイルスのゲノムＲＮＡは、ヌクレオキャプシドの情況
で：メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の合成のための鋳型、およびアンチゲノ
ム（＋）鎖の合成のための鋳型としての２種の鋳型機能を提供する。負センスの
一本鎖ＲＮＡウイルスは、それら自身のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコー
ドしかつパッケージングする。感染した細胞の細胞質にウイルスが進入すると、
メッセンジャーＲＮＡのみが合成される。ウイルス複製は、ｍＲＮＡの合成後に
起こり、そしてウイルスタンパク質の継続的合成を必要とする。新たに合成され
たアンチゲノム（＋）鎖は、（−）鎖のゲノムＲＮＡのさらなるコピーを生成さ
せるための鋳型としてはたらく。
【０００２】 流行性耳下腺炎の病因病原体は、最初に、ＪｏｈｎｓｏｎとＧｏｏｄｐａｓｔ
ｕｒｅにより１９３５年にウイルスであることが再現可能に示された（Ｊｏｈｎ
ｓｏｎとＧｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ、１９３５）。そのとき以来、組織培養物中で
の増殖が、ウイルスの分類および流行性耳下腺炎ウイルス（ＭＵＶ）の生物学的
特性に関する研究を助長した。もともと、ミクソウイルス科のインフルエンザウ
イルスで分類された流行性耳下腺炎ウイルスは、以来、ヌクレオキャプシドの形
態学、ゲノムの構成およびタンパク質の生物学的特性に基づき、パラミクソウイ
ルス科、パラミクソウイルス亜科、ルブラウイルス属に再割り当てされている。
ルブラウイルス属の他の例は、シミアンウイルス５（ＳＶ５）、ヒトパラインフ
ルエンザウイルスタイプ２およびタイプ４、ならびにニューカッスル病ウイルス
を包含する（ＬａｍｂとＫｏｌａｋｏｆｓｋｙ、１９９６）。パラミクソウイル
ス科の全部のウイルスと同様、流行性耳下腺炎ウイルスは形状が多形態性であり
、リボ核タンパク質コアを取り巻く宿主細胞由来の脂質膜を含んで成り；このヌ
クレオキャプシドコアは、ウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）と
緊密に会合した１５，３８４ヌクレオチドのセグメント化されない負センスＲＮ
Ａゲノムより構成されるらせん構造を形成する。ＭＵＶゲノムの遺伝子構成は３
’−ＮＰ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−ＳＨ−ＨＮ−Ｌ−５’であると決定されている（Ｅｌａ
ｎｇｏら、１９９８）。各遺伝子は、Ｐシストロン（これから３種の独特のｍＲ
ＮＡが転写される）を除き単一のタンパク質をコードし；１つはＶタンパク質を
コードするＰ遺伝子の正確なコピーであり、他の２種のｍＲＮＡはＲＮＡエディ
ティング機構により転写の間に挿入される２および４個の鋳型にされない（ｎｏ
ｎ−ｔｅｍｐｌａｔａｅｄ）Ｇ残基を含有し、かつ、それぞれＰおよびＩタンパ
ク質をコードする（ＰａｔｅｒｓｏｎとＬａｍｂ、１９９０）。ＰおよびＬタン
パク質は、ヌクレオキャプシドとともに流行性耳下腺炎ウイルスの機能的ＲＮＡ
ポリメラーゼ複合体を形成する。ＦおよびＨＮタンパク質はビリオンの表面から
突出する不可欠な膜タンパク質であり、かつ、細胞のウイルスの付着および進入
に関与する。小さな疎水姓タンパク質（ＳＨ）およびマトリックス（Ｍ）タンパ
ク質もまた膜会合性であり（Ｔａｋｅｕｃｈｉら、１９９６およびＬａｍｂとＫ
ｏｌａｋｏｆｓｋｙ、１９９６）；ウイルスの成長におけるＶおよびＩタンパク
質の役割は未だ明白でない。
【０００３】 流行性耳下腺炎ウイルスの複製周期は、宿主細胞原形質膜とのウイルスエンベ
ロープの融合、および細胞の細胞質中へのウイルスのヌクレオキャプシドのその
後の放出に際して開始する。その後一次転写が起こり、全ウイルスタンパク質の
産生をもたらし；ウイルスゲノムの複製への切替えが後に起こり、次いでウイル
ス成分が集成して新たなウイルス粒子を形成し、それらが宿主細胞の原形質膜か
ら発芽する。無傷のヌクレオキャプシド構造のみが、ＲＮＡの転写、複製および
その後のウイルス増幅の鋳型として作用することができ；その中にＭＵＶおよび
他の負鎖ＲＮＡウイルスの遺伝子操作における困難が存する。裸のゲノムＲＮＡ
が感染性でありかつ感染性ウイルスが付加的ウイルス因子の非存在下でゲノムの
１コピーのｃＤＮＡから回収することができる正鎖ＲＮＡウイルスと異なり（Ｔ
ａｎｉｇｕｃｈｉら、１９７８；ＲａｃａｎｉｅｌｌｏとＢａｌｔｉｍｏｒｅ、
１９８１）、負鎖ＲＮＡウイルスの裸のゲノムは感染性でなく、また、ｃＤＮＡ
からのウイルスのレスキューは、全部がバクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーターの制御下の完全長の正センスもしくは負センスのゲノムＲＮ
Ａ転写物と一緒にウイルスのＮＰ、ＰおよびＬタンパク質の細胞内の共発現を必
要とする（Ｓｃｈｎｅｌｌら、１９９４；Ｌａｗｓｏｎら １９９５；Ｗｈｅｌ
ａｎら、１９９５；Ｒａｄｅｃｋｅら、１９９５；Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９５
；ＨｏｆｆｍａｎとＢａｎｅｒｊｅｅ、１９９７；Ｄｕｒｂｉｎら、１９９７；
Ｈｅら、１９９７；ＢａｒｏｎとＢａｒｒｅｔｔ、１９９７；Ｊｉｎら、１９９
８；Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、１９９９；Ｐｅｅｔｅｒｓら、１９９９）。報告され
た系の全部において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、共感染させる組換えワクシ
ニアウイルス（Ｆｕｅｒｓｔら、１９８６；Ｗｙａｔｔら、１９９５）もしくは
形質転換された細胞系におけるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの内在性の発現（Ｒａ
ｄｅｃｋｅら、１９９５）のいずれかにより供給されている。
【０００４】 ポリメラーゼ複合体は、ゲノムの３’端、とりわけプロモーター領域でシスに
作用するシグナルを拘束することにより転写および複製を起動かつ達成する。そ
の後、ウイルス遺伝子が、その３’からその５’端へ一方向でゲノム鋳型から転
写される。一般に、それらの上流の隣接物（ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ）（すなわち核
タンパク質遺伝子（ＮＰ））に関して、下流の遺伝子（例えばポリメラーゼ遺伝
子（Ｌ））から作成されるより少ないｍＲＮＡが存在する。従って、ゲノムの３
’端に関して該遺伝子の位置に従ったｍＲＮＡの豊富さの勾配が常に存在する。
【０００５】 こうしたセグメント化されないＲＮＡウイルスの分子遺伝学的分析は、裸のゲ
ノムＲＮＡもしくはトランスフェクションされたプラスミドから細胞内で産生さ
れたＲＮＡが感染性でないために、最近まで困難と判明していた（Ｂｏｙｅｒと
Ｈａｅｎｎｉ、１９９４）。これらの方法は本明細書で「レスキュー（ｒｅｓｃ
ｕｅ）」と称される。数種の組換えのセグメント化されない負鎖ＲＮＡウイルス
の単離を可能にするｃＤＮＡレスキュー方法の操作方法に関する刊行物が存在す
る（Ｓｃｈｎｅｌｌら、１９９４）。これらの多様な負鎖ウイルスのレスキュー
のための技術が普遍的なテーマのあとに続くが；しかしながら、各ウイルスは成
功裏のレスキューのための識別する不可欠の成分を有する（ＢａｒｏｎとＢａｒ
ｒｅｔｔ、１９９７；Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９５；Ｇａｒｃｉｎら、１９９５
；ＨｏｆｆｍａｎとＢａｎｅｒｊｅｅ、１９９７；Ｌａｗｓｏｎら、１９９５；
Ｒａｄｅｃｋｅら、１９９５；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９７；Ｈｅら、１９
９７；Ｓｃｈｎｅｌｌら、１９９４；Ｗｈｅｌａｎら、１９９５）。ゲノムｃＤ
ＮＡプラスミドのトランスフェクション後に、ファージのＴ７ ＲＮＡポリメラ
ーゼ、およびＲＮＡを切断して３’末端を形成するベクターにコードされるリボ
ザイム配列の組み合わせられた作用により、ゲノムＲＮＡの正確な１コピーが産
生される。このＲＮＡは、コトランスフェクションされた発現プラスミドにより
最初に供給されるウイルスタンパク質によりパッケージングかつ複製される。流
行性耳下腺炎ウイルスの場合、レスキュー方法は未だ確立されなければならず、
そして従って流行性耳下腺炎のレスキュー方法を考案する必要性が存在する。流
行性耳下腺炎ウイルスのレスキュー方法の考案は、他のＲＮＡウイルスに関する
研究と比較して、流行性耳下腺炎ウイルスの生物学に関する広範囲の研究の非存
在により複雑である。また、流行性耳下腺炎ウイルスは組織培養系で効率的に成
長しない。さらに、流行性耳下腺炎ウイルスゲノムの末端の配列は、以前に、レ
スキューを実施するのに十分に詳細に特徴づけられていない。
【０００６】 ｃＤＮＡからの流行性耳下腺炎ウイルスの成功裏のレスキューが達成されるた
めには：１）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるゲノムもしくはアンチゲノムＲＮ
Ａの正確な完全長の合成、およびリボザイム配列による３’端のプロセシング；
２）複製を開始するのに適切なレベルでのウイルスのＮＰ、ＰおよびＬタンパク
質の合成；３）転写的に活性かつ複製能力のあるヌクレオキャプシド構造へのゲ
ノムＲＮＡの新たなパッケージング；ならびに４）複製が進行するのに十分なレ
ベルでの新たに形成されたヌクレオキャプシドからのウイルス遺伝子の発現、を
包含する多数の分子事象がトランスフェクション後に起こらなくてはならない。
【０００７】 本発明は、組換え的に生じる流行性耳下腺炎ウイルスのレスキュー方法を提供
する。レスキューされた流行性耳下腺炎ウイルスは、抗体生成、診断、予防およ
び治療の用途、細胞ターゲッティング、突然変異体ウイルスの製造ならびに免疫
原組成物の製造のような多数の用途を所有する。さらに、これらの用途への流行
性耳下腺炎の組換え的に製造されたＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株を使用することに対
する多数の利点が存在する。これらの利点のいくつかは、（１）弱毒表現型、（
２）投与される１億を超える投薬量に基づく実質的な安全性の記録、（３）単回
投与で長期間持続する免疫を誘導する能力、および（４）比較的低レベルのゲノ
ム組換えを包含する。
【０００８】 （発明の要約） 本発明は、最低１個の宿主細胞中で、（ｉ）流行性耳下腺炎ウイルスのゲノム
もしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る単離され
た核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに（ｉｉ）被包化、転写および複
製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低１種の単離された核
酸分子を含んで成る最低１種の発現ベクター、を含んで成るレスキュー組成物の
トランスフェクションを実施することを含んで成る、組換え流行性耳下腺炎ウイ
ルスの製造方法を提供する。該トランスフェクションは、これらのベクターの共
発現および該組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で実施する。
その後、組換えウイルスを収穫する。
【０００９】 付加的な態様は、ｍＲＮＡの転写に際して、１種もしくはそれ以上の流行性耳
下腺炎ウイルスの以下のタンパク質、すなわちＮＰ、Ｍ、Ｆ、ＳＨ、ＨＮ Ｌ、
ならびに上に示されたとおり流行性耳下腺炎ウイルスのＰ「シストロン」から生
成られるＶ、ＰおよびＩタンパク質、またはこれらのいずれかの組み合わせを発
現するヌクレオチド配列に関する。関係する態様はこうしたヌクレオチド配列を
含んで成る核酸分子に関する。本発明の好ましい一態様は配列番号１、１１およ
び１２のヌクレオチド配列である。さらなる態様は、これらのヌクレオチド、上
の流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質およびそれらの変異体のアミノ酸配列に関
する。
【００１０】 本発明のタンパク質およびヌクレオチド配列は、流行性耳下腺炎ウイルスの診
断、予防および治療の利用性を所有する。これらの配列を使用して、被包化、複
製もしくは増幅を介する正常なウイルスの発生を妨害もしくは中断する化合物に
ついてのスクリーニング系を設計することができる。該ヌクレオチド配列はまた
、流行性耳下腺炎ウイルス、および／もしくは外来遺伝子を発現させるのに使用
される場合は他の病原体のための免疫原組成物の製造でも使用することができる
。加えて、発現される外来遺伝子は治療的用途を有することができる。
【００１１】 好ましい態様において、感染性の組換えウイルスは、免疫原組成物、ならびに
流行性耳下腺炎ウイルスによる感染および／もしくは他の病原体による感染の治
療もしくは予防方法（該方法はこうした組成物を使用する）での使用のため製造
される。
【００１２】 代替の態様において、本発明は、弱毒、感染性もしくは双方である組換え流行
性耳下腺炎ウイルスの生成方法を提供する。該組換えウイルスはｃＤＮＡクロー
ンから製造され、そして、従って、定義された変化をゲノム中に有するウイルス
を得ることができる。さらなる態様は、コンセンサスゲノム配列、および／もし
くは外来遺伝子を発現するためのＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株の流行性耳下腺炎の集
団内のゲノム配列のいずれかを使用する。なぜなら、この免許をうけたワクチン
株は安全性について確立した弱毒表現型を包含するからである。コンセンサス配
列は流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムの提案された平均（ａｖｅｒａｇｅ）由来
であるため、Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株の集団内のゲノムのポリヌクレオチド配列
は本発明の態様である。
【００１３】 本発明はまた、流行性耳下腺炎以外の病原体のための免疫原組成物、遺伝子治
療および細胞ターゲッティングを包含する多くの用途のための外来遺伝情報、例
えば外来遺伝子を発現するためのベクターとしての、それから形成された組換え
ウイルスの使用にも関する。
【００１４】 本明細書で詳細に論考される、上で同定された態様および付加的態様は、本発
明の目的を表す。
【００１５】 一次配列の簡単な要約 配列１は、アンチゲノム（＋，５’〜３’）、メッセージセンスにおいて書か
れている、流行性耳下腺炎ウイルスのＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株についての全長ゲ
ノムの共通ヌクレオチド配列（配列番号：１）である。
【００１６】 配列２は、流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株ＮＰタンパク質の
アミノ酸配列（配列番号：２）である。
【００１７】 配列３は、流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株Ｐタンパク質のア
ミノ酸配列（配列番号：３）である。
【００１８】 配列４は、流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株Ｉタンパク質のア
ミノ酸配列（配列番号：４）である。
【００１９】 配列５は、流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株Ｖタンパク質のア
ミノ酸配列（配列番号：５）である。
【００２０】 配列６は、流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株Ｍタンパク質のア
ミノ酸配列（配列番号：６）である。
【００２１】 配列７は、流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株Ｆタンパク質のア
ミノ酸配列（配列番号：７）である。
【００２２】 配列８は、流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株ＳＨタンパク質の
アミノ酸配列（配列番号：８）である。
【００２３】 配列９は、流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株ＨＮタンパク質の
アミノ酸配列（配列番号：９）である。
【００２４】 配列１０は、流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株Ｌタンパク質の
アミノ酸配列（配列番号：１０）である。
【００２５】 配列１１は、プラーク２についての流行性耳下腺炎Ｊｅｒｙｌ ＬｙｎｎＪＬ
５変異株の完全ヌクレオチド配列（配列番号：１１）である。プラーク１は、５
ヌクレオチド位置においてプラーク２とは異なる（表７参照）。配列はアンチゲ
ノム（＋，５’〜３’）センスにおけるＤＮＡとして書かれている。
【００２６】 配列１２は、プラーク２についてのムンプスＪｅｒｙｌ ＬｙｎｎＪＬ２変異
株の完全ヌクレオチド配列（配列番号：１２）である。プラーク１は、５ヌクレ
オチド位置においてプラーク２とは異なる（表７参照）。配列はアンチゲノム（
＋，５’〜３’）センスにおけるＤＮＡとして書かれている。
【００２７】 （発明の詳細な記述） 上に示されたとおり、本発明は組換え流行性耳下腺炎ウイルス（ＭＵＶ）の製
造方法に関する。当該技術分野におけるこうした方法は「レスキュー」もしくは
逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）遺伝子的方法と称される。多様なセグメント化されない負
鎖ウイルスのためのいくつかのレスキュー方法が以下の引用される刊行物に開示
される：ＢａｒｏｎとＢａｒｒｅｔｔ、１９９７；Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９５
；Ｇａｒｃｉｎら、１９９５；Ｈｅら、１９９７；ＨｏｆｆｍａｎとＢａｎｅｒ
ｊｅｅ、１９９７；Ｌａｗｓｏｎら、１９９５；ＲａｄｅｃｋｅとＢｉｌｌｅｔ
ｅｒ、１９９７；Ｒａｄｅｃｋｅら、１９９５；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９
７；Ｓｃｈｎｅｌｌ、１９９４；Ｗｈｅｌａｎら、１９９５。レスキューに関す
る付加的刊行物は、ＭＶおよびパラミクソウイルス亜科の他のウイルスについて
公開国際特許出願第ＷＯ ９７／０６２７０号明細書、およびＲＳＶのレスキュ
ーについて公開国際特許出願第ＷＯ ９７／１２０３２号明細書を包含する。
【００２８】 組換え流行性耳下腺炎ウイルスのレスキューを実施する前に、流行性耳下腺炎
ウイルス（Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株）全体のコンセンサス配列を発生させること
、およびまた流行性耳下腺炎ウイルス（ＭＵＶ）のミニレプリコンレスキュー系
を開発することが必要であった。コンセンサス配列は、細胞の流行性耳下腺炎ウ
イルス感染の間に存在するＲＮＡゲノムの集団をサンプリングすることにより得
られる。相応して、本発明のさらなる態様は、流行性耳下腺炎ウイルスのゲノム
もしくはアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド配列またはその
タンパク質、ならびにこうした配列の変異体に関する。好ましくは、高ストリン
ジェンシーの条件下で、これらの変異体配列は１種もしくはそれ以上の流行性耳
下腺炎タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする（流行性
耳下腺炎ウイルスタンパク質の遺伝子の開始および遺伝子の終止端を包含する流
行性耳下腺炎ウイルスの完全な地図については、図９の表２を参照されたい）。
より好ましくは、高ストリンジェンシーの条件下で、これらの変異体配列は、配
列番号１、１１および１２のポリヌクレオチド配列のような１種もしくはそれ以
上の流行性耳下腺炎ウイルス株をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズ
する。高ストリンジェンシーのサザンハイブリダイゼーション条件を定義する目
的上、便宜的にＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）のｐｐ．３８７−３８９（引用
することにより本明細書に組み込まれる）に言及することができ、ここでは第１
１段落の洗浄段階が高ストリンジェンシーと考えられる。本発明はまた、ポリヌ
クレオチド配列がヌクレオチド三重項の第三のヌクレオチドへの変化により参照
配列と異なる保存的変異体にも関する。好ましくは、これらの保存的変異体は流
行性耳下腺炎ウイルスの参照ポリヌクレオチドの参照配列に対する生物学的同等
物として機能する。本発明の「単離された」配列は天然に存在しない配列である
。例えば、これらの配列はウイルスのゲノム内でそれらの正常な状態から単離す
ることができるか；または、該配列は合成である（すなわち公知の組換え発現系
のような組換え技術を介して生成されるかもしくは機械により生成される）こと
ができる。
【００２９】 本発明はまた、こうしたポリヌクレオチドの１種もしくはそれ以上を含んで成
る核酸分子にも関する。上に示されたとおり、所定のヌクレオチドコンセンサス
配列は、Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株のような流行性耳下腺炎ウイルスの集団内のゲ
ノムの１種もしくはそれ以上を含有することができる。特定の態様は配列番号１
、１１もしくは１２のコンセンサスヌクレオチド配列、または、転写される場合
に流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質（ＮＰ、Ｐ／Ｉ／Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＳＨ、ＨＮ
およびＬ）の１種もしくはそれ以上を発現するヌクレオチド配列を使用する。こ
れらの流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質の遺伝子の開始、翻訳開始、翻訳終止
および遺伝子の終止については図１０の表３を参照されたい。
【００３０】 さらなる態様は、それぞれ配列番号２−１０に示されるような流行性耳下腺炎
ウイルスタンパク質ＮＰ、Ｐ／Ｉ／Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＳＨ、ＨＮおよびＬのアミノ酸
配列、ならびにまたそれらのフラグメントもしくは変異体に関する。好ましくは
、フラグメントおよび変異体のアミノ酸配列、ならびに流行性耳下腺炎ウイルス
タンパク質を発現する変異体のヌクレオチド配列は、弱毒であるにしろ感染性で
あるにしろ双方であるにしろ、所望の組換え流行性耳下腺炎ウイルスを得るため
に、生物学的に同等である（すなわち、それらは、該タンパク質の実質的に同一
の機能を保持する）。こうした変異体のアミノ酸配列は本発明のポリヌクレオチ
ド配列によりコードされる。こうした変異体のアミノ酸配列は、流行性耳下腺炎
ウイルスタンパク質のアミノ酸配列に対する約７０％ないし約８０％、そして好
ましくは約９０％の全体的類似性を有することができる。変異体ヌクレオチド配
列は、転写される場合に流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質のアミノ酸配列もし
くは流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質の変異体のアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列に対する約７０％ないし約８０％および好ましくは約９０％のい
ずれかの全体的類似性を有することができる。流行性耳下腺炎ウイルスタンパク
質ＮＰ、Ｐ／Ｉ／Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＳＨ、ＨＮおよびＬについての例示的ヌクレオチ
ド配列は、（それぞれ図８および９の）表１および２に記述する。
【００３１】 生物学的同等物は、ヌクレオチド配列もしくはタンパク質配列の変異体を生成
させることにより得ることができる。変異体は、鋳型配列の挿入、置換、欠失も
しくは再配列であることができる。流行性耳下腺炎のポリヌクレオチド配列の変
異体は、ＰＣＲ突然変異誘発、アミノ酸（アラニン）スクリーニングおよび部位
特異的突然変異誘発のような慣習的方法により生成させることができる。変異体
の表現型は、変異体でのレスキューを実施して所望の組換え流行性耳下腺炎ウイ
ルスが得られるかもしくは所望の生物学的効果が得られるかどうかを評価するこ
とにより評価することができる。変異体はまた、所望の使用が免疫原組成物中に
ある場合は抗原性についても評価することができる。
【００３２】 アミノ酸変化はヌクレオチド配列のコドンを変化させることにより得ることが
できる。こうした変化はアミノ酸配列中のあるアミノ酸の代わりに他のアミノ酸
を用いることに基づき得ることができることが既知である。例えば、代替のアミ
ノ酸の置換により、タンパク質に小さなコンホメーション変化を賦与することが
でき、これは流行性耳下腺炎ウイルスの他のタンパク質と結合もしくは相互作用
する低下された能力をもたらすことができる。付加的な変化は、組換え流行性耳
下腺炎ウイルスの弱毒化のレベルを変えることができる。
【００３３】 ポリペプチドへの相互作用する生物学的機能の賦与において、ＫｙｔｅとＤｏ
ｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）により論考されたようなアミノ酸のハイドロパシー
指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）を使用することができ、ここでは
ある種のアミノ酸を類似のハイドロパシー指標を有する他のアミノ酸の代わりに
用いることができ、かつ、なお類似の生物学的活性を保持することができること
が見出された。あるいは、とりわけ生成されるべきポリペプチド中で望ましい生
物学的機能が免疫学的態様での使用を意図している場合には、親水性に基づいて
同様のアミノ酸の置換を行うことができる。例えば、その隣接するアミノ酸の親
水性により支配されるようなある「タンパク質」の最大の局所の平均の親水性が
その免疫原性と相関すると述べている、米国特許第４，５５４，１０１号明細書
（これにより引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。従
って、置換は各アミノ酸に割り当てられる親水性に基づいて行うことができるこ
とが注目される。
【００３４】 値を各アミノ酸に割り当てる親水性指標もしくはハイドロパシー指標のいずれ
かの使用において、これらの値が±２であり、±１がとりわけ好ましく、また、
±０．５以内のものが最も好ましい置換であるアミノ酸の置換を導入することが
好ましい。
【００３５】 本発明のヌクレオチド配列によりコードされる流行性耳下腺炎ウイルスタンパ
ク質の好ましい特徴は、以下、すなわち（ａ）膜タンパク質であるか、もしくは
膜と直接会合されるタンパク質である；（ｂ）ＳＤＳアクリルアミド（１０％）
ゲルを使用して１個のタンパク質として分離されることが可能である；ならびに
（ｃ）他の適切な流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質の存在下での所望の組換え
流行性耳下腺炎ウイルスのレスキューおよび産生への寄与においてその生物学的
機能を保持する、の１種もしくはそれ以上を包含する。
【００３６】 上のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を手にすれば、その場合は流行性耳下腺
炎ウイルスのレスキューにおいて進むことができる。流行性耳下腺炎のレスキュ
ーは、レスキュー組成物を使用して媒体中で最低１個の宿主細胞のトランスフェ
クションもしくは形質転換を実施することにより達成される。レスキュー組成物
は（ｉ）流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする最
低１種のポリヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る転
写ベクター、ならびに（ｉｉ）被包化、転写および複製に必要なトランスに作用
するタンパク質をコードする１種もしくはそれ以上の単離された核酸分子（１種
もしくは複数）を含んで成る最低１種の発現ベクターを；前記ベクターの共発現
および該組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下に含んで成る。ア
ンチゲノムにより、子孫のゲノムの合成の鋳型として作用する単離された正のメ
ッセージセンスポリヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、ポリヌクレオチ
ド配列は、転写する複製するヌクレオキャプシドを生成させるのに必要なタンパ
ク質をコードする相補配列の正のセンス転写物とハイブリダイズする可能性を最
小限にするために、転写に際して、複製性の中間体ＲＮＡに対応する流行性耳下
腺炎ゲノムの正センスのバージョンもしくはアンチゲノムを提供するよう構築さ
れるｃＤＮＡである。転写ベクターは遺伝子要素、または流行性耳下腺炎の発現
において調節性の役割を有する要素、例えばプロモーター、構造遺伝子もしくは
流行性耳下腺炎ＲＮＡに転写されるコーディング配列、ならびに適切な転写開始
および終止配列の集成物を含んで成る、操作可能に連結された転写ユニットを含
んで成る。
【００３７】 転写ベクターは、ＲＮＡ複製が可能なヌクレオキャプシドを産生しかつまた子
孫のヌクレオキャプシドをＲＮＡの複製および転写双方に対して能力があるよう
にするのに必要である、流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質、ＮＰ、ＰおよびＬ
と共発現される。ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質は、必要とされるタンパク質をコ
ードする１種もしくはそれ以上の発現ベクター（例えばプラスミド）から生成さ
れるが、とは言えこれらの必要とされるタンパク質の１種、または１種もしくは
それ以上は、安定な形質転換体としてこれらのウイルス特異的遺伝子および遺伝
子産物を含有しかつ発現するように工作された選択された宿主細胞内で産生させ
ることができる。好ましい一態様において、ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質は１個
の発現ベクターから発現される。より好ましくは、ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質
はそれぞれプラスミドのような別個の発現ベクターから発現される。後者の場合
、トランスフェクションもしくは形質転換の間に提供される各タンパク質の相対
的量をより容易に制御することができる。付加的な流行性耳下腺炎ウイルスタン
パク質は、ＮＰ、ＰもしくはＬを発現するプラスミドから発現させることができ
るか、または、付加的タンパク質は付加的プラスミドを使用することにより発現
させることができる。
【００３８】 ＮＰ、ＰおよびＬの量はそれらの発現に対する宿主細胞の耐性に依存して変動
することができるが、ＮＰ、ＰおよびＬを発現するプラスミドは、細胞内でＮＰ
、ＰおよびＬの有効なモル比を達成するよう調節される。有効なモル比は、所望
の組換え流行性耳下腺炎ウイルスの成功裏のレスキューを提供するのに十分であ
るＮＰ、ＰおよびＬの比である。これらの比は、ミニレプリコン（ＣＡＰ／レポ
ーター）アッセイで観察されるところの発現プラスミドの比に基づいて得ること
ができる。一態様において、トランスフェクションするプラスミドｐＭＵＶＮＰ
：ｐＭＵＶＰの分子比は最低約１６：１であり、また、ｐＭＵＶＰ：ｐＭＵＶＬ
は最低約１：６である。好ましくは、ｐＭＵＶＮＰ：ｐＭＵＶＰの分子比は約１
６：１ないし約４：１であり、また、ｐＭＵＶＰ：ｐＭＵＶＬは約１：６ないし
約１：１である。より好ましくは、ｐＭＵＶＮＰ：ｐＭＵＶＰの比は約６：１な
いし約５：１であり、かつ、ｐＭＵＶＰ：ｐＭＵＶＬは約１：３ないし約１：２
である。
【００３９】 流行性耳下腺炎ウイルス発現プラスミドｐＭＵＶＮＰ、ｐＭＵＶＰおよびｐＭ
ＵＶＬと一緒のゲノムｃＤＮＡプラスミドのトランスフェクションもしくは形質
転換後に、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡを切断して３’末
端を形成するベクターにコードされるリボザイム配列の組み合わせられた作用に
より、正確な１コピーのゲノムＲＮＡが産生される。このＲＮＡは、コトランス
フェクションされた発現プラスミドにより最初に供給されるウイルスタンパク質
によりパッケージングかつ複製される。流行性耳下腺炎ウイルスのレスキューの
場合、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する供給源を、ＮＰ、ＰおよびＬの供給
源（１種もしくは複数）とともに宿主細胞（もしくは細胞系）に添加する。流行
性耳下腺炎のレスキューは、適切に配置されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーター、および流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質ＮＰ、ＰおよびＬをコードす
る発現プラスミド（１種もしくは複数）を含有する流行性耳下腺炎ウイルスのゲ
ノムｃＤＮＡクローンでこの細胞系をコトランスフェクションすることにより達
成する。
【００４０】 流行性耳下腺炎のレスキューのためには、所望のウイルスゲノムのクローン化
されたＤＮＡ同等物を、適するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（
例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）と、適する転写ベクター（例え
ば細菌プラスミド）に挿入される自己切断型リボザイム配列（例えばδ型肝炎リ
ボザイム）との間に配置する。この転写ベクターは容易に操作可能なＤＮＡ鋳型
を提供し、それからＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）が
、正確なもしくはほぼ正確な５’および３’末端をもつウイルスアンチゲノム（
もしくはゲノム）の１本鎖ＲＮＡのコピーを転写する。ウイルスゲノムＤＮＡの
コピーならびに隣接するプロモーターおよびリボザイム配列の向きが、アンチゲ
ノムのＲＮＡ同等物が転写されるかゲノムのＲＮＡ同等物が転写されるかを決定
する。
【００４１】 従って、該レスキュー方法においてはレスキュー組成物を使用する。レスキュ
ー組成物は、特定の必要性もしくは用途について所望されるように変動させるこ
とができる。レスキュー組成物の一例は、（ｉ）流行性耳下腺炎ウイルスのゲノ
ムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る単離さ
れた核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに（ｉｉ）被包化、転写および
複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低１種の単離された
核酸分子を含んで成る最低１種の発現ベクターを含んで成る組成物である。宿主
細胞中でのレスキュー組成物のトランスフェクションがこれらのベクターの共発
現および組換え流行性耳下腺炎ウイルスの産生をもたらすような転写および発現
ベクターを選択する。
【００４２】 上に示されたとおり、単離された核酸分子は流行性耳下腺炎ウイルスの最低１
種のゲノムもしくはアンチゲノムをコードする配列を含んで成る。該単離された
核酸分子は、ゲノム、アンチゲノムもしくはそれらの改変されたバージョンをコ
ードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。一態様において、該ポリヌ
クレオチドは、操作可能に連結されたプロモーター、所望のゲノムもしくはアン
チゲノム、自己切断型リボザイム配列および転写ターミネーターをコードする。
【００４３】 本発明の好ましい一態様において、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの挿入
、再配列、欠失もしくは置換により野性型流行性耳下腺炎ウイルスから改変され
ているゲノムもしくはアンチゲノムをコードする。好ましい態様において、ポリ
ヌクレオチド配列は組換え流行性耳下腺炎ウイルスのｃＤＮＡクローンをコード
する。複製するウイルスをレスキューから得る能力は、本来のゲノムおよびアン
チゲノムをコードするポリヌクレオチドがますます改変される際に減少すること
ができることが提案されている。ゲノムもしくはアンチゲノム配列は、流行性耳
下腺炎ウイルスのいずれかの株のもの由来であることができる。ポリヌクレオチ
ド配列はまた、１種もしくはそれ以上の異種供給源からのゲノムもしくはアンチ
ゲノムまたは遺伝子を組換え的に結合することから形成されるキメラゲノムもコ
ードすることができる。
【００４４】 本発明の方法により形成される組換えウイルスは、診断的研究におけるツール
として、または治療もしくは予防的免疫原組成物として使用することができるた
め、ポリヌクレオチドは選択された流行性耳下腺炎ウイルスの野性型もしくは弱
毒の形態もまたコードすることができる。多くの態様において、ポリヌクレオチ
ドは弱毒の感染性の形態の流行性耳下腺炎ウイルスをコードする。とりわけ好ま
しい態様において、ポリヌクレオチドは、公開国際特許出願第ＷＯ ９８／１３
５０１号明細書（これにより引用することにより組み込まれる）により記述され
るような、３’ゲノムプロモーター領域中に最低１個の弱毒突然変異を有しかつ
ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子中に最低１個の弱毒突然変異を有する流行性耳下腺炎
ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする。
【００４５】 上述されたような改変された形態の所望の流行性耳下腺炎のゲノムおよびアン
チゲノムをコードするポリヌクレオチド配列に加え、該ポリヌクレオチド配列は
また、１種もしくはそれ以上の異種遺伝子もしくは所望の異種ヌクレオチド配列
と一緒に所望のゲノムもしくはアンチゲノムもコードすることができる。これら
の変異体は、選択されたヌクレオチド配列を、流行性耳下腺炎のゲノムもしくは
アンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列中に導入することにより調製す
る。好ましくは、所望の異種配列を流行性耳下腺炎ゲノムの遺伝子間領域内に挿
入する。しかしながら、所望の異種配列は、流行性耳下腺炎のポリヌクレオチド
配列の非コーディング領域内に挿入することができるか、もしくは非コーディン
グ領域とコーディング領域との間に挿入することができるか、もしくはポリヌク
レオチド配列のいずれかの端に挿入することができる。代替の態様において、所
望の異種配列は、非必須遺伝子のコーディング領域内に、もしくは非必須遺伝子
のコーディング領域の代わりに挿入することができる。挿入部位の選択は、流行
性耳下腺炎ウイルスの発現の３’から５’への勾配を利用することができる。異
種ヌクレオチド配列（例えば遺伝子）を所望のとおり変動させることができる。
所望の組換えウイルスの用途に依存して、異種ヌクレオチド配列は、補助因子、
（インターロイキンのような）サイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ、制限マ
ーカー、アジュバント、または多様な微生物病原体（例えばウイルス、細菌、真
菌もしくは寄生虫）のタンパク質、とりわけ保護的免疫応答を導き出すことが可
能なタンパク質をコードすることができる。所望の流行性耳下腺炎ウイルスもし
くはミニレプリコンウイルスベクターのレスキューの見込みを最大限にするため
に、補助因子、（インターロイキンのような）サイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピ
トープ、制限マーカー、アジュバント、または多様な微生物病原体（例えばウイ
ルス、細菌もしくは真菌）のタンパク質の免疫原性の部分をコードする異種配列
を選択することが望ましいことができる。他の型の非流行性耳下腺炎部分は、限
定されるものでないが癌細胞もしくは腫瘍細胞からのもの、アレルゲンアミロイ
ドペプチド、タンパク質もしくは他の巨大分子成分を挙げることができる。例え
ば、ある態様において、異種遺伝子は、組換えウイルスの予防的もしくは治療的
特徴を向上させるために選択されるインターロイキン−１２のようなサイトカイ
ンをコードする。
【００４６】 こうした癌細胞もしくは腫瘍細胞の例は、限定されるものでないが前立腺特異
的抗原、癌胎児性抗原、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５およびＭＡＧＥ−
３を挙げることができる。
【００４７】 こうしたアレルゲンの例は、限定されるものでないが、米国特許第５，８３０
，８７７号明細書および公開国際特許出願第ＷＯ ９９／５１２５９号明細書（
これにより引用することにより組み込まれる）に記述されるものを挙げることが
でき、また、花粉、昆虫毒、動物の鱗屑、真菌の胞子および（ペニシリンのよう
な）薬物を包含する。こうした成分はＩｇＥ抗体（アレルギー反応の既知の原因
）の産生を妨害する。
【００４８】 アミロイドペプチドタンパク質（ＡＰＰ）は、アルツハイマー病、アミロイド
ーシスもしくはアミロイド原性疾患と多様に称される疾患に関与している。β−
アミロイドペプチド（Ａβペプチドともまた称される）はＡＰＰの４２アミノ酸
のフラグメントであり、これはβおよびγ分泌酵素酵素によるＡＰＰのプロセシ
ングにより生成され、そして以下の配列： Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｖａｌ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ（配列番号９７） を有する。
【００４９】 若干の患者において、アミロイド沈着物は凝集されたＡβペプチドの形態をと
る。驚くべきことに、単離されたＡβペプチドの投与が、脊椎動物宿主における
アミロイド沈着物のＡβペプチド成分に対する免疫応答を誘導することが今や見
出された（公開国際特許出願第ＷＯ ９９／２７９４４号明細書を参照されたい
）。こうしたＡβペプチドはまた関係のない部分にも連結されている。従って、
本発明の異種ヌクレオチド配列は、このＡβペプチド、ならびにＡβペプチドの
フラグメント、およびＡβペプチドもしくはそれらのフラグメントに対する抗体
の発現を包含する。Ａβペプチドの１つのこうしたフラグメントは、（米国特許
第４，６６６，８２９号明細書に開示されるような）以下の配列： Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｌｙｓ（配列番号９８） を有する２８アミノ酸のペプチドである。
【００５０】 これらの異種配列は、動物もしくはヒトに多様なＲＮＡ、アミノ酸配列、ポリ
ペプチドおよびタンパク質を送達するのに使用することができる流行性耳下腺炎
ウイルスベクターに関する本発明の態様で使用することができる。本明細書に示
される実施例は、流行性耳下腺炎ウイルス転写プロモーターの制御下の１種もし
くはそれ以上の異種遺伝子（および３、４もしくは５種の遺伝子さえ）を発現す
る流行性耳下腺炎ウイルスの能力を立証する。代替の態様において、付加的な異
種核酸配列は、単一の余分な転写ユニットとして発現される７ないし１０ｋｂま
での単一の配列であることができる。好ましくは、６の規則（ｔｈｅ Ｒｕｌｅ
ｏｆ Ｓｉｘ）（ＣａｌａｉｎとＲｏｕｘ、１９９３）に従う。ある種の好ま
しい態様において、この配列は４ないし６ｋｂまでであることができる。異種遺
伝情報を、付加的なモノシストロン性転写ユニットおよびポリシストロン性転写
ユニットの形態で挿入することもまたできる。付加的なモノシストロン性転写ユ
ニットおよびポリシストロン性転写ユニットの使用は、より多くの遺伝情報の挿
入を可能にするはずである。好ましい態様において、異種ヌクレオチド配列は、
１個もしくはそれ以上のリボソーム進入部位を含有することができる最低１個の
ポリシストロン性転写ユニットとして流行性耳下腺炎のゲノム配列内に挿入され
る。代替の好ましい態様において、異種ヌクレオチド配列は、ポリタンパク質、
および前記ポリタンパク質を切断してポリタンパク質の個々のポリペプチドを生
成させる十分な数のプロテアーゼをコードする。
【００５１】 異種ヌクレオチド配列は、気道を通って体内に進入しそして多様な組織および
細胞、例えば唾液腺、リンパ様組織、乳腺、精巣および脳細胞さえ感染させるこ
とができる流行性耳下腺炎ウイルスの通常の感染経路を利用するように選択する
ことができる。異種遺伝子はまた、遺伝子治療もしくは特定の細胞のターゲッテ
ィングに使用される作用物質を提供するのにも使用することができる。通常の流
行性耳下腺炎感染経路の間に曝露される正常細胞を単に利用することに対する一
代替として、異種遺伝子もしくはフラグメントは、組換え流行性耳下腺炎ウイル
スの一部として使用される場合に該組換え流行性耳下腺炎ウイルスを流行性耳下
腺炎ウイルスの正常の経路中にない細胞もしくは組織に向かわせる異なる病原体
からの別のタンパク質もしくはアミノ酸配列をコードすることができる。この様
式で、組換え流行性耳下腺炎ウイルスは広範な外来遺伝子の送達のためのベクタ
ーとなる。
【００５２】 弱毒流行性耳下腺炎ウイルスを使用する態様について、弱毒突然変異を導入し
て改変されたウイルスを生成させるのに、化学的突然変異原が添加された細胞培
養物中でのウイルスの成長の間の化学的突然変異誘発、次いで温度感受性および
／もしくは寒冷適合突然変異を選択するための至適に及ばない温度での継代にか
けられたウイルスの選択、細胞培養物中で小さなプラークを生じさせる突然変異
体ウイルスの同定、ならびに宿主範囲の突然変異について選択するための異種宿
主による継代、のような慣習的な手段を使用する。弱毒突然変異の導入の代替の
一手段は、部位特異的突然変異誘発を使用して予め決められた突然変異を作成す
ることを含んで成る。１種もしくはそれ以上の突然変異を導入することができる
。その後、これらのウイルスを、細胞培養物および／もしくは動物モデル中でそ
れらの生物学的活性の弱毒化についてスクリーニングする。弱毒流行性耳下腺炎
ウイルスをヌクレオチドシークエンシングにかけて、弱毒突然変異の部位の位置
をつきとめる。
【００５３】 レスキューされた組換え流行性耳下腺炎ウイルスを、最初に配列同定、配列標
識の確認および抗体に基づくアッセイのようなインビトロの手段により、その所
望の表現型（温度感受性、寒冷適合、プラークの形態学、ならびに転写および複
製の減弱）について試験する。
【００５４】 レスキューされたウイルスの弱毒化表現型が存在する場合は、適切な動物モデ
ルを用いて攻撃実験を実施することができる。非ヒト霊長類がヒト疾患の病因論
に好ましい動物モデルを提供する。これらの霊長類を最初に弱毒化された組換え
的に製造されたウイルスで免疫化し、その後野性型の形態の該ウイルスで攻撃す
る。
【００５５】 発現ベクター、ならびに被包化、転写および複製に必要なトランスに作用する
タンパク質をコードする単離された核酸分子の選択は、所望のウイルスの選択に
依存して変動することができる。宿主細胞中での転写ベクター（１種もしくは複
数）とのそれらの共発現、および選択された条件下での組換えウイルスの産生を
可能にするために、発現ベクターを調製する。
【００５６】 流行性耳下腺炎のレスキューは、その中でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが存在し
てウイルスゲノムｃＤＮＡを含有する転写ベクターからのアンチゲノム（もしく
はゲノム）の一本鎖ＲＮＡの転写を駆動する、適切な細胞環境、好ましくは哺乳
類を包含する。共転写的にもしくはその直後のいずれかに、このウイルスアンチ
ゲノム（もしくはゲノム）ＲＮＡ転写物が、ヌクレオキャプシドタンパク質によ
り機能的鋳型中に被包化され、かつ、必要とされるウイルス特異的なトランスに
作用するタンパク質をコードするコトランスフェクションされた発現プラスミド
から同時に産生される必要とされるポリメラーゼ成分により拘束される。これら
の事象および過程は、ウイルスｍＲＮＡの欠くことのできない転写、新たなゲノ
ムの複製および増幅、ならびにそれにより新規ウイルスの子孫の産生すなわちレ
スキューにつながる。
【００５７】 本発明のレスキュー方法において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは組換えワクシ
ニアウイルスにより提供することができる。しかしながら、この系は、物理的も
しくは生化学的手段により、またはワクシニアウイルスにとって良好な宿主でな
い細胞もしくは組織中での反復される継代により、レスキューされたウイルスを
ワクシニアウイルスから分離することを必要とする。この要件は、哺乳動物細胞
中で増殖しないワクシニアウイルスの制限された株（例えばＭＶＡ−Ｔ７）を宿
主細胞として使用することにより回避される。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡ
ポリメラーゼを発現する２種の組換えＭＶＡが報告されている。ＭＶＡ／Ｔ７組
換えウイルスは、７．５Ｋの弱い初期／後期プロモーター（Ｓｕｔｔｅｒら、１
９９５）もしくは１１Ｋの強い後期プロモーター（Ｗｙａｔｔら、１９９５）の
いずれかの調節下に、組み込まれた１コピーのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含有
する。
【００５８】 レスキュー組成物のトランスフェクションで使用される宿主細胞もしくは細胞
系は、レスキューに選択された条件に基づき広範に変動することができる。宿主
細胞は、所望の組換え流行性耳下腺炎ウイルスを産生するようにレスキュー組成
物のベクターの共発現を可能にする条件下で培養する。こうした宿主細胞は、真
核生物細胞、および好ましくは脊椎動物細胞を包含する広範な細胞から選択する
ことができる。鳥類細胞を使用することができるが、しかし好ましい宿主細胞は
ヒト胚腎細胞のようなヒト細胞由来である。例示的宿主細胞はヒト２９３細胞、
Ａ５４９細胞およびＨｅｐ２細胞である。Ｖｅｒｏ細胞ならびに多くの他の型の
細胞もまた宿主細胞として使用することができる。適する宿主細胞の他の例は：
（１）ヒト二倍体一次細胞系：例えばＷＩ−３８およびＭＲＣ５細胞；（２）サ
ル二倍体細胞系：例えばＦＲｈＬ−胎児アカゲザル肺細胞；（３）擬（ｑｕａｓ
ｉ）一次連続細胞系：例えばＡＧＭＫ−アフリカミドリザル腎細胞；（４）ＣＨ
Ｏ、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎）および一次ニワトリ胚線維芽細
胞（ＣＥＦ）のような他の潜在的細胞系である。数種の真核生物細胞系はウイル
スの増殖に他者より適しており、また、数種の細胞系は数種のウイルスについて
全くうまくゆかない。生存可能なウイルスのレスキューを容易に検出することが
できるために、検出可能な細胞変性効果を生じさせる細胞系を使用する。流行性
耳下腺炎の場合、該ウイルスはＶｅｒｏ細胞上で迅速に広がりかつ容易に検出可
能なプラークを作成するため、トランスフェクションされた細胞をＶｅｒｏ細胞
上で共培養することができる。一般に、選択されたウイルスの成長を許容する宿
主細胞を使用する。
【００５９】 代替の好ましい態様において、トランスフェクションを助長する試薬を添加し
て細胞によるＤＮＡの取込みを増大させることができる。これらの試薬の多くが
当該技術分野で既知である。リポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）（ラ
イフ テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド
州ゲイタースバーグ）およびエフェクティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）（キアゲ
ン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア）が普遍的な例である。リポ
フェクテース（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｃｅ）およびエフェクティーン（Ｅｆｆｅｃ
ｔｅｎｅ）は双方が陽イオン性脂質である。それら双方はＤＮＡを被覆しかつ細
胞によるＤＮＡの取込みを高める。リポフェクテース（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｃｅ
）はＤＮＡを取り巻くリポソームを形成する一方、エフェクティーン（Ｅｆｆｅ
ｃｔｅｎｅ）はＤＮＡを被覆するがしかしリポソームを形成しない。
【００６０】 転写ベクターおよび発現ベクターは、宿主細胞中での発現のため設計されたプ
ラスミドベクターであることができる。被包化、転写および複製に必要なトラン
スに作用するタンパク質をコードする最低１種の単離された核酸分子を含んで成
る発現ベクターは、これらのタンパク質を同一の発現ベクターもしくは最低２個
の異なるベクターから発現することができる。これらのベクターは基本的なレス
キュー方法から公知であり、そしてそれらは本発明の改良方法での使用のために
変えられる必要はない。
【００６１】 本発明の方法において、レスキューに標準的な温度範囲（約３２℃ないし約３
７℃）を使用することができるが；しかしながら、上昇された温度でのレスキュ
ーが組換えＲＮＡウイルスの回収を向上させることが示されている。上昇された
温度は熱ショック温度と称される（公開国際特許出願第ＷＯ ９９／６３０６４
号明細書（これにより引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照され
たい）。効果的な熱ショック温度は、組換えウイルスの回収のレベルが向上され
る組換えウイルスのレスキューの実施に示唆される標準的温度より上の温度であ
る。温度範囲の例示的一覧は以下のとおりである：３８℃から約４７℃まで、約
４２℃から約４６℃までがより好ましい。あるいは、４３℃、４４℃および４５
℃の熱ショック温度がとりわけ好ましいことが注目される。
【００６２】 所望の組換え流行性耳下腺炎ウイルスの回収のレベルを決定するのに多数の手
段を使用する。本明細書の実施例に示されるとおり、クロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子を使用して組換えウイルス
のレスキューの条件をモニターかつ至適化する。レポーター遺伝子の対応する活
性が、組換えウイルスの発現の基礎および試験レベルを確立する。他の方法は、
得られた組換えウイルスのプラークの数を検出すること、およびシークエンシン
グによりレスキューされたウイルスの産生を確かめることを包含する。
【００６３】 好ましい態様において、宿主細胞（１個もしくは複数）中に存在するようなト
ランスフェクションされたレスキュー組成物を、プラーク拡張段階（すなわち増
幅段階）にかける。トランスフェクションされたレスキュー組成物を、最低一層
のプラーク拡張細胞（ＰＥ細胞）上に移す。トランスフェクションされた細胞か
らの組換えウイルスの回収は、流行性耳下腺炎ウイルスもしくは組換え流行性耳
下腺炎ウイルスが高められた成長を表すプラーク拡張細胞を選択することにより
向上される。好ましくは、レスキュー組成物を含有するトランスフェクションさ
れた細胞を、実質的にコンフルエントなＰＥ細胞の単層上に移す。プラーク拡張
を包含するレスキュー技術の多様な改変は、公開国際特許出願第ＷＯ ９９／６
３０６４号明細書にもまた示される。
【００６４】 本発明の方法から製造される組換え流行性耳下腺炎ウイルスは、診断、予防お
よび治療の用途に使用する。好ましくは、本発明の方法から製造される組換えウ
イルスは弱毒化される。弱毒組換えウイルスは、ヒトおよび動物宿主を感染させ
る野生型ウイルスに比較して、毒性の実質的な低下を表すはずである。弱毒化の
程度は大部分の個体において感染の症状が生じることができないようであるが、
しかし、該ウイルスは感染性であるのに十分な複製能力を保持しかつワクチンに
所望の免疫応答の特徴を導き出すことができる。弱毒組換えウイルスは、単独で
、または医薬、抗原、免疫化剤もしくはアジュバントとともに、疾患の予防もし
くは改善におけるワクチンとして使用することができる。これらの有効成分は、
慣習的手段により、すなわち希釈剤もしくは製薬学的に許容できる担体を使用す
ることにより処方かつ送達することができる。
【００６５】 従って、本発明のさらなる態様において、弱毒化された組換え的に製造された
流行性耳下腺炎ウイルスは、（ｉ）最低１種の組換え的に製造された弱毒流行性
耳下腺炎ウイルスおよび（ｉｉ）製薬学的に許容できる緩衝剤または希釈剤、補
助物質もしくは担体の最低１種を含んで成る免疫原組成物で使用する。好ましく
は、これらの組成物は流行性耳下腺炎の感染の予防および／もしくは改善におけ
る免疫原組成物としての治療的および予防的用途を有する。こうした用途におい
て、免疫学的有効量の本発明の最低１種の弱毒組換え流行性耳下腺炎ウイルスを
、通常の流行性耳下腺炎感染の経過において実質的な低減を引き起こすためにこ
うした量で使用する。
【００６６】 こうした免疫原組成物の製剤はこの分野の当業者に公知である。本発明の免疫
原組成物は付加的抗原成分（例えばポリペプチドもしくはそのフラグメント、ま
たは抗原もしくはそのフラグメントをコードする核酸）を含むことができ、かつ
、好ましくは製薬学的に許容できる担体を包含する。適する製薬学的に許容でき
る担体および／もしくは希釈剤は、いずれかのかつ全部の慣習的な溶媒、分散媒
、増量剤、固体担体、水性溶液、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤お
よび吸収遅延剤などを包含する。「製薬学的に許容できる担体」という用語は、
それが投与される患者においてアレルギー反応もしくは他の都合の悪い影響を引
き起こさない担体を指す。適する製薬学的に許容できる担体は、例えば水、生理
的食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど
の１種もしくはそれ以上、ならびにそれらの組み合わせを包含する。製薬学的に
許容できる担体は、抗原の貯蔵寿命もしくは有効性を高める、少量の湿潤剤もし
くは乳化剤、保存剤もしくは緩衝剤のような補助物質をさらに含むことができる
。製薬学的有効成分のためのこうした媒体および作用物質の使用は当該技術分野
で公知である。いずれかの慣習的媒体もしくは作用物質が有効成分と不適合であ
る限りを除き、本発明の免疫原組成物におけるそれらの使用が企図される。
【００６７】 こうした免疫原組成物の投与は、鼻内で、非経口で、経口でのようないずれか
の慣習的な有効な形態によることができるか、またはエアゾルスプレーによるよ
うな鼻内、口腔、眼、肺、膣もしくは直腸表面のような粘膜表面に局所的に適用
することができる。好ましい投与手段は非経口もしくは鼻内である。
【００６８】 経口製剤は、例えば製薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリ
ン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど
のような通常使用される賦形剤を包含する。
【００６９】 本発明のワクチン組成物は、限定されるものでないが、水酸化アルミニウム；
リン酸アルミニウム；スティミュロン［Ｓｔｉｍｕｌｏｎ］（商標）ＱＳ−２１
（アキラ バイオファーマシューティカルズ インク（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州フラミンガム
）；ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−デアシル化モノホスホリルリピドＡ；ＲＩＢＩ
イムノケム リサーチ（ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
、モンタナ州ハミルトン）、ＩＬ−１２（ジェネティックス インスティテュー
ト（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、マサチューセッツ州ケンブリッ
ジ）；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−
ＭＤＰ）；Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（Ｃ
ＧＰ １１６３７、ノル−ＭＤＰと称される）；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−ア
ラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミト
イル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン（ＣＧ
Ｐ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称される）；およびコレラトキシンを挙げる
ことができるアジュバントを包含することができる。使用することができる他者
は、そのＢサブユニット（例えば、その中でアミノ酸位置２９のグルタミン酸が
、公開国際特許出願第ＷＯ ００／１８４３４号明細書（これにより本明細書に
組み込まれる）に従って、別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンにより置き換え
られる）を包含するコレラトキシンの非毒性の誘導体、および／またはコレラト
キシンもしくはそのＢサブユニット、プロコレラゲノイド（ｐｒｏｃｈｏｌｅｒ
ａｇｅｎｏｉｄ）、真菌多糖との非流行性耳下腺炎ポリペプチドの複合物もしく
は遺伝子的に工作された融合物である。
【００７０】 本発明の組換え的に製造された弱毒流行性耳下腺炎ウイルスは、免疫原組成物
中の唯一の活性の免疫原として投与することができる。あるいは、しかしながら
、免疫原組成物は、他の病原体種に対する他の免疫学的に活性の抗原を包含する
他の活性の免疫源を包含することができる。他の免疫学的に活性の抗原は、複製
病原体もしくは非複製病原体であることができる。複製病原体は、例えば弱毒形
態の麻疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、パライン
フルエンザウイルス（ＰＩＶ）およびＲＳウイルス（ＲＳＶ）を包含する。
【００７１】 本発明の重要な局面の１つは、本発明の免疫原組成物を哺乳動物に提供する段
階を含んで成る、前記哺乳動物における免疫応答の誘導方法に関する。該免疫原
組成物は、こうした組成物中に含有される免疫学的有効量のポリペプチド（１種
もしくは複数）が流行性耳下腺炎感染に対する所望の応答をもたらすような、治
療された動物もしくはヒトにおいて免疫原性である組成物である。好ましい態様
は、免疫学的有効量の免疫原組成物をヒトに投与することを含んで成る、ヒトに
おける流行性耳下腺炎感染の改善を包含する治療、もしくは予防方法に関する。
投薬量は個体の特定の状態に依存して変動することができる。この量は、当業者
に既知の手段による慣例の試験で決定することができる。
【００７２】 確実に、流行性耳下腺炎ウイルスのタンパク質の単離されたアミノ酸配列を、
サブユニットワクチンの形成で使用することができる。それらはまた、ポリクロ
ーナルもしくはモノクローナル抗体を生じさせるために抗原として、および抗流
行性耳下腺炎ウイルスタンパク質反応性抗体の検出のためのイムノアッセイで使
用することもできる。本発明により包含されるイムノアッセイは、限定されるも
のでないが、米国特許第４，３６７，１１０号（二重モノクローナル抗体サンド
イッチアッセイ）および米国特許第４，４５２，９０１号明細書（ウェスタンブ
ロット）（これらの米国特許は引用することにより本明細書に組み込まれる）に
記述されるものを挙げることができる。他のアッセイは、インビトロおよびイン
ビボ双方の標識されたリガンドの免疫沈降および免疫組織化学を包含する。
【００７３】 本発明はまた、配列番号２−１０のアミノ酸配列のサンプル中での存在を決定
する段階を含んで成る、流行性耳下腺炎感染の診断方法、もしくは投与された流
行性耳下腺炎ワクチン株の同定方法も提供する。いかなる慣習的診断方法も使用
することができる。これらの診断方法は、アミノ酸配列もしくはポリペプチドの
存在に容易に基づくことができる。好ましくは、こうした診断方法は、本発明の
アミノ酸配列に普遍的である最低１０、および好ましくは最低２０のアミノ酸を
有するポリペプチドに合致する。
【００７４】 本明細書に開示される核酸配列は多様な診断的用途にもまた使用することがで
きる。これらの核酸配列は、流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質をコードする核
酸配列に特異的にハイブリダイズする能力を有する比較的短いＤＮＡおよびＲＮ
Ａ配列を調製するのに使用することができる。核酸プローブは、診断アッセイの
特異性の選択されたパラメータに照らして所望の長さについて選択する。該プロ
ーブは、所定のサンプル中の、病原性生物体の存在を検出するための診断アッセ
イ、もしくは投与された流行性耳下腺炎ワクチンの同定において使用することが
できる。組換え発現のための現在の進歩した技術を用い、存在する抗体との反応
性、または診断もしくは治療試薬を生成させる能力について対応するオリゴペプ
チドおよびポリペプチドをスクリーニングする目的上、発現構築物中に核酸配列
を挿入することができる。適する発現制御配列および宿主細胞／クローニングベ
ヒクルの組み合わせは当該技術分野で公知であり、そして、例としてＳａｍｂｒ
ｏｏｋら（１９８９）に記述される。
【００７５】 好ましい態様において、ハイブリダイゼーション研究もしくはアッセイに使用
される核酸配列は、最低約１０ないし約２０ヌクレオチドのヌクレオチド伸長に
相補的である配列を包含するが、とは言え最低約１０ないし３０、もしくは約３
０ないし６０ヌクレオチドを使用することができる。Ｆａｌｋｏｗら、米国特許
第４，３５８，５３５号明細書に記述されるもののような診断アッセイを包含す
る、多様な既知のハイブリダイゼーション技術および系を、本発明のハイブリダ
イゼーションの局面の実務に使用することができる。
【００７６】 一般に、本明細書に記述されるハイブリダイゼーションプローブは、溶液のハ
イブリダイゼーションにおける試薬として、ならびに固相を使用する態様におい
ての双方で有用であることができることが予見される。固相を必要とする態様に
おいて、滲出液、体液（例えば羊膜液、中耳滲出液、気管支肺胞洗浄液）、もし
くはなお組織のような疑われる臨床サンプルからの試験ＤＮＡ（もしくはＲＮＡ
）を、選択されたマトリックスもしくは表面に吸収させるかもしくは別の方法で
固定する。その後、この固定された一本鎖核酸を、所望の条件下に選択されたプ
ローブを用いる特異的ハイブリダイゼーションにかける。選択された条件は、必
要とされる特定の基準（例えば、Ｇ＋Ｃ含量、標的核酸の型、核酸の供給源、ハ
イブリダイゼーションプローブの大きさなどに依存する）に基づく特定の情況に
依存することができる。非特異的に結合されたプローブ分子を除去するようなハ
イブリダイズされた表面の洗浄の後に、特異的ハイブリダイゼーションを標識に
よって検出、もしくは定量さえする。
【００７７】 本発明の流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質をコードする核酸配列、もしくは
それらの変異体は、例えば米国特許第４，６０３，１０２号明細書に述べられる
ようなＰＣＲ（商標）技術とともに有用であることができる。本発明の流行性耳
下腺炎ウイルス配列のいずれかの多様な部分を、流行性耳下腺炎ウイルス遺伝子
の定義された一部分、もしくは流行性耳下腺炎ウイルスヌクレオチドのＰＣＲ（
商標）増幅のためのオリゴヌクレオチドプローブとして利用することができ、そ
の配列をその後、相補的配列を含有するハイブリダイゼーションプローブを用い
るハイブリダイゼーションにより検出することができる。この様式で、極端に低
い濃度の流行性耳下腺炎核酸を、本発明のヌクレオチド配列を利用してサンプル
中で検出することができる。
【００７８】 以下の実施例は本発明のある態様を具体的に説明するために包含する。しかし
ながら、当業者は、本開示に照らして、多くの変更を、開示される特定の態様で
行うことができ、かつ、本発明の技術思想および範囲から離れることなく同様の
もしくは類似の結果をなお得ることができることを認識するはずである。
【００７９】 以下の実施例は具体的説明として提供され、かつ、下述されるとおりに本発明
を制限すると解釈されるべきでない。
【００８０】 実施例 例１ 材料および方法 細胞およびウイルス． 一次ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞は、ＳＰＡＦＡ
Ｓ Ｉｎｃ．Ｐｒｅｓｔｏｎ，ＣＴ）から得られ、そして５％胎児ウシ血清を補
足されたイーグルの基本培地（ＢＭＥ）において培養された。Ｈｅｐ２細胞、２
９３細胞、Ａ５４９、およびＶｅｒｏ細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡＴＣＣ）から得られ、そして１０％胎児ウシ血清を補足され
たＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において増殖された。流行
性耳下腺炎ウイルスのＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株は、ＭｕｍｐｓｖａｘR，ロット
番号００８９Ｅ，０６５６Ｊ，および１１５９Ｈ（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．
，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎｔ，ＰＡ）のバイアルからＣＥＦ細胞において
直接培養された。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する組み換
えワクシニアウイルスは、Ｄｒ．Ｂ．Ｍｏｓｓ［（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、Ｗｙａｔｔ
ｅｔ ａｌ．，１９９５、参照］から得られた。
【００８１】 １．Ａ．流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ共通配列の作成 流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ保存株の増殖． 流行性耳下腺
炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株は、５％胎児ウシ血清を補足されたＤｕｌｂ
ｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）または５％胎児ウシ血清を補足された
イーグルの基本培地（ＢＭＥ）における一次ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ，Ｓ
ｐａｆａｓ，Ｉｎｃ．）においてＭｕｍｐｓｖａｘR（ロット番号１１５９Ｈ，
Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）のバイアルから直接培養された。Ｔ−
７５フラスコにおいて塗布されたＣＥＦは、室温で２時間、感染多重度（ｍｏｉ
）約０．００２において再懸濁されたＭｕｍｐｓｖａｘにより感染された。イノ
キュラムが細胞から除去され、そして新鮮培地で置換された。細胞は３７℃で４
日間培養され、この時点で広範囲のシンシチウムおよび細胞変性が観察された。
ウイルスが培養培地中に細胞を掻き取ることによって回収され、続いてドライア
イス／エタノール浴中で２回凍結・融解され、そして３７℃でインキュベートさ
れた。細胞デブリは、ＢｅｃｋｍａｎＧＳ−６ＫＲ遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）において２，５
００ｒｐｍでの遠心分離によって除去された。ウイルスは−８０℃で保存された
。
【００８２】 ウイルスＲＮＡの単離、増幅およびシークエンシング． 流行性耳下腺炎ウイ
ルスＲＮＡは、製造者（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）
によるＴｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬を用いて凍結された一定分量のウイルスから単離
された。ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）へと続く逆転写は、鋳型として
単離されたウイルスＲＮＡおよびＴｉｔａｎ Ｏｎｅ−Ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｎ
ｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて実施された。流行性耳下腺炎ゲノムは、次のプライ
マーペアを用いて、４個の別々のフラグメントにおいて増幅された：5′-1ACCAA
GGGGAGAATGAATATGGG23（配列番号９５）および5′-3875CTGAACTGCTCTTACTAATCTG
GAC3851（配列番号８２)(３.９kb産物)；5′-3773CTGTGTTACATTCTTATCTGTGACAG3 798 （配列番号２１）および5′-7783TGTAACTAGGATCTGATTCCAAGC7760（配列番号
７２）(４kb産物）；5′-7678AGAGTTAGATCAGCGTGCTTTGAG7701（配列番号３２）
および5′-11685CCTTGGATCTGTTTTCTTCTACCG11662（配列番号６２）(４kb産物)；
5′-11529GTGTTAATCCCATGCTCCGTGGAG11552（配列番号４２）および5′-15384ACC
AAGGGGAGAAAGTAAAATC15363（配列番号５３）(３.９kb産物)。製造者（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｎｐｏｌｉｓ，ＩＮ，カタロ
グ番号１８５５４７６）から指示されるプロトコールがＲＴおよびＰＣＲ条件に
ついて行われた。ＰＣＲ生成物は１％アガロースゲルにおいて精製された。
【００８３】 ＰＣＲ生成物は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）３７７
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏ
ｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて配列決定された。シークエンシングのため
に、以下の表４に示されるような全流行性耳下腺炎ゲノムにわたる一連のプライ
マーが設計された。これらのプライマー配列は、不完全に配列決定された流行性
耳下腺炎ウイルス株の様々な組み合わせについてＧｅｎｂａｎｋから得られたヌ
クレオチド配列情報に基づいた。公表された配列を用いて、タンパク質をコード
している仮定の流行性耳下腺炎ゲノム配列が得られ、次いで、プライマーがそれ
から生成された。
【００８４】 流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎゲノムの５’および３’末端に
おける配列を正確に決定するために、ウイルスゲノムＲＮＡがその末端において
結合され、次いで、ｃＤＮＡが結合領域を横断してＰＣＲによって増幅された。
各反応では、３−５μｇウイルスＲＮＡが、１０％ＤＭＳＯ、５Ｘ連結反応バッ
ファーおよび脱イオン水中で８３℃で３分間インキュベートされてすべての２次
構造を変性し、次いで直ちに氷上に置かれた。Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（２０ユニッ
ト，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍ
Ａ）およびＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）４０ユニットが添加されて最終連結
反応混合液２０μｌが得られ、これが１６℃で一夜インキュベートされた。連結
反応生成物は、フェノール／クロロホルム抽出され、そしてゲノムの結合領域に
わたる次のプライマーペアを用いてＲＴ−ＰＣＲにかけられた：5′-15166GCGCA
TTGATATTGACAATG15185（配列番号５２）および5′-216CCCTCCTCACCCCTGTCTTG197 （配列番号９２）。ＰＣＲ生成物は、次のネストプライマーを用いて第２ラウン
ドのＰＣＲにかけられた：5′-15227GAATAAAGACTCTTCTGGC15245（配列番号９３
）および5′-138GGTAGTGTCAAAATGCCCCC119（配列番号９４）。最終ＰＣＲ生成物
はゲル生成され、そして配列決定された。
【００８５】
【表１】
【００８６】
【表２】
【００８７】 従来の研究では、Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎワクチン株は２種の別個のウイルス集
団の混合物を含有することが分かっていた（Ａｆｚａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９
３）。したがって、レスキュー過程においてサブオプティマルなタンパク質−タ
ンパク質相互作用の可能性を最小にする（異なるウイルス集団由来のｃＤＮＡフ
ラグメントを一緒にゲノムｃＤＮＡにスプライシングすることによって）ために
、Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎワクチン調製物から良好に分離されたプラーク（プラー
ク分離株４，ＰＩ４）が選別され、そして全長ゲノムｃＤＮＡ、ならびにＮＰ，
ＰおよびＬ発現プラスミドの誘導のために増幅された。
【００８８】 １．Ｂ．ＭＵＶ ＮＰ，ＰおよびＬタンパク質のための発現プラスミドの構築 ． ＭＵＶ ＮＰ，ＰおよびＬタンパク質のための発現プラスミド（ｐＭＵＶＮＰ
、ｐＭＵＶＰ、ｐＭＵＶＬ）は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）のキャップ非依存
性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）を含有する改変プラスミドベクターｐＥＭＣ（
Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターお
よびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写終結配列間の各ＯＲＦのｃＤＮＡをスプライシ
ングすることによって構築された。総ＭＵＶ感染細胞（ＣＥＦ）ＲＮＡからの、
ＭＵＶ ＮＰタンパク質ＯＲＦのＲＴ−ＰＣＲ増幅のために使用されるプライマ
ーは、5′CGTCTCCCATGTTGTCTGTGCTCAAAGC（配列番号９９）および5′ATCATTCTCG
AGTTGCGATTGGGGTTAGTTTG（配列番号１００）であった；得られるｃＤＮＡフラグ
メントはゲル精製され、ＢｓｍＢＩおよびＸｈｏＩにより切断（ｔｒｉｍ）され
、次いでＮｃｏＩ／ＸｈｏＩカットｐＥＭＣ中に結合されて、ＮＰタンパク質Ｏ
ＲＦのＡＵＧがＣＩＴＥに隣接された。ＭＵＶ Ｐ ＯＲＦの増幅のためのプラ
イマーは、5′TTCCGGGCAAGCCATGGATC（配列番号１０１）および5′ATCATTCTCGAG
AGGGAATCATTGTGGCTCTC（配列番号１０２）であった。Ｐ ＯＲＦ ｃＤＮＡ（ウ
イルスポリメラーゼによって同時転写により挿入されてＰ ｍＲＮＡを生成する
２つのＧヌクレオチドを含むように部位特異的突然変異によって改変された）は
、また、ｐＥＭＣのＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ部位中にクローン化された。その大きい
サイズのために、Ｌタンパク質ＯＲＦは、２段階において構成された；プライマ
ー5′ATCATTCGTCTCCCATGGCGGGCCTAAATGAGATACTC（配列番号１０３）および5′CT
TCGTTCATCTGTTTTGGATCCG（配列番号１０４）が、第１段階において使用されて、
ＢｓｍＢＩおよびＢａｍＨＩにより切断され、次いでｐＥＭＣのＮｃｏＩ／Ｂａ
ｍＨＩ中にクローン化されるｃＤＮＡフラグメントが生成された。第２段階では
、プライマー5′CAGAGTACCTTATATCGGATCC（配列番号１０５）および5′ATCATTCT
GCAGGAATTTGGATGTTAGTTCGGCAC（配列番号１０６）が使用されて上記段階１から
のプラスミドのＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ部位中にクローン化されるｃＤＮＡフラグ
メントが増幅され、Ｌタンパク質ＯＲＦが完成された。３種のＯＲＦの各々につ
いて４種のｃＤＮＡクローンが配列決定され、そしてＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ共通
ヌクレオチド／アミノ酸配列に対する最高レベルの相同性をもつＯＲＦが、各場
合、レスキュー実験における使用のために選ばれた。
【００８９】 １．Ｃ．合成ＭＵＶミニレプリコンの構築． 図１を参照すれば、Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼプロモーター配列は、正確なＭＵＶ５’末端ヌクレオチドにより転
写を開始するよう設計され、そしてＨＤＶリボザイム配列（Ｂｅｅｎ ｅｔ ａ
ｌ．）が、ミニレプリコンＲＮＡ転写物中に正確なＭＵＶ３’末端ヌクレオチド
を生成するよう置かれた。複製Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ末端シグナルは、ＨＤＶ
リボザイム配列後に包含された。細菌のクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ（ＣＡＴ）ＯＲＦは、ＭＵＶゲノムのコーディングおよびシストロン
間配列のすべてを置換する；残りの必須ＭＵＶ特異的配列は、隣接した９０ｎｔ
ＮＰ遺伝子非翻訳領域（ＵＴＲ）をもつ３’ＭＵＶリーダー（５５ｎｔ）、およ
び１３７ｎｔＬ遺伝子ＵＴＲに隣接した５’ＭＵＶトレーラー（２４ｎｔ）を含
有する。
【００９０】 合成ＭＵＶミニレプリコン（ＭＵＶＣＡＴ）は、改変されたＭＵＶゲノムを表
すｃＤＮＡから構成され、この場合コーディングおよびシストロン間領域はＣＡ
Ｔ ＯＲＦによって置換された。ＭＵＶ５’および３’末端についてのｃＤＮＡ
は、プライマーペア5′ACCAAGGGGAGAATGAATATGGG（配列番号１０７）／5′ATCAT
TCGTCTCTTTTCCAGGTAGTGTCAAAATGCC（配列番号１０８）、および5′ACCAAGGGGAGA
AAGTAAAATC（配列番号１０９）／5′ATCATTCGTCTCTATCGAATAAAGACTCTTCTGGC（配
列番号１１０）をそれぞれ使用して、総感染細胞（ＣＥＦ）ＲＮＡからのＲＴ／
ＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲの第２ラウンドでは、ネストプライマーが、
それぞれＭＵＶ５’および３’末端に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターお
よび肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイム配列を付加するために使用された
；これらのプライマーペアは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの付加のた
めには5′AAGCTCGGCGGCCGCTTGTAATACGACTCACTATAACCAAGGGGAGAAAGTAAAATC（配列
番号１１１）／5′ATCATTCGTCTCTATCGAATAAAGACTCTTCTGGC（配列番号１１２）、
そしてリボザイム成分の付加のためには5′ATCATTGGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCATG
CCGGCCACCAAGGGGAGAATGAATATGGG（配列番号１１３）／5′ATCATTCGTCTCTTTTCCAG
GTAGTGTCAAAATGCC（配列番号１１４）であった。ＣＡＴ ＯＲＦ ｃＤＮＡは、
プライマー5′TCATTCGTCTCGGAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACC（配列番号１１５
）および5′ATCATTCGTCTCTCGATTTACGCCCCGCCCTGCCACTC（配列番号１１６）を用
いて増幅された。すべて３成分はゲル精製され、ＢｓｍＢＩで切断され、４ウエ
イ（４−ｗａｙ）結合においてともに接合され、そして改変ｐＢＳＫ Ｓ（＋）
（Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５）のＮｏｔＩ／ＮａｒＩ部位にクローン
化されて、完全ミニレプリコンプラスミド、ｐＭＵＶＣＡＴを生成した。
【００９１】 １．Ｄ．ＭＵＶのための全長ゲノムｃＤＮＡの構築． ＭＵＶの全長ゲノムｃ
ＤＮＡ（ｐＭＵＶＦＬ）は、ｐＭＵＶＣＡＴの構築のために使用された同じプラ
スミド骨格への隣接するｃＤＮＡフラグメントの連続的クローニングによって５
’末端〜３’末端を構成された（図２参照）。各ｃＤＮＡフラグメントは、ユニ
ーク制限部位を適当に含有するプライマーペアを用いるＲＴ−ＰＣＲによって総
感染細胞ＲＮＡから増幅された；各場合、段階的クローニング戦略を容易にする
ために、ウイルス特異的エンドヌクレアーゼ部位に加えて５’近接のＮｏｔＩ部
位を含有した。成長する全長クローンへの付加前に、ウイルス３’末端からＢｓ
ｓＨＩＩ部位にわたるｃＤＮＡフラグメントが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ
ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中に別々に構成
された。第１段階では、ＢｓｓＨＩＩ／ＣｌａＩｃＤＮＡフラグメントが、５’
延長プライマーを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＣｌａＩ／ＸｈｏＩ部位中に
クローン化されてウイルス特異的ＢｓｓＨＩＩ部位に隣接するＸｈｏＩ部位を生
成した。第２段階では、ウイルス３’末端〜ＣｌａＩｃＤＮＡフラグメントが、
第１段階からのプラスミドのＮｏｔＩ／ＣｌａＩ部位中にクローン化されてウイ
ルス３’末端〜ＢｓｓＨＩＩ配列が完成した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモー
ター配列は、ウイルス３’末端／ＣｌａＩ末端フラグメントを生成するために使
用された（＋）センスＲＴ／ＰＣＲプライマーへの組み入れによってウイルス３
’末端に付加された。ゲノムｃＤＮＡの５’末端フラグメント（ＢａｍＨＩ／Ｎ
ａｒＩ）は、ＨＤＶリボザイム配列のＮａｒＩ部分に５’末端を付加するために
、ＰＣＲ増幅の第２ラウンドにおいて別々に改変された。４クローニングサイク
ルのすべてがｐＭＵＶＦＬの構成のために用いられた；各ラウンド後、４クロー
ンは、新しく付加されたｃＤＮＡの領域において配列決定され、そしてＭＵＶ共
通配列に比較された。最少突然変異数を含有するｃＤＮＡクローンが、次いで、
次のｃＤＮＡフラグメントの付加のために選択された。完全に構成されたｃＤＮ
Ａが再び配列決定されて細菌増殖の間の安定性が証明された。エレクトロコンピ
テントＳＵＲＥ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）および
ＤＨ５アルファ細胞（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）が
、ＭＵＶｃＤＮＡのクローニングのための細菌宿主として使用された。
【００９２】 １．Ｅ．感染細胞からのＣＡＴ活性のレスキュー． ＣＡＴ活性のレスキュー
のために、細胞はＭＵＶにより感染され、そしてイン・ビトロで転写されたＭＵ
ＶＣＡＴミニレプリコンＲＮＡを用いてトランスフェクションされるか、または
ＭＶＡ−Ｔ７により感染され、そしてｐＭＵＶＮＰ、ｐＭＵＶＰおよびｐＭＵＶ
Ｌ発現プラスミドとともにｐＭＵＶＣＡＴによりトランスフェクションされるか
いずれかであった。イン・ビトロの転写は、製造者のプロトコール（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にしたがって最終容量２０μｌにおいてＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼのための鋳型としてｐＭＵＶＣＡＴ４μｇを用いて実施された；
次いで、鋳型ＤＮＡがＲＱ−１ＤＮアーゼにより消化された。６穴ディッシュに
おいて約８０％集密まで増殖された２９３細胞の一夜培養物が、ｍｏｉ１−２に
おいてＭＵＶにより感染された；感染後１時間（ｈｐｉ）に、製造者のプロトコ
ールにしたがって、イン・ビトロ転写反応液５−１０μｌ（約５−１０μｇＲＮ
Ａ）およびＬｉｐｏｆｅｃｔＡＣＥ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）１０−１２μｌを含有
する混合液が各ウエルに添加された。４８ｈｐｉにおいて、細胞は懸濁液中にか
き集められ、遠心によって回収され、０．２５ＭｔｒｉｓバッファーｐＨ７．８
１００μｌ中に再懸濁され、３回の凍結−融解にかけられた。澄明な細胞抽出
液が、次に、基質としての14Ｃ標識クロラムフェニコール（Ｓｉｄｈｕ ｅｔ
ａｌ．，１９９５）か、または蛍光標識クロラムフェニコール（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｐｒｏｂｅｓ．Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅ）かいずれかを用いてＣＡＴ活性を
アッセイされ、続いて薄層クロマトグラムにおいて反応生成物が分析された。
【００９３】 ＭＵＶヘルパーウイルスの不在下のＣＡＴ活性のレスキューでは、２９３，Ｈ
ｅｐ２およびＡ５４９細胞が、６穴ディッシュにおいて約８０％集密まで一夜増
殖され、ｍｏｉ １０においてＭＶＡ−Ｔ７により感染され、そして１ｈｐｉに
、２００ｎｇｐＭＵＶＣＡＴ、３００ｎｇｐＭＵＶＮＰ、５０ｎｇｐＭＵＶＰ、
２００ｎｇｐＭＵＶＬ、およびＬｉｐｏｆｅｃｔＡＣＥ１０−１２μｌを含有す
る混合液によりトランスフェクションされた。２４ｈｐｉにおいて、トランスフ
ェクション混合液は、新鮮な増殖培地２ｍｌで置換され、そして細胞がさらに２
４時間培養され、続いて上記のように細胞抽出液の調製およびＣＡＴアッセイが
行われた。
【００９４】 １．Ｆ 感染細胞からの感染性全長ＭＵＶの回収． ｃＤＮＡからの感染性Ｍ
ＵＶのレスキューのために、６穴ディッシュにおいて約９０％集密まで一夜増殖
されＡ５４９細胞は、ｍｏｉ４においてＭＶＡ−Ｔ７により感染された；１ｈｐ
ｉにおいて、細胞は、３−７ｕｇｐＭＵＶＦＬ、３００ｎｇｐＭＵＶＮＰ、５０
ｎｇｐＭＵＶＰ、２００ｎｇｐＭＵＶＬおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｃｅ１４μｌ
を含有する混合液によりトランスフェクションされた。２４ｈｐｉにおいて、ト
ランスフェクション混合液は、増殖培地（１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥ
Ｍ）で置換され、そして細胞は３７℃でさらに２４時間培養された；上澄液（Ｐ
１）か、または懸濁液中にかき取られた総トランスフェクション細胞モノレヤー
のいずれかが、集密なＡ５４９細胞モノレヤー上に直接移され、これが３７℃で
４日間培養され、次いで、ＭＵＶ感染性フォーカスを検出するために全細胞ＥＬ
ＩＳＡ（下記参照）のために調製された。これらのＡ５４９指標細胞からの上澄
液（Ｐ２）は、集密Ｖｅｒｏ細胞モノレヤー上に継代され、３７℃で３−４日間
培養されてＭＵＶ誘導シンシチウムが観察された。
【００９５】 １．Ｇ レスキューされたＭＵＶの同定および確証． レスキューＭＵＶ（ｒ
ＭＵＶ）の最初の同定は、全細胞ＥＬＩＳＡを用いて実施された；感染性上澄液
（上記参照）により感染されたＡ５４９細胞は、１Ｘリン酸バッファー食塩水（
ＰＢＳ）中１０％ホルムアルデヒドにより室温で３０分間固定された；次いで、
細胞はＰＢＳで１回、そしてブロッキング溶液（ｘ１ＰＢＳ中５％（ｗ／ｖ）ミ
ルク）で１回洗浄され、続いてブロッキング溶液中４℃で一夜インキュベートさ
れた。次いで、一夜ブロッキング溶液は除去され、そして細胞は、新鮮ブロッキ
ング溶液中１／４００希釈されたＭＵＶポリクローナルウサギ抗血清（Ａｃｃｅ
ｓｓ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）により室温で２−３時間イ
ンキュベートされた。次いで、ポリクローナル抗血清が除去され；細胞は、ブロ
ッキング溶液で５回洗浄され、次いで室温で２−３時間、ブロッキング溶液中１
／１０００に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ共役のヤギ抗ウサ
ギ血清（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）
とともにインキュベートされた。次に、ヤギ血清が除去された；細胞は、ブロッ
キング溶液で５回およびＰＢＳで１回洗浄され、続いて細胞モノレヤーをカバー
するのに十分なＡＥＣ基質（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加され、
これが、次に染色の出現を促進するために３７℃で１５−２０分間インキュベー
トされた。
【００９６】 ｐＭＵＶＦＬにおいてのみ存在するヌクレオチドタグ（いかなる実験室で増殖
されたＪｅｒｙｌ ＬｙｎｎＭＵＶにも存在しない）が、（Ｐ２）ｒＭＵＶによ
り感染されたＶｅｒｏ細胞からのＲＴ／ＰＣＲによって増幅されたｃＤＮＡフラ
グメントの配列解析によってｒＭＵＶ中に証明された。ＲＮＡは、６穴ディッシ
ュにおける感染細胞から製造者のプロトコールにしたがってＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉ
ｂｃｏＢＲＬ）による抽出によって調製された；各ウエルからの総ＲＮＡの１／
５が、３つの別々なヌクレオチドタグの各々に隣接しているプライマーペアを用
いる、Ｔｉｔａｎ Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄ
ｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）についての指示にしたがうＲＴ／ＰＣＲ増幅のため
の鋳型として使用された。得られるＲＴ／ＰＣＲフラグメントは、エレクトロエ
ルーションによって１％アガロースゲルから精製され、そしてＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）３７７ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて
製造者のプロトコールにしたがって配列決定された。
【００９７】 例２ トランスフェクション細胞からのレポーター遺伝子活性のレスキュー． ｃＤ
ＮＡから感染性流行性耳下腺炎ウイルスのレスキューを可能にするシステムの定
義を助けるために、ＣＡＴレポーター遺伝子を含有する流行性耳下腺炎ウイルス
ミニレプリコンが構成された。構築物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター
の制御下でネガティブ極性のＲＮＡミニレプリコンの合成を可能にするよう設計
された。Ｔ７プロモーターの３つの末端Ｇ残基がミニレプリコンの構築の間に除
かれて、ＭＵＶゲノムの正確な５’ヌクレオチドにより始まる転写開始部位を提
供した。ミニレプリコン構築物におけるＨＤＶリボザイムの包含は、確実なＭＵ
Ｖ特異的３’末端を生成するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写物の切断を可能にした
。ＭＵＶＣＡＴミニレプリコンＲＮＡ中のヌクレオチドの総数（９６６）は、ゲ
ノムの長さが６の倍数ではない場合には効率的な複製が起きないと述べているＲ
ｕｌｅ ｏｆ Ｓｉｘ（Ｃａｌａｉｎ ｓｎｄ Ｒｏｕｘ，１９９３）にしたが
って６で割ることができた。ＣＡＴ遺伝子の発現は、ＭＵＶ特異的プロモーター
の制御下にあって、ミニレプリコンＲＮＡがＮＰタンパク質により包膜され、次
いで機能性ＭＵＶ特異的ＲＮＡポリメラーゼタンパク質と相互作用するようにな
った場合にのみ起きた。
【００９８】 ＣＡＴ活性の回収は、ここでは、２つの異なるレスキューシステムを用いて観
察された。第１の操作では、イン・ビトロ転写されたＭＵＶＣＡＴ ＲＮＡが、
既にＭＵＶにより感染されている２９３細胞にトランスフェクションされた。こ
れらの条件下でレスキューされるＣＡＴ活性は、通常は低いが、再現可能であり
、そして常に、バックグラウンドレベルを十分越えていた（図３Ａ参照）。パネ
ルＡ１，Ａ２およびＡ３は、３回の別々のレスキュー実験の結果を示す；パネル
Ａ１、列１は、イン・ビトロ転写されたｐＭＵＶＣＡＴ ＲＮＡなしにトランス
フェクションされたＭＵＶ感染細胞におけるＣＡＴ活性を示し、列２は、ｐＭＵ
ＶＣＡＴからのイン・ビトロで転写されたＲＮＡによりトランスフェクションさ
れたＭＵＶ感染細胞におけるＣＡＴ活性を示し、列３は、ｐＭＵＶＣＡＴ−ＧＧ
からのイン・ビトロで転写されたＲＮＡによりトランスフェクションされたＭＵ
Ｖ感染細胞におけるＣＡＴ活性を示し、列４は、ｐＭＵＶＣＡＴからのイン・ビ
トロ転写されたＲＮＡによりトランスフェクションされた未感染細胞におけるＣ
ＡＴ活性を示す。パネルＡ１に示される各ＣＡＴアッセイは、約１０6のトラン
スフェクション細胞からの抽出物の２０％とともに３７℃で３−４時間実施され
た。パネルＡ２列１は、ｐＭＵＶＣＡＴからのイン・ビトロで転写されたＲＮＡ
によりトランスフェクションされたＭＵＶ感染細胞を示し；列２は、ｐＭＵＶＣ
ＡＴからのイン・ビトロで転写されたＲＮＡによりトランスフェクションされた
未感染細胞を示す。パネルＡ２に示される各ＣＡＴアッセイは、約１０6のトラ
ンスフェクション細胞からの抽出物の５０％を用いて３７℃で５時間実施された
。パネルＡ３列１は、ｐＭＵＶＣＡＴからのイン・ビトロで転写されたＲＮＡに
よりトランスフェクションされたＭＵＶ感染細胞を示し；列２は、イン・ビトロ
転写されたｐＭＵＶＣＡＴ ＲＮＡなしでトランスフェクションされたＭＵＶ感
染細胞を示し；列３は、ｐＭＵＶＣＡＴからのイン・ビトロで転写されたＲＮＡ
によりトランスフェクションされた未感染細胞を示す。パネルＡ３に示される各
ＣＡＴアッセイは、約１０6のトランスフェクション細胞からの抽出物の５０％
を用いて３７℃で４時間実施された。
【００９９】 ＣＡＴ活性は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター中に正常に存在する３つ
の付加的Ｇ残基の２つを含有するＭＵＶＣＡＴ構築物（ｐＭＵＶＣＡＴ−ＧＧ）
からはレスキューすることはできなかった。しかしながら、同じＭＵＶＣＡＴ構
築物のＭＵＶトレーラー領域に存在する２つの突然変異は、この観察の決定的な
解釈を妨げた。これらの実験からの結果は、ＭＵＶゲノムのｎｔ１−１４５およ
びｎｔ１５２２３−１５３８４が、ゲノムの包膜、転写および多分複製のために
必要な配列を含有していることを示唆した。ＭＵＶ発現されたヘルパータンパク
質の存在下でＣＡＴ活性のレスキューを許したミニレプリコン配列を定義したの
で、第２のシステムが、ｐＭＵＶＣＡＴ、ｐＭＵＶＮＰ、ｐＭＵＶＰおよびｐＭ
ＵＶＬを含む、トランスフェクションされたＤＮＡからＣＡＴ活性のレスキュー
を実施するために設計された。このシステムでは、ＭＵＶ ＮＰ、ＰおよびＬタ
ンパク質ならびにＭＵＶＣＡＴミニレプリコンＲＮＡ転写物は、ＭＶＡ−Ｔ７誘
導のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの制御下で、２９３、Ｈｅｐ２およびＡ５４９細胞
内に同時発現された。２９３細胞において実施された最初の実験は、ＣＡＴレス
キューが効率的で、再現性があることを示した。ＣＡＴレスキューの効率増大は
、２９３細胞に比例してＨｅｐ２細胞において見られ、そして一連のプラスミド
滴定が実施されて、トランスフェクション混合液における各プラスミドの相対量
を最適化した。レスキュー効率におけるさらなる増大は、６穴ディッシュの１つ
のウエルからのＡ５４９細胞溶解物の２０％を用いる、３時間ＣＡＴアッセイに
おける基質のほとんど１００％転化により観察された（図３Ｂ）。これらの結果
は、ｐＭＵＶＮＰ、ｐＭＵＶＰおよびｐＭＵＶＬから発現されたＭＵＶヘルパー
タンパク質が、ＭＵＶＣＡＴアンチセンスＲＮＡミニレプリコンの包膜、複製お
よび転写を促進するのに十分であったことを例証した。さらにまた、ＣＡＴレス
キューについて観察された最適条件は、ｃＤＮＡから完全に感染性ＭＵＶをレス
キューするための出発点を提供した。
【０１００】 例３ トランスフェクション細胞からの全長流行性耳下腺炎ウイルスの回収． 全長
ＭＵＶｃＤＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下でウイルスゲ
ノムの正確な１５，３８４ｎｔポジティブセンスＲＮＡコピーの合成を可能にす
るように構成された。ＭＵＶＣＡＴミニレプリコンについてと同様に、Ｔ７ＲＮ
Ａポリメラーゼプロモーター配列は、３個の末端Ｇ残基を除くように改変され、
そして正確なＭＵＶ末端ヌクレオチドにおいて始まる転写開始部位を提供した。
ＨＤＶリボザイムが使用されて、ポジティブセンスゲノム転写物の正確なＭＵＶ
３’末端ヌクレオチドを生成した。
【０１０１】 ｃＤＮＡからＭＵＶを回収するために、Ａ５４９細胞が、Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼを発現するＭＶＡ−Ｔ７により感染され、次いで、ｐＭＵＶＦＬ、およびＭ
ＵＶ ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質を発現するプラスミドによりトランスフェク
ションされた。関連するルブラ（ｒｕｂｕｌａ）ウイルスＳＶ５（Ｈｅ ｅｔ
ａｌ，１９９７；Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ，１９９７）における類似
の研究からの結果とともにＭＵＶＣＡＴミニレプリコンからのレポーター遺伝子
活性のレスキューについての結果は、すべての相互作用する成分が操作可能なレ
ベルおよび比率で存在する場合には、ＭＵＶ ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質が、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで生成されたポジティブセンスゲノムＲＮＡ転写物を包
膜、複製、次いで転写するのに十分であることを示した。Ａ５４９細胞がＭＵＶ
レスキュー実験のために選ばれたが、その理由は、それらが、ＭＵＶ複製と、そ
して試験された他の細胞系よりも効率的なＣＡＴレスキュー活性（場合によって
は、より効率的なトランスフェクションをとおして）を支持し、そしてまた、そ
れらがＭＶＡ−Ｔ７誘導の細胞変性に対してより耐性であったからである。最初
のレスキュー実験の成功では、感染細胞からの上澄液培地（清澄化なしに）が新
鮮なＡ５４９指標細胞にトランスフェクションされた。３つの感染性フォーカス
が、全細胞ＥＬＩＳＡによって指標細胞の５ウエルのうち１つにおいて観察され
た（図４）。新鮮なＶｅｒｏ細胞モノレヤー上へのこれらの細胞からの上澄液の
継代に続いて、３つのシンシチウムが顕微鏡下で観察された。これらのシンシチ
ウムの１つが、液体プラークピックとして培地中に吸引され、そして新鮮なＶｅ
ｒｏ細胞を感染させるために使用された；次いで、多数のシンシチウムがこの細
胞モノレヤーにおいて観察され（図５）、そして総感染細胞ＲＮＡがレスキュー
されたウイルスの同定のために抽出された。第２のレスキュー実験では、少なく
とも１０−２０の感染性フォーカスが、全細胞ＥＬＩＳＡによって染色された指
標細胞において見られたように、感染細胞の各ウエルから得られた（図５）。こ
の実験では、全ウエルが、ｐＭＵＶＬがトランスフェクション混合液から除かれ
たウエル以外、レスキューされたウイルスを含有し、レスキュー方法が非常に再
現性が高いことを示した。ｃＤＮＡからのＭＵＶのレスキューについて決定され
る限り、各プラスミドの最適レベルは、３００ｎｇｐＭＵＶＮＰ、５０ｎｇｐＭ
ＵＶＰ、２００ｎｇｐＭＵＶＬおよび３−７μｇｐＭＵＶＦＬである。
【０１０２】 例４ レスキューされたＭＵＶの同定． ｒＭＵＶがｐＭＵＶＦＬから得られたこと
を例証することは重要である。これは、全長ゲノムｃＤＮＡの構成の間にＲＴ／
ＰＣＲミス組み入れによって導入される、ｐＭＵＶＦＬ中の３つのヌクレオチド
タグの存在によって可能にされた。これらのタグは、Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎワク
チンウイルスの共通配列、ならびにｐＭＵＶＦＬが得られたＪｅｒｙｌ Ｌｙｎ
ｎワクチン調製物の継代プラーク分離株の両方からｐＭＵＶＦＬを区別した。タ
グの２つは、それぞれＦおよびＬ遺伝子におけるヌクレオチド６０８１および１
１７３１におけるサイレント変化を表し；第３のタグは、ｐＭＵＶＦＬのＬタン
パク質のアミノ酸２２（ヌクレオチド位置８５０２に対応する）におけるＬｙｓ
からＡｒｇへの置換をもたらす。ｒＭＵＶがｐＭＵＶＦＬから生成し、実験室で
増殖された他の２つのＭＵＶ集団のいずれからも生成しないことを示すために、
３つのヌクレオチドタグの各々にわたる、ｒＭＵＶ感染細胞ＲＮＡから調製され
たＲＴ／ＰＣＲ生成物が、関係する位置において配列決定された。ＲＴ／ＰＣＲ
生成物が、感染細胞ＲＮＡからのみ得られ、そして微量のトランスフェクション
するプラスミドＤＮＡのキャリーオーバーからは得られないことを例証するため
に、１つの反応が、前以て逆転写することなく、ＰＣＲ増幅のための鋳型として
ｒＭＵＶ感染細胞ＲＮＡを用いて実施された。ＲＴ／ＰＣＲ増幅からの結果、そ
して続くＲＴ／ＰＣＲ生成物のシークエンシング解析が図６において示される。
総ＲＮＡは、トランスフェクション細胞からのＰ２ｒＭＵＶウイルスにより感染
されたＶｅｒｏ細胞モノレヤーから調製された。ＲＴ／ＰＣＲ反応は、ｐＭＵＶ
ＦＬおよびｒＭＵＶにおいてのみ存在する３つの別々のヌクレオチドタグ部位に
わたるｃＤＮＡ生成物を生成するために設定された。列１は、マーカー１ｋｂラ
ダー（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を示す；列２，３および４は、それぞれヌクレオチ
ドタグ位置６０８１，８５０２および１１７３１にわたるＲＴ／ＰＣＲ生成物を
示す。これらのＲＴ／ＰＣＲ生成物が混入しているプラスミドＤＮＡに由来しな
かったことを例証するために、列４に示されるｃＤＮＡの生成について使用され
たものと同一の反応がＲＴなしに行われた；この反応の生成物が列５に示される
。ｐＭＵＶＬがトランスフェクション混合物から省略された場合、ｒＭＵＶが回
収できなかったことを例証するために、列４に示されるｃＤＮＡ生成物を生成す
るために使用されたものと同一の反応が、ｐＭＵＶＬなしで実施されたトランス
フェクション由来のＶｅｒｏ細胞ＲＮＡを用いて設定された；この反応からの生
成物が列６に示される。
【０１０３】 図６において示されるＲＴ／ＰＣＲ生成物から作成された共通配列データは、
レスキューされたＭＵＶが、ＭＵＶの全長ゲノムｃＤＮＡにおいてのみ存在する
同じヌクレオチドタグを含有していたことを明らかに例証する（図７）。全長ｃ
ＤＮＡクローンおよびプラーク分離株４（ＰＩ４）およびＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ
株についての共通配列（配列番号：１）間のヌクレオチドおよびアミノ酸差異の
列挙のための図８の表１、参照。
【０１０４】 上記の例にかんがみて、感染性流行性耳下腺炎ウイルスは、ウイルスゲノムの
ＤＮＡコピーから生産されたと結論される。この操作は、流行性耳下腺炎ウイル
スの完全なゲノムｃＤＮＡを含有するプラスミドとともに、ＭＵＶ ＮＰ、Ｐお
よびＬタンパク質をコードしているプラスミドによるＭＶＡ−Ｔ７感染Ａ５４９
細胞の同時トランスフェクションを必要とする。この方法の成功は、完全な流行
性耳下腺炎ウイルスゲノム（Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株）についての共通配列の開
発および流行性耳下腺炎ウイルスミニレプリコンのレスキューシステムの新規開
発に左右された。
【０１０５】 注意：全長構築物におけるＬタンパク質のアミノ酸２２におけるＬｙｓからＡ
ｒｇへの置換は、レスキューされる流行性耳下腺炎ウイルスを獲得することを途
絶させない。
【０１０６】 例５ １個以上の異種遺伝子のための発現ベクターとしての流行性耳下腺炎ウイルス 次の実験は、発現ベクターとしての流行性耳下腺炎ウイルスを確立する。この
実施態様は、１個以上のレポーター遺伝子を発現する感染性組み換え流行性耳下
腺炎ウイルスの回収によって例証される。
【０１０７】 β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子、またはホタル のルシフェラーゼ遺伝子とＣＡＴ遺伝子、のいずれかを含有する組み換え流行性 耳下腺炎ウイルスの構築 ． 流行性耳下腺炎ウイルスゲノム中への異種遺伝子ま
たは外来遺伝情報の挿入を可能にするために、ユニークＡｓｃＩ制限エンドヌク
レアーゼ部位が、部位特異的変異誘発を用いて、全長ゲノムｃＤＮＡにおいて生
成された。ＡｓｃＩ部位が、Ｍ遺伝子（ゲノムヌクレオチド４４５１−４４５８
）の５’非コーディング領域に置かれ、その結果、適当に隣接する流行性耳下腺
炎ウイルス調節配列および末端ＡｓｃＩ部位を含有する付加異種遺伝子が、ウイ
ルスのＭおよびＦ遺伝子間で流行性耳下腺炎ゲノム中に組み込まれて、外来遺伝
子を発現することが可能な新規な感染性流行性耳下腺炎ウイルス組み換え株が生
成された。β−ガラクトシダーゼ遺伝子またはホタルのルシフェラーゼ遺伝子の
いずれかを含有する流行性耳下腺炎ウイルス組み換え株が構築された（図１１、
参照）。また、ルシフェラーゼ翻訳開始コドンに隣接するＥＭＣウイルスＣＩＴ
Ｅを含有するその他の組み換え流行性耳下腺炎ウイルスが、翻訳の開始のために
正常な流行性耳下腺炎ウイルスのシス−作用調節要素を利用したルシフェラーゼ
含有組み換え株によって生産されるタンパク質（ルシフェラーゼ）レベルとの比
較のために構築された。
【０１０８】 ホタルルシフェラーゼ遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子のＡＴＧおよびＵＡＡ
に隣接する流行性耳下腺炎ウイルス特異配列（それぞれゲノムヌクレオチド４４
５９−４５３８および４３９２−４４４９）を組み入れたプライマーを用いて、
２ラウンドのネストＰＣＲによって流行性耳下腺炎ウイルスゲノムへの挿入のた
めに調製された。この方法では、ゲノムヌクレオチド４４５０は、最終のルシフ
ェラーゼ含有組み換えゲノムにおいて「ｒｕｌｅ−ｏｆ−ｓｉｘ」を維持するよ
うＰＣＲ生成されたＤＮＡフラグメントから欠失された；また、同じＤＮＡフラ
グメントにおいて、ゲノムヌクレオチド４５３９−４５４５は、ルシフェラーゼ
ＡＴＧの上流に普通見いだされる７個のヌクレオチドによって置換された。最終
ＰＣＲ生成物に存在する末端のＡｓｃＩ部位は、流行性耳下腺炎ウイルスゲノム
中へのルシフェラーゼ遺伝子および隣接する流行性耳下腺炎ウイルス特異配列の
付加を容易にした。同様に、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する別の流行性
耳下腺炎ウイルス組み換え株が構築された。β−ガラクトシダーゼ遺伝子および
隣接する流行性耳下腺炎ウイルス特異配列を組み入れているＰＣＲ生成ＤＮＡフ
ラグメントは、ルシフェラーゼ含有ＤＮＡフラグメントにおけるように、ゲノム
ヌクレオチド４４５０の同じ欠失を含有した。しかしながら、第２のＴＡＡトリ
ヌクレオチドは、最終の組み換え流行性耳下腺炎ウイルスゲノムにおいて「ｒｕ
ｌｅ−ｏｆ−ｓｉｘ」を維持するために、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の正常な
ＴＡＡ翻訳終止コドンに隣接して組み入れられた。また、ルシフェラーゼ含有構
築物とは異なり、β−ガラクトシダーゼＡＴＧ（ゲノムヌクレオチド４５３９−
４５４５）に隣接する７個の上流ヌクレオチドは流行性耳下腺炎ウイルスに特異
的であった。ルシフェラーゼ遺伝子のＡＴＧに隣接するＥＭＣウイルスＣＩＴＥ
を含有する第３の流行性耳下腺炎ウイルス組み換え株がまた構築された。ルシフ
ェラーゼ遺伝子のみを含有する組み換え株に関するように、ネストＰＣＲ反応が
使用されて、それぞれＣＩＴＥおよびルシフェラーゼ遺伝子の５’末端および３
’末端において流行性耳下腺炎ウイルス特異配列が別々に付加された。スリーウ
エイ連結反応では、ＣＩＴＥの３’末端およびルシフェラーゼ遺伝子の５’末端
が、ＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位において接合され、そして流行性耳下
腺炎ウイルスゲノムのＡｓｃＩ部位中に付加された。ゲノムＮｃｏＩ４４５０は
欠失され、そしてトリヌクレオチドＡＣＴは、得られる組み換え流行性耳下腺炎
ウイルスにおいて「ｒｕｌｅ−ｏｆ−ｓｉｘ」を維持するために、ＰＣＲの間に
ＣＩＴＥの５’末端に付加された。
【０１０９】 流行性耳下腺炎ウイルス組み換え株は、ポリシストロンの第２の遺伝子（ルシ
フェラーゼ）の翻訳のための内部リボソームのエントリー部位としてＥＭＣ Ｃ
ＩＴＥを含有する、２つの別々の転写単位か、または１個の転写単位のいずれか
のように、両ＣＡＴ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子を含有したものが構築さ
れた（図１２参照）。ネストＰＣＲが使用されて２種のＤＮＡフラグメントが生
成されたが、この１つはＣＡＴ遺伝子を、そして他はルシフェラーゼ遺伝子を含
有し、そして各々は、適当な流行性耳下腺炎ウイルス特異的遺伝子間ｃＤＮＡ配
列と隣接された。これらの両フラグメントは接合され、次いで単一レポーター遺
伝子の挿入に既に使用されたＡｓｃＩ部位を介して流行性耳下腺炎ウイルスゲノ
ムｃＤＮＡ中に結合された。同様に、ネストＰＣＲが使用されてＣＡＴ遺伝子お
よびルシフェラーゼ遺伝子に融合されたＥＭＣ ＣＩＴＥを含有するＤＮＡフラ
グメントが別々に生成されたが、各々は、適当な流行性耳下腺炎ウイルス特異的
遺伝子間ｃＤＮＡ配列と隣接された。両ＤＮＡフラグメントは接合され、そして
流行性耳下腺炎ウイルスゲノムｃＤＮＡのＡｓｃＩ部位中に結合された。両ゲノ
ム構築物におけるレポーター遺伝子の順序は、５’ＣＡＴ−ＬＵＣ３’および５
’ＣＡＴ ＣＩＴＥ ＬＵＣ３’であった。
【０１１０】 流行性耳下腺炎ウイルス組み換え株のレスキュー． 流行性耳下腺炎ウイルス
ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質を発現するサポートプラスミドとともに、組み換え
流行性耳下腺炎ウイルスゲノムを含有するプラスミドは、例３において既に記述
されたように、ＭＶＡ−Ｔ７感染Ａ５４９細胞中にトランスフェクションされた
。感染細胞からの総レスキューウイルスが、最初に新鮮なＡ５４９細胞（継代１
）において、続いてＶＢｅｒｏ細胞において増幅された。継代３において、レス
キューされたウイルスがレポーター遺伝子活性についてアッセイされた。
【０１１１】 レポーター遺伝子活性のアッセイ． レポーター遺伝子活性は、流行性耳下腺
炎ウイルス組み換え株で感染された細胞の抽出液においてか、または感染細胞モ
ノレヤーの細胞学的染色によって測定された。ルシフェラーゼ遺伝子か、または
ＥＭＣウイルスＣＩＴＥに融合されたルシフェラーゼ遺伝子のいずれかを含有す
る流行性耳下腺炎ウイルス組み換え株により感染された細胞からの抽出液が、ル
ミノメーター（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ ２０１０）においてルシフェラーゼ活性をア
ッセイされた。細胞抽出液の調製およびルシフェラーゼアッセイは、Ｅｎｈａｎ
ｃｅｄ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のための製造者のプロトコールにしたがって行われ
た。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する流行性耳下腺炎ウイルス組み換え株
で感染された細胞からの抽出液は、β−ｇａｌ染色キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ
ａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）のプロトコールにしたがって細胞学的染色によって
アッセイされた。ＣＡＴ活性の測定は、先の例において既に記述されたように、
感染細胞の凍結−融解溶解液において実施された。
【０１１２】 流行性耳下腺炎ウイルスによるホタルルシフェラーゼの発現． 強いルシフェ
ラーゼ活性は、レスキューウイルスで感染された細胞の抽出液中に検出された。
各場合、レスキューウイルスは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子単独か、または縦
列に両ＣＡＴ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子か、いずれかを含有する組み換
え流行性耳下腺炎ウイルスゲノムｃＤＮＡから得られた。両ＣＡＴおよびルシフ
ェラーゼ遺伝子を含有するｒＭＵＶにより感染されたＶｅｒｏ細胞の抽出液に存
在するＣＡＴ活性を示す薄層クロマトグラムである、図１４、参照。１つの転写
単位（ｒＭＵＶＣ／Ｃ／Ｌ）としてＣＡＴおよびルシフェラーゼ遺伝子を含有す
る組み換えウイルスは、ＣＡＴアッセイの前に総レスキューウイルスから精製（
１Ｘ）されたプラークであった。個々の転写単位（ｒＭＵＶＣ／Ｌ）としてＣＡ
Ｔおよびルシフェラーゼ遺伝子を含有するレスキュー組み換えウイルスは、プラ
ーク精製なしに総集団としてアッセイされた。図１４において指示される場合、
Ｖｅｒｏ細胞抽出液におけるルシフェラーゼ活性がまた、両ｒＭＵＶＣ／Ｃ／Ｌ
およびｒＭＵＶＣ／Ｌウイルス組み換え株について測定された。
【０１１３】 さらに、下記表５は、連続３回のプラーク精製によってレスキューウイルス集
団から単離された、ルシフェラーゼ遺伝子（ｒＭＵＶ ＬＵＣおよびｒＭＵＶ
ＣＩＴＥ−ＬＵＣ）を含有する流行性耳下腺炎ウイルス組み換え株のクローン集
団についての相対的明るさの単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）
（ＲＬＵ）読み取りを示す。表５に示されるように、流行性耳下腺炎ウイルス組
み換え株によるルシフェラーゼ活性の強い発現は、組み換えゲノムから１種以上
の異種遺伝子を発現する流行性耳下腺炎ウイルスの潜在能力を明らかに例証して
いる。
【０１１４】
【表３】
【０１１５】 流行性耳下腺炎ウイルスによるβ−ガラクトシダーゼの発現． β−ガラクト
シダーゼを含有するレスキュー流行性耳下腺炎ウイルスが同定された。レスキュ
ーウイルスは、β−ガラクトシダーゼを含有する組み換え流行性耳下腺炎ウイル
スゲノムｃＤＮＡから得られた。β−ガラクトシダーゼ活性は、直接の細胞学的
染色後に、組み換え流行性耳下腺炎ウイルスによって感染された細胞において証
明された。β−ガラクトシダーゼ活性の強い青色染色は、β−ガラクトシダーゼ
遺伝子を含有する組み換え流行性耳下腺炎ウイルスにより感染された細胞におい
てのみ存在していた。いかなるさらなる異種遺伝子も含有しないレスキュー流行
性耳下腺炎ウイルスは、同じ染色アッセイにおいてクリヤープラークを生じた（
図１５参照）。組み換え流行性耳下腺炎ウイルスによるβ−ガラクトシダーゼの
発現は、さらに、流行性耳下腺炎ウイルス転写プロモーターの制御下で比較的大
きい異種遺伝子を発現する流行性耳下腺炎ウイルスの能力を例証している。
【０１１６】 例６ ＪＬ５およびＪＬ２の共通配列の決定 流行性耳下腺炎ウイルスのＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎワクチン株は、２つの個別の
変異株、ＪＬ５およびＪＬ２からなることが分かっている（Ａｆｚａｌ ｅｔ
ａｌ．，１９９３）。ＪＬ５およびＪＬ２と呼ばれる２つの変異株は、ワクチン
調製物中に比率約ＪＬ２ １対ＪＬ５ ５において存在することが示された。こ
れらの変異株は、ＳＨおよびＨＮ遺伝子近くのゲノム中に配列の差異を有するの
で、この差異が、各々の純粋な集団を単離し、そしてそれらの完全なゲノムのシ
ーケンシングによって遺伝子レベルにおいて変異株を区別するために使用された
。
【０１１７】 流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株からＪＬ５およびＪＬ２変異 株の単離 ． 流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株が、直接、ニワトリ胚繊維芽
細胞（ＣＥＦ）において１継代間培養された。次いで、このウイルス保存液が、
１０倍増加において連続に希釈され、そして６穴プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）上で集密ＣＥＦを感染
させるために使用された。細胞は、室温で１．５時間振動させることによって感
染された。次いで、各ウエル上のイノキュラムは、アガロースのオーバーレイ（
ｏｖｅｒｌａｙ）（０．９％アガロース［Ｓｅａｐｌａｑｕｅ，ＦＭＣ Ｂｉｏ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ］、最少必須培地［ＭＥＭ］、０．
２ｍＭ非必須アミノ酸、０．２ｍｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、２
％ＦＢＳおよび０．３３７５％重炭酸ナトリウムを含有する）で置き換えられた
。オーバーレイを室温で固化させた後、感染された細胞は、プラークが肉眼およ
び光学顕微鏡で見られるまで３７℃で６〜８日間培養された。
【０１１８】 ウイルスを含有する個々のプラークが、各プラークを覆うアガロースプラグを
除去するために滅菌パスツールピペット（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を用いて分離された。分離されたプラークは、培地（２％
ＦＢＳ、２０ｍＭＨＥＰＥＳおよび０．１ｍｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマ
イシンを補足されたＭＥＭ）１ｍｌ中に入れられ、そして回転され、そして第２
ラウンドのプラーク精製のための感染に使用された。続く段階では、各希釈プラ
ークの１０，５０，７５，１００もしくは２００μｌが使用されて６穴プレート
上の新鮮な細胞を感染させた。感染、オーバーレイおよびプラーク分離が上記の
ように実施された。第２ラウンドのプラーク形成からウイルスを分離した後、方
法は第３回目を繰り返した。
【０１１９】 第３ラウンドのプラークから分離されたウイルスは、保存液を調製するために
６穴プレート上のＣＥＦにおいて３７℃で４〜６日間増殖された。次いで、ウイ
ルスは、Ｔ−２５フラスコ中のＣＥＦにおける増殖によって拡大された。感染細
胞が最大の細胞変性を示した５〜７日後に、ウイルスが収穫され、そして−８０
℃で凍結保存された。
【０１２０】 分離変異株のＲＴ−ＰＣＲおよびシーケンシング． ＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲは、例１．Ａの「ウイルスＲＮＡの単離、増幅
およびシーケンシング」の節において記述されたように実施された。次の遺伝子
特異的プライマーが、ＳＨおよびＨＮ遺伝子の部分を増幅するために使用された
：6223TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC6246（配列番号２７）および8969ACCCACTCCACT
CATTGTTGAACC8946（配列番号６９）。 増幅生成物は、１％アガロースでゲル精製され、そしてＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）
を用いてゲル切片から単離された。次いで、増幅生成物は、ＳＨ遺伝子領域にお
いて［プライマー6223TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC6246（配列番号２７）、6783GG
ATGATCAATGATCAAGGC6802（配列番号３０）、7325CATCACTGAGATATTGGATC7306（配
列番号７４）、6909GATACCGTTACTCCGTGAAT6980（配列番号７５）を用いて］配列
決定されて、ＪＬ５もしくはＪＬ２として同定された。
【０１２１】 ＳＨ遺伝子領域における予備的な配列解析が実施されて、どの精製ウイルスが
ＪＬ５であるか、そしてどれがＪＬ２であるかを決定した。最初は、すべての３
回プラーク精製されたウイルスはＪＬ５と一致した。ＪＬ２分離株を得るために
、１回プラーク精製され、そして凍結保存されたウイルスが、ＳＨ遺伝子領域に
おけるＲＴ−ＰＣＲおよびシーケンシングによって選別されて、それらがＪＬ２
か、またはＪＬ５かいずれであるか決定された。ＪＬ２を含有するプラークとし
てこの方式で同定された２分離株は、さらに連続２ラウンドのプラーク精製にか
けられた。上記のように、これらの分離株はＣＥＦにおいて２回拡大され、続い
てＲＮＡ抽出、増幅およびシーケンシングが実施された。
【０１２２】 各プラーク分離株をいずれかＪＬ５もしくはＪＬ２として決定した後、各変異
株の２つの別々の分離株が、完全なゲノムのシーケンシングのために選ばれた。
ＲＴ−ＰＣＲは、全ゲノムにわたるフラグメントを増幅するために、次のプライ
マーペアを用いて、単離されたＲＮＡにおいて実施された：1ACCAAGGGGAGAATGAA
TATGGG23（配列番号９５）および2507TGAGGCTCCATTCCCGTCTATG2486（配列番号８
６）、2107CGTTGCACCAGTACTCATTG2126（配列番号１７）および3875CTGAACTGCTCT
TACTAATCTGGAC3851（配列番号８２）、3773CTGTGTTACATTCTTATCTGTGACAG3798（
配列番号２１）および6347CAGACATACAGGGTTATGATGAG6325（配列番号７６）、622 3 TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC6246（配列番号２７）および8969ACCCACTCCACTCATTG
TTGAACC8946（配列番号６９）、7678AGAGTTAGATCAGCGTGCTTTGAG7701（配列番号
３２）および9753TCATGCCGCATCTCAATGAG9734（配列番号６７）、9583CCGAGAGTCC
ATGTGTGCTC9602（配列番号３７）および11685CCTTGGATCTGTTTTCTTCTACCG11662（
配列番号６２）、11529GTGTTAATCCCATGCTCCGTGGAG11552（配列番号４２）および 13412 CATATTCGACAGTTTGGAGT13393（配列番号５８）、13219CGATTATGAGATAGTTGTT
C13238（配列番号４６）および15384ACCAAGGGGAGAAAGTAAAATC15363（配列番号５
３）。増幅生成物が精製され、そして例１．Ａの「ウイルスＲＮＡの単離、増幅
およびシーケンシング」の節において記述されたように配列決定された。各ウイ
ルス分離株のゲノム末端の配列を決定するために、ＲＮＡ末端が結合され、接合
部をとおしてＲＴ−ＰＣＲおよびシーケンシングが実施された（例１．Ａにおい
て記述されたように）。
【０１２３】 配列は、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウエア（Ｇｅｎｅｃｏｄｅｓ，Ａｎｎ
Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いて整列された。ＪＬ５およびＪＬ２配列は、各変異株
について両方の配列決定されたプラーク分離株を比較することによって決定され
た共通性を表した。精製されたＪＬ５およびＪＬ２ウイルスは、例１．Ａの表４
に列挙されたプライマーの同じシリーズを用いて配列決定された。両変異株では
、２つの別々のプラーク分離株は完全に配列決定された（ＪＬ５およびＪＬ２、
各々のプラーク２について、それぞれの共通配列についての配列番号：１１およ
び１２、参照）。期待されたように、少数の配列差異が、２つのＪＬ５プラーク
分離株（表６参照）および２つのＪＬ２プラーク分離株（表７参照）間に観察さ
れた。
【０１２４】 ＪＬ２の配列は、表８において総括されるように、完全ゲノムを横断して分散
されている、４１３個のＪＬ５との差異を含有する。これらの差異の５個はウイ
ルスの５’または３’リーダー配列において存在している。総数３６０の配列差
異は、ウイルス遺伝子のコーディング領域内にある；しかしながら、これらの差
異のうち７３個のみがアミノ酸の差異をコードしている。残りの４８の配列差異
は、ウイルス遺伝子の非コーディング領域内にある。興味あることに、遺伝子間
領域中または内部のシス−作用シグナル（すなわち、遺伝子開始または遺伝子終
結シグナル）のいずれか内には配列差異が存在しないことに注目すべきである。
【０１２５】
【表４】
【０１２６】
【表５】
【０１２７】
【表６】
【０１２８】 例７ Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎワクチン中のＪＬ５およびＪＬ２の相対的多量の決定 Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎのワクチンロット中のＪＬ２に対するＪＬ５の相対的比
率を決定するために、２つの変異株間の制限エンドヌクレアーゼ多型による配列
差異を利用するアッセイが開発された。アッセイは、ＰＣＲおよび制限エンドヌ
クレアーゼ切断による変異解析（ＭＡＰＲＥＣ）と呼ばれる。位置３８２８（ア
ンチゲノムセンス）において、ＪＬ５ゲノム中のＢｓｓＨＩＩ制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位が存在する。ＪＬ２では、この部位におけるＧからＡへのヌクレ
オチド変異は、ＢｓｓＨＩＩ認識の欠如をもたらす。ＪＬ５およびＪＬ２の混合
集団からのＲＮＡが単離され、そしてこの部位を取り巻くプライマーを用いて増
幅されて２５４塩基対の生成物がもたらされた。使用されたプライマーは、プラ
イマー3708CAGGCCAGCGCCGATAAATATG3729（配列番号１１７）および3962AATGACAC
CCTTCTCCATCAGGG3941（配列番号１１８）であった。プライマーは、両ＪＬ５お
よびＪＬ２に対して同一の配列を含有した；かくして、いずれの変異株からのフ
ラグメントも等しい確率において増幅すると期待された。さらにまた、先に挙げ
られた第１のプライマーは、その５’末端にフルオレセインを含有した。フルオ
レセイン化されたフラグメントはＢｓｓＨＩＩにより切断され、そしてアクリル
アミドゲルにおいて分離された。ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒがゲルをスキャンし、
そしてＪＬ５およびＪＬ２をそれぞれ表す、切断および不切断生成物の相対的多
量を定量するために使用された。ＢｓｓＨＩＩによる切断は、ＪＬ５では１２０
塩基対の蛍光生成物を、そしてＪＬ２では２５４塩基対（すなわち不切断）蛍光
生成物を残した。
【０１２９】 ＲＮＡは、流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ（Ｍｕｍｐｓｖａｘ
ロット番号０６５６Ｊ，Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｐ
ｏｉｎｔ，ＰＡ）の１０ワクチンバイアルから単離された。ＲＮＡは、増幅（先
のプライマーを使用することによって）され、ＰＣＲ生成物がＢｓｓＨＩＩによ
り消化され、ゲルにおいて分離され、そしてＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒにおいてス
キャンされた。酵素消化は、ＰＣＲ反応混合物の１／５にＢｓｓＨＩＩ（Ｒｏｃ
ｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ
）５単位を添加し、そして５０℃で２．５時間インキュベートすることによって
実施された。次いで、切断された生成物は、６％アクリルアミドゲルにおいて分
離され、次いで、これがＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎ
ａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いてスキャンされた。
【０１３０】 スキャン画像は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて定量された。一連の対
照が基準として使用された；これらのサンプルは、次のタイターに基づく比：９
９％ ＪＬ５／１％ ＪＬ２，９５％ ＪＬ５／５％ ＪＬ２，８５％ ＪＬ５
／１５％ ＪＬ２，および７５％ ＪＬ５／２５％ ＪＬ２において混合された
純粋なＪＬ５およびＪＬ２ウイルスからなった。ＲＮＡは混合ウイルスから単離
され、そしてＭＡＰＲＥＣ操作において使用された。これらの対照からの結果が
使用されてアッセイのための標準曲線が作成され、ワクチン混合物におけるＪＬ
５およびＪＬ２の相対パーセントを決定するために使用された。さらに、不消化
のＪＬ５ＰＣＲ生成物の一連の２倍希釈液が使用されてＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ
における測定結果の直線範囲が決定された。さらにまた、純粋なＪＬ２ウイルス
ＲＮＡがネガティブ対照として使用され、そして純粋なＪＬ５ウイルスＲＮＡが
ポジティブ対照として使用された。また、純粋なＪＬ５サンプルは、ＢｓｓＨＩ
Ｉ酵素の効率を決定するために対照として役立った。ＭＡＰＲＥＣアッセイおよ
び定量は再現性のために３回繰り返された。結果は３実験について平均された。
図１３は、代表的なスキャンされたゲル画像を示す。切断および不切断生成物が
矢印で示される。ＪＬ２に対応する不切断生成物は２５４塩基対の長さであり、
一方ＪＬ５に対応する切断生成物は長さ１２０塩基対である。各スキャンされた
ゲルについて相対的多量を定量するために、値は最初にバックグラウンド蛍光お
よび純粋なＪＬ５対照サンプルにおける不消化ＤＮＡ量について補正された。％
ＪＬ５値は、消化および不消化ＤＮＡの合計によって消化ＤＮＡ量を割ることに
よって、そしてその値に１００％掛けることによって決定された。各実験のため
に、混合されたＪＬ５およびＪＬ２ウイルスのセットからのＲＮＡが使用されて
標準曲線が作成された。ワクチンサンプルについての前記計算結果が標準曲線に
おいてプロットされて表９において示される値を得た。最後の欄では、各ワクチ
ンサンプルについての平均値が３実験に対して与えられる。最後の欄における結
果を平均することによって得られた１０ワクチンサンプルに関する総平均が表の
下欄に示される。
【０１３１】 表９は、このアッセイで使用されたＭｕｍｐｓｖａｘの１０ワクチンバイアル
についての結果を総括している。これらのサンプルについてのワクチン内の２変
異株の相対的多量は、範囲７３．１％ ＪＬ５／２６．９％ ＪＬ２〜７６．１
％ ＪＬ５／２３．９％ ＪＬ２であった。全３実験についての全１０ワクチン
サンプルの総平均は、７３．９％ ＪＬ５／２６．１％ ＪＬ２であった。
【０１３２】
【表７】
【０１３３】 本明細書に組み入れられている参考文献のリストが以下に与えられる。
【０１３４】
【表８】
【０１３５】
【表９】
【０１３６】
【表１０】
【０１３７】
【表１１】
【０１３８】
【表１２】
【０１３９】
【表１３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＭＵＶＣＡＴミニレプリコンＤＮＡ構築物およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写
のミニレプリコンアンチセンスＲＮＡゲノムの構成を示す図を表す。ＤＮＡ構築
物の構成において利用されるキー制限エンドヌクレアーゼ部位が示される。Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、正確なＭＵＶ５’末端ヌクレオチドに
よる転写を開始するよう設計され、そしてＨＤＶリボザイム配列は、ミニレプリ
コンＲＮＡ転写物における正確なＭＵＶ３’末端ヌクレオチドを生成するように
置かれた。複製Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ終結シグナルは、ＨＤＶリボザイム配列
後に縦列に含まれた。ＣＡＴ ＯＲＦは、ＭＵＶゲノムのコーディングおよびシ
ストロン間配列のすべてを置換する；残りの必須ＭＵＶ特異的配列は、隣接した
９０ｎｔＮＰ遺伝子非翻訳領域（ＵＴＲ）をもつ３’ＭＵＶリーダー（５５ｎｔ
）、および１３７ｎｔＬ遺伝子ＵＴＲに隣接した５’ＭＵＶトレーラー（２４ｎ
ｔ）を含有する。
【図２】 構成過程において使用されるサブゲノムフラグメントおよび制限エンドヌクレ
アーゼ部位を含む、ＭＵＶ全長ゲノムｃＤＮＡ構築物の図による表示である。Ｔ
７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびＨＤＶリボザイム配列は、正確な５’
末端ヌクレオチドによる転写を開始するように置かれ、そしてそれぞれ、ＭＵＶ
アンチセンスゲノムの正確な３’末端ヌクレオチドを生成する。縦列のＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼ終結配列は、ＨＤＶリボザイムに隣接して置かれ、ＲＮＡ切断の
効率の改善を助ける。レスキューされるＭＵＶに対する同定タグとして利用され
るヌクレオチド置換が表１（図８参照）において示される。
【図３Ａ】 ＭＵＶによる感染および実施例２に記述されるようなｐＭＵＶＣＡＴからイン
・ビトロで転写されたＲＮＡによるトランスフェクション後の２９３細胞におい
て存在するＣＡＴ活性を示す３種の薄層クロマトグラムを表す。
【図３Ｂ】 ｐＭＵＶＣＡＴおよびＭＵＶ ＮＰ，ＰおよびＬタンパク質を発現するプラスミ
ドによるトランスフェクション後のＭＶＡ−Ｔ７感染のＨｅｐ２およびＡ５４９
細胞におけるＣＡＴ活性を示す薄層クロマトグラムを表す。ｐＭＵＶＮＰ発現プ
ラスミドのレベルは、両細胞系において滴定された；列１−４は、各々、２００
ｎｇｐＭＵＶＣＡＴ、５０ｎｇｐＭＵＶＰ、２００ｎｇｐＭＵＶＬ、およびそれ
ぞれ３００ｎｇ、４５０ｎｇ、６００ｎｇ，７５０ｎｇｐＭＵＶＮＰを含有する
混合物によるトランスフェクション後のＣＡＴ活性を示す；列５は、ｐＭＵＶＬ
がトランスフェクション混合物から省略された場合に生産されるＣＡＴ活性を示
す。
【図４】 実施例３に記述されるように、Ａ５４９細胞におけるトランスフェクション細
胞上澄液の継代（Ｐ１）を表す。写真Ａ，ＢおよびＣは、レスキューされた流行
性耳下腺炎ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスなし（対照）および流行性耳下腺
炎ウイルスのＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ株に対応する。写真はＡおよびＣについて類
似の感染性フォーカスを示す。
【図５】 実施例３に記述されるように、Ｖｅｒｏ細胞モノレヤーにおいてレスキューさ
れた流行性耳下腺炎ウイルスの全細胞ＥＬＩＳＡを表す。
【図６】 ｒＭＵＶ（実施例４に記述されるような）を同定するために使用されるＲＴ／
ＰＣＲ生成物のゲル分析を示す。総ＲＮＡは、トランスフェクションされた細胞
からのｒＭＵＶウイルスの継代２により感染されたＶｅｒｏ細胞モノレヤーから
作成された。ＲＴ／ＰＣＲ反応は、ｐＭＵＶＦＬおよびｒＭＵＶにおいてのみ存
在する３種の別々なヌクレオチドタグ部位にわたるｃＤＮＡ生成物を生成するよ
うに設定された。列１は、マーカー１ｋｂラダー（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を示す
；列２，３および４は、それぞれヌクレオチドタグ位置６０８１，８５０２およ
び１１７３１にわたるＲＴ／ＰＣＲ生成物を示す。これらのＲＴ／ＰＣＲ生成物
が混入しているプラスミドＤＮＡに由来しなかったことを例証するために、列４
に示されるｃＤＮＡの生成に使用されたものと同一の反応がＲＴなしに行われた
；この反応の生成物が列５に示される。ｐＭＵＶＬがトランスフェクション混合
物から省略された場合、ｒＭＵＶが回収できなかったことを例証するために、列
４に示されるｃＤＮＡ生成物を生成するために使用されたものと同一の反応が、
ｐＭＵＶＬなしで実施されたトランスフェクション由来のＶｅｒｏ細胞ＲＮＡを
用いて設定された；この反応からの生成物が列６に示される。
【図７】 ｒＭＵＶにおける同定タグ部位を横断するヌクレオチド配列を示す３種の電気
泳動図を表す。３種のタグ部位の各々を横断して配列決定されたＲＴ／ＰＣＲ生
成物（図６）。ｒＭＵＶｃＤＮＡについて得られた各タグ部位におけるヌクレオ
チド配列が、ｐＭＵＶＦＬを得るために使用されたＭＵＶのプラーク分離株（プ
ラーク分離株４，ＰＩ４）についての共通配列と比較される。
【図８】 全長ｃＤＮＡクローンおよびプラーク分離株４（ＰＩ４）およびＪｅｒｙｌ
Ｌｙｎｎ株についての共通配列（配列番号：１）間のヌクレオチドおよびアミノ
酸差異を列挙する表（表１）である。
【図９】 流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質についての遺伝子開始点および遺伝子終結
点を含む、流行性耳下腺炎ウイルスの完全遺伝子地図を記す表（表２）である。
５５ヌクレオチド長の３’リーダーおよび２４ヌクレオチド長の５’トレーラー
の配列がまた示される。
【図１０】 配列番号：１において与えられる流行性耳下腺炎ゲノムの個々の遺伝子につい
ての翻訳開始および終止位置とともに、流行性耳下腺炎ウイルス遺伝子の転写開
始および終結ヌクレオチド位置を列挙する表（表３）である。表３における各転
写（遺伝子）開始から各終結ヌクレオチド位置までのヌクレオチドは、タンパク
質ＮＰ，Ｐ，Ｍ，Ｆ，ＳＨ，ＨＮおよびＬについてのヌクレオチド配列（それぞ
れ配列番号：９３−９９）に対応する。
【図１１】 ＭおよびＦ遺伝子間の流行性耳下腺炎ウイルスゲノム中へのルシフェラーゼお
よびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の挿入を示す図である。ＡｓｃＩ部位は、Ｍ遺
伝子の５’非コーディング領域における部位特異的突然変異によって生成された
。ネスト（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲは、流行性耳下腺炎ウイルス特異的Ｍ−Ｆ遺伝
子間配列および各レポーター遺伝子に隣接する末端ＡｓｃＩ部位を生成するため
に使用された。得られるＰＣＲ生成物は、ＡｓｃＩにより消化され、そしてゲノ
ムＡｓｃＩ部位中に移入された。
【図１２】 流行性耳下腺炎ウイルスゲノム中への２種の遺伝子（ルシフェラーゼおよびＣ
ＡＴ）の挿入を示す図である。ポリシストロンの第２の遺伝子の発現のための内
部リボソームのエントリー部位を含有する２個の分離した転写単位および１個の
転写単位が、別々に、Ｍ−Ｆ遺伝子間領域に存在するＡｓｃＩ部位中に挿入され
た。ネストＰＣＲは、各遺伝子および転写単位に隣接する適当な流行性耳下腺炎
ウイルスのＭ−Ｆ遺伝子間配列を生成するために使用された。
【図１３】 実施例７に記述されるように、１０バイアルの流行性耳下腺炎ウイルスＪｅｒ
ｙｌ Ｌｙｎｎワクチンから単離され、そしてＲＴ−ＰＣＲによって増幅された
ＲＮＡから決定されるＪＬ５／ＪＬ２の比例部分に関する１０個のＭｕｍｐｓｖ
ａｘRワクチンサンプルのＭＡＰＲＥＣ解析の結果を表す。列１および２の試験
サンプルは、アッセイの直線性の下方限界を定義するために使用された未消化の
ＰＣＲ生成物の連続希釈液である。列３では、ＰＣＲ生成物はＪＬ５の精製分離
株に由来する。列４では、ＰＣＲ生成物はＪＬ２の精製分離株に由来する。列５
−８では、ＰＣＲ生成物は、それぞれ次の比：９９ ＪＬ５／１ ＪＬ２，９５
ＪＬ５／５ ＪＬ２，８５ ＪＬ５／１５ ＪＬ２，および７５ ＪＬ５／２
５ ＪＬ２において混合されたＪＬ５およびＪＬ２ウイルスのサンプルに由来す
る。列９−１８では、ＰＣＲ生成物はＭｕｍｐｓｖａｘRサンプル１−１０に由
来する。
【図１４】 実施例５に記述されるように、両ＣＡＴおよびルシフェラーゼ遺伝子を含有す
るｒＭＵＶにより感染されたＶｅｒｏ細胞の抽出物に存在するＣＡＴ活性を示す
薄層クロマトグラムを表す。
【図１５】 実施例５に記述されるように、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するｒＭＵ
Ｖにより感染されたＶｅｒｏ細胞モノレヤーの細胞学的染色を示す写真である。
強い青色染色の存在は、β−ガラクトシダーゼ発現および活性を指示した。パネ
ルＣはまた、いかなる付加的な外来遺伝子も含有しないｒＭＵＶによって形成さ
れた「クリアー」プラークを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 7/04 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 7/04 5/00 Ｂ Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シドウ，モヒンデルジト・エス アメリカ合衆国ニユージヤージイ州07076 スコツチプレインズ・コンコードロード 2349 (72)発明者 ユデム，スチーブン・エイ アメリカ合衆国ニユーヨーク州10023ニユ ーヨーク・ウエストセブンテイースストリ ート155・アパートメント６ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA02 DA02 HA17 4B065 AA90X AA95Y AB01 BA01 CA24 CA44 4C085 AA03 BA58 CC08

Claims (44)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 最低１個の宿主細胞中で、（ｉ）流行性耳下腺炎ウイルスの
    ゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列またはその変異
    体のポリヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る転写ベ
    クター、ならびに（ｉｉ）被包化、転写および複製に必要なトランスに作用する
    タンパク質（ＮＰ、ＰおよびＬ）をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成
    るもう１種の単離された核酸分子（１種もしくは複数）を含んで成る最低１種の
    発現ベクター、を含んで成るレスキュー組成物の媒体中でのトランスフェクショ
    ンもしくは形質転換を；前記ベクターの共発現および該組換えウイルスの産生を
    可能にするのに十分な条件下で実施すること を含んで成る、組換え流行性耳下腺炎ウイルスの製造方法。
  2. 【請求項２】 組換えウイルスを収穫することをさらに含んで成る、請求項
    １記載の方法。
  3. 【請求項３】 流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコ
    ードする単離された核酸分子が、１種以上のゲノムもしくはアンチゲノム供給源
    のキメラである、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコ
    ードする単離された核酸分子が、配列番号１、１１および１２より成る群から選
    択されるポリヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコ
    ードする単離された核酸分子が、弱毒ウイルスもしくは感染性の形態の該ウイル
    スをコードする、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコー
    ドする単離された核酸分子が感染性の形態の該ウイルスをコードする、請求項１
    記載の方法。
  7. 【請求項７】 流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコ
    ードする単離された核酸分子が弱毒ウイルスをコードする、請求項１記載の方法
    。
  8. 【請求項８】 流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコ
    ードする単離された核酸分子が感染性の弱毒ウイルスをコードする、請求項１記
    載の方法。
  9. 【請求項９】 宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 宿主細胞が脊椎動物細胞である、請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 宿主細胞が鳥類細胞である、請求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 宿主細胞がヒト細胞由来である、請求項１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 宿主細胞がヒト胚細胞由来である、請求項９記載の方法。
  14. 【請求項１４】 宿主細胞がヒト胚腎細胞由来である、請求項１２記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】 請求項１記載の方法から製造される組換え流行性耳下腺炎
    ウイルス。
  16. 【請求項１６】 （ｉ）請求項１記載の方法から製造される組換え流行性耳
    下腺炎ウイルスおよび（ｉｉ）製薬学的に許容できる担体を含んで成る組成物。
  17. 【請求項１７】 転写ベクターがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をさらに
    含んで成る、請求項１記載の方法。
  18. 【請求項１８】 単離された組換え的に製造された弱毒流行性耳下腺炎ウイ
    ルスおよび生理学的に許容できる担体を含んで成る免疫原組成物。
  19. 【請求項１９】 請求項１８記載の免疫原組成物を個体に投与することを含
    んで成る、流行性耳下腺炎ウイルスに対する保護を誘導するための個体の免疫化
    方法。
  20. 【請求項２０】 流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムを
    コードするポリヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子。
  21. 【請求項２１】 配列番号１、配列番号１１および配列番号１２より成る群
    から選択される正鎖のアンチゲノムメッセージセンス中に流行性耳下腺炎ウイル
    ス配列を含んで成る、請求項２０記載の核酸分子。
  22. 【請求項２２】 流行性耳下腺炎ウイルスの１種もしくはそれ以上のタンパ
    ク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子。
  23. 【請求項２３】 前記ポリヌクレオチド配列が、１種もしくはそれ以上の異
    種ヌクレオチド配列または１種もしくはそれ以上の異種遺伝子をさらに含んで成
    る、請求項２０記載の核酸分子。
  24. 【請求項２４】 前記ポリヌクレオチド配列が、１種もしくはそれ以上の異
    種ヌクレオチド配列または１種もしくはそれ以上の異種遺伝子をさらに含んで成
    る、請求項２２記載の核酸分子。
  25. 【請求項２５】 流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムを
    コードするポリヌクレオチド配列を含んで成るプラスミド。
  26. 【請求項２６】 流行性耳下腺炎ウイルスの１種もしくはそれ以上のタンパ
    ク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成るプラスミド。
  27. 【請求項２７】 ポリヌクレオチド配列が、１種もしくはそれ以上の異種ヌ
    クレオチド配列または１種もしくはそれ以上の異種遺伝子をさらに含んで成る、
    請求項２５記載のプラスミド。
  28. 【請求項２８】 前記ポリヌクレオチド配列が、１種もしくはそれ以上の異
    種ヌクレオチド配列または１種もしくはそれ以上の異種遺伝子をさらに含んで成
    る、請求項２６記載のプラスミド。
  29. 【請求項２９】 請求項２５記載の最低１種のプラスミドで形質転換された
    宿主細胞。
  30. 【請求項３０】 請求項２６記載の最低１種のプラスミドで形質転換された
    宿主細胞。
  31. 【請求項３１】 請求項２７記載の最低１種のプラスミドで形質転換された
    宿主細胞。
  32. 【請求項３２】 流行性耳下腺炎ウイルス以外の病原体に対する最低１種の
    抗原をさらに含んで成る、請求項１８記載の免疫原組成物。
  33. 【請求項３３】 最低１種の抗原が弱毒ＲＮＡウイルスである、請求項３２
    記載の免疫原組成物。
  34. 【請求項３４】 最低１種の抗原が、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘帯
    状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）およびＲＳ
    ウイルス（ＲＳＶ）から選択される弱毒ウイルスである、請求項３３記載の免疫
    原組成物。
  35. 【請求項３５】 最低１種の抗原が組換え的に製造される、請求項３２記載
    の免疫原組成物。
  36. 【請求項３６】 最低１種の抗原が組換え的に製造される、請求項３２記載
    の免疫原組成物。
  37. 【請求項３７】 流行性耳下腺炎ウイルス以外の病原体の最低１種の抗原が
    、組換え的に製造された弱毒流行性耳下腺炎ウイルスから発現される、請求項３
    ２記載の免疫原組成物。
  38. 【請求項３８】 流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、
    水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）およ
    びＲＳウイルス（ＲＳＶ）以外の病原体の最低１種の抗原が、組換え的に製造さ
    れた弱毒流行性耳下腺炎ウイルスから発現される、請求項３２記載の免疫原組成
    物。
  39. 【請求項３９】 異種ヌクレオチド配列が、単一の転写ユニットとして流行
    性耳下腺炎ゲノム配列内に挿入される、請求項２７記載のプラスミド。
  40. 【請求項４０】 異種ヌクレオチド配列が、１種もしくはそれ以上のモノシ
    ストロン性転写ユニットとして流行性耳下腺炎ゲノム配列内に挿入される、請求
    項３９記載のプラスミド。
  41. 【請求項４１】 異種ヌクレオチド配列が、最低１種のポリシストロン性転
    写ユニットとして流行性耳下腺炎ゲノム配列内に挿入され、それが１種もしくは
    それ以上のリボソーム進入部位を含有することができる、請求項３９記載のプラ
    スミド。
  42. 【請求項４２】 異種ヌクレオチド配列が、１種のポリタンパク質、および
    前記ポリタンパク質を切断して個々のポリペプチドを生成させる十分な数のプロ
    テアーゼをコードする、請求項４１記載のプラスミド。
  43. 【請求項４３】 請求項２７記載の宿主細胞により産生される単離された組
    換え的に製造された弱毒流行性耳下腺炎ウイルス、および生理学的に許容できる
    担体を含んで成る製薬学的組成物。
  44. 【請求項４４】 組換え流行性耳下腺炎ウイルスのｃＤＮＡクローンの配列
    を含んで成るヌクレオチド配列。
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