BRPI0312194B1 - vetor de vírus recombinante do sarampo, sistema de resgate e composição imunogênica - Google Patents

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Abstract

VÍRUS MONONEGAVIRAL RECOMBINANTE, VÍRUS DO SARAMPO RECOMBINANTE, VETOR DE VÍRUS DO SARAMPO, SISTEMA DE RESGATE, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA E COMPOSIÇÃO DE VACINA. A presente invenção refere-se a um vírus de sarampo recombinante que expressa uma seqüência de aminoácidos heteróloga derivada de um antígeno de um determinado vírus de RNA, em que o mencionado vírus de sarampo recombinante é capaz de desencadear uma resposta imunológica celular e/ou humoral contra o vírus do sarampo ou contra o mencionado vírus de RNA ou contra ambos, vírus do sarampo e contra o mencionado vírus de RNA. A presente invenção também se refere ao uso do mencionado vírus recombinante do sarampo para a preparação de composição imunogênica.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a vírus recombinantes do sarampo que expressam epítopos de antígenos dos vírus de RNA que incluem, especialmente, retrovírus e flavivírus e ao seu uso para a preparação de composições de vacina.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] O vírus do sarampo é um membro da ordem Mononegavirales, ou seja, vírus com um genoma de RNA de fita negativa não- segmentado. O genoma não-segmentado do vírus do sarampo (MV) possui uma polaridade negativa que resulta em um RNA genômico que não é traduzido tanto in vivo quanto in vitro, nem infeccioso quando purificado.
[003] A transcrição e replicação de RNA viral de fita negativa não- segmentados e seu agrupamento como partículas virais foram estudadas e relatadas, especialmente, em Fields Virology (3a edição, vol. 1, 1996, Lippincott-Raven Publishers, Fields, B. N. et al.). A transcrição e a replicação de vírus do sarampo não envolvem o núcleo das células infectadas, mas ocorrem no citoplasma das mencionadas células infectadas. O genoma do vírus do sarampo compreende genes codificadores de 6 proteínas estruturais principais dos 6 genes (denominados N, P, M, F, H e L) e 2 proteínas não- estruturais adicionais do gene P. A ordem do gene é a seguinte: 3’-I, N, P (incluindo C e V), M, F, H e uma grande proteína L polimerase na extremidade 5’. O genoma compreende adicionalmente regiões não-codificantes na região intergênica M/F; esta região não-codificante contém cerca de 1.000 nucleotídeos de RNA não-traduzido. Os genes mencionados codificam, respectivamente, o peptídeo líder (gene I), as proteínas do nucleocapsídeo do vírus, ou seja, a nucleoproteína (N), a fosfoproteína (P) e a proteína grande (L) que são agrupadas em torno do RNA genômico para fornecer o nucleocapsídeo. Os demais genes codificam as proteínas do envelope viral, que incluem as proteínas hemaglutinina (H), de fusão (F) e de matriz (M).
[004] O vírus do sarampo foi isolado e vacinas vivas atenuadas foram derivadas do MV de Edmonston isolado em 1954 (Enders, J. F. e T. C. Peebles, 1954, Propagation in Tissue Cultures of Cytopathogenic Agents from Patients with Measles, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 277-286), por meio de passagens em série em células primárias humanas de âmnio ou rim. As linhagens utilizadas foram adaptadas em seguida para fibroblastos de embrião de galinha (CEF) para produzir linhagens Edmonston A e B (Griffin, D. e W. Bellini, 1996, Measles Virus, págs. 1267-1312 em B. Fields, D. Knipe et al., (ed.), Virology, vol. 2, Lippincott - Raven Publishers, Filadélfia, Estados Unidos). Edmonston B foi licenciada em 1963 como a primeira vacina MV. Passagens adicionais de Edmonston A e B em CEF produziram os vírus Schwarz e Moraten mais atenuados (Griffin, D. e W. Bellini, 1996, Measles Virus, págs. 1267-1312, em B. Fields, D. Knipe et al., (ed.), Virology, vol. 2, Lippincott - Raven Publishers, Filadélfia, Estados Unidos), cujas sequências se monstraram, recentemente, idênticas (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu e S. A. Udem., 2001, Analysis of the Noncoding Regions of Measles Virus Strains in the Edmonston Vaccine Lineage, J. Virol. 75: 921- 933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu e S. A. Udem, 2001, Comparison of Predicted Amino Acid Sequences of Measles Virus Strains in the Edmonston Vaccine Lineage, J. Virol. 75: 910-920). Como a vacina de Edmonston B era reatogênica, ela foi abandonada em 1975 e substituída pela vacina Schwarz/Moraten que é, atualmente, a vacina contra sarampo mais amplamente utilizada no mundo (Hilleman, M., 2002, Current Overview of the Pathogenesis and Prophylaxis of Measles with Focus on Practical Implications, Vaccine, 20: 651-665). Também foram utilizadas várias outras linhagens de vacinas: AIK-C, Schwarz F88, CAM70, TD97 no Japão, Leningrado-16 na Rússia e Edmonston Zagreb. As linhagens chinesas CAM70 e TD97 não foram derivadas de Edmonston. As vacinas de Schwarz/Moraten e AIK-C são produzidas em CEF. A vacina Zagreg é produzida em células humanas diplóides (WI-38).
[005] A vacina viva atenuada derivada da linhagem Schwarz é comercializada pela Aventis Pasteur (Lyon, França) com a marca comercial Rouvax®.
[006] Em um trabalho notável e pioneiro, Martin Billeter e seus colaboradores clonaram um cDNA infeccioso correspondente ao antigenoma de MV de Edmonston e estabeleceram um procedimento genético reverso original e eficiente para resgatar o vírus correspondente (Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dotsch, G. Christiansen e M. Billeter., 1995, Rescue of Measles Viruses from Cloned DNA, EMBO Journal, 14: 5773-5784) e documento WO 97/06270. Eles desenvolveram um vetor de Edmonston para a expressão de genes exógenos (Radecke, F. e M. Billeter, 1997, Reverse Genetics Meets the Nonsegmented Negative-Strand RNA Viruses, Reviews in Medical Virology, 7: 49-63) e demonstraram a sua grande capacidade de inserção (até 5 kb) e sua alta estabilidade em expressar transgenes (Singh, M. e M. Billeter, 1999, A Recombinant Measles Virus Expressing Biologically Active Human Interleukin-12, J. Gen. Virol. 80: 101-106; Singh, M., R. Cattaneo e M. Billeter, 1999, A Recombinant Measles Virus Expressing Hepatitis B Virus Surface Antigen Induces Humoral Immune Responses in Genetically Modified Mice, J. Virol. 73: 4823-4828; Spielhofer, P., T. Bacchi, T. Fehr, G. Christiansen, R. Cattaneo, K. Kaelin, M. Billeter e H. Naim, 1998, Chimeric Measles Viruses with a Foreign Envelope, J. Virol. 72: 2150-2159); Wang, Z., T. Hangartner, L. Cornu, A. Martin, M. Zuniga, M. Billeter e H. Naim, 2001, Recombinant Measles Viruses Expressing Heterologus Antigens of Mumps and Simian Immunodeficiency Viruses. Vaccine, 19: 2329- 2336. Este vetor foi clonado a partir da linhagem Edmonston B de MV propagado em células HELA (Ballart, I., D. Eschle, R. Cattaneo, A. Schmid, M. Metzler, J. Chan, S. Pifko-Hirst, S. A. Udem e M. A. Billeter, 1990, Infectious Measles Virus from Cloned cDNA, Embo J. 9: 379-384).
[007] Além disso, vírus recombinante do sarampo que expressa antígeno de superfície de vírus de Hepatite B foi produzido e demonstrou-se indutor de respostas imunológicas humorais em camundongos geneticamente modificados (Singh, M. R. et al., 1999, J. Virol. 73: 4823-4828).
[008] A vacina MV induz uma imunidade muito eficiente ao longo da vida após uma única injeção de baixa dosagem (104 TCID50) (33, 34). A proteção é mediada tanto por anticorpos quanto por células T CD4+ e CD8+. O genoma de MV é muito estável e nunca foi observada uma reversão para patogenicidade com esta vacina. O MV se replica exclusivamente no citoplasma, descartando a possibilidade de integração em DNA hospedeiro. Além disso, foram estabelecidos um clone de cDNA infeccioso que corresponde ao antigenoma da linhagem Edmonston de MV e um procedimento de resgate do vírus correspondente (35). Este cDNA foi fabricado em um vetor para expressar genes exógenos (36). Ele pode acomodar até 5 kb de DNA exógeno e é geneticamente muito estável (37, 38, 39).
[009] A partir da observação de que as propriedades do vírus do sarampo e especialmente a sua capacidade de permitir altos títulos de anticorpos neutralizadores in vivo e sua propriedade de ser um potente indutor de resposta imunológica celular de longa duração, os inventores propuseram que pode ser um bom candidato para a preparação de composições que compreendem vírus infecciosos recombinantes que expressam peptídeos antigênicos ou polipeptídeos de vírus de RNA determinados, que incluem especialmente retrovírus ou flavivírus, para induzir anticorpos neutralizadores contra o mencionado vírus RNA e, especialmente, os mencionados retrovírus ou flavivírus que poderão, de preferência, ser apropriados para atingir pelo menos algum grau de proteção contra os mencionados vírus RNA, especialmente retrovírus ou flavivírus, em hospedeiros animais e, de maior preferência, humanos. Especialmente, linhagens MV e, particularmente, linhagens de vacina foram escolhidas na presente invenção como possíveis vetores para induzir a imunidade tanto contra vírus do sarampo quanto contra vírus RNA cujo componente é expresso no MV recombinante projetado, em populações infantis expostas, pois não possuem imunidade contra MV. Populações adultas, mesmo indivíduos já imunizados contra MV, podem, entretanto, também se beneficiarem da imunização recombinante de MV, pois a readministração do vírus MV sob a forma recombinante da presente invenção pode resultar em uma amplificação de anticorpos anti-MV.
[010] Dentre os retrovírus de interesse, os inventores escolheram retrovírus da AIDS, que incluem HIV-1 e, dentre os flavivírus, alguns que são patógenos humanos importantes, tais como Vírus da Febre Amarela (YFV) e Vírus do Oeste do Nilo (WNV).
[011] O YFV e WNV pertencem à família Flaviviridae descrita em Fields Virology (3aedição, vol. 1, 1996, Lippincott - Raven Publishers, Fields, B. N. et al.).
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[012] A presente invenção refere-se a um vírus mononegavirales recombinante que expressa uma sequência de aminoácidos heterólogos, em que o mencionado vírus recombinante é capaz de desencadear uma resposta imunológica humoral e/ou celular contra a mencionada sequência de aminoácidos heterólogos, incluindo em indivíduos que possuam imunidade pré- existente contra o vírus do sarampo.
[013] Em uma primeira realização, a presente invenção fornece, especialmente, vírus recombinantes do sarampo capazes de expressar antígenos e, especialmente, epítopos derivados de antígenos de vírus de RNA, incluindo retrovírus ou flavivírus.
[014] A presente invenção também se refere a construções de ácido nucléico, especialmente a construções de ácido nucléico recombinantes que expressam os vírus recombinantes do sarampo e expressam com eles antígenos ou epítopos de antígenos de retrovírus ou flavivírus.
[015] A presente invenção também se refere a processos de preparação desses vírus recombinantes do sarampo e, especialmente, refere- se à produção desse MV recombinante em sistemas de resgate.
[016] A presente invenção também se refere a composições que compreendem os mencionados vírus recombinantes do sarampo como princípios ativos para a proteção de hospedeiros, especialmente hospedeiros humanos, contra doenças relacionadas a infecções pelos mencionados retrovírus, especialmente por retrovírus da AIDS, ou pelos mencionados flavivírus, especialmente o Vírus da Febre Amarela ou o Vírus do Oeste do Nilo.
[017] As sequências de ácido nucléico de vírus do sarampo foram descritas no documento WO 98/13501, especialmente uma sequência de DNA de 15.894 nucleotídeos que corresponde a uma cópia de DNA da fita positiva de RNA mensageiro sense (antigenômico) de várias linhagens de sarampo de vacina do tipo selvagem, incluindo a linhagem Edmonston do tipo selvagem, linhagem Moraten e linhagem Schwarz, que é idêntica à linhagem Moraten, exceto pelas posições de nucleotídeos 4917 e 4924, em que a linhagem Schwarz contém um “C” no lugar de um “T”.
[018] A fim de produzir vírus recombinantes do sarampo, foi desenvolvido um sistema de resgate para a linhagem MV de Edmonston que foi descrito no documento WO 97/06270. A descrição do mencionado sistema de resgate contido em WO 97/06270 é incorporada ao presente como referência e faz-se referência especialmente aos exemplos deste documento, incluindo os exemplos relacionados a células e vírus, à geração da linhagem celular 293-3-46, construções de plasmídeos, transfecção de plasmídeos e colheita de produtos de genes repórteres, estabelecimento experimental para resgate de MV, células auxiliares que expressam proteínas N e P de MV de forma estável, bem como RNA polimerase T7, resgate de MV utilizando células auxiliares 293-3-46 e caracterização de MV resgatado.
[019] O sistema de resgate descrito no documento WO 97/06270 foi adicionalmente desenvolvido para incluir uma etapa de choque térmico descrita em Parks, C. L. et al., 1999, J. Virol. 73: 3560-3566. A descrição deste sistema de resgate de cDNA de vírus do sarampo amplificado é incorporada ao presente como referência.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[020] A presente invenção refere-se, portanto, a vírus recombinantes do sarampo que expressam uma sequência de aminoácidos heterólogos derivada de um antígeno de um vírus de RNA determinado, especialmente de um retrovírus ou flavivírus, em que o mencionado vírus recombinante do sarampo é capaz de desencadear uma resposta imunológica humoral e/ou celular contra o vírus do sarampo ou contra o mencionado vírus de RNA, especialmente retrovírus ou flavivírus, ou contra ambos, o vírus do sarampo e o mencionado vírus de RNA, especialmente retrovírus ou flavivírus.
[021] A expressão “sequência de aminoácidos heterólogos” refere-se a uma sequência de aminoácidos que não é derivada dos antígenos de vírus do sarampo, em que a mencionada sequência de aminoácidos heterólogos é consequentemente derivada de um vírus de RNA, especialmente de um retrovírus ou flavivírus de interesse, a fim de estabelecer uma resposta imunológica em um hospedeiro, especialmente em um hospedeiro humano e, de preferência, estabelecer proteção contra uma infecção pelo mencionado vírus de RNA, especialmente retrovírus ou flavivírus.
[022] A sequência de aminoácidos heterólogos expressa em vírus recombinante do sarampo de acordo com a presente invenção é tal que é capaz de desencadeiar uma resposta imunológica humoral e/ou celular em um determinado hospedeiro contra o vírus de RNA, especialmente retrovírus ou flavivírus do qual se origina. Consequentemente, esta sequência de aminoácido é aquela que compreende pelo menos um epítopo de um antígeno, especialmente um epítopo conservado, em que o epítopo é exposto naturalmente sobre o antígeno ou é obtido ou exposto como resultado de uma mutação ou modificação ou combinação de antígenos.
[023] Os antígenos utilizados para a preparação dos vírus recombinantes do sarampo são especialmente antígenos de envelope de vírus de RNA, tais como retrovírus ou flavivírus, especialmente de envelopes do vírus da AIDS, que incluem HIV-1 ou de envelopes do Vírus da Febre Amarela ou envelopes do Vírus do Oeste do Nilo. Outros antígenos retrovirais ou flavivirais podem, entretanto, ser utilizados vantajosamente a fim de derivar vírus recombinantes do sarampo capazes de gerar anticorpos contra os mencionados retrovírus ou flavivírus e a presente invenção refere-se, em uma realização, a antígenos dos quais podem ser derivadas sequências de aminoácidos que desencadeiam a produção de anticorpos neutralizadores contra o retrovírus ou flavivírus. De acordo com outra realização da presente invenção, a sequência de aminoácidos destes antígenos, alternativa ou adicionalmente, também desencadeia uma resposta imunológica celular contra os retrovírus ou flavivírus.
[024] Convenientemente, o vírus recombinante do sarampo de acordo com a presente invenção também desencadeia uma resposta imunológica humoral e/ou celular contra o vírus do sarampo. Esta resposta, entretanto, não é obrigatória, desde que a resposta imunológica contra o vírus de RNA, especialmente retrovírus ou flavivírus, seja de fato obtida.
[025] De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o vírus recombinante do sarampo de acordo com a presente invenção é obtido dentro de um sistema de resgate para a preparação de vírus do sarampo infecciosos. Consequentemente, o vírus recombinante do sarampo é um vírus do sarampo infeccioso resgatado recuperado a partir de um sistema de resgate.
[026] Um vírus recombinante do sarampo específico de acordo com a presente invenção é derivado da linhagem Edmonston de vírus do sarampo.
[027] Outro vírus recombinante do sarampo específico e preferido de acordo com a presente invenção é derivado da linhagem Schwarz e, especialmente, de uma linhagem Schwarz de vacina aprovada, tal como a produzida com a marca comercial Rouvax, disponível através da Aventis Pasteur (França).
[028] A presente invenção fornece, portanto, um vírus recombinante do sarampo que é recuperado a partir de células auxiliares transfectadas com cDNA codificador do RNA antigenômico (fita positiva) do vírus do sarampo, em que o mencionado cDNA é recombinado com uma sequência de nucleotídeo codificador da sequência de aminoácidos heterólogos de vírus de RNA, especialmente retroviral ou flaviviral.
[029] A expressão “codificadora” na definição acima engloba a capacidade do cDNA de permitir a transcrição de um RNA positivo antigenômico de comprimento total, em que o mencionado cDNA serve especialmente de modelo para transcrição. Consequentemente, quando o cDNA for uma molécula de dupla fita, uma das fitas contém a mesma sequência de nucleotídeos do RNA de fita positiva antigenômica do vírus do sarampo, exceto pelo fato de que os nucleotídeos “U” são substituídos por “T” no cDNA. Esse cDNA é, por exemplo, o inserto correspondente ao vírus do sarampo, contido no plasmídeo pTM-MVSchw depositado sob n° I-2889 na CNCM Paris, França, em 12 de junho de 2002. Este plasmídeo é representado na Figura 2A.
[030] A expressão “cDNA” utilizada para a descrição da sequência de nucleotídeos da molécula de acordo com a presente invenção refere-se meramente ao fato de que, originalmente, a mencionada molécula é obtida através de transcrição reversa do genoma de RNA positivo genômico de comprimento total de partículas virais do vírus do sarampo.
[031] Isso não deverá ser considerado uma limitação para os métodos utilizados para a sua preparação. A presente invenção engloba, portanto, dentro da expressão “cDNA”, todo DNA, desde que contenha a sequência de nucleotídeos definida acima. Ácidos nucléicos purificados, incluindo DNA, são portanto englobados dentro do significado de cDNA de acordo com a presente invenção, desde que o mencionado ácido nucléico, especialmente DNA, preencha as definições fornecidas acima.
[032] As células auxiliares de acordo com o sistema de resgate são transfectadas com um vetor de transcrição que compreende o cDNA que codifica o RNA positivo antigenômico de comprimento total do vírus do sarampo, quando o mencionado cDNA tiver sido recombinado com uma sequência de nucleotídeos codificadora da sequência de aminoácidos heterólogos de interesse (sequência de nucleotídeos heterólogos) e as mencionadas células auxiliares são adicionalmente transfectadas com um vetor de expressão ou vários vetores de expressão que forneçam as funções auxiliares, incluindo as que permitem a expressão de proteínas com ação trans de vírus do sarampo, ou seja, proteínas N, P e L e que forneçam a expressão de uma RNA polimerase para permitir a transcrição do cDNA recombinante e a replicação do RNA viral correspondente.
[033] A presente invenção refere-se especificamente à preparação de vírus recombinantes do sarampo que contenham epítopos de antígenos de retrovírus de HIV. Ela engloba especialmente um vírus recombinante do sarampo que expressa uma sequência de aminoácidos heterólogos que é derivada de um antígeno do envelope de HIV e que é especialmente derivada de uma glicoproteína ou proteína de envelope de HIV- 1.
[034] Os antígenos de interesse a esse respeito são especialmente gp160, gp120 e gp41 de HIV-1 ou gp140, GAG ou TAT de HIV- 1.
[035] Em uma realização específica da presente invenção, a sequência de aminoácidos heterólogos é derivada de um gp160 recombinante, gp120 de HIV-1 ou gp140, GAG ou TAT de HIV-1.
[036] A presente invenção refere-se especificamente a um vírus recombinante do sarampo em que as alças (loops) V1, V2 e/ou V3 do antígeno gp120 (ou gp160) são deletadas ou parcialmente deletadas, individualmente ou em combinação, de tal forma que os epítopos conservados sejam expostos sobre o antígeno gp120 recombinante obtido.
[037] As alças (loops) V1, V2 e V3 do antígeno gp120 (ou gp160) de HIV-1 foram especialmente descritas em Fields Virology (Fields, B. N. et al., - Lippincott Raven Publishers, 1996, págs. 1953-1977).
[038] De acordo com uma outra realização da presente invenção, o vírus recombinante do sarampo é tal que expressa uma sequência de aminoácidos heterólogos derivada do antígeno gp120 (ou gp160) de HIV-1, em que as alças (loops) V1, V2 e/ou V3 do antígeno gp120 (ou gp160) são substituídas ou parcialmente substituídas, individualmente ou em combinação, de tal forma que os epítopos conservados sejam expostos sobre o antígeno gp120 (ou gp160) recombinante obtido.
[039] De acordo com outra realização particular, o vírus recombinante do sarampo que expressa uma sequência de DNA heteróloga derivada de um antígeno de envelope de HIV-1 é derivado do antígeno gp120, de tal forma que as alças (loops) V1 e V2 sejam deletadas e a alça (loop) V3 seja substituída pela sequência AAELDKWASAA.
[040] De acordo com outra realização particular da presente invenção, o vírus recombinante do sarampo é aquele que expressa uma sequência de aminoácidos heterólogos selecionada a partir de gp160ΔV3, gp160ΔV1V2, gp160ΔV1V2V3, gp140ΔV3, gp140ΔV1V2, gp140ΔV1V2V3, em que as sequências de aminoácidos heterólogos são representadas esquematicamente na Figura 1.
[041] A presente invenção também se refere a vírus recombinantes do sarampo, conforme definido de acordo com as indicações acima, em que a sequência de aminoácidos é derivada de um antígeno do vírus da Febre Amarela selecionado a partir do envelope (Env) ou das proteínas NS1 ou seus mutantes imunogênicos.
[042] A presente invenção também se refere a vírus recombinantes do sarampo, conforme definido de acordo com as indicações acima, em que a sequência de aminoácidos é derivada de um antígeno do vírus do Oeste do Nilo selecionado a partir do envelope (E), pré-membrana (preM) ou seus mutantes imunogênicos.
[043] A presente invenção também se refere a virus recombinantes do sarampo ou a partículas semelhantes a vírus (VLP) que expressam antígenos recombinantes duplos ou múltiplos, especialmente antígenos de HIV múltiplos (incluindo seus fragmentos) ou antígenos de flavivírus, contra os quais busca-se uma resposta imunológica. Esses vírus recombinantes do sarampo ou VLP podem expressar vantajosamente antígenos de diferentes vírus e, desta forma, fornecer imunogenes contra vários vírus.
[044] A presente invenção refere-se ainda a vírus recombinantes do sarampo de acordo com qualquer uma das definições acima, em que o cDNA necessário para a expressão das partículas virais, que é compreendido dentro do vetor de vírus EdB-tag ou, de preferência, dentro do vetor pTM- MVSchw, é recombinado com a sequência de ATU da Figura 8 ou a sequência de ATU ilustrada na Figura 2C, em que a mencionada ATU é inserida em uma posição do vetor EdB-tag ou do vetor pTM-MVSchw utilizando o gradiente do genoma viral para permitir vários níveis de expressão da sequência transgênica codificadora da sequência de aminoácidos heterólogos inserida na mencionada ATU. A presente invenção permite vantajosamente a inserção dessas sequências de DNA heterólogas em uma sequência que é denominada Unidade de Transcrição Adicional (ATU), especialmente uma ATU conforme descrito por Billeter et al., no documento WO 97/06270.
[045] As propriedades imunológicas vantajosas dos vírus recombinantes do sarampo de acordo com a presente invenção podem ser exibidas em um modelo animal que é selecionado a partir de animais suscetíveis a vírus do sarampo e em que é determinada a resposta imunológica humoral e/ou celular contra o antígeno heterólogo e/ou contra o vírus do sarampo.
[046] Dentre os animais apropriados para uso como modelo para caracterizar a resposta imunológica, os técnicos no assunto podem utilizar especialmente camundongos e, especialmente, camundongos recombinantes suscetíveis ao vírus do sarampo, ou em macacos.
[047] Em uma realização preferida da presente invenção, o vírus recombinante do sarampo de acordo com a presente invenção é apropriado para desencadear a neutralização de anticorpos contra a sequência de aminoácidos heterólogos em um modelo animal mamífero suscetível ao vírus do sarampo. Especialmente, essa resposta imunológica que compreende o desencadeamento da neutralização de anticorpos pode ser pesquisada em camundongos recombinantes ou macacos.
[048] De acordo com outra realização específica da presente invenção, especialmente quando a sequência de aminoácidos heterólogos é derivada de uma das proteínas de envelope de HIV-1 e em que ela gera anticorpos capazes de neutralizar um isolado de HIV primário, a resposta é vantajosamente testada sobre células indicadoras, tais como células P4-CCR5 disponíveis através do NIH (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program) (Charneau, P. et al., 1994, J. Mol. Biol. 241: 651-662).
[049] De acordo com outra realização preferida, o vírus recombinante do sarampo de acordo com a presente invenção gera a neutralização de anticorpos contra a sequência de aminoácidos heterólogos em mamíferos, com um título de pelo menos 1/40.000 quando medido em ELISA, e um título neutralizador de pelo menos 1/20.
[050] A presente invenção também se refere a uma sequência de nucleotídeo de vírus recombinante do sarampo que compreende um replicon que compreende (i) uma sequência de cDNA codificadora do RNA positivo antigenômico de comprimento total de vírus do sarampo operacionalmente ligado a (ii) uma sequência de controle de expressão e (iii) uma sequência de DNA heteróloga que codifica uma sequência de aminoácidos heteróloga determinada, em que a mencionada sequência de DNA heteróloga é clonada no mencionado replicon em condições que permitem a sua expressão e em condições que não interferem na transcrição e replicação da mencionada sequência de cDNA, em que o mencionado replicon contém uma quantidade total de nucleotídeos que é múltiplo de seis.
[051] Uma sequência de cDNA específica é a sequência do cDNA da linhagem Schwarz ilustrada na Figura 11. Esse cDNA pode ser obtido a partir de pTM-MVSchw.
[052] O pTM-MVSchw é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém a sequência completa do vírus do sarampo, linhagem de vacina de Schwarz, sob o controle do promotor da RNA polimerase T7. O seu tamanho é 18.967 nt.
[053] A presente invenção também se refere a um vetor de vírus recombinante do sarampo que compreende a sequência de nucleotídeos de vírus recombinante do sarampo definida acima.
[054] A “regra de seis” é expressa no fato de que a quantidade total de nucleotídeos presentes no cDNA recombinante resultante da recombinação da sequência de cDNA derivada da transcrição reversa do RNA antigênico de vírus do sarampo e a sequência de DNA heterólogo representam por fim uma quantidade total de nucleotídeos que é um múltiplo de seis, uma regra que permite replicação eficiente de RNA genômico do vírus do sarampo.
[055] Um vetor de vírus recombinante do sarampo preferido de acordo com a definição acima é tal que o vetor de vírus DNA heterólogo em que a sequência de DNA heteróloga é clonada em uma Unidade de Transcrição Adicional (ATU) inserida no cDNA correspondente ao RNA antigenômico de vírus do sarampo.
[056] A unidade de transcrição adicional (ATU) é descrita na Figura 2A; ela pode ser modificada desde que permita, por fim, que o replicon obtido no vetor cumpra com a regra de seis.
[057] A localização da ATU dentro do cDNA derivado do RNA antigenômico do vírus do sarampo pode variar ao longo do mencionado cDNA. Está, entretanto, localizado em um sítio tal que se beneficiará do gradiente de expressão do vírus do sarampo.
[058] Este gradiente corresponde à abundância de mRNA de acordo com a posição do gene em relação à extremidade 3’ do molde. Consequentemente, quando a polimerase opera sobre o molde (tanto RNA genômico e antigenômico ou cDNAs correspondentes), ela sintetiza mais RNA fabricado a partir de genes a montante que de genes downstream. Este gradiente de abundância de mRNA é, entretanto, relativamente suave para vírus do sarampo. Portanto, a ATU ou qualquer sítio de inserção apropriado para clonagem da sequência de DNA heteróloga pode ser espalhada ao longo do cDNA, com uma realização preferida para um sítio de inserção e, especialmente, em uma ATU presente na porção N-terminal da sequência e especialmente dentro da região a montante ao gene L do vírus do sarampo e vantajosamente a montante ao gene M do mencionado vírus e, de maior preferência, a montante ao gene N do mencionado vírus.
[059] Dependendo do sítio de expressão e do controle de expressão do DNA heterólogo, o vetor de acordo com a presente invenção permite a expressão da sequência de aminoácidos heterólogos em forma de uma proteína de fusão com uma das proteínas de vírus do sarampo.
[060] Alternativamente, o sítio de inserção da sequência de DNA no cDNA do vírus do sarampo pode ser selecionado de tal forma que o DNA heterólogo expresse a sequência de aminoácidos heterólogos de forma que não seja uma proteína de fusão com uma das proteínas do vírus do sarampo.
[061] O vetor de vírus recombinante do sarampo de acordo com qualquer uma das definições preferidas contém vantajosamente uma sequência de DNA heteróloga codificadora de uma sequência de aminoácidos retrovirais e flavivirais.
[062] Esta sequência de aminoácidos é derivada, por exemplo, de um antígeno de um retrovírus selecionado a partir de retrovírus de HIV ou flavivírus, especialmente o vírus da Febre Amarela ou o vírus do Oeste do Nilo.
[063] Em uma realização específica da presente invenção, a sequência de aminoácidos heterólogos codificada pelo vetor de vírus recombinante do sarampo é derivada de um antígeno de envelope de um retrovírus de HIV, especialmente de HIV-1.
[064] Em uma realização preferida, esta sequência de aminoácidos codificada pela sequência de DNA heteróloga é selecionada a partir do gp160, gp120 ou gp41 de HIV-1 ou do gp140 de HIV-1, ou uma versão mutada dos mencionados antígenos.
[065] Como um resultado que é esperado através da expressão do vetor de vírus recombinante do sarampo de acordo com a presente invenção é o desencadeamento de uma resposta imunológica, especialmente uma resposta imunológica celular e/ou humoral, contra a sequência de aminoácidos heterólogos codificada pelo vetor, prefere-se que a sequência de DNA heteróloga utilizada seja uma que codifique um antígeno ou um antígeno que sofreu mutação, que permita a exposição de epítopos neutralizantes sobre o produto de expressão produzido pelo mencionado vetor.
[066] Em uma realização particular, a sequência de aminoácidos heterólogos expressa pode expor epítopos que não são acessíveis ou não são formados no antígeno nativo a partir do qual deriva-se a sequência de aminoácidos heterólogos.
[067] Em uma realização preferida da presente invenção, a sequência de DNA heteróloga codifica gp160ΔV3, gp160ΔV1V2, gp160ΔV1V2V3, gp140ΔV3, gp140ΔV1V2, gp140ΔV1V2V3.
[068] As sequências de aminoácidos heterólogos encontram-se especialmente descritas na Figura 1 e podem ser preparadas de acordo com métodos bem conhecidos, a partir de sequências de antígenos ou sequências de DNA correspondentes dos mencionados antígenos obtidos a partir de vários isolados de HIV-1.
[069] De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o vetor de vírus recombinante do sarampo é projetado de tal forma que as partículas produzidas em células auxiliares transfectadas ou transformadas com o mencionado vetor que contém o DNA codificador do RNA positivo antigenômico de comprimento total de vírus do sarampo, originado de uma linhagem de vírus do sarampo adaptada para vacinação, permitem a produção de partículas virais para uso em composições imunogênicas, de preferência, composições protetoras ou até vacinas.
[070] Dentre as linhagens de vírus do sarampo adaptadas para vacinação, pode-se mencionar a linhagem Edmonston B e a linhagem Schwarz, sendo que esta última é preferida e distribuída pela Aventis Pasteur (Lyon, França) como uma linhagem de vacinação aprovada de vírus do sarampo.
[071] As sequências de nucleotídeos da linhagem Edmonston B e da linhagem Schwarz foram descritas no documento WO 98/13505.
[072] A fim de preparar o vetor de vírus de sarampo recombinante de acordo com a presente invenção, os inventores projetaram o plasmídeo pTM-MVSchw que contém o cDNA resultante da transcrição reversa do RNA antigênico de vírus do sarampo e uma sequência de controle de expressão adaptada que inclui um promotor e um terminador para a polimerase T7.
[073] O vetor de vírus recombinante do sarampo de acordo com a presente invenção é, de preferência, um plasmídeo.
[074] Vetores preferidos são os obtidos com a sequência de nucleotídeos da linhagem Edmonston B depositada em 12 de junho de 2002, especialmente: pMV2 (EdB) gp160 [delta] V3HIV89.6P CNCM I-2883 pMV2 (EdB) gp160 HIV89.6P CNCM I-2884 pMV2 (EdB) gp140 HIV89.6P CNCM I-2885 pMV3 (EdB) gp140 [delta] V3HIV89.6P CNCM I-2886 pMV2 (EdB)-NS1YFV17D CNCM I-2887 pMV2 (EdB)-EnvYFV17D CNCM I-2888
[075] Outros vetores preferidos são os obtidos com a sequência de nucleotídeos da linhagem Schwarz, depositada na CNCM em 26 de maio de 2003 e pTM-MVSchw2-gfp depositado em 12 de junho de 2002 sob n° I-2890 (CNCM): pTM-MVSchw2-Es (WNV) CNCM I-3033 pTM-MVSchw2-GFPbis CNCM I-3034 pTM-MVSchw2-p17p24 [delta] myr (HIVB) CNCM I-3035 pTM-MVSchw3-Tat (HIV89-6p) CNCM I-3036 pTM-MVSchw3-GFP CNCM I-3037 pTM-MVSchw2-Es (YFV) CNCM I-3038 e os vetores depositados na CNCM em 19 de junho de 2003: pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V1 V2 V3 (HIV89-6) CNCM I- 3054 pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V3 (HIV89-6) CNCM I- 3055 pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 V3 (HIV89-6) CNCM I- 3056 pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 (HIV89-6) CNCM I- 3057 pTM-MVSchw2-Gag SIV239 p17-p24 [delta] myr-3-gp140 (HIV89-6) CNCM I-3058
[076] O I-2883 (pMV2 (EdB) gp160 [delta] V3HIV89.6P) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém a sequência completa do vírus do sarampo (linhagem Edmonston B), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que contém o gene do gp160ΔV3 + ELDKWAS da linhagem 89.6P de vírus SVIH inserida em uma ATU na posição 2 (entre os genes N e P do vírus do sarampo). O tamanho do plasmídeo é de 21.264 nt.
[077] O I-2884 (pMV2 (EdB) gp160HIV89.6P) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém a sequência completa do vírus do sarampo (linhagem Edmonston B), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que contém o gene do gp160 da linhagem 89.6P de vírus SVIH inserida em uma ATU na posição 2 (entre os genes N e P do vírus do sarampo). O tamanho do plasmídeo é de 21.658 nt.
[078] O I-2885 (pMV2 (EdB) gp140HIV89.6P) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém a sequência completa do vírus do sarampo (linhagem Edmonston B), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que contém o gene do gp140 da linhagem 89.6P de vírus SVIH inserida em uma ATU na posição 2 (entre os genes N e P do vírus do sarampo). O tamanho do plasmídeo é de 21.094 nt.
[079] O I-2886 (pMV3 (EdB) gp140 [delta] V3HIV89.6P) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém a sequência completa do vírus do sarampo (linhagem Edmonston B), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que contém o gene do gp140ΔV3 (ELDKWAS) da linhagem 89.6P de vírus SVIH inserida em uma ATU na posição 2 (entre os genes N e P do vírus do sarampo). O tamanho do plasmídeo é de 21.058 nt.
[080] O I-2887 (pMV2 (EdB)-NS1YFV17D) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém a sequência completa do vírus do sarampo (linhagem Edmonston B), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que contém o gene NS1 do vírus da Febre Amarela (YFV 17D) inserido em uma ATU na posição 2 (entre os genes N e P do vírus do sarampo). O tamanho do plasmídeo é de 20.163 nt.
[081] O I-2888 (pMV2 (EdB)-EnvYFV17D) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém a sequência completa do vírus do sarampo (linhagem Edmonston B), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que contém o gene Env do vírus da Febre Amarela (YFV 17D) inserido em uma ATU na posição 2 (entre os genes N e P do vírus do sarampo). O tamanho do plasmídeo é de 20.505 nt.
[082] O I-3033 (pTM-MVSchw2-Es (WNV)) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém uma sequência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus do sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que expressa o gene do envelope secretado (E) do vírus do Oeste do Nilo (WNV) inserido em uma ATU.
[083] O I-3034 (pTM-MVSchw2-GFPbis) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém uma sequência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus do sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que expressa o gene do GFP inserido em uma ATU.
[084] O I-3035 (pTM-MVSchw2-p17p24 [delta] myr (HIVB)) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém uma sequência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus do sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que expressa o gene do gene gag codificador de proteínas p17p24Δmyr do vírus HIVB inserido em uma ATU.
[085] O I-3036 (pTMVSchw3-Tat (HIV89-6p)) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém uma sequência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus do sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que expressa o gene do gene Tat da linhagem de vírus 89.6P inserida em uma ATU.
[086] O I-3037 (pTM-MVSchw3-GFP) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém uma sequência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus do sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que expressa o gene do gene GFP inserido em uma ATU que contém uma deleção de um nucleotídeo.
[087] O I-3038 (pTM-MVSchw2-Es) (YFV) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém uma sequência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus do sarampo (linhagem Schwarz) sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que expressa o gene da proteína secretada do vírus da Febre Amarela (YFV) inserido em uma ATU.
[088] O I-3054 (pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V1 V2 V3 (HIV89- 6)) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém uma sequência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus do sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que expressa o gene codificador de gp140 [delta] V1 V2 (HIV 89-6) inserido em uma ATU.
[089] O I-3055 (pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V3 (HIV89-6)) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém uma sequência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus do sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que expressa o gene codificador de gp14 [delta] V3 (HIV 89-6) inserido em uma ATU.
[090] O I-3056 (pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 V3 (HIV89- 6)) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém uma sequência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus do sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que expressa o gene codificador de gp160 [delta] V1 V2 V3 (HIV 89-6) inserido em uma ATU.
[091] O I-3057 (pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 (HIV89-6)) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém uma sequência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus do sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que expressa o gene codificador de gp160 [delta] V1 V2 (HIV 89-6) inserido em uma ATU.
[092] O I-3058 (pTM-MVSchw2-Gag SIV239 p17-p24 [delta] myr- 3-gp140 (HIV89-6)) é um plasmídeo derivado de Bluescript que contém uma sequência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus do sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e que expressa o gene codificador de Gag SIV239 p17-p24 [delta] myr-3-gp140 (HIV 89-6) inserido em uma ATU.
[093] Em uma realização específica da presente invenção, o replicon contido no vetor de vírus recombinante do sarampo é projetado de acordo com o mapa da Figura 2, no qual “inserto” representa a sequência de DNA heteróloga.
[094] Quando a sequência de DNA heteróloga presente no vetor de vírus recombinante do sarampo de acordo com a presente invenção for derivada do Vírus da Febre Amarela (YFV), ela é vantajosamente selecionada a partir de YFV 17D 204 comercializado pela Aventis Pasteur com a marca comercial Stamaril®.
[095] Quando a sequência de DNA heteróloga presente no vetor de vírus recombinante do sarampo de acordo com a presente invenção for derivada do Vírus do Oeste do Nilo (WNV), ela é vantajosamente selecionada a partir da linhagem neurovirulenta IS 98-ST1.
[096] A presente invenção também se refere a um sistema de resgate para a reunião de vírus recombinante do sarampo que expressa uma sequência de aminoácidos heterólogos, que compreende uma célula auxiliar determinada recombinada com pelo menos um vetor apropriado para a expressão de RNA polimerase T7 e expressão das proteínas N, P e L do vírus do sarampo transfectadas com um vetor de vírus recombinante do sarampo de acordo com qualquer uma das definições fornecidas acima.
[097] Os vírus recombinantes de acordo com a presente invenção ou o VLP podem também ser produzidos in vivo por uma vacina viva atenuada tal como MV.
[098] Os vírus recombinantes de acordo com a presente invenção ou o VLP podem ser utilizados em composições imunogênicas ou em composições de vacina, para a proteção contra vírus de RNA, em que os antígenos são expressos no vírus recombinante ou no VLP, conforme descrito acima e ilustrado nos exemplos a seguir.
[099] A presente invenção fornece especialmente composições imunogênicas ou composições de vacina úteis contra vírus HIV, vírus do Oeste do Nilo ou vírus da Febre Amarela.
[0100] A presente invenção também se refere ao uso dos vírus recombinantes descritos ou do VLP, ou dos vetores recombinantes, para a preparação de composições imunogênicas ou para a preparação de composições de vacina.
[0101] A presente invenção também se refere a anticorpos preparados contra os mencionados vírus recombinantes ou contra o mencionado VLP, especialmente a anticorpos protetores e anticorpos neutralizadores. Os anticorpos podem ser anticorpos policlonais ou anticorpos monoclonais.
[0102] Os vírus recombinantes de acordo com a presente invenção ou o VLP podem ser associados a qualquer adjuvante ou veículo apropriado que possa ser útil para a preparação de composições imunogênicas.
[0103] Vários aspectos da presente invenção surgirão nos exemplos que se seguem e nos desenhos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0104] Figura 1: Construções de glicoproteína HIV1 Env. (A) construções gp160 de comprimento total e mutantes ΔV3-AAELDKWASAA, ΔV1V2 e ΔV1V2V3 (de cima para baixo). São indicados os sítios de restrição BbsI e MfeI utilizados para a introdução da deleção de ΔV3 nas outras construções. (B) As construções gp140 são idênticas a gp160, exceto pelo fato de que regiões intracitoplasmáticas e transmembranosas do gp41 foram deletadas.
[0105] Figura 2A: Mapa esquemático do plasmídeo pTM-MVSchw. Para construir a sequência completa, os seis fragmentos representados na parte superior foram gerados e recombinados passo a passo utilizando os sítios de restrição exclusivos indicados. T7 = promotor T7; hh = ribozima de cabeça de martelo; hΔv = ribozima da hepatite delta (=δ); T7t = terminador de RNA polimerase T7.
[0106] Figura 2B: Vetores pMV positivos com ATU que contêm um gene de proteína fluorescente verde (GFP) na posição 2 e na posição 3. Os genes MV são indicados: N (nucleoproteína), PVC (fosfoproteína e proteínas V C), M (matriz), F (fusão), H (hemaglutinina), L (polimerase). T7: promotor de RNA polimerase T7; T7t: terminador de RNA polimerase T7; δ: ribozima do vírus da hepatite delta (HDV); ATU: unidade de transcrição adicional.
[0107] Figura 2C: Sequência ATU: as letras minúsculas representam sequências adicionais (cópia da região intergênica N-P do vírus do sarampo) mais sítios de clonagem. As letras maiúsculas correspondem à sequência GFP amplificada inserida. Esta sequência é inserida no sítio SpeI (posição 3373) da sequência de cDNA da linhagem Schwarz do vírus do sarampo para ATU2 e no sítio SpeI (posição 9174) para ATU3. A mutação que diferencia ATU normal de bis (em pTM-MVSchw2-gfp e pTM-MVSchw2- GFPbis) é um C substituído (maiúsculo) no final da ATU.
[0108] Figura 3 (A): Demonstra que a expressão de ENVHIV89.6 era similar para as passagens 2 e 5, o que confirma a estabilidade da expressão de transgenes neste sistema.
[0109] Figura 3 (B): Construção de vírus do sarampo Schwarz (MVSchw) que expressam antígenos HIV-1 (I-3054 a I-3058). Expressão de antígenos de HIV em pTM-MVSchw recombinante.
[0110] Figura 3BA: Expressão de glicoproteínas do envelope de HIV-1 em pTM-MVSchw recombinante. Células Vero foram infectadas com os diferentes vírus recombinantes por 48H e a expressão de HIV Env foi determinada através de Western Blot. Foram separados 30 μg de cada lisado celular em 4 a 12% SDS-PAGE, distribuidos sobre membranas de nitrocelulose e sondadas com um anticorpo gp120 anti-HIV monoclonal de camundongo (Chessie, NIH). Conjugado RPO anti-IgG de camundongo foi utilizado como segundo anticorpo e as proteínas foram detectadas através do uso de um kit de detecção ECL.
[0111] Fig. 3BB: (1) Construção de pTM-MVSchw2-Gag-3gp140 recombinante duplo. Foram construídos alguns vetores recombinantes que expressam dois antígenos heterólogos diferentes. Eles foram obtidos através da ligação de dois plasmídeos pTM-MVSchw recombinantes diferentes que contêm insertos diferentes na posição 2 e na posição 3. É exibido o plasmídeo pTM-MVSchw2-Gag3-gp140. A partir deste plasmídeo, foi resgatado um vírus recombinante que expressou as proteínas Gag e gp140 (Fig. 3B (2) Western Blot). Utilizando construções apropriadas dos diferentes genes heterólogos inseridos, esse MV recombinante que expressa duas proteínas virais heterólogas pode produzir “partículas similares a vírus” (VLP) reunidas em células infectadas e secretadas: Gag-Env de retrovírus ou prM/E de flavivírus. Esses VLPs são bons imunogenes. Produzidos in vivo por uma vacina viva atenuada como MV, eles deverão ser ainda mais imunogênicos.
[0112] (2) Expressão de gp140 de HIV-1 e SIV239 Gag em pTM- MVSchw2-GagSIV (p17-p24 [delta] myr)-3-gp140HIV recombinante. Foram detectados gp140 de HIV e SIV Gag em lisados de células Vero infectadas. (A) gp120 anti-HIV monoclonal de camundongo e (B) soro de macaco infectado com SIVmac251.
[0113] Figura 3C: Expressão de Gag de HIV-1 (p17-p24 Δmyr) em pTM-MVSchw2-GagHIV (p17-p24 [delta] myr) recombinante. Foram detectados HIV Gag em lisados de células Vero infectadas com um anticorpo anti-Gag de HIV monoclonal de camundongo.
[0114] Figura 3D: Expressão de proteína Tat de HIV-1 em pTM- MVSchw recombinante. Células Vero foram infectadas com vírus MVSchw-Tat HIV recombinante ou MVSchw de controle por 48H e a expressão de Tat de HIV foi determinada através de Western Blot. Foram separados 30 μg de cada lisado celular sobre 4 a 12% SDS-PAGE, distribuidos sobre membranas de nitrocelulose e sondados com anticorpo anti-Tat de HIV monoclonal de camundongo (BH10, NIH). Conjugado RPO anti-IgG de camundongo foi utilizado como segundo anticorpo e as proteínas foram detectadas utilizando um kit de detecção ECL.
[0115] Figura 4: Cinética de crescimento de vírus MVEdB-EnvHIV recombinante sobre células Vero. Células sobre placas de 35 mm foram infectadas com vírus recombinantes em diferentes MOI (conforme indicado). Em cada momento, células foram coletadas e títulos de vírus associados a células foram determinados utilizando o método TCID50 em células Vero. (A) Infecções com MV EdB-tag e diferentes vírus recombinantes MV-HIV em MOI = 0,0001. (B) Infecções com MV2-gp160HIV em dois MOI diferentes (0,0001 e 0,01).
[0116] Figura 5: Respostas imunológicas humorais anti-HIV e anti- MV em camundongos inoculados com vírus MVEdB-EnvHIV recombinantes: A-B quatro grupos de três camundongos foram imunizados com 107 TCID50 de cada vírus MV-HIV recombinante. Os títulos de anticorpos contra MV (A) e HIV Env (B) foram determinados através de ELISA em soro coletado 28 dias após a inoculação. C-F: Títulos de anticorpo anti-HIV e anti-MV em camundongos IFNAR-/-/CD46+/- imunizados com vírus MV-EnvHIV. (C) Títulos anti-MV e anti- HIV detectados 28 dias após a injeção de doses crescentes de MVEdB-gp160 (3 camundongos por grupo). (D) Títulos anti-MV (barras pretas), anti-HIV (barras cinza) e anti-ELDKWAS (barras brancas) detectados 28 dias após a injeção de 5 106 TCID50 de vírus MV-EnvHIV (6 camundongos por grupo). Os resultados são expressos na forma de valores médios ± desvio padrão.
[0117] Figura 6: Atividades de neutralização contra Bx08 de soro de camundongos imunizados com vírus MV2-gp140HIV89,6 e MV2-gp160HIV89,6. O isolado primário Bx08 foi fornecido por C. Moog (Estrasburgo, França) e propagado uma vez sobre PBMC estimulado por PHA para obter estoques virais. Foram incubados 2 ng de vírus por 30 minutos a 37°C com 25 μl de cada soro de camundongo (coletado 1 mês após a infecção) antes da infecção de células P4R5 em uma placa com 96 cavidades. As células foram cultivadas em seguida em DMEM contendo 10% de soro fetal de bezerro até 2 dias após a infecção, quando foi medida a atividade de β-galactosidase com um ensaio de quimioluminescência (Roche, Alemanha). Linha 1: soro de um camundongo imunizado MVEdB-Tag; linha 2: soro de um camundongo imunizado MV2- gp140HIV-1; linha 3: soro de um camundongo imunizado com MV2-gp160HIV-1; linha 4: células não-infectadas. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
[0118] Figura 7: Candidato a vacina Edm-HIV Env estimula linfócitos env-específicos in vivo. Dois grupos de três camundongos foram inoculados com 107 TCID50 de vírus MV2-gp160HIV e sacrificados 7 dias e em um mês após a inoculação. (A) Ensaios ELISpot realizados com esplenócitos de camundongos imunizados. Estímulo com proteína purificada HIV-gp120 (preto) ou BSA irrelevante (branco). (B) Esplenócitos coletados 7 dias após a imunização foram estimulados com meio isolado (quadro esquerdo), HIV-gp120 (quadro central) ou vírus EdB-tag (quadro direito). Citofluorometria de 3 cores detectou linfócitos CD8+ (quadro superior) e CD4+ (quadro inferior) que produzem y-IFN após estímulos de HIV gp120 e vírus do sarampo. Os percentuais são fornecidos de acordo com o total de portais de linfócito CD8+ (quadro superior) e CD4+ (quadro inferior), respectivamente.
[0119] Fig. 7C, D: Títulos de anticorpos anti-MV e anti-HIV em camundongos e macacos imunizados com vírus MV2-gp140HIV89.6 meses após sensibilização (priming) por MV. (C) Camundongos (3 por grupo) foram vacinados com 105 TCID50 de MV EdB-tag e inoculados em seguida duas vezes com 5x106 TCID50 de vírus MV2-gp140HIV89,6 conforme indicado (setas). (D) Macacos cynomolgus (n° 432 e 404) foram vacinados com Rouvax e inoculados em seguida por duas vezes com 5x106 TCID50 de vírus MV2- gp140HIV89,6 conforme indicado (setas).
[0120] Figura 8: Representação esquemática da unidade de transcrição adicional (ATU) e plasmídeo de vetor de MV Schwarz. (A) Elementos com ação cis da ATU inserida na posição 2 entre as estruturas de leitura aberta de MV fosfoproteína (P) e matriz (M). (B) Representação das três posições da inserção de ATU no plasmídeo de vetor de MV Schwarz.
[0121] Figura 9: Expressão de proteínas YFV por MV recombinante. Células Vero foram infectadas por MV EdB-EnvYFV e Edb- NS1 YFV recombinante em um MOI de 0,01. Realizou-se imunofluorescência utilizando um soro anti-YFV policlonal de camundongo e um anticorpo anti-IgG de camundongo secundário Cy3. Todo o sincício observado em células Vero infectadas foi positivo.
[0122] Figura 10: Desafio YFV. Seis camundongos com 4 semanas de idade foram inoculados com uma mistura de vírus EdB-EnvYFV e EdB-NS1YFV (107 TCID50) e seis camundongos de controle foram inoculados com a mesma dose de vírus EdB-tag padrão. Após 1 mês, as sorologias anti- MV foram determinadas e um nível similar de anticorpos foi observado nos dois grupos. Os camundongos foram infectados e a mortalidade foi observada.
[0123] Figura 11: Sequência de nucleotídeos completa do plasmídeo pTM-MVSchw (CNCM I-2889). A sequência pode ser descrita conforme segue com referência à posição dos nucleotídeos: - 1-8 sítio de restrição NotI; - 9-28 promotor T7; - 29-82 ribozima de cabeça de martelo; - 83-15976 antigenoma Schwarz MV; - 15977-16202 ribozima HDV e terminador T7; - 16203-16210 sítio de restrição NotI; reiv.10 - 16211-16216 sítio de restrição ApaI; - 16220-16226 sítio de restrição KpnI; e - 16226-18967 plasmídeo pBluescript KS positivo (Stratagene).
[0124] Figura 12: As sequências flavirais que foram expressas em MV são as seguintes:
[0125] Figura 12A: YFV Env seq: esta é a sequência Env YFV 17D204 clonada pelos inventores. Pos. 1 a 3 códon de início. Pos. 4 a 51 peptídeo de sinal Env. Pos. 52 a 1455 sequência Env. Pos. 1456 a 1458 códon de parada. Os códons de início e de parada foram adicionados.
[0126] Figura 12B: YFV NS1 seq: esta é a sequência NS1 YFV 17D204 clonada pelos inventores. Pos. 1 a 3 códon de início. Pos. 4 a 78 peptídeo de sinal NS1. Pos. 79 a 1110 sequência NS1. Pos. 1111 a 1113 códon de parada. Os códons de início e de parada foram adicionados.
[0127] Figura 12C: seq WNV Env: esta é a sequência Env WNV clonada pelos inventores. Pos. 1 a 3 códon de início. Pos. 4 a 51 peptídeo de sinal env. Pos. 52 a 1485 sequência Env. Pos. 1486 a 1488 códon de parada. Os códons de início e de parada foram adicionados.
[0128] Figura 12D: seq WNV NS1: esta é a sequência NS1 WNV clonada pelos inventores. Pos. 1 a 3 códon de início. Pos. 4 a 78 peptídeo de sinal NS1. Pos. 79 a 1104 sequência NS1. Pos. 1105 a 1107 códon de parada. Pos. 1108 a 1110 códon de parada (é adicionado um Segundo para respeitar a regra de seis).
[0129] Os códons de início e de parada foram adicionados.
[0130] Figura 13: Representação esquemática de pTM-MVSchw- sEWNV recombinante. Os genes MV são indicados: N (nucleoproteína), PVC (fosfoproteína e proteínas V, C), M (matriz), F (fusão), H (hemaglutinina), L (polimerase). T7: promotor de RNA polimerase T7; T7t: terminador de RNA polimerase T7; δ: ribozima do vírus da hepatite delta (HDV); ATU: unidade de transcrição adicional.
[0131] Após o resgate, o vírus recombinante foi cultivado sobre monocamadas de células Vero. O procedimento utilizado para preparar o vírus recombinante foi similar aos procedimentos padrão empregados para preparar as vacinas de sarampo vivas atenuadas, exceto pela liofilização, que não foi utilizada.
[0132] A expressão de WNV sE em células Vero infectadas pelo vírus MV-WN sE foi verificada através do uso de ensaio de imunofluorescência indireta, conforme exibido na Figura 14.
[0133] Figura 14: Expressão de proteína sE a partir de WNV em sincício induzido por MV. Detecção de imunofluorescência de proteína WNV Env (sE) secretada em sincício induzida por MV-WN sE recombinante em células Vero. (A, B) Proteína sE detectada na superfície externa em torno de todo o sincício induzido por MV recombinante. (C, D) proteína sE intracelular em sincício induzido por MV recombinante.
[0134] Figura 15: Sorologia anti-MV um mês após a primeira injeção.
[0135] Figura 16: Sequências imunogênicas de HIV-1 preparadas para inserção em plasmídeo pTM-MVSchw2 ilustrado no Exemplo II.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 VÍRUS RECOMBINANTE DO SARAMPO QUE EXPRESSA A GLICOPROTEÍNA NATIVA DE ENVELOPE DEHIV1 CLADO B OU ENVELOPES COM ALÇAS ( LOOPS)VARIÁVEIS DELETADAS INDUZEM RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS CELULARES E HUMORAIS
[0136] A preparação de vacina contra HIV com sua capacidade formidável de evasão das respostas imunológicas do hospedeiro é certamente uma tarefa assustadora. Entretanto, o que aprendemos sobre a imunopatogênese da infecção e os resultados já obtidos com modelos animais indica que pode ser possível (Mascola, J. R. e G. J. Nabel, 2001, Vaccines for Prevention of HIV-1 Disease, Immunology, 13: 489-495). Idealmente, uma imunização preventiva deverá induzir (1) anticorpos que neutralizem isolados primários, de forma a evitar a entrada em células hospedeiras e (2) CTL que eliminem as células que, ainda assim, foram infectadas. Os anticorpos e CTL deverão ser dirigidos a epítopos conservados que são críticos para entrada viral e replicação em células hospedeiras.
[0137] Vários estudos, particularmente com várias possíveis vacinas, demonstram que uma boa resposta imunológica celular poderá ser capaz de controlar a carga viral, embora sem eliminar o agente (Mascola, J. R. e G. J. Nabel, 2001, Vaccines for Prevention of HIV-1 Disease, Immunology, 13: 489-495). Por outro lado, as respostas imunológicas humorais induzidas até agora por vacinas subunitárias foram desapontadoras, principalmente porque os anticorpos induzidos não neutralizaram isolados primários de HIV. Vacinas recombinantes que expressam o SIV Env, por exemplo, foram capazes de proteger macacos contra uma indução homóloga, mas não heteróloga (Hu, S. et al., 1996, Recombinant Subunit Vaccines as an Approach to Study Correlates of Protection Against Primate Lentivirus Infection, Immunology Letters, 51: 115-119). Imunização de DNA combinada com amplificação com gp recombinante solúvel poderá proteger macacos contra uma indução heteróloga, mas somente contra uma linhagem de SIV geneticamente relacionada à vacina (Boyer, J. et al., 1997, Protection of Chimpanzees from High-Dose Heterologous HIV-1 Challenge by DNA Vaccination, Nature Medicine, 3: 526-532). Mais recentemente, vários regimes de “amplificação pimária” (prime-boost), utilizando combinações de DNA bruto e vetores virais tais como MVA (Amara, R. et al., 2001, Control of a Mucosal Challenge and Prevention of AIDS by a Multiprotein DNA/MVA Vaccine, Science 292: 69-74) ou adenovírus (Shiver, J. W. et al., 2002, Replication-Incompetent Adenoviral Vaccine Vector Elicits Effective Anti-Immunodeficiency-Virus Immunity, Nature, 415: 331-335) geraram proteção razoável contra SHIV89.6P patogênico fixo. “Amplificação pimária” poderá não ser uma necessidade absoluta, visto o uso de macacos protegidos com vacina de vírus da pólio vivo atenuado recombinante contra um SIV251 fixo (Crotty, S. et al., 2001, Protection against Simian Immunodeficiency Virus Vaginal Challenge by Using Sabin Poliovirus Vectors, J. Virol. 75: 7435-7452). É interessante observar que, em todos estes experimentos, mesmo quando os animais não foram protegidos contra a infecção, a imunização causou um atraso na doença clínica ou até a liquidou.
[0138] Conforme exibido através de cristalografia, as alças (loops) V1 e V2 de gp120 mascaram o sítio de ligação de CD4 e a alça (loop) V3 mascara os sítios de ligação para os correceptores CXCR4 e CCR5 (Kwong, P. D. et al., 2000, Structures of HIV-1 gp120 Envelope Glycoproteins from Laboratory Adapted and Primary Isolates, Structure Fold Des. 8: 1329-1339; Kwong, P. D. et al., 1998, Structure of an HIV gp120 Envelope Glycoprotein in Complex with the CD4 Receptor and a Neutralizing Human Antibody, Nature, 393: 648-659; Kwong, P. D. et al., 2000, Oligomeric Modeling and Electrostatic Analysis of the gp120 Envelope Glycoprotein of Human Immunodeficiency Virus, J. Virol. 74: 1961-1972). Em vez disso, os anticorpos contra o sítio de ligação de CD4 gp120 estão presentes no soro de indivíduos HIV soropositivos e são capazes de neutralizar vários isolados de HIV-1 em ensaios in vitro (Burton, D., 1997, A Vaccine for HIV Type 1: the Antibody Perspective, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 94: 10018-10023; Hoffman, T. L. et al., 1999, Stable Exposure of the Coreceptor-Binding Site in a CD4-Independent HIV-1 Envelope Protein, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96: 6359-6364). Além disso, alguns epítopos que são imersos (buried) na estrutura 3-D da glicoproteína mas tornam-se expostos após ligação ao correceptor podem induzir anticorpos altamente neutralizadores (Muster, T. et al., 1993, A Conserved Neutralizing Epitope on gp41 of Human Immunodeficiency Virus Type 1, J. Virol. 67: 6642-6647). Além disso, anticorpos monoclonais neutralizadores foram obtidos a partir de células B de pacientes (Parren, P. W. et al., 1997, Relevance of the Antibody Response Against Human Immunodeficiency Virus Type 1 Envelope to Vaccine Design, Immunol. Lett. 57: 105-112). Eles são dirigidos a epítopos lineares gp41 (2F5) (Muster, T. F. et al., 1993, A Conserved Neutralizing Epitope on gp41 of Human Immunodeficiency Virus Type 1, J. Virol. 67: 6642-6647) ou em epítopos de conformação gp120 (2G12, 17b, 48db12) (Thali, M. et al., 1993, Characterization of Conserved Human Immunodeficiency Virus Type 1 gp 120 Neutralization Epitopes Exposed upon gp120-CD4 Binding, J. Virol. 67: 3978- 3988; Trkola, A. et al., 1996, Human Monoclonal Antibody 2G12 Defines a Distinctive Neutralization Epitope on the gp120 Glycoprotein of Human Immunodeficiency Virus Type 1, J. Virol. 70: 1100-1108). Utilizados em sinergia, eles podem neutralizar in vitrovários isolados primários (Mascola, J. R. et al., 1997, Potent and Synergistic Neutralization of Human Immunodeficiency Virus (HIV) Type 1 Primary Isolates by Hyperimmune anti- HIV Immunoglobulin Combined with Monoclonal Antibodies 2F5 and 2G12, J. Virol. 71: 7198-7206) e proteger macacos contra SHIV fixo via mucosa (Baba, T. W. et al., 2000, Human Neutralizing Monoclonal Antibodies of the IgG1 Subtype Protect Against Mucosal Simian-Human Immunodeficiency Virus Infection, Nat. Med. 6: 200-206; Mascola, J. R. et al., 1999, Protection of Macaques against Pathogenic Simian/Human Immunodeficiency Virus 89.6PD by Passive Transfer of Neutralizing Antibodies, J. Virol. 73: 4009-4018; Mascola, J. R. et al., 2000, Protection of Macaques against Vaginal Transmission of a Pathogenic HIV-1/SIV Chimeric Virus by Passive Infusion of Neutralizing Antibodies, Nat. Med. 6: 207-210). Entretanto, em pessoas infectadas, todos estes anticorpos estão presentes em quantidades muito pequenas, diluídos em grandes quantidades de anticorpos não neutralizadores dirigidos principalmente para alças (loops) gp120 V1, V2 e V3 antigenicamente variáveis. Existe esperança, portanto, que, caso se pudesse induzir altos níveis desses anticorpos neutralizadores cruzados, pode-se atingir pelo menos algum grau de proteção. É objetivo principal projetar um vetor que favoreça a produção desses anticorpos neutralizadores.
[0139] Por esta razão, elaboramos gp160 (ancorado) e gp140 (solúvel) mutantes através da deleção das alças (loops) V1, V2 e V3 hipervariáveis individualmente ou em combinação para expor epítopos conservados e induzir anticorpos capazes de neutralizar isolados primários. Em algumas das construções, também se substituiu a alça (loop) V3 pela sequência AAELDKWASAA, especialmente sequência ELDKWAS flanqueadas em ambos os lados por duas alaninas para manter a conformação deste epítopo conservado por gp41 normalmente imerso na proteína nativa, mas capaz de induzir anticorpos neutralizadores de amplo espectro (Muster, T. F. et al., 1993, A Conserved Neutralizing Epitope on gp41 of Human Immunodeficiency Virus Type 1, J. Virol. 67: 6642-6647; Binley, J. M. et al., 2000, A Recombinant Human Immunodeficiency Virus Type 1 Envelope Glycoprotein Complex Stabilized by an Intermolecular Disulfide Bond between the gp120 and gp41 Subunits is an Antigenic Mimic of the Trimeric Virion- Associated Structure, J. Virol. 74: 627-643; Sanders, R. W. et al., 2000, Variable Loop-Deleted Variants of the Human Immunodeficiency Virus Type 1 Envelope Glycoprotein can be Stabilized by an Intermolecular Disulfide Bond between the gp120 and gp41 Subunits, J. Virol. 74: 5091-5100). A estrutura alfa helicoidal normal deste peptídeo deverá ser conservada quando exposta em nossas construções na extremidade de uma alça (loop) V3 deletada. Estas construções, nas quais os “chamarizes imunológicos” foram eliminados e os epítopos neutralizadores foram expostos, deverão ser boas candidatas para a indução de respostas de anticorpos neutralizadores robustos.
[0140] As construções de HIV gp foram introduzidas em um vetor de vacina contra sarampo porque induzem títulos muito altos (1/80.000) de anticorpos neutralizadores anti-sarampo (isso provavelmente se deve ao fato de replicar-se em uma grande quantidade de células de diferentes tipos). Pode- se esperar, portanto, que a resposta dos anticorpos contra o HIV gps elaborado também seja forte. Além disso, a vacina contra o sarampo também é um potente indutor de respostas celulares de longa duração. As vacinas recombinantes induziram anticorpos neutralizadores cruzados, bem como respostas imunológicas celulares após uma única injeção em camundongos CD46+/- IFN-α/β_R-/-. Além disso, elas induziram respostas imunológicas contra HIV em camundongos e macacos com imunidade anti-MV pré-existente.
CONSTRUÇÃO DE GLICOPROTEÍNAS DO ENVELOPE DE HIV-1 MUTANTE
[0141] As glicoproteínas do envelope utilizadas neste estudo (Figura 1) foram derivadas de SHIV89.6P, um vírus da imunodeficiência humana/símia quimérico que contém genes tat, rev, vpu e env de HIV1 em um ambiente SIVmac239 (Reimann, K. A. et al., 1996, A Chimeric Simian/Human Immunodeficiency Virus Expressing a Primary Patient Human Immunodeficiency Virus Type 1 Isolate Env Causes an AIDS-like Disease after in Vivo Passage in Rhesus Monkeys, J. Virol. 70: 6922-6928). O gene env é derivado de um isolado de HIV1 primário citopático, 89.6, que é trópico para ambos, macrófagos e células T (Collman, R. et al., 1992, An Infectious Molecular Clone of an Unusual Macrophage-Tropic and Highly Cytopathic Strain of Human Immunodeficiency Virus Type 1, J. Virol. 66: 7517-7521). A sequência env foi amplificada a partir do plasmídeo pSHIV-KB9 (NIH) que foi clonado anteriormente após passagens in vivo do vírus original (Karlsson, G. B. et al., 1997, Characterization of Molecularly Cloned Simian-Human Immunodeficiency Viruses Causing Rapid CD4+ Lymphocyte Depletion in Rhesus Monkeys, J. Virol. 71: 4218-4225). O env de comprimento total (gp160) foi amplificado através de PCR (Pfu polimerase) utilizando primers que contêm sítios BsiWI e BssHII exclusivos para clonagem subsequente em vetor de sarampo: 160E5 (5’-TATCGTACGATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3‘) e 160E3 (5’ATAGCGCGCATCACAAGAGAGTGAGCTCAA-3‘). A sequência env correspondente à forma secretada (gp140) foi amplificada utilizando os primers 160E5 e 140E3 (5’-TATGCGCGCTTATCTTATATACCACAGCCAGT-3‘). Um códon de início e de parada foram adicionados às duas extremidades dos genes, bem como vários nucleotídeos após o códon de parada, a fim de respeitar a “regra de seis”, estipulando que a quantidade de nucleotídeos do genoma MV deve ser múltiplo de seis (Calain, P. e L. Roux, 1993, The Rule of Six, a Basic Feature for Efficient Replication of Sendai Virus Defective Interfering RNA, J. Virol. 67: 4822-4830; Schneider, H. et al., 1997. Recombinant Measles Viruses Defective for RNA Editing and V Protein Synthesis are Viable in Cultured Cells, Virology, 227: 314-322). Tanto fragmentos env gp160 quanto gp140 foram clonados em plasmídeo pCR2.1- TOPO (Invitrogen) e sequenciados para verificar que nenhuma mutação foi introduzida.
[0142] Mutantes com deleções de alças (loops) foram gerados através da amplificação por PCR de dois fragmentos sobrepostos que flanqueiam a sequência a ser deletada e hibridação destes fragmentos através de PCR. Para substituir a sequência V3 pela sequência AAELDKWASAA que contém o epítopo gp41 (Muster, T., F. et al., 1993, A Conserved Neutralizing Epitope on gp41 of Human Immunodeficiency Virus Type 1, J. Virol. 67: 6642- 6647), 4 primers foram projetados em ambos os lados dos sítios BbsI e MfeI que englobam a sequência V3: ΔV3A1 (5‘- ATAAGACATTCAATGGATCAGGAC-3’), ΔV3A2 (5’- TGCCCATTTATCCAATTCTGCAGCATTGTTGTTGGGTCTTGTACAATT-3’), ΔV3B1 (5’- GATAAATGGGCAAGTGCTGCAAGACAAGCACATTGTAACATTGT-3’) e ΔV3B2 (5’-CTACTCCTATTGGTTCAATTCTTA-3’). As sequências sublinhadas em ΔV3A2 e ΔV3B1 correspondem ao epítopo AAELDKWASAA com sobreposição de 12 nucleotídeos. Amplificações por PCR com os pares de primers ΔV3A1/ΔV3A2 e ΔV3B1/ΔV3B2 produziram dois fragmentos de 218 e 499 pb, respectivamente. Após purificação em gel, estes fragmentos foram hibridizados entre si através de 15 ciclos de PCR sem primers e amplificados com primers ΔV3A1/ΔV3B2. O fragmento de 705 pb resultante foi clonado em um plasmídeo pCR2.1-TOPO e sequenciado. Após a digestão por BbsI e MfeI, o fragmento que não contém a sequência codificadora da alça (loop) V3 (ΔV3- AAELDKWASAA) foi purificado e introduzido no lugar do fragmento correspondente no gp160 e gp140 em plasmídeos pCR2.1-TOPO.
[0143] Os plasmídeos resultantes foram denominados pMV2- gp160ΔV3 e pMV2-gp140ΔV3.
[0144] Os mutantes ΔV1V2 foram produzidos utilizando o mesmo procedimento. Dois fragmentos foram amplificados em ambos os lados da alça (loop) V1V2, utilizando os primers a seguir: 160E5 (5’- TATCGTACGATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3’), ΔV1V2A1 (5’- ATTTAAAGTAACACAGAGTGGGGTTAATTT-3’), ΔV1V2B1 (5’- GTTACTTTAAATTGTAACACCTCAGTCATTACACAGGCCTGT-3’), ΔV1V2B2 (5’-TTGCATAAAATGCTCTCCCTGGTCCTATAG-3’). As sequências sublinhadas em ΔV1V2A1 e ΔV1V2B1 correspondem à sobreposição de 12 nucleotídeos gerada entre os dois fragmentos. Amplificações de PCR com pares de primers 160E5/ΔV1V2A1 e ΔV1V2B1/ΔV1V2B2 produziram dois fragmentos de 400 e 366 pb, respectivamente. Após purificação em gel, estes fragmentos foram combinados entre si através de 15 ciclos de PCR sem primers e amplificados com primers 160E5/ΔV1V2B2. O fragmento de 766 pb resultante foi clonado em um plasmídeo pCR2.1-TOPO e sequenciado. Após digestão com BsiWI (em primer 160E5) e BbsI, o fragmento que não contém a sequência codificadora da alça (loop) V1V2 foi purificado e introduzido no lugar do fragmento correspondente no gp160 e gp140 em plasmídeos pCR2.1- TOPO.
[0145] Para obter os mutantes ΔV1V2V3, o fragmento de BsiWI/BbsI que não contêm a sequência codificadora da alça (loop) V1V2 foi introduzido no lugar do fragmento correspondente nos plasmídeos pCR2.1- TOPO-gp140ΔV3 e pCR2.1-TOPO-gp160ΔV3.
[0146] Após a digestão de BsiWI/BssHII dos diferentes plasmídeos pCR2.1-TOPO, as sequências gp160 e gp140 nativas e mutantes foram clonadas no vetor EdB-tag em posição ATU 2 e posição ATU 3 (Figura 2B). Os plasmídeos resultantes foram denominados pMV2-gp160HIV e pMV2- gp140HIV.
[0147] As células foram mantidas em meio de Eagle modificado da Dubelbecco (DMEM) suplementado com soro fetal de bezerro a 5% (FCS) para células Vero (rim de macaco verde africano) ou com 10% FCS, 1 mg/ml de G418 para células 293-3-46 auxiliares (35) e para células P4-CCR5 (Hela- CD4-CXCR4-CCR5-HIVLTR-LacZ) (12).
RECUPERAÇÃO DE VÍRUSMVEdB-ENVHiv89,6 RECOMBINANTE
[0148] Para recuperar os vírus MVEdB-HIV recombinante dos plasmídeos, os diferentes plasmídeos EdB-HIV Env foram utilizados para transfectar células auxiliares 293-3-46.
[0149] Para recuperar o vírus do sarampo do cDNA de plasmídeos EdB-HIV-Env, utilizamos o sistema de resgate com base em células auxiliares descrito por Radecke et al., (Radecke, F. et al., 1995, Rescue of Measles Viruses from Cloned DNA, EMBO Journal, 14: 5773-5784) e modificado por Parks et al., (Parks, C. L. et al., 1999, Enhanced Measles Virus cDNA Rescue and Gene Expression after Heat Shock, J. Virol. 73: 3560-3566). Células auxiliares humanas que expressam de forma estável RNA polimerase T7 e proteínas N e P de sarampo (células 293-3-46, descritas por Radecke et al.) foram cotransfectadas utilizando o procedimento de fosfato de cálcio com os plasmídeos EdB-HIV-Env (5 μg) e um plasmídeo que expressa o gene L de MV polimerase (pEMC-La, 20 ng, descrito por Radecke et al.). O vírus foi resgatado após o cocultivo de células auxiliares 293-3-46 transfectadas a 37°C com células Vero de primatas (rim de macaco verde africano). Neste caso, sincício apareceu sistematicamente em todas as transfecções após 2 dias de cocultivo.
[0150] Em um experimento adicional (Figs. 3C-D), após incubação por uma noite a 37°C, as células sofreram choque térmico a 43°C por 3 horas em meio novo (40). Células submetidas a choque térmico foram incubadas a 37°C por 2 dias, transferidas em seguida para uma camada de células Vero confluentes a 70% (placas Petri de 10 cm). Sincício apareceu em células Vero após 2 a 5 dias de cocultivo. Sincícios isolados foram colhidos e transferidos para células Vero cultivadas em cavidades de 35 mm. As células infectadas foram expandidas em cavidades de 75 e 150 cm3. Quando sincício atingiu confluência de 80 a 90%, as células foram raspadas em um pequeno volume de OptiMEM (Gibco BRL), congeladas e descongeladas por uma vez. Após centrifugação, o sobrenadante, que continha vírus foi armazenado a -80°C.
EXPRESSÃO DE GLICOPROTEÍNAS DEHIV1 PORMV RECOMBINANTE
[0151] Os vírus recombinantes resgatados MV2-gp140, MV2- gp160, MV3-gp140ΔV3 e MV2-gp160ΔV3 foram propagados sobre células Vero e a expressão de glicoproteínas Env de HIV foi analisada através de Western Blot e imunofluorescência. A infecção de células Vero por vírus MV2 recombinantes (com inserção de transgene na posição 2) exibiu uma alta expressão do Env de HIV gp160 e gp140. A proteína Env recombinante clivada (gp120) também foi detectada. O vírus MV3 (com inserção de transgene na posição 3) expressou níveis mais baixos de transgene, conforme esperado devido ao gradiente de transcrição observado em expressão de MV. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que glicoproteína Env HIV-1 e mutante ΔV3 são expressos eficientemente pelos MVs recombinantes.
[0152] Titulação de vírus. Os títulos de MV recombinante foram determinados através de um ensaio de diluição de limite de ponto final (endpoint limit dilution essay) sobre células Vero. Dose infecciosa de cultivo de tecidos de 50% (TCID50) foi calculada utilizando o método de Karber.
CAPACIDADE DE CRESCIMENTO DOS VÍRUS RECOMBINANTES MVEdB-ENVHiv89,6
[0153] Para analisar a capacidade de crescimento de vírus MVEdB- EnvHIV89,6, células Vero foram infectadas em diferentes MOI (0,01 e 0,0001), incubadas a 37°C e coletadas em momentos diferentes. Títulos de vírus associados a células foram determinados para cada amostra utilizando o método TCID50 sobre células Vero. A Figura 4 demonstra que, utilizando MOI de 0,0001, a cinética de crescimento de vírus MVEdB-EnvHIV89,6 foi atrasada, em comparação com MVEdB-tag padrão. Entretanto, utilizando um MOI de 0,01, a produção de vírus recombinantes foi comparável à de vírus padrão e picos de títulos de 107 TCID50/ml ou até mais foram facilmente obtidos.
[0154] Particularmente, monocamadas de células Vero (frascos T- 25) foram infectadas em um MOI de 0,05 com os vírus recombinantes. Quando sincício atingiu 80 a 90% de confluência, as células foram lisadas em 150 mM de NaCl, 50 mM de Tris, pH = 8, NP40 a 1%, 0,5 mM de PMSF e 0,2 mg/ml de Pefabloc (Interbiotech, França). Cromatina foi removida através de centrifugação e a concentração de proteína no sobrenadante foi determinada com um ensaio de Bradford. Proteínas (50 μg) foram fracionadas através de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) e transferidas para membranas de celulose (Amersham Pharmacia Biotech). As manchas foram sondadas com anticorpo gp120 anti-HIV monoclonal de camundongo (Chessie 13-39.1, NIH-AIDS Research & Reference Reagent Program) ou com um anticorpo N anti-MV monoclonal (Chemicon, Temecula, Estados Unidos). Um conjugado de peroxidase de rabanete selvagem (HRP) e anticorpo anti-IgG de camundongo (Amersham) foi utilizado como segundo anticorpo. A atividade de peroxidase foi visualizada com um kit de detecção de quimioluminescência aprimorado (Pierce).
IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS
[0155] Camundongos suscetíveis à infecção por MV foram obtidos conforme descrito anteriormente (21). Camundongos FVB transgênicos heterozigotos para CD46 (32), o receptor para linhagens de vacinas MV (24), foram cruzados com camundongos 129sv IFN-α/βR-/’ que não contêm o receptor de interferon do tipo I (22). A progênie F1 foi analizada através de PCR e os animais CD46+/- foram novamente cruzados com camundongos 129sv IFN-α/βR’/’. Animais IFN-α/βR’/’ CD46+/- foram selecionados e utilizados para experimentos de imunização. O mesmo tipo de camundongos já demonstrou ser suscetível a infecções por MV (20, 21).
[0156] Fêmeas de camundongos CD46+/-IFN-α/βR’/’ com 6 semanas de idade foram inoculadas por via intraperitoneal com 107 TCID50 de vírus recombinantes MV2-gp140, MV2-gp160, MV3-gp140ΔV3 ou MV2- gp160ΔV3 preparados e titulados conforme descrito acima. Os camundongos foram sacrificados 7 dias e 1 mês após a infecção. Foram coletados o baço e sangue integral. Esplenócitos foram extraídos dos baços e mantidos congelados em nitrogênio líquido até o uso. Os soros foram decantados e a sorologia foi analisada através de ELISA para determinar MV (Trinity Biotech, Estados Unidos) e HIV (Sanofi Diagnostics, França).
IMUNIZAÇÃO DE MACACOS
[0157] Dois macacos rhesus criados em colônia (Macaca mulatto) (soronegativos para retrovírus D do tipo símio, vírus linfotrópico de células T de símios, vírus da imunodeficiência dos símios e MV) foram vacinados por via subcutânea com 104 TCID50 de vacina MV (Rouvax, Aventis Pasteur, França). Eles foram reforçados um ano mais tarde por duas injeções de 5 106 TCID50 de vírus recombinante MV2-gp140 em intervalo de 1 mês. Amostras de sangue foram coletadas em diferentes momentos e anticorpos anti-MV e anti-HIV foram pesquisados.
RESPOSTA IMUNOLÓGICA HUMORAL A VÍRUS RECOMBINANTES RESGATADOS PRIMEIRO EXPERIMENTO
[0158] Respostas imunológicas humorais contra MV e HIV Env foram analisadas através de ELISA em soros coletados um mês após a imunização de camundongos. Os títulos foram determinados através da limitação de diluições. Os resultados apresentados na Figura 5 demonstram que todos os camundongos vacinados responderam ao sarampo com altos títulos de anticorpos (1/50.000 a 1/80.000) e a HIV Env com títulos de 1/1.000 a 1/5.000, dependendo da sequência inserida. Os títulos de anticorpos entre MV e HIV não podem ser comparados porque o ELISA utilizado não possui a mesma sensibilidade. O MV ELISA (Trinity Biotech, Estados Unidos) detectou a resposta completa contra todas as proteínas MV, enquanto que o HIV ELISA (Sanofi Diagnostics) detectou apenas os anticorpos anti-HIV Env. A capacidade desses soros de neutralizar um isolado de clado B de HIV primário foi testada utilizando células indicadoras, P4R5, que expressam β-galactosidase quando infectadas por HIV (células HeLa-CD4-CXCR4-CCR5-HIV LTR-LacZ). Em experimentos preliminares, testamos soros de camundongos imunizados com vírus MV-HIV recombinantes que expressam glicoproteínas de envelope nativas (MV-gp160HIV-1 ou MVEdB-gp140HIV89.6). Os resultados demonstraram que estes soros possuíam atividade neutralizadora de 70 a 50% contra um isolado primário, Bx08, quando utilizados em diluição 1/20 (Figura 6). A atividade neutralizadora dos soros levantada contra as moléculas Env elaboradas geneticamente atualmente encontra-se em estudo.
SEGUNDO EXPERIMENTO
[0159] Em outro experimento (Fig. 5C-F), soros foram coletados 1 mês após a imunização e desativados por calor. Anticorpos anti-MV (Trinity Biotech, Estados Unidos) e anti-HIV Env (Sanofi Diagnostic Pasteur, Biorad, França) foram detectados utilizando kits ELISA comerciais. Um conjugado de HRP e anticorpo anticamundongo (Amersham) foi utilizado como anticorpo secundário. Os títulos foram determinados através de limitação das diluições e calculados como a diluição mais alta de soro, gerando duas vezes a absorbância de diluição 1/100 de uma mistura de soros controle. Os mesmos kits ELISA foram utilizados para soros de macacos. Um anticorpo secundário anti-IgG de macaco foi utilizado para detectar anticorpos anti-HIV. Anticorpos anti-MV foram detectados com anti-IgG humano, a fim de calibrar o ensaio com padrões fornecidos no kit MV ELISA. Eles foram expressos em mlU/ml. Uma mistura de cinco amostras de macacos negativos foi utilizada como controle negativo. O título de anticorpos anti-ELDKAS foi determinado através de ELISA utilizando placas NeutrAvidin de 96 cavidades (Pierce) revestidas com o peptídeo biotinilado ELDKWAS (Neosystem, 5 μg/ml em NaHCO3 a 2M, Na2CO3.H2O a 2M, pH 9,6). Soros de camundongos imunizados com MV padrão foram utilizados como controles negativos. Anticorpos ligados a peptídeos foram detectados com conjugado de HRP e anticorpo anticamundongo.
[0160] Ensaios de neutralização de HIV-1: soroneutralização foi testada contra SHIV89.6p (A. M. Aubertin, Université Louis Pasteur, Estrasburgo, H. Fleury, Bordeaux, França), 92US660, 92US714, 92HT593 (NIH-AIDS Research & Reference Reagent Program) e um isolado primário de clado A: 3253 (G. Pancino, Instituto Pasteur, Paris, França). Estes vírus foram propagados sobre PBMC humanas estimuladas por PHA conforme já descrito (42). Os ensaios de neutralização de HIV-1 foram realizados utilizando a linhagem de células indicadoras P4-CCR5 (43). As células P4-CCR5 foram semeadas em placas com 96 cavidades (20.000 células por cavidade) e incubadas a 37°C em DMEM, 10% FCS por 24 horas. O meio foi substituído por 100 μl de DMEM, 10% FCS, DEAE dextran (100 μg/ml) e as células foram incubadas a 37°C por 30 minutos. O vírus (0,5 ir 1 ng p24) foi incubado com diluições sorológicas em 50 μl de PBS a 37°C por 20 minutos e as misturas de vírus e soro foram adicionadas às células em triplicata. Após 48 horas de incubação, a atividade de β-galactosidase foi medida utilizando o Ensaio de Gene Repórter de Quimioluminescência (Roche, Estados Unidos).
RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS CELULARES A VÍRUS RECOMBINANTES RESGATADOS
[0161] A capacidade de esplenócitos de camundongos vacinados de secretar a-IFN mediante estímulo in vitrofoi testada através de citometria de fluxo e ensaios ELISpot. Células congeladas de camundongos imunizados foram descongeladas 18 horas antes dos ensaios funcionais e incubadas em meio RPMI suplementado com FCS aquecido a 56°C a 10% (Gibco) e 10 U de rh-IL2 (Boehringer Mannheim). A viabilidade celular foi avaliada através de exclusão de azul de tripano.
[0162] Para realizar ensaio ELISpot de y-IFN, placas com 96 cavidades multitelas-HA foram revestidas com anti-y-IFN de camundongo capturado (R4-6A2, Pharmingen) em solução de PBS (6 μg/ml). Após incubação por uma noite a 4°C, as cavidades foram lavadas por quatro vezes com PBS. Os sítios de ligação de proteínas remanescentes foram bloqueados através da incubação de cavidades com 100 μl de RPMI/FCS a 10% por 1 hora a 37°C. O meio foi retirado pouco antes da adição de suspensões celulares (100 μl) e agentes estimulantes (100 μl). Esplenócitos de camundongos imunizados foram colocados em placas a 5 x 105 células por cavidade em duplicata em RPMI. Concanavalin A (5 μg/ml, Sigma) foi utilizada como controle positivo e RPMI/IL2 (10 U/ml) como controle negativo. As células foram estimuladas com 1 μg/ml de HIV1 gp120, 1 μg/ml de Albumina de Soro Bovino (Sigma) ou vírus Edm-Tag (MOI = 1). Após incubação por 2 horas a 37°C para adsorção viral, FCS aquecido (10 μl) foi adicionado em cada cavidade (concentração final de 10%) e as placas foram incubadas por 24 a 36 horas a 37°C. Para remover as células, as placas foram lavadas duas vezes com PBS, quatro vezes com PBS contendo Tween 20 a 0,05% (Sigma) e novamente duas vezes com PBS. Para detecção, um anticorpo anti-y-IFN de camundongo biotinilado (XMG1.2, Pharmingen) foi adicionado a cada cavidade (100 μl, 4 μg/ml em PBS-0,1% FCS). Após incubação por 2 horas à temperatura ambiente, as placas foram lavadas quatro vezes com PBS-Tween 20 a 0,1% e duas vezes com PBS. Conjugado de fosfatase alcalina e estreptavidina (AP) (Roche) (100 μl, diluição 1/2.000 em PBS) foi adicionado e incubado por 1 a 2 horas à temperatura ambiente. A enzima foi removida através de quatro lavagens com PBS- Tween 20 a 0,1% e duas lavagens com PBS. As manchas foram desenvolvidas em seguida com substrato de coloração BCIP/NBT (Promega) preparado em tampão de AP sob pH 9,5 (1M de Tris, 1,5 M de NaCl, 0,05 M de MgCl2). As cavidades foram monitoradas visualmente para determinar a formação de manchas: após 15 a 30 minutos de incubação, a reação foi suspensa através de lavagem em água corrente da torneira. Após secagem por pelo menos uma noite à temperatura ambiente, manchas coloridas foram contadas utilizando um sistema de análise de imagens automatizada ELISpot Reader (Bio-Sys).
[0163] Para ensaios de citometria de fluxo, 5 x 105 esplenócitos (diluídos em 100 μl de RPMI) foram estimulados em placas com 96 cavidades com fundo em V com 1 μg/ml de proteína gp120 de HIV-1 (AbCys) em RPMI/IL- 2 (10 U/ml) ou vírus EdB-tag (MOI = 1) diluído em 100 μl de RPMI/IL-2. Células controle não-estimuladas foram incubadas com RPMI/IL-2 (10 U/ml). Após incubação por 2 horas a 37°C para adsorção viral, 10 μl de FCS foram adicionados em cada cavidade (concentração final de 10%) e as placas foram incubadas por uma noite a 37°C . O meio foi substituído em seguida por 150 μl de RPMI-10% FCS contendo 10 U rh-IL2 e 10 μg/ml de Brefeldin A (Sigma). As células foram incubadas por 4 horas a 37°C , coletadas, marcadas com anti- CD8-APC de camundongo (Pharmingen) e anti-CD4-CyCr de camundongo (Pharmingen) por 20 minutos à temperatura ambiente, lavadas com PBS-BSA (0,5%) e fixadas em seguida por 5 minutos a 37°C em CytoFix (Pharmingen). Após a lavagem, as células foram novamente suspensas em 100 μl de PBS- BSA (0,5%) contendo 0,1% de saponina (Sigma) e incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente com anti-y-IFN-PE de camundongo (Pharmingen). As células foram novamente lavadas e as amostras foram analisadas utilizando um citômetro FACSCalibur (Becton Dickinson). Os dados foram analisados utilizando o software Cell Quest.
MV RECOMBINANTE EXPRESSA GLICOPROTEÍNAS HIV89.6 ENV E REPLICA-SE EFICIENTEMENTE
[0164] As formas ancorada (gp160) e solúvel (gp140) da glicoproteína Env de HIV (linhagem SHIV89.6p), com ou sem exclusão da alça (loop) V3 e inserção de um epítopo ELDKWAS adicional, foram inseridas em uma das ATU do vetor p positivo MV (Fig. 2). Os vírus recombinantes MV2- gp140, MV2-gp160, MV3-gp140ΔV3 e MV2-gp160ΔV3 foram obtidos após transfecção dos plasmídeos na linhagem de células auxiliares 293-3-46 e propagação em células Vero. MV2 e MV3 referem-se ao sítio da inserção, posição 2 ou 3, respectivamente, da construção de EnvHIV89.6. A expressão da proteína EnvHIV89.6 foi analisada através de Western Blot de lisados de células infectadas (Fig. 3) e imunofluorescência (não exibida). Os vírus MV2- gp140 e MV-2gp160 exibiram um alto nível de expressão da proteína EnvHIV89.6 (Fig. 3C, linhas 1, 2 e 4). Conforme esperado, os vírus MV2- gp160Δ expressaram o precursor env gp160, bem como a proteína gp120 clivada (Fig. 3C, linhas 2 e 4). Por outro lado, os vírus MV2-gp140 e MV3- gp140ΔV3 expressaram apenas a forma gp140 secretada e não-clivada. O vírus MV3-gp140ΔV3 expressou níveis levemente mais baixos de transgene que os vírus da série MV2, conforme esperado, devido ao gradiente de transcrição observado na expressão de MV (Fig. 3C, linha 3). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que EnvHiv89,6 e os mutantes ΔV3 foram expressos eficientemente e amadurecidos corretamente. Os MVs recombinantes foram passados cinco vezes sobre células Vero e a expressão do transgene foi comparada com a da nucleoproteína de MV. A Figura 3 demonstra que a expressão de EnvHIV89,6 foi similar para as passagens 2 e 5, o que confirma a estabilidade da expressão de transgenes neste sistema.
[0165] O crescimento de vírus recombinantes de MV-EnvHIV89,6 foi analisado sobre células Vero utilizando um MOI de 0,0001 ou 0,01. O crescimento de vírus recombinantes foi apenas levemente atrasado em comparação ao do MV de EdB-tag padrão resgatado de p+ (MV). Os vírus que expressam o gp140 secretado foram menos afetados que os vírus que expressam o gp160 ancorado. O gp140ΔV3 recombinante cresceu à mesma velocidade do MV controle. O atraso observado com vírus que expressa o gp160 ancorado pode dever-se à velocidade de replicação mais baixa, devido ao tamanho maior do transgene ou ao reduzido desenvolvimento (budding) de MV devido à inserção de gp160 na superfície das células infectadas. Entretanto, o rendimento final de vírus recombinantes foi comparável com o de MV controle e picos de título de cerca de 106 a 107 TCID50/ml foram obtidos rotineiramente.
INDUÇÃO DE RESPOSTA IMUNOLÓGICA HUMORAL A MV RECOMBINANTE EM CAMUNDONGOS SUSCETÍVEIS
[0166] A imunogenicidade de vírus MV-EnvHIV89,6 foi testada em camundongos geneticamente modificados que expressam o receptor de MV CD46 humano e não contém o receptor de IFN Tipo I. Doses crescentes de vírus MV2-gp160 (130-107 TCID50) foram testadas em cinco grupos de três camundongos. Os anticorpos para MV e Env de HIV foram pesquisados através de ELISA em soro coletado um mês após a imunização (Fig. 5C). Tanto os títulos de anticorpo anti-MV quanto anti-HIV aumentaram quando a dose de MV recombinante aumentou. Como altos títulos anti-MV foram obtidos quando os animais foram inoculados com 106 a 107 TCID50, os camundongos foram imunizados com 5 x 106 TCID50 em todos os experimentos adicionais. Nesta dosagem, os títulos de anticorpo anti-MV foram seis vezes mais altos que os títulos anti-HIV. Deve-se ter em mente que a imunização foi realizada somente contra Env de HIV, enquanto todas as proteínas MV foram expressas durante a infecção. Para comparar a imunogenicidade das diferentes construções de EnvHIV, quatro grupos de seis camundongos foram inoculados por via intraperitoneal com vários vírus MV-EnvHIV89,6 (Fig. 5B, 5E). Todos os camundongos reagiram a MV (título anti-MV médio: 5 104) e a Env de HIV (título anti-HIV médio: 8 103). Nenhuma diferença em títulos anti-MV ou anti- HIV foi observada entre as quatro construções testadas. De forma interessante, a expressão da posição ATU 2 ou da posição ATU 3 do vetor MV não afetou a resposta do anticorpo. Como as construções ΔV3 expressaram um epítopo ELDKWAS adicional, a resposta de anticorpo contra este epítopo gp41 foi examinada separadamente, utilizando ensaio ELISA específico (Fig. 5F). Os resultados demonstraram que as construções de ΔV3-ELDKWAS induziram títulos mais altos de anticorpos anti-ELDKWAS. O título de 1/50.000 corresponde à diluição de um soro imune capaz de reconhecer o antígeno administrado para a imunização em ensaio ELISA.
VÍRUS MV-ENVHIV89,6 INDUZEM ANTICORPOS ANTI-HIV NEUTRALIZADORES
[0167] A capacidade destes soros de neutralizar tanto vírus SHIV89.6p homólogo quanto vários isolados de HIV-1 primários heterólogos foi testada utilizando um ensaio de infectividade por vírus de ciclo único sobre células indicadoras P4-CCR5 (43). As células P4-CCR5 expressam os receptores de HIV-1 CCR5, CXCR4 e CD4 e foram transfectadas de forma estável com um LTR LacZ de HIV. Portanto, elas são suscetíveis a isolados de HIV-1 e expressam β-galactosidase mediante infecção. O ensaio de neutralização sorológica foi validado utilizando uma combinação de imunoglobulina anti-HIV (HIVIG) e anticorpos monoclonais (2F5 e 2G12) que se demonstrou anteriormente neutralizarem sinergicamente isolados de HIV primários (17). Também se utilizaram soros de pacientes infectados que neutralizam isolados de HIV primários (17). Também se empregaram soros de pacientes infectados que neutraliza isolados primários de HIV utilizando ensaio de neutralização padrão sobre PBMCs humanas (42). A atividade neutralizadora de um soro (Tabela 1) é expressa na forma de razão entre a redução da infecção obtida com este soro sobre a redução obtida com soro controle negativo utilizado na mesma diluição (soro de indivíduos HIV negativos e de pacientes infectados com vírus de clado B e A neutralizados apresentam resultados igualmente bons neste ensaio).
[0168] Conforme exibido na Tabela 1, os anticorpos induzidos em camundongos pelos quatro vírus MV-EnvHIV89,6 neutralizaram o SHIV89.6p homólogo nas duas diluições testadas (1/30 e 1/60). Nenhuma diferença significativa foi observada entre os soros obtidos com as diferentes construções Env, o que indica que a forma secretada e ancorada da glicoproteína de HIV induziu anticorpos neutralizadores contra vírus homólogos igualmente bem quando expressa por MV. A deleção da alça (loop) V3, conhecida por conter epítopos neutralizadores específicos de tipos, não apresentou efeito significativo sobre a indução de anticorpos que neutralizaram o vírus homólogo. Isso sugere que a deleção pode ter sido compensada pela adição de um segundo epítopo neutralizador ELDKWAS gp41 ou pela descoberta de outros epítopos neutralizadores.
[0169] Os anticorpos induzidos pelos vírus recombinantes neutralizaram isolados de clado B primários heterólogos, exceto pelo isolado 93HT593, bem como vírus de clado A. Em cada um dos casos, anticorpos induzidos pelo gp160 ancorado foram levemente mais neutralizadores que anticorpos induzidos pelo gp140 secretado, especialmente contra o vírus 3253 de clado A. Os anticorpos induzidos pelo ΔV3-ELDKWAS EnvHiv89,6 neutralizaram vírus heterólogos mais eficientemente que os induzidos pelo envelope nativo. Isso foi particularmente notável para o vírus Bx08, que pôde ser neutralizado até 90% por soro de camundongos imunizados com MV2- gp160ΔV3 (diluição 1/30), mas não por soro de camundongos imunizados com MV que expressam o EnvHIV89,6 nativo. Esta neutralização foi tão eficiente quanto a neutralização por soro controle positivo. Estes resultados demonstram que a substituição da alça (loop) V3 de EnvHIV89,6 por um epítopo ELDKWAS gp41 adicional e que expressa a construção com um vetor de MV permitiu a indução de anticorpos com atividade neutralizadora cruzada contra isolados primários de HIV-1 de clado A e B, pelo menos no contexto de infecção de MV recombinante de camundongos. TABELA1 NEUTRALIZAÇÃO DE ISOLADOS HETERÓLOGOS PRIMÁRIOS DE HIV-1 POR SORO DE CAMUNDONGOS IMUNIZADOS POR MV-ENVHiv89,6a
Figure img0001
Figure img0002
a O soro foi avaliado para determinar a neutralização de anticorpos em duas diluições. Os valores são o percentual de redução em infecção de isolados de HIV primários sobre células P4-CCR5 na presença de soro de camundongos (três camundongos por ponto). As determinações foram realizadas em triplicata e os desvios padrão foram de menos de 10%. b Mistura de HIVIG (2,5 mg/ml) e Mabs 2F5 e 2G12 (25 μg/ml). c Os números correspondem à nomenclatura utilizada em Burrer et al.
INDUÇÃO DE RESPOSTA IMUNOLÓGICA CELULAR CONTRA MV RECOMBINANTE
[0170] Os resultados destes experimentos realizados com esplenócitos de camundongos imunizados com vírus MV2-gp160HIV (Figura 7) demonstraram que uma única imunização com vírus MV2-gp160HIV foi capaz de servir de sensibilização para linfócitos específicos de Env de HIV in vivo. O ensaio y-IFN-ELISpot é um método sensível de numeração de células específicas de antígenos em células novas após imunização in vivo. Este ensaio foi utilizado para determinar se células secretoras de y-IFN específicas de HIV-Env poderão ser detectadas após uma única imunização com o vírus MV2-gp160HIV. A Figura 7A demonstra que uma quantidade significativa de células específicas de Env esteve presente em 2/3 dos camundongos testados, 7 dias bem como 1 mês após a imunização (para um camundongo em cada grupo, a quantidade de manchas foi a mesma após estímulo com BSA ou gp120). A quantidade de manchas específicas de HIV detectadas (até 600/106 células) representa de 15 a 20% de manchas específicas de MV detectadas nos mesmos camundongos (não exibidos), o que indica que MV recombinante é capaz de imunizar eficientemente contra o gene exógeno expresso.
[0171] Para determinar o fenótipo destas células específicas de Env, experimentos de citofluorometria tricolor foram realizados sobre camundongos que foram sacrificados 7 dias após a imunização, no pico teórico da proliferação de células efetoras. Um resultado representativo é exibido na Figura 7B. O nível de produção de y-IFN de base para linfócitos CD4+ e CD8+ é exibido no quadro esquerdo. Para este animal, 0,09% de linfócitos CD8+ (média calculada por três camundongos: 0,31%) e 0,25% de linfócitos CD4+ (média: 0,41%) estavam produzindo espontaneamente y-IFN. As frequências de células T de HIV-gp120 (quadro intermediário) nos subconjuntos CD8+ e CD4+ foram de 1,76% (média: 1,69%) e 0,92% (média: 0,76%), respectivamente. É interessante considerar que, no mesmo camundongo imunizado, as frequências de células específicas de sarampo em subconjuntos CD8+ e CD4+ foram 7,63% (média: 7,03%) e 4,11% (média: 3,50%), respectivamente. De fato, o vírus MV2-gp160HIV recombinante expressa 6 proteínas de sarampo mais uma proteína exógena gp160. Desta forma, as frequências de linfócitos específicos de antígenos seguiram as proporções do gene recombinante. Como conclusão, citofluorometria tricolor realizada 7 dias após a vacinação com vírus MV2-gp160HIV demonstrou que tanto linfócitos CD8+ (Fig. 7B, quadro superior) quanto CD4+ (Fig. 7B, quadro inferior) específicos para vírus do sarampo e HIV gp120 foram sensibilizados (primed) in vivo.
INDUÇÃO DE RESPOSTA ANTI-HIV EM ANIMAIS COM IMUNIDADE ANTI-MV PRÉ- EXISTENTE
[0172] Foi testada, em primeiro lugar, a possibilidade de amplificação da resposta anti-HIV por uma segunda injeção de MV recombinante. Camundongos imunizados com 5 x 106 TCID50 de vírus recombinante MV2-gp140 (três camundongos por grupo) foram induzidos com segunda injeção do mesmo MV recombinante em 1 mês após a primeira injeção. Os títulos de anticorpos anti-MV e anti-HIV médios no momento da amplificação foram de 5 x 104 e 8 x 103, respectivamente. Estes títulos aumentaram, respectivamente, para 5 x 105 e 50 x 104 em 1 mês após a amplificação. Portanto, as respostas anti-MV e HIV podem ser amplificadas dez vezes através da injeção da mesma dose de MV recombinante 1 mês após a primeira imunização.
[0173] Foi testada em seguida a capacidade de MV recombinante de induzir anticorpos anti-HIV em camundongos e macacos na presença de imunidade anti-MV pré-existente. Camundongos (três camundongos por ponto) foram imunizados em primeiro lugar com 105 TCID50 de MV EdB-tag (sem inserto de HIV). Altos níveis de anticorpos anti-MV foram induzidos (Fig. 7C). O título caiu levemente após 2 meses e permaneceu estável pelos 9 meses seguintes. Os camundongos foram inoculados em seguida com 5 x 106 TCID50 de MV2-gp140HIV89,6 e amplificados com a mesma dose 1 mês mais tarde. O título de anticorpos anti-MV aumentou cem vezes e foram induzidos altos títulos de anticorpos anti-HIV (5 x 104). Estes títulos foram similares aos obtidos após a imunização de animais nativos com duas injeções.
[0174] O mesmo experimento foi realizado com macacos rhesus (Fig. 7D). Dois macacos foram imunizados com uma dose padrão (104 TCID50) de vacina MV (Rouvax, Aventis Pasteur). Como ocorre com camundongos, altos níveis de anticorpo anti-MV foram induzidos e permaneceram estáveis durante 1 ano. Os macacos foram inoculados em seguida com 5 x 106 TCID50 de MV2-gp140HIV89.6 duas vezes em um intervalo de 1 mês. Os títulos anti-MV aumentaram 150 vezes após a primeira injeção de MV-HIV, enquanto a segunda injeção apresentou pouco ou nenhum efeito. Os anticorpos anti-HIV foram induzidos pela primeira injeção de MV2-gp140HIV89,6 apesar da presença de imunidade anti-MV pré-existente. 1 mês após a segunda injeção de MV2- gp140HIV89,6, o nível de anticorpo anti-HIV havia aumentado em cerca de dez vezes e atingido títulos similares aos obtidos em camundongos. Este nível permaneceu estável pelos 5 meses seguintes.
[0175] O objetivo principal do presente trabalho foi o de testar a imunogenicidade de vírus recombinantes MV-EnvHIV atenuados. Demonstrou- se que esses recombinantes eram geneticamente estáveis, expressaram a proteína Env de HIV em altos níveis e induziram altos títulos de anticorpos contra ambas construções de MV e Env-HIV em camundongos transgênicos. Os títulos de anticorpos anti-HIV foram de cerca de 15 a 20% dos anticorpos anti-MV. Isso corresponde aproximadamente à razão de proteínas HIV/MV expressa pelos vírus recombinantes. Construções de Env-HIV com um alça (loop) V3 deletada e um epítopo ELDKWAS gp41 adicional induziram duas vezes tantos anticorpos anti-ELDKWAS quanto construções nativas, o que sugere que a conformação nativa do peptídeo adicional foi conservada, apesar da sua posição ectópica. Um alto nível de células CD8+ e CD4+ HIV- específicas também foi induzido. Um índice de 1,5 a 2% do total de células T CD8+ e 0,9% do total de células T CD4+ mostraram-se HIV-específicas.
[0176] Entretanto, o aspecto mais importante dos resultados é que ditos anticorpos anti-HIV foram neutralizadores para o vírus SHIV89.6p homólogo, bem como para vários isolados primários de HIV-1 de clado A e clado B heterólogos. De forma interessante, a construção ΔV3-ELDKWAS gp160 ancorada induziu anticorpos que neutralizaram vírus heterólogos mais eficientemente que os induzidos pelo envelope nativo. Os seus títulos neutralizadores foram similares aos de soro neutralizador de HIV humano de referência. A capacidade de neutralização mais ampla destes anticorpos poderá dever-se à adição de um segundo epítopo neutralizador de ELDKWAS gp41 ou à exposição de epítopos neutralizadores conservados anteriormente mascarados. Vários grupos inseriram o epítopo ELDKWAS em várias moléculas imunogênicas (44, 45, 46, 47). Estes estudos demonstraram que o contexto de conformação no qual o epítopo é exibido é essencial para a indução de anticorpos neutralizadores. Demonstrou-se que uma restrição similar à volta-β (β-tum) é a estrutura conformacional mais provável do epítopo ELDKWAS reconhecido pelo anticorpo neutralizador 2F5 (46). Nas construções de acordo com a presente invenção, a inserção do epítopo AAELDKWASAA curto no lugar da alça (loop) V3, que é flanqueado por fitas-β (β-strand) (28, 29), pode possuir essa conformação similar à volta-β.
[0177] Já se demonstrou que a deleção das alças (loops) hipervariáveis de Env-HIV pode aumentar a sua imunogenicidade (3, 48, 39). Entretanto, em estudos anteriores, anticorpos neutralizadores foram obtidos somente após diversas injeções de grandes quantidades de proteína solúvel (23) ou com um regime de “amplificação de sensibilização” (“prime boost”) utilizando quantidades muito grandes de DNA e proteína pura (3, 39). Por outro lado, observamos os mesmos níveis de anticorpos neutralizadores em camundongos injetados com uma única dose de MV-gp160ΔV3-ELDKWAS. Boa imunogenicidade em nosso sistema resulta provavelmente do fato de que o Env de HIV é expresso e processado pelo sistema imunológico da mesma forma que as proteínas da vacina MV viva, um imunogene de alta potência. Pode-se esperar que esses níveis de anticorpos neutralizadores ao menos induzam proteção parcial em indivíduos vacinados. De acordo com os dados de outros (3, 39), poderá ser possível aumentar ainda mais a imunogenicidade de M-HIV Env recombinantes através da deleção das alças (loops) V1 e V2 de HIV gp120, em particular, induzir anticorpos dirigidos contra o sítio de ligação de CD4. Relatou-se recentemente, entretanto, que este sítio de ligação de receptor pode escapar da resposta imunológica através de mascaramento entrópico e de conformação (49).
[0178] A presença de imunidade anti-MV em quase toda a população humana adulta pareceria restringir o uso de MV recombinantes em crianças, objetivo já valioso em qualquer eventualidade. Entretanto, vários estudos demonstram que a revacinação de indivíduos já imunizados resulta em uma amplificação de anticorpos anti-MV, o que sugere que a vacina viva atenuada replica-se e expressa as suas proteínas ao invés de imunidade previamente existente (50). Sob estas circunstâncias, esperam-se vacinar adultos contra um antígeno exógeno com um MV recombinnte. De fato, os resultados da presente invenção demonstram, tanto com camundongos quanto com macacos, que altos níveis de anticorpos neutralizadores anti-HIV podem ser obtidos na presença de imunidade anti-MV pré-existente.
[0179] Vários regimes de “amplificação de sensibilização”, utilizando combinações de DNA bruto e vetores virais tais como sMVA (1) ou adenovírus (29), geraram uma proteção razoável contra SHIV89.6p patogênico fixo. No presente estudo, demonstrou-se que uma única injeção de MV é capaz de combinar respostas humorais e celulares em níveis similares aos induzidos por estas combinações complexas.
[0180] Os mesmos recombinantes foram preparados utilizando a linhagem Schwarz clonada como vetor. Isso deverá elevar ainda mais a sua imunogenicidade.
EXEMPLO 2 CONSTRUÇÃO DE VÍRUS DO SARAMPO SCHWARZ (MVSCHW) QUE EXPRESSAM ANTÍGENOS DE HIV-1
[0181] A fim de testar a sua capacidade como possíveis vacinas contra infecção por HIV, foram construídos diversos vírus do sarampo (MV) de Schwarz recombinantes que expressam antígenos de HIV-1. Diferentes genes de HIV-1 de diferentes estruturas de leitura aberta foram construídos e introduzidos em unidades de transcrição adicionais no cDNA de MV Schwarz que foram clonados anteriormente (pTM-MVSchw). Após o resgate dos diferentes vírus do sarampo Schwarz recombinantes, a expressão das diferentes proteínas de HIV-1 foi analisada através de Western Blot de lisados de células infectadas (Figs. 3A a D).
[0182] Diferentes imunogenes foram construídos a partir de glicoproteína Env de HIV-1 (a seguir, 1 a 8), proteína Gag (a seguir, 9) e proteína Tat (a seguir, 10): 1. Glicoproteína gp140 secretada de HIV-1 89.6p. 2. Glicoproteína gp160 ancorada de HIV-1 89.6p. 3. Glicoproteína gp140 secretada de HIV-1 89.6p deletada da região hipervariável V3 e epítopo AAELDKWASAA adicional (gp140HIV89.6 ΔV3-ELDKWAS). 4. Glicoproteína gp160 ancorada de HIV-1 89.6p deletada da região hipervariável V3 com um epítopo AAELDKWASAA adicional (gp160HIV89.6 ΔV3-ELDKWAS). 5. Glicoproteína secretada gp140 de HIV-1 89.6p deletada das regiões hipervariáveis V1-V2 (gp140HIV89.6 ΔV1V2). 6. Glicoproteína ancorada gp160 de HIV-1 89.6p deletada das regiões hipervariáveis V1-V2 (gp160HIV89.6 ΔV1V2). 7. Glicoproteína secretada gp140 de HIV-1 89.6p deletada das regiões hipervariáveis V1-V2-V3 (gp140HIV89.6 ΔV1V2V3). 8. Glicoproteína ancorada gp160 de HIV-1 89.6p deletada das regiões hipervariáveis V1-V2-V3 (gp160HIV89.6 ΔV1V2V3). 9. Poliproteína Gag (p17p24, delta myr) de HIV-1 (consenso de clado B) truncada da nucleoproteína ORF no C-terminal (p17p24δmyr HIV-1B). 10. Proteína Tat de HIV-1 89.6p (Tat HIV89.6).
[0183] Os genes HIV env que codificam as diferentes formas da proteína Env foram gerados através de amplificação por PCR a partir do plasmídeo pSHIV-KB9 (NIH-AIDS Research & Reference Reagent Program). As sequências específicas foram amplificadas utilizando DNA polimerase PfuTurbo (Stratagene) e primers específicos. Para gerar as diferentes deleções, fragmentos sobrepostos que flanqueiam as sequências a serem deletadas foram gerados e hibridizados entre si através de PCR. Eles foram introduzidos em seguida através de enzimas de restrição de clonagem no lugar do fragmento correspondente nas sequências gp160 e gp140 já clonadas em plasmídeos pCR2.1-TOPO (Fig. 1A). As diferentes sequências geradas incluem um códon de início e de parada nas duas extremidades e respeitam a “regra de seis”, que estipula que a quantidade de nucleotídeos do genoma de MV deve ser divisível por seis (7, 8). Após a digestão de BsiWI/BssHII, as diferentes sequências de HIV foram introduzidas no vetor pTM-MVSchw na posição 2 ou 3 da ATU (Fig. 1B). Foram designados os plasmídeos resultantes: 1. pTM-MVSchw2-gp140HIV. 2. pTM-MVSchw2-gp160HIV. 3. pTM-MVSchw2-gp140ΔV3Hiv. 4. pTM-MVSchw2-gp160ΔV3Hiv. 5. pTM-MVSchw2-gp140HIVΔV1V2. 6. pTM-MVSchw2-gp160HIVΔV1V2. 7. pTM-MVSchw2-gp140HIVΔV1V2V3. 8. pTM-MVSchw2-gp160HIVΔV1V2V3. 9. pTM-MVSchw2-GagHIV (p17-p24 Δmyr). 10. pTM-MVSchw3-TatHIV.
[0184] Foi produzido um vírus recombinante que expressa Gag e gp140 nas duas posições 1 e 2 do vetor de sarampo Schwarz. 11. pTM-MVSchw2-GagSIV239 (p17-p24 Δmyr)-3-gp140HIV.
[0185] Este vírus expressou as duas proteínas (Fig. 3BB). Estas construções permitem a produção de “partículas semelhantes a vírus” Gag-Env reunidas de HIV, SHIV ou SIV em células infectadas por vírus recombinantes do sarampo.
[0186] Foram geradas as sequências imunogênicas de HIV-1 representadas na Figura 16.
EXEMPLO 3 VÍRUS RECOMBINANTES DO SARAMPO QUE EXPRESSAM DIFERENTES TRANSGENES VIRAIS
[0187] A fim de demonstrar as capacidades protetoras e imunológicas de MV como vetor de vacinação pediátrica, uma série de vírus recombinantes do sarampo que expressam diferentes transgenes virais (relacionados abaixo) de outros vírus foi construída e estudada. Os resultados apresentados no presente foram obtidos com o velho vetor EdB-tag. Demonstrou-se, entretanto, que o EdB-tag foi cem vezes menos imunogênico que a vacina Schwarz. Desta forma, vírus recombinantes MVEdB foram inoculados em doses mais altas. Todas as sequências inseridas com bons registros imunológicos podem ser obviamente inseridas no vetor de Schwarz.
[0188] Genes virais que já foram inseridos nos vírus recombinantes do sarampo:
Figure img0003
Figure img0004
EXEMPLO 4 VÍRUS RECOMBINANTE DO SARAMPO QUE EXPRESSA Env E NS1 DO VÍRUS DA FEBRE AMARELA POSSUEM CAPACIDADE IMUNOLÓGICA
[0189] Como uma vacina bivalente pediátrica contra sarampo e febre amarela deverá ser útil, construiu-se MV recombinante que expressa as proteínas Env e NS1 a partir de Vírus da Febre Amarela (YFV 17D204, linhagem de vacina de Pasteur) e testou-se a sua capacidade de proteger camundongos contra YFV letal fixo.
CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEOSMV-YFV RECOMBINANTES
[0190] O gene env foi amplificado através de PCR com Pfu polimerase utilizando primers que contêm sítios BsiWI e BssHII exclusivos para clonagem subsequente em vetor de MV: MV-YFVEnv5 (5’- TATCGTACGATGCGAGTCGTGATTGCCCTACTG-3’) e MV-YFVEnv3 (5’- ATAGCGCGCTTATGTGTTGATGCCAACCCA-3’). A proteína Env gerada desta forma (aminoácidos 270 a 753 na poliproteína YFV) continha o peptídeo sinal N-terminal e uma parte da região transmembranosa C-terminal. A sequência NS1 foi amplificada por PCR da mesma forma que com polimerase Pfu utilizando os primers: MVYFVNS5 (5’- TATCGTACGATGAGAAACATGACAATGTCC-3’) e MVYFVNS3 (5’- ATAGCGCGCTTAATGGCTTTCATGCGTTTTCC-3’). A proteína NS1 (aminoácidos 754 a 1122 em poliproteína YFV) continha a sua sequência de peptídeo sinal. Um códon de início e de parada foram adicionados nas duas extremidades dos genes, bem como vários nucleotídeos após o códon de parada, a fim de respeitar a “regra de seis”, que estipula que o número de nucleotídeos do genoma MV deve ser múltiplo de 6 (7). Os dois fragmentos env e NS1 foram clonados em plasmídeo pCR2.1-TOPO (Invitrogen) e sequenciados para verificar que nenhuma mutação foi introduzida. Após a digestão de BsiWI/BssHII dos plasmídeos pCR2.1-TOPO, as sequências env e NS1 foram clonadas no vetor EdB-tag na posição 2 da ATU, gerando os plasmídeos: EdB-EnvYFV e EdB-NS1YFV.
RECUPERAÇÃO DE VÍRUS EdB-EnvYFv E EdB-NSlYFv RECOMBINANTES
[0191] Os plasmídeos EdB-EnvYFV e EdB-NS1 YFV foram utilizados para transfectar células auxiliares 293-3-46 conforme descrito acima e vírus recombinantes foram resgatados de células transfectadas cocultivadas a partir de células Vero. Vírus recombinantes foram passados duas vezes sobre células Vero e testados para determinar a expressão do transgene.
EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS YFV PORMV RECOMBINANTE
[0192] Os vírus recombinantes resgatados MV2-EnvYFV e MV2- NS1 YFV foram propagados sobre células Vero e a expressão de proteínas YFV foi analisada através de imunofluorescência. A Figura 9 demonstra que o sincício de células Vero infectadas por vírus MV2-YFV recombinantes exibiu uma alta expressão das proteínas YFV Env e NS1, conforme detectado com soro anti-YFV policlonal de camundongo. A fim de determinar se a expressão de genes YFV era estável, os vírus recombinantes resgatados foram passados em série sobre células Vero. Após dez passagens, todo o sincício observado em células infectadas foi positivo para YFV (não-exibido). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que as proteínas Env e NS1 de YFV são expressas de forma estável e eficiente ao longo de várias passagens pelos MVs recombinantes.
IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS COM VÍRUS RECOMBINANTES DE MV-YFV
[0193] Uma mistura dos vírus MV2-EnvYFV e MV2-NS1YFV (107 TCID50) foi inoculada por via intraperitoneal a seis camundongos CD46+/- IFN- α/βR-/-, conforme descrito acima (vide experimentos com MV-HIV gp). Como controle, seis outros camundongos receberam a mesma dose de vacina contra sarampo padrão. Após 1 mês, os camundongos foram infectados por via intracraniana com YFV 17D204 (10 LD50 determinado sobre camundongos FVB). A Figura 10 demonstra que 65% de animais imunizados com MV-YFV foram totalmente protegidos contra a infecção, enquanto todos os animais vacinados com MV padrão morreram entre cerca de 6 e 7 dias após a infecção. Além disso, um atraso de 4 dias da mortalidade foi observado em camundongos imunizados com MV-YFV e estes camundongos não morreram com os mesmos sintomas clínicos encefalíticos dos camundongos vacinados com vacina MV parão. A doença foi atenuada e consistiu de paralisia dos membros. Deve ser observado que os camundongos IFN-α/βR-/-são muito mais sensíveis a infecções virais que camundongos imunocompetentes (102 a 104 vezes). Por esta razão, a dose letal determinada para camundongos imunocompetentes foi provavelmente alta demais para camundongos IFN- α/βR-/-. O mesmo experimento encontra-se em andamento utilizando várias doses decrescentes de vírus YFV fixo.
[0194] Em conclusão, este experimento preliminar demonstra que as respostas imunológicas induzidas por MV recombinante contra proteínas YFV são capazes de proteger camundongos contra uma infecção letal.
[0195] As construções acima foram elaboradas através do uso das sequências descritas nas Figuras 12A e 12B.
[0196] Os mesmos princípios para a preparação de construções seriam aplicadas com as sequências descritas nas Figuras 12C e 12D.
EXEMPLO 5 VACINAÇÃO CONTRA WNV COM UM VÍRUS DO SARAMPO ATENUADO VIVO (LINHAGEM SCHWARZ) QUE EXPRESSA A FORMA SECRETADA DA GLICOPROTEÍNA E DO WNV (VÍRUS DO OESTE DO NILO)
[0197] Construiu-se um vírus atenuado de sarampo Schwarz recombinante que expressa a forma solúvel de WNV E e testou-se a sua capacidade como possível vacina contra encefalite de WN. O cDNA de WN correspondente à proteína sE da linhagem IS-98-ST1 de WNV foi introduzido em uma unidade de transcrição adicional no cDNA de MV Schwarz (pTM- MVSchw CNCM I-2889). Após o resgate do vírus do sarampo Schwarz recombinante, foi testada a sua capacidade de proteção de camundongos contra encefalite de WNV letal após infecção intraperitoneal.
A. MATERIAIS E MÉTODOS A.1 CÉLULAS E VÍRUS WN
[0198] A linhagem IS-98-ST1 de vírus WN foi produzida em células de mosquito Aedes AP61 de acordo com o protocolo descrito em Desprès et al., (51), Mashimo et al., (52) e Lucas et al. (53). O clone de células Vero-NK utilizado neste estudo foi selecionado pela sua capacidade de fusão após infecção com vírus do sarampo e para amplificar o vírus WN.
A.2 TITULAÇÃO DE VÍRUS WN SOBRE CÉLULAS DE MOSQUITO AP61 ATRAVÉS DA IMUNODETECÇÃO DE REPLICAÇÃO VIRAL DOS FOCOS (FOCUS IMMUNO ASSAY,FIA)
[0199] A titulação foi realizada de acordo com o protocolo descrito em Desprès et al., (51), Mashimo et al., (52) e Lucas et al. (53).
[0200] O título infeccioso de vírus WN sobre células AP61 foi determinado como unidades formadoras de foco sobre células AP61 (AP61 UFF/ml).
A.3 PURIFICAÇÃO DE VÍRUS WN PRODUZIDO SOBRE CÉLULAS AP61
[0201] A purificação foi conduzida de acordo com o protocolo descrito em Desprès et al., (51), Mashimo et al., (52) e Lucas et al. (53).
[0202] Resumidamente, as partículas virais presentes em sobrenadantes de células AP61 infectadas durante 3 dias com linhagem de vírus WN IS-98-ST1 (MOI 0,4) foram concentradas em PEG 6000 a 7% e purificadas em seguida em gradiente de sacarose descontínuo a 30 a 60% e em gradiente de sacarose linear a 10 a 50%. Vírus WN em sacarose a 30% foi armazenado a -80°C . Os títulos infecciosos obtidos foram de cerca de 1010 AP61 FFU/ml.
A.4 DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-WN EM ELISA
[0203] Os títulos de anticorpos anti-WN de soro diluído (1:100) foram determinados através de ELISA sobre uma dada quantidade de 106 AP61 FFU de viriões WN IS-98-ST1 purificados em gradiente de sacarose. O protocolo é descrito em Desprès et al., (1993) e Mashimo et al. (2002).
A.5 SORO IMUNE ANTI-WN
[0204] Soro imune anti-WN foi recolhido em camundongos adultos geneticamente resistentes a encefalite viral (Mashimo et al., 2002) que foram testados durante pelo menos 1 mês com inoculação intraperitoneal de 103 AP61 FFU de linhagem de vírus WN IS-98-ST1.
[0205] O título de anticorpo anti-WN de imunossoro diluído 1:100 foi medido em ELISA e foi de cerca de 1,4 unidades DO. Os títulos neutralizadores (TNRF90) de soro anti-WN foram de cerca de 1.600.
[0206] Ascite de camundongos (HMAF) contra linhagem de WN IS-98-ST1 foi obtida de animais que haviam sido hiperimunizados com homogenados cerebrais de filhotes de camundongos inoculados com WN. Os títulos de ELISA de HMAF anti-WN, diluídos até 1:1000, foram de cerca de 1 unidade DO.
[0207] Os soros imunes anti-WN foram utilizados para ensaios de imunofluorescência indireta e soroproteção passiva contra a doença. HMAF anti-WN foi utilizado para a imunodetecção de membrana de proteínas virais.
A6. CONSTRUÇÃO DE VÍRUS DO SARAMPO SCHWARZ RECOMBINANTE QUE EXPRESSA WN SE
[0208] O gene env de WNV codificador da forma secretada da proteína foi gerado através de amplificação por RT-PCR de RNA viral purificado a partir de partículas virais (linhagem WNV IS-98-ST1). A sequência específica foi amplificada através do uso de DNA polimerase PfuTurbo (Stratagene) e os primers específicos que contêm sítios exclusivos para clonagem subsequente em vetor pTM-MVSchw: MV-WNEnv5 5’- TATCGTACGATGAGAGTTGTGTTTGTCGTGCTA-3’ (sítio BsiWI sublinhado) e MV-WNEnv3 5’-ATAGCGCGCTTAGACAGCCTTCCCAACTGA-3‘ (sítio BssHII sublinhado). Foram adicionados um códon de início e de parada nas duas extremidades do gene. A sequência completa gerada possui 1.380 nucleotídeos de comprimento, incluindo os códons de início e de parada, e respeita a “regra de seis”, que estipula que o número de nucleotídeos do genoma de MV deve ser divisível por seis (Calain, 1993 (7); Schneider, 1997 (28)). A proteína Env gerada desta forma contém o seu peptídeo sinal N- terminal (18 aa) e nenhuma região transmembrana. Desta forma, ela representa os aminoácidos 275 a 732 em poliproteína de WNV e contém a sequência a seguir: atgagagttgtgtttgtcgtgctattgcttttggtggccccagcttacagcttcaactgccttggaatg agcaacagagacttcttggaaggagtgtctggagcaacatgggtggatttggttctcgaaggcg Iacagctgcgtgactatcatgtctaaggacaagcctaccatcgatgtgaagatgatgaatatggag gcggtcaacctggcagaggtccgcagttattgctatttggctaccgtcagcgatctctccaccaa agctgcgtgcccgaccatgggagaagctcacaatgacaaacgtgctgacccagcttttgtgtgc agacaaggagtggtggacaggggctggggcaacggctgcggattatttggcaaaggaagcat tgacacatgcgccaaatttgcctgctctaccaaggcaataggaagaaccatcttgaaagagaat atcaagtacgaagtggccatttttgtccatggaccaactactgtggagtcgcacggaaactactc cacacaggttggagccactcaggcagggagattcagcatcactcctgcggcgccttcatacac actaaagcttggagaatatggagaggtgacagtggactgtgaaccacggtcagggattgacac caatgcatactacgtgatgactgttggaacaaagacgttcttggtccatcgtgagtggttcatgga cctcaacctcccttggagcagtgctggaagtactgtgtggaggaacagagagacgttaatggag tttgaggaaccacacgccacgaagcagtctgtgatagcattgggctcacaagagggagctctg catcaagctttggctggagccattcctgtggaattttcaagcaacactgtcaagttgacgtcgggt catttgaagtgtagagtgaagatggaaaaattgcagttgaagggaacaacctatggcgtctgttc aaaggctttcaagtttcttgggactcccgcagacacaggtcacggcactgtggtgttggaattgc agtacactggcacggatggaccttgcaaagttcctatctcgtcagtggcttcattgaacgacctaa cgccagtgggcagattggtcactgtcaacccttttgtttcagtggccacggccaacgctaaggtc ctgattgaattggaaccaccctttggagactcatacatagtggtgggcagaggagaacaacaga tcaatcaccattggcacaagtctggaagcagcattggcaaagcctttacaaccaccctcaaagg agcgcagagactagccgctctaggagacacagcttgggactttggatcagttggaggggtgttc acctcagttgggaaggctgtctaa MRVVFVVLLLLVAPAYSFNCLGMSNRDFLEGVSGATWVDLVLEGDSCVT IMSKDKPTIDVKMMNMEAVNLAEVRSYCYLATVSDLSTKAACPTMGEAH NDKRADPAFVCRQGVVDRGWGNGCGLFGKGSIDTCAKFACSTKAIGRTI LKENIKYEVAIFVHGPTTVESHGNYSTQVGATQAGRFSITPAAPSYTLKLG EYGEVTVDCEPRSGIDTNAYYVMTVGTKTFLVHREWFMDLNLPWSSAGS TVWRNRETLMEFEEPHATKQSVIALGSQEGALHQALAGAIPVEFSSNTVK LTSGHLKCRVKMEKLQLKGTTYGVCSKAFKFLGTPADTGHGTVVLELQY TGTDGPCKVPISSVASLNDLTPVGRLVTVNPFVSVATANAKVLIELEPPFG DSYIVVGRGEQQINHHWHKSGSSIGKAFTTTLKGAQRLAALGDTAWDFG SVGGVFTSVGKAV*
[0209] Após a purificação em gel de agarose, o fragmento de PCR foi clonado em plasmídeo pCR2.1-TOPO (Invitrogen) e sequenciado para verificar que nenhuma mutação foi introduzida. Após a digestão de BsiWI/BssHII do plasmídeo pCR2.1-TOPO, o fragmento de DNA foi clonado no vetor pTM-MVSchw na posição 2 da ATU, gerando o plasmídeo: pTM- MVSchw-sEWNV de acordo com a Figura 13.
A.7 PRODUÇÃO DE VÍRUS RECOMBINANTE DO SARAMPO QUE EXPRESSEWN SE
[0210] Para recuperar MV recombinante de plasmídeo, utilizou-se o sistema de resgate com base em células auxiliares descrito por Radecke et al. (Radecke, 1995 (35)) e modificado por Parks et al. (Parks, 1999 (40)). Células auxiliares humanas que expressam de forma estável RNA polimerase T7 e proteínas N e P do sarampo (células 293-3-46, gentil presente de MA Billeter, Universidade de Zurique, Suíça) foram transfectadas utilizando o procedimento de fosfato de cálcio com plasmídeo pTM-MVSchw-sEwNv (5 μg) e um plasmídeo que expressa o gene L de polimerase de MV (pEMC-La, 20 ng). Após incubação por 1 noite a 37°C, o meio de transfecção foi substituído por um meio novo e aplicou-se choque térmico (43°C por 2 horas) (Parks, 1999 (40)). Após 2 dias de incubação a 37°C , células transfectadas foram transferidas sobre uma camada de células CEF e incubadas a 32°C a fim de evitar adaptação da vacina Schwarz que foi selecionada originalmente sobre células CEF e atualmente é cultivada sobre essas células. Vírus infeccioso foi recuperado entre 3 e 7 dias após o cocultivo. O vírus recombinante também foi resgatado através da mesma técnica, após o cocultivo de célula auxiliares 293- 3-46 transfectadas a 37°C com células Vero (rim de macaco verde africano, clone Vero-NK). A fim de aumentar o rendimento do resgate e como esses vírus recombinantes foram preparados para uso em experimentos com camundongos, utilizamos células Vero como células produtoras no lugar dos fibroblastos de embrião de galinha usuais (CEF). Sincício isolado foi colhido e transferido para células Vero cultivadas em cavidades de 35 mm em meio de Eagle modificado da Dulbebecco (DMEM) suplementado com soro fetal de bezerro a 5% (FCS). As células infectadas foram distribuidas em frascos de 75 e 150 cm3. Quando o sincício atingiu confluência de 80 a 90% (normalmente em 36 a 48 horas após a infecção), as células foram raspadas em pequeno volume de OptiMEM (Gibco BRL) e congeladas e descongeladas uma vez. Após centrifugação em baixa velocidade para peletizar fragmentos celulares, o sobrenadante, que continha vírus, foi armazenado a -80°C . Demonstrou-se que duas passagens do vírus Schwarz sobre células Vero não modificaram as suas capacidades imunogênicas em macacos.
A.8 TITULAÇÃO DE VÍRUS DE MV-WN RECOMBINANTE
[0211] Os títulos de MV recombinante foram determinados através de ensaio de diluição do limite do ponto final sobre células Vero. Doses infecciosas de cultivo de tecido a 50% (TCID50) foram calculadas utilizando o método de Karber (Karber, 1931 (41)).
A.9 DETECÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA DE WNV SE EXPRESSO EM CÉLULAS VERO INFECTADAS POR VÍRUS RECOMBINANTE DE MV-WN SE
[0212] A expressão da proteína WN sE em células infectadas por MV-WN sE recombinante foi detectada através de imunofluorescência. Células Vero foram cultivadas sobre lamínulas revestidas com poliornitina e infectadas por MV-WN sE em MOI de 0,05. Após 2 dias de infecção, as lamínulas foram lavadas duas vezes em PBS e fixadas por 15 minutos em para-formaldeído (4% em PBS). Em alguns casos, as células foram permeabilizadas por Triton X100 (0,1%, 5 minutos). Após duas lavagens com PBS, as lamínulas foram incubadas por 15 minutos à temperatura ambiente em PBS com soro de cabra a 2% e incubadas em seguida por 1 hora à temperatura ambiente com soro imune anti-WNV de camundongo ou HMAF anti-WNV de camundongo (vide A5) diluído em PBS com soro de cabra a 2%. Após lavagem em PBS, as células foram incubadas por 45 minutos à temperatura ambiente com conjugado de anti-IgG de camundongo com R-ficoeritrina de cabra (SBA, Birmingham, Estados Unidos). Após a lavagem em PBS, as lamínulas foram montadas sobre lâminas com fluoromount (Southern Biotech Associates Inc., Birmingham, Alabama, Estados Unidos).
A.10 DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-MV ATRAVÉS DE ELISA
[0213] Anticorpos anti-MV foram detectados utilizando um kit ELISA padrão (Trinity Biotech, Estados Unidos). Um conjugado anticorpo de camundongo anti-HRP (Amersham) foi utilizado como anticorpo secundário. Os títulos foram determinados através de limitação das diluições e calculados como a diluição mais alta de soro, gerando duas vezes a absorbância de uma diluição 1/100 de uma mistura de soros controle.
A.11 ENSAIO DE NEUTRALIZAÇÃO ATRAVÉS DA REDUÇÃO DE FOCOS DE REPLICAÇÃO VIRAL(TNRF90) SOBRE CÉLULAS VERO
[0214] Sucessivas diluições de soro foram preparadas para teste em DMEM Glutamax com 2% de FCS descomplementado (soro fetal de bezerro) em tubos de 0,5 ml.
[0215] Para 0,1 ml de soro diluído em DMEM Glutamax com 2% de FCS, adicionou-se 0,1 ml de DMEM Glutamax/2% de FCS contendo 100 AP61 UFF de linhagem de vírus WN IS-98-ST1.
[0216] Célula controle: 0,2 ml de DMEM, 0,2% FCS.
[0217] Vírus controle: 0,2 ml de DMEM Glutamax/2% FCS contendo 100 AP61 UFF de linhagem de vírus WN IS-98-ST1.
[0218] 2 horas com rotação suave a 37°C.
[0219] Placas com 12 cavidades com cerca de 150.000 células VERO HK por cavidade que são cultivadas em monocamadas por 24 horas em DMEM Glutamax 5% FCS.
[0220] Uma lavagem em DMEM de camadas celulares.
[0221] Adição de 0,2 ml de DMEM Glutamax/2% SVF.
[0222] Adição de 0,2 ml de mistura de soro/vírus WN sobre as camadas celulares.
[0223] Incubação por 2 horas a 37°C em CO2.
[0224] Retirada da mistura de soro e vírus WN de camadas celulares infectadas.
[0225] Uma lavagem em DMEM de camadas celulares infectadas.
[0226] Adição de 1 ml de DMEM 2% SVF por cavidade.
[0227] Adição de 1 ml de CMC 1,6% diluído em DMEM Glutamax/2% SVF.
[0228] Incubação por 2 dias a 37°C em CO2.
[0229] As placas foram reveladas através de técnica de FIA. A última diluição de imunossoros que neutralizam pelo menos 90 dentre 100 UFF de vírus WN testado sobre células VERO foi determinada (TNRF90: Test de Neutralisation par Réduction de Foyers de Replication Virale à 90%). O título de anticorpos neutralizadores do soro foi determinado através de TNRF90.
A.12 PRODUÇÃO DE PSEUDOPARTÍCULAS DE VÍRUS WN PELA LINHAGEM CELULAR MEF/3T3.TET-OFF/PR ME.WN #H2:
[0230] Pseudopartículas da linhagem de vírus WN IS-98-ST1 compostas de glicoproteínas em complexo de prME foram secretadas por linhagem MEF/3T3.Tet-Off/pr ME.WN #h2 induzida para a expressão de proteínas virais (CNCM I-3018). Elas foram purificadas para determinar sobrenadantes de cultivo celular de 3 dias de acordo com o protocolo utilizado para a purificação de vírus WN.
[0231] Ensaio de soroproteção passiva contra vírus WN em camundongos BALB/c adultos: Camundongos BALB/c com 6 semanas de idade foram fornecidos pelo centro de criação Janvier. A dose para ensaio viral é de 100 AP61 UFF, ou seja, 10 DL 50 (Tomoshi et al., 2002) diluída em 100 μl de DPBS suplementado com 0,2% BSA (albumina de soro bovino), pH 7,5 (Sigma), que são inoculados por via intraperitoneal. O tempo médio para efeito letal foi de 10 dias. Os animais foram observados por 2 a 3 semanas.
[0232] Os soros a serem testados para determinar a soroproteção passiva em camundongos são diluídos em 0,1% DPBS/0,2% BSA e inoculados 24 horas antes do ensaio viral.
B. RESULTADOS E CONCLUSÕES B.1 PRODUÇÃO DE VÍRUS RECOMBINANTE DO SARAMPO QUE EXPRESSA WN sE
[0233] O cDNA codificador da proteína E da linhagem IS-98- ST1 de WNV deletado pela sua região de ancoramento de transmembrana foi inserido no genoma do vírus do sarampo (linhagem Schwarz) de acordo com a Figura 13.
B.2 ENSAIOS PRELIMINARES DE SOROPROTEÇÃO PASSIVA CONTRA VÍRUS WN EM CAMUNDONGOS
[0234] Soro imune anti-WN a ser testado foi obtido de camundongos geneticamente resistentes à doença (52). O soro anti-WN, tomado tardiamente, foi injetado em diluições 1:10 (16 TNRF90) e 1:40 (4 TNRF90) em um volume final de 0,1 ml de DPBS/0,2% SAB por via intraperitoneal em camundongos BALB/c adultos geneticamente sensíveis. Os anticorpos foram administrados apenas 24 horas antes do ensaio viral ou 24 horas antes e 24 horas depois do ensaio com 10 DL50 de linhagem IS-98-ST1 de vírus WN. O controle negativo foi a injeção de soro normal de camundongos a 1:10. A neurovirulência de vírus WN foi avaliada em camundongos testados com DPBS/0,2% SAB. Os resultados de proteção passiva após 2 semanas de ensaios virais foram os seguintes: TABELA 1 SOROPROTEÇÃO PASSIVA CONTRA ENCEFALITE DE WNV EM CAMUNDONGOS BALB/C ADULTOS
Figure img0005
* Dia médio de morte  desvio padrão. ** Dia -1 e Dia +1 de desafio de vírus. *** Dia -1 de desafio de vírus.
[0235] Em conclusão, uma única injeção de anticorpos anti-WN (2,5 a 10 μl de soro) obtidos a partir de camundongos geneticamente resistentes ao vírus WN, em que a mencionada injeção é conduzida por via intraperitoneal em camundongos adultos sensíveis a encefalite viral proporciona proteção passiva contra uma dose teste.
[0236] Observa-se que o soro de camundongos BALB/c que tenham recebido anticorpos protetores anti-WN e resistentes à infecção viral contêm títulos de anticorpos anti-WN através de ELISA que são de cerca de uma unidade DO (para diluição de soro de 1:100) após um mês de teste. Isso indica que o vírus WN inoculado para o teste atingiu uma replicação em camundongos protegidos, induzindo ums resposta humoral. Caso a soroproteção passiva proteja contra a encefalite letal devido ao vírus WN, ela aparentemente não é apropriada a fim de evitar a propagação viral em indivíduos infectados.
B.3 VACINAÇÃO DE CAMUNDONGOSCD46+/- IFN-α/βR-/-COM VÍRUSMV/WN SE
[0237] Camundongos susceteíveis a infecção com MV foram obtidos conforme descrito anteriormente (Mrkic, 1998 (21)). Camundongos FVB heterozigotos para o transgene receptor de CD46 MV (Yannoutsos, 1996 (32)) foram cruzados com camundongos 129Sv IFN-α/βR’/’ (Muller, 1994 (22)). A progênie F1 foi selecionada através de PCR e os animais CD46+/- foram novamente cruzados com camundongos 129Sv IFN-α/βR-/-. Animais IFN-α/βR-/- CD46+/- foram selecionados e utilizados para experimentos de imunização. Camundongos CD46+/- IFN-α/βR-/- de 6 semanas de idade foram inoculados por via intraperitoneal com uma única dose de vacina MV padrão (106 TCID50, três camundongos) ou vírus recombinante MV-WN sE (104 ou 106 TCID50, seis camundongos por dose) em 300 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
[0238] Um soro foi retirado do olho após 1 mês de vacinação com dose única, a fim de determinar a produção de anticorpos anti-MV, anti-WN E e neutralizadores contra o vírus teste. b. Soro diluído até 1:100 e testado para determinar anticorpos através de ELISA sobre virião NV purificado para:
Figure img0006
c. Ensaio de soroneutralização in vitro para WNV sobre células VERO: TNRF90 de conjuntos de soro sobre 100 AP61 UFF de linhagem IS-98-ST1 de vírus WN em células VERO:
Figure img0007
[0239] Em conclusão, os anticorpos dirigidos contra vírus WN de glicoproteína E solúvel possuem a capacidade de neutralizar a linhagem IS-98- ST1 utilizada para o ensaio por vírus WN em camundongos in vitro.
[0240] Uma amplificação de vacina em camundongos CD46+/- IFN-α/βR’/’ imunizados foi conduzida em 1 mês após o início da vacinação com uma dose única, idêntica à dose da primeira injeção.
[0241] Após 2 semanas de amplificação, os soros foram testados através de ELISA e em TNRF90 conforme acima: a. Soro diluído até 1:100 e testado para determinação de anticorpos através de ELISA sobre vírion WN purificado:
Figure img0008
b. Ensaio de soroneutralização in vitro sobre células VERO: TNRF90 de conjuntos de soro sobre 100 AP61 UFF de linhagem IS-98-ST1 de vírus WN em células VERO:
Figure img0009
Após 4 semanas de amplificação, os soros foram testados através de ELISA e em TNRF90 conforme acima: a. Soro diluído a 1:100 e testado para determinação de anticorpos através de ELISA sobre vírion WN purificado:
Figure img0010
c. Soroneutralização in vitro sobre células VERO: TNRF90 de conjuntos de soro sobre 100 AP61 UFF de linhagem IS-98-ST1 de vírus WN sobre células VERO:
Figure img0011
[0242] Em conclusão, após amplificação com uma dose única, os títulos de anticorpos anti-WNV e os títulos de anticorpos neutralizadores anti- WNV aumentaram significativamente em fator de dez vezes ou mais.
[0243] Esplenócitos de camundongos CD46+/- IFN-α/βR-/- imunizados com duas injeções separadas por 4 semanas com o vírus MV-WN sE com doses de 104 ou 106 DCIP50 são testados em ELISpot e citometria de fluxo para a resposta T CD4 e CD8 após estímulo in vitro por pseudopartículas virais purificadas em gradientes de sacarose a partir de sobrenadantes de linhagem celular MEF/3T3.Tet-Off/prME.WN #h-2 (CNCM I-3018) induzida.
B.4 ENSAIO DE SOROPROTEÇÃO ANTI-WN PASSIVA EM BALB/C COM ANTICORPOS ANTI-E
[0244] Soro imune de camundongos CD46+/-IFN-α/βR-/- vacinados com uma única dose de vírus recombinante do sarampo foi coletado após 1 mês. Várias diluições destes soros foram injetadas em um volume final de 0,1 ml em camundongos BALB/c com 6 semanas de idade e somente 24 horas antes da inoculação de 100 AP61 UFF de linhagem IS-98-ST1 de vírus WN (10 DL50) por via intraperitoneal (vide protocolo em § B2).
[0245] Os resultados de proteção passiva após 2 semanas de ensaio viral são os seguintes: TABELA 2 MV-WN sE RECOMBINANTE INDUZ ANTICORPOS QUE FORNECEM PROTEÇÃO TOTAL CONTRA ENCEFALITE DE WNV EM CAMUNDONGOS BALB/C
Figure img0012
Figure img0013
* Dia -1 do vírus fixo.
[0246] Em conclusão, anticorpos dirigidos contra glicoproteína E solúvel em vírus WN possuem a capacidade de proteger in vivo contra encefalite de vírus WN. A vacinação de camundongos CD46+/- IFN-α/βR-/- com dose de 106 DCIP50 de vírus MV-WN sE na forma de injeção única é necessária para induzir uma resposta humoral anti-WN E em um período de tempo de 4 semanas que é capaz de proteger contra a doença através de soroproteção passiva. Um volume mínimo de 2,5 μl de soro imune de camundongos vacinados com vírus MV-WN sE é suficiente para fornecer proteção total em camundongos BALB/c adultos testados com uma dose letal de vírus WN (ou seja, uma razão de cerca de 0,1 ml de soro imune por kg). Observa-se que o soro antiletal diluído até 1:10 induz uma proteção parcial (cerca de 30%) contra encefalite do vírus do Oeste do Nilo. Soros obtidos em camundongos CD46+/- IFN-α/βR-/-vacinados que tenham sido então reforçados com uma dose fraca (104 TCID50) serão testados para determinar a sua capacidade em fornecer uma proteção passiva em camundongos BALB/c.
B.5 ENSAIO VIRAL SOBRE CAMUNDONGOS CD46+/-IFN-α/βR-/-VACINADOS COM MV- WN SE
[0247] Camundongos CD46+/-IFN-α/βR-/-vacinados 2 meses após as duas injeções de 106 DCIP50 de vírus MV-WN sE, em que estas injeções são realizadas em intervalos de 4 semanas, foram testados com 100 AP61 UFF de linhagem IS-98-ST1 de vírus WN administrado por via intraperitoneal.
[0248] Os dois camundongos vacinados com vírus do sarampo padrão morreram no terceiro dia do teste. Nenhuma morbilidade ou letalidade foi observada em camundongos vacinados com MV-WN sE no sétimo dia do teste. Em conclusão, camundongos CD46+/-IFN-α/βR-/-imunizados contra gpE solúvel de vírus WN são protegidos contra uma dose letal teste do vírus WN na ausência de atividade antiviral de interferon-α.
B6. NOVO ENSAIO DE VACINAÇÃO ANTI-WN COM AMPLIFICAÇÃO DE ANTÍGENO
[0249] Camundongos CD46+/-IFN-α/βR-/-adultos são vacinados em um período de tempo de 4 semanas com vírus MV-WN sE em uma dose de 104 DCIP50 que é proposta para seres humanos e uma amplificação com antígeno é conduzida com pseudopartículas purificadas de vírus WN que são secretadas pela linhagem celular MEF/3T3.Tet-Off/WN prME #h2. BIBLIOGRAFIA 1. Amara, R. R., F. Villinger, J. D. Altman, S. L. Lydy, S. P. O’Neil, S. I. Staprans, D. C. Montefiori, Y. Xu, J. G. Herndon, L. S. Wyatt, M. A. Candido, N. L. Kozyr, P. L. Earl, J. M. Smith, H. L. Ma, B. D. Grimm, M. L. Hulsey, J. Miller, H. M. McClure, J. M. McNicholl, B. Moss e H. L. Robinson, 2001, Control of a Mucosal Challenge and Prevention of AIDS by a Multiprotein DNA/MVA Vaccine, Science, 292: 69-74. 2. Baba, T. W., V. Liska, R. Hofmann-Lehmann, J. Vlasak, W. Xu, S. Ayehunie, L. A. Cavacini, M. R. Posner, H. Katinger, G. Stiegler, B. J. Bernacky, T. A. Rizvi, R. Schmidt, L. R. Hill, M. E. Keeling, Y. Lu, J. E. Wright, T. C. Chou e R. 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Claims (22)

1. VETOR DE VÍRUS RECOMBINANTE DO SARAMPO, caracterizado por compreender um replicon que compreende (i) uma sequência de cDNA codificadora do ácido ribonucleico (RNA) positivo antigenômico de comprimento total de um vírus do sarampo da linhagem Schwartz, operacionalmente ligado a (ii) sequências de controle de expressão e (iii) uma sequência de DNA heteróloga codificadora de uma sequência de aminoácidos heterólogos determinada a partir de um antígeno de um determinado flavivírus ou retrovírus, em que a mencionada sequência de DNA heteróloga é clonada no mencionado replicon em condições que permitam a sua expressão, e o mencionado replicon contendo um número total de nucleotídeos que é um múltiplo de seis, em que a sequência nucleotídica que compreende o cDNA resultante da transcrição reversa do ácido ribonucleico antigênico (RNA) do vírus do sarampo é uma molécula de cDNA compreendendo a sequência de nucleotídeo que se estende do nucleotídeo 83 ao nucleotídeo 15976 da sequência de SEQ ID NO: 16.
2. VETOR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela sequência de DNA heteróloga ser clonada em uma Unidade de Transcrição Adicional (ATU) inserida no cDNA que codifica o ácido ribonucléico (RNA) antigenômico do mencionado vírus recombinante do sarampo.
3. VETOR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo sítio de clonagem da Unidade de Transcrição Adicional (ATU) ser selecionado a montante do gene N do vírus do sarampo (MV).
4. VETOR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo sítio de clonagem da Unidade de Transcrição Adicional (ATU) ser selecionado entre os genes P e M do vírus do sarampo (MV).
5. VETOR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo sítio de clonagem da Unidade de Transcrição Adicional (ATU) estar entreos genes H e L do vírus do sarampo (MV).
6. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela sequência de DNA heteróloga ser expressa em forma de uma proteína de fusão com uma das proteínas do vírus do sarampo (MV).
7. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela sequência de DNA heteróloga não ser expressa em forma de proteína de fusão com uma das proteínas do vírus do sarampo (MV).
8. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 caracterizado pela sequência de DNA heteróloga codificar uma sequência de aminoácidos retroviral.
9. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela sequência de DNA heteróloga codificar uma sequuência de aminoácidos retroviral derivada de um antígeno de um retrovírus selecionado a partir do retrovírus da imunodeficiência humana (HIV).
10. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela sequência de DNA heteróloga codificar uma sequência de aminoácidos retroviral de um antígeno de um flavivírus.
11. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pela sequência de DNA heteróloga codificar uma sequuência de aminoácidos retroviral de um antígeno de envelope de um retrovírus da imunodeficiência humana (HIV).
12. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou 11, caracterizado pela sequência de DNA heteróloga codificar uma sequência de aminoácidos retroviral selecionada a partir do gp160, gp120 ou gp41 de HIV-1 ou do gp140 de HIV-1, ou uma versão mutada dos mencionados antígenos.
13. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo antígeno mutado permitir a exposição de epítoposneutralizantes.
14. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, 11 ou 12 caracterizado pela sequência de DNA heteróloga codificar gp160ΔV3, gp160ΔV1V2, gp160ΔV1V2V3, gp140ΔV3, gp140ΔV1V2, gp140ΔV1V2V3.
15. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 10, caracterizado pela sequência de DNA heteróloga codificar uma sequência de aminoácidos flaviviral derivada de um antígeno do Vírus da Febre Amarela ou do vírus do Oeste do Nilo.
16. VETOR, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo cDNA codificador do ácido ribonucleico (RNA) positivo antigenômico de comprimento total do vírus do sarampo e a sequência de controle de expressão serem de pTM-MVSchw, depositado na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) sob n° I-2889.
17. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por ser um plasmídeo.
18. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pela sequência de DNA heteróloga ser selecionada a partir de YFV17D204.
19. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pela sequência de DNA heteróloga ser selecionada a partir da linhagem neurovirulenta IS-98-ST1.
20. VETOR, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por ser selecionado a partir dos vetores a seguir, depositados na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM): pTM-MVSchw2-Es (WNV) CNCM I-3033 pTM-MVSchw2-GFPbis CNCM I-3034 pTM-MVSchw2-p17p24 [delta] myr (HIVB) CNCM I-3035pTM-MVSchw3-Tat (HIV89-6p) pTM-MVSchw3-GFP pTM-MVSchw2-Es (YFV) pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V1 V2 V3 (HIV89-6) CNCM I-3054 pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V3 (HIV89-6) CNCM I-3055 pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 V3 (HIV89-6) CNCM I-3056 pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 (HIV89-6) CNCM I-3057 pTM-MVSchw2-Gag SIV239 p17-p24 [delta] myr-3-gp140 (HIV89-6) CNCM I-3058.
21. SISTEMA DE RESGATE, para a reunião de vírus recombinante do sarampo que expressa uma sequência de aminoácidos heterólogos a partir de um antígeno de um determinado flavivírus ou retrovírus, caracterizado por compreender células Vero transfectadas com um vetor de vírus do sarampo recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, e células auxiliares humanas recombinadas com pelo menos um vetor apropriado para a expressão de ácido ribonucleico (RNA) polimerase T7 e expressão das proteínas N, P e L do vírus do sarampo.
22.COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, caracterizada por compreender um vetor recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 16 ou 20 e um adjuvante.
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