ES2382303T3 - Conjugados de hidroxialquilalmidón y un principio activo, preparados mediante ligado químico a través de tiazolidina - Google Patents

Conjugados de hidroxialquilalmidón y un principio activo, preparados mediante ligado químico a través de tiazolidina Download PDF

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Abstract

Método para preparar un conjugado de un principio activo e hidroxialquilalmidón, en la que el principio activo y el hidroxialquilalmidón se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula o la fórmula (I') o la fórmula (I") en las que R1, R2, R2', R3, R3' y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo alquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo y heteroaralquilo lineal, cíclico y/o ramificado, opcionalmente sustituido de manera adecuada, preferiblemente hidrógeno, comprendiendo dicho método (A) hacer reaccionar un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal de un derivado de hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal con un grupo alfa-SH-beta-amino de un principio activo o un derivado del mismo que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (1); o con un grupo alfa-SH-beta-amino. de un principio activo o un derivado del mismo que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I'), o con un grupo alfa-SH-beta-amino de un principio activo o un derivado del mismo que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I"), en la que R1, R2, R2', R3, R3' y R4 son tal como se definieron anteriormente; o (B) hacer reaccionar un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal de un principio activo o un derivado del mismo que comprende dicho grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal con un grupo alfa-SH-beta-amino de un derivado de hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I); o con un grupo alfa-SH-beta-amino de un derivado de hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I'); o con un grupo alfa-SH-beta-amino

Description

Conjugados de hidroxialquilalmidón y un principio activo, preparados mediante ligado químico a través de tiazolidina
La presente invención se refiere a un método para preparar los conjugados de un principio activo e hidroxialquilalmidón y a los conjugados de un principio activo e hidroxialquilalmidón, preferiblemente hidroxietilalmidón, en el que los conjugados se preparan uniendo covalentemente el hidroxialquilalmidón y el principio activo mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I)
o la fórmula (I’)
20 en las que R1, R2, R2’, R3, R3’ y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo alquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo y heteroaralquilo lineal, cíclico y/o ramificado, opcionalmente sustituido de manera adecuada, preferiblemente hidrógeno.
El documento WO 03/031581 A2 da a conocer un método de conjugar un derivado polimérico con un polipéptido que
25 tiene un residuo de cisteína o histidina en el extremo N-terminal, comprendiendo dicho método proporcionar un polipéptido que tiene un residuo de cisteína o histidina en el extremo N-terminal, proporcionar un polímero terminado en tioéster, comprendiendo el polímero una estructura principal polimérica, no peptídico y soluble en agua, preferiblemente un polímero de polietilenglicol, y hacer reaccionar el derivado polimérico y el polipéptido. Como polímeros, se usan poli(alquilenglicol), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, poli(poliol oxietilado), poli(alcohol
30 olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(alfa hidroxiácido), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolina, poli(Nacriloilmorfolina), poliacrilato, poliacrilamidas, polisacáridos y copolímeros, terpolímeros y mezclas de los mismos. Todos los polímeros dados a conocer explícitamente son polímeros de polietilenglicol.
Pese al avance de los métodos de acoplamiento y al uso de moléculas de PEG monofuncionales, una desventaja
35 general de los fármacos pegilados es que la ruta de metabolización de PEG como polímero no natural no se conoce en detalle.
Además, a partir de J. Am Chem Soc. 1995, 117, 3893-3899 se conoce un enfoque general para formar dendrímeros peptídicos con uniones oxima, hidrazona y tiazolidina. Ahí se describen péptidos no protegidos como elementos
40 estructurales y el ligado selectivo entre un aldehído y una base débil.
El documento WO 99/07719 A1 da a conocer profármacos y los conjugados de compuestos que contienen tiol y selenol y métodos de uso de los mismos. Entre varios de otros compuestos, se da a conocer un profármaco que se prepara mediante la reacción de éster etílico de L-cisteína y una D-ribosa, un monosacárido, conteniendo dicho profármaco un anillo de tiazolidina. Como fórmula general para el monosacárido se da a conocer (CHOH)nCH2OH
5 con n = de 1 a 5. Ni siquiera se dan a conocer disacáridos, ni mucho menos compuestos poliméricos de alto peso molecular tal como almidón, en particular hidroxialquilalmidón, en combinación con la formación de anillos de tiazolidina.
El documento EP-A- 1 398 328 da a conocer un método de conjugar hidroxialquilalmidón con un polipéptido a través 10 de un grupo amino que comprende un elemento de unión. No se da a conocer el acoplamiento a través de la formación de un resto de tiazolidina.
El documento WO 99/07719 da a conocer profármacos de principios activos que contienen tiol y selenol, en los que el principio activo se acopla, por ejemplo, a sacáridos. Los conjugados se forman por ejemplo a través de una unión 15 tiazolidina directa entre el principio activo y los oligosacáridos. No se mencionan los conjugados entre hidroxialquilalmidón y un principio activo que comprende un elemento de unión.
Por tanto, un objeto de la presente invención era proporcionar conjugados novedosos de un principio activo y un polímero formado mediante unión covalente en los que no se usa como polímero polialquilenglicol, especialmente. 20 Por consiguiente, otro objeto de la presente invención era proporcionar un método para preparar esos conjugados.
La solución de estos problemas es un método para preparar un conjugado de un principio activo e hidroxialquilalmidón, en el que el principio activo y el hidroxialquilalmidón se unen covalentemente mediante un 25 residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I)
o la fórmula (I’)
o la fórmula (I’’)
en las que R1, R2, R2’, R3, R3’ y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo alquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo y heteroaralquilo lineal, cíclico y/o ramificado, opcionalmente sustituido de manera adecuada, preferiblemente hidrógeno,
40 comprendiendo dicho método
(A) hacer reaccionar un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal de un derivado de hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal con un grupo alfa-SH-beta-amino de un principio activo o un derivado del mismo que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I); o con un grupo alfa-SH-beta-amino
10 de un principio activo o un derivado del mismo que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I’), o con un grupo alfa-SH-beta-amino
15 de un principio activo o un derivado del mismo que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I”), en la que R1, R2, R2’, R3, R3 y R4 son tal como se definieron anteriormente;
20 o
(B) hacer reaccionar un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal de un principio activo o un derivado del
mismo que comprende dicho grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal con un grupo alfa-SH-beta-amino 25
de un derivado de hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo 30 químico que tiene una estructura según la fórmula (I); o con un grupo alfa-SH-beta-amino
de un derivado de hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un 35 conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I’); o con un grupo alfa-SH-beta-amino
40 de un derivado de hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I’’), en la que R1, R2, R2’, R3, R3 y R4 son tal como se definieron anteriormente, y en la que el derivado de hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o dicho grupo alfa-SH-beta-amino se obtiene mediante un método que comprende hacer reaccionar el hidroxialquilalmidón con al menos un compuesto, al menos bifuncional, comprendiendo dicho compuesto dos grupos funcionales M1 y Q, haciéndose reaccionar un grupo funcional M1 con el hidroxialquilalmidón y siendo un grupo funcional Q
(i)
un grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o un grupo alfa-SH-beta-amino; o
(ii)
un grupo funcional que se modifica químicamente para dar el grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o el grupo alfa-SH-beta-amino.
Por tanto, el término “grupo alfa-SH-beta-amino” tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a un grupo etileno en el que un grupo SH opcionalmente protegido se uno a un átomo de carbono y un grupo amino primario o secundario opcionalmente protegido se une al átomo de carbono vecino. Los enlaces en las fórmulas anteriores en los que, en un extremo de la misma, no se indica ningún residuo, son los enlaces a los que se unen o bien el hidroxialquilalmidón o bien el principio activo.
El término “alquilo” tal como se usa en el contexto de la invención, es preferiblemente un grupo alquilo que tiene de 1 a 20, más preferido de 1 a 10 y en particular de 1 a 4 átomos de carbono, a menos que se defina de manera diferente más adelante en el presente documento.
El término “arilo” tal como se usa en el contexto de la invención, es preferiblemente un grupo arilo que tiene de 6 a 20, más preferido de 6 a 14 y en particular 6 átomos de carbono, a menos que se defina de manera diferente más adelante en el presente documento.
El término “heteroarilo” tal como se usa en el contexto de la invención, es preferiblemente un grupo heteroarilo que tiene de 6 a 20, más preferido de 6 a 14 y en particular 6 átomos de carbono y en el que al menos uno, preferiblemente de 1 a 3, en particular 1, de los átomos de carbono está sustituido por un heteroátomo, tal como S, N y/o O, a menos que se defina de manera diferente más adelante en el presente documento.
El término “aralquilo” tal como se usa en el contexto de la invención, es preferiblemente un grupo arilo unido a través de un grupo alquilo al resto del compuesto, a menos que se defina de manera diferente más adelante en el presente documento.
El término “alcarilo” tal como se usa en el contexto de la invención, es preferiblemente un grupo alquilo unido a través de un grupo arilo al resto del compuesto, a menos que se defina de manera diferente más adelante en el presente documento.
El término “heteroaralquilo” tal como se usa en el contexto de la invención, es preferiblemente un grupo heteroarilo unido a través de un grupo alquilo al resto del compuesto, a menos que se defina de manera diferente más adelante en el presente documento.
El término “opcionalmente sustituido de manera adecuada” tal como se usa en el contexto de la invención, preferiblemente significa que está presente de 1 a 10, más preferido de 1 a 4, en particular 1 sustituyente, a menos que se defina de manera diferente más adelante en el presente documento.
El término “principio activo” tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a una sustancia que puede afectar a cualquier propiedad física o bioquímica de un organismo biológico incluyendo virus, bacterias, hongos, plantas, animales y seres humanos. En particular, el término “principio activo” tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a una sustancia destinada al diagnóstico, cura, alivio, tratamiento o prevención de una enfermedad en seres humanos o animales, o para mejorar de otro modo el bienestar físico o mental de seres humanos o animales. Ejemplos de principios activos incluyen, péptidos, proteínas, enzimas, fármacos de moléculas pequeñas, colorantes, lípidos, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, ácidos nucleicos, células, virus, liposomas, micropartículas y micelas.
Ejemplos de proteínas incluyen, eritropoyetina (EPO) tal como EPO recombinante humana (EPOrh), factores estimuladores de colonias (CSF), tales como G-CSF como el G-CSF recombinante humano (G-CSFrh), alfainterferón (IFN alfa), beta-interferón (IFN beta) o gamma-interferón (IFN gamma), tales como IFN alfa o IFN beta recombinantes humanos (IFNrh alfa o IFNrh beta), interleucinas, por ejemplo de IL-1 a IL-18 tales como IL-2 o IL-3 como IL-2 o IL-3 recombinantes humanas (ILrh-2 o ILrh-3), proteínas séricas tales como los factores de coagulación II-XIII como el factor VIII, alfa-antitripsina (A1AT), proteína C activada (APC), activadores de plasminógeno tales como el activador de plasminógeno de tipo tisular (APt), tal como human el activador de plasminógeno humano (APth), AT III tal como AT recombinante humana III (ATrh III), mioglobina, albúmina tal como albúmina sérica bovina (BSA), factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de trombocitos (PDGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento derivado de cerebro (BDGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento de células B (BCGF), factor de crecimiento neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factores de crecimiento transformantes tales como TGF alfa o TGF beta, BMP (proteínas morfogenéticas óseas), hormonas de crecimiento tales como hormona de crecimiento humana, factores de necrosis tumorales tales como TNF alfa o TNF beta, somatostatina (péptido), somatotropina, somatomedinas, hemoglobina, hormonas o prohormonas tales como insulina, gonadotropina, hormona estimuladora de melanocitos (alfa-MSH), triptorelina, hormonas hipotalámicas tales como hormones antidiuréticas (ADH) y oxitocina así como hormonas de liberación y hormonas de inhibición de liberación, hormona paratifoidea, hormonas tiroideas tales como tiroxina, tirotropina, tiroliberina, prolactina, calcitonina, glucagón, péptidos similares al glucagón (GLP-1, GLP-2 etc.), exendinas tales como exendina-4, leptina, vasopresina, gastrina, secretina, integrinas, hormonas de glicoproteína (por ejemplo LH, FSH etc.), hormonas estimuladoras de melanósido, lipoproteínas y apolipoproteínas tales como apo-B, apo-E, apo-La, inmunoglobulinas tales como IgG, IgE, IgM, IgA, IgD y fragmentos de las mismas, hirudina, inhibidor de la ruta del factor tisular, proteínas vegetales tales como lectina o ricina, veneno de abeja, veneno de serpiente, inmunotoxinas, antígeno E, inhibidor de alfaproteinasa, alérgeno de ambrosía, melanina, proteínas de oligolisina, proteínas de RGD u opcionalmente receptores correspondientes para una de estas proteínas; o un derivado o fragmento funcional de cualquiera de estas proteínas
o receptores. En una realización particularmente preferida, el principio activo es EPO, en particular EPO oxidada tal como se describe más adelante.
Ejemplos de enzimas incluyen, enzimas específicas de hidratos de carbono, enzimas proteolíticas, oxidasas, oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas, cinasas y ligasas. Ejemplos específicos no limitativos son asparaginasa, arginasa, arginina desaminasa, adenosina desaminasa, glutaminasa, glutaminasa-asparaginasa, fenilalanina, triptofanasa, tirosinasa, superóxido dismutasa (SOD), endotoxinasa, catalasa, peroxidasa, calicreína, tripsina, quimiotripsina, elastasa, termolisina, lipasa, uricasa, adenosina difosfatasa, purina nucleósido fosforilasa, bilirrubina oxidasa, glucosa oxidasa, glucodasa, gluconato oxidasa, galactosidasa, glucocerebrosidasa, glucuronidasa, hialuronidasa, factor tisular, estreptocinasa, urocinase, MAP-cinasas, ADNasas, ARNasas, lactoferrina y derivados o fragmentos funcionales de las mismas.
Según una alternativa de la presente invención, el principio activo es un fármaco de moléculas pequeñas, un péptido y/o una proteína.
Entre otras, deben mencionarse explícitamente las proteínas siguientes: eritropoyetina (EPO) tal como EPO recombinante humana (EPOrh), factores estimuladores de colonias (CSF), tales como G-CSF como G-CSF recombinante humano (G-CSFrh), alfa-interferón (IFN alfa), beta-interferón (IFN beta) o gamma-interferón (IFN gamma) tales como IFN alfa o IFN beta recombinantes humanos (IFNrh alfa o IFNrh beta), proteínas séricas tales como factores de coagulación II-XIII como el factor VII, factor VIII, o factor IX, alfa1-antitripsina (A1AT), proteína C activada (APC), activadores de plasminógeno tales como activador de plasminógeno de tipo tisular (APt), tal como activador de plasminógeno tisular humano (APTh), AT III recombinante humana tal como AT III (ATrh III).
Ejemplos para péptidos incluyen ACTH, adrenomedulina, proteína beta-amiloide, angiotensina I, angiotensina II, péptido natriurético auricular (ANP), fragmentos de anticuerpos, bradicinina, péptido natriurético cerebral de tipo B (BNP), calcitonina factor de liberación de corticotropina (CRF), endorfinas, endotelinas, encefalinas, gastrina, péptido relacionado con gastrina, polipéptido inhibidor gástrico (GIP), péptido de liberación de gastrina (GRP), glucagón, péptidos similares al glucagón, factor de liberación de hormonas de crecimiento (GRF), factor de crecimiento de hepatocitos, insulinas, hormona de liberación de gonadotropina (LH-RH, GnRH), neurocininas, oxitocina, hormona paratifoidea, somatostatina, sustancia P, hormona de liberación de tirotropina (TRH), péptido intestinal vasoactivo (VIP) y vasopresina.
El principio activo se selecciona preferiblemente del grupo compuesto de antibióticos, antidepresivos, antidiabéticos, antidiuréticos, anticolinérgicos, antiarrítmicos, antieméticos, antitusivos, antiepilépticos, antihistaminas, antimicóticos, antisimpatotónicos, antitrombóticos, andrógenos, antiandrógenos, estrógenos, antiestrógenos, antiosteoporóticos, agentes antitumorales, vasodilatadores, otros aagentes antihipertensores, agentes antipiréticos, agentes antiinflamatorios, 1-bloqueantes, citostáticos, inmunosupresores y vitaminas.
Algunos ejemplos adicionales, no restrictivos, de principios activos son albuterol, alendronato, amikazina, ampicilina, amoxicilina, anfotericina B, atenolol, azatioprina, cefaclor, cefadroxilo, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona, cilastatina, cimetidina, ciprofloxacino, clonidina, colistina, cosintropina, cicloserina, daunorubicina, doxorubicina, desmopresina, dihidroergotamina, dobutamina, dopamina, efedrina, epinefrina, ácido s-aminocaproico, ergometrina, esmolol, famotidina, flecainida, ácido fólico, flucitosina, furosemida, ganciclovir, gentamicina, glucagón, hidrazalina, imipenem, isoproterenol, ketamina, liotironina, LHRH, merpatricina, metaraminol, metildopa, metoclopramida, metoprolol, mexiletina, mitomicina, neomicina, netilmicina, nimodipina, nistatina, octreotida, oxitocina, pamidronato, pentamidina, fentolamina, fenilefrina, procainamida, procaína, propranolol, ritodrina, sotalol, teicoplanina, terbutalina, tiamina, tiludronato, tolazolina, trimetoprim, trometamina, tilosina, vancomicina, vasopresina y vinblastina.
Según una alternativa, también puede intentarse usar rifamicina, tetraciclina, espectomicina, estreptomicina o eritromicina como principios activos.
Ejemplos para un oligonucleótido son aptámeros, ADN, ARN, ANP o derivados de los mismos.
En el contexto de la presente invención, el término “hidroxialquilalmidón” (HAS) se refiere a un derivado de almidón que se ha sustituido por al menos un grupo hidroxialquilo. Un hidroxialquilalmidón preferido de la presente invención tiene una constitución según la fórmula (II)
en la que R, R’’ y R’’’ son independientemente hidrógeno, un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado o el grupo 10 -[(CR1R2)mO]n(CR3R4]o-OH
en el que R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupo alquilo, preferiblemente hidrógeno y grupo metilo,
15 m es de 2 a 4, en el que los residuos R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes en los m grupos CR1R2; n es de 0 a 20, preferiblemente de 0 a 4; o es de 0 a 20, preferiblemente de 2 a 4, en el que en el caso de que n = 0, o no es 0, y en el que los residuos R3 y R4 pueden ser iguales o diferentes en los o grupos CR3R4,
20 en el que el residuo HAS” junto con el resto de glucosa terminal constituye la molécula de HAS, es decir la fórmula
(II) muestra una molécula de HAS, cuyo resto de hidrato de carbono terminal se muestra explícitamente, siendo la parte restante de la molécula de almidón HAS”.
En la fórmula (II), se muestra el extremo reductor de la molécula de almidón en la forma no oxidada y se muestra la
25 unidad de sacárido terminal de HAS en la forma de hemiacetal que, dependiendo de por ejemplo el disolvente, puede estar en equilibrio con la forma de aldehído. La abreviatura HAS” tal como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a la molécula de HAS sin la unidad de sacárido terminal en el extremo reductor de la molécula de HAS.
30 El término hidroxialquilalmidón, tal como se usa en la presente invención, no se limita a compuestos en los que el resto de hidrato de carbono terminal comprende grupos hidroxialquilo R’, R” y/o R”’ tal como se representa, por motivos de brevedad, en la fórmula (II), pero también se refiere a compuestos en los que al menos está presente un grupo hidroxialquilo en cualquier sitio, o bien en el resto de hidrato de carbono terminal y/u o bien en la parte restante de la molécula de almidón, HAS”, está sustituido por un grupo hidroxialquilo R’, R” o R’’’.
35 También es posible hidroxialquilalmidón que comprende dos o más grupos hidroxialquilo diferentes.
El al menos un grupo hidroxialquilo comprendido en HAS puede contener uno o más, en particular dos o más grupos hidroxilo. Según una realización preferida, el al menos un grupo hidroxialquilo comprendido en HAS contiene un
40 grupo hidroxilo.
La expresión “hidroxialquilalmidón” también incluye derivados en lo que el grupo alquilo está mono o polisustituido. En este contexto, se prefiere que el grupo alquilo esté sustituido con un halógeno, especialmente flúor, o con un grupo arilo. Además, el grupo hidroxilo de a un grupo hidroxialquilo puede esterificarse o eterificarse.
45 Además, en lugar de alquilo, también pueden usarse grupos alqueno lineales o ramificados, sustituidos o no sustituidos.
El hidroxialquilalmidón es un derivado de éter de almidón. Además de dichos derivados de éter, también pueden
50 usarse otros derivados de almidón en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, son útiles derivados que comprenden grupos hidroxilo esterificados. Estos derivados pueden derivarse por ejemplo de ácidos mono o dicarboxílicos no sustituidos con 2-12 átomos de carbono o de derivados sustituidos de los mismos. Especialmente útiles son los derivados de ácidos monocarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono, especialmente derivados de ácido acético. En este contexto, se prefieren acetil almidón, butiril almidón y propionil almidón.
55 Además, se prefieren los derivados de ácidos dicarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono.
En el caso de los derivados de ácidos dicarboxílicos, es útil que el segundo grupo carboxilo del ácido dicarboxílico también esté esterificado. Además, también son adecuados derivados de ésteres de monoalquilo de ácidos dicarboxílicos en el contexto de la presente invención.
Para los ácidos mono o dicarboxílicos sustituidos, los grupos sustitutos pueden ser preferiblemente iguales a los mencionados anteriormente para los residuos de alquilo sustituidos.
Las técnicas para la esterificación del almidón se conocen en la técnica (véase por ejemplo Klemm D. et al, Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, Nueva York, especialmente el capítulo 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9).
Según una realización preferida de la presente invención, se emplea hidroxialquilalmidón según la fórmula (II) mencionada anteriormente. Las otras estructuras de anillo de sacárido comprendidas en HAS” pueden ser iguales o diferentes del anillo de sacárido descrito explícitamente, con la diferencia de que carecen de un extremo reductor.
En lo que respecta a los residuos R’, R” y R”’ según la fórmula (II) no hay limitaciones específicas. Según una realización preferida, R’, R” y R”’ son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de desde 2 hasta 10 átomos de carbono en el residuo de alquilo correspondiente. Se prefieren el hidrógeno y los grupos hidroxialquilo que tienen de desde 2 hasta 10. Más preferiblemente, el grupo hidroxialquilo tiene desde 2 hasta 6 átomos de carbono, más preferiblemente desde 2 hasta 4 átomos de carbono, e incluso más preferiblemente desde 2 hasta 3 átomos de carbono. En una realización preferida, el hidroxialquilalmidón es hidroxietilalmidón en el que R’, R” y R’’’ son independientemente hidrógeno o un grupo (CH2CH2O)n-H, en el que n es un número entero, preferiblemente 0, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
“Hidroxialquilalmidón”, por tanto, comprende preferiblemente hidroxietilalmidón, hidroxipropilalmidón e hidroxibutilalmidón, prefiriéndose particularmente hidroxietilalmidón e hidroxipropilalmidón y siendo el más preferido hidroxietilalmidón.
El grupo alquilo, aralquilo y/o alcarilo pueden ser lineales o ramificados y estar sustituidos de manera adecuada.
Por tanto, la presente invención también se refiere a un método y a un conjugado tal como se describió anteriormente en los que R’, R” y R’’’ son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado con desde 2 hasta 6 átomos de carbono.
Por tanto, R’, R” y R’’’ preferiblemente pueden ser H, hidroxihexilo, hidroxipentilo, hidroxibutilo, hidroxipropilo tales como 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 2-hidroxiisopropilo, hidroxietilo tal como 2-hidroxietilo, prefiriéndose especialmente hidrógeno y el grupo 2-hidroxietilo.
Por tanto, la presente invención también se refiere a un método y a un conjugado tal como se describió anteriormente en los que R’, R” y R’’’ son independientemente hidrógeno o un grupo 2-hidroxietilo, prefiriéndose especialmente una realización en la que al menos un residuo R’, R” y R’’’ es 2-hidroxietilo.
El hidroxietilalmidón (HES) es el más preferido para todas las realizaciones de la presente invención.
Por tanto, la presente invención se refiere al método y al conjugado tal como se describió anteriormente, en los que el polímero es hidroxietilalmidón y el derivado polimérico es un derivado de hidroxietilalmidón.
El hidroxietilalmidón (HES) es un derivado de amilopectina que se produce de manera natural y se degrada mediante alfa-amilasa en el organismo. HES es un derivado sustituido del polímero de hidratos de carbono amilopectina, que está presente en almidón de maíz a una concentración de hasta el 95% en peso. HES muestra propiedades biológicas ventajosas y se usa como agente de reposición de volemia sanguínea en terapia de hemodilución en hospitales (Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; y Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498).
La amilopectina consiste en restos de glucosa, en los que cadena principal están presentes enlaces alfa-1,4glicosídicos y en los sitios de ramificación se encuentran enlaces alfa-1,6-glicosídicos. Las propiedades físicoquímicas de esta molécula se determina principalmente por el tipo de enlaces glicosídicos. Debido al enlace alfa-1,4glicosídico cortado, se producen estructuras helicoidales con aproximadamente seis monómeros de glucosa por vuelta. Las propiedades físico-químicas, así como las bioquímicas del polímero pueden modificarse a través de sustitución. La introducción de un grupo hidroxietilo puede lograrse a través de hidroxietilación alcalina. Mediante la adaptación de las condiciones de reacción es posible aprovecharse de la diferente reactividad del grupo hidroxilo respectivo en el monómero de glucosa no sustituido con respecto a una hidroxietilación. Debido a este hecho, el experto puede influir en el patrón de sustitución en un grado limitado.
HES se caracteriza principalmente por la distribución de peso molecular y el grado de sustitución. Hay dos posibilidades de descripción del grado de substitución:
1.
El grado de substitución puede describirse en relación con la proporción de monómeros de glucosa sustituidos con respecto a todos los restos de glucosa.
2.
El grado de substitución puede describirse como la sustitución molar, en la que se describe el número de grupos hidroxietilo por resto de glucosa.
En el contexto de la presente invención, el grado de sustitución, indicado como GS, se refiere a la sustitución molar, tal como se describió anteriormente (véase también Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271278, tal como se citó anteriormente, en particular la pág. 273).
Las disoluciones de HES están presentes como composiciones polidispersas, en las que cada molécula difiere de la otra con respecto al grado de polimerización, el número y el patrón de sitios de ramificación, y el patrón de substitución. HES es por tanto una mezcla de compuestos con diferente peso molecular. En consecuencia, una disolución de HES particular se determina por el peso molecular promedio con la ayuda de medios estadísticos. En este contexto, Mn se calcula como la media aritmética dependiendo del número de moléculas. Alternativamente, Mw (o MW), el peso molecular promedio en peso, representa una unidad que depende de la masa del HES.
Preferiblemente, el hidroxialquilalmidón usado en la invención tiene un peso molecular medio (media de peso) de desde 1 hasta 300 kD. El hidroxietilalmidón puede mostrar además una sustitución molar preferida de desde 0,1 hasta 3, preferiblemente de 0,1 a 2, más preferido de 0,1 a 0,9 o de 0,4 a 2, preferiblemente de 0,4 a 1,3, y una razón preferida entre la sustitución C2:C6 en el intervalo de desde 2 hasta 20 con respecto a los grupos hidroxietilo.
El término “peso molecular medio” tal como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere al peso tal como se determina según el método LALLS-(dispersión de luz láser a bajo ángulo)-GPC tal como se describe en Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; y Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498. Para pesos moleculares medios de 10 kD y menores, adicionalmente se llevó a cabo la calibración con un patrón que se había calificado anteriormente mediante LALLS-GPC.
Según una realización preferida de la presente invención, el peso molecular medio de hidroxietilalmidón empleado es desde 1 hasta 300 kD, más preferiblemente desde 2 hasta 200 kD, más preferiblemente desde 10 hasta 150 o de 4 a 130 kD, más preferiblemente de desde 10 hasta 100 kD.
Un ejemplo de HES que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 1 a 300 kD, preferiblemente de 10 a 100 kD es un HES con una sustitución molar de 0,1 a 3, preferiblemente de 0,4 a 1,3, tal como 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 u 1,3, preferiblemente de 0,7 a 1,3, tal como 0,7 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 u 1,3.
Un ejemplo para HES con un peso molecular medio de aproximadamente 130 kD es Voluven® de Fresenius. Voluven® es un coloide artificial empleado, por ejemplo, para reposición de volemia usado en la indicación terapéutica para terapia y profilaxis de hipovolemia. Las características de Voluven® son un peso molecular medio de 130.000 +/- 20.000 D, una sustitución molar de 0,4 y una razón C2:C6 de aproximadamente 9:1.
La presente invención también se refiere a un método y a los conjugados tal como se describió anteriormente, en los que el hidroxialquilalmidón es hidroxietilalmidón que tiene un peso molecular medio desde 10 hasta 150 kD, preferiblemente de desde 10 hasta 100 kD.
Intervalos preferidos del peso molecular medio son, por ejemplo, de 10 a 150 kD, o de 10 a 130 kD, o de 30 a 130 kD, o de 50 a 130 kD, o de 70 a 130 kD, o de 100 a 130 kD, o de 10 a 100 kD, o de 4 a 100 kD, o de 10 a 100 kD, o de 12 a 100 kD, o de 18 a 100 kD, o de 50 a 100 kD, o de 4 a 70 kD, o de 10 a 70 kD, o de 12 a 70 kD, o de 18 a 70 kD, o de 50 a 70 kD, o de 4 a 50 kD o de 10 a 50 kD, o de 12 a 50 kD, o de 18 a 50 kD, o de 4 a 18 kD, o de 10 a 18 kD, o de 12 a 18 kD, o de 4 a 12 kD, o de 10 a 12 kD, o de 4 a 10 kD.
Según realización particularmente preferidas de la presente invención, el peso molecular medio de hidroxietilalmidón empleado está en el intervalo de desde más de 4 kD e inferiores a 150 kD, tales como aproximadamente 10 kD, o en el intervalo de desde 9 hasta 10 kD o desde 10 hasta 11 kD o desde 9 hasta 11 kD, o aproximadamente 12 kD, o en el intervalo de desde 11 hasta 12 kD o desde 12 hasta 13 kD o desde 11 hasta 13 kD, o aproximadamente 15 kD, o en el intervalo de 14 a 15 o desde 15 hasta 16 kD, o aproximadamente 18 kD, o en el intervalo de desde 17 hasta 18 kD o desde 18 hasta 19 kD o desde 17 hasta 19 kD, o aproximadamente 50 kD, o en el intervalo de desde 49 hasta 50 kD o desde 50 hasta 51 kD o desde 49 hasta 51 kD, o aproximadamente 56 kD, o en el intervalo de 55 a 56 kD o desde 56 hasta 57 kD.
Según otra realización particularmente preferida de la presente invención, el peso molecular medio de hidroxietilalmidón empleado está en el intervalo de desde más de 60 kD y hasta 130 kD, tal como aproximadamente 70 kD o en el intervalo de desde 65 hasta 75 kD, o aproximadamente 80 kD o en el intervalo de desde 75 hasta 85 kD, o aproximadamente 90 kD o en el intervalo de desde 85 hasta 95 kD o aproximadamente 100 kD, o en el intervalo de desde 95 hasta 105 kD, o aproximadamente 110 kD o en el intervalo de desde 105 hasta 115 kD, o aproximadamente 120 kD o en el intervalo de 115 a 125 kD o aproximadamente 130 kD o en el intervalo de desde 125 hasta 135 kD.
En cuanto al límite superior de la sustitución molar (GS), también son posibles valores de hasta 3,0 tales como 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 ó 2,0, prefiriéndose valores inferiores a 2,0, prefiriéndose más valores inferiores a 1,5, prefiriéndose todavía más valores inferiores a 1,3 tales como 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 ó 1,3.
Por tanto, intervalos preferidos de la sustitución molar son desde 0,1 hasta 2 o desde 0,1 hasta 1,5 o desde 0,1 hasta 1,3 o desde 0,1 hasta 1,0 o desde 0,1 hasta 0,9 o desde 0,1 hasta 0,8. Intervalos más preferido de la sustitución molar son desde 0,2 hasta 2 o desde 0,2 hasta 1,5 o desde 0,2 hasta 1,0 o desde 0,2 hasta 0,9 o desde 0,2 hasta 0,8. Intervalos todavía más preferidos de la sustitución molar son desde 0,3 hasta 2 o desde 0,3 hasta 1,5
o desde 0,3 hasta 1,0 o desde 0,3 hasta 0,9 o desde 0,3 hasta 0,8. Intervalos incluso más preferidos de la sustitución molar son desde 0,4 hasta 2 o desde 0,4 hasta 1,5 o desde de 0,4 hasta 1,3, o desde 0,4 hasta 1,0 o desde 0,4 hasta 0,9 o desde 0,4 hasta 0,8.
En lo que respecta a la sustitución molar (GS), GS es preferiblemente al menos 0,1, más preferiblemente al menos 0,2, más preferiblemente al menos 0,4 y más preferiblemente al menos 0,7. Intervalos preferidos de GS son desde 0,1 hasta 3, preferiblemente de 0,1 a 2, más preferido de 0,1 a 1,3, más preferido de 0,1 a 0,9, más preferiblemente desde 0,1 hasta 0,8, más preferiblemente desde 0,2 hasta 0,8, más preferiblemente desde 0,3 hasta 0,8 e incluso más preferiblemente desde 0,4 hasta 0,8, todavía más preferiblemente desde 0,1 hasta 0,7, más preferiblemente desde 0,2 hasta 0,7, más preferiblemente desde 0,3 hasta 0,7 y más preferiblemente desde 0,4 hasta 0,7. Valores particularmente preferidos de GS son, por ejemplo, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2 ó 1,3, siendo más preferidos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ó 0,8, siendo incluso más preferidos 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ó 0,8, siendo todavía más preferidos 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o 0,8 y siendo particularmente preferidos, por ejemplo 0,4 ó 0,5 y 0,7 ó 0,8.
En el contexto de la presente invención, un valor dado de la sustitución molar tal como 1,3 puede ser el valor exacto
o puede entenderse que está en un intervalo de desde 1,25 hasta 1,34, o 1,0 puede ser el valor exacto o puede entenderse que está en un intervalo de desde 0,95 hasta 1,04, o 0,9 puede ser el valor exacto o puede entenderse que está en un intervalo de desde 0,85 hasta 0,94 o 0,8 puede ser el valor exacto o puede entenderse que está en un intervalo de desde 0,75 hasta 0,84. Por tanto, por ejemplo, un valor dado de 0,1 puede ser el valor exacto de 0,1
o estar en el intervalo de desde 0,05 hasta 0,14, un valor dado de 0,4 puede ser el valor exacto de 0,4 o estar en el intervalo de desde 0,35 hasta 0,44, o un valor dado de 0,7 puede ser el valor exacto de 0,7 o estar en el intervalo de desde 0,65 hasta 0,74.
Combinaciones particularmente preferidas de peso molecular del hidroxialquilalmidón, preferiblemente hidroxietilalmidón, y su sustitución molar GS son, por ejemplo, 10 kD y 0,4 ó 10 kD y 0,7 ó 12 kD y 0,4 ó 12 kD y 0,7 kD y 0,4 ó 15 kD y 0,7 ó 18 kD y 0,4 ó 18 kD y 0,7 ó 50 kD y 0,4 ó 50 kD y 0,7 ó 56 kD y 0,4 y 56 kD y 0,7 ó 70 KD y 0,4 ó 70 kD y0,7, ó 100 kD y 0,4 ó 100 kD y 0,7 ó 130 kD y 0,4 ó 130 kD y0,7.
En lo que respecta a la razón de sustitución C2:C6, dicha substitución está preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 20, más preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 15 e incluso más preferiblemente en el intervalo de desde 3 hasta 12.
Según una realización adicional de la presente invención, también pueden emplearse mezclas de hidroxietilalmidones que tienen diferentes pesos moleculares medios y/o diferente sustitución molar y/o diferentes razones de sustitución C2:C6. Por tanto, pueden emplearse mezclas de hidroxietilalmidones que tienen diferentes pesos moleculares medios y diferente sustitución molar y diferentes razones de sustitución C2:C6, o que tienen diferentes pesos moleculares medios y diferente sustitución molar y la misma o aproximadamente la misma razón de sustitución C2:C6, o que tienen diferentes pesos moleculares medios y la misma o aproximadamente la misma sustitución molar y diferentes razones de sustitución C2:C6, o que tienen el mismo o aproximadamente el mismo peso molecular medio y diferente sustitución molar y diferentes razones de sustitución C2:C6, o que tienen diferentes pesos moleculares medios y la misma o aproximadamente la misma sustitución molar y la misma o aproximadamente la misma razón de sustitución C2:C6, o que tienen el mismo o aproximadamente el mismo peso molecular medio y diferente sustitución molar y la misma o aproximadamente la misma razón de sustitución C2:C6, o que tienen el mismo o aproximadamente el mismo peso molecular medio y la misma o aproximadamente la misma sustitución molar y diferentes razones de sustitución C2:C6, o que tienen aproximadamente el mismo peso molecular medio y aproximadamente la misma sustitución molar y aproximadamente la misma razón de sustitución C2:C6.
En diferentes conjugados y/o diferentes métodos según la presente invención, pueden emplearse diferentes hidroxialquilalmidones, preferiblemente diferentes hidroxietilalmidones y/o diferentes mezclas de hidroxialquilalmidón, preferiblemente diferentes mezclas de hidroxietilalmidón.
En una realización preferida, el hidroxialquilalmidón o derivado del mismo comprende de 1 a 100, preferiblemente de 1 a 15, en particular 1 grupo(s) aldehído, grupo(s) ceto y/o grupos(s) hemiacetal o en los que el hidroxialquilalmidón o derivado del mismo comprende de 1 a 100, preferiblemente de 1 a 15, en particular 1 grupo(s) alfa-SH-beta-amino.
En otra realización preferida, el principio activo comprende de 1 a 15, preferiblemente de 1 a 8, en particular 1 grupo(s) aldehído, grupo(s) ceto y/o grupos(s) hemiacetal o en los que el principio activo comprende de 1 a 15, preferiblemente de 1 a 8, en particular 1 grupo(s) alfa-SH-beta-amino.
El hidroxialquilalmidón, preferiblemente hidroxietilalmidón, que comprende el al menos un grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o grupo alfa-SH-beta-amino puede proporcionarse mediante cualquier método adecuado.
En una realización preferida, el derivado de hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o dicho grupo alfa-SH-beta-amino se obtiene mediante un método que comprende
(a)(2) hacer reaccionar el hidroxialquilalmidón con al menos un compuesto, al menos bifuncional, comprendiendo dicho compuesto dos grupos funcionales M1 y Q, haciéndose reaccionar un grupo funcional M1 con el hidroxialquilalmidón y siendo un grupo funcional Q
(i)
un grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o un grupo alfa-SH-beta-amino; o
(ii)
un grupo funcional que se modifica químicamente para dar el grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o un grupo alfa-SH-beta-amino.
En una realización preferida de (a)(2), el grupo funcional M1 se selecciona del grupo que consiste en un grupo carboxilo, un grupo carboxilo reactivo, anhídrido de ácido carboxílico, halogenuro de ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato; cloroformiatos, y grupos epóxido y el grupo funcional Q es un grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal, grupo alfa-SH-beta-amino, o un grupo funcional que se modifica químicamente para dar un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal, o un grupo alfa-SH-beta-amino.
Según una realización de la presente invención, el método según (a)(2) puede comprender que el hidroxialquilalmidón se hace reaccionar a través del extremo reductor opcionalmente oxidado del hidroxialquilalmidón con el al menos un compuesto bifuncional que comprende al menos dos grupos funcionales M1 y Q.
La expresión de que el hidroxialquilalmidón, preferiblemente hidroxietilalmidón se hace reaccionar “a través del extremo reductor opcionalmente oxidado”, tal como se usa en el contexto de la presente invención, puede referirse a un procedimiento según el cual el hidroxialquilalmidón se hace reacción predominantemente a través de su extremo reductor opcionalmente oxidado.
Esta expresión “predominantemente a través de su extremo reductor opcionalmente oxidado” se refiere a procedimientos según los cuales estadísticamente más del 50%, preferiblemente al menos el 55%, más preferiblemente al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 65%, más preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, y todavía más preferiblemente al menos el 95%, tal como el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de las moléculas de hidroxialquilalmidón empleadas para una reacción dada se hacen reaccionar a través de al menos un extremo reductor opcionalmente oxidado por molécula de hidroxialquilalmidón, en los que una molécula de hidroxialquilalmidón dada que se hace reaccionar a través de al menos un extremo reductor puede hacerse reaccionar en la misma reacción dada a través al menos un grupo funcional adecuado adicional que está comprendido en dicho molécula de hidroxialquilalmidón y que no es un extremo reductor. Si se hace(n) reaccionar una o más molécula(s) de hidroxialquilalmidón a través de al menos un extremo reductor y simultáneamente a través de al menos un grupo funcional adecuado adicional que está comprendido en esta (estas) molécula(s) de hidroxialquilalmidón y que no es un extremo reductor, de manera preferible estadísticamente más del 50%, preferiblemente al menos el 55%, más preferiblemente al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 65%, más preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, y todavía más preferiblemente al menos el 95% tal como el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de todos los grupos funcionales que han reaccionado de esas moléculas de hidroxialquilalmidón, incluyendo dichos grupos funcionales los extremos reductores, son extremos reductores.
El término “extremo reductor” tal como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere al grupo aldehído terminal de un molécula de hidroxialquilalmidón que puede estar presente como grupo aldehído y/o como forma de hemiacetal correspondiente. En caso de que el extremo reductor se oxide, el grupo aldehído o hemiacetal está en la forma de un grupo carboxilo y/o de la lactona correspondiente.
Según una realización de la presente invención, el método según (a)(2) puede comprender por tanto oxidar el hidroxialquilalmidón en su extremo reductor para dar hidroxialquilalmidón según la fórmula (IIIa)
y/o según la fórmula (IIIb)
en las que R’, R” y R’’’ son tal como se definen para la fórmula II, como hacer reaccionar el hidroxialquilalmidón oxidado en su extremo reductor con al menos un compuesto adecuado para dar un hidroxialquilalmidón funcionalizado con aldehído, ceto, hemiacetal o alfa-SH-beta-amino.
La oxidación del hidroxialquilalmidón, preferiblemente hidroxietilalmidón, puede llevarse a cabo según cualquier método o combinación de métodos que dé como resultado compuestos que tienen las estructuras (IIIa) y/o (IIIb) mencionadas anteriormente. Aunque la oxidación puede llevarse a cabo según cualquier método o métodos adecuado(s) que dé(n) como resultado el extremo reductor oxidado del hidroxialquilalmidón, se lleva a cabo preferiblemente usando una disolución alcalina de yodo tal como se describe, por ejemplo, en el documento DE 196 28 705 A1 (ejemplo A, columna 9, líneas 6 a 24)
Según (a)(2) se prefiere que el hidroxialquilalmidón, opcionalmente oxidado en su extremo reductor, se haga reaccionar con un compuesto al menos bifuncional que comprende un grupo funcional M1 que se hace reaccionar con el hidroxialquilalmidón, preferiblemente en el extremo reductor opcionalmente oxidado, y un grupo funcional Q que es un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal o un grupo alfa-SH-beta-amino o un grupo funcional que puede modificarse para dar cualquiera de esos grupos.
Como grupo funcional M1 del compuesto al menos bifuncional que se hace reaccionar con el hidroxialquilalmidón, va a mencionarse especialmente un grupo que tiene la estructura R*-NH-, en la que R* es hidrógeno o un residuo alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo, en la que el residuo cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo puede unirse directamente al grupo NH o, según otra realización, puede unirse mediante un puente de oxígeno al grupo NH. Los residuos de alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo pueden estar sustituidos de manera adecuada. Como sustituyentes preferidos, pueden mencionarse halógenos tales como F, Cl o Br. Residuos R* especialmente preferidos son hidrógeno, grupos alquilo y alcoxilo, e incluso más preferidos son hidrógeno y grupos alquilo y alcoxilo no sustituidos.
Entre los grupos alquilo y alcoxilo, se prefieren grupos con 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 átomos de C. Más preferidos son grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxilo, etoxilo, propoxilo e isopropoxilo. Especialmente preferidos son metilo, etilo, metoxilo, etoxilo, y se da preferencia particular a metilo o metoxilo.
Según otra realización de la presente invención, el grupo funcional M1 tiene la estructura R*-NHR**- en la que R** preferiblemente comprende la unidad estructural -NH- y/o la unidad estructural -(C=G)-, en la que G es O o S, y/o la unidad estructural -SO2-. Ejemplos específicos para el grupo funcional R** son
y
5
en las que, si G está presente dos veces, es independientemente O o S.
10
Por tanto, la presente invención también se refiere a un método y a un conjugado tal como se mencionó anteriormente, en los que el grupo funcional M1 se selecciona del grupo que consiste en
en las que G es O o S y, si están presentes dos veces, independientemente O o S, y R’ es metilo.
Según una realización particularmente preferida de la presente invención, el grupo funcional M1 es un grupo amino 20 NH2.
Con respecto al caso en el que el grupo Q es un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal o un grupo alfa-SH-beta-amino o un grupo funcional que se ha modificado químicamente para dar uno de estos grupos, han de mencionarse los siguientes grupos funcionales, entre otros:
-
dobles enlaces C-C o triples enlaces C-C o enlaces aromáticos C-C;
-
el grupo tio o el grupo hidroxilo; 30 - hidrazida del ácido alquilsulfónico, hidrazida del ácido arilsulfónico;
- 1,2-dioles;
-
1,2 amino-tioalcoholes; 35
-
azidas;
-
1,2-aminoalcoholes;
40 - el grupo amino -NH2 o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad estructural -NH-, tales como grupos aminoalquilo, grupo aminoarilo, grupos aminoaralquilo, o grupos alcarilamino;
-
el grupo hidroxilamino -O-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que comprenden la unidad estructural -O-NH-,
tales como grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino, o grupos 45 hidroxialcarilamino;
-
grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino o grupos alcariloxiamino, comprendiendo cada uno la unidad estructural -NH-O-;
50 - residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M, en el que G es O o S, y M es, por ejemplo,
--
-OH o -SH; -- un grupo alcoxilo, un grupo ariloxilo, un grupo aralquiloxilo o un grupo alcariloxilo; 5 -- un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio o un grupo alcariltio; --un grupo alquilcarboniloxilo, un grupo arilcarboniloxilo, un grupo aralquilcarboniloxilo, un grupo alcarilcarboniloxilo; 10 -- ésteres activados tales como ésteres de hidroxilaminas que tienen estructura de imida tales como Nhidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N en la que N es parte de un compuesto de heteroarilo o, con G = O y Q ausente, tales como compuestos de ariloxilo con un residuo de arilo sustituido tal como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo;
15 en lo que Q está ausente o NH o un heteroátomo tal como S u O; - -NH-NH2, o -NH-NH-; - -NO2;
-
el grupo nitrilo;
-
grupos carbonilo tales como el grupo aldehído o el grupo ceto; 25 - el grupo carboxilo;
- el grupo -N=C=O o el grupo -N=C=S;
-
grupos de haluro de vinilo tales como el grupo yoduro de vinilo o bromuro de vinilo o triflato; 30 - -C:C-H; - -(C=NH2Cl)-O-alquilo
35 - grupos -(C=O)-CH2-Hal en los que Hal es Cl, Br o I; - -CH=CH-SO2-;
-
un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-; 40
-
el grupo
45 - el grupo
En una realización preferida del método de esta invención, el grupo funcional M1 se hace reaccionar con un grupo
50 OH en el hidroxialquilalmidón (o el extremo reductor opcionalmente oxidado o no oxidado del hidroxialquilalmidón). El grupo funcional M1 en esta realización es preferiblemente un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo y el grupo funcional Q es un grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal, comprendiendo en particular el compuesto bifuncional M1 y Q se selecciona del grupo que consiste en ácido formilbenzoico, éster pentafluorofenílico del ácido 4-formilbenzoico, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 4-folmilbenzoico, ácido 4-(4-formil-3,5
55 dimetoxifenoxi)butírico y anhídrido de ácido 4-formilbenzoico, o un compuesto biocompatible seleccionado del grupo que consiste en ácidos alfa-ceto carboxílicos, ácidos neuramínicos o derivados de los mismos y fosfato de piridoxal.
En lo que se refiere a ácidos alfa-ceto carboxílicos, estos son preferiblemente ácidos alfa-ceto carboxílicos derivados de aminoácido y en la mayoría de los casos pueden encontrarse en el cuerpo humano. Los ácidos alfa-ceto carboxílicos preferidos derivados de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en ceto-valina, ceto-leucina, ceto-isoleucina y ceto-alanina. En una realización preferida del método de esta invención, el grupo carboxilo de los ácidos alfa-ceto carboxílicos se hace reaccionar con un grupo OH en el hidroxialquilalmidón (el extremo reductor opcionalmente oxidado o no oxidado del hidroxialquilalmidón) o se hace reaccionar con el grupo Q del hidroxialquilalmidón que es un grupo amino. El grupo ceto libre restante del ácido alfa-ceto carboxílico puede hacerse reaccionar entonces para formar la tiazolidina.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método según (a)(2)(i) o (a)(2)(ii), en el que el hidroxialquilalmidón se hace reaccionar con un ácido alfa-ceto carboxílico.
En lo que se refiere a los ácidos neuramínicos o siálicos o derivados de los mismos, estos son preferiblemente biocompatibles, en particular son azúcares encontrados en el cuerpo humano, que están N- y/u O-acetilados. En una realización preferida, los ácidos neuramínicos o ácidos siálicos son ácidos N-acetil-neurámicos. Estos compuestos muestran una rigidez deseada debido a la estructura de piranosa con el fin de cumplir la función como moléculas espaciadoras. Por otra parte, puede ser posible introducir un grupo aldehído en estos compuestos unidos a través de oxidación selectiva. Los ácidos siálicos se encuentran en el cuerpo humano, por ejemplo como monosacáridos terminales en cadenas de glicano de proteínas glicosiladas.
En una realización preferida, el ácido siálico puede oxidarse selectivamente a un grupo aldehído.
Los métodos para oxidar selectivamente ácidos siálicos o ácidos neurámicos se conocen en la técnica, por ejemplo de L.W. Jaques, B.F. Riesco, W. Weltner, Carbohydrate Research, 83 (1980), 21 - 32 y T. Masuda, S. Shibuya, M. Arai, S. Yoshida, T. Tomozawa, A. Ohno, M. Yamashita, T. Honda, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13 (2003), 669 - 673. Preferiblemente, la oxidación del ácido siálico puede realizarse antes de la reacción con hidroxialquilalmidón.
El ácido siálico opcionalmente oxidado puede hacerse reaccionar entonces a través de su grupo de ácido carboxílico con el hidroxialquilalmidón. En una realización preferida del método de esta invención, el grupo carboxilo del ácido siálico oxidado se hace reaccionar con un grupo OH en el hidroxialquilalmidón o el extremo reductor opcionalmente oxidado o no oxidado del hidroxialquilalmidón o se hace reaccionar con el grupo Q del hidroxialquilalmidón que es un grupo amino. El grupo carbonilo estante del ácido siálico oxidado puede hacerse reaccionar entonces para formar la tiazolidina.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método según (a)(2)(i) o (a)(2)(ii), en el que el hidroxialquilalmidón se hace reaccionar con un ácido siálico oxidado.
En lo que se refiere al fosfato de piridoxal (PyP), se trata de un compuesto bifuncional altamente biocompatible y también se denomina vitamina B6. PyP es una coenzima que participa en transaminaciones, descarboxilaciones, racemizaciones y numerosas modificaciones de cadenas laterales de aminoácidos. Todas las enzimas que requieren PyP actúan a través de la formación de una base de Schiff entre el aminoácido y la coenzima.
En una realización preferida del método de esta invención, el grupo fosfato del PyP o bien se hace reaccionar con un grupo OH en el hidroxialquilalmidón o el extremo reductor opcionalmente oxidado o no oxidado del hidroxialquilalmidón formando un grupo fosfato o bien se hace reaccionar con el grupo Q del hidroxialquilalmidón que es un grupo amino formando una fosforamida. El grupo carbonilo restante de PyP puede hacerse reaccionar entonces para formar la tiazolidina.
En el caso de PyP, el grupo funcional del hidroxialquilalmidón se introduce preferiblemente en el hidroxialquilalmidón mediante el uso de un compuesto de diamino tal como se describió anteriormente.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método según (a)(2)(i) o (a)(2)(ii), en el que el hidroxialquilalmidón se hace reaccionar con fosfato de piridoxal.
En una realización preferida en (a)(2)(i), el grupo funcional M1 se selecciona del grupo que consiste en un grupo carboxilo, un grupo carboxilo reactivo, anhídrido de ácido carboxílico, halogenuro de ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, éster del ácido clorofórmico, y grupos epóxido y el grupo funcional Q es un grupo aldehído, grupo ceto
o grupo hemiacetal, haciéndose reaccionar el grupo funcional M1 con grupos OH en el hidroxialquilalmidón.
En una realización preferida en (a)(2)(i), el grupo funcional M1 se selecciona del grupo que consiste en un grupo amino y un grupo alfa-SH-beta-amino y el grupo funcional Q es un grupo alfa-SH-beta-amino, haciéndose reaccionar en particular el grupo funcional M1 con el extremo reductor opcionalmente oxidado del hidroxialquilalmidón.
En una realización preferida en (a)(2)(i), el hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino se obtiene mediante un método que comprende hacer reaccionar hidroxialquilalmidón en el extremo reductor opcionalmente oxidado con un compuesto que comprende un grupo funcional M1 y un grupo funcional Q que es un grupo alfa-SH-beta-amino, comprendiendo en particular el compuesto M1 y el grupo alfa-SH-beta-amino es 1,3diamino-2-tiopropano o 2,3-diamino-1-tiopropano.
En una realización preferida en (a)(2)(ii), el compuesto al menos bifuncional comprende M1 que es un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo y Q que es un grupo alfa-SH-beta-amino protegido, seleccionándose en particular el compuesto al menos bifuncional del grupo que consiste en D-, L-PG1-Cys(PG2)-OH, o una mezcla racémica del mismo, y su éster activo, en el que PG1 puede ser cualquier grupo protector adecuado para un grupo amino, seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en terc-butiloxicarbonilo (Boc) o 9fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), y PG2 puede ser cualquier grupo protector adecuado para un grupo tiol, seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en tritilo (Trt), p-metoxitritilo (Mmt) S-terc-butiltio (S-t-Bu) y acetamidometilo (Acm).
Según (a)(2)(ii), el grupo funcional Q es un grupo que se modifica adicionalmente para dar un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal o un grupo alfa-SH-beta-amino. Según esta realización, el derivado de hidroxialquilalmidón que resulta de la reacción de hidroxialquilalmidón, opcionalmente oxidado en su extremo reductor, con el compuesto al menos bifuncional, se hace reaccionar con un compuesto adicional al menos bifuncional que comprende un grupo funcional que se hace reaccionar con el grupo funcional Q del derivado de hidroxialquilalmidón.
En el caso preferido de (a)(2)(ii), tanto M1 como Q son un grupo amino -NH2, M1 y Q pueden estar separados mediante cualquier molécula espaciadora adecuada. Entre otros, la molécula espaciadora puede ser un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico, opcionalmente sustituido. Generalmente, el residuo hidrocarbonado tiene desde 1 hasta 40, preferiblemente desde 1 hasta 20, más preferiblemente desde 2 hasta 10, más preferiblemente desde 2 hasta 6 y de manera especialmente preferible desde 2 hasta 4 átomos de carbono. Si están presentes heteroátomos, el grupo de separación comprende generalmente desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 8 y de manera especialmente preferible desde 1 hasta 4 heteroátomos. El residuo hidrocarbonado puede comprender una cadena de alquilo opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene, por ejemplo, desde 5 hasta 7 átomos de carbono, o puede ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo en el que la parte de alquilo puede ser un grupo alquilo lineal y/o cíclico. Según una realización incluso más preferida, el residuo hidrocarbonado es una cadena del alquilo de desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 2 hasta 10, más preferiblemente desde 2 hasta 6, y de manera especialmente preferible desde 2 hasta 4 átomos de carbono.
En una realización del método de la invención según (a)(2)(ii), se prefiere que el compuesto al menos bifuncional que comprende M1 y Q sea un diaminoalcano opcionalmente sustituido que tiene desde 1 hasta 20 átomos de carbono, seleccionándose preferiblemente un compuesto del grupo que consiste en 1,2-diaminoetano, 1,3diaminopropano y 1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano, 1,6-diaminohexano, 1,7-diaminoheptano, 1,8diaminooctano, 1,9-diaminononano, 1,10-diaminodecano, 1,11-diaminoundecano, 1,12-diaminododecano, 1,13diaminotridecano, 1,14-diaminotetradecano, 1,15-diaminopentadecano, 1,16-diaminohexadecano, 1,17diaminoheptadecano, 1,18-diaminooctadecano, 1,19-diaminononadecano y 1,20-diaminoeicosano o un compuesto que tiene la fórmula
H2N-[(CR1’R2’)pO]q[CR3’R4’]r-NH2
en la que R1’, R2’, R3’ y R4’ se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupo alquilo, preferiblemente hidrógeno y grupo metilo, p es de 2 a 4, en la que los residuos R1’ y R2’ pueden ser iguales o diferentes en los p grupos CR1’R2’, q es de 0 a 20, preferiblemente de 0 a 10; r es de 0 a 20, preferiblemente de 2 a 4, en la que en caso de que q = 0, r no es 0, y en la que los residuos R3’ y R4’ pueden ser iguales o diferentes en los r grupos CR3’R4’.
Una realización preferida de la presente invención también se refiere a un método tal como se describió anteriormente, en el que el hidroxialquilalmidón se hace reaccionar con un compuesto bifuncional que puede seleccionarse del grupo que consiste en 1,2-diaminoetano, 1,3-diaminopropano y 1,4-diaminobutano, 1,5diaminopentano, 1,6-diaminohexano, 1,7-diaminoheptano, 1,8-diaminooctano, 1,9-diaminononano, 1,10diaminodecano, 1,11-diaminoundecano, 1,12-diaminododecano, 1,13-diaminotridecano, 1,14-diaminotetradecano, 1,15-diaminopentadecano, 1,16-diaminohexadecano, 1,17-diaminoheptadecano, 1,18-diaminooctadecano, 1,19diaminononadecano y 1,20-diaminoeicosano o un compuesto que tiene la fórmula
H2N-[(CR1’R2’)pO]q[CR3’R4’]r-NH2
en la que R1’, R2’, R3’, y R4’ se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupo alquilo, preferiblemente hidrógeno y grupo metilo, p es de 2 a 4, en la que los residuos R1’ y R2’ pueden ser iguales o diferentes en los p grupos CR1’R2’, q es de 0 a 20, preferiblemente de 0 a 4, y r es de 0 a 20, preferiblemente de 2 a 4, en la que en caso de que q = 0, r no es 0, y en la que los residuos R3’ y R4’ pueden ser iguales o diferentes en los r grupos CR3’R4’, en particular 1,4-diaminobutano, para dar un amino funcionalizado derivado de hidroxialquilalmidón y este amino funcionalizado derivado de hidroxialquilalmidón se hace reaccionar adicionalmente con un compuesto al menos bifuncional que contiene un grupo funcional reactivo con el grupo amino del hidroxialquilalmidón funcionalizado con amino y siendo un grupo funcional al menos un grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o grupo alfa-SH-beta-amino. Este compuesto bifuncional adicional se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en ácido formilbenzoico, éster pentafluorofenílico del ácido 4-formilbenzoico, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 4-folmilbenzoico, ácido 4-(4-formil-3,5-dimetoxifenoxi)butírico y anhídrido de ácido 4-formilbenzoico o un compuesto biocompatible seleccionado del grupo que consiste en ácidos alfa-ceto carboxílicos, ácidos neuramínicos
o derivados de los mismos y fosfato de piridoxal.
En otra realización del método en (a)(2)(ii), el hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino se obtiene mediante un método que comprende oxidar opcionalmente el hidroxialquilalmidón en su extremo reductor, hacer reaccionar el extremo reductor oxidado o no oxidado con un grupo funcional M1 de un compuesto que comprende, además de M1, un grupo funcional Q adicional, para dar un primer derivado de hidroxialquilalmidón, y hacer reaccionar el grupo funcional Q del primer derivado de hidroxialquilalmidón con un grupo funcional V de un compuesto que comprende, además de V, un grupo alfa-SH-beta-amino opcionalmente protegido, para dar el derivado de hidroxialquilalmidón funcionalizado con alfa-SH-beta amino opcionalmente protegido. Los grupos funcionales M1 y Q son preferiblemente tal como se describió anteriormente.
En una realización preferida, el compuesto que comprende V y el grupo alfa-SH-beta-amino opcionalmente protegido es cisteína o un derivado del mismo, siendo V un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo, preferiblemente un éster reactivo o un anhídrido de ácido carboxílico.
Preferiblemente, en (a)(2)(ii), se hace reaccionar hidroxialquilalmidón en su forma no oxidada con un compuesto bifuncional que tiene un grupo amino M1 y un grupo amino Q mediante aminación reductora. En particular, el compuesto bifuncional puede seleccionarse del grupo que consiste en aminas primarias, amoniaco, 1,2diaminoetano, 1,3-diaminopropano, y 1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano, 1,6-diaminohexano, 1,7diaminoheptano, 1,8-diaminooctano, 1,9-diaminononano, 1,10-diaminodecano, 1,11-diaminoundecano, 1,12diaminododecano, 1,13-diaminotridecano, 1,14-diaminotetradecano, 1,15-diaminopentadecano, 1,16diaminohexadecano, 1,17-diaminoheptadecano, 1,18-diaminooctadecano, 1,19-diaminononadecano y 1,20diaminoeicosano o un compuesto que tiene la fórmula
H2N-[(CR1’R2’)pO]q[CR3’R4’]r-NH2
en la que R1’, R2’, R3’ y R4’ se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupo alquilo, preferiblemente hidrógeno y grupo metilo, p es de 2 a 4, en la que los residuos R1’ y R2’ pueden ser iguales o diferentes en los p grupos CR1’R2’, q es de 0 a 20, preferiblemente de 0 a 4, y r es de 0 a 20, preferiblemente de 2 a 4, en la que en caso de que q = 0, r no es 0, y en la que los residuos R3’ y R4’ pueden ser iguales o diferentes en los r grupos CR3’R4’, en particular 1,4 diaminobutano.
Preferiblemente, en (a)(2)(ii), se hace reaccionar el hidroxialquilalmidón oxidado en su extremo reductor con un compuesto bifuncional que tiene un grupo amino M1 y un grupo amino Q mediante una reacción de apertura del anillo de lactona. En particular, el compuesto bifuncional puede seleccionarse del grupo que consiste en 1,2diaminoetano, 1,3-diaminopropano y 1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano, 1,6-diaminohexano, 1,7diaminoheptano, 1,8-diaminooctano, 1,9-diaminononano, 1,10-diaminodecano, 1,11-diaminoundecano, 1,12diaminododecano, 1,13-diaminotridecano, 1,14-diaminotetradecano, 1,15-diaminopentadecano, 1,16diaminohexadecano, 1,17-diaminoheptadecano, 1,18-diaminooctadecano, 1,19-diaminononadecano y 1,20diaminoeicosano o un compuesto que tiene la fórmula
H2N-[(CR1’R2’)pO]q[CR3’R4’]r-NH2
en la que R1’, R2’, R3’ y R4’ se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupo alquilo, preferiblemente hidrógeno y grupo metilo, p es de 2 a 4, en la que los residuos R1’ y R2’ pueden ser iguales o diferentes en los p grupos CR1’R2’, q es de 0 a 20, preferiblemente de 0 a 4, y r es de 0 a 20, preferiblemente de 2 a 4, en la que en caso de que q = 0, r no es 0, y en la que ser los residuos R3’ y R4’ pueden ser iguales o diferentes en los r grupos CR3’R4’, en particular 1,4 diaminobutano.
Preferiblemente, en (a)(2)(ii), se hace reaccionar en primer lugar el hidroxialquilalmidón con un compuesto bifuncional que tiene un grupo amino Q, preparado preferiblemente tal como se describió anteriormente, y el hidroxialquilalmidón funcionarizado con amino obtenido se hace reaccionar adicionalmente con un compuesto bifuncional que tiene un grupo carboxílico activado y un grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal.
En una realización particularmente preferida, el método de la invención en (a)(2)(ii) comprende hacer reaccionar el hidroxialquilalmidón preferiblemente oxidado con un compuesto que tiene un grupo amino M1 y un grupo amino Q, en particular un compuesto de diaminoalquilo, especialmente 1,4-diaminobutano y luego hacer reaccionar el hidroxialquilalmidón funcionalizado con amino con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en cisteína opcionalmente protegida y ácido 4-formilbenzoico.
El principio activo que comprende el al menos un grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o grupo alfa-SHbeta-amino puede proporcionarse mediante cualquier método adecuado.
En una realización preferida, el principio activo, preferiblemente una proteína, péptido, péptido sintético u oligonucleótido opcionalmente modificado, que comprende dicho grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o dicho grupo alfa-SH-beta-amino se obtiene mediante un método que comprende
(b)(1) introducir al menos un grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o al menos un grupo alfa-SH-beta-amino en el principio activo durante su preparación o mediante modificación química, o
(b)(2) hacer reaccionar el principio activo con un compuesto al menos bifuncional, comprendiendo dicho compuesto dos grupos funcionales M2 y Q, haciéndose reaccionar un grupo funcional M2 con el principio activo y siendo un grupo funcional Q
(i)
un grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o un grupo alfa-SH-beta-amino; o
(ii)
un grupo funcional que se modifica químicamente para dar el grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o un grupo alfa-SH-beta-amino.
Preferiblemente en (b)(1), el principio activo es una proteína o péptido que se preparó mediante síntesis orgánica, producido preferiblemente usando una resina de síntesis, permitiendo obtener una proteína o péptido funcionalizado con aldehído, funcionalizado con ceto, funcionalizado con hemiacetal o funcionalizado con alfa-SH-beta-amino, o en el que en (b)(1), el principio activo es una proteína o péptido que se produjo usando un vector de expresión que conduce a una proteína o péptido funcionalizado con aldehído, funcionalizado con ceto, funcionalizado con hemiacetal o funcionalizado con alfa-SH-beta-amino, o en el que en (b)(1), el principio activo es una proteína o un péptido y estando sustituida la estructura principal de la proteína o péptido con un grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o grupo alfa-SH-beta-amino, o en el que en (b)(1), el principio activo es una proteína o un péptido donde dicho grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o dicho grupo alfa-SH-beta-amino se une directamente a la estructura principal de la proteína o péptido o es parte de una cadena lateral de la estructura principal.
En una realización preferida (b)(1), el principio activo se obtiene mediante modificación del principio activo, en particular de una proteína o un péptido mediante oxidación con el fin de introducir un grupo aldehído.
En una realización preferida, el principio activo es una proteína o péptido y el grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal está comprendido en un resto de hidrato de carbono del polipéptido, en particular en el que el resto de hidrato de carbono se selecciona del grupo que consiste en hidroxialdehídos, hidroxicetonas y modificaciones químicas de los mismos. El resto de hidrato de carbono puede ser un derivado de un resto de hidrato de carbono que se produce de manera natural y se selecciona del grupo que consiste en glucosa, galactosa, manosa y ácido siálico, que está opcionalmente oxidado por vía química o enzimática, preferiblemente un residuo de galactosa oxidada o de ácido siálico oxidado de una cadena lateral de hidrato de carbono, más preferiblemente el residuo de galactosa o ácido siálico terminal de una cadena lateral de hidrato de carbono, realizándose la oxidación de un resto de hidrato de carbono terminal preferiblemente o bien por vía enzimática o bien por vía química, llevándose a cabo la oxidación química preferiblemente usando un peryodato.
En una realización preferida, el resto de hidrato de carbono es un derivado de un resto de hidrato de carbono que se produce de manera natural y es una galactosa terminal, que está oxidada por vía enzimática o química, obteniéndose opcionalmente el residuo de galactosa terminal tras la escisión de un ácido siálico terminal.
En una realización preferida, el grupo alfa-SH-beta-amino está comprendido en un resto de cisteína del principio activo, preferiblemente una proteína o péptido, siendo preferiblemente el resto de cisteína un residuo de cisteína Nterminal del principio activo.
En una realización preferida, el principio activo es una proteína o péptido modificado con un residuo de cisteína Nterminal, que no es parte de un puente disulfuro, en particular en la que la proteína o péptido modificado que posee un resto N-terminal de cisteína es un mutante de una proteína o péptido que se produce de manera natural, obtenido mediante (1) añadiendo un resto de cisteína al aminoácido N-terminal, (2) sustituyendo el aminoácido N-terminal con cisteína, o (3) delecionando el/los aminoácido(s) N-terminal(es) hasta que se obtiene una cisteína terminal.
En los péptidos, la cisteína mencionada puede introducirse durante la síntesis. La síntesis de péptidos se conoce en la técnica. (W. Chang, P. D. White; Fmoc solid phase peptide synthesis, a practical approach; Oxford University Press, Oxford, 2000, ISBN 0199637245).
Pueden obtenerse polipéptidos recombinantes mediante técnicas biológicas moleculares convencionales como; por ejemplo, las que se describen en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición, Eds. Sambrook et al., CSHL Press 2001. En resumen, los polipéptidos pueden expresarse a partir de vectores de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico que codifica para el polipéptido deseado, ácido nucleico que se une operativamente a al menos una secuencia reguladora que permite la expresión del polipéptido deseado. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido deseado puede aislarse y clonarse en un vector de expresión y entonces puede transformarse el vector en una célula huésped adecuada para la expresión del polipéptido deseado. Un vector de este tipo puede ser un plásmido, fagémido o un cósmido. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico puede clonarse de forma adecuada en vectores de expresión procariotas o eucariotas (Molecular Cloning, véase anteriormente). Tales vectores de expresión comprenden al menos un promotor y también pueden comprender una señal para el inicio de la traducción y, en el caso de los vectores de expresión procariotas, una señal para la terminación de la traducción, mientras que en el caso de los vectores de expresión eucariotas, comprenden preferiblemente señales de expresión para la terminación de la transcripción y para la poliadenilación. Los ejemplos de vectores de expresión procariotas son, para la expresión en Escherichia coli, por ejemplo vectores de expresión basados en promotores reconocidos por la ARN polimerasa de T7 tal como se describe en el documento US 4.952.496, para vectores de expresión eucariotas para la expresión en Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo los vectores G426/Met25 o P526/Gal1 (Mumberg et al., (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768), para la expresión en células de insecto, por ejemplo vectores de Baculovirus, por ejemplo tal como se describe en los documentos EPB1-0127839 o EPB1- 0549721 o por Ciccarone et al. (“Generation of recombinant Baculovirus ADN in E.coli using baculovirus shuttle vector” (1997) Volumen 13, U. Reischt, ed. (Totowa, NJ: Humana Press Inc.) y para la expresión en células de mamífero, por ejemplo los vectores Rc/CPM y Rc/ASW y vectores de SV40, que se conocen comúnmente y están disponibles comercialmente, o el sistema de EBNA descrito en el ejemplo 4, pCytTS basado en el replicón del virus Sindbis (Boorsma et al. (2002) Biotechnol. Bioeng. 79(6): 602-609), el sistema de expresión del virus Sindbis (Schlesinger (1993) Trends Biotechnol. 11(1):18-22) o un sistema de expresión de Adenovirus (He et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514). El experto conoce bien los métodos de biología molecular para la producción de estos vectores de expresión, así como los métodos para transfectar células huésped y cultivar tales células huésped transfectadas, así como las condiciones para producir y obtener los polipéptidos de la invención a partir de dichas células huésped transformadas.
Pueden generarse polipéptidos con el residuo de cisteína N-terminal deseado a partir de los polipéptidos expresados y purificados tal como se describió anteriormente, clonando el polipéptido de interés tras una secuencia líder Nterminal que puede eliminarse para dar los polipéptidos con el residuo de cisteína N-terminal deseado.
Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante escisión proteolítica del polipéptido expresado y purificado tal como se describió anteriormente. En tal caso, se clonó, expresó y purificó un polipéptido de fusión en el que un resto de cisteína sigue directamente a un sitio de escisión de proteasa altamente selectivo, por ejemplo, un residuo de Cys inmediatamente tras el sitio de escisión del Factor Xa: Ile (Glu/Asp) Gly Arg| (Cys/His), o un residuo de His o Cys inmediatamente tras el sitio de escisión de enterocinasa: Asp Asp Asp Asp Lys| (Cys/His), indicando | el sitio de escisión por la proteasa.
Esto puede lograrse adicionalmente, por ejemplo, mediante la escisión del polipéptido durante la expresión, por ejemplo la escisión en la fase de translocación al RE por la peptidasa señal. En tal caso, se clonó y expresó un polipéptido de fusión en el que un residuo de Cys sigue directamente al péptido señal que dirige al polipéptido recombinante hacia la ruta de secreción (para revisión, véase Rapoport et al., Annu Rev Biochem. 1996;65:271303).
Los métodos de biología molecular para manipular la secuencia codificante de un polipéptido recombinante de manera que se genere la secuencia codificante para un polipéptido con el residuo de Cys deseado en la posición deseada se conocen bien en la técnica (Sambrook, citado anteriormente).
Las realizaciones preferidas para (b)(2) son tal como se describieron para (a)(2) anteriormente, en particular los grupos funcionales M2 y Q son preferiblemente tal como se describió anteriormente para los grupos funcionales M1 y Q, siempre que el principio activo contenga un grupo funcional que sea reactivo con el grupo M1 tal como se describió anteriormente.
En una realización particularmente preferida, el principio activo se selecciona de una proteína y un péptido y se obtiene según (b)(1) anteriormente, de manera preferible tal como se describió anteriormente.
En una realización preferida particular según (A), se obtiene hidroxialquilalmidón que comprende un grupo aldehído mediante (a)(2)(ii), preferiblemente haciendo reaccionar el hidroxialquilalmidón preferiblemente oxidado con un compuesto que tiene un grupo amino M1 y un grupo amino Q, en particular un compuesto de diaminoalquilo, especialmente 1,4-diaminobutano, y luego haciendo reaccionar el hidroxialquilalmidón funcionalizado con amino con un compuesto bifuncional que comprende un grupo aldehído, en particular ácido 4-formilbenzoico, y luego haciendo reaccionar el grupo aldehído del hidroxialquilalmidón con un grupo alfa-SH-beta-amino opcionalmente protegido de un principio activo obtenido mediante (b)(2)(i), preferiblemente introduciendo una cisteína opcionalmente protegida en el principio activo, en particular una proteína o un péptido.
En una realización preferida particular según (B), el principio activo que comprende un grupo aldehído se obtiene mediante (b)(1), en particular introduciendo un grupo aldehído mediante modificación química, preferiblemente oxidando una proteína o péptido, y luego haciendo reaccionar el grupo aldehído del principio activo con hidroxialquilalmidón que comprende un grupo alfa-SH-beta-amino obtenido mediante (a)(2)(ii), preferiblemente haciendo reaccionar el hidroxialquilalmidón preferiblemente oxidado con un compuesto que tiene un grupo amino M1
5 y un grupo amino Q, en particular un compuesto de diaminoalquilo, especialmente 1,4-diaminobutano, y luego haciendo reaccionar el hidroxialquilalmidón funcionalizado con amino con un compuesto bifuncional que comprende un grupo alfa-SH-beta-amino, en particular cisteína.
La reacción de la invención según (A) y (B) del principio activo con el hidroxialquilalmidón puede llevarse a cabo en
10 cualquier disolvente adecuado o mezcla de al menos dos disolventes y a un pH adecuado y a una temperatura de reacción adecuada.
En una realización preferida, la reacción (A) o (B) se lleva a cabo a una temperatura de 0 a 40ºC, preferiblemente de 0 a 25ºC, en particular de 20 a 25ºC, en presencia de un disolvente, y a un pH de 3,5 a 10, preferiblemente de 4 a 8,
15 en particular de 4,8 a 8,0 con un tiempo de reacción de preferiblemente 0,1 a 24 h, en particular de aproximadamente 21 h.
El disolvente se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en agua, tampón acuoso, DMF (dimetilformamida), DMSO (dimetilsulfóxido), DMA (dimetilacetamida) y mezclas de los mismos.
20 La razón molecular de hidroxialquilalmidón con respecto al principio activo es de aproximadamente 1:1 a 200:1, preferiblemente de 10:1 a 100:1, en particular de 40:1 a 70:1.
Además, la invención se refiere a un conjugado de un principio activo e hidroxialquilalmidón, tal como puede 25 obtenerse mediante un método tal como se describió anteriormente.
En otra realización, la invención se refiere al conjugado de un principio activo e hidroxialquilalmidón, en el que el principio activo y el hidroxialquilalmidón se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I)
en las que R1, R2, R2, R3, R3, y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo alquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo y heteroaralquilo lineal, cíclico y/o ramificado, opcionalmente sustituido de
manera adecuada, preferiblemente hidrógeno, teniendo dicho conjugado una estructura según la fórmula (IV), (IV’),
o (IV”)
10 o en las que HAS’ es el residuo del derivado de hidroxialquilalmidón que se unió a un grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal haciendo reaccionar el hidroxialquilalmidón con al menos un compuesto, al menos bifuncional, comprendiendo dicho compuesto dos grupos funcionales M1 y Q, haciéndose reaccionar un grupo funcional M1 con el hidroxialquilalmidón y siendo un grupo funcional Q
15 (i) un grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal; o
(ii) un grupo funcional que se modifica químicamente para dar el grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal,
y en las que AS’ es el residuo del principio activo o un derivado del mismo que se unió al grupo alfa-SH-beta-amino, 20 una estructura según la fórmula (V), (V’) o (V”’)
o
o en las que HAS’ es el residuo del derivado de hidroxialquilalmidón que se unió al grupo alfa-SH-beta-amino 38a y en las que AS’ es el residuo del principio activo o un derivado del mismo que se unió al grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal.
10 En una realización preferida, el conjugado se selecciona del grupo que consiste en
mediante un método que comprende hacer reaccionar el hidroxialquilalmidón con al menos un compuesto, al menos bifuncional, comprendiendo dicho compuesto dos grupos funcionales M1 y Q, haciéndose reaccionar un grupo funcional M1 con el hidroxialquilalmidón y siendo un grupo funcional Q
(i)
un grupo alfa-SH-beta-amino; o
(ii)
un grupo funcional que se modifica químicamente para dar el grupo alfa-SH-beta-amino,
en la que R5 es tal como se definió para de R1 a R4 anteriormente,
en la que R5 es tal como se definió para de R1 a R4 anteriormente,
y
5 en las que en las fórmulas IV’a, IV’b, V’b o V’c, n es un número entero, preferiblemente n es de 0 a 20, y en las que en las fórmulas Va, Vb, V’d o V’e, n es un número entero, preferiblemente n es de 1 a 20. En una realización preferida de la fórmula IV’b y de V’c, n es de 2 a 4, en particular 2.
En una realización preferida, el conjugado es 10
en la que R’, R” y/o R”’ son tal como se definen para la fórmula II y en la que, en al menos una unidad de glucosa de HES, al menos uno de R’, R” y/o R”’ se selecciona independientemente del grupo que consiste en
y
25 y en las que n es un número entero, preferiblemente de 1 a 20 y/o en las que al menos uno de R’, R*” y/o R”’ es (CH2CH2O)m-R#, en la que m es un número entero, preferiblemente de 1 a 3, y R# se selecciona del grupo que consiste en las fórmulas (VIa), (VIb), (VIc) y (VId).
30 En una realización adicional, la invención se refiere a un derivado de hidroxialquilalmidón funcionalizado con alfa
SH-beta-amino seleccionado del grupo que consiste en
en la que R5 es tal como se definió para de R1 a R4 anteriormente, y
en la que n es un número entero, preferiblemente de 0 a 20,
o el grupo que consiste en
en la que R’, R” y/o R”’ son tal como se definen para la fórmula II y en la que en al menos una unidad de glucosa de HES, al menos uno de R’, R” y/o R’” se selecciona independientemente del grupo que consiste en
y
y en las que n es un número entero, preferiblemente de 1 a 20 y/o en las que al menos uno de R’, R” y/o R”’ es (CH2CH2O)m-R##, en la que m es un número entero, preferiblemente de 1 a 3, y R## se selecciona del grupo que consiste en las fórmulas (VI’a), (VI’b) y (VI’c).
30 Las abreviaturas HES” y HES’ usadas específicamente en el contexto de las fórmulas (VI) y (VI’) se refieren a residuos de la molécula de HES que, junto con el resto de hidrato de carbono que une HES” y HES’ tal como se muestra en (VI) y (VI’), constituyen la molécula de HES que a su vez forma parte de los conjugados tal como se define en (VI) y (VI’).
35 En una realización adicional, la invención se refiere a un conjugado tal como se describió anteriormente para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o de animal o como agente terapéutico.
Los conjugados según la invención pueden ser puros en al menos el 50%, incluso más preferido puros en al menos el 70%, incluso más preferido puros en al menos el 90%, en particular en al menos el 95% o en al menos el 99%. En la realización más preferida, los conjugados pueden ser puros en el 100%, es decir no hay otros subproductos presentes.
Por tanto, según otro aspecto, la presente invención también se refiere a una composición que puede comprender el/los conjugado(s) de la invención, en la que la cantidad del/de los conjugado(s) puede ser de al menos el 50% en peso, incluso más preferido de al menos 70% en peso, incluso más preferido de al menos 90% en peso, en particular de al menos 95% en peso al menos el 99% en peso. En la realización más preferida, la composición puede consistir en el/los conjugado(s), es decir la cantidad del/de los conjugado(s) es del 100% en peso.
Por consiguiente, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un conjugado tal como se describió anteriormente o un conjugado, que puede obtenerse mediante un método tal como se describió anteriormente.
Además, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un conjugado tal como se describió anteriormente o un conjugado, que puede obtenerse mediante un método tal como se describió anteriormente, comprendiendo además dicha composición farmacéutica al menos un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptables.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra un análisis de los conjugados de proteína-HES brutos mediante electroforesis en gel de SDS obtenidos mediante la formación de tiazolidina a partir de H-Cys(H)-HES10/0.4 y EPO oxidada. Carril X: Patrón Roti®-Mark (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) Marcador de peso molecular de arriba abajo: 200 kDa, 119 kDa, 66 kDa, 43 kDa, 29 kDa, 20 kDa, 14,3 kDa Carril A: Conjugación de H=Cys(H)-HES10/0.4 con EPO oxidada
La figura 2 muestra un análisis de los conjugados de proteína-HES brutos mediante electroforesis en gel de SDS de la formación de tiazolidina a partir de H-Cys-Péptido-NH2 y AldehídoHES. Carril X: Patrón Roti®-Mark (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) Marcador de peso molecular de arriba abajo: 200 kDa, 119 kDa, 66 kDa, 43 kDa, 29 kDa, 20 kDa, 14,3 kDa. Carril A: Conjugación de AldehídoHES10/0.7 a pH 4,6 Carril B: Conjugación de AldehídoHES50/0.7 a pH 4,6 Carril C: Control de reacción: Péptido a pH 4,6 Carril D: Conjugación de AldehídoHES10/0.7 a pH 8,0 Carril E: Conjugación de AldehídoHES50/0.7 a pH 8,0 Carril F: Control de reacción: Péptido a pH 8,0
La figura 3 muestra un análisis de los conjugados de ADN-HES brutos mediante electroforesis en gel de agarosa obtenidos mediante la formación de tiazolidina a partir de H-Cys(H)-HES50/0.7 y ADN modificado con aldehído tal como se describe en las secciones experimentales 8,4 - 8,5 más adelante en el presente documento. Carril X: marcador pUC19/Msp I (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D). Marcador de peso molecular de arriba abajo: 501/489 pb, 404 pb, 331 pb, 242 pb, 190 pb, 147 pb, 111/110 pb, 67 pb.
Carril A: fila superior: Conjugación de H-Cys(H)-HES50/0.7 con ADN modificado con FBA a pH 4,6 tal como se describe en la sección experimental 8,5; Carril B: fila superior: Control de reacción; Conjugación de Oxo-HES50/0.7 con ADN modificado con FBA a pH 4,6 tal como se describe en la sección experimental 8,5; Carril C: fila superior: Conjugación de H-Cys(H)-HES50/0.7 con ADN modificado con FBA a pH 8,0 tal como se describe en la sección experimental 8,5; Carril D: fila superior: Control de reacción; Conjugación de Oxo-HES50/0.7 con ADN modificado con FBA a pH 8,0 tal como se describe en la sección experimental 8,5; Carril E: fila superior: Control de reacción; ADN modificado con FBA en agua sin derivado de HES; Carril A: fila inferior: Conjugación de H-Cys(H)-HES50/0.7 con ADN modificado con formilindol a pH 4,6 tal como se describe en la sección experimental 8,5; Carril B: fila inferior: Control de reacción; Conjugación de Oxo-HES50/0.7 con ADN modificado con formilindol a pH 4,6 tal como se describe en la sección experimental 8,5; Carril C: fila inferior: Conjugación de H-Cys(H)-HES50/0.7 con ADN modificado con formilindol a pH 8,0 tal como se describe en la sección experimental 8,5; Carril D: fila inferior: Control de reacción; Conjugación de Oxo-HES50/0.7 con ADN modificado con formilindol a pH 8,0 tal como se describe en la sección experimental 8,5; Carril E: fila inferior: Control de reacción; ADN modificado con formilindol en agua sin derivado de HES.
La figuras 4 a 6 muestran el análisis del conjugado de daunorubicina-HES bruto mediante cromatografía HPCL en fase inversa, detección UV a 290 nm, obtenido mediante formación de tiazolidina a partir de H-Cys(H)-HES50/0.7 y daunorubicina tal como se describe en la sección experimental 9 más adelante en el presente documento. Figura 4: Análisis mediante HPLC del conjugado bruto; Figura 5: Análisis mediante HPLC de daunorubicina: Figura 6: Análisis mediante HPLC de H-Cys(H)-HES50/0.7.
La figuras 7 a 9 muestran el análisis del conjugado de tilosina-HES mediante cromatografía HPCL en fase inversa, detección UV a 220 nm, obtenido mediante formación de tiazolidina a partir de H-Cys(H)-HES50/0.7 y tilosina tal como se describe en la sección experimental 9 más adelante en el presente documento. Figura 7: Análisis mediante HPLC del conjugado bruto Figura 8: Análisis mediante HPLC de tilosina Figura 9: Análisis mediante HPLC de H-Cys(H)-HES50/0.7
La figura 10 muestra el análisis de de los conjugados de péptido-HES brutos mediante electroforesis en gel de SDS tal como se describe en la sección experimental 10 más adelante en el presente documento. Carril X: Patrón Roti®-Mark (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) Marcador de peso molecular de arriba abajo: 200 kDa, 119 kDa, 66 kDa, 43 kDa, 29 kDa, 20 kDa, 14,3 kDa. Carril A: Conjugación de HES10/0.7 con péptido a 21ºC, en DMF. Carril B: Conjugación de HES10/0.7 con péptido a 37ºC, en DMF. Carril C: Control de reacción: Péptido a 50ºC en DMF Carril D: Conjugación de HES10/0.7 con péptido a 50ºC, pH 4,6 Carril E: Conjugación de HES10/0.7 con péptido a 50ºC, en DMF Carril F: Conjugación de HES10/0.7 con péptido a 50ºC, pH 4,6, Triton al 1% Carril G: Conjugación de HES10/0.7 con péptido a 50ºC, en DMF, Triton al 1%
La invención se explicará en más detalle mediante los ejemplos siguientes.
Ejemplos
1. Síntesis de H-Cys(StBu)-HES10/0.4 1.1 Síntesis de AminoHES10/0.4 a partir de HES oxidado
Se calentó oxo-HES10/0.4 (4 g, PM = 10,9 kDa, GS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) durante la noche a 80ºC a vacío, se disolvió bajo argón en dimetilsulfóxido seco (25 ml, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se añadió 1,4-diaminobutano (4,0 ml, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D). Tras agitación a 45ºC durante 24 h, se añadió la mezcla de reacción a 2-propanol (125 ml, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) y se incubó durante 1 h a -20ºC. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 2-propanol (100 ml) y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en agua (20 ml, Milli-Q), se dializó durante 43 h frente a agua Milli-Q (tubos de diálisis SnakeSkin, PMCO (punto de corte de peso molecular) de 3,5 kDa, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 65%.
1.2 Síntesis de Fmoc-Cys(StBu)-HES10/0.4 a partir de AminoHES
Se disolvieron Fmoc-Cys(S-tBu)-OH (150 mg, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y 1-hidroxi-1Hbenzotriazol (61,4 mg, Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) en N,N-dimetilformamida (3,5 ml calidad para síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se añadió N,N’-diisopropilcarbodiimida (54,3 !L, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D). Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadió AminoHES10/0.4 (0,35 g), tal como se obtuvo en 1.1. Tras agitación a temperatura ambiente durante la noche, se añadió la mezcla de reacción a una mezcla 1:1 helada (35 ml, v/v) de acetona (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) y etanol (DAB, Sonnenberg, Braunschweig, D) y se incubó durante 1 h a -20ºC. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se disolvió en agua (20 ml, Milli-Q) y se añadió diclorometano (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) (20 ml). Se mezcló meticulosamente la mezcla y se centrifugó. Se dializó la fase superior acuosa durante 41 h frente a agua Milli-Q (tubos de diálisis SnakeSkin, PMCO de 3,5 kDa, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 78%.
1.3 Síntesis de H-Cys(StBu)-HES10/0.4 a partir de Fmoc-Cys(StBu)-HES10/0.4
Se disolvió Fmoc-Cys(S-tBu)HES10/0.4 (0,35 g) tal como se obtuvo en 1.2 en disolución de piperidina (4 ml, 20% en DMF, v/v, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D). Tras agitación a temperatura ambiente durante 15 min. se añadió la mezcla de reacción a una mezcla 1:1 helada de acetona y etanol (35 ml, v/v) y se incubó durante 1 h a -20ºC. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC y se lavó con terc-butil metil éter (25 ml, Acros Organics, Geel, B) y se incubó durante 1 h a -20ºC. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC y se secó en una corriente de nitrógeno. El rendimiento del producto aislado fue del 68%.
2. Síntesis de AldehídoHES10/0.7 2,1 Síntesis de AminoHES10/0.7 a partir de HES oxidado
Se calentó Oxo-HES10/0.7 (6,02 g, PM = 14,7 kDa, GS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) durante 16,5 h a 80ºC a vacío, se disolvió bajo argón en dimetilsulfóxido seco (25 ml, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se añadió 1,4-diaminobutano (5,1 ml, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D). Tras agitación a 40ºC durante 17 h, se añadió la mezcla de reacción a una mezcla 1:1 helada de acetona y etanol (150 ml, v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con una mezcla 1:1 helada de acetona y etanol (40 ml, v/v) y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en agua (80 ml), se dializó durante 42 h frente a agua Milli-Q (tubos de diálisis SnakeSkin, PMCO de 3,5 kDa, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 67%.
2,2. Síntesis de AldehídoHES10/0.7 a partir de AminoHES
Se disolvieron ácido 4-formilbenzoico (75 mg, Lancaster Synthesis, Frankfurt/ Main, D) y 1-hidroxi-1H-benzotriazol (115 mg, Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) en N,N-dimetilformamida (DMF, 5 ml, calidad para síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se añadió N,N’-diisopropilcarbodiimida (102 !l, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D). Tras la incubación a temperatura ambiente durante 30 min., se añadió AminoHES10/0.7 (0,5 g, PM = 14,7 kDa, GS = 0,76). Tras agitar a temperatura ambiente durante la noche, se añadió la mezcla de reacción a 2-propanol (30 ml, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) y se incubó durante 1 h a -20ºC. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 2-propanol (30 ml) y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en agua (10 ml, Milli-Q), se dializó durante 44 h frente a agua Milli-Q (tubos de diálisis SnakeSkin, PMCO de 3,5 kDa, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 86%.
3. Síntesis de AldehídoHES50/0.7 3.1. Síntesis de AminoHES50/0.7 a partir de HES oxidado
Se calentó Oxo-HES50/0.7 (6,09 g, PM = 56,7 kDa, GS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) durante 16,5 h a 80ºC a vacío, se disolvió bajo argón en dimetilsulfóxido seco (32 ml, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se añadió 1,4-diaminobutano (1,2 ml, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D). Tras agitación a 40ºC durante 17 h, se añadió la mezcla de reacción a una mezcla 1:1 helada de acetona y etanol (150 ml, v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con una mezcla 1:1 helada de acetona y etanol (40 ml, v/v) y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en agua (80 ml), se dializó durante 42 h frente a agua Milli-Q (tubos de diálisis SnakeSkin, PMCO de 3,5 kDa, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 82%.
3.2. Síntesis de AldehídoHES50/0.7 a partir de AminoHES
Se disolvieron ácido 4-formilbenzoico (124 mg, Lancaster Synthesis, Frankfurt/ Main, D) y 1-hidroxi-1H-benzotriazol (174 mg, Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) en N,N-dimetilformamida (DMF, 38 ml, calidad para síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se añadió N,N’-diisopropilcarbodiimida (155 !l, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D). Tras la incubación a temperatura ambiente durante 30 min., se añadió AminoHES50/0.7 (3,80 g, PM = 56,7 kDa, GS = 0,76). Tras agitar a temperatura ambiente durante la noche, se añadió la mezcla de reacción a 2-propanol (160 ml, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) y se incubó durante 1 h a -20ºC. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se disolvió en DMF (20 ml), se precipitó con 2-propanol tal como se describió anteriormente y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en agua, se dializó durante 24 h frente a agua Milli-Q (tubos de diálisis SnakeSkin, PMCO de 3,5 kDa, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. Se disolvió el producto en agua (20 ml), se precipitó con una mezcla 1:1 helada de acetona y etanol (150 ml, v/v), se incubó durante 1 h a -20ºC y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en agua (29 ml), se dializó durante 24 h frente a agua Milli-Q (tubos de diálisis SnakeSkin, PMCO de 10 kDa, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 77%.
4. Formación de tiazolidina a partir de H-Cys(H)-HES10/0.4 y EPO oxidada 4.1. Desprotección de H-Cys(StBu)-HES10/0.4
Se disolvió H-Cys(StBu)-HES10/0.4 (10 mg) tal como se obtuvo en ejemplo 1 en tampón acetato de sodio (1 ml, 0,1 M, pH 4,6, EDTA 10 mM) y se añadió clorhidrato de tris-(2-carboxietil)-fosfina (2,8 mg, TCEP, Acros Organics, Geel, B). Se incubó la mezcla de reacción durante 30 min. a temperatura ambiente y se eliminó el exceso de TCEP mediante diafiltración:
Se diluyó la mezcla de reacción con tampón (tampón fosfato de sodio, 0,1 M, pH 8,0, EDTA 1 mM) hasta 0,5 ml y se centrifugó a 20ºC durante 10 min. a 13000 x g en un concentrador Vivaspin 500 (Viva Science, PMCO de 5 KDa, Hannover, Alemania). Se repitió el procedimiento de lavado tres veces mediante dilución de la disolución residual con tampón hasta 0,5 ml y centrifugación durante 35 min. tal como se describe. Se diluyeron las disoluciones de H
5 Cys(H)-HES10/0.4 con el mismo tampón de reacción hasta 150 !l que tiene una concentración calculada final de 66,6 !g/ml.
4.2. Conjugación con EPO oxidada
10 Para preparar la EPO oxidada, a una disolución de EPO 2,0 mg/ml (EPO producida de manera recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos de la EPO humana y similar o esencialmente las mismas características que la epoyetina alfa comercialmente disponible: Erypo, ORTHO BIOTECH, Jansen-Cilag o epoyetina beta: NeoRecormon, Roche; véanse los documentos EP 0 148 605, EP 0 205 564, EP 0411 678) de 20 ml totales mantenida a 0ºC se añadieron 2,2 ml de una disolución helada de meta-peryodato de sodio 10 mM dando como resultado una
15 concentración final de meta-peryodato de sodio 1 mM. Se incubó la mezcla a 0ºC durante 1 hora en un baño de hielo en la oscuridad y se terminó la reacción mediante la adición de 40 !l de glicerol y se incubó durante 5 minutos adicionales. Se cambió el tampón de la mezcla a tampón acetato de sodio pH 5,5.
A la EPO oxidada obtenida (14,9 !l, 1,34 mg/ml, tampón acetato de sodio pH 5,5), se añadió la disolución de H
20 Cys(H)-HES10/0.4 (5 !l) tal como se obtuvo en 4.1. Tras la incubación durante 21 h a temperatura ambiente, se analizó la mezcla de reacción mediante electroforesis en gel de SDS. Se emplearon un dispositivo XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) para la electroforesis en gel de SDS. Se usó un gel Bis/Tris al 10% junto con un tampón de transferencia MOPS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) según las instrucciones de los fabricantes.
5. Formación de tiazolidina a partir de H-Cys(H)-Péptido-NH2 y AldehídoHES
Se añadió una disolución del péptido que porta un resto de cisteína libre en su extremo N-terminal (2 !l, 15 !g, 3147 g/mol, 7,5 mg/ml en DMF, H-CLPSLEGNMQQPSEFHCMMNWSSHIAAC-NH2, obtenida mediante síntesis en fase 30 sólida con Fmoc convencional y purificada mediante HPLC) a 20 !l de una disolución de AldehídoHES (véase la tabla 1) en tampón de reacción (véase la tabla 1) se desgasificó durante 15 min. en un baño ultrasónico y se incubó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. Para el análisis mediante electroforesis en gel de SDS, se emplearon un dispositivo XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usó un gel Bis/Tris al 12% junto con un tampón de transferencia MES
35 en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) según las instrucciones de los fabricantes.
Tabla 1: Condiciones de reacción
AldehídoHES
Concentración de AldehídoHES Tampón de reacción
AldehídoHES10/0.7 tal comoobtuvo en 2.
se 119 mg/ml Acetato de sodio, 0,1 M, pH 4,6, EDTA 10 mM
AldehídoHES50/0.7 tal comoobtuvo en 3.
se 595 mg/ml Acetato de sodio, 0,1 M, pH 4,6, EDTA 10 mM
AldehídoHES10/0.7 tal comoobtuvo en 2.
se 119 mg/ml Fosfato de sodio, 0,1 M, pH 8,0, EDTA 1 mM
AldehídoHES50/0.7 tal comoobtuvo en 3.
se 595 mg/ml Fosfato de sodio, 0,1 M, pH 8,0, EDTA 1 mM
6. Resultados
40 Los resultados de los experimentos pueden observarse en las figuras.
Se llevaron a cabo dos estrategias diferentes tal como puede observarse en los ejemplos anteriores. En un caso (véase 4.), se introdujo el grupo carbonilo en el glicano de EPO mediante oxidación con peryodato y se conjugó con
45 HES que contenía un grupo alfa-SH-beta-amino. Este derivado de HES10/0.4 se sintetizó en dos etapas a partir de HES, oxidado en el extremo reductor. El HES oxidado se convirtió mediante un procedimiento conocido en un AminoHES (véase 1.1.) seguido por acilación con una cisteína protegida (Fmoc-Cys(StBu)-OH) (véase 1.2.) y desprotección (véase 1.3.). La otra vía (véase 5.) utilizó un AldehídoHES10/0.7 y un AldehídoHES50/0.7 (véanse
2.2. y 3.2.), se sintetizó mediante acilación del AminoHES conocido (véase 2,1. y 3,1.) con ácido 4-formilbenzoico y
50 un péptido, que portaba una cisteína no protegida en su extremo N-terminal. Mediante ambas estrategias se obtuvo una conversión de completa a casi completa (véanse las figuras 1 y 2). La conjugación del AldehídoHES con Cyspéptido avanzó igualmente bien a pH 4,6 y a pH 8,0 (véase la figura 2, carriles A y D o carriles B y E). No se produjo la reacción del péptido en estas condiciones de reacción con HES10/0.7 o HES50/0.7. En condiciones de reacción modificadas, podría esperarse el éxito.
55 El método según esta invención tiene la ventaja para las proteínas de que pueden obtenerse mutantes con residuos de cisteína N-terminales unidos a través de expresión, mientras que podrían no estar disponibles otras modificaciones de proteínas que también podrían permitir una conjugación quimioselectiva a través de esta ruta. Con ello se espera que se permita una reacción selectiva con hidroxialquilalmidón, en particular hidroxietilalmidón unido a través del residuo N-terminal de la proteína. Una ventaja adicional del método según la invención es la quimioselectividad de la reacción del grupo aldehído, ceto o hemiacetal con el grupo alfa-SH-beta-amino. Por tanto, no se espera ninguna reacción con los grupos funcionales de las cadenas laterales de por ejemplo una proteína o péptido.
7. Síntesis de H-Cys(H)-HES50/0.7 7.1 Síntesis de AminoHES50/0.7 a partir de HES oxidado
Se calentó Oxo-HES50/0.7 (10,1 g, PM = 44,2 kDa, GS = 0,7, Lote 502, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) durante 72 h a 80ºC a vacío, se disolvió bajo argón en dimetilsulfóxido seco (52 ml, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se añadió 1,4-diaminobutano (2,3 ml, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D). Tras agitación a 45ºC durante 19,5 h, se añadió la mezcla de reacción gota a gota a una mezcla 1:1 (400 ml, v/v) de acetona (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) y etanol (DAB, Sonnenberg, Braunschweig, D). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en agua (100 ml, Milli-Q), se dializó (tubos de diálisis SnakeSkin, PMCO de 10 kDa, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) durante 24 h frente a ácido acético 20 mM y 3,5 h frente a agua. El rendimiento del producto aislado tras la liofilización fue del 84%.
7.2 Síntesis de Fmoc-Cys(StBu)-HES50/0.7 a partir de AminoHES50/0.7
Se disolvieron Fmoc-Cys(S-tBu)-OH (293,1 mg, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y 1-hidroxi-1Hbenzotriazol (155,9 mg, Iris Biotech GmbH, Marktredwitz, D) en N,N-dimetilformamida (30 ml calidad para síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se añadió N,N’-diisopropilcarbodiimida (138 !l, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D). Tras la incubación a 21ºC durante 30 min., se añadió AminoHES50/0.7 (3,00 g), obtenido tal como se describe en 7,1. Tras agitación a temperatura ambiente durante la noche, se añadió la mezcla de reacción a una mezcla 1:1 (230 ml, v/v) de acetona (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) y etanol (DAB, Sonnenberg, Braunschweig, D). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación, se disolvió en DMF (30 ml) y se precipitó de nuevo tal como se describió anteriormente. Tras la centrifugación, se disolvió el producto bruto en agua (30 ml, Milli-Q), se dializó durante 28 h frente a agua Milli-Q (tubos de diálisis SnakeSkin, PMCO de 10 kDa, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 98%.
7.3 Síntesis de H-Cys(StBu)-HES50/0.7 a partir de Fmoc-Cys(StBu)-HES50/0.7
Se disolvió Fmoc-Cys(StBu)HES50/0.7 (2,62 g), obtenido tal como se describe en 7,2 en DMF (20 ml) y se añadió piperidina (5 ml , Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D). Tras agitación a temperatura ambiente durante 15 min., se añadió la mezcla de reacción a mezclas 1:1 de acetona y etanol (190 ml, v/v). Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación, se disolvió en DMF (25 ml) y se precipitó de nuevo tal como se describió anteriormente. Tras la centrifugación, se disolvió el producto bruto en agua (25 ml, Milli-Q) se dializó durante 45 h frente a agua Milli-Q (tubos de diálisis SnakeSkin, PMCO de 10 kDa, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 83%.
7.4 Síntesis de H-Cys(H)-HES50/0.7 a partir de H-Cys(StBu)-HES50/0.7
Se disolvió H-Cys(S-tBu)HES50/0.7 (0,50 g), obtenido tal como se describe en 7,3, en disolución de clorhidrato de tris-(2-carboxietil)-fosfina 50 mM (5 ml, TCEP, Acros Organics, Geel, B en tampón acetato de sodio 0,1 M pH 5,0). Tras agitación a temperatura ambiente durante 1 h, se dializó la mezcla de reacción (tubos de diálisis SnakeSkin, PMCO de 10 kDa, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) durante 22 h frente a EDTA acuoso 5 mM (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D en Milli-Q agua) y 1 h frente a agua (Milli-Q) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 97%.
8. Conjugación con ADN
8.1 Hibridación de ADN modificado con formilindol
Se hibridaron ADN modificado con formilindol en 5’ (la modificación con formilindol, es decir la modificación con 3formilindol, se introdujo según A. Okamoto et al., Tetrahedron Lett. 2002, 43, 4581-4583; 200 !l, atdbio, Southampton, RU, lote A0795, M = 9361 g/mol, c = 37,8 !M en agua, secuencia: XTACTCACCCTGCGAATTCAACTGCTGCCTC) y la hebra complementaria no modificada (199 !l, atdbio, Southampton, RU, lote A0794, M = 9376 g/mol, c = 38,2 !M en agua, secuencia: GAGGCAGCATTGAATTCGCAGGGTGAGTA) en una razón molar 1:1 basándose en las concentraciones facilitadas por el fabricante. Se mezclaron las disoluciones y se incubaron a 95ºC durante 5 min., dando como resultado una concentración final de ADN bicatenario 0,356 mg/ml. Se liofilizaron 157 !l (55,9 !g) durante la noche y se disolvió en agua (27,9, Milli- Q) dando como resultado una concentración final calculada de 2 mg/ml. Las concentraciones se calcularon y no se comprobaron experimentalmente.
5 8.2 Hibridación de ADN modificado con amino-C6 en 5’
Se disolvió ADN modificado con amino-C6 en 5’ (59,1 nmol, biomers.net GmbH, Ulm, D, lote 000334261 ADN, M = 9218 g/mol, 59,1 nmol, secuencia: TACTCACCCTGCGAATTCAACTGCTGCCTC) en agua (100 !l; Milli-Q). Se hibridó (38,78 !l, 595 !M) en una razón molar 1:1 basándose en las concentraciones facilitadas por el fabricante con
10 la hebra complementaria no modificada (600 !l, atdbio, Southampton, RU, lote A0794, M = 9376 g/mol, c = 38,2 !M en agua, secuencia: GAGGCAGCATTGAATTCGCAGGGTGAGTA). Se mezclaron las disoluciones y se incubaron a 95ºC durante 5 min., dando como resultado una concentración calculada final de ADN bicatenario 0,667 mg/ml. Las concentraciones se calcularon y no se comprobaron experimentalmente.
15 8.3 Formación de un ADN modificado con FBA a partir de ADN modificado con amino-C6 en 5’
Se añadió 4-formilbenzoato de succinimidilo (50 !l, 4 mg/ml en DMF, Novabiochem, Merck KGaA, Darmstadt, D) a un ADN bicatenario modificado con amino-C6 en 5’, obtenido tal como se describe en 8.2 (500 !l, 0,667 mg/ml en agua) y se incubó la disolución transparente durante 5 h a 21ºC. Se centrifugó la mezcla de reacción a 21ºC durante
20 15 min. a 13000 x g en un concentrador Vivaspin 500 (Viva Science, PMCO de 5 KDa, Hannover, Alemania). Se repitió el procedimiento de lavado tres veces mediante dilución de la disolución residual con agua (Milli-Q) hasta 0,5 ml y centrifugación durante 12 min. tal como se describe. Se diluyó la disolución de ADN con agua hasta 167 !l, dando como resultado una concentración calculada final de 2 mg/ml. Las concentraciones se calcularon y no se comprobaron experimentalmente.
8.4 Formación de tiazolidina a partir de H-Cys(H)-HES50/0.7 y ADN modificado con formilindol
Se añadió una disolución de derivado de HES50/0.7 (4 !l, 147,5 mg/ml, véase la tabla 1) en tampón de reacción (véase la tabla 2 a continuación en el presente documento) a una disolución acuosa de ADN modificado con 30 formilindol (1,4 !l, 2 mg/ml), obtenida tal como se describe en 8.1. Tras la incubación durante 14 h a 21ºC, se analizó la mezcla de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa. Se emplearon un sistema Agagel Standard y una fuente de alimentación Minicell Power Pack P20 (ambos de Biometra GmbH, Göttingen, D). Se usó agarosa al 2% NEEO Ultra-Qualität (Carl Roth GmbH, + Co. KG, Karlsruhe, D) junto con un tampón de transferencia 0,5 x TBE durante 1 h a 55 V. Se emplearon un sistema de documentación de geles Doc 2000 junto con el software Quality
35 One V4, 0.3 (ambos de BIO-RAD Laboratories, Múnich, D). Los resultados de los experimentos pueden observarse en la figura 2.
Tabla 2: Condiciones de reacción
Derivado de HES50/0.7
Tampón de reacción
H-Cys(H)-HES50/0.7, tal como se obtuvo en 7.4.
Acetato de sodio, 0,1 M, pH 4,6, EDTA 10 mM
Oxo-HES50/0.7, (Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
Acetato de sodio, 0,1 M, pH 4,6, EDTA 10 mM
H-Cys(H)-HES50/0.7, tal como se obtuvo en 7.4.
Fosfato de sodio, 0,1 M, pH 8,0, EDTA 5 mM
Oxo-HES50/0.7, (Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
Fosfato de sodio, 0,1 M, pH 8,0, EDTA 5 mM
40 8.5 Formación de tiazolidina a partir de H-Cys(H)-HES50/0.7 y ADN modificado con FBA
Se añadió una disolución de derivado de HES50/0.7 (4 !l, 147,5 mg/ml, véase la tabla 3 a continuación en el presente documento) en un tampón de reacción (véase la tabla 3 a continuación en el presente documento) a una disolución acuosa de ADN modificado con FBA (1,5 !l, 2 mg/ml), obtenida tal como se describe en 8.3. Tras la
45 incubación durante 14 h a 21ºC, se analizó la mezcla de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa tal como se describe en 8.4. Los resultados de los experimentos pueden observarse en la figura 3.
Tabla 3: Condiciones de reacción
Derivado de HES50/0.7
Tampón de reacción
H-Cys(H)-HES50/0.7, tal como se obtuvo en 7.4.
Acetato de sodio, 0,1 M, pH 4,6, EDTA 10 mM
Oxo-HES50/0.7, (Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
Acetato de sodio, 0,1 M, pH 4,6, EDTA 10 mM
H-Cys(H)-HES50/0.7, tal como se obtuvo en 7.4.
Fosfato de sodio, 0,1 M, pH 8,0, EDTA 5 mM
Oxo-HES50/0.7, (Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
Fosfato de sodio, 0,1 M, pH 8,0, EDTA 5 mM
50 9. Conjugación con moléculas orgánicas pequeñas (en este caso: antibióticos (daunorubicina) y citostáticos
(tilosina))
Conjugación con moléculas orgánicas pequeñas mediante formación de tiazolidina
5 Se disolvió H-Cys(H)-HES50/0.7 (11,0 mg), obtenido tal como se describe en 7.4, en una disolución de moléculas orgánicas pequeñas (44 !l, que tiene concentración [A] mg/ml, 13,4 equiv., véase la tabla 4 a continuación en el presente documento) en DMF (véase la tabla 4 a continuación en el presente documento), se incubó a 21ºC durante la noche y se analizaron 40 !l de la mezcla de reacción mediante HPLC. Los resultados de los experimentos pueden observarse en la figuras 4 a 9.
10 Se emplearon daunorubicina (Fluka, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D) y tilosina tartrato (ambos de BioChemika, Fluka, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D) como moléculas orgánicas pequeñas.
Para el análisis mediante HPLC, se usaron una columna ReproSil-PUR Basic C18, 150 x 4,6 mm de d.i. (n.º de
15 pedido R15.B9.S1546, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, D) y un sistema de cromatografía Akta Basic (Bomba P900 n.º de serie 01118816, detector UV UV900 n.º de serie 01120613, detector de pH/conductividad pH/C900 n.º de serie 01120665, colector de fracciones Frac900 n.º de serie 01120011 y software Unicorn 5.0 n.º de serie 01119821, todos de Amersham Biosciences, Freiburg, D).
20 Se aplicó el siguiente método para todos los análisis:
-
Tampón A: agua con TFA al 0,1% (Rotisolv calidad para CL-EM, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D)
-
Tampón B: A mezcla de 15% de agua con TFA al 0,1 % y 85% de acetonitrilo con TFA al 0,1% (ambos de Rotisolv calidad para CL-EM, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D).
25 - Gradiente: 0% de tampón B en 2 volúmenes de columna (CV); gradiente lineal 0 - 50% de tampón B en 15 CV, gradiente lineal 50 - 100% de tampón B en 7 CV, 100% de tampón B para 7 CV, 0% de tampón B para 5 CV.
-
Detección UV a 220 y 290 nm.
-
Velocidad de flujo: 2 ml/min.
30 Tabla 4: Condiciones de reacción
Moléculas orgánicas pequeñas
Concentración [A] / (mg/ml)
Daunorubicina
43,0
Tilosina
80,7
10. Formación de tiazolidina a partir de H-Cys-Péptido y HES nativo (no según la invención)
Se añadió una disolución de un péptido que porta un resto de cisteína libre en su extremo N-terminal (1 !l, 20 !g,
35 2528 g/mol, 20 mg/ml en DMF, Secuencia H-Cys-Asn-Thr-Arg-Lys-Arg-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-PheVal-Thr-Ile-Gly-Lys-OH, SC623, NeoMPS S.A., Estrasburgo, F) a 9 !l de una disolución de HES10/0.7 (408 mg/ml en [tampón de reacción] (véase la tabla 5 a continuación), PM = 9,2 kDa, GS = 0,7, Lote 437, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D), se añadió disolución Triton-X100 (1 !l, 10% en agua) a reacciones seleccionadas (véase la tabla 5 a continuación) y se incubaron las mezclas durante la noche a [B] ºC (véase la tabla
40 5 a continuación). Para el análisis mediante electroforesis en gel de SDS, se emplearon un dispositivo XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y una fuente de alimentación Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usó un gel Bis/Tris al 10% junto con un tampón de transferencia MOPS en condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) según las instrucciones de los fabricantes. Los resultados del experimento pueden observarse en La figura 10.
45 Tabla 5: Condiciones de reacción
Carril
[Tampón de reacción] [B] / ºC Triton-X100
A
DMF 21 -
B
DMF 37 -
C
DMF 50 -
D
NaOAc 0,1 M, pH 4,6, EDTA 10 mM 50 -
E
DMF 50 -
F
NaOAc 0,1 M, pH 4,6, EDTA 10 mM 50 1 !l
G
DMF 50 1 !l
* sin HES
11. Resultados de los experimentos según los puntos 8 a 10 anteriores 50 11.1 Conjugación con ADN mediante formación de tiazolidina (punto 8 anterior)
Se logró la conjugación con ADN mediante la formación de tiazolidina con dos ADN modificados con aldehído diferentes (véase el punto 8 anteriormente en el presente documento). Los ADN-aldehídos necesarios o bien estaban comercialmente disponibles en el caso de ADN modificado con formilindol (véase el punto 8.1 anteriormente en el presente documento) o bien se prepararon a partir de 5’-amino-ADN y 4-formilbenzoato de succinimidilo comercialmente disponibles (véase el punto 8,3 anteriormente en el presente documento). El HES que contiene el grupo alfa-SH-beta-amino (H-Cys(H)-HES50/0.7) se preparó a partir de H-Cys(StBu)-HES50/0.7 mediante reducción con TCEP y se purificó mediante precipitación y diálisis (véase el punto 7.4 anteriormente en el presente documento). H-Cys(StBu)-HES50/0.7 se preparó en analogía con H-Cys(StBu)-HES10/0.4 (véase el punto 4.1 anteriormente en el presente documento). Los resultados de la conjugación con ambos ADN modificados con aldehído se muestran en la figura 3. La conjugación satisfactoria se indicó mediante la aparición de una nueva banda en el peso molecular superior. Su ancho de banda aumentado se debió a la distribución del peso molecular de la parte de HES del conjugado. La conjugación se logró a pH 4,6 (carril A) o a pH 8,0 (carril C). No se observó conjugación con OxoHES50/0.7, el material de partida para H-Cys(H)-HES50/0.7 (carriles B y D).
11.2 Conjugación con moléculas orgánicas pequeñas (punto 9 anterior)
Se logró la conjugación con compuestos orgánicos pequeños mediante la formación de tiazolidina para un fármaco citostático (daunorubicina, véase la figura 4 más adelante en el presente documento) y un antibiótico (tilosina, véase la figura 7 más adelante en el presente documento). El material de partida de HES que contiene el grupo alfa-SHbeta-amino (la misma concentración que en la reacción de conjugación) apareció como una banda ancha con un tiempo de retención de aproximadamente 10 min. (Véanse las figuras 6, 9 más adelante en el presente documento). Su ancho de pico aumentado se debió a la distribución de peso molecular distribución del HES. Los análisis de HPLC de los compuestos orgánicos pequeños (la misma concentración que en la reacción de conjugación) se muestran en las figuras 5 y 8. La conjugación satisfactoria se indica mediante la aparición de un nuevo pico ancho a tiempos de retención entre los del material de partida de HES y los del compuesto orgánico pequeño (figuras 4 y 7). De nuevo, la forma de pico ancho reflejó la distribución de peso molecular de la parte de HES del conjugado.
11.3 Conjugación usando HES nativo (punto 10 anterior) (no según la invención)
Se logró la conjugación con HES nativo mediante la formación de tiazolidina para un péptido que portaba un resto de cisteína libre en su extremo N-terminal (véase el punto 10 anteriormente en el presente documento) en DMF como disolvente en un intervalo de temperatura de entre 21 ºC y 50º C (figura 10, carriles A, B y E) o en tampón acuoso a pH 4,6 a 50ºC (figura 10, carril D). También se observó conjugación en presencia del detergente Triton X-100 a 50ºC (figura 10, carriles F y G). La conjugación satisfactoria se indicó mediante la aparición de una nueva banda a peso molecular superior. Su ancho de banda aumentado se debió a la distribución de peso molecular de la parte de HES del conjugado.
Por tanto, pudo demostrarse que en general es posible la conjugación de HES nativo con un Cys-péptido, incluso a diversas condiciones diferentes, tal como se señala en el punto 6 anteriormente en el presente documento.

Claims (31)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Método para preparar un conjugado de un principio activo e hidroxialquilalmidón, en la que el principio activo y el hidroxialquilalmidón se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula
    o la fórmula (I’)
    o la fórmula (I”)
    en las que R1, R2, R2’, R3, R3’ y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo alquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo y heteroaralquilo lineal, cíclico y/o ramificado, opcionalmente sustituido de manera adecuada, preferiblemente hidrógeno,
    20 comprendiendo dicho método
    (A) hacer reaccionar un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal de un derivado de
    hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal con un grupo 25 alfa-SH-beta-amino
    de un principio activo o un derivado del mismo que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (1); o con un grupo alfa-SH-beta-amino
    de un principio activo o un derivado del mismo que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I’), o con un grupo alfa-SH-beta-amino
    10 de un principio activo o un derivado del mismo que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I”), en la que R1, R2, R2’, R3, R3’ y R4 son tal como se definieron anteriormente; o
    15 (B) hacer reaccionar un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal de un principio activo o un derivado del mismo que comprende dicho grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal con un grupo alfa-SH-beta-amino
    20 de un derivado de hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I); o con un grupo alfa-SH-beta-amino
    de un derivado de hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I’); o con un grupo alfa-SH-beta-amino
    35 de un derivado de hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino, preparando de ese modo un conjugado de dicho principio activo y dicho hidroxialquilalmidón que se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I”), en la que R1, R2, R2’, R3, R3’ y R4 son tal como se definieron anteriormente
    40 y en la que el derivado de hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o dicho grupo alfa-SH-beta-amino se obtiene mediante un método que comprende hacer reaccionar el hidroxialquilalmidón con al menos un compuesto, al menos bifuncional, comprendiendo dicho compuesto dos grupos funcionales M1 y Q, haciéndose reaccionar un grupo funcional M1 con el hidroxialquilalmidón y siendo un grupo funcional Q
    (i)
    un grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o un grupo alfa-SH-beta-amino; o
    (ii)
    un grupo funcional que se modifica químicamente para dar el grupo aldehído, grupo ceto, grupo
    hemiacetal o el grupo alfa-SH-beta-amino.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que el hidroxialquilalmidón tiene la estructura siguiente (II)
    10 en la que R’, R” y R”’ son independientemente hidrógeno, un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado o el grupo
    -
    [(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-OH
    15 en el que R1, R2, R3, y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupo alquilo, preferiblemente hidrógeno y grupo metilo,
    m es de 2 a 4, en el que los residuos R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes en los m grupos CR1R2;
    20 n es de 0 a 20, preferiblemente de 0 a 4;
    o es de 0 a 20, preferiblemente 2-4, en el que en el caso de que n = 0, o no es 0, y en el que los residuos R3 y R4 pueden ser iguales o diferentes en los o grupos CR3R4;
    25 en la que, preferiblemente, R’, R” y R”’ son independientemente hidrógeno o un grupo 2-hidroxietilo.
  3. 3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el hidroxialquilalmidón es hidroxietilalmidón, y en el que, preferiblemente, el hidroxietilalmidón tiene un peso molecular de desde 1 hasta 300 kD, más preferiblemente desde 2 hasta 200 kD, más preferiblemente desde 10 hasta 150 KD o de 4 a 130 kD, más
    30 preferiblemente desde 10 hasta 100 kD; y/o una sustitución molar de desde 0,1 hasta 3, más preferiblemente de 0,1 a 2, más preferiblemente de 0,1 a 0,9 o de 0,4 a 2, más preferiblemente de 0,4 a 1,3; y/o una razón entre la sustitución C2:C6 en el intervalo de desde 2 hasta 20 con respecto a los grupos hidroxietilo.
    35 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el principio activo se selecciona del grupo que consiste en proteínas, péptidos, fármacos de moléculas pequeñas, glicoproteínas y oligonucleótidos, tales como ADN, ARN, ANP o derivados de los mismos, preferiblemente del grupo que consiste en proteínas, péptidos y ANP que comprenden un grupo alfa-SH-beta-amino, preferiblemente que comprenden un grupo cisteína, en particular una cisteína N-terminal, en el que la proteína se selecciona preferiblemente
    40 del grupo que consiste en EPO, G-CSF, IFN alfa, IFN beta, AT III, IL-2, IL-3, mioglobina, SOD, BSA, EPOrh, G-CSFrh, IFNrh alfa, IFNrh beta, ATrh III, ILrh-2, ILrh-3, A1AT, factor VII, factor VIII, factor IX, APt y APC.
  4. 5. Método según la reivindicación 4, en el que el principio activo se selecciona del grupo que consiste en proteínas, glicoproteínas o péptidos que comprenden un aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal,
    45 preferiblemente glicoproteínas que contienen un aldehído en una cadena lateral de glicano o péptidos sintéticos.
  5. 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el derivado de hidroxialquilalmidón comprende de 1 a 100, preferiblemente de 1 a 15, en particular 1 grupo(s) aldehído, grupo(s) ceto y/o
    50 grupos(s) hemiacetal o en el que el derivado de hidroxialquilalmidón comprende de 1 a 100, preferiblemente de 1 a 15, en particular 1 grupo(s) alfa-SH-beta-amino.
  6. 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el principio activo comprende de 1 a 15, preferiblemente de 1 a 8, en particular 1 grupo(s) aldehído, grupo(s) ceto y/o grupos(s) hemiacetal o en
    55 el que el principio activo comprende de 1 a 15, preferiblemente de 1 a 8, en particular 1 grupo(s) alfa-SHbeta-amino.
  7. 8.
    Método según las reivindicaciones 1 a 7, en el que el grupo funcional M1 se hace reaccionar con un grupo OH en el hidroxialquilalmidón o el extremo reductor oxidado o no oxidado del hidroxialquilalmidón.
  8. 9.
    Método según las reivindicaciones 1 a 7, en el que el grupo funcional M1 es un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo y el grupo funcional Q es un grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal, en el que el compuesto bifuncional que comprende M1 y Q se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en ácido formilbenzoico, éster pentafluorofenílico del ácido 4-formilbenzoico, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 4-folmilbenzoico y ácido 4-(4-formil-3,5-dimetoxifenoxi)butírico o un compuesto biocompatible seleccionado del grupo que consiste en ácidos alfa-ceto carboxílicos, ácidos neuramínicos o derivados de los mismos y fosfato de piridoxal.
  9. 10.
    Método según las reivindicaciones 1 a 7, en el que en (ii), el compuesto al menos bifuncional comprende un grupo amino M1 y un grupo amino Q, y en el que el compuesto al menos bifuncional es preferiblemente un diaminoalcano opcionalmente sustituido que tiene desde 1 hasta 20 átomos de carbono, seleccionándose más preferiblemente un compuesto del grupo que consiste en 1,2-diaminoetano, 1,3-diaminopropano y 1,4diaminobutano, 1,5-diaminopentano, 1,6-diaminohexano, 1,7-diaminoheptano, 1,8-diaminooctano, 1,9diaminononano, 1,10-diaminodecano, 1,11-diaminoundecano, 1,12-diaminododecano, 1,13diaminotridecano, 1,14-diaminotetradecano, 1,15-diaminopentadecano, 1,16-diaminohexadecano, 1,17diaminoheptadecano, 1,18-diaminooctadecano, 1,19-diaminononadecano y 1,20-diaminoeicosano o un compuesto que tiene la fórmula
    H2N-[(CR1’R2’)pO]q[CR3’R4’]r-NH2
    en la que R1’, R2’, R3’, y R4’ se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupo alquilo, preferiblemente hidrógeno y grupo metilo,
    p es de 2 a 4, en el que los residuos R1’ y R2’ pueden ser iguales o diferentes en los p grupos CR1’R2’,
    q es de 0 a 20, preferiblemente de 0 a 10;
    r es de 0 a 20, preferiblemente 2-4, en la que en caso de que q = 0, r no es 0, y en la que los residuos R3’ y R4’ pueden ser iguales o diferentes en los r grupos CR3’R4’.
  10. 11.
    Método según la reivindicación 10, que comprende adicionalmente hacer reaccionar el derivado de hidroxialquilalmidón, que resulta de la reacción del hidroxialquilalmidón con el compuesto al menos bifuncional que comprende dos grupos aminos M1 y Q, en el grupo amino Q con un compuesto bifuncional adicional que comprende un grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal para dar un derivado de hidroxialquilalmidón que tiene un grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal, en el que elcompuesto bifuncional adicional se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en ácido formilbenzoico, éster pentafluorofenílico del ácido 4-formilbenzoico, éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 4-folmilbenzoico, ácido 4-(4-formil-3,5-dimetoxifenoxi)butírico y anhídrido de ácido 4-formilbenzoico.
  11. 12.
    Método según la reivindicación 10 u 11, en el que el hidroxialquilalmidón se hace reaccionar a través de su extremo reductor opcionalmente oxidado con el grupo funcional M1, y en el que, de manera preferible, estadísticamente más del 50%, más preferiblemente al menos el 55%, más preferiblemente al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 65%, más preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, y todavía más preferiblemente al menos el 95% tal como el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de las moléculas de hidroxialquilalmidón empleadas para una reacción dada se hacen reaccionar a través de al menos un extremo reductor opcionalmente oxidado por molécula de hidroxialquilalmidón.
  12. 13.
    Método según las reivindicaciones 1 a 7, en el que en (i), el grupo funcional M1 se selecciona del grupo que consiste en un grupo carboxilo, un grupo carboxilo reactivo, anhídrido de ácido carboxílico, halogenuro de ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, éster del ácido clorofórmico y grupos epóxido y el grupo funcional Q es un grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal, en el que el grupo funcional M1 se hace reaccionar preferiblemente con grupos OH en el hidroxialquilalmidón.
  13. 14.
    Método según las reivindicaciones 1 a 7, en el que en (i), el grupo funcional M1 se selecciona del grupo que consiste en un grupo amino y un grupo alfa-SH-beta-amino y el grupo funcional Q es un grupo alfa-SH-betaamino, y en el que el grupo funcional M1 se hace reaccionar preferiblemente con el extremo reductor opcionalmente oxidado del hidroxialquilalmidón, en el que, de manera preferible, estadísticamente más del 50%, más preferiblemente al menos el 55%, más preferiblemente al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 65%, más preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, y todavía más preferiblemente al menos el 95% tal como el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de
    las moléculas de hidroxialquilalmidón empleadas para una reacción dada se hacen reaccionar a través de al menos un extremo reductor opcionalmente oxidado por molécula de hidroxialquilalmidón.
  14. 15.
    Método según las reivindicaciones 1 a 7, en el que en (i), el hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino se obtiene mediante un método que comprende hacer reaccionar hidroxialquilalmidón en el extremo reductor opcionalmente oxidado con un compuesto que comprende un grupo funcional M1 y un grupo funcional Q que es un grupo alfa-SH-beta-amino, en el que el compuesto que comprende M1 y el grupo alfa-SH-beta-amino es preferiblemente 1,3-diamino-2-tiopropano o 2,3-diamino-1tiopropano.
  15. 16.
    Método según las reivindicaciones 1 a 7, en el que en (ii) el compuesto al menos bifuncional comprende M1 que es un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo y Q que es un grupo alfa-SH-beta-amino protegido.
  16. 17.
    Método según las reivindicaciones 1 a 7, en el que el compuesto al menos bifuncional se selecciona del grupo que consiste en D-, L-PG1-Cys(PG2)-OH, o una mezcla racémica del mismo, y su éster activo, en el que PG1 puede ser cualquier grupo protector adecuado para un grupo amino, seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en terc-butiloxicarbonilo (Boc) o 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), y PG2 puede ser cualquier grupo protector adecuado para un grupo tiol, seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en tritilo (Trt), p-metoxitritilo (Mmt) S-terc-butiltio (S-t-Bu), y acetamidometilo (Acm).
  17. 18.
    Método según las reivindicaciones 1 a 7, en el que en (ii), el hidroxialquilalmidón que comprende dicho grupo alfa-SH-beta-amino se obtiene mediante un método que comprende oxidar opcionalmente el hidroxialquilalmidón en su extremo reductor, hacer reaccionar el extremo reductor oxidado o no oxidado con un grupo funcional M1 de un compuesto que comprende, además de M1, un grupo funcional Q adicional, para dar un primer derivado de hidroxialquilalmidón, y hacer reaccionar el grupo funcional Q del primer derivado de hidroxialquilalmidón con un grupo funcional V de un compuesto que comprende, además de V, un grupo alfa-SH-beta-amino opcionalmente protegido, para dar el derivado de hidroxialquilalmidón funcionalizado con alfa-SH-beta amino opcionalmente protegido, y en el que el compuesto que comprende M1 y Q es un compuesto de diamino o carbodiimidazol o carbonato de N,N’-disuccinimidilo, en el que el compuesto al menos bifuncional es preferiblemente un diaminoalcano opcionalmente sustituido que tiene desde 1 hasta 20 átomos de carbono, seleccionándose más preferiblemente un compuesto del grupo que consiste en 1,2-diaminoetano, 1,3-diaminopropano y 1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano, 1,6diaminohexano, 1,7-diaminoheptano, 1,8-diaminooctano, 1,9-diaminononano, 1,10-diaminodecano, 1,11diaminoundecano, 1,12-diaminododecano, 1,13-diaminotridecano, 1,14-diaminotetradecano, 1,15diaminopentadecano, 1,16-diaminohexadecano, 1,17-diaminoheptadecano, 1,18-diaminooctadecano, 1,19diaminononadecano y 1,20-diaminoeicosano o un compuesto que tiene la fórmula
    H2N-[(CR1’R2’)pO]q[CR3’R4’]r-NH2
    en la que R1’, R2’, R3’, y R4’ se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupo alquilo, preferiblemente hidrógeno y grupo metilo,
    p es de 2 a 4, en la que los residuos R1’ y R2’ pueden ser iguales o diferentes en los p grupos CR1’R2’,
    q es de 0 a 20, preferiblemente de 0 a 10;
    r es de 0 a 20, preferiblemente 2-4, en la que en caso de que q = 0, r no es 0, y en la que los residuos R3’ y R4’ pueden ser iguales o diferentes en los r grupos CR3’R4;
    y en el que el compuesto que comprende V y el grupo alfa-SH-beta-amino opcionalmente protegido es preferiblemente cisteína o un derivado del mismo, siendo V un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo, preferiblemente un éster reactivo o un anhídrido de ácido carboxílico o el compuesto que comprende V es 1,3-diamino-2-tiopropano o 2,3-diamino-1-tiopropano.
  18. 19. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el principio activo, preferiblemente una proteína, péptido, péptido sintético u oligonucleótido opcionalmente modificado, que comprende dicho grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o dicho grupo alfa-SH-beta-amino se obtiene mediante un método que comprende
    (b)(1) introducir al menos un grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o al menos un grupo alfa-SHbeta-amino en el principio activo durante su preparación o mediante modificación química, o
    (b)(2) hacer reaccionar el principio activo con un compuesto al menos bifuncional, comprendiendo dicho compuesto dos grupos funcionales M2 y Q, haciéndose reaccionar un grupo funcional M2 con el principio activo y siendo un grupo funcional Q
    (i)
    un grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o un grupo alfa-SH-beta-amino; o
    (ii)
    un grupo funcional que se modifica químicamente para dar el grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o un grupo alfa-SH-beta-amino.
  19. 20.
    Método según la reivindicación 19, en el que en (b)(1), el principio activo es una proteína o péptido que se preparó mediante síntesis orgánica, producido preferiblemente usando una resina de síntesis, permitiendo obtener una proteína o péptido funcionalizado con aldehído, funcionalizado con ceto, funcionalizado con hemiacetal o funcionalizado con alfa-SH-beta-amino, o en el que en (b)(1), el principio activo es una proteína o péptido que se produjo usando un vector de expresión que conduce a una proteína o péptido funcionalizado con aldehído, funcionalizado con ceto, funcionalizado con hemiacetal o funcionalizado con alfa-SH-beta-amino, o en el que en (b)(1), el principio activo es una proteína o un péptido y estando sustituida la estructura principal de la proteína o péptido con un grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal o grupo alfa-SH-beta-amino, o en el que en (b) (1), el principio activo es una proteína o un péptido donde dicho grupo aldehído, grupo ceto , grupo hemiacetal o dicho grupo alfa-SH-beta-amino se une directamente a la estructura principal de la proteína o péptido o es parte de una cadena lateral de la estructura principal.
  20. 21.
    Método según la reivindicación 19, en el que en (b)(1), el principio activo es una proteína o péptido y el grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal está comprendido en un resto de hidrato de carbono del polipéptido,
    siendo preferiblemente el resto de hidrato de carbono un derivado de un resto de hidrato de carbono que se produce de manera natural y se selecciona del grupo que consiste en glucosa, galactosa, manosa y ácido siálico, que está opcionalmente oxidado por vía química o enzimática, preferiblemente un residuo de galactosa oxidada o de ácido siálico oxidado de una cadena lateral de hidrato de carbono, más preferiblemente el residuo de galactosa o ácido siálico terminal de una cadena lateral de hidrato de carbono, realizándose la oxidación de un resto de hidrato de carbono terminal preferiblemente o bien por vía enzimática o bien por vía química, llevándose a cabo la oxidación química preferiblemente usando un peryodato,
    o el resto de hidrato de carbono se selecciona del grupo que consiste en hidroxialdehídos, hidroxicetonas y modificaciones químicas de los mismos,
    o el resto de hidrato de carbono es un derivado de un resto de hidrato de carbono que se produce de manera natural y es una galactosa terminal, que se oxida por vía química o enzimática, obteniéndose opcionalmente el residuo de galactosa terminal tras la escisión de un ácido siálico terminal.
  21. 22.
    Método según la reivindicación 19, en el que en (b)(2)(i), el grupo alfa-SH-beta-amino está comprendido en un resto de cisteína del principio activo, preferiblemente una proteína o péptido, siendo preferiblemente el resto de cisteína un residuo de cisteína N-terminal del principio activo.
  22. 23.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el principio activo es una proteína o péptido modificado con un residuo de cisteína N-terminal, que no es parte de un puente disulfuro, en el que la proteína o péptido modificado que posee un residuo de cisteína N-terminal es preferiblemente un mutante de una proteína o péptido que se produce de manera natural, obtenido mediante (1) añadiendo un resto de cisteína al aminoácido N-terminal, (2) sustituyendo el aminoácido N-terminal con cisteína, o (3) delecionando el/los aminoácido(s) N-terminal(es) hasta que se obtiene una cisteína terminal.
  23. 24.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la reacción (A) o (B) se lleva a cabo a una temperatura de 0 a 40ºC, preferiblemente de 0 a 25ºC, en particular de 20 a 25ºC, en presencia de un disolvente, y a un pH de 3,5 a 10, preferiblemente de 4 a 8, en particular de 4,8 a 8,0 con un tiempo de reacción de preferiblemente 0,1 a 24 h, en particular de aproximadamente 21 h, en el que, preferiblemente, el disolvente se selecciona del grupo que consiste en agua, tampón acuoso, DMF, DMSO, DMA y mezclas de los mismos y/o la razón molecular de hidroxialquilalmidón con respecto al principio activo es de aproximadamente 1:1 a 200:1, preferiblemente de 10:1 a 100:1, en particular de 40:1 a 70:1.
  24. 25.
    Conjugado de un principio activo e hidroxialquilalmidón, tal como puede obtenerse mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.
  25. 26.
    Conjugado de un principio activo e hidroxialquilalmidón, en el que el principio activo y el hidroxialquilalmidón se unen covalentemente mediante un residuo químico que tiene una estructura según la fórmula (I)
    o la fórmula (I’)
    o la fórmula (I”)
    10 en las que R1, R2, R2’, R3, R3’ y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo alquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo y heteroaralquilo lineal, cíclico y/o ramificado, opcionalmente sustituido de manera adecuada, preferiblemente hidrógeno,
    15 teniendo dicho conjugado una estructura según la fórmula (IV), (IV’) o (IV”) en las que HAS’ es el residuo del derivado de hidroxialquilalmidón que se unió a un grupo aldehído, grupo ceto o grupo hemiacetal haciendo reaccionar el hidroxialquilalmidón con al menos un compuesto, al menos bifuncional, comprendiendo dicho compuesto dos grupos funcionales M1 y Q, haciéndose reaccionar un
    10 grupo funcional M1 con el hidroxialquilalmidón y siendo un grupo funcional Q
    (i) un grupo aldehído, grupo ceto, grupo hemiacetal; o
    (ii) un grupo funcional que se modifica químicamente para dar el grupo aldehído, grupo ceto, grupo 15 hemiacetal,
    y en las que AS’ es el residuo del principio activo o un derivado del mismo que se unió al grupo alfa-SHbeta-amino,
    20 o una estructura según la fórmula (V), (V’) o (V”)
    en las que HAS’ es el residuo del derivado de hidroxialquilalmidón que se unió al grupo alfa-SH-beta-amino
    mediante un método que comprende hacer reaccionar el hidroxialquilalmidón con al menos un compuesto,
    al menos bifuncional, comprendiendo dicho compuesto dos grupos funcionales M1 y Q, haciéndose
    10
    reaccionar un grupo funcional M1 con el hidroxialquilalmidón y siendo un grupo funcional Q
    (i) un grupo alfa-SH-beta-amino; o
    (ii) un grupo funcional que se modifica químicamente para dar el grupo alfa-SH-beta-amino,
    15
    y en las que AS’ es el residuo del principio activo o un derivado del mismo que se unió al grupo aldehído,
    grupo ceto o grupo hemiacetal.
  26. 27.
    Conjugado según la reivindicación 26, seleccionándose el conjugado del grupo que consiste en
    20
    en las que R5 es tal como se definió para de R1 a R4 anteriormente,
    en las que R5 es tal como se definió para de R1 a R4 anteriormente,
    y
    10
    en las que en las fórmulas IV’a, IV’b, V’b o V’c, n es un número entero, preferiblemente n es de 0 a 20, y en
    las que en las fórmulas Va, Vb, V’d, o V’e, n es un número entero, preferiblemente n es de 1 a 20.
  27. 28.
    Conjugado según la reivindicación 26, siendo el conjugado
    15
    en la que R’, R” y/o R”’ son tal como se definen para la fórmula II y en la que, en al menos una unidad de
    glucosa de HES, al menos uno de R’, R” y/o R”’ se selecciona independientemente del grupo que consiste en
    10 y
    y en las que n es un número entero, preferiblemente de 1 a 20 y/o en las que al menos uno de R’, R” y/o R”’
    15
    es -(CH2CH2O)m-R#, en la que m es un número entero, preferiblemente de 1 a 3, y R4 se selecciona del
    grupo que consiste en las fórmulas (VIa), (VIb), VIc) y (VId).
  28. 29.
    Derivado de hidroxialquilalmidón funcionalizado con alfa-SH-beta-amino seleccionado del grupo que
    consiste en
    20
    en la que R5 es tal como se definió para de R1 a R4 anteriormente, y en la que n es un número entero, preferiblemente de 0 a 20, o el grupo que consiste en
    en la que R’, R” y/o R”’ son tal como se definen para la fórmula II y en la que en al menos una unidad de glucosa de HES, al menos uno de R’, R” y/o R”’ se selecciona independientemente del grupo que consiste en
    y
    y en las que n es un número entero, preferiblemente de 1 a 20 y/o en las que al menos uno de R’, R” y/o R”’ es -(CH2CH2O)m-R##, en la que m es un número entero, preferiblemente de 1 a 3, y R## se selecciona del 20 grupo que consiste en las fórmulas (VI’a), (VI’b) y (VI’c).
  29. 30. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, para su uso en un método para el tratamiento de un cuerpo humano o de animal.
    25 31. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, como agente terapéutico.
  30. 32. Composición farmacéutica que comprende un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, que comprende además preferiblemente al menos un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptables.
  31. 33. Composición que comprende un conjugado de un principio activo e hidroxialquilalmidón según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28.
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10209821A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209822A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
WO2004024761A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin
BRPI0413450A (pt) * 2003-08-08 2006-10-17 Fresenius Kabi De Gmbh conjugados de hidroxialquil amido e g-csf
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
EP1732609B1 (en) * 2004-03-11 2012-07-11 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
JP5191729B2 (ja) 2004-03-11 2013-05-08 フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 還元的アミノ化によって製造される、ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲート
AU2006222187A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material by conjugation with hydroxyalkylstarch
EP2197919B1 (en) 2007-08-27 2014-04-09 ratiopharm GmbH Liquid formulation of g-csf conjugate
KR101695807B1 (ko) 2008-07-25 2017-01-13 비이브 헬쓰케어 컴퍼니 화합물
SG171731A1 (en) 2008-12-11 2011-07-28 Glaxosmithkline Llc Processes and intermediates for carbamoylpyridone hiv integrase inhibitors
EP2376080B1 (en) 2008-12-11 2017-09-13 Shionogi&Co., Ltd. Synthesis of carbamoylpyridone hiv integrase inhibitors and intermediates
TWI518084B (zh) 2009-03-26 2016-01-21 鹽野義製藥股份有限公司 哌喃酮與吡啶酮衍生物之製造方法
TWI582097B (zh) 2010-03-23 2017-05-11 Ｖｉｉｖ醫療保健公司 製備胺甲醯吡啶酮衍生物及中間體之方法
JP2014521594A (ja) 2011-05-25 2014-08-28 アミリン・ファーマシューティカルズ，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 長持続期間デュアルホルモンコンジュゲート
EP2537866A1 (en) 2011-06-21 2012-12-26 Serumwerk Bernburg AG Hydroxyethyl starch derivatives, method for manufacturing the same and therapeutical uses thereof
EP3812376A4 (en) * 2018-06-20 2022-08-17 Santolecan Pharmaceuticals LLC PACLITAXEL-LIPID-POLYSACCHARIDE DOUBLE-TYPE CONJUGATE, METHOD FOR PREPARING IT AND ITS USE
CN113214620B (zh) * 2021-05-25 2022-06-21 湖北工业大学 一种环氧基有机改性蒙脱土的制备方法及应用
CN115385973B (zh) * 2022-07-13 2023-06-06 康龙化成(宁波)科技发展有限公司 寡聚核酸-四氢噻唑类化合物在基因编码化合物库合成上的应用
CN116448996B (zh) * 2023-03-22 2023-11-21 卡秋(江苏)生物科技有限公司 一种串珠结构的多聚酶-抗体复合物的制备方法

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US581476A (en) * 1897-04-27 Shaft for stamp-mills
US3191291A (en) * 1959-01-21 1965-06-29 Continental Can Co Art of producing very thin steel and like sheets in wide strips
CH397115A (de) * 1960-10-04 1965-08-15 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher Farbstoffe
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4125492A (en) * 1974-05-31 1978-11-14 Pedro Cuatrecasas Affinity chromatography of vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers
US4001401A (en) * 1975-02-02 1977-01-04 Alza Corporation Blood substitute and blood plasma expander comprising polyhemoglobin
US4001200A (en) * 1975-02-27 1977-01-04 Alza Corporation Novel polymerized, cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4053590A (en) * 1975-02-27 1977-10-11 Alza Corporation Compositions of matter comprising macromolecular hemoglobin
CA1055932A (en) * 1975-10-22 1979-06-05 Hematech Inc. Blood substitute based on hemoglobin
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
FR2378094A2 (fr) * 1977-01-24 1978-08-18 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux reactifs biologiques constitues par des supports solides sur lesquels sont couples des composes organiques comportant un residu glucidique
US4454161A (en) * 1981-02-07 1984-06-12 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Process for the production of branching enzyme, and a method for improving the qualities of food products therewith
JPS57206622A (en) * 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
EP0127839B1 (en) 1983-05-27 1992-07-15 THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
IL77081A (en) 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5217998A (en) * 1985-07-02 1993-06-08 Biomedical Frontiers, Inc. Composition for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
FR2600894B1 (fr) * 1986-07-02 1989-01-13 Centre Nat Rech Scient Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
US5214132A (en) * 1986-12-23 1993-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5362853A (en) * 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US4863984A (en) * 1987-09-03 1989-09-05 General Electric Company Flame retardant extrudate of polypheylene ether blends, and method of making
JP2594123B2 (ja) * 1987-09-12 1997-03-26 株式会社林原生物化学研究所 減感作剤
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
FR2630329B1 (fr) * 1988-04-20 1991-07-05 Merieux Inst Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
US4900780A (en) * 1988-05-25 1990-02-13 Masonic Medical Research Laboratory Acellular resuscitative fluid
US4925677A (en) * 1988-08-31 1990-05-15 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US5420105A (en) * 1988-09-23 1995-05-30 Gustavson; Linda M. Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation
US5218092A (en) * 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
DE3836600A1 (de) * 1988-10-27 1990-05-03 Wolff Walsrode Ag Kohlensaeureester von polysacchariden und verfahren zu ihrer herstellung
ATE135370T1 (de) * 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US6261800B1 (en) * 1989-05-05 2001-07-17 Genentech, Inc. Luteinizing hormone/choriogonadotropin (LH/CG) receptor
DE19975071I2 (de) * 1989-06-16 2000-02-03 Fresenius Ag Hydroxyethylstaerke als Plasmaexpander Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung als kolloidales Plasmaersatzmittel
JP2896580B2 (ja) * 1989-08-25 1999-05-31 チッソ株式会社 アミロース―リゾチームハイブリッドと活性化糖およびその製造法
JP2838800B2 (ja) * 1989-09-02 1998-12-16 株式会社林原生物化学研究所 減感作剤
EP0456557B1 (en) * 1990-05-07 1995-03-01 Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. Foamable silicone rubber composition
US5169784A (en) 1990-09-17 1992-12-08 The Texas A & M University System Baculovirus dual promoter expression vector
DK130991D0 (da) * 1991-07-04 1991-07-04 Immunodex K S Polymere konjugater
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
DE4130807A1 (de) * 1991-09-17 1993-03-18 Wolff Walsrode Ag Verfahren zur herstellung von polysaccharidcarbonaten
US6172208B1 (en) * 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
GB2270920B (en) * 1992-09-25 1997-04-02 Univ Keele Alginate-bioactive agent conjugates
EP0601417A3 (de) * 1992-12-11 1998-07-01 Hoechst Aktiengesellschaft Physiologisch verträglicher und physiologisch abbaubarer, Kohlenhydratrezeptorblocker auf Polymerbasis, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
US5589356A (en) * 1993-06-21 1996-12-31 Vanderbilt University Litigation of sidechain unprotected peptides via a masked glycoaldehyde ester and O,N-acyl rearrangement
US5840900A (en) * 1993-10-20 1998-11-24 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5876980A (en) * 1995-04-11 1999-03-02 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of oligosaccharides
WO1996040662A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
US5736533A (en) * 1995-06-07 1998-04-07 Neose Technologies, Inc. Bacterial inhibition with an oligosaccharide compound
US5723589A (en) * 1995-12-21 1998-03-03 Icn Pharmaceuticals Carbohydrate conjugated bio-active compounds
JP3737518B2 (ja) * 1996-03-12 2006-01-18 ピージー−ティーエックスエル カンパニー， エル．ピー． 水溶性パクリタキセルプロドラッグ
DE19628705A1 (de) * 1996-07-08 1998-01-15 Fresenius Ag Neue Sauerstoff-Transport-Mittel, diese enthaltende Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als Blutersatzstoffe
US5770645A (en) * 1996-08-02 1998-06-23 Duke University Medical Center Polymers for delivering nitric oxide in vivo
US5851984A (en) * 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
US6011008A (en) * 1997-01-08 2000-01-04 Yissum Research Developement Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Conjugates of biologically active substances
US5952347A (en) * 1997-03-13 1999-09-14 Merck & Co., Inc. Quinoline leukotriene antagonists
US6299881B1 (en) * 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
CA2299271C (en) * 1997-08-07 2009-02-03 University Of Utah Prodrugs and conjugates of thiol- and selenol- containing compounds and methods of use thereof
US5847110A (en) * 1997-08-15 1998-12-08 Biomedical Frontiers, Inc. Method of reducing a schiff base
US6875594B2 (en) * 1997-11-13 2005-04-05 The Rockefeller University Methods of ligating expressed proteins
US6596135B1 (en) * 1998-03-05 2003-07-22 Asahi Glass Company, Limited Sputtering target, transparent conductive film, and method for producing the same
CA2233725A1 (en) * 1998-03-31 1999-09-30 Hemosol Inc. Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6555660B2 (en) * 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6749865B2 (en) * 2000-02-15 2004-06-15 Genzyme Corporation Modification of biopolymers for improved drug delivery
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
US7118737B2 (en) * 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
DE10112825A1 (de) * 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10129369C1 (de) * 2001-06-21 2003-03-06 Fresenius Kabi De Gmbh Wasserlösliches, einen Aminozucker aufweisendes Antibiotikum in Form eines Pol ysaccharid-Konjugats
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
US7179617B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US7125843B2 (en) * 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
DE50214456D1 (de) * 2001-10-26 2010-07-08 Noxxon Pharma Ag Modifizierte l-nukleinsäure
US6375846B1 (en) * 2001-11-01 2002-04-23 Harry Wellington Jarrett Cyanogen bromide-activation of hydroxyls on silica for high pressure affinity chromatography
DE10155098A1 (de) * 2001-11-09 2003-05-22 Supramol Parenteral Colloids Mittel zur Prävention von mykotischen Kontaminationen bei der Zell- und Gewebekultur bakteriellen, pflanzlichen, animalischen und humanen Ursprungs, bestehend aus Polyen-Makrolid-Konjugaten mit Polysacchariden
US6916962B2 (en) * 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
DE10209822A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
AU2003249692B2 (en) * 2002-06-03 2008-07-31 The Institute For Systems Biology Methods for quantitative proteome analysis of glycoproteins
ES2897470T3 (es) * 2002-09-09 2022-03-01 Nektar Therapeutics Alcanales poliméricos solubles en agua
DE10242076A1 (de) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh HAS-Allergen-Konjugate
WO2004024761A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin
EP1549350B1 (en) * 2002-10-08 2008-09-24 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
JP4075722B2 (ja) * 2003-07-22 2008-04-16 日産自動車株式会社 車両用表示制御装置
WO2005014024A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
EP1732609B1 (en) * 2004-03-11 2012-07-11 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
JP5191729B2 (ja) * 2004-03-11 2013-05-08 フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 還元的アミノ化によって製造される、ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲート
TW200603818A (en) * 2004-03-11 2006-02-01 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyethyl starch and erythropoietin
AU2006222187A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material by conjugation with hydroxyalkylstarch
EP2070951A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
EP2070950A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation

Also Published As

Publication number Publication date
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