BRPI0615732A2 - conjugados de amido de hidroxialquila e uma substáncia ativa preparada por ligação quìmica por meio de tiazolidina - Google Patents

conjugados de amido de hidroxialquila e uma substáncia ativa preparada por ligação quìmica por meio de tiazolidina Download PDF

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BRPI0615732A2
BRPI0615732A2 BRPI0615732-7A BRPI0615732A BRPI0615732A2 BR PI0615732 A2 BRPI0615732 A2 BR PI0615732A2 BR PI0615732 A BRPI0615732 A BR PI0615732A BR PI0615732 A2 BRPI0615732 A2 BR PI0615732A2
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Fresenius Kabi De Gmbh
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Abstract

CONJUGADOS DE AMIDO DE HIDROXIALQUILA E UMA SUBSTáNCIA ATIVA PREPARADA POR LIGAçãO QUìMICA POR MEIO DE TIAZOLIDINA. A presente invenção refere-se a um método para preparar conjugados de uma substância ativa e amido de hidroxialquila e a conjugados de uma substância ativa e amido de hidroxialquila, preferivelmente amido de hidroxietila, em que os conjugados são preparados ligando-se covalente- mente o amido de hidroxialquila e a substância ativa por um resíduo químico tendo uma estrutura de acordo com a fórmula (1) (1') (1") em que R~ 1~, R~ 2~, R~ 2~, R~ 3~, R~ 3~ e R~ 4~ são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, um grupo heteroaralquila, aralquila, heteroarila, arila ealquila opcionalmente adequadamente substituído, linear, cíclico e/ou ramificado, preferivelmente hidrogênio.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONJUGA-DOS DE AMIDO DE HIDROXIALQUILA E UMA SUBSTÂNCIA ATIVAPREPARADA POR LIGAÇÃO QUÍMICA POR MEIO DE TIAZOLIDINA".
A presente invenção refere-se a um método para preparar con-jugados de uma substância ativa e amido de hidroxialquila e a conjugadosde uma substância ativa e amido de hidroxialquila, preferivelmente amido dehidroxietila, em que os conjugados são preparados ligando-se covalente-mente o amido de hidroxialquila e a substância ativa por um resíduo químicotendo uma estrutura de acordo com a fórmula (I)
<formula>formula see original document page 2</formula>
em que R1, R2, R2-, R3, R3' e R4 são independentemente selecionados a par-tir do grupo consistindo em hidrogênio, um grupo heteroalquila, aralquila,heteroarila, arila e alquila opcionalmente adequadamente substituído, linear,cíclico e/ou ramificado, preferivelmente hidrogênio.
WO n° 03/031581 A2 descreve um método de conjugação de umderivado de polímero a um polipeptídeo tendo um resíduo de histidina oucisteína no terminal N, em que o referido método compreende fornecer umpolipeptídeo tendo um resíduo de cisteína ou histidina no terminal N, forne-cendo um polímero terminado por tioéster, o polímero compreendendo umacadeia principal de polímero não peptídico e solúvel em água, preferivelmen-te um polímero de polietileno glicol, e reagir o derivado de polímero e o poli-peptídeo. Como polímeros, poli(alquileno glicol), copolímero de etileno glicole propileno glicol, poli(poliol oxietilado), poli(álcool olefínico), po-li(vinilpirrolidona), poli(ácido alfa-hidróxi), poli(álcool de vinila), polifosfazeno,polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina), poliacrilato, poliacrilamidas, polissaca-rídeos, e copolímeros, terpolímeros e misturas destes são empregados. To-dos os polímeros explicitamente descritos são polímeros de polietilenoglicol.
A despeito do progresso de métodos de acoplamento e uso demoléculas de PEG monofuncionais, uma desvantagem geral de fármacosPEGuiIados é que a trilha de metabolização de PEG como um polímero nãonatural não é conhecida em detalhes.
Além disso, um método geral para formar dendrímeros de peptí-deo com ligações de oxima, hidrazona e tiazolidina é conhecido de J. AmChem Soe. 1995, 117, 3893-3899. Peptídeos desprotegidos como blocos deconstrução e ligação seletiva entre um aldeído e uma base fraca são descri-tos nesse ponto.
WO 99/07719 A1 descreve pró-fármacos e conjugados de com-postos contendo seleonol e tiol e métodos de uso destes. Entre vários outroscompostos, um pró-fármaco é descrito o qual é preparado pela reação deéster de etila de L-cisteína e uma D-ribose, um monossacarídeo, o referidopró-fármaco contendo um anel de tiazolidina. Como fórmula geral para omonossacarídeo, (CHOH)nCH2OH com η = 1 a 5 é descrito. Nem mesmo osdissacarídeos, muito menos compostos poliméricos moleculares elevados talcomo amido, em particular amido de hidroxialquila, são descritos em combi-nação com a formação de anéis de tiazolidina.
Portanto, foi um objetivo da presente invenção fornecer novosconjugados de uma substância ativa e um polímero formado por ligação co-valente onde nenhum polialquileno glicol, especialmente nenhum polietilenoglicol é empregado como polímero.
Conseqüentemente, foi outro objetivo da presente invenção for-necer um método para preparar estes conjugados.
A solução destes problemas é um método para preparar um con-jugado de uma substância ativa e amido de hidroxialquila, em que a subs-tância ativa e o amido de hidroxialquila são covalentemente ligados por umresíduo químico tendo uma estrutura de acordo com a fórmula (I)
<formula>formula see original document page 4</formula>
em que R1, R2, R2', R3, R3' e R4 são independentemente selecionados a par-tir do grupo que consiste em hidrogênio, um grupo heteroalquila, aralquila,heteroarila, arila e alquila opcionalmente adequadamente substituído, linear,cíclico e/ou ramificado, preferivelmente hidrogênio, o referido método com-preendendo
(A) reagir um grupo aldeído, um grupo ceto ou um grupohemiacetal de um amido de hidroxialquila ou um derivado deste compreen-dendo o referido grupo aldeído, grupo ceto ou grupo hemiacetal com umgrupo alfa-SH-beta amino
<formula>formula see original document page 5</formula>
de uma substância ativa ou um derivado desta compreendendo o referidogrupo alfa-SH-beta amino, desse modo preparando um conjugado da referi-da substância ativa e do referido amido de hidroxialquila sendo covalente-mente ligado por um resíduo químico tendo uma estrutura de acordo comfórmula (I); ou com um grupo alfa-SH-beta amino
<formula>formula see original document page 5</formula>
de uma substância ativa ou um derivado desta compreendendo o referidogrupo alfa-SH-beta amino, desse modo preparando um conjugado da referi-da substância ativa e do referido amido de hidroxialquila sendo covalente-mente ligado por um resíduo químico tendo uma estrutura de acordo com afórmula (Γ), ou com um grupo alfa-SH-beta amino
<formula>formula see original document page 5</formula>
de uma substância ativa ou um derivado desta compreendendo o referidogrupo alfa-SH-beta amino, desse modo preparando um conjugado da referi-da substância ativa e do referido amido de hidroxialquila sendo covalente-mente ligado por um resíduo químico tendo uma estrutura de acordo comfórmula (I"), em que R-ι, R2, R2-. R3» R3· e R4 são como definidos acima;ou
(B) reagir um grupo aldeído, um grupo ceto ou um grupo hemia-cetal de uma substância ativa ou um derivado desta compreendendo o refe-rido grupo aldeído, grupo ceto ou grupo hemiacetal com um grupo alfa-SH-beta amino
<formula>formula see original document page 5</formula>de um derivado de amido de hidroxialquila compreendendo o referido grupoalfa-SH-beta amino, desse modo preparando um conjugado da referidasubstância ativa e do referido amido de hidroxialquila sendo covalentementeligado por um resíduo químico tendo uma estrutura de acordo com fórmula(I); ou com um grupo alfa-SH-beta amino
<formula>formula see original document page 6</formula>
de um derivado de amido de hidroxialquila compreendendo o referido grupoalfa-SH-beta amino, desse modo preparando um conjugado da referidasubstância ativa e do referido amido de hidroxialquila sendo covalentementeligado por um resíduo químico tendo uma estrutura de acordo com fórmula(I'); ou com um grupo alfa-SH-beta amino
<formula>formula see original document page 6</formula>
de um derivado de amido de hidroxialquila compreendendo o referido grupoalfa-SH-beta amino, desse modo preparando um conjugado da referidasubstância ativa e do referido amido de hidroxialquila sendo covalentementeligado por um resíduo químico tendo uma estrutura de acordo com fórmula(lM), em que Ri, R2, R2-, R3> R3' e R4 são como definidos acima.
Portanto, o termo "grupo alfa-SH-beta-amino "quando emprega-do no contexto da presente invenção refere-se a um grupo etileno no qualum grupo SH opcionalmente protegido é ligado a um átomo de carbono e umgrupo amino primário ou secundário opcionalmente protegido é ligado aoátomo de carbono próximo. As ligações nas fórmulas anteriores em que, emuma extremidade destas nenhum resíduo é indicado, são aquelas ligaçõesem que o amido de hidroxialquila ou a substância ativa é ligado.
O termo "alquila" quando empregado no contexto da invenção épreferivelmente um grupo alquila tendo 1 a 20, mais preferido 1 a 10 e emparticular 1 a 4 átomos de carbono, a menos que definido diferentemente emseguida.O termo "arila" quaipdo empregado no contexto da invenção épreferivelmente um grupo arila tendo 6 a 20, mais preferido 6 a 14 e em par-ticular 6 átomos de carbono, a menos que definido diferentemente em se-guida.
O termo "heteroarila1 quando empregado no contexto da inven-ção é preferivelmente um grupo heteroarila tendo 6 a 20, mais preferido 6 a14 e em particular 6 átomos de Icarbono e em que pelo menos um, preferi-velmente 1 a 3, em particular 1, dos átomos de carbono é substituído por umheteroátomo, tal como S, N e/ou O, a menos que definido diferentemente emseguida.
O termo "aralquila" qjuando empregado no contexto da invençãoé preferivelmente um grupo arila ligado através de um grupo alquila ao res-tante do composto, a menos que definido diferentemente em seguida.
O termo "alcarila" quando empregado no contexto da invenção épreferivelmente um grupo alquila i ligado através de um grupo arila ao restan-te do composto, a menos que defjinido diferentemente em seguida.
O termo "heteroaral(puila" quando empregado no contexto dainvenção é preferivelmente um gifupo heteroarila ligado através de um grupoalquila ao restante do composto, a menos que definido diferentemente emseguida.
O termo "opcionalmente adequadamente substituído" quandoempregado no contexto da invehção preferivelmente significa que 1 a 10,mais preferido 1 a 4, em particular 1 substituinte está presente, a menos quedefinido diferentemente em seguida.
O termo "substância ativa" quando empregado no contexto dapresente invenção refere-se a uma substância que pode afetar qualquerpropriedade física ou bioquímica de um organismo biológico incluindo, masnão limitado a, vírus, bactérias, fungos, plantas, animais e seres humanos.Em particular, o termo "substância ativa" quando empregado no contexto dapresente invenção refere-se a uma substância destinada para diagnóstico,cura, mitigação, tratamento ou prevenção de doença em seres humanos ouanimais, ou para de outra maneira realçar o bem-estar físico ou mental deseres humanos ou animais. Exemplos de substâncias ativas incluem, masnão estão limitados a, peptídeos, proteínas, enzimas, fármacos de moléculapequena, tinturas, lipídios, nucleosídeos, nucleotídeos, oligonucleotídeos,polinucleotídeos, ácidos nucléicos, células, vírus, lipossomas, micropartícu-Ias, e micelas.
Exemplos de proteínas incluem, mas não estão limitados a, eri-tropoietina (EPO) tal como EPO recombinante humana (rhEPO), fatores es-timuladores de colônia (CSF), tal como G-CSF como G-CSF humano re-combinante (rhG-CSF), alfa-interferon (IFN alfa), beta-interferon (IFN beta)ou gama-interferon (IFN gama), tal como IFN alfa ou IFN beta recombinantehumano ou (rhIFN alfa ou rhIFN beta), interleucinas, por exemplo, IL-1 a IL-18 tal como IL-2 ou IL-3 como IL-2 ou IL-3 recombinante humano (rhlL-2 ourhlL-3), proteínas de soro tal como fatores de coagulação Il-Xlll como fatorVIII, alfa 1-antitripsina (AIAT), proteína ativada C (APC), ativadores de plas-minogênio tal como ativador de plasminogênio tipo tecido (tPA), tal comoativador de plasminogênio de tecido humano (hTPA), AT Ill tal como AT Illhumano recombinante (rhAT III), mioglobina, albumina tal como albumina desoro bovino (BSA), fatores de crescimento, tal como fator de crescimentoepidérmico (EGF), fator de crescimento de trombócito (PDGF), fator de cres-cimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento derivado de cérebro(BDGF)1 fator de crescimento de nervo (NGF), fator de crescimento de célulaB (BCGF)1 fator de crescimento neurotrófico derivado de cérebro (BDNF)1fator neurotrófico ciliar (CNTF), fatores de crescimento transformadores talcomo TGF alfa ou TGF beta, BMP (proteínas morfogênicas ósseas), hormô-nios de crescimento hormônio de crescimento humano, fatores de necrosede tumor tal como TNF alfa ou TNF beta, somatostatina (peptídeo), somato-tropina, somatomedinas, hemoglobina, hormônios ou proormônios tal comoinsulina, gonadotropina, hormônio estimulador de melanócito (alfa-MSH),triptorrelina, hormônios hiptalâmicos tais como hormônios antidiuréticos (A-DH) e oxitocina bem como hormônios Iiberadores e hormônios inibidores deliberação, hormônio da paratireóide, hormônios da tireóide tais como tiroxina,tirotropina, tiroliberina, prolactina, calcitonina, glucagon, peptídeos similaresa glucagon (GLP-I, GLP-2 etc.), exendinas tal como exendina-4, leptina, va-sopressina, gastrina, secretina, integrinas, hormônios de glicoproteína (porexemplo, LH1 FSH etc.), hormônios estimuladores de melanosídeo, Iipoprote-ínas e apo-lipoproteínas tais como apo-B, apo-E, apo-La, imunoglobulinastais como IgG, IgE, IgM, IgA, IgD e fragmentos destas, hirudina, inibidor datrilha de tecido, proteínas de planta tal como Iectina ou ricina, veneno de a-belha, veneno de cobra, imunotoxinas, antígeno E, inibidor de alfa-proteinase, alergênio de erva-de-santiago, melanina, proteínas de oligolisina,proteínas de RGD ou receptores opcionalmente correspondentes para umadestas proteínas; ou um derivado funcional ou fragmento de quaisquer des-tas proteínas ou receptores. Em uma modalidade particularmente preferida,a substância ativa é EPO, em particular EPO oxidada como descrito no se-guinte.
Exemplos de enzimas incluem, mas não estão limitados a, enzi-mas específicas de carboidrato, enzimas proteolíticas, oxidases, oxidorre-ductases, transferases, hidrolases, liases, isomerases, cinases e ligases.Exemplos não Iimitantes específicos são asparaginase, arginase, argininadesaminase, adenosina desaminase, glutaminase, glutaminase-asparaginase, fenilalanina, triptofanase, tirosinase, superóxido dismutase(SOD), endotoxinase, catalase, peroxidase, calicreína, tripsina, quimiotripsi-na, elastase, termolisina, lipase, uricase, adenosina difosfatase, purina nu-cleosídeo fosforilase, bilirrubina oxidase, glicose oxidase, glicodase, glicona-to oxidase, galactosidase, glicocerebrosidase, glicuronidase, hialuronidase,fator de tecido, estreptocinase, urocinase, Mapa-cinases, DNA1 RNAses,lactoferrina e derivados funcionais ou fragmentos destes.
De acordo com uma alternativa da presente invenção, a subs-tância ativa é uma fármaco de molécula pequena, um peptídeo e/ou umaproteína.
Entre outros, as proteínas seguintes devem ser mencionadasexplicitamente: eritropoietina (EPO) tal como EPO recombinante humana(rhEPO), fatores estimuladores de colônia (CSF), tal como EPO recombinan-te humana (rhEPO), fatores estimuladores de colônia (CSF), tal como G-CSF como G-CSF humano recombinante (rhG-CSF), alfa-interferon (IFNalfa), beta-interferon (IFN beta) ou gama-interferon (IFN gama), tal como IFNalfa ou IFN beta recombinante humano (rhIFN alfa ou rhIFN beta), proteínasde soro tal como fatores de coagulação Il-Xlll como fator VII, fator VIII, oufator IX, alfa 1-antitripsina (AIAT), proteína ativada C (APC), ativadores deplasminogênio tal como ativâdor de plasminogênio tipo tecido (tPA), tal comoativador de plasminogênio de tecido humano (hTPA), AT Ill tal como AT Illhumano recombinante (rhAT III).
Exemplos para peptídeos incluem ACTH, adrenomedulina, pro-teína beta-amilóide, angiotensina I, angiotensina II, peptídeo natriurético atri-al (ANP), fragmentos de anticorpo, bradicinina, peptídeo natriurético de cé-rebro tipo B (BNP), calcitonina, fator Iiberador de corticotropina (CRF), en-dorfinas, endotelinas, encefalinas, gastrina, peptídeo relacionado à gastrina,polipeptídeo inibidor gástrico (GIP), peptídeo Iiberador de gastrina (GRP),glucagon, peptídeos similar a glucagon, fator Iiberador do hormônio de cres-cimento (GRF), fator de crescimento de hepatócito, insulinas, hormônio Iibe-rador de gonadotropina (LH-RH, GnRH), neurocininas, oxitocina, paratormô-nio, somatostatina, substância P, hormônio Iiberador de tirotropina (TRH),peptídeo intestinal vasoativo (VIP), e vasopressina.
A substância ativa é selecionada preferivelmente a partir do gru-po composto de antibióticos, antidepressivos, antidiabéticos, antidiuréticos,anticolinérgicos, antiarrítmicos, antieméticos, antitussígenos, antiepilépticos,anti-histamínicos, antimicóticos, anti-simpatotônicos, antitrombóticos, andro-gênio, antiandrogênios, estrogênios, antiestrogênios, antiosteoporóticos, a-gentes antitumor, vasodilatadores, outros agentes anti-hipertensivos, agen-tes antipiréticos, analgésicos, agentes antiinflamatórios, β-bloqueadores,citoestáticos, imunossupressores e vitaminas.
Alguns exemplos adicionais, não restritivos de substâncias ati-vas são albuterol, alendronato, amicazim, ampicilina, amoxicilina, anfoterici- na B, atenolol, azatioprina, cefaclor, cefadroxil, cefotaxima, ceftazidima, cef-triaxona, cilastatina, cimetidina, ciprofloxacina, clonidina, colistina, cosintro-pina, ciclosserina, daunorrubicina, doxorrubicina, desmopressina, diidroergo-tamina, dobutamina, dopamina, efedrina, epinefrina, ácido ε-aminocapróico,ergometrina, esmolol, famotidina, flecainida, ácido fólico, flucitosína, furose-mida, ganciclovir, gentamicina, glucagon, hidrazalina, imipenem, isoprotere-nol, cetamina, liotironina, LHRH, merpatricina, metaraminol, metildopa, me-toclopramida, metoprolol, mexiletina, mitomicina, neomicina, netilmicina, ni-modipina, nistatina, octreotídeo, oxitocina, pamidronato, pentamidina, fento-lamina1 fenilefrina, procainamida, procaína, propranolol, ritodrina, sotalol,teicoplanina, terbutalina, tiamina, tiludronato, tolazolina, trimetoprim, trome-tamina, tilosina, vancomicína, vasopressina e vimblastina.
De acordo com uma alternativa, alguém pode tentar tambémempregar rifamicina, tetraciclina, espectomicina, estreptomicina ou eritromi-cina como substâncias ativas.
Exemplos para um oligonucleotídeo são aptâmeros, DNA, RNA1PNA ou derivados destes.
No contexto da presente invenção, o termo "amido de hidroxial-quila" (TEM) refere-se a um derivado de amido que foi substituído por pelomenos um grupo hidroxialquila. Um amido de hidroxialquila preferido da pre-sente invenção tem uma constituição de acordo com a fórmula (II)
em que R', R" e R"' são independentemente hidrogênio, um grupo hidroxial-quila Iinearou ramificado ou o grupo
—((CR1R2)mOUCR3R V-OH
em que R1, R2, R31 e R4 são selecionados independentemente a partir dogrupo, consistindo em hidrogênio e grupo alquila, preferivelmente hidrogênioe grupo metila,m é 2 a 4, em que os resíduos R1 e R2 podem ser os mesmos ou diferentesnos grupos m CR1R2; η é 0 a 20, preferivelmente 0 a 4; o é 0 a 20, preferi-velmente 2 a 4, em que no caso de η = 0, o não é 0, e em que os resíduosR3 e R4 poçlem ser os mesmos ou diferentes nos grupos o CR3R4,onde o resíduo HAS" junto com a porção de glicose terminal constitui a mo-lécula HAS, isto é, fórmula (II) mostra uma molécula HAS, a porção de car-boidrato terminal da qual é mostrada explicitamente, a parte restante do a-mido da molécula sendo HAS".
Na fórmula (II) a extremidade de redução da molécula de amidoé mostrada na forma não oxidada e a unidade de sacarídeo terminal de HASé mostrado na forma de hemiacetal que, dependendo, por exemplo, do sol-vente, pode estar em equilíbrio com a forma de aldeído. A abreviação HAS"quando empregada no contexto da presente invenção refere-se a moléculaHAS sem a unidade de sacarídeo terminal na extremidade de redução damolécula HAS.
O termo amido de hidroxialquila quando empregado na presenteinvenção não está limitado a compostos onde a porção de carboidrato termi-nal compreende grupos hidroxialquila R', R" e/ou R1" como descrito, devido àbrevidade, na fórmula (II), mas também se refere aos compostos em quepelo menos um grupo hidroxialquila que está em qualquer lugar presente, naporção de carboidrato terminal e/ou na parte restante da molécula de amido,HAS", é substituído por um grupo hidroxialquila R', R", ou R'".
Amido de hidroxialquila compreendendo dois ou mais gruposhidroxialquila é da mesma forma possível.
O pelo menos um grupo hidroxialquila compreendido em HASpode conter um ou mais, em particular, dois ou mais grupos hidróxi. De a-cordo com uma modalidade preferida, o pelo menos um grupo hidroxialquilacompreendido em HAS contém um grupo hidróxi.
A expressão "amido de hidroxialquila" da mesma forma incluiderivados em que o grupo alquila é mono ou polissubstituído. Neste contex-to, é preferido que o grupo alquila seja substituído com um halogênio, espe-cialmente flúor, ou com um grupo arila. Além disso, o grupo hidróxi de umgrupo hidroxialquila pode ser esterificado ou eterificado.
Além disso, em vez de alquila, da mesma forma grupos alcenonão substituídos ou substituídos ramificados ou lineares podem ser empre-gados.
Amido de hidroxialquila é um derivado de éter de amido. Alémdos referidos derivados de éter, da mesma forma outros derivados de amidopodem ser empregados no contexto da presente invenção. Por exemplo,derivados são úteis os quais compreendem grupos hidróxi esterifiçados.Estes derivados podem ser, por exemplo, derivados de ácidos mono ou di-carboxílicos não substituídos com 2-12 átomos de carbono ou de derivadossubstituídos destes. Especialmente úteis são derivados de ácidos monocar-boxílicos não substituídos com 2-6 átomos de carbono, especialmente deri-vados de ácido acético. Neste contexto, amido de acetila, amido de butirila eamido de propionila são preferidos.
Além disso, derivados de ácidos dicarboxílicos não substituídoscom 2-6 átomos de carbono são preferidos.
No caso de derivado de ácidos dicarboxílicos, é útil que o se-gundo grupo carbóxi do ácido dicarboxílico é da mesma forma esterificado.Além disso, derivados de ésteres de monoalquila de ácidos dicarboxílicossão da mesma forma adequados no contexto da presente invenção.
Para os ácidos mono ou dicarboxílicos dissubstituídos, os gru-pos substituídos podem ser preferivelmente os mesmos como mencionadoacima para resíduos de alquila substituídos.
Técnicas para a esterificação de amido são conhecidas na técni-ca (vide, por exemplo, Klemm D. e outros, Comprehensive Cellulose Che-mistry Vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York, especialmente capí-tulo 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9).
De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção,amido de hidroxialquila de acordo com a fórmula supracitada (II) é emprega-do. As outras estruturas de anel de sacarídeo compreendidas em HAS" po-dem ser iguais como ou diferentes do anel de sacarídeo explicitamente des-crito, com a diferença que eles necessitam de uma extremidade de redução.Até onde os resíduos R', R" e R'" de acordo com a fórmula (II)estão envolvidos não há nenhuma limitação específica. De acordo com umamodalidade preferida, R', R" e R'" são independentemente hidrogênio ou umgrupo hidroxialquila, um grupo hidroxiaralquila ou um grupo hidroxialcarilatendo de 2 a 10 átomos de carbono no resíduo de alquila respectivo. Hidro-gênio e grupos hidroxialquila tendo de 2 a 10 são preferidos. Mais preferi-velmente, o grupo hidroxialquila tem de 2 a 6 átomos de carbono, mais pre-ferivelmente de 2 a 4 átomos de carbono, e ainda mais preferivelmente de 2a 3 átomos de carbono. Em uma modalidade preferida, amido de hidroxial-quila é amido de hidroxietila em que R', R" e R'" são independentementehidrogênio ou um grupo (CH2CH2O)n-H, em que η é um número inteiro, pre-ferivelmente 0,1,2, 3, 4, 5, ou 6.
"Amido de hidroxialquila", portanto, preferivelmente compreendeamido de hidroxietila, amido de hidroxipropilá e amido de hidroxibutila, emque o amido de hidroxietila e amido de hidroxipropilá são particularmentepreferidos e amido de hidroxietila é o mais preferido.
O grupo alquila, aralquila e/ou alcarila pode ser linear ou ramifi-cado e adequadamente substituído.
Portanto, a presente invenção da mesma forma refere-se a ummétodo e um conjugado como descrito acima em que R', R" e R"' são inde-pendentemente hidrogênio ou um grupo hidroxialquila linear ou ramificadocom a partir de 2 a 6 átomos de carbono.
Desse modo, R', R" e R'" preferivelmente pode ser H, hidroxiexi-la, hidroxipentila, hidroxibutila, hidroxipropilá tais como 2-hidroxipropila, 3-hidroxipropilá, 2-hidroxiisopropila, hidroxietila tal como 2-hidroxietila, hidro-gênio e o grupo 2-hidroxietila sendo especialmente preferido.
Portanto, a presente invenção da mesma forma refere-se a ummétodo e a um conjugado como descrito acima em que R', R" e R'" são in-dependentemente hidrogênio ou um grupo 2-hidroxietila, uma modalidadeem que pelo menos um resíduo R', R" e R'" sendo 2-hidroxietila sendo es-pecialmente preferido.
Amido de hidroxietila (HES) é o mais preferido para todas asmodalidades da presente invenção.
Portanto, a presente invenção refere-se ao método e ao conju-gado como descrito acima, em que o polímero é amido de hidroxietila e oderivado de polímero é um derivado de amido de hidroxietila.
Amido de hidroxietila (HES) é um derivado de amilopectina deocorrência natural e é degradado por alfa-amilase no corpo. HES é um deri-vado substituído da amilopectina do polímero de carboidrato, que está pre-sente em amido de milho em uma concentração de até 95% em peso. HESexibe propriedades biológicas vantajosas e é empregado como um agentede substituição de volume de sangue e na terapia de hemodiluição nas clíni-cas (Sommermeyer e outros, 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; eWeidlere outros, 1991, Arzneim. - Forschung/Drug Res., 41, 494-498).
Amilopectina consiste em porções de glicose, em que na cadeiaprincipal, ligações alfa-1,4-glicosídicas principais estão presentes e nos sí-tios de ramificação, ligações alfa-1,6-glicosídicas são encontradas. As pro-priedades físico-químicas desta molécula são principalmente determinadaspelo tipo de ligações glicosídicas. Devido à ligação alfa-1,4-glicosídica mar-cada, estruturas helicoidais com aproximadamente seis monômeros de gli-cose sucessivamente são produzidas. As propriedades físico-química comotambém as bioquímicas do polímero podem ser modificadas por meio desubstituição. A introdução de um grupo hidroxietila pode ser obtida por meiode hidroxietilação alcalina. Adaptando-se as condições de reação é possívelexplorar a reatividade diferente do grupo hidróxi respectivo no monômero deglicose não substituído com respeito a uma hidroxietilação. Devido a estefato, a pessoa versada pode influenciar o padrão de substituição a uma ex-tensão limitada.
HES é principalmente caracterizado pela distribuição de pesomolecular e pelo grau de substituição. Há duas possibilidades de descrevero grau de substituição:
1.0 grau de substituição pode ser descrito com relação à por-ção de monômeros de glicose substituídos com respeito a todas as porçõesde glicose.2. O grau de substituição pode ser descrito como a substituiçãomolar, em que o número de grupos hidroxietila por porção de glicose é des-crito.
No contexto da presente invenção, o grau de substituição, deno-tado como DS, refere-se à substituição molar, como descrito acima (vide damesma forma Sommermeyer e outros, 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8),271 -278, como citado acima, em particular p. 273).
Soluções de HES estão presentes como composições polidis-persas, em que cada molécula difere-se da outra com respeito ao grau depolimerização, o número e padrão de sítios de ramificação, e o padrão desubstituição. HES é, portanto, uma mistura de compostos com peso molecu-lar diferente. Por conseguinte, uma solução de HES particular é determinadapor peso molecular médio com a ajuda de médias estatísticos. Neste contex-to, Mn é calculado como a média aritmética que depende do número de mo-léculas. Alternativamente, Pm (ou PM), o peso molecular médio ponderado,representa uma unidade que depende da massa do HES.
Preferivelmente, o amido de hidroxialquila empregado na inven-ção tem um peso molecular médio (média de peso) da partir de 1 a 300 kD.Amido de hidroxietila pode também exibir uma substituição molar preferidade 0,1 a 3, preferivelmente 0,1 a 2, mais preferido 0,1 a 0,9 ou 0,4 a 2, prefe-rivelmente 0,4 a 1,3, e uma relação preferida entre substituição de C2 : C6na faixa de 2 a 20 com respeito aos grupos hidroxietila.
O termo "peso molecular médio" quando empregado no contextoda presente invenção refere-se ao peso como determinado de acordo com ométodo LALLS-(dispersão de luz à laser de ângulo inferior)-GPC como des-crito em Sommermeyer e outros, 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; e Weidler e outros, 1991, Arzneim.- Forschung/Drug Res., 41, 494-498.Para pesos moleculares médios de 10 kD e menores, adicionalmente, o cali-bre foi realizado com um padrão que foi previamente qualificado por LALLS-GPC.
De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção,o peso molecular médio de amido de hidroxietila empregado é de 1 a 300kD, mais preferivelmente de 2 a 200 kD, mais preferivelmente de 10 a 150ou 4 a 130 kD, mais preferivelmente de 10 a 100 kD.
Um exemplo de HES que tem um peso molecular médio de cer-ca de 1 a 300 kD, preferivelmente 10 a 100 kD é um HES com uma substitu-ição molar de 0,1 a 3, preferivelmente 0,4 a 1,3, tal como 0,4, 0,5, 0,6, 0,7,0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, ou 1,3, preferivelmente de 0,7 a 1,3, tal como 0,7, 0,8,0,9, 1,0, 1,1, 1,2, ou 1,3.
Um exemplo para HES com um peso molecular médio de cercade 130 kD é Voluven® de Fresenius. Voluven® é um colóide artifical, empre-gado, por exemplo, para substituição de volume empregado na indicaçãoterapêutica para terapia e profilaxia de hipovolemia. As características deVoluven® são um peso molecular médio de 130.000 +/- 20.000 D, uma subs-tituição molar de 0,4 e uma relação de C2 : C6 de cerca de 9 : 1.
A presente invenção também se refere a um método e a conju-gados como descrito acima em que o amido de hidroxialquila é amido dehidroxietila tendo um peso molecular médio de 10 a 150 kD, preferivelmentede 10 a 100 kD.
Faixas preferidas do peso molecular médio são, por exemplo, 10a 150 kD, ou 10 a 130 kD, ou 30 a 130 kD, ou 50 a 130 kD, ou 70 a 130 kD,ou 100 a 130 kD, ou 10 a 100 kD, ou 4 a 100 kD, ou 10 a 100 kD, ou 12 a100 kD, ou 18 a 100 kD, ou 50 a 100 kD, ou 4 a 70 kD, ou 10 a 70 kD, ou 12a 70 kD, ou 18 a 70 kD, ou 50 a 70 kD, ou 4 a 50 kD ou 10 a 50 kD, ou 12 a50 kD, ou 18 a 50 kD, ou 4 a 18 kD, ou 10 a 18 kD, ou 12 a 18 kD, ou 4 a 12kD, ou 10 a 12 kD, ou 4 a 10 kD.
De acordo com modalidades particularmente preferidas da pre-sente invenção, o peso molecular médio de amido de hidroxietila empregadoestá na faixa de mais de 4 kD e abaixo de 150 kD, tal como cerca de 10 kD,ou na faixa de 9 a 10 kD ou de 10 a 11 kD ou de 9 a 11 kD, ou cerca de 12kD, ou na faixa de 11 a 12 kD ou de 12 a 13 kD ou de 11 a 13 kD, ou cercade 15 kD, ou na faixa de 14 a 15 ou de 15 a 16 kD, ou cerca de 18 kD, ou nafaixa de 17 a 18 kD ou de 18 a 19 kD ou de 17 a 19 kD, ou cerca de 50 kD,ou na faixa de 49 a 50 kD ou de 50 a 51 kD ou de 49 a 51 kD, ou cerca de56 kD, ou na faixa de 55 a 56 kD ou de 56 a 57 kD.
De acordo com outra modalidade particularmente preferida dapresente invenção, o peso molecular médio de amido de hidroxietila empre-gado está na faixa de mais de 60 kD e até 130 kD, tal como cerca de 70 kDou na faixa de 65 a 75 kD, ou cerca de 80 kD ou na faixa de 75 a 85 kD, oucerca de 90 kD ou na faixa de 85 a 95 kD ou cerca de 100 kD, ou na faixa de95 a 105 kD, ou cerca de 110 kD ou na faixa de 105 a 115 kD, ou cerca de120 kD ou na faixa de 115 a 125 kD ou cerca de 130 kD ou na faixa de 125 a135 kD.
Quanto ao limite superior da substituição molar (DS), valores deaté 3,0 tal como 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 ou 2,0 sãoda mesma forma possíveis, valores abaixo de 2,0 sendo preferidos, valoresabaixo de 1,5 sendo mais preferido, valores abaixo de 1,3 tal como 0,7, 0,8,0,9, 1,0, 1,1, 1,2, ou 1,3 sendo ainda mais preferido.
Portanto, faixas preferidas da substituição molar são de 0,1 a 2ou de 0,1 a 1,5 ou de 0,1 a 1,3 ou de 0,1 a 1,0 ou de 0,1 a 0,9 ou de 0,1 a0,8. Faixas mais preferidas da substituição molar são de 0,2 a 2 ou de 0,2 a1,5 ou de 0,2 a 1,0 ou de 0,2 a 0,9 ou de 0,2 a 0,8. Faixas ainda mais prefe-ridas da substituição molar são de 0,3 a 2 ou de 0,3 a 1,5 ou de 0,3 a 1,0 oude 0,3 a 0,9 ou de 0,3 a 0,8. Faixas ainda mais preferidas da substituiçãomolar são de 0,4 a 2 ou de 0,4 a 1,5 ou de 0,4 a 1,3, ou de 0,4 a 1,0 ou de0,4 a 0,9 ou de 0,4 a 0,8.
Até onde a substituição molar (DS) está envolvida, DS é preferi-velmente pelo menos 0,1, mais preferivelmente pelo menos 0,2, mais prefe-rivelmente pelo menos 0,4 e mais preferivelmente pelo menos 0,7. Faixaspreferidas de DS são de 0,1 a 3, preferivelmente 0,1 a 2, mais preferida 0,1a 1,3, mais preferida 0,1 a 0,9, mais preferivelmente de 0,1 a 0,8, mais prefe-rivelmente de 0,2 a 0,8, mais preferivelmente de 0,3 a 0,8 e ainda mais pre-ferivelmente de 0,4 a 0,8, ainda mais preferivelmente de 0,1 a 0,7, mais pre-ferivelmente de 0,2 a 0,7, mais preferivelmente a partir de 0,3 a 0,7 e maispreferivelmente de 0,4 a 0,7. Valores particularmente preferidos de DS são,por exemplo, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2 ou 1,3 com 0,2,0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou 0,8 sendo mais preferidas, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou0,8 sendo ainda mais preferidas, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou 0,8 sendo ainda maispreferidas e, por exemplo, 0,4 ou 0,5 e 0,7 ou 0,8 sendo particularmente pre-feridas.
No contexto da presente invenção, um determinado valor dasubstituição molar tal como 1,3 pode ser o valor exato ou pode ser entendidocomo estando em uma faixa de 1,25 a 1,34, ou 1,0 pode ser o valor exato oupode ser entendido como estando em uma faixa de 0,95 a 1,04, ou 0,9 podeser o valor exato ou pode ser entendido como estando em uma faixa de 0,85a 0,94 ou 0,8 pode ser o valor exato ou pode ser entendido como estandoem uma faixa de 0,75 a 0,84. Portanto, por exemplo, um determinado valorde 0,1 pode ser o valor exato de 0,1 ou pode estar na faixa de 0,05 a 0,14,um determinado valor de 0,4 pode ser o valor exato de 0,4 ou na faixa de0,35 a 0,44, ou um determinado valor de 0,7 pode ser o valor exato de 0,7ou estar na faixa de 0,65 a 0,74.
Combinações particularmente preferidas de peso molecular doamido de hidroxialquila, preferivelmente amido de hidroxietila, e sua substitu-ição molar DS são, por exemplo, 10 kD e 0,4 ou 10 kD e 0,7 ou 12 kD e 0,4ou 12 kD e 0,7 ou 15 kD e 0,4 ou 15 kD e 0,7 ou 18 kD e 0,4 ou 18 kD e 0,7ou 50 kD e 0,4 ou 50 kD e 0,7 ou 56 kD e 0,4 e 56 kD e 0,7 ou 70 KD e 0,4ou 70 kD e 0,7, ou 100 kD e 0,4 ou 100 kD e 0,7 ou 130 kD e 0,4 ou 130 kDe 0,7.
Até onde a relação de substituição de C2 : C6 está envolvida, areferida substituição está preferivelmente na faixa de 2 a 20, mais preferi-velmente na faixa de 2 a 15 e ainda mais preferivelmente na faixa de 3 a 12.
De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, damesma forma misturas de amidos de hidroxietila podem ser empregadastendo pesos moleculares médios diferentes e/ou substituição molar diferentee/ou relações diferentes de substituição de C2 : C6. Portanto, misturas deamidos de hidroxietila podem ser empregadas tendo pesos moleculares mé-dios diferentes e substituição molar diferente e relações diferentes de substi-tuição de C2 : C6, ou tendo pesos moleculares médios diferentes e substitui-ção molar diferente e a mesma ou cerca da mesma relação de substituiçãode C2 : C6, ou tendo pesos moleculares médios diferentes e a mesma oucerca da mesma substituição molar e relações diferentes de substituição deC2 : C6, ou tendo o mesmo ou cerca do mesmo peso molecular médio esubstituição molar diferente e relações diferentes de substituição de C2: C6,ou tendo pesos moleculares médios diferentes e a mesma ou cerca damesma substituição molar e o mesma ou cerca da mesma relação de substi-tuição de C2 : C6, ou tendo o mesmo ou cerca dos mesmos pesos molecula-res médios e substituição molar diferente e a mesmo ou cerca da mesmarelação de substituição de C2 : C6, ou tendo o mesmo ou cerca do mesmopeso molecular médio e a mesma ou cerca da mesma substituição molar erelações diferentes de substituição de C2: C6, ou tendo cerca do mesmo pe-so molecular médio e cerca da mesma substituição molar e cerca da mesmarelação de substituição de C2: C6.
Em conjugados diferente e/ou métodos diferentes de acordocom a presente invenção, amidos de hidroxialquila diferentes, preferivelmen-te amidos de hidroxietila diferentes e/ou misturas de hidroxialquila diferentes,preferivelmente misturas de amido de hidroxietila diferentes, podem ser em-pregados.
Em uma modalidade preferida, o amido de hidroxialquila ou deri-vado deste compreende 1 a 100, preferivelmente 1 a 15, em particular 1grupo(s) aldeído, grupo(s) ceto e/ou grupo(s) hemiacetal ou em que o amidode hidroxialquila ou derivado deste compreende 1 a 100, preferivelmente 1 a15, em particular 1 grupo(s) alfa-SH-beta amino.
Em outra modalidade preferida, a substância ativa compreende -1 a 15, preferivelmente 1 a 8, em particular 1 grupo(s) aldeído, grupo(s) cetoe/ou grupo(s) hemiacetal ou em que a substância ativa compreende 1 a 15,preferivelmente 1 a 8, em particular 1 grupo(s) alfa-SH-beta amino.
O amido de hidroxialquila, preferivelmente amido de hidroxietila,compreendendo o pelo menos um grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemia-cetal ou grupo alfa-SH-beta amino pode ser fornecido por cada método ade-quado.Em uma modalidade preferida, o derivado de amido de hidroxi-alquila compreendendo o referido grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiace-tal ou referido grupo alfa-SH-beta amino é obtido por um método compreen-dendo
(a)(l) introduzir pelo menos um grupo aldeído no amido de hidro-xialquila por uma reação de oxidação de abertura de anel, ou
(a)(2) reagir o amido de hidroxialquila com pelo menos um, pelomenos composto bifuncional, o referido composto compreendendo dois gru-pos funcionais Mi e Q, um grupo funcional Mi sendo reagido com o amidode hidroxialquila e um grupo funcional Q sendo
(i) um grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiacetal ou um grupoalfa-SH-beta amino; ou
(ii) um grupo funcional sendo quimicamente modificado paraproduzir o grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiacetal ou um grupo alfa-SH-beta amino.
De acordo com (a)(1) é preferido que amido de hidroxialquilaseja submetido a uma reação de oxidação de abertura de anel empregando-se periodato para produzir um derivado de amido de hidroxialquila tendo pe-lo menos um grupo aldeído.
A reação de oxidação de abertura de anel de acordo com (a)(1)pode ser realizada em um meio aquoso. A reação de oxidação de aberturade anel é realizada em uma temperatura de 0 a 37°C, preferencialmente em0 a 5°C.
Em uma modalidade preferida de (a)(2), o grupo funcional M1 éselecionado a partir do grupo que consiste em um grupo carbóxi, um grupocarbóxi reativo, anidrido de ácido carboxílico, halogeneto de ácido carboxíli-co, isocianato, isotiocianato, cloroformatos, e grupos epóxido e o grupo fun-cional Q é um grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiacetal, grupo alfa-SH-beta amino, ou um grupo funcional sendo quimicamente modificado paraproduzir um grupo aldeído, um grupo ceto, um grupo hemiacetal, ou um gru-po alfa-SH-beta amino.
De acordo com uma modalidade da presente invenção, o méto-do de acordo com (a)(2) pode compreender que o amido de hidroxialquila éreagido por meio da extremidade de redução opcionalmente oxidada do a-mido de hidroxialquila com o pelo menos um composto bifuncional compre-endendo pelo menos dois grupos funcionais M1 e Q.
O termo o qual o amido de hidroxialquila, preferivelmente amidode hidroxietila é reagido "por meio da extremidade de redução opcionalmen-te oxidada" quando empregado no contexto da presente invenção pode sereferir-se a um processo de acordo com o qual o amido de hidroxialquila éreagido predominantemente por meio de sua extremidade de redução opcio-nalmente oxidada.
Este termo "predominantemente por meio de sua extremidadede redução opcionalmente oxidada" refere-se a processos de acordo com oqual estatisticamente mais que 50%, preferivelmente pelo menos 55%, maispreferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 65%,mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo me-nos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e ainda mais preferivel-mente pelo menos 95% tal como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% das molécu-las de amido de hidroxialquila empregados para uma determinada reaçãosão reagidos por meio de pelo menos uma extremidade de redução opcio-nalmente oxidada por molécula de amido de hidroxialquila, em que uma de-terminada molécula de amido de hidroxalquila que é reagida por pelo menosuma extremidade de redução pode ser reagida na mesma determinada rea-ção por meio de pelo menos um outro grupo funcional adequado que é com-preendido na referida molécula de amido de hidroxialquila e que não é umaextremidade de redução. Se uma ou mais molécula(s) de amido de hidroxi-alquila é(são) reagida(s) por meio de pelo menos uma redução e simultane-amente por meio de pelo menos um outro grupo funcional adequado que écompreendido nesta (nestas) molécula(s) de amido de hidroxialquila e quenão é um extremidade de redução, estatisticamente preferivelmente maisque 50%, preferivelmente pelo menos 55%, mais preferivelmente pelo me-nos 60%, mais preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelomenos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmentepelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivel-mente pelo menos 90%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 95% talcomo 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de todos os grupos funcionais reagidosdestas moléculas de amido de hidroxialquila, os referidos grupos funcionaisincluindo as extremidades de redução, são extremidades de redução.
O termo "extremidade de redução" quando empregado no con-texto da presente invenção refere-se ao grupo aldeído terminal de uma mo-lécula de amido de hidroxialquila que pode estar presente como grupo aldeí-do e/ou como forma de hemiacetal correspondente. No caso da extremidadede redução ser oxidada, o grupo aldeído ou hemiacetal está na forma de umgrupo carbóxi e/ou da Iactona correspondente.
De acordo com uma modalidade da presente invenção, o méto-do de acordo com (a)(2) pode, portanto, compreender oxidar a hidroxialquilaem sua extremidade de redução para produzir o amido de hidroxalquila deacordo com a fórmula (IIIa)
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e/ou de acordo com a fórmula (IIIb)
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em que R', R" e R'" são como definidos para fórmula II, e reagir o amido dehidroxialquila oxidado em sua extremidade de redução com pelo menos umcomposto adequado para produzir um amido de hidroxialquila funcionalizadopor aldeído, ceto, hemiacetal ou alfa-SH-beto amido.Oxidação do amido de hidroxialquila, preferivelmente amido dehidroxietila, pode ser realizada de acordo com cada método ou combinaçãode métodos que resultam em compostos tendo as estruturas (IIIa) e/ou (IIIb)supracitadas. Embora a oxidação possa ser realizada de acordo com todosos métodos ou método adequados que resultam na extremidade de reduçãooxidada do amido de hidroxialquila, é preferivelmente realizada empregando-se uma solução de iodo alcalina como descrito, por exemplo, em DE 196 28705 A1, os conteúdos respectivos dos quais (exemplo A, coluna 9, linhas 6 a24) são incorporados aqui por referência.
Em outra modalidade preferida, o grupo hemiacetal do amido dehidroxialquila é o grupo hemiacetal da extremidade de redução do amido dehidroxialquila em sua forma não oxidada.
De acordo com (a)(2) é preferido que o amido de hidroxialquila,opcionalmente oxidado em sua extremidade de redução, seja reagido comum pelo menos composto bifuncional compreendendo um grupo funcionalMi que é reagido com o amido de hidroxialquila, preferivelmente na extremi-dade de redução opcionalmente oxidada, e um grupo funcional Q que é umgrupo aldeído, um grupo ceto, um grupo hemiacetal ou um grupo alfa-SH-beta amino ou um grupo funcional que pode ser modificado para produzirqualquer um destes grupos.
Como grupo funcional Mi do pelo menos composto bifuncionalque é reagido com o amido de hidroxialquila, especialmente um grupo deveser mencionado tendo a estrutura R -NH- onde R* é hidrogênio ou um resíduode alquila, cicloalquila, arila, aralquila, arilcicloalquila, alcarila ou cicloalquilarilaonde o resíduo de cicloalquila, arila, aralquila, arilcicloalquila, alcarila ou ciclo-alquilarila pode ser ligado diretamente ao grupo NH ou, de acordo com outramodalidade, pode ser ligado por uma ponte de oxigênio ao grupo NH. Os re-síduos de alquila, cicloalquila, arila, aralquila, arilcicloalquila, alcarila, ou ciclo-alquilarila podem ser adequadamente substituídos. Como substituintes prefe-ridos, halogênios tal como F, Cl ou Br podem ser mencionados. Resíduos es-pecialmente preferidos R* são hidrogênio, grupos alquila e alcóxi, e aindamais preferidos são hidrogênio e grupos alcóxi e alquila não substituídos.Entre os grupos alquila e alcóxi, grupos com 1,2,3, 4, 5, ou 6átomos de C são preferidos. Mais preferidos são grupos metila, etila, propila,isopropila, metóxi, etóxi, propóxi, e isopropóxi. Especialmente preferidos sãometila, etiia, metóxi, etóxi, e preferência particular é dada a metila ou metóxi.
De acordo com outra modalidade da presente invenção, o grupofuncional M1 tem a estrutura FT-NH-R**- onde R** preferivelmente compre-ende a unidade de estrutura -NH- e/ou a unidade de estrutura -(C=G)- ondeG é O ou S, e/ou a unidade de estrutura -SO2-. Exemplos específicos para ogrupo funcional R** são
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onde, se G estiver presente duas vezes, é independentemente O ou S.
Portanto, a presente invenção da mesma forma refere-se a ummétodo e um conjugado como mencionado acima em que o grupo funcionalM1 é selecionado a partir do grupo que consiste em
<formula>formula see original document page 25</formula>
em que G é O ou S e, se presente duas vezes, independentemente O ou S,e R' é metila.
De acordo com uma modalidade particularmente preferida dapresente invenção, o grupo funcional M1 é um grupo amino -NH2.Com respeito ao caso quando o grupo Q é um grupo aldeído, umgrupo ceto, um grupo hemiacetal ou um grupo alfa-SH-beta amino ou umgrupo funcional sendo quimicamente modificado para produzir um destesgrupos, os seguintes grupos funcionais devem ser mencionados, entreoutros:
ligações duplas de C-C ou ligações triplas de C-C ou ligações deC-C aromáticas;
o grupo tio ou o grupo hidróxi;
hidrazida de ácido alquil sulfônico, hidrazida de ácido aril sulfônico;
1,2-dióis;
1,2 amino-tioálcoois;
azidas;
1,2-aminoálcoois;
- o grupo amino -NH2 ou derivados dos grupos aminos que com-preendem a unidade de estrutura -NH- tais como grupos aminoalquila, grupoaminoarila, grupo aminoaralquila, ou grupos alcarliamino;
o grupo hidroxilamino -O-NH2, ou derivados do grupo hidroxilami-no compreendendo a unidade da estrutura -O-NH -, tais como grupos hidro-xilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino, ou gru-pos hidroxialcarilamino;
grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino,ou grupos alcariloxiamino, cada qual compreendendo a unidade deestrutura -NH-O-;
resíduos que têm um grupo carbonila, -Q-C(=G)-M, em que G é Oou S, e M é, por exemplo,-- -OH ou -SH ;
um grupo alcóxi, um grupo arilóxi, um grupo aralquilóxi, ou umgrupo alcarilóxi;
um grupo alquiltio, um grupo ariltio, um grupo aralquiltio, ou umgrupo alcariltio;
um grupo alquilcarbonilóxi, um grupo arilcarbonilóxi, um grupoaralquilcarbonilóxi, um grupo alcarilcarbonilóxi;ésteres ativados tais como ésteres de hidroxilaminas tendo estru-tura de imida tal como N-hidroxissuccinimida ou tendo uma unidade de es-trutura O-N onde N faz parte de um composto de heteroarila ou, com G = Oe Q ausente, tais como compostos de arilóxi com um resíduo de arila substi-tuído tal como pentafluorofenila, paranitrofenila ou triclorofenila;em que Q está ausente ou NH ou um heteroátomo tal como S ou O;
-NH-NH2 ou -NH-NH-;
-NO2;
o grupo nitrila;
grupos carbonila tais como o grupo aldeído ou o grupo ceto;o grupo carbóxi;
o grupo -N=C=O ou o grupo -N=C=S;
grupos haleto de vinila tal como o iodeto de vinila ou o grupo bro-meto de vinila ou triflato;
-CsC-H;
-(C=NH2CI)-OAIquiIagrupos -(C=O)-CH2-HaI em que Hal é Cl, Br ou I;
-CH=CH-SO2-;
um grupo dissulfeto que compreende a estrutura -S-S-;o grupo
po funcional M1 é reagido com um grupo OH no amido de hidroxialquila (ou aextremidade de redução não oxidada ou opcionalmente oxidada de amido dehidroxialquila). O grupo funcional M1 nesta modalidade é preferivelmente umgrupo carbóxi ou um grupo carbóxi reativo e o grupo funcional Q é um grupoo grupo
Em uma modalidade preferida do método desta invenção, o gru-aldeído, grupo ceto ou grupo hemiacetal, em particular o composto bifuncionalcompreendendo M1 e Q é selecionado a partir do grupo que consiste em áci-do formilbenzóico, éster de pentafluorofenila de ácido 4-formilbenzóico, ésterde N-hidroxissuccinimida de ácido 4-formilbenzóico, ácido 4-(4-formil-3,5-dimetoxifenóxi)butírico, e anidrido de ácido 4-formilbenzóico ou um compostobiocompatível selecionado a partir do grupo que consiste em ácidos alfa-cetocarboxílicos, ácidos neuramínicos ou derivado destes e piridoxal fosfato.
Quanto aos ácidos alfa-ceto carboxílicos, esses são preferivel-mente ácidos alfa-ceto carboxílicos derivados a partir de aminoácidos e tam-bém podem na maioria dos exemplos ser encontrados no corpo humano. Osácidos alfa-ceto carboxílicos preferidos derivados a partir de aminoácidossão selecionados a partir do grupo que consiste em ceto-valina, ceto-leucina,ceto-isoleucina e ceto-alanina. Em uma modalidade preferida do métododesta invenção, o grupo carbóxi dos ácidos alfa-ceto carboxílicos é reagidocom um grupo OH no amido de hidroxialquila (ou a extremidade de reduçãoopcionalmente oxidada ou não oxidada de amido de hidroxialquila) ou é rea-gido com grupo Q do amido de hidroxialquila que é um grupo amino. O gru-po ceto livre restante do ácido alfa-ceto carboxílico pode ser em seguida re-agido para formar a tiazolidina.
Adequadamente, a presente invenção refere-se a um método deacordo com (a)(2)(i) ou (a)(2)(ii), em que o amido de hidroxialquila é reagidocom um ácido alfa-ceto carboxílico. Quanto aos ácidos neuramínicos ou siá-Iicos ou derivados destes, esses são preferivelmente biocompatíveis, emparticular eles são açúcares encontrados no corpo humano, que são N- e/ouO-acetilados. Em uma modalidade preferida, os ácidos neurâmicos ou áci-dos siálicos são ácidos N-acetilneurâmicos ácidos. Estes compostos mos-tram uma rigidez desejada por causa da estrutura de piranose a fim de cum-prir a função como um esapaçador. Por outro lado, pode ser possível intro-duzir um grupo aldeído nestes compostos através de oxidação seletiva. Áci-dos siálicos são emcontrados no corpo humano, por exemplo, como monos-sacarídeos terminais em cadeias de glicano de proteínas glicosiladas.
Em uma modalidade preferida, o ácido siálico pode ser seletiva-mente oxidado para um grupo aldeído.
Os métodos para seletivamente oxidar ácidos siálicos ou ácidosneurâmicos são conhecidos na técnica, por exemplo, de L.W. Jaques, B.F.Riesco, W. Weltner, Carbohydrate Research, 83 (1980), 21 - 32 e T. Masu-da, S. Shibuya, M. Arai, S. Yoshida, T. Tomozawa, A. Ohno, M. Yamashita,T. Honda, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13 (2003), 669 - 673.Preferivelmente, a oxidação do ácido siálico pode ser administrada antes dareação com amido de hidroxialquila.
O ácido siálico opcionalmente oxidado pode ser em seguida re-agido por meio de seu grupo ácido carboxílico com amido de hidroxialquila.
Em uma modalidade preferida do método desta invenção, o grupo carbóxi doácido siálico oxidado é reagido com um grupo OH no amido de hidroxialquilaou na extremidade de redução opcionalmente oxidada ou não oxidada deamido de hidroxialquila ou é reagido com grupo Q do amido de hidroxialquilaque é um grupo amino. O grupo carbonila restante do ácido siálico oxidadopode ser em seguida reagido para formar a tiazolidina.
Conseqüentemente, a presente invenção refere-se a um métodode acordo com (a)(2)(i) ou (a)(2)(ii), em que o amido de hidroxialquila é rea-gido com um ácido siálico oxidado.
Quanto ao piridoxal fosfato (PyP), este é um composto bifuncio-nal altamente biocompatível e também é chamado vitamina B6. PyP é umaco-enzima que participa nas transaminações, descarboxilações, racemiza-ções, e numerosas modificações de cadeias laterais de aminoácido. Todasas enzimas de requerimento de PyP agem por meio de formação de umabase de Schiff entre o aminoácido e a co-enzima.
Em uma modalidade preferida do método desta invenção, o gru-po fosfato da PyP é reagido com um grupo OH no amido de hidroxialquila ouextremidade de redução opcionalmente oxidada ou não oxidada de amido dehidroxialquila que forma um grupo fosfato ou é reagido com grupo Q do ami-do de hidroxialquila que é um grupo amino que forma uma fosforamida. Ogrupo carbonila restante de PyP pode ser em seguida reagido para formar atiazolidina.No caso de PyP, o grupo funcional do amido de hidroxialquila éintroduzido preferivelmente no amido de hidroxialquila por uso de um com-posto diamino como descrito acima.
Conseqüentemente, a presente invenção refere-se a um métodode acordo com (a)(2)(i) ou (a)(2)(ii), em que o amido de hidroxialquila é rea-gido com piridoxal fosfato.
Em uma modalidade preferida em (a)(2)(i), o grupo funcional M1é selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo carbóxi, um grupocarbóxi reativo, anidrido de ácido carboxílico, halogeneto de ácido carboxíli-co, isocianato, isotiocianato, éster de ácido clorofórmico, e grupos epóxido, eo grupo funcional Q é um grupo aldeído, grupo ceto ou grupo hemiacetal, emque o grupo funcional M1 é reagido com grupos OH no amido de hidroxial-quila.
Em uma modalidade preferida em (a)(2)(i), o grupo funcional M1é selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo amino e grupoalfa-SH-beta-amino, e o grupo funcional Q é um grupo alfa-SH-beta amino,em particular em que o grupo funcional M1 é reagido com a extremidade deredução opcionalmente oxidada do amido de hidroxialquila.
Em uma modalidade preferida em (a)(2)(i), o amido de hidroxial-quila que compreende o referido grupo alfa-SH-beta-amino é obtido por ummétodo que compreende reagir amido de hidroxialquila na extremidade deredução opcionalmente oxidada com um composto que compreende umgrupo funcional M-i e um grupo funcional Q que é um grupo alfa-SH-beta-amino, em particular em que o composto que compreende M1 e o grupo alfa-SH-beta-amino é 1,3-diamino-2-tiopropano ou 2,3-diamino-1-tiopropano.
Em uma modalidade preferida em (a)(2)(ii) o pelo menos com-posto bifuncional compreende M1 que é um grupo carbóxi ou um grupo car-bóxi reativo e Q que é um grupo alfa-SH-beta amino protegido, em particularem que o, pelo menos, composto bifuncional é selecionado a partir do grupoque consiste em D-, L-PG1-Cis(PG2)-OH, ou uma mistura racêmica deste, eo seu éster ativo, em que PG1 pode ser qualquer grupo protetor adequadopara um grupo amino, preferivelmente selecionado a partir do grupo queconsiste em terc-butiloxicarbonila (Boc) ou 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc)1e PG2 pode ser qualquer grupo protetor adequado para um grupo tiol, prefe-rivelmente selecionado a partir do grupo que consiste em tritila (Trt), p-metoxitritila (Mmt) S-terc-butiltio (S-t-Bu) e acetamidometila (Acm).
De acordo com (a)(2)(ii), o grupo funcional Q é um grupo que étambém modificado para produzir um grupo aldeído, um grupo ceto, um gru-po hemiacetal ou um grupo alfa-SH-beta amino. De acordo com esta moda-lidade, o derivado de amido de hidroxialquila resultante da reação de amidode hidroxialquila, opcionalmente oxidado em sua extremidade de redução,com o pelo menos composto bifuncional, é reagido com um outro pelo me-nos composto bifuncional que compreende um grupo funcional que é reagidocom o grupo funcional Q do derivado de amido de hidroxialquila.
No caso preferido de (a)(2)(ii), ambos M1 e Q são um grupo ami-no -NH2, M1 e Q podem ser separados por qualquer espaçador adequado.Entre outros, o espaçador pode ser um resíduo de hidrocarboneto opcional-mente substituído, linear, ramificado e/ou cíclico. Geralmente, o resíduo dehidrocarboneto tem a partir de 1 a 40, preferivelmente a partir de 1 a 20,mais preferivelmente a partir de 2 a 10, mais preferivelmente a partir de 2 a 6e especialmente preferivelmente a partir de 2 a 4 átomos de carbono. Seheteroátomos estiverem presentes, o grupo de separação geralmente com-preende a partir de 1 a 20, preferivelmente a partir de 1 a 8 e especialmentepreferivelmente a partir de 1 a 4 heteroátomos. O resíduo de hidrocarbonetopode compreender uma cadeia de alquila opcionalmente ramificada ou umgrupo arila ou um grupo cicloalquila tendo, por exemplo, a partir de 5 a 7 á-tomos de carbono, ou ser um grupo aralquila, um grupo alcarila onde a partealquila pode ser um grupo alquila linear ou cíclico. De acordo com uma mo-dalidade até mesmo mais preferida, o resíduo de hidrocarboneto é uma ca-deia de alquila a partir de 1 a 20, preferivelmente a partir de 2 a 10, maispreferivelmente a partir de 2 a 6, e especialmente preferivelmente a partir de2 a 4 átomos de carbono.
Em uma modalidade do método da invenção de acordo com(a)(2)(ii), é preferido que o, pelo menos, composto bifuncional que compre-ende M1 e Q é um diaminoalcano opcionalmente substituído que tem a partirde 1 a 20 átomos de carbono, preferivelmente um composto que é selecio-nado a partir do grupo que consiste em 1,2-diaminoetano, 1,3-diaminopro-pano, e 1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano, 1,6-diaminoexano, 1,7-dia-minoeptano, 1,8-diaminooctano, 1,9-diaminononano, 1,10-diaminodecano,1,11-diaminoundecano, 1,12-diaminododecano, 1,13-diaminotridecano, 1,14-diaminotetradecano, 1,15-diaminopentadecano, 1,16-diaminoexadecano,1,17-diam inoeptadecano, 1,18-diam inooctadecano, 1,19-diaminononadecano,e 1,20-diaminoeicosanó ou um composto tendo a fórmula
<formula>formula see original document page 32</formula>
em que R11 R2', R3' e R4' são independentemente selecionados a partir dogrupo, que consiste em hidrogênio, e grupo alquila, preferivelmente grupometila e hidrogênio, ρ é 2 a 4, em que os resíduos R1' e R2' podem ser osmesmos ou diferentes nos grupos p, CRr R2', q é 0 a 20, preferivelmente 0 a10; r é 0 a 20, preferivelmente 2 a 4, em que no caso de q = 0, r não é 0, eem que os resíduos R3' e R4' podem ser os mesmos ou diferentes no grupo r,CR3' R4'.
Uma modalidade preferida da presente invenção também se re-fere a um método como descrito acima, em que o amido de hidroxialquila éreagido com um composto bifuncional que pode ser selecionado a partir dogrupo que consiste em 1,2-diaminoetano, 1,3-diaminopropano, e 1,4-diami-nobutano, 1,5-diaminopentano, 1,6-diaminoexano, 1,7-diaminoeptano, 1,8-diaminooctano, 1,9-diaminononano, 1,10-diaminodecano, 1,11-diaminounde-cano, 1,12-diaminododecano, 1,13-diaminotridecano, 1,14-diaminotetrade-cano, 1,15-diaminopentadecano, 1,16-diaminoexadecano, 1,17-diaminoepta-decano, 1,18-diaminooctadecano, 1,19-diaminononadecano e 1,20-diaminoeicosano ou um composto tendo a fórmula
<formula>formula see original document page 32</formula>
em que R1', R2', R3' e R4' são independentemente selecionados a partir dogrupo, que consiste em hidrogênio, e grupo alquila, preferivelmente grupometila e hidrogênio, p é 2 a 4, em que os resíduos R1 e R2 podem ser osmesmos ou diferentes nos grupos p, CR1 R2, q é 0 a 20, preferivelmente 0 a4, e r é 0 a 20, preferivelmente 2 a 4, em que no caso de q = 0, r não é 0, eem que os resíduos R3 e R4 podem ser os mesmos ou diferentes no grupo r,CR3 R4', em particular 1,4-diaminobutano, para produzir um derivado de a-mido de hidroxialquila funcionalizada por amino e este derivado de amido dehidroxialquila funcionalizada por amino é também reagido com um pelo me-nos composto bifuncional contendo um grupo funcional reativo com o grupoamino da hidroxialquila funcionalizada por amino e um grupo funcional que épelo menos üm grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiacetal ou grupo alfa-SH-beta amino. Este outro composto bifuncional é preferivelmente selecio-nado a partir do grupo que consiste em ácido formilbenzóico, ácido 4-formilbenzóico, éster de pentafluorofenila, éster de N-hidroxissuccinimida deácido 4-formilbenzóico, ácido 4-(4-formil-3,5-dimetoxifenóxi)butírico e anidri-do de ácido 4-formilbenzóico ou um composto biocompatível selecionado apartir do grupo que consiste em ácidos alfa-ceto carboxílico, ácidos neura-mínicos ou derivado destes e piridoxal fosfato.
Em outra modalidade do método em (a)(2)(ii), o amido de hidro-xialquila que compreende o referido grupo alfa-SH-beta-amino é obtido porum método que compreende opcionalmente oxidar amido de hidroxialquilaem sua extremidade de redução, reagir a extremidade de redução oxidadaou não oxidada com um grupo funcional Mi de um composto que compreen-de, além de Mi, um outro grupo funcional Q, para produzir um primeiro deri-vado de amido de hidroxialquila, e reagir o grupo funcional Q do primeiroderivado de amido de hidroxialquila com um grupo funcional V de um com-posto que compreende, além de V, um grupo alfa-SH-beta-amino opcional-mente protegido, para produzir o derivado de amido de hidroxialquila funcio-nalizada por alfa-SH-beta-amino opcionalmente protegido. Os grupos fun-cionais M1 e Q são preferivelmente como descrito acima.
Em uma modalidade preferida, o composto que compreende V eo grupo alfa-SH-beta-amino opcionalmente protegido é cisteína ou um deri-vado destes, V que é um grupo carbóxi ou um grupo carbóxi reativo, preferi-velmente um éster reativo ou um anidrido de ácido carboxílico.
Preferivelmente1 em (a)(2)(ii), amido de hidroxialquila em suaforma não oxidada é reagido com um composto bifuncional que tem um gru-po amino M1 e um grupo amino Q por animação redutiva. Em particular, ocomposto bifuncional pode ser selecionado a partir do grupo que consisteem aminas primárias, amônia, 1,2-diaminoetano, 1,3-diaminopropano, e 1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano, 1,6-diaminoexano, 1,7-diaminoeptano,1,8-diaminooctano, 1,9-diaminononano, 1,10-diaminodecano, 1,11-diamino-undecano, 1,12-diaminododecano, 1,13-diaminotridecano, 1,14-diaminotetra-decano, 1,15-diaminopentadecano, 1,16-diaminoexadecano, 1,17-diamino-eptadecano, 1,18-diaminooctadecano, 1,19-diaminononadecano, e 1,20-diaminoeicosano ou um composto tendo a fórmula
<formula>formula see original document page 34</formula>
em que R1, R2, R3 e R4 são independentemente selecionados a partir dogrupo, que consiste em hidrogênio, e grupo alquila, preferivelmente hidrogê-nio e grupo metila, ρ é 2 a 4, em que os resíduos R1' e R2' podem ser osmesmos ou diferentes nos grupos p, CRr R2', q é 0 a 20, preferivelmente 0 a4, e r é 0 a 20, preferivelmente 2 a 4, em que no caso de q = 0, r não é 0, eem que os resíduos R3 e R4' podem ser os mesmos ou diferentes no grupo r,CR3' R4', em particular 1,4 diaminobutano.
Preferivelmente, em (a)(2)(ii), o amido de hidroxialquila oxidadaem sua extremidade de redução é reagido com um composto bifuncional quetem um grupo amino M-i e um grupo amino Q por uma reação de abertura deanel de lactona. Em particular, o composto bifuntional pode ser selecionadoa partir do grupo que consiste em 1,2-diaminoetano, 1,3-diaminopropano, e1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano, 1,6-diaminoexano, 1,7-diamino-eptano, 1,8-diaminooctano, 1,9-diaminononano, 1,10-diaminodecano, 1,11-diaminoundecano, 1,12-diaminododecano, 1,13-diaminotridecano, 1,14-diaminotetradecano, 1,15-diaminopentadecano, 1,16-diaminoexadecano,1,17-diaminoeptadecano, 1,18-diaminooctadecano, 1,19-diaminononade-cano, e 1,20-diaminoeicosano ou um composto tendo a fórmulaH2N-[(CR,R2')pO]q[CR3'R4']1-NH2
em que R11 R2, R3' e R4' são independentemente selecionados a partir dogrupo, que consiste em hidrogênio, e grupo alquila, preferivelmente hidrogê-nio e grupo metila, ρ é 2 a 4, em que os resíduos R1' e R2' podem ser osmesmos ou diferentes nos grupos p, CR1R2', q é 0 a 20, preferivelmente 0 a4, e r é 0 a 20, preferivelmente 2 a 4, em que no caso de q = 0, r não é 0, eem que os resíduos R3' e R4' podem ser os mesmos ou diferentes no grupo r,CR3 R4, em particular 1,4 diaminobutano.
Preferivelmente, em (a)(2)(ii), amido de hidroxialquila é primeiroreagido com um composto bifuncional que tem um grupo amino Q, preferi-velmente preparado como descrito acima, e o amido de hidroxialquila fun-cionalizada por amino obtido é também reagida com um composto bifuncio-nal que tem um grupo carboxílico ativado e um grupo aldeído, grupo ceto ougrupo hemiacetal.
Em uma modalidade particularmente preferida, o método da in-venção em (a)(2)(ii) compreende reagir o amido de hidroxialquila preferivel-mente oxidado com um composto que tem um grupo amino M1 e um grupoamino Q, em particular um composto de diaminoalquila, especialmente 1,4-diaminobutano, e em seguida reagir o amido de hidroxialquila funcionalizadapor amino com um composto selecionado a partir do grupo que consiste emcisteína opcionalmente protegida e ácido 4-formil benzóico.
A substância ativa que compreende o pelo menos um grupo al-deído, grupo ceto, grupo hemiacetal ou grupo alfa-SH-beta amino pode serfornecida por todo método adequado.
Em uma modalidade preferida, a substância ativa, preferivelmen-te uma proteína opcionalmente modificada, peptídeo, peptídeo sintético ouoligonucleotídeo, que compreende o referido grupo aldeído, grupo ceto, gru-po hemiacetal ou grupo alfa-SH-beta-amino é obtida por um método quecompreende
(b)(1) introduzir pelo menos um grupo aldeído, grupo ceto, grupohemiacetal ou pelo menos um grupo alfa-SH-beta-amino na substância ativadurante sua preparação ou por modificação química; ou
(b)(2) reagir a substância ativa com um pelo menos compostobifuncional, o referido composto que compreende dois grupos funcionais M2e Q, um grupo funcional M2 que é reagido com a substância ativa e um gru-po funcional Q que é:
(i) um grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiacetal ou um grupoalfa-SH-beta amino; ou
(ii) um grupo funcional que é quimicamente modificado para pro-duzir o grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiacetal ou um grupo alfa-SH-beta amino.
Preferivelmente em (b)(1), a substância ativa é uma proteína oupeptídeo que foi preparado por síntese orgânica, preferivelmente produzidoempregando-se uma resina de síntese, que permite uma proteína ou peptí-deo funcionalizado por aldeído, funcionalizado por ceto, funcionalizado porhemiacetal ou funcionalizado por alfa-SH-beta-amino, ou em que em (b)(l), asubstância ativa é uma proteína ou peptídeo que foi produzido empregando-se um vetor de expressão que conduz a uma proteína ou peptídeo funciona-lizado por aldeído, funcionalizado por ceto, funcionalizado por hemiacetal oufuncionalizado por alfa-SH-beta-amino, ou em que em (b)(1), a substânciaativa é uma proteína ou um peptídeo e a cadeia principal da proteína ou pep-tídeo é substituída com um grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiacetal ougrupo alfa-SH-beta-amino, ou em que em (b)(1), a substância ativa é umaproteína ou um peptídeo onde o referidor grupo aldeído, grupo ceto, grupohemiacetal ou grupo alfa-SH-beta-amino é ligado diretamente à cadeia prin-cipal da proteína ou peptídeo ou faz parte de uma cadeia lateral da cadeiaprincipal.
Em uma modalidade preferida (b)(1), a substância ativa é obtidapor modificação da substância ativa, em particular de uma proteína ou umpeptídeo por oxidação para introduzir um grupo aldeído.
Em uma modalidade preferida, a substância ativa é uma proteí-na ou peptídeo e o grupo aldeído, grupo ceto ou grupo hemiacetal está com-preendido em uma porção de carboidrato do polipeptídeo, em particular emque a porção de carboidrato é selecionada a partir do grupo que consiste emhidroxialdeídos, hidroxicetonas e modificações químicas destes. A porção decarboidrato pode ser um derivado de um porção de carboidrato de ocorrên-cia natural e é selecionar a partir do grupo que consiste em glicose, galacto-se, manose e ácido siálico, que são opcionalmente quimicamente ou enzi-maticamente oxidados, preferivelmente uma galactose oxidada ou um resí-duo ácido siálico oxidado de uma cadeia lateral de carboidrato, mais preferi-velmente a galactose terminal ou resíduo de ácido siálico de uma cadeialateral de carboidrato, a oxidação de uma porção de carboidrato terminal queé preferivelmente realizada enzimaticamente ou quimicamente, uma oxida-ção química preferivelmente realizada empregando-se um periodato.
Em uma modalidade preferida, a porção de carboidrato é umderivado de uma porção de carboidrato de ocorrência natural e é uma galac-tose terminal que é enzimaticamente ou quimicamente oxidada, em que oresíduo de galactose terminal é obtido opcionalmente depois da clivagem deum ácido siálico terminal.
Em uma modalidade preferida, o grupo alfa-SH-beta-amino écompreendido em um resíduo de cisteína da substância ativa, preferivelmen-te uma proteína ou peptídeo, o resíduo de cisteína que é preferivelmente umresíduo de cisteína de terminal N da substância ativa.
Em uma modalidade preferida, a substância ativa é um peptídeoou proteína modificada ou com um resíduo de cisteína de terminal N, quenão faz parte de uma ponte de dissulfeto, em particular em que o peptídeoou proteína modificada que possui um resíduo de cisteína de terminal N éum mutante de uma proteína ou peptídeo de ocorrência natural, obtido (1)adicionando-se um resíduo de cisteína ao aminoácido de terminal N, (2)substituindo-se o aminoácido de terminal N com cisteína, ou (3) eliminando-se o(s) aminoácido(s) de terminal N até uma cisteína terminal ser obtida.
Nos peptídeos, a cisteína mencionada pode ser introduzida du-rante a síntese. Síntese de peptídeo é conhecida na técnica. (W. Chang, P.D. White; Fmoc solid phase peptide synthesis, a practical approach; OxfordUniversity Press, Oxford, 2000, ISBN 0199637245).Polipeptídeos recombinantes são obteníveis por meio de técni-cas biológicas moleculares padrão como, por exemplo, descritas em Molecu-lar Cloning: A Laboratory Manual, 3- edição, Eds. Sambrook e outros, CSHLPress 2001. Resumidamente, polipeptídeos podem ser expressos a partir devetores de expressão recombinantes que compreendem um ácido nucléicoque codifica o polipeptídeo desejado, cujo ácido nucléico está operavelmen-te ligado a pelo menos uma seqüência reguladora que permite a expressãodo polipeptídeo desejado. Por exemplo, uma seqüência de ácido nucléicoque codifica o polipeptídeo desejado pode ser isolada e pode ser clonadaem um vetor de expressão e o vetor pode ser em seguida transformado emuma célula hospedeira adequada para expressão do polipeptídeo desejado.
Um tal vetor pode ser um plasmídeo, um fagomídeo ou um cosmídeo. Porexemplo, uma molécula de ácido nucléico pode ser clonada de um modoadequado em vetores de expressão procarióticos ou eucarióticos (MolecularCloning, vide acima). Tais vetores de expressão compreendem pelo menosum promotor e também podem compreender um sinal para iniciação detranslação e - no caso de vetores de expressão procarióticos - um sinal paraterminação de translação, enquanto no caso de vetores de expressão euca-rióticos, preferivelmente sinais de expressão para terminação transcricional epara poliadenilação são compreendidos. Exemplos para vetores de expres-são procarióticos são, para expressão em Escherichia coli, por exemplo, ve-tores de expressão com base em promotores reconhecidos por RNA polime-rase de T7 como descrito em US 4.952.496, para vetores de expressão eu-carióticos para expressão em Saccharomyces cerevisiae, por exemplo, osvetores G426/Met25 ou P526/Gal1 (Mumberg e outros, (1994) Nucl. AcidsRes., 22, 5767-5768), para a expressão em células de inseto, por exemplo,vetores de Baculovirus, como por exemplo, descrito em EP-B 1-0127839 ouEP-B 1-0549721 ou por Ciccarone e outros. ("Generation of recombinantBaculovirus DNA in E.coli using baculovirus shuttle vector" (1997) Volume13, U. Reischt, ed. (Totowa, NJ: Humana Press Inc.) e para a expressão emcélulas mamíferas, por exemplo os vetores Rc/CMW e Rc/ASW e VetoresSW40, que são geralmente conhecidos e comercialmente disponibilizados,ou o sistema EBNA descrito no Exemplo 4, o pCytTS com base em répliconde Sindbis (Boorsma e outros (2002) Biotechnol. Bioeng. 79(6): 602-609), osistema de expressão de vírus Sindbis (Schlesinger (1993) Trends Biotech-nol. 11(1): 18-22) ou um sistema de expressão de Adenovírus (He e outros(1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:2509-2514). Os métodos biológicosmoleculares para a produção destes vetores de expressão, bem como osmétodos para transfectar células hospedeiras e cultivar tais células hospe-deiras transfectadas bem como as condições para produzir e obter o poli-peptídeos da invenção a partir das referidas células hospedeiras transforma-das são bem-conhecidas pela pessoa versada.
Polipeptídeos com o resíduo de cisteína de terminal N desejadopodem ser gerados a partir dos polipeptídeos expressos e purificados comodescrito acima clonando-se o polipeptídeo de interesse atrás de uma se-qüência líder de terminal N que é removível para produzir os polipeptídeoscom o resíduo de cisteína de terminal N desejado.
Isto pode ser obtido, por exemplo, por clivagem proteolítica dopolipeptídeo expresso e purificado como descrito acima. Em um tal caso, umpolipeptídeo de fusão foi clonado, expresso e purificado em que um resíduode cisteína segue diretamente um sítio de clivagem de protease altamenteseletivo, por exemplo, um resíduo de Cis imediatamente seguindo o sítio declivagem de Fator Xa: Ile (Glu/Asp) Gli Arg | (Cis/His), ou um resíduo His ouCis imediatamente seguindo o sítio de clivagem de Enterocinase: Asp AspAsp Asp Lis | (Cis/His), em que | denota o local de clivagem pela protease.
Isto pode também ser alcançado, por exemplo, por clivagem dopolipeptídeo durante a expressão, por exemplo, clivagem no estágio detranslocação de ER pela peptidase de sinal. Em um tal caso, um polipeptí-deo de fusão foi clonado e expresso onde um resíduo Cis segue diretamenteo peptídeo de sinal que direciona o polipeptídeo recombinante à trilha segre-gadora (para revisão vide Rapoport e outros, Annu Rev Biochem.1996;65:271-303).
Os métodos biológicos moleculares para manipular a seqüênciade codificação de um polipeptídeo recombinante de forma que uma seqüên-cia de codificação para um polipeptídeo com o resíduo Cis desejado na po-sição desejada seja gerada são bem-conhecidos na técnica (Sambrook,acima).
As modalidades preferidas para (b)(2) são como descritos para(a)(2) acima, em particular grupos funcionais M2 e Q são preferivelmentecomo descrito acima para grupos funcionais M1 e Q1 contanto que a subs-tância ativa contenha um grupo funcional que é reativo com o grupo M1 co-mo descrito acima.
Em uma modalidade particularmente preferida, a substância ati-va é selecionada a partir de uma proteína e peptídeo e é obtida de acordocom (b)(1) acima, preferivelmente como descrito acima.
Em uma modalidade preferida particular de acordo com (A), a-mido de hidroxialquila compreendendo um grupo aldeído é obtido por(a)(2)(ii), preferivelmente reagindo-se o amido de hidroxialquila preferivel-mente oxidado com um composto tendo um grupo amino M1 e um grupo a-mino Q, em particular um composto de diaminoalquila, especialmente 1,4-diaminobutano, e em seguida reagindo-se o amido de hidroxialquila funcio-nalizado por amino com um composto bifuncional compreendendo um grupoaldeído, em particular ácido 4-formil benzóico, e em seguida reagindo-se ogrupo aldeído do amido de hidroxialquila com um grupo alfa-SH-beta-aminoopcionalmente protegido de uma substância ativa obtida por (b)(2)(i), preferi-velmente introduzindo-se uma cisteína opcionalmente protegida na substân-cia ativa, em particular uma proteína ou um peptídeo.
Em uma modalidade preferida particular de acordo com (B)1 asubstância ativa compreendendo um grupo aldeído é obtida por (b)(1), emparticular introduzindo-se um grupo aldeído por modificação química, prefe-rivelmente oxidando-se uma proteína ou peptídeo, e em seguida reagindo-seo grupo aldeído da substância ativa com amido de hidroxialquila compreen-dendo um grupo alfa-SH-beta-amino obtido por (a)(2)(ii), preferivelmentereagindo-se o amido de hidroxialquila preferivelmente oxidado com um com-posto tendo um grupo amino M-i e um grupo amino Q, em particular umcomposto de diaminoalquila, especialmente 1,4-diaminobutano, e em segui-da reagindo-se o amido de hidroxialquila funcionalizado com um compostobifuncional que compreende um grupo alfa-SH-beta-amino, em particularcisteína.
A reação da invenção de acordo com (A) e (B) da substânciaativa com o amido de hidroxialquila pode ser realizada em qualquer solventeadequado ou mistura de pelo menos dois solventes e em um pH adequado eem uma temperatura de reação adequada.
Em uma modalidade preferida, a reação (A) ou (B) é realizadaem uma temperatura de 0 a 40°C, preferivelmente 0 a 25°C, em particular 20a 25°C, na presença de um solvente, e em um pH de 3,5 a 10, preferivel-mente 4 a 8, em particular 4,8 a 8,0 com um tempo de reação de preferivel-mente 0,1 a 24 h, em particular cerca de 21 h.
O solvente é selecionado preferivelmente a partir do grupo queconsiste em água, tampão aquoso, DMF (dimetilformamida), DMSO (dimetil-sulfóxido), DMA (dimetilacetamida) e misturas destes.
A relação molecular de amido de hidroxalquila para substânciaativa é cerca de 1:1 a 200:1, preferivelmente 10:1 a 100:1, em particular 40:1a 70:1.
Além disso, a invenção refere-se a um conjugado de uma subs-tância ativa e amido de hidroxialquila, como obtenível por um método comodescrito acima.
Em outra modalidade, a invenção refere-se ao conjugado deuma substância ativa e amido de hidroxialquila, em que a substância ativa eamido de hidroxialquila são covalentemente ligados por um resíduo quími-co tendo uma estrutura de acordo com a fórmula (I)
<formula>formula see original document page 41</formula>
ou fórmula (Γ)<formula>formula see original document page 42</formula>
ou fórmula (I")
<formula>formula see original document page 42</formula>
em que Fh, R2, R2-, R3, R3· e R4' são independentemente selecionados a par-tir do grupo que consiste em hidrogênio, um grupo heteroalquila, aralquila,heteroarila, arila e alquila opcionalmente adequadamente substituído, linear,cíclico e/ou ramificado, preferivelmente hidrogênio, o referido conjugado ten-do uma estrutura de acordo com fórmula (IV), (IV'), ou (IV")
<formula>formula see original document page 42</formula>
em que HAS' é o resíduo do amido de hidroxialquila ou um derivado desteque foi ligado a um grupo aldeído, grupo ceto ou grupo hemiacetal, e em queAS1 é o resíduo da substância ativa ou um derivado deste que foi ligado aogrupo alfa-SH-beta-amino,
ou uma estrutura de acordo com a fórmula (V)1 (V), ou (V")
<formula>formula see original document page 43</formula>
em que HAS' é o resíduo do amido de hidroxialquila ou um derivado desteque foi ligado ao grupo alfa-SH-beta-amino, e em que AS' é o resíduo dasubstância ativa ou um derivado desta que foi ligado ao grupo aldeído, grupoceto ou grupo hemiacetal.
Em uma modalidade preferida, o conjugado é selecionado a par-tir do grupo que consiste em<formula>formula see original document page 44</formula>
em que R5 é como definido para Ri a R4 acima,
<formula>formula see original document page 44</formula>
em que R5 é como definido para Ri a R4 acima,<formula>formula see original document page 45</formula>
em que na fórmula IV', IV'b, V'b ou V'c η é um número inteiro, preferivelmen-te η é O a 20 e em que na fórmula Va, Vb, V'd ou V'e η é um número inteiro,preferivelmente, η é 1 a 20. Em uma modalidade preferida da fórmula IV'b ede V'c, η é 2 a 4, em particular 2.
Em uma modalidade preferida, o conjugado é
<formula>formula see original document page 45</formula>
em que R', R" e/ou R'" são como definidos para fórmula Il e em que, em pe-Io menos uma unidade de glicose de HES, pelo menos um dentre R', R"e/ou R"' é independentemente selecionado a partir do grupo que consisteem
<formula>formula see original document page 46</formula>
e em que η é um número inteiro, preferivelmente 1 a 20 e/ou em que pelomenos um dentre R', R" e/ou R"' é -(CH2CH2O)m-Rn8, em que m é um núme-ro inteiro, preferivelmente 1 a 3 e Rn9 é selecionado a partir do grupo queconsiste na fórmula (Via), (Vlb), (VIc) e (Vld).
Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a um derivadode amido de hidroxialquila funcionalizado por alfa-SH-beta amino seleciona-do a partir do grupo consistindo em
<formula>formula see original document page 46</formula>
em que R5 é definido para R1 a R4 acima,<formula>formula see original document page 47</formula>
em que η é um número inteiro, preferivelmente O a 20,ou o grupo consistindo em
<formula>formula see original document page 47</formula>
em que R', R" e/ou R'" são como definidos para fórmula Il e em que em pelomenos uma unidade de glicose de HES, pelo menos um dentre R', R" e/ouR'" é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em
<formula>formula see original document page 47</formula>
e em que η é um número inteiro, preferivelmente 1 a 20 e/ou em que pelomenos um dentre R', R" e /ou R'" é -(CH2CH2O)m-Rn8n9, em que m é um nú-mero inteiro, preferivelmente 1 a 3, e Rn9ns é selecionado a partir do grupoconsistindo nas fórmulas (Vl'a), (Vl'b) e (Vl'c).
As abreviações HES" e HES' especificamente empregadas nocontexto das fórmulas (VI) e (Vl') referem-se aos resíduos da molécula deHES que, junto com a porção de carboidrato ligando HES" e HES' comomostrado em (VI) e (Vl'), constituem a molécula de HES que por sua vez éparte dos conjugados como definido em (VI) e (Vl').Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a um conjugadocomo descrito acima para uso em um método para o tratamento do corpohumano ou animal ou como um agente terapêutico.
Os conjugados de acordo com a invenção podem ser pelo me-nos 50% puros, ainda mais preferido pelo menos 70% puros, ainda mais pre-feridos pelo menos 90%, em particular pelo menos 95% ou pelo menos 99%puros. Em uma modalidade mais preferida, os conjugados podem ser 100%puros, isto é, não há outros subprodutos presentes.
Portanto, de acordo com outro aspecto, a presente invenção damesma forma refere-se a uma composição que pode compreender o(s) con-jugado) da invenção, em que a quantidade do(s) conjugado(s) pode serpelo menos 50% em peso, ainda mais preferido pelo menos 70% em peso,ainda mais preferido pelo menos 90% em peso, em particular pelo menos95% em peso ou pelo menos 99% em peso. Em uma modalidade mais pre-ferida, a composição pode consistir no(s) conjugado(s), isto é a quantidadedo(s) conjugado(s) é 100% em peso.
Desta maneira, a presente invenção da mesma forma refere-sea uma composição farmacêutica compreendendo um conjugado como des-crito acima ou um conjugado, obtenível por um método como descrito acima.
Além disso, a presente invenção da mesma forma refere-se auma composição farmacêutica compreendendo um conjugado como descritoacima ou um conjugado, obtenível por um método como descrito acima, areferida composição farmacêutica também compreendendo pelo menos umdiluente, adjuvante, ou veículo farmaceuticamente aceitável.
Breve Descrição das Figuras
Figura 1 mostra uma análise dos conjugados de proteína-HESbrutos por eletroforese em gel de SDS obtida pela formação de tiazolidina deH-Cis(H)-HESI0/0,4 e EPO oxidada.
Faixa X: marcador de peso molecular Roti®-Mark STANDARD (Carl RothGmbH + Co. KG, Karlusruhe, D) do topo à base: 200 kDa, 119 kDa,66 kDa,43 kDa, 29 kDa, 20 kDa, 14,3 kDa
Faixa A: conjugação de H-Cis(H)-HES 10/0,4 para EPO oxidadaFigura 2 mostra uma análise dos conjugados de proteína-HESbrutos por eletroforese em gel de formação de tiazolidina de um H-Cis-peptídeo-NH2 e AldeídoHES.
Faixa X: marcador de peso molecular Roti®-Mark STANDARD (Carl Roth
GmbH + Co. KG, Karlusruhe, D) do topo à base: 200 kDa, 119 kDa,66 kDa,43 kDa, 29 kDa, 20 kDa, 14,3 kDa
Faixa A: conjugação de AldeidoHES10/0,7 em pH 4,6
Faixa B: conjugação de AldeídoHES50/0,7 em pH 4,6
Faixa C: controle de reação: peptídeo em pH 4,6
Faixa D: conjugação de AIdeidoHESI0/0,7 em pH 8,0
Faixa E: conjugação de AldeídoHES50/0,7 em pH 8,0
Faixa F: controle de reação: peptídeo em pH 8,0
Figura 3 mostra uma análise dos conjugados de DNA-HES bru-tos por eletroforese em gel de agarose obtida pela formação de tiazolidinade H-Cis(H)-HES50/0.7 e DNA modificado por aldeído como descrito nasseções experimentais 8,4 - 8,5 aqui abaixo.
Faixa X: marcador pUC19/Msp I (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlusruhe, D).Marcador de peso molecular do topo à base: 501/489 bp, 404 bp, 331 bp,242 bp, 190 bp, 147 bp, 111/110 bp, 67 bp.
Faixa A, fileira de topo: conjugação de H-Cis(H)-HES50/0,7 para DNA modi-ficado por FBA em pH 4,6 como descrito na seção experimental 8,5;
Faixa B, fileira de topo: controle de reação; conjugação de Oxo-HES50/0,7para DNA modificado por FBA em pH 4,6 como descrito na seção experi-mental 8,5;
Faixa C1 fileira de topo: conjugação de H-Cis(H)-HES50/0,7 para DNA modi-ficado por FBA em pH 8,0 como descrito na seção experimental 8,5;
Faixa D, fileira de topo: controle de reação; conjugação de Oxo-HES50/0,7para DNA modificado por FBA em pH 8,0 como descrito na seção experi-mental 8,5;
Faixa E, fileira de topo: controle de reação; DNA modificado por FBA em á-gua sem derivado de HES;
Faixa A, fileira de topo: conjugação de H-Cis-(H)-HES50/0,7 para DNA modi-ficado por Formilindol em pH 4,6 como descrito na seção experimental 8,5;Faixa B, fileira de topo: controle de reação; conjugação de Oxo-HES50/0,7para DNA modificado por Formilindol em pH 4,6 como descrito na seção ex-perimental 8,5;
Faixa C, fileira de topo: conjugação de H-Cis-(H)-HES50/0,7 para DNA modi-ficado por Formilindol em pH 8,0 como descrito na seção experimental 8,5;Faixa D, fileira de topo: controle de reação; conjugação de C)xo-HES50/0,7para DNA modificado por Formilindol em pH 8,0 como descrito na seção ex-perimental 8,5;
Faixa E, fileira de topo: controle de reação; DNA modificado por Formilindolem água sem derivado de HES.
Figuras 4 a 6 mostram a análise do conjugado de Daunorrubici-na-HES por cromatografia de fase reversa HPLC, detecção de UV em 290nm, obtida por formação de tiazolidina de H-Cis(H)-HES50/0,7 e Daunorrubi-cina como descrito na seção experimental 9 aqui abaixo.
Figura 4: análise por HPLC do conjugado bruto;
Figura 5: análise por HPLC de Daunorrubicina;
Figura 6: análise por HPLC de H-Cis(H)-HES50/0,7;
Figuras 7 a 9 mostram a análise do conjugado de TiIosina-HESbruto por cromatografia de fase reversa HPLC, detecção de UV em 220 nm,obtida por formação de tiazolidina de H-Cis(H)-HES50/0,7 e Tilosina comodescrito na seção experimental 9. aqui abaixo.
Figura 7: análise por HPLC do conjugado bruto;
Figura 8: análise por HPLC de Tilosina;
Figura 9: análise por HPLC de H-Cis(H)-HES50/0,7
Figura 10 mostra análise dos conjugados de peptídeo-HES bru-to por eletroforese em gel de SDS como descrito na seção experimental 10aqui abaixo.
Faixa X: marcador de peso molecular Roti®-Mark STANDARD (Carl RothGmbH + Co. KG, Karlusruhe, D) do topo à base: 200 kDa, 119 kDa,66 kDa,43 kDa, 29 kDa, 20 kDa, 14,3 kDa.
Faixa A: conjugação de HES10/0,7 para peptídeo a 21 °C, em DMF.Faixa Β: conjugação de HES10/0,7 para peptídeo a 37°C, em DMF.Faixa C: controle de reação: peptídeo a 50°C, em DMF.Faixa D: conjugação de HES 10/0,7 para peptídeo a 50°C, pH 4,6.Faixa E: conjugação de HES 10/0,7 para peptídeo a 50°C, em DMF.Faixa F: conjugação de HES10/0,7 para peptídeo a 50°C, pH 4,6, 1% de Triton.
Faixa G: conjugação de HES10/0,7 para peptídeo a 50°C, em DMF, 1% deTriton.
A invenção será explicada em mais detalhes por meio dos se-guintes exemplos.
Exemplos
1. Síntese de H-Cis(StBu)-HESI 0/0.4
1.1 Síntese de AminoHESI 0/0.4 a partir de HES oxidado
Oxo-HESI0/0,4 (4 g, PM = 10,9 kDa, DS = 0,4, Supramol Paren-teral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) foi aquecido durante a noite a80°C em vácuo, dissolvido sob argônio em dimetil sulfóxido seco (25 mL,Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) e 1,4-diaminobutano(4,0 mL, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) foi adicionado.
Depois de agitar a 45°C durante 24 horas, a mistura de reação foi adiciona-da em 2-propanol (125 mL, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlusruhe, D) e in-cubada durante uma hora a -20°C. O produto precipitado bruto foi coletadopor centrifugação a 4°C, lavado com 2-propanol (100 mL) e coletado porcentrifugação. O produto bruto foi dissolvido em água (20 mL, Milli-Q), diali-sado durante 43 horas com água Milli-Q (tubulação para diálise SnakeSkin,3,5 kDa MWCO, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) e liofilizado.
O rendimento do produto isolado foi 65%.
1.2 Síntese de Fmoc-Cis(StBu)-HESI 0/0.4 de AminoHES
Fmoc-Cis(S-tBu)-OH (150 mg, Fluka, Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Taufkirchen, D) e 1-hidróxi-1H-benzotriazol (61,4 mg, Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) foram dissolvidos em N,N-dimetilformamida (3,5 mL de Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswa-ard NL) e Ν,Ν'-diisopropilearbodiimida (54,3 μL, Fluka, Sigma-Aldrich Che-mie GmbH, Taufkirchen, D) foi adicionado. Depois da incubação a 210C du-rante 30 minutos, AminoHESI 0/0,4 (0,35 g) como esboçado em 1,1 foi adi-cionado. Depois de agitar em temperatura ambiente durante a noite, a mistu-ra de reação foi adicionada a uma mistura gelada de 1:1 (35 ml_, v/v) de ace-tona (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlusruhe, D) e etanol (DAB, Sonnenberg,Braunschweig, D) e incubada durante uma hora a -20°C. O produto precipi-tado foi coletado por centrifugação a 4°C, dissolvido em água (20 mL, Milli-Q) e diclorometano (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlusruhe, D) foi adiciona-do (20 mL). A mistura foi misturada cuidadosamente e centrifugada. A ca-mada aquosa superior foi dialisada durante 41 horas com água Milli-Q (tubu-lação para diálise SnakeSkin, 3,5 kDa MWCO, Perbio Sciences DeutschlandGmbH, Bonn, D) e liofilizada. O rendimento do produto isolado foi 78%.1.3 Síntese de H-Cis(StBu)-HESI 0/0.4 de Fmoc-Cis(StBu)-HESI 0/0.4Fmoc-Cis(StBu)-HESI0/0,4 (0,35 g) como obtido em 1,2 foi dis-solvido em solução de piridina (4 mL, 20% em DMF, v/v, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D). Depois de agitar em temperaturaambiente durante 15 minutos, a mistura de reação foi adicionada em umamistura gelada de 1:1 de acetona e etanol (35 mL, v/v) e incubada duranteuma hora a -20°C. O produto precipitado foi coletado por centrifugação a4°C e lavado com metil éter de terc-butila (25 mL, Acros Organics, Geel, B) eincubado durante uma hora a -20°C. O produto precipitado foi coletado porcentrifugação a 4°C e secado em uma corrente de nitrogênio. O rendimentodo produto isolado foi 68%.
2. Síntese de AIdeidoHESI 0/0,7
2.1 Síntese de AminoHESI 0/0.7 de HES oxidadoOxo-HESI 0/0,7 (6,02 g, PM = 14,7 kDa, DS = 0,76, SupramolParenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim1 D) foi aquecido durante 16,5horas a 80°C em vácuo, dissolvido sob argônio em dimetil sulfóxido seco (25mL, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) e 1,4-diaminobutano (5,1 mL, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen,D) foi adicionado. Depois de agitar a 40°C durante 17 horas, a mistura dereação foi adicionada em uma mistura gelada de 1:1 de acetona e etanol(150 mL, ν/ν). O produto precipitado foi coletado por centrifugação a 4°C,lavado com uma mistura gelada de 1:1 de acetona e etanol (40 mL, v/v) ecoletado por centrifugação. O produto bruto foi dissolvido em água (80 mL),dialisado durante 42 horas com água Milli-Q (tubulação para diálise SnakeS-kin, 3,5 kDa MWCO, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) e Iiofili-zado. O rendimento do produto isolado foi 67%.2.2 Síntese de AIdeidoHESI0/0,7 de AminoHES
Ácido 4-formilbenzóico (75 mg, Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D) e 1-hidróxi-1H-benzotriazol (115 mg, Aldrich, Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Taufkirchen, D) foram dissolvidos em Ν,Ν-dimetilformamida (DMF, 5mL Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard NL) e N,N'-diisopropilcarbodiimida (102 μί, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Tauf-kirchen, D) foi adicionado. Depois da incubação em temperatura ambientedurante 30 minutos, AminoHESI 0/0,7 (0,5 g, PM = 14,7 kDa, DS = 0,76) foiadicionado. Depois de agitar em temperatura ambiente durante a noite, amistura de reação foi adicionada em 2-propanol (30 mL, Carl Roth GmbH +Co. KG, Karlusruhe, D) e incubada durante uma hora a -20°C. O produtoprecipitado foi coletado por centrifugação a 4°C, lavado com 2-propanol (30mL) e coletado por centrifugação. O produto bruto foi dissolvido em água (10mL, Milli-Q), dialisado durante 44 horas com água Milli-Q (tubulação paradiálise SnakeSkin, 3,5 kDa MWCO, Perbio Sciences Deutschland GmbH,Bonn, D) e liofilizado. O rendimento do produto isolado foi 86%.3. Síntese de AldeídoHES50/0.7
3.1 Síntese de AminoHES50/0,7 de HES oxidado
Oxo-H ES50/0.7 (6,09 g, PM = 56,7 kDa, DS = 0,76, SupramolParenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodhein, D) foi aquecido durante 16,5horas a 80°C em vácuo, dissolvido sob argônio em dimetil sulfóxido seco (32mL, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) e 1,4-diaminobutano (1,2 mL, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen,D) foi adicionado. Depois de agitar a 40°C durante 17 horas, a mistura dereação foi adicionada a uma mistura gelada de 1:1 de acetona e etanol (150mL, v/v). O produto precipitado foi coletado por centrifugação a 4°C, lavadocom uma mistura gelada de 1:1 de acetonal e etanol (40 mL, v/v) e coletadopor centrifugação. O produto bruto foi dissolvido em água (80 mL), dialisadodurante 42 horas com água Milli-Q (tubulação para diálise SnakeSkin1 3,5kDa MWCO, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) e liofilizado. Orendimento do produto isolado foi 82%.
3.2 Síntese de AldeídoHES50/0.7 de AminoHES
Ácido 4-formilbenzóico (124 mg, Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D) e 1-hidróxi-1H-benzotriazol (174 mg, Aldrich, Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Taufkirchen, D) foram dissolvidos em Ν,Ν-dimetilformamida (DMF,38 mL Peptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard NL) e N,N'-diisopropilcarbodiimida (155 μί, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Tauf-kirchen, D) foram adicionados. Depois da incubação em temperatura ambi-ente durante 30 minutos, AminoHES50/0,7 (3,80 g, PM = 56,7 kDa, DS =0,76) foi adicionado. Depois da agitação em temperatura ambiente durante anoite, a mistura de reação foi adicionada em 2-propanol (160mL, Carl RothGmbH + Co. KG, Karlusruhe, D) e incubada durante uma hora a-20°C. O produto precipitado foi coletado por centrifugação a 4°C, dissolvidoem DMF (20 mL), precipitado com 2-propanol como descrito acima e coleta-do por centrifugação. O produto bruto foi dissolvido em água, dialisado du-rante 24 horas com água Milli-Q (tubulação para diálise SnakeSkin, 3,5 kDaMWCO, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) e liofilizado. O pro-duto foi dissolvido em água (20 mL), precipitado com uma mistura gelada de1:1 de acetona e etanol (150 mL, v/v), incubado durante uma hora a -20°C ecoletado por centrifugação. O produto bruto foi dissolvido em água (29 mL),dialisado durante 24 horas com água Milli-Q (tubulação para diálise SnakeS-kin, 10 kDa MWCO, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) e liofili-zado. O rendimento do produto isolado foi 77%.
4. Formação de tiazolidina a partir de H-Cis(H)-HESI 0/0.4 e EPO oxi-dada
4.1 Desprotecão de H-Cis(StBu)-HESI0/0.4
H-Cis(StBu)-HESI 0/0,4 (10 mg) como esboçado no esquema 1foi obtido em tampão de acetato de sódio (1 mL, 0,1 M, pH 4,6, 10 mM deEDTA) e cloridrato de tris-(2-carboxietil)-fosfina (2,8 mg, TCEP, Acros Orga-nics, Geel, B) foi adicionado. A mistura de reação foi incubada durante 30minutos em temperatura ambiente e o excesso de TCEP foi removido pordiafiltração:
A mistura de reação foi diluída com tampão (tampão de fosfatode sódio, 0,1 M, pH 8,0, 1 mM de EDTA) para 0,5 mL e centrifugação a 20°Cdurante 10 minutos em 13000 χ g em um concentrador Vivaspin 500 (VivaScience, 5 kDa MWCO, Hannover, Germany). O procedimento de lavagemfoi repetido três vezes por diluição da solução residual com tampão em 0,5mL e centrifugação durante 35 minutos como descrito. As soluções de H-Cis(H)-HESI0/0,4 foram diluídas com o mesmo tampão de reação em 150μΙ_ tendo uma concentração final calculada de 66,6 μg/mL.
4.2. Conjugação para EPO oxidado
Para preparar a EPO oxidada, a uma solução de 2,0 mg/mL deEPO (EPO recombinantemente produzida tendo uma seqüência de aminoá-cido de EPO humano e similar ou essencialmente as mesmas característicascomo a Epoietina alfa comercialmente disponível: Erypo, ORTHO BIOTECH,Jansen-Cilag ou Epoietina beta: NeoRecormon, Roche; cf. EP 0 148 605, EP0 205 564, EP 0 411 678) de 20 mL totais mantidas a O0C foram adicionados2,2 mL de uma solução gelada de 10 mM de meta-periodato de sódio queresulta em uma concentração final de 1 mM de meta-periodato de sódio. Amistura foi incubada a 0°C durante uma hora em um banho de gelo no escu-ro e a reação foi terminada por adição de 40 μί de glicerol e incubada du-rante mais 5 minutos. O tampão da mistura foi mudado para tampão de ace-tato de sódio pH 5,5.
A EPO oxidada obtida (14,9 μί, 1,34 mg/mL, tampão de acetatode sódio pH 5,5), a solução de H-Cis(H)-HES 10/0,4 (5 μί) como obtido em4,1 foi adicionada. Depois da incubação durante 21 horas em temperaturaambiente a mistura de reação foi analisada por eletroforese em gel de SDS.
Uma XCeII Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) e um forne-cimento de força Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout1B) foram emprega-dos para eletroforese em gel de SDS. Um gel de 10% de Bis/Tris junto comum tampão fluente de MOPS em condições de redução (ambos InvitrogenGmbH, Karlsruhe, D) foram empregados de acordo com a instrução dos fa-bricantes.
5. Formação de tiazolidina a partir de H-Cis(H)-peptídeo-NH2 e AldeídoHES
Uma solução do peptídeo transportando um resíduo de cisteínalivre em seu terminal N (2 μΙ_, 15 μg1 3147 g/mol, 7,5 mg/mL em DMF, H-CLPSLEGNMQQPSEFHCMMNWSSHIAAC-NH2, obtido por síntese de fasesólida de Fmoc padrão e purificado por HPLC) foi adicionada a 20 μΙ_ deuma solução de AIdeidoHES (vide Tabela 1) em tampão de reação (vide Ta-bela 1, desgaseificado durante 15 minutos em um banho ultra-sônico) e amistura foi incubada durante a noite em temperatura ambiente. Para análisepor eletroforese em gel de SDS, uma XCeII Sure Lock Mini Cell (InvitrogenGmbH, Karlsruhe, D) e um fornecimento de força Consort E 143 (CON-SORTnv, Turnhout, B) foram empregados. Um gel de 12% de Bis/Tris juntocom um tampão fluente de MES em condições de redução (ambos Invitro-gen GmbH, Karlsruhe, D) foram empregados de acordo com a instrução dosfabricantes.
Tabela 1: Condições de reação
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6. Resultados
Os resultados das experiências podem ser vistos nas Figuras.Duas estratégias diferentes foram conduzidas como pode servisto nos exemplos acima. Em um caso (vide 4), o grupo carbonila foi intro-duzido no glicano de EPO por oxidação de periodato e conjugado a um gru-po alfa-SH-beta amino contendo HES. Este derivado de HES10/0,4 foi sinte-tizado em duas etapas a partir de HES, oxidado na extremidade de redução.
O HES oxidado foi convertido por um procedimento conhecido em um Ami-noHES (vide 1,1.) seguido por acilação com uma cisteína protegida (Fmoc-Cis(StBu)-OH) (vide 1,2.) e desproteção (vide 1,3.). A outra rotina (vide 5.)utilizou um AIdeidoHESI 0/0,7 e um AldeídoHES50/0,7 (vide 2,2. e 3,2.), sin-tetizado por acilação do AminoHES conhecido (vide 2,1. e 3,1.) com ácido 4-formilbenzóico e um peptídeo, transportando uma cisteína desprotegida emseu terminal N. Conclusão para conversão quase completa foi obtida pelasestratégias (vide Figura 1 e 2). A conjugação de AldeídoHES para Cis-peptídeo continuou igualmente corretamente em pH 4,6 e pH 8,0 (vide Figu-ra 2, Faixas A e D ou Faixas B e Ε). A reação do peptídeo nestas condiçõesde reação com HES10/0,7 ou HES50/0.7 falhou. Sob condições de reaçãomodificadas, o sucesso pôde ser esperado.
O método de acordo com esta invenção tem a vantagem paraproteínas que mutantes com resíduos de cisteína de terminal N são obtení-veis através de expressão, enquanto outras modificações de proteínas queda mesma forma permitiriam uma conjugação de quimiosseletiva poderiamnão estar disponíveis através desta rotina. Com isso, espera-se que umareação seletiva com amido de hidroxialquila, em particular, amido de hidroxi-etila através do resíduo de terminal N da proteína seja permitida. Uma outravantagem do método de acordo com a invenção é a quimiosseletividade dareação do grupo aldeído, ceto ou hemiacetal com o grupo alfa-SH-beta ami-no. Portanto, nenhuma reação com os grupos funcionais das cadeias lateraisde, por exemplo, uma proteína ou peptídeo é esperada.
7. Síntese de H-Cis(H)-HES50/0,7
7.1 Síntese de AminoHES50/0.7 a partir de HES oxidadoOxo-HES50/0,7 (10,1 g, PM = 44,2 kDa, DS = 0,7, Parte 502,
Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) foi aquecidodurante 72 horas a 80°C em vácuo, dissolvido sob argônio em dimetil sulfó-xido seco (52 mL, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen1 D) e1,4-diaminobutano (2,3 mL, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkir-chen, D) foi adicionado. Depois de agitar a 45°C durante 19,5 horas, a mistu-ra de reação foi adicionada em gotas a uma mistura de 1:1 (400 mL, v/v) deacetona (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) e etanol (DAB, Sonnen-berg, Braunschweig, D). O produto precipitado foi coletado por centrifuga-ção. O produto bruto foi dissolvido em água (100 mL, Milli-Q), dialisado (tu-bulação para diálise SnakeSkin, 10 kDa MWCO, Perbio Sciences Deutsc-hland GmbH, Bonn, D) durante 24 horas contra 20 mM de ácido acético e3,5 horas contra água. O rendimento do produto isolado depois da Iiofiliza-ção foi 84%.
7.2 Síntese de Fmoc-Cis(StBu)-HES50/0,7 a partir de AminoHES50/0.7 .
Fmoc-Cis(S-tBu)-OH (293,1 mg, Fluka, Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Taufkirchen, D) e 1-hidróxi-1H-benzotriazol (155,9 mg, Iris BiotechGmbH, Marktredwitz, D) foram dissolvidos em N,N-dimetilformamida (30 mLPeptide synthesis grade, Biosolve, Valkenswaard, NL) e N1N'-diisopropilcarbodiimida (138 μί, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Tauf-kirchen, D) foram adicionados. Depois de incubação a 210C durante 30 mi-nutos, AminoHES50/0,7 (3,00 g), obtido como descrito em 7,1 foi adicionado.
Depois de agitar em temperatura ambiente durante a noite, a mistura de rea-ção foi adicionada a uma mistura de 1:1 (230 mL, v/v) de acetona (Carl RothGmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) e etanol (DAB, Sonnenberg, Braunschweig,D). O produto precipitado foi colecionado por centrifugação, dissolvido emDMF (30 mL) e precipitado novamente como descrito acima. Depois da cen-trifugação, o produto bruto foi dissolvido em água (30 mL, Milli-Q), dialisadodurante 28 horas com água Milli-Q (tubulação para diálise SnakeSkin, 10kDa MWCO, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) e liofilizado. Orendimento do produto isolado foi 98%.
7.3 Síntese de H-Cis(StBu)-HES50/0,7 a partir de Fmoc-Cis(StBu)-HES50/0.7
Fmoc-Cis(StBu)HES50/0,7 (2,62 g), obtido como descrito em 7,2foi dissolvido em DMF (20 mL) e piperidina (5 mL, Fluka, Sigma-AldrichChemie GmbH, Taufkirchen, D) foi adicionado. Depois de agitar em tempera-tura ambiente durante 15 minutos a mistura de reação foi adicionada a umamistura de 1:1 de acetona e etanol (190 mL, v/v). O produto precipitado foicoletado por centrifugação, dissolvido em DMF (25 mL) e precipitado nova-mente como descrito acima. Depois da centrifugação, o produto bruto foidissolvido em água (25 mL, Milli-Q) dialisado durante 45 horas com águaMilli-Q (tubulação para diálise SnakeSkin1 10 kDa MWCO, Perbio Sciences
Deutschland GmbH, Bonn, D) e liofilizado. O rendimento do produto isoladofoi 83%.
7.4-Síntese de H-Cis(H)-HES50/Q,7 a partir de H-Cis(StBui-HES50/0.7
H-Cis(S-tBu)HES50/0,7 (0,50 g), obtido como descrito em 7,3 foidissolvido em 50 mM de solução de cloridrato de tris-(2-carboxietil)-fosfina (5mL, TCEP, Acros Organics, Geel, B em 0,1 M de tampão de acetato de só-dio pH 5,0). Depois de agitar em temperatura ambiente durante uma hora, amistura de reação foi dialisada (tubulação para diálise SnakeSkin, 10 kDaMWCO, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) durante 22 horascom 5 mM de EDTA aquosa (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkir-chen, D em Milli-Q water) e uma hora com água (MiIIi-Q) e liofilizada. O ren-dimento do produto isolado foi 97%.
8.Conjugação para DNA
8.1 Hibridizacão de DNA modificado por Formilindol
DNA modificado por 5'-Formilindol (a modificação de Formilindol,isto é a modificação de 3-Formilindol, foi introduzida de acordo com A. Oka-moto e outros, Tetrahedron Lett. 2002, 43, 4581-4583; 200 μΐ, atdbio, Sou-thampton, UK1 parte A0795, M = 9361 g/mol, c = 37,8 μΜ em água, seqüên-cia: XTACTCACCCTGCGAATTCAACTGCTGCCTC) e o padrão comple-mentar não modificado (199 μί, atdbio, Southampton, UK, parte A0794, M =9376 g/mol, c = 38,2 μΜ em água, seqüência: GAGGCAGCATTGAATTCG-CAGGGTGAGTA) foram hibridizados em uma relação molar de 1:1 com ba-se nas concentrações produzidas pelo fabricante. As soluções foram mistu-radas e incubadas a 95°C durante 5 minutos, resultando em uma concentra-ção final de 0,356 mg/mL de DNA de filamento duplo. 157 μΐ (55,9 μς) foramliofilizados durante noite e dissolvidos em água (27,9, Milli-Q) resultando emuma concentração final calculada de 2 mg/mL. As concentrações são calcu-ladas e não são experimentalmente verificadas.
8.2 Hibridizacão de DNA modificado por 5'-amino-C6DNA modificado por 5'-amino-C6 (59,1 nmols, biomers.netGmbH, Ulm, D, Iot 00033426_1 DNA, M = 9218 g/mol, 59,1 nmols, seqüên-cia: TACTCACCCTGCGAATTCAACTGCTGCCTC) foi dissolvido em água(100 μΙ; Milli-Q). Ele (38,78 μι., 595 μΜ) foi hibridizado em uma relação molarde 1: 1 com base nas concentrações dadas pelo fabricante ao filamentocomplementar não modificado (600 μΙ_, atdbio, Southampton, UK, parteA0794, M = 9376 g/mol, c = 38,2 μΜ em água, seqüência: GAGGCAG-CATTGAATTCGCAGGGTGAGTA). As soluções foram misturadas e incuba-das a 95°C durante 5 minutos, resultando em uma concentração calculadafinal de 0,667 mg/mL de DNA de filamento duplo. As concentrações foramcalculadas e não foram experimentalmente verificadas.
8.3 Formação de um DNA modificado por FBA a partir de DNA modifi-cado por 5'-amino-C6
4-Formilbenzoato de succinimidila (50 μΐ_, 4 mg/mL em DMF,Novabiochem, Merck KGaA, Darmstadt, D) foi adicionado ao DNA modifica-do por 5'-amino-C6 de filamento duplo, obtido como descrito em 8,2 (500 μί,0,667 mg/mL em água) e a solução clara foi incubada durante 5 horas a21 °C. A mistura de reação foi centrifugada a 210C durante 15 minutos em13000 χ g em um concentrador Vivaspin 500 (Viva Science, 5 kDa de MW-CO, Hannover, Germany). O procedimento de lavagem foi repetido três ve-zes por diluição da solução residual com água (Milli-Q) em 0,5 mL e centrifu-gação durante 12 minutos como descrito. A solução de DNA foi diluída comágua em 167 μί, resultando em uma concentração final calculada de 2mg/mL. As concentrações foram calculadas e não experimentalmente verifi-cadas.
8.4 Formação de tiazolidina a partir de H-Cis(H)-HES50/0.7 e DNA mo-dificado por Formilindol
Uma solução de derivado de HES50/0,7 (4 μί, 147,5 mg/mL,vide Tabela 1) em tampão de reação (vide Tabela 2 em seguida) foi adicio-nada a uma solução aquosa de DNA modificado por Formilindol (1,4 μί, 2mg/mL), obtida como descrito em 8.1. Depois da incubação durante 14 horasa 210C, a mistura de reação foi analisada por eletroforese em gel de agaro-se. Um sistema Agagel Standard e um fornecimento de força Minicell PowerPack P20 (ambos Biometra GmbH, Góttingen, D) foram empregados. 2% deagarose NEEO Ultra-Qualitãt (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) juntocom tampão fluente de TBE de 0,5 χ foram empregados durante uma hora a55 V. Um sistema de documentação em gel Gel Doc 2000 junto com o soft-ware Quality One V4.0.3 (ambos BIO-RAD laboratories, München, D) foramempregados. Os resultados das experiências podem ser vistos na Figura 2.
Tabela 2: Condições de reação
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8.5 Formação de Tiazolidina a partir de H-Cis(H)-HES50/0.7 e DNAmodificado por FBA
Uma solução de derivado de HES50/0,7 (4 μΐ_, 147,5 mg/mL, videTabela 3 em seguida) em um tampão de reação (vide Tabela 3 em seguida)foi adicionada a uma solução aquosa de DNA modificado por FBA (1,5 μΙ_, 2mg/mL), obtido como descrito em 8.3. Depois da incubação durante 14 horasa 21 °C, a mistura de reação foi analisada por eletroforese em gel de agarosecomo descrito em 8.4. Os resultados das experiências podem ser vistos naFigura 3.Tabela 3: Condições de reação
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9. Conjugação em moléculas orgânicas pequenas (aqui: antibióticos(Daunorrubicina) e citostáticos (TvIosin)) Conjugação em moléculas orgâni-cas pequenas por formação de tiazolidina
H-Cis(H)-HES50/0,7 (11,0 mg), obtido como descrito em 7.4, foidissolvido em uma solução de molécula orgânica pequena (44 μΐ_, tendoconcentração [A] mg/mL, 13,4 equiv., vide Tabela 4 em seguida) em DMF(vide Tabela 4 em seguida), incubado a 210C durante a noite e 40 μΐ_ da mis-tura de reação foram analisados por HPLC. Os resultados das experiênciaspodem ser vistos nas Figuras 4 a 9.
Daunorrubicina (Fluka, Sigma-AIdrich, Taufkirchen, D) e tartaratode Tilosina (ambos BioChemika grade, Fluka, Sigma-AIdrich, Taufkirchen, D)foram empregados como moléculas orgânicas pequenas. Para análise porHPLC, uma coluna C18 ReproSiI-PUR Basic 150 χ 4,6 mm i. d. (Order NsR15.B9.S1546, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, D) e um sistema de croma-tografia de Akta Basic (Bomba P900 Ser. N2 01118816, detector de UVUV900 Ser. Ne 01120613, pH/detector de condutividade pH/C900 Ser. Ns01120665, coletor de fração Frac900 Ser. Ns 01120011 e software Unicom5.0 Ser. N9 01119821, todos Amersham Biosciences, Freiburgl D) foramempregados.
O seguinte método foi aplicado para todas as análises:- Tampão A: água com 0,1 de TFA (Rotisolv LC-MS Garde, CarlRoth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D)
- Tampão B: uma mistura de 15% de água com 0,1 de TFA e85% de acetonitrila com 0,1% de TFA (ambos Rotisolv LC-MS grade, CarlRoth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D).
- Gradiente: 0% de tampão B em 2 volumes de coluna (CV);gradiente linear 0 - 50% de tampão B em 15 CV, gradiente linear 50 - 100%de tampão B em 7 CV, 100% de tampão B para 7 CV, 0% de tampão B para 5 CV.
- Detecção de UV em 220 e 290 nm.
- Taxa de fluxo: 2 mL/min.
Tabela 4: Condições de reação
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10. Formação de Tiazolidina a partir de H-Cis-peptídeo e HES nativo
Uma solução de um peptídeo transportando um resíduo de ciste-ína livre como seu terminal N (1 μΐ, 20 μg, 2528 g/mol, 20 mg/mL em DMF,Sequenze H-Cis-Asn-Thr-Arg-Lis-Arg-Ile-Arg-Ile-Gln - Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-AIa-Phe-VaI-Thr-IIe-GIy-Lis-OH, SC623, NeoMPS S.A., Strasbourg, F) foiadicionada em 9 μί de uma solução de HES 10/0,7 (408 mg/mL em [Tam-pão de Reação] (vide Tabela 5 abaixo), PM = 9,2 kDa, DS = 0,7, Parte 437,Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D), solução de Tri-ton-X100 (1 μί, 10% em água) foi adicionada às reações selecionadas (videTabela 5 abaixo) e as misturas foram incubadas durante a noite a [B]°C (videTabela 5 abaixo). Para análise por Eletroforese em gel de SDS, uma XCeIISure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) e um fornecimento deforça Consort E 143 (CONSORTnv, Turnhout, B) foram empregados. Um gelde 12% de Bis/Tris junto com um tampão fluente de MOPS em condições deredução (ambos Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) foi empregado de acordocom a instrução dos fabricantes. Os resultados da experiência podem servistos na Figura 10.Tabela 5: Condições de reação
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* sem HES
11. Resultados das experiências de acordo com os itens 8 a 10 acima
11.1 Conjugação para DNA por formação de tiazolidina (item 8 acima)
Conjugação para DNA por formação de tiazolidina foi obtida comdois DNAs modificados por aldeído diferentes (vide item 8. aqui acima). OsDNA-aldeídos necessários estavam comercialmente disponíveis no caso deDNA modificado por Formilindol (vide artigo 8.1 aqui acima) ou foram prepa-rados a partir de DNA de 5'-amino comercialmente disponível e 4-formilbenzoato de succinimidila (vide item 8.3 aqui acima). O grupo alfa-SH-beta amino contendo HES (H-Cis(H)-HES50/0,7) foi preparado a partir de H-Cis(StBu)-HES50/0,7 por redução com TCEP e purificado por precipitação ediálise (vide item 7.4 aqui acima). H-Cis(StBu)-HES50/0,7 foi preparado emanalogia a H-Cis(StBu)-HESI 0/0,4 (vide item 4.1 aqui acima). Os resultadosda conjugação para os DNAs modificados por aldeído são mostrados na Fi-gura 3. Conjugação bem-sucedida foi indicada pelo aparecimento de umanova faixa em peso molecular mais alto. Sua largura de faixa aumentada foidevido à distribuição de peso molecular da parte de HES do conjugado. Con-jugação foi obtida em pH 4,6 (Faixa A) ou pH 8,0 (Faixa C). Nenhuma conju-gação foi observada com OxoHES50/0.7, o material de partida para H-Cis(H)-HES50/0,7 (Faixa B e D).
11.2 Conjugação para moléculas orgânicas pequenas (item 9 acima)
Conjugação para compostos orgânicos pequenos por formaçãode tiazolidina foi obtida para um fármaco citostático (Daunorrubicina, videFigura 4 aqui abaixo) e um antibiótico (Tylosin, vide Figura 7 aqui abaixo). Ogrupo alfa-SH-beta amino que contém material de partida de HES (a mesmaconcentração como na reação de conjugação) apareceu como uma faixaampla com um tempo de retenção por volta de 10 minutos (vide Figuras 6, 9aqui abaixo). Sua largura de pico aumentada foi devido à distribuição de pe-so molecular do HES. As análises de HPLC dos compostos orgânicos pe-quenos (a mesma concentração como na reação de conjugação) são mos-tradas nas Figuras 5 e 8. Conjugação bem-sucedida é indicada pelo apare-cimento de um novo pico amplo em tempos de retenção entre aqueles domaterial de partida de HES e aqueles do composto orgânico pequeno (Figu-ras 4, e 7). Novamente, a forma de pico amplo refletiu a distribuição de pesomolecular da parte de HES do conjugado.
11.3 Conjugação empreaando-se HES nativo (item 10 acima)
Conjugação para HES nativo por formação de tiazolidina foi ob-tida para um peptídeo transportando um resíduo de cisteína livre em seuterminal N (vide item 10. aqui acima) em DMF como o solvente em uma faixade temperatura entre 210C - 50°C (Figura 10 Faixas A1 B e E) ou em tampãoaquoso em pH 4,6 a 50°C (Figura 10, Faixa D). Conjugação foi da mesmaforma observada nos presentes do detergente Triton X-100 a 50°C (FiguraFaixas F e G). Conjugação bem-sucedida foi indicada pelo aparecimentode uma nova faixa em peso molecular mais alto. Sua largura de faixa au-mentada foi devido à distribuição de peso molecular da parte de HES doconjugado.
Desse modo, pode ser mostrado que a conjugação de HES nati-vo com um Cis-peptídeo é geralmente possível, mesmo sob várias condi-ções diferentes, como mostrado sob item 6. aqui acima.

Claims (60)

1. Método para preparar um conjugado de uma substância ativae amido de hidroxialquila, em que a substância ativa e o amido de hidroxial-quila são covalentemente ligados por um resíduo químico tendo uma estrutu-ra de acordo com a fórmula (I)<formula>formula see original document page 66</formula>ou fórmula (I')<formula>formula see original document page 66</formula>ou fórmula (I")em que R1, R2, R2, R3, R3 e R4 são selecionados independentemente a par-tir do grupo que consiste em hidrogênio, um grupo heteroaralquila, aralquila,heteroarila, arila e alquila opcionalmente apropriadamente substituído, linear,cíclico e/ou ramificado, preferivelmente hidrogênio,o referido método compreendendo(A) reagir um grupo aldeído, um grupo ceto ou um grupo hemia-cetal de um amido de hidroxialquila ou um derivado do mesmo compreen-dendo o referido grupo aldeído, grupo ceto ou grupo hemiacetal com umgrupo alfa-SH-beta amino<formula>formula see original document page 67</formula> de uma substância ativa ou um derivado da mesma compreendendo o refe-rido grupo alfa-SH-beta amino, desse modo preparando um conjugado dareferida substância ativa e do referido amido de hidroxialquila sendo cova-Ientemente ligado por um resíduo químico tendo uma estrutura de acordocom a fórmula (I); ou com um grupo alfa-SH-beta amino <formula>formula see original document page 67</formula> de uma substância ativa ou um derivado da mesma compreendendo o refe-rido grupo alfa-SH-beta amino, desse modo preparando um conjugado dareferida substância ativa e do referido amido de hidroxialquila sendo cova-Ientemente ligado por um resíduo químico tendo uma estrutura de acordocom fórmula (Γ), ou com um grupo alfa-SH-beta amino <formula>formula see original document page 67</formula> de uma substância ativa ou um derivado da mesma compreendendo o refe-rido grupo alfa-SH-beta amino, desse modo preparando um conjugado dareferida substância ativa e do referido amido de hidroxialquila sendo cova-Ientemente ligado por um resíduo químico tendo uma estrutura de acordocom fórmula (I"), em que R1, R2, R2', Ra, Ra- e R4 são como definidos acima;ou(B) reagir um grupo aldeído, um grupo ceto ou um grupo hemia-cetal de uma substância ativa ou um derivado da mesma compreendendo oreferido grupo aldeído, grupo ceto ou grupo hemiacetal com um grupo alfa-SH-beta amino <formula>formula see original document page 67</formula>de um derivado de amido de hidroxialquila compreendendo o referido grupoalfa-SH-beta amino, desse modo preparando um conjugado da referidasubstância ativa e do referido amido de hidroxialquila sendo covalentementeligado por um resíduo químico tendo uma estrutura de acordo com fórmula(I); ou com um grupo alfa-SH-beta amino<formula>formula see original document page 19</formula> de um derivado de amido de hidroxialquila compreendendo o referido grupoalfa-SH-beta amino, desse modo preparando um conjugado da referidasubstância ativa e do referido amido de hidroxialquila sendo covalentementeligado por um resíduo químico tendo uma estrutura de acordo com fórmula(I); ou com um grupo alfa-SH-beta amino<formula>formula see original document page 68</formula> de um derivado de amido de hidroxialquila compreendendo o referido grupoalfa-SH-beta amino, desse modo preparando um conjugado da referidasubstância ativa e do referido amido de hidroxialquila sendo covalentementeligado por um resíduo químico tendo uma estrutura de acordo com fórmula(I"), em que R1, R2, R2-, R3, R3· e R4 são como definidos acima.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o amido dehidroxialquila tem a seguinte estrutura (II)<formula>formula see original document page 68</formula>em que R', R" e R'" são independentemente hidrogênio, um grupo hidroxial-quila linear ou ramificado ou o grupo—[(CR1 R2)mO]n[CR3R4]a—OHem que R1, R2, R3 e R4 são selecionados independentemente a partir dogrupo, que consiste em hidrogênio, e grupo alquila, preferivelmente hidrogê-nio e grupo metila,m é 2 a 4, em que os resíduos R1 e R2 podem ser os mesmos oudiferentes nos grupos m CR1R2;η é O a 20, preferivelmente 0 a 4;o é 0 a 20, preferivelmente 2 a 4, em que no caso de η = 0, o nãoé 0, e em que os resíduos R3 e R4 podem ser os mesmos ou diferentes nogrupo o CR3R4.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que R', R" e R'"são independentemente hidrogênio ou um grupo 2-hidroxietila.
4. Método, de acordo com quaisquer dentre as reivindicações 1a 3, em que o amido de hidroxialquila é amido de hidroxietila.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o amido dehidroxietila tem um peso molecular de 1 a 300 kD, mais preferivelmente de 2a 200 kD, mais preferivelmente de 10 a 150 KD ou 4 a 130 kD, mais preferi-velmente a partir de 10 a 100 kD.
6. Método, de acordo com quaisquer dentre as reivindicações 4ou 5, em que o amido de hidroxietila tem uma substituição molar de 0,1 a 3,preferivelmente 0,1 a 2, mais preferido 0,1 a 0,9 ou 0,4 a 2, preferivelmente-0,4 a 1,3.
7. Método, de acordo com quaisquer dentre as reivindicações 4a 6, em que o amido de hidroxietila tem uma relação preferida entre substitu-ição de C2: C6 na faixa de 2 a 20 com respeito aos grupos hidroxietila.
8. Método, de acordo com quaisquer dentre as reivindicações 1a 7, em que a substância ativa é selecionada a partir do grupo que consisteem proteínas, peptídeos, fármacos de molécula pequena, agentes ativos,glicoproteínas e oligonucleotídeos, tais como DNA, RNA1 PNA ou derivadodestes.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que a substân-cia ativa é selecionada a partir do grupo que consiste em proteínas, peptí-deos e PNA compreendendo um grupo alfa-SH-beta amino, preferivelmentecompreendendo um grupo cisteína, em particular uma cisteína de terminal N.
10. Método, de acordo com quaisquer dentre as reivindicações 8-5 ou 9, em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste emEPO, G-CSF, IFN alfa, IFN beta, AT III, IL-2, IL-3, mioglobina, SOD, BSA,rhEPO, rhG-CSF, rhIFN alfa, rhIFN beta, rhAT III, rhlL-2, rhlL-3, AIAT, FatorVII, Fator VIII, Fator IX, tPA, e APC.
11. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que a subs-tância ativa é selecionada a partir do grupo que consiste em proteínas, gli-coproteínas ou peptídeos que compreendem um aldeído, grupo ceto ou gru-po herriiacetal, preferivelmente glicoproteínas contendo um aldeído em umacadeia lateral de glicanos ou peptídeos sintéticos.
12. Método, de acordo com quaisquer dentre as reivindicaçõesanteriores, em que o amido de hidroxialquila ou derivado deste compreende-1 a 100, preferivelmente 1 a 15, em particular 1 grupo aldeído, grupo cetoe/ou grupo hemiacetal ou em que o amido de hidroxialquila ou derivado des-te compreende 1 a 100, preferivelmente 1 a 15, em particular 1 grupo alfa-SH-beta amino.
13. Método, de acordo com quaisquer dentre as reivindicaçõesanteriores, em que a substância ativa compreende 1 a 15, preferivelmente 1a 8, em particular 1 grupo aldeído, grupo ceto e/ou grupo hemiacetal ou emque a substância ativa compreende 1 a 15, preferivelmente 1 a 8, em parti-cular 1 grupo alfa-SH-beta amino.
14. Método, de acordo com quaisquer dentre as reivindicaçõesanteriores, em que de acordo com (A), o grupo hemiacetal do amido de hi-droxialquila é o grupo hemiacetal da extremidade de redução do amido dehidroxialquila em sua forma não oxidada.
15. Método, de acordo com quaisquer dentre as reivindicações 1a 14, em que o derivado de amido de hidroxialquila compreendendo o referi-do grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiacetal ou o referido grupo alfa-SH-beta amino é obtido por um método que compreende(a)(1) introduzir pelo menos um grupo aldeído no amido de hi-droxialquila por uma reação de oxidação de abertura de anel, ou(a)(2) reagir o amido de hidroxialquila com pelo menos um, pelomenos composto bifuncional, o referido composto compreendendo dois gru-pos funcionais M1 e Q, um grupo funcional M1 sendo reagido com o amidode hidroxialquila e um grupo funcional Q sendo(i) um grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiacetal ou um grupoalfa-SH-beta amino; ou(ü) um grupo funcional sendo quimicamente modificado paraproduzir o grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiacetal ou o grupo alfa-SH-beta amino.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que em(a)(1), o amido de hidroxialquila é submetido a uma reação de oxidação deabertura de anel empregando-se um periodato para produzir um derivado deamido de hidroxialquila tendo pelo menos um grupo aldeído.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que em(a)(2), o grupo funcional M1 é reagido com um grupo OH no amido de hidro-xialquila ou a extremidade de redução não oxidada ou oxidada de amido dehidroxialquila.
18. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que em(a)(2), o grupo funcional M1 é um grupo carbóxi ou um grupo carbóxi reativoe o grupo funcional Q é um grupo aldeído, grupo ceto ou grupo hemiacetal.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que o com-posto bifuncional compreendendo M1 e Q é selecionado a partir do grupoque consiste em ácido formilbenzóico, éster de pentafluorofenila de ácido-4-formilbenzóico, éster de N-hidroxissuccinimida de ácido 4-formilbenzóico eácido 4-(4-formil-3,5-dimetoxifenóxi)butírico ou um composto biocompatívelselecionado a partir do grupo que consiste em ácidos alfa-ceto carboxílicos,ácidos neuramínicos ou derivados dos mesmos e fosfato de piridoxal.
20. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que em(a)(2)(ii) o, pelo menos, composto bifuncional compreende um grupo aminoM1 e um grupo amino Q.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que o, pelomenos, composto bifuncional é um diaminoalcano opcionalmente substituídotendo de 1 a 20 átomos de carbono, preferivelmente um composto sendoselecionado a partir do grupo que consiste em 1,2-diaminoetano, 1,3-diaminopropano, e 1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano, 1,6-diamino-exano, 1,7-diaminoeptano, 1,8-diaminooctano, 1,9-diaminononano, 1,10-diaminodecano, 1,11-díaminoundecano, 1,12-diaminododecano, 1,13-diaminotridecano, 1,14-diaminotetradecano, 1,15-diaminopentadecano, 1,16-diaminoexadecano, 1,17-diaminoeptadecano, 1,18-diaminooctadecano,-1,19-diaminononadecano, e 1,20-diaminoeicosano ou um composto tendo afórmulaH2N—[CCR1 R2)pO]q[CR3R4'],—NH2em que R1, R2, R3 e R4' são selecionados independentemente a partir dogrupo, consistindo em hidrogênio, e grupo alquila, preferivelmente hidrogênioe grupo metila,P é 2 a 4, em que os resíduos R1' e R2' podem ser os mesmos oudiferentes nos grupos ρ CR1' R2',q é 0 a 20, preferivelmente 0 a 10;r é 0 a 20, preferivelmente 2 a 4, em que no caso de q = 0, r não é 0, e emque os resíduos R3' e R4' podem ser os mesmos ou diferentes no grupo rCR3R4'.
22. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, adicional-mente compreendendo reagir o derivado de amido de hidroxialquiia, resul-tando da reação do amido de hidroxialquiia com o, pelo menos, compostobifuncional compreendendo dois grupos amino M1 e Q1 no grupo amino Qcom um outro composto bifuncional compreendendo um grupo aldeído, gru-po ceto ou grupo hemiacetal para produzir um derivado de amido de hidroxi-alquiia tendo um grupo aldeído, grupo ceto ou grupo hemiacetal.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o outrocomposto bifuncional é selecionado a partir do grupo que consiste em ácidoformilbenzóico, éster de pentafluorofenila de ácido 4-formilbenzóico, éster deN-hidroxissuccinimida de ácido 4-formilbenzóico, ácido 4-(4-formil-3,5-dimetoxifenóxi)butírico, e anidrido de ácido 4-formilbenzóico.
24. Método, de acordo com quaisquer dentre as reivindicações-20 a 23, em que o amido de hidroxialquila é reagido por sua extremidade deredução opcionalmente oxidada com o grupo funcional M1.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, em que estatisti-camente mais que 50%, preferivelmente pelo menos 55%, mais preferivel-mente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 65%, mais prefe-rivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, maispreferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%,mais preferivelmente pelo menos 90%, e ainda mais preferivelmente pelomenos 95% tal como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% das moléculas de ami-do de hidroxialquila empregadas para uma determinada reação são reagidospor pelo menos uma extremidade de redução opcionalmente oxidada pormolécula de amido de hidroxialquila.
26. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que em(a)(2)(i), o grupo funcional Mi é selecionado a partir do grupo que consisteem um grupo carbóxi, um grupo carbóxi reativo, anidrido de ácido carboxíli-co, halogeneto de ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, éster de ácidoclorofórmico, e grupos epóxido e o grupo funcional Q é um grupo aldeído,grupo ceto ou grupo hemiacetal.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, em que o grupofuncional M1 é reagido com grupos OH no amido de hidroxialquila.
28. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que em(a)(2)(i), o grupo funcional M1 é selecionado a partir do grupo que consisteem um grupo amino e um grupo alfa-SH-beta amino e o grupo funcional Q éum grupo alfa-SH-beta amino.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que o grupofuncional M1 é reagido com a extremidade de redução opcionalmente oxida-da do amido de hidroxialquila.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, em que estatisti-camente mais que 50%, preferivelmente pelo menos 55%, mais preferível-mente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 65%, mais prefe-rivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, maispreferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%,mais preferivelmente pelo menos 90%, e ainda mais preferivelmente pelomenos 95% tal como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% das moléculas de ami-do de hidroxialquila empregados para uma determinada reação são reagidospor pelo menos uma extremidade de redução opcionalmente oxidada pormolécula de amido de hidroxialquila.
31. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que em(a)(2)(i), o amido de hidroxialquila compreendendo o referido grupo alfa-SH-beta-amino é obtido por um método compreendendo reagir o amido de hi-droxialquila na extremidade de redução opcionalmente oxidada com umcomposto compreendendo um grupo funcional M1 e um grupo funcional Qsendo um grupo alfa-SH-beta amino.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, em que o com-posto compreendendo M1 e o grupo alfa-SH-beta-amino é 1,3-diamino-2-tiopropano ou 2,3-diamino-1-tio propano.
33. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que em(a)(2)(ii) o, pelo menos, composto bifuncional compreende M1 sendo um gru-po carbóxi ou um grupo carbóxi reativo e Q sendo um grupo alfa-SH-betaamino protegido.
34. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que o, pelomenos, composto bifuncional é selecionado a partir do grupo que consisteem D-, L-PG1-Cis(PG2)-OH, ou uma mistura racêmica do mesmo, e seu és-ter ativo, em que PG1 pode ser qualquer grupo protetor adequado para umgrupo amino, preferivelmente selecionado a partir do grupo que consiste emterc-butiloxicarbonila (Boc) ou 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), e PG2 podeser qualquer grupo protetor adequado para um grupo tiol, preferivelmenteselecionado a partir do grupo que consiste em tritila (Trt), p-metoxitritila(Mmt) S-terc-butiltio (S-t-Bu), e acetamidometila (Acm).
35. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que em(a)(2)(ii), o amido de hidroxialquila compreendendo o referido grupo alfa-SH-beta-amino é obtido por um método compreendendo opcionalmente oxidaramido de hidroxialquila em sua extremidade de redução, reagir as extremi-dade de redução não oxidada ou oxidada com um grupo funcional Mi de umcomposto compreendendo, além de M1, um grupo funcional adicional Q, paraproduzir um primeiro derivado de amido de hidroxialquila, e reagir o grupofuncional Q do primeiro derivado de amido de hidroxialquila com um grupofuncional V de um composto compreendendo, além de V1 um grupo alfa-SH-beta-amino opcionalmente protegido, para produzir o derivado de amido dehidroxialquila funcionalizado por alfa-SH-beta-amino opcionalmente protegido.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o com-posto compreendendo M1 e Q são um composto de diamino ou carbodiimi-dazol ou carbonato de Ν,Ν'-dissuccinimidila.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, em que o, pelomenos, composto bifuncional é um diaminoalcano opcionalmente substituídotendo de 1 a 20 átomos de carbono, preferivelmente um composto sendoselecionado a partir do grupo que consiste em 1,2-diaminoetano, 1,3-diaminopropano, e 1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano, 1,6-diamino-exano, 1,7-diaminoeptano, 1,8-diaminooctano, 1,9-diaminononano, 1,10-diaminodecano, 1,11-diaminoundecano, 1,12-diaminododecano, 1,13-diaminotridecano, 1,14-diaminotetradecano, 1,15-diaminopentadecano, 1,16-diaminoexadecano, 1,17-diaminoeptadecano, 1,18-diaminooctadecano,-1,19-diaminononadecano e 1,20-diaminoeicosano ou um composto tendo afórmulaH2N-[(CR1,R2,)pO]q[CR3'R4,]l-WH2em que R1, R2, R3', e R4' são selecionados independentemente a partir dogrupo, consistindo em hidrogênio, e grupo alquila, preferivelmente hidrogênioe grupo metila,ρ é 2 a 4, em que os resíduos R1 e R2 podem ser os mesmos oudiferentes nos grupos ρ CR1R2',q é 0 a 20, preferivelmente 0 a 10;r é 0 a 20, preferivelmente 2 a 4, em que no caso de q = 0, r não éO, e em que os resíduos R3' e R4' podem ser os mesmos ou diferentes nosgrupos r CR3R4'.
38. Método, de acordo com quaisquer dentre as reivindicaçõesa 37, em que o composto compreendendo Veo grupo alfa-SH-beta-amino opcionalmente protegido são cisteína ou um derivado desta, V sendoum grupo carbóxi ou um grupo carbóxi reativo, preferivelmente um éster rea-tivo ou um anidrido de ácido carboxílico ou o composto compreendendo V é-1,3-diamino-2-tio propano ou 2,3-diamino-1-tio propano.
39. Método, de acordo com quaisquer dentre as reivindicaçõesanteriores, em que a substância ativa, preferivelmente uma proteína opcio-nalmente modificada, peptídeo, peptídeo sintético ou oligonucleotídeo, com-preendendo o referido grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiacetal ou o re-ferido grupo alfa-SH-beta-amino é obtido por um método compreendendo(b)(1) introduzir pelo menos um grupo aldeído, grupo ceto, grupohemiacetal ou pelo menos um grupo alfa-SH-beta-amino na substância ativadurante sua preparação ou por modificação química, ou(b)(2) reagir a substância ativa com um, pelo menos, compostobifuncional, o referido composto compreendendo dois grupos funcionais M2 eQ, um grupo funcional M2 sendo reagido com a substância ativa e um grupofuncional Q sendo(i) um grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiacetal ou um grupoalfa-SH-beta amino; ou(ii) um grupo funcional sendo quimicamente modificado paraproduzir o grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiacetal ou um grupo alfa-SH-beta amino.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, em que em(b)(1), a substância ativa é uma proteína ou peptídeo que foi preparada porsíntese orgânica, preferivelmente produzida empregando-se uma resina desíntese, permitindo uma proteína ou peptídeo funcionalizado por aldeído,funcionalizado por ceto, funcionalizado por hemiacetal ou funcionalizado poralfa-SH-beta-amino, ou em que em (b)(1), a substância ativa é uma proteínaou peptídeo que foram produzidos empregando-se um vetor de expressãoque conduz a um proteína ou peptídeo funcionalizado por aldeído, funciona-Iizado por ceto, funcionalizado por hemiacetal ou funcionalizado por alfa-SH-beta-amino, ou em que em (b)(1), a substância ativa é uma proteína ou umpeptídeo e a cadeia principal da proteína ou peptídeo é substituída com umgrupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiacetal ou grupo alfa-SH-beta-amino,ou em que em (b)(1), a substância ativa é uma proteína ou um peptídeo on-de o referido grupo aldeído, grupo ceto, grupo hemiacetal ou o referido grupoalfa-SH-beta-amino ser ligado diretamente à cadeia principal da proteína oupeptídeo ou ser parte de uma cadeia lateral da cadeia principal.
41. Método, de acordo com a reivindicação 39, em que em (b)(1)a substância ativa é uma proteína ou peptídeo e o grupo aldeído, grupo cetoou grupo hemiacetal é compreendido em uma porção de carboidrato do poli-peptídeo.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, em que a porçãode carboidrato é selecionada a partir do grupo que consiste em hidroxialdeí-dos, hidroxicetonas e modificações químicas das mesmas.
43. Método, de acordo com a reivindicação 41, em que a porçãode carboidrato é um derivado de uma porção de carboidrato de ocorrêncianatural e é selecionada a partir do grupo que consiste em glicose, galactose,manose e ácido siálico, que são opcionalmente quimicamente ou enzimati-camente oxidados, preferivelmente uma galactose oxidada ou um resíduo deácido siálico oxidado de uma cadeia lateral de carboidrato, mais preferivel-mente a galactose terminal ou resíduo de ácido siálico de uma cadeia lateralde carboidrato, a oxidação de uma porção de carboidrato terminal sendorealizada enzimaticamente ou quimicamente, uma oxidação química preferi-velmente realizada empregando-se um periodato.
44. Método, de acordo com a reivindicação 41, em que a porçãode carboidrato é um derivado de um porção de carboidrato de ocorrêncianatural e é uma galactose terminal, que é quimicamente ou enzimaticamenteoxidada, em que o resíduo de galactose terminal é obtido opcionalmentedepois da clivagem de um ácido siálico terminal.
45. Método, de acordo com a reivindicação 39, em que em(b)(2)(i), o grupo alfa-SH-beta-amino é compreendido em um resíduo de cis-terna da substância ativa, preferivelmente uma proteína ou peptídeo, o resí-duo de cisteína preferivelmente sendo um resíduo de cisteína de terminal Nda substância ativa.
46. Método, de acordo com quaisquer dentre as reivindicaçõesanteriores, em que a substância ativa é uma proteína ou peptídeo modifica-do com um resíduo de cisteína de terminal N1 que não faz parte de uma pon-te de dissulfeto.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, em que a proteí-na ou peptídeo modificado que possuem um resíduo de cisteína de terminalN é um mutante de uma proteína ou peptídeo de ocorrência natural, obtido(1) adicionando-se um resíduo de cisteína ao aminoácido de terminal N, (2)substituindo-se o aminoácido de terminal N com cisteína, ou por (3) deletan-do -se o(s) aminoácido(s) de terminal N até uma cisteína terminal ser obtida.
48. Método, de acordo com quaisquer dentre as reivindicaçõesanteriores, em que a reação (A) ou (B) é realizada em uma temperatura de 0a 40°C, preferivelmente 0 a 25°C, em particular 20 a 25°C, na presença deum solvente, e em um pH de 3,5 a 10, preferivelmente 4 a 8, em particular-4,8 a 8,0 com um tempo de reação de preferivelmente 0,1 a 24 h, em parti-cular aproximadamente 21 h.
49. Método, de acordo com a reivindicação 48, em que o solven-te é selecionado a partir do grupo que consiste em água, tampão aquoso,DMF, DMSO1 DMA e misturas dos mesmos.
50. Método, de acordo com quaisquer dentre as reivindicações-48 ou 49, em que a relação molecular de amido de hidroxalquila para subs-tância ativa é cerca de 1 :1 a 200:1, preferivelmente 10:1 a 100:1, em parti-cular 40:1 a 70:1.
51. Conjugado de uma substância ativa e amido de hidroxialqui-la, quando alcançável por um método como definido nas reivindicações 1 a 50.
52. Conjugado de uma substância ativa e amido de hidroxialqui-Ia1 em que a substância ativa e o amido de hidroxialquila são covalentemen-te ligados por um resíduo químico tendo uma estrutura de acordo com afórmula (I)<formula>formula see original document page 79</formula>ou fórmula (I')<formula>formula see original document page 79</formula>ou fórmula (I")<formula>formula see original document page 79</formula>em que R1, R2, R2-, R3, R3' e R4 são selecionados independentemente a partirdo grupo que consiste em hidrogênio, um grupo heteroalquila, aralquila, he-teroarila, arila e alquila opcionalmente adequadamente substituído, linear,cíclico e/ou ramificado, preferivelmente hidrogênio,o referido conjugado tendo uma estrutura de acordo com a fórmula (IV), (IV'),ou (IV")<formula>formula see original document page 79</formula><formula>formula see original document page 80</formula> em que HAS' é o resíduo do amido de hidroxialquila ou um derivado domesmo que foi ligado a um grupo aldeído, grupo ceto ou grupo hemiacetal, eem que AS1 é o resíduo da substância ativa ou um derivado da mesma quefoi ligado ao grupo alfa-SH-beta-amino,ou uma estrutura de acordo com a fórmula (V), (V), ou (V") <formula>formula see original document page 80</formula><formula>formula see original document page 81</formula> em que HAS' é o resíduo do amido de hidroxialquila ou um derivado domesmo que foi ligado ao grupo alfa-SH-beta-amino, e em que AS' é o resí-duo da substância ativa ou um derivado da mesma que foi ligado ao grupoaldeído, grupo ceto ou grupo hemiacetal.
53. Conjugado, de acordo com a reivindicação 52, em que oconjugado é selecionado a partir do grupo que consiste em <formula>formula see original document page 81</formula> em que Ffe é como definido para Ri a R4 acima, <formula>formula see original document page 81</formula><formula>formula see original document page 82</formula>em que R5 é como definido para Ri a R4 acima,<formula>formula see original document page 82</formula><formula>formula see original document page 83</formula>em que na fórmula IV'a, IV'b, V'b, ou V'c, η é um número inteiro, preferivel-mente η é O a 20, e onde na fórmula Va, Vb, V'd, ou V'e, η é um número in-teiro, preferivelmente η é 1 a 20.
54. Conjugado, de acordo com a reivindicação 52, em que oconjugado é<formula>formula see original document page 83</formula>em que R', R" e/ou R'" é/são como definido(s) para fórmula Il e em que, empelo menos uma unidade de glicose de HES, pelo menos um dentre R', R"e/ou R'" seja selecionado independentemente a partir do grupo que consisteem<formula>formula see original document page 83</formula>e em que η é um número inteiro, preferivelmente 1 a 20 e/ou em que pelomenos um dentre R', R" e/ou R'" é -(CH2CH2O)m-Rn8, em que m é um núme-ro inteiro, preferivelmente 1 a 3, e Rns é selecionado a partir do grupo queconsiste na fórmula (Via), (Vlb), (VIc) e (Vld).
55. Derivado de amido de hidroalquila funcionalizado por alfa-SH-beta amino selecionado a partir do grupo que consiste em <formula>formula see original document page 84</formula> em que Rs é como definido para Ri a R4 acima, <formula>formula see original document page 84</formula> em que η é um número inteiro, preferivelmente O a 20,ou o grupo que consiste emem que R', R" e/ou R'" é/são como definido(s) para fórmula Il e em que empelo menos uma unidade de glicose de HES, pelo menos um dentre R', R"e/ou R'" seja selecionado independentemente a partir do grupo que consisteem <formula>formula see original document page 84</formula><formula>formula see original document page 85</formula> e em que η é um número inteiro, preferivelmente 1 a 20 e/ou em que pelomenos um dentre R', R" e/ou R'" é -(CH2CH2O)m-Rn8n8, em que m é um nú-mero inteiro, preferivelmente 1 a 3, e R n8nS é selecionado a partir do grupoque consiste na fórmula (Vl'a), (Vl'b), e (Vl'c).
56. Conjugado, de acordo com quaisquer dentre as reivindica-ções 51 a 54, para uso em um método para o tratamento do corpo humanoou animal.
57. Conjugado, de acordo com quaisquer dentre as reivindica-ções 51 a 54, como um agente terapêutico.
58. Composição farmacêutica compreendendo um conjugado deacordo com quaisquer dentre as reivindicações 51 a 54.
59. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-58, também compreendendo pelo menos um diluente, adjuvante, ou veículofarmaceuticamente aceitável.
60. Composição compreendendo um conjugado de uma subs-tância ativa e amido de hidroxialquila de acordo com quaisquer dentre asreivindicações 51 a 54.
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