ES2371495T3

ES2371495T3 - Proteínas de fusión de exendina.

Info

Publication number: ES2371495T3
Application number: ES07789496T
Authority: ES
Inventors: Homayoun Sadeghi; Christopher Philip Prior; David James Ballance; Andrew John Turner
Original assignee: Biorexis Pharmaceutical Corp
Current assignee: Biorexis Pharmaceutical Corp
Priority date: 2006-07-24
Filing date: 2007-07-13
Publication date: 2012-01-03
Anticipated expiration: 2027-07-13
Also published as: DK2046826T3; IL196674A; ZA200901280B; HK1135112A1; US20110245178A1; PE20080733A1; JP2009544301A; JP5102833B2; AU2007278994B2; EP2046826B1; WO2008012629A2; KR101193722B1; US20090239795A1; CA2658654A1; NO20090830L; KR20090033906A; WO2008012629A3; CN101511868A; CN101511868B; AU2007278994A1

Abstract

Una proteína de fusión que comprende una exendina-4 fusionada con una transferrina modificada (mTf) mediante un polipéptido enlazante, comprendiendo dicha proteína de fusión la secuencia de aminoácidos que se muestra en (i) SEC ID Nº: 23 o (ii) SEC ID Nº: 25.

Description

Proteínas de fusión de exendina

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden una exendina-4 y una transferrina modificada y a sus usos para el tratamiento de enfermedades asociadas con niveles elevados de glucosa en suero tales como diabetes de Tipo II, y para reducir el peso corporal. Se puede usar también la proteína de fusión de la invención para tratar otras enfermedades conocidas para beneficiarse del tratamiento con exendina-4 y otros agonistas del receptor GLP-1 tales como diabetes de Tipo I, insuficiencia cardiaca congestiva, infarto de miocardio, síndrome del colon irritable, enfermedades neurológicas tales como enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Huntington, y patología hepática no alcohólica no grasa.

Antecedentes de la invención

La diabetes se refiere a un proceso de enfermedad derivado de múltiples factores causantes y caracterizado por elevados niveles de glucosa en plasma o hiperglucemia en el estado de ayunas o tras la administración de glucosa durante una prueba oral de tolerancia a la glucosa. Existen dos formas generalmente reconocidas de la diabetes. En la diabetes de Tipo I, o diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI), los pacientes producen poca o ninguna insulina, la hormona que regula la utilización de la glucosa. En la diabetes de Tipo II, o diabetes mellitus no dependiente de insulina (DMNDI), los pacientes tienen a menudo niveles de insulina en plasma que son los mismos o incluso elevados en comparación con sujetos no diabéticos. Sin embargo, estos pacientes han desarrollado una resistencia al efecto estimulador de la insulina sobre la glucosa y el metabolismo lipídico en los principales tejidos sensibles a la insulina, que son el músculo, el hígado y los tejidos adiposos. Los niveles de insulina en plasma, aunque elevados, son insuficientes para superar la pronunciada resistencia a la insulina, dando como resultado hiperglucemia.

La hiperglucemia persistente o no controlada se asocia a morbilidad y mortalidad crecientes y prematuras. A menudo, la homeostasia anormal de la glucosa se asocia tanto directa como indirectamente con alteraciones del metabolismo lipídico, de las lipoproteínas y de las apolipoproteínas y de otras enfermedades metabólicas y hemodinámicas Por ejemplo, los pacientes con diabetes mellitus de Tipo II tienen un riesgo especialmente creciente de complicaciones macrovasculares y microvasculares, que incluyen arteriopatía coronaria, apoplejía, enfermedad vascular periférica, hipertensión, nefropatía, y neuropatía.

La obesidad y el sobrepeso se definen generalmente por el índice de masa corporal (IMC), que está correlacionado con la grasa corporal total y sirve como una medida del riesgo de algunas enfermedades El IMC se calcula como el peso en kilogramos dividido por la altura en metros cuadrados (kg/m2). El sobrepeso se define normalmente como IMC de 2529,9 kg/m2, y la obesidad, se define normalmente como un IMC de 30 kg/m2 o mayor. Véanse, por ejemplo, National Heart, Lung, and Blood Institute, Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adults, The Evidence Report, Washington, DC: U.S. Department of Health and Human Services, publicación del NIH con nº 98-4083 (1998).

El sobrepeso y los individuos obesos tienen un riesgo aumentado de dolencias tales como hipertensión, dislipidemia, diabetes de Tipo II (no dependiente de insulina), resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa, hiperinsulinemia, cardiopatía coronaria, angina de pecho, insuficiencia cardíaca congestiva, ictus, cálculos biliares, colecistitis, colelitiasis, gota, osteoartritis, apnea del sueño obstructiva y problemas respiratorios, colecistopatía, algunas formas de cáncer (por ejemplo, endometrial, de mama, de próstata, y de colon) y trastornos psicológicos (tales como depresión, trastornos de la alimentación, imagen corporal distorsionada y baja autoestima). Las consecuencias negativas para la salud de la obesidad hacen de ésta la segunda causa que conduce a una muerte evitable en los Estados Unidos e imparten un significativo efecto económico y psicosocial sobre la sociedad. Véase, McGinnis M, Foege WH., "Actual Causes of Death in the United States," JAMA 270: 2207-12, 1993.

La obesidad se reconoce ahora como una dolencia crónica que requiere tratamiento para reducir sus riesgos asociados a la salud. Aunque la pérdida de peso es un resultado importante del tratamiento, una de las metas importantes del control de la obesidad es mejorar los valores cardiovasculares y metabólicos para reducir la morbilidad y la mortalidad relacionadas con la obesidad. Se ha demostrado que una pérdida de peso corporal de 5-10% puede mejorar sustancialmente los valores metabólicos, tales como la glucosa en sangre, la presión sanguínea, y las concentraciones de lípidos. De esta forma, se cree que una reducción del 5-10% en el peso corporal puede reducir la morbilidad y la mortalidad. Los fármacos de prescripción actualmente disponibles para controlar la obesidad reducen generalmente el peso disminuyendo la absorción de la grasa de la dieta, como con orlistat, o creando un déficit de energía reduciendo la captación de alimento y/o aumentando los gastos de energía, como se observa con sibutramina.

Los tratamientos actuales para la diabetes de Tipo II incluyen la administración de insulina exógena, la administración

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oral de fármacos y las terapias dietéticas y los tratamientos de ejercicio. En 2005, la exenatida (exendina-4; Byetta®) fue aprobada por la FDA como una terapia auxiliar para los diabéticos de Tipo II que están tomando metformina y/o una sulfonilurea que no ha conseguido un adecuado control glucémico. La exenatida es exendina-4, un potente agonista del receptor agonista de GLP-1 que es un producto endógeno en las glándulas salivares del monstruo de Gila. Como GLP-1, exendina-4 es una incretina. Es insulinotrópica, inhibe la captación de alimento y el vaciamiento gástrico, y es trófico en las células � de los roedores (Parks y col., Metabolism. 50: 583-589, 2001; Aziz y Anderson, J. Nutr. 132: 990995, 2002; y Egan y col., J. Clin. Endocrinol. Metab. 87: 1282-1290, 2002). Además, debido a la presencia de glicina en la posición 2 de su extremo N, no es un sustrato para DPPIV, tal como es GLP-1. La desventaja para el uso de exenatida es que se debe inyectar dos veces al día debido a que su t1/2 es solo de 2-4 horas (Kolterman y col., J. Clin. Endocrinol. Metab. 88: 3082-3089, 2003 y Fineman y col., Diabetes Care. 26: 2370-2377, 2003).

El documento WO 2006/017688 A2 da a conocer moléculas de exendina-4 modificadas fusionadas con componentes de la sangre entre los que se incluye la transferrina. Los conjugados son útiles para el tratamiento de la diabetes y la obesidad.

Sin embargo, sigue existiendo necesidad de una molécula agonista del receptor GLP-1 resistente a la degradación que se pueda usar como terapia para proporcionar el control glucémico y para reducir el peso corporal. El desarrollo de una incretina mimética de larga acción ofrece la capacidad de potenciar el control glucémico a través de un aumento continuo de la secreción de insulina dependiente de glucosa, con la conveniencia de una dosificación menos frecuente. La presente invención cumple esta necesidad proporcionando moléculas de exendina-4 fusionadas a una transferrina modificada, que extiende la semivida circulatoria in vivo de exendina-4 manteniendo a la vez la bioactividad. Adicionalmente, el uso de una proteína de fusión de la invención puede reducir la elevada incidencia de náuseas y vómitos asociada actualmente con el uso de incretinas.

Resumen de la invención

De acuerdo con una primera forma de realización de la presente invención, se proporciona una proteína de fusión que comprende una exendin-4 fusionada a una transferrina modificada (mTf) mediante un polipéptido enlazante, comprendiendo dicha proteína de fusión la secuencia de aminoácidos que se muestra en (i) SEC ID Nº: 23 o (ii) SEC ID Nº: 25. Preferiblemente, dicha mTf está modificada para presentar glucosilación reducida en comparación con una molécula de transferrina natural.

De acuerdo con una segunda forma de realización de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de acuerdo con la primera forma de realización. Preferiblemente, dicho ácido nucleico comprende la secuencia que se muestra en la SEC ID Nº: 24 (cuando se refiere a la característica (i) de la primera forma de realización) o SEC ID Nº: 26 (cuando se refiere a la característica (ii) de la primera forma de realización).

De acuerdo con una tercera forma de realización de la presente invención, se proporciona un vector que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la segunda forma de realización.

De acuerdo con una cuarta forma de realización de la presente invención, se proporciona una célula hospedadora que comprende el vector de acuerdo con la tercera forma de realización.

De acuerdo con una quinta forma de realización de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de acuerdo con la primera forma de realización y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la composición está adaptada para administrarse a una dosis que varía desde 0,5 mg a 50 mg o de 1 mg a 100 mg. Preferiblemente la composición está adaptada para administrarse mediante inhalación.

De acuerdo con una sexta forma de realización de la presente invención, se proporciona una proteína de fusión de acuerdo con una característica (i) de la primera forma de realización, para uso en el tratamiento de la diabetes de Tipo II o en la reducción del nivel de glucosa en sangre en un paciente que lo necesita. Preferiblemente, dicha proteína de fusión se administra a una dosis de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 50 mg a una frecuencia de aproximadamente una vez por semana, una vez cada dos semanas, o una vez por mes.

De acuerdo con una séptima forma de realización de la presente invención, se proporciona una proteína de fusión de acuerdo con la característica (i) de la primera forma de realización para uso en el tratamiento de la obesidad o en la reducción del peso corporal en un paciente que lo necesita. Preferiblemente, dicha proteína de fusión se administra a una dosis de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg a una frecuencia de aproximadamente una vez por semana, una vez cada dos semanas, o una vez por mes.

De acuerdo con una octava forma de realización de la presente invención, se proporciona el uso de una proteína de fusión de acuerdo con la característica (i) de la primera forma de realización en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes de Tipo II, la reducción del nivel de glucosa en sangre, el tratamiento de la obesidad, o la 3 10

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reducción del peso corporal en un paciente humano que lo necesite.

El polipéptido enlazante es preferiblemente un polipéptido enlazante no helicoidal. Preferiblemente, el enlazante se selecciona entre el grupo constituido por PEAPTD (SEC ID Nº: 6), (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5), PEAPTD (SEC ID Nº: 6) en combinación con un enlazante bisagra de IgG, y (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 6) en combinación con un enlazante bisagra de IgG Más preferiblemente, el enlazante es (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5).

El resto Tf de la proteína de fusión de la invención puede originarse a partir de cualquier Tf de mamífero, preferiblemente, de Tf humana. La Tf está modificada (mTf) para presentar glucosilación reducida en comparación con una molécula de transferrina natural, e, incluso de manera más preferible, la Tf tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 17. En otras formas de realización preferidas, la Tf está modificada para reducir la unión al hierro y/o la unión al receptor de la Tf.

En otra forma de realización preferida, el extremo N de la proteína de fusión comprende además una secuencia señal de la secreción, preferiblemente una secuencia señal de transferrina, lactoferrina, melanotransferrina, o una de sus variantes en suero, más preferiblemente, la secuencia líder del híbrido (HSA)/MFa-1 una albúmina de suero humano, una secuencia líder del híbrido HSA/MFa-1, o una secuencia señal de la Tf, y, aún de manera más preferible, la secuencia señal es la secuencia señal de la Tf humana (nL) que se muestra en la SEC ID Nº:18.

En una forma de realización preferida, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf, en la que dicha proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 23 o SEC ID Nº: 25, la última de las cuales comprende la secuencia líder nL en el extremo N. En otras formas de realización preferidas, la exendina-4 es exendina-4 (1-39) y tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 4, y/o la molécula de exendina-4 está fusionada en el extremo Nterminal de la proteína de fusión, en el extremo C-terminal de la proteína de fusión o en ambos y en los extremos N y C de la proteína de fusión.

La invención proporciona también moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión anteriormente descritas, así como los correspondientes vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico, y células hospedadoras que comprenden las moléculas de ácido nucleico y los vectores.

También se ha presentado por la invención una composición farmacéutica que comprende algunas de las proteínas de fusión anteriormente descritas y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una forma de realización, la composición farmacéutica de la presente invención comprende la proteína de fusión exendina-4 (1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf de la SEC ID Nº: 23, y, en algunas formas de realización, la composición que comprende la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf de la SEC ID Nº: 23 está adaptada para administrarse a un intervalo de dosificación de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 50 mg o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg.

En otra forma de realización preferida, la composición está adaptada para administrarse mediante inhalación.

La invención presenta también un procedimiento de tratamiento de la diabetes de Tipo II o de la reducción de glucosa en sangre en un paciente humano que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión que comprende una exendina-4 fusionada a mTf mediante un polipéptido enlazante, preferiblemente, un enlazante no helicoidal.

Preferiblemente, estos procedimientos comprenden administrar la proteína de fusión exendina-4 (1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 23, y, en algunas formas de realización, se administra la proteína de fusión que se muestra en la SEC ID Nº: 23 a una dosis de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 50 mg a una frecuencia de aproximadamente una vez por semana, una vez cada dos semanas, o una vez por mes. En otra forma de realización, la exendina-4 fusionada a mTf mediante un polipéptido enlazante, preferiblemente, un polipéptido no helicoidal, y, más preferiblemente, la proteína de fusión que se muestra en la SEC ID Nº: 23, se administra con menos frecuencia que la exenatida para conseguir la efectividad terapéutica a una dosis terapéutica equivalente.

La invención presenta también un procedimiento de tratamiento de la obesidad o de reducción del peso corporal en un paciente humano que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión que comprende una exendina-4 fusionada a mTf mediante un polipéptido enlazante, preferiblemente un enlazante no helicoidal. Preferiblemente, la proteína de fusión comprende una proteína de fusión exendina-4 (1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 23, y, en algunas formas de realización, la proteína de fusión que se muestra en la SEC ID Nº: 23 se administra a una dosis de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg a una frecuencia de aproximadamente una vez por semana, una vez cada dos semanas, o una vez por mes. En otra realización, la exendina-4 fusionada a mTf mediante un polipéptido

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enlazante, preferiblemente la proteína de fusión que se muestra en la SEC ID Nº: 23, se administra con menos frecuencia que la exenatida para conseguir la efectividad terapéutica.

La invención proporciona también el uso de una proteína de fusión exendina-4/mTf, o una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión exendina/mTf, preferiblemente, la proteína de fusión exendina-4 (1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf, y, más preferiblemente, siendo la proteína de fusión como se muestra en la SEC ID Nº: 23, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes de Tipo II o para la reducción de la glucosa en sangre en un paciente que lo necesita, preferiblemente, estando el medicamento adaptado para administrarse a una dosis de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 50 mg, o en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la obesidad o para la reducción del peso corporal, en un paciente humano que lo necesita, preferiblemente, estando el medicamento adaptado para administrarse a una dosis de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg.

Por “exendina-4” se entiende la exendina-4 (1-39) que se muestra en la SEC ID Nº: 4, así como un fragmento de exendina-4 que tiene hasta 8 o 9 restos de aminoácidos eliminados del extremo C de la secuencia que se muestra en la SEC ID Nº: 4, para crear, por ejemplo, una exendina-4 (1-31) o exendina-4 (1-30), así como los péptidos que tienen al menos un 90%, y, preferiblemente, al menos un 95% de identidad con exendina-4 (1-31), o uno de los otros fragmentos de exendina-4 anteriormente descritos.

Tal como se usa en el presente documento, se dice que dos o más secuencias que codifican ADN están “unidas” o “fusionadas” cuando, como resultado de las fusiones en fase entre las secuencias que codifican el ADN, las secuencias que codifican el ADN se traducen en un polipéptido de fusión. La frase “unidos” o “fusionados” se puede usar también para referirse a péptidos fusionados mediante procedimientos alternativos por ejemplo, procedimientos químicos. El término “fusión”, en referencia a transferrina (Tf) o fusiones de transferrina modificada (mTf) incluye, pero no se limita a, unión de al menos una proteína, polipéptido o péptido terapéutico al extremo N terminal de Tf/mTf, fusión al extremo C terminal de Tf/mTf, y/o inserción entre dos aminoácidos cualesquiera en Tf/mTf.

Por “farmacéuticamente aceptable” se entiende una sustancia o composición que debe ser compatible químicamente y/o toxicológicamente con los otros ingredientes que comprenden una formulación, y/o el mamífero que se está tratando con la misma.

Por “cantidad terapéuticamente eficaz” se entiende una cantidad de una proteína de fusión exendina-4/mTf de la presente invención que reduce la glucosa en sangre, la ingesta calórica, reduce el peso corporal, y/o reduce la grasa corporal con respecto a los valores apropiados del control determinados antes del tratamiento o en un grupo tratado con el vehículo.

Los términos “que trata”, “tratar”, o “tratamiento” abarcan el tratamiento preventivo, es decir, el profiláctico, y el paliativo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una gráfica que muestra una comparación de la resistencia a la colagenasa (MMP-1) in vitro entre la proteína de fusión GLP-1 (7-37, A8G,K34A) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf (GLP-1/Tf) (Figura 1A) y la proteína de fusión exendina-4 (1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf (exendina-4/Tf) (Figura 1B),

La Figura 2 es una grafica que muestra el efecto de la dosis de la proteína de fusión exendina-4 (1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf (Exendina-4/Tf) en glucosa en sangre en ratones diabéticos (db/db), y muestra un efecto comparativo para el control de exendina-4. Cada punto representa la medida promedio de glucosa (n=3),

La Figura 3 es una gráfica que muestra el efecto de la dosis de inyecciones diarias de la proteína de fusión exendina-4 (1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf (Exendina-4/Tf) en el peso corporal, y muestra un efecto comparativo para exendina-4 y para los controles de mTf,

La Figura 4 es una gráfica que compara la potencia relativa para la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf (Exendina-4/Tf) y exendina-4. Se determinó esto mediante un ensayo de AMPc basado en células. La CE50 para la proteína de fusión 4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf es 31,3 pM y la CE50 para exendina-4 es 6,6 pM.

Descripción detallada de la invención

Proteínas de fusión exendina-4/Tf

La proteína de fusión exendina-4/Tf de la presente invención comprende exendina-4 fusionada a un péptido mTf mediante un polipéptido enlazante. Preferiblemente, se usa la exendina-4 (1-39) (SEC ID Nº: 4) de longitud completa, o un fragmento de exendina-4, con hasta 8 o 9 restos de aminoácidos eliminados del extremo C terminal de la secuencia que se muestra en la SEC ID Nº: 4, para crear, por ejemplo, una exendina-4 (1-31) o exendina-4 (1-30).

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Preferiblemente, se usa un polipéptido enlazante no helicoidal para unir el exendina-4 a mTf.

El enlazante preferido es PEAPTDPEAPTD (SEC ID Nº: 5). Se pueden seleccionar otros enlazantes del grupo constituido por PEAPTD (SEC ID Nº: 6), PEAPTD (SEC ID Nº: 6) en combinación con un enlazante bisagra de IgG (SEC ID Nº: 7-16) y PEAPTDPEAPTD (SEC ID Nº: 5) en combinación con un enlazante bisagra de IgG (SEC ID Nº: 7-16). La proteína de fusión de la invención que contiene un resto enlazante sustancialmente no helicoidal puede presentar una productividad creciente de la expresión en comparación con una proteína de fusión similar sin un enlazante sustancialmente no helicoidal. Además, una proteína de fusión exendina-4/mTf que contiene un enlazante sustancialmente no helicoidal puede presentar una productividad creciente de la expresión en comparación con una proteína de fusión similar con un polipéptido enlazante helicoidal.

La proteína de fusión exendina-4/mTf preferida comprende exendina-4(1-39) (SEC ID Nº: 4) enlazada, mediante el enlazante (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5), al mTf que se proporciona en la SEC ID Nº: 17. Cuando se produce, se prefiere que la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf comprenda también la señal de secreción de la transferrina humana o la secuencia líder (nL) (SEC ID Nº: 18). Las secuencias de ácido nucleico que codifican cada uno de los componentes de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf son como sigue; secuencia líder nL (SEC ID Nº: 19), exendina-4 (1-39) (SEC ID Nº: 20), (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 21), y la mTf (SEC ID Nº: 22). La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf completa, sin la nL líder es la SEC ID Nº: 23; su secuencia de ácido nucleico correspondiente es SEC ID Nº: 24. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf completa con la secuencia nL líder en el extremo N es la SEC ID Nº: 25; su correspondiente secuencia de ácido nucleico es la SEC ID Nº: 26).

Aunque se ha descrito anteriormente la mTf preferida, se puede usar cualquier transferrina modificada para preparar las proteínas de fusión exendina-4/mTf de la invención. La Tf humana natural es una proteína de 679 aminoácidos de aproximadamente 75 kDa (no cuenta para la glucosilación), con dos dominios o lóbulos principales, N (aproximadamente 330 aminoácidos) y C (aproximadamente 340 aminoácidos), que parecen originarse a partir de una duplicación génica. Véanse los números de referencia del GenBank NM_001063, XM_002793, M12530, XM_039845, XM_039847 y S95936, todos los cuales se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad, así como las SEC ID Nº: 2 y 3 (SEC ID Nº: 2 comprende la secuencia de 19 aminoácidos adicionales de la secuencia líder de la transferrina humana nL). Los dos dominios han divergido con el tiempo, pero retienen un gran grado de identidad/similitud.

Cada uno de los lóbulos N o C se divide además en dos subdominios, N1 y N2, C1 y C2. La función de Tf es transportar hierro a las células del cuerpo. Este proceso está mediado por el receptor Tf (TfR), que se expresa en todas las células, de manera particularmente activa en las células en crecimiento. La TfR reconoce la forma unida a hierro de Tf (se unen dos moléculas de la misma a cada receptor), produciendo la endocitosis, mientras que el complejo TfR/Tf se transporta al endosoma La caída localizada en el pH en el endosoma da como resultado la liberación del hierro unido y de la recirculación del complejo TfR/Tf a la superficie celular y la liberación de Tf (conocida como apoTf en su forma unida al hierro). La unión con el receptor se produce mediante el dominio C de Tf. Los dos sitios de glucosilación en el dominio C no parecen estar implicados en la unión del receptor debido a que la TF unida al hierro no está glucosilada y no se une al receptor.

Cada molécula de Tf puede transportar dos iones hierro (Fe3+). Estos están complejados en el espacio entre los subdominios N1 y N2, C1 y C2, dando como resultado un cambio conformacional en la molécula.

Para la transferrina humana de la SEC ID Nº: 3, los sitios de unión al hierro comprenden al manos los aminoácidos Asp 63 (Asp 82 de la SEC ID Nº: 2 que incluyen la secuencia señal de la Tf natural), Asp 392 (Asp 411 de la SEC ID Nº: 2), Tyr 95 (Tyr 114 de la SEC ID Nº: 2), Tyr 426 (Tyr 445 de la SEC ID Nº: 2), Tyr 188 (Tyr 207 de la SEC ID Nº: 2), Tyr 514

o 517 (Tyr 533 o Tyr 536 de la SEC ID Nº: 2), His 249 (His 268 de la SEC ID Nº: 2), e His 585 (His 604 de la SEC ID Nº: 2). Las regiones bisagra comprenden al menos los restos de aminoácidos 94-96, 245 - 247 y/o 316-318 del dominio N, así como los restos de aminoácidos 425-427, 581-582 y/o 652-658 del dominio C de la SEC ID Nº: 3. Los sitios de unión a carbonato de la Tf humana de la SEC ID Nº: 3 comprenden al menos los aminoácidos Thr 120 (Thr 139 de la SEC ID Nº: 2), Thr 452 (Thr 471 de la SEC ID Nº: 2), Arg 124 (Arg 143 de la SEC ID Nº: 2), Arg 456 (Arg 475 de la SEC ID Nº: 2), Ala 126 (Ala 145 de la SEC ID Nº: 2), Ala 458 (Ala 477 de la SEC ID Nº: 2), Gly 127 (Gly 146 de la SEC ID Nº: 2), y Gly 459 (Gly 478 de la SEC ID Nº: 2).

Preferiblemente, la proteína de fusión exendina-4/Tf modificada es de origen humano, aunque puede usarse cualquier molécula mTf animal para producir las proteínas de fusión de la invención, incluyendo variantes de Tf humanas, de vaca, cerdo, oveja, perro, conejo, rata, ratón, hámster, equidna, ornitorrinco, pollo, rana, gusano cachón, mono, así como otras especies de bóvidos, cánidos y aves. Todas estas secuencias de Tf están fácilmente disponibles en el GenBank y otras bases de datos públicas. Está disponible la secuencia del ácido nucleico de la Tf humana (véase la SEC ID Nº: 1 y los números de referencia descritos anteriormente) y se puede usar para preparar fusiones genéticas

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entre Tf o un dominio de Tf y la molécula terapéutica de elección. Se pueden preparar también fusiones a partir de moléculas relacionadas tales como lactotransferrina (Lactoferrina) Nº de Ref del GenBank: NM_002343) o melanotransferrina de murino Nº de Ref del GenBank: NM_013900).

La melanotransferrina es una proteína glucosilada que se encuentra a elevados niveles en las células del melanoma maligno y que se denominó originalmente antígeno p97 del melanoma humano (Brown y col., 1982, Nature, 296: 171173). Posee una elevada homología de la secuencia con la transferrina del suero humano, la lactoferrina humana, y la transferrina de pollo (Brown y col., Nature, 296: 171-173, 1982; Rose y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 1261-1265, 1986). Sin embargo, a diferencia de estos receptores, no se ha identificado el receptor celular de la melanotransferrina. La melanotransferrina se une de manera reversible al hierro y existe en dos formas, una de las cuales se une a las membranas celulares mediante un anclaje de glucosilfosfatidilinositol mientras que la otra forma es soluble y se secreta activamente (Baker y col., FEBS Lett, 298, 1992: 215-218; Alemany y col., J. Cell Sci., 104: 1155-1162, 1993; Food y col., J. Biol. Chem. 274: 7011-7017, 1994).

Se ha encontrado que la lactoferrina (Lf), una proteína de unión a hierro de defensa natural, posee actividad antibacteriana, antimicótica, antivírica, antineoplásica y antiinflamatoria. La proteína está presente en las secreciones exocrinas que están comúnmente expuestas a la flora normal: leche, lágrimas, exudado nasal, saliva, moco bronquial, fluidos gastrointestinales, moco cervical y fluido seminal. Adicionalmente, la Lf es un constituyente principal de los gránulos específicos secundarios de los neutrófilos polimorfonucleares circulantes (PMN). La apoproteína se libera en la desgranulación de los PMN en las áreas sépticas. Una función principal de la Lf es la de secuestrar los iones de hierro libre en fluidos y áreas inflamadas de tal manera que suprime el daño mediado por radicales libres y disminuye la disponibilidad del metal para invadir las células microbianas y neoplásicas. En un estudio que examinó el índice de renovación de la 125I Lf en adultos, se demostró que la Lf es capturada rápidamente por el hígado y el bazo, y la radioactividad persistió durante algunas semanas en el hígado y el bazo (Bennett y col., Clin. Sci. (Lond.) 57: 453-460, 1979).

La porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/mTf de la invención incluye una variante de corte y empalme de la transferrina. En un ejemplo, una variante de corte y empalme de la transferrina puede ser una variante de corte y empalme de la transferrina humana. Específicamente, la variante de corte y empalme de la transferrina humana puede ser la del Nº de Acceso AAA61140 del GenBank.

La porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/mTf de la invención incluye una variante de corte y empalme de la lactoferrina. En un ejemplo, una variante de corte y empalme de la lactoferrina de suero humano puede ser una novedosa variante de corte y empalme de una lactoferrina neutrófila. Específicamente, la variante de corte y empalme de la lactoferrina neutrófila puede ser la de la secuencia que se muestra con el Nº de Acceso AAA59479 del GenBank. También, la variante de corte y empalme de la lactoferrina neutrófila puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos EDCIALKGEADA (SEC ID Nº: 27), que incluye la novedosa región de varianza de corte y empalme.

Alternativamente, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/mTf de la invención incluye una variante de melanotransferrina.

Se pueden realizar fusiones de la Tf modificadas con cualquier proteína, fragmento, dominio, o dominio de Tf diseñado mediante ingeniería genética. Por ejemplo, se pueden producir proteínas de fusión usando una secuencia de Tf de longitud completa, con o sin la secuencia señal de la Tf natural. Se pueden preparar también proteínas de fusión de Tf usando un único dominio de Tf, tal como un dominio N o C individual o una forma modificada de Tf que comprende dominios 2N o 2C (Véase la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nº US 2006/0130158). Se pueden producir fusiones de una proteína terapéutica con un único dominio C, en el que el dominio C está alterado para reducir, inhibir o evitar la glucosilación. Alternativamente, el uso de un único dominio N es ventajoso ya que los sitios de glucosilación residen en el dominio C y en el dominio N. Preferiblemente, la proteína de fusión de la Tf tiene un único dominio N que se expresa a un elevado nivel.

Tal como se usa en el presente documento, un dominio o lóbulo C terminal modificado para funcionar como un dominio de tipo N, está modificado para presentar modelos de glucosilación o propiedades de unión al hierro sustancialmente similares a las de un dominio o lóbulo N natural. Preferiblemente, el dominio o lóbulo C está modificado de tal manera que no está glucosilado y no se une al hierro mediante sustitución de las regiones relevantes del dominio C o los aminoácidos de aquellas presentes en las correspondientes regiones o sitios de un dominio N natural o nativo.

Tal como se usa en el presente documento, un resto Tf que comprende “dos dominios o lóbulos N” incluye una molécula de Tf que está modificada para sustituir el dominio o lóbulo C natural con un dominio o lóbulo N natural o nativo o un dominio o lóbulo N modificado o contiene un dominio C que se ha modificado para funcionar de manera sustancialmente similar a la del dominio N modificado o natural.

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El análisis de los dos dominios mediante solapamiento de los dominios (Swiss PDB Viewer 3.7b2, Iterative Magic Fit) y mediante alineación directa de aminoácidos (alineación múltiple utilizando ClustalW) desvela que las dos regiones han divergido con el tiempo. La alineación de aminoácidos muestra un 42% de identidad y un 59% de similitud entre los dos dominios. Sin embargo, aproximadamente el 80% del dominio N se corresponde con el dominio C por equivalencia estructural. El dominio C tiene también algunos enlaces disulfuro adicionales en comparación con el dominio N.

En una forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/mTf incluye al menos dos lóbulos N terminales de transferrina. En formas de realización adicionales, la Porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/mTf incluye al menos dos lóbulos N terminales de transferrina derivados de transferrina de suero humano.

La porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/mTf puede incluir también: al menos dos lóbulos N terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, e His249 de la SEC ID Nº: 3; o al menos dos lóbulos C terminales de transferrina. E formas de realización adicionales, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/mTf incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina derivada de la transferrina de suero humano.

En una forma de realización adicional el lóbulo mutante C terminal incluye además una mutación de al menos uno de Asn413 y Asn611 de la SEC ID Nº: 3, que no permite la glucosilación.

En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/mTf incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por Asp392, Tyr426, Tyr514, Tyr517 e His585 de la SEC ID Nº: 3, en el que el mutante retiene la capacidad de unirse al metal. En una forma de realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/mTf incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por Tyr426, Tyr514, Tyr517 e His585 de la SEC ID Nº: 3, en el que el mutante tiene una capacidad reducida de unirse al metal. En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/mTf incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por Asp392, Tyr426, Tyr517 e His585 de la SEC ID Nº: 3, en el que el mutante no retiene la capacidad de unirse a metal y funciona de manera sustancialmente similar a un dominio N.

Cuando el dominio C de Tf es parte de la proteína de fusión, los dos sitios de glucosilación unidos a N, los restos de aminoácidos que corresponden a N413 y N611 de la SEC ID Nº: 3 pueden mutarse para la expresión en un sistema de levaduras para evitar la glucosilación o la hipermanosilación y extender la semivida en suero de la proteína de fusión y/ de la proteína terapéutica (para producir asialo, o en algunos ejemplos, monoasialo-Tf o disialo-Tf). Además de los aminoácidos de Tf que corresponden a N413 y N611, las mutaciones pueden ser en los restos adyacentes dentro del sitio de glucosilación N-X-S/T para evitar o reducir sustancialmente la glucosilación. Véase la Patente de los Estados Unidos Nº 5.986.067. Se ha informado también que el dominio N de la Tf expresada en Pichia pastoris llega a glucosilarse unido a O con una única hexosa en S32 que también puede estar mutada o modificada para evitar dicha glucosilación.

De acuerdo con esto, la proteína de fusión exendina-4/Tf incluye una molécula de transferrina modificada en la que la transferrina presenta glucosilación reducida, incluyendo, pero sin limitarse a formas asialo, monosialo y disialo de Tf E otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/Tf incluye una transferrina recombinante mutante que está mutada para evitar la glucosilación. En una forma de realización adicional, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/Tf incluye una transferrina mutante recombinante de suero humano que está mutada para evitar la glucosilación unida a N, en la que al menos uno de Asn413 y Asn611 de la SEC ID Nº: 3 esta mutado en un aminoácido, lo que no permite la glucosilación. En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/Tf incluye una transferrina mutante recombinante de suero humano que está mutada para evitar o reducir sustancialmente la glucosilación, en la que, por ejemplo, se preparan las mutaciones en los restos adyacentes dentro del sitio de glucosilación N-X-S/T, por ejemplo, la mutación de los restos S/T. Además, se puede reducir o evitar la glucosilación mutando el resto serina o treonina. Adicionalmente, se sabe que el cambio de la X a prolina inhibe la glucosilación.

Tal como se discute a continuación con más detalle, las proteínas de fusión de Tf modificada de la invención pueden también diseñarse mediante ingeniería genética para unirse al hierro y/o unirse al receptor de Tf. En otras formas de realización de la invención, la unión al hierro está retenida y la capacidad de unión al hierro de Tf se puede usar para liberar una proteína o péptido(s) terapéuticos en el interior de una célula, a través de una membrana celular epitelial o endotelial. Estas formas de realización que se unen al hierro y/o al receptor de Tf serán a menudo genotecnológicas para reducir o evitar la glucosilación para extender la semivida en suero de la proteína terapéutica. El dominio N solo no se unirá a TfR cuando se cargue con hierro, y el hierro unido al dominio C se unirá a TfR pero no con la misma afinidad

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que la molécula completa.

Alternativamente, la porción de la transferrina de la proteína de fusión exendina-4/Tf puede incluir una transferrina mutante recombinante que tenga una mutación en la que el mutante no retenga la capacidad de unirse a iones metálicos. En una forma de realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/Tf incluye una transferrina mutante recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una afinidad de unión más débil por los iones metálicos que la transferrina natural de suero. En una forma de realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/Tf incluye una transferrina mutante recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una afinidad de unión más fuerte por los iones metálicos que la transferrina natural de suero.

En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/Tf incluye una transferrina mutante recombinante que tiene una mutación en la que el mutante no retiene la capacidad de unirse al receptor de la transferrina. Por ejemplo, la exendina-4 y las proteínas de fusión de Tf de la invención pueden unirse al receptor de GLP-1 superficial celular pero no al receptor de Tf. Dichas proteínas de fusión pueden ser terapéuticamente activas en la superficie celular, es decir, sin penetrar en la célula.

Alternativamente, la porción de la transferrina de la proteína de fusión exendina-4/Tf puede incluir: una transferrina mutante recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una afinidad de unión más débil por el receptor de la transferrina que la transferrina natural de suero; una transferrina mutante recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una afinidad de unión más fuerte por el receptor de la transferrina que la transferrina natural de suero; una transferrina mutante recombinante que tiene una mutación en la que el mutante no retiene la capacidad de unirse a iones carbonato; una transferrina mutante recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una mutación en la que el mutante tiene una afinidad de unión más fuerte por los iones carbonato que la transferrina natural de suero.

En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/Tf incluye una transferrina recombinante de suero humano que tiene una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426, Tyr514, Tyr517 e His585 de la SEC ID Nº: 3, en la que el mutante retiene la capacidad de unirse a iones metálicos. En una forma de realización alternativa, una transferrina mutante recombinante de suero humano tiene una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426, Tyr514, Tyr517 e His585 de la SEC ID Nº: 3, en la que el mutante tiene una reducida capacidad de unirse a iones metálicos. En otra forma de realización, una transferrina mutante recombinante de suero humano tiene una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo constituido por Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426, Tyr517 e His585 de la SEC ID Nº: 3, en la que el mutante no retiene la capacidad de unirse a iones metálicos.

En otra forma de realización, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/Tf incluye una transferrina mutante recombinante de suero humano que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la SEC ID Nº: 3, en la que el mutante tiene una afinidad de unión más fuerte por los iones metálicos que la transferrina natural de suero humano (véase la Patente de los Estados Unidos Nº 5.986.067). En una forma de realización alternativa, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/Tf incluye una transferrina mutante recombinante de suero humano que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la SEC ID Nº: 3, en la que el mutante tiene una afinidad de unión más débil por los iones metálicos que la transferrina natural de suero humano. En una forma de realización adicional, la porción de transferrina de la proteína de fusión exendina-4/Tf incluye una transferrina mutante recombinante de suero humano que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la SEC ID Nº: 3, en la que el mutante no se une a iones metálicos.

Se puede usar cualquier técnica disponible para producir las proteínas de fusión de exendina-4/Tf de la invención, incluyendo, pero sin limitarse a técnicas moleculares comúnmente disponibles, por ejemplo, las descritas en Sambrok y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Cuando se llevan a cabo sustituciones de nucleótidos usando las técnicas para llevar a cabo la mutagénesis específica de sitio que son bien conocidas en la técnica, los cambios en los aminoácidos codificados son preferiblemente de una naturaleza menor, es decir, sustituciones conservativas de aminoácidos, aunque se contemplan también otras sustituciones no conservativas, particularmente cuando producen una porción de transferrina modificada de una proteína de fusión de Tf, por ejemplo, una proteína de Tf modificada que presenta glucosilación reducida, unión al hierro reducida, y similares. Se contemplan específicamente sustituciones de aminoácidos, pequeñas deleciones o inserciones, normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos, inserciones entre dominios de la transferrina, pequeñas extensiones amino o carboxilo terminales, tales como de un resto de metionina amino terminal, o pequeños péptidos enlazantes de menos de 50, 40, 30, 20 o 10 0 restos entre dominios de transferrina o de unión a una proteína de la transferrina y a una exendina-4 o una pequeña extensión que facilita la purificación, tal como un tramo de polihistidina o un epítopo antigénico o un dominio de la unión.

Son ejemplos de sustituciones conservativas de aminoácidos sustituciones hechas en el mismo grupo tales como en el 9

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grupo de aminoácidos básicos (tales como arginina, lisina, histidina), aminoácidos ácidos (tales como ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (tales como glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (tales como leucina, isoleucina, valina), aminoácidos aromáticos (tales como fenilalanina, triptófano, tirosina) y aminoácidos pequeños (tales como glicina, alanina, serina, treonina, metionina).

Las sustituciones no conservativas abarcan sustituciones de aminoácidos de un grupo por aminoácidos de otro grupo. Por ejemplo, una sustitución no conservativa incluiría la sustitución de un aminoácido hidrófobo por un aminoácido polar. Para una descripción general de la sustitución de nucleótidos, véase por ejemplo, Ford y col., Prot. Exp. Pur. 2: 95-107, 1991. Las sustituciones, deleciones e inserciones no conservativas son particularmente útiles para producir proteínas de fusión de Tf de la invención que presentan ninguna o reducida unión al hierro, ninguna o reducida unión de la proteína de fusión al receptor de Tf y/o ninguna o reducida glucosilación.

La unión al hierro y/o la unión al receptor puede estar reducida o perturbada mediante mutación, incluyendo deleción, sustitución o inserción en, los restos de aminoácidos que corresponden a uno o más restos Asp63, Tyr95, Tyr188, His249del dominio N de Tf y/o los restos Asp 392, Tyr 426, Tyr 514 y/o His 585 de La SEC ID Nº: 3 del dominio C. La unión al hierro puede estar también afectada mediante una mutación en los aminoácidos Lys206, His207 o Arg632 de la SEC ID Nº: 3. La unión al carbonato puede estar reducida o perturbada mediante mutación, incluyendo deleción, sustitución o inserción en, los restos de aminoácidos que corresponden a uno o más de los restos Thr120, Arg124, Ala126, Gly 127 del dominio N de Tf y los restos Thr 452, Arg 456, Ala 458 y/o Gly 459 de la SEC ID Nº: 3 del dominio C Una reducción o perturbación de la unión al carbonato puede afectar adversamente la unión al hierro y/o al receptor.

La unión al receptor de Tf puede estar reducida o perturbada mediante una mutación, incluyendo deleción, sustitución o inserción en, los restos de aminoácidos que corresponden a uno o más de los restos del dominio N de Tf descritos anteriormente para la unión al hierro.

Tal como se ha discutido anteriormente, la glucosilación puede reducirse o evitarse mediante mutación, incluyendo deleción, sustitución o inserción en, los restos de aminoácidos que corresponden a uno o más de los restos del dominio C de Tf alrededor de los sitios N-X-S/T que corresponden a los restos N413 y/o N611 del dominio C (véase la Patente de los Estados Unidos Nº 5.986.067). Por ejemplo, N413 y/o N611 pueden estar mutados con restos de Glu.

En los casos en los que las proteínas de fusión de Tf no están modificadas para evitar la glucosilación, la unión al hierro, la unión al carbonato y/o la unión al receptor, la glucosilación, los iones de hierro y/o carbonato pueden estar despojados de o eliminados mediante escisión de la proteína de fusión. Por ejemplo, se pueden usar deglicosilasas disponibles para escindir los restos de la glucosilación procedentes de la proteína de fusión, en particular se pueden usar restos de azúcares unidos a la porción de Tf, enzimas de levaduras deficientes en la glucosilación, para evitar la glucosilación y/o se pueden hacer crecer células recombinantes en presencia de un agente que evite la glucosilación, por ejemplo, tunicamicina.

Los carbohidratos de la proteína de fusión pueden también reducirse o eliminarse completamente por métodos enzimáticos tratando la proteína de fusión con deglicosilasas. Se conocen bien en la técnica las deglicosilasas. Los ejemplos de deglicosilasas incluyen, pero no se limitan a galactosidasa, PNGasa A, PNGasa F, glucosidasa, mannosidasa, fucosidasa, y Endo H deglicosilasa.

Sin embargo, en algunas circunstancias, puede ser preferible la administración oral para que la porción Tf de la proteína de fusión pueda glucosilarse completamente.

Se pueden realizar mutaciones adicionales con Tf para alterar la estructura tridimensional de Tf, tales como modificaciones en la región bisagra para evitar el cambio conformacional necesario para el reconocimiento de la unión al hierro y al receptor de Tf. Por ejemplo, se pueden realizar mutaciones en o alrededor de los restos de aminoácidos 94-96, 245-247 y/o 316-318 del dominio N así como de los restos de aminoácidos 425-427, 581-582 y/o 652-658 del dominio C. Adicionalmente, se pueden realizar mutaciones en o alrededor de las regiones que flanquean estos sitios para alterar la estructura y la función de Tf.

La proteína de fusión exendina-4/Tf puede funcionar como proteína portadora para extender también la semivida o la biodisponibilidad de la proteína terapéutica, en algunos ejemplos, la administración de la proteína terapéutica en el interior de una célula y/o a través de la barrera hematoencefálica (BHE). En una forma de realización alternativa, la proteína de fusión incluye una molécula de transferrina modificada en la que la transferrina no retiene la capacidad de cruzar la BHE.

En otra forma de realización, la proteína de fusión exendina-4/Tf incluye una molécula de transferrina modificada en la que la molécula de transferrina retiene la capacidad de unirse al receptor de la transferrina y transportar el péptido terapéutico al interior de las células En una forma de realización alternativa, la proteína de fusión exendina-4/Tf incluye una molécula de transferrina modificada en la que la molécula de transferrina no retiene la capacidad de unirse al

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receptor de la transferrina y transportar el péptido terapéutico al interior de las células.

En formas de realización adicionales la proteína de fusión exendina-4/Tf incluye una molécula de transferrina modificada en la que la molécula de transferrina retiene la capacidad de unirse al receptor de la transferrina y transportar el péptido terapéutico al interior de las células y retiene la capacidad de cruzar la BHE. En una forma de realización alternativa la proteína de fusión exendina-4/Tf incluye una molécula de transferrina modificada en la que la molécula de transferrina retiene la capacidad de cruzar la BHE, pero no retiene la capacidad de unirse al receptor de la transferrina y transportar el péptido terapéutico al interior de las células.

Las proteínas de fusión modificadas de la presente invención pueden estar compuestas por aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados y pueden contener aminoácidos diferentes de los de los 20 aminoácidos codificados por genes. Los polipéptidos pueden estar modificados tanto mediante procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional, como mediante técnicas de modificación química, que se conocen bien en la técnica. Dichas modificaciones se describen también en textos básicos y en monografías más detalladas, también en una voluminosa bibliografía de investigación.

Pueden producirse modificaciones en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo en la estructura peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxi. Se apreciará que pueden estar presentes el mismo tipo de modificaciones en grados igual o variable en diversos sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ser ramificados, por ejemplo, como resultado de ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados, y cíclicos ramificados puede ser el resultado de procesos naturales después de la traducción o se pueden preparar mediante procedimientos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlace disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, glucosilación, formación de un anclaje GPI, hidroxilación, yodación metilación, miristilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia tal como arginilación, y ubiquitinación (Véanse, por ejemplo, Proteins - Structure and Molecular Properties, 2ª Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York, 1993; Post-translational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, págs. 1-12, 1983; y Seifter y col. Meth. Enzymol. 182:626-646, 1990).

Moléculas de ácido nucleico que codifican exendina-4/Tf.

La presente invención proporciona también moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión exendina-4/mTf. Una molécula de ácido nucleico preferido codifica la SEC ID Nº: 23, que es la secuencia de aminoácidos de exendina-4 (1-39), unida por (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) a una mTf. Se muestra como SEC ID Nº: 24 una secuencia de ácido nucleico a modo de ejemplo. Lo más preferible, la secuencia de ácido nucleico de la presente invención codifica la SEC ID Nº: 25, que es la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión exendin-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf más 19 aminoácidos N terminales que representan la señal de secreción de la transferrina humana o la secuencia líder. Una secuencia de ácido nucleico a modo de ejemplo que codifica SEC ID Nº: 25 se muestra como SEC ID Nº: 26.

Las secuencias que codifican una proteína de fusión exendina-4/mTf pueden incluir también un codón de detención (por ejemplo, tga, taa, tag) en el extremo C terminal, y se pueden obtener fácilmente por una variedad de maneras que incluyen, sin limitación, síntesis química, mutación genética y secuencias de polinucleótido de exendina-4 y transferrina naturales obtenidas del cribado del ADNc o de una genoteca, el cribado de una biblioteca de expresión, y/o la amplificación del ADNc mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se pueden producir moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión exendina-4/mTf usando la mutagénesis sitiodirigida, la amplificación mediante la PCR, u otros procedimientos apropiados, en el que el(los) cebador(es) tiene(n) las mutaciones puntuales deseadas. Los procedimientos de ADN recombinante y los procedimientos de mutagénesis descritos en el presente documento son generalmente los que se muestran en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, and Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., Green Publishers Inc. y Wiley and Sons, 1994.

Se puede identificar el ácido nucleico de los polinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión exendina-4/mTf mediante clonación de la expresión que emplea la detección de clones positivos basándose en una propiedad de la proteína expresada. Normalmente, se criban bibliotecas de ácido nucleico mediante la unión de un anticuerpo u de otro compañero de unión (por ejemplo, receptor o ligando). Normalmente, las bibliotecas de ácido nucleico se criban mediante la unión de un anticuerpo u otro compañero de unión (por ejemplo, receptor o ligando) para clonarse a proteínas que se expresan y muestran sobre la superficie de la célula hospedadora. El anticuerpo o compañero de unión está modificado con una marca detectable para identificar aquellas células que expresan el clon

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deseado.

Pueden seguirse técnicas de expresión recombinante llevadas a cabo de acuerdo con las descripciones que se muestran a continuación para producir una proteína de fusión exendina-4/mTf que codifica polinucleótidos y expresa los polipéptidos codificados. Por ejemplo, insertando una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión exendina-4/mTf en un vector apropiado, un experto en la técnica puede producir fácilmente grandes cantidades de la secuencia de nucleótidos deseada Las secuencias que se pueden usar para generar sondas de detección o cebadores de amplificación. Alternativamente, se puede insertar un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión exendina-4/mTf en un vector de expresión. Introduciendo el vector de expresión en un huésped apropiado, la proteína de fusión exendina-4/mTf codificada puede producirse en grandes cantidades.

Otro procedimiento para obtener una secuencia adecuada de ácido nucleico es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) En este procedimiento, se prepara ADNc a partir de poli(A) + ARN total usando la enzima transcriptasa inversa, a continuación se añaden dos cebadores, normalmente complementarios, a dos regiones separadas del ADNc que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión exendina-4/mTf, al ADNc junto con una polimerasa, tal como la polimerasa Taq, y la polimerasa amplifica la region del ADNc entre los dos cebadores.

El fragmento de ADN que codifica el extremo amino del polipéptido puede tener un ATG, que codifica un resto metionina. Esta metionina puede estar o no estar presente en la forma madura de la proteína de fusión exendina-4/mTf dependiendo de si el polipéptido producido en la célula hospedadora está segregado para secretarse procedente de esta célula. Se puede usar también el codón que codifica la isoleucina como sitio de inicio. Se pueden usar también otros procedimientos conocidos por el técnico experto. En algunas formas de realización, codones que contienen variantes de ácido nucleico que se han alterado para la óptima expresión de una proteína de fusión exendina-4/mTf en una célula hospedadora dada. Las alteraciones concretas del codón dependerán de la proteína de fusión exendina4/mTf y de la célula hospedadora seleccionada para la expresión. Dicha optimización del codón se puede llevar a cabo por una variedad de procedimientos, por ejemplo, seleccionando codones que se prefieren para uso en los genes muy expresados en una célula hospedadora dada. Se pueden utilizar algoritmos informáticos que incorporan tablas de frecuencia de codones tales como “Eco_high.Cod” para la preferencia de codones de genes bacterianos muy expresados y la Universidad de Wisconsin proporciona el Paquete Versión 9.0 (Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Otras tablas de frecuencia de codones útiles incluyen "Celegans_high.cod," "Celegans_low.cod," "Drosophila_high.cod," "Human_high.cod," "Maize_high.cod," and "Yeast_high.cod."

Vectores

Una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión exendina-4/mTf se insertó en un vector de expresión apropiado usando técnicas de ligadura normalizadas. El vector se seleccionó normalmente por ser funcional en la célula hospedadora concreta empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula hospedadora de tal manera que se puede producir la amplificación del gen y/o la expresión del gen). Se puede amplificar/expresar una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión exendina-4/mTf en procariotas, levaduras, insectos (sistemas de baculovirus) y/o células hospedadoras eucariotas. Para una recapitulación de los vectores de expresión, véase Meth. Enz., vol. 185, D. V. Goeddel, Academic Press, 1990.

Normalmente, los vectores de expresión usados en cualquiera de las células hospedadoras contendrán secuencias para el mantenimiento de plásmidos y para la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos exógenos. Dichas secuencias, denominadas colectivamente como “secuencias flanqueantes” en algunas formas de realización, incluirán normalmente una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias potenciadoras, un origen de la replicación, una secuencia de terminación de la transcripción, una secuencia completa del intrón que contiene un sitio de corte y empalme donante y aceptor, una secuencia que codifica una secuencia líder para la secreción de polipéptido, un sitio de unión a ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región poliligante para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que se va a expresar, y un elemento marcador seleccionable. Se discuten a continuación cada una de estas secuencias.

Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia que codifica una “marca”, es decir, una molécula de oligonucleótido localizada en el extremo 5’ o 3’ de una secuencia que codifica una proteína exendina-4/Tf; la secuencia de oligonucleótido codifica polihis (tal como hexaHis), u otra “marca” tal como FLAG, HA (hemaglutinina del virus de la gripe), o myc para la cual existen anticuerpos comercialmente disponibles. Esta marca se fusiona normalmente al polipéptido tras la expresión del polipéptido, y puede servir como un medio para la purificación por afinidad de la proteína de fusión exendina-4/Tf procedente de la célula hospedadora. Se puede llevar a cabo la purificación por afinidad, por ejemplo, mediante cromatografía en columna usando anticuerpos contra la marca como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la marca puede eliminarse posteriormente de la proteína de fusión exendina-4/Tf por diversos medios tales como usando algunas peptidasas para la escisión, por ejemplo, digestión con enterocinasa 3’ de una

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secuencia con marca FLAG que está en la dirección 5’ de una de las secuencias de aminoácidos.

Las secuencias flanqueantes pueden ser homólogas (es decir, procedentes de la misma especie y/o cepa de la célula huésped), heterólogas (es decir, procedentes de une especie diferente que la de la especie o cepa huésped), hibridas (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes procedentes de más de una fuente) o sintéticas, o las secuencias flanqueantes pueden ser secuencias naturales que funcionan normalmente para regular la expresión de exendina-4 La fuente de una secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo procariota o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, con la condición de que la secuencia flanqueante sea funcional en, y pueda activarse mediante, la maquinaria de la célula hospedadora.

Se pueden obtener secuencias flanqueantes útiles mediante cualquiera de diversos procedimientos conocidos en la técnica. Normalmente, las secuencias flanqueantes útiles en el presente documento habrán de identificarse previamente mediante cartografiado y/o mediante digestión con endonucleasa de restricción y pueden aislarse de esta manera de la fuente apropiada de tejido usando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, se puede conocer la secuencia completa del nucleótido de una secuencia flanqueante Aquí, se puede sintetizar la secuencia flanqueante usando los procedimientos descritos en el presente documento para la síntesis de ácido nucleico o la clonación.

Cuando se conoce toda o solo una parte de la secuencia flanqueante, se puede obtener ésta usando la PCR y/o cribando una genoteca con un oligonucleótido y/o fragmento de secuencia flanqueante adecuado procedente de la misma u otra especie. Cuando no se conoce la secuencia flanqueante, se puede aislar un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante a partir de una parte más grande de este ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia de codificación o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede llevarse a cabo mediante digestión con una endonucleasa de restricción para producir el fragmento de ADN apropiado seguido por aislamiento usando purificación en gel de agarosa cromatografía en columna de Qiagen® (Qiagen, Chatsworth, CA), u otros procedimientos que el experto en la técnica conoce. La selección de enzimas adecuadas para llevar a cabo este objetivo será fácilmente evidente para una persona experta en la técnica.

Un origen de la replicación es normalmente una parte de aquellos vectores de expresión procariotas adquiridos comercialmente, y el origen ayuda en la amplificación del vector en una célula hospedadora. La amplificación del vector hasta un cierto número de copias puede, en algunos casos, ser importante para la óptima expresión de una proteína de fusión exendina-4/Tf. Si el vector de elección no contiene un origen del sitio de replicación, se puede sintetizar químicamente basándose en una secuencia conocida, y ligarse en el vector. Por ejemplo, el origen de la replicación procedente del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayor parte de bacterias gram negativas y diversos orígenes (por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus de la estomatitis vesicular (VSV), o papilomavirus tales como VPH o VPB) son útiles para los vectores de clonación en células de mamíferos. Generalmente, no se necesita el origen del componente de la replicación para los vectores de expresión de mamíferos (por ejemplo, el origen de SV40 se usa a menudo solo debido a que contiene el promotor temprano).

Una secuencia de terminación de la transcripción se localiza normalmente en 3’ del extremo de una región que codifica un polipéptido y sirve para terminar la transcripción Normalmente una secuencia de terminación de la transcripción en células procariotas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia poli-T. Aunque la secuencia se clona fácilmente de una biblioteca o incluso se adquiere comercialmente como parte de un vector, se puede sintetizar fácilmente usando procedimientos para la síntesis de ácidos nucleicos tal como la descrita en el presente documento.

Un elemento génico marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula hospedadora en crecimiento en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, o kanamicina para células hospedadoras procariotas, (b) deficiencias auxotróficas del complemente de la célula o (c) suministro de nutrientes críticos no disponibles de medios complejos Los marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a la kanamicina el gen de resistencia a la ampicilina, y el gen de resistencia a la tetraciclina. Se puede usar también un gen de resistencia a la neomicina para la selección en células hospedadoras procariotas y eucariotas.

Se puede usar otros genes de selección para amplificar el gen que se va a expresar. La amplificación es el procedimiento en el que los genes que tienen mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento se reiteran en tándem en el interior de los cromosomas de sucesivas generaciones de células recombinantes. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para las células de mamíferos incluyen la dihidrofolato reductasa (DHFR) y la timidina cinasa. Las células mamíferos transformantes se colocan bajo presión de selección en la que únicamente los transformantes se adaptan a sobrevivir en virtud del gen de selección presente en el vector. Se impone la presión de selección cultivando las células transformadas en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio cambia sucesivamente, conduciendo por tanto a la amplificación del gen de selección y del ADN que codifica una proteína de fusión exendina-4/mTf. Como resultado, se sintetizan

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cantidades crecientes de una proteína de fusión exendina-4/mTf a partir del ADN amplificado.

Se necesita normalmente un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción del ARNm y está caracterizado por una secuencia Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia Kozak (eucariotas). El elemento se localiza típicamente en 3’ del promotor y en 5’ de la secuencia de codificación de la proteína de fusión exendina-4/mTf que se va a expresar. La secuencia Shine-Dalgarno es variada, pero normalmente es una polipurina (es decir, tiene un elevado contenido e A-G). Se ha identificado muchas secuencias Shine-Dalgarno, cada una de las cuales se puede sintetizar fácilmente usando los procedimientos que se muestran en el presente documento y usados en un vector procariota.

Los términos “secuencia señal secretora” o “secuencia señal” o “secuencia líder de la secreción” se usan de manera indistinta y se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos 6.291.212 y 5.547.871. Las secuencias señal secretoras o secuencias señal o secuencias líderes de la secreción codifican péptidos secretores. Un péptido secretor es una secuencia de aminoácidos que actúa para dirigir la secreción de un polipéptido o proteína madura procedente de una célula. Los péptidos secretores se caracterizan generalmente por un núcleo de aminoácidos hidrófobos y se encuentran normalmente (pero no de manera exclusiva) en los términos amino de las proteínas sintetizadas recientemente. Muy a menudo, el péptido secretor se escinde de la proteína madura durante la secreción. Los péptidos secretores pueden contener sitios de procesamiento que permiten la escisión del péptido señal de la proteína madura a medida que éste pasa a través de la ruta secretora Los sitios de procesamiento pueden estar codificados en el interior del péptido señal o se pueden añadir al péptido señal mediante, por ejemplo, mutagénesis in vitro.

Se pueden usar péptidos secretores para dirigir la secreción de las proteínas de fusión de la invención. Uno de dichos péptidos secretores que se puede usar en combinación con otros péptidos secretores es la secuencia líder del factor de acoplamiento alfa. Se requieren secuencias señal secretoras o secuencias señal o secuencias líderes de la secreción para una compleja serie de etapas de procesamiento después de la traducción que dan como resultado la secreción de una proteína. Si está presente una secuencia señal intacta, la proteína que se está expresando penetra en la luz del retículo endoplásmico rugoso y a continuación se transporta a través del aparato de Golgi a las vesículas secretoras y finalmente se transporta fuera de la célula. Generalmente, la secuencia señal sigue inmediatamente al codón de inicio y codifica un péptido señal en el extremo amino terminal de la proteína que se va a secretar. En la mayor parte de los casos, la secuencia señal se elimina mediante escisión por una proteasa específica, denominada una peptidasa señal Las secuencias señal preferidas mejoran el procesamiento y la eficacia de exportación de la expresión de la proteína recombinante usando vectores de expresión víricos, de mamíferos o de levaduras.

En una forma de realización, se puede usar la secuencia señal de Tf natural para expresar y secretar proteínas de fusión de la presente invención. Debido a que existen moléculas de transferrina en diversos tipos de secreciones, tales como sangre, lágrimas, y leche, existen muchos péptidos señal de transferrina diferentes. Por ejemplo, el péptido señal de transferrina podría ser de transferrina de suero, lactotransferrina, o melanotransferrina. El péptido señal de transferrina natural podría ser también de diversas especies tales como insectos, mamíferos, peces, ranas, patos, pollos, u otras especies. Preferiblemente, el péptido señal es de una molécula de transferrina de mamífero. Más preferiblemente, el péptido señal es de transferrina de suero humano. W la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nº 2006/0205037 se describen las secuencias del péptido señal de diversas moléculas de transferrina de mamífero.

Preferiblemente, la secuencia señal derivada de la transferrina se puede usar para secretar una proteína heteróloga, por ejemplo, cualquier proteína de interés que sea heteróloga para la secuencia señal de Tf que se pueda expresar u secretar usando una señal de Tf. E particular, se puede usar una secuencia señal de Tf para secretar proteínas a partir de levaduras recombinantes. Preferiblemente, el péptido señal es de trasferrina de suero humano (SEC ID Nº: 18; codificada por SEC ID Nº: 19). Otros péptidos señal preferidos incluyen HSA/MFa-1 (SEC ID Nº: 40; codificada por SEC ID Nº: 41), y HSA/MFa-1 modificada (SEC ID Nº: 42; codificada por SEC ID Nº: 43).

Con el fin de asegurar una eficaz eliminación de la secuencia señal, puede ser preferible en algunos casos incluir una corta secuencia propeptídica entre la secuencia señal y la proteína madura en la que la porción c terminal del propéptido comprende un sitio de reconocimiento de una proteasa, tal como la proteasa kex2p de levadura. Preferiblemente, la secuencia propeptídica es aproximadamente de 2-12 aminoácidos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 4-8 aminoácidos de longitud. Los ejemplos de dichos propéptidos son Arg-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg (SEC ID Nº: 113), Arg-Ser-Leu-Asp-Arg-Arg (SEC ID Nº: 114), Arg-Ser-Leu-Glu-Lys-Arg (SEC ID Nº: 115), y Arg-Ser-Leu-Glu-Arg-Arg (SEC ID Nº: 116).

Los vectores de expresión y de clonación contendrán normalmente un promotor que sea reconocido por el organismo huésped y unido de manera operable a la molécula que codifica la proteína de fusión exendina-4/mTf. Los promotores son secuencias no transcritas localizadas en la dirección 5’ (es decir, 5’) del codón de inicio de un gen estructural (comprendiendo en general aproximadamente 100 a 1000 pb) que controla la transcripción del gen estructural. Los

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promotores se agrupan convencionalmente en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles crecientes de la transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Los promotores constitutivos, por otra parte, inician la producción continua del producto génico; esto es, existe poco o ningún control sobre la expresión génica. Se conocen bien un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de células hospedadoras potenciales. Un promotor adecuado se une de manera operable al ADN que codifica una proteína de fusión exendina-4/mTf eliminando el promotor de la fuente de ADN mediante digestión con enzima de restricción e insertando la secuencia promotora deseada en el vector. Se puede usar la secuencia promotora natural de exendina 4 o transferrina para dirigir la amplificación y/o la expresión de una molécula de ácido nucleico de la proteína de fusión exendina-4/mTf. Sin embargo, se prefiere un promotor heterólogo, si este permite una transcripción mayor y unos rendimientos más elevados de la proteína expresada en comparación con el promotor natural, y si éste es compatible con el sistema de la célula hospedadora que se ha seleccionado para el uso.

Se conocen bien en la técnica los promotores adecuados para el uso con levaduras hospedadoras y se discuten adicionalmente a continuación. Se usan ventajosamente potenciadores de levaduras con promotores de levaduras. Se conocen bien los promotores adecuados para el uso con células hospedadoras de mamíferos e incluyen, pero no se limitan a los obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, los adenovirus (tales como Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, los retrovirus, el virus de la hepatitis B, y lo más preferible, el Virus 40 de Simios (SV40). Otros promotores de mamíferos adecuados incluyen promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, los promotores del choque térmico y el promotor de la actina.

Los promotores adecuados para el uso con hospedadoras procariotas incluyen los sistemas promotores de la betalactamasa y la lactosa; la ARN polimerasa inducible de E. coli T7; a alcalino fosfatasa; un sistema promotor de triptófano (trp); y promotores híbridos tales como el promotor tac. Son también adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Se han publicado sus secuencias, permitiendo por tanto que un experto en la técnica las una a la secuencia de ADN deseado, usando enlazantes o adaptadores según sea necesario para suministrar cualquier sitio de restricción útil.

Los promotores adicionales que pueden ser de interés en el control de la expresión de una proteína de fusión exendina-4/mTf incluyen, pero no se limitan a: la región promotora temprana de SV40 (Bemoist y Chambon, Nature

290: 304-10, 1981); el promotor del CMV, el promotor contenido en el extremo 3’ de la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto y col, Cell 22: 787- 97, 1980); el promotor de la timidina cinasa del herpes (Wagner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-45, 1981); las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster y col., Nature 296: 39-42, 1982); los vectores de expresión procariotas tales como el promotor de la beta-lactamasa (Villa-Kamaroff y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727-31, 1978); o el promotor tac (DeBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-25, 1983).

Se puede insertar una secuencia potenciadora en el vector, para aumentar la transcripción en eucariotas superiores de un ADN que codifica una proteína de fusión exendina-4/mTf. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, usualmente de aproximadamente 10 – 300 pb de longitud, que actúan sobre el promotor para aumentar la transcripción. Los potenciadores tienen orientación y posición relativamente independientes. Se han encontrado en las direcciones 5’ y 3’ de la unidad de transcripción. Se conocen algunas secuencias potenciadoras disponibles de genes de mamíferos (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína, e insulina). Normalmente, sin embargo, se usará un potenciador procedente de un virus. El potenciador de SV40, el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma, y los potenciadores de adenovirus son elementos potenciadores a modo de ejemplo para la activación de promotores eucariotas. Aunque se puede cortar y empalmar un potenciador en el vector en la posición 5’ o 3’ de una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión exendina-4/mTf, se localiza normalmente en el sitio 5’ del promotor.

Se pueden construir vectores de expresión a partir de un vector de partida tal como un vector comercialmente disponible Dichos vectores pueden o no contener todas las secuencias flanqueantes deseadas. Cuando una o más de las secuencias flanqueantes descritas en el presente documento no están ya presentes en el vector, se pueden obtener individualmente y ligarse en el vector. Un experto en la técnica conoce bien los procedimientos usados para obtener cada una de las secuencias flanqueantes.

Se describen vectores de levaduras adecuados para el uso en la presente invención, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Nº 6.291.212, e incluyen YRp7 (Struhl y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039, 1978), YEp13 (Broach y col., Gene 8: 121-133, 1979), pJDB249 y pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104-108, 1978), pPPC0005, pSeCHSA, pScNHSA, pC4 y sus derivados. Los vectores plásmidos de levaduras útiles incluyen pRS403-406, pRS413-416 y los vectores de Pichia disponibles de Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA). Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos que se Integran en Levaduras (YIp) e incorporan los marcadores

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seleccionables de levaduras HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413∼41.6 son plásmidos de Centrómeros de Levaduras (YCp).

Dichos vectores incluirán generalmente un marcador seleccionable, que puede ser uno de cualquier número de genes que presente un fenotipo dominante, para el cual exista un ensayo fenotípico que permita seleccionar a los transformantes. Los marcadores seleccionables preferidos son aquellos que complementa la auxotrofia de la célula hospedadora, proporcionan resistencia a antibióticos o permiten a una célula utilizar fuentes de carbono específicas, e incluyen LEU2 (Broach y col. más arriba), URA3 (Botstein y co., Gene 8: 17, 1979), HIS3 (Struhl y col., más arriba) o POT1 (Kawasaki y Bell, Patente Europea Nº EP 171,142). Otros marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen CAT, que confiere resistencia al cloranfenicol en células de levaduras. Los promotores preferidos para uso en levaduras incluyen promotores de genes glucolíticos de levaduras (Hitzeman y col., J Biol. Chem. 225: 12073-12080, 1980; Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982; Kawasaki, Patente de los Estados Unidos Nº 4.599.311)

o los genes de la alcohol deshidrogenasa (Young y col., en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender y col., p. 355, Plenum, N.Y., 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101: 192-201, 1983). A este respecto, los promotores particularmente preferidos son el promotor TPI1 (Kawasaki, Patente de los Estados Unidos Nº 4.599.311) y el ADH2-4c (véase el promotor de la Patente de los Estados Unidos Nº 6.291.212 (Russell y col., Nature 304: 652-654, 1983). Las unidades de expresión pueden incluir también un terminador de la transcripción. Un terminador de la transcripción preferido es el terminador es el terminador TPI1 (Alber y Kawasaki, más arriba) Se dan a conocer otros vectores preferidos y componentes preferidos tales como promotores y terminadores de un sistema de expresión de levadura en las Patentes Europeas Nos EP 0258067, EP 0286424, EP0317254, EP 0387319, EP 0386222, EP 0424117, EP 0431880, EP 1002095EP, EP 0828759, EP 0764209, EP 0749478, y EP 0889949; las Publicaciones PCT. Nos WO 00/44772 y WO 94/04687; y las Patentes de los Estados Unidos Nos 5.739.007, 5.637.504, 5.302.697, 5.260.202, 5.667.986, 5.728.553, 5.783.423, 5.965.386, 6.150.133, 6.379.924, y 5.714.377.

Adicionalmente a las levaduras, las proteínas de fusión de la presente invención pueden expresarse en hongos filamentosos, por ejemplo, cepas de los hongos Aspergillus. Los ejemplos de promotores útiles incluyen los derivados de los genes glucolíticos de Aspergillus nidulans, tales como el promotor adh3 (McKnight y col., EMBO J. 4: 2093-2099, 1985) y el promotor tpiA. Un ejemplo de un terminador adecuado es el terminador adh3 (McKnight y col., supra). Las unidades de expresión que utilizan dichos componentes ser pueden clonar en vectores que son, por ejemplo, capaces de inserción en el ADN cromosómico de Aspergillus.

Otros vectores son aquellos que son biocompatibles con células hospedadoras bacterianas, de insectos, y de mamíferos Dichos vectores incluyen, entre otros, pCRII, pCR3, y pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pBSII (Stratagene), pET15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSR-alfa (Publicación de Solicitud PCT Nº WO 90/14363) y pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, NY).

Los vectores adicionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, cósmidos, plásmidos, o virus modificados, pero se apreciará que la sistema de vectores debe ser compatible con la célula hospedadora seleccionada. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos tales como derivados del plásmido Bluescript® (un fagémido basado en ColE1 de un elevado número de copias, Stratagene), plásmidos de clonación mediante la PCR para clonar los productos de la PCR amplificados mediante Taq (por ejemplo, TOPO® TA Cloning® Kit, derivados del plásmido PCR2.1®, Invitrogen), y vectores de mamíferos, levaduras o virus tales como un sistema de expresión de baculovirus (derivados del plásmido pBacPAK, Clontech).

Contenida también en los vectores de expresión se localiza una señal de poliadenilación en la dirección 3’ de la secuencia de codificación de interés Las señales de poliadenilación incluyen las señales de poliadenilación temprana o tardía de SV40 (Kaufman y Sharp, más arriba), la señal de poliadenilación procedente de la región 5 E1 B de adenovirus, y el terminador del gen de la hormona del crecimiento humano (DeNoto y col., Nucl. Acid Res. 9: 37193730, 1981). Una señal de poliadenilación particularmente preferida es el terminador del gen VH (véase la Patente de los Estados Unidos Nº 6.291.212). Los vectores de expresión pueden incluir una secuencia líder vírica no codificante, tal como el líder tripartido de adenovirus 2, localizado entre el promotor y los sitios de corte y empalme del ARN. Los vectores preferidos pueden incluir también secuencias potenciadoras, tales como el potenciador de SV40 y el potenciador de ratón: (véase la Patente de los Estados Unidos Nº 6.291.212) (Gillies, Cell 33: 717-728, 1983). Los vectores de expresión pueden incluir también secuencias que codifican los ARN del adenovirus VA.

Una vez que se ha construido el vector y se ha insertado una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión exendina-4/mTf en el sitio apropiado del vector, se puede insertar el vector completo en una célula hospedadora adecuada para la amplificación y/o la expresión del polipéptido. Se puede llevar a cabo la transformación de un vector de expresión para una proteína de fusión exendina-4/mTf en una célula hospedadora seleccionada mediante procedimientos bien conocidos que incluyen procedimientos tales como transfección, infección, electroporación, microinyección, lipofección, procedimiento con DEAE-dextrano, u otras técnicas conocidas. El procedimiento

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seleccionado será en parte función del tipo de célula hospedadora que se va a usar. El experto en la técnica conoce bien estos procedimientos y otros procedimientos adecuados, y se muestran a continuación en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Se pueden introducir las secuencias de ADN clonado en células cultivadas de mamíferos mediante, por ejemplo, transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler y col., Cell 14: 725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham y Van der Eb, Virology 52: 456, 1973.). Se pueden usar también otras técnicas para introducir secuencias de ADN clonado en células de mamíferos, tales como electroporación (Neumann y col., EMBO J. 1: 841-845, 1982) o lipofección. Con el fin de identificar las células que han integrado el ADN clonado, se introduce generalmente un marcador seleccionable en las células junto con el gen o el ADNc de interés: Los marcadores seleccionables preferidos para uso en células de mamíferos cultivadas incluyen genes que confieren resistencia a fármacos, tales como neomicina, higromicina, y metotrexato. El marcador seleccionable puede ser un marcador seleccionable amplificable. Un marcador seleccionable amplificable preferido es el gen DHFR. Un marcador amplificable particularmente preferido es el ADNc de DHFRr (véase la Patente de los Estados Unidos Nº 6.291.212) (Simonsen y Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495-2499, 1983). Thilly revisó los marcadores seleccionables (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA) y la elección de los marcadores seleccionables está bien comprendida en el nivel de conocimiento del técnico normalmente experto en la técnica.

Células huéspedes

La presente invención incluye también una célula, preferiblemente, una célula de levadura, transformada para expresar una proteína de fusión exendina-4/mTf de la invención. Adicionalmente a las células hospedadoras transformadas por sí mismas, la presente invención incluye también un cultivo de aquellas células, preferiblemente un cultivo monoclonal (clonalmente homogéneo), o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un medio nutriente. Si se secreta el polipéptido, el medio contendrá el polipéptido, con las células, o sin las células si se han separado mediante filtración o centrifugación.

Las células huéspedes particularmente útiles para producir las proteínas de fusión exendina-4/mTf de la invención son de la levadura Pichia pastoris metilotrófica (Steinlein y col., Protein Express. Purif. 6: 619-624, 1995). Se ha desarrollado P. pastoris para ser un sobresaliente huésped para la producción de proteína extrañas debido a que se aisló y clonó su promotor de la alcohol oxidasa; se informó su transformación en primer lugar en 1985. P. pastoris puede utilizar metanol como fuente de carbono en ausencia de glucosa. El sistema de expresión de P. pastoris puede usar el promotor de la alcohol oxidasa inducida por metanol (AOX1), que controla el gen que codifica la expresión de la alcohol oxidasa, la enzima que cataliza la primera etapa en el metabolismo del metanol. Se ha caracterizado e incorporado este promotor en una serie de vectores de expresión de P. pastoris, Debido a que las proteínas producidas en P. pastoris se pliegan normalmente y se secretan en el medio de manera correcta, la fermentación de P. pastoris genomanipulada proporciona una excelente alternativa para los sistemas de expresión de E. coli. Se han producido numerosas proteínas usando este sistema, incluyendo un fragmento de la toxina del tétanos, pertactina de Bordetella pertussis, albúmina de suero humano y lisozima.

Cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae son otro hospedador preferido. En una forma de realización preferida, se usa una célula de levadura, o más específicamente, una célula hospedadora de S. cerevisiae que contiene una deficiencia genética en un gen requerido para la glucosilación de proteínas unida a asparagina. Se pueden preparar células hospedadoras de S. cerevisiae que tienen dichos defectos usando técnicas normalizadas de mutación y selección, aunque se han modificado muchas cepas de levaduras disponibles para evitar o reducir la hipermannosilación. Ballou y col. (J. Biol. Chem. 255: 5986-5991, 1980) han descrito el aislamiento de mutantes de la biosíntesis de mannoproteínas que son defectivos en los genes que afectan la glucosilación unida a asparagina. Gentzsch y Tanner (Glycobiology 7: 481-486, 1997) han descrito una familia de al menos seis genes (PMT1-6) que codifican las enzimas responsables de la primera etapa en la O-glucosilación de las proteínas en levadura. Los mutantes defectivos en uno o más de estos genes muestran glucosilación unida a O reducida y/o especificidad alterada de O-glucosilación.

En una forma de realización, el huésped es una cepa de S. cerevisiae descrita en la publicación de la Solicitud de Patente PCT Nº WO 05/061718. Por ejemplo, el huésped puede contener un plásmido basado en pSAC35 que transporta una copia del gen PDI1 o cualquier otro gen de la chaperona en una cepa con la versión de PDI1 del huésped u otra chaperona inactivada, respectivamente. Dicha construcción confiere una estabilidad aumentada.

Para optimizar la producción de las proteínas heterólogas, se prefiere también que la cepa huésped transporte una mutación, tal como la mutación pep4 de S. cerevisiae (Jones, Genetics 85: 23-33, 1977), que da como resultado una reducida actividad proteolítica. Las células hospedadoras que contienen mutaciones en otras regiones que codifican proteasas son particularmente útiles para producir grandes cantidades de las proteínas de fusión exendina-4/mTf de la invención.

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que puede recogerse posteriormente del medio de cultivo (si la célula hospedadora la secreta en el medio) o directamente de la célula hospedadora que la produce (si ésta no se secreta). La selección de una célula hospedadora apropiada dependerá de diversos factores, tales como los niveles de expresión deseados, modificaciones del polipéptido que son deseables o necesarias para la actividad (tales como la glucosilación o la fosforilación) y la facilidad de plegarse en una molécula biológicamente activa.

Otras células hospedadoras pueden ser células hospedadoras procariotas (tales como E. coli) o células hospedadoras

eucariotas (tales como células de insectos o vertebrados). Se conocen en la técnica numerosas células hospedadoras

adecuadas y muchas están disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Va. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, células de mamíferos, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células CHO DHFR(-) (Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 4216-20, 1980), células 293 o 293T de riñón embriónico humano (HEK), o células 3T3. Se conocen en la técnica la selección de células hospedadoras de mamíferos adecuadas y los procedimientos de transformación, cultivo, amplificación, cribado, producción del producto, y purificación. Otras líneas celulares de mamíferos adecuadas son las líneas celulares COS-1 y COS-7 de monos y la línea celular CV-1. Las células hospedadoras de mamíferos a modo de ejemplo adecuadas incluyen líneas celulares de primates y líneas celulares de roedores, que incluyen líneas celulares transformadas. Son también adecuadas las células diploides normales, las cepas de células derivadas de cultivos in vitro de tejido primario, así como explantes primarios. Las células candidatas pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección que actúa de manera dominante. Otras líneas celulares de mamíferos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células N2A de neuroblastoma de ratón, células HeLA, células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, líneas celulares BHK o HaK de hámster. Se conoce cada una de estas líneas celulares y están disponibles para los expertos en la técnica de la expresión de proteínas.

Similarmente útiles como células hospedadoras adecuadas son las células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, DH5a, DH10, y MC1061) son bien conocidas como células hospedadoras en el campo de la biotecnología. Se pueden emplear también diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp., otros Bacillus spp., y Streptomyces spp.

Adicionalmente, cuando se desee, se pueden utilizar sistemas de células de insectos para la expresión de una proteína de fusión exendina-4/mTf. Se describen dichos sistemas, por ejemplo, en Kitts y col., Biotechniques 14: 810-17, 1993; Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol. 4: 564-72, 1993; y Lucklow y col., J. Virol., 67: 4566-79, 1993. Las células de insectos preferidas son Sf-9 e Hi5 (Invitrogen).

Producción de la proteína de fusión exendina-4/mTf

Las células hospedadoras que contienen construcciones de ADN de la presente invención se hacen crecer en un medio de crecimiento apropiado. Tal como se usa en el presente documento, el término “medio de crecimiento apropiado” significa un medio que contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento de las células. Los nutrientes necesarios para el crecimiento celular pueden incluir una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales y factores de crecimiento, el medio de crecimiento se seleccionará generalmente para las células conteniendo la construcción de ADN, mediante, por ejemplo , la selección del fármaco o la deficiencia en un nutriente esencial que se complementa por el marcador seleccionable en la construcción de ADN o se transfecta simultáneamente con la construcción de ADN. Se hacen crecer células de levadura, por ejemplo, en un medio químicamente definido, que comprende una fuente de carbono, por ejemplo, sacarosa, una fuente de nitrógeno no de aminoácido, sales inorgánicas, vitaminas y suplementos de aminoácidos esenciales. El pH del medio se mantiene preferiblemente a un pH mayor de 2 y menor de 8, preferiblemente a pH 5,5-6,5. Los procedimientos para mantener un pH estable incluyen el tamponamiento y el control constante del pH. Los agentes tamponantes preferidos incluyen ácido succínico y Bis-Tris (Sigma Chemical Co., San. Luis, MO). Las células de levaduras que tienen un defecto en un gen necesario para la glucosilación unida a asparagina se hacen crecer preferiblemente en un medio que contiene un estabilizante osmótico. Un estabilizante osmótico preferido es sorbitol suplementado en el medio a una concentración entre 0,1 M y 1,5 M, preferiblemente a 0,5 M o 1,0 M.

Los medios adecuados para cultivar células de E. coli incluyen, por ejemplo, Caldo de Luria (LB) y/o Caldo Terrífico. Los medios adecuados para cultivar células eucariotas incluyen el medio 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640), el Medio Esencial Mínimo (MEM) y el medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), todos los cuales pueden estar suplementados con suero y/o factores de crecimiento según sean necesarios para la línea celular concreta que se está cultivando. Un medio adecuado para los cultivos de insectos es el medio de Grace suplementado con yeastolato, hidrolizado de lactoalbúmina, y/o suero de ternera fetal, según sea necesario.

Normalmente, se añade un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de células transfectadas o transformadas como un suplemento de los medios. El compuesto que se va a usar vendrá dictado por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el cual se va a transformar la célula hospedadora. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es de resistencia a la kanamicina, el compuesto añadido al medio de

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cultivo será kanamicina. Otros compuestos para el crecimiento selectivo incluyen ampicilina, tetraciclina, y neomicina.

Se pueden usar también sistemas de expresión de baculovirus/células de insectos para producir las proteínas de fusión de Tf modificadas de la invención. El sistema de expresión de Baculovirus BacPAK™ (BD Biosciences (Clontech)) expresa proteínas recombinantes a elevados niveles en células de insectos hospedadoras. El den diana se inserta en un vector de transferencia, que se transfecta simultáneamente en células hospedadoras de insectos con el ADN vírico de BacPAK6 linealizado Con el ADN de BacPAK6 desaparece una porción esencial del genoma de baculovirus Cuando el ADN se recombina con el vector, se restaura el elemento esencial y se transfiere el gen diana al genoma de baculovirus. El virus recombinante aislado recientemente puede a continuación amplificarse y usarse para infectar cultivos de células de insectos para producir grandes cantidades de la proteína deseada.

Las proteínas de fusión exendina-4/mTf de la presente invención pueden también producirse usando plantas transgénicas y animales. Por ejemplo, ovejas y cabras pueden tener la proteína terapéutica en su leche. O las plantas del tabaco pueden incluir la proteína en sus hojas Las plantas transgénicas y la producción animal de proteínas comprenden añadir un nuevo gen que codifica la proteína de fusión en el genoma del organismo. No solo puede el organismo transgénico producir una nueva proteína, sino que también transmite esta capacidad a su progenie.

La cantidad de una proteína de fusión exendina-4/mTf producida por una célula hospedadora puede evaluarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Dichos procedimientos incluyen, sin limitación, análisis de transferencia Western, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis en gel no desnaturalizante separación mediante Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC), inmunoprecipitación, y/o ensayos de actividad tales como los ensayos de desplazamientos del gel de unión del ADN.

Si se ha diseñado una proteína de fusión exendina-4/mTf para secretarse de la línea celular huésped, la mayoría del polipéptido se puede encontrar en el medio de cultivo celular. Si, sin embargo, el polipéptido no se ha secretado de las células hospedadoras, estará presente en el citoplasma y/o el núcleo (de células hospedadoras eucariotas) o en el citosol (de células hospedadoras de bacterias gram negativas).

Para una proteína de fusión exendina-4/mTf situada en el citoplasma de la célula hospedadora y/o el núcleo (de células hospedadoras eucariotas) o en el citosol (de células hospedadoras bacterianas), el material intracelular (que incluye cuerpos de inclusión de bacterias gram-negativas) puede extraerse de la célula hospedadora usando cualquier técnica normalizada conocida por el técnico experto. Por ejemplo, se pueden lisar las células hospedadoras para liberar los contenidos del periplasma/citoplasma mediante una prensa francesa, homogeneización, sonicación, seguido por centrifugación.

Si una proteína de fusión exendina-4/mTf ha formado cuerpos de inclusión en el citosol, los cuerpos de inclusión pueden a menudo unirse en el interior y/o el exterior de las membranas celulares y de esta manera se encontrarán principalmente en el material aglomerado tras la centrifugación. A continuación se puede tratar el material aglomerado a pH extremos o con un agente caótropo tal como un detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea, o derivados de urea en presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a pH alcalino o triscarboxietilfosfina a pH ácido para liberar, separar, y solubilizar los cuerpos de inclusión. A continuación se puede analizar la proteína de fusión exendina4/mTf usando electroforesis en gel, inmunoprecipitación, o similar. Si se desea aislar el polipéptido, se puede llevar a cabo el aislamiento usando procedimientos normalizados tales como los descritos en Marston y col., Meth. Enz. 182: 264-75, 1990.

Si no se han formado cuerpos de inclusión en un grado significativo tras la expresión de una proteína de fusión exendina-4/mTf, entonces, el polipéptido se encontrará principalmente en el sobrenadante tras la centrifugación del homogenado celular. El polipéptido se puede aislar adicionalmente del sobrenadante usando procedimientos tales como los descritos en el presente documento.

Se conocen en la técnica una serie de procedimientos adicionales para producir polipéptidos, y se pueden usar los procedimientos para producir una proteína de fusión exendina-4/mTf. Véase, por ejemplo, Roberts y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12297-303, 1997, que describe la producción de proteínas de fusión entre un ARNm y su péptido codificado. Véase también, Roberts, Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 268-73, 1999.

Los procedimientos para producir péptidos o polipéptidos se describen también en las Patentes de los Estados Unidos

Nos

5.763.192, 5.814.476, 5.723.323, y 5.817.483. Los procedimientos implican producir genes estocásticos o sus fragmentos, y a continuación introducir estos genes en células hospedadoras que producen una o más proteínas codificadas por los genes estocásticos. A continuación se criban las células hospedadoras para identificar aquellos clones que producen péptidos o polipéptidos que tienen la actividad deseada. Se dan a conocer en las Patentes de los Estados Unidos Nos 6.103.495, 6.210.925, 6.627.438, y 6.737.250 otros procedimientos para la expresión del péptido recombinante. El procedimiento utiliza E. coli y la ruta secretoria general de E. coli. El péptido se fusiona a una

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secuencia señal; de esta manera el péptido se dirige a la secreción

En la Publicación de Solicitud de Patente PCT Nº WO 99/15650 se describe otro procedimiento para producir péptidos

o polipéptidos.

El procedimiento publicado, denominado activación aleatoria de la expresión génica para el descubrimiento del gen, implica la activación de la expresión endógena del gen o la expresión en exceso de un gen mediante procedimientos de recombinación in situ. Por ejemplo, la expresión de un gen endógeno se activa o aumenta integrando una secuencia reguladora en la célula diana que es capaz de activar la expresión del gen mediante recombinación no homóloga o ilegítima. El ADN diana se somete en primer lugar a radiación, y se inserta un promotor genético. El promotor localiza eventualmente una rotura en la parte frontal de un gen, iniciando la transcripción del gen. Esto da como resultado la expresión del péptido o polipéptido deseado.

Aislamiento/purificación de las proteínas de fusión exendina-4/mTf

Se pueden aislar las proteínas de fusión exendina-4/mTf secretadas biológicamente activas del medio de las células hospedadoras que crecen en condiciones que permiten la secreción de las proteínas de fusión biológicamente activas. El material celular se elimina del medio de cultivo, y las proteínas de fusión biológicamente activas se aíslan usando técnicas de aislamiento conocidas en la técnica. Las técnicas de aislamiento adecuadas incluyen la precipitación y el fraccionamiento mediante una variedad de procedimientos cromatográficos, que incluyen la filtración en gel, la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de afinidad.

Un procedimiento de purificación particularmente preferido es la cromatografía de afinidad en una columna de unión al hierro o quelante metálica o una cromatografía de inmunoafinidad usando un antígeno dirigido contra la transferrina o la proteína terapéutica del polipéptido de fusión. El antígeno se inmoviliza o se une preferiblemente a un soporte o sustrato sólido. En una forma de realización el sustrato es Sefarosa activada por CNBr (Pharmacia LKB Technologies, Inc., Piscataway, N.J.). Mediante este procedimiento, el medio se combina con el antígeno/sustrato en condiciones que permitirán que se produzca la unión. Se puede lavar el complejo para eliminar el material no unido, y la proteína de fusión exendina-4/mTf se libera o eluye mediante el uso de condiciones desfavorables para la formación del complejo. Los procedimientos de elución particularmente útiles incluyen cambios en el pH, en el que el antígeno inmovilizado tiene una elevada afinidad por la proteína de fusión exendina-4/mTf a un primer pH y una reducida afinidad a un segundo (mayor o menor) pH, cambios en la concentración de algunos agentes caótropos; o mediante el uso de detergentes.

La purificación de una proteína de fusión exendina-4/mTf de la solución se puede llevar a cabo usando una variedad de técnicas. Si el polipéptido se ha sintetizado de tal manera que contiene una marca tal como Hexahistidina 9 u otro péptido pequeño tal como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) o myc, en cualquiera de su término carboxilo o amino, se puede purificar éste en un procedimiento en una etapa pasando la solución a través de una columna de afinidad en la que la matriz de la columna tiene una elevada afinidad por la marca.

Por ejemplo, la polihistidina se une con mayor afinidad y especificidad al níquel. De esta manera, se puede usar una columna de afinidad de níquel (tal como las columnas de níquel de Qiagen®. Véanse, Current Protocols in Molecular Biology, § 10.11.8 (más arriba).

Adicionalmente, se puede purificar una proteína de fusión exendina-4/mTf mediante el uso de un anticuerpo monoclonal que sea capaz de reconocer y unirse específicamente a una proteína de fusión exendina-4/mTf.

Cuando es preferible purificar parcial o completamente una proteína de fusión exendina-4/mTf de tal manera que está parcial o sustancialmente exenta de contaminantes, se pueden usar los procedimientos normalizados conocidos por los expertos en la técnica. Dichos procedimientos incluyen, sin limitación, la separación mediante electroforesis seguida por electroelución, diversos tipos de cromatografía (de afinidad, de inmunoafinidad, de exclusión molecular, y de intercambio iónico), HPLC, focalización isoeléctrica preparativa (máquina/técnica “Isoprime”, Hoefer Scientific, San Francisco, CA). En algunos casos, se pueden combinar dos o más técnicas de purificación para conseguir un aumento de la pureza.

Composiciones farmacéuticas

Las proteínas de fusión exendina-4/mTf de la presente invención se administrarán generalmente en la forma de una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede, por ejemplo, estar en forma adecuada para la administración oral (por ejemplo, un comprimido, cápsula, píldora, polvo, disolución, suspensión), para inyección parenteral (por ejemplo una disolución, suspensión o emulsión estéril), para la administración intranasal (por ejemplo, unas gotas de aerosol, etc), para la administración rectal (por ejemplo, un supositorio) o para la administración transdérmica (por ejemplo, un parche). La composición farmacéutica puede estar en formas farmacéuticas unitarias adecuadas para la administración individual de dosificaciones precisas. La composición farmacéutica incluirá una

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proteína de fusión exendina-4/mTf de la invención como un ingrediente activo y puede incluir un vehículo farmacéutico convencional. Además, puede incluir otros agentes farmacéuticos, adyuvantes, etc.

Se conocen en la técnica de las ciencias farmacéuticas procedimientos de preparación de diversas composiciones farmacéuticas de péptidos bioactivos. Por ejemplo, véase la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nº 2005/0009748 (para la administración oral); y las Publicaciones de Solicitudes de Patentes de los Estados Unidos

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2004/0157777, 2005/0002927 y 2005/0215475 (para la administración transmucosal, por ejemplo, administración intranasal o bucal). Véase también Remington: The Practice of Pharmacy, Lippincott Williams y Wilkins, Baltimore, MD, 20ª ed., 2000.

Tradicionalmente, se han administrado fármacos de péptidos y proteínas mediante inyección debido a la mala biodisponibilidad cuando se administran oralmente. Estos fármacos son propensos a inestabilidad química y conformacional y a menudo se degradan por las condiciones ácidas en el estómago, así como por las enzimas del estómago y el tracto gastrointestinal. En respuesta a estos problemas de administración, se han desarrollado algunas tecnologías para la administración oral, tales como la encapsulación en nanopartículas compuestas de polímeros con un esqueleto hidrófobo y ramas hidrófilas como portadores del fármaco, encapsulación en nanopartículas, inserción en liposomas en emulsiones, y conjugación con otras moléculas. Todas las cuales se pueden usar como moléculas de fusión de la presente invención.

Los ejemplos de nanopartículas incluyen nanopartículas mucoadhesivas revestidas con quitosán y Carbopol (Takeuchi y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 47: 39-54, 2001) y nanopartículas que contienen poliésteres en combinación cargados alcohol de poli (2-sulfobutil-vinilo) y ácido poli (D,L-láctico-co-glicólico) (Jung y col., Eur. J. Pharm. Biopharm. 50: 147160, 2000). Las nanopartículas que contienen polímeros superficiales con regiones de poli-N-isopropilacrilamida y grupos de polivinilamina catiónicos mostraron absorción mejorada de la calcitonina de salmón cuando se administraron oralmente a ratas.

Las partículas de administración de fármacos compuestas de alginato y pectina, fortalecidas con polilisina, son relativamente resistentes a ácidos y bases y se pueden usar como vehículos de fármacos. Estas partículas combinan las ventajas de la bioadhesión, absorción potenciada y liberación sostenida (Liu y col., J. Pharm. Pharmacol. 51: 141149, 1999).

Adicionalmente, se mostró que grupos de lipoaminoácidos y grupos de lipopolisacáridos conjugados con los extremos N y C de péptidos tales como somatostatina sintética, creando un tensioactivo anfifático, producían una composición que retenía la actividad biológica (Toth y col., J. Med. Chem. 42 (19): 4010-4013, 1999).

Los ejemplos de otras tecnologías de administración de péptidos incluyen emulsiones mucoadhesivas revestidas de carbopol que contienen el péptido de interés y cualquiera de nitroso-N-acetil-D,L-penicilamina y carbopol o taurocolato y carbopol. Se mostró que estos eran eficaces cuando se administraron oralmente a ratas para reducir las concentraciones de calcio en suero (Ogiso y col., Biol. Pharm. Bull. 24: 656-661, 2001). Se usó fosfatidiletanol, derivado de fosfatidilcolina para preparar liposomas que contenían fosfatidiletanol como un vehículo de insulina. Estos liposomas, cuando se administraron oralmente a ratas, demostraron ser activos (Kisel y col., Int. J. Pharm. 216: 105114, 2001).

Se ha formulado también insulina en esferas de gel de alcohol polivinílico que contienen insulina y un inhibidor de la proteasa, tal como aprotinina o bacitracina. Se han demostrado las propiedades disminuidoras de la glucosa de estas esferas de geles en ratas, en las que la insulina se libera en gran medida en el intestino delgado (Kimura y col., Biol. Pharm. Bull. 19: 897-900, 1996).

Se ha estudiado también la administración oral de insulina usando nanopartículas preparadas de poli(alquil cianoacrilato) que se dispersaron con un tensioactivo en una fase oleosa (Damge y col., J. Pharm. Sci. 86: 1403-1409, 1997) y usando perlas de alginato de calcio revestidas con quitosán (Onal y col., Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 30: 229-237, 2002).

En otros procedimientos, los extremos N y C de un péptido se unen al polietilenglicol y a continuación a las cadenas de alilo para formar conjugados con resistencia mejorada a la degradación enzimática y difusión mejorada a través de la pared GI (www.nobexcorp.com).

BioPORTER® es una mezcla lipídica catiónica, que interactúa de manera no covalente con péptidos para crear un revestimiento o capa protectora. El complejo péptido-lípido puede fusionarse a la membrana plasmática de las células, y los péptidos se internalizan en las células-

En un procedimiento que utiliza liposomas como material de partida, se han desarrollado partículas con forma de caracol como un vehículo farmacéutico. Se añade un péptido a una suspensión de liposomas que contienen principalmente lípidos cargados negativamente. La adición de calcio produce el colapso y la fusión de los liposomas en

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grandes láminas compuestas de bicapas de lípidos, que se enrollan o apilan en estructuras en forma de caracol (Patente de los Estados Unidos Nº 5.840.707).

Además, la presente invención incluye la administración pulmonar de formulaciones de proteínas de fusión exendina4/mTf. La administración pulmonar es particularmente prometedora para la administración de macromoléculas que son difíciles de administrar mediante otras vías de administración. Dicha administración pulmonar puede ser eficaz para la administración sistémica y para la administración localizada para tratar enfermedades de los pulmones, ya que los fármacos administrados al pulmón se absorben fácilmente a través de la región alveolar directamente en la circulación sanguínea.

La presente invención proporciona composiciones adecuadas para formar una dispersión de fármacos para inhalación oral (administración pulmonar) para tratar diversas dolencias o enfermedades. La formulación de la proteína de fusión podría administrarse mediante diferentes soluciones tales como nebulizadores líquidos, inhaladores de dosis medidas MDI) basados en aerosoles (, y dispositivos de dispersión de polvo seco En las composiciones de formulación para la administración pulmonar, se añaden comúnmente vehículos farmacéuticamente aceptables que incluyen agentes con actividad superficial o tensioactivos y vehículos de engrosamiento, para proporcionar estabilidad, dispersabilidad, consistencia, y/o características de volumen para potenciar la administración pulmonar uniforme de la composición al sujeto.

Los agentes con actividad superficial o tensioactivos promueven la absorción del polipéptido a través de la membrana o revestimiento mucosal. Los agentes de superficie activa o tensioactivos útiles incluyen ácidos grasos y sus sales, sales biliares, fosfolípidos, o un alquil sacárido. Los ejemplos de ácidos grasos y sus sales incluyen sales de sodio, potasio y lisina de caprilato (C8), caprato (C10), laurato (C12) y miristato (C14). Los ejemplos de sales biliares incluyen ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido glicocólico, ácido taurocólico, ácido glicoquenodesoxicólico, ácido tauroquenodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurodesoxicólico, ácido litocólico, y ácido ursodesoxicólico.

Los ejemplos de fosfolípidos incluyen fosfolípidos monocatenarios, tales como lisofosfatidilcolina, lisofosfatidilglicerol, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilinositol y lisofosfatidilserina, o fosfolípidos bicatenarios, tales como diacilfosfatidilcolinas, diacilfosfatidilgliceroles, diacilfosfatidiletanolaminas, diacilfosfatidilinositoles y diacilfosfatidilserinas. Los ejemplos de alquil sacáridos incluyen alquil glucósidos o alquil maltósidos, tales como decil glucósido y dodecil maltósido.

Los excipientes farmacéuticos que son útiles como vehículos incluyen estabilizantes tales como albúmina de suero humano (ASH), agentes de volumen tales como carbohidratos, aminoácidos o polipéptidos; ajustadores del pH o tampones, y sales tales como cloruro de sodio. Estos vehículos pueden estar en forma cristalina o amorfa o pueden ser una mezcla de los dos.

Los ejemplos de carbohidratos para uso como agentes de volumen incluyen monosacáridos tales como galactosa, Dmanosa, y sorbosa, disacáridos tales como lactosa y trehalosa; ciclodextrinas tales como 2-hidroxipopil-betaciclodextrina, y polisacáridos, tales como rafinosa, maltodextrinas, y extraños, alditoles, tales como manitol y xilitol. Los ejemplos de polipéptidos para uso como agentes de volumen incluyen aspartamo. Los aminoácidos incluyen alanina y glicina, prefiriéndose glicina

Se pueden incluir aditivos, que son componentes minoritarios de la composición, para la estabilidad conformacional durante el secado mediante pulverización y para mejorar la dispersabilidad del polvo. Estos aditivos incluyen aminoácidos hidrófobos tales como triptófano, tirosina, leucina, y fenilalanina.

Los ajustadores del pH o tampones adecuados incluyen sales orgánicas preparadas a partir de ácidos y bases orgánicas, tales como citrato de sodio, y ascorbato de sodio; se prefiere citrato de sodio.

Se pueden envasar las composiciones de fusión agonistas del receptor de GLP1 para la administración pulmonar como dosis unitarias en las que está presente una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición en un receptáculo de dosis unitaria, tal como un envase blister o cápsula de gelatina. La fabricación de los envases blister o de las cápsulas de gelatina se lleva a cabo normalmente mediante procedimientos que se conocen generalmente bien en la técnica del envasado.

La Patente de los Estados Unidos Nº 6.524.557 da a conocer una formulación farmacéutica de aerosol que comprende

(a) un propulsor de HFA; (b) un polipéptido farmacéuticamente activo dispersable en el propulsor; y (c) un tensioactivo que es un ácido graso C8-C16 o una de sus sales, una sal biliar, un fosfolípido, o un alquil sacárido, tensioactivo que potencia la absorción sistémica del polipéptido en el tracto respiratorio inferior. La invención proporciona también procedimientos de fabricación de dichas formulaciones, y el uso de dichas formulaciones en pacientes en tratamiento.

Una solución para la administración pulmonar o los fármacos de polvos secos utiliza un dispositivo manipulado

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manualmente con una bomba manual para proporcionar una fuente de gas presurizado, el gas presurizado se libera repentinamente a través de un dispositivo de dispersión del polvo, tal como una boquilla venturi, y el polvo dispersado se encuentra disponible para la inhalación del paciente. Los dispositivos de dispersión de polvo seco, se describen en varias patentes. La Patente de los Estados Unidos Nº 3.921.637, describe una bomba manual con agujas para perforar a través de una cápsula individual de medicamento en polvo. Se describe en la Patente Europea Nº EP 0 467 172; las Publicaciones de Solicitudes de Patentes PCT Nos WO 91/02558 y WO 93/09832; y las Patentes de los Estados Unidos

Nos

4.627.432, 4.811.731, 5.035.237, 5.048.514, 4.446.862, 5.048.514, y 4.446.862 el uso de múltiples discos o tiras receptáculos de medicación.

En la Patente Europea Nº EP 0 289 336 se da a conocer la aerosolización de agentes terapéuticos proteínicos. En la Publicación de Solicitud de Patente PCT Nº WO 90/09781 se dan a conocer las formulaciones de aerosoles terapéuticos.

Procedimientos de tratamiento

Las proteínas de fusión exendina-4/mTf de esta invención se pueden usar junto con otros agentes farmacéuticos para el tratamiento de los estados de enfermedad o dolencias descritos en el presente documento. Por tanto, se describen también los procedimientos de tratamiento que incluyen administrar compuestos de la presente invención en combinación con otros agentes farmacéuticos.

En el aspecto de los procedimientos, se administra periféricamente una proteína de fusión exendina-4/mTf de la invención, sola o en combinación con uno o más agentes farmacéuticos, a un sujeto, por separado o juntos por cualquiera de los procedimientos convencionales de administración periférica conocidos en la técnica. De acuerdo con esto, se puede administrar la proteína o combinación de fusión exendina-4/mTf a un sujeto por vía parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o subcutánea), intranasal, oral, sublingual, bucal, mediante inhalación (por ejemplo, en aerosol), rectal (por ejemplo, en supositorios) o transdérmicamente. La administración parenteral, pero no oral (por ejemplo, inyección) es un procedimiento preferido de administración, y la administración subcutánea es un procedimiento preferido de administración parenteral. La administración pulmonar mediante inhalación es también un procedimiento preferido de administración.

Las composiciones adecuadas para la inyección parenteral incluyen generalmente disoluciones, dispersiones, suspensiones, o emulsiones acuosas o no acuosas estériles farmacéuticamente aceptables, y polvos estériles para la reconstitución en disoluciones o dispersiones inyectables estériles. Los ejemplos de vehículos o diluyentes acuosos y no acuosos adecuados (incluyendo disolventes y vehículos) incluyen agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, y similares), sus mezclas adecuadas, triglicéridos incluyendo aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo.

Estas composiciones para la inyección parenteral pueden contener también excipientes tales como agentes conservantes, humectantes, solubilizantes, emulsionantes, y dispersantes. Se puede llevar a cabo la prevención de la contaminación por microorganismos de las composiciones con diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, y ácido sórbico. Puede ser también deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares y cloruro de sodio puede realizarse mediante el uso de agentes capaces de retrasar la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las proteínas de fusión exendina-4/mTf de la presente invención se administrarán a un sujeto a una dosificación que varía dependiendo de numerosos factores, que incluyen el modo de administración, la edad y el peso del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la dolencia o el trastorno que se está tratando, y la actividad farmacológica de la proteína de fusión exendina-4/mTf que se está administrando. Se encuentran comprendidos dentro de los conocimientos de una persona normalmente experta en la técnica la determinación de los intervalos de dosificación y las dosificaciones óptimas para un paciente concreto.

Para la inyección parenteral para el tratamiento para reducir la glucosa en sangre, se puede administrar la proteína de fusión exendina-4 (1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf que se muestra en la SEC ID Nº: 23 a un sujeto humano a unos niveles de dosificación en el intervalo de aproximadamente 0,6-50 mg por dosis, más preferiblemente, 0,5-20 mg por dosis, produciéndose la administración de la dosis aproximadamente una vez por semana, una vez cada dos semanas, o una vez por mes.

Para la inyección parenteral para el tratamiento para reducir el peso corporal, el intervalo de la dosis puede ser mayor que para reducir la glucosa en sangre. Por tanto, para la administración parenteral para reducir el peso corporal, se puede administrar la proteína de fusión exendina-4 (1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf que se muestra en la SEC ID Nº: 23 a niveles de dosificación en el intervalo de aproximadamente 1-100 mg por dosis, con una administración de la dosis que se produce aproximadamente una vez por semana, una vez cada dos semanas, o una vez por mes.

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La invención proporciona también una proteína de fusión exendina-4/mTf de la invención para uso en el tratamiento de la diabetes de Tipo II o en la reducción de la glucosa en sangre en un paciente humano. Se proporciona además una proteína de fusión exendina-4/mTf de la invención para uso en el tratamiento de la obesidad o para disminuir la ingesta de alimentos en un paciente humano. Un aspecto adicional de la invención proporciona el uso de una proteína de fusión exendina-4/mTf de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes de Tipo II

o para la reducción de la glucosa en sangre en un paciente humano. Un aspecto más adicional proporciona el uso de una proteína de fusión exendina-4/mTf de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la obesidad o para la disminución de la ingesta de alimentos. Las características de los aspectos de los procedimientos de la invención pueden aplicarse a cada uno de estos aspectos.

Las formas de realización de la presente invención se ilustran mediante los siguientes Ejemplos. Debe entenderse, sin embargo, que las realizaciones de la invención no se limitan a los detalles específicos de estos Ejemplos, ya que una persona normalmente experta en la técnica conocerá o le resultarán evidentes otras variaciones de los mismos, a la luz de la presente divulgación y de las reivindicaciones adjuntas

Ejemplos

Ejemplo 1: Construcción de proteínas de fusión exendina-4/Tf

Proteína de fusión Exendin-4 (1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf

Se insertó la secuencia de ADN de exendina-4 (1-39) (SEC ID Nº: 20) entre la secuencia señal de la secreción (nL) (SEC ID Nº: 19) y la secuencia de mTf (SEC ID Nº: 22) de pREX0549 usando la extensión mediante solapamiento del sitio (SOE) de la PCR. Se diseñaron dos cebadores, P0702 (SEC ID Nº: 28) y P0703 (SEC ID Nº: 29), para insertar la secuencia usando pREX0549 como un molde.

Se obtuvo la secuencia de ADN mediante traducción inversa de la secuencia de aminoácidos de exendina-4 usando codones óptimos para la expresión en levaduras (SEC ID Nº: 20). Inicialmente, se crearon dos productos de la PCR usando un cebador 5’ del sitio Af/II, P0177 (SEC ID Nº: 31) con P0702, o un cebador 3’ del sitio BamHI.

Se crearon construcciones para expresar exendina-4/mTf (SEC ID Nº: 23; codificada por la SEC ID Nº: 24) unida a las secuencias señal HSA/MFa-1 (pREX 1354) (SEC ID Nº: 40; codificada por SEC ID Nº: 41) y HSA modificada/MFa-1 (pREX 1345) (SEC ID Nº: 42; codificada SEC ID Nº: 43). Una comparación de la productividad de cepas de levaduras que expresaban la exendina-4/mTf con tres secuencias señal diferentes desveló una relación de productividad relativa como sigue, para la secuencia señal de la transferrina (nL)/HSA/MFa-1/HSA modificada /MFa-1: 1/1.75/1.32.

Ejemplo 2: Determinación de las potencia de las proteínas de fusión exendina-4/Tf

Se calculó la potencia a partir de la respuesta medida del AMPc como resultado de la unión del ligando mediada por el receptor de GLP-1 en células CHO transfectadas con el receptor de GLP-1 de rata (CHO-GLP-1 R) tras la incubación con muestras. Se sembraron placas de cultivo de tejido de 96 pocillos con células CHO-GLP-1 R y se cultivaron durante la noche. El día siguiente, se enjuagaron las células con tampón Krebs-Ringer (KRB) y se incubaron en KRB que contenía el inhibidor de la fosfodiesterasa 3-isobutil.1.metilxantina (IBMX, 2 mM) para inhibir las enzimas intracelulares que procesa el AMPc. Se prepararon diluciones en serie de los compuestos de ensayo y de los controles. Tras la incubación, se evaluaron a continuación los lisados de muestras individuales para medir el aumento en los niveles del AMPc intracelular usando un inmunoensayo fluorescente basado en competición (CatchPoint® cAMP Fluorescent Assay Kit, Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA). Se usó la cantidad de acumulación de AMPc en las células tras la unión del ligando mediada por el receptor de GLP-1 para determinar la bioactividad y la potencia relativa.

Los datos en la Tabla 1 indican que las fusiones de exendina-4/Tf son más potentes en la activación del receptor de GLP-1 que en el de la proteína de fusión GLP-1 (7-37, A8G, K34A) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf. El resto mTf en cada proteína de fusión tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 17.

Tabla 1. Potencia de las proteínas de fusión GLP-1/mTf y Exendina-4/Tf

Plásmido: Construcción Potencia (nM)

pREX0585: GLP-1(7-37;A8G,K34A) (PEAPTD)2 mTf 1,3

pREX0659: Exendina-4(1-30) (PEAPTD)2 mTf 0,85

pREX0658: Exendina-4(1-31) (PEAPTD)2 mTf 0,33

pREX0936: Exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 mTf 0,16

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Ejemplo 3: Resistencia a la MMP de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf

Se ensayó la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf (SEC ID Nº: 23) para la resistencia a la inactivación por la metaloproteinasa de matriz I (MMP-1, colagenasa) in vitro. Se incubaron las muestras de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf y de la proteína de fusión GLP-1(7-37, A8G, K34A) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf con MMP-1 recombinante durante 48 h a 37ºC y a continuación se ensayaron para la actividad. La Figura 1 muestra que la proteína de fusión exendina-4/Tf es resistente a la inactivación por MMP-1 (Figura 1B), en contraste a la proteína de fusión GLP-1/mTf (Figura 1 A). Esta diferencia en la degradación se produce a pesar de la estrecha similitud en la secuencia de aminoácidos en la porción activa de las moléculas.

Ejemplo 4: Efecto de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf sobre la glucosa en sangre en ratones diabéticos

Se inyectaron ratones diabéticos (db/db) con diversas dosis de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf (SEC ID Nº: 23), la proteína de fusión GLP-1(7-37, A8G, K34A) (PEAPTD)2 mTf, o el péptido exendina-4 (Bachem, King of Prussia, PA) y se controlaron las concentraciones de glucosa en sangre analizando muestras de sangre usando un glucómetro. Tal como se muestra en la Figura 2, dosis de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf tan bajas como 1,3 nmol/kg redujeron significativamente la glucosa en sangre en estos animales 3 horas después de la inyección subcutánea. El nivel de glucosa se normalizó prácticamente en todos los grupos de tratamiento y este nivel persistió durante 24 horas. Las concentraciones de glucosa aumentaron gradualmente hasta los niveles del pretratamiento entre 48-72 horas después del tratamiento, dependiendo de la dosis administrada. El péptido exendina-4 no disminuyó la glucosa en sangre tanto como la proteína de fusión exendina-4(139) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf, con respecto a la dosis y la exendina-4 tuvo un efecto de disminución de la glucosa que se disipó completamente en aproximadamente 12 horas. Esto es consistente con los informes bibliográficos de que la máxima reducción de la glucosa en sangre conseguible con la exendina-4 es aproximadamente del 37%; la reducción observada con la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf fue aproximadamente del 70%. El efecto de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf sobre la glucosa en sangre fue también significativamente mayor y de una duración más larga que las dosis equivalentes de la proteína de fusión GLP-1 (7-37, A8G, K34A) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf.

Ejemplo 5 Efecto de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf sobre el peso corporal de rata

Se inyectaron ratas Sprague Dawley por vía subcutánea con diferentes dosis de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf (SEC ID Nº: 23), y del péptido exendina-4. Se usó mTf o solución salina como control. Se pesaron las ratas diariamente (antes de la dosificación en los días de dosificación). Los animales tuvieron un acceso completo al alimento y al agua en todo momento.

Tal como se muestra en la Figura 3, los animales tratados con 10 y 100 nmol/kg de dosis de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf experimentaron una pérdida de peso después de la primera inyección y la pérdida de peso continuó duran el periodo de administración completo En el día quinto, los animales tratados con dosis de 100 nmol/kg perdieron un promedio de 75 gramos (17%) de peso corporal en comparación con los controles, y la pérdida de peso está relacionada con una disminución en la ingesta de alimento y agua. Debido a la drástica y aguda pérdida de peso observada, se detuvo la administración diaria en el día quinto. Después de 5 días del periodo de administración, todos los animales ganaron peso a una tasa similar. Sin embargo, los grupos tratados con la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf, especialmente el grupo de dosis elevada, pesaron todavía menos que los animales del control 20 días después de la última administración.

Ejemplo 6: Dosis predictiva para la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf para el control glucémico en diabéticos de Tipo II y para la pérdida de peso

Basándose en los datos publicados, una única dosis terapéutica de 10 µg de exenatida (BYETTA®) produjo una Cmax de 200 pg/ml en seres humanos. La diferencia del tamaño molecular entre exenatida y la proteína de fusión exendina4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf (SEC ID Nº: 23) (4,2 kDa vs. 80,5 kDa) indican que el nivel en sangre de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf es equivalente al nivel terapéutico de exenatida en términos de efecto de disminución de la glucosa en sangre. Además del tamaño, la proteína de fusión exendin-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf es aproximadamente 5 veces menos potente que la exendina-4 basada en el ensayo in vitro en células CHO que expresaban el receptor de GLP-1 humano (Figura 4) Por tanto, para conseguir la actividad terapéutica similar de 10 µg de exenatida, se requeriría una concentración en circulación de aproximadamente 20 ng/ml de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf.

La proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf y la proteína de fusión GLP 1 (7-37, A8G, K34A) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf son similares en tamaño y estructura. El peso molecular de la proteína de fusión exendina-4 (1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf es de 80,5 kDa y de la proteína de fusión GLP-1 (7-37, A8G, K34A) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf es de 79,6 kDa. La proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf es aproximadamente de cuatro-ocho veces más potente que la proteína de fusión GLP-1 (7-37, A8G, K34A) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf. Se presentan en la Tabla 2 los parámetros farmacocinéticos promedio de la proteína

5 de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf tras la administración intravenosa y subcutánea de 1 mg/kg a macacos. Se presentan en la Tabla 3 los parámetros farmacocinéticos promedio de la proteína de fusión GLP-1 (737, A8G, K34A) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf tras la administración subcutánea de 0,6 mg/kg al mono Cynomolgus.

Tabla 2: Resumen de los parámetros farmacocinéticos promedio de la proteína de fusión exendin-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf tras la administración intravenosa y subcutánea de 1 mg/kg a machos y hembras 10 de macacos

Parámetro: Intravenosa Subcutánea

Cmax (ng/ml): 33.981 ± 14.826 (4) 5.236 ± 1.038 (4)

Tmax (h): 0,542 (4) 9,02 (4)

AUC(0-t) (h·ng/ml): 567.364 ± 68.102 (4) 278.067 ± 24.367 (4)

AUC(inf) (h·ng/ml): 572.314 ± 68.660 (4) 280.279 ± 29.261 (3)

λ z (h-1): 0,0313 ± 0,0137 (4) 0,0252 ± 0,0084 (3)

t1/2 (h): 25,5 ± 10,3 (4) 29,3 ± 0,82 (3)

CL (ml/min/kg): 1,77 ± 0,24 (4) -

Vz (mUkg): 65,9 ± 31,0 (4) -

F (%): - 49,0

Tabla 3. Resumen de los parámetros farmacocinéticos promedio de la proteína de fusión GLP-1(7-37, A8G, K34A) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf tras la administración subcutánea de 0,6 mg/kg a machos y hembras de macacos

Parámetro: Machos Hembras

Cmax (ng/ml): 2.922 ± 1.530 (3) 3.173 ± 1.767 (3)

Tmax (h): 12,0 (3) 24,2 (3)

AUC(0-t) (h·ng/ml): 168.087 ± 58.749 (3) 165.474 ± 32.756 (3)

AUC(inf) (h·ng/ml): 171.963 ± 61.998 (3) 186.065 ± 140 (2)

λ z (h-1): 0,0216 ± 0,0042 (3) 0,0250 ± 0,0002 (2)

t1/2 (h): 32,9 ± 6,78 (3) 27,7 ± 0,23 (2)

CL (mUmin/kg): - -

Vz (ml/kg): - -

F (%): - -

En un experimento independiente, se demostró que la biodisponibilidad de la proteína de fusión GLP-1 (7-37, A8G, K34A) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf era aproximadamente del 50% en macacos.

La semivida de eliminación (t1/2) de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf para la administración intravenosa y subcutánea, el intervalo de la Tmax, y la biodisponibilidad (F(%)) fueron similares a los de

20 los parámetros farmacocinéticos del mono con respecto a la proteína de fusión GLP-1 (7-37, A8G, K34A) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf

La experiencia humana previa con la proteína de fusión GLP-1 (7-37, A8G, K34A) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf indicó que la farmacocinética fue lineal a partir de dosis 30 µg/kg a 900 µg/kg, con una Tmax promedio a las 48 horas, y la t1/2 promedio fue aproximadamente de 50 horas. La Cmax fue de 758 ± 435 ng/ml a una dosis de 300 µg/kg (o 30 25 mg/paciente de 100 kg) 1.609 ± 805 ng/ml a una dosis de 900 µg/kg (90 mg/ paciente de 100 kg). Sin embargo, la proteína de fusión no muestra un efecto fuerte sobre los niveles de glucosa en sangre en sujetos diabéticos a estas

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dosis, ni a una dosis de 1800 µg/kg).

Debido a la similitud en el tamaño y la estructura, así como al perfil farmacocinético preclínico similar en monos entre estos dos compuestos, se predijo que las características farmacocinéticas de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf en seres humanos eran similares a la proteína de fusión GLP-1 (7-37, A8G, K34A) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf.

Basándose en las similitudes con GLP-1(7-37, A8G, K34A) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf, una potencia in vitro relativa mayor de cuatro-ocho veces de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf en comparación con GLP-1 (7-37, A8G, K34A) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf, y una disminución relativa de cinco veces en la potencia in vitro para la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf en comparación con exenatida, es sorprendente que una dosis de 2 mg de la proteína de fusión exendin-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf pueda tener un efecto de disminución de la glucosa . Además, sería necesaria una dosis de 10 mg por sujeto, sobre una base de dosificación semanal, para conseguir una Cmin en estado estacionario de 20 ng/ml. De esta manera, la dosis eficaz de la proteína de fusión exendin-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf (SEC ID Nº: 23) (SEC ID Nº: 23) para los intervalos terapéuticos de disminución de la glucosa en sangre de 0,5 a 50 mg por dosis administrada sobre una base de dosis semanal. Se puede también administrar dicha dosis una vez cada dos semanas o una vez por mes.

Además de su efecto sobre la glucosa en sangre, la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf a o por encima de 10 nmol/kg se correlacionó con una reducción en el peso corporal del animal en ratones y ratas. Veinticuatro horas después de la administración de una única dosis de 10 o 100 nmol/kg de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf esto dio como resultado una disminución promedio en el peso corporal del 6% y del 14%, respectivamente, en comparación con una pérdida promedio del 1% en los animales del control o en los animales tratados con 1 nmol/kg de exendina-4. La administración diaria de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf, dio también como resultado una pérdida de peso del 16% en ratas a una dosis de 100 nmol/kg. La pérdida de peso puede ser atribuida a una ingesta reducida de alimento observada en los animales dosificados con la proteína de fusión exendin-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf, que es un efecto farmacológico conocido de la activación del receptor de GLP-1. Los datos disponibles indican que la dosis requerida para la pérdida de peso es aproximadamente 2-3 veces mayor que las dosis necesarias para la disminución de la glucosa. De esta manera, la dosis eficaz de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf (SEC ID Nº: 23) para intervalos de pérdida de peso de 1,0 a 100 mg por dosis, administrados una vez por semana. Se puede administrar también dicha dosis una vez cada dos semanas o una vez por mes.

Ejemplo 7: Administración mediante inhalación de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf

Se generaron aerosoles con un nebulizador de chorro de aire comprimido Aerotech II (CIS-US Inc., Bedford, MA) y se dirigieron a través de una línea de administración del aerosol de acero inoxidable con un diámetro de 1,58 cm en un sistema de exposición de roedores con 24 puertos de paso de flujo (IN-TOX, ABQ, NM). El caudal de escape que salió hacia el exterior de la cámara fue de ~ 11,5 l/min. La presión del nebulizador se mantuvo a ~30 psi (2,07 x 105 N/m2).

Para probar el efecto de aerosolización sobre la proteína de fusión, una disolución de 10 ng/ml de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf (SEC ID Nº: 23) en histidina 10 mM pH 7,4, se nebulizó NaCl 100 mM y se recogieron posteriormente 5 ml de líquido condensado a partir del aerosol en un biomuestreador en un periodo de ocho minutos y se ensayaron para su integridad y actividad. El procedimiento de aerosolización no tuvo efecto adverso detectable sobre la estructura de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf tal como se evaluó mediante SDS-PAGE y SEC-HPLC. No hubo rotura aparente o formación de agregados: Se demostró también que el material recuperado era biológicamente activo.

Para el ensayo in vivo, se situaron ratones diabéticos (db/db) en las cámaras de inhalación y se les dejó respirar una proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf aerosolizada durante varios lapsos de tiempo. Al final del periodo de exposición a la inhalación se controlaron a continuación los ratones para la glucosa en sangre durante las siguientes 72 horas. Se escogió el tiempo de inhalación en la cámara de tal manera que los animales recibieran una exposición equivalente a 0,3, 1 y 3 mg/kg de dosis administrada por vía subcutánea. Como un control, se administraron estas dosis por vía subcutánea (SC) para comparar la actividad in vivo con la ruta inhalada de administración. Los niveles de glucosa en sangre en los animales que recibieron la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf mediante inhalación, mostraron una significativa disminución tras la exposición al fármaco. La evaluación de los niveles en circulación de la proteína de fusión exendina-4(1-39) (PEAPTD)2 (SEC ID Nº: 5) mTf indicó una biodisponibilidad de aproximadamente un 10% para este sistema y la formulación no optimizados.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Pfizer Products Inc. Sadeghi, Homayoun Turner, Andrew J. Prior, Christopher P. Ballance, David J.

<120> PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE EXENDINA 5 <130> PC19606A

<150> US 60/832.582

<151> 24-07-2006

<150> US/857.474

<151> 08-11-2006 10 <150> US 60/874.965

<151> 15-12-2006

<160> 38

<170> PatentIn versión 3.4

<210> 1 15 <211> 2318

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 698

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 679

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 39

<212> PRT

<213> Heloderma suspectum

<400> 4

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> péptido enlazante

<400> 5

15 <210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 20 <223> péptido enlazante no helicoidal

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31) .. (31)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce naturalmente 25 <400> 6

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido enlazante

<400> 7

<210> 8

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido enlazante

<400> 8

15 <210> 9

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 20 <223> péptido enlazante

<400> 9

<210> 10

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido enlazante

<400> 10

<210> 11

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial 10 <220>

<223> péptido enlazante

<400> 11

<210> 12 15 <211> 31

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido enlazante 20 <400> 12

<210> 13

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido enlazante

<400> 13

<210> 14

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial 10 <220>

<223> péptido enlazante

<400> 14

<210> 15 15 <211> 31

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido enlazante 20 <400> 15

<210> 16

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> péptido enlazante

<400> 16

<210> 17

<211> 679

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <400> 17

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 57

10: <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 19

atgaggctcg ccgtgggagc cctgctggtc tgcgccgtcc tggggctgtg tctggcg: 57

<210> 20

15: <211> 117

<212> ADN

<213> Heloderma suspectum

<400> 20

20 <210> 21

<211> 0

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 25 <223> péptido enlazante

<400> 21 000

<210> 22

<211> 2043

<212> ADN 5 <213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 730

<212> PRT

<213> Heloderma subspectum/Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 2196

<212> ADN

<213> Heloderma subspectum/Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 749

<212> PRT

<213> Heloderma subspectum/Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 2253

<212> ADN

<213> Heloderma subspectum/Homo sapiens

<400> 26 <210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> variante de corte y empalme de lactoferrina neutrófila

<400> 27

10 <210> 28

<211> 95

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 15 <223> cebador P0702 de la PCR

<400> 28

<210> 29

<211> 107

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador P0702 de la PCR

<400> 29

<210> 30

<211> 116

<212> ADN

<213> Heloderma suspectum

<400> 30 <220>

<210> 31

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

10: <220>

<223> cebador P0177 de la PCR

<400> 31

gcgataaaga gcgcgatg 18

<210> 32

15: <211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador P0014 de la PCR

20: <400> 32

ggctcaggta agtcacagta 20

<210> 33

<211> 47

<212> ADN

25: <213> Artificial

<220>

<223> cebador P1810 de la PCR

<400> 33

ccaactgatc cagaagctcc aactgatgta cctgataaaa ctgtgag: 47

30: <210> 34

<211> 46

<212> ADN

<213> Artificial

<223> cebador 1811 de la PCR

<400> 34 gcttctggat cagttggagc ttctggagat ggtggtggag caccag 46

<210> 35

<211> 67

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador P0940 de la PCR

<400> 35

<210> 36

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador P0941 de la PCR

<400> 36 tggagcttct ggtggaccac catttttcaa ccattcaata aac 43

<210> 37

<211> 65

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 0942 de la PCR

<400> 37

<210> 38

<211> 35

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 0943 de la PCR

<400> 38 gttggagctt ctggaccacc atttttcaac cattc 35

35 E07789496 10-11-2011

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Una proteína de fusión que comprende una exendina-4 fusionada con una transferrina modificada (mTf) mediante un polipéptido enlazante, comprendiendo dicha proteína de fusión la secuencia de aminoácidos que se muestra en (i) SEC ID Nº: 23 o (ii) SEC ID Nº: 25.
2.- Un proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que dicha mTf está modificada para presentar glucosilación reducida en comparación con una molécula de transferrina modificada.
3.- Un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
4.- El ácido nucleico de la reivindicación 3, comprendiendo dicho ácido nucleico la secuencia que se muestra en la SEC ID Nº: 24 (cuando es dependiente de la reivindicación 1 (i)) o la SEC ID Nº: 26 (cuando es dependiente de la reivindicación 1 (ii)).
5.- Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 3 o la reivindicación 4.
6.- Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 5.
7.- Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8.- La composición farmacéutica de la reivindicación 7, estando la composición adaptada para administrarse a una dosis que varía de 0,5 mg a 50 mg o de 1 mg a 100 mg.
9.- La composición farmacéutica de la reivindicación 7, estando la composición adaptada para administrarse mediante inhalación.
10.- Una proteína de fusión de la reivindicación 1 (i) o la reivindicación 2 (cuando es dependiente de la reivindicación 1(i) para uso en el tratamiento de la diabetes de Tipo II o en la reducción del nivel de glucosa en sangre en un paciente que lo necesite.
11.- La proteína de fusión de la reivindicación 10, administrándose dicha proteína de fusión a una dosis de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 50 mg a una frecuencia de aproximadamente una vez por semana, una vez por dos semanas, o una vez por mes.
12.- Una proteína de fusión de la reivindicación 1 (i) o la reivindicación 2 (cuando es dependiente de la reivindicación 1 (i)) para uso en el tratamiento de la obesidad o en la reducción de peso corporal en un paciente que lo necesite.
13.- La proteína de fusión de la reivindicación 12, administrándose dicha proteína de fusión a una dosis de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg a una frecuencia de aproximadamente una vez por semana, una vez por dos semanas, o una vez por mes.
14.- Uso de una proteína de fusión de la reivindicación 1 (i) o la reivindicación 2 (cuando es dependiente de la reivindicación 1 (i)) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes de Tipo II, la reducción del nivel de glucosa en sangre, el tratamiento de la obesidad, o la reducción del peso corporal de un paciente humano que lo necesite.