ES2366092T3 - Expresión de proteínas en células endoteliales derivadas de sangre umbilical. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la preparación de células endoteliales humanas que expresen un factor de coagulación sanguínea, que comprende a) obtener células precursoras endoteliales de una muestra de sangre umbilical humana: b) poner en contacto, in vitro, dichas células precursoras endoteliales derivadas de sangre umbilical humana con al menos un factor de crecimiento, en el que el al menos un factor de crecimiento promueve la diferenciación de las células precursoras endoteliales en células endoteliales maduras; y c) transducir las células endoteliales maduras con ADN que codifica el factor de coagulación sanguínea, o transducir, antes de la etapa b), las células precursoras endoteliales con ADN que codifica el factor de coagulación sanguínea.

Description

La invención se refiere a un procedimiento para la producción de una proteína, por ejemplo, un factor de coagulación sanguínea. El procedimiento comprende cultivar células endoteliales derivadas de sangre umbilical humana y aislar la proteína deseada a partir del medio de cultivo celular. La solicitud describe adicionalmente una población de células endoteliales humanas transducidas con un vector que codifica una proteína, por ejemplo, un factor de coagulación sanguínea. Las células pueden usarse en el procedimiento para la producción de una proteína o en un protocolo de terapia génica.

La hemofilia A está causada por niveles insuficientes o incluso la ausencia completa del factor de coagulación VIII (FVIII) funcional en la circulación. Es un trastorno hemorrágico ligado al cromosoma X que afecta a 1 de cada 5.000 a 10.000 varones. El FVIII es un componente esencial de la vía intrínseca de la cascada de coagulación sanguínea, donde sirve como cofactor para el factor IX activado dentro de un complejo unido a membrana (complejo Xasa) que activa el factor X, que a su vez participa en la conversión del zimógeno protrombina en la enzima trombina. El FVIII se sintetiza como una molécula de 2332 restos aminoacídicos (∼300 kDa) que consiste en tres dominios A homólogos, dos dominios C homólogos, y un dominio B único dispuestos en el orden A1-A2-B-A3-C1-C2. El FVIII se procesa por múltiples escisiones intracelulares dentro del dominio B, y en la unión B-A3, en un heterodímero que consiste en las cadenas ligera y pesada ligadas a Me2+. La cadena pesada está comprendida por los dominios A1 (1-336), A2 (373-740) y B (741-1648) y la cadena ligera incluye los dominios A3 (1649-2019), C1 (2020-2172) y C2 (2173-2332). En la circulación, el FVIII está ligeramente unido al factor de von Willebrand (VWF), una proteína necesaria para mantener el nivel normal de FVIII en plasma. El VWF evita la formación prematura del complejo Xasa y protege al FVIII de la inactivación por la proteína C activada, el factor IX activado (FIXa) y el factor X activado (FXa). La deficiencia de VWF tanto en seres humanos como en animales ha demostrado conducir a una deficiencia secundaria de FVIII, sugiriendo de este modo que VWF también evita que FVIII se elimine de forma acelerada.

Los síntomas principales de la hemofilia A son hemorragias en las articulaciones, músculos y órganos internos, que pueden suceder de forma espontánea y ser amenazantes para la vida (Mannucci y Tuddenhem, 2001; véase infra para los datos bibliográficos de las referencias). En base a la actividad residual de FVIII en plasma, la hemofilia A se clasifica como grave (<1% de actividad normal), moderada (1-5%) y leve (5-30%).

La hemofilia B existe en aproximadamente 1 de cada 25.000 varones. Se caracteriza por la deficiencia de la serín proteasa factor IX (factor de Christmas). Este polipéptido de 415 aminoácidos se sintetiza en el hígado como una glicoproteína de 56 kDa. Para obtener su función apropiada es necesaria una etapa de carboxilación posttraduccional que solamente sucede en presencia de vitamina K.

Los pacientes con hemofilia A y B actualmente se tratan por infusiones intravenosas de FVIII y FIX derivados de plasma o recombinantes, respectivamente (Mannucci y Giangrande, 2000). Aunque esta terapia de sustitución ha llegado a ser relativamente segura y eficaz durante la última década, hay varios inconvenientes tales como la inconveniencia de infusiones a lo largo de la vida y la transmisión potencial de enfermedades infecciosas por los concentrados de FVIII (Hoots, 2001; Teitel, 2000; White II y col., 2000; VandenDriessche y col., 2001). Debido a la semivida relativamente corta de FVIII en la circulación (12-14 h), el tratamiento profiláctico de la hemofilia A requiere infusiones repetidas -hasta tres veces a la semana -de preparaciones de FVI.

El uso de líneas celulares no humanas para la producción de factor VIII recombinante encontró ciertas desventajas. La limitación principal en la producción de FVIII recombinante es el bajo rendimiento a partir de células que expresan FVIII, que es dos órdenes de magnitud inferior a la de otras proteínas.

Se realizaron varios estudios in vivo para la terapia génica de la hemofilia A con vectores virales y no virales (revisados en White II, 2001; Chuah y col., 2001; Greengard y Jolly 1999, VandenDriessche y col., 2001; Kaufman, 1999). Sin embargo, siguen existiendo preocupaciones sobre la seguridad de estos enfoques. Los efectos secundarios potenciales incluyen reacciones inmunológicas adversas, citotoxicidad mediada por el vector (Yang y col., 1996; Lozier y col., 1999) y transmisión en la línea germinal.

En condiciones fisiológicas, la síntesis de FVIII sucede principalmente en los hepatocitos y en las células endoteliales sinusoidales del hígado (Wion y col., 1985; Zelechowska y col., 1985; Do y col., 1999; Hollestelle y col., 2001). Estos y otros tipos celulares tales como piel (Hoeben y col., 1990; Fakharzadeh y col., 2000), células endoteliales (Dwarki y col., 1995; Chuah y col., 1995; Rosenberg y col., 2000), hepatocitos (Andrews y col., 1999), células estromáticas de médula ósea (Chuah y col., 1998) y células hematopoyéticas (Hoeben y col., 1992; Evans y Morgan, 1998; Tonn y col., 2002) pueden ser útiles en enfoques terapéuticos génicos. De hecho, el implante de fibroblastos modificados ex vivo que secretaban FVIII demostró tolerarse bien y conducir a niveles plasmáticos detectables de FVIII en pacientes con hemofilia A grave (Roth y col., 2001).

La solicitud de patente de Estados Unidos 2002/0042130 A1 y Lin y col. (2002) describen estudios sobre el uso de células endoteliales del torrente sanguíneo (BOEC) para terapia génica para la hemofilia A. Gehling y col. (2000) informan de la diferenciación in vitro de células endoteliales a partir de células progenitoras AC133-positivas. Gehling y col. no describen, sin embargo, la transducción de células con ADN codificante del factor VIII. Los documentos EP 1 136 553 A1 y WO 01/70968 A2 se refieren a la producción de factores de coagulación sanguínea recombinantes en líneas celulares humanas inmortalizadas.

Rosenberg y col. (2000) "Arteriosclerosis, thrombosis and vascular biology" 20, 2689-2695 describen la transducción del gen VIII con el dominio B delecionado en células endoteliales de vena umbilical humana primarias (HUVEC). Estas células recubren la pared interior de la vena umbilical y por tanto representan células endoteliales completamente diferenciadas que muestran potencial proliferativo muy limitado. Rosenbreg y col. no describen el uso de células derivadas de sangre umbilical, es decir, sangre residual placentaria. Las células descritas por Rosenberg y col. difieren de las células endoteliales de sangre umbilical en su fenotipo y potencial proliferativo.

Ferrari y col., (2003), Gene Therapy 10, 647-656 describe estudios sobre células tipo progenitores endoteliales derivados de médula ósea como vectores de direccionamiento génico selectivos para la angiogénesis. Las células descritas en Ferrari y col. expresan β-gal, GFP o timidina quinasa.

El documento WO 02/08389 A2 se refiere a la angiogénesis terapéutica por transplante de células derivadas de médula ósea en tejido isquémico miocárdico y tejido isquémico de músculo esquelético.

El documento WO 03/013570 A1 se refiere a la protección por el factor de crecimiento derivado de plaquetas del miocardio cardiaco y los objetivos para proporcionar procedimientos para tratar y prevenir la pérdida de vascularización tisular que puede suceder en el envejecimiento. Las células de acuerdo con el documento WO 03/013570 A1 expresan PDGF.

Müller y col., (2002) investigan la expresión de los marcadores endoteliales PECAM-1, vWf, y CD34 in vitro e in vivo.

Un objeto de la presente invención es proporcionar células que sean adecuadas para producir cantidades suficientes de una proteína terapéuticamente eficaz. Un objeto adicional de la invención es proporcionar células que sean adecuadas para producir cantidades suficientes de la proteína funcional factor VIII y que puedan usarse en terapia génica.

Se ha descubierto sorprendentemente que las células precursoras endoteliales derivadas de sangre umbilical humana pueden diferenciarse en células endoteliales maduras que secretan niveles elevados de factor VIII después de transducción viral con ADNc que codifica el factor VIII. La invención, por lo tanto, se refiere a un procedimiento para la preparación de células endoteliales humanas que expresan un factor de coagulación sanguínea, que comprende

a) obtener células precursoras endoteliales de sangre umbilical humana;

b) poner en contacto, in vitro, dichas células precursoras endoteliales derivadas de sangre umbilical humana con al menos un factor de crecimiento, en el que el al menos un factor de crecimiento promueve la diferenciación de las células precursoras endoteliales en células endoteliales maduras; y

c) transducir las células endoteliales maduras con ADN que codifica el factor de coagulación sanguínea, o transducir, antes de la etapa b), las células precursoras endoteliales con ADN que codifica el factor de coagulación sanguínea.

La presente invención se refiere adicionalmente a un procedimiento para la producción de un factor de coagulación sanguínea, que comprende

a) obtener una población de células endoteliales por un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5; y opcionalmente generar una línea celular inmortalizada a partir de dicha población de células endoteliales humanas;

b) cultivar dicha población de células endoteliales humanas o dicha línea celular en condiciones adecuadas; y

c) aislar el factor de coagulación sanguínea a partir del medio de cultivo celular.

Las células que se usan en el procedimiento de acuerdo con la invención se obtienen de sangre umbilical.

La expresión "factor de crecimiento" se refiere a una sustancia, por ejemplo, una proteína, que es capaz de inducir la proliferación y/o diferenciación de células de mamífero.

Una "población de células" indica una composición que comprende al menos dos células. La población generalmente comprende al menos 100 células, preferiblemente al menos 1000 células. Las células pueden ser homogéneas con respecto a la expresión de una proteína marcadora dada, también pueden ser heterogéneas con respecto a la expresión de otra proteína marcadora.

Como se usa en este documento, la expresión "célula endotelial" o "célula endotelial madura" indica una célula que expresa los marcadores VE-cadherina (CD144), CD146, CD31 y receptor LDL. Las "células endoteliales" o "células endoteliales maduras" pueden tener aún un potencial proliferativo significativo mayor que el de células endoteliales completamente diferenciadas.

Una "célula endotelial diferenciada" o "célula endotelial completamente diferenciada" se refiere a una célula endotelial que ha experimentado diferenciación terminal. Las células endoteliales diferenciadas por tanto tienen un potencial proliferativo muy limitado.

Una "célula precursora endotelial" (EPC) es una célula que puede diferenciarse en una célula endotelial madura. Una EPC habitualmente expresa CD34, AC133 y/o el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF1-R) y se caracteriza por su potencial proliferativo.

En una "población de células endoteliales" al menos el 10% de las células son células endoteliales, preferiblemente al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50%, mucho más preferiblemente al menos el 75%.

Como se usa en este documento, la expresión "células CD34-positivas" indica células que expresan la proteína marcadora de superficie CD34. La expresión de CD34 puede determinarse por análisis de inmunofluorescencia o análisis FACS usando un anticuerpo dirigido contra CD34.

Un "factor de coagulación sanguíneo" es una sustancia, por ejemplo, una proteína, que tiene la actividad coagulante de un componente de la vía intrínseca de la cascada de coagulación sanguínea. Los componente de la cascada de coagulación sanguínea incluyen, aunque sin limitación, el factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, VWF, y similares. "Factor VIII" indica una sustancia, por ejemplo, una proteína, que tiene la capacidad, cuando se administra a pacientes con hemofilia A, de corregir el defecto de coagulación. Como ejemplos no limitantes, esta definición incluye el factor VIII recombinante de longitud completa y el factor VIII con el dominio B delecionado. "Factor IX" indica una sustancia, por ejemplo, una proteína, que tiene la capacidad, cuando se administra a pacientes con hemofilia B, de corregir el defecto de coagulación.

El término "transducir" se refiere a un procedimiento en el que se transfiere ADN al interior de una célula. Pueden usarse vectores virales o no virales en este procedimiento. Las células son preferiblemente células humanas. El ADN puede integrarse o no en el genoma de la célula. Para la transducción, pueden usarse vectores que contienen una secuencia que codifica un polipéptido a expresar. Habitualmente se une de forma funcional un promotor a la secuencia codificante, es decir, el promotor está localizado dentro del vector de un modo que puede estimular la trascripción de la secuencia de ADN que codifica la proteína, por ejemplo, el factor de coagulación sanguínea.

La expresión "ADN recombinante" indica una molécula de ADN que se ha preparado uniendo fragmentos de ADN de diferentes fuentes. Dichas moléculas de ADN recombinante incluyen ADNc y clones genómicos. El ADN recombinante se ha creado por intervención humana. Las moléculas de ADN recombinante de acuerdo con la presente invención están en una forma adecuada para su uso dentro de sistemas de producción de proteínas diseñados por ingeniería genética. El ADN puede incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural tales como promotores y terminadores.

Las células precursoras endoteliales humanas se obtienen de sangre umbilical. Las células precursoras endoteliales pueden expresar al menos un marcador de superficie seleccionado entre el grupo que consiste en CD34, AC133, CD146 y FGF1-R. En una realización particular, las células precursoras endoteliales expresan al menos dos, como alternativa al menos tres, como alternativa al menos las cuatro proteínas marcadoras de superficie celular. Habitualmente, al menos el 10% de la población de células precursoras endoteliales son positivas para uno de los marcadores de superficie celular mencionados anteriormente, preferiblemente al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50%, incluso más preferiblemente al menos el 75%, mucho más preferiblemente al menos el 80%. Las células precursoras endoteliales pueden obtenerse por enriquecimiento de las células que son positivas para uno de los marcadores de superficie celular mencionados anteriormente. En una primera etapa, pueden aislarse las células mononucleares de la sangre umbilical por separación por densidad en Ficoll. Después de lavar las células mononucleares, pueden enriquecerse las células CD34-positivas o las células AC133-positivas o las células-CD146 o las células FGF1-R-positivas usando clasificación celular activada magnética. Después una primera etapa de enriquecimiento, puede realizarse una segunda etapa de enriquecimiento usando otra proteína marcadora de superficie celular como diana.

Pueden obtenerse células de médula ósea por aspiración, y pueden seleccionarse las células precursoras endoteliales adecuadas y amplificarse por procedimientos adecuados como se describe en este documento. Como alternativa, las células precursoras endoteliales humanas obtenidas de la sangre umbilical y la médula ósea pueden mezclarse.

Cuando las células CD34-positivas tienen que ponerse en contacto con al menos un factor de crecimiento, estas células pueden obtenerse por enriquecimiento de las células CD34-positivas a partir de la sangre umbilical humana. Las técnicas de enriquecimiento adecuadas son conocidas para los especialistas en la técnica. En una primera etapa, pueden aislarse las células mononucleares de la sangre por separación por densidad en Ficoll. Después de lavar las células mononucleares, pueden enriquecerse las células CD34-positivas usando clasificación celular activada magnética. Usando este procedimiento, puede enriquecerse la fracción de células CD34-positivas de menos del 2% en la fracción celular mononuclear a más del 80% en la fracción enriquecida. También puede contemplarse el aislamiento de las células CD34-positivas por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

En las células CD34-positivas que se ponen en contacto con al menos un factor de crecimiento, habitualmente al menos el 10% de las células son CD34-positivas, preferiblemente al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50%, incluso más preferiblemente al menos el 75%, mucho más preferiblemente al menos el 80%. En una realización preferida, la pureza de las células CD34-positivas está en el intervalo del 80% al 95%. Las poblaciones de células con purezas de células CD34-positivas en este intervalo pueden obtenerse enriqueciendo las células como se ha descrito anteriormente.

Las células pueden cultivarse en un medio apropiado en placas de cultivo tisular o matraces antes de ponerlas en contacto con el factor o factores de crecimiento para la diferenciación en células endoteliales.

De acuerdo con el procedimiento de la invención, las células precursoras endoteliales derivadas de sangre umbilical se ponen en contacto, in vitro, con al menos un factor de crecimiento, en el que el al menos un factor de crecimiento promueve la diferenciación de las células precursoras endoteliales en células endoteliales maduras. Si un factor de crecimiento promueve la diferenciación de las células precursoras endoteliales en células endoteliales maduras puede determinarse poniendo en contacto las células CD34-positivas derivadas de sangre umbilical con un factor de crecimiento y determinando si se expresa uno o más de los marcadores endoteliales CD144, CD146, CD31 y receptor LDL.

En una realización, las células se ponen en contacto con el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). En otra realización, puede combinarse VEGF con otro factor de crecimiento, por ejemplo, el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), el factor de células madre (SCF) o el factor de crecimiento de células madre β (SCGF-β). Las células precursoras endoteliales pueden ponerse en contacto con una de las siguientes combinaciones de factores de crecimiento: VEGF + bFGF; VEGF + SCF; VEGF + SCGF-β; VEGF + bFGF + SCF; VEGF + bFGF + SCGF-β; VEGF + SCF + SCGF-β. Más preferiblemente, las células precursoras endoteliales se ponen en contacto con los cuatro factores de crecimiento VEGF, bFGF, SCF y SCGF-β. Habitualmente, los factores de crecimiento se añaden al medio de cultivo celular. Preferiblemente, los factores de crecimiento son factores de crecimiento humanos. Los factores de crecimiento pueden producirse por expresión recombinante.

Las secuencias de aminoácidos y las secuencias de ADNc de VEGF humano, FGF básico humano, SCF humano y SCGF-β humano son conocidas (VEGF: Conn y col., Proc Natl Acad Sci, USA Abril 1990 87(7):2628-32; Tischer E. y col., J Biol Chem 1991 Junio 25, 266(18):11947-54; bFGF: Kurokawa T. y col., FEBS Lett. 9 Marzo 1987, 213(1):189-94; SCF: Martin F.H. y col., Cell 1990 Octubre 5, 63(1):203-11; SCGF-β: Hiraoka A. y col., Proc Natl Acad Sci, USA 1997 Julio 8, 94(14):7577-82; Bannwarth S. y col., J Biol Chem 1998 Enero 23, 273(4):1911-6.

Puede administrarse VEGF al medio de cultivo celular de las EPC a una concentración de 1 a 1000 ng/ml, preferiblemente de 10 a 200 ng/ml, más preferiblemente de 25 a 100 ng/ml, mucho más preferiblemente a aproximadamente 50 ng/ml. Habitualmente se añade FGF básico al medio a una concentración de 1 a 500 ng/ml, preferiblemente de 5 a 100 ng/ml, más preferiblemente de 10 a 50 ng/ml, mucho más preferiblemente a aproximadamente 20 ng/ml. Puede añadirse SCF a una concentración de 1 a 1000 ng/ml, preferiblemente de 10 a 200 ng/ml, más preferiblemente de 25 a 100 ng/ml, mucho más preferiblemente a aproximadamente 50 ng/ml. Puede añadirse SCGF-β al medio a una concentración de 1 a 500 ng/ml, preferiblemente de 5 a 100 ng/ml, más preferiblemente de 10 a 50 ng/ml, mucho más preferiblemente a aproximadamente 20 ng/ml.

Los factores de crecimiento pueden añadirse a las células simultánea o sucesivamente. El orden de adición puede variarse. Se prefiere, sin embargo, que los factores de crecimiento se añadan a las células simultáneamente.

En una realización de la invención, se añade al menos un factor de crecimiento adicional a las células cuando se induce la diferenciación en un fenotipo endotelial. Opcionalmente, se añaden al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro factores de crecimiento adicionales a las células para la inducción del fenotipo endotelial. Los ejemplos de factores de crecimiento adicionales incluyen, aunque sin limitación, el factor de crecimiento tipo insulina (IGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), y similares.

En otra realización, se añade al menos un inhibidor de la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) tal como Atorvastatina a las células para la inducción del fenotipo endotelial. El inhibidor de HMG-CoA (por ejemplo, Atorvastatina) puede añadirse en combinación con uno o más factores de crecimiento o citoquinas.

Las células pueden cultivarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Pueden cultivarse en placas o matraces revestidos con gelatina o colágeno a una densidad de, por ejemplo, 5x104 a 1x105 células/cm2. Las EPC se diferencian en células endoteliales (maduras) debido a la presencia de los factores de crecimiento.

Habitualmente, al menos el 10%, preferiblemente al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50%, incluso más preferiblemente al menos el 75%, mucho más preferiblemente al menos el 90% de las células en la población de células endoteliales expresan la proteína marcadora CD144. Habitualmente, al menos el 10%, preferiblemente al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50%, incluso más preferiblemente al menos el 75%, mucho más preferiblemente al menos el 90% de las células en la población de células endoteliales expresan la proteína

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marcadora CD146. Habitualmente, al menos el 10%, preferiblemente al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50%, incluso más preferiblemente al menos el 75%, mucho más preferiblemente al menos el 90% de las células en la población de células endoteliales expresan la proteína marcadora CD31. Habitualmente, al menos el 10%, preferiblemente al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50%, incluso más preferiblemente al menos el 75%, mucho más preferiblemente al menos el 90% de las células en la población de células endoteliales expresan la proteína marcadora receptor LDL. Las células endoteliales en la población de células preferiblemente son capaces de formar vasos en un ensayo de Matrigel como se describe en los ejemplos. En una realización preferida, la población de células endoteliales se caracteriza por una expresión sustancialmente uniforme de las moléculas marcadoras CD144 (VE-cadherina), CD146, CD31 y/o receptor LDL. Más preferiblemente, se expresan dos, tres, o todos de CD144, CD146, CD31 y receptor LDL de un modo sustancialmente uniforme. Las células endoteliales de la invención se caracterizan adicionalmente por la expresión de VWF, que se secreta. Cuando las células expresan el factor VIII, la proporción molar de VWF:FVIII en el sobrenadante puede variar entre 1:1 y 100:1. Además, las células pueden ser capaces de unirse a aglutinina de Ulex europaeus. Habitualmente, al menos el 10%, preferiblemente al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50%, incluso más preferiblemente al menos el 75%, mucho más preferiblemente al menos el 90% de las células en la población de células endoteliales expresan VWF. Habitualmente, al menos el 10%, preferiblemente al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50%, incluso más preferiblemente al menos el 75%, mucho más preferiblemente al menos el 90% de las células en la población de células endoteliales son capaces de unirse a aglutinina de Ulex europaeus.

Las células endoteliales de la invención preferiblemente no expresan las moléculas marcadoras CD45, CD14, CD133 y/o HLA-DR. Más preferiblemente, no se expresa ninguna de las cuatro moléculas marcadoras en las células de acuerdo con la invención. Una fracción de las células puede expresar el marcador CD34, por ejemplo, del 1 al 90%, preferiblemente de 5 al 50% de las células.

En una realización específica, menos del 90% de las células expresan KDR (= receptor-2 de VEGF = flk-1). Como alternativa, menos del 50% o menos del 25% o menos del 10% de las células expresan KDR. En otra realización, más del 90% de las células expresan KDR.

Pueden combinarse las diversas realizaciones que se refieren a la expresión de marcadores descritos supra.

En una etapa adicional, las células endoteliales se transducen con ADN que codifica una proteína terapéuticamente eficaz, por ejemplo, un factor de coagulación sanguínea. Los ejemplos de proteínas terapéuticamente eficaces incluyen, aunque sin limitación, 1. factores de coagulación sanguínea, 2. factores de crecimiento (por ejemplo, NEGF, FGF, SCF), 3. quimioquinas. El ADN puede codificar el factor VIII de coagulación sanguínea, el IX, o similares. Preferiblemente, el ADN codifica el factor VIII humano. El ADN puede codificar el factor VIII de tipo silvestre maduro o una muteína del mismo. La muteína del factor VIII puede ser una muteína que tiene mutaciones puntuales, una muteína que está truncada en su extremo C o N, y/o una muteína que carece parcial o completamente de su dominio B.

Los documentos US 6.346.513, WO 86/06101, WO 92/16557, y EP 0 123 945 describen deleciones de la secuencia que codifica el dominio B del factor VIII. Los documentos EP 1 233 064, US 2002/0165177 y US6.271.025 describen la inserción de intrones en el ADNc que codifica el factor VIII. El documento US 5.422.260 describe mutaciones puntuales en la secuencia de ADN que codifica el factor VIII. Las modificaciones en la secuencia de ADN codificante

o no codificante descritas en este documento pueden usarse de acuerdo con la presente invención. También pueden emplearse combinaciones de las modificaciones descritas. Los documentos US 6.228.620, US 5.789.203 y US

5.693.499 describen la co-expresión de ADN que codifica la cadena pesada y ADN que codifica la cadena ligera del factor VIII. Estas realizaciones también pueden usarse de acuerdo con la presente invención.

En una realización particular, la muteína del factor VIII tiene al menos una de las siguientes mutaciones (documento EP 1 136 553 A1):

-la valina en la posición 162 se reemplaza por otro resto aminoacídico neutro;

-la serina en la posición 2011 se reemplaza por otro resto aminoacídico hidrófilo;

-la valina en la posición 2223 se reemplaza por un resto aminoacídico ácido;

-el dominio-B entre las posiciones de la arginina 740 y el ácido glutámico 1640 se reemplaza por un péptido enlazador rico en arginina que comprende de 10 a 25, preferiblemente de 14 a 20 restos aminoacídicos.

Las posiciones se refieren a las secuencias de aminoácidos publicadas del factor VIII humano maduro (Toole y col., Nature 1984, 312(5992):342-7; Wood y col., Nature 1984, 312(5992):330-7; Gitschier y col., Nature 1984, 312(5992):326-30). La secuencia de aminoácidos del factor VIII humano se muestra en la figura 7 (SEC ID Nº 3). En otra realización, el ADN que codifica el factor VIII es un ADNc del factor VIII modificado, en el que se ha insertado al menos un intrón en al menos una localización del ADNc del factor VIII.

El ADN que codifica el factor VIII habitualmente es parte de un vector que se usa para transducir células. El vector puede comprender un promotor unido de forma funcional a la secuencia de ADN que codifica el factor de coagulación sanguínea. Se prefiere que el vector sea un vector viral, preferiblemente un vector retroviral, más preferiblemente un vector lentiviral. Más preferiblemente, el vector lentiviral es un vector basado en VIH-1. Además de VIH-1, pueden usarse vectores lentivirales basados en VIH-2, el virus de la inmunodeficiencia de simios, el virus de la anemia infecciosa equina, el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) y el virus visna. En otra realización, el vector que codifica el FVM puede ser un ADN plasmídico (por ejemplo, pcDNA3).

Las células endoteliales de la invención pueden crioconservarse y después descongelarse y devolverse a cultivo sin pérdida significativa de su capacidad de proliferar. Para crioconservar las células, las células en cultivo pueden desprenderse y resuspenderse en medio de crioconservación adecuado, por ejemplo, que contiene un agente de crioconservación tal como azúcar o azúcares, BSA, dimetil sulfóxido (DMSO), glicerol, ésteres de glicerol y similares.

De acuerdo con la presente invención, las células pueden congelarse y descongelarse antes de la transducción con el ADN o después de la transducción con el ADN. En otro aspecto de la invención, las células se transducen antes de diferenciarlas de EPC en células endoteliales maduras.

En una realización, las células endoteliales transducidas pueden expandirse en 4 a 10 órdenes de magnitud (104 a 1010 veces), preferiblemente en 5 a 9 órdenes de magnitud (105 a 109 veces). Esta etapa de expansión o proliferación puede realizarse después de completarse las etapas a) y b). La etapa de expansión se realiza preferiblemente in vitro.

Las células endoteliales descritas anteriormente son útiles en un procedimiento para la producción de un factor de coagulación sanguínea. El procedimiento comprende a) obtener una población de células endoteliales humanas por un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5; y opcionalmente generar una línea celular inmortalizada a partir de dicha población de células endoteliales humanas; b) cultivar dicha población de células endoteliales humanas o dicha línea celular en condiciones adecuadas; y c) aislar el factor de coagulación sanguínea a partir del medio de cultivo celular. La etapa de aislamiento puede comprender purificar el factor de coagulación sanguínea a partir del medio. Las etapas de purificación adicionales incluyen, aunque sin limitación, cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de intercambio aniónico, etc., y combinaciones de las mismas. Se describen protocolos de purificación detallados para factores de coagulación a partir de plasma sanguíneo humano, por ejemplo, en los documentos WO 93/15105, EP 0 813 597, WO 96/40883 y WO 96/15140/50. Pueden adaptarse a los requisitos necesarios para aislar los factores recombinantes VIII y IX. Para el factor IX se ha introducido un protocolo eficaz que contiene una etapa de precipitación con sulfato amínico seguido por DEAE y cromatografía de con resina tentáculo HIC así como cromatografía de afinidad por heparina (documento US 5.919.909). La cantidad y actividad de la proteína purificada durante y después del procedimiento de purificación pueden controlarse por ELISA y ensayos de coagulación.

Preferiblemente, el factor de coagulación sanguínea es el factor VIII humano. En este caso, el factor VIII puede purificarse en presencia de VWF. El VWF puede estar presente en el medio de cultivo celular y se usa preferiblemente en una cantidad de 1 a 100, más preferiblemente de 50 a 60 moles de VWF por mol de factor VIII.

En el caso de la producción de factor IX, el cultivo se realiza preferiblemente en presencia de vitamina K que puede estar presente en una cantidad de 0,1 a 100 µg/ml de caldo de cultivo, mas preferiblemente de 1 a 20 µg/ml de caldo de cultivo.

Una composición obtenida por el procedimiento para la producción de una proteína, por ejemplo, un factor de coagulación sanguíneo, puede someterse a tratamiento de inactivación viral. Un tratamiento de inactivación viral incluye tratamiento con calor (en seco o en estado líquido, con o sin la adición de sustancias químicas incluyendo inhibidores de proteasa). Después de la inactivación del virus, puede ser necesaria una etapa adicional de purificación para retirar las sustancias químicas. En particular, para el factor VIII aislado de plasma sanguíneo, se describió la recuperación de una proteína inactivada por virus de alta pureza por cromatografía de intercambio aniónico (documento WO 93/15105). Se han presentado varios procedimientos adicionales para la producción de factores de coagulación no infecciosos de alta pureza a partir de plasma sanguíneo u otras fuentes biológicas. Los virus revestidos de lípido se inactivan de forma eficaz tratando el material potencialmente infeccioso con una fase hidrófoba que forma un sistema de dos fases, a partir del cual posteriormente se retira la parte insoluble en agua. Se ha demostrado que una ventaja adicional es complementar el tratamiento de fase hidrófoba simultánea o secuencialmente con un tratamiento con detergentes biocompatibles no iónicos y dialquil o trialquil fosfatos (documentos WO 96/36369, EP 0 131 740, US 6.007.979). Los virus no revestidos con lípido requieren protocolos de inactivación que constan de tratamiento con detergentes no iónicos seguidos por una etapa de calentamiento (6065ºC) durante varias horas (documento WO 94/17834).

Una composición farmacéutica que comprenda una cantidad eficaz de la proteína aislada, por ejemplo, el factor de coagulación, puede comprender adicionalmente aditivos farmacéuticamente aceptables incluyendo albúmina sérica humana (HSA; preferiblemente en solución de aproximadamente 1 mg/ml); sales inorgánicas tales como CaCl2 (preferiblemente de 2 a 5 mM), aminoácidos tales como glicina, lisina, e histidina (preferiblemente de 0,1 a 1 M por aminoácido); disacáridos tales como sacarosa y/o trehalosa (preferiblemente de 0,4 a 1 M); sales orgánicas tales como citrato de Na (preferiblemente hasta 50 mM); etc. Las preparaciones pueden ser acuosas o no acuosas. En el último caso, el componente mayoritario es glicerol y/o polietilenglicol (por ejemplo, PEG-300). La preparación también puede estar en forma seca (a disolverse en el disolvente deseado antes de la administración).

Otro aspecto de la invención es el uso de una población de células endoteliales humanas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la hemofilia A o B, en el que dicho uso comprende obtener dicha población de células endoteliales humanas por un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5. Las células que expresan el factor VIII pueden usarse en un protocolo de terapia génica ex vivo para la hemofilia A. las células endoteliales transducidas que expresan el factor VIII o IX pueden transferirse a un individuo que padece hemofilia A o B. Los procedimientos de transferencia incluyen, aunque sin limitación, el transplante de vasos sintéticos o válvulas protésicas revestidas con células transducidas o el transplante de un dispositivo o matriz diseñado para albergar células endoteliales transducidas. Las células también pueden introducirse en el torrente sanguíneo de un paciente por medios convencionales tales como infusión intravenosa durante un periodo de tiempo.

En este documento se describe adicionalmente el uso de una población de células de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos del sistema cardiovascular. Estos trastornos incluyen, aunque sin limitación, fallo cardiaco, enfermedad cardiaca aguda y crónica. De acuerdo con este aspecto, las células preferiblemente proporcionan un depósito de células autólogas para la síntesis ectópica y secreción de cualquier proteína con efectos sistémicos a través de la circulación. Un aspecto particular es la revascularización en enfermedad cardiaca aguda y crónica.

Habitualmente, las células que se pueden obtener de acuerdo con la invención muestran un efecto terapéutico mejor, ya que pueden integrarse en el tejido afectado de un modo mejorado. El direccionamiento de estas células también puede mejorarse significativamente.

Las células que se pueden obtener de acuerdo con la invención pueden expandirse en 4 a 10 órdenes de magnitud, preferiblemente en 5 a 9 órdenes de magnitud y tienen la capacidad de secretar una proteína, por ejemplo, el factor VIII, después de la transducción lentiviral. Por lo tanto, las células endoteliales preparadas de acuerdo con la presente invención pueden usarse en terapia génica de la hemofilia A. En una realización específica, la expansión de las células está limitada. Por consiguiente, las células endoteliales pueden dejar de proliferar en 15 semanas, preferiblemente en 12 semanas, opcionalmente en 8 ó 9 semanas, a partir de la adición de al menos un factor de crecimiento para la diferenciación en células endoteliales. Se prefieren células con potencial de proliferación limitado para su uso en un protocolo de terapia génica.

Las células endoteliales preparadas de acuerdo con la presente invención expresan altos niveles de factor VIII. La cantidad de factor VIII secretado por las células es de al menos 2,5 UI/106 células/48 h, preferiblemente al menos 5 UI/106 células/48 h, mucho más preferiblemente al menos 7 UI/106 células/48 h.

En este documento se describe adicionalmente un procedimiento para preparar una línea celular inmortalizada a partir de la población de células endoteliales descritas en este documento. El procedimiento incluye la transformación de las células endoteliales. Las células pueden convertirse en una línea celular inmortalizada por infección viral y/o no viral (por ejemplo, virus del papiloma humano, virus Epstein-Barr, plásmidos de ADN), transferencia de genes que codifican proteínas sometidas a la telomerosa humana tal como la transcriptasa inversa de telomerasa (hTERT) o de uno o más oncogenes.

Esta realización es preferida para la producción in vitro y el posterior aislamiento del factor de coagulación sanguínea, por ejemplo, FVIII.

Fig. 1. Curvas de crecimiento cumulativo de células endoteliales. En los experimentos representativos mostrados aquí, se cultivaron aproximadamente 106 células CD34-positivas a partir de sangre umbilical obtenida de dos combinaciones de donantes en EDM sobre placas revestidas de gelatina. Las células adherentes después se pasaron y se cultivaron en EGM-2 hasta la senescencia. El gráfico definido por los cuadrados negros (WT; ■) da la cantidad de células endoteliales representada frente al tiempo después del primer pase. En el día 37 (A) y 23 (B), respectivamente, se sembraron 104 células para la transducción 48 horas después con la construcción cPPT-C (FVIIIΔB)IGWS (abreviado como C(F8)IGWS; círculos vacíos; o) y pHR'SIN.cPPT-SEW (abreviado como SEW; triángulos vacíos; Δ). Estas células también se mantuvieron en EGM-2 hasta que dejaron de proliferar.

Fig. 2. Morfología y caracterización fenotípica de CBEC (células endoteliales derivadas de sangre umbilical). Se analizaron las CBEC de cuatro lotes diferentes para la captación de Dil-Ac-LDL y la expresión de marcadores de superficie celular por citometría de flujo en diversos momentos puntuales durante el cultivo. El eje x da la intensidad de fluorescencia de las células analizadas. Las células que se marcaron con Dil-Ac-LDL o anticuerpos se representan por las líneas gruesas, mientras que las líneas delgadas representan los controles negativos apropiados. Los paneles muestran que las CBEC eran uniformemente positivas para la captación de Dil-Ac-LDL y para los marcadores endoteliales VE-cadherina, CD146 y CD31. Subconjuntos de células expresaban CD34 y, aunque muy débilmente, KDR. Todas las CBEC fueron negativas para CD133, HLA-DR, CD45 y CD14.

Fig. 3. Transducción lentiviral de células endoteliales. En cuatro experimentos independientes, se transdujeron CBEC a números de pase de tres a ocho con las construcciones lentivirales pHR'SIN.cPPT-SEW (abreviado como SEW) y cPPT-C(FVIIIΔB)IGWS (abreviado como C(F8)IGWS). (A) Las transducciones se realizaron con las construcciones a MOl de 10 y 100 para cada vector, y las eficacias de transducción se determinaron por análisis de la expresión de EGFP con células no transducidas como controles negativos. En (B), el histograma ilustra el nivel de expresión de EGFP detectado por FACS. El diagrama muestra el resultado de un ejemplo representativo de cuatro experimentos. El análisis FACS se realizó 30 días después de la transducción con C(F8)IGWS (MOI 10; área negra bajo la curva) y con SEW (MOI 10; área gris bajo la curva). Las células no transducidas sirvieron como controles negativos (área blanca bajo la curva).

Fig. 4. Fenotipo de CBEC transducidas: Incorporación de Dil-Ac-LDL y formación de tubos in vitro. (A y B) Cinco semanas después de la transducción con pHR'SIN.cPPT-SEW (MOI 100), las células se incubaron con Dil-Ac-LDL durante una hora y se examinaron para la expresión de EGFP (A) y la captación de Dil-Ac-LDL (B) por microscopía de fluorescencia. (C y D) Para el ensayo de formación de vasos, las CBEC se desprendieron por tratamiento con tripsina/EDTA y se sembraron en una matriz de membrana basal Matrigel®. Las células se incubaron a 37ºC durante 8 a 10 horas y se examinaron microscópicamente para la formación de vasos angiogénicos (C: contraste de fase; D: expresión de EGFP).

Fig. 5. Cuantificación de FVIII:C en sobrenadantes de CBEC. Se transdujeron CBEC de tres combinaciones de donantes con la construcción codificante de BDD FBI cPPT-C(FVIIIΔB)IGWS a la MOI de 10. Para cuantificar la secreción de FVIII:C en diversos momentos puntuales después de la transducción, se sembraron 5x104 células en 1 ml de EGM-2 y se incubaron a 37ºC. Después de 48 horas, se recogió el sobrenadante, se aclararon los desechos celulares por una corta centrifugación y se almacenaron a -80ºC hasta el análisis. Cada ensayo incluía sobrenadantes de células transducidas con pHR'SIN.cPPT-SEW y de células no transducidas. No pudo detectarse FVIII:C en ninguno de estos controles (límite de detección 0,01 UI/ml).

Fig. 6. Detección de la proteína FVIII en sobrenadantes de CBEC concentrados por inmunotransferencia. Se concentraron sobrenadantes de cultivo sin suero de CBEC no transducidas y de CBEC que se transdujeron con cPPT-C(FVIIIΔB)IGWS de 200 a 400 veces por ultrafiltración. Las muestras se separaron por SDS-PAGE y se sometieron a inmunotransferencia. Los carriles 1 y 2 muestran concentrados de FVIII disponibles en el mercado como referencia. Los carrilles 3 y 4 contienen sobrenadante concentrado de CBEC. Para detectar señales de diversas intensidades, la película de autorradiografía se expuso durante diferentes periodos de tiempo (1a-4a: un minuto; 1b-4b: 20 minutos). Carril 1: Oct, Octanate® (FVIII de longitud completa derivado de plasma); carril 2: ReF, ReFacto® (BDD FVIII recombinante); carril 3: sobrenadante de CBEC transducidas con cPPT-C(FVIIIΔB)IGWS (BDD FVIII); carril 4: sobrenadante de CBEC no transducidas.

La Fig. 7 muestra la secuencia de aminoácidos del factor VIII humano (los aminoácidos 20-2351 corresponden al factor VIII maduro).

Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran adicionalmente la invención.

1. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Aislamiento de células CD34-positivas a partir de sangre umbilical

Se aislaron células mononucleares por separación por densidad en Ficoll (d=1,077 g/ ml) a partir de sangre umbilical de donantes sanos y contenían menos del 2% de células CD34+ según se determinó por tinción con inmunofluorescencia y análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Las células se lavaron dos veces en PBS de Dulbecco (BioWhittaker, Verviers, Bélgica) que contenía EDTA 2 mM (Sigma, Taufkirchen, Alemania) y albúmina sérica humana al 0,5% (HSA; DRK-Blutspendedienst Niedersachsen, Springe, Alemania), y se enriquecieron las células CD34-positivas por clasificación celular activada magnética (MACS) usando el kit de aislamiento directo de células progenitoras CD34 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La pureza de las células CD34+ estaba en el intervalo del 80% al 95%.

Diferenciación de células endoteliales

Las células CD34+ se resuspendieron en medio de diferenciación endotelial que consta de medio de lscove basal al 80% (Biochrom, Berlin, Alemania), suero de caballo al 10% (PAN Biotech, Aidenbach, Alemania; lotes seleccionados), suero de ternera fetal inactivado por calor al 10% (FCS; Biochrom, lotes seleccionados), L-alanil-Lglutamina (concentración final 2 mM; BioWhittaker) y penicilina-estreptomicina (concentraciones finales 100 U/ ml y 100 µg/ml, respectivamente; BioWhittaker). El medio se filtró (tamaño de poro 0,22 µm) y después se suplementó con VEGF humano recombinante (rh) (factor de crecimiento del endotelio vascular; 50 ng/ml), FGF básico rh (factor de crecimiento de fibroblastos-2; 20 ng/ml), SCF rh (factor de células madre; 50 ng/ml; todos de R&D Systems, Wiesbaden, Alemania), y SCF-rh (factor de crecimiento de células madre β; 20 ng/ml; PeproTech, Frankfurt am Main, Alemania). Este medio que incluye los factores de crecimiento se mencionará como medio de diferenciación endotelial (EDM).

Las células CD34+ se cultivaron en placas de 6 pocillos tratadas con cultivo tisular revestidas con solución de gelatina al 1% (Sigma) a 5x104-1x105 células/cm2 en 3 ml por pocillo a 37ºC con CO2 al 5% en una atmósfera humidificada. Si la producción celular de un donante era inferior a 5x105, las células se cultivaban en placas de 24 pocillos, o se combinaban las células de diferentes donantes. Se intercambió la mitad del medio dos veces a la semana, y las células se incubaron hasta que los pocillos fueron un 80%-90% confluyentes con células adherentes (habitualmente hasta tres semanas).

Las células adherentes se desprendieron por tratamiento con tripsina/EDTA y después se cultivaron en matraces de cultivo tisular revestidos con gelatina en medio EGM-2 (medio basal de células endoteliales (EBM)-2 suplementado con FCS al 2%, VEGF, EGF rh (factor de crecimiento epidérmico), FGF básico rh, R3-IGF-1 (factor de crecimiento tipo insulina), hidrocortisona, ácido ascórbico, heparina, gentamicina, y anfotericina B; Clonetics/BioWhittaker, Verviers, Bélgica). Las células pudieron expandirse de forma más eficaz cuando crecieron a baja densidad (1 x 103/cm2).

Inmunofluorescencia

Se prepararon aproximadamente 105 células para la citometría de flujo lavando con PBS que contenía FCS al 1% (Biochrom) y azida sódica al 0,1% (Sigma). Para caracterizar la expresión de los marcadores de superficie celular hematopoyéticos y endoteliales, se usaron los siguientes anticuerpos monoclonales (mAb): anti-CD14-PE, antiCD34-PE, anti-CD45-FITC, anti-HLA-DR-FITC (todos de BD Biosciences, Heidelberg, Alemania), anti-CD133-PE (Miltenyi Biotec), anti-CD146, anti-CD146-FITC, anti-VE-cadherina (todos de Chemicon, Temecula, CA), anti-34-PC5 (Immunotech, Marseille, Francia), anti-CD31-FITC y anti-KDR (ambos de Sigma). Las células se incubaron con el mAb respectivo durante 20 minutos a 20ºC (anti-CD31-FITC, anti-KDR) o a 4ºC (todos los demás). En una segunda etapa, se detectaron los mAb primarios sin conjugar por incubación con el fragmento F(ab')2 de inmunoglobulina de conejo anti-ratón conjugado con RPE (Dako, Glostrup, Dinamarca). Las muestras de células también se tiñeron con anticuerpos de control de isotipo coincidente (adquiridos en BD Biosciences e Immunotech). Los análisis FACS se realizaron usando un citómetro de flujo FACScan (BD Biosciences) y el software Cell Quest (BD Biosciences). Cada análisis incluyó al menos 10.000 acontecimientos. Las células muertas se excluyeron en base a sus propiedades de dispersión directa y dispersión lateral.

Marcaje con Dil-Ac-LDL

El marcaje fluorescente de las células endoteliales por captación de lipoproteína de baja densidad acetilada (Ac-LDL) se realizó incubando las células con 2 µg/ml de Dil-Ac-LDL (Harbor Bio-Products, Norwood, MA) en EGM-2 durante 60 minutos a 37ºC. Después, el medio se intercambió por EGM-2, y se analizó la captación de Dil-Ac-LDL de las células por microscopía de fluorescencia (Nikon Eclipse TE300) y citometría de flujo.

Construcciones lentivirales

Se usaron dos construcciones de transferencia génica lentivirales de auto-inactivación derivados de VIH-1 en este ejemplo: El vector pHR'SIN.cPPT-SEW (Demaison y col., 2002) contiene un casete de expresión génica que consta de la región potenciadora del virus formador de foco esplénico (U3-LTR), el ADNc de la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) y el elemento regulador post-transcripcional del virus de la hepatitis Woodchuck (WPRE).

Para generar el vector cPPT-C(FVIIIAB)IGWS, se requieren tres etapas de clonación. Primero, se modificó el vector de auto-inactivación monocistrónico basado en VIH-1 pRRL-CMV-GFP-WPRE-SIN (CGWS, derivado de los vectores pRRL-PGK-GFP-SIN-18 y pHR'-CMV-lacZ-SIN-18 proporcionados amablemente por R. Zufferey, Geneva, Suiza) que codifica el gen EGFP como gen marcador flanqueado 5' por un promotor CMV interno y 3' por la secuencia WPRE, por inserción de un sitio de clonación múltiple (MCS) y el sitio interno de entrada del ribosoma (IRES) del virus de la encefalomiocarditis (ECMV; MCS y IRES de pIRES2-EGFP, Clontech, Heidelberg, Alemania). En una segunda etapa, se clonó el tramo de polipurina central y la secuencia de terminación central (cPPT/CTS; Chameau y col., 1992; Zennou y col., 2000; Sirven y col., 2000; Follenzi y col., 2000) de VIH-1 en el sitio ClaI 5' del promotor CMV interno. El fragmento cPPT/CTS flanqueado por los sitios de restricción ClaI se obtuvo por reacción en cadena la polimerasa (PCR) usando los oligonucleótidos PPTCTSCLA-5: 5'-CCA TCG ATA CAA ATG GCA TTC ATC C-3' (SEC ID Nº 1) y PPTCTSCLA-3: 5'-CCA TCG ATC TCG AGC CAA AGT GGA TCT CTG CTG TCC-3' (SEC ID Nº 2) con un plásmido que contenía el ADNc gag-pol de VIH-1 LAI (Myers y col., 1989) como molde. Finalmente, el ADNc para el FVIII humano con el dominio B delecionado (huBDD FVIII; deleción como se describe en Tonn y col., 2002) se clonó en el sitio SalI del MCS entre el promotor CMV y el IRES para producir el vector bicistrónico cPPT-C(FVIIIΔB)IGWS.

Producción de sobrenadantes lentivirales

Para generar partículas lentivirales, el ADN del vector de transferencia génica se introdujo de forma transitoria en células 293T (cultivadas como se describe en Tonn y col., 2002) por triple co-transfección con la construcción de empaquetado pCMVAR8.91 (Zufferey y col., 1997) que codifica gag, pol, rev, y tat y la construcción de pseudotipado pMD2.VSVG (Follenzi y Naldini, 2002) que codifica la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G).

La transfección del ADN plasmídico se realizó por co-precipitación con fosfato cálcico. Dieciséis horas después de la transfección, a las células se les dio medio fresco (DMEM [Gibco, Karlsruhe, Alemania] suplementado con FCS inactivado por calor al 10%, L-glutamina 4 mM, y penicilina-estreptomicina a 100 U/ml y 100 µg/ml, respectivamente). Después de 24 horas adicionales, se recogió el sobrenadante viral, se filtró (tamaño de poro 0,22 µm), se concentró por ultracentrifugación y se filtró de nuevo. Los títulos de virus se determinaron como unidades de transducción de 293T (UT/ml) por transducción de células 293T con diluciones de concentrado del vector y posterior análisis FACS. Las soluciones madre concentradas de vector de las construcciones pHR'SIN.cPPT-SEW y cPPT-C(FVIIIAB)IGWS tuvieron títulos entre 108 y 109 y entre 107 y 108 UT/ml, respectivamente.

Transducción de células endoteliales

Las células endoteliales se sembraron en placas de 6 pocillos revestidas de gelatina a 1 x 104 células por pocillo en EGM-2 y se incubaron a 37ºC durante 48 horas. Para la transducción, se intercambió el medio por sobrenadante viral no concentrado o concentrado en EGM-2 en presencia de 4 µg/ml de sulfato de protamina (Sigma) y dNTP 50 µM (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Alemania). Después de la espinoculación (1250 g, 90 minutos, 32ºC), las células se incubaron durante 16 horas adicionales a 37ºC. Después, el sobrenadante del virus se retiró y se dio a las células EGM-2 fresco. Las multiplicidades de infección (MOI) se calcularon como las proporciones de UT de 293T/ml a las células diana. La expresión de EGFP se analizó por análisis FACS y microscopía de fluorescencia en diversos momentos puntuales.

Cuantificación de FVIII

Para evaluar la cantidad de FVIII secretado, las células endoteliales transducidas y las células de control no transducidas se sembraron a 5 x 104 células en un volumen total de 1 ml de EGM-2 en placas de 12 pocillos revestidos de gelatina. Después de 48 horas, los sobrenadantes se aclararon de los desechos celulares por centrifugación (700 g, 3 minutos, 4ºC) y se almacenaron en múltiples alícuotas a -80ºC hasta el análisis. El antígeno FVIII (FVIII:Ag) y la actividad FVIII (FVIII:C) se determinaron con el ELISA Immunozym FVIII:Ag y el ensayo cromogénico Immunochrom FVIII:C disponibles en el mercado, respectivamente (Immuno, Heidelberg, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de FVIII se dan como unidades internacionales (UI)/ml correspondiendo 150 ng/ml a 1,0 UI/ml. Los patrones de FVIII en ambos ensayos estaban calibrados frente a patrones de plasma WHO por el fabricante.

Transferencia de Western de FVIII

Se lavaron capas confluyentes de células endoteliales con PBS y se cultivaron con EGM-2 sin FCS durante 15-24 horas. Los sobrenadantes de cultivo se filtraron (0,22 µm) para retirar los desechos celulares y se concentraron hasta 400 veces por ultracentrifugación en concentradores Vivaspin 20 (Sartorius, Göttingen, Alemania) con un punto de corte de peso molecular (MWCO) de 30 kDa. Los concentrados se hirvieron durante 5 minutos en tampón de Laemmli (RotiLoad 1; Roth, Karlsruhe, Alemania), se separaron por SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 10% y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilidino (Roth). Las membranas se bloquearon durante 3 horas a 20ºC en leche desnatada en polvo al 5% y se incubaron a 4ºC durante 15-20 horas con anticuerpo policlonal de oveja anti-factor VIII:C humano (Enzyme research Laboratories, Swansea, UK). Después de lavado extensivo, las transferencias se incubaron con un anticuerpo secundario de burro anti-IgG de oveja conjugado con peroxidasa (Sigma) durante 40 minutos a temperatura ambiente. Después de lavado adicional, las proteínas se visualizaron por quimioluminiscencia potenciada (Pierce, Bonn, Alemania). Como controles positivos, se usaron FVIII recombinante con el dominio B delecionado ReFacto® (Pharmacia & Upjohn, Martinsried, Alemania) y FVIII humano derivado de plasma (Octanate®; proporcionado amablemente por Lothar Biesert, Octapharma, Frankfurt am Main, Alemania).

Ensayo de Matrigel in vitro

Se revistieron placas de 24 pocillo pre-enfriadas con 500 µl de matriz de membrana basal Matrigel® (BD Biosciences) por pocillo y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Las células endoteliales se recogieron por tratamiento con tripsina/EDTA, se resuspendieron en EGM-2, y se sembraron en la parte superior del Matrigel® gelificado a entre 6 x 104 y 1 x 105 células en 400 µl. Los cultivos se incubaron a 37ºC. Después de 8 a 10 horas, los cultivos se comprobaron para la formación de vasos por contraste de fase y microscopía de fluorescencia (Nikon Eclipse TE300).

Análisis estadístico

Los datos se presentan como las medias ± DT. Se usó en ensayo t de Student apareado para comparar las eficacias de transducción y los niveles de secreción de FVIII de las células transducidas a diferentes multiplicidades de infección (MOI). El análisis estadístico se realizó usando el software GraphPad Prism 3.0.

2. RESULTADOS

Diferenciación y cultivo de células endoteliales derivadas de sangre umbilical (CBEC)

Después del aislamiento de las células mononucleares de sangre umbilical, se obtuvieron fracciones de células CD34+ con una pureza del 80% al 95% usando perlas inmunomagnéticas MACS. Se cultivaron células de donantes individuales o combinaciones celulares de varios donantes en EDM que contenía VEGF rh, FGF básico rh, SCF rh y SCGF-β rh (véase Materiales y Procedimientos) durante aproximadamente tres semanas. Cuando pudieron detectarse células adherentes proliferantes con morfología endotelial, se pasaron antes de alcanzar la confluencia. Con un aporte de 105 a 107 células CD34+, las células adherentes pudieron expandirse hasta 109 veces durante un tiempo de cultivo total de ocho semanas. La Fig. 1 muestra las curvas de crecimiento cumulativo de dos experimentos representativos con células de las combinaciones donantes (indicados como 'WT'). En este ejemplo, las células proliferaron con un tiempo de duplicación de aproximadamente 30-35 horas y se expandieron hasta más de 108 veces antes de dejar de crecer y el cultivo se volviera senescente.

Los cultivos con células mononucleares de CB antes del aislamiento CD34 y con la fracción de CD34 agotado o no produjeron ninguna diferenciación EC detectable en condiciones por lo demás idénticas o produjeron una cantidad celular considerablemente inferior. Por lo tanto, se prefiere el enriquecimiento de células que expresan CD34. Los datos sugieren que las EC derivaron de células progenitoras CD34+.

Caracterización fenotípica de CBEC

Las células adherentes crecieron en forma de monocapas de células planas con forma de huso (Fig. 2). Las células eran capaces de incorporar Dil-Ac-LDL que se detectó por microscopía de fluorescencia y citometría de flujo (Fig. 2) y mostraron formación de túbulos en el ensayo de Matrigel (véase a continuación). Las células se caracterizaron adicionalmente por citometría de flujo con respecto a la expresión de diversos marcadores de superficie endoteliales y hematopoyéticos y se descubrió que eran uniformemente positivas para VE-cadherina (CD144), CD146 y CD31, que son típicos de células endoteliales. Las células eran uniformemente negativas para los marcadores hematopoyéticos CD45, CD14, CD133 y HLA-DR (Fig. 2). El análisis FACS de cinco lotes de EC demostró que las células obtenidas con este protocolo eran heterogéneas con respecto a la expresión de CD34 y KDR/VEGF-R2 (Fig. 2). La expresión de CD34 se detectó en un subconjunto del 5-45% de las células, mientras que KDR se expresaba débilmente por menos del 5% de las CBEC. La expresión de los marcadores de superficie celular mencionados anteriormente parece ser inalterable durante toda la expansión celular.

Los datos respecto a la expresión de VE-cadherina, CD146, CD31, CD45, CD34 y KDR se confirmaron por análisis inmunohistoquímico (IHC). Además, la expresión del marcador endotelial factor de von Willebrand (vWF) y la unión de aglutinina de Ulex europaeus pudieron demostrarse por IHC.

Eficacia de transducción

Para observar si las CBEC pueden transducirse de forma eficaz con vectores lentivirales, se transdujeron las CBEC de cuatro combinaciones diferentes de donantes en una primera serie de experimentos con las construcciones pHR'SIN.cPPT-SEW que codifica EGFP y cPPT-C(FVIIIΔB)IGWS que codifica huBDD FVIII y EGFP a números de pase de tres a ocho y a multiplicidades de infección (MOI) de 10 y 100. La eficacia de transducción se determinó por detección de células EGFP-positivas a al menos dos momentos puntuales diferentes y no antes de ocho días después de la transducción.

Para la transducción de EC, MOI de 10 produjeron eficacias de transducción del 88,2% ± 7,6% (intervalo del 80,3%95,6%) y 76,9% ± 5,0% (intervalo del 73,1%-84,2%) con pHR'SIN.cPPT-SEW y cPPT-C(FVIIIOB)IGWS, respectivamente (Fig. 3A). Cuando las MOI se elevaron hasta 100, no hubo aumento estadísticamente significativo en las eficacias de transducción (90,4% ± 9,5% y 90,6% ± 9,7%, p>0,05 para ambos vectores; Fig. 3A).

El porcentaje de células que expresan EGFP así como el nivel de expresión de EGFP permanecieron relativamente inalterados durante el periodo de cultivo. La Fig. 3B muestra la expresión de EGFP de células transducidas frente a no transducidas 30 días después de la transducción con MOI de 10 en un experimento representativo.

Influencia de la transducción lentiviral sobre el fenotipo celular y la proliferación celular

Se observó algo de toxicidad mediada por el vector en las EC transducidas, que fue evidente debido a la muerte celular durante/después de la transducción (en particular con la mayor MOI) y una fase lag antes de que las células vuelvan a la velocidad de proliferación de las células de control no transducidas como se muestra en la Fig. 1. Por tanto, se quiso investigar si esto estaba acompañado por alteraciones del fenotipo celular entre las células transducidas y las células de control. Las células se analizaron varias semanas después de la transducción para la expresión de CD146, CD34, KDR, y CD133 por citometría de flujo y para la capacidad de incorporar Dil-Ac-LDL. La expresión de los marcadores de superficie celular mencionados anteriormente estaba inalterada en comparación con las células no transducidas, así como la captación de Dil-Ac-LDL (Fig. 4A y B). Además, las CBEC retenían su capacidad de formar vasos en el ensayo de Matrigel (Fig. 4C y D), lo que es característico de EC maduras y funcionales.

Cuantificación de la secreción de FVIII por ensayo cromogénico y ELISA

Se investigó la capacidad de las CBEC de expresar huBDD FVIII en siete experimentos independientes. Las células se transdujeron con la construcción lentiviral cPPT-C(FVIIIAB)IGWS que codifica huBDD FVIII y EGFP y se cultivaron como se ha descrito anteriormente hasta la senescencia. La secreción de FVIII se cuantificó a diversos momentos puntuales sembrando 5x104 células en 1 ml de EGM-2 en placas de 12 pocillos y recogiendo los sobrenadantes de cultivo celular después de 48 horas. Se almacenaron alícuotas a -80ºC hasta el análisis usando un ensayo cromogénico y un ELISA con un anticuerpo monoclonal contra la cadena ligera como anticuerpo de detección. Las células se mantuvieron desde la transducción hasta que dejaron de proliferar.

5

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50

Los niveles de FVIII:C medidos por ensayo cromogénico fueron relativamente constantes hasta la senescencia. Durante las primeras cuatro semanas después de la transducción de las células a partir de tres combinaciones de donantes, los niveles medios de FVIII:C fueron de 0,35-0,39 UI/5x104 células/48 h a una MOI de 10 que corresponde con 7,0-7,8 UI/106 células/48 h (Fig. 5). La secreción de FVIII:C después disminuyó en todos los cultivos, lo que estuvo acompañado por una proliferación reducida y finalmente senescencia. En una segunda serie de experimentos, se investigó la influencia de la MOI sobre la secreción de FVIII. Elevar la MOI de 10 a 100 conduce solamente a un ligero aumento en la secreción de FVIII:C, que no era estadísticamente significativo (p>0,05, n=4). Las células que se transdujeron con la construcción de control pHR'SIN.cPPT-SEW y las células no transducidas no secretaron cantidades detectables de FVIII:C (ambos <0,01 UI/5x104 células/48 h; n=7).

La determinación de los niveles de FVIII:Ag en los mismos sobrenadantes de EC produjo concentraciones de FVIII:Ag ligeramente mayores con 0,45-0,66 UI/5x104 células/48 h a una MOI de 10 en comparación con FVIII:C (n=3). Esto produjo proporciones medias de FVIII:C/FVIII:Ag de 0,54-0,83 (n=3; Tabla 1). En un experimento de control, se transdujeron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) con el mismo vector codificante de huBDD FVIII. En seis sobrenadantes, se descubrió que la proporción de FVIII:C/FVIII:Ag era de 0,91 ± 0,23. Esta última proporción no difiere de las proporciones que son características de varias líneas celulares hematopoyéticas transducidas con un vector codificante de FVIII que contenía el mismo casete transgénico (Tonn y col., 2002).

Tabla 1. Actividad específica de BDD FVIII recombinante en diferentes tipos celulares humanos. Se transdujeron líneas celulares hematopoyéticas, HUVEC y CBEC (células endoteliales derivadas de sangre umbilical) con vectores lentivirales que contenían el mismo casete de expresión de FVIII. La actividad específica se calculó como la proporción entre FVIII:Ag y FVIII:C en el sobrenadante de estas células y se da como los valores medios de al menos tres experimentos.

Tipo celular transducido

Proporción media de FVIII:C/FVIII:Ag

CBEC (células endoteliales derivadas de sangre umbilical CD34+)

0,54-0,83

HUVEC

0,91

Líneas celulares hematopoyéticas (Tonn y col., 2002)

0,85-1,02

Caracterización de FVIII secretado por análisis de transferencia de Western

Para confirmar la suposición de que las EC secretan FVIII procoagulante correctamente procesado y por tanto activo, se enriqueció FVIII a partir de los sobrenadantes de cultivo celular por ultrafiltración usando concentradores Vivaspin con un punto de corte de peso molecular de 30 kDa. Como el contenido de suero del EGM-2 no permitía una concentración eficaz, las EC se cultivaron durante una noche sin suero. Las muestras se concentraron hasta 400 veces y se analizaron por ELISA, transferencia de Western de FVIII y ensayo cromogénico.

Los sobrenadantes concentrados de EC transducidas con cPPT-C(FVIIIAB)IGWS y de células no transducidas se sometieron a SDS-PAGE e inmunotransferencia. Como referencia, se usaron FVIII derivado de plasma (Octanate®) y FVIII recombinante con el dominio B delecionado (ReFacto®). Octanate® consta de un doblete de cadena ligeras de aproximadamente 80 kDa y cadenas pesadas de diversos tamaños debido a las diferentes etapas proteolíticas implicadas en el dominio B in vivo. ReFacto® está compuesto por un doblete de 80 kDa de cadenas ligeras y una cadena pesada de 90 kDa. La deleción del dominio B usada para expresar ReFacto® es casi idéntica a la deleción en el vector de transferencia génica que se usó. Usando un anticuerpo policlonal anti-FVIII, por lo tanto se esperaban bandas para la cadena ligera a la misma altura en las preparaciones de FVIII derivado de EC y de referencia y también tamaños comparables de la cadena pesada en FVIII derivado de EC y ReFacto®. La Fig. 6 demuestra que de hecho éste fue el caso. Después de exposición más larga, apareció una banda débil a 170 kDa que indica que la escisión intracelular de FVIII en la cadena pesada y la cadena ligera puede no haber sido completa. No pudo detectarse proteína FVIII en sobrenadantes concentrados de células no transducidas.

Antes de la inmunotransferencia, se determinaron las concentraciones de FVIII:Ag de las muestras derivadas de EC por ELISA. La intensidad de señal encontrada para FVIII derivado de EC está en buen consenso con las muestras de referencia. Con un ensayo cromogénico, también se conformó que los sobrenadantes concentrados mostraban actividad procoagulante.

La invención proporciona una nueva combinación de citoquinas para la diferenciación de células endoteliales a partir de células CD34-positivas, y se ha demostrado que la sangre de cordón umbilical era una fuente asequible de células. Después del enriquecimiento de células CD34-positivas a partir de sangre umbilical, los cultivos que contenían VEGF, FGF-2, SCF y SCGF-β produjeron células adherentes que tenían un fenotipo endotelial y un potencial proliferativo muy elevado, aunque limitado. Estudios previos han demostrado que pueden obtenerse células endoteliales y expandirse considerablemente a partir de células progenitoras en sangre periférica (Gehling y col., 2000; Lin y col., 2000) y médula ósea (Quirici y col., 2001), pero la sangre de la vena umbilical no se ha investigado a este respecto. En el presente estudio, la expresión uniforme de VE-cadherina (CD144), CD31, CD146 y receptor LDL, la ausencia de expresión de CD45 y CD14, y la formación de vasos en el ensayo de Matrigel demostraron un fenotipo claramente endotelial. Un subconjunto sustancial de las células retenía la expresión de CD34, mientras que un porcentaje sorprendentemente pequeño era sólo débilmente KDR-positivo. Este patrón de marcadores de superficie celular aún no se ha presentado y difiere de los estudios de Gehling y col. (2000) y Lin y col. (2000) con respecto a la expresión de CD34, KDR, CD144 y CD31. Las células obtenidas con el protocolo de Gehling a partir de células CD133+ de sangre periférica movilizada con G-CSF eran casi uniformemente KDR-positivas solamente con subconjuntos que expresaban CD31, CD34 y CD144. Las células endoteliales del torrente sanguíneo (BOEC) a partir de células mononucleares de sangre periférica que se diferenciaron de acuerdo con el protocolo de Lin fueron uniformemente positivas para CD34, KDR, CD144 y CD31. El ensayo de Matrigel no se ha incluido en los otros estudios de modo que las células no pueden compararse con respecto a la característica funcionar de formación de vasos. Las células también diferían en su potencial proliferativo, que pareció ser inmenso en el protocolo de Lin (18 log en 60 días) y relativamente bajo en el estudio de Gehling, mientras que el protocolo descrito supra permite una expansión intermedia de los cultivos en 5 a 9 log. Después de un periodo de cultivo total ex vivo de varios meses con un fenotipo celular constante, finalmente pudo observarse senescencia de los cultivos. Como la proliferación excesiva e incontrolable in vivo presentada por Lin y sus colaboradores sobre BOEC en ratones inmunodeficientes podría conllevar graves efectos adversos, el potencial de expansión limitado de las células endoteliales presentado en este documento realmente puede ser ventajoso.

Las CBEC también podrían ser células diana útiles para la terapia génica de la hemofilia A. Se usó un vector lentiviral de auto-inactivación derivado de VIH-1, de integración estable con un ADNc del factor VIII con el dominio B delecionado y EGFP como gen marcador para los experimentos de transducción. Una MOI moderada de 10 demostró ser suficiente para conseguir elevadas tasas de transducción que estaban típicamente en el intervalo del 75% al 95% para la construcción de control de FVIII/EGFP o EGFP. Las transducciones produjeron niveles muy elevados de secreción de FVIII que se determinaron por un ensayo cromogénico y por ELISA. Los niveles de FVIII:C correspondían a 7,0-7,8 UI/106 células/48 h y estaban entre los niveles más elevados presentados hasta ahora en otros sistemas recombinantes. Se consiguieron niveles comparables de secreción de FVIII en HUVEC transducidas con el mismo vector, pero niveles 10-20 veces inferiores en líneas celulares hematopoyéticas que se transdujeron con el mismo casete transgénico (Tonn y col., 2002). Además, se descubrió que el nivel de secreción de FVIII en HUVEC era más de 10 veces más elevado que el presentado por Chuah y colaboradores que usaron un vector retroviral (Chuah y col., 1995).

Los datos sobre la secreción de FVIII se confirmaron por un ELISA específico de FVIII, que produjo valores incluso ligeramente mayores de FVIII:Ag de modo que la proporción media de FVIII:C/FVIII:Ag estuvo en el intervalo de 0,54-0,83 (en lugar de aproximadamente 1 como para las líneas celulares hematopoyéticas y HUVEC). Esta reducción en la actividad específica podría estar causada por la proteolisis intracelular incompleta ya que la transferencia de Western del sobrenadante celular concentrado demostró que una parte de la proteína FVIII se secretaba en forma de un precursor de 170 kDa, procesándose la mayor parte del FVIII en cadenas pesadas y ligeras de 90 y 80 kDa como se esperaba. Pero como la activación de FVIII en el plasma implica etapas proteolíticas adicionales, la actividad procoagulante in vivo del FVIII derivado de CBEC probablemente estaría en el intervalo normal.

Los ejemplos indican que las células endoteliales son particularmente adecuadas para la expresión recombinante de FVIII y que el vector lentiviral permite una expresión considerablemente más eficaz de FVIII recombinante que los vectores de expresión virales o no virales usados previamente. Aunque los experimentos de transducción a una MOI de 10 produjeron en algo de muerte celular durante/después de la incubación con vector y una corta fase lag en la proliferación en comparación con células no transducidas, no pudieron detectarse alteraciones fenotípicas o una reducción o aumento neto de la expansión de las CBEC transducidas. Los niveles de expresión transgénica determinados por un ensayo cromogénico específico de FVIII:C o por citometría de flujo para EGFP permanecieron relativamente estables hasta que las células dejaron de proliferar. Por tanto, el sistema de vector elegido en los ejemplos no solamente era muy eficaz, sino también seguro en este análisis preliminar in vitro.

Las células endoteliales derivadas de sangre umbilical son una fuente autóloga atractiva de células para terapia génica de la hemofilia A. Se sabe que para aproximadamente dos tercios de todos los pacientes de hemofilia A, la mutación subyacente es hereditaria y por lo tanto su deficiencia en FVIII es predecible en base a la historia familiar. En estos casos, las células CD34-positivas de sangre del cordón umbilical que habitualmente se desecharían podrían usarse para los cultivos de diferenciación endotelial. Para pacientes adolescentes o adultos, el protocolo presentado en los ejemplos para las CBEC puede adaptarse a células CD34-positivas de sangre periférica o médula ósea.

La invención, por lo tanto, también se refiere a un procedimiento para la preparación de células endoteliales que expresan una proteína, por ejemplo, un factor de coagulación sanguínea, que comprende a) poner en contacto, in vitro, células precursoras endoteliales humanas con los factores de crecimiento VEGF, bFGF, SCF y SCGF-β; y b) transducir las células ADN que codifica la proteína. Las células precursoras endoteliales pueden obtenerse de médula ósea, sangre periférica o sangre umbilical. Las realizaciones preferidas de este procedimiento corresponden a las realización preferidas de los procedimientos de la invención descritos supra.

Después de la transducción lentiviral en un momento puntual temprano, el cultivo podría expandirse y analizares para las características de secreción eficaz de FVIII y seguridad tales como la ausencia de lentivirus competentes en la replicación. Podrían almacenarse lotes congelados de células y usarse para múltiples inyecciones durante la vida.

La senescencia observada en todos los cultivos in vitro hasta ahora sugiere una cantidad moderada de duplicaciones de la población in vivo y, por lo tanto, la necesidad de infusiones celulares repetidas. Esta situación puede ser preferible a la proliferación in vivo de BOEC transfectadas con FVIII que demostraron injertarse en el bazo y en la médula ósea de ratones inmunodeficientes después de las inyecciones en la vena de la cola sin régimen de acondicionamiento auxiliar (Lin y col., 2002). En base a los datos publicados hasta ahora, tendrán que considerarse las complicaciones a largo plazo tales como el remplazo de la médula ósea por BOEC que conduce a anormalidades hematológicas o riesgo potenciado de trombosis y deben descartarse antes de cualquier aplicación terapéutica de estas células salvo que se pueda controlar su proliferación in vivo.

La presente invención proporciona el uso de células endoteliales, en particular CBEC, para la terapia génica de la hemofilia A y otros trastornos congénitos que se caracterizan por la ausencia de proteínas plasmáticas tales como el factor IX, el factor de von Willebrand o la α1-antitripsina.

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LISTA DE SECUENCIAS

<110> DRK-Blutspendedienst Baden-Wurttemberg -Hessen gGmbH

<120> Expresión de proteínas en células endoteliales derivadas de sangre umbilical

<130> CBEC

<160> 3

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 1

<400> 1 ccatcgatac aaatggcatt catcc 25

<210> 2

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 2

<400> 2 ccatcgatct cgagccaaag tggatctctg ctgtcc 36

<210> 3

<211> 2351

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 3

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Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para la preparación de células endoteliales humanas que expresen un factor de coagulación sanguínea, que comprende

   a) obtener células precursoras endoteliales de una muestra de sangre umbilical humana:

   b) poner en contacto, in vitro, dichas células precursoras endoteliales derivadas de sangre umbilical humana con al menos un factor de crecimiento, en el que el al menos un factor de crecimiento promueve la diferenciación de las células precursoras endoteliales en células endoteliales maduras; y

   c) transducir las células endoteliales maduras con ADN que codifica el factor de coagulación sanguínea, o transducir, antes de la etapa b), las células precursoras endoteliales con ADN que codifica el factor de coagulación sanguínea.

2. 2.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las células precursoras endoteliales derivadas de sangre umbilical humana expresan al menos un marcador de superficie celular seleccionado entre el grupo que consiste en CD34, AC133, CD146 y FGF1-R.

3. 3.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en el que la etapa a) comprende enriquecer células CD34-positivas, células AC133-positivas, células CD146-positivas y/o células FGF1-R-positivas a partir de sangre umbilical.

4. 4.

   Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se usa un vector retroviral, preferiblemente un vector lentiviral, para transducir las células.

5. 5.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el factor de coagulación sanguínea es el factor VIII humano.

6. 6.

   Un procedimiento para la producción de un factor de coagulación sanguínea, que comprende a) obtener una población de células endoteliales humanas por un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de

   las reivindicaciones 1-5; y opcionalmente generar una línea celular inmortalizada a partir de dicha población de células endoteliales humanas; b) cultivar dicha población de células endoteliales humanas o dicha línea celular en condiciones adecuadas; y c) aislar el factor de coagulación sanguínea de dicho medio de cultivo celular.

7. 7.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el factor de coagulación sanguínea es el factor VIII

   o IX humano de coagulación sanguínea.

8. 8.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en el que el ADN recombinante que codifica un factor de coagulación sanguínea codifica una muteína del factor VIII humano de coagulación sanguínea.

9. 9.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la muteína del factor VIII humano carece al menos parcialmente del dominio B del factor VIII de tipo silvestre.

10. 10.

    Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el ADN recombinante que codifica un factor de coagulación sanguínea es un ADNc del factor VIII modificado, en el que

    (i)

    se ha delecionado al menos parte del dominio B del ADNc del factor VIII de tipo silvestre,

    (ii)

    se ha insertado al menos un intrón en al menos una localización del ADNc del factor VIII, y/o

    (iii) está sustituido al menos un nucleótido de la secuencia de ADNc de tipo silvestre del factor VIII humano.

11. 11.

    Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que al menos el 75% de las células expresan al menos un marcador seleccionado entre el grupo que consiste en CD144, CD31, CD146 y receptor LDL.

12. 12.

    Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en el que al menos el 75% de las células expresan VWF de forma endógena.

13. 13.

    Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en el que el factor de coagulación sanguínea es el factor VIII de coagulación sanguínea y la etapa de aislamiento incluye purificar el factor VIII de coagulación sanguínea en presencia del factor de von Willebrand.

14. 14.

    Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, en el que el factor de coagulación sanguínea se somete a tratamiento de inactivación viral.

15. 15.

    El uso de una población de células endoteliales humanas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la hemofilia A o la hemofilia B, comprendiendo dicho uso obtener dicha población de células endoteliales humanas por un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

16. 16.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que las células que secretan el factor VIII humano de coagulación sanguínea se administran a un individuo que padece hemofilia A.