JPH10508187A

JPH10508187A - 移植および炎症または血栓症のための遺伝子療法

Info

Publication number: JPH10508187A
Application number: JP8508483A
Authority: JP
Inventors: バッハ，フリッツ・エイチ; ライトン，クリストファー
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1995-08-25
Publication date: 1998-08-18
Also published as: WO1996006933A1; CA2197427A1; AU3518695A; EP0781333A1

Abstract

(57)【要約】哺乳動物細胞の炎症性または免疫学的刺激に対する感受性を低減させるために、特に、炎症または免疫活性化を受け易い内皮細胞におけるトロンボゲン性を緩和するためにこれらの細胞を遺伝子的に修飾する方法を記載しており、細胞にトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを挿入し、それによって、トロンボモジュリンを内皮細胞活性化条件下でこれらの細胞から発現させることにより、細胞を遺伝子的に修飾する。インビボまたはインビトロ（エクスビボ）のいずれかで実施できるこの方法は、移植と同様、血栓を特徴とする全身または局所炎症症状の処置における用途が示されている。

Description

【発明の詳細な説明】移植および炎症または血栓症のための遺伝子療法発明の分野本発明は、移植および炎症および血栓症に対する遺伝子療法分野に改善をもたらすものである。特に、炎症性または免疫学的刺激に対する内皮細胞の感受性を低減させるための内皮細胞の遺伝子修飾に関する。さらに、遺伝子的に修飾した組織または器官の移植にも関し、とりわけ、遺伝子的に修飾した内皮細胞または組織または器官を同種または異種の哺乳動物受容個体に移植する方法、それを達成するための組換ベクター、およびそのように修飾した細胞、組織または器官、並びにヒト以外のトランスジェニック動物を指向する。発明の背景内皮は、血管、例えば、動脈、静脈、および毛細血管の内層を形成する細胞の層からなる。内皮(“血管内皮”ともいう)は、単なる血液および血清の受動管にすぎないと考えられていたが、現在では、内皮組織の状態が循環する血液の正常な抗凝固状態の維持に重要であることが認識されている。特に、内皮細胞により製造され、動脈、静脈および毛細血管の内皮を通って表面糖タンパク質として分配されるトロンボモジュリン（ＴＭ）タンパク質は、十分に特性化されているプロテインＣ凝固経路の中軸となる多機能性抗凝固分子の構成要素である。この経路において、トロンボモジュリンは、循環するトロンビンの結合受容体として機能しており、トロンビンを循環から除去することにより、他の作用の中でもとりわけ、トロンビンがフィブリノーゲンを凝固したり、血小板を活性化するのを妨げる。最も重要なことに、一旦トロンボモジュリンが結合すると、トロンビンは、循環している不活性プロテインＣと結び付き、そうしてプロテインＣを活性化形態へと変換させる。凝固経路の更に他の補因子、即ちプロテインＳに対する活性化プロテインＣの作用は、最終的に、抗凝固定常状態を維持するのに役立つ。損傷、炎症、または免疫学的攻撃、例えば、組織または器官の同種間または異種間移植に関連して生じる損傷、炎症、または免疫学的攻撃、並びに様々な自己免疫疾患または敗血症などの他の炎症症状に応答して、内皮は、機能不全または “活性化”前凝固状態へと変化する。腫瘍壊死因子（ＴＮＦまたはＴＮＦα）などのサイトカインの存在下で起こるこの変換の特徴は、内皮細胞表面からのトロンボモジュリンの損失または消費である。このトロンボモジュリンの低減は、転写レベルでのダウンレギュレーションが原因であるとされている［Yu等、J.Biol .Chem.2667(1992)23237-23247］。このように、組織または器官の移植に伴うような炎症性または免疫学的攻撃は、微小血管血栓症の重大な脅威、即ちトロンボモジュリンが通常最も活性である場合の内皮の微小血管における血液の生理学的凝固、および炎症を与える。上記理由から、例えば、イトーおよび共同研究者らは、人工器官動脈移植片のような移植可能合成材料に関して、トロンボモジュリンタンパク質を粘着性表面コーティングとして使用した(米国特許5,126,140号)。しかしながら、この研究は、生体移植片に関する場合は、その有用性が制限される。器官移植体による内皮細胞機能不全または“活性化”の問題は、例えば、細胞毒性薬剤、抗代謝物、コルチコステロイド、シクロスポリンＡのような非特異的免疫抑制剤、および同等物を用いて、宿主免疫応答を無力化する方向で大規模に取り組まれている。内皮細胞の活性化に伴うトロンボゲン性を緩和する、特に免疫抑制剤の大量投与に関連する毒性および他の可逆的作用を最少化しながら器官移植体の生存を延長する方法に対する危急の要望が存在する。発明の概要本発明は、遺伝子療法技術を利用して、炎症または免疫学的刺激を受け易い血管内皮細胞のトロンボゲン性（即ち、血液凝固を促進する傾向）を軽減するものである。調節的または構成的ベース下で機能性トロンボモジュリンを発現可能にさせることにより内皮細胞を修飾し、そうすることにより、トロンボモジュリン発現は内皮細胞活性化因子の存在下でさえも維持される。“機能性”とは、該内皮細胞の発現したトロンボモジュリンタンパク質が細胞環境において（例えば、移植片受容個体の血液の存在下）トロンビンに結合できること、およびそうして形成されたトロンボモジュリン−トロンビン複合体がチモーゲン（即ち不活性）プロテインＣの活性化を触媒して活性化プロテインＣを提供できることを意味する。“ 調節的（性）”とは、タンパク質発現が増大するかまたは低下するかは所定の物質の存在または添加に依存していることを意味する。用語“調節的発現”は、遺伝子発現が刺激を加えることにより増大される“誘導的発現”を含む。“構成的（性）”とは、タンパク質発現が本質的に内皮細胞活性化と無関係であることを意味する。従って、内皮細胞によるトロンボモジュリンの構成的発現は、ＴＮＦ αまたは他の活性化因子によるダウンレギュレーションを実質的に免れる。同様に、トロンボモジュリンの構成的プロモーターは、ＴＮＦなどの血清ダウンレギュレーション因子の存在下でさえ遺伝子の転写を命令する能力がある。従って、本発明は、哺乳動物の、好ましくは内皮細胞の炎症性または免疫学的刺激に対する感受性を低減させるために、好ましくはこれらの細胞またはこれらの前駆細胞に、適切なプロモーターと機能的に関連して機能性トロンボモジュリンタンパク質をコードするＤＮＡを挿入して、哺乳動物の、好ましくは内皮細胞を遺伝子的に修飾する方法に関し、それによって、トロンボモジュリンを内皮細胞活性化条件下で発現させるものである。本発明はまた、炎症性または免疫刺激を受け易い哺乳動物対象における血栓症を阻止する方法を含み、対象の細胞、組織、または器官に、プロモーターと機能的に関連してトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを挿入し、それによって機能性トロンボモジュリンを細胞活性化因子の存在下でこれらの修飾化細胞から発現させることを含んでなる。好ましくは、細胞または組織をインビボで、即ち、患者身体中にとどめながら修飾する。あるいは、細胞または組織を対象から抽出し、インビトロ培養に移してもよく、その場合、本明細書に記載したようにＤＮＡを挿入して遺伝子的に修飾し、次いで、その対象または異なる受容個体へと移植する。対象は、脊椎動物、特に、ブタなどの哺乳動物であるが、霊長動物、特にヒトであってもよい。このような療法は、炎症症状または免疫症状、例えば患者の、特に患者がヒトである場合、自己免疫疾患を軽減するのに有用である。本発明の更なる態様は、ドナー同種または異種内皮細胞、または内皮細胞を含有する組織または器官を、哺乳動物受容個体に移植する方法であって、かかる細胞、組織または器官は炎症または免疫活性化を受け易いものであり： (ａ)これらのドナー細胞、またはそれらの前駆細胞または組織または器官を、それらにプロモーター制御下でトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを挿入することにより遺伝子的に修飾し； (ｂ)得られた修飾ドナー細胞、組織、または器官を受容個体に移植し；さらに、 (ｃ)得られた修飾細胞、組織または器官から機能的に活性なトロンボモジュリンを発現させる、ことを含んでなる。工程（ａ）および（ｂ）は、いずれの順序で実施しても良く、即ち、ドナー同種または異種細胞、組織、または器官を、受容個体に移植する前に、あるいは後に、（例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換、その他により）修飾または遺伝子的に操作してもよい。プロモーターは、構成性または調節性、例えば誘導性のいずれかであることができる。例えば、ブタ由来の内皮細胞または組織を、適切なプロモーターの制御下でヒトトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを挿入することにより遺伝子的にインビボで修飾することもでき、修飾が生殖細胞系列で起こった場合はそれによって “トランスジェニック”にさせた修飾細胞または組織を、あるいは修飾が体細胞で起こった場合は体細胞組換え体を、次いで受容個体、例えば、ヒトに移植する。一旦移植すれば、修飾細胞または組織は、ＴＮＦなどの他のダウンレギュレーション因子の存在下でさえ、機能性ヒトトロンボモジュリンを移植部位で発現する。ドナー哺乳動物の遺伝子修飾を、よく知られた技術により、初期段階で実施して、所望の受容個体タンパク質を発現するトランスジェニックまたは体細胞組換え動物を産生することができる。ドナー、例えばブタ内皮細胞または組織は、エクスビボ手段により遺伝子的に修飾することもでき、それによって、ドナーから抽出し、かつ培養維持した細胞、組織または器官を上記のように遺伝子的に修飾して、次いで移植片が内皮細胞活性化因子の存在下で実質的にダウンレギュレーションを免れた所望の機能性受容個体トロンボモジュリンを発現できるような受容個体へと移植する。遺伝子修飾はインビトロ（即ちエクスビボ）よりもむしろインビボでなされるのが好ましい。好ましいインビボ法は、トランスジェニック哺乳動物、例えば、ブタを育てて、所望の機能性タンパク質を発現するドナー細胞、組織、および器官の供給源として使用することによるものである。特に適切なプロモーターおよびベクター構築物は、内皮細胞または組織、および特にブタの内皮細胞［例えば、一般にブタ大動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）またはブタ微小管内皮細胞］を修飾して機能性トロンボモジュリンの構成的または調節的発現物とするためにのものと同一であった。これに関し、ある実施態様において、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ｔＫ）プロモーターと機能的に関連してトロンボモジュリンＤＮＡを含んでなる構築物を以後記載する。更に、下記からなるレトロウイルス構築物を利用する： (ａ)モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍo−Ｍu−ＬＶ）などのレトロウイルスの５'−末端繰り返し配列(long terminal repeat)(ＬＴＲ)： (ｂ)ＬＴＲの下流の、Ψなどのレトロウイルスパッケージングシグナル； (ｃ)ＬＴＲの下流の、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターと機能的に関連してトロンボモジュリンをコードするＤＮＡ；さらに、 (ｄ)３'−末端繰り返し配列。ベクターは、少なくともレトロウイルスの、一般に、パッケージングシグナル配列、即ち、通常はΨの下流にあるgagコード領域の一部（例えば、それらの約４００ヌクレオチド）を含むこともある。３'−ＬＴＲはまた、好ましくはポリアデニル化配列を含む。好ましくは、ネオマイシンまたはそれらの類似体に対する耐性を与えるneo遺伝子などの選択マーカーを、一般にパッケージングシグナル配列の下流にある５'−ＬＴＲの制御下で設置することもできる。このようなプラスミドの例は、図３に例示したｐＮＴＫ−２.ＴＭ.ＣＷ１である。アデノウイルス構築物も利用することができ、例えば、下記のようにして製造できる。特に、ＴＭをコードするアデノウイルス構築物を用いて罹病血管を前以て融合させて、罹病血管の内皮中にＴＭを導入できる。本発明の更なる態様に従い、プロモーター制御下でトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを含んでなる移植可能な哺乳動物内皮細胞、組織、または器官、特に、ドナー哺乳動物種の移植可能な内皮細胞、組織、または器官を与え、その細胞、組織、または器官は、ドナーとして同種または異種である移植受容個体種のトロンボモジュリンを発現するように修飾されている。本発明の更なる態様は、特に上記のように修飾した移植可能な内皮細胞または組織を有する、異種のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを含んでなるヒト以外のトランスジェニック哺乳動物、および異種のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを含んでなるヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の製法を提供する。このような哺乳動物の例は、その内皮（または他の）細胞からヒトＴＭを発現するトランスジェニックマウスである。更なる例は、その内皮（または他の）細胞からヒトＴＭを発現するトランスジェニックブタである。例示の実施態様において、本発明は、機能性ヒトトロンボモジュリンを発現するように遺伝子的に修飾したブタ内皮細胞を含んでなる器官をヒトに移植する方法を含んでなる。図面の説明図１プラスミドｐＮＴＫ−２の制限地図。図２a ヒトＴＭをコードするプラスミドｐＵＣ１９.ＴＭ１５の略図。図２b プラスミドｐＵＣ１９.ＴＭ.ＣＷ１の挿入の略図(図２aおよび２bにおいて、太線は、プラスミド基幹配列を示す)。図３発現ベクターｐＮＴＫ-２.ＴＭ.ＣＷ１の略図。図４a ＮＴＫ.ＴＭ.ＣＷ１プロデューサー細胞プールのＦＡＣスキャン分析。図４b ＮＴＫ-２.ＴＭ.ＣＷ１プロデューサープールの限界希釈に由来するＴＭクローンの相対発現レベル（任意単位）を示す棒グラフ。図５ＮＴＫ.ＴＭ.ＣＷ１形質導入細胞のノーザン分析。図６トロンボモジュリン発現のヌクレアーゼＳ１分析。図７活性化プロテインＣ産生についての、色原体アッセイの図解原理。図８３７℃でのＳ−２３６６切断速度白抜き四角形：非形質導入ＰＡＥＣ菱形：ＮＴＫ-２.ＴＭ.ＣＷ１形質導入および選択ＰＡＥＣ黒四角形：ＥＡhy９２６細胞系列。図９ＴＮＦで細胞を処理した後の活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）産生の最大速度に反映される、トロンボモジュリンの活性を例示する棒グラフ。図10 天然ヒトトロンボモジュリンｃＤＮＡ配列（配列番号１）を含んでなるＴＭ.ＣＷ１およびＮＴＫ-２.ＴＭ.ＣＷ１制限分析。定義 “移植片”、“移植体”または“移植組織”は、相互変換的に用いて、受容個体へ移植するためのドナー由来の生物学的材料、およびかかる生物学的材料を受容個体に植える行為を表す。 “宿主”または“受容個体(recipient)”は、ドナー生物学的材料を移植する患者の身体を表す。 “トランスジェニック”は、外来遺伝子を、それぞれが生殖細胞系列のものであるか、体細胞のものであるかに関係無く、有する動物を表す “同種の”（および“同種移植片”）は、ドナーおよび受容個体が同種であることを表す。それらの下位部類として“同系の”は、ドナーおよび受容個体が遺伝子的に同一である状態を表す。“自家移植の”は、ドナーおよび受容個体が同一個体であることを表す。“異種の”（および“異種移植片”）は、移植片ドナーおよび受容個体が異なる種であることを表す。 “Ｍo−Ｍu−ＬＴＲ”：モロニーマウス白血病ウイルスの末端繰り返し（long terminal repeat）ＤＮＡ配列。 “ポリＡ”：ポリアデニル化シグナルをコードするＤＮＡ。 “neo”：殆どの真核細胞および他の宿主細胞にとって有毒であるネオマイシンまたはＧ４１８などのネオマイシン類似体に対する耐性を与える、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子。 “プロモーター”：ＤＮＡのＲＮＡへの転写の開始を調節するＤＮＡ配列。 “ｔｋ”：単純ヘルペスチミジンキナーゼ。 “ＰＡＥＣ”：ブタ大動脈内皮細胞。 “ＨＵＶＥＣ”：ヒト臍静脈内皮細胞。 “ＥＡhy９２６ＨＵＶＥＣ”：ヒトＴＭを構成的に発現する不死化ヒト臍内皮細胞系列。 “ＴＮＦ”：腫瘍壊死因子。 “トロンボモジュリン”（ＴＭ）は、天然トロンボモジュリン遺伝子（それらのｃＤＮＡを含む）またはタンパク質を表し、天然トロンボモジュリンの機能性を害しないＤＮＡ（またはアミノ酸）配列の変形（例えば、サイレント突然変異または欠失）を有するそれらの誘導体を含む（米国特許第５,２７３,９６２号および米国特許第５,２５６,７７０号）。発明の詳細な説明天然トロンボモジュリンをコードする遺伝子は、その一般的な形態でおよびｃＤＮＡとしての双方で様々な生物種から単離および配列決定されている。ヒト臍静脈内皮細胞に由来する、１,７２５塩基対の転写解読枠(open reading frame) を含み、５７５アミノ酸の６０.３kＤa（Ｍ_r＝６０,３２８）タンパク質をコードする、ヒトトロンボモジュリンの完全ｃＤＮＡ配列は、Majerusにより、米国特許第４,９１２,２０７号に開示されており、また図１０（配列番号１）においてヌクレオチド位置１７０ないし１,８９４として表している。本発明は、広義には、内皮細胞、組織、または器官の中に、適切なプロモーターと機能的に関連してトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを挿入して該内皮細胞、組織または器官を修飾し、修飾した細胞から有効レベルで機能性トロンボモジュリンを発現することによって、内皮細胞または組織または器官の、免疫攻撃に応答する際の活性化または機能不全に対する感受性を低減することを含む。プロモーターは、構成性または調節性であることができ、例えば、好適に誘導可能な方法で操作できる。ある実施態様では、本発明の内皮細胞は、ＴＭタンパク質を構成的、即ち、連続的に発現でき、従って、ＴＭコード配列を、該細胞中でタンパク質を構成的に発現するプロモーター配列と操作容易に連結させる。あるいは、内皮細胞は、調節的、例えば誘導的ベース下で、トロンボモジュリンを発現できる、即ち、ＴＭコード配列を、誘導性プロモーターと操作容易に連結させて、内皮細胞活性化の前後、または予め定めた外部刺激に応答して要求があり次第直ちにタンパク質を発現できる。更なる実施態様では、ＴＭｃＤＮＡを、内皮細胞特異的プロモーターに操作容易に連結させることができる。上記プロモーターは全て、好ましくは、ＴＭタンパク質コードＤＮＡ配列本来のプロモーター以外のものである。こうして、本発明は、一態様において、かかる修飾により、患者における炎症性または免疫刺激に対する血管内皮細胞または組織の機能不全または活性化応答の問題に取り組むものである。これは、ドナー内皮細胞または組織に、適切な、例えば、調節性または構成性プロモーターの制御下でトロンボモジュリンタンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、これらのドナー細胞または組織を受容個体に移植することによって、これらのドナー細胞または組織から機能性トロンボモジュリンを発現させることにより、ドナー内皮細胞または組織をインビボまたはインビトロで遺伝子修飾した結果、かかる療法を必要とする患者における血栓症の阻止を可能にする。ドナー種は、受容個体と同一かまたは異なり、かつ適切な移植または遊離移植のための内皮細胞、組織、または器官を提供できる適切な種であることができる。好ましい実施態様では、ヒトＴＭタンパク質を、ヒト受容個体中に配置または移植されている、異なる哺乳類動物種の細胞から発現させる。ヒト受容個体の場合、ブタドナーが好適であると考えられているが、他の哺乳動物種、例えば、ウシが好適であることもある。例えば、ブタ内皮細胞またはそれらの前駆細胞は、遺伝子的に修飾したブタ対象から得ることができ、自家移植ドナーまたは他の哺乳動物、例えば、ヒト対象のいずれかに移植できる。ドナー細胞または組織は、それらが、それらを移植する移植受容個体種または異なる種のトロンボモジュリンタンパク質をコードするＤＮＡを含有し、発現する点でトランスジェニックであることができる。これらのトランスジェニック細胞または組織は、細胞、組織、または器官の寿命中無期限にトロンボモジュリンを発現し続けることができる。本発明の内皮細胞の修飾は、当業者には既知の様々な手段によるものであり得る。例えば、ＤＮＡの細胞または組織へのインビボ直接注入が実施できる。トランスジェニック動物作成法は、一層普及してきており、外来細胞またはＤＮＡを動物組織に挿入する適切な方法には、マイクロインジェクション、胚性幹（ＥＳ）細胞マニピュレーション、電気穿孔法、セル・ガン（cell gun）、トランスフェクション−ｋ、形質導入、レトロウイルス感染、等がある。レトロウイルスベクター、および特に、レトロウイルス複製に必要なgag、pol およびenv配列の１またはそれ以上を欠く複製不全レトロウイルスベクターは、当分野ではよく知られており、内皮細胞を形質転換するのに使用できる。ヘルパーフリーのウイルスベクターを産生するＰＡ３１７または他のプロデューサー細胞系列が、文献、例えば、MillerおよびButtimore、Mol.Cell.Biol.(1986),2895 -2902；米国特許第５,２１９,７４０号；米国特許第４,８６１,７１９号；米国特許第５,１２４,２６３号；および米国特許第４,６５０,７６４号に十分に記載されている。本発明の目的に適した代表的なレトロウイルス構築物は、少なくとも１つのウイルス末端繰り返し配列と治療対象のヌクレオチド配列の上流にあるプロモーター配列、および少なくとも１つのウイルス末端繰り返し配列と治療対象配列の下流にあるポリアデニル化シグナルを含んでなる。例えば、それは、モロニーマウス白血病ウイルス(Ｍo−Ｍu−ＬＶ)−由来のＮ２プロウイルスベクターであることができ、その対象となる遺伝子は、５'−および３'−末端繰り返し配列（ＬＴＲ）および５'−ＬＴＲの下流にあるパッケージングシグナル配列と隣接(flank) している。Ｎ２はまた、Ｍo−Ｍu−ＭＬＶの約４００塩基対のgagコード領域を含有している。更に、Ｍo−Ｍu−ＭＬＶコード配列の大部分が、Ｎ２では欠失しており、細菌性ネオマイシン−耐性遺伝子（neo）で置き換わっている［Eglitis 等、Science 230(1985)1395-1398］。ブタ大動脈内皮細胞などのブタ内皮細胞は、典型的な遺伝子工学技術では取り扱い困難である。哺乳動物細胞におけるトロンボモジュリンの構成的発現のための様々なベクター構築物を下記の表１に示す。驚いたことに、特定のレトロウイルス構築物が、形質導入トロンボモジュリンのタンパク質発現と同様に優れたウイルス力価を与えることが分かった。例示したｐＮＴＫ−２ベクターは、高レベルのウイルス力価およびトロンボモジュリン発現を与える点で、例えば、下記表１に示した他のレトロウイルス構築物よりも優れていることが分かった。このｐＮＴＫ−２ベクターのプロモーター含有５'−末端繰り返し配列とその単純ヘルペスｔｋプロモーター配列との明らかな共同作用の結果として、魅力あるトロンボモジュリン発現レベルが、形質転換内皮細胞から得られ得る。アデノウイルス、即ち、上部呼吸系疾患を引き起こし、霊長類の潜伏性感染にも存在するウイルスに由来するベクター類も、一般に知られており、使用できる。アデノウイルスが低周辺温度で細胞に結合する能力は、冷保存中の遺伝子導入を促進できる移植片設置（the transplant setting）の際に有利である。アデノウイルスベクター構築物を様々な方法で製造して、トロンボモジュリンタンパク質の発現をもたらすことができる。このようなベクターでは、ＴＭ遺伝子は、１またはそれ以上の異なるプロモーターの制御下にあることがある。このようなプロモーターの１つは、既知のＣＭＶプロモーター／エンハンサーである。内皮細胞へＴＭを運ぶためのアデノウイルスベクターは、例えば、下記のようにして構築できる：（ａ）ＴＭトランスファーベクターは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの下流かつ御下でＴＭ遺伝子（例えば、構築物ＴＭ.ＣＷ１）をその遺伝子の下流にあるポリＡ配列と共に含んでなることができる。この構築物の両側にあるのは、適切なベクターとの組換えを促進するのに必要なアデノウイルス配列である。例えば、このような配列は、上流に約４００bpのアデノウイルス配列、および下流に上流の４００bp配列に比しておよそ３０００−６０００を数える約３kbのアデノウイルス配列を含むこともできる。（ｂ）アデノウイルスベクター構築物は、アデノウイルスゲノムをＥ１コード領域の挿入物と共に含んでなり、それによって挿入物は、プラスミドがバックグラウンドを生じるのを妨げる。（ｃ）２９３細胞は、ヒト胎児腎臓に由来する連続系列であり、アデノウイルスＥ１領域（即ち、トランスで）タンパク質を含有および発現するが、この領域は、この領域を欠くアデノウイルスベクターの複製および関連機能に必要である。例えば、２９３細胞は、複製関連機能に必要とされるアデノウイルスＥ１aおよびＥ１bタンパク質を含有および発現できる。２９３細胞への同時トランスフェクションによるベクター（ａ）およびベクター（ｂ）の組換えの結果、ＴＭをコードする遺伝子を含有するアデノウイルス粒子を形成するが、これらの粒子は、好ましくは、アデノウイルス領域の１またはそれ以上の配列を欠いており、そのため好ましくは複製不全である。同時トランスフェクションは、細胞を１％アガロースを含有する培地で覆いながら行うので、純粋な組換えウイルスまたはウイルスベクターが、ウイルス産生細胞の溶解の際、単層において目で見える透明／プラークとして直接得られる。この組換えウイルスは、例えば、ＰＣＲおよびサザンブロットにより、および例えば既知の方法で調製したhuＴＭモノクローナル抗体を用いる発現により、物理的に特性化および拡張（expand）させることもできる。得られた複製不全組換えウイルス、例えば、感染２９３細胞の凍結解凍溶解により得られるようなものは、特に内皮細胞におけるＴＭタンパク質の構成的生産に特に有効である。本発明に使用するためのアデノウイルスベクター構築物は、cmvプロモーターと機能的に関連してトロンボモジュリンＤＮＡおよびその下流のポリＡ配列を含む発現カセットを含んでなる。この発現カセットは、トランスでＥ１遺伝子の存在を示すため、Ｅ１領域を欠くアデノウイルスベクターの複製を可能にするものであるヒト胚性腎臓細胞（２９３細胞系列）において、２つのプラスミドを組換えることによりアデノウイルスゲノムに導入される。標的遺伝子輸送のための別の方法は、ＤＮＡ−タンパク質複合体の形成を経ている。この種の遺伝子導入基質は、トロンボモジュリン遺伝子を内皮細胞上のアクセプターのポリペプチドリガンドにコンジュゲーションすることにより構築される。細胞または細胞集団を本発明によりインビボまたはインビトロで処理できる。例えば、インビボ処理のために、本発明のトロンボモジュリンベクターを、細胞、組織または器官をin situで直接感染させることにより挿入できる。そのため、腎臓などの器官の管をインビボで血液循環から一時的にクランプ止めにし、そして血管を、対象のトロンボモジュリン遺伝子含有の伝達性ベクター構築物を含む溶液で遺伝子が器官の細胞内に挿入されるのに十分な時間灌流し、その後クランプを外して、血流を器官へ回復させてもよい。その他の実施態様では、細胞修飾を培養細胞中、エクスビボで実施できる。細胞集団をドナーまたは患者から取り出し、ベクターＤＮＡの挿入により遺伝子的に修飾し、次いで、患者または他の受容個体に移植することができる。更に、器官をドナーから取り出し、エクスビボで上記灌流工程に付し、その器官をドナーに再移植するか、または同種または異種の別の受容個体に移植してもよい。遺伝子的に修飾した内皮細胞を、移植部位で、例えば、自生露出管（reseeded denuded vellels）または人工器官に導入することもできる。それらを含む組織または器官をドナーから取り出し、よく知られた外科手術により受容個体へ移植することもできる。移植の前に、処理した内皮細胞または組織を、構築物を含有および発現する遺伝子的に修飾した細胞についてスクリーニングしてもよい。このためには、選択マーカー物質に対する耐性を与える発現生成物をコードする第２のヌクレオチド配列をベクター構築物に供給してもよい。スクリーニングに適した選択マーカーには、ネオマイシンまたはネオマイシン類似体Ｇ４１８に対する耐性を与えるneo遺伝子がある。いずれの哺乳動物細胞も、トロンボモジュリン遺伝子挿入の標的であることができるが、内皮細胞が操作上好ましい細胞である。受容個体種は、主にヒトであるが、それに制限されない。その他の霊長類などの哺乳動物も適切な受容個体であり得る。ＴＮＦなどの血清因子による内皮細胞の活性化を導く炎症刺激は、損傷、火傷、敗血性ショック、自己免疫疾患、同種または異種間移植、外科手術等を含む広範囲の病的症状に起こる。更なる疾患には、血栓形成傾向の増大があるようなもの（例えば、虚血性心疾患、アテローム性動脈硬化、多発性硬化、頭蓋内腫瘍、血栓塞栓症および高脂血症などのアテローム性動脈硬化症状および血栓症状、血栓静脈炎、脳血栓症、冠動脈血栓症、および網膜血栓症）、また、分娩または冠動脈バイパス手術、血管形成術、および人工心臓弁移植などの外科手術に伴うものがある。上記の試薬、出発物質または細胞系列は、本明細書に具体的に記載されていないが、これらは既知および入手可能であるか、またはそれらまたはそれらの均等物は既知の入手可能製品から既知の方法に従い製造できる。下記の実施例は、単なる例示であって、本明細書に記載および請求した発明を何等限定するものではない。温度は全て、セ氏温度である。実施例材料ヒトトロンボモジュリンｃＤＮＡは、プラスミドｐＵＣ１９のＥcoＲＩ部位でクローン化して、ｐＵＣ１９ＴＭ１５を形成させたもの（ＡＴＣＣ寄託番号６１３４８）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレンション（アメリカ合衆国、ＭＤ、ロックビル）から入手する。プラスミドｐＮＴＫ−２は、ｐＸＴ１［Boulter等、Nucleic Acids Research 15(17)(1987)7194 から得られるものであり、詳細は図１に記載している。ＰＡ３１７細胞系列（ＡＴＣＣＣＲＬ９０７８）は、ウイルスパッケージングシグナルを欠くが、gag、pol、およびenvタンパク質パッケージング遺伝子をコードする両向性（amphotropic）複製不全レトロウイルス構築物を含有する。ブタ大動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）は、例えば、ディーコネス・ホスピタル・アニマル・ラボラトリーズ（アメリカ合衆国、ＭＡ、ボストン）から入手した大動脈から精製する。４継代ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、チルドレンズ・ホスピタル（アメリカ合衆国、ＭＡ、ボストン）由来のものである。ＰＡ３１７細胞およびＰＡＥＣは、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（Gibco）で維持する。方法ａ．ｐＮＴＫ−２.ＴＭ.ＣＷ１の構築プラスミドｐＵＣ１９.ＴＭ１５をＢstＸIおよびＨindIIIで消化すると、ＴＫ遺伝子ポリアデニル化部位および隣接ｐＵＣポリリンカーの小セグメントを含む３'−非転写領域が欠失した切断ｃＤＮＡ配列を生じる。切り取ったセグメントを、中間のＳal１、ＥcoＲ１およびＢamＨＩ部位をコードする突出部を与えた２９ヌクレオチドの合成リンカーで置き換え、ｐＵＣ.ＴＭ.ＣＷ１として図２ｂに略図的に表す。切断配列ＴＭ.ＣＷ１を、Ｓal−１部位でｐＵＣ.ＴＭ.ＣＷ１から切り取り、ｐＮＴＫ−２においてＸhol部位に融合させたSal１フラグメントとしてｐＮＴＫ −２中にクローン化し、図３に略図的に表したｐＮＴＫ−２.ＴＭ.ＣＷ１を得る。ｂ．プロデューサー細胞の形質導入プラスミドｐＮＴＫ−２.ＴＭ.ＣＷ１をそのプラスミド基幹においてＳcalで鎖状にし、鎖状にしたプラスミドｐＮＴＫ−２.ＴＭ.ＣＷ１を電気穿孔法により、ＰＡ３１７細胞培養物中へ形質導入させた。ｃ．対照操作法プラスミドを上記ａ記載の方法により製造するが、ただし、これはトロンボモジュリン遺伝子を欠いている。このプラスミドもまた電気穿孔法によりＰＡ３１７細胞へと形質導入させて、“空の”プロウイルス、即ち、neo遺伝子を含有するがトロンボモジュリン遺伝子を含有しないウイルス力価を示す。ｄ．プロデューサークローンの選択および分析トランスフェクションしたＰＡ３１７細胞のネオマイシン選択を、少なくとも６００μg／mlＧ４１８（Gibco Grand Island NY カタログ番号11811-031）中で少なくとも１４日間行う。得られたＮＴＫ−２.ＴＭ.ＣＷ１プロデューサープールを制限希釈により、サブクローン化して、２９個のサブクローンを得る。サブクローン由来の上清を後期対数初期定常期で集め、２０００gで１０分間遠心にかけて、プロデューサー細胞と異物を取り出し、次いで、液体窒素中、単サイクルの迅速凍結解凍で精製する。ｅ．ＦＡＣスキャン分析ＮＴＫ−２.ＴＭ.ＣＷ１プロデューサープールのＦＡＣスキャン分析は、Harl owおよびLane，Antibodies；A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laborat ory Publication，Ch.10（1988）に記載の方法に従い、第２試薬をコンジュゲートした抗−トロンボモジュリンモノクローナル抗体１１Ｂ１およびＦＩＴＣを用いて行う。図４aでは、白抜き部分は、第２試薬単独でインキュベーションしたプロデューサー細胞を示す。黒塗り部分（第２試薬と１１Ｂ１）は、細胞当たりのトロンボモジュリンレベルに相当し、左から右へと増大している。ＮＴＫ−２ .ＴＭ.ＣＷ１プロデューサープールは、中間力価ウイルス（１−２×１０⁴感染単位／ml）を生ずる。約８０％のＮＴＫ−２.ＴＭ.ＣＷ１クローンがＴＭ発現性であることが分かる。１０−１５％のサブクローンは、Ｇ４１８耐性を与えるがＮＴＫ−２.ＴＭ.ＣＷ１発現を与えないウイルスを生ずる（図４ｂ）。ｆ．３Ｔ３細胞の感染３Ｔ３繊維芽細胞に精製ウイルス上清を感染させ、その１４日後Ｇ４１８で選択する。２９個のサブクローンの内、２２個が３Ｔ３繊維芽細胞に対するウイルス力価を示す。比較すると、ＮＴＫ−２.ＴＭ.ＣＷ１を含有する他のレトロウイルス構築物は、上記表１に示したようなより強力な構成性プロモーターの制御下で、低いウイルス力価を示す。単一クローン、Ａ５を選択した結果、抗−ＴＭ免疫組織化学により判断したところ、形質導入頻度のそれぞれ３０−４０％から６０−８０％の概算的倍加を生じる。ｇ．ＰＡＥＣの感染対数増殖期のＰＡＥＣを、３０mm径ペトリ皿当たり０.５−２×１０⁹細胞で接種し、８μg／mlポリブレン界面活性剤の存在下、精製Ａ５上清と共に２４時間にわたりインキュベートした。ｈ．細菌エンドトキシンおよびヒトＴＮＦでのＰＡＥＣ刺激形質導入ＰＡＥＣが活性化に対する感受性を保持しているという確証は、１００ng／mlの細菌細胞壁リポ多糖類（ＬＰＳ）またはＴＮＦ、既知の細胞アクチベーターで処理したＰＡＥＣクローンに対し抗−ヒトＴＭモノクローナル抗体ＩＡ４を用いてＥＬＩＳＡを実施することにより得られる。細胞は、細胞活性化中にアップレギュレーションされることが知られているＥ−セレクチンをアップレギュレーションすることにより刺激に応答する。刺激の結果、これもまた１Ａ４でのＥＬＩＳＡで測定したところ、トロンボモジュリン活性の若干の減少が起こり、これは、発現の低減というよりはむしろ、転写後機構（即ち、タンパク質のメチオニン₃₈₈の酸化傾向）に大きく起因するようである。ＴＮＦでの様々な細胞系列の刺激に応答する際のＴＭ発現およびＡＰＣ生産は、図９に示している（誤差バー±１標準偏差）。ＨＵＶＥＣにより発現された内生ＴＭタンパク質の活性が、実質的には、ＴＮＦ−αによって十分にダウンレギュレーションされるのに対し、形質導入ＰＡＥＣにより発現されたヒトＴＭは、サイトカイン誘導ダウンレギュレーションに対して耐性である。ｉ．イムノペルオキシダーゼ研究指数関数的に増殖するＰＡＥＣの形質導入効率は、抗体１Ａ４での間接免疫ペルオキシダーゼ染色により感染後２４時間で測定する。形質導入ＰＡＥＣをホスフェート緩衝化塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、０.０５％グルタルアルデヒドで１０分間室温で固定する。ＰＢＳ中５％ヤギ血清中でブロッキングした後、細胞を、１：３５０に希釈した抗−ヒトトロンボモジュリンモノクローナル１Ａ４、ビオチニル化ヤギ抗−マウス抗体（Pierce３１８０２、１：２０００希釈）およびストレプトアビジンペルオキシダーゼ（Pierce、１：２０００希釈）と共に、ＰＢＳ中２％ヤギ血清中で１時間室温でインキュベーションする。アミノエチルカルバゾールを用いて抗原の存在を検出した。Ａ５クローンから集めた上清を用いる一回の感染により良好な形質導入頻度が得られる。非形質導入ＰＡＥＣでは、トロンボモジュリンメッセージは無視でき、タンパク質は何等検出されない。ｊ．ノーザン分析次いで、総ＲＮＡをグアニジンイソチオシアナート／酸フェノール法により形質導入陽性選択ＰＡＥＣから単離する。図５は、ｐＵＣ.ＴＭ.ＣＷ１のＥcoＲＩフラグメントでプローブしたＰＡＥＣ培養細胞；非形質導入ＰＡＥＣ；ＥＡhy９２６；ＮＩＨ３Ｔ３；およびＮＴＫ−２.ＴＭ.ＣＷ１形質導入陽性選択ＮＩＨ３Ｔ３由来のＲＮＡ（１６時間さらす）のノーザンブロットを示す。各レーンは１０μgＲＮＡを含有する。トロンボモジュリンmＲＮＡの補間サイズ（interpolat ed size）は、３.７キロベースである。２つの主たるＲＮＡ種が優れている：（１）ｔｋ作動転写物に相当する３−３ .５kb配列；および（２）転写読み取りを証明し、ＬＴＲ作動転写から開始し、n eo遺伝子から５'−ＬＴＲないし３'−ＬＴＲ転写物に相当するｔｋおよびＴＭ配列へと続く、ＴＭプローブおよびＧ４１８耐性用プローブとハイブリダイズ可能な約５.５kb配列。ｋ．ヌクレアーゼＳ１分析ヒトＴＭをコードするｍＲＮＡの定常状態レベルを、Ｓ１ヌクレアーゼ保護分析により測定する。プラスミドｐＫＳＭ１３＋においてＥcoＲ１部位でクローン化したＴＭ１５をＰvullおよびＸmalで消化して、Ｓ１ヌクレアーゼ保護用の５３０bpプローブを生産する。形質導入細胞に見られる保護フラグメントは、ＴＭ１５中のＥcoＲＩからＸmal部位にあると予想される２６０bpフラグメントに相当する。野生型ヒトトロンボモジュリンは、２３bp短い保護フラグメントを生ずる。形質導入細胞由来のＲＮＡのＳ１ヌクレアーゼ分析（３日さらす）は、ヒトＴＭをコードするｍＲＮＡの顕著な定常状態発現を示している（図６）。ｌ．ＴＭ発現のスキャッチャード分析高発現ＥＡhy９２６細胞系列と比較した場合の形質導入ＰＡＥＣにおけるＴＭの発現レベルと、構成的にヒトＴＭを発現するヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＹＶＥＣ）と比較した場合の形質導入ＰＡＥＣにおけるＴＭの発現レベルとの間の比較を行う。まず、全ての細胞がトロンボモジュリン分子を発現すると思われることから、放射性標識１Ａ４によるスキャッチャード分析を用いて、ＥＡhy９２６細胞系列における細胞当たりのトロンボモジュリン分子の絶対数を見積もることにより比較を行う。ＰＡＥＣおよびＥＡhy９２６の発現レベルは、同様に大きい。競合型ＥＬＩＳＡでは、ＥＡhy９２６細胞は、細胞当たり平均２.５×１０⁵分子を発現し、Ｇ４１８−選択ＮＴＫ−２.ＴＭ.ＣＷ１形質導入細胞は細胞当たり少なくとも１.５×１０⁵分子を発現する。ｍ．生物学的活性発現したヒトＴＭの機能性を、集密的ヒトＴＭ発現性ＰＡＥＣ、空のベクター形質導入ＰＡＥＣ、ＨＵＶＥＣおよびＥＡhy９２６における補因子アッセイにより定量する（図７）。細胞を２４ウェルプレートにおいて集密的になるまで増殖させる。培地を除去し、ウェルをＰＢＳで洗浄する。細胞培養物を下記：０.８μgヒトプロテインＣ(プールした血漿から精製した(アメリカ赤十字)) １×補因子緩衝液(５０mＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０；１００mＭＮaＣl；１０mＭＣaＣl₂；０.１％ＢＳＡを含む)中０.１国際単位のウシトロンビンの基質補因子溶液１７０μlと共に、Owen,W.およびEsmon,C.，J.Biol.Chem．257 （1982）859およびFreyssinet等，Biochem.J．238（1986）151に記載のＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベーションする。反応を止めるために、ヒルのヒルジン３単位（トロンビン結合剤）を各培養物に加える。上記インキュベーション中に産生された活性化プロテインＣは、色原対基質Ｓ−２３６６を用いて、反応停止した反応混合物１５９μlおよび基質５０μlを合わせ、マイクロプレートリーダーで４０５nmでのＯＤを読み取ることにより、動力学的に検定する。トロンボモジュリンの活性は、色原体切断の最大速度としてmＯＤ単位／分で表現する。ＰＡＥＣにより発現されたトロンボモジュリンは、ヒトおよびウシトロンビンの両方を用いるヒトプロテインＣのトロンビン媒介作用を触媒できることが分かる。比較すると、非形質導入ＰＡＥＣではなんら顕著なトロンボモジュリン活性が検出されず（図８）、ＥＡhy９２６細胞系列ではより低い活性しか観察されない。トロンボモジュリンの活性は、ＨＵＶＥＣで観察されたものに匹敵する。ｎ．凝固研究マイクロウェルでのインビトロ凝固実験は、ヒト血漿で活性化して、細胞を凍結解凍破壊した場合、形質導入ＰＡＥＣが凝固時間の延長を引き起こすことを立証できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ライトン，クリストファーアメリカ合衆国02146マサチューセッツ州ブルックリン、ステアーンズ・ロード17 番ユニット５

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物細胞の炎症性または免疫学的刺激に対する感受性を低減させるために、これらの細胞またはこれらの前駆細胞に、適切なプロモーターと機能的に関連して機能性トロンボモジュリンタンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、それによって、トロンボモジュリンを内皮細胞活性化条件下で発現させることを含んでなる、哺乳動物細胞を遺伝子的に修飾する方法。２．哺乳動物対象の細胞、組織、または器官に、プロモーターと機能的に関連してトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを挿入し、それによって機能性トロンボモジュリンを細胞活性化因子の存在下でこれらの修飾化細胞から発現させることを含んでなる、炎症性または免疫刺激を受け易い哺乳動物対象における血栓症を阻止する方法。３．哺乳動物トロンボモジュリンをコードするＤＮＡを、内皮細胞または組織に挿入する、請求の範囲第１項または２項記載の方法。４．ＤＮＡがヒトトロンボモジュリンをコードするものである、請求の範囲第３項記載の方法。５．トロンボモジュリンをコードするＤＮＡが構成性プロモーターと機能的に関連している、請求の範囲第４項記載の方法。６．トロンボモジュリンをコードするＤＮＡが調節性および／または誘導性プロモーターと機能的に関連している、請求の範囲第４項記載の方法。７．トロンボモジュリンをコードするＤＮＡがチミジンキナーゼプロモーターと機能的に関連している、請求の範囲第１項または２項記載の方法。８．トロンボモジュリンをコードするＤＮＡがチミジンキナーゼプロモーターおよびレトロウイルス５'−末端繰り返しＤＮＡ配列の両方と機能的に関連しており、この繰り返し配列はチミジンキナーゼプロモーターの上流に位置している、請求の範囲第１項または２項記載の方法。９．レトロウイルス３'−末端繰り返しＤＮＡ配列がトロンボモジュリンをコードするＤＮＡの下流にある、請求の範囲第１項または２項記載の方法。１０．トロンボモジュリンをコードするＤＮＡがｃｍｖプロモーターと機能的に関連している、請求の範囲第１項または２項記載の方法。１１．ドナー同種または異種内皮細胞、または内皮細胞を含有する組織または器官を、哺乳動物受容個体に移植する方法であって、かかる細胞、組織または器官は炎症または免疫活性化を受け易いものであり： (ａ)これらのドナー細胞またはそれらの前駆細胞、または組織または器官を、それらにプロモーター制御下でトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを挿入することにより遺伝子的に修飾し； (ｂ)得られた修飾ドナー細胞、組織、または器官を受容個体に移植し；さらに、 (ｃ)得られた修飾細胞、組織または器官から機能的に活性なトロンボモジュリンを発現させる、ことを含んでなる方法。１２．ヒトトロンボモジュリンをコードするＤＮＡをドナー細胞または組織に挿入し、かつ受容個体がヒトである、請求の範囲第１１項記載の方法。１３．ドナー細胞または組織がヒト以外の哺乳動物である、請求の範囲第１２項記載の方法。１４．トロンボモジュリンをコードするＤＮＡが構成性プロモーターと機能的に関連している、請求の範囲第１３項記載の方法。１５．トロンボモジュリンをコードするＤＮＡが調節性および／または誘導性プロモーターと機能的に関連している、請求の範囲第１３項記載の方法。１６．トロンボモジュリンをコードするＤＮＡがチミジンキナーゼプロモーターと機能的に関連している、請求の範囲第１３項記載の方法。１７．トロンボモジュリンをコードするＤＮＡがチミジンキナーゼプロモーターおよびレトロウイルス５'−末端繰り返しＤＮＡ配列の両方と機能的に関連しており、この繰り返し配列はチミジンキナーゼプロモーターの上流に位置している、請求の範囲第１６項記載の方法。１８．レトロウイルス３'−末端繰り返しＤＮＡ配列がトロンボモジュリンをコードするＤＮＡの下流にある、請求の範囲第１７項記載の方法。１９．トロンボモジュリンをコードするＤＮＡがｃｍｖプロモーターと機能的に関連している、請求の範囲第１３項記載の方法。２０．(ａ)レトロウイルスの５'−末端繰り返し配列（ＬＴＲ）： (ｂ)ＬＴＲの下流にあるレトロウイルスパッケージングシグナル； (ｃ)ＬＴＲの下流にある単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターと機能的に関連してトロンボモジュリンをコードするＤＮＡ； (ｄ)３'−末端繰り返し配列、からなるレトロウイルス構築物。２１．構成性または調節性および／または誘導性プロモーターの制御下でトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを含んでなる移植可能な哺乳動物内皮細胞、組織、または器官。２２．ドナーとして異なる動物種である移植受容個体種のトロンボモジュリンを発現させるために修飾されている、ドナー哺乳動物種の、請求の範囲第２１項記載の内皮細胞、組織、または器官。２３．ドナー哺乳動物種がブタであり、移植受容個体がヒトである、請求の範囲第２２項記載の細胞、組織または器官。２４．異種のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを含んでなるヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。２５．ブタまたはマウスであり、そのＤＮＡがヒトトロンボモジュリンをコードするものである、請求の範囲第２４項記載のトランスジェニック哺乳動物。