CN101980726A - 治疗与dna重复不稳定性相关的遗传病症的方法和装置 - Google Patents

治疗与dna重复不稳定性相关的遗传病症的方法和装置 Download PDF

Info

Publication number
CN101980726A
CN101980726A CN2009801112548A CN200980111254A CN101980726A CN 101980726 A CN101980726 A CN 101980726A CN 2009801112548 A CN2009801112548 A CN 2009801112548A CN 200980111254 A CN200980111254 A CN 200980111254A CN 101980726 A CN101980726 A CN 101980726A
Authority
CN
China
Prior art keywords
oligonucleotide
nucleotide
rna
cell
repeat
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801112548A
Other languages
English (en)
Inventor
约瑟夫斯·约翰尼斯·德吉姆彼
勒德乌斯·约翰尼斯·普拉滕伯格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PROSENSA HOLDING BV
Original Assignee
PROSENSA HOLDING BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by PROSENSA HOLDING BV filed Critical PROSENSA HOLDING BV
Publication of CN101980726A publication Critical patent/CN101980726A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/331—Universal or degenerate base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了应用寡核苷酸的方法和药物，该寡核苷酸包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷，所述寡核苷酸优选是RNA酶H基本上非依赖的和只与人基因转录本的重复序列互补，用于制备用于诊断、治疗或预防人类与顺式元件重复不稳定性相关的遗传病症的药物。因此本发明提供了与顺势元件重复不稳定相关的遗传病症的治疗方法。本发明也涉及应用于本发明的方法中以预防重复扩增转录本在细胞中积累和/或翻译的修饰的寡核苷酸。

Description

治疗与DNA重复不稳定性相关的遗传病症的方法和装置
发明领域
本发明涉及医学领域，具体涉及与在编码或非编码序列有不稳定重复的基因相关的遗传病症的治疗，最具体而言是导致人类亨廷顿病的HD基因或导致强直性肌营养不良1型的DMPK基因中的不稳定重复。
发明背景
基因特异微卫星和小卫星重复序列的不稳定性，导致随体中重复序列长度的增加，与35种人的遗传病症相关。例如发现基因中三核苷酸重复不稳定性导致X连接脊髓和延髓性肌萎缩(SBMA)、强直性肌营养不良1型(DM1)、脆性X综合征(FRAX基因A、E、F)、亨廷顿病(HD)和数种脊髓小脑共济失调(SCA基因家族)。不稳定重复发现于基因例如亨廷顿病基因的编码区域，因此所述疾病的表型是由蛋白质功能和/或蛋白质折叠的改变引起的。不稳定重复单元也发现于非翻译区域，例如强直性肌营养不良1型中，发现于3’UTR或内含子序列，例如强直性肌营养不良2型中。对于DMPK重复的正常数目为约5-37，但是在前突变和完全发病状态增加到2-10倍或更多，至50、100并且有时1000或更多重复单元。对于DM2/ZNF9增加至10,000或更多重复(Cleary和Pearson，Cytogenet.Genome Res.100：25-55，2003)。
亨廷顿病的致病基因，HD，位于4号染色体。亨廷顿病以常染色体显性方式遗传。当所述基因拥有超过35个编码聚谷氨酰胺延伸的CAG三核苷酸重复时，重复的数目可以在连续世代扩增。由于重复长度的累进增加，所述疾病在连续世代中趋向严重性增加和在更早年龄出现，此过程称为早现(anticipation)。HD基因的产物是348kDa的细胞质蛋白亨廷顿蛋白(huntingtin)。亨廷顿蛋白在正常形式具有少于40个谷氨酰胺氨基酸残基的特征序列；导致疾病的突变亨廷顿蛋白有超过40个残基。在神经细胞中突变亨廷顿蛋白分子的持续表达导致形成最终引起细胞死亡的大块蛋白质沉积，尤其是在额叶和基底神经节(主要在尾状核)。所述疾病的严重性通常与额外的残基的数目成比例。
DM1是成人中最常见的肌营养不良症并且是遗传的、累进的、退行性多***病症，主要累及骨骼肌、心脏和脑。DM1是由位于人染色体19q的DMPK基因(强直性肌营养不良蛋白激酶)的3’非翻译区域中不稳定三核苷酸(CTG)n重复的扩增导致的(Brook et al，Cell，1992)。强直性肌营养不良2型(DM2)是由ZNF9基因的内含子1中CCTG的扩增导致的(Liquori et al，Science 2001)。对于强直性肌营养不良1型，DMPK转录本的核-胞质输出由重复的增加的长度所阻断，所述重复形成在核灶(nuclear foci)积聚的发夹状二级结构。携带长(CUG)n区的DMPK转录本可以形成发夹状结构，所述发夹状结构结合盲肌(muscleblind)蛋白家族并且随后聚集在核中的核糖核酸灶。这些核内含物被认为隐蔽盲肌蛋白质和其他可能的因子，然后成为细胞的限制。在DM2中，携带(CCUG)n扩增重复的ZNF9RNA的积累形成相似的灶。由于盲肌蛋白是剪接因子，其消耗导致其他转录本剪接中显著的重排。许多基因的转录本因而成为异常剪接的，例如通过包含胎儿外显子、或外显子遗漏产生了无功能蛋白质和导致受损的细胞功能。
上述观察和新发现使人们理解了诸如强直性肌营养不良1型、亨廷顿病等不稳定重复疾病可以通过全部或者至少部分移除导致疾病的异常转录本来治疗。对于DM1，在核中积聚的异常转录本可以被下调或完全移除。甚至所述异常转录本相对小的减少可以释放大量的和可能充足数量的被隐蔽的细胞因子从而促进恢复DM中正常RNA加工和细胞代谢(Kanadia et al.，PNAS 2006)。对于HD，减少HD患者细胞中积聚的亨廷顿蛋白沉积物可以改善疾病症状。
已经做了一些尝试使用反义核酸、RNA干扰或核酶设计用于不稳定重复疾病强直性肌营养不良1型的治疗方法和药物。
(i)Langlois et al.(Molecular Therapy，Vol.7 No.5，2003)设计了能够裂解DMPK mRNA的核酶。锤头状核酶具有与在DMPK中恰好在CUG重复前面的3’UTR互补的延伸RNA。在体内，载体转录核酶能够在被转染的细胞里分别裂解和减少包含扩增CUG重复的mRNA和正常mRNA种类63％和50％。因此，通过此方法正常转录本也受严重影响，并且带有扩增重复的受累及的mRNA种类并非被特异性靶向。
(ii)Langlois et al.，(Journal Biological Chemistry，vol280，no.17，2005)采用了利用RNA干扰的另一种方法。慢病毒递送的短发夹RNA(shRNA)被导入到DM1成肌细胞并且被证明可下调核中保留的突变DMPK mRNA。测试了4种shRNA分子，两种与DMPK的编码区域互补，一种与3’UTR的独特序列互补和一种为有不相干序列的阴性对照。前两种shRNA能够下调具有扩增重复的突变DMPK转录本至约50％，但是更有效地下调细胞质野生型转录本至约30％或更少。通过阳离子脂质递送的等量的合成的siRNA是无效的。针对3’UTR序列的shRNA被证实对两种转录本都是无效的。因此，这种方法也不是选择性地靶向扩增的重复mRNA种类。
(iii)来自Furling et al.(Gene Therapy，Vol.10，p795-802，2003)的第三种方法使用表达149bp长的反义RNA的重组逆转录病毒在人DM1成肌细胞中抑制DMPK mRNA水平。逆转录病毒被设计用于向DM1细胞提供与39bp长的(CUG)13重复和在该重复之后的110bp区域互补的149bp长的反义RNA以增加特异性。与野生型DMPK转录本50％的减少的相比，这种方法导致了突变的(重复扩增的)DMPK转录本80％的减少，以及在被转染的DM1成肌细胞中恢复分化和功能特征。因此，这种方法也没有选择性靶向扩增的重复mRNA种类，它取决于非常长的反义RNA并且只能与重组病毒递送技术组合使用。
发明详述
上述方法和技术为与重复不稳定性和/或扩增相关的遗传疾病提供了导致受累的重复扩增的等位基因和未受累的或正常等位基因均非选择性降解的基于核酸的方法。此外，本领域使用的序列特异于与所述疾病相关的基因但没有提供可应用于数种与重复扩增相关的遗传病症的方法。最后，本领域只教导了涉及使用重组DNA载体递送***的方法，所述***需要适应每个寡核苷酸和靶细胞并且仍然需要进一步优化。
本发明提供通过使用包含或含有次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的短核酸分子或寡核苷酸提供了这些问题的解决方案，所述核酸分子包含只与扩增的重复区域互补的序列或由其组成，即其不依赖与包含重复的基因的外显子或内含子的独特序列的杂交。第二种解决方案包括使用包含只与扩增重复区域互补并且基本上不能招募和/或激活RNA酶H的序列或由其组成的短核酸分子；即RNA酶H基本上非依赖的核酸分子。两种解决方案也可以结合：本发明提供了包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的寡核苷酸或核酸分子的用途，所述寡核苷酸基本上不能招募和/激活RNA酶H。
不希望被理论限制，本发明可以通过改变未成熟RNA的转录后加工和/或剪接导致转录本水平的减少。通过可变剪接和/或转录后加工减少转录本水平可以产生缺乏过度扩增的或不稳定的(三)核苷酸重复，但仍具有功能活性的转录本。另外或可选择地，通过结合于mRNA的靶序列后启动或激活降解机制mRNA的稳定性会减少。通过改变的RNA加工和/或剪接和/或RNA稳定性减少异常转录本可以预防异常的、重复扩增转录本在细胞中的积累和/或翻译。
不希望被理论限制，本发明的方法也考虑提供针对具有扩增重复的受累的转录本的特异性，因为针对扩增重复杂交的动力学是更有利的。重复特异性互补的核酸寡核苷酸分子与RNA或DNA分子中互补延伸杂交的可能性随着重复延伸的大小增加而增加。RNA分子并且特别是包含互补序列的RNA分子通常内部配对，形成包含开环和封闭发夹状部分的二级结构。只有所述开环部分对于互补核酸相对容易接近。与疾病无关的野生型转录本的短重复延伸经常只有5至约20-40重复并且由于其二级结构相对难以与互补核酸进行碱基配对。相反，扩增的重复和与疾病相关的等位基因的重复单元通常至少是两倍扩增的但经常更多，3、5、10倍、高达100或对于某些不稳定重复病症甚至高于1000倍扩增。相对于野生型等位基因，这种扩增增加了重复部分是，至少临时是，处于开环结构的可能性并且因此而更易接近以与互补核酸分子进行碱基配对。所以尽管事实是寡核苷酸与野生型和重复扩增的转录本中都存在的重复序列互补并且理论上与两种转录本都杂交，但本发明教导了与重复域互补的寡核苷酸优选与疾病相关的或导致疾病的转录本杂交并且相对不影响正常转录本的功能。不管异常转录本降解的机制，这种选择性对于治疗重复不稳定性相关疾病是有益的。另外，至少2倍扩增但经常更多，3、5、10倍、高达100或甚至高于1000倍扩增允许结合更多寡核苷酸，这可以对减少突变转录本的机制有额外的效果。在本文语境中，本文设计的寡核苷酸能够在患者的细胞中、在患者的组织中和/或在患者中减少“包含重复的基因转录”和/或“治疗任何不稳定顺式元件DNA重复相关的遗传病症”。它优选意味着其减少包含延伸或不稳定数目重复的重复的疾病相关的或导致疾病的或突变的转录本在所述患者的细胞中、在所述患者的组织中和/或在所述中可检测数目。可选择的或与前一句组合的，所述寡核苷酸可以减少所述突变转录本的翻译。
因此本发明提供了不稳定顺势元件DNA重复相关的遗传病症的治疗方法，通过提供只与重复序列互补和/或可以杂交的核酸分子。因此本方法优先靶向扩增重复转录本并且相对不影响正常的、野生型等位基因的转录本。这是有利地，因为正常的等位基因可以因此提供基因的正常功能，取决于具有不稳定DNA重复的特定基因，这至少是理想的，并且可能在许多情况下对于待治疗细胞和/或个体是必需的。因此在本发明语境中，本文设计的寡核苷酸可被用于治疗任何“顺势元件重复不稳定性相关的遗传病症”。所述病症优选任何疾病，其中指定基因的等位基因包含重复序列即所谓的不稳定重复序列，因为出现于所述重复序列中重复的数目会随着所述疾病发展而增加或扩增。所述重复数目的增加或扩增发生在一个指定个体和/或指定个体的连续世代(后代)中。
而且，本方法不限于特定不稳定DNA重复相关的遗传病症，而是可应用于任何已知的不稳定DNA重复疾病，例如，但不仅限于：有聚谷氨酰胺(CAG)重复的编码区重复疾病：亨廷顿病、霍河综合征(Haw River syndrome)、肯尼迪氏病/脊髓延髓性肌萎缩、脊髓小脑共济失调或有聚丙氨酸(GCG)重复的疾病例如：婴儿痉挛症、颅骨锁骨发育异常(deidocranial dysplasia)、睑裂狭小/上睑下垂/倒转型内眦赘皮综合征、手脚生殖器症(hand-foot-genital syndrome)、并指(趾)多指(趾)畸形(synpolydactyly)、眼咽型肌营养不良、前脑无裂畸形。如发明所述在基因非编码区有重复的待治疗的疾病包括三核苷酸重复病症(主要为CTG和/或CAG和/或CCTG重复)：强直性肌营养不良1型、强直性肌营养不良2型、弗里德赖希氏共济失调(主要为GAA)、脊髓小脑共济失调、自闭症。而且本发明的方法可用于易脆位点相关的重复病症包括多种脆性X综合征、雅各布森综合征和其他不稳定重复元件病症例如癫痫性肌阵挛、面肩胛臂营养不良和糖尿病2型的某些形式。
本发明的另一个优点是重复区域特异的寡核苷酸可被直接给药至细胞并且不依赖基于载体的递送***。在现有技术中描述的技术，例如那些上文提到的用于治疗DM1的和从细胞中去除DMPK转录本的技术，需要使用基于载体的递送***以给予细胞足够水平的寡核苷酸。然而，由于目前对治疗用重组DNA载体的严格的安全规范、用于广泛临床应用的充足重组载体的生产和应用后对扩大的(或非特异的)应答有限的控制和逆转，治疗用途的质粒或病毒载体的使用还较不理想。尽管如此，将来的优化在这些领域是可能的，且质粒的病毒递送可以产生有利的长期持久的效应。本发明人惊人地发现了包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与扩增重复转录本的重复序列互补的序列或由其组成，由于它们用于杂交的分子靶标的扩增，所述寡核苷酸相对于对转录本中独特的序列特异的寡核苷酸，具有对其靶标显著增加的亲和性和/或亲和力。由于这种对重复扩增靶标转录本的高亲和性和亲和力，较低量的所述寡核苷酸足够产生足够的抑制和/或通过RNA酶H降解、RNA干扰降解或改变的转录后加工(包含但不仅限于剪接或外显子遗漏)活性减少重复扩增的等位基因。包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的寡核苷酸，所述寡核苷酸只与重复序列配对，可以通过合成产生并且当使用直接递送寡核苷酸至细胞和/或组织的普通应用技术直接递送至细胞时足够有效。当需要时，重组载体递送***可以通过使用本发明的方法和寡核苷酸规避。如下文所解释的，包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的寡核苷酸的用途十分有吸引力。例如，次黄嘌呤核苷是已知的修饰的碱基，可以与三种碱基配对：尿嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶。次黄嘌呤核苷是通过将次黄嘌呤以β-N9-糖苷键连接到核糖环(也称为呋喃核糖)上形成的核苷。次黄嘌呤核苷通常存在于tRNA中并且对于在摆动碱基对中遗传密码的正确翻译是必需的。摆动碱基对是RNA二级结构中基本的G-U和I-U/I-A/I-C对。其热力学稳定性与沃森-克里克配对相当。摆动碱基对对于遗传密码的正确翻译是重要的。遗传密码通过在反密码子第一个碱基使用修饰的碱基对弥补了氨基酸(20)和三重密码子(64)的数量差异。相似地，当设计用于聚合酶链式反应的引物时，次黄嘌呤核苷是有用的，在于它会无差别地与腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶配对。这允许人们设计跨越单个核苷酸多态性的引物，而不需要担心所述多态性会干扰引物的退火效率。本发明中，出现在本文定义的寡核苷酸中的次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷优选出现在所述寡核苷酸与本文定义的重复序列互补的部分。然而，次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷也可以出现在所述寡核苷酸不与重复序列互补的部分，例如在如本文随后鉴定的靶向配体中。
在本发明中，mRNA中(三)核苷酸重复扩增的表达可以导致多种依赖于三核苷酸重复序列和相关基因的疾病。例如，DM1是由DMPK转录本的外显子15中(CUG)n重复引起的，而HD是由亨廷顿转录本的外显子1中(CAG)n重复引起的。特异靶向这些扩增重复需要两种寡核苷酸，然而，使用包含次黄嘌呤核苷的寡核苷酸可以导致设计同时针对两种转录本激活的一种寡核苷酸，即包含(CIG)n、(IGC)n或(GCI)n或由其组成，优选核苷酸总长为9-50，更优选为12-40，最优选为15-30个。在整个申请的语境中，本领域技术人员会理解n是优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多的整数。然而，所述寡核苷酸的长度本身并非是3的倍数。在实施方案中，本发明的寡核苷酸有3的倍数的长度。因此，使用次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷可以减少必须设计或开发的可能用于针对数种疾病的药物的核酸分子的数量。表2举例说明如何设计针对每种已知重复的包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶的寡核苷酸。
在第一方面，本发明公开和教导了优选包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的寡核苷酸用于制备诊断、治疗或预防人类与顺式元件重复不稳定性相关的遗传病症的药物的用途，所述寡核苷酸优选为RNA酶H基本上非依赖的，以及所述寡核苷酸包含只与人类基因转录本的重复序列互补的序列或由其组成。因此本发明提供了与顺势元件重复不稳定相关的遗传病症的治疗方法。
在第二方面，本发明还涉及优选包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的寡核苷酸，所述寡核苷酸优选为RNA酶H基本上非依赖的并且所述寡核苷酸优选用于本发明的第一方面和/或应用于本发明的方法中以预防重复扩增的转录本在细胞中积累和/或翻译。
优选包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的寡核苷酸优选是RNA酶H基本上非依赖的并且可以包含只与如下文定义的重复序列互补的序列。这意味着所述寡核苷酸还可以包含不与待治疗细胞中存在的序列互补的额外部分。例如所述额外部分可以是克隆过程中加入的，和/或是如本文随后定义的靶向部分。
在可选择的实施方案中，这可以意味着所述寡核苷酸还可以包含与待治疗细胞中存在的序列互补的额外部分。例如这一额外部分可以是侧翼连接于重复区域的序列。或者，这一额外部分可以例如是不直接侧翼连接于重复区域的序列。或者，这一额外部分可以例如是不直接侧翼连接于重复区域并且包含功能基序(例如，但不仅限于，ESE)的序列。或者，例如这一额外部分可以是不直接侧翼连接于重复区域但由于二级或三级结构而接近。优选地，所述重复序列是本发明的寡核苷酸全长的至少50％，更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％或更多。在最优选实施方案中，本发明的寡核苷酸由只与下文定义的重复序列互补的序列组成。例如，寡核苷酸可以包含只与下文定义的重复序列互补的序列和随后称为靶向配体的靶向部分。
重复或重复元件或重复序列或重复延伸在本文定义为至少3、4、5、10、100、1000或更多连续重复的重复单元或重复核苷酸单元或包含在受试者包括人受试者的基因组中转录的基因序列中的三核苷酸重复单元、或可选地4、5或6核苷酸重复单元的重复核苷酸单元。
本发明的寡核苷酸优选含有或包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷。更优选地，所述寡核苷酸包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶。在本发明的语境中，含有(contain)优选意味着包含(comprise)。包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的寡核苷酸可以定义为其中至少一个核苷被次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷取代的寡核苷酸。本领域技术人员知道如何测试核苷是否含有能形成摆动碱基对的碱基。例如由于次黄嘌呤核苷可与尿嘧啶、腺嘌呤和/或胞嘧啶形成碱基对，这意味着至少一个可与尿嘧啶、腺嘌呤和/或胞嘧啶形成碱基对的核苷被次黄嘌呤核苷取代。然而，为了维护特异性，包含次黄嘌呤核苷的寡核苷酸优选包含至少一个可与尿嘧啶或腺嘌呤或胞嘧啶形成碱基对的核苷取代。更优选地，所有可与尿嘧啶或腺嘌呤或胞嘧啶形成碱基对的核苷都被次黄嘌呤核苷取代。例如，与重复元件(CAG)n或(CUG)n互补的包含次黄嘌呤核苷的寡核苷酸会包含(CIG)n、或(IGC)n、或(GCI)n或由其组成。表2示出可与(CAG)n、(CUG)n、(CGG)n、(GCG)n、(GAA)n、(GCC)n或(CCUG)n互补的包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶的寡核苷酸的实例。为了便利，在此表中n采用2。本领域技术人员会理解对于本发明的寡核苷酸，如本文随后定义的，n优选为包含3-17的整数。可以通过在指定重复序列(或基序)的任意位置开始或结束设计特异寡核苷酸，而没有一个或其他因而产生的序列更有效的的损害，这对于本领域技术人员也是显而易见的。例如与重复元件(CAG)n或(CUG)n互补的包含次黄嘌呤核苷的寡核苷酸会包含(CIG)n、或(IGC)n、或(GCI)n或由其组成。本发明也包括由于如本文定义的寡核苷酸中至少一个核苷被次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷取代，与重复元件诸如(CAG)n互补的寡核苷酸可以包含(CIG)n或由其组成。如上所提及的，所述互补的寡核苷酸也可以包含(IGC)n或(GCI)n或由其组成。如果以(CIG)n为例，以n为3为例，本发明包括基于诸如(CIG)3的指定式的在所示位置包含1或2或3个次黄嘌呤核苷的任何可能的寡核苷酸：(CTG)(CIG)(CTG)、(CIG)(CTG)(CTG)、(CIG)(CTG)(CIG)、(CIG)(CIG)(CTG)、(CIG)(CIG)(CIG)。
包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的寡核苷酸，所述寡核苷酸优选是RNA酶H基本上非依赖的，可以是单链的或双链的。双链的意味着寡核苷酸是两条互补链形成的异质二聚体，例如在siRNA中。在优选实施方案中，寡核苷酸是单链的。本领域技术人员会理解尽管单链寡核苷酸可以形成内部双链结构。然而这种寡核苷酸在本发明语境中仍然被称为单链核苷酸。单链寡核苷酸与双链siRNA寡核苷酸相比有数种优势：(i)其合成预期比两条互补siRNA链更为简单；(ii)有更宽的化学修饰可能性范围以优化更有效地摄入细胞、更好的(生理的)稳定性和减少可能的遗传不利效应；(iii)siRNA有更高的非特异作用(包括脱靶基因)和放大的药理学(例如，通过治疗方案或剂量对有效性和选择性的较小控制可能性)的可能性和(iv)siRNA较不可能在细胞核中起作用并且不能直接针对内含子。因此，在第一方面的优选实施方案中，本发明涉及优选包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的单链寡核苷酸用于制备用于诊断、治疗或预防人类与顺式元件重复不稳定性相关的遗传病症的药物的用途，所述寡核苷酸优选是RNA酶H基本上非依赖的，以及所述寡核苷酸包含只与人类基因转录本的重复序列互补的序列或由其组成。
寡核苷酸优选包含至少9至约50个与重复元件互补的连续核苷酸，或至少9-50个与重复元件互补的连续核苷酸，更优选12-45个核苷酸，甚至更优选12-40个核苷酸，甚至更优选12-30个，甚至更优选15-30个核苷酸以及最优选为与优选有三核苷酸重复单元或四核苷酸重复单元的重复延伸互补的12-25个核苷酸。优选包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的寡核苷酸优选是RNA酶H基本上非依赖的，可以与转录本编码区域优选聚谷氨酰胺(CAG)或聚丙氨酸(GCG)编码域中的重复延伸互补和/或能够与之杂交。所述寡核苷酸也可以与存在于前体RNA分子中的非编码区域例如5’或3’非翻译区域或内含子序列互补和/或能够与之杂交。
在优选实施方案中，优选包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷、优选是RNA酶H基本上非依赖的并且用于本发明的方法的寡核苷酸包含与具有选自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重复核苷酸单元作为重复核苷酸单元的重复元件互补的序列或由其组成。所述寡核苷酸可以是单或双链寡核苷酸。在优选实施方案中，所述寡核苷酸是双链的。因为寡核苷酸优选包含至少9至约50个与重复元件互补的连续核苷酸，更优选包含至少9-50个与重复元件互补的连续核苷酸，这意味着n是包含3-17的整数，更优选为4-15，甚至更优选为4-14，甚至更优选为4-13，甚至更优选为4-10，甚至更优选为5-10和最优选为4-8或4-9。
优选包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷和优选为RNA酶H基本上非依赖的以及包含与转录本中聚谷氨酰胺(CAG)n域互补的序列或由其组成的寡核苷酸的用途，特别用于诊断、治疗和/或预防由于HD、HDL2/JPH3、SBMA/AR、SCA1/ATX1、SCA2/ATX2、SCA3/ATX3、SCA6/CACNAIA、SCA7、SCA17、AR或DRPLA人基因重复扩增引起的人类病症亨廷顿病、几种形式的脊髓小脑共济失调或霍河综合征、X连锁的脊髓和延髓性肌萎缩和/或齿状核红核苍白球萎缩症。这类寡核苷酸，优选包含次黄嘌呤核苷的这类寡核苷酸优选包含(CIG)n、或(IGC)n、或(GCI)n或由其组成。对于其他优选可能性见表2。
优选包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷、优选为RNA酶H基本上非依赖的以及包含与转录本中聚丙氨酸(GCG)n域互补的序列或由其组成的寡核苷酸的用途，特别用于诊断、治疗和/或预防由于ARX、CBFA1、FOXL2、HOXA13、HOXD13、OPDM1PABP2、TCFBR1或ZIC2人基因重复扩增引起的人类病症：婴儿痉挛症、颅骨锁骨发育不良、睑裂狭小、手脚生殖器症、并指(趾)多指(趾)畸形、眼咽型肌营养不良和/或前脑无裂畸形。对于优选的寡核苷酸见表2。
优选包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷、优选为RNA酶H基本上非依赖的以及包含与转录本中(CUG)n重复互补的序列或由其组成的寡核苷酸的用途，特别用于诊断、治疗和/或预防分别由于DM1/DMPK、SCA8或JPH3基因重复扩增引起的人类遗传病症强直性肌营养不良1型、脊髓小脑共济失调8和/或类亨廷顿病2。优选地，这些基因来自人的来源。这类寡核苷酸，优选这类含有次黄嘌呤核苷的寡核苷酸优选包含(CIG)n、或(IGC)n、或(GCI)n或由其组成。对于其他优选的寡核苷酸，见表2。
优选包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷、优选为RNA酶H基本上非依赖的以及包含与转录本中(CCUG)n重复互补的序列或由其组成的寡核苷酸的用途，特别用于诊断、治疗和/或预防由于DM2/ZNF9基因重复扩增引起的人类遗传病症强直性肌营养不良2型。对于优选的寡核苷酸，见表2。
优选包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷、优选为RNA酶H基本上非依赖的以及包含与转录本中(CGG)n重复互补的序列或由其组成的寡核苷酸的用途，特别用于诊断、治疗和/或预防由于FRAXA/FMR1、FRAXE/FMR2和FRAXF/FAM11A基因重复扩增引起的人类脆性X综合征。对于优选的寡核苷酸，见表2。
优选包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷、优选为RNA酶H基本上非依赖的以及包含与转录本中(CCG)n重复互补的序列或由其组成的寡核苷酸的用途，特别用于诊断、治疗和/或预防由于FRA11B/CBL2基因重复扩增引起的人类遗传病症雅各布森综合征。对于优选的寡核苷酸，见表2。
优选包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷、优选为RNA酶H基本上非依赖的以及包含与转录本中(GAA)n重复互补的序列或由其组成的寡核苷酸的用途，特别用于诊断、治疗和/或预防人类遗传病症弗里德赖希氏共济失调。对于优选的寡核苷酸，见表2。
优选包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷、优选为RNA酶H基本上非依赖的以及包含与内含子中(ATTCT)n重复互补的序列或由其组成的寡核苷酸的用途，特别用于诊断、治疗和/或预防人类遗传病症脊髓小脑共济失调10型(SCA10)。对于优选的寡核苷酸，见表2。
所述重复互补的寡核苷酸或用于本发明方法中的寡核苷酸可以包含以下或由以下组成：RNA、DNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、***啉磷酰二胺(morpholino phosphorodiamidates)(PMO)、乙烯桥核酸(ENA)或其包含天然存在的DNA和RNA核苷酸以及合成的、修饰的核苷酸组合物的混合物或杂交物。本领域技术人员也会认识到，任何人类核苷酸碱基，并且任何其他天然或合成的核苷酸碱基或其衍生物都可以被使用，例如：2-胺基嘌呤、胸腺嘧啶代替尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基次黄嘌呤核苷、5-甲基鸟嘌呤核苷、二胺基腺嘌呤。本领域技术人员也会认识到有许多寡核苷酸的合成衍生物。因此“寡核苷酸”包括，但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、二胺基硫代磷酸酯和H-磷酸酯衍生物。它还包括天然存在的和合成的寡核苷酸衍生物。
在这类寡核苷酸中，磷酸二酯主链化学还可以被其他修饰取代，例如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯。已存在其他的寡核苷酸修饰，新的寡核苷酸修饰也可能被开发和用于实践。然而，所有这些寡核苷酸具有寡聚体的特征，能够序列特异结合于RNA。因此，在优选实施方案中，寡核苷酸包含以下或由以下组成：有或没有含有硫代磷酸酯的主链的RNA核苷酸、2’O-取代的RNA核苷酸、DNA核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)核苷酸、***啉磷酰二胺、乙烯桥核酸(ENA)核苷酸或其混合物。
至少部分含有天然存在的DNA核苷酸的寡核苷酸用于在细胞中通过RNA酶H活性(EC.3.1.26.4)诱导DNA-RNA杂交分子降解。
包含天然存在的RNA核糖核苷酸或类RNA合成的核糖核苷酸的寡核苷酸可以应用于本发明的方法中以形成双链RNA-RNA杂交物，其通过RNA干扰或沉默(RNAi/siRNA)途径作为酶依赖性反义起作用，包括通过正-反义链配对的靶RNA识别，随后通过RNA诱导的沉默复合体(RISC)降解靶RNA。
可选择地或另外地，空间位阻的反义寡核苷酸(RNA酶H非依赖反义)干扰基因表达或其他前体RNA或信使RNA依赖的细胞内过程，具体是但不限于RNA剪接和外显子遗漏，通过结合于RNA转录本的靶序列以及阻碍例如翻译的过程或封闭剪接供体或剪接受***点。利用修饰的反义寡核苷酸改变剪接和外显子遗漏技术有很多文献记载，是本领域技术人员已知的，并且例如可以在US6,210,892、W09426887、WOO41083446和W002124906中找到。此外，空间位阻可以抑制蛋白质、核因子等的结合并且因此有助于在如DM1的疾病中减少核积聚或核糖核酸灶。
本文定义的可以包含合成的或修饰的核苷酸、与(扩增)重复序列互补的寡核苷酸用于本发明的方法中，用于通过siRNA/RNA干扰或沉默途径减少或失活包含重复的转录本。
用于本发明中方法的单或双链寡核苷酸可以包含以下或由以下组成：DNA核酸、RNA核酸、2’-O取代的核糖核苷酸(优选2’-O-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸)包括烷基和甲氧基乙基取代(包括本文确定的2’-4’约束的变体)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和***啉(PMO)反义寡核苷酸和乙烯桥核苷酸(ENA)和其组合物，任选地RNA酶H依赖反义的嵌合体。优选的寡核苷酸包含2’-O-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸，优选其中所述2’-O取代是甲氧基乙基(MOE)和/或甲基(Me)和/或2’O，4’C亚甲基桥(LNA)和/或2’O，4’C约束的乙基(cEt)和/或2’O，4’C约束的甲氧基乙基(cMOEt)(参考文献：Short Antisense Oligonucleotides with Novel 2’-4’Conformationaly Restricted Nucleoside Analogues Analogues Show Improved Potency without Increased Toxicityin Animals，Punit P.Seth，Andrew Siwkowski，Charles R.Allerson，Guillermo Vasquez，Sam Lee，Thazha P.Prakash，Edward V.Wancewicz，Donna Witchell，和Eric E.Swayze，J.Med.Chem.，2009，52(1)，10-13)。将锁核酸整合至所述寡核苷酸改变碱基配对后螺旋构象并且增加双链体稳定性。整合LNA碱基至所述寡核苷酸序列可以因此用于增加本发明的互补寡核苷酸在体外和体内活化的能力，以增加RNA降解抑制转录本积累或增加外显子遗漏能力。肽核酸是人工DNA/RNA模拟物，其主链是假肽而不是糖，其具有通过增加的结合和较高解链温度与互补DNA寡聚体形成极稳定的复合体的能力。PNA也是本发明中反义和外显子遗漏应用的优等试剂。更优选地，用于本发明中方法的寡核苷酸至少部分或全部地包含2’-O-甲氧基硫代磷酸酯RNA核苷酸、2’-O-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸和/或锁核酸(LNA)。甚至更优选地，寡核苷酸包含LNA和2’-O-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸或由其组成。在另一优选实施方案中，寡核苷酸包含LNA和硫代磷酸酯DNA核苷酸或由其组成。在另一优选实施方案中，寡核苷酸包含LNA和2’-O-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸和硫代磷酸酯DNA核苷酸或由其组成。在另一优选实施方案中，寡核苷酸包含LNA和2’-O-甲氧基乙基硫代磷酸酯RNA核苷酸或由其组成。在另一更优选实施方案中，寡核苷酸由PMO寡核苷酸组成。在另一优选实施方案中，寡核苷酸由2’-O-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸组成。最优选地，这些修饰应用于会通过其他机制而不是RNA酶H使突变mRNA分解或抑制的构型中。最优选用于本发明中以用于顺式元件重复不稳定性遗传病症的诊断、治疗或预防的寡核苷酸包含与选自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(CCG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重复序列互补的序列或由其组成，长度为9-50，更优选为12-40，最优选为12-25个核苷酸，以及包含2’-O-甲氧基乙基硫代磷酸酯RNA核苷酸、2’-O-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸、LNA核苷酸或PMO核苷酸。
可选择地或与一个或多个之前定义的优选实施方案组合，本发明还具体地提供了包含只与基因转录本的重复序列互补的序列或由其组成的寡核苷酸，以及它制备用于治疗或预防人类顺式元件重复不稳定性相关的遗传病症药物的用途，并且该寡核苷酸是RNA酶H基本上非依赖的寡核苷酸。
RNA酶H基本上非依赖的寡核苷酸优选定义为如下的寡核苷酸：结合于靶向的RNA后基本上不能募集和/或激活RNA酶H。RNA酶H的募集和/或激活可以通过将待测靶向的RNA和寡核苷酸与优选来自大肠杆菌(E coli)的RNA酶H接触后使用标准RNA酶H消化检测评价。这类检测为本领域技术人员所已知并且可以如Honcharenko D et al或Kurreck J et al(Honcharenko D et al，(2007)，Biochemistry，46：5635-5646，和Kurreck J et al(2002)，Nucl.Ac.Res.，30：1911-1918)所描述的来实施。在本发明语境中，寡核苷酸或指定剂量或浓度的寡核苷酸优选所述基本不能募集和/或激活RNA酶H和/或所述基本上RNA酶H非依赖的寡核苷酸，当在以上定义的两种试验中的至少一种时，少于50％的靶向的RNA被消化。更优选地，少于45％的靶向的RNA被消化，甚至更优选少于40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少。最优选地，寡核苷酸或指定剂量或浓度的所述寡核苷酸不能募集和/激活RNA酶H。在优选实施方案中，预期当寡核苷酸在浓度范围中使用时，其中所述寡核苷酸作为用于本文定义的所述疾病的药物，所述寡核苷酸基本上不能募集和/或激活RNA酶H和/或所述RNA酶H基本上非依赖的。在这种情况下，优选在这类试验中没有检测到靶向的RNA的消化。这类寡核苷酸是RNA酶H非依赖的寡核苷酸。迄今为止反义的许多形式已被描述包括降解靶mRNA的酶依赖机制例如RNA酶H活性。RNA酶H只裂解RNA-DNA双链体并且因此为了下调mRNA，反义寡核苷酸应该包含脱氧核糖(DNA)核苷酸。轻微修饰例如使用硫代磷酸酯脱氧核糖核苷酸是被允许的以保留这种RNA酶H活性。嵌合寡核苷酸(或寡聚体)由于其稳定的性质(提高生理稳定性或半衰期)已被使用，例如在寡核苷酸的3’和5’末端应用2’O-烷基和2’O-甲氧基乙基修饰。然而，通过寡核苷酸-靶RNA双链体的RNA酶H募集，仍然需要脱氧核糖核苷酸延伸。这些嵌合寡核苷酸(有或没有硫代磷酸酯主链修饰)被称为间断体(gapmer)(见WO2007/089611)。人们相信这类(脱氧核糖)间断应该优选至少长为6个核苷酸并且更优选为长为10个核苷酸以便可以募集和/或激活RNA酶H。
因此，在本发明的优选实施方案中，寡核苷酸被设计为在结合于靶向的RNA后基本上不募集和/或激活RNA酶H。本发明优选使用寡核苷酸(寡聚体)，其优选基本上不能募集和/或激活RNA酶H。这类寡核苷酸可以包含例如2’-O主链修饰，优选2’O-烷基或2’O-甲氧基乙基、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或***啉反义。这类寡核苷酸可以甚至是包含脱氧核苷酸的嵌合分子，但优选具有少于9个或最优选有少于6个脱氧核苷酸彼此相邻(连续脱氧核苷酸)。
惊人地，本发明证明RNA酶H基本上非依赖的寡核苷酸可被用于制备用于治疗或预防人类顺式元件重复不稳定性相关的遗传病症的药物。所述RNA酶H基本上非依赖的寡核苷酸比相应的经典的RNA酶H依赖的寡核苷酸更有吸引力，因为我们能够合理地预期这类RNA酶H基本上非依赖的寡核苷酸比相应的RNA酶H依赖的对应物更容易被合成、毒性更小和更稳定。
因此，在优选实施方案中，提供了寡核苷酸和其用途，其中所述用途如上文所定义的，并且其中所述寡核苷酸长度为约9至约50个核苷酸，在其5’或3’末端的至少一个被取代并且在其序列的其余部分包含少于9，更优选少于6个的连续脱氧核糖。寡核苷酸的更优选的长度已经在本文定义。优选的取代包括含硫代磷酸酯的主链。优选的含硫代磷酸酯的主链包括2’-O-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸。优选的2’-O-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸包括2’-O-取代的甲氧基乙基和/或甲基和/或2’O，4’C亚甲基桥(LNA)和/或2’O，4’C约束的乙基(cEt)和/或2’O，4’C约束的甲氧基乙基(cMOEt)。
如本文定义的，寡核苷酸在其5’或3’末端的至少一个被取代并且在其序列的其余部分包含少于9、更优选少于6个的连续的脱氧核糖。所述序列的其余部分优选在序列的中心。在其5’或3’末端均被取代并且在其序列的中心包含9或更多个连续脱氧核糖的寡核苷酸被称为间断体(gapmer)。间断体已在WO 2007/089611被详细描述。间断体被设计为能够募集和/或激活RNA酶H。不希望被理论限制，相信RNA酶H通过结合于脱氧核糖形成的间断体的中心区域被募集和/或激活。本发明的RNA酶H基本上非依赖的寡核苷酸被设计为以便具有基本上不能募集和/或激活RNA酶H的中心区域。在优选实施方案中，本发明寡核苷酸的序列的其余部分，更优选其中心部分包含少于9、8、7、6、5、4、3、2、1或没有脱氧核糖。因此，本发明的寡核苷酸优选如上文定义的部分至全部被取代。部分取代的优选意味着寡核苷酸包含其至少50％的核酸已被取代，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(即全部)被取代。
因此，在优选实施方案中，包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷、优选RNA酶H基本上非依赖的和用于本发明的寡核苷酸包含与选自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重复序列互补的序列或由其组成，长度为9-50个核苷酸，并且进一步表征为：
a)包含2’-O-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸例如2’-O-甲基或2’-O-甲氧基乙基或2’-O，4’C乙烯基(cEt)、2’-O，4’C甲氧基乙烯基(cMOE)RNA硫代磷酸酯核苷酸、LNA核苷酸或PMO核苷酸。所述核苷酸可以用于任何组合和/或同DNA硫代磷酸酯核苷酸或RNA核苷酸使用；和/或
b)是单链寡核苷酸。
因此，在另一优选实施方案中，包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷、优选RNA酶H基本上非依赖的和用于本发明的寡核苷酸包含与选自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重复序列互补的序列或由其组成，长度为9-50个核苷酸，并且进一步表征为：
a)包含2’-O-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸例如2’-O-甲基或2’-O-甲氧基乙基或2’-O，4’C乙烯基(cEt)、2’-O，4’C甲氧基乙烯基(cMOEt)RNA硫代磷酸酯核苷酸、LNA核苷酸或PMO核苷酸。所述核苷酸可以用于任何组合和/或同DNA硫代磷酸酯核苷酸或RNA核苷酸使用；和/或
b)是双链寡核苷酸。
在另一优选实施方案中，上述优选修饰会应用于通过其他机制而不是RNA酶H使突变mRNA分解的构型中。
如果，本发明涉及具有两条互补链的双链寡核苷酸，其反义链，只与人的基因转录本中的重复序列互补，这种双链寡核苷酸优选不是应用于培养的猴成纤维细胞(COS-7)或人成神经细胞瘤(SH-SY5Y)细胞系的具有反义RNA链(CUG)7和有义RNA链(GCA)7的siRNA，所述细胞或细胞系有或没有用融合了GFP的人亨廷顿基因外显子1转染，如Wanzhao Liu et al(Wanzhao Liu et al，(2003)，Proc.Japan Acad，79：293-298)所描述的。更优选地，本发明即不涉及双链寡核苷酸siRNA(反义链为(CUG)7和有意义链为(GCA)7)，也不涉及其制备用于治疗或预防亨廷顿病、甚至更优选用于治疗或预防包含亨廷顿病基因外显子1构建体的药物的用途。
尽管使用单寡核苷酸可以充分地减少诸如核积累的DMPK或ZNF9转录本或其片段的重复扩增的转录本的数量，或充分地减少重复扩增的HD蛋白质的积累，组合2、3、4、5或更多寡核苷酸也在本发明的范围内。包含与转录本重复部分互补的序列或由其组成的寡核苷酸可以有利地与另一寡核苷酸组合，所述另一寡核苷酸包含与含重复的转录本的独特序列互补和/或能够与之杂交的序列或由其组成。如本文前面定义的，本发明包括含有次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷和优选RNA酶H基本上非依赖的寡核苷酸的用途。本发明也包括将含有次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的寡核苷酸与为RNA酶H基本上非依赖的寡核苷酸另一寡核苷酸组合使用。包含重复特异性寡核苷酸的本发明的方法和本发明的药物也可以与任何其他针对顺式元件重复不稳定性遗传病症的治疗或药物组合。
出于诊断目的，包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷、优选RNA酶H基本上非依赖的和用于本发明方法中的寡核苷酸可以带有放射性标记或荧光标记以允许在样品、细胞、体内原位细胞、离体或体外检测转录本。对于强直性肌营养不良，标记的寡核苷酸可被用于诊断目的，用于DMPK或ZNF9RNA转录本分子和相关蛋白质的核聚集体的可视化。荧光标记可以包括CY3、CY5、FITC、TRITC、若丹明(Rhodamine)、GFP和其他类似物。放射性标记可以包括3H、35S、32/33p、125I。酶和/或免疫原性半抗原例如地高辛、生物素和其他分子标签(HA、Myc、FLAG、VSV、lexA)也可以使用。因此，在另一方面，本发明公开了体外或离体检测和/或诊断方法，其中使用了如上文定义的包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷以及优选RNA酶H基本上非依赖的寡核苷酸。
包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷、优选RNA酶H基本上非依赖的以及按照本发明使用的寡核苷酸适用于直接给药至受顺式元件重复不稳定性遗传病症侵袭或有发展为该病症风险的个体体内的细胞、组织和/或器官，以及可以直接进行体内、离体或体外给药。可选择地，所述寡核苷酸可以通过能够使人的细胞表达所述寡核苷酸的核酸载体提供，以允许所述寡核苷酸的持续来源。可以将本发明的寡核苷酸分子以表达载体形式提供给待治疗的细胞、组织、器官和/或受试者，所述表达载体能够使人的细胞表达所述寡核苷酸。优选通过基因递送媒介将载体导入细胞。优选用于递送的媒介是病毒载体例如逆转录病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)，腺病毒载体、赛姆利基森林病毒载体(Semliki Forest virus vectors)(SFV)、EBV载体等。质粒、人工染色体、适用于在人的细胞基因组中进行靶向同源重组和整合的质粒也可以适用于递送寡核苷酸。优选用于本发明的是那些其中转录受polIII启动子驱动，和/或其中转录本是与U1或U7转录本融合的形式的载体，其在递送小转录本时产生好的效果。
在优选实施方案中，包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷以及优选RNA酶H基本上非依赖的寡核苷酸的使用浓度范围为约0.1nM至约1μM。更优选地，使用浓度范围为约0.3至约400nM，甚至更优选地，约1至约200nM。优选的浓度为0.1nm至1μM。更优选地，使用浓度为0.3至400nM，甚至更优选地1至200nM。如果使用了数种寡核苷酸，这一浓度可以指寡核苷酸的总浓度或加入的每种寡核苷酸的浓度。如上文给出的寡核苷酸的浓度范围是在体外或离体使用的优选浓度。本领域技术人员会理解取决于使用的寡核苷酸、待治疗的靶细胞、靶基因和其表达水平，使用的培养基和转染与孵育条件，使用的寡核苷酸的浓度还可以变化并且可能需要进一步优化。
更优选地，包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷、优选RNA酶H基本上非依赖的和用于本发明以预防、治疗或诊断顺式元件重复不稳定性病症的寡核苷酸通过合成制备，并且以药学上可接受的组合物的制剂形式直接给予细胞、组织、器官和/或患者或个体或受试者。将所述药物组合物递送至受试者优选通过一种或多种肠胃外注射实施，例如静脉内的和/或皮下的和/或肌肉内的和/或鞘内的和/或脑室内的给药，优选在人体的一个或多个部位注射。鞘内或脑室内给药(在脑脊髓流体中)优选通过向受试者体内引入扩散泵实现。数种扩散泵对于本领域技术人员是已知的。
包含与本文定义的重复序列互补的序列或由其组成的用于靶向寡核苷酸分子的药物组合物可以包含多种赋形剂例如稀释剂、填充剂、防腐剂、增溶剂等，这些可以在例如The Science and Practice of Pharmacy(制药科学与实践)，第20版.Baltimore，MD：Lippincott Williams & Wilkins，2000中找到。
本发明的方法特别地优选使用可以辅助递送所述寡核苷酸至细胞和进入细胞的赋形剂，特别是能够形成将复合于或捕获于泡囊或脂质体的物质和/或寡核苷酸递送通过细胞膜的复合物、泡囊和/或脂质体的赋形剂。许多这种物质在本领域内是已知的。合适的物质包括聚乙烯基亚胺(PEI)、ExGen 500、合成的两性分子(SAINT-18)、lipofectinTM、DOTAP和/或能自我装配成微粒的病毒壳体蛋白质，其能够递送所述寡核苷酸至细胞。Lipofectin代表脂质体转染剂的实例。其由两种脂质组分组成，阳离子脂质N-[1-(2，3二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯铵(DOTMA)(cp.DOTAP，其为甲基硫酸盐)和中性脂质二油酰基磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine)(DOPE)。中性组分介导细胞内释放。另一组递送***是聚合纳米粒。众所周知为DNA转染试剂的如二乙氨基乙氨基乙基(DEAE)-葡聚糖(di ethyl amino ethylaminoethyl(DEAE)-dextran)之类的聚阳离子，可以与氰基丙烯酸丁酯(PBCA)和氰基丙烯酸己酯(hexylcyanoacrylate)(PHCA)结合形成能够递送寡核苷酸透过细胞膜进入细胞的阳离子纳米粒。除了这些常用的纳米粒之外，阳离子肽鱼精蛋白提供了可选择的途径以将寡核苷酸配制成胶体。这种胶体纳米粒***可以形成所谓的蛋白微粒(proticles)，其可通过简单的自我装配过程制备以包裹和介导本文定义的寡核苷酸在细胞内释放。本领域技术人员可以选择和调整任何上述或其他可商购的可选择的赋形剂和递送***以包裹和递送用于本发明的寡核苷酸以递送用于治疗人类顺式元件重复不稳定性病症的这类寡核苷酸。
另外，包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷和优选RNA酶H基本上非依赖的寡核苷酸可以共价或非共价连接于经特异设计以促进摄入细胞、细胞质和/或其核的靶向配体。这类配体可以包括(i)识别细胞、组织或器官特异元件、促进细胞摄入的化合物(包括但不仅限于肽(样)(结构)和/或(ii)能够促进寡核苷酸摄入至细胞和/或从泡囊例如内体或溶酶体细胞内释放的化学化合物。这类靶向配体也包括促进寡核苷酸通过血液脑屏障摄入至脑中的分子。
因此，在优选实施方案中，包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷以及优选为RNA酶H基本上非依赖的寡核苷酸是药物的一部分或被视为药物并且被提供至少一种赋形剂和/或用于递送的靶向配体和/或递送所述寡核苷酸至细胞和/或增强其细胞内递送的递送装置。因此，本发明也包括包含本发明的寡核苷酸并且还包含至少一种赋形剂和/或用于递送的靶向配体和/或递送所述寡核苷酸至细胞和/或增强其细胞内递送的递送装置的药学上可接受的组合物。
本发明也涉及用于减少细胞内包含重复的基因转录本的方法，其包括单链或双链寡核苷酸的给药，所述寡核苷酸包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷、优选为RNA酶H基本上非依赖的以及优选包含2’-O-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸例如2’-O-甲基或2’-O-甲氧基乙基RNA硫代磷酸酯核苷酸或LNA或cET或cMOE核苷酸或PMO核苷酸，并且具有只与重复序列互补的9-50个核苷酸的长度。所述核苷酸可以组合和/或与DNA硫代磷酸酯核苷酸一起使用。
在本文和其权利要求中，动词“包含”和其词形变化以其非限定意义使用，意指包括该词之后的项目，但并不排除没有具体提及的组合和/或项目。
另外动词“组成为(to consist)”可以被“基本由...组成”替代，意指本文定义的分子或基于病毒的载体或组合物除具体鉴定的组分还可以包含额外的组分，所述额外的组分不改变本发明的独特特征。
优选地，单词“约(about)”或“大约(approximately)”与数值联用时(约10)意指该值可以是比给定值10大或小1％的值。
另外，通过不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”提及的元素并不排除多于一个元素存在的可能性，除非上下文明确地要求为一个并且只有一个元素。因此不定冠词“a”或“an”通常意味着“至少一个”。
通过下面的实施例进一步说明本发明，这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1：显示以不同浓度的寡核苷酸PS58或PS142处理后DM500肌管中浓度应答曲线。寡(核糖)核苷酸PS58显示出全长2’O-甲基硫代磷酸酯修饰的主链以及寡(脱氧核糖)核苷酸PS142显示全长硫代磷酸酯DNA主链。PS58比PS142更有效地抑制突变扩增的hDMPK转录本。PS58，不像PS142，包含通过寡核苷酸防止RNA酶H介导的靶mRNA降解的2’OMe修饰。hDMPK的表达通过Northern印迹分析随后以磷光显像仪分析定量。所述信号用GAPDH信号标准化并且相对于模拟(mock)处理后的应答表示。
图2：
对来自患亨廷顿病的男性患者的GM00305成纤维细胞用寡核苷酸PS57(CUG)7或PS261(CIG)7在不同浓度处理后进行RT-PCR分析。GM00305的分析显示了代表突变(扩增的疾病)等位基因和正常等位基因的转录本的两种RT-PCR产物。PS57和PS261显示剂量依赖的对突变转录本的抑制。
图3：
对来自患亨廷顿病的男性患者的GM00305成纤维细胞或来自健康志愿者的PAFC1成纤维细胞用寡核苷酸PS262(UGC)7在不同浓度处理后进行RT-PCR分析。对照处理的GM00305分析显示了代表突变(扩增的疾病)等位基因和正常等位基因的转录本的两种RT-PCR产物，而PAFC1细胞的分析显示了一种RT-PCR产物，表示两个正常等位基因的转录本。PS262对GM00305中突变转录本比对GM00305或PAFC1中正常转录本显示更有效的抑制。
图4.
突变转录本的RT-PCR产物(来自图2和图3也描述的实验)的水平确定为与正常转录本的比，并且表示为对照处理(设为100％)的百分比。本图描述在GM00305细胞中用不同浓度的PS262(方块)、PS57(圆形)和PS261(三角形)处理后突变比正常等位基因转录本的浓度依赖的减少。
图5.
对来自患亨廷顿病的男性患者的GM00305成纤维细胞用寡核苷酸PS57处理4h后进行RT-PCR分析。处理开始后的24h(圆形)或48h(菱形)时收集细胞。突变转录本的RT-PCR产物的水平确定为与正常转录本的比，并且表示为对照处理(设为100％)的百分比。本图描述在PS574h处理时段开始之后的24h(圆形)或48h(菱形)时突变比正常等位基因转录本的浓度依赖的减少。
图6.
对来自患亨廷顿病的男性患者的GM00305成纤维细胞用寡核苷酸PS278或PS277或对照处理后进行RT-PCR分析。PS278和PS277原则上均是结合于靶mRNA时能够激活RNA酶H的间断体(只在寡核苷酸的3’和5’末端包含2’O-甲基取代的嵌合体的)。PS277包括单个错配。GM00305的分析显示了两种RT-PCR产物，其表示源自突变(扩增的疾病)等位基因和正常等位基因的转录本。
图7.
GM00305中突变转录本的RT-PCR产物(来自图2和图6也描述的实验)的水平确定为与正常转录本的比，并且表示为对照处理(设为100％)的百分比。本图描述在用50nM PS57(封闭柱)、PS278(条点柱)和PS261(条纹柱)处理后突变比正常等位基因转录本的浓度依赖的减少。
图8显示了用200nM寡核苷酸PS259(有可选择的起始核苷酸)或200nM寡核苷酸PS261(包含替代腺苷(A)的次黄嘌呤核苷(I))处理后DM500肌管中hDMPK mRNA水平(实心柱)。hDMPK的表达通过Northern印迹分析随后以磷光图像仪分析定量。所述信号用GAPDH信号标准化并且相对于模拟处理后的应答表示。以PS259或PS261处理导致hDMPK mRNA水平减少。实心柱描述hDMPK和空心柱描述m(鼠)DMPK；mDMPK不包含三联核苷酸重复区域。
图9.显示了用PEI(200nM寡核苷酸)或可选择地用脂质转染胺(lipofectamine)2000(50nM寡核苷酸)转染后，用双链siRNA寡核苷酸组合物PI-01或PI-02处理后DM500肌管中的hDMPK mRNA水平。图8显示的处理后hDMPK信号表明相对于PS58，siRNA寡核苷酸抑制的缺乏。hDMPK的表达通过Northern印迹分析随后以磷光图像仪分析定量。所述信号用GAPDH信号标准化并且相对于模拟处理后的应答表示。PI-01或PI-02处理均专门针对重复的重复序列，与有效的寡核苷酸PS58相比并不导致hDMPK mRNA水平的减少。
实施例
实施例1.
本领域技术人员已知的技术从DM500小鼠取得永生成肌细胞细胞系。DM500小鼠源自从巴黎的古尔东(de Gourdon)组获得的小鼠。在DMPK基因中具有约500的不定(CTG)n重复长度的永生成肌细胞细胞系DM500生长至近汇合并且在5％CO2气体中于33℃下维持在0.1％明胶包被的器皿中。成肌细胞在添加了20％FCS、50μg/mL庆大霉素和20单位的γ-干扰素/mL的DMEM里近汇合生长。通过在Matrigel(BD Biosciences)包被的器皿上生长成肌细胞以及将汇合的成肌培养物在37℃置于添加了5％马血清和50μg/mL庆大霉素的DMEM中诱导肌管形成。在这种低血清培养基中5天后，收缩的肌管在培养物中产生并且以所需寡核苷酸转染。对于转染，将NaCl(500mM过滤灭菌)、寡核苷酸和转染试剂PEI(ExGen 500，Fermentas)以这一特定顺序加入并且直接混合。根据说明书(ExGen 500，Fermentas)，寡核苷酸转染溶液包含比例为每μg寡核苷酸5μl的ExGen500。室温孵育15分钟后，将寡核苷酸转染溶液加入至含有培养的肌管的低血清培养基并且轻轻混合。最终寡核苷酸浓度范围为10pM-600nM。模拟对照处理用不含寡核苷酸的转染溶液实施。在37℃孵育4小时后，将新鲜培养基加入至培养物(导致约2.3倍稀释)并且于37℃延长孵育过夜。次日，移去含有寡核苷酸的培养基并且将新鲜的低血清培养基加至在37℃再保持培养一天的肌管。将寡核苷酸加至肌管培养物后48小时(即换为低血清条件以诱导肌管形成后七天)，用“总RNA微量试剂盒(Total RNA mini kit)”(Bio-Rad)分离和制备RNA用于Northern印迹和RT-PCR分析。Northern印迹是与放射性人DMPK(hDMPK)探针和鼠GADPH探针杂交。用于DMPK的探针是由具有全3’UTR和11个CTG的DMPK开放阅读框组成的人DMPK cDNA。
人和鼠DMPK信号用磷光图像仪分析定量并且以GAPDH信号进行标准化。
图1描述寡核苷酸PS58和PS142对hDMPK信号的浓度依赖的抑制作用。PS58为结合于靶mRNA后不能激活RNA酶H的完全修饰的2’O-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸，在浓度低于DNA硫代磷酸酯寡核苷酸PS142约3000倍时有效。
实施例2.
来自患有亨廷顿病的男性患者的成纤维细胞(GM 00305)获自Coriell细胞库(Coriell Cell Repository)(Camden，New Jersey，US)并且根据所附的使用说明书和本领域技术人员已知的标准技术培养。亨廷顿病患者携带一个健康的和一个导致疾病的亨廷顿基因等位基因，分别导致有正常数量的和扩大数量的(CAG)重复的两种mRNA表达。对照成纤维细胞(PAFC1)获自在两个亨廷顿等位基因中有正常重复长度的健康志愿者。
以均针对亨廷顿转录本的互补三联体重复(CAG)的寡核苷酸PS57、PS261、PS262、PS277和PS278转染所述成纤维细胞。按生产商的说明，使用PEI以几种浓度水平进行转染。处理开始后4小时，清洗所述细胞并且应用新鲜培养基。转染开始后24小时或28小时，收获所述细胞，分离总RNA并且通过RT-PCR进行分析。在55℃使用随机六聚物实施逆转录。使用侧翼连接于外显子1中的重复扩增区的引物(正向：5’ATGGCGACCCTGGAAAAGCTG 3’和5’TGAGGCAGCAGCGGCTGT 3′)测定亨廷顿转录本。这种方法检测两种类型的亨延顿mRNA，正常的和具有额外(CAG)扩增的突变转录本，其可以通过2％琼脂糖电泳分离分析用于进行定性评价或通过Agilent2100生物分析仪或Caliper LabChip90进行定量。突变转录本的RT-PCR产物的定量结果相对于正常转录本的RT-PCR产物表示，并且表示为来自相同患者成纤维细胞的空载对照处理(没有寡核苷酸)(设为100％)的百分比。
图2-7示出实验的结果。图1-3显示均特异性针对重复序列的三种不同寡核苷酸，(CUG)7、(UCG)7或(CIG)7，能够有效地抑制具有扩增(CAG)重复的突变亨廷顿转录本。这些化合物对具有高数目的致疾病的(CAG)重复的突变亨廷顿转录本比对携带较低数目的(CAG)重复的正常转录本更有效。这在源自亨廷顿病患者的GM00305细胞中得到证实，也在来自健康志愿者(PAFC1)的对照细胞中得以确认。PCR产物经测序确认。图5显示上述效应不但在4小时处理时段后的24小时存在，也在48小时后存在。这一较晚的时间点看起来比24小时更佳，因为在较低浓度已经出现明显抑制。这些结果表明尽管处理时段短至4小时，但效应可能会保持长得多的时段。
最终，图7和8显示了两种嵌合的寡核苷酸的结果。所述寡核苷酸的3’和5’末端的核苷酸，而不是中心的10个核苷酸，以2’O-甲基取代修饰，产生了所谓的间断体(gapmer)。对本领域技术人员而言，已知2’O-甲基取代(或使用包括2’O-甲氧基乙基或锁核酸的其他修饰)结合于靶mRNA后限制RNA酶H介导的降解。这种RNA酶H介导的降解机制作为mRNA抑制手段可以通过维持寡核苷酸(“间断(thegap)”)中(硫代磷酸酯)DNA核苷酸的延伸保持。然而图7和8中的结果清楚地表明完全修饰的PS57寡核苷酸有效得多，其应用寡核苷酸PS278或PS277抑制效果不明显或没有抑制效果的浓度有效地抑制了突变HD转录本水平。
实施例3.
根据实施例1描述的方法，源自DM500细胞的肌管用200nM寡核苷酸PS259(与PS58相比具有可选择的起始核苷酸)或200nM寡核苷酸PS261(包含替代腺苷(A)的次黄嘌呤核苷(I)核苷酸)处理。图8显示的处理后hDMPK信号(实心柱)表明寡核苷酸的有效抑制。
实施例4.
根据实施例1描述的方法，源自DM500细胞的肌管在用PEI(200nM寡核苷酸)或可选择地用脂质转染胺(lipofectamine)2000(根据生产商的使用说明书，使用50nM寡核苷酸)转染后用双链siRNA寡核苷酸组合PI-01或PI-02处理。寡核苷酸组合(siRNA)PI-01或PI-02只与重复序列互补。在处理孵育时段，进行两次转染操作。图8显示的处理后hDMPK信号表明相对于PS58，siRNA寡核苷酸抑制的缺乏。
表1：实施例中应用的寡核苷酸综览
Figure BPA00001232212200291
表2：包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶(即含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷)的优选的寡核苷酸
重复寡核苷酸
Figure BPA00001232212200292
重复寡核苷酸
重复寡核苷酸
Figure BPA00001232212200301
重复寡核苷酸
Figure BPA00001232212200302
重复寡核苷酸
Figure BPA00001232212200303
重复寡核苷酸
Figure BPA00001232212200304
重复寡核苷酸
Figure BPA00001232212200311
*在这些表格中给出的所有寡核苷酸序列是从右向左读取的。
Figure IPA00001232211700011
Figure IPA00001232211700021
Figure IPA00001232211700031
Figure IPA00001232211700041
Figure IPA00001232211700051
Figure IPA00001232211700061

Claims (17)

1.包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的寡核苷酸用于制备治疗或预防人类与顺式元件重复不稳定性相关的遗传病症的药物的用途，所述寡核苷酸包含只与基因转录本的重复序列互补的序列或由其组成。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的寡核苷酸是单链寡核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中重复元件存在于所述基因转录本的编码或非编码序列。
4.如上述权利要求中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸包含与选自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(CCG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重复元件互补的序列或由其组成。
5.如上述权利要求中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸的长度为约9至约50个核苷酸，优选地为12-40个核苷酸，更优选地为15-30个。
6.如上述权利要求中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸包含下列或由下列组成：有或没有包含硫代磷酸酯的主链的RNA核苷酸、DNA核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)核苷酸、***啉磷酰二胺、乙烯桥核酸(ENA)核苷酸或其混合物。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述寡核苷酸包含2’-O-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸，优选地，其中所述2’-O-取代是甲氧基乙基和/或甲基和/或2’O，4’C亚甲基桥(LNA)和/或2’O，4’C约束的乙烯基(cEt)和/或2’O，4’C约束的甲氧基乙烯基(cMOEt)。
8.如上述权利要求中任一项所述的用途，其中所述寡核苷酸包含只与基因转录本的重复序列互补的序列或由其组成，用于制备治疗或预防人类与顺式元件重复不稳定性相关的遗传病症的药物，并且其中所述寡核苷酸是RNA酶H基本上非依赖的寡核苷酸，以及优选地，其中所述寡核苷酸的长度为9-50个核苷酸，并在其5’或3’末端的至少一个被如权利要求6所定义的取代，并且在其序列的其余部分包含少于9个，更优选地少于6个连续的脱氧核糖。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述寡核苷酸不包含脱氧核糖并且所述主链被如权利要求6所定义的完全修饰。
10.如上述权利要求中任一项所述的用途，其中所述药物中的寡核苷酸通过能够使所述寡核苷酸表达的核酸载体提供和/或其中所述药物中的寡核苷酸被提供有至少一种赋形剂和/或用于将所述寡核苷酸递送至细胞和/或增强其细胞内递送的靶向配体。
11.包含次黄嘌呤核苷和/或尿嘧啶和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含与选自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(CCG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重复序列互补的序列或由其组成，并且长度为9-50个核苷酸。
12.优选如权利要求11所述的寡核苷酸，其包含与选自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(CCG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重复序列互补的序列或由其组成，长度为9-50个核苷酸，以及其中所述寡核苷酸是RNA酶H基本上非依赖的寡核苷酸。
13.如权利要求11或12所述的寡核苷酸，以及还如在权利要求1-10中任一权利要求所定义的，所述寡核苷酸优选被提供有放射性标记或荧光标记。
14.包含如权利要求11-13中任一权利要求定义的寡核苷酸的药学上可接受的组合物，其优选地还包含至少一种赋形剂和/或用于将所述寡核苷酸递送至细胞和/或增强其细胞内递送的靶向配体。
15.核酸载体，优选为病毒载体，其能够使如权利要求11-13中任一权利要求定义的寡核苷酸在人细胞中表达。
16.减少细胞中包含重复的基因转录本的体外方法，其包括给药如权利要求11-13中任一权利要求所定义的寡核苷酸或如权利要求14所定义的药学上可接受的组合物，或如权利要求15所定义的核酸载体。
17.体外或离体检测和/或诊断方法，其中使用如权利要求11-13中任一权利要求所述的寡核苷酸。
CN2009801112548A 2008-02-08 2009-02-05 治疗与dna重复不稳定性相关的遗传病症的方法和装置 Pending CN101980726A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08151228.7 2008-02-08
EP08151228 2008-02-08
PCT/NL2009/050049 WO2009099326A1 (en) 2008-02-08 2009-02-05 Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101980726A true CN101980726A (zh) 2011-02-23

Family

ID=39761095

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801112548A Pending CN101980726A (zh) 2008-02-08 2009-02-05 治疗与dna重复不稳定性相关的遗传病症的方法和装置

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8263760B2 (zh)
EP (1) EP2249874A1 (zh)
JP (1) JP2011510678A (zh)
CN (1) CN101980726A (zh)
AU (1) AU2009210872A1 (zh)
CA (1) CA2714120A1 (zh)
IL (1) IL207453A0 (zh)
NZ (1) NZ587178A (zh)
WO (1) WO2009099326A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103747805A (zh) * 2011-04-22 2014-04-23 普罗森萨科技有限公司 用于治疗、延缓和/或预防人类遗传性疾病如强直性肌营养不良症1型（dm1）的新化合物
CN104271741A (zh) * 2012-04-23 2015-01-07 普罗森萨科技有限公司 用于治疗神经肌肉障碍的具有改善特性的rna调节寡核苷酸
CN108291225A (zh) * 2015-10-05 2018-07-17 ProQR治疗上市公司Ⅱ 单链反义寡核苷酸在预防或治疗涉及三核苷酸重复扩增的遗传疾病中的用途
US10689646B2 (en) 2006-08-11 2020-06-23 Biomarin Technologies B.V. Treatment of genetic disorders associated with DNA repeat instability

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
WO2004083432A1 (en) 2003-03-21 2004-09-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
DK2203173T3 (en) 2007-10-26 2016-02-29 Academisch Ziekenhuis Leiden Materials and methods for prevention of muscle diseases
EP2119783A1 (en) 2008-05-14 2009-11-18 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means
US10131913B2 (en) 2009-08-31 2018-11-20 Centre National De La Recherche Scientifique Purification process of nascent DNA
US20120208868A1 (en) * 2009-08-31 2012-08-16 Centre National De La Recherche Scientifique Purification process of nascent dna
JP5976548B2 (ja) * 2010-02-22 2016-08-23 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｐｙｃｒ１に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるピロリン−５−カルボン酸レダクターゼ１（ｐｙｃｒ１）関連疾患の治療
CN106434648A (zh) * 2010-07-19 2017-02-22 F·C·贝内特 肌强直性营养障碍蛋白激酶(dmpk)表达的调节
CN104203289B (zh) 2012-01-27 2020-11-03 比奥马林技术公司 用于治疗杜兴型肌营养不良症和贝克型肌营养不良症的具有改善特性的rna调节性寡核苷酸
MX353562B (es) 2012-04-25 2018-01-17 Regulus Therapeutics Inc Compuestos de microarn y metodos de modulacion de la actividad de mir-21.
UA116639C2 (uk) * 2012-10-09 2018-04-25 Рег'Юлес Терап'Ютікс Інк. Способи лікування синдрому альпорта
TW201536329A (zh) 2013-08-09 2015-10-01 Isis Pharmaceuticals Inc 用於調節失養性肌強直蛋白質激酶(dmpk)表現之化合物及方法
JP2016528258A (ja) * 2013-08-16 2016-09-15 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド 非コードｒｎａを形成するヘテロクロマチン
EP3256591A4 (en) 2015-02-13 2018-08-08 Translate Bio Ma, Inc. Hybrid oligonucleotides and uses thereof
US10533175B2 (en) * 2015-09-25 2020-01-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating Ataxin 3 expression
JOP20190104A1 (ar) 2016-11-10 2019-05-07 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير عن atxn3
EP3626821A4 (en) * 2017-05-18 2021-03-03 Kyoto University COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF SPINOCEREBELLOUS ATAXIA TYPE 36
WO2019126641A2 (en) * 2017-12-21 2019-06-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of frataxin expression
BR112020021253A2 (pt) 2018-05-09 2021-02-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. compostos e métodos para redução da expressão de atxn3
US20230227824A1 (en) 2020-05-12 2023-07-20 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Compound, method and pharmaceutical composition for regulating expression of ataxin 3
EP4396352A2 (en) 2021-09-01 2024-07-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing dmpk expression
AR127158A1 (es) * 2021-09-29 2023-12-27 Hoffmann La Roche Oligonucléotido antisentido para la edición de arn asociado a enfermedades de poliglutamina

Family Cites Families (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5541308A (en) 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
US5766847A (en) 1988-10-11 1998-06-16 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Process for analyzing length polymorphisms in DNA regions
DE3834636A1 (de) 1988-10-11 1990-04-19 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur analyse von laengenpolymorphismen in dna-bereichen
US6867195B1 (en) 1989-03-21 2005-03-15 Vical Incorporated Lipid-mediated polynucleotide administration to reduce likelihood of subject's becoming infected
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
FR2675803B1 (fr) 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
JPH07501204A (ja) 1991-06-28 1995-02-09 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 局所的オリゴヌクレオチド療法
CA2082411A1 (en) 1991-06-28 1992-12-29 Robert D. Rosenberg Localized oligonucleotide therapy
US6200747B1 (en) 1992-01-28 2001-03-13 North Shore University Hospital Research Corp. Method and kits for detection of fragile X specific, GC-rich DNA sequences
US5869252A (en) 1992-03-31 1999-02-09 Abbott Laboratories Method of multiplex ligase chain reaction
US5418139A (en) 1993-02-10 1995-05-23 University Of Iowa Research Foundation Method for screening for cardiomyopathy
CA2116280A1 (en) 1993-03-05 1994-09-06 Marcy E. Macdonald Huntingtin dna, protein and uses thereof
US5741645A (en) 1993-06-29 1998-04-21 Regents Of The University Of Minnesota Gene sequence for spinocerebellar ataxia type 1 and method for diagnosis
US5627263A (en) 1993-11-24 1997-05-06 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
DE4342605A1 (de) 1993-12-14 1995-06-22 Buna Gmbh Funktionalisierte Olefinhomo- und -copolymere
US5962332A (en) 1994-03-17 1999-10-05 University Of Massachusetts Detection of trinucleotide repeats by in situ hybridization
AU2360195A (en) * 1994-05-05 1995-11-29 Beckman Instruments, Inc. Oligonucleotide repeat arrays
US5968909A (en) 1995-08-04 1999-10-19 Hybridon, Inc. Method of modulating gene expression with reduced immunostimulatory response
US5854223A (en) 1995-10-06 1998-12-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York S-DC28 as an antirestenosis agent after balloon injury
US6300060B1 (en) 1995-11-09 2001-10-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Method for predicting the risk of prostate cancer morbidity and mortality
CA2749312A1 (en) 1996-02-14 1997-08-21 Novartis Ag Sugar-modified gapped oligonucleotides
JP3950480B2 (ja) 1996-07-18 2007-08-01 株式会社エスアールエル 脊髄小脳変性症２型の原因遺伝子の検出方法及びそのためのプライマー
EP0878543A1 (en) 1996-10-30 1998-11-18 Srl, Inc. cDNA FRAGMENTS OF GENE CAUSATIVE OF SPINOCEREBELLAR ATAXIA TYPE 2
US5853995A (en) 1997-01-07 1998-12-29 Research Development Foundation Large scale genotyping of diseases and a diagnostic test for spinocerebellar ataxia type 6
US20020137890A1 (en) 1997-03-31 2002-09-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU7265298A (en) 1997-04-29 1998-11-24 Trustees Of Boston University Methods and compositions for targeted dna differential display
US6329501B1 (en) 1997-05-29 2001-12-11 Auburn University Methods and compositions for targeting compounds to muscle
US6514755B1 (en) 1998-08-18 2003-02-04 Regents Of The University Of Minnesota SCA7 gene and methods of use
US6280938B1 (en) 1997-08-19 2001-08-28 Regents Of The University Of Minnesota SCA7 gene and method of use
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6130207A (en) 1997-11-05 2000-10-10 South Alabama Medical Science Foundation Cell-specific molecule and method for importing DNA into a nucleus
JP3012923B2 (ja) 1998-01-26 2000-02-28 新潟大学長 Ｃａｇリピート病の治療薬
KR100280219B1 (ko) 1998-02-26 2001-04-02 이수빈 삼핵산 반복 서열을 이용한 신경정신 질환의 진단 방법 및 진단 시약
US6322978B1 (en) 1998-04-20 2001-11-27 Joslin Diabetes Center, Inc. Repeat polymorphism in the frataxin gene and uses therefore
US6924355B2 (en) 1998-09-01 2005-08-02 Genentech, Inc. PRO1343 polypeptides
CN1319133A (zh) 1998-09-25 2001-10-24 儿童医疗中心有限公司 选择性地调节蛋白激酶活性的短肽
US6172216B1 (en) 1998-10-07 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of BCL-X expression
US6399575B1 (en) 1998-11-10 2002-06-04 Auburn University Methods and compositions for targeting compounds to the central nervous system
US6133031A (en) 1999-08-19 2000-10-17 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of focal adhesion kinase expression
US20040226056A1 (en) 1998-12-22 2004-11-11 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating neurological disorders and diseases
US20020049173A1 (en) 1999-03-26 2002-04-25 Bennett C. Frank Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
US6379698B1 (en) 1999-04-06 2002-04-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Fusogenic lipids and vesicles
JP2000325085A (ja) 1999-05-21 2000-11-28 Masafumi Matsuo デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤
US20030236214A1 (en) 1999-06-09 2003-12-25 Wolff Jon A. Charge reversal of polyion complexes and treatment of peripheral occlusive disease
US6355481B1 (en) 1999-06-18 2002-03-12 Emory University Hybridoma cell line and monoclonal antibody for huntingtin protein
EP1133993A1 (en) 2000-03-10 2001-09-19 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Substances for the treatment of spinal muscular atrophy
US20020187931A1 (en) 2000-04-13 2002-12-12 Michael Hayden Modulating cell survival by modulating huntingtin function
US6653467B1 (en) 2000-04-26 2003-11-25 Jcr Pharmaceutical Co., Ltd. Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy
WO2001083695A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 Xiao Xiao Dna sequences encoding dystrophin minigenes and methods of use thereof
US20020013287A1 (en) 2000-05-09 2002-01-31 Reliable Biopharmaceuticals, Inc. St Louis Missouri Polymeric compounds useful as prodrugs
CN1326990A (zh) 2000-06-07 2001-12-19 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人类dna cgg重复结合蛋白16.17和编码这种多肽的多核苷酸
US20030124523A1 (en) 2000-06-22 2003-07-03 Asselbergs Fredericus Alphonsus Maria Organic compounds
US6794192B2 (en) 2000-06-29 2004-09-21 Pfizer Inc. Target
RU2165149C1 (ru) 2000-07-03 2001-04-20 Шапошников Валерий Геннадьевич Система формования и упаковки изделий из сахарной ваты
US6727355B2 (en) 2000-08-25 2004-04-27 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy
EP1191097A1 (en) 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
US6869777B2 (en) 2000-10-06 2005-03-22 Regents Of The University Of Michigan Mini-dystrophin nucleic acid sequences
US6623927B1 (en) 2000-11-08 2003-09-23 Council Of Scientific And Industrial Research Method of detection of allelic variants of SCA2 gene
AU2002236499A1 (en) 2000-11-30 2002-06-11 Uab Research Foundation Receptor-mediated uptake of peptides that bind the human transferrin receptor
TW200526779A (en) 2001-02-08 2005-08-16 Wyeth Corp Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
CA2414782C (en) 2001-05-11 2012-10-09 Regents Of The University Of Minnesota Intron associated with myotonic dystrophy type 2 and methods of use
US20050277133A1 (en) * 2001-05-18 2005-12-15 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of polyglutamine (polyQ) repeat expansion diseases using short interfering nucleic acid (siNA)
AU2004266311B2 (en) 2001-05-18 2009-07-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
CA2455424A1 (en) 2001-08-07 2003-02-20 University Of Delaware Compositions and methods for the prevention and treatment of huntington's disease
US20060074034A1 (en) 2001-09-17 2006-04-06 Collins Douglas A Cobalamin mediated delivery of nucleic acids, analogs and derivatives thereof
KR20030035047A (ko) 2001-10-29 2003-05-09 (주)바이오코돈 Bmp-4 유전자 발현을 이용한 편평태선 질환의 치료 및진단방법
US20030134790A1 (en) 2002-01-11 2003-07-17 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Bone Morphogenetic Protein-2 And Bone Morphogenetic Protein-4 In The Treatment And Diagnosis Of Cancer
WO2003069330A1 (en) 2002-02-11 2003-08-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York System and method for identifying proteins involved in force-initiated signal transduction
US20050096284A1 (en) 2002-02-20 2005-05-05 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of polyglutamine (polyQ) repeat expansion diseases using short interfering nucleic acid (siNA)
DK1487493T3 (da) 2002-03-01 2010-05-25 Univ Tulane Konjugater af cytotoksiske midler og biologisk aktive peptider
US20040101852A1 (en) 2002-11-21 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of CGG triplet repeat binding protein 1 expression
ITRM20020253A1 (it) 2002-05-08 2003-11-10 Univ Roma Molecole chimeriche di snrna con sequenze antisenso per le giunzioni di splicing del gene della distrofina e applicazioni terapeutiche.
EP1380644A1 (en) 2002-07-08 2004-01-14 Kylix B.V. The use of specified TCF target genes to identify drugs for the treatment of cancer, in particular colorectal cancer, in which TCF/beta-catenin/WNT signalling plays a central role
EP1585560A4 (en) 2002-07-26 2011-03-16 Mirus Bio Corp ADMINISTRATION OF MOLECULES AND COMPLEXES TO IN VIVO MAMMAL CELLS
US20050255086A1 (en) * 2002-08-05 2005-11-17 Davidson Beverly L Nucleic acid silencing of Huntington's Disease gene
CA2493297A1 (en) 2002-08-12 2004-02-19 Universite De Sherbrooke Methods to reprogram splice site selection in pre-messenger rnas
GB0219143D0 (en) 2002-08-16 2002-09-25 Univ Leicester Modified tailed oligonucleotides
US7892793B2 (en) * 2002-11-04 2011-02-22 University Of Massachusetts Allele-specific RNA interference
ATE517992T1 (de) 2002-11-14 2011-08-15 Dharmacon Inc Funktionelle und hyperfunktionelle sirna
EP2530154B1 (en) 2002-11-25 2016-03-16 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
GB0228079D0 (en) 2002-12-02 2003-01-08 Laxdale Ltd Huntington's Disease
WO2004080406A2 (en) * 2003-03-07 2004-09-23 Alnylam Pharmaceuticals Therapeutic compositions
WO2004083432A1 (en) 2003-03-21 2004-09-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
US7589189B2 (en) * 2003-05-14 2009-09-15 Japan Science And Technology Agency Inhibition of the expression of huntingtin gene
RU2322261C2 (ru) 2003-06-02 2008-04-20 Уайт Применение ингибиторов миостатика (gdf8) в сочетании с кортикостероидами для лечения нервно-мышечных заболеваний
DK1495769T3 (da) 2003-07-11 2008-06-23 Lbr Medbiotech B V Mannose-6-phosphat-receptormedieret gentransfer til muskelceller
JP2007508030A (ja) 2003-10-14 2007-04-05 カーネル・バイオファーマ・インコーポレイテッド 血液脳関門を介してｐｎａを送達するための２相ｐｎａ結合体
US20050191636A1 (en) 2004-03-01 2005-09-01 Biocept, Inc. Detection of STRP, such as fragile X syndrome
EP1735443A2 (en) 2004-04-14 2006-12-27 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF POLYGLUTAMINE (POLYQ) REPEAT EXPANSION DISEASES USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
EP1752536A4 (en) 2004-05-11 2008-04-16 Alphagen Co Ltd POLYNUCLEOTIDE CAUSING RNA INTERFERENCE AND METHOD OF REGULATING GENE EXPRESSION WITH THE USE OF THE SAME
ATE498685T1 (de) 2004-06-28 2011-03-15 Univ Western Australia Antisense-oligonukleotide zur induktion von exon- skipping sowie verfahren zur verwendung davon
EP1618881A1 (en) 2004-07-20 2006-01-25 Santhera Pharmaceuticals (Schweiz) GmbH Use of non-glucocorticoid steroids for the treatment of muscular dystrophy
ITRM20040568A1 (it) 2004-11-18 2005-02-18 Uni Degli Studi Di Roma Tor Vergata Uso della tecnica "phage display" per l'identificazione di peptidi con capacita' di legame a cellule staminali/progenitore, peptidi cosi' ottenuti e loro usi.
US7838657B2 (en) 2004-12-03 2010-11-23 University Of Massachusetts Spinal muscular atrophy (SMA) treatment via targeting of SMN2 splice site inhibitory sequences
US20060148740A1 (en) 2005-01-05 2006-07-06 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
AU2006210973A1 (en) * 2005-01-31 2006-08-10 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid silencing of Huntington's Disease gene
EP1885854B1 (en) 2005-05-06 2012-10-17 Medtronic, Inc. Methods and sequences to suppress primate huntington gene expression
US20070161590A1 (en) 2005-06-28 2007-07-12 Medtronic, Inc. Methods and sequences to preferentially suppress expression of mutated huntingtin
US20070299027A1 (en) 2006-01-26 2007-12-27 Gene Hung Compositions and their uses directed to huntingtin
EP1857548A1 (en) 2006-05-19 2007-11-21 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and method for inducing exon-skipping
US7855053B2 (en) 2006-07-19 2010-12-21 The Regents Of The University Of California Methods for detecting the presence of expanded CGG repeats in the FMR1 gene 5′ untranslated region
EP2049664B1 (en) * 2006-08-11 2011-09-14 Prosensa Technologies B.V. Single stranded oligonucleotides complementary to repetitive elements for treating DNA repeat instability associated genetic disorders

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10689646B2 (en) 2006-08-11 2020-06-23 Biomarin Technologies B.V. Treatment of genetic disorders associated with DNA repeat instability
US11274299B2 (en) 2006-08-11 2022-03-15 Vico Therapeutics B.V. Methods and means for treating DNA repeat instability associated genetic disorders
CN103747805A (zh) * 2011-04-22 2014-04-23 普罗森萨科技有限公司 用于治疗、延缓和/或预防人类遗传性疾病如强直性肌营养不良症1型（dm1）的新化合物
CN103747805B (zh) * 2011-04-22 2017-08-29 比奥马林技术公司 用于治疗、延缓和/或预防人类遗传性疾病如强直性肌营养不良症1型（dm1）的化合物
CN107267517A (zh) * 2011-04-22 2017-10-20 比奥马林技术公司 用于治疗、延缓和/或预防人类遗传性疾病如强直性肌营养不良症1型的新化合物
CN104271741A (zh) * 2012-04-23 2015-01-07 普罗森萨科技有限公司 用于治疗神经肌肉障碍的具有改善特性的rna调节寡核苷酸
CN110025628A (zh) * 2012-04-23 2019-07-19 比奥马林技术公司 治疗神经肌肉障碍的具有改善特性的rna调节寡核苷酸
US11345915B2 (en) 2012-04-23 2022-05-31 Vico Therapeutics B.V. RNA modulating oligonucleotides with improved characteristics for the treatment of neuromuscular disorders
CN110025628B (zh) * 2012-04-23 2023-03-31 维科医疗有限公司 治疗神经肌肉障碍的具有改善特性的rna调节寡核苷酸
CN108291225A (zh) * 2015-10-05 2018-07-17 ProQR治疗上市公司Ⅱ 单链反义寡核苷酸在预防或治疗涉及三核苷酸重复扩增的遗传疾病中的用途
CN108291225B (zh) * 2015-10-05 2022-07-12 ProQR治疗上市公司Ⅱ 单链反义寡核苷酸在预防或治疗涉及三核苷酸重复扩增的遗传疾病中的用途

Also Published As

Publication number Publication date
US8263760B2 (en) 2012-09-11
JP2011510678A (ja) 2011-04-07
EP2249874A1 (en) 2010-11-17
NZ587178A (en) 2011-11-25
IL207453A0 (en) 2010-12-30
AU2009210872A1 (en) 2009-08-13
US20110184050A1 (en) 2011-07-28
CA2714120A1 (en) 2009-08-13
WO2009099326A1 (en) 2009-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101980726A (zh) 治疗与dna重复不稳定性相关的遗传病症的方法和装置
US11274299B2 (en) Methods and means for treating DNA repeat instability associated genetic disorders
JP6265940B2 (ja) ポリグルタミンタンパク質発現の選択的阻害
CN101501193B (zh) 用于治疗与dna重复不稳定性相关的遗传病的方法和手段
JP2021011501A (ja) キメラ２重鎖核酸
US20070185050A1 (en) Double-stranded RNA (dsRNA) and method of use for inhibiting expression of a fusion gene
CN105793422A (zh) 酸性α-葡糖苷酶中反义诱导的外显子2纳入
KR20240036132A (ko) 대상에게서 ｓｍｎ２ 스플라이싱을 조정하기 위한 조성물 및 방법
JPH08510130A (ja) 異常スプライシングを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドと同物質の利用法
JP2011200235A (ja) 真核細胞におけるエキソンスキッピングの誘導
WO2006066203A2 (en) Small interfering rna (sirna) molecules for modulating superoxide dismutase (sod)
De Serres-Bérard et al. Recent progress and challenges in the development of antisense therapies for myotonic dystrophy type 1
BR112020009431A2 (pt) tratamento antisense da síndrome de angelman
US20220401466A1 (en) Rna action inhibitor and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20110223