JP6530564B2 - 抗凝固・抗血小板活性を有するマルチターゲット化合物及びその製法並びに用途 - Google Patents
抗凝固・抗血小板活性を有するマルチターゲット化合物及びその製法並びに用途 Download PDFInfo
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Description
本発明はバイオ医薬分野に関し、具体的には、抗凝固・血小板GPIIb/IIIa受容体拮抗作用を有するマルチターゲット化合物及びその製造方法・用途に関する。
血栓形成は血栓性疾患発生の初期の事態であり、疾患発症の全過程に渡って存在している。血小板の活性化及び凝固系の活性化は血栓形成過程で重要な役割を果たし、両者は生体内で緊密な関係を有している。凝固系の活性化後で生じたトロンビンは、強力な血小板活性化因子であり、血小板活性化後、また凝固過程を促進することになる。血栓性疾患の予防及び治療の原則は凝固亢進状態を改善し、血栓拡大及び新しい血栓形成を防止し、血栓を溶解した後、血液流路を疎通または再構築することで、組織虚血・壊死を予防することにある。血栓性疾患の治療方法は、抗血栓、血栓溶解、介入療法及び手術療法を含む。その中でも、抗血栓治療は、抗血小板と抗凝固療法を含み、血栓性疾患、特に、心血管疾患治療の基礎として注目されている。抗凝固薬は、凝固因子に影響を及ぼすことにより、血液凝固の過程を阻止し、血栓形成を防止することになる。抗血小板薬は、血小板の接着、凝集および放出などの機能を抑制することにより、血栓形成を防止することになる。現在では、臨床応用されたトロンビン阻害剤として、主に低分子ヘパリンとビバリルジンがあり、血小板GPIIb/IIIa受容体拮抗薬として、主にラミフィバン、チロフィバンなどがある。前記薬物は出血傾向等の副作用があり、応用において一定の制限が存在する。より重要なのは、前記薬物はいずれも単一ターゲットで血栓形成を抑制するものであり、現在、臨床的には、異なる作用ターゲットの薬物を併用することにより、治療効果を向上させ、副作用を減らす臨床効果を達することが多い。但し、薬物併用は、現段階で、投与量適合性、出血、効果の協調などの問題がある。これは臨床的抗血栓効果に大きな影響を及ぼす。
そこで、マルチターゲット抑制作用により血栓形成を抑制できる技術方案の開発が求められ、これによって、１種の薬物を投与して異なる作用ターゲットに同時に効く効果を実現し、薬物併用による問題を避けることができる。
本発明は、従来技術における前記欠陥を克服し、同時にトロンビンと血小板GPIIb/IIIa受容体を標的として作用できるマルチターゲット拮抗化合物を提供することを目的とする。
本発明は、抗トロンビン・血小板GPIIb/IIIa受容体拮抗作用を有するマルチターゲット化合物を提供する。前記化合物は式（1）に示すような構造を有する。
A-L-B-L’-C 式（1）
（ここで、A及びBはトロンビンとの結合部位であり、Cは血小板GPIIb/IIIa受容体との結合部位であり、Lは第1の連結基であり、L’は第2の連結基である。）
A-L-B-L’-C 式（1）
（ここで、A及びBはトロンビンとの結合部位であり、Cは血小板GPIIb/IIIa受容体との結合部位であり、Lは第1の連結基であり、L’は第2の連結基である。）
L’の構造は、式（2）で表されるものであってもよい。
((Gly)n1-(Ser) n2)n3 式（2）
（ここで、n1は1、2、3又は4であり、n2は0又は1であり、n3は0、1、2又は3である。）
((Gly)n1-(Ser) n2)n3 式（2）
（ここで、n1は1、2、3又は4であり、n2は0又は1であり、n3は0、1、2又は3である。）
L’の構造は式（3）で表されるものであってもよい。
(Glu-Ala- Ala- Ala-Lys) n1 式（3）、
（ここで、n1は0、1、2又は3である。）
(Glu-Ala- Ala- Ala-Lys) n1 式（3）、
（ここで、n1は0、1、2又は3である。）
L’の構造は式（4）で表されるものであってもよい。
(Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala) n1 式（4）
（n1は0、1、2又は3である。）
(Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala) n1 式（4）
（n1は0、1、2又は3である。）
Aの構造は式（5）で表されるものであってもよい。
A1-A2-A3-A4 式（5）
（ここで、A1はD-Pheであり、A2はPro又はPipであり、A3はArg、Lys、Orn又はHarであり、A4はPro、D-Pro又はSerである。）
A1-A2-A3-A4 式（5）
（ここで、A1はD-Pheであり、A2はPro又はPipであり、A3はArg、Lys、Orn又はHarであり、A4はPro、D-Pro又はSerである。）
Bの構造は式（6）で表されるものであってもよい。
B1-B2-B3-B4-B5 式（6）
（ここで、B1は任意の2つの酸性アミノ酸からなるジペプチドであり、B2はVal、Leu、Ile、Nle又はPheであり、B3はHyp、Ser、Pro又はN-メチルアミノ酸であり、B4は任意の2つの酸性アミノ酸からなるジペプチドであり、B5はTyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha及びProから選ばれる１種のアミノ酸であり、或いはB5はTyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha又はProの少なくとも１種のアミノ酸を含むジペプチドである。）
B1-B2-B3-B4-B5 式（6）
（ここで、B1は任意の2つの酸性アミノ酸からなるジペプチドであり、B2はVal、Leu、Ile、Nle又はPheであり、B3はHyp、Ser、Pro又はN-メチルアミノ酸であり、B4は任意の2つの酸性アミノ酸からなるジペプチドであり、B5はTyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha及びProから選ばれる１種のアミノ酸であり、或いはB5はTyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha又はProの少なくとも１種のアミノ酸を含むジペプチドである。）
Cの構造は（7）で表されるものであってもよい。
Cys-Har-C1-Asp-Trp-Pro-C2 式（7）
（C1はGly又はSerであり、C2はCysまたはCysの-OHが-NH2で置換された構造であり、式（7）において、２つのメルカプトの間にジスルフィド結合が形成されている。）
Cys-Har-C1-Asp-Trp-Pro-C2 式（7）
（C1はGly又はSerであり、C2はCysまたはCysの-OHが-NH2で置換された構造であり、式（7）において、２つのメルカプトの間にジスルフィド結合が形成されている。）
Lの構造は式（8）で表されるものであってもよい。
L1-L2-L3-L4-Gly-Asp-L5 式（8）
（ここで、L1はGly、Ala、ValまたはGly-Glyであり、L2はGlyまたはCysであり、L3はGly、Gly- Gly、Gly- Gly-GlyまたはD-アミノ酸であり、L4はAsnまたはGlnであり、L5はPhe、Tyr、Pheのベンゼン環が置換された誘導体及びTyrのベンゼン環が置換された誘導体から選ばれる１種である。）
L1-L2-L3-L4-Gly-Asp-L5 式（8）
（ここで、L1はGly、Ala、ValまたはGly-Glyであり、L2はGlyまたはCysであり、L3はGly、Gly- Gly、Gly- Gly-GlyまたはD-アミノ酸であり、L4はAsnまたはGlnであり、L5はPhe、Tyr、Pheのベンゼン環が置換された誘導体及びTyrのベンゼン環が置換された誘導体から選ばれる１種である。）
A-L-BはSEQ ID No.1〜SEQ ID No.3に表されるポリペプチド配列から選ばれる１種であってもよい。
前記化合物は式（9）に表される構造を有してもよい。
X-A-L-B-L’-C-Y 式（9）
（ここで、Xは水素、１つ又は２つのC1-C6のアルキル基、１つ又は２つのC2-C10のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基又はtert-ブトキシカルボニル基から選ばれる１種であり、YはOH、C1-C6のアルコキシ基、アミノ基、１つ又は２つのC1-C4のアルキル基で置換されたアミノ基から選ばれる１種である。）
X-A-L-B-L’-C-Y 式（9）
（ここで、Xは水素、１つ又は２つのC1-C6のアルキル基、１つ又は２つのC2-C10のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基又はtert-ブトキシカルボニル基から選ばれる１種であり、YはOH、C1-C6のアルコキシ基、アミノ基、１つ又は２つのC1-C4のアルキル基で置換されたアミノ基から選ばれる１種である。）
前記化合物は、SEQ ID No.4〜SEQ ID No.7に表されるポリペプチド構造からの１種のポリペプチド配列を含んでもよい。
前記化合物はSEQ ID No.4〜SEQ ID No.7に表されるポリペプチド構造から選ばれる１種であってもよい。
本発明はさらに前記の抗トロンビン・血小板GPIIb/IIIa受容体拮抗作用を有するマルチターゲット化合物の塩を提供する。
前記塩は前記化合物の酢酸塩又は前記化合物のトリフルオロ酢酸塩であってもよい。
本発明は、さらに本発明にかかる化合物の製造方法を提供する。その方法は、
（1）固相合成法によりポリペプチド配列に従ってカルボキシル末端から順に保護型アミノ酸または断片を導入することにより、側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド-ワング樹脂を得るステップと（2）酸分解剤で側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド-ワング樹脂を酸分解させて線状ポリペプチド粗生成物を得るステップと、（3）線状ポリペプチド粗生成物を環化させてジスルフィド結合を形成した後、分取液体クロマトグラフで精製し、ポリペプチド配列を得るステップとを含む。
（1）固相合成法によりポリペプチド配列に従ってカルボキシル末端から順に保護型アミノ酸または断片を導入することにより、側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド-ワング樹脂を得るステップと（2）酸分解剤で側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド-ワング樹脂を酸分解させて線状ポリペプチド粗生成物を得るステップと、（3）線状ポリペプチド粗生成物を環化させてジスルフィド結合を形成した後、分取液体クロマトグラフで精製し、ポリペプチド配列を得るステップとを含む。
本発明は、さらに医薬組成物を提供し、上記組成物は、活性成分として、本発明にかかる化合物又は本発明にかかる化合物の塩を含む。
上記医薬組成物の剤形は、注射剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、又は乳剤であってもよい。
本発明は、さらに本発明にかかる化合物又は本発明にかかる化合物の塩の、末梢動脈血栓症、動静脈バイパス血栓形成を予防・治療する薬物の調製における応用を提供する。本発明は、さらに本発明にかかる化合物、又は本発明にかかる化合物の塩の、進行性虚血性脳卒中を予防・治療する薬物の調製における応用、急性冠脈症候群、経皮的冠動脈インターベンション（PCI）治療、又はPCI冠動脈ステント留置治療における血栓形成を治療するための薬物の調製における応用、急性肺塞栓症を予防・治療する薬物の調製における応用、器官・組織移植における血栓形成を予防・治療する薬物の調製における応用を提供する。
本発明で提供された抗トロンビン・血小板GPIIb/IIIa受容体拮抗作用を有するマルチターゲット化合物は、直接的な・可逆的な・特異的な抗トロンビン機能を有し、さらにGPIIb/IIIa受容体を抑制する作用を有し、少量の投与量で抗凝固・抗血栓効果を達成できる。同時に、出血のリスクを減らし、薬物併用による投与量適合性、出血、作用協調などの問題を避けることができる。
すなわち、本明細書は以下の発明の開示を包含する：
［１］式（1）で表される構造を有する、抗凝固・血小板GPIIb/IIIa受容体拮抗作用を有するマルチターゲット化合物。
A-L-B-L’-C 式（1）
（ここで、A及びBはトロンビンとの結合部位であり、Cは血小板GPIIb/IIIa受容体との結合部位であり、Lは第１の連結基であり、L’は第２の連結基である。）
［２］L’の構造は式（2）で表されることを特徴とする、［１］に記載の化合物。
((Gly) n1 -(Ser) n2 ) n3 式（2）
（ここで、n1は1、2、3又は4であり、n2は0又は1であり、n3は、1、2又は3である。）
［３］L’の構造は式（3）で表されることを特徴とする、［１］に記載の化合物。
(Glu-Ala- Ala- Ala-Lys) n1 式（3）
（ここで、n1は0、1、2又は3である。）
［４］L’の構造は式（4）で表されることを特徴とする、［１］に記載の化合物。
(Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala) n1 式（4）
（ここで、n1は0、1、2又は3である。）
［５］Aの構造は式（5）で表されることを特徴とする、［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物。
A1-A2-A3-A4 式（5）
（ここで、A1はD-Pheであり、A2はPro又はPipであり、A3はArg、Lys、Orn又はHarであり、A4はPro、D-Pro又はSerである。）
［６］Bの構造は式（6）で表されることを特徴とする、［５］に記載の化合物。
B1-B2-B3-B4-B5 式（6）
（B1は任意の2つの酸性アミノ酸からなるジペプチドであり、
B2はVal、Leu、Ile、Nle又はPheであり、
B3はHyp、Ser、Pro又はN-メチルアミノ酸であり、
B4は任意の2つの酸性アミノ酸からなるジペプチドであり、
B5はTyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha及びProから選ばれる１種のアミノ酸であり、又は、B5はTyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha及びPro中の少なくとも１種のアミノ酸を含むジペプチドである。）
［７］Cの構造は式（7）で表されることを特徴とする、［１］〜［４］及び［６］のいずれかに記載の化合物。
Cys-Har-C1-Asp-Trp-Pro-C2 式（7）
（ここで、C1はGly又はSerであり、C2はCysまたはCysの-OHが-NH 2 で置換された構造であり、式（7）において、２つのメルカプトの間にジスルフィド結合が形成されている。）
［８］Lの構造は式（8）で表されることを特徴とする、［７］に記載の化合物。
L1-L2-L3-L4-Gly-Asp-L5 式（8）
（ここで、L1はGly、Ala、ValまたはGly-Glyであり、L2はGlyまたはCysであり、L3はGly、Gly- Gly、Gly-Gly-GlyまたはD-アミノ酸であり、L4はAsnまたはGlnであり、L5はPhe、Tyr、Pheのベンゼン環が置換された誘導体及びTyrのベンゼン環が置換された誘導体から選ばれる１種である。）
［９］A-L-BはSEQ ID No.1〜SEQ ID No.3に表されるポリペプチド配列から選ばれる１種であることを特徴とする、［８］に記載の化合物。
［１０］前記化合物は、式（9）で表される構造を有することを特徴とする、［１］〜［４］、［６］、［８］及び［９］のいずれかに記載の化合物。
X-A-L-B-L’-C-Y 式（9）
（ここで、Xは水素、１つ又は２つのC1-C6のアルキル基、１つ又は２つのC2-C10のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基又はtert-ブトキシカルボニル基から選ばれる１種であり、YはOH、C1-C6のアルコキシ基、アミノ基、１つ又は２つのC1-C4のアルキル基で置換されたアミノ基から選ばれる１種である。）
［１１］前記化合物は、SEQ ID No.4〜SEQ ID No.7に表されるポリペプチド構造のうちの1種のポリペプチド配列を含むことを特徴とする、［１０］に記載の化合物。
［１２］前記化合物は、SEQ ID No.4〜SEQ ID No.7に表されるポリペプチド構造から選ばれる1種であることを特徴とする、［１１］に記載の化合物。
［１３］［１］〜［１２］のいずれかに記載の化合物の塩。
［１４］前記塩は、前記化合物の酢酸塩又は前記化合物のトリフルオロ酢酸塩であることを特徴とする、［１３］に記載の化合物の塩。
［１５］［１］〜［１２］のいずれかに記載の化合物の製造方法であって、
（1）固相合成法によりポリペプチド配列に従ってカルボキシル末端から順に保護型アミノ酸または断片を導入することにより、側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド-ワング樹脂を得るステップと、
（2）酸分解剤で側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド-ワング樹脂を酸分解させて線状ポリペプチド粗生成物を得るステップと、
（3）線状ポリペプチド粗生成物を環化させてジスルフィド結合を形成した後、分取液体クロマトグラフで精製し、ポリペプチド配列を得るステップと、
を含むことを特徴とする、製造方法。
［１６］活性成分として、［１］〜［１２］のいずれかに記載の化合物又は［１３］及び［１４］のいずれかに記載の塩を含むことを特徴とする、医薬組成物。
［１７］前記医薬組成物は、剤形が、注射剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤又は乳剤であることを特徴とする、［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］［１］〜［１２］に記載の化合物又は［１３］〜［１４］に記載の塩の、末梢動脈内の血栓形成及び動静脈バイパス内の血栓形成を予防・治療する薬物の調製における応用。
［１９］［１］〜［１２］に記載の化合物又は［１３］〜［１４］に記載の塩の、急性冠脈症候群、経皮的冠動脈インターベンション治療又はPCI冠動脈ステント留置治療における血栓形成を治療するための薬物の調製における応用。
［２０］［１］〜［１２］に記載の化合物又は［１３］〜［１４］に記載の塩の、進行性虚血性脳卒中を予防・治療する薬物の調製における応用。
［２１］［１］〜［１２］に記載の化合物又は［１３］〜［１４］に記載の塩の、急性肺塞栓症を予防・治療する薬物の調製における応用。
［２２］［１］〜［１２］に記載の化合物又は［１３］及び［１４］に記載の塩の、器官・組織移植における血栓形成を予防・治療する薬物の調製における応用。
すなわち、本明細書は以下の発明の開示を包含する：
［１］式（1）で表される構造を有する、抗凝固・血小板GPIIb/IIIa受容体拮抗作用を有するマルチターゲット化合物。
A-L-B-L’-C 式（1）
（ここで、A及びBはトロンビンとの結合部位であり、Cは血小板GPIIb/IIIa受容体との結合部位であり、Lは第１の連結基であり、L’は第２の連結基である。）
［２］L’の構造は式（2）で表されることを特徴とする、［１］に記載の化合物。
((Gly) n1 -(Ser) n2 ) n3 式（2）
（ここで、n1は1、2、3又は4であり、n2は0又は1であり、n3は、1、2又は3である。）
［３］L’の構造は式（3）で表されることを特徴とする、［１］に記載の化合物。
(Glu-Ala- Ala- Ala-Lys) n1 式（3）
（ここで、n1は0、1、2又は3である。）
［４］L’の構造は式（4）で表されることを特徴とする、［１］に記載の化合物。
(Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala) n1 式（4）
（ここで、n1は0、1、2又は3である。）
［５］Aの構造は式（5）で表されることを特徴とする、［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物。
A1-A2-A3-A4 式（5）
（ここで、A1はD-Pheであり、A2はPro又はPipであり、A3はArg、Lys、Orn又はHarであり、A4はPro、D-Pro又はSerである。）
［６］Bの構造は式（6）で表されることを特徴とする、［５］に記載の化合物。
B1-B2-B3-B4-B5 式（6）
（B1は任意の2つの酸性アミノ酸からなるジペプチドであり、
B2はVal、Leu、Ile、Nle又はPheであり、
B3はHyp、Ser、Pro又はN-メチルアミノ酸であり、
B4は任意の2つの酸性アミノ酸からなるジペプチドであり、
B5はTyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha及びProから選ばれる１種のアミノ酸であり、又は、B5はTyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha及びPro中の少なくとも１種のアミノ酸を含むジペプチドである。）
［７］Cの構造は式（7）で表されることを特徴とする、［１］〜［４］及び［６］のいずれかに記載の化合物。
Cys-Har-C1-Asp-Trp-Pro-C2 式（7）
（ここで、C1はGly又はSerであり、C2はCysまたはCysの-OHが-NH 2 で置換された構造であり、式（7）において、２つのメルカプトの間にジスルフィド結合が形成されている。）
［８］Lの構造は式（8）で表されることを特徴とする、［７］に記載の化合物。
L1-L2-L3-L4-Gly-Asp-L5 式（8）
（ここで、L1はGly、Ala、ValまたはGly-Glyであり、L2はGlyまたはCysであり、L3はGly、Gly- Gly、Gly-Gly-GlyまたはD-アミノ酸であり、L4はAsnまたはGlnであり、L5はPhe、Tyr、Pheのベンゼン環が置換された誘導体及びTyrのベンゼン環が置換された誘導体から選ばれる１種である。）
［９］A-L-BはSEQ ID No.1〜SEQ ID No.3に表されるポリペプチド配列から選ばれる１種であることを特徴とする、［８］に記載の化合物。
［１０］前記化合物は、式（9）で表される構造を有することを特徴とする、［１］〜［４］、［６］、［８］及び［９］のいずれかに記載の化合物。
X-A-L-B-L’-C-Y 式（9）
（ここで、Xは水素、１つ又は２つのC1-C6のアルキル基、１つ又は２つのC2-C10のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基又はtert-ブトキシカルボニル基から選ばれる１種であり、YはOH、C1-C6のアルコキシ基、アミノ基、１つ又は２つのC1-C4のアルキル基で置換されたアミノ基から選ばれる１種である。）
［１１］前記化合物は、SEQ ID No.4〜SEQ ID No.7に表されるポリペプチド構造のうちの1種のポリペプチド配列を含むことを特徴とする、［１０］に記載の化合物。
［１２］前記化合物は、SEQ ID No.4〜SEQ ID No.7に表されるポリペプチド構造から選ばれる1種であることを特徴とする、［１１］に記載の化合物。
［１３］［１］〜［１２］のいずれかに記載の化合物の塩。
［１４］前記塩は、前記化合物の酢酸塩又は前記化合物のトリフルオロ酢酸塩であることを特徴とする、［１３］に記載の化合物の塩。
［１５］［１］〜［１２］のいずれかに記載の化合物の製造方法であって、
（1）固相合成法によりポリペプチド配列に従ってカルボキシル末端から順に保護型アミノ酸または断片を導入することにより、側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド-ワング樹脂を得るステップと、
（2）酸分解剤で側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド-ワング樹脂を酸分解させて線状ポリペプチド粗生成物を得るステップと、
（3）線状ポリペプチド粗生成物を環化させてジスルフィド結合を形成した後、分取液体クロマトグラフで精製し、ポリペプチド配列を得るステップと、
を含むことを特徴とする、製造方法。
［１６］活性成分として、［１］〜［１２］のいずれかに記載の化合物又は［１３］及び［１４］のいずれかに記載の塩を含むことを特徴とする、医薬組成物。
［１７］前記医薬組成物は、剤形が、注射剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤又は乳剤であることを特徴とする、［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］［１］〜［１２］に記載の化合物又は［１３］〜［１４］に記載の塩の、末梢動脈内の血栓形成及び動静脈バイパス内の血栓形成を予防・治療する薬物の調製における応用。
［１９］［１］〜［１２］に記載の化合物又は［１３］〜［１４］に記載の塩の、急性冠脈症候群、経皮的冠動脈インターベンション治療又はPCI冠動脈ステント留置治療における血栓形成を治療するための薬物の調製における応用。
［２０］［１］〜［１２］に記載の化合物又は［１３］〜［１４］に記載の塩の、進行性虚血性脳卒中を予防・治療する薬物の調製における応用。
［２１］［１］〜［１２］に記載の化合物又は［１３］〜［１４］に記載の塩の、急性肺塞栓症を予防・治療する薬物の調製における応用。
［２２］［１］〜［１２］に記載の化合物又は［１３］及び［１４］に記載の塩の、器官・組織移植における血栓形成を予防・治療する薬物の調製における応用。
以下に、具体的な実施形態によって本発明について詳しく説明する。なお、以下に挙げられた実施例は単に説明するために挙げられたものであり、本発明の範囲を限定するものではないと理解すべきである。当業者にとっては、本発明の趣旨及び精神から逸脱することなく、本発明に対して種々の変更及び置換を行うことが可能である。
本発明において、トロンビンはトロンビンの前駆体（血漿における必要な成分）から形成したタンパク質加水分解酵素を表し、フィブリノーゲンを触媒させてフィブリンに変化することにより、血液凝固を促進することができる。血小板GPIIb/IIIa受容体は血小板表面における接着性糖タンパク質であり、インテグリンファミリーの１種である。活性化されていない血小板表面あたりに約50000〜80000個のGPIIb/IIIa受容体分子が存在し、血小板表面数量が最も多いインテグリンである。アミノ酸とは、アミノ基とカルボキシル基を含有する有机化合物の通称であり、タンパク質の基本的な組成単位であり、動物栄養に必要なタンパク質を構成する基本物質であり、本発明において、アミノ酸は当分野に通用の略称で表される。酸性アミノ酸とは、等電点が7未満のアミノ酸を意味し、アスパラギン酸（Asp）とグルタミン酸（Glu）を含む。N-メチルアミノ酸とは、アミノ酸に含まれるアミノ基がメチル基で置換されたアミノ酸である。ベンゼン環が置換された誘導体とは、アミノ酸に含まれるベンゼン環が直鎖や分岐アルカン、ハロゲン、アルコキシ基、アミド基、アシルオキシ基などで置換されたアミノ酸の誘導体である。C1-C6のアルキル基とは、炭素数が1〜6個のアルキル基であり、C2-C10のアシル基とは、炭素数が2〜10個のアシル基である。
本発明の一実施形態において、抗トロンビン・血小板GPIIb/IIIa受容体拮抗作用を有するマルチターゲット化合物を提供する。上記化合物は式（1）で表される構造を有する。
A-L-B-L’-C 式（1）、
（ここで、A及びBはトロンビンとの結合部位であり、Cは血小板GPIIb/IIIa受容体との結合部位、Lは第1の連結基であり、L’は第2の連結基である。）
ここで、上記第1の連結基LはAとBを連結してA-L-B構造となり、第2の連結基L’はA-L-B構造とC構造を連結して式（1）で表される構造となる。本発明の一実施形態において、A-L-B構造は直接にC構造と連結してマルチターゲット拮抗化合物を形成できる。
本発明の一実施形態において、L’は式（2）で表される構造であってもよい。
((Gly)n1-(Ser)n2)n3 式（2）
（式（2）において、n1は1、2、3、又は4であり、n2は0、又は１であり、n3は0、1、2、又は3である。）
好ましい実施形態において、L’の構造はGly-Gly-Gly-Gly-Ser、又はGly-Gly-Gly-Serである。
本発明の一実施形態において、L’は式（3）で表される構造であってもよい。
(Glu-Ala- Ala- Ala-Lys) n1 式（3）
（ここで、n1は0、1、2、又は3である。）
好ましい実施形態において、L’の構造はGlu-Ala-Ala-Ala-Lysである。
本発明の一実施形態において、L’は式（4）で表される構造であってもよい。
(Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala)n1 式（4）
（ここで、n1は0、1、2又は3である。）
好ましい実施形態において、L’の構造はArg-Val-Leu-Ala-Glu-Alaである。
本発明の一実施形態において、Aの構造は式（5）で表される。
A1-A2-A3-A4 式（5）
（ここで、A1はD-Pheであり、A2はPro、又はPipであり、A3はArg、Lys、Orn、又はHarであり、A4はPro、D-Pro、又はSerである。ここで、Pipとは4-アミノピペリジン-4-カルボキシル、Ornとはオルニチン、Harとはホモアルギニンを指す。）
好ましい実施形態において、Aの構造はD-Phe-Pro-Arg-Proである。
本発明の一実施形態において、Bの構造は式（6）で表される。
B1-B2-B3-B4-B5 式（6）
（ここで、B1は任意の2つの酸性アミノ酸からなるジペプチドであり、B2はVal、Leu、Ile、Nle、又はPheであり、B3はHyp、Ser、Pro、又はN-メチルアミノ酸であり、B4は任意の2つの酸性アミノ酸からなるジペプチドであり、B5はTyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha及びProから選ばれる１種のアミノ酸であり、又は、B5はTyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha及びProからの少なくとも1種のアミノ酸を含有するジペプチドである。ここで、Nleはノルロイシンを示し、Hypはヒドロキシプロリンを示す。）
本発明の好ましい実施形態において、Bの構造はGlu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leuである。
好ましくは、Cの構造は式（7）で表される。
Cys-Har-C1-Asp-Trp-Pro-C2 式（7）
（式（7）において、C1はGly又はSerであり、C2はCysまたはCysの-OHが-NH2で置換された構造であり、式（7）において、２つのメルカプトの間にジスルフィド結合が形成されている。ここで、Harはホモアルギニンを示す。）
好ましくは、Lの構造は式（8）で表される。
L1-L2-L3-L4-Gly-Asp-L5 式（8）
（ここで、L1はGly、Ala、ValまたはGly-Glyであり、L2はGlyまたはCysであり、L3はGly、Gly-Gly、Gly-Gly-GlyまたはD-アミノ酸であり、L4はAsnまたはGlnであり、L5はPhe、Tyr、Pheのベンゼン環が置換された誘導体、及びTyrのベンゼン環が置換された誘導体から選ばれる1種である。ここで、L1はGly-Glyが好ましい、L2はGlyが好ましい、L3はGlyが好ましい、L4はAsnが好ましい、L5はPheが好ましい。）
好ましい場合には、A-L-BはSEQ ID No.1〜SEQ ID No.3に表される配列から選ばれる1種である。SEQ ID No.1〜SEQ ID No.3に表される配列において、Ｎ末端のフェニルアラニンはいずれもD-フェニルアラニンである。
SEQ ID No.1：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Tyr Glu Asp Ile Pro- Glu Glu Tyr Leu
SEQ ID No.2：D-Phe Pro Arg Ser Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Asp Ile Pro Glu Glu Tyr Leu
SEQ ID No.3：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro- Glu Glu Tyr Leu
本発明の一実施形態において、上記化合物は式（9）で表される構造を有する。
X-A-L-B-L’-C-Y 式（9）
（ここで、Xは水素、１つ又は２つのC1-C6のアルキル基、１つ又は２つのC2-C10のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基又はtert-ブトキシカルボニル基から選ばれる1種であり、好ましくは、上記のC1-C6のアルキル基はメチル又はエチルであってもよい。YはOH、C1-C6のアルコキシ基、アミノ基、１つ又は２つのC1-C4のアルキル基で置換されたアミノ基から選ばれる1種であり、本発明の一実施形態において、YはOH又はNH2である。特に好ましい実施形態において、上記化合物はSEQ ID No.5に表される構造を有し、且つC末端の
YはNH2である場合に、血小板GPIIb/IIIa受容体と結合している時間が長く、良い血小板機能抑制効果を有する。）
ここで、上記アルキル基は直鎖構造又は分枝鎖構造であってもよく、上記アシル基は直鎖構造又は分枝鎖構造であってもよく、ここで、Xは2つのC1-C6のアルキル基である場合に、上記の2つのC1-C6のアルキル基の種類は同じであっても異なっていてもよい。ここで、Xは2つのC2-C10のアシル基である場合には、上記の2つのC2-C10のアシル基の種類は同じであっても異なっていてもよい。Yは2つのC1-C4のアルキル基で置換されたアミノ基である場合には、上記のC1-C4のアルキル基で置換されたアミノ基の種類は同じであっても異なっていてもよい。
好ましくは、前記化合物はSEQ ID No.4〜SEQ ID No.7に表されるポリペプチド構造中の1種のポリペプチド配列を含む。SEQ ID No.4〜SEQ ID No.7において、N末端のPheはD-フェニルアラニンである。
SEQ ID No.4：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gly Gly Gly Gly Ser Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys （ここで、26-Cysと32-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）
SEQ ID No.5：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Ala Ala Lys Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys （ここで、26-Cysと32-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）
SEQ ID No.6：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys （ここで、21-Cysと27-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）
SEQ ID No.7：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Arg Val Leu Ala Glu Ala Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys （ここで、27-Cysと33-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）
本発明の好ましい実施形態において、前記化合物はSEQ ID No.4〜SEQ ID No.7に表されるポリペプチド構造から選ばれる1種である。
A-L-B-L’-C 式（1）、
（ここで、A及びBはトロンビンとの結合部位であり、Cは血小板GPIIb/IIIa受容体との結合部位、Lは第1の連結基であり、L’は第2の連結基である。）
ここで、上記第1の連結基LはAとBを連結してA-L-B構造となり、第2の連結基L’はA-L-B構造とC構造を連結して式（1）で表される構造となる。本発明の一実施形態において、A-L-B構造は直接にC構造と連結してマルチターゲット拮抗化合物を形成できる。
本発明の一実施形態において、L’は式（2）で表される構造であってもよい。
((Gly)n1-(Ser)n2)n3 式（2）
（式（2）において、n1は1、2、3、又は4であり、n2は0、又は１であり、n3は0、1、2、又は3である。）
好ましい実施形態において、L’の構造はGly-Gly-Gly-Gly-Ser、又はGly-Gly-Gly-Serである。
本発明の一実施形態において、L’は式（3）で表される構造であってもよい。
(Glu-Ala- Ala- Ala-Lys) n1 式（3）
（ここで、n1は0、1、2、又は3である。）
好ましい実施形態において、L’の構造はGlu-Ala-Ala-Ala-Lysである。
本発明の一実施形態において、L’は式（4）で表される構造であってもよい。
(Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala)n1 式（4）
（ここで、n1は0、1、2又は3である。）
好ましい実施形態において、L’の構造はArg-Val-Leu-Ala-Glu-Alaである。
本発明の一実施形態において、Aの構造は式（5）で表される。
A1-A2-A3-A4 式（5）
（ここで、A1はD-Pheであり、A2はPro、又はPipであり、A3はArg、Lys、Orn、又はHarであり、A4はPro、D-Pro、又はSerである。ここで、Pipとは4-アミノピペリジン-4-カルボキシル、Ornとはオルニチン、Harとはホモアルギニンを指す。）
好ましい実施形態において、Aの構造はD-Phe-Pro-Arg-Proである。
本発明の一実施形態において、Bの構造は式（6）で表される。
B1-B2-B3-B4-B5 式（6）
（ここで、B1は任意の2つの酸性アミノ酸からなるジペプチドであり、B2はVal、Leu、Ile、Nle、又はPheであり、B3はHyp、Ser、Pro、又はN-メチルアミノ酸であり、B4は任意の2つの酸性アミノ酸からなるジペプチドであり、B5はTyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha及びProから選ばれる１種のアミノ酸であり、又は、B5はTyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha及びProからの少なくとも1種のアミノ酸を含有するジペプチドである。ここで、Nleはノルロイシンを示し、Hypはヒドロキシプロリンを示す。）
本発明の好ましい実施形態において、Bの構造はGlu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leuである。
好ましくは、Cの構造は式（7）で表される。
Cys-Har-C1-Asp-Trp-Pro-C2 式（7）
（式（7）において、C1はGly又はSerであり、C2はCysまたはCysの-OHが-NH2で置換された構造であり、式（7）において、２つのメルカプトの間にジスルフィド結合が形成されている。ここで、Harはホモアルギニンを示す。）
好ましくは、Lの構造は式（8）で表される。
L1-L2-L3-L4-Gly-Asp-L5 式（8）
（ここで、L1はGly、Ala、ValまたはGly-Glyであり、L2はGlyまたはCysであり、L3はGly、Gly-Gly、Gly-Gly-GlyまたはD-アミノ酸であり、L4はAsnまたはGlnであり、L5はPhe、Tyr、Pheのベンゼン環が置換された誘導体、及びTyrのベンゼン環が置換された誘導体から選ばれる1種である。ここで、L1はGly-Glyが好ましい、L2はGlyが好ましい、L3はGlyが好ましい、L4はAsnが好ましい、L5はPheが好ましい。）
好ましい場合には、A-L-BはSEQ ID No.1〜SEQ ID No.3に表される配列から選ばれる1種である。SEQ ID No.1〜SEQ ID No.3に表される配列において、Ｎ末端のフェニルアラニンはいずれもD-フェニルアラニンである。
SEQ ID No.1：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Tyr Glu Asp Ile Pro- Glu Glu Tyr Leu
SEQ ID No.2：D-Phe Pro Arg Ser Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Asp Ile Pro Glu Glu Tyr Leu
SEQ ID No.3：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro- Glu Glu Tyr Leu
本発明の一実施形態において、上記化合物は式（9）で表される構造を有する。
X-A-L-B-L’-C-Y 式（9）
（ここで、Xは水素、１つ又は２つのC1-C6のアルキル基、１つ又は２つのC2-C10のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基又はtert-ブトキシカルボニル基から選ばれる1種であり、好ましくは、上記のC1-C6のアルキル基はメチル又はエチルであってもよい。YはOH、C1-C6のアルコキシ基、アミノ基、１つ又は２つのC1-C4のアルキル基で置換されたアミノ基から選ばれる1種であり、本発明の一実施形態において、YはOH又はNH2である。特に好ましい実施形態において、上記化合物はSEQ ID No.5に表される構造を有し、且つC末端の
YはNH2である場合に、血小板GPIIb/IIIa受容体と結合している時間が長く、良い血小板機能抑制効果を有する。）
ここで、上記アルキル基は直鎖構造又は分枝鎖構造であってもよく、上記アシル基は直鎖構造又は分枝鎖構造であってもよく、ここで、Xは2つのC1-C6のアルキル基である場合に、上記の2つのC1-C6のアルキル基の種類は同じであっても異なっていてもよい。ここで、Xは2つのC2-C10のアシル基である場合には、上記の2つのC2-C10のアシル基の種類は同じであっても異なっていてもよい。Yは2つのC1-C4のアルキル基で置換されたアミノ基である場合には、上記のC1-C4のアルキル基で置換されたアミノ基の種類は同じであっても異なっていてもよい。
好ましくは、前記化合物はSEQ ID No.4〜SEQ ID No.7に表されるポリペプチド構造中の1種のポリペプチド配列を含む。SEQ ID No.4〜SEQ ID No.7において、N末端のPheはD-フェニルアラニンである。
SEQ ID No.4：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gly Gly Gly Gly Ser Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys （ここで、26-Cysと32-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）
SEQ ID No.5：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Ala Ala Lys Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys （ここで、26-Cysと32-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）
SEQ ID No.6：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys （ここで、21-Cysと27-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）
SEQ ID No.7：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Arg Val Leu Ala Glu Ala Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys （ここで、27-Cysと33-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）
本発明の好ましい実施形態において、前記化合物はSEQ ID No.4〜SEQ ID No.7に表されるポリペプチド構造から選ばれる1種である。
本発明の一側面は、上記の抗トロンビン・血小板GPIIb/IIIa受容体拮抗作用を有するマルチターゲット化合物の塩を提供する。
本発明において、上記の塩は薬学的に許容される塩である。“薬学的に許容される塩”とは、人間や動物の組織への接触に適し、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などがないということである。薬学的に許容される塩は当分野で周知のものである。このような塩は本発明の化合物であるペプチドの最終的な分離と精製の過程で調製されてもよく、遊離の塩基または酸を適切な有機または無機酸、或いは塩基と反応させて単独に調製されてもよい。代表的な酸付加塩は酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ジヘキサノエート、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、へプチラート、カプロン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、シュウ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、炭酸水素塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩を含むが、これらに限定されない。上記塩は前記化合物の酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩又は塩酸塩であることが好ましく、特に、上記の塩は酢酸塩又はトリフルオロ酢酸塩であってもよい。
本発明の一側面は、上記の抗トロンビン・血小板GPIIb/IIIa受容体拮抗作用を有するマルチターゲット化合物の製造方法を提供する。その方法は（1）固相合成法によりポリペプチド配列に従ってカルボキシル末端から順に対応する保護型アミノ酸または断片を導入し、側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド-ワング樹脂を得るステップと（2）酸分解剤で側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド-ワング樹脂を酸分解させて線状ポリペプチド粗生成物を得るステップと、（3）線状ポリペプチド粗生成物を環化させてジスルフィド結合を形成した後、分取液体クロマトグラフ（Preparative HPLC）で精製し、ポリペプチド配列を得るステップを含む。
本発明の一側面は、1種の医薬組成物を提供する。上記医薬組成物の活性成分には、本発明にかかる抗トロンビン・血小板GPIIb/IIIa受容体拮抗作用を有するマルチターゲット化合物又は前記化合物の塩を含む。好ましくは、上記医薬組成物は、さらに薬学的に許容される担体を含む。上記医薬組成物の剤形は注射液又はマイクロエマルションであってもよい。医薬組成物の剤形に応じて当分野で普通な薬学的に許容される担体物質を選択して使用できる。上記医薬組成物において、活性成分の含有量は85%以上である。上記載体物質の種類は生理食塩水を含むが、これに限定されない。本発明にかかる医薬組成物は血栓性疾患の治療及び/又は予防に適用することができ、主な効果は抗凝固、抗血栓及び抗血小板凝集である。上記抗トロンビン・血小板GPIIb/IIIa受容体拮抗作用を有するマルチターゲット化合物及び/又は上記化合物の塩を活性成分とする薬物を被検体に投与する。
本発明の一側面は、さらに本発明にかかる化合物又は本発明にかかる化合物の塩の末梢動脈血栓症、動静脈バイパス血栓形成を予防・治療する薬物の調製における応用を提供する。本発明の一側面は、さらに本発明にかかる化合物又は本発明にかかる化合物の塩の進行性虚血性脳卒中を予防・治療する薬物の調製における応用を提供する。本発明の一側面は、さらに本発明にかかる化合物又は本発明にかかる化合物の塩の急性肺塞栓症を予防・治療する薬物の調製における応用を提供する。本発明は、さらに本発明にかかる化合物又は本発明にかかる化合物の塩の器官・組織移植における血栓形成を予防・治療する薬物の調製における応用、急性冠脈症候群、経皮的冠動脈インターベンション（PCI）治療、又はPCIによる冠動脈ステント留置治療における血栓形成を治療するための薬物の調製における応用、急性肺塞栓症を予防・治療する薬物の調製における応用、器官・組織移植における血栓形成を予防・治療する薬物の調製における応用を提供する。本発明にかかる応用には、本発明にかかる化合物を含有する薬物の調製を含む。上記薬物の剤形は凍結乾燥粉末注射剤、注射液、マイクロエマルション、マイクロスフェア、ミセルなどの剤形を含むが、これらに限定されない。上記抗血栓薬は末梢動脈閉塞性疾患（抗凝固、抗血栓、抗血小板凝集により役割を果たす）、進行性虚血性脳卒中、急性冠脈症候群などの等疾患の治療又は予防に用いられる薬物を含む。さらに、上記抗血栓薬は血液透析患者のVAFとVAG手術での動静脈瘻における血栓形成の予防に用いられる薬物を含むこともできる。
以下に、本発明の具体的な実施形態について実施例によりさらに説明し、以下の実施例に係る装置と試薬はいずれも市販製品を購入することにより得られる。
以下に、実施例における、実験材料の一部を表1に示し、機器装置を表2に示す。
以下に、実施例における、実験材料の一部を表1に示し、機器装置を表2に示す。
実施例1
実施例1は本発明の一実施形態による化合物及びその調製過程を説明するためのものである。
実施例1は本発明の一実施形態による化合物及びその調製過程を説明するためのものである。
1、断片IFmoc -Gly-Gly-Gly-Gly-OHの調製
置換度が0.7mmol/gのFmoc-Gly-2-Cl-Trt-樹脂（23.5g、16.5mmol）を秤量し、2.5Lの25%PIP/DMF溶液で25分間Fmoc脱保護し、ろ過した後、樹脂を、それぞれ毎回1分間以上、DMF、DCMで交互に3回洗浄した。Fmoc-Gly-OH（14.8g、50mmol）を加え、30℃で4時間撹拌しながら反応し、ニンヒドリン法で反応の終点を検出し、反応終了後、ろ過した後、樹脂をそれぞれDMF、DCMで交互に3回洗浄した。
上記のステップを2回繰り返し、他の2つのGlyを連結し、最終的にFmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-2-Cl-Trt-樹脂を得た。得られた樹脂を5Lの30%ヘキサフルオロイソプロパノール/DCM溶液に溶解し、2時間撹拌しながら反応し、ろ過して濾液を収集し、30℃で10時間真空乾燥し、Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH（收率96%、純度95.6%、MS m/z:469（M+1））7.2gを得た。
置換度が0.7mmol/gのFmoc-Gly-2-Cl-Trt-樹脂（23.5g、16.5mmol）を秤量し、2.5Lの25%PIP/DMF溶液で25分間Fmoc脱保護し、ろ過した後、樹脂を、それぞれ毎回1分間以上、DMF、DCMで交互に3回洗浄した。Fmoc-Gly-OH（14.8g、50mmol）を加え、30℃で4時間撹拌しながら反応し、ニンヒドリン法で反応の終点を検出し、反応終了後、ろ過した後、樹脂をそれぞれDMF、DCMで交互に3回洗浄した。
上記のステップを2回繰り返し、他の2つのGlyを連結し、最終的にFmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-2-Cl-Trt-樹脂を得た。得られた樹脂を5Lの30%ヘキサフルオロイソプロパノール/DCM溶液に溶解し、2時間撹拌しながら反応し、ろ過して濾液を収集し、30℃で10時間真空乾燥し、Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH（收率96%、純度95.6%、MS m/z:469（M+1））7.2gを得た。
2、断片IIFmoc-Cys(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-ワング樹脂の調製
Fmoc-Cys(Trt)-ワング樹脂10g（負荷量1.0mmol/g、10mmol）を秤量して固相反応装置中に置き、25%のPIP/DMF溶液150mlを加えて脱保護し、25℃で30分間撹拌し、反応終了後、樹脂をそれぞれDMF、DCMで交互に3回洗浄した。Fmoc-Pro-OH(10.1g、30mmol)、HOBt（4.05g、30mmol）を150mlのDMFに溶解し、反応器に加え、0〜5℃で反応液に徐々にDIC（3.78g、30mmol）を加え、さらに、脱保護後のアミノ酸樹脂を加え、30℃で3時間撹拌しながら反応し、ニンヒドリン法で反応の終点を検出し、反応終了後、ろ過した後、樹脂をそれぞれDMF、DCMで交互に3回洗浄した。上記のステップを繰り返し、ペプチド配列に従って順にFmoc-Trp-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Har-OH及びFmoc-Cys(Trt)-OHをカップリングさせてFmoc-Cys(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys (Trt)-ワング樹脂が得られ、検出したところ、置換度は0.6mmol/gである。
Fmoc-Cys(Trt)-ワング樹脂10g（負荷量1.0mmol/g、10mmol）を秤量して固相反応装置中に置き、25%のPIP/DMF溶液150mlを加えて脱保護し、25℃で30分間撹拌し、反応終了後、樹脂をそれぞれDMF、DCMで交互に3回洗浄した。Fmoc-Pro-OH(10.1g、30mmol)、HOBt（4.05g、30mmol）を150mlのDMFに溶解し、反応器に加え、0〜5℃で反応液に徐々にDIC（3.78g、30mmol）を加え、さらに、脱保護後のアミノ酸樹脂を加え、30℃で3時間撹拌しながら反応し、ニンヒドリン法で反応の終点を検出し、反応終了後、ろ過した後、樹脂をそれぞれDMF、DCMで交互に3回洗浄した。上記のステップを繰り返し、ペプチド配列に従って順にFmoc-Trp-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Har-OH及びFmoc-Cys(Trt)-OHをカップリングさせてFmoc-Cys(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys (Trt)-ワング樹脂が得られ、検出したところ、置換度は0.6mmol/gである。
3、線状ポリペプチド1樹脂の合成
線状ポリペプチド1樹脂はFmoc-D-Phe-Pro-Arg（pbf）-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(OtBu)-Leu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(Trt)-Cys(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Wangである。
Fmoc-Cys(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-ワング樹脂20g（置換度0.6mmol/g、12mmol）を秤量し、25%のPIP/DMF溶液 300mlを加えて脱保護し、25℃で30分間撹拌し、反応終了後、樹脂をそれぞれDMF、DCMで交互に3回洗浄した。Fmoc-Ser(Trt)-OH（20.5g、36mmol）、HOBt（4.86g、36mmol）を150mlのDMFに溶解し、反応器に加え、0〜5℃で反応液に徐々にDIC（4.53g、36mmol）を加え、また脱保護後のアミノ酸樹脂を加え、30℃で3時間撹拌しながら反応し、ニンヒドリン法で反応の終点を検出し、反応終了後、ろ過した後、樹脂をそれぞれDMF、DCMで交互に3回洗浄した。上記方法により順にFmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OHを導入して側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド1-ワング樹脂を得た。
線状ポリペプチド1樹脂はFmoc-D-Phe-Pro-Arg（pbf）-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(OtBu)-Leu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(Trt)-Cys(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-Wangである。
Fmoc-Cys(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-ワング樹脂20g（置換度0.6mmol/g、12mmol）を秤量し、25%のPIP/DMF溶液 300mlを加えて脱保護し、25℃で30分間撹拌し、反応終了後、樹脂をそれぞれDMF、DCMで交互に3回洗浄した。Fmoc-Ser(Trt)-OH（20.5g、36mmol）、HOBt（4.86g、36mmol）を150mlのDMFに溶解し、反応器に加え、0〜5℃で反応液に徐々にDIC（4.53g、36mmol）を加え、また脱保護後のアミノ酸樹脂を加え、30℃で3時間撹拌しながら反応し、ニンヒドリン法で反応の終点を検出し、反応終了後、ろ過した後、樹脂をそれぞれDMF、DCMで交互に3回洗浄した。上記方法により順にFmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OHを導入して側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド1-ワング樹脂を得た。
4、線状ポリペプチド1粗生成物の調製
ステップ3で調製された側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド1-ワング樹脂20gを酸分解剤（トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：水=190ml：5ml：5ml）に加え、25℃で2時間反応し、樹脂をろ過し、少量のトリフルオロ酢酸で樹脂を洗浄し、濾液を合わせた。濾液を激しく撹拌しながら徐々に予備冷却されたジエチルエーテル1.1Lに加え、白色沈殿が現れ、1時間静置した後、吸引ろ過し、ジエチルエーテルでケーキを5回洗浄し、真空乾燥して粗生成物6gを得た。
ステップ3で調製された側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド1-ワング樹脂20gを酸分解剤（トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：水=190ml：5ml：5ml）に加え、25℃で2時間反応し、樹脂をろ過し、少量のトリフルオロ酢酸で樹脂を洗浄し、濾液を合わせた。濾液を激しく撹拌しながら徐々に予備冷却されたジエチルエーテル1.1Lに加え、白色沈殿が現れ、1時間静置した後、吸引ろ過し、ジエチルエーテルでケーキを5回洗浄し、真空乾燥して粗生成物6gを得た。
5、ポリペプチド1のジスルフィド結合形成及び精製
ポリペプチド1の構造式は（SEQ ID No.4に表されるポリペプチド配列）D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gly Gly Gly Gly Ser Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys（ここで、26-Cysと32-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）で表される。10gのステップ4で調製された線状ポリペプチド1を200mlの精製水に溶解し、撹拌しながら5%のI2溶液を徐々に滴下し、HPLCで反応を検出し、反応終了後、分取液体クロマトグラフにより目的の製品を精製し、冷凍乾燥して最終生成物とするポリペプチド1（質量1g）を得た。ポリペプチド1の質量分析の検出結果を図1に示す。
ポリペプチド1の構造式は（SEQ ID No.4に表されるポリペプチド配列）D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gly Gly Gly Gly Ser Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys（ここで、26-Cysと32-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）で表される。10gのステップ4で調製された線状ポリペプチド1を200mlの精製水に溶解し、撹拌しながら5%のI2溶液を徐々に滴下し、HPLCで反応を検出し、反応終了後、分取液体クロマトグラフにより目的の製品を精製し、冷凍乾燥して最終生成物とするポリペプチド1（質量1g）を得た。ポリペプチド1の質量分析の検出結果を図1に示す。
実施例2
L’断片をGlu Ala Ala Ala Lysとした以外は、実施例1と同様の方法でポリペプチド化合物2を調製し、ポリペプチド2（製品質量1.2g）を得た。ポリペプチド2の質量分析の検出結果を図2に示す。
ポリペプチド2の構造式は（SEQ ID No.5に表されるポリペプチド配列）：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Ala Ala Lys Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys（ここで、26-Cysと32-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）で表される。
L’断片をGlu Ala Ala Ala Lysとした以外は、実施例1と同様の方法でポリペプチド化合物2を調製し、ポリペプチド2（製品質量1.2g）を得た。ポリペプチド2の質量分析の検出結果を図2に示す。
ポリペプチド2の構造式は（SEQ ID No.5に表されるポリペプチド配列）：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Ala Ala Lys Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys（ここで、26-Cysと32-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）で表される。
実施例3
Gly Gly Gly Gly Ser断片（即ち、L’断片）を除去した以外は、実施例1と同様の方法でポリペプチド化合物3を調製し、ポリペプチド3（製品質量1.5g）を得た。ポリペプチド3の質量分析の検出結果を図3に示す。
ポリペプチド3の構造式は（SEQ ID No.6に表されるポリペプチド配列）：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys（ここで、21-Cysと27-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）で表される。
Gly Gly Gly Gly Ser断片（即ち、L’断片）を除去した以外は、実施例1と同様の方法でポリペプチド化合物3を調製し、ポリペプチド3（製品質量1.5g）を得た。ポリペプチド3の質量分析の検出結果を図3に示す。
ポリペプチド3の構造式は（SEQ ID No.6に表されるポリペプチド配列）：D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys（ここで、21-Cysと27-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）で表される。
実施例4
L’断片をArg Val Leu Ala Glu Alaとした以外は、実施例1と同様の方法でポリペプチド化合物4を調製し、ポリペプチド4（製品質量0.86g）を得た。ポリペプチド4の質量分析の検出結果を図4に示す。
ポリペプチド4の構造式は（SEQ ID No.7に表されるポリペプチド配列）D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Arg Val Leu Ala Glu Ala Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys（ここで、27-Cysと33-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）で表される。
L’断片をArg Val Leu Ala Glu Alaとした以外は、実施例1と同様の方法でポリペプチド化合物4を調製し、ポリペプチド4（製品質量0.86g）を得た。ポリペプチド4の質量分析の検出結果を図4に示す。
ポリペプチド4の構造式は（SEQ ID No.7に表されるポリペプチド配列）D-Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Arg Val Leu Ala Glu Ala Cys Har Gly Asp Trp Pro Cys（ここで、27-Cysと33-Cysとの間にジスルフィド結合が形成される。）で表される。
試験例1〜4
試験例1〜4は実施例1〜4で調製されたポリペプチド1〜4抗ヒト凝固、抗ヒト血小板凝集の作用を説明するためのものである。健常人ドナーの静脈から30ml採血し、血液を迅速に3mlの3.8%クエン酸ナトリウムを含有するプラスチックチューブに注入し、やさしく上下反転して均一に混合した。採血された血液を810rpmで8min遠心分離して多血小板血漿(platelet rich plasma、PRP )を得、PRPを取り出し、さらに、血液サンプルを3510rpmで8min遠心分離して乏血小板血漿(platelet poor plasma、PPP)を得た。
1、プロトロンビン時間(PT)、トロンビン時間(TT)、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)の測定
キット操作方法に従って試薬の再構成および保存を行い、おのおの各PPPについて、それぞれ10部の試験サンプルを取り試験カップに置き、それぞれ生理食塩水、ポリペプチド1、ポリペプチド2、ポリペプチド3、ポリペプチド4を各10μL加え、さらに、それぞれPT、TT、APTT試薬を加え、すぐに試験を開始した。ポリペプチド1〜4の人体外の血液凝固機能に対する影響は表3（nは例数である）に示す。
試験例1〜4は実施例1〜4で調製されたポリペプチド1〜4抗ヒト凝固、抗ヒト血小板凝集の作用を説明するためのものである。健常人ドナーの静脈から30ml採血し、血液を迅速に3mlの3.8%クエン酸ナトリウムを含有するプラスチックチューブに注入し、やさしく上下反転して均一に混合した。採血された血液を810rpmで8min遠心分離して多血小板血漿(platelet rich plasma、PRP )を得、PRPを取り出し、さらに、血液サンプルを3510rpmで8min遠心分離して乏血小板血漿(platelet poor plasma、PPP)を得た。
1、プロトロンビン時間(PT)、トロンビン時間(TT)、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)の測定
キット操作方法に従って試薬の再構成および保存を行い、おのおの各PPPについて、それぞれ10部の試験サンプルを取り試験カップに置き、それぞれ生理食塩水、ポリペプチド1、ポリペプチド2、ポリペプチド3、ポリペプチド4を各10μL加え、さらに、それぞれPT、TT、APTT試薬を加え、すぐに試験を開始した。ポリペプチド1〜4の人体外の血液凝固機能に対する影響は表3（nは例数である）に示す。
表3の結果は、ポリペプチド1〜4という4つの化合物はいずれも人体外の血液凝固機能に影響を及ぼすことができ、様々な程度にPT、APTT及びTTを延長させ、終濃度が1×10-6mol/Lの各々化合物において、ポリペプチド2は、PT、APTTを延長させた倍数が最大であることが示された。
2、血小板凝集の測定
血小板凝集能測定装置を起動させて30min予熱し、PPPで補正し、試験カップに270μl PRPを加え、10μlポリペプチド1、ポリペプチド2、ポリペプチド3、ポリペプチド4 (1.0×10-7mol/L)及び/又は20μlの生理食塩水をそれぞれ加え、全体積は300μlとなった。5min温浴した後、さらに誘発剤ADP 5μl、アドレナリン5μlを加え、試験を開始した。5分後、試験終了し、5min内の最大凝集率を記録し、データとグラフを印刷した。試験結果から計算式1により異なる濃度のポリペプチド1〜4のヒト血小板凝集への抑制率を計算し、ポリペプチド1〜4のADP誘発人体外の血小板凝集機能に対する影響を表4に示す。計算式は以下の通りである。
血小板凝集能測定装置を起動させて30min予熱し、PPPで補正し、試験カップに270μl PRPを加え、10μlポリペプチド1、ポリペプチド2、ポリペプチド3、ポリペプチド4 (1.0×10-7mol/L)及び/又は20μlの生理食塩水をそれぞれ加え、全体積は300μlとなった。5min温浴した後、さらに誘発剤ADP 5μl、アドレナリン5μlを加え、試験を開始した。5分後、試験終了し、5min内の最大凝集率を記録し、データとグラフを印刷した。試験結果から計算式1により異なる濃度のポリペプチド1〜4のヒト血小板凝集への抑制率を計算し、ポリペプチド1〜4のADP誘発人体外の血小板凝集機能に対する影響を表4に示す。計算式は以下の通りである。
表4の結果は、ポリペプチド1、ポリペプチド2、ポリペプチド3、ポリペプチド4という4つの化合物はいずれもADP誘発人体外の血小板凝集に影響を及ぼすことができ、終濃度が3×10-6mol/LのエプチフィバチドはADP誘発人体外の血小板凝集を完全に抑制でき、抑制率は100%であるが、終濃度が3×10-6mol/L、1×10-5mol/Lのポリペプチド1、ポリペプチド2、ポリペプチド3、ポリペプチド4という4つの化合物において、ポリペプチド2のADP誘発人体外の血小板凝集に対する抑制作用は最強であることが示された。
試験例5
本試験例は実施例2で調製されたポリペプチド2の抗ラット血栓形成の效果を説明するためのものである。
1. 実験動物：健康、成年SDラット160匹、雄性、体重250g~300g、北京維通利華公司から購入。動物生産許可証号：SCXK（京）2012-0001。
2.供試薬品
ポリペプチド2、ペプチド含有量97.21%。
エノキサパリンナトリウム注射液Aventis Intercontinental、SANOFI（北京）製薬有限公司、個包装承認番号：中国CFDA承認番号 No.J20090094。ロット番号：2SN76、0.4ml:4000AxaIU×2支。
注射用ビバリルジン、西安新通薬物研究有限公司、分子量2180.2、純度96.55%、含有量69.44%。
3.実験方法
3.1試薬の調製及び材料の製造方法
3.1.1試薬の調製
3.1.1.1供試品のポリペプチド2溶液の調製
200mgのポリペプチド2を正確に秤量し、生理食塩水を10mg/mLの母液とし、毎日実験前に動物体重に応じて、対応する母液を取って必要な投与量を調製した。
3.1.1.2 20%ウラタン：ウラタン20gを精密に量り蒸留水を加えて100mlに定容した。
3.1.1.3 3.8%クエン酸ナトリウム：クエン酸ナトリウム二水和物4.33gを精密に量り、生理食塩水を加えて100mlに定容し3.8%の溶液を調製した。
3.1.2材料の調製
3.1.2.1 アルミホイル紙：直尺で測量して2.5cm×2.5cmにカットし、番号をつけて秤量した。
3.1.2.2 35%塩化第2の鉄溶液：塩化第2の鉄35gを取り出し、100mL蒸留水に溶解した。
本試験例は実施例2で調製されたポリペプチド2の抗ラット血栓形成の效果を説明するためのものである。
1. 実験動物：健康、成年SDラット160匹、雄性、体重250g~300g、北京維通利華公司から購入。動物生産許可証号：SCXK（京）2012-0001。
2.供試薬品
ポリペプチド2、ペプチド含有量97.21%。
エノキサパリンナトリウム注射液Aventis Intercontinental、SANOFI（北京）製薬有限公司、個包装承認番号：中国CFDA承認番号 No.J20090094。ロット番号：2SN76、0.4ml:4000AxaIU×2支。
注射用ビバリルジン、西安新通薬物研究有限公司、分子量2180.2、純度96.55%、含有量69.44%。
3.実験方法
3.1試薬の調製及び材料の製造方法
3.1.1試薬の調製
3.1.1.1供試品のポリペプチド2溶液の調製
200mgのポリペプチド2を正確に秤量し、生理食塩水を10mg/mLの母液とし、毎日実験前に動物体重に応じて、対応する母液を取って必要な投与量を調製した。
3.1.1.2 20%ウラタン：ウラタン20gを精密に量り蒸留水を加えて100mlに定容した。
3.1.1.3 3.8%クエン酸ナトリウム：クエン酸ナトリウム二水和物4.33gを精密に量り、生理食塩水を加えて100mlに定容し3.8%の溶液を調製した。
3.1.2材料の調製
3.1.2.1 アルミホイル紙：直尺で測量して2.5cm×2.5cmにカットし、番号をつけて秤量した。
3.1.2.2 35%塩化第2の鉄溶液：塩化第2の鉄35gを取り出し、100mL蒸留水に溶解した。
3.2. 群分け及び投与
ラット160匹を、無作為に群分け、1群あたり5〜10匹である。
1）モデルによる対照群：同容量の生理食塩水を静脈注射し、
2）ポリペプチド2の6個の投与量組は、1.5mg/kg+3.75mg/kg/hで開始し、下へ1mg/kg+2.5 mg/kg/h、0.5mg/kg+1.25mg/kg/h、0.25mg/kg+0.75mg/kg/h、0.125mg/kg+0.375mg/kg/h、0.041mg/kg+0.125mg/kg/hと低下させ、
3）陽性対照としてのエノキサパリンの5個の投与量組は、30U/kg+45U/kg/hで開始し、上へ60U/kg+60U/kg/h、30U/kg+120U/kg/h、90U/kg+120U/kg/h、60U/kg+240U/kg/hと増加させ、
4）陽性対照としてのビバリルジンの5個の投与量組は、0.5mg/kg+2mg/kg/hで開始し、下へ0.35mg/kg+1.3mg/kg/h、0.17mg/kg+0.65mg/kg/h、0.08mg/kg+0.325mg/kg/hと低下させ、実験前の12時間で動物を絶食させたが、絶水させなった（表5に示す）。
ラットの体重（Kg）に準して、初回投与量の薬物を2mL生理食塩水に溶解し１回注射し、維持投与量で9mlの生理食塩水に溶解し、ダブルチャネルマイクロシリンジポンプに置き、点滴滴下速度0.1ml/minで90分間かけて滴下した。偽手術群は、同容量の生理食塩水を与えた。
ラット160匹を、無作為に群分け、1群あたり5〜10匹である。
1）モデルによる対照群：同容量の生理食塩水を静脈注射し、
2）ポリペプチド2の6個の投与量組は、1.5mg/kg+3.75mg/kg/hで開始し、下へ1mg/kg+2.5 mg/kg/h、0.5mg/kg+1.25mg/kg/h、0.25mg/kg+0.75mg/kg/h、0.125mg/kg+0.375mg/kg/h、0.041mg/kg+0.125mg/kg/hと低下させ、
3）陽性対照としてのエノキサパリンの5個の投与量組は、30U/kg+45U/kg/hで開始し、上へ60U/kg+60U/kg/h、30U/kg+120U/kg/h、90U/kg+120U/kg/h、60U/kg+240U/kg/hと増加させ、
4）陽性対照としてのビバリルジンの5個の投与量組は、0.5mg/kg+2mg/kg/hで開始し、下へ0.35mg/kg+1.3mg/kg/h、0.17mg/kg+0.65mg/kg/h、0.08mg/kg+0.325mg/kg/hと低下させ、実験前の12時間で動物を絶食させたが、絶水させなった（表5に示す）。
ラットの体重（Kg）に準して、初回投与量の薬物を2mL生理食塩水に溶解し１回注射し、維持投与量で9mlの生理食塩水に溶解し、ダブルチャネルマイクロシリンジポンプに置き、点滴滴下速度0.1ml/minで90分間かけて滴下した。偽手術群は、同容量の生理食塩水を与えた。
4. 実験操作
4.1 ラット手術準備
実験前の一宿にラットを絶食させ、自由飲水させた。20%ウラタン溶液5ml/kgを静脈注射して麻酔させ、仰臥位で固定し、両側総頸動脈、外頸静脈及び下大静脈を分離した。外頸静脈カテーテル挿入は投与するために用いられ、一側総頸動脈カテーテル挿入は、採血して血液凝固機能PT、APTTを測定するために用いられ、他の一側総頸動脈は動脈血栓モデルを作成することに用いられ、下大静脈は静脈血栓モデルを作成することに用いられた。
4.2血液凝固機能測定
それぞれ投与前、投与60min、休薬前で採血して活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin tim、APTT)、プロトロンビン時間（prothrombin time、PT）を測定した。血液サンプルを3510rpmで8min遠心分離して乏血小板血漿(platelet poor plasma, PPP)を得た。キット操作方法に従って試薬の再構成及び保存を行い、各々血液サンプルを試験カップに置き、さらにPT、APTT試薬をそれぞれ加え、すぐに測定を開始し、測定終了後、結果を記録した。
4.3 動脈血栓モデル
負荷量で投与し、30min維持投与した後、直径3mmであり、35%FeCl3を浸漬した濾紙を総頸動脈下に敷き、それの下に周囲組織を保護するための小片のプラスチックフィルム（2.5×2.0cm）を置いた。動脈遠位端に温度プローブで温度を検出し、刺激から温度が2.5度下がるまでに必要な時間を考察し、血管閉塞時間とした。
4.4静脈血栓モデル
負荷量で投与し、30min維持投与した後、直径3mmであり、35% FeCl3溶液を吸収した濾紙を下大静脈の下に敷き、それの下に周囲組織を保護するための小片のプラスチックフィルム（2.5×2.0cm）を置いた。15分後、濾紙を除き、さらに45min観察した後加温生理食塩水で血管と局所的な組織を洗浄し、包まれた血管をカットし、血管壁に接着された血栓をアルミホイル紙に剥離して湿重量を秤量し、室温で一晩乾燥し、乾燥重量を秤量した。実験終了まで投与し続けた。
4.1 ラット手術準備
実験前の一宿にラットを絶食させ、自由飲水させた。20%ウラタン溶液5ml/kgを静脈注射して麻酔させ、仰臥位で固定し、両側総頸動脈、外頸静脈及び下大静脈を分離した。外頸静脈カテーテル挿入は投与するために用いられ、一側総頸動脈カテーテル挿入は、採血して血液凝固機能PT、APTTを測定するために用いられ、他の一側総頸動脈は動脈血栓モデルを作成することに用いられ、下大静脈は静脈血栓モデルを作成することに用いられた。
4.2血液凝固機能測定
それぞれ投与前、投与60min、休薬前で採血して活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin tim、APTT)、プロトロンビン時間（prothrombin time、PT）を測定した。血液サンプルを3510rpmで8min遠心分離して乏血小板血漿(platelet poor plasma, PPP)を得た。キット操作方法に従って試薬の再構成及び保存を行い、各々血液サンプルを試験カップに置き、さらにPT、APTT試薬をそれぞれ加え、すぐに測定を開始し、測定終了後、結果を記録した。
4.3 動脈血栓モデル
負荷量で投与し、30min維持投与した後、直径3mmであり、35%FeCl3を浸漬した濾紙を総頸動脈下に敷き、それの下に周囲組織を保護するための小片のプラスチックフィルム（2.5×2.0cm）を置いた。動脈遠位端に温度プローブで温度を検出し、刺激から温度が2.5度下がるまでに必要な時間を考察し、血管閉塞時間とした。
4.4静脈血栓モデル
負荷量で投与し、30min維持投与した後、直径3mmであり、35% FeCl3溶液を吸収した濾紙を下大静脈の下に敷き、それの下に周囲組織を保護するための小片のプラスチックフィルム（2.5×2.0cm）を置いた。15分後、濾紙を除き、さらに45min観察した後加温生理食塩水で血管と局所的な組織を洗浄し、包まれた血管をカットし、血管壁に接着された血栓をアルミホイル紙に剥離して湿重量を秤量し、室温で一晩乾燥し、乾燥重量を秤量した。実験終了まで投与し続けた。
5.検測指標
5.1 血液凝固機能測定：それぞれ投与前0min、投与60min、休薬の時で採血して血小板凝集凝固因子分析装置で血液凝固機能（PT、APTT）、ACTを測定した。
5.2閉塞時間
FeCl3を置いてから、動脈表面温度が2.5℃下がるまでの時間は、血栓形成を反映する血管閉塞時間である。
5.3血栓重量
実験終了後、血栓が形成された血管セグメントをカットし、その湿重量を秤量し、室温で一晩乾燥し、血栓の乾燥重量を測定し、血栓形成抑制率を計算した。
5.1 血液凝固機能測定：それぞれ投与前0min、投与60min、休薬の時で採血して血小板凝集凝固因子分析装置で血液凝固機能（PT、APTT）、ACTを測定した。
5.2閉塞時間
FeCl3を置いてから、動脈表面温度が2.5℃下がるまでの時間は、血栓形成を反映する血管閉塞時間である。
5.3血栓重量
実験終了後、血栓が形成された血管セグメントをカットし、その湿重量を秤量し、室温で一晩乾燥し、血栓の乾燥重量を測定し、血栓形成抑制率を計算した。
表6と表7の結果により、ポリペプチド2は、投与量依存的にFeCl3誘発ラット下大静脈血栓形成を抑制し、FeCl3誘発ラット総頸動脈血栓形成を抑制し、ラットのAPTTとPTを延長させることができることが明らかになった。
図5はポリペプチド2のFeCl3誘発ラット下大静脈血栓形成に対する影響を示す図であり、モデル群と比較して、*P<0.05、** P<0.01となる。図6はポリペプチド2のFeCl3誘発ラット総頸動脈における血栓形成に対する影響を示すものである。動脈閉塞時間変化倍数として、モデル群と比較して、*P<0.05、** P<0.01となる。図7はポリペプチド2のラットのAPTTに対する影響を示すものである。図8はポリペプチド2のラットのPTに対する影響を示すものである。
試験例6
本試験例は実施例2で調製されたポリペプチド2の持続静脈内投与によるウサギ血栓抑制の薬力学試験を説明するためのものである。
1. 実験動物及び材料
1.1 実験動物：健康成年ウサギ10匹、雄性、体重2〜2.5kg、西安市迪楽普生物資源開発有限公司から提供、動物生産許可証号：SCXK（陝）2006-001。
供試薬品：ポリペプチド2、ペプチド含有量97.21%。
陽性対照品：エノキサパリンナトリウム注射液Aventis Intercontinental、Sanofi（北京）製薬有限公司、個包装承認番号：中国CFDA承認番号No.J20090094、ロット番号：2SN76、0.4ml:4000AxaIU×2支。
1.2 実験材料
実験材料は、表8の通りである。
本試験例は実施例2で調製されたポリペプチド2の持続静脈内投与によるウサギ血栓抑制の薬力学試験を説明するためのものである。
1. 実験動物及び材料
1.1 実験動物：健康成年ウサギ10匹、雄性、体重2〜2.5kg、西安市迪楽普生物資源開発有限公司から提供、動物生産許可証号：SCXK（陝）2006-001。
供試薬品：ポリペプチド2、ペプチド含有量97.21%。
陽性対照品：エノキサパリンナトリウム注射液Aventis Intercontinental、Sanofi（北京）製薬有限公司、個包装承認番号：中国CFDA承認番号No.J20090094、ロット番号：2SN76、0.4ml:4000AxaIU×2支。
1.2 実験材料
実験材料は、表8の通りである。
1.3 供試品のポリペプチド2溶液の調製
200mgのポリペプチド2を電子天秤で精密に量り、生理食塩水で10mg/mLの母液を調製した。均一によく混合し、5mLずつ取り分け、-20℃で保管した。試験時にウサギの体重に基づいて計算し、適量取り出し、希釈し使用した。
3%ペントバルビタールナトリウム：ペントバルビタールナトリウム3gを精密に量り、蒸留水を加えて100mlに定容した。
3.8%クエン酸ナトリウム：クエン酸ナトリウム二水和物4.33gを精密に量り、生理食塩水を加えて100mlに定容して3.8%の溶液に調製した。
アドレナリン：1.319mlストック溶液を量り100mlに定容された生理食塩水にて60μMの溶液を調製し、4℃で冷蔵庫保管し、使用前に取り分けた。
ADP：ADP 14.3mgを精密に量り、5mlの生理食塩水に溶解して6000μmol/LのADP溶液を得、4℃で保管し、実験前、生理食塩水を加え、それを600μmol/Lに希釈し、用意した。
1.4材料の調製
アルミホイル紙：直尺で測量して2.5cm×2.5cmにカットし、番号をつけて秤量した。
非吸収性外科手術用縫合糸：直尺にて長さで8cm量り取り、秤量した。
50%塩化第2の鉄溶液：塩化第2の鉄50gを取り、100mL蒸留水に溶解させた。
200mgのポリペプチド2を電子天秤で精密に量り、生理食塩水で10mg/mLの母液を調製した。均一によく混合し、5mLずつ取り分け、-20℃で保管した。試験時にウサギの体重に基づいて計算し、適量取り出し、希釈し使用した。
3%ペントバルビタールナトリウム：ペントバルビタールナトリウム3gを精密に量り、蒸留水を加えて100mlに定容した。
3.8%クエン酸ナトリウム：クエン酸ナトリウム二水和物4.33gを精密に量り、生理食塩水を加えて100mlに定容して3.8%の溶液に調製した。
アドレナリン：1.319mlストック溶液を量り100mlに定容された生理食塩水にて60μMの溶液を調製し、4℃で冷蔵庫保管し、使用前に取り分けた。
ADP：ADP 14.3mgを精密に量り、5mlの生理食塩水に溶解して6000μmol/LのADP溶液を得、4℃で保管し、実験前、生理食塩水を加え、それを600μmol/Lに希釈し、用意した。
1.4材料の調製
アルミホイル紙：直尺で測量して2.5cm×2.5cmにカットし、番号をつけて秤量した。
非吸収性外科手術用縫合糸：直尺にて長さで8cm量り取り、秤量した。
50%塩化第2の鉄溶液：塩化第2の鉄50gを取り、100mL蒸留水に溶解させた。
2. 群分け及び投与：ウサギ10匹を、無作為に3群に分け、1群あたり2-3匹である。1）偽手術群(NS)：同容量の生理食塩水を静脈注射し、手術方法は上記のものと同じい； 2）ポリペプチド2の投与群8.0mg/kg+20.0mg/kg/h；3) 陽性対照としてのエノキサパリン群50U/kg+150U/kg/h。ウサギの体重（Kg）で計算し、初回投与量の薬物を2mLの生理食塩水に溶解して1回注射し、維持投与量で90mlの生理食塩水に溶解し、ダブルチャネルマイクロシリンジポンプに置き、1ml/minの点滴滴下速度で90minかけて滴下した。偽手術群に同容量の生理食塩水を与えた。
3. 実験操作
3.1 ウサギ手術準備：ウサギを実験室に送って1日適応した後、まず、スクリーニングを行った。耳介動脈に採血して血液一般検査及びAPTT測定を行い、血液像が正常で、APTTが16s〜28sの間にあるウサギを選択して実験を行った。試験ウサギを実験前の一晩絶食させ、自由飲水させた。3%ペントバルビタールナトリウム溶液1ml/kgを静脈注射して麻酔させ、仰臥位で固定し、一側総頸動脈、外頸静脈、一側大腿動脈、大腿静脈及び一側前肢静脈を分離した。前肢静脈カテーテル挿入は投与するために用いられ、左側大腿静脈カテーテル挿入は採血して血小板凝集率を測定するために用いられ、大腿動脈は動脈血栓モデルに用いられ、総頸動脈、外頸静脈は動静脈バイパス血栓モデルに用いられた。
3.2動脈血栓（AT）モデル：投与する同時に、50%のFeCl3溶液をを吸収した小片の濾紙（1cm×1.5cm）を右側大腿動脈の上に敷き、それの下に周囲組織を保護するための小片のプラスチックフィルム（2.5×2.0cm）を置いた。10分後、濾紙を除き、加温生理食塩水で血管と局所的な組織を洗浄し、包んだ血管をカットし、血管壁に接着された血栓をアルミホイル紙に剥離して湿重量を秤量し、室温で一晩乾燥し、乾燥重量を秤量した。
3.3 実験手順：ウサギの前肢と両側大腿動脈とを分離した後、10min安定し、投与が始また。投与する同時に、50%FeCl3濾紙で大腿動脈を包んでATモデルを作成し、15min包んだ後、除去した。投与後120minにわたって観察続け、試験が全部終わった。
3.1 ウサギ手術準備：ウサギを実験室に送って1日適応した後、まず、スクリーニングを行った。耳介動脈に採血して血液一般検査及びAPTT測定を行い、血液像が正常で、APTTが16s〜28sの間にあるウサギを選択して実験を行った。試験ウサギを実験前の一晩絶食させ、自由飲水させた。3%ペントバルビタールナトリウム溶液1ml/kgを静脈注射して麻酔させ、仰臥位で固定し、一側総頸動脈、外頸静脈、一側大腿動脈、大腿静脈及び一側前肢静脈を分離した。前肢静脈カテーテル挿入は投与するために用いられ、左側大腿静脈カテーテル挿入は採血して血小板凝集率を測定するために用いられ、大腿動脈は動脈血栓モデルに用いられ、総頸動脈、外頸静脈は動静脈バイパス血栓モデルに用いられた。
3.2動脈血栓（AT）モデル：投与する同時に、50%のFeCl3溶液をを吸収した小片の濾紙（1cm×1.5cm）を右側大腿動脈の上に敷き、それの下に周囲組織を保護するための小片のプラスチックフィルム（2.5×2.0cm）を置いた。10分後、濾紙を除き、加温生理食塩水で血管と局所的な組織を洗浄し、包んだ血管をカットし、血管壁に接着された血栓をアルミホイル紙に剥離して湿重量を秤量し、室温で一晩乾燥し、乾燥重量を秤量した。
3.3 実験手順：ウサギの前肢と両側大腿動脈とを分離した後、10min安定し、投与が始また。投与する同時に、50%FeCl3濾紙で大腿動脈を包んでATモデルを作成し、15min包んだ後、除去した。投与後120minにわたって観察続け、試験が全部終わった。
4.検測指標
4.1血小板凝集率：投与前0min、投与30min、60min、90min、休薬60min、120min、180minで大腿静脈から2.7ml採血し、3.8%クエン酸ナトリウムを0.3ml含有する遠沈管に迅速に注入し、均一によく混合した。810rpm（100g）で8min遠心分離し、PRPを取り出し、3500rpm（1863g）で8min遠心分離し、PPPを取り出して血小板凝集を行った。
それぞれ投与前（0min）、投与後5min、15minに採血して血小板凝集率を測定し、血小板凝集抑制率を計算した。計算式は以下の通りである。
4.2血液凝固機能測定：それぞれ投与前0min、投与30min、60min、90min、休薬60min、120min、180minに採血して血小板凝集凝固因子分析装置で血液凝固機能（PT、TT、APTT）を測定した。血液サンプルを3510rpmで8min遠心分離して乏血小板血漿(platelet poor plasma、PPP)を得た。キット操作方法に従って試薬の再構成と保管を行い、各々血液サンプルを試験カップに置き、さらに、PT、TT、APTT試薬をそれぞれ加え、すぐに測定を開始し、測定終了後、結果を記録した。
4.3 ACTの測定：投与前0min、投与5min、15minに全血採血し、カリオンを加え、37℃の水浴鍋内に置き、全血凝固時間を記録した。
4.4血栓重量：実験終了後、血栓が形成された血管セグメントをカットし、その湿重量を秤量し、室温で一晩乾燥し、血栓の乾燥重量を測定し、血栓形成抑制率を計算した。公式は以下の通りである。
4.1血小板凝集率：投与前0min、投与30min、60min、90min、休薬60min、120min、180minで大腿静脈から2.7ml採血し、3.8%クエン酸ナトリウムを0.3ml含有する遠沈管に迅速に注入し、均一によく混合した。810rpm（100g）で8min遠心分離し、PRPを取り出し、3500rpm（1863g）で8min遠心分離し、PPPを取り出して血小板凝集を行った。
それぞれ投与前（0min）、投与後5min、15minに採血して血小板凝集率を測定し、血小板凝集抑制率を計算した。計算式は以下の通りである。
4.3 ACTの測定：投与前0min、投与5min、15minに全血採血し、カリオンを加え、37℃の水浴鍋内に置き、全血凝固時間を記録した。
4.4血栓重量：実験終了後、血栓が形成された血管セグメントをカットし、その湿重量を秤量し、室温で一晩乾燥し、血栓の乾燥重量を測定し、血栓形成抑制率を計算した。公式は以下の通りである。
5. 試験結果：
5.1ポリペプチド2の持続静脈内投与によるFeCl3誘発ウサギ大腿動脈血栓形成に対する影響
結果により、ポリペプチド2の8.0mg/kg+20.0mg/kg/h投与の、FeCl3誘発ウサギ大腿動脈血栓形成に対する影響では、エノキサパリンの50U/kg+150U/kg/h投与は、血栓抑制率がポリペプチド2より低く、生理食塩水群と比較して、統計的な差(P>0.05）がないことが示された。結果は表9に示す。
5.1ポリペプチド2の持続静脈内投与によるFeCl3誘発ウサギ大腿動脈血栓形成に対する影響
結果により、ポリペプチド2の8.0mg/kg+20.0mg/kg/h投与の、FeCl3誘発ウサギ大腿動脈血栓形成に対する影響では、エノキサパリンの50U/kg+150U/kg/h投与は、血栓抑制率がポリペプチド2より低く、生理食塩水群と比較して、統計的な差(P>0.05）がないことが示された。結果は表9に示す。
5.2ポリペプチド2の持続静脈内投与によるウサギ血小板凝集機能に対する影響
結果により、ポリペプチド2の持続静脈内投与はウサギ血小板凝集を抑制でき、休薬後、時間が経つにつれて血小板凝集への抑制作用が徐々に弱まり、エノキサパリンの50U/kg+150U/kg/h投与は、血小板凝集抑制率がポリペプチド2より低いことが示された。結果は表10に示す。
結果により、ポリペプチド2の持続静脈内投与はウサギ血小板凝集を抑制でき、休薬後、時間が経つにつれて血小板凝集への抑制作用が徐々に弱まり、エノキサパリンの50U/kg+150U/kg/h投与は、血小板凝集抑制率がポリペプチド2より低いことが示された。結果は表10に示す。
5.3ポリペプチド2の持続静脈内投与によるウサギ血液凝固機能に対する影響
結果は、表11-14の通りであり、表11はポリペプチド2の持続静脈内投与によるウサギ血液凝固機能APTT対する影響（S、（x±S））であり、表12はポリペプチド2の持続静脈内投与によるウサギ血液凝固機能PT対する影響（S、（x±S））であり、表13はポリペプチド2の持続静脈内投与によるウサギ血液凝固機能TT対する影響（S、（x±S））であり、表14はポリペプチド2の持続静脈内投与によるウサギのACT対する影響（S、（x±S））である。表11-14では、投与量単位は( mg/kg+ mg/kg/h)である。結果により、ポリペプチド2の持続静脈内投与はウサギ血小板凝集を抑制できることが示された。休薬後、時間が経つにつれて、血小板凝集に対する抑制作用は徐々に弱まった。
結果は、表11-14の通りであり、表11はポリペプチド2の持続静脈内投与によるウサギ血液凝固機能APTT対する影響（S、（x±S））であり、表12はポリペプチド2の持続静脈内投与によるウサギ血液凝固機能PT対する影響（S、（x±S））であり、表13はポリペプチド2の持続静脈内投与によるウサギ血液凝固機能TT対する影響（S、（x±S））であり、表14はポリペプチド2の持続静脈内投与によるウサギのACT対する影響（S、（x±S））である。表11-14では、投与量単位は( mg/kg+ mg/kg/h)である。結果により、ポリペプチド2の持続静脈内投与はウサギ血小板凝集を抑制できることが示された。休薬後、時間が経つにつれて、血小板凝集に対する抑制作用は徐々に弱まった。
以上の結果により、ポリペプチド2の注射（iv）+点滴静脈注射（vd）8.0mg/kg+20.0mg/kg 90minでは、ウサギ血小板凝集を抑制し、ウサギ血液凝固機能に影響を及ぼし、APTT、PT、TTおよびACTを延長させることができ、大腿動脈血栓形成を抑制することが示された。ポリペプチド2の大腿動脈血栓抑制と血小板凝集抑制作用がエノキサパリンに相当する場合に、エノキサパリンは、APTTを延長させる作用がポリペプチド2より強いので、エノキサパリンの出血の危険性はポリペプチド2より大きいことが示された。
試験例7
本試験例は単回静脈内投与によるウサギ体内で血栓形成抑制及び凝抗血小板凝集抑制の実験を説明するためのものである。実験動物：健康成年ウサギ48匹、雄性、体重2〜2.5kg、西安市迪楽普生物資源開発有限公司から提供され、動物合格証号：SCXK（陝）2006-001である。供試薬品：ポリペプチド2、ペプチド含有量は97.21%である。陽性薬：エノキサパリンとビバリルジンである。
本試験例は単回静脈内投与によるウサギ体内で血栓形成抑制及び凝抗血小板凝集抑制の実験を説明するためのものである。実験動物：健康成年ウサギ48匹、雄性、体重2〜2.5kg、西安市迪楽普生物資源開発有限公司から提供され、動物合格証号：SCXK（陝）2006-001である。供試薬品：ポリペプチド2、ペプチド含有量は97.21%である。陽性薬：エノキサパリンとビバリルジンである。
1. 群分け及び投与：ウサギ48匹。無作為に6群に分け、1群あたり8匹である。1）偽手術群(NS)：同容量の生理食塩水を静脈注射し；2）陽性対照としてのビバリルジン群(6mg/kg)；3）陽性対照としてのエノキサパリン群(200U/kg)；4）ポリペプチド2の低用量群(3.0mg/kg)；5）ポリペプチド2の中用量群(6.0mg/kg)；6）ポリペプチド2の高用量群(12.0mg/kg)。ポリペプチド2は単回静脈内投与を採用した。ウサギ体重（Kg）で、薬物を2mL生理食塩水に溶解して1回注射した。偽手術群は同容量の生理食塩水を与えた。
2. 実験操作
2.1 ウサギ手術準備：ウサギを実験室に送って1日適応した後、まず、スクリーニングを行った。耳介動脈に採血して血液一般検査及びAPTT測定を行い、血液像が正常で、APTTが16s〜28sの間にあるウサギを選択して実験を行った。実験前、試験ウサギを一晩絶食させ、自由飲水させた。3%ペントバルビタールナトリウム溶液1ml/kgを静脈注射して麻酔させ、仰臥位で固定し、一側総頸動脈、外頸静脈、一側大腿動脈、大腿静脈及び一側前肢静脈を分離した。前肢静脈カテーテル挿入は投与するために用いられ、左側大腿静脈カテーテル挿入は採血して血小板凝集率を測定するために用いられ、大腿動脈は動脈血栓モデルを作成することに用いられ、総頸動脈、外頸静脈は動静脈バイパス血栓モデルを作成することに用いられた。
2.2動静脈バイパス血栓（AVST）モデル：動静脈シャント装置は2つのカニューレからり、外カニューレは長さ約8cm、内径7.9mmであり、内カニューレは長さ約2.5cm、内径4.8mmであり、ポリエチレン管に長さ約8cmの絹糸を置き、50Μ/mlのヘパリンナトリウム溶液を満たし、一端を左側大腿動脈に挿入し、他の一端を右側大腿静脈に挿入した。30s投与して血流を流出させ、血液は左側動脈からポリエチレン管に流れ、右側静脈に返し、15分後、血流を中断し、絹糸を迅速に取り出してアルミホイル紙（サイズは2.5cm×2.5cm）に置き、湿重量を秤量し、室温で一晩乾燥し、乾燥重量を秤量した。
2.3動脈血栓（AT）モデル：投与する同時に、50%のFeCl3溶液を吸収した小片の濾紙（1cm×1.5cm）を右側大腿動脈に敷き、それの下に周囲組織を保護するための小片のプラスチックフィルム（2.5×2.0cm）を置いた。10分後、濾紙を除き、加温生理食塩水で血管と局所的な組織を洗浄し、包まれた血管をカットし、血管壁に接着した血栓をアルミホイル紙に剥離して湿重量を秤量し、室温で一晩乾燥し、乾燥重量を秤量した。
2.4 実験手順：実験手順は、図9に示すとおりであり、犬の前肢と両側大腿動脈を分離した後、10min安定し、投与を開始した。投与する同時に、50%のFeCl3濾紙で大腿動脈を包んでATモデルを作成し、10min包んでいる後、除去し、AVSTモデルを作成し、40分後取り出した。投与後120minにわたって観察し続け、試験が全部終わった。
2.1 ウサギ手術準備：ウサギを実験室に送って1日適応した後、まず、スクリーニングを行った。耳介動脈に採血して血液一般検査及びAPTT測定を行い、血液像が正常で、APTTが16s〜28sの間にあるウサギを選択して実験を行った。実験前、試験ウサギを一晩絶食させ、自由飲水させた。3%ペントバルビタールナトリウム溶液1ml/kgを静脈注射して麻酔させ、仰臥位で固定し、一側総頸動脈、外頸静脈、一側大腿動脈、大腿静脈及び一側前肢静脈を分離した。前肢静脈カテーテル挿入は投与するために用いられ、左側大腿静脈カテーテル挿入は採血して血小板凝集率を測定するために用いられ、大腿動脈は動脈血栓モデルを作成することに用いられ、総頸動脈、外頸静脈は動静脈バイパス血栓モデルを作成することに用いられた。
2.2動静脈バイパス血栓（AVST）モデル：動静脈シャント装置は2つのカニューレからり、外カニューレは長さ約8cm、内径7.9mmであり、内カニューレは長さ約2.5cm、内径4.8mmであり、ポリエチレン管に長さ約8cmの絹糸を置き、50Μ/mlのヘパリンナトリウム溶液を満たし、一端を左側大腿動脈に挿入し、他の一端を右側大腿静脈に挿入した。30s投与して血流を流出させ、血液は左側動脈からポリエチレン管に流れ、右側静脈に返し、15分後、血流を中断し、絹糸を迅速に取り出してアルミホイル紙（サイズは2.5cm×2.5cm）に置き、湿重量を秤量し、室温で一晩乾燥し、乾燥重量を秤量した。
2.3動脈血栓（AT）モデル：投与する同時に、50%のFeCl3溶液を吸収した小片の濾紙（1cm×1.5cm）を右側大腿動脈に敷き、それの下に周囲組織を保護するための小片のプラスチックフィルム（2.5×2.0cm）を置いた。10分後、濾紙を除き、加温生理食塩水で血管と局所的な組織を洗浄し、包まれた血管をカットし、血管壁に接着した血栓をアルミホイル紙に剥離して湿重量を秤量し、室温で一晩乾燥し、乾燥重量を秤量した。
2.4 実験手順：実験手順は、図9に示すとおりであり、犬の前肢と両側大腿動脈を分離した後、10min安定し、投与を開始した。投与する同時に、50%のFeCl3濾紙で大腿動脈を包んでATモデルを作成し、10min包んでいる後、除去し、AVSTモデルを作成し、40分後取り出した。投与後120minにわたって観察し続け、試験が全部終わった。
3.検測指標
3.1血小板凝集率：大腿静脈から2.7ml採血し、0.3ml 3.8%クエン酸ナトリウムを含有する遠沈管に迅速に注入し、均一によく混合した。810rpm（100g）で8min遠心分離し、PRPを取り出し、3500rpm（1863g）で8min遠心分離し、PPPを取り出して血小板凝集をした。
それぞれ投与前（0min）、投与後5min、15minで採血して血小板凝集率を測定し、血小板凝集抑制率を計算した。計算式は以下の通りである。
3.2血液凝固機能測定：それぞれ投与前0min、投与5min、15minで採血して血小板凝集凝固因子分析装置で血液凝固機能（PT、TT、APTT）を測定した。血液サンプルを3510rpmで8min遠心分離して乏血小板血漿(platelet poor plasma、PPP)を得た。キット操作方法に従って試薬の再構成・保管を行い、各々血液サンプルを試験カップに置き、さらに、PT、TT、APTT試薬をそれぞれ加え、すぐに測定を開始し、測定終了後、結果を記録した。
3.3 ACTの測定：投与前0min、投与5min、15minで全血採血し、カリオンを加え、37℃の水浴鍋に置き、全血凝固時間を記録した。
3.4血栓重量：実験終了後、血栓が形成された血管セグメントをカットし、その湿重量を秤量し、室温で一晩乾燥し、血栓の乾燥重量を測定し、血栓形成抑制率を計算した。
3.1血小板凝集率：大腿静脈から2.7ml採血し、0.3ml 3.8%クエン酸ナトリウムを含有する遠沈管に迅速に注入し、均一によく混合した。810rpm（100g）で8min遠心分離し、PRPを取り出し、3500rpm（1863g）で8min遠心分離し、PPPを取り出して血小板凝集をした。
それぞれ投与前（0min）、投与後5min、15minで採血して血小板凝集率を測定し、血小板凝集抑制率を計算した。計算式は以下の通りである。
3.3 ACTの測定：投与前0min、投与5min、15minで全血採血し、カリオンを加え、37℃の水浴鍋に置き、全血凝固時間を記録した。
3.4血栓重量：実験終了後、血栓が形成された血管セグメントをカットし、その湿重量を秤量し、室温で一晩乾燥し、血栓の乾燥重量を測定し、血栓形成抑制率を計算した。
4 実験結果
4.1ポリペプチド2の単回静脈内投与によるFeCl3誘発ウサギ大腿動脈血栓形成に対する影響は、結果を図10及び表15に示す。異なる濃度のポリペプチド2の単回静脈内投与では、FeCl3誘発ウサギ大腿動脈血栓の乾燥重量を減し、FeCl3誘発ウサギ大腿動脈血栓形成を抑制できた。生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の低用量3.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）があり、ポリペプチド2の中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に極めて顕著な差（P<0.01）があり、ポリペプチド2の中用量群は抗動脈血栓效果がビバリルジン群より良かった。
4.1ポリペプチド2の単回静脈内投与によるFeCl3誘発ウサギ大腿動脈血栓形成に対する影響は、結果を図10及び表15に示す。異なる濃度のポリペプチド2の単回静脈内投与では、FeCl3誘発ウサギ大腿動脈血栓の乾燥重量を減し、FeCl3誘発ウサギ大腿動脈血栓形成を抑制できた。生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の低用量3.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）があり、ポリペプチド2の中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に極めて顕著な差（P<0.01）があり、ポリペプチド2の中用量群は抗動脈血栓效果がビバリルジン群より良かった。
4.2ポリペプチド2の単回静脈内投与によるウサギ大腿動静脈バイパス血栓形成に対する影響
図11及び表16の結果に示すように、異なる濃度のポリペプチド2の単回静脈内投与では、ウサギ大腿動静脈バイパス血栓の乾燥重量を減し、ウサギ大腿動静脈バイパス血栓形成を抑制できた。生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.01）があり、ポリペプチド2の中用量群は抗動静脈バイパス血栓效果は明らかにビバリルジン及びエノキサパリン群より良かった。
図11及び表16の結果に示すように、異なる濃度のポリペプチド2の単回静脈内投与では、ウサギ大腿動静脈バイパス血栓の乾燥重量を減し、ウサギ大腿動静脈バイパス血栓形成を抑制できた。生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.01）があり、ポリペプチド2の中用量群は抗動静脈バイパス血栓效果は明らかにビバリルジン及びエノキサパリン群より良かった。
4.3ポリペプチド2の単回静脈内投与によるウサギ血小板凝集機能に対する影響
図12及び表17の結果に示すように、ポリペプチド2の各用量群の単回静脈内投与はウサギ血小板凝集を抑制できた。休薬後、時間が経つにつれて、血小板凝集に対する抑制作用は徐々に弱まった。
ポリペプチド2の各用量群の5min単回静脈内投与では、様々な程度にウサギ血小板凝集を抑制できた。生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）があり、ポリペプチド2の中用量群は抗血小板作用が明らかにビバリルジン及びエノキサパリン群より良かった。15min投与する時に、ウサギ血小板凝集への抑制作用徐々に弱まった。生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の高用量12.0mg/kgは統計学的に顕著な差（P<0.05）があった。
図12及び表17の結果に示すように、ポリペプチド2の各用量群の単回静脈内投与はウサギ血小板凝集を抑制できた。休薬後、時間が経つにつれて、血小板凝集に対する抑制作用は徐々に弱まった。
ポリペプチド2の各用量群の5min単回静脈内投与では、様々な程度にウサギ血小板凝集を抑制できた。生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）があり、ポリペプチド2の中用量群は抗血小板作用が明らかにビバリルジン及びエノキサパリン群より良かった。15min投与する時に、ウサギ血小板凝集への抑制作用徐々に弱まった。生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の高用量12.0mg/kgは統計学的に顕著な差（P<0.05）があった。
4.4ポリペプチド2の単回静脈内投与によるウサギ血液凝固機能に対す影響
結果により、ポリペプチド2を投与した後、ウサギのAPTT、 PT、TT、及びACTを延長させることができることが示された。休薬後、時間が経つにつれて上記の凝血指標への延長作用は徐々に弱まった。
4.4.1ウサギのAPTTへの影響
図13、表18及び19の結果に示すように、ポリペプチド2の各用量群は様々な程度にウサギのAPTTを延長させることができ、時間が経つにつれて、15min投与で、APTT対する延長作用は徐々に弱まった。5min投与では、生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）があり；15min投与する時に、生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）がある。
結果により、ポリペプチド2を投与した後、ウサギのAPTT、 PT、TT、及びACTを延長させることができることが示された。休薬後、時間が経つにつれて上記の凝血指標への延長作用は徐々に弱まった。
4.4.1ウサギのAPTTへの影響
図13、表18及び19の結果に示すように、ポリペプチド2の各用量群は様々な程度にウサギのAPTTを延長させることができ、時間が経つにつれて、15min投与で、APTT対する延長作用は徐々に弱まった。5min投与では、生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）があり；15min投与する時に、生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）がある。
4.4.2ウサギのPTへの影響
結果は、図14、表20、及び表21に示すように、ポリペプチド2の各用量群は様々な程度にウサギのPTを延長させることができ、時間が経つにつれて、15minで、PTへの延長作用は徐々に弱まった。
5min投与する時に、生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）があり；15min投与する時に、生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）があった。
結果は、図14、表20、及び表21に示すように、ポリペプチド2の各用量群は様々な程度にウサギのPTを延長させることができ、時間が経つにつれて、15minで、PTへの延長作用は徐々に弱まった。
5min投与する時に、生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）があり；15min投与する時に、生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）があった。
4.4.3ウサギのTTへの影響
結果は、表22に示すように、ポリペプチド2の各用量群が5min、15min投与される場合には、ウサギのTTを延長させて検出限界180sを超えることができた。
結果は、表22に示すように、ポリペプチド2の各用量群が5min、15min投与される場合には、ウサギのTTを延長させて検出限界180sを超えることができた。
4.4.4 ポリペプチド2のウサギのACTに対する影響
結果は図15、表23、及び表24に示すように、ポリペプチド2の各用量群は様々な程度にウサギのACTを延長させることができ、時間が経つにつれて、15minでは、ACTへの延長作用が徐々に弱まった。
5min投与では、生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）がある。
15min投与では、生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の低用量3.0mg/kg、中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）がある。
結果は図15、表23、及び表24に示すように、ポリペプチド2の各用量群は様々な程度にウサギのACTを延長させることができ、時間が経つにつれて、15minでは、ACTへの延長作用が徐々に弱まった。
5min投与では、生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）がある。
15min投与では、生理食塩水群と比較して、ポリペプチド2の低用量3.0mg/kg、中用量6.0mg/kg、高用量12.0mg/kg群は統計学的に顕著な差（P<0.05）がある。
ポリペプチド2の単回静脈内投与では、FeCl3誘発ウサギ大腿動脈血栓形成を抑制でき、投与量依存的にウサギ大腿動静脈バイパスにおける血栓形成を抑制でき、ここで、中用量と高用量群の抗血栓效果はビバリルジン群より良かった。ポリペプチド2は、投与量依存性にウサギ血小板凝集を抑制でき、ウサギ血液凝固機能に影響を及ぼし、APTT、 PT、TT、及びACTを延長させることができた。
試験例8
本試験例はポリペプチド2の進行性虚血性脳卒中に対する保護作用を説明するためのものである。
1、実験動物：健康、成年SDラット60匹、雄性、体重250g~300g、西安交通大学医学院動物中心から購入、動物生産許可証号：SCXK（陝）2012-003。
2、供試薬品：ポリペプチド2、ペプチド含有量97.21%；対照薬：エノキサパリン注射液、Sanofi（北京）製薬有限公司生産、ロット番号：4SH69。
3、実験方法：
3.1溶液の調製：ポリペプチド2、使用前、2mg/mlの母液を調製した。
3.2群分け及び投与：15minモデリングした後、頸静脈カテーテル挿入投与により投与し、初回量及び維持投与量で合計60min投与し、投与群はポリペプチド2の投与量が0.25mg/kg+0.75mg/kg/hであり、モデル群は生理食塩水を与えた。
本試験例はポリペプチド2の進行性虚血性脳卒中に対する保護作用を説明するためのものである。
1、実験動物：健康、成年SDラット60匹、雄性、体重250g~300g、西安交通大学医学院動物中心から購入、動物生産許可証号：SCXK（陝）2012-003。
2、供試薬品：ポリペプチド2、ペプチド含有量97.21%；対照薬：エノキサパリン注射液、Sanofi（北京）製薬有限公司生産、ロット番号：4SH69。
3、実験方法：
3.1溶液の調製：ポリペプチド2、使用前、2mg/mlの母液を調製した。
3.2群分け及び投与：15minモデリングした後、頸静脈カテーテル挿入投与により投与し、初回量及び維持投与量で合計60min投与し、投与群はポリペプチド2の投与量が0.25mg/kg+0.75mg/kg/hであり、モデル群は生理食塩水を与えた。
3.3、実験操作：塞栓糸法（総頸動脈挿入法）：頸部の真ん中に切り口を切り出して皮膚を切開し、総頸動脈、外頸動脈、内頸動脈を分離し、近位端に総頸動脈を結紮し、遠位端に外頸動脈を結紮した。微小血管クリップで内頸動脈の遠位端を一時的に閉塞させ、総頸動脈、外頸動脈、内頸動脈の分岐部で予め結紮糸を残し、眼科剪刀で総頸動脈の内頸動脈寄りの箇所に切口を切り出し、MCAO塞栓糸にある程度の曲がりを持たせ、総頸動脈に沿って内頸動脈に挿入し、糸を挿入する時に塞栓糸を操作者に向けて曲げ、ゆっくり約18mm（自動脈が分岐する箇所から）前進させ、抵抗感がある時に塞栓糸の前進を停止し、分岐箇所で予め残った結紮糸を結紮して塞栓糸を固定し、15minモデリングした後、初回量及び維持投与量で合計60min静脈内投与し、投与終了後、頸部の傷を普通に縫合した。
4、検測指標
4.1神経行動学的スコア：術後4h、8h、24hで2つの群のラットについて神経行動学的スコアを行い、Longaらの5階段4点法を標準として、0点：神経行動学的欠損症なし、1点：尾を持ち上げる時、反対側の前肢は内側へ折れ曲がり、完全にまっすぐに伸びらなく; 2点：反対側へ回転し、3分：歩きながら反対側へ倒れ、4点：歩くことができなく、または昏迷になる。1〜4点は有効モデルである。
4.2 TTC染色による梗塞病変と梗塞体積の観察
術後24hでその動物を犠牲にし、脳を取り出し、TTC染色しグラフィックソフトウェアで梗塞体積を計算した。
4.3脳化指数、脳含水量：各群におけるラットについて手術モデリング後24hでラットを断頭して全脳をすばやく摘出し湿重量を秤量し、脳化指数を計算し、脳化指数=脳湿重量/体重*100%。
4.1神経行動学的スコア：術後4h、8h、24hで2つの群のラットについて神経行動学的スコアを行い、Longaらの5階段4点法を標準として、0点：神経行動学的欠損症なし、1点：尾を持ち上げる時、反対側の前肢は内側へ折れ曲がり、完全にまっすぐに伸びらなく; 2点：反対側へ回転し、3分：歩きながら反対側へ倒れ、4点：歩くことができなく、または昏迷になる。1〜4点は有効モデルである。
4.2 TTC染色による梗塞病変と梗塞体積の観察
術後24hでその動物を犠牲にし、脳を取り出し、TTC染色しグラフィックソフトウェアで梗塞体積を計算した。
4.3脳化指数、脳含水量：各群におけるラットについて手術モデリング後24hでラットを断頭して全脳をすばやく摘出し湿重量を秤量し、脳化指数を計算し、脳化指数=脳湿重量/体重*100%。
5、試験結果
表25及び表26の試験結果は、ポリペプチド2の投与量0.5+1.25と1.0+2.5（mg/kg+mg/kg/h））では、術後24時間で脳梗塞体積は（23.41±10.08）%から（11.12±6.56）%と（8.01±6.66）%にそれぞれ下がり、神経行動学的損傷も改善されることが示され、実験的脳梗塞に対する保護作用があることが示された。
表25及び表26の試験結果は、ポリペプチド2の投与量0.5+1.25と1.0+2.5（mg/kg+mg/kg/h））では、術後24時間で脳梗塞体積は（23.41±10.08）%から（11.12±6.56）%と（8.01±6.66）%にそれぞれ下がり、神経行動学的損傷も改善されることが示され、実験的脳梗塞に対する保護作用があることが示された。
試験例9
本試験例はポリペプチド2のトロンビン誘発マウス肺栓塞に対する保護作用を説明するためのものである。
1、 実験動物：昆明マウス、雄性、6〜8週齢、20〜25g、西安交通大学実験動物中心から提供、動物生産許可証号：SCXK(陝)2012-003。
2、実験試薬
2.1トロンビン sigma公司、ロット番号T4648、ウシ血清由来、規格1000U/瓶。
2.2エノキサパリン注射液 0.4ml:4000AxalU、Sanofi（北京）製薬有限公司、個包装承認番号：国薬准字J20090094。
2.3ポリペプチド2 吉爾生化（上海）有限公司に委託し、ロット番号P131029-ML360794、ペプチド含有量97.21%。
3、実験装置
BC-2800Vet型邁瑞全自動血球分析装置、深セン邁瑞生物医療電子股フン有限公司 。
本試験例はポリペプチド2のトロンビン誘発マウス肺栓塞に対する保護作用を説明するためのものである。
1、 実験動物：昆明マウス、雄性、6〜8週齢、20〜25g、西安交通大学実験動物中心から提供、動物生産許可証号：SCXK(陝)2012-003。
2、実験試薬
2.1トロンビン sigma公司、ロット番号T4648、ウシ血清由来、規格1000U/瓶。
2.2エノキサパリン注射液 0.4ml:4000AxalU、Sanofi（北京）製薬有限公司、個包装承認番号：国薬准字J20090094。
2.3ポリペプチド2 吉爾生化（上海）有限公司に委託し、ロット番号P131029-ML360794、ペプチド含有量97.21%。
3、実験装置
BC-2800Vet型邁瑞全自動血球分析装置、深セン邁瑞生物医療電子股フン有限公司 。
4、実験方法
マウスは、無作為に7群と分け、1群あたり10匹である。第一群は生理食塩水群であり、第二群はモデル対照群であり、第三群は陽性対照エノキサパリン0.5mg/kgであり、第四群は陽性対照群ビバリルジン8 mg/kgであり、第五群はポリペプチド2の低用量群2.5mg/kgであり、第六群はポリペプチド2の中用量群5.0mg/kgであり、第七群はポリペプチド2の高用量群10.0mg/kgである。生理食塩水群、モデル対照群は、生理食塩水を200ul尾静脈注射した以外は、他の各群は、それぞれ投与量で投与した。2分後生理食塩水群は、生理食塩水を100ul尾静脈注射し、他の各群はトロンビン1500u/kg（80-90%致死量）を100ul尾静脈注射した。投与後、マウスの反応、15min内の死亡の状況を観察した。15min内死んでいないマウスを処理した。
（1）死亡率の記録：15min内の急性肺塞栓症のマウスの死亡の状況、存活時間を記録し、死亡率を計算した。
（2）肺係数の測定：死亡後すぐに解剖して肺組織以外の気管支及び脂肪組織を切除し、蒸留水で肺組織を洗浄し、濾紙で肺表面の水分を乾かした後で肺質量を秤量した。肺を取り出して秤量し、肺係数を計算した。肺係数= 肺質量/体重× 100%；
（3）血小板数の測定：15min内死んでいないマウスについて、眼球から採血し、EDTAによる抗凝固後、血小板数を測定し、すぐに解剖して肺を取り出し秤量し、肺係数を測定した。
マウスは、無作為に7群と分け、1群あたり10匹である。第一群は生理食塩水群であり、第二群はモデル対照群であり、第三群は陽性対照エノキサパリン0.5mg/kgであり、第四群は陽性対照群ビバリルジン8 mg/kgであり、第五群はポリペプチド2の低用量群2.5mg/kgであり、第六群はポリペプチド2の中用量群5.0mg/kgであり、第七群はポリペプチド2の高用量群10.0mg/kgである。生理食塩水群、モデル対照群は、生理食塩水を200ul尾静脈注射した以外は、他の各群は、それぞれ投与量で投与した。2分後生理食塩水群は、生理食塩水を100ul尾静脈注射し、他の各群はトロンビン1500u/kg（80-90%致死量）を100ul尾静脈注射した。投与後、マウスの反応、15min内の死亡の状況を観察した。15min内死んでいないマウスを処理した。
（1）死亡率の記録：15min内の急性肺塞栓症のマウスの死亡の状況、存活時間を記録し、死亡率を計算した。
（2）肺係数の測定：死亡後すぐに解剖して肺組織以外の気管支及び脂肪組織を切除し、蒸留水で肺組織を洗浄し、濾紙で肺表面の水分を乾かした後で肺質量を秤量した。肺を取り出して秤量し、肺係数を計算した。肺係数= 肺質量/体重× 100%；
（3）血小板数の測定：15min内死んでいないマウスについて、眼球から採血し、EDTAによる抗凝固後、血小板数を測定し、すぐに解剖して肺を取り出し秤量し、肺係数を測定した。
5、実験結果：LPSモデル群は、マウスは12/13匹が死亡し、死亡率85%であり、生理食塩水群と比較して両方の死亡率の違いは顕著な意味がある（P<0.01）。エノキサパリン0.5mg/kg群、ビバリルジン8 mg/kg、及びポリペプチド2の高用量10.0 mg/kg群は1/10匹が死亡し、死亡率10%であり、それぞれモデル群と比較して、両方の死亡率の違いは顕著な意味がある（P<0.01）。ポリペプチド2の中用量5.0 mg/kg群は3/10匹が死亡し、死亡率30%であり、それぞれモデル群と比較して、両方の死亡率の違いは顕著な意味があり（P<0.01）、ポリペプチド2の2群はそれぞれエノキサパリン0.5mg/kg、ビバリルジン8 mg/kgと比較して、2群の死亡率の違いは顕著な意味がない（P>0.05）。
ポリペプチド2の低用量2.5mg/kg群は、6/10匹が死亡し、死亡率60%であり、モデル群と比較して、2群の死亡率の違いは顕著な意味がなく（P>0.05）、エノキサパリン250U/kg、ビバリルジン8 mg/kgと比較して、2群の死亡率の違いは顕著な意味があり（P<0.01）、ポリペプチド2の中用量5.0 mg/kg、ポリペプチド2の高用量10.0 mg/kgと比較して、2群の死亡率の違いは顕著な意味がある（P<0.05）。モデル群は、マウスの肺係数は顕著に増加し、生理食塩水群と比較して統計学的に顕著な差があり（P<0.01）、ビバリルジン8 mg/kg群は、マウスの肺係数が減少し、モデル群と比較して統計学的に顕著な差があり（P<0.05）、ポリペプチド2の高用量10.0 mg/kg群は、マウスの肺係数が減少し、モデル群と比較して統計学的に顕著な差がある（P<0.01）。結果は表27、図16に示し、ポリペプチド2はトロンビン誘発マウス肺栓塞に対する保護作用を有する。
ポリペプチド2の低用量2.5mg/kg群は、6/10匹が死亡し、死亡率60%であり、モデル群と比較して、2群の死亡率の違いは顕著な意味がなく（P>0.05）、エノキサパリン250U/kg、ビバリルジン8 mg/kgと比較して、2群の死亡率の違いは顕著な意味があり（P<0.01）、ポリペプチド2の中用量5.0 mg/kg、ポリペプチド2の高用量10.0 mg/kgと比較して、2群の死亡率の違いは顕著な意味がある（P<0.05）。モデル群は、マウスの肺係数は顕著に増加し、生理食塩水群と比較して統計学的に顕著な差があり（P<0.01）、ビバリルジン8 mg/kg群は、マウスの肺係数が減少し、モデル群と比較して統計学的に顕著な差があり（P<0.05）、ポリペプチド2の高用量10.0 mg/kg群は、マウスの肺係数が減少し、モデル群と比較して統計学的に顕著な差がある（P<0.01）。結果は表27、図16に示し、ポリペプチド2はトロンビン誘発マウス肺栓塞に対する保護作用を有する。
上記に一般的な説明及び具体的な実施方案によって本発明を詳しく述べたが、本発明に基づいて、若干の変更又は改良を行うことが可能であることは当業者にとって明らかである。従って、本発明の精神から逸脱することなく様々な変更又は改良も、本発明の範囲内に含まれる
本発明で提供された抗トロンビン・血小板GPIIb/IIIa受容体抵抗作用を有するマルチターゲット化合物は直接的・可逆的・特異的抗トロンビン機能を有し、さらにGPIIb/IIIa受容体を抑制する作用を有し、少ない投与量で抗凝固・抗血栓效果を発揮できる。同時に、出血のリスクを減らし、薬物併用による投与量適合性、出血、作用協調などの問題を避ける。
陝西麦科奥特科技有限公司
抗凝固・抗血小板活性のマルチターゲット化合物及びその製法並びに用途
人工配列
Xxaはホモアルギニンである。
抗凝固・抗血小板活性のマルチターゲット化合物及びその製法並びに用途
人工配列
Xxaはホモアルギニンである。
Claims (7)
- 式（1）で表される構造を有する、抗凝固・血小板GPIIb/IIIa受容体拮抗作用を有するマルチターゲット化合物であって、
A-L-B-L’-C 式（1）
（ここで、A及びBはトロンビンとの結合部位であり、Cは血小板GPIIb/IIIa受容体との結合部位であり、Lは第１の連結基であり、L’は第２の連結基である。）
Aの構造は式（5）で表され、
A1-A2-A3-A4 式（5）
（ここで、A1はD-Pheであり、A2はPro又はPipであり、A3はArg、Lys、Orn又はHarであり、A4はPro、D-Pro又はSerである。）
Bの構造は式（6）で表され、
B1-B2-B3-B4-B5 式（6）
（B1は任意の2つの酸性アミノ酸からなるジペプチドであり、
B2はVal、Leu、Ile、Nle又はPheであり、
B3はHyp、Ser、Pro又はN-メチルアミノ酸であり、
B4は任意の2つの酸性アミノ酸からなるジペプチドであり、
B5はTyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha及びProから選ばれる１種のアミノ酸であり、又は、B5はTyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha及びPro中の少なくとも１種のアミノ酸を含むジペプチドである。）
Cの構造は式（7）で表され、
Cys-Har-C1-Asp-Trp-Pro-C2 式（7）
（ここで、C1はGly又はSerであり、C2はCysまたはCysの-OHが-NH 2 で置換された構造であり、式（7）において、２つのメルカプトの間にジスルフィド結合が形成されている。）
L’の構造は式（2）で表され、
((Gly) n1 -(Ser) n2 ) n3 式（2）
（ここで、n1は1、2、3又は4であり、n2は0又は1であり、n3は、0、1、2又は3である。）
または、L’の構造は式（3）で表され、
(Glu-Ala- Ala- Ala-Lys) n1 式（3）
（ここで、n1は0、1、2又は3である。）
または、L’の構造は式（4）で表され、
(Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala)n1 式（4）
（ここで、n1は0、1、2又は3である。）
Lの構造は式（8）で表され、
L1-L2-L3-L4-Gly-Asp-L5 式（8）
（ここで、L1はGly、Ala、ValまたはGly-Glyであり、L2はGlyまたはCysであり、L3はGly、Gly- Gly、Gly-Gly-GlyまたはD-アミノ酸であり、L4はAsnまたはGlnであり、L5はPhe、Tyr、Pheのベンゼン環が置換された誘導体及びTyrのベンゼン環が置換された誘導体から選ばれる１種である。）
A-L-BはSEQ ID No.1〜SEQ ID No.3に表されるポリペプチド配列から選ばれる１種であり、
前記化合物は、式（9）で表される構造を有し、
X-A-L-B-L’-C-Y 式（9）
（ここで、Xは水素、１つ又は２つのC1-C6のアルキル基、１つ又は２つのC2-C10のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基又はtert-ブトキシカルボニル基から選ばれる1種であり、YはOH、C1-C6のアルコキシ基、アミノ基、１つ又は２つのC1-C4のアルキル基で置換されたアミノ基から選ばれる１種である。）
前記化合物は、SEQ ID No.4〜SEQ ID No.7に表されるポリペプチド構造のうちの1種のポリペプチド配列を含むことを特徴とする化合物。 - 前記化合物は、SEQ ID No.4〜SEQ ID No.7に表されるポリペプチド構造から選ばれる1種であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
- 請求項１〜２のいずれか１項に記載の化合物の塩。
- 前記塩は、前記化合物の酢酸塩又は前記化合物のトリフルオロ酢酸塩であることを特徴とする、請求項３に記載の化合物の塩。
- 請求項１〜２のいずれか１項に記載の化合物の製造方法であって、
（1）固相合成法によりポリペプチド配列に従ってカルボキシル末端から順に保護型アミノ酸または断片を導入することにより、側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド-ワング樹脂を得るステップと、
（2）酸分解剤で側鎖完全保護アミノ酸ポリペプチド-ワング樹脂を酸分解させて線状ポリペプチド粗生成物を得るステップと、
（3）線状ポリペプチド粗生成物を環化させてジスルフィド結合を形成した後、分取HPLCで精製し、ポリペプチド配列を得るステップと、
を含むことを特徴とする、製造方法。 - 活性成分として、請求項１〜２のいずれか１項に記載の化合物又は請求項３及び４のいずれか１項に記載の塩を含む医薬組成物であって、
剤形は、注射剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤又は乳剤であることが好ましいことを特徴とする、医薬組成物。 - 請求項１〜２のいずれか１項に記載の化合物又は請求項３〜４のいずれか１項に記載の塩の、末梢動脈内の血栓形成及び動静脈バイパス内の血栓形成、急性冠脈症候群、経皮的冠動脈インターベンション治療又はPCI冠動脈ステント留置治療における血栓形成、進行性虚血性脳卒中、急性肺塞栓症、器官・組織移植における血栓形成を予防・治療する薬物の調製における応用。
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