JP2023535604A - 遺伝子複製を有する細胞およびその使用 - Google Patents

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Abstract

改善された成長特徴を有する宿主細胞が提供される。また、かかる細胞を選択、使用、および作製する方法もまた提供される。【図１Ａ】TIFF2023535604000009.tif154163

Description

本発明は、１つまたは複数の遺伝子の複製を有する、バイオ医薬品の産生のための宿主細胞に関するものであり、かかる細胞を選択、使用、および作製することを含む。ある特定の実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
高分子バイオ医薬品（例えば組換えタンパク質）は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞などの培養された宿主細胞において典型的には産生される。バイオ医薬品の産生のための改善された宿主細胞の開発はここ数十年で大きく進歩してきたが、望ましい成長および生産性の特徴を有する特定の宿主細胞の生成および選択は、依然として、時間がかかりかつ困難なプロセスである。
したがって、強い成長特徴を有する宿主細胞が必要とされており、また、かかる細胞を生成および選択する方法が必要とされている。
１つまたは複数の遺伝子複製を有する哺乳動物宿主細胞が、本明細書で提供される。また、かかる細胞を選択、使用、および作製する方法も提供される。一部の態様では、本明細書で提供される遺伝子複製を有する細胞は、複製を有していないこと以外は同一の細胞と比較して、１つまたは複数の改善された成長特徴を有する。
一部の実施形態では、外因性核酸と、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の複製とを含む哺乳動物宿主細胞が、本明細書で提供される。任意選択により、宿主細胞は、遺伝子のうちの少なくとも２つの複製を含む。任意選択により、２つの遺伝子のうちの１つは、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３からなる群から選択され、２つの遺伝子のうちの１つは、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、およびＳｈ３ｒｆ２からなる群から選択される。任意選択により、宿主細胞は、１つまたは複数の遺伝子の複製を欠くこと以外は同一の宿主細胞と比較して改善された成長特徴を有している。
一部の実施形態では、外因性核酸と、少なくとも４つの遺伝子の複製とを含む哺乳動物宿主細胞であって、４つの遺伝子のうちの１つがＳｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３からなる群から選択され、４つの遺伝子のうちの１つがＦｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１からなる群から選択され、４つの遺伝子のうちの１つがＭｅ２およびＰｉａｓ２からなる群から選択され、４つの遺伝子のうちの１つがＳｈ３ｒｆ２である、哺乳動物宿主細胞が、本明細書で提供される。任意選択により、宿主細胞は、遺伝子の複製を欠くこと以外は同一の宿主細胞と比較して改善された成長特徴を有している。
一部の実施形態では、外因性核酸と、２番染色体の少なくとも一部分の複製とを含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞が、本明細書で提供される。任意選択により、２番染色体の複製部分は、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、およびＳｈ３ｒｆ２からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの遺伝子の複製を含む。任意選択により、２番染色体の複製部分は、遺伝子のうちの少なくとも４つの複製を含み、４つの遺伝子のうちの１つはＳｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３からなる群から選択され、４つの遺伝子のうちの１つはＦｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１からなる群から選択され、４つの遺伝子のうちの１つはＭｅ２およびＰｉａｓ２からなる群から選択され、４つの遺伝子のうちの１つはＳｈ３ｒｆ２である。任意選択により、宿主細胞は、２番染色体の部分の複製を欠くこと以外は同一の宿主細胞と比較して改善された成長特徴を有している。
一部の実施形態では、改善された成長特徴を有する哺乳動物宿主細胞を選択する方法であって、（ａ）外因性核酸を含む哺乳動物宿主細胞をＳｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、およびＳｈ３ｒｆ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の複製についてアッセイするステップ、ならびに（ｂ）少なくとも１つの遺伝子の複製を含む哺乳動物宿主細胞を選択するステップであって、少なくとも１つの遺伝子の複製を含む哺乳動物宿主細胞が、少なくとも１つの遺伝子の複製を欠くこと以外は同一の哺乳動物宿主細胞と比較して改善された成長特徴を有している、ステップを含む、方法が、本明細書で提供される。任意選択により、哺乳動物宿主細胞は、遺伝子のうちの少なくとも２つの複製についてアッセイされる。任意選択により、２つの遺伝子のうちの１つはＳｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３からなる群から選択され、２つの遺伝子のうちの１つはＦｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、およびＳｈ３ｒｆ２からなる群から選択される。
一部の実施形態では、改善された成長特徴を有する哺乳動物宿主細胞を選択するための方法であって、（ａ）外因性核酸を含む哺乳動物宿主細胞を少なくとも４つの遺伝子の複製についてアッセイするステップであって、（ｉ）４つの遺伝子のうちの１つがＳｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３からなる群から選択され、（ｉｉ）４つの遺伝子のうちの１つがＦｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１からなる群から選択され、（ｉｉｉ）４つの遺伝子のうちの１つがＭｅ２およびＰｉａｓ２からなる群から選択され、（ｉｖ）４つの遺伝子のうちの１つがＳｈ３ｒｆ２である、ステップ、ならびに（ｂ）少なくとも４つの遺伝子の複製を含む哺乳動物宿主細胞を選択するステップであって、少なくとも４つの遺伝子の複製を含む哺乳動物宿主細胞が、少なくとも４つの遺伝子の複製を欠くこと以外は同一の哺乳動物宿主細胞と比較して改善された成長特徴を有している、ステップを含む、方法が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、組換えタンパク質を産生するための方法であって、（ａ）本明細書で提供される組換え哺乳動物宿主細胞を提供するステップであって、宿主細胞の外因性核酸が組換えタンパク質をコードしている、ステップ、および（ｂ）組換え哺乳動物宿主細胞を、組換えタンパク質の発現に十分な条件下で培養するステップを含む、方法が、本明細書で提供される。任意選択により、この方法は、発現された組換えタンパク質を回収するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、組換えタンパク質を産生するための方法であって、（ａ）本明細書で提供される方法に従って選択された組換え哺乳動物宿主細胞を提供するステップであって、宿主細胞の外因性核酸が組換えタンパク質をコードしている、ステップ、および（ｂ）組換え哺乳動物宿主細胞を、組換えタンパク質の発現に十分な条件下で培養するステップを含む、方法が、本明細書で提供される。任意選択により、この方法は、発現された組換えタンパク質を回収するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、外因性核酸を含む、本明細書で提供される宿主細胞または方法では、外因性核酸がタンパク質をコードする。任意選択により、タンパク質は治療的タンパク質である。任意選択により、治療的タンパク質は抗体またはサイトカインである。
一部の実施形態では、改善された成長特徴を有する哺乳動物宿主細胞を調製する方法であって、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、およびＳｈ３ｒｆ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の配列を含む外因性核酸分子を哺乳動物宿主細胞中に導入するステップを含み、外因性核酸分子を含む宿主細胞が、外因性核酸分子を含んでいないこと以外は同一の哺乳動物宿主細胞と比較して改善された成長特徴を有している、方法が、本明細書で提供される。任意選択により、遺伝子のうちの少なくとも２つの配列を含む１つまたは複数の外因性核酸分子が宿主細胞中に導入される。任意選択により、２つの遺伝子のうちの１つはＳｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３からなる群から選択され、２つの遺伝子のうちの１つはＦｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、およびＳｈ３ｒｆ２からなる群から選択される。任意選択により、遺伝子のうちの少なくとも４つの配列が宿主細胞中に導入され、４つの遺伝子のうちの１つはＳｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３からなる群から選択され、４つの遺伝子のうちの１つはＦｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１からなる群から選択され、４つの遺伝子のうちの１つはＭｅ２およびＰｉａｓ２からなる群から選択され、４つの遺伝子のうちの１つはＳｈ３ｒｆ２である。
一部の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞または方法では、哺乳動物細胞は、マウス細胞、ラット細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト細胞である。任意選択により、ヒト細胞は、ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＨＴ１０８０細胞である。
一部の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞または方法では、宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
一部の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞または方法では、外因性核酸は、宿主細胞染色体において、染色体中に組み込まれている。任意選択により、宿主細胞染色体は、染色体中への外因性核酸の部位特異的組み込みのための組換え標的部位を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞または方法では、改善された成長特徴は、遺伝子または２番染色体の一部分の複製を欠くこと以外は同一の哺乳動物宿主細胞を含む第２の細胞培養物と比較して改善された成長特徴を有する細胞を含む第１の細胞培養物の、より優れた細胞数、より優れた生存細胞数、より優れた細胞密度、またはより優れた生存細胞密度であり、ここで、第１および第２の細胞培養物は、同じ条件下で同じ期間にわたって成長させられる。任意選択により、期間は、３、５、７、または１０日間である。任意選択により、より優れた細胞数、より優れた生存細胞数、より優れた細胞密度、またはより優れた生存細胞密度は、第１の細胞培養物でのそれぞれの値の、第２の細胞培養物での値と比較して少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、または２００％の増大である。任意選択により、細胞数、生存細胞数、細胞密度、または生存細胞密度は、自動セルアナライザーによって測定される。
一部の実施形態では、宿主細胞を遺伝子の複製についてアッセイするステップを含む、本明細書で提供される方法では、この方法は、遺伝子の配列を含むＤＮＡまたは遺伝子から転写されたｍＲＮＡの相対量を決定するステップを含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って、本明細書で提供される宿主細胞によって、本明細書で提供される方法に従って選択された宿主細胞によって、本明細書で提供される方法に従って調製された宿主細胞によって、または本明細書で提供される宿主細胞もしくは方法に従って調製された組換えタンパク質が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞、方法、または組換えタンパク質では、Ｓｐｉｒｅ１遺伝子が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、Ｎａｒｓ遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、Ｒｐｓ１４遺伝子が、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、Ｓｍｉｍ３遺伝子が、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、Ｆｅｍ１ｃ遺伝子が、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、Ｐｐｉｃ遺伝子が、配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、Ｌｍｎｂ１遺伝子が、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、Ｍｅ２遺伝子が、配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、Ｐｉａｓ２遺伝子が、配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、またはＳｈ３ｒｆ２遺伝子が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードする。
クローン細胞株Ｔ３－６ ２５ｇｅｎ、Ｔ３－６ １００ｇｅｎ、およびＴ３－９ ２５ｇｅｎにおける遺伝子Ｌｍｎｂ１、Ｓｅｈ１l、Ｓｈ３ｒｆ２、およびＳｐｉｒｅ１についての遺伝子コピー数分析を示す棒グラフである。Ｘ軸はそれぞれの遺伝子を列挙しており、Ｙ軸は平均遺伝子コピー数を列挙している。各遺伝子について３本の棒が示されている。左から右の順で、３本の棒はそれぞれ、Ｔ３－６ ２５ｇｅｎ、Ｔ３－６ １００ｇｅｎ、およびＴ３－９ ２５ｇｅｎ細胞株における２番染色体当たりのそれぞれの遺伝子についての平均遺伝子コピー数を示している。 クローン細胞株Ｔ３－６ ２５ｇｅｎ、Ｔ３－６ １００ｇｅｎ、およびＴ３－９ ２５ｇｅｎにおける遺伝子Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｌｍｎｂ１、Ｒｎｍｔ、Ｓｅｈ１l、およびＳｐｉｒｅ１によってコードされるｍＲＮＡについてのｍＲＮＡ存在量の分析を示す棒グラフである。Ｘ軸はそれぞれの遺伝子を列挙しており、Ｙ軸は、ｍＲＮＡレベルの相対的倍率変化（ＦＣ）（Ｔ３－６ ２５ｇｅｎ細胞におけるｍＲＮＡレベルと比較した）を列挙している。各遺伝子について３本の棒が示されている。左から右の順で、３本の棒は、Ｔ３－６ ２５ｇｅｎ、Ｔ３－６ １００ｇｅｎ、およびＴ３－９ ２５ｇｅｎ細胞株における２番染色体当たりのそれぞれの遺伝子によってコードされているｍＲＮＡについての相対的ｍＲＮＡ存在量を示している。（Ｔ３－６ ２５ｇｅｎの値を「１」とし、Ｔ３－６ １００ｇｅｎおよびＴ３－９ ２５ｇｅｎの値はＴ３－６ ２５ｇｅｎの値と比較されている。）
１つまたは複数の遺伝子複製を有する哺乳動物宿主細胞、ならびに関連する方法および組成物、例えば、かかる細胞を選択、使用、および作製する方法、ならびにかかる細胞を調製するための組成物が本明細書で開示される。
本明細書で提供される発明は、遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lのうちの１つまたは複数の複製を有する宿主細胞が、これらの遺伝子のうちの１つまたは複数の複製を有さない対応する宿主細胞と比較して改善された成長特徴を有するということの発見に関する。
一般的技術
本発明の実施は、特記しない限り、当業者の技術範囲内の、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用する。かかる技術は、文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３～１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）中で、ならびに該当する場合には、上記参考文献の後続の版および対応するウェブサイト中で、十分に説明されている。
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、および他の科学用語または専門用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有するものである。一部の場合では、一般に理解されている意味を有する用語は、明確にするためおよび／またはすぐに参照できるようにするために本明細書において定義されており、本明細書にかかる定義を含めることは、当該技術において一般に理解されているものと大きく異なることを表すと必ずしも解釈されない。
以下の用語は、特記しない限り、以下の意味を有すると理解される。
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどへの特異的結合が可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、特記しない限り、特異的結合についてインタクトな抗体と競合するその任意の抗原結合部分、抗原結合部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された構成もまた包含する。抗原結合部分には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ、例えば、サメおよびラクダ科抗体）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む断片、単鎖可変断片抗体（ｓｃＦｖ）、マキシボディ（maxibody）、ミニボディ（minibody）、イントラボディ（intrabody）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、ｖ－ＮＡＲおよびｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ならびにそのポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むポリペプチドが含まれる。抗体には、任意のクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはそのサブクラス）の抗体、および任意の特定のクラスである必要がない抗体が含まれる。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスに割当てることができる。５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２へとさらに分割され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成は、周知である。
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸の鎖を指すために、本明細書で相互交換可能に使用される。この鎖は、直鎖でも分岐鎖でもよく、改変されたアミノ酸を含み得、および／または非アミノ酸によって中断され得る。これらの用語は、天然にまたは介入によって改変されたアミノ酸鎖、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは改変、例えば、標識化構成成分とのコンジュゲーションもまた包含する。例えば、アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）ならびに当該分野で公知の他の改変を含むポリペプチドもまた、この定義内に含まれる。ポリペプチドは、単一の鎖として、または会合した鎖として存在し得ることが理解される。
当該分野で公知のように、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で相互交換可能に使用される場合、任意の長さおよびコンフォメーション（例えば、直鎖または環状）のヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって鎖中に取り込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびそれらのアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、鎖のアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識化構成成分とのコンジュゲーションによって、重合後にさらに改変され得る。他の型の改変には、例えば、「キャップ」、アナログによる、１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間改変、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート（phosphoamidate）、カルバメートなど）および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）によるものなど、ペンダント部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジンなど）などを含むもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）によるもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属（oxidative metal）など）を含むもの、アルキル化薬を含むもの、改変された連結によるもの（例えば、アルファアノマー核酸など）、ならびに未改変の形態のポリヌクレオチドが含まれる。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置き換えられ得、標準的な保護基によって保護され得、もしくはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を準備するために活性化され得、または固体支持体にコンジュゲートされ得る。５’および３’末端のＯＨは、リン酸化され得、または１～２０炭素原子のアミンもしくは有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基へと誘導体化され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、２’－Ｏ－メチル－、２’－Ｏ－アリル、２’－フルオロ－または２’－アジド－リボース、炭素環式糖アナログ、アルファ－またはベータ－アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよび無塩基ヌクレオシド（abasic nucleoside）アナログ、例えば、メチルリボシドを含む、当該分野で一般に公知の類似の形態のリボースまたはデオキシリボース糖もまた含み得る。１つまたは複数のホスホジエステル連結は、代替的連結基によって置き換えられ得る。これらの代替的連結基には、ホスフェートが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート（amidate）」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール（formacetal）」）によって置き換えられた実施形態が含まれるがこれらに限定されず、式中、各ＲまたはＲ’は独立して、Ｈ、またはエーテル（－Ｏ－）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジル（araldyl）を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル（１～２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドに当てはまる。
本明細書で使用する場合、「ベクター」は、１つまたは複数の目的の遺伝子または配列を送達し、好ましくは、宿主細胞においてそれを発現させることが可能な構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と関連したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、ならびに特定の真核生物細胞、例えば産生細胞が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で使用する場合、「組換え」核酸は、天然に存在しないおよび／または合成により製造されたポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。例えば、「組換え」核酸は、ベクター配列にカップリングされたタンパク質コード遺伝子を含み得る。タンパク質コード遺伝子の配列は、天然に存在してもよいが、この遺伝子は、ベクター配列と組み合わせては天然に存在しない。言い換えると、「組換え」核酸分子は、分子の一部として、天然に存在する核酸配列を含み得るが、その配列は、（核酸分子配列の全体が天然に存在しないように）別の配列にカップリングされる、および／またはこの分子は、合成により製造される。「組換え」ポリペプチドは、組換え核酸から産生されたポリペプチドを指す。
本明細書で使用する場合、「外因性」核酸は、その導入の前にはその宿主細胞中に存在しなかった、宿主細胞中に（例えば、従来の遺伝子操作法によって、好ましくは、形質転換、エレクトロポレーション、リポフェクションまたはトランスフェクションによって）導入されるまたは導入された組換え核酸分子を指す。一部の状況では、外因性核酸は、宿主細胞中で天然に存在しないヌクレオチド配列を含む。かかる配列は「トランスジェニック」とも呼ばれる。一部の状況では、外因性核酸は、細胞にとって内因性である配列と同じヌクレオチド配列を含み得る（例えば、外因性核酸分子は、宿主細胞にとって内因性である遺伝子のヌクレオチド配列を含み得、その結果、宿主細胞中への外因性核酸分子の導入は、宿主細胞中への遺伝子のさらなるコピーを導入する）。「外因性核酸」は、外因性核酸分子またはそのヌクレオチド配列を指す。
本発明の態様または実施形態が、マーカッシュ群または選択肢の他のグループ分けの観点から記載される場合、本発明は、全体として列挙された群全体だけでなく、その群の各メンバーを個々に、および主群の全ての可能な下位群、群メンバーのうち１つまたは複数が存在しない主群もまた包含する。本発明は、特許請求された発明中の任意の群メンバーのうち１つまたは複数の明示的な排除も想定する。
本明細書および特許請求の範囲を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または変化形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた整数または整数の群を含むが、任意の他の整数または整数の群を排除しないことを意味すると理解される。文脈が他を要求しない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。用語「例えば（ｅ．ｇ．）」または「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」の後に記載される任意の例は、網羅的または限定的ではないことを意味する。用語「または」は、複数の選択肢のリストに関して使用される場合（例えば、「Ａ、ＢまたはＣ」）、文脈が明らかに他を示さない限り、それらの選択肢のうち任意の１つまたは複数を含むと解釈するものとする。実施形態が「含む」という言葉を用いて本明細書に記載される場合には、「～からなる」および／または「～から本質的になる」の用語で記載される他の点では類似の実施形態もまた提供されることが理解される。
例示的な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用され得る。材料、方法および実施例は、例示に過ぎず、限定を意図しない。
１つまたは複数の遺伝子の複製を有する細胞
一態様では、１つまたは複数の遺伝子複製を有する哺乳動物宿主細胞が本明細書で提供される。遺伝子としては、例えば、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lが含まれる。また、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の２番染色体の１つまたは複数の部分の複製を有するＣＨＯ細胞も本明細書で提供される。
本明細書で使用する場合、遺伝子の「複製」は、細胞中に通常生じているもの（すなわち、野生型の遺伝子コピー数を有する細胞中に存在しているもの）と比較して１つまたは複数の追加の遺伝子コピーが細胞中に存在している状況を指す。例えば、野生型細胞中の５番染色体当たりに遺伝子ＸＹＺのコピーが通常１つ存在する場合、細胞中の５番染色体当たり２つ、３つ、４つ、またはそれを超える遺伝子コピーが存在していれば、遺伝子ＸＹＺは細胞中で「複製」されている。一部の状況では、複製した遺伝子は、野生型の遺伝子コピー数を有する対応する細胞の培養物中の細胞当たりに存在する量よりも少なくとも１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、または５倍多くの、目的の複製を有する細胞株の培養物中の細胞当たりの平均量で存在する。同様に、染色体の一部分の複製は、細胞中で通常生じるものと比較して、染色体の一部分の１つまたは複数の追加のコピーが細胞中に存在している状況を指す。本明細書の他の箇所にさらに記載されるように、複製された目的の遺伝子または染色体の部分を有する細胞は、例えば細胞中への複製対象の遺伝子を含む外因性核酸の導入を含む、様々な方法によって、または複製された遺伝子を含む改変された組換え宿主細胞の選択によって、生成することができる。
本明細書で提供される実施形態には、Ｓｐｉｒｅ１遺伝子が含まれ得る。Ｓｐｉｒｅ１遺伝子は、タンパク質Ｓｐｉｒｅホモログ１をコードする。Ｓｐｉｒｅ１は、アクチン核形成因子である。例示的なＳｐｉｒｅ１遺伝子およびポリペプチドの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ５２ＫＦ３（マウス）、Ｑ０８ＡＥ８（ヒト）、およびＤ３ＺＥＸ７（ラット）を介して提供されている。例示的なチャイニーズハムスター（モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ））Ｓｐｉｒｅ１のｍＲＮＡ配列はＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿０２７４０２６９５．１で提供されており、ポリペプチド配列は表１の配列番号１に示されている。
本明細書で提供される実施形態は、Ｎａｒｓ遺伝子を含み得る。Ｎａｒｓ遺伝子は、細胞質性のタンパク質アスパラギン－ｔＲＮＡリガーゼをコードする（Ｎａｒｓ１またはＮＲＳとしても公知である）。Ｎａｒｓは、ｔＲＮＡへのアスパラギンの結合を触媒する（Ａｓｎ）。例示的なＮａｒｓ遺伝子およびポリペプチドの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＢＰ４７（マウス）、Ｏ４３７７６（ヒト）、およびＦ１ＬＰＶ０（ラット）を介して提供されている。例示的なチャイニーズハムスター（モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ））ＮａｒｓのｍＲＮＡ配列はＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿０１６９７４１７５．１で提供されており、ポリペプチド配列は表１の配列番号２に示されている。
本明細書で提供される実施形態は、Ｒｐｓ１４遺伝子を含み得る。Ｒｐｓ１４遺伝子は、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１４をコードする。例示的なＲｐｓ１４遺伝子およびポリペプチドの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ６２２６４（マウス）、Ｐ６２２６３（ヒト）、およびＰ１３４７１（ラット）を介して提供されている。例示的なチャイニーズハムスター（モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ））Ｒｐｓ１４のｍＲＮＡ配列はＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１２４４５１９．１で提供されており、ポリペプチド配列は表１の配列番号３に示されている。
本明細書で提供される実施形態は、Ｓｍｉｍ３遺伝子を含み得る。Ｓｍｉｍ３遺伝子は、低分子内在性膜タンパク質３をコードする。例示的なＳｍｉｍ３遺伝子およびポリペプチドの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９ＰＥ５（マウス）、Ｑ９ＢＺＬ３（ヒト）、およびＱ９９ＰＥ６（ラット）を介して提供されている。例示的なチャイニーズハムスター（モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ））Ｓｍｉｍ３のｍＲＮＡ配列はＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿０２７４３９２４６．１で提供されており、ポリペプチド配列は表１の配列番号４に示されている。
本明細書で提供される実施形態は、Ｆｅｍ１ｃ遺伝子を含み得る。Ｆｅｍ１ｃ遺伝子は、タンパク質ｆｅｍ－１ホモログＣをコードする。Ｆｅｍ１ｃは、Ｅ３ユビキチン－タンパク質リガーゼ複合体の推定構成成分である。例示的なＦｅｍ１ｃ遺伝子およびポリペプチドの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＣＥＦ１（マウス）、Ｑ９６ＪＰ０（ヒト）、およびＤ３ＺＺＲ４（ラット）を介して提供されている。例示的なチャイニーズハムスター（モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ））Ｆｅｍ１ｃのｍＲＮＡ配列はＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００３５０６７８０．４で提供されており、ポリペプチド配列は表１の配列番号５に示されている。
本明細書で提供される実施形態は、Ｐｐｉｃ遺伝子を含み得る。Ｐｐｉｃ遺伝子は、タンパク質ペプチジル－プロピルシス－トランスイソメラーゼＣをコードする。Ｐｐｉｃは、ペプチド中のプロリンイミドペプチド結合のシス－トランス異性化を触媒する。例示的なＰｐｉｃ遺伝子およびポリペプチドの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ３０４１２（マウス）、Ｐ４５８７７（ヒト）、およびＱ６ＡＹＱ９（ラット）を介して提供されている。例示的なチャイニーズハムスター（モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ））ＰｐｉｃのｍＲＮＡ配列はＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００７６４４６６１．２で提供されており、ポリペプチド配列は表１の配列番号６に示されている。
本明細書で提供される実施形態は、Ｌｍｎｂ１遺伝子を含み得る。Ｌｍｎｂ１遺伝子は、タンパク質ｌａｍｉｎ－Ｂ１をコードする。Ｌａｍｉｎ－Ｂ１は核ラミナの一部分である。例示的なＬｍｎｂ１遺伝子およびポリペプチドの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１４７３３（マウス）、Ｐ２０７００（ヒト）、およびＰ７０６１５（ラット）を介して提供されている。例示的なチャイニーズハムスター（モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ））Ｌｍｎｂ１のｍＲＮＡ配列はＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００７６２３８６２．２で提供されており、ポリペプチド配列は表１の配列番号７に示されている。
本明細書で提供される実施形態は、Ｍｅ２遺伝子を含み得る。Ｍｅ２遺伝子は、ミトコンドリアのタンパク質ＮＡＤ依存性リンゴ酸酵素（リンゴ酸酵素２としても公知である）をコードする。例示的なＭｅ２遺伝子およびポリペプチドの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９ＫＥ１（マウス）およびＰ２３３６８（ヒト）を介して提供されている。例示的なチャイニーズハムスター（モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ））Ｍｅ２のｍＲＮＡ配列はＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００３５０６７９９．２で提供されており、ポリペプチド配列は表１の配列番号８に示されている。
本明細書で提供される実施形態は、Ｐｉａｓ２遺伝子を含み得る。Ｐｉａｓ２遺伝子は、タンパク質Ｅ３ ＳＵＭＯタンパク質リガーゼＰＩＡＳ２（活性型ＳＴＡＴ２のタンパク質阻害剤としても公知である）をコードする。例示的なＰｉａｓ２遺伝子およびポリペプチドの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８Ｃ５Ｄ８（マウス）、Ｏ７５９２８（ヒト）、およびＱ６ＡＺ２８（ラット）を介して提供されている。例示的なチャイニーズハムスター（モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ））Ｐｉａｓ２のｍＲＮＡ配列はＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿０２７３９７９３３．１で提供されており、ポリペプチド配列は表１の配列番号９に示されている。
本明細書で提供される実施形態は、Ｓｈ３ｒｆ２遺伝子を含み得る。Ｓｈ３ｒｆ２遺伝子は、タンパク質Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＳＨ３ＲＦ２（ｒｉｎｇフィンガー２を含むＳＨ３ドメインとしても公知である）をコードする。例示的なＳｈ３ｒｆ２遺伝子およびポリペプチド配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＢＺＴ２（マウス）、Ｑ８ＴＥＣ５（ヒト）およびＱ４９８Ｍ５（ラット）を介して提供されている。例示的なチャイニーズハムスター（モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ））Ｓｈ３ｒｆ２のｍＲＮＡ配列はＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００３５０３２７７．４で提供されており、ポリペプチド配列は表１の配列番号１０に示されている。
Figure 2023535604000002
Figure 2023535604000003
Figure 2023535604000004
一部の実施形態では、ＣＨＯの２番染色体の一部分の複製を有する宿主ＣＨＯ細胞が本明細書で提供される。改善された成長特徴を有する本明細書で提供される宿主細胞において複製され得るＣＨＯの２番染色体の特定の部分は、実施例２および３で記載されている。実施例３で議論されているように、遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、およびＳｍｉｍ３はＣＨＯの２番染色体のスキャホールド領域ＮＷ＿０２０８２２４６６．１にあり、遺伝子Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、およびＬｍｎｂ１はＣＨＯの２番染色体のスキャホールド領域ＮＷ＿０２０８２２４５９．１にあり、遺伝子Ｍｅ２およびＰｉａｓ２はＣＨＯの２番染色体のスキャホールド領域ＮＷ＿０２０８２２４４０．１にあり、遺伝子Ｓｈ３ｒｆ２はＣＨＯの２番染色体のスキャホールド領域ＮＷ＿０２０８２２４４２．１にある。
改善された成長特徴を有する細胞
一態様では、１つまたは複数の改善された成長特徴を有する哺乳動物宿主細胞が本明細書で提供される。例えば、遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lのうちの１つまたは複数の複製を有する細胞は、これらの遺伝子のうちの１つまたは複数の複製を有さない宿主細胞と比較して１つまたは複数の改善された成長特徴を有する。また、ＣＨＯの２番染色体の一部分の複製を有さない宿主細胞と比較して１つまたは複数の改善された成長特徴を有する、ＣＨＯの２番染色体の部分の複製を有するＣＨＯ細胞も、本明細書で提供される。
本明細書で使用する場合、「成長特徴」は、細胞の成長と互いに関係する、細胞または細胞培養物の特徴を指す。細胞の成長は、例えば、Ａ）細胞数（「細胞の数」としても公知である）、Ｂ）細胞の生存度、Ｃ）細胞の代謝、Ｄ）細胞のサイズ、またはこれらの組合せを測定することによって評価することができる。多くの場合、細胞の成長を評価するときに、細胞培養物の複数の態様が同時に調べられる。例えば、培養された細胞は、細胞培養物における細胞数および細胞の生存度の両方を考慮に入れる「生存細胞密度」について一般に評価される。さらに、細胞の成長は、上記のパラメータのいずれかを一定期間にわたり測定することによって評価することができる。例えば、細胞の成長は、培養物中の細胞数が倍増するためにかかる時間（すなわち「倍加時間」）を測定することによって評価することができる。
細胞は、手動で（例えば血球計を用いて）または自動機器を介して計数することができる。自動セルカウンター機器としては、例えば、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓシステム（Ｒｏｃｈｅ）、ＬＵＮＡ（商標）（Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、Ｎｏｖａ ＦＬＥＸアナライザー（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）、ＣＥＬＬＯＭＥＴＥＲ（商標）自動Ｔ４Ｃｅｌｌ生存度カウンター（Ｐｅｑｌａｂ）、ＴＣ１０（商標）およびＴＣ２０（商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、ＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）自動セルカウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにＶＩ－ＣＥＬＬ（登録商標）細胞生存度アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）が含まれる。細胞はまた、組み込み型のセルカウンターを含む自動バイオリアクターシステム［例えばＡＭＢＲ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）］でも計数することができる。集合的に、自動のセルカウンターシステムおよびバイオリアクターシステムは、本明細書で「セルアナライザー」と呼ばれる。
生存細胞は、当該分野で公知の様々な方法によって同定することができる。例えば、生存細胞は、生細胞または死細胞のいずれかを選択的に結合する色素に細胞を曝露することによって同定することができる。死細胞を染色するが生細胞は染色しない色素としては、トリパンブルー、エオシン、およびプロピジウムが含まれる。生細胞の膜はこれらの色素を排除するが、死細胞の膜は当該色素を排除しない。細胞の生存度を評価するために使用され得るさらなる色素としては、例えば、ＤＮＡに結合する色素（例えばエチジウムモノアジド）またはホスファチジルセリンに結合する色素（例えばアネキシンＶ）が含まれる。
細胞の生存度はまた、生細胞が基質を容易に検出され得る産物（着色産物または蛍光産物など）に変換するアッセイを介して調べることができる。これらのアッセイでは、生成する検出可能な産物の量は、アッセイされる細胞の生存度に比例する。代表的なアッセイとしては、例えば、テトラゾリウム還元アッセイ［例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）非放射性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；細胞成長決定キット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＭＴＴ細胞成長アッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ毒性アッセイキット、ＸＴＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＷＳＴ－８ベースの細胞数キット－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）］、レサズリン還元アッセイ［例えば、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＢＬＵＥ（登録商標）細胞生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ毒性アッセイキット、レサズリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）］、プロテアーゼ基質アッセイ［例えば、基質グリシルフェニルアラニル－アミノフルオロクマリンを使用するもの（ＧＦ－ＡＦＣ）；ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＦＬＵＯＲ（商標）細胞生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）］、ＡＴＰ／ルシフェラーゼアッセイ［例えば、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）発光細胞生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ＡＴＰＬＩＴＥ（商標）１ステップ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）；ＡＴＰ生物発光細胞アッセイキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）］が含まれる。
細胞の代謝は、例えば、細胞におけるＤＮＡ合成（例えば、ＢｒｄＵアッセイもしくはＥｄＵアッセイ）、または細胞増殖に関連する核タンパク質（例えば抗Ｋｉ６７抗体）を調べることができる。
細胞培養物の複数の態様を同時に調べることができる。例えば、一部の実施形態では、セルアナライザーは、細胞数および細胞の生存度を含む複数のパラメータを決定することができる（すなわち、こうして生存細胞の数を決定する）。例えば、自動ＶＩ－ＣＥＬＬ（商標）細胞生存度アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）は、生存細胞の同定にトリパンブルー染色を使用し、例えば細胞数、細胞のサイズ、パーセント生存度、全細胞密度、および生存細胞密度の自動測定値を提供する。別の実施例では、ＡＭＢＲ（登録商標）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）バイオリアクターシステムは、複数の細胞培養物を培養するためのバイオリアクターと、細胞数、細胞の生存度、および代謝産物（ラクテート、グルコースなど）を含む細胞培養物の複数の特徴を評価するためのセンサーおよびセルアナライザーとを組み合わせることができる。別の実施例では、細胞生存度イメージングキット（Ｓｉｇｍａ）は、カルセイン－ＡＭ色素、ヨウ化プロピジウム色素、およびヘキスト３３３４２色素をそれぞれ使用して試料中の生存細胞、死細胞、および全細胞を同時に染色するための試薬を含む。
参照細胞または参照細胞培養物と比較して「改善された成長特徴」（など）を有する細胞または細胞培養物は、かかる細胞または細胞培養物がそれを上回って「改善された成長特徴」を有する参照細胞または参照細胞培養物よりも、上記特徴（すなわち、細胞数、細胞の生存度、細胞の代謝、細胞のサイズ、または関連する特徴）のうち少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つについて、大きい値（または適切な場合には、より小さい値であって、このより小さい値は、より速い成長を示す）を有する。一部の実施形態では、参照細胞または参照細胞培養物よりも「改善された成長特徴」を有する細胞または細胞培養物は、細胞が同じ条件下で同じ期間にわたって培養される場合、参照細胞または参照細胞培養物よりも少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１００％、２００％、３００％、または５００％大きい全細胞数または生存細胞数を有する。一部の実施形態では、参照細胞または参照細胞培養物よりも「改善された成長特徴」を有する細胞または細胞培養物は、細胞が同じ条件下で同じ期間にわたって培養される場合、参照細胞または参照細胞培養物よりも少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１００％、２００％、３００％、または５００％大きい全細胞密度または生存細胞密度を有する。一部の実施形態では、参照細胞または参照細胞培養物よりも「改善された成長特徴」を有する細胞または細胞培養物は、細胞が同じ条件下で同じ期間にわたって培養される場合、参照細胞または参照細胞培養物よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％短い倍加時間を有する（すなわち、改善された成長特徴を有する細胞または細胞培養物は参照細胞または参照細胞培養物よりも短い時間で倍加する）。一部の実施形態では、参照細胞または参照細胞培養物よりも「改善された成長特徴」を有する細胞または細胞培養物は、細胞が同じ条件下で同じ期間にわたって培養される場合、参照細胞または参照細胞培養物よりも少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１００％、２００％、３００％、または５００％大きいＢｒｄＵ、Ｅｄｕ、またはＫｉ６７シグナル量を有する。
核酸
一部の実施形態では、核酸が本明細書で提供される。核酸は、以下に記載する様々な構成成分および形式を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書で提供される細胞（例えば、遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lのうちの１つまたは複数の複製を有する宿主細胞）は、目的のヌクレオチド配列を含み得る。本明細書で使用する場合、「目的のヌクレオチド配列」は、宿主細胞中に導入したいまたはベクター中に存在している任意のヌクレオチド配列を指す。目的のヌクレオチド配列は、外因性核酸中に存在し得る。最も一般的には、目的のヌクレオチド配列は、目的のポリペプチドをコードする、または目的のＲＮＡ分子の生成のための鋳型である、ＤＮＡ配列である。しかし、あるいは、目的のヌクレオチド配列は、例えば、調節性もしくは構造的機能を提供する配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列）、またはクローニング目的のための制限酵素配列など、異なる目的を果たす配列（例えば、目的のヌクレオチド配列は、マルチクローニング部位であり得る）であり得る。目的のヌクレオチド配列は、任意のヌクレオチド長のものであり得る。目的のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列であり得る。一部の実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、宿主細胞中に内因性に存在しない配列である。一部の実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、宿主細胞中に内因性に別々に存在する（即ち、この配列はまた、宿主細胞中に導入された目的のヌクレオチド配列を含む組換え核酸構築物とは別に、宿主細胞中に存在する）。かかる実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、例えば、対応する内因性ヌクレオチド配列の比較的低い発現が存在する場合、および細胞におけるヌクレオチド配列の増加した発現を有することが望ましい場合、宿主細胞中に導入され得る。
一部の実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、組換えタンパク質（本明細書では「組換えポリペプチド」または「目的のポリペプチド」とも呼ばれる）をコードする。目的のポリペプチドには、例えば、抗体、酵素、ペプチドホルモン、融合タンパク質または検出可能なタンパク質（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質）が含まれる。一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、ポリペプチドの構造的または機能的に規定された部分、例えば、抗体の断片、例えば、抗体の重鎖、軽鎖もしくは定常領域、または酵素の触媒ドメインであり得る。当業者に理解されるように、ポリペプチドは、上述の型のうち１つよりも多くのものであり得る（例えば、酵素は、検出可能なタンパク質でもあり得る、など）。
一部の実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、目的のＲＮＡ分子のためのＤＮＡ鋳型である。目的のＲＮＡ分子には、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９システム関連ＲＮＡ、またはＲＮＡｉ（干渉ＲＮＡ）関連分子、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡが含まれる。
一部の態様では、核酸構築物が、本明細書で提供される。本明細書で提供される「核酸構築物」は、上記ポリヌクレオチドまたは核酸の１つの型である。「核酸構築物」は、上記ポリヌクレオチドまたは核酸の特徴のいずれかを有し得る。典型的には、本明細書で提供される「核酸構築物」は、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの鎖内に２つ以上の機能的単位を含む。ヌクレオチド配列中の機能的単位は、特定の機能を有する任意の型の別個のヌクレオチド配列、例えば、目的のヌクレオチド配列、ポリペプチドをコードする遺伝子、調節性配列、組換え配列、または阻害性ＲＮＡ分子のための鋳型などであり得る。
「組換え標的配列」または「組換え標的部位」は、標的化された組換えのために必要であり、リコンビナーゼと一緒になって標的化された組換えを可能にし、かかる組換えの位置を規定する、ヌクレオチドのストレッチである。本明細書で使用する場合、「組換え標的配列」は、典型的には、宿主細胞中に導入される外因性核酸構築物上の組換え配列を指すために使用され、「組換え標的部位」は、典型的には、宿主細胞染色体中の対応する組換え配列を指すために使用される。組換え標的部位は、宿主細胞ゲノムにとって非ネイティブであり得る（例えば、組換え標的部位は、ランディングパッド配列の一部として、宿主細胞染色体中に導入され得る）。
一部の実施形態では、核酸構築物の一部または全てが、宿主細胞染色体中の対応する部位中に組み込まれ得るように、１つまたは複数の組換え標的配列が、本明細書で提供される核酸構築物中に含まれ得る。
チロシンリコンビナーゼベースの系およびセチンリコンビナーゼベースの系の両方を含む、任意の適切な組換え標的部位、標的配列およびリコンビナーゼの組合せが、本明細書で提供される組成物および方法と共に使用され得る。本明細書で提供される核酸構築物および宿主細胞共に使用され得るリコンビナーゼ（およびそれらの対応する組換え標的配列）には、例えば、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、Ｆｌｐ、ＫＤ、Ｂ２、Ｂ３、λ、ＨＫ０２２、ＨＰ１、γδ、ＰａｒＡ、Ｔｎ３、Ｇｉｎ、Ｂｘｂ１、φＣ３１、φＢＴ１およびＲ４が含まれる。部位特異的リコンビナーゼは、例えば、ＴｕｒａｎおよびＢｏｄｅ、Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ、２５（１２）：４０８８～１０７（２０１１）；Ｎｅｒｎら、ＰＮＡＳ、１０８（３４）：１４１９８～２０３（２０１１）；ならびにＸｕら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３（８７）（２０１３）中に記載されている。
一部の実施形態では、核酸構築物中の目的のヌクレオチド配列（例えば、目的のポリペプチドをコードする遺伝子）は、核酸構築物中の１つまたは複数の調節性遺伝子制御エレメントに連結され得る。ある特定の実施形態では、遺伝子制御エレメントは、目的のヌクレオチド配列の構成的発現を指示する。ある特定の実施形態では、目的のヌクレオチド配列の誘導性発現を提供する遺伝子制御エレメントが使用され得る。誘導性遺伝子制御エレメント（例えば、誘導性プロモーター）の使用は、例えば、遺伝子によってコードされるポリペプチドの産生のモジュレーションを可能にする。真核生物細胞における使用のための潜在的に有用な誘導性遺伝子制御エレメントの非限定的な例には、ホルモン調節型エレメント（例えば、Ｍａｄｅｒ，Ｓ．およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５６０３～５６０７、１９９３を参照されたい）、合成リガンド調節型エレメント（例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１０１９～１０２４、１９９３を参照されたい）および電離放射線調節型エレメント（例えば、Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１０６０７～１０６１３、１９９３；Ｄａｔｔａ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０１４９～１０１５３、１９９２を参照されたい）が含まれる。当該分野で公知のさらなる細胞特異的または他の調節系は、本明細書で提供される方法および組成物に従って使用され得る。
一部の態様では、核酸構築物を含むベクターが、本明細書で提供される。核酸構築物は、本発明の他の箇所に記載される特徴のいずれかを有し得る。
一部の実施形態では、ベクターは、プロモーター配列、方向性クローニング部位、非方向性クローニング部位、制限部位、エピトープタグ、ポリアデニル化配列および抗生物質耐性遺伝子のうち１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、プロモーター配列はヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターであり、方向性クローニング部位はＴＯＰＯであり、エピトープタグは、抗Ｖ５抗体を使用した検出のためのＶ５であり、ポリアデニル化配列は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ由来であり、抗生物質耐性遺伝子は、ブラストサイジン、ピューロマイシンまたはジェネテシン（Ｇ４１８）である。
本明細書で提供される一部の実施形態では、組換え核酸配列、例えば、プロモーター配列、方向性クローニング部位、エピトープタグをコードする配列、ポリアデニル化配列、抗生物質耐性遺伝子、およびタンパク質コード遺伝子は、核酸構築物およびベクターの両方の一部であり得る。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、発現ベクターである。発現ベクターは一般に、組換え核酸構築物を含む複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの一体的な部分として、宿主細胞において複製可能でなければならないことが意味される。適切な発現ベクターには、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ出願公開番号ＷＯ８７／０４４６２に開示された発現ベクターが含まれるがこれらに限定されない。ベクター構成成分には、一般に、以下：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、適切な転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーおよびターミネーター）のうち１つまたは複数が含まれ得るがこれらに限定されない。発現（即ち、翻訳）のために、リボソーム結合部位、翻訳開始部位および停止コドンなどの、１つまたは複数の翻訳制御エレメントもまた、通常必要とされる。
本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）または二本鎖であり得、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。さらなるコードまたは非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいが存在する必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持体材料に連結されていてもよいが、連結されている必要はない。本明細書で提供される任意の核酸構築物またはベクター配列に対して相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明によって包含される。遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書で提供されるポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列が存在し得ることが、当業者によって理解される。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の相同性分析は、当該分野で公知の方法（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して実施され得る。２つの配列間の比較は、典型的には、配列類似性の局所的領域を同定および比較するために、比較ウインドウにわたってそれらの配列を比較することによって実施される。好ましくは、パーセント相同性または配列同一性は、少なくとも２０個の位置の比較のウインドウにわたって、２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定され、このとき、比較ウインドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して、２０パーセント以下、通常は５～１５パーセント、または１０～１２パーセントの付加または欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得、参照配列中の位置の総数（即ち、ウインドウサイズ）によって、一致した位置の数を除算し、結果に１００を乗算して配列同一性の百分率を得ることによって計算される。
本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、化学的合成、組換え法またはＰＣＲを使用して取得され得る。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当該分野で周知であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。当業者は、所望のＤＮＡ配列を産生するために、本明細書で提供される配列および市販のＤＮＡ合成機を使用できる。
組換え法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、本明細書でさらに議論されるように、所望の配列を含むポリヌクレオチドは、適切なベクター中に挿入され得、ベクターは次に、複製および増幅に適切な宿主細胞中に導入され得る。ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の手段によって、宿主細胞中に挿入され得る。細胞は、直接的取込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ－接合またはエレクトロポレーションによって外因性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。いったん導入されると、外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター（例えば、プラスミド）として細胞内で維持され得、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれ得る。そうして増幅されたポリヌクレオチドは、当該分野で周知の方法によって、宿主細胞から単離され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい。
あるいは、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の複製を可能にする。ＰＣＲ技術は、当該分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号および同第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４中に記載されている。
ＲＮＡは、単離されたＤＮＡを適切なベクター中で使用し、それを適切な宿主細胞中に挿入することによって取得され得る。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されると、このＲＮＡは、次いで、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記に示されるような、当業者に周知の方法を使用して単離され得る。
適切なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築され得、または当該分野で入手可能な多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは、使用が意図される宿主細胞に従って変動し得るが、有用なクローニングベクターは一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一の標的を有し得、および／またはベクターを含むクローンを選択する際に使用され得るマーカーの遺伝子を有し得る。適切な例には、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、限定なしに、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにシャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８が含まれる。これらおよび多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、ＳｔｒａｔｅｇｅｎｅおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの供給業者から入手可能である。
宿主細胞
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、本明細書で提供される組換え核酸を有する、またはかかる核酸のレシピエントであり得る、細胞または細胞培養物を指す。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、そのゲノム中（例えば、染色体中）の位置に安定に組み込まれた組換え核酸を有し得る。一部の実施形態では、宿主細胞中の組換え核酸は、宿主細胞のゲノム中に安定に組み込まれない－例えば、組換え核酸は、宿主細胞中でプラスミド中に存在し得る。
本開示の文脈では、「細胞」は、好ましくは哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、例えば、イヌ細胞（例えば、Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓上皮（ＭＤＣＫ）細胞）、霊長類細胞、ヒト細胞（例えば、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞）、マウス細胞またはハムスター細胞であり得る。一部の実施形態では、ハムスター細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。任意選択により、ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫ１ ＳＶ細胞（Ｐｏｒｔｅｒ，ＡＪら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２６（２０１０）、１４５５～１４６４）、または別のＣＨＯ細胞株であり得る。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫細胞、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６）、サル腎臓細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞（２９３）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＥＲＯ－７６）、ＨｅＬａ細胞、バッファローラット肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝臓細胞、マウス乳癌細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞またはヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）である。一部の実施形態では、細胞は、非哺乳動物細胞（例えば、昆虫細胞または酵母細胞）である。
一部の実施形態では、目的のヌクレオチド配列を含む組換え核酸を含み、遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lのうちの１つまたは複数の複製を有する宿主細胞が、本明細書で提供される。また、関連する組成物および細胞を作製する方法も本明細書で提供される。
一部の実施形態では、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１l遺伝子のうちの１つまたは複数を含む１つまたは複数の核酸構築物を受け取った宿主細胞が本明細書で提供される。
一部のさらなる態様では、１つまたは複数の外因性Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１l遺伝子を受け取っていないが、その内因性Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、またはＳｅｈ１l遺伝子が対応する非改変細胞中よりも高い発現を有するように遺伝子改変された宿主細胞もまた、本明細書で提供される。例えば、一部の実施形態では、組換えプロモーター配列は、導入されると、内因性Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、またはＳｅｈ１l遺伝子に作動可能に連結され、それぞれの内因性Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、またはＳｅｈ１l遺伝子の増加した発現を引き起こすように、宿主細胞ゲノム中に導入され得る。
細胞中へのポリヌクレオチドの導入
本明細書で提供されるポリヌクレオチド（例えば、核酸構築物、ベクターなど）は、例えば、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション、および感染（例えば、ベクターが、ワクシニアウイルスなどの感染性因子である場合）を含むいくつかの適切な手段のいずれかによって、宿主細胞中に導入され得る。宿主細胞中へのポリヌクレオチドの導入のための方法の選択は、宿主細胞の特色に依存する場合が多い。
哺乳動物宿主細胞中に、目的のタンパク質の発現を達成するのに十分な核酸を導入するのに適切な方法は、当該分野で公知である。例えば、その各々が本明細書で参照によって組み込まれる、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２９３：６２０～６２５、１９８１；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０～４６、１９７９；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら ＥＰ １１７，０６０；およびＥＰ １１７，０５８を参照されたい。哺乳動物細胞について、哺乳動物細胞中に遺伝材料を導入する一般的な方法には、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｒｂ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６～４５７、１９７８）のリン酸カルシウム沈殿方法またはｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｈａｗｌｅｙ－Ｎｅｌｓｏｎ（Ｆｏｃｕｓ １５：７３、１９９３）が含まれる。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的態様は、１９８３年８月１６日に発行した米国特許第４，３９９，２１６号においてＡｘｅｌによって記載されている。哺乳動物細胞中に遺伝材料を導入するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８９、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７～５３７、１９９０およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８～３５２、１９８８を参照されたい。核酸を導入するのに適切なさらなる方法には、例えば、ＢｉｏＲａｄ（商標）によるＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＸＣｅｌｌ（商標）エレクトロポレーターまたはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによるＮｅｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを使用して採用されるエレクトロポレーションが含まれる。哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現に適切なベクターの比限定的な代表例には、以下のものが含まれ、その各々の全体は、本明細書で参照によって組み込まれる：ｐＣＤＮＡ１；ｐＣＤ、Ｏｋａｙａｍａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６～１１４２、１９８５を参照；ｐＭＣｌｎｅｏ Ｐｏｌｙ－Ａ、Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ ５１：５０３～５１２、１９８７を参照；バキュロウイルスベクター、例えば、ｐＡＣ ３７３またはｐＡＣ ６１０；ＣＤＭ８、Ｓｅｅｄ，Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０、１９８７を参照；およびｐＭＴ２ＰＣ、Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７～１９５、１９８７を参照。
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞における発現のためのウイルスベースのベクターは、当該分野で周知である。例示的なウイルスベースのビヒクルには、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、米国特許第５，２１９，７４０号および同第４，７７７，１２７号、英国特許第２，２００，６５１号、および欧州特許第０３４５２４２号を参照されたい）、アルファウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－６７、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－９２３、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ－５３２））、ならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照されたい）が含まれるがこれらに限定されない。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７に記載されるような、死滅アデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与もまた使用され得る。
死滅アデノウイルス単独に連結されたまたは連結されていないポリカチオン性縮合ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７を参照されたい）、リガンド連結したＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９、２６４：１６９８５を参照されたい）、真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９５／０７９９４、ＷＯ９６／１７０７２、ＷＯ９５／３０７６３、およびＷＯ９７／４２３３８を参照されたい）および核荷電中和（nucleic charge neutralization）または細胞膜との融合が含まれるがこれらに限定されない、非ウイルス性の送達ビヒクルおよび方法もまた使用され得る。
ネイキッドＤＮＡもまた使用され得る。例示的なネイキッドＤＮＡ導入法は、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５、およびＥＰ ０５２４９６８に記載されている。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９９４、１４：２４１１およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９４、９１：１５８１に記載されている。ネイキッドＤＮＡは、ＤＮＡおよびリン酸カルシウムを含む沈殿物を形成することによって、細胞中に導入され得る。あるいは、ネイキッドＤＮＡは、ＤＮＡおよびＤＥＡＥ－デキストランの混合物を形成し、この混合物を細胞と共にインキュベートすること、または細胞およびＤＮＡを適切な緩衝液中で一緒にインキュベートし、（例えば、エレクトロポレーションによって）細胞を高電圧電気パルスに供することによっても、細胞中に導入され得る。ネイキッドＤＮＡは、例えば、マイクロインジェクションによって、細胞中に直接注入することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡは、細胞表面受容体に対するリガンドにカップリングされたポリリジンなどのカチオンにＤＮＡを複合体化させることによって、細胞中に導入することもできる（例えば、その各々の全体が本明細書で参照によって組み込まれる、Ｗｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１、１９８８；Ｗｉｌｓｏｎら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３～９６７、１９９２；ならびに米国特許第５，１６６，３２０号を参照されたい）。受容体へのＤＮＡ－リガンド複合体の結合は、受容体媒介性のエンドサイトーシスによるＤＮＡの取込みを促進する。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、宿主細胞中に安定に導入される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、宿主細胞中に一過的に導入される。
宿主細胞染色体中への核酸の組み込み
ポリヌクレオチドが宿主細胞中に安定に導入される本明細書で提供される実施形態（例えば、ポリヌクレオチドが宿主細胞染色体中に組み込まれる状況）では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞の染色体中にランダムに組み込まれ得、またはポリヌクレオチドは、宿主細胞の染色体中の特定の位置において組み込まれ得る。これらのアプローチは、本明細書で、それぞれ、「ランダム組み込み」または「部位特異的組み込み（「ＳＳＩ」）」と呼ばれ得る。
ランダム組み込みについて、典型的には、組換え核酸構築物が各々、少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、および少なくとも１つの選択マーカー（例えば、抗生物質耐性をコードする遺伝子）を含む、１つまたは複数の組換え核酸構築物が調製される。例えば、遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lのうちの１つまたは複数および選択マーカーを含む核酸構築物が調製され得る。一部の実施形態では、遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lのうちの１つまたは複数を含む第１の核酸構築物が調製され、遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lのうちの１つまたは複数を含む第２の核酸構築物が調製され、ここで、第１の構築物中の遺伝子は第２の構築物中の遺伝子と異なる。
遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lのうちの１つまたは複数を含むポリヌクレオチドの調製後、ポリヌクレオチドは宿主細胞中に導入され得る。ポリヌクレオチドが組み込まれた宿主細胞が、例えば、構築物中の抗生物質耐性遺伝子がそれに対して耐性を付与する抗生物質に対する耐性によって、選択され得る。一般に、目的の遺伝子を含むポリヌクレオチドが細胞集団中に導入され、細胞が、関連する選択マーカーシステム（例えば抗生物質耐性）を介して選択された後に、１つまたは複数のＳｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１l遺伝子を含むポリヌクレオチドの異なる数のコピーを含む、ならびに細胞の染色体中にポリヌクレオチドの異なる位置の組み込みを含む、細胞の不均一な集団（本明細書で細胞の「プール」とも呼ばれる）が存在し得る。任意選択により、この細胞プール由来の個々の細胞は、選別および単離され得、異なる細胞の個々の均一な細胞株集団が樹立され得る（本明細書で細胞株「クローン」とも呼ばれる）。あるいは、一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１l遺伝子を含む細胞の不均一なプールも維持され得る。いずれかの型の上記細胞集団（例えば、均一または不均一な集団）が、本明細書に記載される種々の方法（例えば、タンパク質産生）のために使用され得る。
一部の実施形態では、ランダム組み込みのための核酸構築物は、直鎖ポリヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、直鎖構造は、（例えば、ＰＣＲまたは化学的ポリヌクレオチド合成による）直鎖分子の合成によって生成され得る。一部の実施形態では、直鎖構造は、直鎖核酸分子を生成するための（例えば、制限酵素による）環状ベクターの切断によって生成され得る。
一部の実施形態では、細胞の染色体中に組み込まれた本明細書で提供される１つまたは複数の核酸構築物を含む宿主細胞が、本明細書で提供される。例えば、一部の実施形態では、細胞の染色体中に組み込まれた目的のヌクレオチド配列および遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、またはＳｅｈ１lのうちの１つまたは複数を含む組換え核酸構築物を含む宿主細胞が、本明細書で提供される。
部位特異的組み込みについて、一部の実施形態では、規定された染色体遺伝子座において「ランディングパッド」を含む宿主細胞が使用される。ランディングパッドは、染色体中に安定に組み込まれている、１つまたは複数の組換え標的部位を含む外因性ヌクレオチド配列を含む。ランディングパッド中の組換え標的部位に対応する１つまたは複数の組換え標的配列を含む外因性核酸構築物が宿主細胞中に導入される場合、外因性核酸構築物中の発現カセットは、（例えば、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）を介して）ランディングパッド配列中に組み込まれ得るまたはランディングパッド配列を置き換え得る。一部の実施形態では、部位特異的組み込みシステムは、例えば、全ての目的のために本明細書で参照によって組み込まれるＺｈａｎｇ Ｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、３１（６）：１６４５～１６５６、２０１５年１０月１３日；Ｉｎｎｉｓｓ，Ｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１１４（８）：１８３７～１８４６、２０１７年３月１４日；または国際出願公開番号ＷＯ２０１３／１９００３２において記載されているように使用することができる。
一部の実施形態では、宿主細胞株中のランディングパッドは、宿主細胞のゲノム中の「ホットスポット」に位置し得る。本明細書で使用する場合、用語「ホットスポット」は、その部位において組み込まれた遺伝子（単数または複数）の安定な高い発現を提供する、宿主細胞のゲノム中の部位を意味する。
ＳＳＩのためのランディングパッドを含む細胞は、本明細書で「ＳＳＩ宿主細胞」とも呼ばれ得る。本明細書で使用する場合、「ＳＳＩ宿主細胞」は、少なくとも１つの組換え標的部位（例えば、ランディングパッド）を含む外因性ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を指す。宿主細胞中の組換え標的部位は、宿主細胞のゲノム中への外因性ヌクレオチド配列の部位特異的組み込みを可能にし、したがって、宿主細胞のゲノム中の所望の場所における所望のヌクレオチド配列の所定の局在化され指示された組み込みを可能にする。したがって、一部の実施形態では、部位特異的組み込み宿主細胞は、宿主細胞の染色体中への本明細書に記載される組換え核酸構築物（またはその中の発現カセット）の標的化された組み込みが可能である。一部の実施形態では、部位特異的組み込み宿主細胞は、組換え媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）による発現カセットの標的化された組み込みが可能である。
上記のような、宿主細胞ゲノム中への外因性核酸構築物の組換えが関与する本明細書で提供される組成物および方法について、リコンビナーゼもまた宿主細胞中に存在し、または宿主細胞中に導入される。外因性核酸構築物を導入することが関与する本明細書で提供される方法は、宿主細胞中に、リコンビナーゼをコードする遺伝子を導入することを含み得る。
一部の実施形態では、細胞の染色体中の特定の位置中に組み込まれた外因性組換え核酸構築物を含む宿主細胞が、本明細書で提供される。核酸構築物は、本明細書で提供される核酸構築物の特性のいずれかを有し得る。
組換えタンパク質
別の態様では、本明細書で提供される組成物および方法を介して産生される組換えタンパク質（本明細書で「組換えポリペプチド」とも呼ばれる）が本明細書で提供される。例えば、本明細書で提供される組換え核酸構築物の構成成分である目的のヌクレオチド配列によってコードされる組換えタンパク質が本明細書で提供される。
宿主細胞において発現可能な任意のポリペプチドは、本発明の教示に従って産生され得、本発明の方法に従って、または本発明の細胞によって産生され得る。ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列を有し得、またはあるいは、人によって操作もしくは選択された配列を有し得る。
本発明に従って発現されることが望まれ得るポリペプチドは、興味深いまたは有用な生物学的または化学的活性に基づいて選択される場合が多い。例えば、本発明は、任意の薬学的にまたは商業的に適切な酵素、受容体、抗体、ホルモン、調節因子、抗原、結合因子などを発現させるために使用され得る。一部の実施形態では、培養物中の細胞によって発現されるタンパク質は、抗体もしくはその断片、ナノボディ、単一ドメイン抗体、糖タンパク質、治療的タンパク質、増殖因子、凝固因子、サイトカイン、融合タンパク質、医薬薬物物質、ワクチン、または酵素から選択される。当業者は、任意のタンパク質が本発明に従って発現され得ることを理解する。
発現されたタンパク質の単離
一般に、本発明に従って発現されたタンパク質を単離および／または精製することが、典型的には望ましい。ある特定の実施形態では、発現されたタンパク質は、培地中に分泌され、したがって、細胞および他の固形物は、例えば、精製プロセス中の第１のステップとして、遠心分離または濾過などによって除去され得る。あるいは、発現されたタンパク質は、細胞中に残存し得、または宿主細胞の表面に結合され得る。かかる状況では、培地は除去され得、タンパク質を発現する宿主細胞は、精製プロセス中の第１のステップとして溶解される。哺乳動物宿主細胞の溶解は、ガラスビーズによる物理的破壊および高ｐＨ条件への曝露を含む、当業者に周知の任意の数の手段によって達成され得る。
発現されたタンパク質は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、サイズ排除およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心分離もしくは示差的溶解度、エタノール沈殿が含まれるがこれらに限定されない標準的な方法によって、および／またはタンパク質の精製のための任意の他の利用可能な技術によって、単離および精製され得る（例えば、その各々が本明細書で参照によって組み込まれる、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ 第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ Ｐｒｅｓｓ、１９９９；ならびにＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．、Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．、Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．（編）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ、１８２巻）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７を参照されたい）。特に免疫親和性クロマトグラフィーについて、タンパク質は、そのタンパク質に対して惹起され静置支持体に固定された抗体を含むアフィニティカラムにそのタンパク質を結合させることによって単離され得る。あるいは、親和性タグ、例えば、インフルエンザコート配列、ポリヒスチジンまたはグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼが、適切なアフィニティカラムを通過させることによる容易な精製を可能にするために、標準的な組換え技術によってタンパク質に結合され得る。プロテアーゼ阻害剤、例えば、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンが、精製プロセスの間のタンパク質の分解を低減または排除するために、任意のまたは全ての段階で添加され得る。プロテアーゼ阻害剤は、発現されたタンパク質を単離および精製するために細胞が溶解される必要がある場合、特に有利である。
細胞培養および細胞培養培地
用語「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」、「培地（ｍｅｄｉａ）」などは、本明細書で使用する場合、成長中の哺乳動物細胞に栄養分を与える構成成分または栄養素を含む溶液を指す。典型的には、栄養素には、最低限の成長および／または生存のために細胞が必要とする、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質ならびに微量元素が含まれる。かかる溶液は、ホルモンおよび／もしくは他の増殖因子、特定のイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸）、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（非常に低い最終濃度で通常存在する無機化合物）、高い最終濃度で存在する無機化合物、アミノ酸、脂質ならびに／またはグルコースもしくは他のエネルギー源が含まれるがこれらに限定されない、最小速度を上回って成長および／または生存を増強するさらなる栄養素または補足的構成成分もまた含み得る。一部の実施形態では、培地は、有利には、細胞の生存および増殖にとって最適なｐＨおよび塩濃度になるように製剤化される。一部の実施形態では、培地は、細胞培養の開始後に添加される供給培地である。
広範な種々の哺乳動物成長培地が、本発明に従って使用され得る。一部の実施形態では、細胞は、種々の化学的に規定された培地のうち１つにおいて成長され得、この培地の構成成分は、公知であり、管理されている。一部の実施形態では、細胞は、培地の構成成分が必ずしも全て公知ではないかおよび／または管理されていない複合的な培地中で成長させることもできる。
哺乳動物細胞培養のための化学的に規定された成長培地は、過去数十年間にわたって幅広く開発され、公開されている。規定された培地の全ての構成成分は、十分に特徴付けられており、したがって、規定された培地は、血清または加水分解産物などの複雑な添加物を含まない。初期の培地製剤は、タンパク質産生についてほとんどまたは全く気にせずに、細胞の成長および生存度の維持を可能にするために開発されたものである。より最近では、培地製剤は、高度に生産的な組換えタンパク質産生細胞培養物を支持するという明確な目的をもって開発されている。かかる培地は、本発明の方法における使用に好ましい。かかる培地は、一般に、高密度での細胞の成長および／または維持を支持するために、高い量の栄養素、特にアミノ酸を含む。必要に応じて、これらの培地は、本発明の方法における使用のために、当業者によって改変され得る。例えば、当業者は、本明細書で開示される方法における基本培地または供給培地としての使用のために、これらの培地中のフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよび／またはメチオニンの量を減少させ得る。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物には、細胞培養物および細胞培養培地が関与する。用語「培養物」および「細胞培養物」は、本明細書で使用する場合、細胞集団の生存および／または成長に適切な条件下で培地中にある細胞集団を指す。当業者に明らかなように、一部の実施形態では、これらの用語は、本明細書で使用する場合、細胞集団および集団がその中に存在する培地を含む組合せを指す。一部の実施形態では、細胞培養物の細胞は、哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞培養物は、懸濁物中の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞培養物は、基材上で成長した細胞を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される組換え核酸構築物を含む本明細書で提供される宿主細胞は、目的のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を産生するために使用され得る。同様に、本明細書で提供されるように、本明細書で提供される方法および組成物は、目的のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を取得するために使用され得、かかる目的のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドが、産生および精製され得る。さらに、かかる宿主細胞は、生成および培養され得る。
本発明は、所望のプロセス（例えば、本明細書で提供される方法に従う組換え核酸構築物の導入、および組換えタンパク質（例えば、抗体）の産生）に適した任意の細胞培養法と共に使用され得る。非限定的な例として、細胞は、バッチまたは流加培養で成長され得、この場合、培養は、組換えタンパク質（例えば、抗体）の十分な発現後に終結され、その後、発現されたタンパク質（例えば、抗体）が収集される。あるいは、別の非限定的な例として、細胞は、バッチ再供給（batch-refeed）で成長され得、この場合、培養は終結されず、新たな栄養素および他の構成成分が、培養物に周期的または継続的に添加され、その間、発現された組換えタンパク質（例えば、抗体）は、周期的または継続的に収集される。他の適切な方法（例えば、スピンチューブ）培養）が、当該分野で公知であり、本発明を実施するために使用され得る。
一部の実施形態では、凍結乾燥製剤または水溶液の形態の、本明細書で提供される方法に従って宿主細胞から産生されたポリペプチド、および１種または複数の薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定剤を含む組成物が、本明細書で提供される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ編）。許容できる担体、賦形剤または安定剤は、その投薬量および濃度においてレシピエントにとって非毒性であり、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン；グルコース、マンノースもしくはデキストランを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得る。
方法
一部の態様では、本明細書で提供される宿主細胞を選択する方法、本明細書で提供される宿主細胞を調製する方法、および本明細書で提供される組換えタンパク質を産生するための方法が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、およびＳｈ３ｒｆ２のうちの１つまたは複数の複製を有する宿主細胞は、これらの遺伝子のうちの少なくとも１つの複製について細胞をアッセイすることによって選択することができる。細胞中の遺伝子コピー数を同定するための方法は、当該分野で公知である。例えば、遺伝子コピー数は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、マイクロアレイベースのシステム、全エキソームシーケンシング、および全ゲノムシーケンシングを介して決定することができる。例えば、Ｚａｒｅ，Ｆ．ら、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １８、２８６（２０１７）を参照されたい。
一部の実施形態では、遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、およびＳｈ３ｒｆ２のうちの１つまたは複数の複製を有する宿主細胞は、これらの遺伝子からのｍＲＮＡ発現について細胞をアッセイすることによって選択することができる。相対的ＲＮＡ発現レベルは、対応する遺伝子のコピー数の指標を提供し得る。ＲＮＡ発現は、定量ＰＣＲ、マイクロアレイ、ＲＮＡシーケンシング（全トランスクリプトームシーケンシングを含む）などの、当該分野で知られている方法によって分析することができる。例えば、Ｓｏｎｅｓｏｎ ＣおよびＤｅｌｏｒｅｎｚｉ Ｍ、ＢＭＣ Ｂｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１４、９１（２０１３）を参照されたい。
一部の実施形態では、目的のヌクレオチド配列を含む外因性核酸をこれまでにトランスフェクトされている宿主細胞を、遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lのうちの１つもしくは複数またはＣＨＯの２番染色体の一部分の複製についてアッセイすることができる。かかる複製を有する細胞を次いで、さらなる分析および／または下流プロセスでの使用のために選択してもよい。
一部の実施形態では、遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lのうちの１つまたは複数の複製を有する宿主細胞は、核酸の調製および宿主細胞中へのかかる核酸の導入のための本明細書で記載されるプロセスによって調製することができる。
一部の実施形態では、組換えタンパク質を産生するための方法が本明細書で提供される。かかる方法に従うと、本明細書で提供される細胞（本明細書で提供される方法に従って選択されたまたは本明細書で提供される方法に従って調製された細胞を含む）を、例えば、宿主細胞中の外因性核酸によってコードされる組換えタンパク質の発現のために、使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、全ての目的のために本明細書で参照によって組み込まれるＰＣＴ／ＩＢ２０１６／０５５６６６に開示された組成物および方法と組み合わせて使用され得る。
当業者は、正確な精製技術が、精製されるタンパク質の特徴、タンパク質が発現される細胞の特徴、および／または細胞が成長した培地の組成に依存して変動することを理解する。
米国仮特許出願第６２／７０６，０７５号（２０２０年７月３０日出願）の内容は、全ての目的のために本明細書で参照によって組み込まれる。
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書で引用された全ての参考文献、およびそれらの中で引用された参考文献は、まだ引用されていない範囲まで、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。定義された用語、用語の用法、記載された技術などが含まれるがこれらに限定されない、組み込まれた文献および同様の資料のうち１つまたは複数が、本出願とは異なる場合または本出願と矛盾する場合には、本出願が支配する。
開示された教示は、種々の適用、方法、キットおよび組成物に関して記載されてきたが、種々の変化および改変が、本明細書の教示および以下の特許請求された本発明から逸脱することなしになされ得ることが理解される。上述の実施例は、開示された教示をよりよく説明するために提供されるのであって、本明細書に提示された教示の範囲を限定する意図はない。本明細書の教示は、これらの例示的な実施形態に関連して記載されてきたが、当業者は、これらの例示的な実施形態の多数のバリエーションおよび改変が、過度の実験なしに可能であることを容易に理解する。全てのかかるバリエーションおよび改変は、本明細書の教示の範囲内である。
以下の実施例は、例示目的のためにのみ提供され、本発明の方法を限定することは決して意図しない。実際、本明細書に示され記載されるものに加えた、本発明の種々の改変は、上述の説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲の範囲内に入る。
（実施例１）
異なる成長特徴を有する同一の親細胞株からの異なるクローン細胞集団の同定
この実施例では、同一の親細胞株に由来する異なるクローン細胞集団を同定した。クローン細胞集団は、同一の親細胞株に由来しているが、異なる成長特徴を有している。
（実施例１ａ）ｍＡｂ１を含む親細胞株ＣＨＯ細胞株１に由来するクローン
社内製のファイザー宿主ＣＨＯ細胞株１（ＣＨＯＫ１誘導体）に、モノクローナル抗体（「ｍＡｂ１」）をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトして、この実施例で「親細胞株ＣＨＯ１」と呼ばれる、ｍＡｂ１を安定的に発現する細胞株を樹立した。
親細胞株ＣＨＯ１から、「Ｔ３－６」、「Ｔ３－９」、および「Ｔ３－１１」という３つの別々のクローン細胞株集団を樹立した。３つのクローン細胞株は同様に処理し、親細胞株ＣＨＯ１と比較して遺伝子操作しなかった。３つのクローン細胞株全てをＣＤ ＣＨＯ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ／Ｇｉｂｃｏ）中で週に２回継代して、世代を増やした。３つの細胞株全てについて、凍結保存バンクを２５世代目（２５ｇｅｎ）および１００世代目（１００ｇｅｎ）で樹立した。
クローン細胞株「Ｔ３－６」、「Ｔ３－９」、および「Ｔ３－１１」の表現型の安定性を評価するために、２５ｇｅｎおよび１００ｇｅｎ凍結保存バンク由来の凍結保存細胞を同時に解凍し、同じ培養条件下で３回継代し、その後、ＡＭＢＲ（登録商標）バイオリアクターシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して標準的な流加細胞培養物プロセスで培養した。
２５ｇｅｎおよび１００ｇｅｎ凍結保存バンク由来の異なるクローン細胞株についての成長のデータを以下で表２に示す。０日目は細胞培養の開始日である。表に示されるように、Ｔ３－６ ２５ｇｅｎのピーク生存細胞密度は、２５ｇｅｎのＴ３－９およびＴ３－１１のピーク生存細胞密度よりも顕著に低かった。例えば、７日目に、Ｔ３－６ ２５ｇｅｎのクローン細胞は１７８．１６×１０５／ｍｌの生存細胞密度（ＶＣＤ）を有しており、一方、Ｔ３－９ ｇｅｎおよびＴ３－１１ ｇｅｎは、それぞれ２９６．７７５×１０５／ｍｌおよび２８９．１７５×１０５／ｍｌのＶＣＤを有していた。１００世代目では、Ｔ３－６ １００ｇｅｎのピーク細胞密度は、２５ｇｅｎのＴ３－９およびＴ３－１１のピーク細胞密度に匹敵するレベルまで増大したが、一方、細胞株Ｔ３－９およびＴ３－１１の２５ｇｅｎおよび１００ｇｅｎの間で成長の変化は検出されなかった。
Figure 2023535604000005
（実施例１ｂ）親細胞株：ｍＡｂ２を含むＣＨＯ２に由来するクローン
社内製のファイザー宿主ＣＨＯ細胞株２（ＣＨＯＫ１誘導体）に、モノクローナル抗体（「ｍＡｂ２」）をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトして、この実施例で「親細胞株ＣＨＯ２」と呼ばれる、ｍＡｂ２を安定的に発現する細胞株を樹立した。
親細胞株ＣＨＯ２から、「Ｃ１５」および「Ｃ３２」という２つの別々のクローン細胞株集団を樹立した。２つのクローン細胞株を同様に処理し、親細胞株ＣＨＯ２と比較して遺伝子操作しなかった。同一の世代で、Ｃ１５およびＣ３２クローン細胞集団を、ＡＭＢＲ（登録商標）バイオリアクターシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用する標準的な流加細胞培養物プロセスで別々に成長させた（それぞれ、３つの別々の容器中で３回）。
Ｃ１５およびＣ３２クローン細胞株についての成長データを以下で表３に示す。０日目は細胞培養の開始日である。表３に示すように、Ｃ３２集団の細胞ＶＣＤのピークは、３日目以降、Ｃ１５のピークよりも顕著に低かった。例えば、７日目に、Ｃ１５培養物の各々（すなわち各容器中の）は２９０～３１０×１０５／ｍｌの間のＶＣＤを有していたが、一方、Ｃ３２培養物の各々は１００～１１０×１０５／ｍｌの間のＶＣＤを有しているにすぎなかった。
Figure 2023535604000006
したがって、表２および表３に示されているデータに基づいて、同一の親細胞株に由来しているにもかかわらず異なる成長特徴を有しているクローン細胞集団が同定された。
（実施例２）
コピー数のバリエーションの分析による異なるクローン細胞集団の分析
この実施例は、実施例１で異なる成長特徴を有すると同定された異なるクローン集団のコピー数のバリエーションの分析を説明する。
上記の実施例１ａおよび実施例１ｂで記載されているクローン細胞株の間で見られた成長特徴の違いの考えられる根拠を調べるために、異なるクローン細胞株でコピー数のバリエーション（ＣＮＶ）の分析を行った。
ＣＮＶ分析では、８つの異なる細胞株、すなわち、Ｔ３－９ ２５ｇｅｎ、Ｔ３－１１ ２５ｇｅｎ、Ｔ３－６ １００ｇｅｎ、およびＣ１５を含む、高い成長特徴を有する４つのクローン細胞株；低い成長特徴を有する２つのクローン細胞株：Ｔ３－６ ２５ｇｅｎおよびＣ３２；ならびに２つの親細胞株：ファイザーＣＨＯ１およびＣＨＯ２（実施例１で記載されている）から得られた、全ゲノムの再シーケンシング（ＷＧＲＳ）のデータを使用した。ＷＧＲＳデータを、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）ソフトウェア（ＧｉｔＨｕｂで入手可能）を使用して、ＣＨＯ ＰＩＣＲゲノム（ＮＣＢＩ受託番号ＧＣＦ＿００３６６８０４５．１）にマッピングした。全てのスキャホールドについて、Ｓｕｂｒｅａｄソフトウェアのｆｅａｔｕｒｅｃｏｕｎｔツールを使用して、１ｋｂのビンからのリードカウントを計算した。各試料についてのリード数を全部で３億のリードに対して正規化し、次いで、ｃｎ．ｍｏｐｓソフトウェア（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）へのインプットとして使用して、コピー数のコールを得た。Ｃｉｒｃｏプロットを、ｃｉｒｃｌｉｚｅパッケージのサーキュラービジュアライゼーションソフトウェアを用いて作成した。
このＣＮＶ分析によって、高い成長特徴を有する細胞株がＣＨＯの２番染色体の複数の領域の複製を有していることが明らかになった。複製された領域についての詳細を以下で表４に示す。全部で、２番染色体における複製された領域は３４．２９メガベース（Ｍｂ）となった。ＣＨＯの２番染色体は全長が４６３．５９Ｍｂであるため、複製された領域はＣＨＯの２番染色体の約７．４％であると計算された。複製された領域では、染色体のそれぞれの領域の２つのコピーが存在していた（野生型２番染色体においてそれぞれの領域のコピーが１つであることと比較して）。
Figure 2023535604000007
この実施例は、高い成長特徴を有する細胞株がＣＨＯの２番染色体の複数の領域の複製を有していたことを示している。
アップデートされたＣＨＯゲノムアセンブリＰＩＣＲＨ（ＧｅｎＢａｎｋアセンブリ受託番号：ＧＣＡ＿００３６６８０４５．２）では、コンティグＮＷ＿０２０８２２４４０．１、ＮＷ＿０２０８２２４４２．１、ＮＷ＿０２０８２２４５９．１、ＮＷ＿０２０８２２４６６．１が、より大きいコンティグＮＣ＿０４８５９５．１：１６０２６２１８８～１９６７８８７５１に共に含まれている。
（実施例３）
高い成長特徴を有する細胞株中で複製した遺伝子の同定
この実施例は、高い成長特徴を有するクローン細胞株中に存在すると実施例２で同定されたＣＨＯの２番染色体の領域で複製されている遺伝子の同定を記載している。
高い成長特徴を有する細胞株において複製されていると実施例２で同定されたＣＨＯの２番染色体の領域内の遺伝子を同定するために、実施例１および２に記載されている高い成長特徴を有する細胞および低い成長特徴を有する細胞の遺伝子発現プロファイルを比較することによって、示差的遺伝子分析を行った。この分析のために、ペアエンドＲＮＡ－Ｓｅｑデータを、Ｓｕｂｒｅａｄパッケージ（Ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ）のｓｕｂｊｕｎｃプログラムを使用してＣＨＯ ＰＩＣＲアセンブリ（ＮＣＢＩ受託番号ＧＣＦ＿００３６６８０４５．１）にマッピングした。Ｒａｗ遺伝子カウントを、ＳｕｂｒｅａｄパッケージのｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔによって得た。トランスクリプトーム全体にわたる相対的遺伝子発現量を計算するために、ＦＰＫＭ（Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ Ｍｉｌｌｉｏｎ）値を、ｅｇｄｅＲパッケージ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）を用いて計算した。ＦＰＫＭ値が＞１の遺伝子を、技術的ノイズを上回って検出可能であるとみなした。示差的発現の統計（ｌｏｇ２ＦＣ、ＡｖｅＥｘｐ、ｐ値、ＦＤＲ）をＲ Ｌｉｍｍａパッケージ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）によって計算した。ヒートマップを、ＣｏｍｐｌｅｘＨｅａｔｍａｐパッケージ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）を用いて作成した。
この分析で、ＣＨＯの２番染色体の増幅された領域にある９７のタンパク質コード遺伝子を、有意に過剰発現していると同定した（ｌｏｇＦＣ≧０．７、ＦＤＲ≦０．１）。１０の最も有意に過剰発現している遺伝子（最低誤検出率（Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ）（ＦＤＲ））を、これらのＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ（遺伝子＿ｉｄ）、染色***置（スキャホールド、開始、終点、鎖）、相対的転写産物存在量（平均ＤＰＫＭ）、ならびにＤＥの統計（ｌｏｇＦＣ、調整済みＰ値、および平均ＦＰＫＭ）と共に、以下で表５に示す。表５に示すように、１０の最も有意に過剰発現した遺伝子は、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、およびＳｈ３ｒｆ２である。表５でさらに示すように、遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、およびＳｍｉｍ３は、スキャホールド領域ＮＷ＿０２０８２２４６６．１にあり、遺伝子Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、およびＬｍｎｂ１は、スキャホールド領域ＮＷ＿０２０８２２４５９．１にあり、遺伝子Ｍｅ２およびＰｉａｓ２は、スキャホールド領域ＮＷ＿０２０８２２４４０．１にあり、遺伝子Ｓｈ３ｒｆ２はスキャホールド領域ＮＷ＿０２０８２２４４２．１にある。
Figure 2023535604000008
次に、過剰発現しているとＦＰＫＭ分析において上記で同定された遺伝子の一部をさらに調べるために、クローン細胞株Ｔ３－６ ２５ｇｅｎ、Ｔ３－６ １００ｇｅｎ、およびＴ３－９ ２５ｇｅｎを定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）および定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって分析して、目的の遺伝子についての遺伝子コピー数およびｍＲＮＡ存在量を分析した。具体的には、細胞を、Ｌｍｎｂ１、Ｓｅｈ１l、Ｓｈ３ｒｆ２、およびＳｐｉｒｅ１遺伝子のコピー数について、またＰｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｌｍｎｂ１、Ｒｎｍｔ、Ｓｅｈ１l、およびＳｐｉｒｅ１のＲＮＡ量について分析した。（遺伝子ＲｎｍｔおよびＳｅｈ１ｌもまたＣＨＯの２番染色体の増幅された領域で有意に過剰発現していると同定されたが、１０の最も有意に過剰発現している遺伝子の中には入っていなかった。）
図１Ａは、遺伝子コピー数分析の結果を示している。Ｘ軸は関連する遺伝子（Ｌｍｎｂ１、Ｓｅｈ１l、Ｓｈ３ｒｆ２、およびＳｐｉｒｅ１）を列挙しており、それぞれの遺伝子について３つの棒が示されている。棒は、左から右の順で、細胞株Ｔ３－６ ２５ｇｅｎ、Ｔ３－６ １００ｇｅｎ、およびＴ３－９ ２５ｇｅｎのそれぞれの遺伝子についての結果を示している。Ｙ軸は、染色体当たりの平均遺伝子コピー数を示している。図１Ａに示されるように、Ｌｍｎｂ１、Ｓｅｈ１l、Ｓｈ３ｒｆ２、およびＳｐｉｒｅ１遺伝子のそれぞれについて、Ｔ３－６ ２５ｇｅｎ細胞では、存在する平均コピーは、染色体当たり１つの当該遺伝子のコピーであった。（実施例１によると、Ｔ３－６ ２５ｇｅｎ細胞は遅い成長特徴／比較的低いＶＣＤを有している）。逆に、これらの遺伝子のそれぞれについて、存在する平均コピーは、Ｔ３－６ １００ｇｅｎおよびＴ３－９ ２５ｇｅｎ細胞では、染色体当たり少なくとも１．５個の当該遺伝子のコピーであった。（実施例１によると、Ｔ３－６ １００ｇｅｎおよびＴ３－９ ２５ｇｅｎ細胞は、速い成長特徴／比較的高いＶＣＤを有している）。これらの結果は、ＣＨＯの２番染色体の遺伝子Ｌｍｎｂ１、Ｓｅｈ１l、Ｓｈ３ｒｆ２、およびＳｐｉｒｅ１遺伝子の複製が、遅い成長／低いＶＣＤの表現型から速い成長／高いＶＣＤ表現型への変化に関連していることを示している。
図１Ｂは、ｍＲＮＡ存在量の分析の結果を示している。Ｘ軸は関連する遺伝子（Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｌｍｎｂ１、Ｒｎｍｔ、Ｓｅｈ１l、Ｓｐｉｒｅ１）を列挙しており、それぞれの遺伝子について３つの棒が示されている。棒は、左から右の順で、細胞株Ｔ３－６ ２５ｇｅｎ、Ｔ３－６ １００ｇｅｎ、およびＴ３－９ ２５ｇｅｎのそれぞれの遺伝子についての結果を示している。Ｙ軸は、各それぞれの遺伝子についてのｍＲＮＡレベルの相対的倍率変化（ＦＣ）を示している（Ｔ３－６ ２５ｇｅｎの値を「１」とし、Ｔ３－６ １００ｇｅｎおよびＴ３－９ ２５ｇｅｎの値をＴ３－６ ２５ｇｅｎの値と比較している）。図１Ｂに示すように、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｌｍｎｂ１、Ｒｎｍｔ、Ｓｅｈ１l、およびＳｐｉｒｅ１の各々で、Ｔ３－６ １００ｇｅｎ細胞およびＴ３－９ ２５ｇｅｎ細胞のｍＲＮＡの相対的ＦＣ値は、Ｔ３－６ ２５ｇｅｎ細胞のそれぞれ少なくとも１．５倍または２倍の値であった。（実施例１によると、Ｔ３－６ １００ｇｅｎおよびＴ３－９ ２５ｇｅｎ細胞は速い成長特徴／比較的高いＶＣＤを有しており、Ｔ３－６ ２５ｇｅｎ細胞は遅い成長特徴／比較的低いＶＣＤを有している。）これらの結果は、低い成長特徴から高い成長特徴への細胞の変化に関連する遺伝子Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｌｍｎｂ１、Ｒｎｍｔ、Ｓｅｈ１l、およびＳｐｉｒｅ１の増大したｍＲＮＡレベルを示している。
全体として、この実施例は、ＣＨＯの２番染色体の遺伝子Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１の複製がＣＨＯ細胞の増大した成長に関連していることを示している。

Claims (34)

  1. 外因性核酸と、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の複製とを含む、哺乳動物宿主細胞。
  2. 前記遺伝子のうちの少なくとも２つの複製を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
  3. ２つの遺伝子のうちの１つが、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３からなる群から選択され、２つの遺伝子のうちの１つが、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、およびＳｈ３ｒｆ２からなる群から選択される、請求項２に記載の宿主細胞。
  4. 外因性核酸と、少なくとも４つの遺伝子の複製とを含む哺乳動物宿主細胞であって、
    ４つの遺伝子のうちの１つが、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３からなる群から選択され、
    ４つの遺伝子のうちの１つが、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１からなる群から選択され、
    ４つの遺伝子のうちの１つが、Ｍｅ２およびＰｉａｓ２からなる群から選択され、
    ４つの遺伝子のうちの１つがＳｈ３ｒｆ２である、
    哺乳動物宿主細胞。
  5. 外因性核酸と、２番染色体の少なくとも一部分の複製とを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞。
  6. ２番染色体の複製部分が、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lからなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの遺伝子の複製を含む、請求項５に記載のＣＨＯ宿主細胞。
  7. ２番染色体の複製部分が前記遺伝子のうちの少なくとも４つの複製を含み、
    ４つの遺伝子のうちの１つが、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３からなる群から選択され、
    ４つの遺伝子のうちの１つが、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１からなる群から選択され、
    ４つの遺伝子のうちの１つが、Ｍｅ２およびＰｉａｓ２からなる群から選択され、
    ４つの遺伝子のうちの１つがＳｈ３ｒｆ２である、
    請求項６に記載のＣＨＯ宿主細胞。
  8. 少なくとも１つの遺伝子または少なくとも２番染色体の一部分の複製を含む宿主細胞が、少なくとも１つの遺伝子または少なくとも２番染色体の一部分の複製を欠くこと以外は同一の宿主細胞と比較して改善された成長特徴を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  9. 改善された成長特徴を有する哺乳動物宿主細胞を選択する方法であって、
    （ａ）外因性核酸を含む哺乳動物宿主細胞をＳｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の複製についてアッセイするステップ、
    （ｂ）少なくとも１つの遺伝子の複製を含む哺乳動物宿主細胞を選択するステップであって、少なくとも１つの遺伝子の複製を含む哺乳動物宿主細胞が、少なくとも１つの遺伝子の複製を欠くこと以外は同一の哺乳動物宿主細胞と比較して改善された成長特徴を有している、ステップ
    を含む、方法。
  10. 哺乳動物宿主細胞が、前記遺伝子のうちの少なくとも２つの複製についてアッセイされる、請求項９に記載の方法。
  11. ２つの遺伝子のうちの１つが、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３からなる群から選択され、２つの遺伝子のうちの１つが、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、およびＳｈ３ｒｆ２からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 改善された成長特徴を有する哺乳動物宿主細胞を選択するための方法であって、
    （ａ）外因性核酸を含む哺乳動物宿主細胞を少なくとも４つの遺伝子の複製についてアッセイするステップであって、
    （ｉ）４つの遺伝子のうちの１つが、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３からなる群から選択され、
    （ｉｉ）４つの遺伝子のうちの１つが、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１からなる群から選択され、
    （ｉｉｉ）４つの遺伝子のうちの１つが、Ｍｅ２およびＰｉａｓ２からなる群から選択され、
    （ｉｖ）４つの遺伝子のうちの１つがＳｈ３ｒｆ２である、
    ステップ、ならびに
    （ｂ）少なくとも４つの遺伝子の複製を含む哺乳動物宿主細胞を選択するステップであって、少なくとも４つの遺伝子の複製を含む哺乳動物宿主細胞が、少なくとも４つの遺伝子の複製を欠くこと以外は同一の哺乳動物宿主細胞と比較して改善された成長特徴を有している、ステップ
    を含む、方法。
  13. 組換えタンパク質を産生するための方法であって、
    （ａ）請求項１から８のいずれか一項に記載の組換え哺乳動物宿主細胞を提供するステップであって、宿主細胞の外因性核酸が組換えタンパク質をコードしている、ステップ、
    （ｂ）組換え哺乳動物宿主細胞を、組換えタンパク質の発現に十分な条件下で培養するステップ、
    を含む、方法。
  14. 組換えタンパク質を産生するための方法であって、
    （ａ）請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法に従って選択された組換え哺乳動物宿主細胞を提供するステップであって、宿主細胞の外因性核酸が組換えタンパク質をコードしている、ステップ、
    （ｂ）組換え哺乳動物宿主細胞を、組換えタンパク質の発現に十分な条件下で培養するステップ
    を含む、方法。
  15. 発現された組換えタンパク質を回収するステップをさらに含む、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 外因性核酸がタンパク質をコードする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の宿主細胞または方法。
  17. タンパク質が治療的タンパク質である、請求項１６に記載の宿主細胞または方法。
  18. 治療的タンパク質が抗体またはサイトカインである、請求項１７に記載の宿主細胞または方法。
  19. 改善された成長特徴を有する哺乳動物宿主細胞を調製する方法であって、
    Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ２、Ｒｎｍｔ、およびＳｅｈ１lからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の配列を含む外因性核酸分子を哺乳動物宿主細胞中に導入するステップ
    を含み、
    外因性核酸分子を含む宿主細胞が、外因性核酸分子を有していないこと以外は同一の哺乳動物宿主細胞と比較して改善された成長特徴を有している、方法。
  20. 少なくとも２つの前記遺伝子の配列を含む１つまたは複数の外因性核酸分子が宿主細胞中に導入される、請求項１９に記載の方法。
  21. ２つの遺伝子のうちの１つが、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３からなる群から選択され、２つの遺伝子のうちの１つが、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１、Ｍｅ２、Ｐｉａｓ２、およびＳｈ３ｒｆ２からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 少なくとも４つの前記遺伝子の配列が宿主細胞中に導入され、
    ４つの遺伝子のうちの１つが、Ｓｐｉｒｅ１、Ｎａｒｓ、Ｒｐｓ１４、Ｓｍｉｍ３からなる群から選択され、
    ４つの遺伝子のうちの１つが、Ｆｅｍ１ｃ、Ｐｐｉｃ、Ｌｍｎｂ１からなる群から選択され、
    ４つの遺伝子のうちの１つが、Ｍｅ２およびＰｉａｓ２からなる群から選択され、
    ４つの遺伝子のうちの１つがＳｈ３ｒｆ２である、請求項２１に記載の方法。
  23. 哺乳動物細胞が、マウス細胞、ラット細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト細胞である、請求項１から４または８から２２のいずれか一項に記載の宿主細胞または方法。
  24. ヒト細胞が、ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＨＴ１０８０細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞または方法。
  25. 宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞または方法。
  26. 外因性核酸が、宿主細胞染色体において、染色体中に組み込まれている、請求項１から２５のいずれか一項に記載の宿主細胞または方法。
  27. 宿主細胞染色体が、染色体中への外因性核酸の部位特異的組み込みのための組換え標的部位を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の宿主細胞または方法。
  28. 改善された成長特徴が、遺伝子または２番染色体の一部分の複製を欠くこと以外は同一の哺乳動物宿主細胞を含む第２の細胞培養物と比較して改善された成長特徴を有する細胞を含む第１の細胞培養物の、より優れた細胞数、より優れた生存細胞数、より優れた細胞密度、またはより優れた生存細胞密度であり、第１および第２の細胞培養物が、同じ条件下で同じ期間にわたって成長させられる、請求項８から２７のいずれか一項に記載の宿主細胞または方法。
  29. 期間が、３、５、７、または１０日間である、請求項２８に記載の宿主細胞または方法。
  30. より優れた細胞数、より優れた生存細胞数、より優れた細胞密度、またはより優れた生存細胞密度が、第２の細胞培養物での値と比較して、第１の細胞培養物でのそれぞれの値において少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、または２００％の増大である、請求項２８または２９のいずれか一項に記載の宿主細胞または方法。
  31. 細胞数、生存細胞数、細胞密度、または生存細胞密度が、自動セルアナライザーによって測定される、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の宿主細胞または方法。
  32. 宿主細胞を遺伝子の複製についてアッセイするステップが、遺伝子の配列を含むＤＮＡまたは遺伝子から転写されたｍＲＮＡの相対量を決定するステップを含む、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
  33. 請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法に従って、請求項１から８のいずれか一項に記載の宿主細胞によって、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法に従って選択された宿主細胞によって、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法に従って調製された宿主細胞によって、または請求項２３から３２のいずれか一項に記載の宿主細胞もしくは方法に従って調製された組換えタンパク質。
  34. 請求項１から３３のいずれか一項に記載の宿主細胞、方法、または組換えタンパク質であって、
    Ｓｐｉｒｅ１遺伝子が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、
    Ｎａｒｓ遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、
    Ｒｐｓ１４遺伝子が、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、
    Ｓｍｉｍ３遺伝子が、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、
    Ｆｅｍ１ｃ遺伝子が、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、
    Ｐｐｉｃ遺伝子が、配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、
    Ｌｍｎｂ１遺伝子が、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、
    Ｍｅ２遺伝子が、配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、
    Ｐｉａｓ２遺伝子が、配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードするか、または
    Ｓｈ３ｒｆ２遺伝子が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドをコードする、
    宿主細胞、方法、または組換えタンパク質。
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