DE3788944T2 - Verfahren zur herstellung eines koagulationsaktiven komplexes vom faktor viii-fragment. - Google Patents
Verfahren zur herstellung eines koagulationsaktiven komplexes vom faktor viii-fragment.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines gerinnungsaktiven Komplexes eines N-terminalen Fragments von Faktor VIII mit einem Molekulargewicht von 92 bis 210 kD und eines C-terminalen Fragments von Faktor VIII mit einem Molekulargewicht von 80 bis 70 kD.
- Faktor VIII ist ein im Blut natürlich vorkommendes Protein.
- Es nimmt als Kofaktor an der Überführung von FX in aktiviertes FX (FXa) teil. Die Anwesenheit von FVIII erhöht die FXa-Bildungsgeschwindigkeit um etwa das 200 000fache (Dieijen et al., J. Biol. Chem. 156, S. 3433, 1981). Ein Mangel an FVIII (Hämophilie A) offenbart sich als unkontrollierte Blutungen.
- Die Rolle von FVIII in der Gerinnungskaskade geht aus dem folgenden Schema hervor: Kofaktoren: Phospholipid
- FVIII kann durch Thrombin oder FXa aktiviert und durch Thrombin, FXa oder Protein C inaktiviert werden.
- Hämophilie A-Patienten werden entweder vorbeugend oder im Falle von Blutungen akut mit FVIII-Zubereitungen behandelt.
- FVIII kann aus Humanblutplasma, in welchem etwa 1 ppm des Proteins FVIII ist, isoliert werden. Dieses Verfahren vermag nur begrenzte Mengen FVIII zu liefern und es ist daher erwünscht, FVIII biosynthetisch in einer Zellkultur herzustellen. Drei Forschergruppen sind dabei erfolgreich gewesen (Wood et al., Nature 312, S. 330, 1984 - Toole et al., Nature 312, S. 342, 1984 - Truet et al., DNA 4, S. 333, 1985).
- 2 mg Fremdprotein/ml können in einer Zellkultur hergestellt werden. Für FVIII entspräche dies 20 000 Einheiten/ml. Dieser Wert überschreitet bei weitem das, was für FVIII in der Literatur beschrieben worden ist. Einer der Gründe ist, daß FVIII ein sehr großes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 330 kD (Vehar et al., Nature 312, S. 337, 1984) ist.
- Aus Blutplasma oder aus einer Zellkultur gereinigter FVIII umfaßt ein leichte Faktor VIII-Kette oder FVIII-LC genanntes Fragment mit einem Molekulargewicht von etwa 80 kD und ein schwere FVIII-Kette oder FVIII-HC genanntes Fragment mit einem Molekulargewicht von 92 bis 210 kD. Die Fragmente werden so aus dem 330 kD-Protein durch proteolytische Spaltung hergestellt, daß 80 kD-FVIII-LC das C-terminale Fragment ist, während FVIII-HC das N-terminale Fragment ist, dessen Größe vom Grad der Spaltung abhängt.
- So ist es bekannt, daß gerinnungsaktiver FVIII ein 80 kD-Fragment und ein Fragment mit einem Molekulargewicht von 92 kD oder mehr einschließt (Fulcher und Zimmerman, Symposium on FVIII, Scripps Clinic, 1982).
- Es wäre ein Vorteil, FVIII aus kleineren Fragmenten herzustellen, falls diese Fragmente in vitro zu gerinnungsaktivem FVIII vereinigt werden könnten. Die Fragmente könnten wegen ihrer geringeren Größe hinsichtlich unversehrtem FVIII leichter biosynthetisch in großen Mengen hergestellt werden. Weiter wäre die Herstellung von FVIII-Fragmenten im Hinblick auf die nachfolgende Reinigung aus der Zellkultur vorteilhaft, da das Produkt durch die Komplexbildung Ladung und Molekulargewicht ändert. Da es auf diese Weise möglich ist, sowohl die Fragmente als auch den Komplex zu reinigen, kann ein reineres Endprodukt erhalten werden.
- Die EP-A-150 735 offenbart ein Verfahren und eine Zusammensetzung zur Herstellung von Faktor VIIIC. In diesem Dokument werden Komplexe eines Faktors VIIIHC und LC-Fragmenten erwähnt, die mit Ca&spplus;&spplus; verbrückt sind.
- Die EP-A-197 901 offenbart eine Kette aus Faktor VIIIHC und LC-Fragmenten, die mit der Metallionenbrücke zusammengehalten werden.
- Versuche haben gezeigt, daß die einfache Vereinigung der Fragmente keine gerinnungsaktiven Produkte liefert. Auch beschreibt die Literatur keine Verfahren oder Bedingungen, welche es FVIII- Fragmenten ermöglicht, in einen gerinnungsaktiven Komplex überführt zu werden.
- Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Befund, daß ein gerinnungsaktiver Komplex erzeugt wird, wenn eine gerinnungsinaktive schwere FVIII-Kette (FVIII-HC, N-terminales Fragment) zum Reagieren mit einer gerinnungsinaktiven, leichten FVIII-Kette (FVIII-LC, C-terminales Fragment) in Anwesenheit eines komplexfördernden Mittels veranlaßt wird. Dies ist völlig überraschend, da die Literatur über die Reinigung von FVIII-LC und FVIII-HC berichtet, s. DK-Patentanmeldung 5387/85, ohne von irgendeiner versuchten aktivitätserzeugenden Kombination zu berichten, ungeachtet daß eine Aktivitätserzeugung durch eine Kombination eine große theoretische und praktische Bedeutung hätte.
- Burke et al. (Abstract 14, S. 111, Research in clinic and laboratory 16, 1986) sind in der Lage gewesen, gerinnungsaktiven FVIII in vivo mit Zellen herzustellen, die mit DNA sowohl für FVIII-LC und FVIII-HC transfiziert waren. Es war jedoch nicht möglich, eine Gerinnungsaktivität durch Vermischen von Kulturüberständen zu erhalten, welche FVIII-LC beziehungsweise FVIII-HC enthielten, selbst wenn verschiedene Bedingungen versucht wurden.
- FVIII-LC kann aus Humanplasma gereinigt werden und besitzt keine Gerinnungsaktivität (siehe WO 86/02838). FVIII-HC-Fragmente können auch aus Blutplasma gereinigt werden (Truett et al., DNA 4, S. 333, 1985). Auch diese Fragmente sind ohne Gerinnungsaktivität.
- Gemäß der Erfindung werden vorzugsweise ein oder mehrere zweiwertige Metallionen als komplexfördernde Mittel verwendet. Beispiele geeigneter Mittel dieses Typs sind Mn²&spplus;, Ca²&spplus; und Co²&spplus;. Andere geeignete Komplexförderungsmittel sind FIXa und FX und Substanzen mit Reaktionsfähigkeit gegenüber R-SH- und/oder R-S- S-R-Verbindungen. Gewünschtenfalls kann ein Gemisch dieser Mittel verwendet werden.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein dadurch gekennzeichnetes Verfahren, daß ein Fragment oder beide Fragmente derivatisiert werden. Weiter bezieht sich die Erfindung auf ein dadurch gekennzeichnetes Verfahren, daß die Derivatisierung den Ersatz einer oder mehrerer cys-Aminosäuren durch eine andere Aminosäure, vorzugsweise Serin, umfaßt.
- Die Erfindung bezieht sich auch auf ein dadurch gekennzeichnetes Verfahren, daß das komplexfördernde Mittel (= Verbrückungsmittel) ein Proteinkondensationsmittel ist, wie etwa Glutaraldehyd, Hydrazin, Bisepooxirane, Epichlorhydrin, Divinylsulfon, Benzochinon, Carbonyldiimidazol oder Carbodiimid.
- FVIII-LC oder leichte FVIII-Kette ist ein Fragment aus dem C-terminalen Bereich von FVIII in voller Länge. Das Molekulargewicht des Fragments beträgt typischerweise etwa 80 kD, kann aber 70 kD oder weniger betragen. Das Fragment mit dem Molekulargewicht 80 kD besitzt in dem beschriebenen Test gegenüber einem FVIII-LC-Antigen und nicht in dem Test gegenüber dem FVIII-HC-Antigen eine immunologische Reaktionsfähigkeit.
- FVIII-HC oder schwere FVIII-Kette ist ein Fragment aus dem N- terminalen Bereich von FVIII in voller Länge. Das Molekulargewicht des Fragments beträgt typischerweise 92 kD, kann aber weniger und bis zu 210 kD betragen. Aus Plasma gereinigter FVIII-HC besteht aus einem Gemisch mit einem Molekulargewicht von 92 bis 210 kD. Das Fragment mit einem gleichen oder größeren Molekulargewicht als 92 kD besitzt in dem beschriebenen Test gegenüber einem FVIII-HC-Antigen und nicht in dem Test auf ein FVIII-LC-Antigen eine immunologische Reaktionsfähigkeit.
- Gerinnungsaktiver FVIII ist ein Protein, das zum Verringern der Gerinnungszeit von Hämophilie A-Plasma im Gerinnungstest befähigt ist. Gerinnungsaktiver FVIII ist weiter zum Fördern der Bildung von FXa im Coatest-Test (vgl. im Folgenden) und somit dem Umwandeln des chromogenen Substrats befähigt. Die Gerinnungsaktivität wird als FVIII:C angegeben.
- Der Prothrombinkomplex stellt γ-Carboxyglutaminsäure enthaltende Gerinnungsfaktoren, z. B. FII, FVII, FIX, FX-Protein C oder aktivierte Formen dieser Gerinnungsfaktoren (Davie et al., Advances in enzymology 48, S. 277, 1979), dar.
- In diesem Test wird FVIII:C in einem System gemessen, welches aus FIXa, FX, Ca²&spplus; und Phospholipid (PL) besteht (Rosen et al., Thromb Haemostas 54, S. 818, 1985). FXa wird in einer von der Menge FVIII:C abhängenden Menge gebildet. Der Test wird wie nachstehend angegeben ausgeführt:
- 1. Eine 50 ul-Probe wird mit 50 ul Aktivierungsreagenz (Gemisch von FIXa/FX und PL) gemischt. Inkubationszeit 10 min, 22ºC.
- 2. 25 ul 25 mM CaCl&sub2; werden zugesetzt und das Gemisch wird 20 Minuten bei 22ºC inkubiert.
- 3. 50 ul chromogenes Substrat (S2222) für FXa werden zugesetzt.
- 4. Nach 15 min Inkubation wird Zitronensäure zugesetzt und die E&sub4;&sub0;&sub5; wird abgelesen.
- Es ist bei der Coatest-Bestimmung nicht möglich, eine enzymatische Aktivierung von FVIII zu verfolgen, da FVIII bei der Bestimmung durch Inkubation mit FIXa/FX, PL und Ca²&spplus; vollständig aktiviert wird.
- FVIII-LC-Antigen (Ag) wird in einem spezifischen Immuntest (Nordfang et al., Thromb Haemostas 53, S. 346, 1985) gemessen. Der Human-Hemm-Antikörper wird auf Mikroplatten beschichtet, die Probe wird zugesetzt und gebundener FVIII-LC wird mit Peroxidase-markiertem F(ab')&sub2;-Fragment von Human-Hemm-IgG nachgewiesen. Normales Humanplasma wird als Standard verwendet.
- FVIII-LC-Antigen (Ag) wird in einem spezifischen Hemmtest gemessen. Hund-Hemm-Antikörper wird auf Mikroplatten mit losen Näpfchen beschichtet. Die Probe und ¹²&sup5;I-markiertes FVIII-HC werden zugesetzt. Die FVIII-HC-Menge in der Probe bestimmt die Menge an gebundenem ¹²&sup5;I-FVIII-HC. Standard ist FVIII-Konzentrat (FVIII Nordisk), das so eingestellt ist, daß es 1 Einheit FVIII-HC je Einheit FVIII:C enthält.
- Die mittels Immuntest bestimmte FVIII-LC- und FVIII-HC-Menge wird relativ angegeben. Das heißt, das Verhältnis zwischen Einheiten FVIII:C, Einheiten FVIII-LCAg und Einheiten FVIII-HCAg für verschiedene FVIII-Typen ist nicht 1 : 1 : 1. Es wird jedoch angenommen, daß die Einheiten aus den verschiedenen Tests vergleichbar sind, daß aber bei einer FVIII-Probe, in der alles Protein mit Coatest gerinnungsaktiv ist, ein gewisser Unterschied zwischen den Einheiten FVIII:C, Einheiten FVIII-LCAg und Einheiten FVIII-HCAg besteht.
- Das Molekulargewicht wird durch reduzierte SDS-PAGE (Laemmli, Nature 227, S. 680, 1970) bestimmt.
- Die FVIII-Probe für Kontrolltests wurde aus FVIII-Konzentrat (siehe WO 84/03628) durch Affinitätschromatographie an Ziege-Anti-von Willebrand-Faktor-Sepharose (Truett et al., DNA 4, S. 333, 1985) hergestellt.
- FVIII-LC kann aus Blutplasma durch mehrere Verfahren (wie z. B. in WO 86/02838 beschrieben) gereinigt werden. Hierbei wird hochkonzentrierter FVIII-LC verwendet, der durch Affinitätschromatographie an monoklonalem 47 IgG aus Nordiocto isoliert wurde, das wie von O. Nordfang et al., Thrombosis and Haemostasis, Bd. 54, S. 586-590, 1985, beschrieben hergestellt wurde. In 200 ml Puffer A (0,02 M Imidazol, 0,15 M NaCl, 10 mM EDTA, pH 7,4) in einer Konzentration von 110 Einheiten/ml VIII-LCAg gelöstes Nordiocto wurde über Nacht mit 7 ml 47 IgG-Sepharose (mit 9 mg IgG/ml verbunden) inkubiert. Das Inkubationsgemisch wurde auf eine Säule gegossen und das Eluat wurde gesammelt. Das Gel wurde mit 40 ml Puffer A und 40 ml Puffer A mit insgesamt 0,65 M NaCl gewaschen. FVIII-LC wurde mit 40 ml 20 mM Imidazol/0,65 M NaCl/10 mM EDTA/50% Ethylenglykol/pH 7,4 eluiert. Eine Peakfraktion von 4 ml wurde gegen 50 mM Imidazol/0,15 M NaCl/10% Glycerin/0,02% NaN&sub3;/pH 7,4 dialysiert. Der Gehalt an FVIII-Bestandteilen in der dialysierten Probe ergibt sich aus Tabelle 1.
- FVIII-HC wird aus einer FVIII-Probe durch Affinitätschromatographie an monoklonaler 56 IgG-Sepharose (hergestellt wie von O. Nordfang et al., Thrombosis and Haemostasis, Bd. 54, S. 586-590, 1985, angegeben) hergestellt. 56 IgG-Sepharose bindet den FVIII-LC/FVIII-HC-Komplex über FVIII-LC. 25 ml der FVIII-Probe mit einem Gehalt von 405 Einheiten/ml FVIII-HCAg wurden über Nacht mit 1,5 ml 56 IgG Sepharose (mit 4 mg 56 IgG/ml verbunden) inkubiert. Das Inkubationsgemisch wurde auf eine Säule gegossen und das Eluat wurde gesammelt. Das Gel wurde mit 5 ml Puffer B (20 mM Imidazol/0,15 M NaCl/10% Glycerin/0,1 M Lysin/pH 7,4), der 0,35 M CaCl&sub2; enthielt, gewaschen. Anschließend wurde das Gel mit 15 ml Puffer B mit einem NaCl-Gesamtgehalt von 0,65 M, gefolgt von 5 ml Puffer B mit 10 mM EDTA und 0,02% NaN&sub3; (EDTA-Puffer) gewaschen. Man ließ das Gel trockenlaufen und inkubierte es 1 Stunde bei Raumtemperatur mit EDTA-Puffer. Nach der Inkubation wurde das FVIII-HC mit 5 ml EDTA-Puffer eluiert. Eine Peakfraktion von 2 ml wurde gegen 50 mM Imidazol/0,15 M NaCl/10% Glycerin/0,02% NaN&sub3;/pH 7,4 dialysiert. Der Gehalt an FVIII-Bestandteilen in der dialysierten Probe ergibt sich aus Tabelle 1. TABELLE 1 FVIII-Fragmente in der dialysierten FVIII-LC-Probe und FVIII-HC-Probe Einheit/ml (Probe A)
- Die Proben A und B wurden durch SDS-PAGE analysiert, siehe die beigefügte Abbildung, in der
- Bahn 1 entspricht Probe A (FVIII-LC) 4 FVIII-LCAg-Einheiten,
- Bahn 2 enthält Molekulargewichtsmarker und
- Bahn 3 entspricht Probe B (FVIII-HC) 8 FVIII-LCAg-Einheiten.
- Das Verfahren der Erfindung wird nachstehend mittels einiger Ausführungsbeispiele veranschaulicht.
- Die Proben A und B wurden in Puffer C (50 mM Imidazol, 0,15 M NaCl, 0,1% BSA, pH 7,4) jeweils 10fach verdünnt. 20 ul A (1 : 10 verdünnt) wurden mit 20 ul B 1 : 10, 3 ul 0,15 M MnCl&sub2; und 40 ul Puffer C gemischt. Nach 48 Stunden Inkubation bei 22ºC enthielt das Inkubationsgemisch mittels Coatest gemessene 1200 m Einheiten VIII:C/ml.
- Der Versuch wurde wie im Beispiel beschrieben mit der Änderung wiederholt, daß 3 ul Puffer C anstelle 3 ul 0,15 M MnCl&sub2; zugesetzt wurden. Nach 48 Stunden Inkubation bei 22ºC enthielt dieses Inkubationsgemisch mittels Coatest gemessen weniger als 5 m Einheiten VIII:C/ml.
- Probe A wurde in Puffer C 40fach verdünnt. 80 ul A (1 : 40 verdünnt) wurden mit 3 ul 0,15 M MnCl&sub2; gemischt. Nach 48 Stunden Inkubation enthielt das Inkubationsgemisch weniger als 5 Einheiten VIII:C/ml. Ähnlich enthielt ein Inkubationsgemisch mit Probe B weniger als 5 m Einheiten VIII:C/ml.
- 80 ul einer in Puffer C 1000fach verdünnten FVIII-Probe wurden mit 3 ul 0,15 M MnCl&sub2; gemischt. Nach 48 Stunden Inkubation wurden 170 m Einheiten VIII:C/ml gemessen. 80 ul einer in Puffer C 1000fach verdünnten FVIII-Probe wurden mit 3 ul Puffer C gemischt. Nach 48 Stunden Inkubation wurden 140 in Einheiten VIII:C/ml gemessen.
- Die Proben A und B wurden in Puffer C jeweils 10fach verdünnt. 20 ul A 1 : 10 wurden mit 20 ul B (1 : 10 verdünnt), 3 ul 2,2 M CaCl&sub2; und 40 ul Puffer C gemischt. Nach 12 Tagen Inkubation bei 22ºC enthielt das Inkubationsgemisch 1300 in Einheiten VIII:C/ml.
- Der Versuch wurde wie vorstehend beschrieben mit der Änderung wiederholt, daß 3 ul Puffer C anstelle 3 ul 2,2 M CaCl&sub2; zugesetzt wurden. Nach 12 Tagen Inkubation bei 22ºC enthielt dieses Inkubationsgemisch weniger als 5 in Einheiten VIII:C/ml.
- Die Proben A und B wurden in Puffer C jeweils 100fach verdünnt. 100 ul A und 100 ul B wurden gemischt. 50 ul des Gemisches wurden wie vorstehend beschrieben mit Coatest getestet. In dem Gemisch wurden 1,5 in Einheiten/ml gemessen. Weiter wurden 50 ul des Gemisches mit modifiziertem Coatest mit 1 Stunde Vorinkubation mit FIXa/FX vor der Zugabe von PL getestet. Dadurch nahm die Coatest-Aktivität auf 3,0 in Einheiten/ml zu.
- Die FVIII-Probe wurde in Puffer C 30000fach verdünnt. 50 ul der verdünnten Probe wurden mit Coatest wie vorstehend beschrieben getestet. Es wurden 3,4 in Einheiten/ml gemessen.
- Weiter wurden 50 ul der verdünnten FVIII-Probe mit modifiziertem Coatest mit 1 Stunde Vorinkubation mit FIXa/FX vor der Zugabe von PL getestet. Bei der verdünnten FVIII-Probe wurden 3,8 m Einheiten/ml gemessen.
- Wenn ein Versuch wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt wurde, wurden nach 24 Stunden Inkubation 1000 in Einheiten VIII:C/ml gemessen. Wenn 40 ul FIXa/FX anstelle von 40 ul Puffer c zugesetzt wurden, wurden nach 24 Stunden Inkubation 1600 in Einheiten/ml gemessen.
- Der Versuch wurde wie in Beispiel 1, erster Vergleichsversuch, beschrieben, ausgeführt. Nach 24 Stunden Inkubation wurden weniger als 5 in Einheiten/ml in der Inkubationsmischung gemessen.
- 40 ul in Puffer C 500fach verdünnte FVIII-Probe wurden mit 40 ul FIXa/FX und 3 ul 0,15 M Mn²&spplus; gemischt. Nach 24 Stunden Inkubation wurden 120 in Einheiten/ml gemessen. Wenn 40 ul FIXa/FX durch 40 ul Puffer C ersetzt wurden, wurden 170 in Einheiten/ml gemessen. Wenn zusätzlich 3 ul 0,15 M Mn²&spplus; durch 3 ul Puffer C ersetzt wurden, wurden 140 in Einheiten/ml gemessen.
- Die Proben A und B wurden in Puffer C jeweils 20fach verdünnt. 20 ul A 1/20 wurden mit 20 ul B 1/20, 40 ul FIXa/FX und 3 ul 0,15 M CaCl&sub2; gemischt. Nach 4 Stunden Inkubation bei 22ºC enthielt das Inkubationsgemisch 199 mU FVIII:C/ml. Wenn in dem Gemisch FIXa/FX durch 40 ul Puffer C ersetzt wurde, wurden auf 4 Stunden Inkubation folgend 43 mU FVIII:C/ml gemessen.
- 800 Einheiten FVIII-LC:Ag/ml beziehungsweise 850 Einheiten FVIII-HC:Ag/ml enthaltende FVIII-LC- und FVIII-HC-Proben wurden jeweils 3fach verdünnt. 20 ul FVIII-LC 1/3 wurden mit 20 ul FVIII-HC 1/3 und 10 ul Me²&spplus; gemischt. In Gemisch A war Me²&spplus; 25 m Mn²&spplus;. In Gemisch B war Me²&spplus; 250 mM Ca²+ und in Gemisch C war Me²&spplus; 25 mM Mn²&spplus; und 250 mM Ca²&spplus;. Nach 24 Stunden Inkubation enthielt Gemisch A 10,3 Einheiten FVIII:C/ml, Gemisch B enthielt 4,0 Einheiten und Gemisch C enthielt 12,9 Einheiten FVIII:C/ml. Nach 144 Stunden enthielten die Inkubationsgeinische A, B und C 6,6 Einheiten, 6,5 Einheiten beziehungsweise 11,9 Einheiten FVIII:C/ml.
- COS-Zellen wurden mit dem Plasmid pSVF8-80 transfiziert, das eine 80 kD-Kette exprimiert; s. DK-Patentanmeldung 0428/87. Der Überstand aus der Kultur, der 870 in Einheiten FVIII-LC:Ag/ml enthielt, wurde mit plasmagereinigtem FVIII-HC auf eine Endkonzentration von 20 Einheiten/ml FVIII-HC:Ag und Mn²&spplus; auf eine Endkonzentration von 5 mM ergänzt. Nach 24 Stunden Inkubation bei 22ºC enthielt das Gemisch 137 in Einheiten FVIII:C/ml. Wenn plasmagereinigtes FVIII-LC in einer Konzentration von 1000 in Einheiten FVIII-LC:Ag/ml entsprechend mit FVIII-HC und Mn²&spplus; ergänzt wurde, enthielt das Inkubationsgemisch nach 24 Stunden Inkubation 33 in Einheiten FVIII:C/ml. Wenn der Kulturüberstand nur mit Mn²&spplus; und nicht mit FVIII-HC ergänzt wurde, enthielt das Gemisch nach 24 Stunden Inkubation weniger als 2,5 m Einheiten FVIII:C/ml.
- 25 ul FVIII-LC wurden in Puffer C mit 25 ul FVIII-HC, 7 ul MnCl&sub2; und 10 ul Redoxmittel unter Erhalten in Tabelle 2 angegebener Endkonzentrationen der Einzelbestandteile gemischt. FVIII:C wurde nach 5 Stunden Inkubation bei 20ºC gemessen. TABELLE 2 Rekombination von FVIII-LC und FVIII-HC in Anwesenheit eines Redoxmittels Einheiten/ml Redoxmittel in Bezug auf nach 5 Stunden keines
- Bei den angegebenen Konzentrationen von DDT (Dithiothreit), ME (Mercaptoethanol) und Cys (Cystein) besteht in wäßrigem Puffer ein Gleichgewicht zwischen der oxidierenden und reduzierenden Form.
- FVIII-HC wurde wie vorstehend beschrieben und mit der Abänderung hergestellt, daß der EDTA-Elutionspuffer und der Dialysepuffer mit 50 uM Mercaptoethanol gemischt wurden. Nach der Verdünnung wurde die Rekombination mit den FVIII-HC-Proben bei 20 Stunden Inkubation in Puffer C bei Raumtemperatur unter Zusatz von Mercaptoethanol auf 35 uM, MnCl&sub2; auf 5 mM und FVIII-LC auf 22 Einheiten/ml FVIII-LC:Ag ausgeführt.
- Tabelle 3 zeigt die Rekombination mit den beiden FVIII-HC-Probetypen. TABELLE 3 Einheiten/ml im Rekombinationsgemisch %FVIII:C in Bezug auf FVIII-HC:Ag nach 20 Stunden Probe 1, wie vorstehend beschrieben hergestellt Probe 2, wie vorstehend beschrieben hergestellt Probe 3, wie in diesem Beispiel beschrieben mit ME hergestellt
- Ein Inkubationsgemisch der folgenden Zusammensetzung wurde in Puffer C aus abgetrennten FVIII-Fragmenten hergestellt: 60 Einheiten/ml FVIII-LC, 60 Einheiten/ml FVIII-HC, 50 mM CaCl&sub2;, 2 Einheiten/ml FX.
- Nach 20 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurden 6,9 Einheiten/ml FVIII:C gemessen. In einem entsprechenden Inkubationsgemisch ohne FX wurden nach 20 Stunden Inkubation bei 20ºC 0,59 FVIII:C mU/ml gemessen.
Claims (10)
1. Verfahren zur Herstellung eines gerinnungsaktiven
Komplexes eines N-terminalen Fragments von Faktor VIII mit
einem Molekulargewicht von 92 bis 210 kD und eines
C-terminalen Fragments von Faktor VIII mit einem
Molekulargewicht von 80 bis 70 kD, dadurch gekennzeichnet, daß
man die beiden Fragmente miteinander in Gegenwart eines
oder mehrerer überbrückender Elemente, kombiniert mit
wenigstens einem Redox-Mittel, reagieren läßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
N-terminale Fragment eine schwere Kette mit einem
Molekulargewicht von etwa 92 kD ist und das C-terminale Fragment
eine leichte Kette mit einem Molekulargewicht von etwa
80 kD ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß ein Fragment oder beide Fragmente derivatisiert
ist/sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die
Derivatisierung den Ersatz einer oder mehrerer
cys-Aminosäuren durch eine andere Aminosäure, vorzugsweise Serin,
umfaßt.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß
eine schwere FVIII-Kette und/oder eine leichte FVIII-Kette
mit einer Substanz, die Reaktionsfähigkeit gegenüber
Verbindungen
besitzt, die die Gruppe -SH und/oder -S-S-
enthalten, behandelt wird/werden.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß ein Fragment oder beide Fragmente
biosynthetisch erzeugt wird/ werden.
7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß das überbrückende Element ein oder
mehrere zweiwertige Metall-Ionen ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das
überbrückende Element Mn²&spplus;, Ca²&spplus; oder Co²&spplus; ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
Redoxmittel DTT, Mercaptoethanol oder Cystein oder eine
Kombination aus diesen ist.
10. Gerinnungsaktives Präparat, umfassend einen Komplex eines
N-terminalen Fragments von Faktor VIII mit einem
Molekulargewicht von 92 bis 210 kD und eines C-terminalen
Fragments von Faktor VIII mit einem Molekulargewicht von 80
bis 70 kD, überbrückt mit Mn&spplus;&spplus; oder einer Kombination aus
Mn&spplus;&spplus; und Ca&spplus;&spplus;.
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