ES2323644T3

ES2323644T3 - Desaturasas de acidos grasos procedentes de primula.

Info

Publication number: ES2323644T3
Application number: ES04781601T
Authority: ES
Inventors: Virginia Ursin; Byron Froman; Jennifer Gonzales; Steven E. Screen; Fenggao Dong; Thomas J. La Rosa
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2003-08-21
Filing date: 2004-08-20
Publication date: 2009-07-22
Anticipated expiration: 2024-08-20
Also published as: EP1656449A1; US20130041032A1; US10174297B2; ZA200601438B; US8221819B2; CA2881252A1; US11041148B2; AU2004268196A1; MXPA06002028A; CN1871353B; US9701947B2; BRPI0413786B1; US20130041031A1; EP1656449B1; PT1656449E; CA2535310A1; DK1656449T3; US20170283780A1; BRPI0413786A; DE602004021001D1

Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, en el que el polinucleótido se selecciona de: (a) un polinucleótido que codifica la secuencia del polipéptido de SEC. ID Nº: 4 ó SEC. ID Nº: 5; (b) un polinucleótido que comprende la secuencia del ácido nucleico de SEC. ID Nº: 2 ó SEC. ID Nº: 3; y (c) un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 92% de similitud de secuencia con una secuencia del polipéptido de SEC. ID Nº: 4 ó SEC. ID Nº: 5.

Description

Desaturasas de ácidos grasos procedentes de Primula.

1. Campo de la invención

La invención se refiere, en general, a las enzimas desaturasas que modulan el número y la localización de los enlaces dobles en ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA). En particular, la invención se refiere a la mejora de los perfiles de ácidos grasos usando las enzimas desaturasas y a los ácidos nucleicos que codifican tales enzimas desaturasas.

2. Descripción de la técnica relacionada

Los productos principales de la biosíntesis de ácidos grasos en la mayoría de los organismos son compuestos de 16 y 18 carbonos. La proporción relativa de longitudes de cadena y el grado de insaturación de estos ácidos grasos varía ampliamente entre las especies. Los mamíferos, por ejemplo, producen principalmente ácidos grasos saturados y monoinsaturados, mientras que la mayoría de las plantas superiores producen ácidos grasos con uno, dos o tres enlaces dobles, comprendiendo los dos últimos los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA).

Dos familias principales de PUFA son los ácidos grasos omega-3 (también representados como ácidos grasos "n-3"), ejemplificados por el ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:4, n-3), y los ácidos grasos omega-6 (también representados como ácidos grasos "n-6"), ejemplificados por el ácido araquidónico (ARA, 20:4, n-6). Los PUFA son componentes importantes de la membrana plasmática de la célula y del tejido adiposo, donde pueden encontrarse en formas tales como fosfolípidos y como triglicéridos, respectivamente. Los PUFA son necesarios para el desarrollo adecuado en mamíferos, en particular en el cerebro infantil en desarrollo y para la formación y la reparación de tejidos.

Varios trastornos responden al tratamiento con ácidos grasos. Se ha demostrado que la suplementación con PUFA reduce el índice del reestenosis después de la angioplastia. También se han documentado bien las ventajas para la salud de ciertos ácidos grasos omega-3 de la dieta para la enfermedad cardiovascular y la artritis reumatoide (Simopoulos, 1997; James y col., 2000). Además, se ha sugerido el uso de los PUFA en los tratamientos para el asma y la psoriasis. Las evidencias indican que los PUFA pueden estar involucrados en el metabolismo del calcio, sugiriendo que los PUFA pueden ser útiles en el tratamiento o la prevención de la osteoporosis y de los cálculos renales o del tracto urinario. La mayor parte de las evidencias de las ventajas para la salud se aplica a las grasas omega-3 de cadena larga, al EPA y al ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6) que están en el pescado y el aceite de pescado. Con esta base de evidencias, las autoridades sanitarias y los nutricionistas en Canadá (Scientific Review Committee, 1990, Nutrition Recommendations, Minister of National Health and Welfare, Canadá, Ottawa), Europa (de Deckerer y col., 1998), el Reino Unido (The British Nutrition Foundation, 1992, Unsaturated fatty-acids - nutritional and physiological significance: The report of the British Nutrition Foundation's Task Force, Chapman and Hall, Londres), y los Estados Unidos (Simopoulos y col., 1999) han recomendado el consumo aumentado de estos PUFA en la dieta.

Los PUFA también pueden utilizarse para tratar la diabetes (Patente de EEUU Nº 4.826.877; Horrobin y col., 1993). Se ha demostrado la alteración del metabolismo y la composición de los ácidos grasos en animales diabéticos. Se ha sugerido que estas alteraciones están involucradas en algunas de las complicaciones a largo plazo que son resultado de la diabetes, incluidos la retinopatía, la neuropatía, la nefropatía y el daño del sistema reproductivo. Se ha demostrado que el aceite de prímula, que contiene ácido \gamma-linolénico (GLA, 18:3, \Delta6, 9, 12), previene y revierte los daños de los nervios por la diabetes.

Los PUFA, tales como el ácido linoleico (LA, 18:2, \Delta9, 12) y el ácido \alpha-linolénico (ALA, 18:3, \Delta9, 12, 15), se consideran ácidos grasos esenciales en la dieta porque los mamíferos carecen de la capacidad para sintetizar estos ácidos. Sin embargo, cuando se ingieren, los mamíferos tienen la capacidad para metabolizar el LA y el ALA para formar las familias n-6 y n-3 de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA). Estos LC-PUFA son componentes celulares importantes que confieren fluidez a las membranas y que funcionan como precursores de eicosanoides biológicamente activos tales como las prostaglandinas, las prostaciclinas y los leucotrienos, que regulan funciones fisiológicas normales. El ácido araquidónico es el principal precursor para la síntesis de eicosanoides, que incluyen leucotrienos, prostaglandinas y tromboxanos, y que también desempeñan una función en el proceso de inflamación. Se ha demostrado que la administración de un ácido graso omega-3, tal como el SDA, inhibe la biosíntesis de los leucotrienos (Patente de EEUU Nº 5.158.975). Se ha demostrado que el consumo de SDA da lugar a una disminución en los niveles sanguíneos de las citocinas proinflamatorias TNF-\alpha e IL-1\beta (PCT US 0306870).

En los mamíferos, la formación de LC-PUFA está limitada por la etapa de desaturación \Delta6, que convierte el LA en ácido \gamma-linolénico (GLA, 18:3, \Delta6, 9, 12) y el ALA en SDA (18:4, \Delta6, 9, 12, 15). Se ha demostrado que muchas condiciones fisiológicas y patológicas deprimen esta etapa metabólica incluso más, y por consiguiente, la producción de LC-PUFA. Para superar la etapa limitante y aumentar los niveles tisulares de EPA, podrían consumirse grandes cantidades de ALA. Sin embargo, el consumo de cantidades sólo moderadas de SDA proporciona una fuente eficaz de EPA, pues el SDA es aproximadamente cuatro veces más eficaz que el ALA para elevar los niveles tisulares de EPA en los seres humanos (Solicitud de EEUU Nº de Serie 10/384.369, en trámite). En los mismos estudios, la administración de SDA pudo también aumentar los niveles tisulares de ácido docosapentaenoico (DPA), que es un producto del alargamiento del EPA. Como alternativa, evitando la \Delta6-desaturación a través de la suplementación de la dieta con EPA o DHA se puede aliviar eficazmente muchas enfermedades patológicas asociadas con los niveles bajos de PUFA. Sin embargo, como se establece más detalladamente a continuación, las fuentes de PUFA actualmente disponibles no son deseables por una multiplicidad de razones. La necesidad de una fuente confiable y económica de PUFA ha estimulado el interés en fuentes alternativas de PUFA.

Los principales PUFA de cadena larga de importancia incluyen DHA y EPA, que se encuentran sobre todo en diferentes tipos de aceite de pescado, y ARA, que se encuentra en hongos filamentosos tales como Mortierella. Para el DHA, existe una serie de fuentes para la producción comercial incluidos una diversidad de mamíferos marinos, aceites obtenidos de peces marinos de agua fría, y fracciones de la yema del huevo. Las fuentes comerciales de SDA incluyen los géneros de plantas Trichodesma, Borago (borraja) y Echium. Sin embargo, hay varias desventajas asociadas con la producción comercial de los PUFA a partir de fuentes naturales. Las fuentes naturales de PUFA, tales como animales y plantas, tienden a tener composiciones de aceites altamente heterogéneas. Los aceites obtenidos de estas fuentes pueden requerir, por consiguiente, extensa purificación para separar uno o más PUFA deseados o para producir un aceite que esté enriquecido en uno o más PUFA.

Las fuentes naturales de PUFA también están sometidas a fluctuaciones de disponibilidad incontrolables. Las poblaciones de peces pueden experimentar variación natural o pueden agotarse por sobreexplotación pesquera. Además, incluso con evidencias abrumadoras de sus ventajas terapéuticas, no se presta atención a las recomendaciones dietéticas con respecto a los ácidos grasos omega-3. Los aceites de los pescados tienen sabor y olor desagradable, que pueden ser imposibles de separar económicamente del producto deseado, y pueden convertir a tales productos en inaceptables como suplementos de alimentos. Los aceites de animales, y particularmente los aceites de pescado, pueden acumular agentes contaminantes ambientales. Los alimentos pueden enriquecerse con aceites de pescados, pero una vez más, tal enriquecimiento es problemático por el coste y la disminución de las poblaciones de peces en todo el mundo. Este problema es también un impedimento para el consumo y la ingesta de pescados enteros. No obstante, si los mensajes de salud para aumentar la ingesta de pescados fueran adoptados por las comunidades, habría probablemente un problema para satisfacer la reivindicación de pescados. Además, hay problemas con la sostenibilidad de esta industria, que se basa fundamentalmente en las poblaciones de peces salvajes para la alimentación de la acuicultura (Naylor y col., 2000).

Otras limitaciones naturales favorecen un nuevo enfoque para la producción de ácidos grasos omega-3. El tiempo y las enfermedades pueden causar fluctuación en las producciones de las fuentes de pescados y de plantas. El terreno de cultivo disponible para la producción de cosechas productoras de aceite alternativos está sometido a la competencia de la constante extensión de las poblaciones humanas y a la creciente necesidad asociada de producción de alimentos en la tierra cultivable restante. Las cosechas que producen PUFA, tales como la borraja, no se han adaptado al crecimiento comercial y pueden no tener buenos resultados en monocultivo. El crecimiento de tales cosechas no es, por consiguiente, económicamente competitivo donde pueden crecer cosechas más provechosas y mejor establecidas. La fermentación a gran escala de organismos tales como Mortierella es también costosa. Los tejidos naturales de los animales contienen bajas cantidades de ARA y son difíciles de procesar. Los microorganismos tales como Porphyridium y Mortierella son difíciles de cultivar a escala comercial.

Una serie de enzimas están involucradas en la biosíntesis de los PUFA. El LA (18:2, \Delta9, 12) se produce a partir del ácido oleico (OA, 18:1, \Delta9) por una \Delta12-desaturasa mientras que el ALA (18:3, \Delta9, 12, 15) se produce a partir del LA por una \Delta15-desaturasa. El SDA (18:4, \Delta6, 9, 12, 15) y el GLA (18:3, \Delta6, 9, 12) se producen a partir del LA y del ALA por una \Delta6-desaturasa. Sin embargo, como se estableció anteriormente, los mamíferos no pueden desaturar más allá de la posición \Delta9 y por consiguiente no pueden convertir el ácido oleico en LA. Asimismo, el ALA no puede ser sintetizado por los mamíferos. Otros eucariotas, incluidos hongos y plantas, tienen enzimas que desaturan en la posición del carbono 12 y del carbono 15. Los principales ácidos grasos poliinsaturados de los animales derivan por consiguiente de la dieta a través de la posterior desaturación y el alargamiento del LA y del ALA de la
dieta.

Se han descrito diversos genes que codifican desaturasas. Por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 5.952.544 describe fragmentos de ácido nucleico aislados y clonados de Brassica napus que codifican las enzimas desaturasas de ácidos grasos. La expresión de los fragmentos de ácido nucleico de la patente 5.952.544 dio como resultado la acumulación de ALA. Sin embargo, en plantas transgénicas que expresan la \Delta15-desaturasa de B. napus, queda una cantidad considerable de LA sin convertir por la desaturasa. Serían ventajosas enzimas más activas que conviertan mayores cantidades de LA en ALA. Los niveles aumentados de ALA permiten que una \Delta6-desaturasa, cuando se expresa conjuntamente con un ácido nucleico que codifica la \Delta15-desaturasa, actúe sobre el ALA, produciendo de esta manera mayores niveles de SDA. Por la multiplicidad de usos ventajosos para el SDA, existe una necesidad de crear un aumento sustancial en la producción de SDA.

Se han buscado los ácidos nucleicos de una serie de fuentes para uso en el aumento de la producción del SDA. Sin embargo, aún se necesitan innovaciones que permitan una mejor producción comercial en cosechas basadas en la tierra (véase, por ejemplo, Reed y col., 2000). Además, el uso de los polinucleótidos de desaturasas derivadas de organismos tales como Caenorhabditis elegans (Meesapyodsuk y col., 2000) no es ideal para la producción comercial de aceites de semillas de plantas enriquecidos. Se han aislado los genes que codifican las \Delta6-desaturasas de dos especies de Primula, P. farinosa y P. vialii, y se ha encontrado que estos son activos en levaduras, pero no se ha demostrado la función en plantas (Sayanova y col., 2003).

Por consiguiente, sería ventajoso obtener el material genético implicado en la biosíntesis de PUFA y expresar el material aislado en un sistema de planta, en particular, un sistema de planta de cosecha terrestre basado en el terreno, que pueda manipularse para proporcionar la producción de cantidades comerciales de uno o más PUFA. Hay también una necesidad de aumentar la ingesta de grasas omega-3 en seres humanos y animales. Por consiguiente, hay una necesidad de proporcionar una amplia variedad de alimentos enriquecidos en omega-3 y de suplementos de alimentos para que los individuos puedan elegir la alimentación, los ingredientes de la alimentación, el alimento y los ingredientes del alimento que satisfacen sus hábitos dietéticos usuales. Serían particularmente ventajosos los aceites de semillas con SDA aumentado.

Actualmente hay sólo un ácido graso omega-3, ALA, disponible en los aceites vegetales. Sin embargo, hay pobre conversión del ALA ingerido en ácidos grasos omega-3 de cadena larga tales como EPA y DHA. Se ha demostrado en la Solicitud de EEUU Nº de Serie 10/384.369, en trámite, para "Treatment And Prevention Of Inflammatory Disorders", que elevando la ingesta de ALA del promedio de la comunidad de 1 g/día a 14 g/día por medio del uso de aceite de linaza, los niveles plasmáticos del fosfolípido EPA aumentaron sólo modestamente. Un aumento de 14 veces en la ingesta de ALA dio como resultado un aumento de 2 veces en el fosfolípido EPA del plasma (Manzioris y col., 1994). Por consiguiente, para ese fin, existe una necesidad de una producción eficaz y comercialmente viable de PUFA que use desaturasas de ácidos grasos, los genes que las codifican, y los procedimientos recombinantes para producirlas. Existe también una necesidad de aceites que contengan proporciones relativas mayores de PUFA específicos, y de composiciones de alimentos y suplementos que los contengan. También existe una necesidad de procedimientos económicos y confiables para producir PUFA específicos.

A pesar de las ineficacias y los bajos rendimientos como se describió anteriormente, la producción de ácidos grasos omega-3 a través de la cadena de alimentos terrestres es una empresa ventajosa para la salud pública y, en particular, la producción de SDA. El SDA es importante porque, como se describió anteriormente, hay baja conversión de ALA en EPA. Esto es porque la enzima inicial en la conversión, la \Delta6-desaturasa, tiene actividad baja en los seres humanos y es limitante. La evidencia de que la \Delta6-desaturasa es limitante está proporcionada por los estudios que demuestran que la conversión de su sustrato, ALA, es menos eficaz que la conversión de su producto, SDA en EPA en ratones y en ratas (Yamazaki y col., 1992; Huang, 1991).

Basándose en tales estudios, se observa que en cosechas comerciales de oleaginosas, tales como canola, soya, maíz, girasol, alazor, o lino, la conversión de alguna fracción de los ácidos grasos mono y poliinsaturados que caracterizan sus aceites de semilla en SDA requiere la expresión específica de semilla de las múltiples enzimas desaturasas, incluidas \Delta6-, \Delta12- y/o \Delta15-desaturasas. Los aceites derivados de plantas que expresan niveles elevados de \Delta6, \Delta12, y \Delta15-desaturasas son ricos en SDA y otros ácidos grasos omega-3. Tales aceites pueden utilizarse para producir alimentos y suplementos de alimentos enriquecidos en ácidos grasos omega-3 y el consumo de tales alimentos aumenta eficazmente los niveles tisulares de EPA y DHA. Los alimentos y los productos alimenticios, tales como la leche, la margarina y las salchichas, hechos totalmente o preparados con aceites enriquecidos en omega-3, darán como resultado ventajas terapéuticas. Se ha demostrado que los individuos pueden tener una ingesta de omega-3 comparable a EPA y a DHA de al menos 1,8 g/día sin alterar sus hábitos dietéticos utilizando los alimentos que contienen aceites enriquecidos con ácidos grasos omega-3. Por consiguiente, existe una fuerte necesidad de ácidos nucleicos nuevos de \Delta6-desaturasas para uso en plantas de cultivo transgénico con aceites enriquecidos en PUFA, así como de los aceites mejorados producidos de ese modo.

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Resumen de la invención

En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido capaz de desaturar una molécula de ácido graso en el carbono 6 (\Delta6-desaturasa). Estos pueden utilizarse para transformar células o para modificar la composición de ácidos grasos de una planta o del aceite producido por una planta. Una forma de realización de la invención es una secuencia aislada de polinucleótidos aislada de una especie de Primula que tiene actividad desaturasa única. En ciertas formas de realización, los polinucleótidos aislados se aíslan, por ejemplo, de Primula juliae, P. alpicola, P. waltonii, P. farinosa o P. florindae. En otras ciertas formas de realización de la invención, los polinucleótidos codifican un polipéptido que tiene al menos 92% de similitud de secuencia con la secuencia del polipéptido de SEC. ID Nº: 4 ó SEC. ID Nº: 5, incluidos al menos aproximadamente 95%, 98% y 99% de homología con estas secuencias. Los expertos en la técnica reconocerán que, como estas secuencias están relacionadas, un polipéptido dado puede compartir simultáneamente una homología del 92% o mayor con más de una de estas secuencias de polipéptidos. En ciertas formas de realización, una secuencia proporcionada por la invención tiene una selectividad de sustrato para el ácido \alpha-linolénico en comparación con el ácido linoleico, como se describe en este documento. En otras formas de realización, hay al menos una selectividad de sustrato 2:1 para el ácido \alpha-linolénico en comparación con el ácido linoleico, incluidos desde aproximadamente 2:1 hasta aproximadamente 2,9:1.

En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por: (a) un polinucleótido que codifica el polipéptido del SEC. ID Nº: 4, o SEC. ID Nº: 5; (b) un polinucleótido que comprende la secuencia del ácido nucleico de SEC. ID Nº: 2, o SEC. ID Nº: 3; y (c) un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 92% de similitud de secuencia con una secuencia de polipéptido de SEC. ID Nº: 4, o SEC. ID Nº: 5.

En aún otro aspecto, la invención proporciona un vector recombinante que comprende un polinucleótido aislado según la invención. El término "vector recombinante" según se utiliza en este documento, incluye cualquier segmento de ADN recombinante que uno desee introducir en una célula huésped, un tejido y/u organismo, e incluye específicamente las casetes de expresión aisladas de un polinucleótido de partida. Un vector recombinante puede ser lineal o circular. En diversos aspectos, un vector recombinante puede comprender al menos una secuencia adicional elegida del grupo constituido por: secuencias reguladoras acopladas de manera operativa al polinucleótido; marcadores de selección acoplados de manera operativa al polinucleótido; secuencias de marcadores acopladas de manera operativa al polinucleótido; un resto de purificación acoplado de manera operativa al polinucleótido; y una secuencia marcadora acoplada de manera operativa al polinucleótido.

En aún otro aspecto, la invención proporciona células, tales como células de mamíferos, de plantas, de insectos, de levaduras y de bacterias transformadas con los polinucleótidos de la presente invención. En otra forma de realización, las células se transforman con los vectores recombinantes que contienen promotores constitutivos y específicos de tejido además de los polinucleótidos de la presente invención. En ciertas formas de realización de la invención, tales células pueden definirse además como transformadas con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 12 y/o 15.

La invención también proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº: 4, o SEC. ID Nº: 5; o uno de sus fragmentos que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6.

Aún otro aspecto de la invención proporciona un procedimiento para producir aceites de semillas que contienen ácidos grasos omega-3 a partir de semillas de plantas, que comprende las etapas de (a) obtener las semillas de una planta según la invención; y (b) extraer el aceite de dichas semillas. Los ejemplos de tales plantas incluyen la canola, la soya, las semillas de soya, la colza, el girasol, el algodón, el cacao, el cacahuete, el alazor, el coco, el lino, la palma de aceite, oleaginosa Brassica napus, y maíz. Los procedimientos de preferencia para transformar tales células de plantas incluyen el uso de los plásmidos Ti y Ri de Agrobacterium, la electroporación y el bombardeo balístico de alta velocidad.

En aún otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir una planta que comprende el aceite de la semilla que contiene niveles alterados de ácidos grasos omega-3 que comprende introducir un vector recombinante de la invención en una planta productora de aceite. En el procedimiento, introducir el vector recombinante puede comprender la transformación genética. En la forma de realización, la transformación comprende las etapas de: (a) transformar una célula de la planta con un vector recombinante de la invención; y (b) regenerar la planta a partir de la célula de la planta, en la que la planta tiene niveles alterados de ácidos grasos omega-3 en comparación con una planta correspondiente del mismo genotipo que no se ha transformado con el vector. En el procedimiento, la planta puede, por ejemplo, seleccionarse del grupo constituido por Arabidopsis thaliana, la oleaginosa Brassica, la colza, el girasol, el alazor, la canola, el maíz, la soya, el algodón, el lino, la jojoba, el árbol del sebo de China, el tabaco, el cacao, el cacahuete, las plantas frutales, las plantas de cítricos, y las plantas que producen nueces y bayas. La planta puede definirse además como transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 12 y/o 15. La planta puede comprender SDA aumentado. El procedimiento puede comprender además introducir el vector recombinante en una pluralidad de plantas productoras de aceite y seleccionar las plantas o sus progenies que heredan el vector recombinante para una planta que tiene un perfil deseado de ácidos grasos omega-3.

En aún otro aspecto, la invención proporciona un aceite de semilla endógeno de la soya que tiene un contenido de SDA de aproximadamente desde 5% hasta aproximadamente 50% y un contenido de ácido gamma linoleico inferior a aproximadamente 10%. El contenido de SDA puede, en ciertas formas de realización, definirse además como desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 32%, desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 35%, desde aproximadamente 15% hasta aproximadamente 30%, desde aproximadamente 22% hasta aproximadamente 30%, y desde aproximadamente 22% hasta aproximadamente 40%. El contenido de ácido gamma linoleico puede, en otras formas de realización, definirse como menos que aproximadamente 10, 8, 5 y/o aproximadamente 3%. En formas de realización particulares, el contenido de ácido estearidónico pueden ser desde aproximadamente 15% hasta aproximadamente 35% y el contenido de ácido gamma linoleico menos que 5%. En aún otras formas de realización, la semilla puede comprender una proporción de ácidos grasos omega-3 a omega-6 de desde aproximadamente 0,35:1 hasta aproximadamente 3,5:1, incluidos desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 3,5:1 y desde aproximadamente 2:1 hasta aproximadamente 3,5:1.

En aún otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para aumentar el valor nutritivo de un producto comestible para el consumo humana o animal, que comprende añadir un aceite de semilla de soya proporcionado por la invención al producto comestible. En ciertas formas de realización, el producto es alimento para seres humanos y/o pienso para animales. El producto comestible puede también ser pienso para animales y/o un suplemento del alimento. En el procedimiento, el aceite de semilla de soya puede aumentar el contenido de SDA del producto comestible y/o puede aumentar la proporción de ácidos grasos omega-3 a omega-6 del producto comestible. El producto comestible puede carecer de SDA antes de añadir el aceite de semilla de soya.

En aún otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para fabricar alimento o pienso, que comprende añadir un aceite de semilla de soya proporcionado por la invención a ingredientes de partida del alimento o del pienso para producir el alimento o el pienso. En ciertas formas de realización, el procedimiento se define además como un procedimiento para fabricar el alimento y/o pienso. La invención también proporciona el alimento o el pienso fabricado por medio del procedimiento.

En aún otro aspecto, la invención comprende un procedimiento para proporcionar SDA a un ser humano o a un animal, que comprende administrar el aceite de semilla de soya de la reivindicación 1 a dicho ser humano o animal. En el procedimiento, el aceite de semilla de soya puede administrarse en una composición comestible, incluidos el alimento o el pienso. Los ejemplos de alimento incluyen las bebidas, los alimentos infundidos, las salsas, los condimentos, las aderezos de ensalada, los zumos de frutas, los jarabes, los postres, los glaseados y los rellenos, los productos congelados suaves, los dulces o alimento intermedio. La composición comestible puede ser sustancialmente un líquido o un sólido. La composición comestible puede ser también un suplemento del alimento y/o nutracéutico. En el procedimiento, el aceite de semilla de soya puede administrarse a un ser humano y/o a un animal. Los ejemplos de animales a los que se puede administrar el aceite incluyen el ganado o las aves de corral.

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Breve descripción de las figuras

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar más ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las formas de realización específicas presentadas en este documento.

La Fig. 1 muestra la alineación de \Delta6 desaturasas de Primula juliae PjD6D-1 y PjD6D-2 (SEC. ID Nº: 4 y 5), Primula alpicola Pa6D-1 y Pa6D-2 (SEC. ID Nº: 22 y 24), Primula waltonii PwD6D (SEC. ID Nº: 26), Primula farinosa D6D-2 (SEC. ID Nº: 46), Primula florindae D6D (SEC. ID Nº: 48), Borago oficinalis D6D (SEC. ID Nº: 59) y Echium gentianoides D6D (SEC. ID Nº: 60).

La Fig. 2 muestra el mapa del vector pMON67011.

La Fig. 3 muestra el mapa del vector pMON83950.

La Fig. 4 muestra el mapa del vector pMON77245.

La Fig. 5 muestra el mapa del vector pMON77247.

La Fig. 6 muestra el mapa del vector pMON82821.

La Fig. 7 muestra el mapa del vector pMON82822.

La Fig. 8 muestra el mapa del vector pMON83961.

La Fig. 9 muestra el mapa del vector pMON83962.

La Fig. 10 muestra el mapa del vector pMON83963.

La Fig. 11 muestra el mapa del vector pMON83964.

La Fig. 12 muestra el mapa del vector pMON83965.

La Fig. 13 muestra el mapa del vector pMON83966.

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Descripción detallada de la invención

La invención supera las limitaciones de la técnica anterior proporcionando procedimientos y composiciones para la creación de plantas con contenido mejorado de PUFA. La modificación del contenido de ácidos grasos de un organismo tal como una planta presenta muchas ventajas, incluidas la mejor nutrición y ventajas en la salud. La modificación del contenido de ácidos grasos puede utilizarse para alcanzar niveles o perfiles ventajosos de los PUFA deseados en plantas, partes de plantas y productos de plantas, incluidos los aceites de semillas de plantas. Por ejemplo, cuando se producen los PUFA deseados en el tejido de la semilla de una planta, el aceite puede aislarse de las semillas dando como resultado típicamente un aceite alto en los PUFA deseados o un aceite que tiene un contenido o un perfil deseado de ácidos grasos, que pueden a su vez utilizarse para proporcionar características ventajosas en productos alimenticios y otros productos. La invención proporciona en formas de realización particulares aceite de soya endógeno que tiene SDA mientras que contiene también un contenido ventajoso de ácido oleico.

Diversos aspectos de la invención incluyen procedimientos y composiciones para la modificación del contenido de PUFA de una célula, por ejemplo, modificación del contenido de PUFA de una célula(s) de plantas. Las composiciones relacionadas con la invención incluyen nuevas secuencias de polinucleótidos aisladas, construcciones de polinucleótidos y plantas y/o partes de plantas transformadas por los polinucleótidos de la invención. El polinucleótido aislado puede codificar desaturasas de ácidos grasos de Primula y, en particular, puede codificar una \Delta6-desaturasa de Primula. Las células huésped pueden manipularse para expresar un polinucleótido que codifique polipéptido(s) de desaturasa que cataliza la desaturación de uno o varios ácidos grasos.

Algunos aspectos de la invención incluyen los polipéptidos de las desaturasas y los polinucleótidos que los codifican. Diversas formas de realización de la invención pueden utilizar combinaciones de polinucleótidos de desaturasas y los polipéptidos codificados que dependen típicamente de la célula huésped, de la disponibilidad de sustrato(s), y del(los) producto(s) final(es) deseado(s). "Desaturasa" se refiere a un polipéptido que puede desaturar o catalizar la formación de un enlace doble entre carbonos consecutivos de uno o más ácidos grasos para producir un ácido graso mono o poliinsaturado o uno de sus precursores. Resultan de particular interés los polipéptidos que pueden catalizar la conversión del ácido oleico en LA, LA en ALA, o ALA en SDA, que incluye las enzimas que desaturan en las posiciones 12, 15 ó 6. El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de su longitud o modificación posterior a la traducción (por ejemplo, glicosilación o fosforilación). Las consideraciones para elegir un polipéptido específico con actividad desaturasa incluyen, pero no se limitan a, el pH óptimo del polipéptido, si el polipéptido es una enzima limitante o uno de sus componentes, si la desaturasa usada es esencial para la síntesis de un PUFA deseado, y/o si el polipéptido requiere un cofactor. El polipéptido expresado tiene de preferencia características que son compatibles con el ambiente bioquímico de su localización en la célula huésped. Por ejemplo, el polipéptido puede tener que competir por el(los) sustrato(s).

Pueden considerarse los análisis de la K_{m} y de la actividad específica de un polipéptido en cuestión para determinar si un polipéptido dado es adecuado para modificar la producción, el nivel, o el perfil de PUFA(s) en una célula huésped dada. El polipéptido usado en una situación particular es uno que puede funcionar típicamente bajo las condiciones presentes en la célula huésped prevista, pero de otra manera puede ser cualquier polipéptido de desaturasa que tenga una característica deseada o que sea capaz de modificar la producción relativa, el nivel o el perfil de un PUFA(s) deseado(s) o de cualesquiera otra característica deseada según se analiza en este documento. El(los) sustrato(s) para la enzima expresada puede producirlo la célula huésped o puede suministrarse de manera exógena. Para alcanzar la expresión, el(los) polipéptido(s) de la presente invención está(n) codificado(s) por polinucleótidos como se describe a continuación.

Los inventores han aislado y producido las enzimas de Primula que exhiben actividad \Delta6-desaturasa. Las secuencias que codifican la \Delta6-desaturasa pueden expresarse en plantas, microorganismos o animales transgénicos para producir una mayor síntesis de SDA. Pueden usarse otros polinucleótidos que son sustancialmente idénticos a los polinucleótidos de \Delta6-desaturasa proporcionados en este documento, o que codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a los polipéptidos de \Delta6-desaturasa. "Sustancialmente idéntico" se refiere a una secuencia de aminoácidos o a una secuencia de ácido nucleico que exhibe en orden de preferencia creciente al menos el 92%, el 95%, el 98 ó el 99% de similitud con la secuencia del polipéptido de la \Delta6-desaturasa en la SEC. ID Nº: 4, o SEC. ID Nº: 5, o secuencias que codifican estos polipéptidos. Las comparaciones de polipéptidos o polinucleótidos pueden realizarse usando programas informáticos de análisis de secuencias, por ejemplo, el paquete de programas Sequence Analysis del GCG Wisconsin Package (Accelrys, San Diego, CA), MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wis. 53715), y MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, Calif. 95008). Tales programas emparejan secuencias similares asignando grados de similitud o identidad.

La presente invención abarca las desaturasas relacionadas, incluidas variantes de las \Delta6-desaturasas divulgadas que se presentan en la naturaleza dentro de la misma o de diferentes especies de Primula. Las desaturasas relacionadas pueden identificarse por su capacidad para funcionar sustancialmente de la misma manera que las desaturasas divulgadas; es decir, teniendo actividad \Delta6-desaturasa. Las desaturasas relacionadas también pueden identificarse seleccionando las bases de datos de secuencias para secuencias homólogas a las desaturasas divulgadas, por hibridación de una sonda basada en las desaturasas divulgadas a una biblioteca construida del organismo fuente, o por RT-PCR usando el ARNm del organismo fuente y cebadores basados en las desaturasas divulgadas. Por consiguiente, la invención proporciona los ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones rigurosas a las secuencias codificadoras de desaturasas descritas en este documento. Un experto en la técnica entiende que las condiciones pueden hacerse menos rigurosas aumentando la concentración de sales y disminuyendo la temperatura. Por consiguiente, las condiciones de hibridación pueden manipularse fácilmente, y de esta manera serán por lo general un procedimiento de elección dependiendo de los resultados deseados. Un ejemplo de condiciones de alta rigurosidad es 5X SSC, formamida al 50% y 42ºC. Llevando a cabo un lavado bajo tales condiciones, por ejemplo, durante 10 minutos, las secuencias que no hibridan a una secuencia diana particular bajo estas condiciones pueden eliminarse.

En otro aspecto de la invención, pueden transferirse vectores que contienen un ácido nucleico, o un fragmento del mismo, que contienen un promotor, una secuencia codificadora de \Delta6-desaturasa y una región de terminación en un organismo en el que las regiones del promotor y de terminación son funcionales. Por consiguiente, esta invención proporciona organismos que producen \Delta6-desaturasa recombinante. Aún otro aspecto de esta invención proporciona \Delta6-desaturasa aislada, que puede purificarse de los organismos recombinantes por medio de procedimientos convencionales de purificación de proteínas. (Por ejemplo, véase Ausubel y col., 1994).

Diversos aspectos de la invención incluyen las secuencias de ácido nucleico que codifican desaturasas, descritas en este documento. Los ácidos nucleicos pueden aislarse de Primula, incluidas las SEC. ID Nº: 2, y SEC. ID Nº: 3. Para secuenciar clones individuales puede usarse una estrategia de clonación basada en cebadores de oligonucleótidos diseñados para amplificar las secuencias identificadas como potenciales desaturasas de ácidos grasos, basados en búsquedas de bases de datos de ADN genómico con BLAST. Estos clones pueden a continuación caracterizarse funcionalmente.

Pueden proporcionarse construcciones de ácidos nucleicos que se integran en el genoma de una célula huésped o que se replican de manera autónoma (por ejemplo, por replicación episomal) en la célula huésped. Para la producción de ALA y/o SDA, las casetes de expresión (es decir, un polinucleótido que codifica una proteína que está unida de manera operativa a la(s) secuencia(s) del ácido nucleico que dirige(n) la expresión del polinucleótido) usadas generalmente incluyen una casete de expresión que proporciona la expresión de un polinucleótido que codifica una \Delta6-desa-
turasa. En ciertas formas de realización una célula huésped puede tener contenido de ácido oleico de tipo salvaje.

Los procedimientos y las composiciones para la construcción de vectores de expresión, cuando se toman a la luz de las enseñanzas proporcionadas en este documento, para la expresión de las enzimas desaturasas de Primula serán evidentes para un experto en la técnica. Los vectores de expresión, según se describen en este documento, son moléculas de ADN o ARN producidas por ingeniería para la expresión controlada de un polinucleótido deseado, por ejemplo, el polinucleótido de que codifica la \Delta6-desaturasa. Los ejemplos de vectores incluyen plásmidos, bacteriófagos, cósmidos o virus. Los vectores lanzadera, por ejemplo (Wolk y col. 1984; Bustos y col., 1991) también están contemplados según la presente invención. Pueden encontrarse revisiones de vectores y de procedimientos para prepararlos y usarlos en Sambrook y col. (2001); Goeddel (1990); y Perbal (1988). Los elementos de la secuencia capaces de efectuar la expresión de un polinucleótido incluyen promotores, elementos potenciadores, secuencias de activación secuencia arriba, señales de terminación de la transcripción y sitios de poliadenilación.

Los polinucleótidos que codifican desaturasas pueden colocarse bajo el control transcripcional de un promotor fuerte. En algunos casos esto da lugar a un aumento en la cantidad de enzima desaturasa expresada y de manera concomitante a un aumento en el ácido graso producido como resultado de la reacción catalizada por la enzima. Existe una gran diversidad de secuencias de promotores de plantas que pueden utilizarse para dirigir la expresión específica de tejido de los polinucleótidos que codifican desaturasas en plantas transgénicas. De hecho, en formas de realización particulares las de la invención, el promotor usado es un promotor específico de semilla. Los ejemplos de tales promotores incluyen las regiones reguladoras 5' de genes tales como napina (Kridl y col., Seed Sci. Res. 1: 209:219, 1991), faseolina (Bustos, y col., Plant Cell, 1 (9): 839-853, 1989), inhibidor de tripsina de la soya (Riggs, y col., Plant Cell 1 (6): 609-621, 1989), ACP (Baerson y col., Plant Mol. Biol., 22 (2): 255-267, 1993), estearoil-ACP desaturasa (Slocombe y col., Plant Physiol. 104 (4): 167-176, 1994), subunidad a' de \beta-conglicinina de soya (P-Gm7S, véase por ejemplo, Chen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 8560-8564, 1986), Vicia faba USP (P-Vf. Usp, véase por ejemplo, SEC. ID Nº: 1, 2 y 3, Solicitud de Patente de EEUU 10/429.516), el promotor de globulina (véase por ejemplo Belanger and Kriz, Genet. 129: 863-872 (1991), subunidad alfa de \beta-conglicinina de soya (alfa 7S) (Solicitud de Patente de EEUU 10/235.618) y promotor de L3 oleosina de Zea mays (P-Zm.L3, véase, por ejemplo, Hong y col., Plant Mol. Biol., 34 (3): 549-555, 1997). También se incluyen las zeínas, que son un grupo de proteínas de almacenamiento que se encuentran en el endospermo del maíz. Se han aislado clones genómicos para los genes de zeínas (Pedersen y col., Cell 29: 1015-1026 (1982), y Russell y col., Transgenic Res. 6 (2): 157-168) y podrían usarse también los promotores de estos clones, incluidos los 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, kD 27 y los genes.

El experto en la técnica puede determinar los vectores y los elementos reguladores (incluidos los promotores y las regiones codificadoras unidos de manera operativa) adecuados para la expresión en una célula huésped particular. "Unido de manera operativa" en este contexto significa que las secuencias del promotor y del terminador funcionan con eficacia para regular la transcripción. Como otro ejemplo, un vector adecuado para la expresión de \Delta6-desaturasa en plantas transgénicas puede comprender una secuencia de promotor específico de semilla derivada de heliantinina, de napina, o de glicinina unida de manera operativa a la región codificadora de \Delta6-desaturasa y unida además de manera operativa a una señal de terminación de la proteína de almacenamiento de la semilla o a la señal de terminación de la sintasa de nopalina. Como aún otro ejemplo, un vector para uso en la expresión de \Delta6-desaturasa en plantas puede comprender un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido unido de manera operativa a la región codificadora de la \Delta6-desaturasa y además unido de manera operativa a un terminador constitutivo o específico de tejido o a la señal de terminación de la sintasa de nopalina.

Las modificaciones de las secuencias de nucleótidos o los elementos reguladores divulgados en este documento que mantienen las funciones contempladas en este documento están dentro del ámbito de esta invención. Tales modificaciones incluyen inserciones, sustituciones y deleciones, y específicamente sustituciones que reflejan la redundancia del código genético.

Las técnicas convencionales para la construcción de tales vectores recombinantes son muy conocidas por los expertos en la técnica y pueden encontrarse en referencias tales como Sambrook y col. (2001), o en cualquiera de la miríada de manuales de laboratorio sobre tecnología de ADN recombinante que están extensamente disponibles. Una diversidad de estrategias están disponible para unir los fragmentos de ADN, cuya elección depende de la naturaleza de los extremos terminales de los fragmentos de ADN. Se contempla además, de acuerdo con la presente invención, incluir en un vector de ácido nucleico otros elementos de la secuencia de nucleótidos que faciliten la clonación, la expresión o el procesamiento, por ejemplo las secuencias que codifican los péptidos de señal, una secuencia que codifica KDEL, que es necesaria para retener las proteínas en el retículo endoplásmico o las secuencias que codifican los péptidos de tránsito que dirigen la \Delta6-desaturasa hacia el cloroplasto. Tales secuencias son conocidas por los expertos en la técnica. Un péptido de tránsito optimizado está descrito, por ejemplo, por Van den Broeck y col. (1985). Las secuencias de señal procariotas y eucariotas están divulgadas, por ejemplo, por Michaelis y col. (1982).

Los polinucleótidos que codifican las desaturasas deseadas puede identificarse en una diversidad de maneras. Como ejemplo, una fuente de la desaturasa deseada, por ejemplo se seleccionan bibliotecas genómicas o de ADNc de Primula con sondas detectables sintetizadas enzimática o químicamente, que puede estar hechas de ADN, ARN, o de nucleótidos que no se presentan en la naturaleza, o mezclas de los mismos. Las sondas pueden sintetizarse enzimáticamente a partir de los polinucleótidos de desaturasas conocidas para procedimientos de hibridación normales o de rigurosidad reducida. Las sondas de oligonucleótidos también pueden utilizarse para seleccionar fuentes y pueden estar basados en secuencias de desaturasas conocidas, incluidas las secuencias conservadas entre desaturasas conocidas, o en secuencias de péptidos obtenidas de la proteína deseada purificada. Las sondas oligonucleótidos basadas en secuencias de aminoácidos pueden ser redundantes para abarcar la redundancia del código genético, o pueden predisponerse a favor de los codones de preferencia del organismo fuente. Los oligonucleótidos también pueden utilizarse como cebadores para PCR a partir del ARNm transcrito inverso de una fuente conocida o sospechada; el producto de PCR puede ser el ADNc de longitud total o puede utilizarse para generar una sonda para obtener el ADNc de longitud total deseado. Como alternativa, puede secuenciarse totalmente una proteína deseada y puede llevarse a cabo la síntesis total de un ADN que codifica ese polipéptido.

Una vez aislado el ADNc o genómico deseado, puede secuenciarse por medio de procedimientos conocidos. Se reconoce en la técnica que tales procedimientos están sujetos a errores, de modo tal que la secuenciación múltiple de la misma región es rutina y aún se espera que de lugar a tasas de errores mensurables en la secuencia deducida resultante, particularmente en las regiones que tienen dominios repetidos, estructura secundaria extensa, o composiciones de bases inusuales, tales como regiones con alto contenido de bases GC. Cuando surgen las discrepancias, puede realizarse nuevamente la secuenciación y pueden emplearse procedimientos especiales. Los procedimientos especiales pueden incluir alterar las condiciones de secuenciación usando: diferentes temperaturas; diferentes enzimas; proteínas que alteran la capacidad de los oligonucleótidos para formar estructuras de orden superior; nucleótidos alterados tales como ITP o dGTP metilado; diferentes composiciones de gel, por ejemplo añadiendo formamida; diferentes cebadores o cebadores localizados a diferentes distancias de la región problema; o diferentes moldes tales como moléculas de ADN de hebra única. También puede usarse la secuenciación de ARNm.

Alguna o todas las secuencias codificadoras de un polipéptido que tiene actividad desaturasa pueden ser de una fuente natural. En algunas situaciones, sin embargo, es deseable modificar todos o una parte de los codones, por ejemplo, para potenciar la expresión, usando codones de preferencia del huésped. Los codones de preferencia del huésped pueden determinarse a partir de la frecuencia más alta en las proteínas expresadas en mayor cantidad en una especie particular del huésped y/o un tejido de interés. Por consiguiente, la secuencia codificadora para un polipéptido que tiene actividad desaturasa puede sintetizarse entera o en forma parcial. También puede sintetizarse todo o partes del ADN para eliminar cualquier secuencia o región de desestabilización de la estructura secundaria que estuviera presente en el ARNn transcrito. También puede sintetizarse todo o partes del ADN para alterar la composición de bases a una de más preferencia en la célula huésped deseada. Los procedimientos para sintetizar secuencias y juntar secuencias están establecidos en la bibliografía. Pueden usarse la mutagénesis y la selección in vitro, la mutagénesis dirigida a sitios, u otros medios para obtener mutaciones de los genes de desaturasa que se presentan en la naturaleza para producir un polipéptido con actividad desaturasa in vivo con parámetros físicos y cinéticos más deseables para la actuar en la célula huésped, tales como una semivida más prolongada o una tasa de producción de un ácido graso poliinsaturado deseado.

Una vez obtenido el polinucleótido que codifica un polipéptido de desaturasa, se coloca en un vector capaz de replicar en una célula huésped, o se propaga in vitro por medio de técnicas tales como PCR o PCR larga. Los vectores replicantes puede incluir plásmidos, fagos, virus, cósmidos y similares. Los vectores deseables incluyen los que son útiles para la mutagénesis del gen de interés o para la expresión del gen de interés en células huésped. La técnica de PCR larga ha hecho posible la propagación in vitro de construcciones grande, de modo que las modificaciones al gen de interés, tal como la mutagénesis o la adición de señales de expresión, y la propagación de las construcciones resultantes pueden tener lugar en su totalidad in vitro sin el uso de un vector replicante o de una célula huésped.

Para la expresión de un polipéptido de desaturasa, las regiones de transcripción, traducción y terminación funcionales se unen de manera operativa al polinucleótido que codifica el polipéptido de desaturasa. La expresión de la región codificadora del polipéptido puede tener lugar in vitro o en una célula huésped. Las regiones de iniciación y terminación de la transcripción y la traducción derivan de una diversidad de fuentes no exclusivas, incluidos el polinucleótido a expresar, genes que se sabe o se sospecha que son capaces de expresarse en el sistema deseado, vectores de expresión, síntesis química, o de un locus endógeno en una célula huésped.

La expresión en una célula huésped puede llevarse a cabo de una manera transitoria o estable. La expresión transitoria puede tener lugar a partir de construcciones introducidas que contienen las señales de expresión funcionales en la célula huésped, pero cuyas construcciones no replican y raramente se integran en la célula huésped, o donde la célula huésped no está proliferando. La expresión transitoria también puede llevarse a cabo induciendo la actividad de un promotor que puede regularse unido de manera operativa al gen de interés, aunque tales sistemas factibles de inducción exhiben con frecuencia un nivel basal de expresión bajo. La expresión estable puede alcanzarse por medio de la introducción de una construcción que pueda integrarse en el genoma del huésped o que se replique de manera autónoma en la célula huésped. La expresión estable del gen de interés puede seleccionarse través el uso de un marcador seleccionable localizado en o transfectado con la construcción de expresión, seguido por la selección de las células que expresan el marcador. Cuando la expresión estable es resultado de la integración, la integración de construcciones puede tener lugar aleatoriamente dentro del genoma del huésped o puede dirigirse a través del uso de construcciones que contienen regiones de homología con el genoma del huésped suficientes para dirigir la recombinación con el locus del huésped. Donde las construcciones están dirigidas a un locus endógeno, todas o algunas de las regiones reguladoras de la transcripción y de la traducción pueden estar proporcionadas por el locus endógeno.

Cuando se desea la expresión aumentada del polipéptido de desaturasa en el organismo fuente, pueden utilizarse diversos procedimientos. Pueden introducirse otros genes que codifican el polipéptido de desaturasa en el organismo huésped. La expresión del locus nativo de la desaturasa también puede aumentarse con la recombinación homóloga, por ejemplo insertando un promotor más fuerte en el genoma del huésped para causar la expresión aumentada, eliminando secuencias desestabilizadoras del ARNm o de la proteína codificada por deleción de esa información del genoma del huésped, o por adición de secuencias estabilizadoras al ARNm (Patente de EEUU Nº 4.910.141).

Está contemplado que pueda introducirse y propagarse más de un polinucleótido que codifique una desaturasa o un polinucleótido que codifique más de una desaturasa en una célula huésped a través del uso de vectores de expresión episomales o integrados. Donde dos o más genes se expresan de vectores replicantes separados, es deseable que cada vector tenga diferentes medios de replicación. Cada construcción introducida, integrada o no, debe tener diferentes medios de selección y debe carecer de homología a las otras construcciones para mantener la expresión estable y para evitar la redistribución de elementos entre las construcciones. Las elecciones acertadas de regiones reguladoras, medios de selección y procedimientos de propagación de la construcción introducida pueden determinarse de manera experimental para que todos los polinucleótidos introducidos se expresen en los niveles necesarios para proporcionar la síntesis de los productos deseados.

Cuando son necesarias para la transformación, las secuencias codificadoras de \Delta6-desaturasa de la presente invención pueden insertarse en un vector de transformación de plantas, por ejemplo el vector binario descrito por Bevan (1984). Los vectores de transformación de plantas pueden obtenerse modificando el sistema de transferencia natural del gen de Agrobacterium tumefaciens. El sistema natural comprende plásmidos Ti (introductor de tumores) grandes que contienen un segmento grande, conocido como ADN-T, que se transfiere a las plantas transformadas. Otro segmento del plásmido Ti, la región vir, es responsable de la transferencia del ADN-T. La región del ADN-T está confinada por repeticiones terminales. En los vectores binarios modificados se han suprimido los genes que inducen tumores y las funciones de la región vir se utilizan para transferir el ADN extraño confinado por las secuencias de vecinas del ADN-T. La región T también contiene un marcador para resistencia antibiótica que puede seleccionarse, y un sitio de clonación múltiple para insertar las secuencias para la transferencia. Tales cepas producidas por ingeniería se conocen como cepas de A. tumefaciens "desarmadas", y permiten la transformación eficaz de las secuencias confinadas por la región T en los genomas nucleares de plantas.

El objeto de la invención encuentra muchas aplicaciones. Las sondas basadas en los polinucleótidos de la presente invención pueden encontrar uso en los procedimientos para aislar moléculas relacionadas o en procedimientos para detectar organismos que expresan desaturasas. Cuando se utilizan como sondas, los polinucleótidos u oligonucleótidos deben ser detectables. Esto se lleva a cabo generalmente uniendo una etiqueta en un sitio interno, por ejemplo a través de la incorporación de un residuo modificado, o en los extremos 5' o 3' terminales. Tales etiquetas pueden ser detectables directamente, pueden unirse a una molécula secundaria que está etiquetada de manera detectable, o pueden unirse a una molécula secundaria sin etiquetar y a una molécula terciaria etiquetada detectable; este proceso puede extenderse hasta que sea práctico para alcanzar una señal satisfactoriamente detectable sin niveles inaceptables de señal de fondo. Los sistemas secundarios, terciarios, o de creación de puentes pueden incluir el uso de anticuerpos dirigidos contra cualquier otra molécula, incluidos etiquetas u otros anticuerpos, o puede involucrar cualquier molécula que se una a la otra, por ejemplo un sistema de biotina-estreptavidina/avidina. Las etiquetas detectables incluyen típicamente los isótopos radiactivos, las moléculas que, química o enzimáticamente, producen o alteran la luz, las enzimas que producen productos de la reacción detectables, las moléculas magnéticas, las moléculas fluorescentes o las moléculas cuya fluorescencia o características luminescentes cambian tras la unión. Los ejemplos de procedimientos de etiquetado pueden encontrarse en la Patente de EEUU Nº 5.011.770. Como alternativa, la unión de las moléculas diana puede detectarse directamente midiendo el cambio en el calor de la disolución al unir la sonda a la diana a través de calorimetría de valoración isotérmica, o recubriendo la sonda o la diana en una superficie y detectando el cambio en la dispersión de la luz de la superficie producida por la unión de la diana o la sonda, respectivamente, como puede realizarse con el sistema BIAcore.

Las construcciones que comprenden el gen de interés pueden introducirse en una célula huésped por medio de técnicas convencionales. Por conveniencia, en este documento se denominará "transformada" o "recombinante" a una célula huésped que ha sido manipulada por cualquier procedimiento para tomar una secuencia del ADN o de la construcción. El huésped tendrá al menos una copia de la construcción de expresión y puede tener dos o más, por ejemplo, dependiendo de si el gen está integrado en el genoma, si está amplificado, o si está presente en un elemento extracromosómico que tiene múltiples números de copias.

La célula huésped transformada puede identificarse por selección para un marcador contenido en la construcción introducida. Como alternativa, puede introducirse una construcción marcadora separada con la construcción deseada, ya que muchas técnicas de transformación introducen muchas moléculas de ADN en las células huésped. Típicamente, los huéspedes transformados se seleccionan por su capacidad para crecer en medios selectivos. Los medios selectivos pueden incorporar un antibiótico o pueden carecer de un factor necesario para el crecimiento del huésped sin transformar, tal como nutriente o un factor de crecimiento. Un gen marcador introducido puede por consiguiente conferir resistencia a antibióticos, o puede codificar un factor de crecimiento o una enzima esencial para el crecimiento, y permitir el crecimiento en medios selectivos cuando se expresa en el huésped transformado. La selección de un huésped transformado también puede tener lugar cuando la proteína marcadora expresada puede detectarse, directamente o indirectamente. La proteína marcadora puede expresarse sola o como una fusión a otra proteína. La proteína marcadora puede detectarse por su actividad enzimática; por ejemplo, la beta galactosidasa puede convertir el sustrato X-gal en un producto coloreado, y la luciferasa puede convertir la luciferina en un producto luminescente. La proteína marcadora puede detectarse por sus características de producción o modificación de la luz; por ejemplo, la proteína fluorescente verde de Aequorea victoria fluoresce cuando se ilumina con luz azul. Pueden usarse anticuerpos para detectar la proteína marcadora o una etiqueta molecular en, por ejemplo, una proteína de interés. Las células que expresan la proteína marcadora o la etiqueta pueden seleccionarse, por ejemplo, de manera visual, o por medio de técnicas tales como FACS o filtrado usando anticuerpos. De manera deseable, la resistencia a la kanamicina y al aminoglucósido G418 son de interés, así como la capacidad para crecer en medios que carecen de uracilo, leucina, lisina o triptofano.

Resulta de particular interés la producción PUFA mediada por \Delta6-desaturasa en células huésped eucariotas. Las células eucariotas incluyen las células de plantas, tales como las de las plantas de cultivo productoras de aceite, y otras células susceptibles para la manipulación genética incluidas las células fúngicas. Las células pueden cultivarse o formarse como parte o todo el organismo huésped incluyendo una planta. En una forma de realización de preferencia, el huésped es una célula de planta que produce y/o puede asimilar el(los) sustrato(s) para una \Delta6-desaturasa suministrado(s)
de manera exógena, y de preferencia produce grandes cantidades de uno o más de los sustratos.

La célula huésped transformada se cultiva bajo condiciones adecuadas adaptadas para un resultado final deseado. Para las células huésped que crecen en cultivo, las condiciones se optimizan típicamente para producir el mayor y más económico rendimiento de PUFA, que están relacionadas con la actividad desaturasa seleccionada. Las condiciones de los medios que pueden optimizarse incluyen: la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno, la adición del sustrato, la concentración final del substrato añadido, la forma del sustrato añadido, el cultivo aerobio o anaerobio, la temperatura de crecimiento, el agente inductor, la temperatura de inducción, la fase de crecimiento en la inducción, la fase de crecimiento en la cosecha, el pH, la densidad, y el mantenimiento de la selección.

Otro aspecto de la presente invención proporciona plantas transgénicas o progenie de plantas que contienen el ADN aislado de la invención. Se contemplan tanto las plantas monocotiledóneas como las dicotiledóneas. Las células de plantas se transforman con un ADN aislado que codifica la \Delta6-desaturasa por cualquier procedimiento de transformación de plantas. La célula transformada de la planta, frecuentemente en un cultivo de callos o disco foliar, se regenera en una planta transgénica completa por los procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo Horsch y col., 1985). En una forma de realización, la planta transgénica se selecciona del grupo constituido por Arabidopsis thaliasla, canola, soya, semilla de soya, colza, girasol, algodón, cacao, cacahuete, alazor, coco, lino, palma de aceite, Brassica napus, maíz, jojoba, árbol del sebo de China, tabaco, plantas frutales, plantas de cítricos o plantas que producen nueces y bayas. Puesto que la progenie de las plantas transformadas hereda el polinucleótido que codifica la \Delta6-desaturasa, las semillas o las estacas de las plantas transformadas pueden utilizarse para mantener la línea transgénica de la planta.

La presente invención proporciona además un procedimiento para proporcionar plantas transgénicas con un contenido aumentado de ALA y/o SDA. Este procedimiento incluye, por ejemplo, introducir el ADN que codifica la \Delta6-desaturasa en las células de la planta que carecen o tienen niveles bajos de SDA pero contienen ALA, y regenerar las plantas con el contenido aumentado de SDA a partir de las células transgénicas. En ciertas formas de realización de la invención, puede también introducirse un ADN que codifica una \Delta15- y/o \Delta12-desaturasa en las células de la planta. Tales plantas pueden o no comprender también actividad \Delta12- y/o \Delta15-desaturasa endógena. En ciertas formas de realización, las plantas de cultivo modificadas cultivadas comercialmente están contempladas como el organismo transgénico, incluidos, pero no limitados a, Arabidopsis thaliana, canola, soya, semilla de soya, colza, girasol, algodón, cacao, cacahuete, alazor, coco, lino, palma de aceite, oleaginosa Brassica napus, maíz, jojoba, árbol del sebo de China, tabaco, plantas frutales, plantas de cítricos o plantas que producen nueces y bayas.

La presente invención proporciona además un procedimiento para proporcionar plantas transgénicas que pueden contener niveles elevados de ALA y/o SDA, en el que dichos niveles elevados son mayores que los niveles encontrados en las plantas no transformadas. Los vectores de expresión que comprenden el ADN que codifica una \Delta6-desaturasa, y/o una \Delta12-desaturasa y/o una \Delta15-desaturasa, pueden construirse por medio de procedimientos de tecnología recombinante conocidos por los expertos en la técnica (Sambrook y col., 2001). En particular, las plantas de cultivo cultivadas comercialmente están contempladas como el organismo transgénico, incluidos, pero no limitados a, Arabidopsis thaliana, canola, soya, semilla de soya, colza, girasol, algodón, cacao, cacahuete, alazor, coco, lino, palma de aceite, oleaginosa Brassica napus, y maíz.

Para suplementar la dieta pueden incorporarse los PUFA purificados, las plantas transformadas o partes de las plantas, o sus derivados, en los aceites de cocina, las grasas o las margarinas formulados para que en el uso normal el receptor reciba la cantidad deseada. Los PUFA pueden incorporarse también en fórmulas infantiles, suplementos nutritivos u otros productos alimenticios, y puede encontrar uso como agentes antiinflamatorios o de disminución del colesterol.

Según se utiliza en este documento, "composición comestible" se define como las composiciones que puede ingerir un mamífero tales como comestibles, sustancias nutritivas y composiciones farmacéuticas. Como se usa en este documento "comestibles" se refiere a las sustancias que pueden utilizarse o prepararse para uso como alimento para un mamífero e incluyen las sustancias que pueden utilizarse en la preparación del alimento (tales como aceites de fritura) o aditivos de alimentos. Por ejemplo, los comestibles incluyen los animales usados para el consumo humano o cualquier producto de los mismos, tales como, por ejemplo, los huevos. Los comestibles típicos incluyen, pero no se limitan a, las bebidas, (por ejemplo, bebidas no alcohólicas, bebidas carbonatadas, bebidas listas mezclar), alimentos infundidos (por ejemplo frutas y verduras), salsas, condimentos, aliños de ensalada, zumos de fruta, jarabes, postres (por ejemplo, pudines, gelatina, glaseados y rellenos, alimentos horneados y postres congelados tales como helados y sorbetes), productos suaves congelados (por ejemplo, cremas batidas congeladas, cremas heladas congeladas y yogures, coberturas suaves congeladas tales como coberturas batidas lácteas o no lácteas), aceites y los productos emulsionados (por ejemplo, manteca vegetal o shortening, margarina, mayonesa, mantequilla, aceite de cocina, y aliños de ensalada) y alimentos de humedad intermedia (por ejemplo, arroz y alimentos para perros).

Además, las composiciones comestibles descritas en este documento pueden también ingerirse como un aditivo o suplemento contenido en alimentos y bebidas. Estos pueden formularse junto con una sustancia nutritiva tal como diversas vitaminas y minerales y pueden incorporarse en composiciones sustancialmente líquidas tales como bebidas nutritivas, leches de soya y sopas; composiciones sustancialmente sólidas; y gelatinas o pueden utilizarse en forma de polvo para incorporar en diversos alimentos. El contenido del ingrediente eficaz en tal alimento funcional o saludable puede ser similar a la dosis contenida en un agente farmacéutico típico.

Los PUFA purificados, las plantas transformadas o las partes de las plantas pueden también incorporarse en el pienso de los animales, particularmente ganado. De esta manera, los animales pueden beneficiarse ellos mismos de una dieta rica en PUFA, mientras que los consumidores humanos de los productos alimenticios producidos a partir de tal ganado pueden beneficiarse también. Se espera en ciertas formas de realización que el SDA se convierta en EPA en los animales y tales animales pueden beneficiarse de esta manera de un aumento de EPA por el consumo de SDA.

Para uso farmacéutico (humano o veterinario), las composiciones pueden administrarse generalmente por vía oral pero pueden administrarse por cualquier ruta por la que puedan absorberse con éxito, por ejemplo, por vía parenteral (es decir, vía subcutánea, intramuscular o intravenosa), rectal, vaginal o tópica, por ejemplo, como un ungüento o loción para la piel. Las plantas o las partes de plantas transformadas para PUFA de la presente invención pueden administrarse solas o en combinación con un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptable. Donde están disponibles, las cápsulas de gelatina son la forma de administración oral de preferencia. La suplementación de la dieta según lo establecido anteriormente puede también proporcionar una ruta de administración oral. Los ácidos insaturados de la presente invención pueden administrarse en formas conjugadas, o como sales, ésteres, amidas o profármacos de los ácidos grasos. La presente invención abarca cualquier sal farmacéuticamente aceptable; resultan especialmente de preferencia las sales de sodio, potasio o litio. También se abarcan las sales de N-alquilpolihidroxamina, tales como N-metilglucamina, que se encuentra en la publicación del PCT WO 96/33155. Los ésteres de preferencia son los etilésteres. Como sales sólidas, los PUFA también pueden administrarse en forma de comprimido. Para la administración intravenosa, los PUFA o sus derivados pueden incorporarse en formulaciones comerciales tales como Intralipids.

Si se desea, las regiones de un polipéptido de desaturasa importantes para la actividad desaturasa pueden determinarse a través de mutagénesis rutinaria seguida por la expresión de los polipéptidos mutantes resultantes y la determinación de sus actividades. Los mutantes pueden incluir sustituciones, deleciones, inserciones y mutaciones puntuales, o combinaciones de las mismas. Las sustituciones pueden realizarse en base a la característica hidrófoba o hidrófila conservada (Kyte y Doolittle, 1982), o en base de la capacidad para asumir una estructura secundaria del polipéptido similar (Chou and Fasman, 1978). Un análisis funcional típico comienza con la mutagénesis de deleción para determinar los límites N- y C-terminal de la proteína necesaria para la función, y a continuación se realizan las deleciones, las inserciones o las mutaciones puntuales internas para determinar además las regiones necesarias para la función. También pueden utilizarse otras técnicas tales como la mutagénesis de la casete o la síntesis total. La mutagénesis de deleción se lleva a cabo, por ejemplo, usando exonucleasas para eliminar de manera secuencial las regiones codificadoras 5' o 3'. Se dispone de kits para tales técnicas. Tras la deleción, la región codificadora se completa uniendo los oligonucleótidos que contienen codones de inicio o de parada a la región codificadora delecionada tras la deleción 5' o 3', respectivamente. Como alternativa, se insertan los oligonucleótidos que codifican el inicio o la parada en la región de codificación por una diversidad de procedimientos incluidos la mutagénesis dirigida al sitio, la PCR mutagénica o por unión sobre el ADN digerido en los sitios de restricción existentes.

Las deleciones internas pueden realizarse de manera similar con una diversidad de procedimientos incluidos el uso de los sitios de restricción existentes en el ADN, por medio del uso de cebadores mutagénicos por mutagénesis dirigida al sitio o PCR mutagénica. Las inserciones se realizan a través de procedimientos tales como la mutagénesis de exploración de conectores, mutagénesis dirigida al sitio o PCR mutagénica. Las mutaciones puntuales se realizan con técnicas tales como la mutagénesis dirigida al sitio o PCR mutagénica. La mutagénesis química puede también utilizarse para identificar regiones de un polipéptido de desaturasa importante para la actividad. Tal análisis de estructura-función puede determinar qué regiones pueden suprimirse, qué regiones toleran inserciones, y qué mutaciones puntuales permiten que la proteína mutante funcione sustancialmente de la misma manera que la desaturasa nativa. Todas tales proteínas mutantes y secuencias de nucleótidos que las codifican están dentro del alcance de la presente invención.

Según se describió anteriormente en este documento, ciertas formas de realización de la presente invención se refieren a construcciones de transformación de plantas. Por ejemplo, un aspecto de la presente invención es un vector de transformación de plantas que comprende uno o más genes o el(los) ADNc de desaturasa. Las secuencias codificadoras ejemplares para uso con la invención incluyen la \Delta6-desaturasa de Primula juliae (SEC. ID Nº: 2-3). En ciertas formas de realización, también pueden usarse secuencias complementarias de desaturasa con la invención. Los ácidos nucleicos que codifican desaturasas ejemplares incluyen al menos 20, 40, 80, 120, 300 y hasta la longitud total de las secuencias de ácido nucleico de SEC. ID Nº: 2, SEC. ID Nº: 3, SEC. ID Nº: 21, SEC. ID Nº: 23, SEC. ID Nº: 25, SEC. ID Nº: 45 o SEC. ID Nº: 47. En ciertos aspectos, un ácido nucleico puede codificar 1, 2, 3, 4 o más enzimas desaturasa. En formas de realización particulares, un ácido nucleico pueden codificar una \Delta6-y una \Delta15-desaturasa.

Los vectores usados para la transformación de plantas pueden incluir, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, YACs (cromosomas artificiales de levadura), BACs (cromosomas artificiales bacterianos) o cualquier otro sistema de clonación adecuado, así como fragmentos del ADN de los mismos. Por consiguiente, cuando se utiliza el término "vector" o "vector de expresión", todos los tipos de vectores precedentes, así como las secuencias de ácido nucleico aisladas de los mismos, están incluidos. Se contempla que la utilización de los sistemas de clonación con gran capacidad de inserción permitirán la introducción de secuencias grandes de ADN que comprenden más de un gen seleccionado. De acuerdo con la invención, esto podría utilizarse para introducir diversos ácidos nucleicos codificadores de desaturasa. La introducción de tales secuencias puede facilitarse por medio del uso de cromosomas artificiales bacterianos o de levaduras (BACs o YACs, respectivamente), o incluso cromosomas artificiales de plantas. Por ejemplo, el uso de BACs para la transformación mediada por Agrobacterias fue divulgado por Hamilton y col. (1996).

Particularmente útiles para la transformación son las casetes de expresión que se han aislado de tales vectores. Los segmentos de ADN usados para transformar las células de la planta generalmente comprenden, por supuesto, el ADNc, el gen o los genes que uno desea introducir y tener expresados en las células huésped. Estos segmentos de ADN pueden incluir además estructuras tales como promotores, potenciadores, policonectores, o incluso genes reguladores según lo deseado. El segmento de ADN o el gen elegido para la introducción celular codificará frecuentemente una proteína que se expresará en las células recombinantes resultantes dando como resultado un rasgo que puede investigarse o seleccionarse y/o que impartirá un fenotipo mejorado a la planta transgénica resultante. Sin embargo, este puede no siempre ser el caso, y la presente invención también abarca las plantas transgénicas que incorporan transgenes no expresados. Los componentes de preferencia con probabilidad de incluirse con los vectores usados en la presente invención son los siguientes.

En una forma de realización la presente invención utiliza ciertos promotores. Los ejemplos de tales promotores que pueden utilizarse con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, el 35S de CaMV (virus del mosaico de la coliflor), el 34S de FMV (virus del mosaico de la escrafularia) (véase, por ejemplo, Patente de EEUU Nº 5.378.619, Napina (de Brassica), 7S (de la soya), Globulina y Lec (del maíz). El promotor de napina y los promotores, que se regulan durante la maduración de la semilla de la planta, son de interés particular para uso con la presente invención. Todos tales elementos promotores y reguladores de la transcripción, solos o en combinación, están contemplados para uso en los presentes vectores de expresión replicables y son conocidos por los expertos en la técnica.

La secuencia de ADN entre el sitio de iniciación de la transcripción y el comienzo de la secuencia codificadora, es decir, la secuencia líder sin traducir, puede también influir en la expresión del gen. Por consiguiente, puede ser deseable usar una secuencia líder particular con una construcción de transformación de la invención. Está contemplado que las secuencias líder de preferencia incluyan las que comprenden secuencias predichas para dirigir la expresión óptima del gen unido, es decir, que incluyan una secuencia líder de consenso de preferencia que puede aumentar o mantener la estabilidad del ARNm y evitar la iniciación inadecuada de la traducción. A la luz de la presente divulgación, los expertos en la técnica conocerán la elección de tales secuencias. Las secuencias que derivan de los genes que se expresan de manera importante en plantas serán típicamente de preferencia.

Las construcciones de transformación preparadas según la invención incluirán típicamente una secuencia de ADN del extremo 3' que actúa como señal para terminar la transcripción y permite la poliadenilación del ARNm producido por las secuencias codificadoras unidas de manera operativa a un gen de desaturasa (por ejemplo, ADNc). En una forma de realización de la invención, se usa el terminador nativo de un gen de desaturasa. Como alternativa, un extremo 3' heterólogo puede aumentar la expresión de las regiones codificadoras de la desaturasa. Los ejemplos de terminadores que se consideran útiles incluyen los del gen de la sintasa de nopalina de Agrobacterium tumefaciens (extremo nos 3') (Bevan y col., 1983), el terminador para la transcripción de T7 del gen de la sintasa de octopina de Agrobacterium tumefaciens, el extremo 3' de los genes del inhibidor de proteasa I o II de la patata o del tomate y el terminador 35S de CaMV (tml3'). Los elementos reguladores tales como un intrón Adh (Callis y col., 1987), un intrón de sintasa de sacarosa (Vasil y col., 1989) o un elemento omega de TMV (Gallie y col., 1989), pueden además incluirse donde se desee.

Utilizando una proteína marcadora que puede investigarse o seleccionarse, puede proporcionarse o aumentarse la capacidad para identificar transformantes. Los "genes marcadores" son genes que imparten un fenotipo distinto a las células que expresan la proteína marcadora y permiten de esa manera que tales células transformadas se distingan de las células que no tienen el marcador. Tales genes pueden codificar un marcador que puede investigarse o seleccionarse, dependiendo de si el marcador confiere un rasgo que puede "investigarse" por medios químicos, es decir, a través del uso de un agente selectivo (por ejemplo, un herbicida, un antibiótico, o similares), o si es simplemente un rasgo que puede identificarse a través de la observación o de pruebas, es decir, por "selección" (por ejemplo, la proteína fluorescente verde). Por supuesto, se conocen muchos ejemplos de proteínas marcadoras adecuadas y pueden usarse en la práctica de la invención.

Se cree que los procedimientos adecuados para la transformación de plantas o de otras células para uso con la presente invención incluyen virtualmente cualquier procedimiento por el que puede introducirse ADN en una célula, tal como por administración directa del ADN tal como por la transformación de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh y col., 1993), por captación de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus y col., 1985), por electroporación (Patente de EEUU Nº 5.384.253, por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler y col., 1990; Patente de EEUU Nº 5.302.523; y Patente de EEUU Nº 5.464.765, por transformación mediada por Agrobacterium (Patente de EEUU Nº 5.591.616 y Patente de EEUU Nº 5.563.055; y por aceleración de partículas recubiertas con ADN (Patente de EEUU Nº 5.550.318; Patente de EEUU Nº 5.538.877; y Patente de EEUU Nº 5.538.880, etc. A través del uso de técnicas tales como estas, las células de virtualmente cualquier especie de planta pueden transformarse de manera estable, y estas células pueden desarrollarse en plantas transgénicas.

Después de llevar a cabo la administración del ADN exógeno a las células receptoras, las etapas siguientes se refieren generalmente a identificar las células transformadas para el posterior cultivo y regeneración de la planta. Para mejorar la capacidad para identificar transformantes, puede ser deseable usar un gen marcador que pueda investigarse o seleccionarse con un vector de transformación preparado según la invención. En este caso, se ensayará generalmente la población de células potencialmente transformadas exponiendo las células a un agente o agentes selectivos, o se seleccionarán las células para el rasgo deseado del gen marcador.

Las células que sobreviven a la exposición al agente selectivo, o las células que han recibido puntuación positiva en un análisis de selección, pueden cultivarse en medios que apoyan la regeneración de las plantas. En una forma de realización ejemplar, los medios MS y N6 pueden modificarse incluyendo otras sustancias tales como reguladores del crecimiento. Un de tales reguladores del crecimiento es dicamba o 2,4-D. Sin embargo, pueden usarse otros reguladores del crecimiento, incluidos NAA, NAA + 2,4-D o picloram. Se ha encontrado que la mejora de los medios de esta y otras maneras facilita el crecimiento de las células en etapas de desarrollo específicas. El tejido puede mantenerse en un medio básico con reguladores del crecimiento hasta tener disponible suficiente tejido para comenzar el intento de regeneración de la planta, o tras repetidos ciclos de selección manual, hasta que la morfología del tejido sea adecuada para la regeneración, típicamente al menos 2 semanas, para a continuación transferirlos a los medios que dan lugar a la maduración de embrioides. Los cultivos se transfieren cada 2 semanas en este medio. El desarrollo de brotes señalará el momento para transferir al medio carente de reguladores del crecimiento.

Para confirmar la presencia del ADN exógeno o de "transgen(es)" en las plantas en regeneración, pueden realizarse una diversidad de ensayos. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos "biológicos moleculares", tales como transferencias Southern y Northern y PCR^{TM}; ensayos "bioquímicos", tales como detectar la presencia de un producto proteico, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISA y transferencia Western) o por función enzimática; ensayos de partes de plantas, tales como ensayos de hojas o raíz; y también, analizando el fenotipo de la planta regenerada en su totalidad.

Además de la transformación directa de un genotipo particular de planta con una construcción preparada según la presente invención, pueden generarse plantas transgénicas cruzando una planta que tiene un ADN seleccionado de la invención con una segunda planta que carece del ADN. También pueden usarse técnicas de reproducción de plantas para introducir múltiples desaturasas, por ejemplo \Delta6, \Delta12, y/o \Delta15-desaturasa(s) en una única planta. De esta manera, puede regularse positivamente la \Delta6-desaturasa de manera eficaz. Creando plantas homocigotas para la actividad \Delta6-desaturasa y/u otra actividad desaturasa (por ejemplo, actividad \Delta12- y/o \Delta-15 desaturasa) pueden aumentarse los metabolitos ventajosos en la planta.

Según se estableció anteriormente, puede introducirse un gen de desaturasa seleccionado en una variedad de planta particular por cruzamiento, sin necesidad de transformar siempre directamente una planta de esa variedad dada. Por consiguiente, la presente invención no sólo abarca una planta transformada directamente o regenerada a partir de células que se han transformado según la presente invención, sino también la progenie de tales plantas. Según se utiliza en este documento, el término "progenie" significa el descendiente de cualquier generación de una planta original preparada según la presente invención, en la que la progenie comprende una construcción de ADN seleccionada preparada según la invención. "Cruzar" una planta para proporcionar una línea de plantas que tiene uno o más transgenes o alelos añadidos con relación a la línea de la planta de inicio, como se divulga en este documento, se define como las técnicas que dan lugar a una secuencia particular que se introduce en una línea de planta por cruzamiento de una línea de inicio con una línea de planta donadora que comprende un transgen o un alelo de la invención. Para lograr esto podrían realizarse, por ejemplo, las siguientes etapas: (a) plantar semillas de las plantas originales, primera (línea de inicio) y segunda (línea de planta donadora que comprende un transgen o un alelo deseado); (b) hacer crecer las semillas de las plantas originales, primera y segunda, para obtener plantas con flores; (c) polinizar una flor de la primera planta original con polen de la segunda planta original; y (d) cosechar las semillas producidas en la planta original que lleva la flor fertilizada.

En este documento se define el retrocruzamiento como el proceso que incluye las etapas de: (a) cruzar una planta de un primer genotipo que contiene un gen, una secuencia de ADN o un elemento deseado con una planta de un segundo genotipo que carece de dicho gen, secuencia de ADN o elemento deseado; (b) seleccionar una o más plantas de la progenie que contienen el gen, la secuencia de ADN o el elemento deseado; (c) cruzar la planta de la progenie con una planta del segundo genotipo; y (d) repetir las etapas (b) y (c) para transferir una secuencia de ADN deseada de una planta de un primer genotipo a una planta de un segundo genotipo.

La introgresión de un elemento de ADN en un genotipo de planta se define como el resultado del proceso de conversión del retrocruzamiento. Puede referirse a un genotipo de planta en el que se ha realizado la introgresión de una secuencia de ADN como un genotipo, una línea, línea endogámica, o híbrido convertido por retrocruzamiento. De manera similar, puede referirse a un genotipo de planta que carece de la secuencia de ADN deseada como un genotipo, una línea, línea endogámica, o híbrido no convertido.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar las formas de realización de la invención.

Ejemplo 1 Clonación de las secuencias de \Delta6 desaturasa de Primula juliae

La clonación de la \Delta6 desaturasa de Primula juliae (PjD6D) se llevó a cabo por medio de amplificación por PCR de una región parcial de ADN genómico interno usando oligonucleótidos redundantes, seguida por la marcha genómica bidireccional. Se aisló el ADN genómico total de P. juliae (Collector's Nursery, Battleground WA) usando el Kit DNeasy Plant Mini (Qiagen, Valencia, CA), siguiendo el procedimiento del fabricante. En primer lugar, se aisló un fragmento de 552 pb que corresponde a las posiciones 687 a 1238 de la SEC. ID Nº: 1 usando oligonucleótidos redundantes BO-1 Dir. y BO-2 Inv. como está descrito por García-Maroto y col. (2002). El fragmento se clonó en pCR®4-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA) para dar el vector pMON83955 y se secuenció el inserto. Las secuencias de los cebadores BO-1 Dir. y BO-2 Inv. eran las siguientes:

BO-1 Dir.:	5'-ATMAGYATYGGTTGGTGGAARTGG-3'	(SEC. ID Nº: 6)

BO-2 Inv.:	5'-AATCCACCRTGRAACCARTCCAT-3'	(SEC. ID Nº: 7)

Para determinar la secuencia genómica vecina del inserto de pMON83955, se utilizó un Universal Genome Walker Kit^{TM} (BD Biosciences, Palo Alto, CA), siguiendo el procedimiento del fabricante. Se generaron cuatro bibliotecas genómicas de P. juliae por digestión del ADN con cuatro enzimas de restricción: EcoRV, PvuII, StuI, y Dral. Tras una etapa de purificación, se unieron las digestiones a un adaptador proporcionado en el kit. A continuación el procedimiento involucró dos reacciones de PCR, cada una con un cebador específico de gen y un cebador adaptador. La reacción secundaria de PCR usó una dilución de los productos de la reacción primaria de PCR como un molde. Para la dirección 5', se usaron los cebadores PD6D R8 y PD6D R2 para las reacciones primaria y secundaria de PCR, respectivamente. Para la dirección 3', se usaron los cebadores PD6D F8 y PD6D F3 para las reacciones primaria y secundaria de PCR, respectivamente. Las secuencias de los cebadores se dan a continuación:

PD6D R8:	5'-CACACATGACCGGATAAAACGACCAGT-3'	(SEC. ID Nº: 8)

PD6D R2:	5'-GGGAATGTACTGGAGGTCAGGGTCGTA-3'	(SEC. ID Nº: 9)

PD6D F8:	5'-CGTGCAGTTCAGCTTGAACCATTTCTC-3'	(SEC. ID Nº: 10)

PD6D F3:	5'-TGCAGGGACACTCAACATATCGTGCCC-3'	(SEC. ID Nº: 11)

La marcha genómica en la dirección 5' dio un fragmento de 574 pb de la biblioteca de EcoRV. Este producto se clonó en pCR®4-TOPO® (Invitrogen) dando pMON83956, y se secuenció el inserto. La secuencia resultante no contenía un codón de inicio del gen putativo de la delta 6 desaturasa y por consiguiente se realizó otra serie de reacciones de PCR usando cebadores específicos del gen diseñados para marchar en la dirección 5' del inserto de pMON83956. Los cebadores usados para la segunda serie de marcha genómica en la dirección 5' eran PD6D R15 y PD6D R14 para las reacciones primaria y secundaria de PCR, respectivamente. Las secuencias se dan a continuación:

PD6D R15:	5'- GTAGGTTGGTGGAGAAGGGAGGGAGGA-3'	(SEC. ID Nº: 12)

PD6D R14:	5'-GGAAGGGGGATGGTAAGCGAGGAAAGC-3'	(SEC. ID Nº: 13)

Se clonó un producto de 328 pb de longitud de la biblioteca de StuI en pCR®4-TOPO® (Invitrogen) dando pMON83958 y se secuenció el inserto. Este inserto contenía 2 codones de inicio potenciales, separados por 44 bases. El primer codón de inicio corresponde a la posición 87 y el segundo a la posición 135 de la SEC. ID Nº: 1. La marcha genómica en la dirección 3' dio como resultado un fragmento de 773 pb de la biblioteca de Dral. Este producto se clonó en pCR®4-TOPO®, dando pMON83957. Se secuenció el inserto y se encontró que contenía 292 pb de la región codificadora para el gen putativo de delta 6 desaturasa, seguido por un codón de parada en la posición 1473 con respecto a la SEC. ID Nº: 1.

Se alinearon los insertos de pMON83955, pMON83956, pMON83957 y pMON83958 para formar una secuencia compuesta, la SEC. ID Nº: 1. Se diseñaron tres cebadores para amplificar por PCR 2 longitudes diferentes de la secuencia codificadora de ADN genómico de P. juliae, que reflejan los dos codones de inicio que se encuentran en pMON83958. La más larga de las dos secuencias, PjD6D-1, se amplificó usando el cebador directo Pj D6D F2 y el cebador inverso Pj D6D R1. La más corta de las dos, PjD6D-2, se amplificó usando el cebador directo Pj D6D F1 y el cebador inverso Pj D6D R1. A continuación se unió cada una de las dos secuencias putativas codificadoras de delta 6 desaturasa en el vector de expresión de levadura pYES2.1-TOPO. Una vez secuenciado, el plásmido que contenía PjD6D-1 se denominó pMON83950 (SEC. ID Nº: 3) y el plásmido que contenía PjD6D-2 se denominó pMON67011 (SEC. ID Nº: 2). Las secuencias de cebadores se dan a continuación:

Pj D6D F2:	5'-GTCGACATGGAAAACACATTTTCACCACCACCT-3'	(SEC. ID Nº: 14)

Pj D6D F1:	5'-GTCGACATGACTAAGACCATTTACATAACCAGC-3'	(SEC. ID Nº: 15)

Pj D6D R1:	5'-CCTGCAGGTCACCCGACATTTTTAACAGCCTCCC-3'	(SEC. ID Nº: 16)

Los dos clones de PjA6 desaturasa, PjD6D-2 y PjD6D-1, codifican los polipéptidos potenciales de 446 aminoácidos y 462 aminoácidos, que se dan en SEC. ID Nº: 4 y SEC. ID Nº: 5, respectivamente. El sitio MET inicial de la secuencia del péptido más corta (PjD6D-2) está situada 16 aminoácidos secuencia abajo del primer sitio MET de la secuencia más larga (PjD6D-1). En dirección 3' de la segunda MET, las secuencias son idénticas. Estas secuencias tienen alta similitud con otras \Delta6 desaturasas de plantas (Fig. 1), incluido un dominio N-terminal del citocromo b_{5} que se encuentra en todas las desaturasas "front-end" (Napier y col., 2003). Dentro del dominio del citocromo b_{5} se encuentran los ocho residuos constantes característicos de la superfamilia del citocromo b_{5} y el motivo de unión a hemo H-P-G-G, que se ha mostrado que es esencial para la actividad enzimática (Napier y col., 1997, Sayanova y col, 1999, Sperling and Heinz 2001). Dentro del dominio de desaturasa de la desaturasa putativa PjD6D hay tres cajas de histidina conservadas que son características de todas las desaturasas unidas a membranas (Shanklin y col., 1994). Una característica típica que se encuentra en todas las desaturasas "front-end" es que la tercera caja de histidina contiene un residuo glutamina en la primera posición (Q-x-x-H-H) en lugar de una histidina (Napier y col., 1997, Napier y col., 2003, Sperling and Heinz 2001). La secuencia de aminoácidos deducida de la PjD6D tuvo aproximadamente el 88% de similitud con las desaturasas de Primula vialii y P. farinosa y aproximadamente el 64% de similitud con las desaturasas de Echium pitardii y E. gentianoides. La inspección visual de la alineación de múltiples secuencias mostrada en la Fig. 1 sugiere que la secuencia de \Delta6 desaturasa de P. juliae no contiene ningún intrón. Esto se ha observado
en las \Delta6 desaturasas de las especies de Primula y Echium (Sayanova y col., 2003, García-Maroto y col., 2002).

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Ejemplo 2 Transformación y expresión en levaduras

Los construcciones pMON83950 (Fig. 3) y pMON67011 (Fig. 2) se introdujeron en la cepa huésped de Saccharomyces cerevisiae INVSc1 (Invitrogen), que es auxótrofa para uracilo, usando el protocolo PEG/Li Ac como se describe en el manual de Invitrogen para pYES2.1/V5-His-TOPO. Los transformantes se seleccionaron de placas preparadas de medio SC mínimo sin uracilo con glucosa al 2%. Las colonias de transformantes se usaron para inocular 5 ml de medio SC mínimo sin uracilo y glucosa al 2% y se cultivaron durante la noche a 30ºC. Para la inducción, se sedimentaron las células de levadura en fase estacionaria y se resuspendieron en medio SC mínimo sin uracilo suplementado con galactosa al 2% y se cultivaron durante 3 días a 15ºC. Cuando se proporcionaron ácidos grasos exógenos a los cultivos, se añadió LA al 0,01% (\Delta9,12-18:2) con el emulsivo Tergitol al 0,1%. Se dejaron crecer los cultivos durante 3 días a 15ºC, y posteriormente se recogieron por centrifugación. Los sedimentos celulares se lavaron una vez con tampón TE estéril pH 7,5, para eliminar el medio y se liofilizó durante 24 horas. La cepa huésped transformada con el vector que contenía el gen LacZ se usó como un control negativo en todos los estudios.

Se extrajeron los lípidos de los sedimentos liofilizados de levaduras añadiendo 0,1 ml de tolueno e incubando durante la noche a temperatura ambiente. Los lípidos extraídos se convirtieron en metilésteres de ácidos grasos (FAME) in situ por medio de la adición de 0,5 ml de metóxido de sodio 0,6 N en metanol e incubando durante 45 minutos. Los FAME se extrajeron por medio de la adición de 0,8 ml de NaCl al 10% (p/v) y 0,15 ml de heptano. La fase de heptano que contenía los FAME se retiró y se usó directamente para cromatografía gaseosa (CG). Los FAME se identificaron en un Hewlett-Packard 5890 II Plus GC (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) equipado con un detector de ionización de llama y una columna de capilaridad (omegawax 250; 30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25 \mum; Supelco, Bellefonte, PA). Se usó una relación de división de flujo de 100:1 para las inyecciones. El inyector se mantuvo a 250ºC y el detector de ionización de llama se mantuvo a 270ºC. La temperatura de la columna se mantuvo en 180ºC durante 1,5 minutos tras la inyección, se aumentó hasta 240ºC a 40ºC/minutos, y se mantuvo en 245ºC durante 3,38 minutos.

La Tabla 1 muestra la composición de ácidos grasos para levadura que expresa los clones de P. juliae pMON67011 (PjD6D-2), pMON83950 (PjD6D-1) o \Delta6 desaturasa de Mortierella alpina, pMON77205. Los productos esperados para la desaturación \Delta6 de LA y ALA se observaron para ambos clones de P. juliae (Tabla 1, GLA y SDA, respectivamente), demostrando que los clones contenidos en pMON67011 y pMON83950 son \Delta6desaturasas. La selectividad del sustrato se determinó por alimentación de cantidades iguales de LA y ALA. M. alpina es un hongo filamentoso que acumula altos niveles del ácido graso n-6 ácido araquidónico y se esperaba que tuviera una \Delta6 desaturasa con selectividad n-6. La Tabla 2 muestra las selectividades de sustrato n-3:n-6 de las \Delta6 desaturasas de P. juliae y M. alpina. Se observó una selectividad para n-3:n-6 de aproximadamente 0,8 para la \Delta6 desaturasa de M. alpina. Se observó una selectividad para n-3:n-6 de aproximadamente 1,5-1,9 para ambos clones de \Delta6 desaturasa de P. juliae.

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TABLA 1 Comparación de la composición de ácidos grasos de levaduras que expresan diferentes \Delta6 desaturasas

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TABLA 2 Comparación de selectividades de sustrato n-3:n-6 para \Delta6 desaturasas de P. juliae y M. alpina

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Ejemplo 3 Transformación y expresión en plantas de \Delta6-desaturasa de Primula juliae

La actividad de la \Delta6-desaturasa de P. juliae se evaluó en semilla de soya al combinarla con una \Delta15-desaturasa de Neurospora crassa (NcD15D), pMON77245 (Fig. 4), o de Aspergillus nidulans (AnD15D), pMON77247 (Fig. 5). El vector pMON77245 se construyó en tres etapas. Primero se colocó la \Delta6-desaturasa de P. juliae (PjD6D-2) detrás del promotor 7S alfa específico de la semilla digiriendo el pMON67011 con Sse8387 I, seguido por la eliminación de los salientes 3', y Sal I, y a continuación uniendo el fragmento resultante en la EcoRI y rellenando los sitios de XhoI del vector de expresión pMON68527, generando el vector pMON77243. En segundo lugar, se eliminó la casete de expresión PjD6D-2 de pMON77243 digiriendo con NotI, seguido por una reacción de relleno, y a continuación se unió el fragmento resultante en el sitio de EcoRV del vector binario 2T pMON77244. Finalmente, se combinó un codón optimizado de NcD15D (SEC. ID Nº: 17) bajo el control de un promotor específico de semilla 7S alfa con el PjD6D-2 digiriendo pMON77227 con NotI y a continuación uniendo el fragmento de la casete de expresión resultante de NcD15D en pMON77344 digerido con NotI para dar pMON77245 (Fig. 4). El vector pMON77247 (Fig. 5) se construyó digiriendo el vector pMON77242 con NotI y uniendo el fragmento de la casete de expresión resultante que comprende un codón optimizado AnD15D (SEC. ID Nº: 18) unido al promotor 7S alfa en el sitio de NotI de pMON77244. Los vectores pMON77245 y pMON77247 se transformaron en semilla de soya usando el procedimiento de Martineli y col. (Patente de EEUU Nº: 6.384.301).

La expresión de la secuencia codificadora de PjD6D-2 se midió determinando la composición de ácidos grasos de semillas de soya transgénicas R1 inmaduras (aproximadamente 30 días después de florecer), incluyendo homocigotas y heterocigotas, por cromatografía gaseosa de derivados de metiléster de lípidos (PCT US03/16144, presentado el 21 de mayo de 2003. Los niveles de PA (ácido palmítico, 16:0), SA (ácido esteárico, 18:0), OA, LA, GLA, ALA, y SDA están expresados como un porcentaje del peso total de los ácidos grasos medidos y se muestran en las Tablas 3 y 4 a continuación. La línea de control no transgénica fue A3525. Siempre que fuera posible, se analizaron cinco semillas individuales de cada suceso.

Se encontró que la semilla individual de la mayoría de los sucesos transgénicos de pMON77245 acumuló cantidades de SDA que pueden medirse. En todos los casos, los niveles de SDA fueron mayores que los de GLA, con una proporción de SDA:GLA promedio para cada suceso que varía desde 2:1 hasta un máximo de 8:1. Se observó el valor más elevado de semilla única del suceso GM_A38083, que contenía SDA al 32,0% y GLA al 2,6%, con una proporción SDA:GLA de 12:1. De los 12 sucesos que se muestran a continuación, 9 tuvieron valores de SDA > 10% en al menos una de cinco semillas. A medida que aumentaron los valores de SDA, los niveles de PA, SA y OA no variaron significativamente de los niveles de control; sin embargo, existe una correlación negativa fuerte para LA. En las semillas que acumularon SDA, los niveles de GLA permanecen bajos, entre 2,3 y 5,5%. Los niveles de ALA aumentaron junto con los niveles de SDA.

TABLA 3 Resultados en porcentaje de área relativa (aproximadamente en por ciento en peso) de semillas R1 únicas transformadas con pMON77245

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TABLA 3 (continuación)

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TABLA 3 (continuación)

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La semilla individual de los sucesos transgénicos pMON77247 acumularon cantidades similares de SDA comparados con pMON77245, con excepción del suceso GM_A38083 que acumuló niveles significativamente más altos de SDA. Los niveles de PA, SA, OA, y LA fueron similares a los niveles de control que se muestran en la Tabla 3. En general, los niveles de SDA fueron mayores a los de GLA con una relación de SDA-GLA promedio de cada suceso que varía desde 1:1 hasta 1,6:1, que fue menor que la observada para pMON77245.

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TABLA 4 Resultados en porcentaje de área relativa (aproximadamente en por ciento en peso) de las semillas R1 únicas de pMON77247

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TABLA 4 (continuación)

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Ejemplo 4 Actividad de la \Delta6-desaturasa de Primula juliae en combinación con la \Delta15-desaturasa de Neurospora crassa en la canola

Se evaluó la actividad de la \Delta6-desaturasa de Primula juliae en combinación con la \Delta15-desaturasa de Neurospora crassa transformando canola con el MON82822 (Fig. 7). El pMON82822 contenía una NcD15D nativa (SEC. ID Nº: 19) así como PjD6D-2, ambas insertadas en una casete de expresión específica de semilla bajo el control del promotor de napina (PCT US03/16144).

El vector pMON82822 se construyó digiriendo primero el pMON77214 (PCT US03/16144) con PmeI y BamHI (relleno) y uniendo la casete de napina nativa NcD15D en el sitio de EcoRV del vector binario 2T pMON71801 para generar pMON82820. A continuación, se digirió pMON82819 con NotI, se rellenaron los extremos y la casete de expresión de napina de PjD6D-2 resultante se unió en el sitio de AscI rellenado de pMON82820 para generar pMON82822.

También se construyó un segundo vector, pMON82821, conteniendo la NcD15D optimizada con codones (SEC. ID Nº: 17) y PjD6D-2 pMON82821 digiriendo primero pMON67011 con SalI y Sse8387I y uniendo el fragmento resultante de PjD6D-2 en los sitios de la casete de expresión de napina de SalI y XhoI (rellenados) en pMON82800 dando pMON82819. La casete de napina que contiene una NcD15D con optimizada con codones se construyó digiriendo pMON67024 con PmeI y BamHI (rellenado) y uniendo el fragmento resultante en un vector 2T binario, pMON71801, digerido con EcoRV, dando pMON82801. Finalmente, se digirió pMON82819 con NotI, se rellenó y se unió la casete de expresión de napina resultante de PjD6D-2 en el sitio de NotI rellenado de pMON82801 dando pMON82821.

pMON82822 se transformó en canola (Brassica napus) usando una modificación del protocolo descrito por Radke y col., (Plant Cell Reports 11: 499-505, 1992). Brevemente, se desinfectaron las semillas de canola de la variedad "Ebony" (Monsanto Canada, Inc., Winnipeg, Canadá) y germinaron in vitro como se describió en Radke y col., 1992. El precocultivo con placas de hojas de tabaco, la preparación de los explantes y la inoculación de los explantes con cepa ABI de Agrobacterium tumefaciens (Koncz and Schell, Mol Gen Gen204: 383-396 (1986)) conteniendo el vector deseado fueron como se describió manteniendo al Agrobacterium en medio LB (sólido o líquido) que contenía espectinomicina 75 mg/l, cloranfenicol 25 mg/l y kanamicina 50 mg/l. Para la transformación de las plantas incluidos la inducción de callos, la regeneración de brotes, la maduración y el enraizamiento, se usó la selección con glifosato más que la selección con canamicina como se describió en Radke y col., 1992. Específicamente, el medio de inducción de callos B5-1 se suplementó con carbenicilina 500 mg/l y Timentin 50 mg/l (Duchefa Biochemie BV) para inhibir el crecimiento de Agrobacterium y se omitió la kanamicina del medio. El medio de regeneración de brotes B5BZ contenía, además, carbenicilina 500 mg/l, Timentin 50 mg/l y glifosato 45 mg/l, con transferencia de los explantes a medio fresco cada dos semanas.

Los brotes seleccionados con glifosato se transfirieron a un medio de maduración de brotes B5-0 libre de hormonas que contenía carbenicilina 300 mg/l y glifosato 45 mg/l durante dos semanas y finalmente se transfirieron los brotes a un medio de inducción de raíces B5 que contenía glifosato 45 mg/l. Las plántulas verdes enraizadas se transplantaron a un suelo abonado y se aclimataron a las condiciones de invernadero. Las plantas de mantuvieron en un invernadero bajo condiciones convencionales. La composición de ácidos grasos de la semilla madura se determinó por análisis de CG de lípidos derivados de metiléster como se hizo anteriormente para los transformantes de semilla de soya. El análisis de CG de semilla de canola de plantas transformadas con pMON82822 dio 199 sucesos con niveles de SDA que varían desde 0,12 hasta 4,49% (% en peso, combinación de 100 semillas).

Ejemplo 5 Construcción y transformación de los vectores de expresión de PjD6D para soya, maíz y canola

La expresión de las secuencias de PjD6D solas se evalúa in planta para la canola, el maíz y la soya bajo la expresión de un promotor específico de semilla. Se construye un vector de expresión de soya digiriendo pMON77243 con Not I y uniendo el fragmento resultante que contiene PjD6D-2 en el sitio de Not I del vector binario pMON17227. Se construye un vector de expresión de canola digiriendo pMON83950 con SalI y Sse8387I (convertido en romo) y uniendo el fragmento resultante, que contiene la región codificadora de PjD6D-1 en los sitios de SalI y XhoI (rellenados) del vector de expresión de la casete de napina pMON82800. A continuación se digiere el plásmido resultante con Not I seguido por la unión de la casete de expresión de napina-PjD6D-1 resultante en el sitio de Not I del vector binario pMON17227. Se construye un vector de expresión de maíz digiriendo pMON83950 con Sal I (rellenado) y Sse83872I (convertido en romo) y uniendo el fragmento PjD6D-1 resultante en el sitio de SfiI (convertido en romo) de la casete de expresión de globulina en pMON71084. A continuación se digiere el vector resultante con PmeI y HindIII y posteriormente se une la casete de expresión en los sitios de HpaI y HindIII del vector binario pMON30167.

La actividad de la \Delta6-desaturasa de P. juliae en el maíz se evalúa en combinación con una \Delta15-desaturasa de Neurospora crassa optimizada con codones para el maíz (NcD15Dnno) (SEC. ID Nº: 20). El vector pMON67011 se digiere con SaII y Sse8387I (convertido en romo) y el fragmento PjD6D-2 resultante se une en el sitio de Sfil (rellenado) de la casete de expresión de globulina en pMON71084 para dar pMON82823. A continuación, se digiere pMON82806 (PCT US03/16144) con PmeI y HindIII y se une la casete de globulina de NcD15Dnno resultante en los sitios de NotI (rellenado) y HindIII del vector binario 1T pMON30167 para dar pMON82824. Finalmente se combina la casete de globulina de PjD6D-2 con globulina de NcD15Dnno digiriendo pMON82823 con PmeI y HindIII y uniendo el fragmento resultante en los sitios de SmaI y HindIII de pMON82824 dando pMON82825. El vector resultante se introduce en el maíz por medio de una transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens como conocen los expertos en la técnica, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº: 6.603.061.

Ejemplo 6 Clonación de secuencias de \Delta6 desaturasa de Primula waltonii y Primula alpicola

La clonación de los genes de \Delta6 desaturasa de Primula waltonii (PwD6D) y \Delta6 desaturasa de P. alpicola (PaD6D) se llevó a cabo por amplificación por PCR de una región de ADN genómico interna parcial usando oligonucleótidos redundantes, seguida por la marcha genómica bidireccional. Se aisló el ADN genómico total de P. waltonii y P. alpicola (Collector's Nursery) usando el Dneasy Plant Mini Kit (Qiagen), siguiendo el procedimiento del fabricante. Se aislaron dos fragmentos del ADN genómico de P. alpicola usando los oligonucleótidos redundantes BO-1 Dir y BO-2 Inv como está descrito por García-Maroto y col. 2002:

BO-1 Dir:	5'-ATMAGYATYGGTTGGTGGAARTGG-3'	(SEC. ID Nº: 6)

BO-2 Inv:	5'-AATCCACCRTGRAACCARTCCAT-3'	(SEC. ID Nº: 7)

El primer fragmento de P. alpicola tenía una longitud de 550 pb y correspondió a las posiciones 553 a 1103 de SEC. ID Nº: 21. Este fragmento se clonó en pCR®4-TOPO® (Invitrogen) para dar el vector pMON83977 (sin intrón). El segundo fragmento de P. alpicola tenía una longitud de 550 pb y correspondió a las posiciones 763 a 1313 de SEC. ID Nº: 23. Este fragmento se clonó en pCR®4-TOPO® (Invitrogen) para dar el vector pMON83975 (que contiene intrón). Se obtuvo un fragmento de P. waltonii que tenía una longitud de 550 pb y correspondió a las posiciones 763 a 1313 de SEC. ID Nº: 25. Este fragmento se clonó en pCR®4-TOPO® (Invitrogen) para dar el vector pMON83976. Las secuencias de polipéptidos codificadas por las SEC. ID Nº: 21, 23 y 25 se dan en las SEC. ID Nº: 22, 24 y26, respectivamente.

Para determinar las secuencias genómicas vecinas de los insertos de pMON83975, pMON83976, y pMON83977, se utilizó un Universal Genome Walker Kit^{TM} (BD Biosciences), siguiendo el procedimiento del fabricante. Se generaron cuatro bibliotecas genómicas para cada especie de Primula digiriendo el ADN con cuatro enzimas de restricción: EcoRV, PvuII, StuI, y DraI. Tras una etapa de purificación, se unieron las digestiones a un adaptador proporcionado en el kit. A continuación el procedimiento involucró dos reacciones de PCR, cada una con un cebador específico de gen y un cebador- adaptador. La reacción secundaria de PCR usó una dilución de los productos de la reacción primaria de PCR como un molde.

A. pMON83975 (PaD6D-2)

Para la dirección 5', se usaron los cebadores PD6D R7 y PD6D R1 para las reacciones de PCR primaria y secundaria, respectivamente. Para la dirección 3', se usaron los cebadores PD6D F7 y PD6D F1 para las reacciones de PCR primaria y secundaria, respectivamente. Las secuencias de los cebadores se dan a continuación:

PD6D R7:	5'-CACACATGACCGGATAAAACGTCCAGT-3'	(SEC. ID Nº: 27)

PD6D R1:	5'-AGGGATATACTGGAGGTCGGGGTCGTA-3'	(SEC. ID Nº: 28)

PD6D F7:	5'- GAGCTATTCCGTTACGGGGATACAACA -3'	(SEC. ID Nº: 29)

PD6D F1:	5'- TGCAGGGACACTTAACATATCGTGCCC-3'	(SEC. ID Nº: 30)

La marcha genómica en la dirección 5' dio un fragmento de 751 pb de la biblioteca de EcoRV. Este producto se clonó en pCR®4-TOPO® (Invitrogen) dando pMON83978, y se secuenció el inserto. La secuencia resultante no contenía un codón de inicio del gen putativo de delta 6 desaturasa y por consiguiente se realizó otra serie de reacciones de PCR usando cebadores específicos del gen diseñados para marchar en la dirección 5' del inserto de pMON83978. Los cebadores usados para la segunda serie de marchas genómicas en la dirección 5' fueron PD6D R17 y PD6D R16 para las reacciones de PCR primaria y secundaria, respectivamente. Las secuencias se dan a continuación:

PD6D R17:	5'- GTGAAAGTTGTTGAGGAGGGATCGGTA-3'	(SEC. ID Nº: 31)

PD6D R16:	5'-GTGGAAGGAGGATGGTAAGCGAGGAAA-3'	(SEC. ID Nº: 32)

Se clonó un producto de una longitud de 473 pb de la biblioteca de PvuII en pCR®4-TOPO® dando pMON83980 y se secuenció el inserto. Este inserto contenía un codón de inicio que corresponde a la posición 1 de SEC. ID Nº: 23. La marcha genómica en la dirección 3' dio como resultado un fragmento de 942 pb de la biblioteca de DraI. Este producto se clonó en pCR®4-TOPO®, dando pMON83979. Se secuenció el inserto y se encontró que contiene 294 pb de la región codificadora para el gen putativo de delta 6 desaturasa, seguido por un codón de parada en la posición 1549 con respecto a la SEC. ID Nº: 23.

Se alinearon los insertos de pMON83975, pMON83978, pMON83980 y pMON83979 para formar una secuencia compuesta de un gen putativo de \Delta6 desaturasa para P. alpicola dando PaD6D-2, SEC. ID Nº: 23. Se diseñaron dos cebadores para amplificar por PCR el marco de lectura abierto completo del ADN genómico de P. alpicola. Las secuencias de los cebadores se dan a continuación:

Pa D6D F1:	5'- GTCGACATGGCTAACAAATCTCAAACAGGTTAC-3'	(SEC. ID Nº: 33)

Pa D6D R1:	5'- CCTGCAGGTCACCCGAGAGTTTTAACAGCCTCC-3'	(SEC. ID Nº: 34)

El fragmento amplificado por PCR (SEC. ID Nº: 23) se unió a continuación en el vector de expresión de levadura pYES2.1-TOPO dando el vector pMON83968.

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B. pMON83976 (PwD6D)

Se amplificó por PCR una \Delta6 desaturasa putativa de ADN genómico de P. waltonii usando los cebadores Pa D6D F1 (SEC. ID Nº: 33) y Pa D6D R1 (SEC. ID Nº: 34) que se muestran a continuación. El fragmento amplificado por PCR (SEC. ID Nº: 25) se unió a continuación en vector de expresión de levadura pYES2.1-TOPO dando el vector pMON83967.

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C. pMON83977 (PaD6D-1)

Para la dirección 5', se usaron los cebadores PD6D R9 y PD6D R4 para las reacciones de PCR primaria y secundaria, respectivamente. Para la dirección 3', se usaron los cebadores PD6D F9 y PD6D F4 para las reacciones de PCR primaria y secundaria, respectivamente. Las secuencias de los cebadores se dan a continuación:

PD6D R9:	5'-CACACATTACCGGATAAAACGTCCAGT-3'	(SEC. ID Nº: 35)

PD6D R4:	5'-AGGAATATACTGGAGGTCTGGGTCGTA-3'	(SEC. ID Nº: 36)

PD6D F9:	5'- ATTTTTCTTCGGACGTATACATGGGCC -3'	(SEC. ID Nº: 37)

PD6D F4:	5'- TTCGGGGACACTGAACATATCGTGCCC-3'	(SEC. ID Nº: 38)

La marcha genómica en la dirección 5' dio un fragmento de 979 pb de la biblioteca de StuI. Este producto se clonó en pCR®4-TOPO® (Invitrogen) dando pMON83981, y se secuenció el inserto. La secuencia resultante contenía el codón de inicio de la delta 6 desaturasa putativa en la posición 1 con respecto a la SEC. ID Nº: 21. La marcha genómica en la dirección 3' dio como resultado un fragmento de 1028 pb de la biblioteca de DraI. Este producto se clonó en pCR®4-TOPO® (Invitrogen), dando pMON83982. El inserto se secuenció y se encontró que contiene 295 pb de la región codificadora para el gen putativo de delta 6 desaturasa, seguido por un codón de parada en la posición 1339 con respecto a la SEC. ID Nº: 21.

Se alinearon los insertos de pMON83977, pMON83981 y pMON83982 para formar una secuencia compuesta de un segundo gen putativo de \Delta6 desaturasa para P. alpicola dando PaD6D-1, SEC. ID Nº: 21. Se diseñaron dos cebadores para amplificar por PCR el marco de lectura abierto completo del ADN genómico de P. alpicola. Las secuencias de los cebadores se dan a continuación:

Pf D6D-F2:	5'-GTCGACATGGCCAACACTAGTTACATTTCCAGCT-3'	(SEC. ID Nº: 39)

Pf D6D-R2:	5'-GATATCACCCCAGAGTGTTAACAGCTTCCCAG-3'	(SEC. ID Nº: 40)

El fragmento amplificado por PCR se unió a continuación en el vector de expresión de levadura pYES2.1-TOPO dando el vector pMON67026 (SEC. ID Nº: 21).

La alineación de PaD6D-2 y PwD6D (también abreviado PRIwaD6D) con otros genes de \Delta6 desaturasa de plantas caracterizados reveló que estos dos genes contenían un intrón único correspondiente a las posiciones 476 a 676 en SEC. ID Nº: 23 y a las posiciones 476 a 651 en SEC. ID Nº: 25. Esto se ha observado en \Delta6 desaturasas de las especies de Primula y Echium (Sayanova y col., 2003, García-Maroto y col, 2002).

Los tres clones de \Delta6 desaturasa codifican polipéptidos potenciales de 446 aminoácidos para PaD6D-1 (SEC. ID Nº: 22), 449 aminoácidos para PaD6D-2 (SEC. ID Nº: 24) y 449 aminoácidos para PwD6D (SEC. ID Nº: 26). Estas secuencias tienen alta similitud con otras \Delta6 desaturasas de plantas (Fig. 1), incluido un dominio N-terminal del citocromo b_{5}, que se encuentra en todas las desaturasas front-end (Napier y col., 2003). Dentro del dominio del citocromo b_{5} se encuentran los ocho residuos constantes característicos de la superfamilia de citocromo b_{5} y el motivo de unión al hemo H-P-G-G, que se ha demostrado que es esencial para la actividad enzimática (Napier y col., 1997, Sayanova y col., 1999, Sperling and Heinz 2001). Dentro del dominio de desaturasa de las desaturasas PaD6D-1, PaD6D-2, y PwD6D hay tres cajas de histidina conservadas que son características de todas las desaturasas unidas a membrana (Shanklin y col., 1994). Una característica típica que se encuentra en todas las desaturasas front-end es que la tercera caja de histidina contiene un residuo glutamina en la primera posición (Q-x-x-H-H) en lugar de una histidina (Napier y col., 1997, Napier y col., 2003, Sperling and Heinz 2001). La secuencia de aminoácidos deducida de la PaD6D-1 tuvo aproximadamente el 80% de similitud con PaD6D-2 y aproximadamente 80% de similitud con PwD6D. Sin embargo, los dos genes que contienen intrones, PaD6D-1 y PaD6D, son más similares uno al otro con aproximadamente el 97% de similitud, que los dos genes de P. alpicola, PaD6D-2 y PwD6D, entre si.

Ejemplo 7 Clonación de otras secuencias de \Delta6 desaturasa de Primula

Se aisló ADN genómico de P. farinosa y P. florindae usando un sistema de lisis Sarkosyl/CTAB. Se trituraron cinco gramos de tejido de cada especie en un mortero con pilón con nitrógeno líquido hasta formar un polvo fino. A continuación se resuspendió el tejido en polvo en tampón de lisis (sorbitol 140 mM, Tris-HCl 220 mM, pH 8,0, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 22 mM, cloruro de sodio(NaCl) 800 mM, N-laurilsarcosina al 1% y bromuro de hexadeciltrimetil amonio (CTAB) al 0,8%) y se incubó durante 1 hora a 65ºC con inversión suave cada 10 minutos. Tras la incubación, se añadieron 10 ml de cloroformo a la suspensión de lisis y se incubó a temperatura ambiente con agitación suave durante 20 minutos. Se centrifugó la suspensión de lisis durante 10 minutos a 12.000 X g. Se transfirió la fase acuosa a un tubo limpio y se precipitó el ácido nucleico con isopropanol al 0,6%. El sedimento de ácido nucleico se resuspendió en 4 ml de una disolución que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 1 M y 20 mg de Proteinasa K. A continuación se incubó el ácido nucleico resuspendido durante 2 horas a 63ºC. A continuación se inactivó la Proteinasa K con calor por medio de incubación a 75ºC durante 20 minutos. Se añadió RNasa (2,5 \mug) a la disolución y se incubó a 37ºC durante 1 hora. Se extrajo la disolución con un volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) 2 veces. A continuación se precipitó el ADN genómico purificado con etanol.

Se digirieron aproximadamente, 3 \mug de ADN genómico en reacciones separadas con las endonucleasas de restricción, EcoRI, HindIII, KpnI, SalI y Xhol. Tras la digestión, se purificó cada reacción usando un kit de purificación de PCR QIAquick® (Qiagen, Valencia, CA), siguiendo el protocolo del fabricante. Se eluyó el ADN genómico digerido de las columnas de purificación usando 100 \mul de tampón de elución suministrado en el kit. Las interacciones intramoleculares favorecedoras de la unión se realizaron en un volumen de 200 \mul usando 20 \mul del ADN genómico digerido eluido en una reacción de unión libre de PEG con 800 unidades de ligasa (M0202L) (New England Biolabs, Beverly MA) durante la noche a 16ºC, seguido por inactivación con calor a 75ºC durante 10 minutos. Tras la unión, se purificó nuevamente la reacción usando un kit de purificación de PCR QIAquick®. Se realizó la PCR inversa usando 6-20 ng de ADN unido purificado y de 10 a 20 pg de cebador y el sistema de PCR de Expansión de Molde Largo (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Los cebadores se muestran en la Tabla 5 y se diseñaron usando una combinación de datos de secuencias disponibles y datos que cubren el dominio de desaturasa. Las condiciones de ciclos térmicos estaban constituidas por una incubación inicial a 94ºC durante 2 minutos; 10 ciclos de 94ºC durante 20 segundos, 52ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 8 minutos; seguido por 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 52ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 8 minutos más 10 segundos por ciclo. Una vez completados los ciclos, se realizó otra incubación a 68ºC durante 7 minutos. Los productos de la biblioteca de PCR inversa visibles tras la electroforesis en agarosa se clonaron en pCR®2.1-TOPO o en pCR®4Blunt-TOPO (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Se clonaron los siguientes fragmentos de la biblioteca inversa (con tamaño aproximado) P. farinosa-EcoRI (6 kb) y P. florindae-HindIII (3 kb). La secuenciación del ADN se llevó a cabo en un Analizador de ADN Applied Biosystems 3730x1 usando Big Dye® Terminator v3.0.

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TABLA 5 Cebadores y fragmentos usados en la determinación por PCR inversa de las regiones 5' y 3' de los genes de delta 6 desaturasa

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Las secuencias putativas se alinearon con datos públicos para determinar la región aproximada del marco de lectura abierto (ORF) cubierto por cada gen. Se diseñaron cebadores para amplificar el ORF de cada gen basándose en los datos de PCR inversa alineados. Se usaron polimerasas de corrección para amplificar los genes putativos del delta 6 para asegurar la fidelidad del producto final. Los cebadores usados en la clonación final de las genes putativos de la delta 6 desaturasa se muestran en la Tabla 6. Los productos se clonaron en pUC19 o en pCR®4Blunt-TOPO (Invitrogen). La secuenciación del ADN se llevó a cabo en un Analizador de ADN Applied Biosystems 3730x1 usando Big Dye® Terminator v3.0. Se clonaron dos genes putativos de delta 6 desaturasa: P. farinosa (PfaD6D) (pMON84809) (SEC. ID Nº: 45) y P. florindae (PflD6D) (pMON84810) (SEC. ID Nº: 47).

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TABLA 6 Cebadores usados para amplificar los genes de delta 6 desaturasa

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Se diseñaron dos cebadores para amplificar el marco de lectura abierto de PfaD6D completo de pMON84809. El fragmento resultante se unió en el vector de expresión de levadura pYES2.1-TOPO dando pMON67065. Los dos cebadores se dan a continuación.

Pfar F1:	5'- GTCGACAACAATGTCCAACACATATCCACCAAATC -3'	(SEC. ID Nº: 53)

Pfar R1:	5'- CCTGCAGGTCACCCCAGAGTGTTAACAGCTTC -3'	(SEC. ID Nº: 54)

Se diseñaron dos cebadores para amplificar el gen de PflD6D completo que contenían 2 exones y 1 intrón de pMON84810. El fragmento resultante se unió en el vector pYES2.1-TOPO dando pMON67067. Los dos cebadores se dan a continuación.

PW F1:	5'- GTCGACATGGCTAACAAATCTCAAAC -3'	(SEC. ID Nº: 55)

PW R2:	5'- CCTGCAGGTCACCCGAGAGT -3'	(SEC. ID Nº: 56)

Los dos clones de \Delta6 desaturasa codifican polipéptidos potenciales de 454 aminoácidos para PfaD6D (SEC. ID Nº: 46) y 449 aminoácidos para PflD6D (SEC. ID Nº: 48). Estas secuencias tienen alta similitud con otras \Delta6 desaturasas de plantas (Fig. 1), incluido un dominio N-terminal del citocromo b_{5}, que se encuentra en todas las desaturasas front-end (Napier y col., 2003). Dentro del dominio del citocromo b_{5} se encuentran los ocho residuos constantes característicos de la superfamilia de citocromo b_{5} y el motivo de unión al hemo H-P-G-G, que se ha demostrado que es esencial para la actividad enzimática (Napier y col., 1997, Sayanova y col., 1999, Sperling and Heinz 2001). Dentro del dominio de desaturasa de las desaturasas putativas de PflD6D y PfaD6D hay tres cajas de histidina conservadas que son características de todas las desaturasas unidas a membrana (Shanklin y col., 1994). Una característica típica que se encuentra en todas las desaturasas front-end es que la tercera caja de histidina contiene un residuo glutamina en la primera
posición (Q-x-x-H-H) en lugar de una histidina (Napier y col., 1997, Napier y col., 2003, Sperling and Heinz 2001).

Ejemplo 8 Eliminación del intrón

La alineación de los tres clones de Primula PaD6D-2 (SEC. ID Nº: 22), PwD6D (SEC. ID Nº: 25), y PflD6D (SEC. ID Nº: 47) revelaron amplia similitud entre las secuencias de ADN. PaD6D-2 tuvo aproximadamente 97% de similitud con PwD6D y aproximadamente 98% de similitud con PflD6D. PwD6D tuvo aproximadamente 98% de similitud con PflD6D. Se utilizó un procedimiento de PCR de 2 etapas para eliminar la región del intrón de cada gen. Brevemente, el procedimiento implica la amplificación de los dos exones en PCR separadas, seguidas por un segundo ciclo de amplificación por PCR para combinar los dos exones juntos. Se usó la misma serie de cebadores para cada amplificación de genes por la amplia similitud entre los tres genes de \Delta6 desaturasa.

Se diseñaron dos series de cebadores para amplificar el exón 1 del inserto de PwD6D en pMON83967. El tamaño del producto amplificado fue de 475 pb y correspondió al exón 1 de PwD6D. Los dos cebadores se dan a continuación.

Pw F1:	5'- GTCGACATGGCTAACAAATCTCAAAC -3'	(SEC. ID Nº: 55)

Pw R1:	5'-GTAATGCCCAGAGTCGTGACCTATCCATCCGCACTGGATCC -3'	(SEC. ID Nº: 57)

El exón 2 se amplificó por PCR de pMON83967 usando las secuencias de cebadores que se muestran a continuación. El tamaño del producto amplificado fue de 875 pb.

Pw F2:	5'- GATCCAGTGCGGATGGATAGGTCACGACTCTGGGCATTACCG -3'	(SEC. ID Nº: 58)

Pw R2:	5'- CCTGCAGGTCACCCGAGAGT-3'	(SEC. ID Nº: 56)

Los productos amplificados del exón 1 y el exón 2 se combinaron a continuación junto con los cebadores Pw F1 y Pw R2 para amplificar por PCR el ORF completo menos el intrón original. El fragmento resultante de 1350 pb se unió en el vector de expresión de levadura pYES2.1-TOPO dando pMON67062.

La eliminación de la región del intrón de PaD6D-2 en pMON83968 y PflD6D en pMON84810 se realizó utilizando el mismo procedimiento que se describió anteriormente para PwD6D. Los tamaños de los exones fueron iguales a los de PwD6D. Los fragmentos de exones combinados de 1350 pb resultantes se unieron en el vector de expresión de levadura pYES2.1-TOPO dando pMON67063 para PaD6D-2 y pMON67064 para PflD6D.

Ejemplo 9 Transformación y expresión en levaduras

Se introdujeron las construcciones pMON83950 (Fig. 3), pMON67011 (Fig. 2), pMON67026, pMON67062, pMON67064, y pMON67065 en la cepa de Saccharomyces cerevisiae auxótrofa para uracilo INVSc1 (Invitrogen) usando el Kit de Transformación EasyComp de S. cerevisiae (Invitrogen). Los transformantes se seleccionaron en placas preparadas de medio SC mínimo sin uracilo con glucosa al 2%. Las colonias de transformantes se usaron para inocular 5 ml de medio SC mínimo sin uracilo y glucosa al 2% y se cultivaron durante la noche a 30ºC. Para la inducción, se sedimentaron las células de levadura en fase estacionaria y se resuspendieron en medio SC mínimo sin uracilo suplementado con galactosa al 2% y se cultivaron durante 1 día a 25ºC seguido por 3 días a 15ºC. Cuando se proporcionaron ácidos grasos exógenos a los cultivos, se añadió LA (\Delta9, 12-18:2) al 0,01% y ALA (\Delta9, 12, 15-18:3) al 0,01% con el emulsivo Tergitol al 0,1% (p/v). Se dejaron crecer los cultivos durante 1 día a 25ºC seguido por 3 días a 15ºC, y posteriormente se recogieron por centrifugación. Los sedimentos celulares se lavaron una vez con tampón TE estéril pH 7,5, para eliminar el medio y se liofilizó durante 24 horas. La cepa huésped transformada con el vector que contenía el gen LacZ se usó como un control negativo en todos los estudios.

Se prepararon los FAME a partir de sedimentos liofilizados de levaduras por medio de transmetilación con 0,5 ml de H_{2}SO_{4} al 5% (v/v) en metanol conteniendo 2,6-Di-terc-butil-4-metoxifenol 0,075 mg/ml durante 90 minutos a 90ºC. Se extrajeron los FAME añadiendo 0,9 ml de NaCl al 10%(p/v) y 0,3 ml de heptano. La fase de heptano que contenía los FAME se eliminó y se usó directamente para CG como se describió en el Ejemplo 2.

Los resultados mostrados en la Tabla 7 demuestran que los clones de P. juliae pMON67011 y pMON83950, los clones de P. alpicola pMON67026 y pMON67063, el clon de P. waltonii pMON67062, el clon de P. farinosa pMON67064, y el clon de P. farinosa pMON67065 exhiben actividad \Delta6 desaturasa en un sistema de expresión de levadura. Los datos en la Tabla 8 demuestran que cada clon de Primula codifica una proteína con selectividad para sustratos de ácidos grasos n-3 o n-6.

TABLA 7 Actividad de la \Delta6 desaturasa de los clones de Primula en un sistema de expresión de levaduras

11

TABLA 7 (continuación)

12

TABLA 8 Comparación de las selectividades de sustrato n-3:n-6 para las \Delta6 desaturasas de Primula

13

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Ejemplo 10 Clonación, transformación y expresión en Arabidopsis

Tras confirmar la actividad de la \Delta6 desaturasa de Primula en levadura, a continuación se clonaron los genes en pMON73273 (un vector binario que contiene el promotor constitutivo 35S de CaMV) para la expresión en Arabidopsis thaliana para determinar la actividad in planta. PwD6D y PaD6D-2 se clonaron con intrones intactos. Los vectores siguientes se transformaron en Arabidopsis: pMON83961 (MaD6D) (Fig. 8), pMON83962 (PjD6D-1) (Fig. 9), pMON83963 (PaD6D-2) (FiG. 10), pMON84964 (PjD6D-2) (Fig. 11), pMON84965 (PaD6D-1) (Fig. 12), y pMON83966 (PwD6D) (Fig. 13).

Las plantas de Arabidopsis se cultivaron sembrando semillas en recipientes de 10,2 cm (4 pulgadas) conteniendo MetroMix 200 (The Scotts Company, Columbus, OH), saturado con agua de ósmosis inversa (AOI). Las plantas se vernalizaron colocándolas en recipientes en un receptáculo cubierto, en una cámara de cultivo a 4-7ºC, 8 horas de luz diurna durante 4-7 días. Los receptáculos se transfirieron a una cámara de cultivo a 22ºC, humedad relativa del 55%, y 16 horas de luz diurna a una intensidad promedio de 160-200 \muEinstein/s/m^{2}. La cubierta se levantó y deslizó 2,5 cm (1 pulgada) hacia atrás tras la germinación, y a continuación se retiró cuando se formaron las hojas. Las plantas se regaron desde la base, según necesidad, con AOI hasta 2-3 semanas tras la germinación. A continuación las plantas se regaron desde la base, según necesidad, con disolución de Plantex 15-15-18 (Plantex Corporation Ottawa, Canadá) a N_{2} 50 ppm. Los recipientes se redujeron para que quedara 1 planta por recipiente a las 2-3 semanas tras la germinación. Una vez que las plantas comenzaron a florecer, se recortó la inflorescencia primaria para estimular el crecimiento de los brotes auxiliares.

Se obtuvieron plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana como está descrito por Bent y col., Science, 265: 1856-1860, 1994 o Bechtold y col., C.R. Acad. Sci, Life Sciences, 316: 1194-1199, 1993. Los cultivos de la cepa ABI de Agrobacterium tumefaciens conteniendo uno de los vectores de transformación pMON69804, pMON69812, o pMON69815 se cultivaron durante la noche en LB (bactotriptona al 10%, extracto de levadura al 5%, y NaCl al 10% con canamicina (75 mg/l), cloranfenicol (25 mg/l), y espectinomicina (100 mg/l)). El cultivo bacteriano se centrifugó y resuspendió en sacarosa al 5% + disolución de Silwet-77 al 0,05%. Las partes aéreas de las plantas de Arabidopsis thaliana Columbia completas (a aproximadamente a las 5-7 semanas de edad) se sumergieron en la disolución resultante durante 2-3 segundos. Se eliminó la disolución en exceso secando las plantas sobre toallas de papel. Las plantas sumergidas se colocaron de lado en un receptáculo cubierto y se transfirieron a una cámara de cultivo a 19ºC. Tras 16 a 24 horas se retiró la cubierta y se colocaron las plantas en posición vertical. Cuando las plantas alcanzaron la madurez, se dejó de regar con agua durante 2-7 días antes de recoger las semillas. La semilla recogida se hizo pasar a través de un tamiz de malla de acero inoxidable (40 poros/pulgada) para eliminar los
desechos.

Las semillas recogidas descritas anteriormente se sembraron en receptáculos que contenían MetroMix 200 (The Scotts Company) saturados con AOI. Las plantas se vernalizaron y germinaron como se describió anteriormente. Una vez emergidas las hojas las plantas de semillero se pulverizaron con Roundup para seleccionar las plantas transformadas.

La composición de ácidos grasos de la semilla madura (R2) se determinó por medio de análisis de CG de lípidos de derivados de metiléster como se realizó anteriormente para la semilla de soya. En la Tabla 9 se muestran los valores para semillas combinadas de cada suceso transgénico. Las selectividades de sustrato n-3 o n-6 que se observaron en los ensayos de levadura se conservaron in planta.

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TABLA 9 Análisis de ácidos grasos de semilla de Arabidopsis

14

TABLA 9 (continuación)

15

TABLA 9 (continuación)

16

TABLA 9 (continuación)

17

TABLA 9 (continuación)

18

Ejemplo 10 Transformación y expresión en canola

Los vectores pMON83961, pMON83962, pMON83963, y pMON83964 descritos en el Ejemplo 9 se transformaron también en Canola según los procedimientos en el Ejemplo 4. Se incluyó pMON70500 como control negativo. La composición de ácidos grasos de las hojas se determinó por medio de análisis de CG de lípidos derivados de metiléster. Los datos se muestran en la Tabla 10. Una vez más, se confirmaron las selectividades de sustrato observadas en levadura y Arabidopsis.

TABLA 10 Análisis de ácidos grasos del tejido de hojas de Canola

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19

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Todas las composiciones y procedimientos divulgados y reivindicados en este documento pueden realizarse y ejecutarse sin excesiva experimentación a la luz de la presente divulgación. Mientras que las composiciones y los procedimientos de esta invención se han descrito en términos de formas de realización de preferencia, resultará evidente para los expertos en la técnica que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y procedimientos y en las etapas o en las secuencias de etapas de un procedimiento descrito en este documento sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, resultará evidente que los agentes descritos en este documento pueden sustituirse por ciertos agentes que están tanto química como fisiológicamente relacionados mientras se logren los mismos o similares resultados. Se considera que todos tales sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención según se define por medio de las reivindicaciones.

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<110> Ursin, Virginia

\hskip1cm Froman, Byron

\hskip1cm Gonzales, Jennifer

\hskip1cm LaRosa, Thomas J.

\hskip1cm Screen, Steven E.

\hskip1cm Dong, Fenggao

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<120> DESATURASAS DE ÁCIDOS GRASOS PROCEDENTES DE PRIMULA

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<130> MONS: 044WO

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<160> 60

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<140> DESCONOCIDO

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<141> 20-08-2004

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<140> 60/496.751

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<141> 21-08-2003

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 1953

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<212> ADN

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<213> Primula juliae

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<400> 1

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21

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<210> 2

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<211> 1341

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<212> ADN

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<213> Primula juliae

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<400> 2

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22

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<210> 3

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<211> 1389

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<212> ADN

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<213> Primula juliae

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<400> 3

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23

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<210> 4

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<211> 446

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<212> PRT

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<213> Primula juliae

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<400> 4

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24

25

26

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<210> 5

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<211> 462

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<212> PRT

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<213> Primula juliae

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<400> 5

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27

\hskip1cm28

\hskip1cm29

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<210> 6

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 6

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\hskip1cm100

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<210> 7

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 7

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\hskip1cm101

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<210> 8

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 8

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<210> 9

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 9

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\hskip1cm103

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<210> 10

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 10

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<210> 11

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1290

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neurospora crassa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1209

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aspergillus nidulans

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1290

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neurospora crassa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1290

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Neurospora crassa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1341

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Primula alpicola

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 446

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Primula alpicola

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1551

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Primula alpicola

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 449

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Primula alpicola

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

39

40

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1526

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Primula waltonii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 449

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Primula waltonii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

43

44

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip1cm113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm115

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm117

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm118

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm119

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm120

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\hskip1cm121

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm122

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm123

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm124

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm125

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm126

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm127

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm128

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1365

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Primula farinosa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 454

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Primula farinosa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

47

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1559

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Primula florindae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 449

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Primula florindae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm129

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip1cm130

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 51

\hskip1cm131

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<210> 52

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

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<400> 52

\hskip1cm132

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<210> 53

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

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<400> 53

\hskip1cm133

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<210> 54

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

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<400> 54

\hskip1cm134

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<210> 55

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

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<400> 55

\hskip1cm135

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<210> 56

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

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<400> 56

\hskip1cm136

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<210> 57

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<211> 41

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

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<400> 57

\hskip1cm137

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<210> 58

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<211> 42

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

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<400> 58

\hskip1cm138

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<210> 59

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<211> 448

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<212> PRT

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<213> Borago officinalis

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<400> 59

53

54

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<210> 60

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<211> 448

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<212> PRT

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<213> Echium gentianoides

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<400> 60

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55

56

Claims

1. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, en el que el polinucleótido se selecciona de:

(a): un polinucleótido que codifica la secuencia del polipéptido de SEC. ID Nº: 4 ó SEC. ID Nº: 5;

(b): un polinucleótido que comprende la secuencia del ácido nucleico de SEC. ID Nº: 2 ó SEC. ID Nº: 3; y

(c): un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 92% de similitud de secuencia con una secuencia del polipéptido de SEC. ID Nº: 4 ó SEC. ID Nº: 5.

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2. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido codifica el polipéptido de SEC. ID Nº: 4 ó SEC. ID Nº: 5.

3. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, definido además como

(i): codificador de un polipéptido con al menos 95% de similitud de secuencia con una secuencia del polipéptido de SEC. ID Nº: 4 ó SEC. ID Nº: 5, o

(ii): unido de manera operativa a un promotor heterólogo.

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4. Un polipéptido aislado que comprende la secuencia del polipéptido de SEC. ID Nº: 4 ó SEC. ID Nº: 5, o uno de sus fragmentos que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6.

5. Un vector recombinante que comprende la secuencia del polinucleótido aislado de la reivindicación 1.

6. El vector recombinante de la reivindicación 5, que además comprende al menos una secuencia adicional elegida de:

(a): secuencias reguladoras unidas de manera operativa al polinucleótido;

(b): marcadores de selección unidos de manera operativa al polinucleótido;

(c): secuencias de marcadores unidas de manera operativa al polinucleótido;

(d): un resto de purificación unido de manera operativa al polinucleótido; y

(e): una secuencia marcadora unida de manera operativa al polinucleótido.

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7. El vector recombinante de la reivindicación 5, definido además como

(i): que comprende un promotor unido de manera operativa a dicho polinucleótido aislado, de preferencia dicho promotor es un promotor regulado por el desarrollo, específico de orgánulo, específico de tejido, constitutivo o específico de célula, o dicho promotor se selecciona del grupo constituido por 35S CaMV, 34S FMV, Napina, 7S alpha, 7S alpha', Glob y Lec; o

(ii): siendo una casete de expresión aislada.

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8. Una planta transgénica que comprende el vector recombinante de la reivindicación 5.

9. La planta transgénica de la reivindicación 8, definida además como

(i): transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 12; o

(ii): transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 15.

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10. Una célula huésped que comprende el vector recombinante de la reivindicación 5.

\newpage

11. La célula huésped de la reivindicación 10, en la que

(i): dicha célula huésped expresa una proteína codificada por dicho vector; o

(ii): la célula ha heredado dicho vector recombinante de un progenitor de la célula; o

(iii): la célula ha sido transformada con dicho vector recombinante; o

(iv): la célula huésped es una célula de planta.

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12. Una semilla de la planta de la reivindicación 8, en la que la semilla comprende el vector recombinante.

13. Un procedimiento para producir aceite de semillas que contienen ácidos grasos omega-3 a partir de semillas de plantas, que comprende las etapas de:

(a): obtener las semillas de una planta según la reivindicación 8; y

(b): extraer el aceite de dichas semillas.

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14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el aceite de semillas contiene ácido estearidónico.

15. Un procedimiento para producir un ácido graso omega-3 que comprende cultivar una célula huésped de la reivindicación 10.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el ácido graso omega-3 es el ácido estearidónico.

17. Un procedimiento para producir una planta que comprende aceite de semillas que contiene niveles alterados de ácidos grasos omega-3 que comprende introducir el vector recombinante de la reivindicación 5 en una planta oleaginosa.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que

(i): introducir el vector recombinante comprende la transformación genética; o

(ii): la planta es una planta seleccionada del grupo constituido por Arabidopsis thaliana, oleaginosa Brassica, colza, girasol, alazor, canola, maíz, soya, algodón, lino, jojoba, el árbol del sebo de China, tabaco, cacao, cacahuete, plantas frutales, plantas de cítricos, y plantas que producen nueces y bayas; o

(iii): la planta se define además como transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 15, de preferencia el ácido estearidónico está aumentado; o

(iv): el procedimiento se define además como que comprende introducir el vector recombinante de la reivindicación 5 en una pluralidad de plantas oleaginosas y seleccionar dichas plantas o sus progenies que han heredado el vector recombinante para una planta que tiene un perfil deseado de ácidos grasos omega-3.

19. El procedimiento de las reivindicaciones 13, 17 ó 18, en el que la planta es la soya y el aceite de semillas tiene un contenido de ácido estearidónico de desde 5% hasta 50% y un contenido de ácido gamma linoleico inferior al 10%.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que el aceite de semillas

(i): comprende menos del 10% de ácido alfa linoleico, ácido linoleico y ácido gamma linoleico combinados; o

(ii): tiene un contenido de ácido estearidónico desde 15% hasta 35%; o

(iii): tiene un contenido de ácido estearidónico desde 22% hasta 30%; o

(iv): tiene menos del 5% de ácido gamma linoleico; o

(v): tiene un contenido de ácido estearidónico desde 15% hasta 35% y un contenido de ácido gamma linoleico inferior al 5%; o

(vi): tiene una relación de ácidos grasos omega-3 a omega-6 desde 0,35:1 hasta 3,5:1; o

(vii): tiene una relación de ácidos grasos omega-3 a omega-6 desde 1:1 hasta 3,5:1.