ES2656217T3 - Producción de DHA y otros LC-PUFA en plantas - Google Patents

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Abstract

Una planta de Brassica napus genéticamente modificada, sus descendientes, células, tejidos, semillas o partes, que comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un sistema de ácido graso poliinsaturado (PUFA) sintasa que produce al menos un PUFA, en la que el sistema de PUFA sintasa comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:1-3; (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfopanteteinilo transferasa (PPTasa) que transfiere un cofactor de fosfopanteteinilo a un dominio ACP del sistema de PUFA sintasa, en la que la PPTasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; and (iii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una acil-CoA sintetasa (ACoAS) que cataliza la conversión de ácidos grasos libres (FFA) PUFA de cadena larga a acil-CoA, en la que la ACoAS comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; en la que las secuencias de ácidos nucleicos (i), (ii) y (iii) están contenidas en un único vector de expresión recombinante y las secuencias de ácidos nucleicos (i), (ii) y (iii) están unidas operablemente a un promotor PvDlec2, en la que el vector de expresión recombinante comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:35, y en la que la planta, sus descendientes, células, tejidos, semillas o partes comprenden DHA (ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3)) en una cantidad entre 0,01% y 15%, DPA (C22:5, n-6 o n-3) en una cantidad entre 0,01% y 5%, o EPA (ácido eicosapentaenoico (C20:5, n-3)) en una cantidad entre 0,01% y 5%.

Description

Producción de DHA y otros LC-PUFA en plantas
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere, en general, a organismos hospedantes recombinantes (por ejemplo, plantas) genéticamente modificados con un sistema de ácido graso poliinsaturado ("polyunsaturated fatty acid", PUFA) sintasa y una o más proteínas accesorias que permiten y/o mejoran la producción de PUFA en el organismo hospedante. La presente invención también se refiere a métodos para fabricar y emplear dichos organismos (por ejemplo, para obtener PUFA), así como a productos obtenidos de dichos organismos (por ejemplo, aceite y semillas).
Antecedentes de la técnica
Los ácidos grasos poliinsaturados ("polyunsaturated fatty acids", PUFA) se consideran útiles para aplicaciones nutricionales, aplicaciones farmacéuticas, aplicaciones industriales y otros fines. Sin embargo, el suministro actual de PUFA procedentes de fuentes naturales (por ejemplo, aceites de pescado) y de síntesis química no es suficiente para las necesidades comerciales a largo plazo.
Los aceites vegetales derivados de plantas (por ejemplo, cultivos de semillas oleaginosas) son relativamente baratos y no presentan los problemas de contaminación asociados con los aceites de pescado. Sin embargo, los PUFA que se encuentran en plantas desarrolladas para el comercio y en los aceites vegetales generalmente no incluyen PUFA más saturados o de cadena más larga, y generalmente solo incluyen ácidos grasos, tales como ácido linoleico (dieciocho carbonos con 2 dobles enlaces, en las posiciones delta 9 y 12 --18:2 delta 9,12) y ácido linolénico (18:3 delta 9,12,15).
Se ha descrito la producción de PUFA más insaturados o de cadena más larga en plantas mediante la modificación de los ácidos grasos producidos de modo endógeno por las plantas. Por ejemplo, se ha descrito que la modificación genética de plantas con diversos genes individuales que codifican ácido graso elongasas y/o desaturasas da como resultado la generación de hojas o semillas que contienen niveles significativos de PUFA más insaturados y de cadena más larga, tales como ácido eicosapentaenoico (EPA), pero que también contienen niveles significativos de PUFA menos insaturados y de cadena más corta mixtos (Qi et al., Nature Biotech., 22:739 (2004); documento WO 04/071467; Abbadi et al., Plant Cell, 16:1 (2004); Napier y Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society, 64:387393 (2005); Robert et al., Functional Plant Biology, 32:473-479 (2005); solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2004/0172682).
El género Brassica incluye la colza, uno de los cultivos de semillas oleaginosas más importantes del mundo, y el cultivo de semillas oleaginosas más importante en las zonas templadas. La colza se ha caracterizado tradicionalmente como Brassica napus (una especie derivada como resultado de cruzamientos interespecíficos de Brassica rapa y Brassica oleracea), en la que el ácido erúcico y los glucosinolatos se han eliminado o se han reducido significativamente a través de cruzamientos convencionales. La mayoría del aceite de colza está en forma de aceites vegetales producidos para el consumo humano. También existe un mercado creciente para el uso del aceite de colza en aplicaciones industriales.
La calidad del aceite comestible e industrial derivado de una variedad concreta de semilla de colza se determina por medio de sus ácidos grasos constituyentes, puesto que el tipo y la cantidad de insaturación de ácidos grasos tiene implicaciones para las aplicaciones dietéticas e industriales. Un aceite de colza convencional contiene aproximadamente 60% de ácido oleico (C18:1), aproximadamente 20% de ácido linoleico (C18:2) y aproximadamente 10% de ácido linolénico (18:3). Los niveles de ácido linolénico poliinsaturado típicos de la colza convencional resultan indeseables, puesto que el aceite se oxida con facilidad, y la tasa de oxidación se ve afectada por varios factores, que incluyen la presencia de oxígeno, la exposición a la luz y al calor, y la presencia de antioxidantes y pro-oxidantes nativos o añadidos en el aceite. La oxidación provoca la pérdida de sabores y rancidez como resultado de frituras repetidas (oxidación inducida) o conservación durante un periodo prolongado (autooxidación). La oxidación también puede alterar las propiedades lubricantes y viscosas del aceite de colza.
Los aceites que muestran unos niveles reducidos de ácidos grasos poliinsaturados y un aumento en el nivel de ácido oleico monoinsaturado con relación al aceite de colza convencional se asocian a una mayor estabilidad oxidativa. La susceptibilidad de los ácidos grasos individuales a la oxidación depende de su grado de insaturación. Así, la tasa de oxidación del ácido linolénico, que posee tres dobles enlaces de carbono-carbono, es 25 veces mayor que la del ácido oleico, que solo tiene un doble enlace, y es 2 veces mayor que la del ácido linoleico, que tiene dos dobles enlaces. Los ácidos linoleico y linolénico también tienen el mayor impacto sobre el sabor y el olor porque forman hidroperóxidos con facilidad. Un aceite con un alto contenido en ácido oleico (≥ 70% de ácido oleico) es menos susceptible a la oxidación durante la conservación, la fritura y el refinamiento, y puede calentarse hasta una temperatura más alta sin que produzca humo, lo cual hace que sea más adecuado como aceite para cocinar. Los ejemplos de variedades de colza comercializadas en el mercado que tienen un perfil de ácidos grasos en el aceite
de semillas de ácido oleico (C18:1) mayor que 70% (en peso) y de ácido linolénico (C18:3) menor que 3,5% (en peso) son las variedades NEXERA™, comercializada por Dow AgroSciences LLC (Indianápolis, IN), cuyas variedades producen "aceite omega-9”, un aceite no hidrogenado de alto contenido en ácido oleico y bajo contenido en ácido linolénico que se emplea en la actualidad en numerosas aplicaciones, que incluyen la fritura en aceite abundante, el salteado, el horneado, la pulverización y en aliños para ensaladas, en restaurantes y en la industria de servicios de alimentación.
Breve sumario de la invención
En la técnica es necesario un método relativamente barato para producir de modo eficaz cantidades (por ejemplo, cantidades comerciales) de PUFA más insaturados o de cadena más larga en plantas, semillas de plantas o aceite de plantas, así como cantidades de lípidos (por ejemplo, triacilglicerol (TAG) y fosfolípidos (PL)) enriquecidos en dichos PUFA en plantas, semillas de plantas o aceite de plantas. Un sistema para proporcionar y mejorar la producción de PUFA en organismos hospedantes (por ejemplo, plantas) proporcionando organismos hospedantes recombinantes modificados genéticamente con una ácido graso poliinsaturado (PUFA) sintasa y una o más proteínas accesorias, tal como se describe en la presente, es una alternativa significativa a las estrategias de la técnica.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona una planta de Brassica napus genéticamente modificada, sus descendientes, células, tejidos, semillas o partes, que comprende:
(i)
una secuencia de ácido nucleico que codifica un sistema de ácido graso poliinsaturado (PUFA) sintasa que produce al menos un PUFA, en la que el sistema de PUFA sintasa comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:1-3;
(ii)
una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfopanteteinilo transferasa (PPTasa) que transfiere un cofactor de fosfopanteteinilo a un dominio ACP del sistema de PUFA sintasa, en la que la PPTasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; y
(iii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una acil-CoA sintetasa (ACoAS) que cataliza la conversión de ácidos grasos libres ("free fatty acids", FFA) PUFA de cadena larga a acil-CoA, en la que la ACoAS comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4;
en la que las secuencias de ácidos nucleicos (i), (ii) y (iii) están contenidas en un único vector de expresión recombinante y las secuencias de ácidos nucleicos (i), (ii) y (iii) están unidas operablemente a un promotor PvDlec2, en la que el vector de expresión recombinante comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:35,
y en la que la planta, sus descendientes, células, tejidos, semillas o partes comprenden DHA (ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3)) en una cantidad entre 0,01% y 15%, DPA (C22:5, n-6 o n-3) en una cantidad entre 0,01% y 5%, o EPA (ácido eicosapentaenoico (C20:5, n-3)) en una cantidad entre 0,01% y 5%. En una realización, la planta de Brassica napus genéticamente modificada, sus descendientes, células, tejidos, semillas o partes de la presente invención, comprenden además una secuencia de ácido nucleico que codifica una acetil CoA carboxilasa (ACCasa) y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica una diacilglicerol aciltransferasa de tipo 2 (DGAT2).
En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID NO:7-10.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:35.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir la planta de Brassica napus genéticamente modificada, sus descendientes, células, tejidos, semillas o partes de la invención, que comprende transformar una planta o una célula de una planta de Brassica napus con un módulo de expresión que comprende:
(i)
una secuencia de ácido nucleico que codifica un sistema de PUFA sintasa que produce al menos un ácido graso poliinsaturado (PUFA), en el que el sistema de PUFA sintasa comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:1-3;
(ii)
una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfopanteteinilo transferasa (PPTasa) que activa un dominio ACP del sistema de PUFA sintasa, en el que la PPTasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; y
(iii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una acil-CoA sintetasa (ACoAS) que cataliza la conversión de ácidos grasos libres ("free fatty acids", FFA) PUFA de cadena larga a acil-CoA, en el que la ACoAS comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4;
en el que las secuencias de ácidos nucleicos (i), (ii) y (iii) están contenidas en un único vector de expresión recombinante y las secuencias de ácidos nucleicos (i), (ii) y (iii) están unidas operablemente a un promotor PvDlec2, en el que el vector de expresión recombinante comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:35.
También se describen en la presente plantas genéticamente modificadas (por ejemplo, Brassica), sus descendientes, semillas, células, tejidos o partes, que comprenden (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un sistema de ácido graso poliinsaturado (PUFA) sintasa (por ejemplo, un sistema de PUFA sintasa de algas) que produce al menos un PUFA; y (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfopanteteinilo transferasa (PPTasa) que transfiere un cofactor de fosfopanteteinilo a un dominio ACP del sistema de PUFA sintasa (por ejemplo, un sistema de PUFA sintasa de algas). La planta genéticamente modificada, sus descendientes, semillas, células, tejidos o partes, pueden proceder de una especie de Brassica importante desde el punto de vista comercial (por ejemplo, Brassica napus o Brassica juncea). El sistema de PUFA sintasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% al 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 o comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1. La secuencia de ácido nucleico que codifica el sistema de PUFA sintasa puede comprender una secuencia de ácido nucleico al menos 60% al 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:6 o comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:6. El sistema de PUFA sintasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% al 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. La secuencia de ácido nucleico que codifica el sistema de PUFA sintasa puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es al menos 60% al 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:7 o comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:7. El sistema de PUFA sintasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% al 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3. La secuencia de ácido nucleico que codifica el sistema de PUFA sintasa puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es al menos 60% al 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:8 o comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:8. El sistema de PUFA sintasa puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, 2, o 3 o cualquiera de sus combinaciones. La secuencia de ácido nucleico que codifica el sistema de PUFA sintasa puede comprender la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:6, 7 o 8 o cualquiera de sus combinaciones.
La PPTasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% al 99% idéntica a SEQ ID NO:5
o comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5. La secuencia de ácido nucleico que codifica la PPTasa puede ser al menos 60% al 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:10 o puede comprender la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:10.
Las secuencias de ácidos nucleicos de (i) y (ii) pueden estar contenidas en un único vector de expresión recombinante. Las secuencias de ácidos nucleicos de (i) y (ii) pueden estar unidas operablemente a un promotor específico de semilla. Las secuencias de ácidos nucleicos de (i) y (ii) pueden estar unidas operablemente a un promotor seleccionado del grupo que consiste en PvDlec2, PvFaseolina, LfKCS3 y FAE 1.
La planta genéticamente modificada (por ejemplo, una especie de Brassica que produce aceite de colza), sus descendientes, semillas, células, tejidos o partes, pueden comprender además (iii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una acil-CoA sintetasa (ACoAS) que cataliza la conversión de ácidos grasos libres PUFA de cadena larga (PFFA) a acil-CoA. La ACoAS puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% al 99% idéntica a SEQ ID NO:4 o comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. La ACoAS puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es al menos 60% al 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:9 o comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:9. La secuencia de ácido nucleico que codifica la ACoAS puede comprender la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:34. Las secuencias de ácidos nucleicos de (i), (ii) y/o (iii) pueden estar contenidas en un único vector de expresión recombinante. Las secuencias de ácidos nucleicos de (i), (ii) y/o (iii) pueden estar unidas operablemente a un promotor específico de semilla. Las secuencias de ácidos nucleicos de (i), (ii) y/o (iii) pueden estar unidas operablemente a un promotor seleccionado del grupo que consiste en PvDlec2, LfKCS3 y FAE 1.
La planta genéticamente modificada (por ejemplo, Brassica), sus descendientes, células, tejidos o partes, pueden comprender además una secuencia de ácido nucleico que codifica una acetil CoA carboxilasa (ACCasa) y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica una diacilglicerol aciltransferasa de tipo 2 (DGAT2).
En la presente se describe además una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID NO:6-10 y SEQ ID NO:34, un vector de expresión recombinante pDAB7361, un vector de expresión recombinante pDAB7362, un vector de expresión recombinante pDAB7363, un vector de expresión recombinante pDAB7365, un vector de expresión recombinante pDAB7368, un vector de expresión recombinante pDAB7369, un vector de expresión recombinante pDAB7370, un vector de expresión recombinante pDAB100518, un vector de expresión recombinante pDAB101476, un vector de expresión recombinante pDAB9166, un vector de expresión recombinante pDAB9167, un vector de expresión recombinante pDAB7379, un vector de expresión recombinante pDAB7380, un vector de expresión recombinante pDAB9323, un vector de expresión recombinante pDAB9330, un vector de expresión recombinante pDAB9337, un vector de expresión recombinante pDAB9338, un vector de expresión recombinante pDAB9344, un vector de expresión recombinante pDAB9396, un vector de expresión recombinante pDAB101412, un vector de expresión recombinante pDAB7733, un vector de expresión recombinante pDAB7734, un vector de expresión recombinante pDAB101493, un vector de expresión recombinante pDAB109507, un vector de expresión recombinante pDAB109508, un vector de expresión recombinante pDAB109509, un vector de expresión recombinante pDAB9151, un vector de expresión recombinante pDAB108207, un vector de expresión recombinante pDAB108208, un vector de expresión recombinante
pDAB108209, un vector de expresión recombinante pDAB9159, un vector de expresión recombinante pDAB9147, un vector de expresión recombinante pDAB108224, o un vector de expresión recombinante pDAB108225.
Un aceite de semillas obtenido a partir de la planta genéticamente modificada, sus descendientes, semillas, células, tejidos o partes, puede comprender cantidades detectables de DHA (ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3)) y/o EPA (ácido eicosapentaenoico (C20:5, n-3)). En algunas realizaciones, el aceite de semillas comprende del 0,01% al 15% de DHA, del 0,05% al 10% de DHA, o del 0,05% al 5% de DHA. El aceite de semillas puede comprender del 0,01% al 5% de EPA, del 0,05% al 5% de EPA, o del 0,05% al 1% de EPA. Las cantidades detectables de DHA y/o EPA encontradas en el aceite de semillas también pueden encontrarse en granos y/o harina obtenidos de la planta genéticamente modificada. Las cantidades detectables de DHA y/o EPA pueden encontrarse en el aceite de semillas de una especie de Brassica que tiene un contenido en ácidos grasos que comprende, en peso, 70% o más de ácido oleico (C18:1) y/o 4% o menos de ácido linolénico (C18:3).
En la presente también se describe un aceite o una semilla obtenido de una planta genéticamente modificada (por ejemplo, Brassica), sus descendientes, células, tejidos o partes descritos en la presente. En la presente también se describe un producto alimentario que comprende un aceite obtenido de una planta genéticamente modificada, sus descendientes, células, tejidos o partes descritos en la presente. En la presente también se describe un alimento funcional que comprende un aceite obtenido a partir de una planta genéticamente modificada, sus descendientes, células, tejidos o partes descritos en la presente, o una semilla obtenida a partir de una planta genéticamente modificada, sus descendientes, células, tejidos o partes descritos en la presente. En la presente también se describe un producto farmacéutico que comprende un aceite obtenido de una planta genéticamente modificada, sus descendientes, células, tejidos o partes descritos en la presente.
En la presente también se describe un método para producir un aceite que comprende al menos un LC-PUFA, que comprende recuperar el aceite a partir de una planta genéticamente modificada (por ejemplo, Brassica), sus descendientes, células, tejidos o partes descritos en la presente, o a partir de una semilla de una planta genéticamente modificada (por ejemplo, Brassica), sus descendientes, células, tejidos o partes descritos en la presente. En la presente también se describe un método para producir un aceite que comprende al menos un LC-PUFA, que comprende cultivar una planta genéticamente modificada (por ejemplo, Brassica), sus descendientes, células, tejidos o partes descritos en la presente. En la presente también se describe un método para producir al menos un LC-PUFA en un aceite de semillas, que comprende recuperar el aceite a partir de una semilla de una planta genéticamente modificada (por ejemplo, Brassica), sus descendientes, células, tejidos o partes descritos en la presente.
En la presente también se describe un método para producir al menos un PUFA en un aceite de semillas, que comprende cultivar una planta genéticamente modificada (por ejemplo, Brassica), sus descendientes, células, tejidos
o partes descritos en la presente. En la presente también se describe un método para proporcionar un suplemento o un producto terapéutico que contiene al menos un PUFA a un individuo, que comprende proporcionar al individuo una planta genéticamente modificada (por ejemplo, Brassica), sus descendientes, células, tejidos o partes descritos en la presente, un aceite descrito en la presente, una semilla descrita en la presente, un producto alimentario descrito en la presente, un alimento funcional descrito en la presente, o un producto farmacéutico descrito en la presente. El PUFA contenido en dichos productos puede ser DHA y/o EPA.
En la presente también se describe un método para producir una planta genéticamente modificada (por ejemplo, Brassica), sus descendientes, células, tejidos o partes descritos en la presente, que comprende transformar una planta o una célula de una planta con (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un sistema de PUFA sintasa (por ejemplo, un sistema de PUFA sintasa de algas) que produce al menos un ácido graso poliinsaturado (PUFA); y
(ii)
una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfopanteteinilo transferasa (PPTasa) que transfiere un cofactor de fosfopanteteinilo a un dominio ACP del sistema de PUFA sintasa (por ejemplo, un sistema de PUFA sintasa de algas). En algunas realizaciones, el método comprende además transformar la planta o la célula de una planta con (iii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una acil-CoA sintetasa (ACoAS) que cataliza la conversión de ácidos grasos libres (FFA) PUFA de cadena larga a acil-CoA.
Breve descripción de los dibujos
Las diversas realizaciones de la invención pueden comprenderse mejor a partir de la siguiente descripción detallada, figuras y descripciones de secuencias adjuntas, que forman parte de esta solicitud.
La figura 1 muestra el Clustal W (alineamientos en el vector NTI) de las secuencias de ADN rediseñadas que codifican cada uno de los 9 dominios repetidos de OrfA de PUFA.
La figura 2 muestra el mapa de plásmido de pDAB7361.
La figura 3 muestra el mapa de plásmido de pDAB7362.
La figura 4 muestra el mapa de plásmido de pDAB7363.
La figura 5 muestra el análisis de semillas individuales del contenido en DHA de semillas T1 procedentes del
acontecimiento de colza 5197[14]-032.002.
La figura 6 muestra los resultados de transferencias Western SDS-PAGE de extractos de semillas T1 en desarrollo de estadio tardío (>30 DAP) procedentes del acontecimiento de colza 5197[14]-032.002 sondadas con antisuero específico de Orf A, Orf B y Orf C.
La figura 7a muestra el contenido en lípidos de muestras de semillas T2 en desarrollo recogidas 15, 20, 25, 30, 35 y 42 días después de la polinización procedentes del acontecimiento de colza que produce DHA 5197[14]032.002.Sx002.
La figura 7b muestra la presencia de los polipéptidos de OrfA, OrfB y OrfC en extractos procedentes del acontecimiento de colza que produce DHA 5197[14]-032.002.Sx002 mediante un análisis de la transferencia Western.
La figura 8 muestra el contenido en LC-PUFA de plantas T2 homocigóticas procedentes de plantas T1 cultivadas en invernadero procedentes del acontecimiento de colza 5197[14]-032.002.
La figura 9 muestra un resumen de los LC-PUFA de análisis de semillas T2 individuales procedentes de seis líneas homocigóticas.
La figura 10 muestra el contenido en DHA de las semillas de progenitores e híbridas F1 resultantes de un cruzamiento recíproco de dos líneas T1 y Omega-9 Nexera 710 no transformada.
La figura 11 muestra el número de copias del gen pat de sesenta plantas T1 individuales derivadas del acontecimiento de colza 5197[13]-010.001.
La figura 12 muestra los perfiles de expresión de genes de interés en la línea Omega-9 Nexera 710 nula no transformada empleando los valores brutos de intensidad para cada uno de los 6 momentos del tiempo expresados en días después de la polinización ("days after pollination", DAP).
La figura 13 muestra los perfiles de expresión de genes de interés en la línea Omega-9 Nexera 710 nula no transformada empleando los valores de intensidad normalizados para cada uno de los 6 momentos del tiempo expresados en DAP.
La figura 14 muestra los perfiles de expresión de genes de interés en la línea homocigótica del acontecimiento 5197[14]-032.002 empleando los valores brutos de intensidad para cada uno de los 6 momentos del tiempo expresados en DAP.
La figura 15 muestra los perfiles de expresión de genes de interés en la línea homocigótica del acontecimiento 5197[14]-032.002 empleando los valores de intensidad normalizados para cada uno de los 6 momentos del tiempo expresados en DAP.
La figura 16 muestra la actividad PUFA sintasa en semillas de colza transgénicas maduras medida mediante una cromatografía en capa fina (TLC).
La figura 17 muestra las proporciones calculadas de los péptidos de referencia entre sí, procedentes de OrfA expresados en E. coli con y sin HetI coexpresado, y de OrfA expresados en el acontecimiento de colza 5197[14]
032.002. La figura 18 muestra las proporciones calculadas del péptido apo2-9 a cada uno de seis péptidos de referencia
procedentes de OrfA expresados en E. coli con y sin HetI, y de OrfA expresados en el acontecimiento de colza transgénica 5197[14]-032.002. La figura 19 muestra el mapa de plásmido de pDAB7365. La figura 20 muestra el mapa de plásmido de pDAB7368. La figura 21 muestra el mapa de plásmido de pDAB7369. La figura 22 muestra el mapa de plásmido de pDAB7370. La figura 23 muestra el mapa de plásmido de pDAB100518. La figura 24 muestra el mapa de plásmido de pDAB101476. La figura 25 muestra el mapa de plásmido de pDAB101477. La figura 26 muestra el mapa de plásmido de pDAB9166. La figura 27 muestra el mapa de plásmido de pDAB9167.
La figura 28 muestra el mapa de plásmido de pDAB7379. La figura 29 muestra el mapa de plásmido de pDAB7380. La figura 30 muestra el mapa de plásmido de pDAB9323. La figura 31 muestra el mapa de plásmido de pDAB9330. La figura 32 muestra el mapa de plásmido de pDAB9337. La figura 33 muestra el mapa de plásmido de pDAB9338. La figura 34 muestra el mapa de plásmido de pDAB9344. La figura 35 muestra el mapa de plásmido de pDAB9396. La figura 36 muestra el mapa de plásmido de pDAB101412. La figura 37 muestra el mapa de plásmido de pDAB7733. La figura 38 muestra el mapa de plásmido de pDAB7734. La figura 39 muestra el mapa de plásmido de pDAB101493. La figura 40 muestra el mapa de plásmido de pDAB109507. La figura 41 muestra el mapa de plásmido de pDAB109508. La figura 42 muestra el mapa de plásmido de pDAB109509. La figura 43 muestra el mapa de plásmido de pDAB9151. La figura 44 muestra el mapa de plásmido de pDAB108207. La figura 45 muestra el mapa de plásmido de pDAB108208. La figura 46 muestra el mapa de plásmido de pDAB108209. La figura 47 muestra el mapa de plásmido de pDAB9159. La figura 48 muestra el mapa de plásmido de pDAB9147. La figura 49 muestra el mapa de plásmido de pDAB108224. La figura 50 muestra el mapa de plásmido de pDAB108225. La figura 51 ilustra el contenido en DHA y LC-PUFA de semillas T2 procedentes de acontecimientos transgénicos
individuales de Arabidopsis transformado con pDAB101493, pDAB7362, pDAB7369, pDAB101412 o pDAB7380.
Descripción detallada de la invención
La expresión "ácido graso poliinsaturado" o el término "PUFA", tal como se emplean en la presente, se refieren a ácidos grasos con una longitud de cadena de carbonos de al menos 16 carbonos, al menos 18 carbonos, al menos 20 carbonos, o 22 o más carbonos, con al menos 3 o más dobles enlaces, 4 o más dobles enlaces, 5 o más dobles enlaces, o 6 o más dobles enlaces, en los que todos los dobles enlaces están en la configuración cis.
La expresión "ácido graso poliinsaturado de cadena larga" o el término "LC-PUFA", tal como se emplean en la presente, se refieren a ácidos grasos de 18 y más carbonos de longitud de cadena, 20 y más carbonos de longitud de cadena, que contienen 3 o más dobles enlaces, o 22 o más carbonos, con al menos 3 o más dobles enlaces, 4 o más dobles enlaces, 5 o más dobles enlaces, o 6 o más dobles enlaces. Los LC-PUFA de la serie omega-6 incluyen, pero no se limitan a ácido gamma-linolénico (C18:3), ácido di-homo-gamma-linolénico (C20:3n-6), ácido araquidónico (C20:4n-6), ácido adrénico (también denominado ácido docosatetraenoico o DTA) (C22:4n-6), y ácido docosapentaenoico (C22:5n-6). Los LC-PUFA de la serie omega-3 incluyen, pero no se limitan a ácido alfa-linolénico (C18:3), ácido eicosatrienoico (C20:3n-3), ácido eicosatetraenoico (C20:4n-3), ácido eicosapentaenoico (C20:5n-3), ácido docosapentaenoico (C22:5n-3), y ácido docosahexaenoico (C22:6n-3). Los LC-PUFA también incluyen ácidos grasos con más de 22 carbonos y 4 o más dobles enlaces que incluyen, pero no se limitan a C28:8(n-3).
Las expresiones "PUFA sintasa" o "sistema de PUFA sintasa" y los términos "SzPUFA" o "hSzThPUFA", tal como se emplean en la presente, se refieren a un sistema enzimático que produce ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) y, en particular, PUFA de cadena larga (LC-PUFA), así como cualquier dominio de dicha enzima en un complejo. La expresión PUFA sintasa incluye, pero no se limita a sistemas de PUFA PKS o sistemas similares a PKS para la
producción de PUFA.
La expresión "fosfopanteteinilo transferasa" y los términos "PPTasa" o "NoHetI", tal como se emplean en la presente, se refieren a una enzima que activa un sistema de PUFA sintasa mediante la transferencia de un cofactor (por ejemplo, 4-fosfopanteteína) desde la coenzima A (CoA) a uno o más dominios ACP presentes en el sistema de PUFA sintasa.
La expresión "acil-CoA sintetasa" y los términos "ACoAS" o "SzACS-2", tal como se emplean en la presente, se refieren a una enzima que cataliza la conversión de ácidos grasos libres (FFA) poliinsaturados de cadena larga a acil-CoA.
El término "planta", tal como se emplea en la presente, incluye, pero no se limita a cualquier descendiente, célula, tejido o parte de una planta.
Un "nutracéutico" significa un producto aislado, purificado, concentrado o producido a partir de plantas que proporciona un beneficio fisiológico o proporciona protección frente a una enfermedad, que incluye alimentos procesados suplementados con dichos productos, junto con alimentos producidos a partir de cultivos que han sido genéticamente modificados para que contengan niveles potenciados de dichos componentes fisiológicamente activos.
Un "alimento funcional" significa un alimento que (a) es similar en aspecto o puede ser un alimento convencional que se consume como parte de la dieta habitual, y (b) posee un valor nutricional potenciado y/o beneficios dietéticos específicos basados en una modificación en la proporción de componentes que generalmente existen en el alimento no modificado.
El término "polinucleótido" y la expresión "ácido nucleico" pretenden incluir un único ácido nucleico, así como una pluralidad de ácidos nucleicos, una molécula de ácido nucleico o sus fragmentos, variantes o derivados, o una construcción, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp). Un polinucleótido o un ácido nucleico puede contener la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADNc de longitud completa, o de uno de sus fragmentos, que incluye las secuencias 5’ y 3’ no traducidas y las secuencias codificadoras. Un polinucleótido o un ácido nucleico puede estar compuesto de cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que pueden ser un ARN o ADN no modificado, o un ARN o ADN modificado. Por ejemplo, un polinucleótido o un ácido nucleico puede estar compuesto de ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario, y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, de modo más habitual, bicatenarios o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Estos términos también incluye las formas química, enzimática o metabólicamente modificadas de un polinucleótido o un ácido nucleico.
Una secuencia de polinucleótido o de ácido nucleico puede decirse que está "aislada”, porque se ha retirado de su entorno nativo. Por ejemplo, un polinucleótido o un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido o un fragmento de polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa contenido en un vector se considera aislado para los fines de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido o un ácido nucleico aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedantes heterólogas o un polinucleótido o un ácido nucleico purificado (parcial o sustancialmente) en disolución. Un polinucleótido o un ácido nucleico aislado según la presente invención incluye además moléculas producidas de modo sintético. Un polinucleótido o un ácido nucleico aislado en forma de un polímero de ADN puede estar formado por uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.
El término "gen" se refiere a un ácido nucleico, o a uno de sus fragmentos, que es capaz de ser expresado como una proteína específica, y que incluye opcionalmente secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificadoras 5’) y que siguen (secuencias no codificadoras 3’) a la secuencia codificadora.
Tal como se emplea en la presente, la expresión "región codificadora" se refiere a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos específica. Las "secuencias reguladoras adecuadas" se refieren a secuencias de nucleótidos localizadas cadena arriba (secuencias no codificadoras 5’), dentro o cadena abajo (secuencias no codificadoras 3’) de una secuencia codificadora, y que influyen en la transcripción, el procesamiento
o la estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia codificadora asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias conductoras de la traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de la poliadenilación, sitios de procesamiento del ARN, sitios de unión de efectores y estructuras de tallo-bucle.
Tal como se emplea en la presente, el término "polipéptido" pretende incluir un único "polipéptido", así como una pluralidad de "polipéptidos" y sus fragmentos, y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente mediante enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Así, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, proteínas, cadenas de aminoácidos o cualquier otro término o expresión utilizado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, se incluyen en la definición de "polipéptido”, y el término "polipéptido" puede emplearse en lugar de cualquier de estos términos y expresiones, o de modo intercambiable con los mismos. Un polipéptido puede proceder de una fuente biológica
natural o puede estar producido mediante la tecnología recombinante, pero no necesariamente se traduce a partir de una secuencia de ácido nucleico concreta. Puede generarse de cualquier manera, que incluye la síntesis química.
Un polipéptido "aislado", o uno de sus fragmentos, variantes o derivados, significa un polipéptido que no se encuentra en su entorno natural. No se requiere un nivel concreto de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede retirarse de su entorno nativo o natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de modo recombinante expresados en células hospedantes se consideran aislados para los fines de la invención, así como los polipéptidos nativos o recombinantes que se han separado, fraccionado, o parcial o sustancialmente purificado mediante cualquier técnica adecuada.
Tal como se emplea en la presente, "nativo" se refiere a la forma de un polinucleótido, gen o polipéptido tal como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras, si están presentes.
Tal como se emplea en la presente, "endógeno" se refiere a la forma nativa de un polinucleótido, gen o polipéptido en su localización natural en el organismo o en el genoma de un organismo. Un "polinucleótido endógeno" incluye un polinucleótido nativo en su localización natural en el genoma de un organismo. Un "gen endógeno" incluye un gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo. Un "polipéptido endógeno" incluye un polipéptido nativo en su localización natural en el organismo.
Tal como se emplea en la presente, "heterólogo" se refiere a un polinucleótido, gen o polipéptido que no se encuentra normalmente en el organismo hospedante, sino que se introduce en el organismo hospedante. Un "polinucleótido heterólogo" incluye una región codificadora nativa, o una de sus porciones, que se reintroduce en el organismo de origen en una forma que es diferente del correspondiente polinucleótido nativo. Un "gen heterólogo" incluye una región codificadora nativa, o una de sus porciones, que se reintroduce en el organismo de origen en una forma que es diferente del correspondiente gen nativo. Por ejemplo, un gen heterólogo puede incluir una región codificadora nativa que es una porción de un gen quimérico que incluye regiones reguladoras no nativas, que se reintroduce en el hospedante nativo. Un "polipéptido heterólogo" incluye un polipéptido nativo que se reintroduce en el organismo de origen en una forma que es diferente del correspondiente polipéptido nativo.
Tal como se emplea en la presente, el término "modificación" se refiere a un cambio en un polinucleótido descrito en la presente que da como resultado una actividad reducida, sustancialmente eliminada o eliminada de un polipéptido codificado por el polinucleótido, así como un cambio en un polipéptido descrito en la presente que da como resultado una actividad reducida, sustancialmente eliminada o eliminada del polipéptido. Estos cambios pueden realizarse mediante métodos muy conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a delecionar, mutar (por ejemplo, mutagénesis espontánea, mutagénesis aleatoria, mutagénesis provocada por genes mutadores o mutagénesis de transposones), sustituir, insertar, infrarregular, alterar la localización celular, alterar el estado del polinucleótido o del polipéptido (por ejemplo, metilación, fosforilación o ubiquitinación), eliminar un cofactor, introducir un ARN/ADN antisentido, introducir un ARN/ADN de interferencia, realizar una modificación química, realizar una modificación covalente, irradiar con rayos UV o rayos X, realizar una recombinación homóloga, realizar una recombinación mitótica, realizar métodos de sustitución de promotores y/o sus combinaciones. Pueden obtenerse las directrices para determinar los nucleótidos o restos aminoácidos que pueden modificarse comparando la secuencia del polinucleótido o polipéptido concreto con la de polinucleótidos o polipéptidos homólogos, por ejemplo, de levadura o bacterianos, y maximizando el número de modificaciones realizadas en regiones de alta homología (regiones conservadas) o secuencias consenso.
El término "derivado”, tal como se emplea en la presente, se refiere a una modificación de una secuencia descrita en la presente invención. Los ejemplos de dichas modificaciones serían la sustitución, la inserción y/o la deleción de una o más bases con relación a una secuencia de ácido nucleico de una secuencia codificadora descrita en la presente que conserven, alteren ligeramente o aumenten la función de una secuencia codificadora descrita en la presente en una especie de cultivo de semillas oleaginosas. Estos derivados pueden ser determinados con facilidad por los expertos en la técnica, por ejemplo, empleando técnicas de formación de modelos por ordenador para predecir y optimizar la estructura de la secuencia. Por tanto, el término "derivado" también incluye secuencias de ácidos nucleicos que presentan una homología de secuencia sustancial con las secuencias codificadoras descritas en la presente, de modo que son capaces de tener las funcionalidades descritas para su uso para producir LC-PUFA de la presente invención.
Tal como se emplea en la presente, el término "variante" se refiere a un polipéptido que se diferencia de un polipéptido específicamente indicado de la invención por inserciones, deleciones, mutaciones y sustituciones de aminoácidos, que se ha creado empleando, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, tales como mutagénesis. Pueden encontrarse directrices para determinar los restos aminoácidos que pueden reemplazarse, añadirse o delecionarse sin abolir las actividades de interés comparando la secuencia del polipéptido concreto con la de polipéptidos homólogos y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos realizados en regiones de alta homología (regiones conservadas) o mediante la sustitución de aminoácidos por secuencias consenso.
Como alternativa, pueden sintetizarse o seleccionarse variantes de polinucleótidos recombinantes que codifican estos mismos polipéptidos o polipéptidos similares, empleando la "redundancia" del código genético. Pueden
introducirse diversas sustituciones de codones, tales como cambios silenciosos que producen diversos sitios de restricción, para optimizar la clonación en un vector plasmídico o vírico para la expresión. Las mutaciones en la secuencia del polinucleótido pueden reflejarse en el polipéptido o los dominios de otros péptidos añadidos al polipéptido para modificar las propiedades de cualquier parte del polipéptido.
La "sustituciones" de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido por otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, es decir, sustituciones de aminoácidos conservativas, o pueden ser el resultado de sustituir un aminoácido por otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas diferentes, es decir, sustituciones de aminoácidos no conservativas. Las sustituciones de aminoácidos "conservativas" pueden realizarse basándose en similitudes en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad o la naturaleza anfipática de los restos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Como alternativa, las sustituciones de aminoácidos "no conservativas" pueden realizarse seleccionando las diferencias en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad o la naturaleza anfipática de cualquiera de estos aminoácidos. Las "inserciones" o las "deleciones" pueden estar dentro de la gama de variación tolerada desde el punto de vista estructural o funcional por las proteínas recombinantes. La variación permitida puede determinarse de modo experimental realizando sistemáticamente inserciones, deleciones
o sustituciones de aminoácidos en una molécula de polipéptido empleando técnicas de ADN recombinante y ensayando los variantes recombinantes resultantes para la actividad.
El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificadora o un ARN funcional. En general, una secuencia codificadora se localiza 3’ con respecto a una secuencia de promotor. Los promotores pueden derivarse, en su totalidad, de un gen nativo, o pueden estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintéticos. Los expertos en la técnica entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tipos de tejidos o de células, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales o fisiológicas. Los promotores que provocan que un gen se exprese en la mayoría de los tipos de células la mayor parte del tiempo se denominan habitualmente "promotores constitutivos". También se reconoce que, puesto que en la mayoría de los casos, los límites exactos de las secuencias reguladoras aún no se han definido por completo, existen fragmentos de ADN de diferente longitud qie pueden tener una actividad de promotor idéntica.
La expresión "unido operablemente" se refiere a la asociación de secuencias de ácidos nucleicos en un único fragmento de ácido nucleico, de modo la función de una se ve afectada por las otras. Por ejemplo, un promotor está unido operablemente con una secuencia codificada cuando es capaz de realizar la expresión de dicha secuencia codificadora (por ejemplo, la secuencia codificadora está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificadoras pueden estar unidas operablemente a secuencias reguladoras en orientación sentido o antisentido.
El término "expresión”, tal como se emplea en la presente, se refiere a la transcripción y la acumulación estable de ARN sentido (ARNm) o antisentido derivado del fragmento de ácido nucleico de la invención. La expresión también puede referirse a la traducción del ARNm en un polipéptido.
El término "sobreexpresión", tal como se emplea en la presente, se refiere a una expresión que es mayor que la expresión endógena del mismo gen o de un gen relacionado. Un gen heterólogo se sobreexpresa si su expresión es mayor que la de un gen endógeno comparable.
Tal como se emplea en la presente, el término “transformación” se refiere a la transferencia de un ácido nucleico o fragmento hacia el interior de un organismo hospedante, que resulta en una herencia genéticamente estable. Los organismos hospedantes que contienen los fragmentos de ácidos nucleicos transformados se denominan organismos "transgénicos" o "recombinantes" o "transformados".
Los términos "plásmido" y "vector", tal como se emplean en la presente, se refieren a un elemento extracromosómico que a menudo porta genes que no son parte del metabolismo central de la célula y habitualmente está en forma de moléculas de ADN bicatenario circular. Estos elementos pueden ser secuencias de replicación autónoma, secuencias de integración en el genoma, secuencias de fago o de nucleótidos, lineales o circulares, de ADN o ARN monocatenario o bicatenario, procedentes de cualquier fuente, en los que un número de secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una construcción exclusiva que es capaz de introducir un fragmento de promotor y una secuencia de ADN para un producto génico seleccionado, junto con la secuencia no traducida 3’ apropiada en una célula.
Tal como se emplea en la presente, la expresión "degeneración del código genético" se refiere a la naturaleza del código genético que permite variar la secuencia de nucleótidos sin afectar a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. Los expertos en la técnica conocen el "sesgo de codones" que muestra una célula hospedante específica cuando emplea los codones de nucleótidos para especificar un aminoácido concreto. Por
tanto, cuando se sintetiza un gen para para una mayor expresión en una célula hospedante, resulta deseable diseñar el gen de modo que su frecuencia de utilización de codones se aproxima a la frecuencia de la utilización de codones preferida de la célula hospedante.
La expresión "codones optimizados", cuando se refiere a genes o regiones codificadores de moléculas de ácidos nucleicos para la transformación de diversos hospedantes, se refiere a la alteración de los codones en el gen o las regiones codificadoras de las moléculas de ácidos nucleicos para reflejar la utilización de codones típica del organismo hospedante sin alterar el polipéptido codificado por el ADN. Esta optimización incluye reemplazar al menos uno o más de uno o un número significativo de codones por uno o más codones que se emplean con más frecuencia en los genes de ese organismo.
Las desviaciones en la secuencia de nucleótidos que comprende los codones que codifican los aminoácidos de cualquier cadena polipeptídica permiten variar la secuencia codificadora para el gen. Puesto que cada codón consiste en tres nucleótidos y que los nucleótidos que forman el ADN se limitan a cuatro bases específicas, existen 64 posibles combinaciones de nucleótidos, 61 de las cuales codifican aminoácidos (los tres codones restantes codifican señales de fin de la traducción). El "código genético" que muestra cuáles son los codones que codifican cada aminoácido se reproduce en la presente en la tabla 1. Como resultado, muchos aminoácidos son indicados por más de un codón. Por ejemplo, los aminoácidos alanina y prolina son codificados por cuatro tripletes, la serina y la arginina por seis, mientras que el triptófano y la metionina son codificados solo por un triplete. Esta degeneración permite variar la composición de bases del ADN a través de una amplia gama sin alterar la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas por el ADN.
Tabla 1. El código genético convencional
T
C A G
T
TTT Phe (F) TTC ″ TTA Leu (L) TTG ″ TCT Ser (S) TCC ″ TCA ″ TCG ″ TAT Tyr (Y) TAC ″ TAA Fin TAG Fin TGT Cys (C) TGC TGA Fin TGG Trp (W)
C
CTT Leu (L) CTC ″ CTA ″ CTG ″ CCT Pro (P) CCC ″ CCA ″ CCG ″ CAT His (H) CAC ″ CAA Gln (Q) CAG ″ CGT Arg (R) CGC ″ CGA ″ CGG ″
A
ATT Ile (I) ATC ″ ATA ″ ATG Met (M) ACT Thr (T) ACC ″ ACA ″ ACG ″ AAT Asn (N) AAC ″ AAA Lys (K) AAG ″ AGT Ser (S) AGC ″ AGA Arg (R) AGG ″
G
GTT Val (V) GTC ″ GTA ″ GTG ″ GCT Ala (A) GCC ″ GCA ″ GCG ″ GAT Asp (D) GAC ″ GAA Glu (E) GAG ″ GGT Gly (G) GGC ″ GGA ″ GGG ″
Muchos organismos muestran un sesgo de uso de codones concretos que codifican la inserción de un aminoácido concreto en una cadena peptídica en crecimiento. Las diferencias en la preferencia de codones, o sesgo de codones, en la utilización de codones entre organismos es proporcionada por la degeneración del código genético y esto está bien documentado en muchos organismos. El sesgo de codones a menudo se correlaciona con la eficacia de la traducción del ARN mensajero (ARNm) que, a su vez, se cree que depende, entre otras cuestiones, de las propiedades de los codones que se están traduciendo y de la disponibilidad de las moléculas de ARN de transferencia (ARNt) concretas. La predominancia de los ARNt seleccionados en una célula, en general, es un reflejo de los codones que se emplean con más frecuencia en la síntesis de péptidos. Por consiguiente, los genes pueden adaptarse para la expresión óptima de genes en un organismo concreto basándose en la optimización de codones.
Puesto que está disponible un gran número de secuencias génicas para una amplia diversidad de especies animales, vegetales y microbianas, es posible calcular las frecuencias relativas de utilización de codones. Están disponibles tablas de utilización de codones y estas pueden adaptarse mediante una serie de formas. Véase, Nakamura et al., Nucl. Acids Res., 28:292 (2000). Utilizando estas tablas o tablas similares, los expertos en la técnica pueden aplicar las frecuencias a cualquier secuencia polipeptídica concreta y producir un fragmento de ácido nucleico de una región codificadora con codones optimizados que codifica el polipéptido, pero que emplea los codones óptimos para una especie concreta. La presente invención se refiere a las formas con codones optimizados de OrfA, OrfB, OrfC quimérico, PPTasa y/y otras proteínas accesorias de la invención, tal como se describe a continuación en la presente.
La expresión "porcentaje de identidad”, tal como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, según se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de similitud de secuencia entre las secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según sea el caso, determinada mediante el apareamiento entre las hebras de estas secuencias. La "identidad" y la "similitud" pueden calcularse con facilidad por medio de métodos conocidos, que incluyen, pero no se limitan a los descritos en: 1) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.), Oxford University, NY (1988); 2) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.), Academic, NY (1993); 3) Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds.), Humania, NJ (1994); 4) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.), Academic (1987); y 5) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J., eds.), Stockton, NY (1991).
Los métodos para determinar la identidad se diseñan para proporcionar el mejor apareamiento entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas informáticos públicos. Los cálculos de alineamiento de secuencias y de porcentaje de identidad pueden realizarse, por ejemplo, empleando el programa AlignX del paquete Vector NTI® (Invitrogen, Carlsbad, CA) o el programa MegAlign™ del paquete bioinformático LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Se realizan múltiples alineamientos de las secuencias empleando el "método de alineamiento Clustal", que incluye algunas variedades del algoritmo que incluyen el "método de alineamiento Clustal V" que se corresponde con el método de alineamiento denominado Clustal V (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS., 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) y que se encuentra en el programa MegAlign™ del paquete bioinformático LASERGENE (DNASTAR Inc.). Para múltiples alineamientos, los valores por defecto se corresponden con PENALIZACIÓN DE HUECO = 10 y PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE HUECO = 10. Los parámetros por defecto para los alineamientos apareados y el cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de proteínas empleando el método Clustal V son KTUPLO = 1, PENALIZACIÓN DE HUECO = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS= 5. Para los ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLO = 2, PENALIZACIÓN DE HUECO = 5, VENTANA = 4 y DIAGONALES GUARDADAS = 4. Después del alineamiento de las secuencias empleando el programa Clustal V, es posible obtener un "porcentaje de identidad" observando la tabla de "distancias de secuencia" en el mismo programa. Además, está disponible el "método de alineamiento Clustal W", que se corresponde con el método de alineamiento denominado Clustal W (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS., 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191(1992)) y que se encuentra en el programa MegAlign™ v6.1 del paquete bioinformático LASERGENE (DNASTAR Inc.). Los parámetros por defecto para múltiples alineamientos son: PENALIZACIÓN DE HUECO = 10, PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE HUECO = 0,2, Retraso de sec. divergentes (%) = 30, Peso del ADN de transición = 0,5, Matriz de peso de proteínas = serie Gonnet, Matriz de peso de ADN = IUB. Después del alineamiento de las secuencias empleando el programa Clustal W, es posible obtener un "porcentaje de identidad" observando la tabla de "distancias de secuencia" en el mismo programa.
Los expertos en la técnica entienden que son útiles muchos niveles de identidad de secuencia para identificar polipéptidos procedentes de otras especies, en los que dichos polipéptidos tienen la misma función o actividad, o una función o actividad similar. Los ejemplos útiles de porcentajes de identidad incluyen, pero no se limitan a: 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95%, o cualquier porcentaje de número entero desde 60% a 100% que puede ser útil para describir la presente invención, tal como 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Los fragmentos de ácidos nucleicos adecuados no solo presentan las anteriores homologías, sino que generalmente codifican un polipéptido que tiene al menos 50 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, al menos 150 aminoácidos, al menos 200 aminoácidos, y al menos 250 aminoácidos.
La expresión "programa de análisis de secuencias" se refiere a cualquier algoritmo informático o programa de software que es útil para el análisis de secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. El "programa de análisis de secuencias" puede estar disponible en el mercado o puede estar desarrollado independientemente. Los programas de análisis de secuencias típicos incluyen, pero no se limitan a: 1.) el paquete de programas GCG (Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI); 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)); 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, WI); 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI); y 5.) el programa FASTA que incorpora el algoritmo de Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res. [Proc. Int. Symp.] (1994), fecha del simposio 1992, 111-120, (editores: Suhai, Sandor), Plenum, Nueva York, NY). En el contexto de esta solicitud, se entenderá que cuando se emplea un programa de análisis de secuencias para un análisis, los resultados se basan en los "valores por defecto" del
programa mencionado, a menos que se indique lo contrario. Tal como se emplean en la presente, los "valores por defecto" significan cualquier conjunto de valores o parámetros que han sido originariamente cargados con el programa cuando se inicia por primera vez.
Las técnicas de clonación molecular y de ADN recombinante convencionales empleadas en la presente son muy conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2000); y Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987 hasta la actualidad).
Las manipulaciones genéticas de los hospedantes recombinantes descritos en la presente pueden realizarse empleando técnicas genéticas y de selección convencionales, y pueden realizarse en cualquier célula hospedante que sea adecuada para la manipulación genética. En algunas realizaciones, una célula hospedante recombinante descrita en la presente puede ser cualquier organismo o microorganismo hospedante útil para la modificación genética y la expresión de genes recombinantes. En algunas realizaciones, un hospedante recombinante puede ser, pero no se limita a cualquier planta superior, incluyendo plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, y plantas comestibles, que incluyen plantas de cultivos y plantas empleadas por su aceite. Así, puede seleccionarse cualquier especie de planta o célula de planta, tal como se describe más a fondo a continuación.
Los aceites descritos en la presente pueden obtenerse a partir de cultivares de colza que producen DHA y/o EPA en el aceite de las semillas de una especie de Brassica, en los que los aceites tienen un contenido en ácidos grasos que comprende, en peso, 70% o más de ácido oleico (C18:1) y/o 4% o menos de ácido linolénico (C18:3). Estos aceites son saludables para el corazón y presentan mayor estabilidad para aplicaciones de artículos envasados para consumidores y servicios de alimentación. Estos aceites también reducen la necesidad de una hidrogenación y proporcionan ventajas nutricionales frente a los aceites de soja, de palma y muchos otros aceites empleados por la industria alimentaria. La estabilidad oxidativa de dichos aceites puede aumentar aún más mediante la adición de antioxidantes y aditivos del procesamiento conocidos en la técnica.
Los aceites descritos en la presente también pueden utilizarse en composiciones y procesos no culinarios o no dietéticos. Algunos de estos usos pueden ser industriales, cosméticos o médicos. Los aceites descritos en la presente también pueden utilizarse en cualquier aplicación para la cual los aceites de la presente invención resultan adecuados. En general, los aceites de la presente invención pueden emplearse para sustituir, por ejemplo, aceites minerales, ésteres, ácidos grasos o grasas animales en una diversidad de aplicaciones, tales como lubricantes, aditivos de lubricantes, fluidos para trabajar metales, fluidos hidráulicos y fluidos hidráulicos pirorresistentes. Los aceites descritos en la presente también pueden utilizarse como materiales en un proceso para producir aceites modificados. Los ejemplos de técnicas para modificar aceites de la presente invención incluyen el fraccionamiento, la hidrogenación, la alteración del contenido en ácido oleico o ácido linolénico del aceite y otras técnicas de modificación conocidas por los expertos en la técnica.
Los ejemplos de usos cosméticos para los aceites descritos en la presente incluyen el uso como emoliente en una composición cosmética; como sustituto de la gelatina de petróleo; como parte componente de un jabón o como un material en un proceso para producir jabón; como parte componente de una disolución de tratamiento oral; como parte componente de una composición de tratamiento del envejecimiento; y como parte componente de una preparación de espuma en aerosol para la piel o el pelo.
Además, los aceites descritos en la presente pueden utilizarse en aplicaciones médicas. Por ejemplo, los aceites de la presente invención pueden utilizarse como barrera protectora contra infecciones, y los aceites con alto contenido en ácidos grasos omega-9 pueden emplearse para potenciar la supervivencia de injertos trasplantados (patente de EE. UU. n.º 6.210.700).
Debe entenderse que los anteriores son ejemplos no limitantes de usos no culinarios para los cuales los aceites de la presente invención resultan adecuados. Tal como se indicó previamente, los aceites y los aceites modificados descritos en la presente pueden emplearse para sustituir, por ejemplo, aceites minerales, ésteres, ácidos grasos o grasas animales en todas las aplicaciones conocidas por los expertos en la técnica.
Sistema de PUFA sintasa
La vía "convencional" o "clásica" para la síntesis de PUFA de cadena larga ("long chain PUFAs", LC-PUFA) en organismos eucariotas implica el alargamiento y la desaturación de ácidos grasos saturados o monoinsaturados de longitud de cadena intermedia y esta ha sido descrita. La vía para la síntesis de PUFA de cadena larga por medio del sistema de PUFA sintasa también se ha descrito y es muy diferente de la vía "convencional". De modo específico, la PUFA sintasa emplea la malonil-CoA como fuente de carbono y produce el PUFA final sin liberar intermedios en cantidad significativa. Además, con la PUFA sintasa se añaden los dobles enlaces cis apropiados durante la síntesis empleando un mecanismo que no requiere oxígeno. En algunas realizaciones, se emplea NADPH como reductor durante los ciclos de síntesis.
La presente invención se refiere a organismos hospedantes (por ejemplo, plantas) que han sido genéticamente
modificados para que expresen un sistema de PUFA sintasa (de modo endógeno o mediante manipulación genética). En algunas realizaciones, un organismo que ha sido genéticamente modificado para que exprese un sistema de PUFA sintasa, en el que el organismo no expresa de modo natural (de forma endógena, sin modificación genética) dicho sistema, o al menos esa PUFA sintasa concreta o una de sus porciones, con la que el organismo está siendo genéticamente modificado, puede denominarse en la presente un organismo hospedante "heterólogo", con respecto a la modificación del organismo con la PUFA sintasa o con otra proteína que no es expresada de modo endógeno por el organismo. Las modificaciones genéticas de la presente invención pueden emplearse para mejorar la producción de PUFA en un organismo hospedante que expresa de modo endógeno un sistema de PUFA sintasa, en el que el organismo no se vuelve a modificar con una PUFA sintasa diferente o con una de sus porciones.
Un sistema de PUFA sintasa según la presente invención puede comprender varias proteínas multifuncionales (y puede incluir proteínas de una única función, en particular para sistemas de PUFA sintasa procedentes de bacterias marinas) que actúan juntas para realizar el procesamiento iterativo de cadenas de ácidos grasos y también el procesamiento no iterativo, que incluye la isomerización trans-cis y las reacciones de reducción de enoílo en ciclos seleccionados. Estas proteínas también se pueden denominar en la presente el complejo de enzimas de PUFA central o el sistema de PUFA sintasa central. Las funciones generales de los dominios y los motivos contenidos dentro de estas proteínas se conocen individualmente en la técnica y han sido descritos en detalle con respecto a diversos sistemas de PUFA sintasa procedentes de bacterias marinas y organismos eucariotas (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 6.140.486; la patente de EE. UU. n.º 6.566.583; Metz et al., Science, 293:290-293 (2001); la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2002/0194641; la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2004/0235127; la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2005/0100995, y el documento WO 2006/135866). Los dominios pueden aparecer como una única proteína (por ejemplo, el dominio y la proteína son sinónimos) o como uno de dos o más dominios (múltiples) en una única proteína, tal como se mencionó anteriormente. Se ha descrito la arquitectura de los dominios de diversas PUFA sintasas procedentes de bacterias marinas y miembros de Thraustochytrium, y las características estructurales y funcionales de genes y proteína que comprenden dichas PUFA sintasas (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 6.140.486; la patente de EE. UU. n.º 6.566.583; Metz et al., Science, 293:290-293 (2001); la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2002/0194641; la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2004/0235127; la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2005/0100995, y el documento WO 2006/135866).
En la técnica se conocen numerosos ejemplos de polinucleótidos, genes y polipéptidos que tienen actividad PUFA sintasa, y estos pueden utilizarse en un hospedante genéticamente modificado descrito en la presente. Las proteínas o dominios de PUFA sintasa que son útiles en la presente invención pueden incluir PUFA sintasas bacterianas y no bacterianas. Una PUFA sintasa no bacteriana es un sistema que procede o se deriva de un organismo que no es una bacteria, tal como un eucariota. Las PUFA sintasas bacterianas se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2008/0050505. Pueden producirse plantas genéticamente modificadas descritas en la presente que incorporan dominios funcionales de una PUFA sintasa no bacteriana con dominios funcionales de PUFA sintasa bacteriana, así como proteínas o dominios funcionales de PUFA sintasa procedentes de otros sistemas de PKS (modular o iterativo de tipo I, tipo II, o tipo III) o sistemas de FAS.
Un sistema de PUFA sintasa descrito en la presente puede comprender al menos los siguientes dominios biológicamente activos que están contenidos generalmente en tres o más proteínas: (a) al menos un dominio enoil-ACP reductasa (ER); (b) múltiples dominios de proteína portadora de acilo (ACP) (por ejemplo, al menos de uno a cuatro, y preferiblemente al menos cinco dominios ACP y, en algunas realizaciones, hasta seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez dominios ACP); (c) al menos dos dominios de β-cetoacil-ACP sintasa (KS); (d) al menos un dominio de aciltransferasa (AT); (e) al menos un dominio de β-cetoacil-ACP reductasa (KR); (f) al menos dos dominios de β-hidroxiacil-ACP deshidratasa (DH) similares a FabA; (g) al menos un dominio de factor de longitud de cadena (CLF); (h) al menos un dominio de malonil-CoA:ACP aciltransferasa (MAT). Un sistema de PUFA sintasa descrito en la presente también puede comprender al menos una región que contiene un motivo de sitio activo conservado de deshidratasa (DH).
Un sistema de PUFA sintasa puede comprender al menos los siguientes dominios biológicamente activos: (a) al menos un dominio enoil-ACP reductasa (ER); (b) al menos cinco dominios de proteína portadora de acilo (ACP); (c) al menos dos dominios de β-cetoacil-ACP sintasa (KS); (d) al menos un dominio de aciltransferasa (AT); (e) al menos un dominio de β-cetoacil-ACP reductasa (KR); (f) al menos dos dominios de β-hidroxiacil-ACP deshidratasa (DH) similares a FabA; (g) al menos un dominio de factor de longitud de cadena (CLF); (h) al menos un dominio de malonil-CoA:ACP aciltransferasa (MAT). Un sistema de PUFA sintasa descrito en la presente también puede comprender al menos una región o dominio que contiene un motivo de sitio activo conservado de deshidratasa (DH) que no es parte de un dominio DH similar a FabA. Las características estructurales y funcionales de cada uno de estos dominios se describen en detalle en la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2002/0194641; la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2004/0235127; la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2005/0100995; la solicitud de patente publicada n.º 2007/0245431, y el documento WO 2006/135866.
Existen tres marcos de lectura abiertos que forman el sistema de PUFA sintasa central de Schizochytrium y que han sido descritos previamente, por ejemplo, en la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2007/0245431. La estructura de dominios de cada marco de lectura abierto es la siguiente.
Marco de lectura abierto A de Schizochytrium (OrfA o Pfa1): OrfA es una secuencia de 8730 nucleótidos (que no incluye el codón de terminación) que codifica una secuencia de 2910 aminoácidos. Dentro de OrfA hay doce dominios: (a) un dominio de β-cetoacil-ACP sintasa (KS); (b) un dominio de malonil-CoA:ACP aciltransferasa (MAT);
(c) nueve dominios de proteína portadora de acilo (ACP); y (d) un dominio de cetorreductasa (KR). Se han aislado y secuenciado clones de ADN genómico (plásmidos) que codifican OrfA de Schizochytrium sp. ATCC 20888 y de una cepa hija de ATCC 20888, denominada Schizochytrium sp., cepa N230D.
Se depositó el clon genómico pJK1126 (denominado clon genómico pJK1126 OrfA, en forma de un vector plasmídico de E. coli que contiene el gen "OrfA" de Schizochytrium ATCC 20888) en the American Type Culture Collection (ATCC), 10801, University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, EE. UU., el 8 de junio, 2006, y se le asignó el número de registro ATCC PTA-7648.
Se depositó el clon genómico pJK306 (denominado clon genómico pJK306, en forma de un vector plasmídico de E. coli que contiene la porción 5’ del gen OrfA de Schizochytrium sp. N230D (solapamiento de 2,2 kB con pJK320)) en the American Type Culture Collection (ATCC), 10801, University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, EE. UU., el 8 de junio, 2006, y se le asignó el número de registro ATCC PTA-7641.
Se depositó el clon genómico pJK320 (denominado clon genómico pJK320 OrfA, en forma de un vector plasmídico de E. coli que contiene la porción 3’ del gen OrfA de Schizochytrium sp. N230D (solapamiento de 2,2 kB con pJK306)) en the American Type Culture Collection (ATCC), 10801, University Boulevard, Manassas, Va., 201102209, EE. UU., el 8 de junio, 2006, y se le asignó el número de registro ATCC PTA-7644.
Marco de lectura abierto B de Schizochytrium (OrfB o Pfa2): OrfB es una secuencia de 6177 nucleótidos (que no incluye el codón de terminación) que codifica una secuencia de 2059 aminoácidos. Dentro de OrfB hay cuatro dominios: (a) un dominio de cetoacil-ACP sintasa (KS); (b) un dominio de factor de longitud de cadena (CLF); (c) un dominio de acil transferasa (AT); y (d) un dominio de enoilo ACP-reductasa (ER). Se han aislado y secuenciado clones de ADN genómico (plásmidos) que codifican OrfB de Schizochytrium sp. ATCC 20888 y de una cepa hija de ATCC 20888, denominada Schizochytrium sp., cepa N230D.
Se depositó el clon genómico pJK1129 (denominado clon genómico pJK1129 OrfB, en forma de un vector plasmídico de E. coli que contiene el gen "OrfB" de Schizochytrium ATCC 20888) en the American Type Culture Collection (ATCC), 10801, University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, EE. UU., el 8 de junio, 2006, y se le asignó el número de registro ATCC PTA-7649.
Se depositó el clon genómico pJK324 (denominado clon genómico pJK324 OrfB, en forma de un vector plasmídico de E. coli que contiene la secuencia del gen OrfB de Schizochytrium sp. N230D) en American Type Culture Collection (ATCC), 10801, University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, EE. UU., el 8 de junio, 2006, y se le asignó el número de registro ATCC PTA-7643.
Marco de lectura abierto C de Schizochytrium C (OrfC o Pfa3): OrfC es una secuencia de 4506 nucleótidos (que no incluye el codón de terminación) que codifica una secuencia de 1502 aminoácidos. Dentro de OrfC hay tres dominios: (a) dos dominios de hidroxiacil-ACP deshidratasa similares a FabA (DH); y (b) un dominio de enoilo ACPreductasa (ER). Se han aislado y secuenciado clones de ADN genómico (plásmidos) que codifican OrfC de Schizochytrium sp. ATCC 20888 y de una cepa hija de ATCC 20888, denominada Schizochytrium sp., cepa N230D.
Se depositó el clon genómico pJK1131 (denominado clon genómico pJK1131 OrfC, en forma de un vector plasmídico de E. coli que contiene el gen "OrfC" de Schizochytrium ATCC 20888) en the American Type Culture Collection (ATCC), 10801, University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, EE. UU., el 8 de junio, 2006, y se le asignó el número de registro ATCC PTA-7650.
Se depositó el clon genómico pBR002 (denominado clon genómico pBR002 OrfC, en forma de un vector plasmídico de E. coli que contiene la secuencia del gen OrfC de Schizochytrium sp. N230D) en the American Type Culture Collection (ATCC), 10801, University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, EE. UU., el 8 de junio, 2006, y se le asignó el número de registro ATCC PTA-7642.
Además, existe tres marcos de lectura abierto que forman el sistema de PUFA sintasa central de Thraustochytrium y que han sido descritos previamente. La estructura de dominios de cada marco de lectura abierto es la siguiente.
Marco de lectura abierto A de Thraustochytrium 23B (OrfA): OrfA es una secuencia de 8433 nucleótidos (que no incluye el codón de terminación) que codifica una secuencia de 2811 aminoácidos. Los siguientes dominios están presentes en OrfA de Th. 23B: (a) un dominio β--cetoacil-ACP sintasa (KS); (b) un dominio de malonil-CoA:ACP aciltransferasa (MAT); (c) ocho dominios de proteína portadora de acilo (ACP); y (d) un dominio de β-cetoacil-ACP reductasa (KR).
Se depositó el clon genómico Th23BOrfA_pBR812.1 (denominado clon genómico Th23BOrfA_pBR812.1, en forma de un vector plasmídico de E. coli que contiene la secuencia del gen OrfA de Thraustochytrium 23B) en the American Type Culture Collection (ATCC), University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, EE. UU., el 1 de marzo, 2007, y se le asignó el número de registro ATCC PTA-8232. Se depositó el clon genómico
Th23BOrfA_pBR811 (denominado clon genómico Th23BOrfA_pBR811, en forma de un vector plasmídico de E. coli que contiene la secuencia del gen OrfA de Thraustochytrium 23B)en the American Type Culture Collection (ATCC), 10801, University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, EE. UU., el 1 de marzo, 2007, y se le asignó el número de registro ATCC PTA-8231.
Marco de lectura abierto B de Thraustochytrium 23B (OrfB): OrfB es una secuencia de 5805 nucleótidos (que no incluye el codón de terminación) que codifica una secuencia de 1935 aminoácidos. Los siguientes dominios están presentes en OrfB de Th. 23B: (a) un dominio de β-cetoacil-ACP sintasa (KS); (b) un dominio de factor de longitud de cadena (CLF); (c) un dominio de acil transferasa (AT); y (d) un dominio de enoíl-ACP reductasa (ER). Se depositó el clon genómico Th23BOrfB_pBR800 (denominado clon genómico Th23BOrfB_pBR800, en forma de un vector plasmídico de E. coli que contiene la secuencia del gen OrfB de Thraustochytrium 23B) en the American Type Culture Collection (ATCC), 10801, University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, EE. UU., el 1 de marzo, 2007, y se le asignó el número de registro ATCC PTA-8227.
Marco de lectura abierto C de Thraustochytrium 23B (OrfC): OrfC es una secuencia de 4410 nucleótidos (que no incluye el codón de terminación) que codifica una secuencia de 1470 aminoácidos. Los siguientes dominios están presentes en OrfC de Th. 23B: (a) dos dominios de β-hidroxiacil-ACP deshidrasa similares a FabA (DH), ambos con homología con la proteína FabA (una enzima que cataliza la síntesis de trans-2-decenoil-ACP y la isomerización reversible de este producto a cis-3-decenoil-ACP); y (b) un dominio de enoíl-ACP reductasa (ER) con una alta homología con el dominio ER de OrfB de Schizochytrium. Se depositó el clon genómico Th23BOrfC_pBR709A (denominado clon genómico Th23BOrfC_pBR709A, en forma de un vector plasmídico de E. coli que contiene la secuencia del gen OrfC de Thraustochytrium 23B) en the American Type Culture Collection (ATCC), 10801, University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, EE. UU., el 1 de marzo, 2007, y se le asignó el número de registro ATCC PTA-8228.
Sistemas de PUFA sintasa quiméricos o híbridos: En algunas realizaciones, el sistema de PUFA sintasa comprende dominios seleccionados de cualquiera de los descritos en la presente, en los que los dominios se combinan (por ejemplo, se mezclan y se aparean) para formar un sistema de PUFA sintasa completo que cumple los requisitos mínimos descritos en la presente. El organismo genéticamente modificado descrito en la presente puede modificarse aún más con al menos un dominio, o uno de sus fragmentos biológicamente activos, de otro sistema de PUFA sintasa. En algunas realizaciones, cualquiera de los dominios de un sistema de PUFA sintasa puede modificarse a partir de estructura natural para modificar o potenciar la función de ese dominio en el sistema de PUFA sintasa (por ejemplo, para modificar los tipos de PUFA o sus proporciones producidos por el sistema). Esta mezcla de dominios para producir sistemas de PUFA sintasa quiméricos se describe en las patentes y publicaciones referenciadas en la presente.
En algunas realizaciones, el sistema de PUFA sintasa comprende un sistema de PUFA sintasa de Schizochytrium en el que el OrfC del sistema de PUFA sintasa de Schizochytrium es reemplazado por el OrfC de Thraustochytrium 23B. En algunas realizaciones, dicho OrfC quimérico de Thraustochytrium 23B es codificado por una secuencia de ácido nucleico que está optimizada para la utilización de codones de Schizochytrium. Como ejemplo no limitante de dicho OrfC quimérico, se depositó el plásmido pThOrfC-synPS (denominado pThOrfC-synPS, en forma de un vector plasmídico de E. coli que contiene un OrfC de PKS PUFA de Thraustochytrium 23B sintético de "cosido perfecto" con codones optimizados para la expresión en Schizochytrium u otros hospedantes heterólogos) en the American Type Culture Collection (ATCC), 10801, University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, EE. UU., el 1 de marzo, 2007, y se le asignó el número de registro ATCC PTA-8229 (véase también la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2008/0022422).
Otros ejemplos de polipéptidos y genes de PUFA sintasa que pueden emplearse en un organismo genéticamente modificado descrito en la presente incluyen, pero no se limitan a las siguientes secuencias con codones optimizados generadas mediante los métodos descritos a continuación en la presente: SEQ ID NO:1 (proteína SzPUFA OrfA v3); SEQ ID NO:2 (proteína SzPUFA OrfB v3); SEQ ID NO:3 (proteína hSzThPUFA OrfC v3); SEQ ID NO:6 (gen SzPUFA OrfA); SEQ ID NO:7 (gen SzPUFA OrfB v3); y SEQ ID NO:8 (gen hSzThPUFA OrfC v3), así como un variante activo, porción, fragmento o derivado de dichas secuencias, en las que dicho gen codifica, o dicho polipéptido o proteína tiene actividad PUFA sintasa. En la presente también se describe un polinucleótido o un polipéptido aislado que comprende o que consiste en una o más de dichas secuencias.
Otros ejemplos de polipéptidos y genes de PUFA sintasa que pueden emplearse en un organismo genéticamente modificado descrito en la presente incluyen, pero no se limitan a polipéptidos o genes de PUFA sintasa que tienen 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una cualquiera de las PUFA sintasas o secuencias descritas en la presente. Los intervalos útiles pueden seleccionarse de entre cualquiera de estos valores (por ejemplo, de 60% a 99%, de 65% a 95%, de 70% a 95%, de 75% a 95%, de 80% a 95%, de 85% a 95%, o de 90% a 99%). Otros ejemplos de polipéptidos y genes de PUFA sintasa que pueden emplearse en un organismo genéticamente modificado descrito en la presente incluyen, pero no se limitan a un variante activo, porción, fragmento o derivado de cualquiera de las PUFA sintasas o secuencias descritas en la presente, en los que dicho gen codifica, o dicho polipéptido o proteína tiene actividad PUFA sintasa.
En algunas realizaciones, el sistema de PUFA sintasa puede ser un PUFA sintasa de algas. En algunas
realizaciones, el sistema de PUFA sintasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% al 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, el sistema de PUFA sintasa puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el sistema de PUFA sintasa puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es al menos 60% al 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:6. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el sistema de PUFA sintasa puede comprender la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:6. En algunas realizaciones, el sistema de PUFA sintasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, el sistema de PUFA sintasa puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el sistema de PUFA sintasa puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es al menos 80% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:7. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el sistema de PUFA sintasa puede comprender la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:7. En algunas realizaciones, el sistema de PUFA sintasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3. En algunas realizaciones, el sistema de PUFA sintasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el sistema de PUFA sintasa puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es al menos 80% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:8. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el sistema de PUFA sintasa comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:8.
En algunas realizaciones, el sistema de PUFA sintasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, 2,
o 3, o cualquiera de sus combinaciones. En algunas realizaciones, el sistema de PUFA sintasa comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:6, 7, o 8, o cualquiera de sus combinaciones.
En algunas realizaciones, las secuencias de otros polipéptidos y/o genes de PUFA sintasa pueden identificarse en la bibliografía y en bases de datos bioinformáticas muy conocidas por los expertos en la técnica empleando las secuencias descritas en la presente y disponibles en la técnica. Por ejemplo, dichas secuencias pueden identificarse mediante una búsqueda con BLAST de bases de datos públicas con secuencias de polipéptidos o genes de PUFA sintasa conocidos. En este método, las identidades pueden basarse en el método de alineamiento Clustal W empleando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN DE HUECO = 10, PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE HUECO = 0,1, y serie Gonnet 250 de matriz de peso de proteínas.
Además, las secuencias de polipéptidos o genes de PUFA sintasa descritas en la presente o conocidas en la técnica pueden emplearse para identificar otros homólogos de PUFA sintasa en la naturaleza. Por ejemplo, cada uno de los fragmentos de ácidos nucleicos de PUFA sintasa descritos en la presente pueden emplearse para aislar genes que codifican proteínas homólogas. El aislamiento de genes homólogos empleando protocolos dependientes de secuencia es muy conocido en la técnica. Los ejemplos de protocoles dependientes de secuencia incluyen, pero no se limitan a: (1) métodos de hibridación de ácidos nucleicos; (2) métodos de amplificación de ADN y ARN, según se ejemplifica por los diversos usos de tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos [por ejemplo, la reacción en cadena con polimerasa (PCR), Mullis et al., patente de EE. UU. n.º 4.683.202; la reacción en cadena con ligasa (LCR), Tabor, S. et al., Proc. Acad. Sci., USA, 82:1074 (1985); o la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:392 (1992)]; y (3) métodos de construcción de bancos y selección por complementación.
Todos estos métodos pueden ser realizados con facilidad por los expertos en la técnica empleando las secuencias conocidas o identificadas que codifican proteínas diana. En algunas realizaciones, las secuencias de ADN que rodean a una secuencia codificadora de PUFA sintasa diana también son útiles en algunos procedimientos de modificación y los expertos en la técnica pueden encontrarlas con facilidad en bases de datos públicas. Los métodos para crear mutaciones genéticas son habituales y muy conocidos en la técnica, y pueden aplicarse al ejercicio de crear mutantes.
Fosfopanteteinilo transferasa
Las fosfopantetienil transferasas (PPTasas) son una familia de enzimas que se han caracterizado muy bien en la síntesis de ácidos grasos, la síntesis de policétidos, y la síntesis de péptidos no ribosómicos. En particular, los dominios ACP presentes en las enzimas PUFA sintasas requieren la activación mediante la unión de un cofactor (4fosfopanteteína) desde la coenzima A a la proteína portadora de acilo (ACP). La unión de este cofactor es realizada por las PPTasas. Si las PPTasas endógenas del organismo hospedante son incapaces de activar los dominios ACP de la PUFA sintasa, entonces es necesario proporcionar una PPTasa que sea capaz de realizar dicha función. Las secuencias de muchas PPTasas son conocidas, y se han determinado las estructuras cristalinas (por ejemplo, Reuter et al., EMBO J., 18:6823-6831 (1999)), así como el análisis mutacional de los restos aminoácidos importantes para la actividad (Mofid et al., Biochemistry, 43:4128-4136 (2004)).
Un ejemplo de una PPTasa heteróloga que se ha demostrado previamente que reconoce los dominios ACP de OrfA descritos en la presente como sustratos es la proteína Het I de Nostoc sp. PCC 7120 (denominado anteriormente Anabaena sp. PCC 7120). Het I está presente en un agrupamiento de genes en Nostoc conocidos por ser responsables de la síntesis de hidroxiácidos grasos de cadena larga que son un componente de la capa de
glicolípidos presente en los heterocistos de este organismo (Black y Wolk, J. Bacteriol., 176:2282-2292 (1994); Campbell et al., Arch. Microbiol., 167:251-258 (1997)). Es probable que Het I active los dominios ACP de una proteína, Hgl E, presente en este agrupamiento. Los dos dominios ACP de Hgl E tienen una alto grado de homología de secuencia con los dominios ACP que aparecen en OrfA de Schizochytrium y otras PUFA sintasas.
En algunas realizaciones, puede considerarse que una PUFA sintasa incluye al menos un dominio de 4’fosfopanteteinilo transferasa (PPTasa), o puede considerarse que dicho dominio sea un dominio o proteína accesorio para la PUFA sintasa. Las características estructurales y funcionales de las PPTasas se han descrito en detalle, por ejemplo, en la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2002/0194641; la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2004/0235127; y la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2005/0100995.
En la técnica se conocen numerosos ejemplos de genes y polipéptidos que tienen actividad PPTasa y que pueden utilizarse en un organismo genéticamente modificado de la invención, si son capaces de activar los dominios ACP de la PUFA sintasa concreta que se está utilizando. Los ejemplos de genes y polipéptidos que pueden emplearse en un organismo genéticamente modificado descrito en la presente incluyen, pero no se limitan a las siguientes secuencias con codones optimizados descritas con más detalle en la presente: SEQ ID NO:5 (proteína NoHetI v3) y SEQ ID NO:10 (gen NoHetI v3).
Otros ejemplos de polipéptidos y genes de PPTasa que pueden emplearse en un organismo genéticamente modificado descrito en la presente incluyen, pero no se limitan a polipéptidos o genes de PPTasa que tienen 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una cualquiera de las PPTasas o secuencias descritas en la presente. Los intervalos útiles pueden seleccionarse entre cualquiera de estos valores (por ejemplo, de 60% a 99%, de 65% a 95%, de 70% a 95%, de 75% a 95%, de 80% a 95%, de 85% a 95%, de 90% a 99%). Otros ejemplos de polipéptidos y genes de PPTasa que pueden emplearse en un organismo genéticamente modificado descrito en la presente incluyen, pero no se limitan a un variante activo, porción, fragmento o derivado de cualquiera de las secuencias de PPTasas descritas en la presente, en los que dicho gen codifica, o dicho polipéptido tiene actividad PPTasa.
En algunas realizaciones, la PPTasa puede ser una PPTasa de algas. En algunas realizaciones, la PPTasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% al 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, la PPTasa puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica la PPTasa de algas puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es al menos 60% al 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:10. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica la PPTasa de algas puede comprender la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:10.
En algunas realizaciones, puede proporcionarse una PPTasa para la producción y/o la acumulación de PPTasa en un hospedante heterólogo.
En algunas realizaciones, puede emplearse un gen y/o un polipéptido que codifica una PPTasa para identificar otras secuencias de genes y/o polipéptidos de PPTasas y/o puede emplearse para identificar un homólogo de PPTasa en otras células. Dichas secuencias que codifican PPTasas pueden identificarse, por ejemplo, en la bibliografía y/o en bases de datos bioinformáticas muy conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la identificación de una secuencia que codifica una PPTasa en otro tipo de célula empleando la bioinformática puede lograrse por medio de búsqueda con BLAST (tal como se describió anteriormente) de bases de datos públicas con secuencias de polipéptidos y ADN que codifican PPTasas conocidas, tales como las proporcionadas en la presente. Las identidades se basan en el método de alineamiento Clustal W empleando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN DE HUECO = 10, PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE HUECO = 0,1, y serie Gonnet 250 de matriz de peso de proteínas.
En algunas realizaciones, la planta genéticamente modificada (por ejemplo, Brassica), sus descendientes, células, tejidos o partes, contienen las secuencias de ácidos nucleicos de (i) y (ii) en un único vector de expresión recombinante.
Acil-CoA sintetasa
En la presente también se describen proteínas de acil-CoA sintetasa (ACoAS) que catalizan la conversión de ácidos grasos libres (FFA) PUFA de cadena larga a acil-CoA. El productor endógeno de PUFA mediante PUFA sintasa, Schizochytrium, posee una o más ACoAS que son capaces de convertir productos de ácidos grasos libres de su PUFA sintasa en acil-CoA. Esto resulta evidente por el hecho de que se acumulan niveles elevados de PUFA en estas fracciones en este organismo. Por tanto, Schizochytrium , así como otros organismos que contienen de modo endógeno una PUFA sintasa (por ejemplo, otros Thraustochytrium) u otros organismos que pueden convertir PUFA FFA en acil-CoA (tales como Thalassiosira pseudonana o Crypthecodinium cohnii), pueden representar fuentes de genes que codifican enzimas que son útiles para permitir o aumentar la acumulación de los productos de una PUFA sintasa expresada en un hospedante heterólogo. Se han descrito otras secuencias de ACoAS en la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2007/0245431.
En la técnica se conocen numerosos ejemplos de genes y polinucleótidos que tienen actividad ACoAS, y estos
pueden utilizarse en un hospedante genéticamente modificado descrito en la presente. Los ejemplos de genes y polipéptidos que pueden emplearse en un organismo genéticamente modificado de la invención pueden incluir, pero no se limitan a las siguientes secuencias con codones optimizados descritas con más detalle en la presente: SEQ ID NO:4 (proteína SzACS-2 v3) y SEQ ID NO:9 (gen hSzThACS-2 v3).
Otros ejemplos de polipéptidos y genes de ACoAS que pueden emplearse en un organismo genéticamente modificado descrito en la presente incluyen, pero no se limitan a polipéptidos o genes de ACoAS que tienen 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una cualquiera de las ACoAS o secuencias descritas en la presente. Los intervalos útiles pueden seleccionarse de entre cualquiera de estos valores (por ejemplo, de 60% a 99%, de 65% a 95%, de 70% a 95%, de 75% a 95%, de 80% a 95%, de 85% a 95%, o de 90% a 99%). Otros ejemplos de polipéptidos y genes de ACoAS que pueden emplearse en un organismo genéticamente modificado descrito en la presente incluyen, pero no se limitan a un variante activo, porción, fragmento o derivado de cualquiera de las secuencias de ACoAS descritas en la presente, en los que dicho gen codifica, o dicho polipéptido tiene actividad ACoAS.
En algunas realizaciones, la ACoAS puede ser una ACoAS de algas. En algunas realizaciones, la ACoAS puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% al 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. En algunas realizaciones, la ACoAS puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica la ACoAS de algas puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es al menos 60% al 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:9. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica la ACoAS de algas puede comprender la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:9. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica la ACoAS comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:34.
En algunas realizaciones, puede proporcionarse una ACoAS para la producción y/o la acumulación de ACoAS en un hospedante heterólogo, así como para la producción y/o la acumulación mejoradas de ACoAS en un hospedante heterólogo.
En algunas realizaciones, puede emplearse un gen y/o un polipéptido que codifica una ACoAS para identificar otras secuencias de genes y/o polipéptidos de ACoAS y/o puede emplearse para identificar un homólogo de ACoAS en otras células. Dichas secuencias que codifican ACoAS pueden identificarse, por ejemplo, en la bibliografía y/o en bases de datos bioinformáticas muy conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la identificación de una secuencia que codifica una ACoAS en otro tipo de célula empleando la bioinformática puede lograrse por medio de una búsqueda con BLAST (tal como se describió anteriormente) de bases de datos públicas con secuencias de polipéptidos y ADN que codifican ACoAS conocidas, tales como las proporcionadas en la presente. Las identidades se basan en el método de alineamiento Clustal W empleando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN DE HUECO = 10, PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE HUECO = 0,1, y serie Gonnet 250 de matriz de peso de proteínas.
En algunas realizaciones, la planta genéticamente modificada (por ejemplo, Brassica), sus descendientes, células, tejidos o partes, comprenden las secuencias de ácidos nucleicos de (i), (ii) o (iii), o cualquiera de sus combinaciones, contenidas en un único vector de expresión recombinante. En algunas realizaciones, las secuencias de ácidos nucleicos de (i), (ii) o (iii), o sus combinaciones, están bajo el control de uno o más promotores específicos de semilla y/o están contenidas en un único vector de expresión recombinante.
Métodos para fabricar organismos modificados genéticamente
Para producir rendimientos significativamente elevados de uno o más ácidos grasos poliinsaturados, un organismo (por ejemplo, una planta) puede modificarse genéticamente para introducir una PUFA sintasa en la planta. La presente invención se refiere además a métodos para mejorar o potenciar la eficacia de dicha modificación genética y, en particular, para mejorar o potenciar la producción y/o la acumulación del producto final de una PUFA sintasa, por ejemplo, PUFA.
Los métodos para la expresión de genes en un organismo modificado genéticamente que incluyen, pero no se limitan a plantas, son conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, se pueden optimizar los codones de la región codificadora para los genes de PUFA sintasa que se van a expresar para la célula hospedante diana, según se describe a continuación. La expresión de genes en células hospedantes recombinantes que incluyen, pero no se limitan a células de plantas, puede requerir un promotor unido operablemente a una región codificadora de interés y/o a un terminador de la transcripción. Pueden utilizarse una serie de promotores en la construcción de vectores para genes que incluyen, pero no se limitan a un promotor específico de semilla (por ejemplo, PvDlec2, LfKCS3 y FAE 1). Otros ejemplos no limitantes de promotores que pueden emplearse en la presente invención incluyen el promotor de la proteína portadora de acilo descrito en el documento WO 1992/18634; el promotor de beta-faseolina de Phaseolus vulgaris y las versionas truncadas descritas en Slightom et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80:18971901, 1983); Sengupta-Gopalan et al. (Proc. Nat. Acad. Sci., 82:3320-3324, 1985); van der Geest et al. (Plant Mol. Biol., 33:553-557, 1997), y Bustos et al. (EMBO J., 10:1469-1479, 1991).
En algunas realizaciones de la presente invención, un vector recombinantes es una molécula de ácido nucleico
modificada (por ejemplo, producida de modo artificial) que se emplea como herramienta para manipular una secuencia de ácido nucleico elegida y para introducir dicha secuencia de ácido nucleico en una célula hospedante. Por tanto, el vector recombinante es adecuado para su uso en la clonación, la secuenciación y/o la manipulación de cualquier otra forma de la secuencia de ácido nucleico elegida, tal como mediante la expresión y/o el transporte de la secuencia de ácido nucleico elegida hacia el interior de una célula hospedante para formar una célula recombinante. Este vector generalmente contiene secuencias de ácidos nucleicos heterólogas, es decir, secuencias de ácidos nucleicos que, en la naturaleza, no se encuentran adyacentes a la secuencia de ácido nucleico que se va clonar o transportar, aunque el vector también puede contener secuencias de ácidos nucleicos reguladoras (por ejemplo, promotores, regiones no traducidas) que, en la naturaleza, se encuentran adyacentes a las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la presente, o que son útiles para la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la presente. El vector puede ser de ARN o ADN, procariota o eucariota, y generalmente es un plásmido. El vector puede mantenerse como un elemento extracromosómico (por ejemplo, un plásmido) o puede integrarse en el cromosoma de un organismo recombinante (por ejemplo, un microbio o una planta). El vector completo puede permanecer en su sitio dentro de una célula hospedante o, bajo ciertas condiciones, el ADN plasmídico puede delecionarse, dejando la molécula de ácido nucleico descrita en la presente. La molécula de ácido nucleico integrada puede estar bajo el control de un promotor cromosómico, bajo el control de un promotor nativo o plasmídico, o bajo el control de una combinación de varios promotores. Puede integrarse una sola copia o múltiples copias de la molécula de ácido nucleico en el cromosoma. Un vector recombinante descrito en la presente puede contener al menos un marcador seleccionable.
En algunas realizaciones, un vector recombinante empleado en una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención es un vector de expresión. En dicha realización, una secuencia de ácido nucleico que codifica el producto que se va a producir (por ejemplo, una PUFA sintasa) se inserta en el vector recombinante para producir una molécula de ácido nucleico recombinante. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína que se va a producir se inserta en el vector de una manera que une operativamente la secuencia de ácido nucleico a secuencias reguladoras en el vector que permiten la transcripción y la traducción de la secuencia de ácido nucleico dentro de la célula hospedante recombinante.
Los vectores útiles para la transformación de una diversidad de organismos y células hospedantes son habituales y se describen en la bibliografía. Generalmente, el vector contiene un marcador seleccionable y secuencias que permiten la replicación autónoma o la integración cromosómica en el hospedante deseado. Además, los vectores adecuados pueden comprender una región de promotor que porta controles de inicio de la transcripción y una región de control del fin de la transcripción, entre las cuales puede insertarse un fragmento de ADN de una región codificadora para proporcionar la expresión de la región codificadora insertada. Ambas regiones control pueden derivarse de genes homólogos a la célula hospedante transformada, aunque se entiende que dichas regiones de control también pueden derivarse de genes que no son nativos a la especie específica elegida como hospedante de producción.
La presente invención incluye la expresión de una o más acil-CoA sintetasas, tal como se describe y ejemplifica en la presente, con una PUFA sintasa, tal como se describe en la presente, y con una PPTasa exógena que se emplea sola o en combinación con una cualquiera o más de las estrategias descritas en la presente (por ejemplo, cualquiera de una, dos, tres o cuatro de: optimización de codones, conducción a orgánulos, potenciación de la competición de PUFA sintasa por la malonil CoA (por ejemplo, mediante la inhibición de FAS) y/o expresión de una o más aciltransferasas o enzimas relacionadas), para aumentar la producción y/o la acumulación de PUFA en un hospedante heterólogo.
Algunas realizaciones de la invención se refieren a la conducción de la expresión de las enzimas de PUFA sintasa, la PPTasa y/o una cualquiera o más de las proteínas accesorias y/o modificaciones genéticas conducidas a uno o más orgánulos del hospedante. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la expresión del sistema de PUFA sintasa y la PPTasa puede conducirse al plástido de una planta. En algunas realizaciones, la expresión del sistema de PUFA sintasa y la PPTasa se conduce al citosol. En algunas realizaciones, la expresión del sistema de PUFA sintasa y la PPTasa se conduce al plástido y al citosol de una planta. En cualquiera de estas realizaciones, pueden conducirse otras dianas al plástido o al citosol.
En algunas realizaciones, las acil-CoA sintetasas se expresan en el citosol para convertir el DHA y/u otros ácidos grasos libres LC-PUFA a acil-CoA que, a su vez, puede ser utilizado por las aciltransferasas.
Un ejemplo de secuencia que se dirige al plástido se deriva de una acil-ACP tioesterasa de Brassica napus y se describe en la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2007/0245431. En la técnica se conoce una diversidad de otras secuencias que se dirigen al plástido y estas pueden utilizarse en realizaciones en las que el hospedante heterólogo es una planta o una célula de una planta y en las que se desea la conducción al plástido.
La presente invención incluye el uso de la conducción a orgánulos (por ejemplo, al plástido o cloroplasto en plantas) con la expresión de una PUFA sintasa, tal como se describe en la presente, y con una PPTasa exógena, que se utilizan por sí solas o en combinación con una cualquiera o más de las estrategias descritas en la presente (por ejemplo, cualquiera de una, dos, tres o cuatro de: optimización de codones, potenciación de la competición de PUFA sintasa por la malonil CoA (por ejemplo, mediante la inhibición de FAS), expresión de una o más acil-CoA sintetasas
y/o expresión de una o más aciltransferasas o enzimas relacionadas), para aumentar la producción y/o la acumulación de PUFA en un hospedante heterólogo.
La conducción de productos génicos al plástido o cloroplasto es controlada por una secuencia señal que se encuentra en el extremo amino terminal de diversas proteínas y que se escinde durante la importación, produciendo la proteína madura (por ejemplo, con respecto a la conducción al cloroplasto, véase, por ejemplo, Comai et al., J. Biol. Chem., 263:15104-15109 (1988)). Estas secuencias señal pueden condensarse con productos de genes heterólogos para realizar la importación de productos heterólogos al cloroplasto (van den Broeck et al., Nature, 313:358-363 (1985)). El ADN que codifica las secuencias señal apropiadas puede aislarse a partir de los ADNc que codifican la proteína RUBISCO, la proteína CAB, la enzima EPSP sintasa, la proteína GS2 y muchas otras proteínas que se sabe que están localizadas en el cloroplasto.
En algunas realizaciones de la invención, la localización de las proteínas empleadas en la invención se dirige a un compartimento subcelular, por ejemplo, al plástido o cloroplasto. Las proteínas pueden dirigirse al cloroplasto incluyendo en sus amino-terminales un péptido de tránsito al cloroplasto ("chloroplast transit peptide", CTP). De modo similar, las proteínas pueden dirigirse al plástido incluyendo en su N-terminal un péptido de señalización o de tránsito al plástido.
Las proteínas conducidas al cloroplasto que aparecen en la naturaleza, sintetizadas como proteínas precursoras más grandes que contienen un péptido de conducción al cloroplasto amino-terminal que dirige el precursor a la maquinaria de importación al cloroplasto, son muy conocidas en la técnica. Los péptidos de conducción al cloroplasto en general son rotos por endoproteasas específicas localizadas dentro del orgánulo del cloroplasto, con lo que liberan la enzima madura conducida, y preferiblemente activa, desde el precursor hacia el medio del cloroplasto. Los ejemplos de secuencias que codifican péptidos que son adecuados para dirigir la conducción del gen o producto génico al cloroplasto o plástido de la célula vegetal incluyen EPSPS CTP de petunia, EPSPS CTP2 e intrón de Arabidopsis, y otras conocidas por los expertos en la técnica. Estas secuencias de conducción permiten que la proteína expresada deseada se transfiera a la estructura celular en la que actúa con más eficacia, o transfieren la proteína expresada deseada a áreas de la célula en las que se concentran los procesos celulares necesarios para la función fenotípica deseada. Los ejemplos específicos de péptidos de conducción al cloroplasto son muy conocidos en la técnica e incluyen el péptido de tránsito ats1A de la subunidad pequeña de la ribulosa bifosfato carboxilasa de Arabidopsis thaliana, un péptido de tránsito EPSPS de Arabidopsis thaliana, y un péptido de tránsito de la subunidad pequeña de la ribulosa bifosfato carboxilasa de Zea mays.
Un péptido de tránsito optimizado se describe, por ejemplo, en van den Broeck et al., Nature, 313:358-363 (1985). Se describen secuencias procariotas y eucariotas en Michaelis et al., Ann. Rev. Microbiol., 36:425 (1982). Otros ejemplos de péptidos de tránsito que pueden utilizarse en la invención incluyen los péptidos de tránsito al cloroplasto descritos en Von Heijne et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:104-126 (1991); Mazur et al., Plant Physiol., 85:1110 (1987); Vorst et al., Gene, 65:59 (1988). Chen y Jagendorf (J. Biol. Chem., 268:2363-2367 (1993)) han descrito el uso de un péptido de tránsito al cloroplasto para la importación de un transgén heterólogo. Este péptido empleado es el péptido de tránsito del gen rbcS de Nicotiana plumbaginifolia (Poulsen et al., Mol. Gen. Genet., 205:193-200 (1986)). Una CTP que ha funcionado en la presente para localizar proteínas heterólogas al cloroplasto se deriva de la acil-ACP tioesterasa de Brassica napus.
Un medio alternativo para localizar genes al cloroplasto o plástido incluye la transformación del cloroplasto o plástido. Pueden producirse plantas recombinantes en las que solo se ha alterado el ADN del cloroplasto para incorporar las moléculas previstas en esta solicitud. Los promotores que actúan en cloroplastos son conocidos en la técnica (Hanley-Bowden et al., Trends in Biochemical Sciences, 12:67-70 (1987)). Se han descrito métodos y composiciones para obtener células que contienen cloroplastos en los que se ha insertado ADN heterólogo, por ejemplo, en Daniell et al. (patente de EEUU n.º 5.693.507) y Maliga et al. (patente de EEUU n.º 5.451.513).
Combinaciones de estrategias
Tal como se describe en la presente, en la producción de un hospedante heterólogo para la producción y la acumulación de uno o más PUFA diana, pueden utilizarse una cualquiera o más (cualquier combinación) de las estrategias descritas en la presente para mejorar la producción y/o la acumulación de PUFA en el hospedante. En efecto, se anticipa que diversas combinaciones de estrategias serán aditivas o sinérgicas, y proporcionan una mejor producción y/o acumulación de PUFA, comparado con la ausencia de dichas una o más estrategias. En efecto, los ejemplos proporcionan ejemplos de estrategias para la producción de PUFA en un organismo hospedante.
En la presente se describe cualquier planta o célula de planta que emplea estas combinaciones de modificaciones o cualquier otra modificación o combinación de modificaciones. Esta planta puede modificarse genéticamente aún más para que exprese una proteína accesoria, tal como se describe en la presente, para la mejora de la producción y/o la acumulación de PUFA (u otros productos bioactivos de la PUFA sintasa) por el hospedante (por ejemplo, ACoAS, GPAT, LPAAT, DAGAT o acetil CoA carboxilasa (ACCasa)). Además, en la presente se describe cualquier célula u organismo hospedante que emplea cualquiera de las modificaciones o combinación de modificaciones descritas en la presente, así como cualquier producto derivado de dicha célula u organismo, que incluye las semillas o el aceite que comprende los PUFA diana.
Las plantas para modificar genéticamente según se describe en la presente (por ejemplo, células hospedantes de plantas) incluyen, pero no se limitan a cualquier planta superior, incluyendo plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, y, en particular, plantas comestibles, que incluyen plantas de cultivos y, en especial, plantas empleadas por su aceite. Estas plantas pueden incluir, pero no se limitan a, por ejemplo, colza, soja, colza de semilla oleaginosa, linaza, maíz, cártamo, girasol y tabaco. Así, puede seleccionarse cualquier especie de planta o célula de planta. Las células de plantas empleadas según se describe en la presente y las plantas cultivadas o derivadas de ellas incluyen, pero no se limitan a células que pueden obtenerse de colza (Brassica napus); colza de semilla oleaginosa (Brassica napus); mostaza de la India (Brassica juncea); mostaza etíope (Brassica carinata); nabo (Brassica rapa); col (Brassica oleracea); soja (Glycine max); linaza/lino (Linum usitatissimum); maíz (Zea mays); cártamo (Carthamus tinctorius); girasol (Helianthus annuus); tabaco (Nicotiana tabacum); Arabidopsis thaliana; nuez del Brasil (Betholettia excelsa); ricino (Ricinus communis); coco (Cocus nucifera); cilantro (Coriandrum sativum); algodón (Gossypium spp.); cacahuete (Arachis hypogaea); yoyoba (Simmondsia chinensis); palma aceitera (Elaeis guineeis); olivo (Olea europaea); arroz (Oryza sativa); calabacín (Cucurbita maxima); cebada (Hordeum vulgare); trigo (Triticum aestivum); y lenteja de agua (Lemnaceae sp.). En algunas realizaciones, el trasfondo genético dentro de una especie vegetal puede variar.
Las "partes de plantas”, tal como se emplean en la presente, incluyen cualquier parte de una planta que incluye, pero no se limita semillas (que incluyen semillas maduras y semillas inmaduras), polen, embriones, flores, frutos, brotes, hojas, raíces, tallos, explantes, etc. En algunas realizaciones, una planta genéticamente modificada tiene un genoma que está modificado (por ejemplo, mutado o cambiado) de su forma normal (por ejemplo, de tipo salvaje o tal como aparece en la naturaleza), de modo que se logra el resultado deseado (por ejemplo, mayor cantidad de PUFA sintasa o PUFA sintasa modificada y/o la producción y/o la acumulación de un producto deseado empleando la PUFA sintasa). En algunas realizaciones, la modificación genética de una planta puede lograrse empleando técnicas de desarrollo de cepas y/o de genética molecular convencionales. Los métodos para producir una planta transgénica, en los que una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una secuencia de aminoácidos deseada se incorpora en el genoma de la planta, son conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, una planta que se va a modificar genéticamente según la presente invención es una planta adecuada para su consumo por animales, incluyendo seres humanos.
Pueden producirse, seleccionarse o identificarse líneas de plantas procedentes de estas plantas, optimizadas para un rasgo particularmente deseable, por ejemplo, resistencia a enfermedades, facilidad de transformación de la planta, perfil o contenido en aceite, etc. En algunas realizaciones, pueden seleccionarse líneas de plantas mediante cruzamiento de plantas o mediante métodos tales como cruzamiento asistido por marcadores y labranza. En algunas realizaciones, pueden emplearse cultivos de células vegetales y, por ejemplo, estos no se cultivan para producir plantas diferenciadas ni se cultivan empleando prácticas agrícolas normales, sino que se cultivan y se mantienen en un medio líquido.
En algunas realizaciones, la planta puede ser una planta de semillas oleaginosas, en la que las semillas oleaginosas y/o el aceite en las semillas oleaginosas contienen PUFA producidos por la PUFA sintasa. En algunas realizaciones, estos aceites pueden contener una cantidad detectable de al menos un PUFA diana o primario que es el producto de la PUFA sintasa. En algunas realizaciones, estos aceites pueden estar sustancialmente exentos de productos intermedios o secundarios que no son los productos PUFA diana o primarios y que no son producidos de modo natural por el sistema FAS endógeno en las plantas de tipo salvaje (por ejemplo, las plantas de tipo salvaje producen algunos PUFA de cadena más corta o de longitud intermedia, tales como PUFA de 18 carbonos, a través del sistema FAS, pero se producirán nuevos ácidos grasos u otros ácidos grasos en la planta como resultado de la modificación genética con un sistema de PUFA sintasa).
Con respecto a la producción de plantas genéticamente modificadas, los métodos para la modificación genética de plantas son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, se han desarrollado numerosos métodos para la transformación de plantas, que incluyen protocolos de transformación biológica y física para plantas dicotiledóneas, así como para plantas monocotiledóneas (por ejemplo, Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech., 17:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. y Thompson, J. E. eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993). Además están disponibles vectores y métodos de cultivo in vitro para la transformación de células o tejidos vegetales y para la regeneración de plantas, por ejemplo, en Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. y Thompson, J. E. eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993).
En la presente se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID NO:6-10, así como una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una modificación o una mutación de dicha secuencia tal como se describe en la presente. En la presente se describen polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:1-5, así como un polipéptido aislado que comprende una modificación o una mutación de dicha secuencia tal como se describe en la presente.
En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB7361. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB7362. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB7363. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB7365. En la presente se describe un vector de
expresión recombinante pDAB7368. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB7369. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB7370. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB100518. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB101476. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB9166. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB9167. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB7379. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB7380. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB9323. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB9330. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB9337. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB9338. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB9344. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB9396. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB101412. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB7733. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB7734. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB101493. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB109507. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB109508. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB109509. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB9151. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB108207. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB108208. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB108209. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB9159. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB9147. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB108224. En la presente se describe un vector de expresión recombinante pDAB108225.
Tal como se emplea en la presente, el término "transfección" se utiliza para indicar cualquier método por el cual una molécula de ácido nucleico exógena (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante) puede insertarse en una célula. El término "transformación" puede utilizarse de modo intercambiable con el término "transfección" cuando dicho término se emplea para indicar la introducción de moléculas de ácidos nucleicos en células microbianas, tales como algas, bacterias y levaduras, o en células vegetales. En sistemas microbianos y vegetales, el término "transformación" se emplea para describir un cambio heredado debido a la adquisición de ácidos nucleicos exógenos por el microorganismo o la planta y fundamentalmente es sinónimo del término "transfección". En algunas realizaciones, las técnicas de transfección incluyen, pero no se limitan a transformación, bombardeo de partículas, difusión, transporte activo, sonicación en baño, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, infección y fusión de protoplastos.
Un método ampliamente utilizado para introducir un vector de expresión en plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium (Horsch et al., Science, 227:1229 (1985)). A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias del suelo patógenas de plantas conocidas por ser útiles para transformar genéticamente células vegetales. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, portan genes responsables de la transformación genética de la planta (Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci., 10:1 (1991)). También están disponibles descripciones de los sistemas de vector de Agrobacterium y métodos para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium, por ejemplo, Gruber et al., supra, Miki et al., supra, Moloney et al., Plant Cell Reports, 8:238 (1989), y las patentes de EE. UU. n.os 4.940.838 y 5.464.763.
Otro método conocido para la transformación de plantas es la transformación mediada por microproyectiles, en la que el ADN se transporta sobre la superficie de microproyectiles. En este método, el vector de expresión se introduce en tejidos de plantas con un dispositivo biolístico que acelera los microproyectiles hasta una velocidad suficiente para penetrar en las paredes y membranas de las células vegetales (Sanford et al., Part. Sci. Technol.,
5:27 (1987); Sanford, J. C., Trends Biotech., 6:299 (1988); Sanford, J. C., Physiol. Plant, 79:206 (1990); Klein et al., Biotechnology, 10:268 (1992)).
Otro método para el transporte físico de ADN a plantas es la sonicación de células diana (Zhang et al., Bio/Technology, 9:996 (1991)). Además se ha empleado la fusión de liposomas o esferoplastos para introducir vectores de expresión en plantas (Deshayes et al., EMBO J., 4:2731 (1985); Christou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3962 (1987)). También se ha indicado la captación directa de ADN hacia el interior de protoplastos empleando precipitación con CaCl2, poli(alcohol vinílico) o poli-L-ornitina (Hain et al., Mol. Gen. Genet., 199:161 (1985); y Draper et al., Plant Cell Physiol., 23:451 (1982)). También se ha descrito la electroporación de protoplastos y de tejidos y células completas (Donn et al., Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990); D’Halluin et al., Plant Cell, 4:1495-1505 (1992); y Spencer et al., Plant Mol. Biol., 24:51-61 (1994)). Además también pueden emplearse filamentos de carburo de silicona (Kaepler et al., 1990, Plant Cell Reports) y, en la transformación de plantas, emplear la metodología de inmersión de flores (Clough y Bent, Plant J., 16:735-743 (1998)). La metodología exacta de transformación de plantas puede variar dependiendo de la especie de planta seleccionada y del tipo de célula vegetal seleccionada para la transformación (por ejemplo, tipos celulares derivados de plántulas, tales como hipocotilos y cotiledones o tejido embrionario).
Después de la introducción de la construcción genética en las células vegetales, estas pueden cultivarse y, tras la emergencia de los tejidos diferenciadores, tales como brotes y raíces, pueden generarse las plantas maduras. En algunas realizaciones, puede generarse una pluralidad de plantas. Las metodologías para regenerar plantas son conocidas por los expertos en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en: Plant Cell and Tissue Culture, 1994,
Vasil y Thorpe eds., Kluwer Academic Publishers, y en: Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology, 111, 1999, Hall eds., Humana Press).
En algunas realizaciones, una planta genéticamente modificada descrita en la presente puede cultivarse en un medio de fermentación o cultivarse en un medio adecuado, tal como tierra. En algunas realizaciones, un medio de crecimiento adecuado para plantas superiores puede incluir cualquier medio de crecimiento para plantas, que incluye, pero no se limita a tierra, arena, cualquier otro medio en partículas que mantenga el crecimiento de las raíces (por ejemplo, vermiculita, perlita, etc.) o cultivo hidropónico, así como la luz, el agua y los suplementos nutricionales adecuados que optimicen el crecimiento de la planta superior.
Los expertos en la técnica apreciarán que el uso de las tecnologías de ADN recombinante puede mejorar el control de la expresión de moléculas de ácidos nucleicos transfectadas manipulando, por ejemplo, el número de copias de las moléculas de ácidos nucleicos dentro de la célula hospedante, la eficacia con la que estas moléculas de ácidos nucleicos son transcritas, la eficacia con la que las transcripciones resultantes son traducidas, y la eficacia de las modificaciones postraduccionales. Además, la secuencia del promotor puede modificarse genéticamente para mejorar el nivel de expresión comparado con el promotor nativo. Las técnicas recombinantes útiles para controlar la expresión de moléculas de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a la integración de las moléculas de ácidos nucleicos en uno o más cromosomas de la célula hospedante, la adición de secuencias de estabilidad del vector a plásmidos, sustituciones o modificaciones de señales de control de la transcripción (por ejemplo, promotores, operadores, potenciadores), sustituciones o modificaciones de señales de control de la traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosomas, secuencias de Shine-Dalgarno), la modificación de moléculas de ácidos nucleicos para que se correspondan con la utilización de codones de la célula hospedante, y la deleción de secuencias que desestabilizan las transcripciones.
En algunas realizaciones, una planta puede incluir las plantas que son conocidas por producir compuestos empleados como agentes farmacéuticos, agentes aromatizantes, agentes nutracéuticos, ingredientes de alimentos funcionales o agentes cosméticamente activos, o planas que son genéticamente modificadas para que produzcan estos compuestos/agentes.
Todas estas realizaciones de la invención se aplican al análisis de cualquiera de los organismos modificados genéticamente y a los métodos para producir y emplear dichos organismos descritos en la presente.
Productos producidos por organismos modificados genéticamente
En algunas realizaciones, un organismo genéticamente modificado descrito en la presente produce uno o más ácidos grasos poliinsaturados que incluyen, pero no se limitan a EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), DPA (C22:5, n6 o n-3), ARA (C20:4, n-6), GLA (C18:3, n-6), ALA (C18:3, n-3) y/o SDA (C18:4, n-3)), y, en algunas realizaciones, uno o más PUFA de cadena más larga, que incluyen, pero no se limitan a EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), DPA (C22:5, n-6 o n-3), o DTA (C22:4, n-6), o cualquiera de sus combinaciones. En algunas realizaciones, una planta genéticamente modificada descrita en la presente produce uno o más ácidos grasos poliinsaturados que incluyen, pero no se limitan a EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3) y/o DPA (C22:5, n-6 o n-3), o cualquiera de sus combinaciones.
En algunas realizaciones, un organismo genéticamente modificado es una planta que ha sido genéticamente modificada para que exprese, de modo recombinante, un sistema de PUFA sintasa y una PPTasa, según se describe en la presente. En algunas realizaciones, dicha planta ha sido genéticamente modificada para que exprese una proteína accesoria, tal como se describe en la presente, para la mejora de la producción y/o la acumulación de PUFA (u otros productos bioactivos de la PUFA sintasa) por el hospedante (por ejemplo, ACoAS, GPAT, LPAAT, DAGAT o ACCasa).
Algunas realizaciones incluyen la producción de ácidos grasos poliinsaturados con la longitud de cadena deseada y con el número deseado de dobles enlaces y, por extensión, semillas oleaginosas y aceites obtenidos de las plantas genéticamente modificadas descritas en la presente (por ejemplo, obtenidos del aceite o las semillas de dichas plantas) que comprenden estos PUFA. Los ejemplos de PUFA que pueden ser producidos por la presente invención incluyen, pero no se limitan a DHA (ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3)), ARA (ácido eicosatetraenoico o ácido araquidónico (C20:4, n-6)), DPA (ácido docosapentaenoico (C22:5, n-6 o n-3)) y EPA (ácido eicosapentaenoico (C20:5, n-3)), y cualquiera de sus combinaciones. La presente invención permite la producción de lípidos valiosos desde el punto de vista comercial, enriquecidos en uno o más PUFA deseados (diana o primarios) mediante el desarrollo de plantas genéticamente modificadas a través del uso de un sistema de PUFA sintasa que produce PUFA de los presentes inventores.
En algunas realizaciones, un sistema de PUFA sintasa concreto derivado de un organismo concreto producirá uno o más PUFA concretos, de modo que la selección de un sistema de PUFA sintasa procedente de un organismo concreto provocará la producción de PUFA diana o primarios específicos. En algunas realizaciones, la proporción de PUFA puede diferir dependiendo de la selección del sistema de PUFA sintasa concreto y del modo en que ese sistema responde a las condiciones específicas en las que se expresa. Por ejemplo, el uso de una PUFA sintasa procedente de Thraustochytrium 23B (ATCC n.º 20892) también puede provocar la producción de DHA y DPAn-6
como PUFA diana o primarios; sin embargo, en el caso de Thraustochytrium 23B, la proporción de DHA a DPAn-6 es de aproximadamente 10:1 (y puede variar de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 40:1), mientras que en Schizochytrium, la proporción generalmente es de aproximadamente 2,5:1. En algunas realizaciones, una PUFA sintasa concreta puede modificarse mezclando proteínas y dominios procedentes de diferentes PUFA sintasas, o se puede modificar un dominio o una proteína de una PUFA sintasa concreta para cambiar el producto de PUFA diana y/o las proporciones.
En algunas realizaciones, la referencia a "productos intermedios" o "productos secundarios" de un sistema enzimático que produce PUFA se refiere a cualquier producto y, en particular, productos de ácidos grasos, que son producidos por el sistema enzimático como resultado de la producción de los PUFA diana o primarios del sistema, pero que no son los PUFA diana o primarios. En algunas realizaciones, los productos intermedios y secundarios pueden incluir ácidos grasos que no son la diana que son producidos en la naturaleza por la planta de tipo salvaje, o por la planta progenitora empleada como receptor para la modificación genética indicada, pero que ahora se clasifican como productos intermedios o secundarios porque son producidos a niveles mayores como resultado de la modificación genética, comparado con los niveles producidos por la planta de tipo salvaje, o por la planta progenitora empleada como receptor de la modificación genética indicada. En algunas realizaciones, un PUFA diana o primario de un sistema enzimático puede ser un intermedio de un sistema enzimático diferente, en el que el producto diana o primera es un PUFA diferente. Por ejemplo, cuando se emplea la vía convencional para producir EPA, se producen ácidos grasos tales como GLA, DGLA y SDA como productos intermedios en cantidades significativas (por ejemplo, (solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2004/0172682). De modo similar, y también ilustrado en la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º. 2004/0172682, cuando se emplea la vía convencional para producir DHA, además de los ácidos grasos mencionados anteriormente, pueden producirse ETA y EPA (notablemente, el PUFA diana en el primer ejemplo anterior) en cantidades significativas y pueden estar presentes en cantidades significativamente mayores con relación al producto de ácidos grasos totales que el propio PUFA diana.
En algunas realizaciones, para producir rendimientos significativamente elevados de uno o más ácidos grasos poliinsaturados deseados, una planta puede modificarse genéticamente para introducir un sistema de PUFA sintasa en la planta. Se sabe que las plantas no contienen de modo endógeno una PUFA sintasa y, por tanto, la presente invención representa una oportunidad para producir plantas con capacidades exclusivas de producción de ácidos grasos. La presente invención proporciona plangas genéticamente modificadas para producir uno o más PUFA en la misma planta que incluyen, pero no se limitan a EPA, DHA, DPA (n3 o n6), ARA, GLA, SDA y otros, incluyendo cualquiera de sus combinaciones. La presente invención ofrece la posibilidad de crear uno cualquiera de una serie de "aceites diseñados" en diversas proporciones y formas. En algunas realizaciones, el uso de un sistema de PUFA sintasa procedente de los organismos marinos concretos descritos en la presente puede extender la gama de producción de PUFA y producir con éxito estos PUFA dentro de intervalos de los temperatura empleados para cultivar la mayoría de las plantas de cultivo.
En algunas realizaciones, el hecho de estar "sustancialmente exento" de intermedios o productos secundarios del sistema para sintetizar PUFA, o DE que no haya productos intermedios o secundarios presentes en cantidades sustanciales, significa que cualquier producto intermedio o secundario de ácidos grasos (que no sean los PUFA diana) que se producen en la planta genéticamente modificada (y/o partes de las plantas y/o la fracción de aceite de las semillas) como resultado de la introducción o la presencia del sistema enzimático para producir PUFA (por ejemplo, que no sean producidos por la planta de tipo salvaje o por la planta progenitora empleada como receptor para la modificación genética indicada) puede estar presente en una cantidad que es menor que aproximadamente 10% en peso de los ácidos grasos totales producidos por la planta, y más preferiblemente menor que aproximadamente 9%, y más preferiblemente menor que aproximadamente 8%, y más preferiblemente menor que aproximadamente 7%, y más preferiblemente menor que aproximadamente 6%, y más preferiblemente menor que aproximadamente 5%, y más preferiblemente menor que aproximadamente 4%, y más preferiblemente menor que aproximadamente 3%, y más preferiblemente menor que aproximadamente 2%, y más preferiblemente menor que aproximadamente 1% en peso de los ácidos grasos totales producidos por la planta, y más preferiblemente menor que aproximadamente 0,5% en peso de los ácidos grasos totales producidos por la planta.
En algunas realizaciones, una planta genéticamente modificada descrita en la presente, o un aceite o semilla obtenido de una planta genéticamente modificada descrita en la presente comprende cantidades detectables de DHA (ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3)) o EPA (ácido eicosapentaenoico (C20:5, n-3)). En algunas realizaciones, una planta genéticamente modificada descrita en la presente, o un aceite o semilla obtenido de una planta genéticamente modificada de la invención comprende 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5% o 15% de DHA. Los intervalos útiles pueden seleccionarse de entre cualquiera de estos valores, por ejemplo, 0,01-15%, 0,05-10% y 1-5% de DHA.
En algunas realizaciones, una planta genéticamente modificada descrita en la presente, o un aceite o semilla obtenido de una planta genéticamente modificada descrita en la presente comprende 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, o 10% de EPA. Los intervalos útiles pueden seleccionarse de entre cualquiera de estos valores, por ejemplo, 0,01-10%, 0,05-5% y 0,1-5% de EPA.
En algunas realizaciones, cuando el producto diana de un sistema de PUFA sintasa es un PUFA de cadena larga, tal como DHA, DPA (n-6 o n-3), o EPA, los productos intermedios y productos secundarios que no están presentes en cantidades sustanciales en los lípidos totales de las plantas genéticamente modificadas con dicho sistema de PUFA sintasa pueden incluir, pero no se limitan a: ácido gamma-linolénico (GLA; 18:3, n-6); ácido estearidónico (STA o SDA; 18:4, n-3); ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA o HGLA; 20:3, n-6); ácido araquidónico (ARA, C20:4, n-6); ácido eicosatrienoico (ETA; 20:3, n-9) y diversos otros productos intermedios o secundarios, tales como 20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5,11,14); 20:3 (Δ11,14,17); ácido pan-cis-5,8,11-eicosatrienoico ("mead acid") (20:3; Δ5,8,11); o 20:4 (Δ5,1,14,17).
La modificación genética de una planta según la presente invención puede dar como resultado la producción de uno
o más PUFA por la planta. En algunas realizaciones, el perfil de PUFA y la proporción de PUFA producidos por la planta no son necesariamente los mismos que el perfil de PUFA o la proporción de PUFA producidos por el organismo del cual procede la PUFA sintasa.
En algunas realizaciones, una planta genéticamente modificada descrita en la presente puede modificarse para producir PUFA a través de la actividad de la PUFA sintasa. En algunas realizaciones, los PUFA pueden recuperarse a través de procesos de purificación que extraen los compuestos de la planta. En algunas realizaciones, los PUFA pueden recuperarse recolectando la planta. En algunas realizaciones, los PUFA pueden recuperarse recolectando el aceite de la planta (por ejemplo, a partir de semillas oleaginosas) o semillas de la planta. En algunas realizaciones, la planta también puede consumirse en su estado natural o puede procesarse aún más para producir productos consumibles.
En algunas realizaciones, una planta genéticamente modificada descrita en la presente puede producir uno o más ácidos grasos poliinsaturados. En algunas realizaciones, la planta puede producir (por ejemplo, en sus semillas maduras, si es una planta de semillas oleaginosas, o en el aceite de las semillas de una planta de semillas oleaginosas) al menos un PUFA (el PUFA diana), y el perfil de ácidos grasos totales en la planta, o la parte de la planta que acumula los PUFA (por ejemplo, las semillas maduras, si es una planta de semillas oleaginosas, o en el aceite de las semillas de una planta de semillas oleaginosas) comprende una cantidad detectable de dicho uno o más PUFA. En algunas realizaciones, el PUFA diana es al menos un PUFA de 20 carbonos y comprende al menos 3 dobles enlaces, y más preferiblemente al menos 4 dobles enlaces, y aún más preferiblemente al menos 5 dobles enlaces. En algunas realizaciones, el PUFA diana puede ser un PUFA que no es producido de modo natural por la planta. En algunas realizaciones, el perfil de ácidos grasos totales en la planta o en la parte de la planta que acumula los PUFA (que incluye el aceite de las semillas de la planta) comprende al menos 0,1% de dicho uno o más PUFA diana en peso de los ácidos grasos totales, al menos 0,2%, al menos 0,3%, al menos 0,4%, al menos 0,5%, al menos 1%, al menos 1,5%, al menos 2%, al menos 2,5%, al menos 3%, al menos 3,5%, al menos 4%, al menos 4,5%, al menos 5%, al menos 5,5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, más de 75% de al menos un ácido graso poliinsaturado (dichos uno o más PUFA diana) en peso de los ácidos grasos totales producidos por la planta, o cualquier porcentaje del 0,1% al 75%, o mayor que 75% (hasta 100% o 100%), en incrementos de 0,1%, de dichos uno o más PUFA diana.
Tal como se emplea en general en la presente, la referencia a una cantidad en porcentaje de producción de PUFA es en peso de los ácidos grasos totales producidos por el organismo (planta), a menos que se indique lo contrario. En algunas realizaciones, los ácidos grasos totales producidos por una planta se presenten como porcentaje en peso determinado mediante un análisis de cromatografía de gases (GC) de la preparación de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME), aunque la determinación de los ácidos grasos totales no se limita a este método.
En algunas realizaciones, los ácidos grasos totales en una planta descrita en la presente (y/o en partes de plantas o la fracción de aceite de las semillas) puede contener menos del 10% en peso de los ácidos grasos totales producidos por la planta, menos del 9%, menos del 8%, menos del 7%, menos del 6%, menos del 5%, menos del 4%, menos del 3%, menos del 2%, menos del 1% de un ácido graso seleccionado de uno cualquiera o más de: ácido gamma-linolénico (GLA; 18:3, n-6); ácido estearidónico (STA o SDA; 18:4, n-3); ácido dihomo-gammalinolénico (DGLA o HGLA; 20:3, n-6); ácido araquidónico (ARA, C20:4, n-6); ácido eicosatrienoico (ETA; 20:3, n-9) y diversos otros ácidos grasos, tales como 20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5,11,14);
20:3 (Δ11,14,17); ácido pan-cis-5,8,11-eicosatrienoico ("mead acid") (20:3; Δ5,8,11); o 20:4 (Δ5,1,14,17).
En la presente también se describe cualquier semilla producida por las plantas descritas en la presente, así como cualquier aceite producido por una planta o semilla descritas en la presente. En la presente también se describe cualquier producto producido empleando las plantas, las semillas o los aceites según se describe en la presente.
Usos y productos relacionados con los organismos genéticamente modificados de la invención
En la presente también se describe un método para producir PUFA cultivando un organismo genéticamente modificado (por ejemplo, una planta) descrito en detalle anteriormente. En algunas realizaciones, dicho método incluye, por ejemplo, la etapa de cultivar, en un entorno adecuado tal como tierra, una planta que presenta una modificación genética según se ha descrito previamente en la presente.
En la presente también se describe un método para producir un aceite que comprende al menos un PUFA, que comprende recuperar el aceite a partir de una planta genéticamente modificada de la invención, o a partir de una semilla de una planta genéticamente modificada descrita en la presente. En la presente también se describe un método para producir un aceite que comprende al menos un LC-PUFA, que comprende cultivar una planta genéticamente modificada descrita en la presente. En la presente también se describe un método para producir al menos un PUFA, que comprende recuperar un aceite a partir de una semilla de una planta genéticamente modificada descrita en la presente. En la presente también se describe un método para producir al menos un PUFA en un aceite de semillas, que comprende cultivar una planta genéticamente modificada descrita en la presente.
En la presente también se describe un método para proporcionar un suplemento o un producto terapéutico que contiene al menos un PUFA a un individuo, que comprende proporcionar al individuo una planta genéticamente modificada descrita en la presente, un aceite descrito en la presente, una semilla de la invención, un producto alimentario descrito en la presente, un alimento funcional descrito en la presente, o un producto farmacéutico descrito en la presente. En la presente también se describe un método para producir una planta genéticamente modificada descrita en la presente, que comprende transformar una planta o una célula de una planta con (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un sistema de PUFA sintasa de algas que produce al menos un ácido graso poliinsaturado (PUFA); y (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfopanteteinilo transferasa (PPTasa) que transfiere un cofactor de fosfopanteteinilo a un dominio ACP del sistema de PUFA sintasa de algas. En algunas realizaciones, el método comprende además transformar la planta o la célula de una planta con (iii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una acil-CoA sintetasa (ACoAS) que cataliza la conversión de ácidos grasos libres (FFA) PUFA de cadena larga a acil-CoA.
En algunas realizaciones, el PUFA de dichos métodos es DHA o EPA.
En la presente también se describe cualquier organismo, o sus partes, descritos en la presente (por ejemplo, plantas, partes de las plantas (por ejemplo, semillas oleaginosas), o sus preparaciones o fracciones), así como cualquier aceite producido por los organismos descritos en la presente. En la presente también se describe cualquier producto producido empleando los organismos, sus partes o los aceites descritos en la presente.
En la presente también se describe un método para modificar un producto que contiene al menos un ácido graso, que comprende añadir al producto un organismo, una cualquiera de sus partes o un aceite producido por un organismo genéticamente modificado según la invención y tal como se describe en la presente (por ejemplo, una planta que ha sido genéticamente modificada según se describe en la presente). Cualquier producto producido por este método o que contiene, en general, cualquier organismo, una cualquiera de sus partes o aceites procedentes de los organismos descritos en la presente también se describe en la presente.
En algunas realizaciones, el producto se selecciona del grupo que consiste en un alimento, un suplemento dietético, una formulación farmacéutica, una leche animal humanizada, una leche en polvo para bebés, un nutracéutico y un alimento funcional. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas incluyen, pero no se limitan a una formulación antiinflamatoria, un agente quimioterapéutico, un excipiente activo, un fármaco para la osteoporosis, un antidepresivo, un anticonvulsivo, un fármaco anti-Helicobacter pylori, un fármaco para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, un fármaco para el tratamiento de una enfermedad degenerativa del hígado, un antibiótico y una formulación para disminuir el colesterol. En algunas realizaciones, el producto se usa para tratar un trastorno seleccionado del grupo que consiste en inflamación crónica, inflamación aguda, trastorno gastrointestinal, cáncer, caquexia, reestenosis cardíaca, trastorno neurodegenerativo, trastorno degenerativo del hígado, trastorno de lípidos sanguíneos, osteoporosis, osteoartritis, enfermedad autoinmunológica, preeclampsia, nacimiento prematuro, maculopatía relacionada con el envejecimiento, trastorno pulmonar, y trastorno peroxisómico.
En algunas realizaciones, el producto es un producto alimentario o un producto de alimento funcional. Los productos alimentarios adecuados incluyen, pero no se limitan a mercancías de bollería fina, pan y panecillos, cereales para el desayuno, queso procesado y no procesado, condimentos (kétchup, mayonesa, etc.), productos lácteos (leche, yogur), budines y postres de gelatina, bebidas carbonatadas, tés, mezclas de bebidas en polvo, productos de pescado procesados, bebidas a base de fruta, goma de mascar, caramelos duros, productos lácteos congelados, productos cárnicos procesados, cremas para untar de frutos secos y basadas en frutos secos, pasta, productos avícolas procesados, salsas de carne y salsas, patatas fritas y otros productos fritos, chocolate y otros dulces, sopas y mezclas de sopa, productos basados en la soja (por ejemplo, leches, bebidas, cremas, crema no láctea), cremas para untar basadas en aceites vegetales y bebidas basadas en verduras.
En algunas realizaciones, el producto es una composición de pienso o harina, o un aditivo para una composición de pienso o harina, para un animal. El término animal incluye todos los animales, incluyendo los seres humanos. Los ejemplos no limitantes de animales son los no rumiantes (por ejemplo, cerdos, aves de corral o pescados), y rumiantes (por ejemplo, vacas, ovejas y caballos). El término pienso o la expresión composición de pienso significa cualquier compuesto, preparación, mezcla o composición adecuado o previsto para la ingestión por un animal.
En algunas realizaciones, la planta genéticamente modificada, semilla o aceite (por ejemplo, colza) comprende niveles reducidos de ácidos grasos poliinsaturados y niveles aumentados de ácido oleico monoinsaturado con relación a los aceites convencionales. Esta planta, semilla o aceite puede mostrar, por ejemplo, una mayor
estabilidad oxidativa. En algunas realizaciones, la planta genéticamente modificada, semilla o aceite comprende un fondo de aceite con alto contenido en ácido oleico (por ejemplo, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de ácido oleico). Dicha planta, semilla o aceite puede ser, por ejemplo, menos susceptible a la oxidación durante la conservación, la fritura y/o el refinamiento y/o puede calentarse hasta una temperatura más alta sin producir humo, lo cual hace que sea más adecuado como aceite para cocinar. En algunas realizaciones, la planta genéticamente modificada, semilla o aceite comprende una cantidad de DHA tal como se describe en la presente, y un fondo de aceite con alto contenido en ácido oleico (por ejemplo, una cantidad mayor o igual que 70%, que incluye 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, y 99% de ácido oleico y cualquiera de sus intervalos). En algunas realizaciones, la planta genéticamente modificada, semilla o aceite comprende una cantidad de DHA tal como se describe en la presente, y un fondo de aceite con bajo contenido en ácido linolénico (por ejemplo, una cantidad menor o igual que 10%, que incluye 9,5%, 9%, 8,5%, 8%, 7,5%, 7%, 6,5%, 6%, 5,5%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5%, 1%, 0,05%, 0,02%, o 0,01% de ácido linolénico y cualquiera de sus intervalos). En algunas realizaciones, la planta genéticamente modificada, semilla o aceite comprende una cantidad de DHA tal como se describe en la presente, un fondo de aceite con alto contenido en ácido oleico (por ejemplo, presente en una cantidad mayor o igual que 70%, que incluye 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, y 99% de ácido oleico y cualquiera de sus intervalos), y un fondo de aceite con bajo contenido en ácido linolénico (por ejemplo, una cantidad menor o igual que 10%, que incluye 9,5%, 9%, 8,5%, 8%, 7,5%, 7%, 6,5%, 6%, 5,5%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5%, 1%, 0,05%, 0,02%, o 0,01% de ácido linolénico y cualquiera de sus intervalos). En algunas realizaciones, dicha planta genéticamente modificada, semilla o aceite (por ejemplo, colza) puede incorporarse en un producto descrito en la presente.
Otros objetos, ventajas y características nuevas de esta invención serán evidentes para los expertos en la técnica tras examinar los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Optimización de codones de OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa, acil-CoA sintetasa y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI
El análisis de las secuencias de ADN que codifican las regiones codificadoras de OrfA de PUFA de Schizochytrium sp. ATCC_20888 (GenBank ID: AF378327, GI:158518688), OrfB de PUFA de Schizochytrium sp. ATCC_20888 (GenBank ID: AF378328, GI:158518690), OrfC de PUFA quimérico de Schizochytrium sp. ATCC_20888 y Thraustochytrium (solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2008/0022422) ("OrfC quimérico" u "OrfC híbrido"), acil-CoA sintetasa de Schizochytrium sp. ATCC_20888 (solicitud de patente de EE. UU. publicada n.º 2007/0245431), y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI de Nostoc sp. PCC 7120 (GenBank ID: P37695, GI:20141367) reveló la presencia de varios motivos de secuencia que contienen composiciones de codones no óptimas que pueden ser perjudiciales para la expresión óptima en plantas. El diseño del gen o de genes que codifican las proteínas de OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico, acil-CoA sintetasa y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI se optimizó para generar una secuencia de ADN que tiene una naturaleza más "similar a las plantas", y en la que las modificaciones de secuencia no dificultan la traducción ni crean una inestabilidad en el ARNm por la composición no óptima de codones.
Debido a la plasticidad proporcionada por la redundancia/degeneración del código genético (por ejemplo, algunos aminoácidos son especificados por más de un codón), la evolución de los genomas en diferentes organismos o clases de organismos ha dado como resultado una utilización diferente de codones sinónimos. Este "sesgo de codones" se refleja en la composición promedio de bases de las regiones codificadoras de proteínas. Por ejemplo, los organismos que poseen genomas con un contenido relativamente bajo en G+C utilizan más codones que contienen A o T en la tercera posición de codones sinónimos, mientras que los que presentan un contenido más alto en G+C utilizan más codones que contienen G o C en la tercera posición. Además, se cree que la presencia de codones "minoritarios" dentro de un ARNm puede reducir la tasa absoluta de traducción de ese ARNm, en especial cuando la abundancia relativa del ARNt cargado que se corresponde con el codón minoritario es baja. Una extensión de este razonamiento es que la disminución de la tasa de traducción por los codones minoritarios individuales resultaría al menos aditiva para múltiples codones minoritarios. Por tanto, los ARNm que presentan un contenido relativamente alto de codones minoritarios tendrían, de modo correspondiente, unas tasas de traducción bajas. Esta tasa se refleja en unos niveles correspondientemente bajos de la proteína codificada.
Cuando se modifican genes que codifican proteínas de OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico, acil-CoA sintetasa y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI para la expresión en colza (u otras plantas, tales como arroz, tabaco, maíz, algodón o soja), las utilizaciones de codones para la colza se extrajeron de bases de datos públicas (tabla 2).
Tabla 2 -Representación de codones sinónimos en regiones codificadoras de genes de Brassica napus (colza) (columnas C y G). Los valores para un conjunto de representación de codones equilibrados con respecto al sesgo para un diseño de genes sintéticos optimizados para plantas aparecen en las columnas D y H.
A
B C D E F G H
Aminoácido
Codón Colza, % Promedio ponderado Aminoácido Codón Colza, % Promedio ponderado
ALA (A)
GCA 23,3 23,3 LEU (L) CTA 10,1 NU
GCC
21,2 21,2 CTC 22,8 28,5
GCG
14,2 14,2 CTG 11,6 14,6
GCT
41,3 41,3 CTT 25,2 31,6
ARG (R)
AGA 31,8 43,8 TTA 10,1 NU
AGG
22,1 30,5 TTG 20,2 25,3
CGA
9,9 NU LYS (K) AAA 44,6 44,6
CGC
8,9 NU AAG 55,4 55,4
CGG
8,6 NU MET (M) ATG 100,0 100,0
CGT
18,6 25,7 PHE (F) TTC 58,6 58,6
ASN (N)
AAC 62,6 62,6 TTT 41,4 41,4
AAT
37,4 37,4 PRO (P) CCA 29,6 29,6
ASP (D)
GAC 42,5 42,5 CCC 14,6 14,6
GAT
57,5 57,5 CCG 18,4 18,4
CYS (C)
TGC 49,2 49,2 CCT 37,3 37,3
TGT
50,8 50,8 SER (S) AGC 16,0 17,9
FIN
TAA 38,5 NU AGT 14,1 15,8
TAG
22,1 NU TCA 18,2 20,4
TGA
39,4 100,0 TCC 16,7 18,7
GLN (Q)
CAA 50,0 50,0 TCG 10,7 NU
CAG
50,0 50,0 TCT 24,3 27,2
GLU (E)
GAA 43,6 43,6 THR (T) ACA 26,3 26,3
GAG
56,4 56,4 ACC 26,9 26,9
GLY (G)
GGA 36,4 36,4 ACG 16,9 16,9
GGC
16,2 16,2 ACT 30,0 30,0
GGG
15,2 15,2 TRP (W) TGG 100,0 100,0
GGT
32,1 32,1 TYR (Y) TAC 59,4 59,4
HIS (H)
CAC 49,6 49,6 TAT 40,6 40,6
CAT
50,4 50,4 VAL (V) GTA 10,8 NU
ILE (I)
ATA 21,1 21,1 GTC 24,1 27,0
ATC
42,7 42,7 GTG 28,3 31,7
ATT
36,2 36,2 GTT 36,8 41,3
*NU—No utilizar
Para equilibrar la distribución del resto de elecciones de codones para un aminoácido, se calculó una representación del promedio ponderado para cada codón (tabla 2), empleando la fórmula: % del promedio ponderado de C1 = 1/(%C1 + %C2 + %C3 + etc.) x %C1 x 100, en la que C1 es el codón en
cuestión, y %C2, %C3, etc. representan los porcentaje de los valores de porcentaje para la colza del resto de codones sinónimos (el promedio de los valores de porcentaje para los codones pertinentes se toman de las columnas C y G) de la tabla 2.
El valor del porcentaje de promedio ponderado para cada codón se indica en las columnas D y H de la tabla 2.
En el diseño de regiones codificadoras para la expresión en plantas, se determinan los codones primarios (la "primera elección") preferidos por la planta, así como la segunda, tercera, cuarta, etc., elecciones de codones preferidos cuando existen múltiples elecciones. Después se diseñó una nueva secuencia de ADN que codifica fundamentalmente la misma secuencia de aminoácidos de un OrfA de PUFA sintasa, un OrfB de PUFA sintasa, un OrfC de PUFA sintasa, acil-CoA sintetasa y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI, pero que se diferencia de la secuencia de ADN original (que codifica el OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico, acil-CoA sintetasa y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI) por la sustitución de los codones de la planta (primero preferido, segundo preferido, tercero preferido, cuarto preferido, etc.) para especificar el aminoácido en cada posición dentro de la secuencia de aminoácidos.
Después las nuevas secuencias se analizan para determinar los sitios de enzimas de restricción creados por las modificaciones en la secuencia. Los sitios identificados entonces se modifican reemplazando los codones por los codones preferidos de la primera, segunda, tercera o cuarta elección. Después la secuencia se vuelve a analizar y se modifica para reducir la frecuencia de dobletes TA o GC.
El análisis de estas secuencias revela que las nuevas secuencias de ADN codifican fundamentalmente la secuencia de aminoácidos de las proteínas de OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico, acil-CoA sintetasa y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI, pero fueron respectivamente diseñadas para la expresión óptima en colza empleando una distribución de codones equilibrada de los codones de uso frecuente encontrados en los genes de colza. En particular, las nuevas secuencias de ADN se diferencian de las secuencias de ADN originales que codifican un OrfA de PUFA sintasa, un OrfB de PUFA sintasa, un OrfC de PUFA sintasa quimérico, acil-CoA sintetasa y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI por la sustitución de los codones de la planta (primero preferido, segundo preferido, tercero preferido, cuarto preferido, etc.) para especificar el aminoácido apropiado en cada posición dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína.
El diseño de secuencias de ADN optimizadas para plantas se inicia mediante la traducción inversa de las secuencias de proteínas de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5 empleando una tabla de sesgo de codones de colza construida a partir de la tabla 2, columnas D y H. La secuencia de proteína para la acil-CoA sintetasa (SEQ ID NO:4) fue alterada con respecto a la secuencia original, eliminándose de la proteína el segundo aminoácido alanina. Las secuencias iniciales después de modificaron compensando los cambios en los codones (pero manteniendo la representación de codones global en promedio ponderado) para retirar o añadir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, retirar estructuras secundarias intracatenarias muy estables, y retirar otras secuencias que podrían resultar perjudiciales para las manipulaciones de clonación o la expresión del gen modificado en plantas. Después las secuencias de ADN se vuelven a analizar para determinar los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción que puedan haber sido creados por las modificaciones. Los sitios identificados entonces se vuelven a modificar reemplazando los codones pertinentes por los codones preferidos de la primera, segunda, tercera o cuarta elección. Otros sitios en las secuencias que pueden afectar a la transcripción o la traducción del gen de interés incluyen las uniones de exón:intrón (5’ o 3’), las señales de adición de poliA, o las señales de terminación de ARN polimerasa. Las secuencias modificadas se vuelven a analizar y se modifican para reducir la frecuencia de dobletes TA o GC, y para aumentar la frecuencia de dobletes TG o CT. Además de estos dobletes, los bloques de secuencia que contienen más de aproximadamente seis restos consecutivos de [G+C] o [A+T] pueden afectar a la transcripción o la traducción de la secuencia. Por tanto, estos bloques de secuencia también se modifican reemplazando los codones de primera o segunda elección, etc., por otros codones preferidos elegidos. Los codones que se emplean con muy poca frecuencia no se incluyen en un grado sustancial en el diseño de genes, y se emplean solo cuando sea necesario adaptarse a un criterio de diseño diferente de la composición de codones per se (por ejemplo, la adición o la deleción de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción).
La proteína codificada por OrfA de PUFA sintasa comprende 10 dominios repetidos de "prolina-alanina" que varían en tamaño de 17 a 29 aminoácidos. Intercalados entre las repeticiones de prolina-alanina se encuentran 9 dominios de secuencia repetida más largos que comprenden 87 aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos de estas repeticiones varían en solo 4 posiciones y solo existen dos elecciones de aminoácidos en cada una de las posiciones variantes. El análisis de las secuencias de aminoácidos de las 9 repeticiones empleando el programa informático Clustal W generó un valor de homología del 100% y un valor de identidad del 95,4%. A nivel del ADN, las secuencias que codifican las 9 repeticiones son 100% homólogas, 89,7% idénticas, y varían solo en 27 posiciones en las 261 bases que codifican cada repetición (23 de los 27 cambios son diferencias "silenciosas", en las que se intercambian codones sinónimos para el mismo aminoácido).
Los procesos convencionales de diseño de genes no pueden adaptarse con facilidad al desarrollo de nuevas secuencias de ADN con sesgo de codones para múltiples repeticiones de este tamaño, puesto que hay que equilibrar constantemente todas las elecciones de codones en una repetición individual con las elecciones de codones realizadas en la misma posición en las otras 8 repeticiones para evitar generar secuencias de ADN muy
relacionadas. Para cada una de las 87 repeticiones de restos, existen más de 4,5 x 1043 secuencias de ADN posibles que codifican la misma secuencia de aminoácidos (calculadas como el producto del número de codones sinónimos para cada aminoácido en la secuencia). Por tanto, se necesita un espacio de cálculo muy grande disponible para generar secuencias de ADN de codificación idéntica. El siguiente protocolo describe un método empleado para generar (en un entorno informático) múltiples diseños de secuencias para cada repetición individual, seguido de la comparación de todas las versiones de las secuencias en masa para identificar un conjunto que represente las secuencias muy divergentes que codifican las repeticiones:
Etapa 1: Extraer la secuencia de ADN nativa que codifica cada dominio de aminoácido repetido como una secuencia separada.
Etapa 2: Importar las secuencias de ADN repetidas individuales como secuencias separadas a un programa de diseño de genes (por ejemplo, OPTGENE™, Ocimum Biosolutions, Hyderabad, India). Las etapas 3-5 se realizan sobre cada secuencia por separado.
Etapa 3: Traducir la secuencia de ADN empleando el código genético convencional.
Etapa 4: Traducir de modo inverso la secuencia de proteína traducida empleando el código genético convencional y la tabla de sesgo de codones apropiada. En este ejemplo, se emplea una tabla de sesgo de codones compilada a partir de 530 regiones codificadoras de proteínas de Brassica napus, y a cada secuencia generada se le asignó un nombre de código "nap" (por "napus") más el número de versión. Así, la primera secuencia con sesgo de codones que se sometió a traducción inversa para la repetición 1 se denominó "rpt1 nap1". En este ejemplo, este proceso se realizó 10 veces para generar 10 versiones de secuencias de ADN que codifican la secuencia de proteína de la repetición 1.
Etapa 5: Exportar las 10 versiones de secuencias al correspondiente número de archivos de texto.
Etapa 6: Repetir las etapas 3-5 para cada uno de los otros dominios de secuencia repetida. En este ejemplo, se generó un total de 90 versiones de secuencias "nap" (10 por cada elemento repetido).
Etapa 7: Importar los 90 archivos de secuencias al programa Clustal W Mega 3.1 (al que puede accederse en Megasoftware) y realizar un alineamiento de múltiples secuencias empleando las 90 secuencias como entradas. Debido a que estas secuencias son segmentos de regiones codificadoras de proteínas, los alineamientos se realizan sin permitir huecos. Después del alineamiento de Clustal W, se ensambla un árbol de unión de vecinos y se visualiza, y se elige de modo visual una de las diez secuencias con codones optimizados para cada uno de los nueve dominios repetidos en la proteína. Cada versión de secuencia seleccionada se elige de la sección del árbol que tiene más ramificaciones.
Etapa 8: Incorporar la secuencia elegida para cada dominio repetido en la secuencia de ADN con codones optimizados que codifica la proteína completa en la posición adecuada para cada repetición particular.
Etapa 9: Realizar el análisis final de la secuencia completa con codones optimizados, incluyendo los elementos repetidos divergidos diseñados por separado, para asegurarse de la ausencia de motivos no deseados, sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, etc.
Las secuencias de ADN recién diseñadas y optimizadas para colza de OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa, acil-CoA sintetasa y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI se listan, respectivamente, en SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10. Estas secuencias con codones optimizados se identifican como la versión 3 (v3) a lo largo de la memoria descriptiva. Las secuencias indicadas como versión 2 (v2) describen las secuencias originales sin optimización de codones.
Las secuencias de ADN resultantes tienen un grado mayor de diversidad de codones, una composición de bases deseable, contienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción colocados de modo estratégico, y carecen de secuencias que puedan interferir con la transcripción del gen o la traducción del producto de ARNm. La tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7 presentan las comparaciones de las composiciones de codones de las regiones codificadoras para las proteínas de OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico, acil-CoA sintetasa y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI que se encuentran en el gen original, las versiones optimizadas para plantas y las recomendaciones de composición de codones para una secuencia optimizada para plantas calculadas a partir de la tabla 2, columnas D y H.
Tabla 3 -Composición de codones de OrfA de PUFA
Aminoácido
Codón Gen original, n.º Gen original, n.º Gen opt. plant., n.º Gen opt. plant., n.º Opt. plant. recom. Aminoácido Codón Gen original, n.º Gen original, n.º Gen opt. plant., n.º Gen opt. plant., n.º Opt. plant. recom.
ALA (A)
GCA 7 1,5 109 23,3 23,3 LEU (L) CTA 0 0,0 0 0,0 0,0
GCC
302 64,5 99 21,2 21,2 CTC 173 77,9 63 28,4 28,5
GCG
49 10,5 67 14,3 14,2 CTG 15 6,8 32 14,4 14,6
GCT
110 23,5 193 41,2 41,3 CTT 33 14,9 71 32,0 31,6
ARG (R)
AGA 0 0,0 57 43,5 43,8 TTA 0 0,0 0 0,0 0,0
AGG
0 0,0 40 30,5 30,5 TTG 1 0,5 56 25,2 25,3
CGA
0 0,0 0 0,0 0,0 LYS (K) AAA 2 1,2 73 44,5 44,6
CGC
112 85,5 0 0,0 0,0 AAG 162 98,8 91 55,5 55,4
CGG
1 0,8 0 0,0 0,0 MET (M) ATG 88 100 88 100 100,0
CGT
18 13,7 34 26,0 25,7 PHE (F) TTC 50 69,4 42 58,3 58,6
ASN (N)
AAC 73 97,3 47 62,7 62,6 TTT 22 30,6 30 41,7 41,4
AAT
2 2,7 28 37,3 37,4 PRO (P) CCA 2 1,3 45 30,0 29,6
ASP (D)
GAC 126 76,8 70 42,7 42,5 CCC 56 37,3 22 14,7 14,6
GAT
38 23,2 94 57,3 57,5 CCG 46 30,7 27 18,0 18,4
CYS (C)
TGC 34 94,4 18 50,0 49,2 CCT 46 30,7 56 37,3 37,3
TGT
2 5,6 18 50,0 50,8 SER (S) AGC 40 21,3 34 18,1 17,9
FIN
TAA 1 100,0 0 0,0 0,0 AGT 1 0,5 30 16,0 15,8
TAG
0 0,0 0 0,0 0,0 TCA 0 0,0 38 20,2 20,4
TGA
0 0,0 1 100,0 100,0 TCC 70 37,2 35 18,6 18,7
GLN (Q)
CAA 4 4,4 46 50,5 50,0 TCG 59 31,4 0 0,0 0,0
CAG
87 95,6 45 49,5 50,0 TCT 18 9,6 51 27,1 27,2
GLU (E) 16
GAA 9 3,8 103 43,6 43,6 THR (T) ACA 2 1,3 41 26,3 26,3
GAG
227 96,2 133 56,4 56,4 ACC 81 51,9 42 26,9 26,9
GLY (G)
GGA 6 3,1 71 36,2 36,4 ACG 26 16,7 26 16,7 16,9
GGC
156 79,6 32 16,3 16,2 ACT 47 30,1 47 30,1 30,0
GGG
0 0,0 30 15,3 15,2 TRP (W) TGG 13 100 13 100 100,0
GGT
34 17,3 63 32,1 32,1 TYR (Y) TAC 42 97,7 26 60,5 59,4
HIS (H)
CAC 25 83,3 15 50,0 49,6 TAT 1 2,3 17 39,5 40,6
CAT
5 16,7 15 50,0 50,4 VAL (V) GTA 0 0,0 0 0,0 0,0
ILE (I)
ATA 0 0,0 29 21,0 21,1 GTC 176 70,7 67 26,9 27,0
ATC
99 71,7 59 42,8 42,7 GTG 39 15,7 79 31,7 31,7
ATT
39 28,3 50 36,2 36,2 GTT 34 13,7 103 41,4 41,3
Totales
1566 1566 Totales 1345 1345
Tabla 4 -Composición de codones de OrfB de PUFA
Aminoácido
Codón Gen original, n.º Gen original, n.º Gen opt. plant., n.º Gen opt. plant., n.º Opt. plant. recom. Aminoácido Codón Gen original, n.º Gen original, n.º Gen opt. plant., n.º Gen opt. plant., n.º Opt. plant. recom.
ALA (A)
GCA 13 5,7 53 23,2 23,3 LEU (L) CTA 0 0,0 0 0,0 0,0
GCC
135 59,2 48 21,1 21,2 CTC 116 63,0 51 27,7 28,5
GCG
43 18,9 34 14,9 14,2 CTG 21 11,4 27 14,7 14,6
GCT
37 16,2 93 40,8 41,3 CTT 44 23,9 59 32,1 31,6
ARG (R)
AGA 0 0,0 54 45,0 43,8 TTA 0 0,0 0 0,0 0,0
AGG
0 0,0 36 30,0 30,5 TTG 3 1,6 47 25,5 25,3
CGA
1 0,8 0 0,0 0,0 LYS (K) AAA 10 8,8 52 45,6 44,6
CGC
95 79,2 0 0,0 0,0 AAG 104 91,2 62 54,4 55,4
CGG
1 0,8 0 0,0 0,0 MET (M) ATG 45 100 45 100 100,0
CGT
23 19,2 30 25,0 25,7 PHE (F) TTC 33 47,8 41 59,4 58,6
ASN (N)
AAC 75 89,3 51 60,7 62,6 TTT 36 52,2 28 40,6 41,4
AAT
9 10,7 33 39,3 37,4 PRO (P) CCA 8 7,2 33 29,7 29,6
ASP (D)
GAC 86 72,3 52 43,7 42,5 CCC 47 42,3 16 14,4 14,6
GAT
33 27,7 67 56,3 57,5 CCG 35 31,5 20 18,0 18,4
CYS (C)
TGC 41 100,0 20 48,8 49,2 CCT 21 18,9 42 37,8 37,3
TGT
0 0,0 21 51,2 50,8 SER (S) AGC 40 26,5 28 18,5 17,9
FIN
TAA 1 100,0 0 0,0 0,0 AGT 7 4,6 24 15,9 15,8
TAG
0 0,0 0 0,0 0,0 TCA 2 1,3 31 20,5 20,4
TGA
0 0,0 1 100,0 100,0 TCC 55 36,4 28 18,5 18,7
GLN (Q)
CAA 8 13,6 30 50,8 50,0 TCG 33 21,9 0 0,0 0,0
CAG
51 86,4 29 49,2 50,0 TCT 14 9,3 40 26,5 27,2
GLU (E) 16
GAA 33 24,8 58 43,6 43,6 THR (T) ACA 8 8,1 28 28,3 26,3
GAG
100 75,2 75 56,4 56,4 ACC 58 58,6 24 24,2 26,9
GLY (G)
GGA 11 7,2 55 36,2 36,4 ACG 26 26,3 16 16,2 16,9
GGC
102 67,1 25 16,4 16,2 ACT 7 7,1 31 31,3 30,0
GGG
3 2,0 23 15,1 15,2 TRP (W) TGG 22 100 22 100 100,0
GGT
36 23,7 49 32,2 32,1 TYR (Y) TAC 51 91,1 32 57,1 59,4
HIS (H)
CAC 29 76,3 19 50,0 49,6 TAT 5 8,9 24 42,9 40,6
CAT
9 23,7 19 50,0 50,4 VAL (V) GTA 1 0,8 0 0,0 0,0
ILE (I)
ATA 0 0,0 22 21,2 21,1 GTC 85 65,4 34 26,2 27,0
ATC
67 64,4 44 42,3 42,7 GTG 30 23,1 42 32,3 31,7
ATT
37 35,6 38 36,5 36,2 GTT 14 10,8 54 41,5 41,3
Totales
1079 1079 Totales 981 981
Tabla 5 -Composición de codones de OrfC de PUFA
Aminoácido
Codón Gen original, n.º Gen original, n.º Gen opt. plant., n.º Gen opt. plant., n.º Opt. plant. recom. Aminoácido Codón Gen original, n.º Gen original, n.º Gen opt. plant., n.º Gen opt. plant., n.º Opt. plant. recom.
ALA (A)
GCA 18 14,0 30 23,3 23,3 LEU (L) CTA 2 1,6 0 0,0 0,0
GCC
84 65,1 28 21,7 21,2 CTC 78 63,9 34 27,9 28,5
GCG
14 10,9 19 14,7 14,2 CTG 18 14,8 18 14,8 14,6
GCT
13 10,1 52 40,3 41,3 CTT 16 13,1 39 32,0 31,6
ARG (R)
AGA 1 1,3 33 44,0 43,8 TTA 1 0,8 0 0,0 0,0
AGG
1 1,3 23 30,7 30,5 TTG 7 5,7 31 25,4 25,3
CGA
6 8,0 0 0,0 0,0 LYS (K) AAA 15 16,1 42 45,2 44,6
CGC
53 70,7 0 0,0 0,0 AAG 78 83,9 51 54,8 55,4
CGG
3 4,0 0 0,0 0,0 MET (M) ATG 48 100 48 100 100,0
CGT
11 14,7 19 25,3 25,7 PHE (F) TTC 40 58,8 40 58,8 58,6
ASN (N)
AAC 63 90,0 43 61,4 62,6 TTT 28 41,2 28 41,2 41,4
AAT
7 10,0 27 38,6 37,4 PRO (P) CCA 10 11,2 27 30,3 29,6
ASP (D)
GAC 70 76,9 40 44,0 42,5 CCC 35 39,3 13 14,6 14,6
GAT
21 23,1 51 56,0 57,5 CCG 26 29,2 16 18,0 18,4
CYS (C)
TGC 26 81,3 16 50,0 49,2 CCT 18 20,2 33 37,1 37,3
TGT
6 18,8 16 50,0 50,8 SER (S) AGC 16 19,0 13 15,5 17,9
FIN
TAA 1 100,0 0 0,0 0,0 AGT 3 3,6 14 16,7 15,8
TAG
0 0,0 0 0,0 0,0 TCA 9 10,7 18 21,4 20,4
TGA
0 0,0 1 100,0 100,0 TCC 28 33,3 16 19,0 18,7
GLN (Q)
CAA 11 24,4 25 55,6 50,0 TCG 21 25,0 0 0,0 0,0
CAG
34 75,6 20 44,4 50,0 TCT 7 8,3 23 27,4 27,2
GLU (E) 16
GAA 17 19,1 40 44,9 43,6 THR (T) ACA 4 6,2 17 26,2 26,3
GAG
72 80,9 49 55,1 56,4 ACC 41 63,1 17 26,2 26,9
GLY (G)
GGA 21 17,9 43 36,8 36,4 ACG 8 12,3 11 16,9 16,9
GGC
78 66,7 18 15,4 16,2 ACT 12 18,5 20 30,8 30,0
GGG
7 6,0 18 15,4 15,2 TRP (W) TGG 18 100 18 100 100,0
GGT
11 9,4 38 32,5 32,1 TYR (Y) TAC 41 87,2 28 59,6 59,4
HIS (H)
CAC 24 85,7 14 50,0 49,6 TAT 6 12,8 19 40,4 40,6
CAT
4 14,3 14 50,0 50,4 VAL (V) GTA 6 5,3 0 0,0 0,0
ILE (I)
ATA 0 0,0 15 21,7 21,1 GTC 62 54,4 31 27,2 27,0
ATC
48 69,6 30 43,5 42,7 GTG 24 21,1 37 32,5 31,7
ATT
21 30,4 24 34,8 36,2 GTT 22 19,3 46 40,4 41,3
Totales
746 746 Totales 748 748
Tabla 6 -Composición de codones de acil-CoA sintetasa
Aminoácido
Codón Gen original, n.º Gen original, n.º Gen opt. plant., n.º Gen opt. plant., n.º Opt. plant. recom. Aminoácido Codón Gen original, n.º Gen original, n.º Gen opt. plant., n.º Gen opt. plant., n.º Opt. plant. recom.
ALA (A)
GCA 2 2,3 21 24,7 23,3 LEU (L) CTA 0 0,0 0 0,0 0,0
GCC
59 68,6 18 21,2 21,2 CTC 35 63,6 15 27,3 28,5
GCG
11 12,8 12 14,1 14,2 CTG 6 10,9 9 16,4 14,6
GCT
14 16,3 34 40,0 41,3 CTT 13 23,6 17 30,9 31,6
ARG (R)
AGA 0 0,0 14 43,8 43,8 TTA 0 0,0 0 0,0 0,0
AGG
3 9,4 10 31,3 30,5 TTG 1 1,8 14 25,5 25,3
CGA
0 0,0 0 0,0 0,0 LYS (K) AAA 2 4,1 22 44,9 44,6
CGC
25 78,1 0 0,0 0,0 AAG 47 95,9 27 55,1 55,4
CGG
0 0,0 0 0,0 0,0 MET (M) ATG 21 100 21 100 100,0
CGT
4 12,5 8 25,0 25,7 PHE (F) TTC 16 51,6 18 58,1 58,6
ASN (N)
AAC 22 95,7 14 60,9 62,6 TTT 15 48,4 13 41,9 41,4
AAT
1 4,3 9 39,1 37,4 PRO (P) CCA 0 0,0 11 30,6 29,6
ASP (D)
GAC 38 74,5 22 43,1 42,5 CCC 20 55,6 5 13,9 14,6
GAT
13 25,5 29 56,9 57,5 CCG 9 25,0 7 19,4 18,4
CYS (C)
TGC 11 91,7 6 50,0 49,2 CCT 7 19,4 13 36,1 37,3
TGT
1 8,3 6 50,0 50,8 SER (S) AGC 7 17,5 7 17,5 17,9
FIN
TAA 1 100,0 0 0,0 0,0 AGT 4 10,0 6 15,0 15,8
TAG
0 0,0 0 0,0 0,0 TCA 1 2,5 8 20,0 20,4
TGA
0 0,0 1 100,0 100,0 TCC 19 47,5 8 20,0 18,7
GLN (Q)
CAA 3 18,8 8 50,0 50,0 TCG 7 17,5 0 0,0 0,0
CAG
13 81,3 8 50,0 50,0 TCT 2 5,0 11 27,5 27,2
GLU (E) 16
GAA 11 17,7 27 43,5 43,6 THR (T) ACA 1 2,0 13 25,5 26,3
GAG
51 82,3 35 56,5 56,4 ACC 27 52,9 14 27,5 26,9
GLY (G)
GGA 5 7,4 25 36,8 36,4 ACG 19 37,3 9 17,6 16,9
GGC
49 72,1 11 16,2 16,2 ACT 4 7,8 15 29,4 30,0
GGG
0 0,0 10 14,7 15,2 TRP (W) TGG 10 100 10 100 100,0
GGT
14 20,6 22 32,4 32,1 TYR (Y) TAC 18 85,7 12 57,1 59,4
HIS (H)
CAC 10 83,3 6 50,0 49,6 TAT 3 14,3 9 42,9 40,6
CAT
2 16,7 6 50,0 50,4 VAL (V) GTA 0 0,0 0 0,0 0,0
ILE (I)
ATA 0 0,0 10 21,3 21,1 GTC 34 58,6 16 27,6 27,0
ATC
27 57,4 20 42,6 42,7 GTG 9 15,5 19 32,8 31,7
ATT
20 42,6 17 36,2 36,2 GTT 15 25,9 23 39,7 41,3
Totales
410 409 Totales 372 372
Tabla 7 -Composición de codones de fosfopanteteinilo transferasa HetI
Aminoácido
Codón Gen original, n.º Gen original, n.º Gen opt. plant., n.º Gen opt. plant., n.º Opt. plant. recom. Aminoácido Codón Gen original, n.º Gen original, n.º Gen opt. plant., n.º Gen opt. plant., n.º Opt. plant. recom.
ALA (A)
GCA 4 20,0 5 25,0 23,3 LEU (L) CTA 6 17,1 0 0,0 0,0
GCC
6 30,0 4 20,0 21,2 CTC 4 11,4 10 28,6 28,5
GCG
2 10,0 3 15,0 14,2 CTG 0 0,0 5 14,3 14,6
GCT
8 40,0 8 40,0 41,3 CTT 3 8,6 11 31,4 31,6
ARG (R)
AGA 1 6,3 6 37,5 43,8 TTA 14 40,0 0 0,0 0,0
AGG
1 6,3 5 31,3 30,5 TTG 8 22,9 9 25,7 25,3
CGA
2 12,5 0 0,0 0,0 LYS (K) AAA 10 90,9 5 45,5 44,6
CGC
6 37,5 0 0,0 0,0 AAG 1 9,1 6 54,5 55,4
CGG
1 6,3 0 0,0 0,0 MET (M) ATG 1 100 1 100 100,0
CGT
5 31,3 5 31,3 25,7 PHE (F) TTC 3 25,0 6 50,0 58,6
ASN (N)
AAC 3 50,0 4 66,7 62,6 TTT 9 75,0 6 50,0 41,4
AAT
3 50,0 2 33,3 37,4 PRO (P) CCA 9 56,3 5 31,3 29,6
ASP (D)
GAC 3 25,0 5 41,7 42,5 CCC 6 37,5 2 12,5 14,6
GAT
9 75,0 7 58,3 57,5 CCG 1 6,3 3 18,8 18,4
CYS (C)
TGC 0 0,0 1 33,3 49,2 CCT 0 0,0 6 37,5 37,3
TGT
3 100,0 2 66,7 50,8 SER (S) AGC 0 0,0 2 15,4 17,9
FIN
TAA 0 0,0 0 0,0 0,0 AGT 4 30,8 2 15,4 15,8
TAG
0 0,0 0 0,0 0,0 TCA 3 23,1 3 23,1 20,4
TGA
1 100,0 1 100,0 100,0 TCC 3 23,1 2 15,4 18,7
GLN (Q)
CAA 5 45,5 5 45,5 50,0 TCG 1 7,7 0 0,0 0,0
CAG
6 54,5 6 54,5 50,0 TCT 2 15,4 4 30,8 27,2
GLU (E) 16
GAA 13 72,2 8 44,4 43,6 THR (T) ACA 3 27,3 3 27,3 26,3
GAG
5 27,8 10 55,6 56,4 ACC 2 18,2 3 27,3 26,9
GLY (G)
GGA 0 0,0 5 35,7 36,4 ACG 2 18,2 2 18,2 16,9
GGC
5 35,7 2 14,3 16,2 ACT 4 36,4 3 27,3 30,0
GGG
2 14,3 2 14,3 15,2 TRP (W) TGG 6 100 6 100 100,0
GGT
7 50,0 5 35,7 32,1 TYR (Y) TAC 2 22,2 5 55,6 59,4
HIS (H)
CAC 1 20,0 3 60,0 49,6 TAT 7 77,8 4 44,4 40,6
CAT
4 80,0 2 40,0 50,4 VAL (V) GTA 0 0,0 0 0,0 0,0
ILE (I)
ATA 2 20,0 3 30,0 21,1 GTC 1 12,5 2 25,0 27,0
ATC
4 40,0 4 40,0 42,7 GTG 3 37,5 3 37,5 31,7
ATT
4 40,0 3 30,0 36,2 GTT 4 50,0 3 37,5 41,3
Totales
116 116 Totales 122 122
Después de completar la optimización de las secuencias de las regiones codificadoras, se añadieron secuencias de nucleótidos adicionales a la secuencia de la región codificadora optimizada. Se añadieron sitios de restricción para facilitar la clonación, una secuencia Kozak y codones de fin adicionales a la secuencia codificadora optimizada para plantas. Además, se diseñó una segunda serie de secuencias codificadoras de OrfA de PUFA sintasa, OrfB de
PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico, acil-CoA sintetasa y fosfopanteteinilo transferasa HetI que contienen una secuencia de conducción al cloroplasto procedente de la cadena pequeña 1A de la ribulosa bifosfato carboxilasa de Arabidopsis thaliana (GenBank ID: NM_202369.2). Esta secuencia SEQ ID NO:11 se añadió a las secuencias codificadoras previamente descritas para el OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico y fosfopanteteinilo transferasa HetI. La metionina inicial de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, y SEQ ID NO:10 se retiró y se reemplazó por la secuencia de conducción al cloroplasto. Las secuencias que contienen la secuencia de conducción al cloroplasto se identifican como la versión 4 (v4) a lo largo de la memoria descriptiva.
Se añadió un segundo péptido de conducción al cloroplasto a las secuencias codificadoras de OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico, acil-CoA sintetasa y fosfopanteteinilo transferasa HetI. Estas secuencias codificadoras se diseñaron para que contuviesen una secuencia de conducción al cloroplasto de la acil-ACP-tioesterasa (GenBank ID: X73849.1). Esta secuencia, SEQ ID NO:38, se añadió a las secuencias codificadoras previamente descritas para el OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico y fosfopanteteinilo transferasa HetI. La metionina inicial de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10 se retiró y se reemplazó por la secuencia de conducción al cloroplasto. Las secuencias que contienen la secuencia de conducción al cloroplasto se identifican como la versión 5 (v5) a lo largo de la memoria descriptiva.
Tras haber diseñado una secuencia de ADN optimizada para plantas sobre el papel o de modo informático, las verdaderas moléculas de ADN pueden sintetizarse en el laboratorio para que se correspondan con precisión en secuencia con la secuencia diseñada. Estas moléculas de ADN sintéticas pueden clonarse y manipularse de otra forma exactamente como si procediesen de fuentes naturales o nativas. La síntesis de fragmentos de ADN que comprenden SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10 que contienen las secuencias adicionales descritas anteriormente fue realizada por suministradores comerciales (Geneart Ag, Regensburg, Alemania). Después el ADN sintético se clonó en vectores de expresión y se transformó en Agrobacterium y colza, tal como se describe en los ejemplos 2, 3, y 4.
El empleo de este método con la optimización de codones de la secuencia codificadora de OrfA de PUFA sintasa dio como resultado la selección de secuencias de prolina-alanina repetidas que son suficientemente divergentes para evitar la inestabilidad de secuencias repetidas. Estas secuencias se eligieron de las zonas de mayor ramificación del árbol de unión de vecinos (es decir, las que están más lejanamente emparentadas entre sí en este conjunto de secuencias). Se realizaron alineamientos globales de Smith-Wasserman para todas las combinaciones apareadas, y el intervalo de homología fue del 74-81% con una mediana probable de 76-77% (tabla 8).
Tabla 8 -Homologías de Smith-Wasserman de secuencias con codones optimizados seleccionadas de repeticiones de OrfA de PUFA
rpt1 nap9
rpt2 nap10 rpt3 nap10 rpt4 nap1 rpt5 nap 10 rpt6 nap6 rpt7 nap9 rpt8 nap4 rpt9 nap10
rpt1 nap9
100 77 74 77 74 77 81 76 76
rpt2 nap10
100 81 76 74 77 79 76 77
rpt3 nap10
100 79 80 74 74 76 78
rpt4 nap1
100 80 77 75 76 76
rpt5 nap10
100 78 77 77 77
rpt6 nap6
100 78 76 77
rpt7 nap9
100 75 74
rpt8 nap4
100 76
rpt9 nap10
100
En la figura 1 se muestra un alineamiento de Clustal W (Vector NTI, Invitrogen, Carlsbad, CA) de las 9 regiones codificadoras recién diseñadas elegidas para los 9 dominios repetidos. Globalmente, las secuencias son 93,1% homólogas, 61,7% idénticas comparadas con las secuencias originales, que son 100% homólogas y 89,7% idénticas. Puede lograrse una mayor divergencia de secuencia empleando más de 10 iteraciones de secuencia y empleando un programa informático o algoritmo matemático que realice la selección de estas secuencias (en lugar de elegir las secuencias de modo visual). No obstante, las secuencias ejemplificadas son muy divergentes y producen fragmentos polinucleotídicos estables que contienen nucleótidos.
Ejemplo 2: Construcción de los plásmidos pDAB7361, pDAB7362, pDAB7363, y otras construcciones
Construcción de pDAB7361
Se construyó el plásmido pDAB7361 (figura 2; SEQ ID NO:35) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios (Invitrogen, Carlsbad, CA). El pDAB7361 contiene tres unidades de transcripción en plantas de PUFA sintasa ("plant transcription unit", PTU), una PTU de acil-CoA sintetasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa como sigue. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene un promotor del gen de fitohemaglutinina-L de Phaseolus vulgaris truncado (promotor v2 de PvDlec2; GenBank n.º de registro X06336), una región no traducida 5' del gen AT2S3 de Arabidopsis thaliana (2S 5’ UTR; GenBank n.º de registro NM_118850), el marco de lectura abierto A de la ácido graso poliinsaturado sintasa de Schizochytrium sp. (Sz PUFA OrfA v2) y la región de terminador v1 no traducida 3' del gen de la albúmina 2S de Arabidopsis thaliana (terminador v1 de At2S SSPv1; GenBank n.º de registro M22035). La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, el marco de lectura abierto B de la ácido graso poliinsaturado sintasa de Schizochytrium sp. (SzPUFA OrfB v3) y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, el marco de lectura abierto C de la ácido graso poliinsaturado sintasa de Schizochytrium y Thraustochytrium sp. (hSzThPUFA OrfC v3) y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de acil-CoA sintetasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, la acil-CoA sintetasa de Schizochytrium sp. (SzACS-2 v3) y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa PTU contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, la 4' fosfopanteteinilo transferasa HetI de Nostoc sp. (NoHetI v3) y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB7355, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7339 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB7361. De modo específico, las cinco PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El pDAB7333 también contiene la PTU de la fosfinotricín acetil transferasa: el promotor del virus del mosaico de las venas de mandioca (promotor v2 de CsVMVv2; Verdaguer et al., Plant Molecular Biology, 31:11291139, 1996), fosfinotricín acetil transferasa (PAT v5; Wohlleben et al., Gene, 70:25-37, 1988) y región no traducida 5' del ORF1 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORFl 3’ UTR v4; Huang et al., J. Bacteriol., 172:1814-1822, 1990), además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive (Toro et al., PNAS 85(22):8558-8562, 1988) y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T; Gardner et al., Science, 231:725-727, 1986 y documento WO 2001/025459 A1). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB7362
Se construyó el plásmido pDAB7362 (figura 3; SEQ ID NO:36) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB7362 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de acil-CoA sintetasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de acil-CoA sintetasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, el gen SzACS-2 v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, NoHetI v3 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB7334, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7339 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB7362. De modo específico, las cinco PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB7363
Se construyó el plásmido pDAB7363 (figura 4; SEQ ID NO:37) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB7363 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de acil-CoA sintetasa y una secuencia de PTU de fosfopanteteinilo transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v4 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v4 y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v4 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de acil-CoA sintetasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, el gen SzACS-2 v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, NoHetI v4 y el terminador v1 de At2S SSP. Además, todas las PTU contenían además la secuencia de
conducción al cloroplasto de la cadena pequeña 1A de ribulosa bifosfato carboxilasa de Arabidopsis thaliana, según se indica con el indicador "v4."
Los plásmidos pDAB7340, pDAB7341, pDAB7342, pDAB7344 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB7363. De modo específico, las cinco PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB7365
El pDAB7365 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones nativas con codones no optimizados de SzPUFA OrfA v2, SzPUFA OrfB v2, hSzThPUFA OrfC v2, SzACS-2 v2, y NoHetI v2. Se construyó el plásmido pDAB7365 (figura 19; SEQ ID NO:39) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB7365 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de acil-CoA sintetasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v2 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v2 y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfC v2 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de acil-CoA sintetasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, el gen SzACS-2 v2 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, NoHetI v2 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmido pDAB7355, pDAB7356, pDAB7357, pDAB7360 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB7365. De modo específico, las cinco PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v2, SzPUFA OrfB v2, SzPUFA OrfC v2, SzACS-2 v2, NoHetI v2. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las seis PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB7368
El pDAB7368 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones nativas con codones no optimizados de SzPUFA OrfA v2, SzPUFA OrfB v2, hSzThPUFA OrfC v2, y NoHetI v2. Esta construcción no contiene la secuencia codificadora de SzACS-2. Se construyó el plásmido pDAB7368 (figura 20; SEQ ID NO:40) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB7368 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de acil-CoA sintetasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v2 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v2 y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfC v2 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, NoHetI v2 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB7355, pDAB7356, pDAB7357, pDAB7359 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB7368. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v2, SzPUFA OrfB v2, SzPUFA OrfC v2, NoHetI v2. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB7369
El pDAB7369 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones reconstruidas con codones optimizados de SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, y NoHetI v3. Esta construcción no contiene la PTU de la secuencia codificadora de SzACS-2. Se construyó el plásmido pDAB7369 (figura 21; SEQ ID NO:41) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB7369 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de acil-CoA sintetasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de
PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, NoHetI v3 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB7334, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7338 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB7369. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB7370
El pDAB7370 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones reconstruidas con codones optimizados de SzPUFA OrfA v4, SzPUFA OrfB v4, hSzThPUFA OrfC v4, y NoHetI v4, que contienen la cadena pequeña 1A de ribulosa bifosfato carboxilasa (indicada como SSU-TP v1) que está condensada al amino-terminal de la secuencia codificadora. Esta construcción no contiene la PTU de la secuencia codificadora de SzACS-2. Se construyó el plásmido pDAB7370 (figura 22; SEQ ID NO:42) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB7370 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de acil-CoA sintetasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v4 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v4 y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v4 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, NoHetI v4 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB7340, pDAB7341, pDAB7342, pDAB7343 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB7370. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v4, SzPUFA OrfB v4, hSzThPUFA OrfC v4, NoHetI v4. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB100518
El pDAB100518 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones reconstruidas con codones optimizados de SzPUFA OrfA v5, SzPUFA OrfB v5, hSzThPUFA OrfC v5, y NoHetI v5, que contiene el péptido de tránsito al cloroplasto procedente de acil-ACP-tioesterasa (indicado como péptido de tránsito de tioesterasa) que está condensado al amino-terminal de la secuencia codificadora. Además, el plásmido contiene una PTU de la secuencia codificadora de SzACS-2 v3 que no posee un péptido de tránsito al cloroplasto. Se construyó el plásmido pDAB100518 (figura 23; SEQ ID NO:43) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB100518 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de acil-CoA sintetasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v5 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v5 y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v5 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de acil-CoA sintetasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, el gen SzACS-2 v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, NoHetI v5 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB100517, pDAB100514, pDAB100511, pDAB100515 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB100518. De modo específico, las cinco PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v5, SzPUFA OrfB v5, hSzThPUFA OrfC v5, SzACS-2 v3, NoHetI v5. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las seis PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las seis PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB101476
El pDAB101476 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones reconstruidas con codones optimizados de SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, y NoHetI v3. La secuencia del gen SzACS-2 v2 es la versión nativa sin codones optimizados. Se construyó el plásmido pDAB101476 (figura 24; SEQ ID NO:44) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB101476 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de acil-CoA sintetasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de acil-CoA sintetasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, el gen SzACS-2 v2 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, NoHetI v3 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB7334, pDAB7335, pDAB7336, pDAB101471 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB101476. De modo específico, las cinco PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v2, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las seis PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las seis PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB101477
El plásmido pDAB101477 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones reconstruidas con codones optimizados de SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, y NoHetI v3. Se construyó el plásmido pDAB101477 (figura 25; SEQ ID NO:45) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB101477 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de acil-CoA sintetasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de acil-CoA sintetasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, el gen SzACS-2 v4 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, NoHetI v3 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB7334, pDAB7335, pDAB7336, pDAB101472 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB101477. De modo específico, las cinco PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v4, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las seis PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las seis PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Ejemplo 3: Producción en una cepa de Agrobacterium de los plásmidos pDAB7361, pDAB7362, pDAB7363
Los plásmidos pDAB7361, pDAB7362 y pDAB7363 se transformaron en Agrobacterium tumefaciens empleando técnicas de electroporación convencionales. De modo específico, la cepa Z707S de Agrobacterium tumefaciens (Hepburn et al., J. Gen. Microbiol., 131:2961-2969 (1985)) se electroporaron con los plásmidos pDAB7361, pDAB7362 o pDAB7363. Las colonias transformadas de Agrobacterium que contenían los plásmidos se seleccionaron y se confirmaron empleando una digestión con enzimas de restricción. Las cepas de Agrobacterium que contenían pDAB7361, pDAB7362 o pDAB7363 se conservaron como cepas madre en glicerol a -80 °C.
Ejemplo 4: Transformación mediada por Agrobacterium de colza
Preparación de Agrobacterium
Se empleó un raspado con asa de una cepa madre en glicerol de las cepas de Agrobacterium que contenían pDAB7361, pDAB7362 o pDAB7363 para sembrar placas de YEP (bactopeptona 20,0 gm/l y extracto de levadura 10,0 gm/l) que contenían estreptomicina (100 mg/ml) y espectinomicina (50 mg/ml) y se incubaron durante 2 días a 28 °C. Después un raspado con asa de las placas sembradas al segundo día se inoculó en 150 ml de líquido YEP modificado con estreptomicina (100 mg/ml) y espectinomicina (50 mg/ml) en uno o más matraces con hendiduras de 500 ml y se agitaron a 200 rpm a 28 °C. Los cultivos se resuspendieron en medio M (sales LS, glucosa al 3%,
vitaminas B5 modificadas, quinetina 1 M, 2,4-D 1 M, pH 5,8) y se diluyeron hasta la densidad apropiada (50 unidades Klett) antes de la transformación de hipocotilos de colza.
Transformación de colza
Germinación de las semillas: Se esterilizó la superficie de semillas de colza (variedad Nexera 710) en Clorox al 10% durante 10 minutos y se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril (las semillas estaban contenidas en coladores de acero inoxidable durante este proceso). Las semillas se plantaron para la germinación en medio 1/2 MS Canola (1/2 MS, sacarosa al 2%, agar al 0,8%) contenido en bandejas Phytatrays, 25 semillas por cada bandeja Phytatray, y se colocaron en una cámara Percival para un régimen de crecimiento ajustado a 25 °C, con un fotoperiodo de 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad, y se hicieron germinar durante 5 días.
Pretratamiento: En el día 5, segmentos del hipocotilo de aproximadamente 3 mm se cortaron asépticamente, se rechazaron las secciones de la raíz y el brote (se evitó que los hipocotilos se secasen colocándolos en 10 ml de agua milliQ estéril durante el proceso de cortado). Los segmentos de hipocotilo se colocaron horizontalmente sobre papel de filtro estéril en medio de inducción de callos MSK1D1 (MS, quinetina 1 mg/l, 2,4-D 1 mg/l, sacarosa al 3%, Phytagar al 0,7%) para 3 días de pretratamiento en una cámara Percival para un régimen de crecimiento ajustado a 22-23 °C (fotoperiodo de 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad).
Cocultivo con Agrobacterium: El día anterior al tratamiento con Agrobacterium, los matraces de medio YEP que contenían los antibióticos apropiados se inocularon. Los segmentos de hipocotilo se trasladaron del papel de filtro a placas Petri de 100 x 25 mm vacías que contenían 10 ml de medio M líquido para evitar que los segmentos de hipocotilo se secasen. En esta etapa se empleó una espátula para recoger los segmentos y transferirlos. El medio M líquido se retiró con una pipeta y se añadieron 40 ml de la suspensión de Agrobacterium a la placa Petri (500 segmentos con 40 ml de disolución de Agrobacterium). Los segmentos se trataron durante 30 minutos moviendo en círculos periódicamente la placa Petri para que los hipocotilos se mantuviesen sumergidos en la disolución de Agrobacterium. Al final del periodo de tratamiento, la disolución de Agrobacterium se pipeteó hacia un vaso de precipitado de residuos, se sometió a autoclave y se rechazó (la disolución de Agrobacterium se retiró completamente para evitar un crecimiento excesivo de Agrobacterium). Los hipocotilos tratados se trasladaron con un fórceps de nuevo a las placas originales que contenían MSK1D1 con papel de filtro (se tuvo cuidado para que los segmentos no se secasen). Los segmentos de hipocotilo, junto con los segmentos control, se devolvieron a la cámara Percival bajo una intensidad de luz reducida (cubriendo las placas con una lámina de aluminio), y los hipocotilos tratados se cocultivaron con Agrobacterium durante 3 días.
Inducción de callos sobre medio de selección: Después de 3 días de cocultivo, los segmentos de hipocotilo se trasladaron individualmente con fórceps a un medio de inducción de callos MSK1D1H1 (MS, quinetina 1 mg/l, 2,4-D 1 mg/l, MES 0,5 gm/l, AgNO3 5 mg/l, timentina 300 mg/l, carbenicilina 200 mg/l, Herbiace 1 mg/l, sacarosa al 3%, Phytagar al 0,7%). Los segmentos de hipocotilo se anclaron en el medio pero no se sumergieron en el medio.
Selección y regeneración del brote: Después de 7 días en el medio de inducción de callos, los segmentos de hipocotilo callosos se trasladaron al medio de regeneración de brotes 1 con selección MSB3Z1H1 (MS, BAP 3 mg/l, zeatina 1 mg/l, MES 0,5 gm/l, AgNO3 5 mg/l, timentina 300 mg/l, carbenicilina 200 mg/l, Herbiace 1 mg/l, sacarosa al 3%, Phytagar al 0,7%). Después de 14 días, los hipocotilos con brotes se trasladaron al medio de regeneración 2 con una mayor selección MSB3Z1H3 (MS, BAP 3 mg/l, zeatina 1 mg/l, MES 0,5 gm/l, AgNO3 5 mg/l, timentina 300 mg/l, carbenicilina 200 mg/l, HERBIACE 3 mg/l, sacarosa al 3%, Phytagar al 0,7%).
Alargamiento de los brotes: Después de 14 días, los segmentos con brotes se trasladaron a un medio de alargamiento de brotes MSMESH5 (MS, timentina 300 mg/l, Herbiace 5 mg/l, sacarosa al 2%, agar TC al 0,7%). Los brotes que ya se habían alargado se aislaron y se trasladaron a MSMESH5. Después de 14 días, los brotes que no se habían alargado en la primera ronda se colocaron en MSMESH5 y se trasladaron a medio de selección fresco de la misma composición. En esta etapa todos los segmentos de hipocotilo remanentes se rechazaron.
Los brotes que se alargaron en medio MSB3Z1H3 después de 2 semanas se aislaron y se trasladaron a medio MSMESH5. El resto de los brotes que no se habían alargado en la primera ronda en MSMESH5 se aislaron y se trasladaron a medio de selección fresco de la misma composición. En esta etapa todos los segmentos de hipocotilo remanentes se rechazaron.
Inducción de las raíces: Después de 14 días, los brotes se trasladaron a medio MSMEST (MS, MES 0,5 g/l, timentina 300 mg/l, sacarosa al 2%, agar TC al 0,7%) para la inducción de las raíces. Los brotes que no enraizaron en la primera transferencia en medio MSMEST se trasladaron para un segundo o tercer ciclo en medio MSMEST hasta que obtuvieron plantas con raíces. Los brotes que no se alargaron o que no produjeron raíces en la primera transferencia en medio MSMEST se trasladaron para un segundo o tercer ciclo en medio MSMEST hasta que obtuvieron plantas con raíces.
Análisis con PCR: Las muestras para la PCR se aislaron después de que brotes se cultivasen en medio MSMESH5 durante al menos 14 días. El tejido foliar de los brotes verdes se ensayó mediante PCR para determinar la presencia del gen de marcador seleccionable PAT. Todos los brotes cloróticos se rechazaron y no se sometieron al ensayo PAT. Las muestras que dieron un resultado positivo para la reacción de PCR se guardaron y los brotes se dejaron
en medio MSMEST para que se alargasen y desarrollasen raíces. Los brotes que dieron un resultado negativo según el ensayo de PCR se rechazaron.
Las plantas que enraizaron en MSMESH5 o MSMEST y que dieron un resultado positivo en la PCR se llevaron a trasplantar en tierra. Después de su consolidación, las plantas de colza T0 se analizaron para descubrir acontecimientos que contuviesen todos los módulos PTU de transgenes y después las plantas se trasladaron a un invernadero, se cultivaron hasta la madurez y las semillas se recolectaron para posteriores análisis.
Ejemplo 5: Análisis del número de copias y detección de la región codificadora en colza transgénica
Las plantas T0 seleccionadas del ejemplo 4 se volvieron a analizar para identificar las plantas que contenían cada uno de los módulos de expresión de PTU de los transgenes. Se realizaron ensayos con sondas de hidrólisis e Invader para seleccionar inicialmente muestras de plantas T0 putativamente transformadas para identificar los acontecimientos que contenían el módulo de expresión de PAT. Se realizaron posteriores análisis de PCR del OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico, acil-CoA sintetasa y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI para identificar las plantas que contenían cada uno de los módulos de expresión PTU del gen del vector binario empleado para transformar las plantas. Se seleccionaron los acontecimientos que contenían todas las PTU para proseguir hasta las plantas T1.
Se recogieron muestras de tejido en placas de recolección de 96 pocillos y se liofilizaron durante 2 días. La maceración de los tejidos se realizó con un pulverizador de tejidos Kleco y esferas de wolframio (Kleco, Visalia, CA). Después de la maceración de los tejidos, el ADN genómico se aisló en formato de alta capacidad de procesamiento empleando el kit DNeasy 96 Plant (Qiagen, Germantown, MD) según el protocolo sugerido por el fabricante.
Se cuantificó el ADNg con el kit de ensayo de ADN Quant-IT Pico Green DNA (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). El ADNg cuantificado se ajustó a 10 ng/l para el ensayo Invader® o a 2 ng/l para el ensayo con sondas de hidrólisis empleando un manipulador de líquidos automático Biorobot3000 (Qiagen, Germantown, MD).
Third Wave Technologies (Madison, WI) desarrolló ensayos INVADER® adaptados para el análisis de pat dentro de colza. Las muestras de ADNg (7,5 l de ADNg 10 ng/l) primero se desnaturalizaron en formato de placas de 96 pocillos mediante incubación a 95 °C durante 10 minuto y después se enfriaron hasta la temperatura ambiente. Después se añadieron 7,5 l de la mezcla maestra (3 l de mezcla de sondas para pat y el gen de referencia interna HMG (Weng, 2005, Weng H. et al., (2005), J. AOAC Int., 88(2):577-584), 3,5 l de mezcla Cleavase XI FRET, y 1 l de disolución de enzima Cleavase XI/MgCl2) a cada pocillo, y se superpuso a las muestras una capa de aceite mineral. Las placas se sellaron y se incubaron a 63 °C durante 1 hora en un termociclador BioRad Tetrad. Las placas se enfriaron hasta la temperatura ambiente antes de leerse en un lector de placas de fluorescencia. Todas las placas contenían patrones de 1 copia, 2 copias y 4 copias, así como muestras control de tipo salvaje y pocillos de blanco que no contenían muestras.
Se recogieron lecturas para los canales de FAM (λ 485-528 nm) y RED (λ 560-620 nm) y, a partir de estas, se determinó el número de veces por encima de cero (es decir, el fondo) para cada canal para cada muestra mediante la señal bruta de la muestra dividida entre la señal bruta sin molde. A partir de estos datos se construyó una curva patrón y se determinó el mejor ajuste mediante análisis de regresión lineal. Utilizando los parámetros identificados a partir de este ajuste se calculó el número de copias de pat aparente para cada muestra.
Se realizó la determinación del número de copias del transgén mediante un ensayo con sondas de hidrólisis, análogo al ensayo TAQMAN®, con una PCR a tiempo real empleando el sistema LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Los ensayos se diseñaron para pat y el gen de referencia interno HMG utilizando el programa informático LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0. Para la amplificación se preparó una mezcla maestra de sondas de LIGHTCYCLER®480 Probes Master (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) a 1X concentración final en una reacción múltiplex con 10 l de volumen que contenía 0,4 M de cada cebador y 0,2 M de cada sonda (tabla 8). Se realizó una reacción de amplificación en dos etapas con una extensión a 60 °C durante 35 segundos con adquisición de fluorescencia. Todas las muestras se ensayaron por triplicado y se emplearon los valores de umbral de ciclo ("cycle threshold", Ct) promediados para el análisis de cada muestra.
El análisis de los datos de la PCR a tiempo real se realizó empleando el programa informático LIGHTCYCLER® versión 1.5 empleando el módulo de cuanto relativo y basado en el método ΔΔCt. Para esto, se incluye en cada ensayo una muestra de ADNg procedente de un calibrador de una sola copia y un comprobador conocido de 2 copias (idénticos a los empleados en los anteriores ensayos Invader).
Se detectó la presencia de otros módulos de expresión de genes contenidos en los acontecimientos de las plantas T0 mediante reacciones de PCR individuales. Se emplearon parejas de cebadores (tabla 9) específicos para las regiones codificadoras de estas cinco PTU.
Tabla 9. Información de cebadores y sondas para el ensayo con sondas de hidrólisis de pat y una referencia interna (HMG)
Nombre del cebador
Secuencia Detección
TQPATS
SEQ ID NO:12; 5’ ACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT 3’
TQPATA
SEQ ID NO:13; 5’ CTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACAGT 3’
TQPATFQ
SEQ ID NO:14; 5’ CY5-GGTGTTGTGGCTGGTATTGCTTACGCTGG-BHQ2 3’ Cy5
HMGF
SEQ ID NO:15; 5’ CCTCTCTACCACCGTCTCACATG 3’
HMGR
SEQ ID NO:16; 5’GATCTGGCCGGACTGTTTCA 3’
HMG-HEX
SEQ ID NO:17; 5’ CGCTCCTCAGCTACCACCTCAACCA-IB 3’ Hex
Las reacciones de PCR de OrfA de PUFA sintasa requieren dos reacciones de PCR distintas y diferentes
5 condiciones (por ejemplo, cebadores de PCR y condiciones de ciclado) para amplificar el marco de lectura abierto de la secuencia génica. Todas las reacciones de PCR se completaron empleando las condiciones descritas en la tabla 10 con 35 ciclos empleando el kit de PCR EX-TAQ (TaKaRa Biotechnology Inc., Otsu, Shiga, Japón) según las instrucciones del fabricante. Los productos de la PCR se resolvieron y se identificaron empleando una electroforesis en gel de agarosa TAE. Los tamaños de los fragmentos de gel esperados a partir de los productos de la PCR que
10 indicarían la presencia de una PTU de longitud completa se describen en la tabla 10 en la columna de "Tamaños esperados".

Tabla 10. Cebadores y condiciones de la PCR
1ª mitad de los cebadores de Orf A
pDAB7361
Secuencia Tamaños esperados Condiciones
MAS480 SEQ ID NO:18
CGAGTTCGGACTCAACATGTTCCA 2524 pb 94 ºC 3’
MAS554 SEQ ID NO:19
AAGGTTGACGCCAGCGACAACGAG 94 ºC 30’’
60 ºC
30’’
72 ºC
2’30’’
72 ºC
10’
4 ºC
∞
pDAB7362 y pDAB7363
Secuencia Tamaños esperados Condiciones
MAS547 SEQ ID NO:20
AAGTTTGGAGTTGGCTTCTGCAGC 2833 pb 94 ºC 3’
MAS581 SEQ ID NO:21
TGAGTTTGGTCTCAACATGTTCCA 94 ºC 30’’
60 ºC
30’’
72 ºC
2’30’’
72 ºC
10’
4 ºC
∞
2ª mitad de los cebadores de Orf A
pDAB7361
Secuencia Tamaños esperados Condiciones
MAS556 SEQ ID NO:22
GATGCACGCCAAGGTGGTTGACAT 2246 pb 94 ºC 3’
MAS481 SEQ ID NO:23
TAATGTAGAAGGGCTTGTCCTGCG 94 ºC 30’’
60 ºC
30’’
72 ºC
2’
72 ºC
10’
4 ºC
∞
pDAB7362 y pDAB7363
Secuencia Tamaños esperados Condiciones
MAS550 SEQ ID NO:24
GATGCACGCAAAGGTGGTTGACAT 2246 pb 94 ºC 3’
MAS572 SEQ ID NO:25
TGATGTAGAAGGGTTTGTCTTGTG 94 ºC 30’’
60 ºC
30’’
72 ºC
2’
72 ºC
10’
4 ºC
∞
Cebadores de Orf B
pDAB7361, pDAB7362, y pDAB7363
Secuencia Tamaños esperados Condiciones
MAS482 SEQ ID NO:26
CATGAGATGCATGACGAGAAGAGG 5476 pb 94 ºC 3’
MAS483 SEQ ID NO:27
TGGCAACTTGGTTCACTGTTCCAG 94 ºC 30’’
60 ºC
30’’
72 ºC
5’
72 ºC
10’
4 ºC
∞
Cebadores de Orf C quimérico
pDAB7361, pDAB7362, y pDAB7363
Secuencia Tamaños esperados Condiciones
MAS488 SEQ ID NO:28
CGCTTCGTGTCAAGACCAACAAGA 4354 pb 94 ºC 3’
MAS489 SEQ ID NO:29
GCACCACGCAAAATCTGAAGGTTG 94 ºC 30’’
60 ºC
30’’
72 ºC
5’
72 ºC
10’
4 ºC
∞
Cebadores de Acs-2
pDAB7361, pDAB7362,y pDAB7363
Secuencia Tamaños esperados Condiciones
MAS496 SEQ ID NO:30
GAACTTCTCTGAAACTGGTGTGGG 1827 pb 94 ºC 3’
MAS497 SEQ ID NO:31
TCACAGGCATCCTCAATGGTCTCA 94 ºC 30’’
60 ºC
30’’
72 ºC
1’30’’
72 ºC
10’
4 ºC
∞
Cebadores de HetI
pDAB7361, pDAB7362, y pDAB7363
Secuencia Tamaños esperados Condiciones
MAS500 SEQ ID NO:32
TCAGATGAGGTTCATCTCTGGAGG 576 pb 94 ºC 3’
MAS501 SEQ ID NO:33
ATCTGGCACAAGCTCCAACAGAGA 94 ºC 30’’
60 ºC
30’’
72 ºC
30’’
72 ºC
10’
4 ºC
∞
Se identificó un total de 197 acontecimientos de colza como positivos a pat a partir de los experimentos con sondas de hidrólisis e Invader. Quince de estos acontecimientos produjeron amplicones de PCR para los cinco módulos de expresión de genes (OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico, acil-CoA
5 sintetasa y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI) que estaban contenidos dentro del plásmido binario empleado para transformar las plantas. La tabla 11 indica los quince acontecimientos que se analizaron después para la producción de ácido docosahexaenoico (DHA). Estas plantas de colza T0 se cultivaron hasta la madurez en el invernadero y después se autopolinizaron. Las semillas T1 maduras se recolectaron y se analizaron para DHA mediante un análisis GC-FAME.
10 Tabla 11 -Detección por PCR de genes que producen ácido docosahexaenoico (DHA) en plantas de colza transgénicas
Nombre del plásmido
Nombre del acontecimiento Número de copias Reacciones de PCR
ORFA
ORFB ORFC SzACS-2 HetI
pDAB7361
5197[13]-010.001 1,3 + + + + +
5197[14]-032.002
1 + + + + +
5197[21]-052.001
4,3 + + + + +
5197[21]-053.001
4,6 + + + + +
5197[23]-054.001
8,2 + + + + +
pDAB7362
5217[6]-058.001 2,5 + + + + +
5217[6]-065.002
1,1 + + + + +
5217[1]-021.001
3,1 + + + + +
5217[4]-011.001
2,0 + + + + +
5217[2]-038.001
1,2 + + + + +
5217[2]-039.001
5,4 + + + + +
5217[6]-055.001
6,0 + + + + +
5217[6]-057.001
2,2 + + + + +
pDAB7363
5222[1]-026.001 6,3 + + + + +
5222[1]-004.001
1,7 + + + + +
5222[7]-029.002
2,6 + + + + +
Ejemplo 6: Detección de DHA en lípidos de semillas de colza transgénica
Se homogeneizaron muestras de semillas de colza (semillas individuales o muestras en masa) en triheptadecanoína que contenía heptano (preparación Nu-Chek) como patrón interno de triacilglicerol, empleando un molino de bolas de acero. Antes de la homogeneización se añadió una disolución 0,25 M de metóxido de sodio recién preparada (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en metanol. La extracción se realizó a 40 °C con agitación constante. Las recuperaciones se verificaron mediante la recuperación del ácido graso C17 sustituto metilado. La extracción de los FAME ("fatty-acid methyl esters", ésteres metílicos de ácidos grasos) se repitió tres veces y las capas de heptano se reunieron antes del análisis. Se verificó que la reacción se había completado comprobando la presencia de FAME endógenos en una cuarta extracción/derivatización. Los FAME resultantes se analizaron mediante GC-FID empleando una columna capilar BPX 70 de SGE (15 m x 0,25 mm x 0,25 M). Cada FAME se identificó mediante el tiempo de retención y se cuantificó mediante la inyección de una mezcla de referencia de aceite de colza de Matreya LLC (Pleasant Gap, PA) como patrón de calibración, con la adición de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga apropiados (Nu-Chek Prep, Elysian MN).
Se descubrió que el extracto de FAME que se corresponde con las semillas de siete acontecimientos contenía picos que se corresponden con DHA y DPA (n-6) tras los análisis de GC-FAME de las semillas T1 (tabulados a continuación en la tabla 12). La tabla 12 muestra que el número de semillas que contienen DHA varía (tal como se espera por la segregación de diversas copias del conjunto de transgenes insertados en el genoma de la colza), así como el contenido máximo den DHA observado en las semillas individuales.

Tabla 12 -Contenido en LC-PUFA de semillas T1 procedentes de siete acontencimientos de colza transgénica que contenían genes para la PUFA sintasa, SzACS-2 y HetI
Plásmido (pDAB)
Nombre del acontecimiento n.º de copias de PAT n.º de semillas positivas a DHA1 Contenido promedio en DHA2 Contenido promedio en DPA2 Promedio de PUFA totales3 Promedio n-3/PUFA4 Mayor contenido en DHA5
7361
5197[13]-010.001 1,3 75/96 0,36 0,15 0,51 70% 0,81
7361
5197[14]-032.002 1 67/96 0,43 0,12 0,55 78% 1,05
7361
5197[21]-052.001 4,3 5/24 0,02 0,01 0,03 81% 0,05
7361
5197[21]-053.001 4,6 32/48 0,07 0,03 0,11 64% 0,22
7362
5217[6]-058.001 2,5 13/48 0,36 0,23 0,61 60% 1,02
7362
5217[6]-065.002 1,1 16/48 0,15 0,09 0,25 61% 0,23
7363
5222[1]-026.001 6,3 46/48 0,09 0,05 0,16 59% 0,40
a.
Número de semillas que contienen DHA detectable/número total de semillas analizadas de la masa de T1.
b.
Promedio del contenido en DHA (% de los lípidos totales) de todas las semillas positivas a DHA.
c.
Promedio del contenido en PUFA (% de los lípidos totales) de todas las semillas positivas a DHA.
d.
Promedio del porcentaje de la proporción de DHA n-3/LC-PUFA totales (DHA+DPA n-6).
e.
El mayor contenido en DHA observado en una única semilla.
Se analizaron las semillas en desarrollo procedentes de un acontecimiento adicional y se descubrió que contenían DHA, pero la planta madura no produjo las suficientes semillas T1 como para realizar más análisis. Se confirmaron las identidades de los picos de los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA) mediante un análisis de espectrometría de masas y se compararon con los patrones auténticos (Nu-Chek Prep, Elysian, MN).
En la figura 5 se muestra el análisis de semillas individuales para el contenido en DHA de semillas T1 procedentes de un acontecimiento (acontecimiento 5197[14]-032.002). Las semillas individuales contenían hasta 1% de DHA (como porcentaje de los FAME totales). Los niveles de DHA parecen segregarse en tres clases (0, aproximadamente 0,4% y aproximadamente 0,9% de DHA), lo cual refleja una segregación de un único locus que contiene los genes productores de DHA.
Estos datos indican que se produce DHA en plantas transformadas con los plásmidos pDAB7361, pDAB7362 y pDAB7363. El plásmido pDAB7362 contiene las versiones optimizadas para plantas de los cinco genes (que codifican el OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico, acil-CoA sintetasa y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI) dirigidos por el promotor del gen de fitohemaglutinina-L de Phaseolus vulgaris. En pDAB7361, una secuencia del gen nativo del OrfA de PUFA sintasa (SzOrfA v2) reemplaza a la versión optimizada para plantas (SzOrfA v3). El pDAB7363 también es similar a pDAB7362, excepto que se añade un péptido de tránsito al cloroplasto de la cadena pequeña 1A de la ribulosa bifosfato carboxilasa de Arabidopsis thaliana al Nterminal del OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI para conducir estos polipéptidos al plástido.
Ejemplo 7: Detección de proteínas de PUFA sintasa en semillas de colza
Se detectaron los polipéptidos de PUFA sintasa en muestras de semillas transgénicas maduras mediante un análisis de la transferencia Western. Las semillas se prepararon para el análisis rompiendo las semillas secas con 2 esferas de acero inoxidable en un Kleco Bead Beater (Garcia Machine, Visalia, CA). Se añadió tampón de extracción (Tris 50 mM, EDTA 10 mM, SDS al 2%) y los tubos de las muestras se agitaron suavemente durante 30 minutos. Las muestras se centrifugaron durante 30 minutos a 3000 rcf. El sobrenadante se recogió y se empleó para el análisis. Se determinó la cantidad de proteína soluble total en el extracto de semillas mediante un ensayo de Lowry (BioRad, Hercules, CA). Las muestras se normalizaron a 1,55 mg/ml de proteína soluble total y se prepararon en tampón de muestras LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) con DTT 40 mM para una carga normalizada de 20 g de proteína soluble total por carril. Las muestras se sometieron a una electroforesis en geles de Tris acetato al 3-8% (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se trasladaron a membranas de nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon en tampón de bloqueo y se sondaron con anticuerpos contra los diferentes polipéptidos de OrfA, OrfB y OrfC de PUFA sintasa. Se emplearon el anti-A2-A de conejo, que se dirige contra la región A2 de la subunidad A de PUFA sintasa de Schizochytrium (SzPUFS-A) y el anti-B3-A de conejo, que se dirige contra la región B3 de la subunidad B de la PUFA sintasa de Schizochytrium (SzPUFS-B). La región B3 es la región de enoil reductasa (ER). También existe una región ER en la subunidad C, de modo que este antisuero reconoce ambas subunidades B y C en un ensayo de la transferencia Western. Se empleó un anticuerpo secundario marcado fluorescente anti-conejo (AF 633 anti-conejo de cabra (Invitrogen, Carlsbad, CA)) para la detección. Las transferencias se visualizaron en un aparato formador de imágenes fluorescentes a Typhoon Trio Plus (GE Healthcare, New Brunswick, NJ).
Las transferencias Western SDS-PAGE de extractos de semillas T1 en desarrollo de estadio tardío (>30 DAP) procedentes del acontecimiento 5197[14]-032.002 mostraron bandas del tamaño apropiado cuando se sondan con antisuero específico de Orf A, Orf B y Orf C (figura 6). Estas bandas también pueden observarse por tinción directa con azul de Coomassie. También se han detectado Orf A, Orf B y Orf C en muestras de semillas procedentes de los acontecimientos productores de DHA 5197[13]-010.001, 5197[21]-052.001, 5197[21]-053.001 y 5217[6]-065.002.
Se analizó un conjunto de semillas T2 en desarrollo recogidas 15, 20, 25, 30, 35, y 42 días después de la polinización (DAP) procedentes del acontecimiento de colza que produce DHA 5197[14]-032.002.Sx002 para el contenido en lípidos (figura 7a) y la presencia de los polipéptidos de OrfA, OrfB y OrfC mediante un análisis de la transferencia Western (figura 7b).
Se detectó la expresión de los tres polipéptidos en semillas en desarrollo a los 30 y 35 días después de la polinización, y se detectó de una manera destacada a los 42 días después de la polinización y en semillas maduras (figuras 7a y 7b).
Ejemplo 8: Niveles de DHA, DPA y EPA en semillas de colza T2
Se plantaron semillas T1 procedentes del acontecimiento 5197[14]-032.002 en el invernadero y se tomaron muestras de hojas de 96 plantas en la etapa de 4-5 hojas para un análisis del ADN para determinar el número de copias del transgén en cada planta segregante T1. Esto se realizó mediante ensayos con sondas de hidrólisis del gen pat, empleando el protocolo descrito anteriormente, y se identificaron tres clases diferenciadas de segregantes: 21 plantas homocigóticas, 45 plantas heterocigóticas y 30 plantas nulas. Todas las plantas homocigóticas y 31 plantas nulas se cultivaron hasta la madurez en el invernadero y se recogieron las semillas. El promedio de rendimiento de semillas T2 por planta de las plantas homocigóticas y nulas fue de 7,36 g y 8,61 g, respectivamente.
Se determinó el contenido en ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA) de las semillas T2 procedentes de las plantas T1 del acontecimiento 5197[14]-032.002 cultivadas en invernadero sobre extracciones en masa de 8-12 semillas mediante análisis GC-FAME, según se describió previamente. También se cultivaron hasta la madurez 21 plantas segregantes nulas como controles. El contenido en LC-PUFA de las plantas homocigóticas se muestra en la figura 8. No se detectaron LC-PUFA en las semillas de ninguno de los segregantes nulos. Veinte de las líneas transgénicas produjeron entre 0,28% y 0,90% de DHA en los análisis de semillas en masa y una línea no produjo ningún LC-PUFA. Las semillas que contenían DHA también contenían entre 0,09 y 0,34% de DPA (n-6). La proporción promedio de DHA en los PUFA totales (DHA+DPA) fue del 77%.
La composición de ácidos grasos de las semillas de cuatro líneas que producen más de 0,7% de DHA se muestra en la tabla 13 en comparación con la de las cuatro líneas segregantes nulas.
032.002

Tabla 13 -Composición de ácidos grasos de la masa de semillas T2 procedentes de cuatro líneas transgénicas y cuatro segregantes nulos del acontecimiento 5197[14]
ID de la línea
Zigosidad C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0 C22:1 C24:0 C22:5 C22:6
5197-[14]-032.002.Sx002.012
HOMO 0,05 3,49 0,24 1,69 76,33 10,87 3,80 0,67 1,25 0,39 0,02 0,18 0,28 0,74
5197-[14]-032.002.Sx002.093
HOMO 0,07 3,50 0,24 1,67 76,10 11,39 3,63 0,60 1,21 0,33 0,02 0,16 0,32 0,77
5197-[14]-032.002.Sx002.050
HOMO 0,05 3,43 0,24 1,87 77,73 9,72 3,48 0,70 1,18 0,39 0,02 0,19 0,20 0,80
5197-[14]-032.002.Sx002.010
HOMO 0,06 3,48 0,24 1,70 75,53 11,63 3,73 0,62 1,22 0,36 0,02 0,16 0,34 0,90
5197-[14]-032.002.Sx002.011
NULO 0,06 3,59 3 1,68 76,56 12,08 3,24 0,68 1,29 0,37 0,03 0,20 0,00 0,00
5197-[14]-032.002.Sx002.032
NULO 0,06 3,63 0,25 1,60 76,28 12,21 3,33 0,67 1,31 0,40 0,03 0,23 0,00 0,00
5197-[14]-032.002.Sx002.037
NULO 0,05 3,74 0,25 1,61 77,46 10,78 3,35 0,70 1,37 0,42 0,01 0,26 0,00 0,00
5197-[14]-032.002.Sx002.048
NULO 0,06 3,61 0,24 1,61 75,83 12,54 3,67 0,64 1,24 0,35 0,01 0,19 0,00 0,00
Se realizó un análisis de semillas individuales de 48 semillas T2 procedentes de seis líneas de plantas T1 homocigóticas (4, 35, 63, 96, 50, y 106). Un análisis detallado del perfil de GC-FAME demostró que siempre estaba presente un pico adicional en las semillas que contenían DHA y DPA. Este se identificó como C20:5(n-3) EPA por comparación con un patrón auténtico (NU-Chek). El tiempo de retención se corresponde con el del EPA (C20:5 (n3)) auténtico, y la masa molecular nominal determinada mediante GC-MS con PolarisQ fue idéntica.
En la figura 9 se muestra un resumen de los LC-PUFA de análisis de semillas T2 individuales procedentes de las seis líneas homocigóticas. Se encontraron semillas individuales con un contenido en DHA de hasta 1,6%. Además, se identificaron plantas con un contenido en EPA de hasta 0,27%.
Se realizaron cruzamientos recíprocos entres dos líneas T1 y Nexera710 no transformada. Las semillas progenitoras y las semillas híbridas F1 resultantes se analizaron para el contenido en DHA (figura 10). En la figura 10, los rombos representan el ANOVA promedio para cada categoría descrita en el eje de abscisas. La barra vertical representa el promedio para la categoría, y la distancia entre el extremo del rombo es el intervalo de confianza del 95%. El nivel promedio de acumulación de DHA en las semillas F1 (0,29% y 0,28%) es la mitad de lo que acumulan las semillas de progenitor transgénico (0,51% y 0,47%). A partir de este resultado puede deducirse una correlación cuantitativa del fenotipo y el nivel de cigosidad.
En resumen, estos datos demuestran que el rasgo de DHA conferido por los cinco transgenes es heredable y se mantiene en la segunda generación.
Ejemplo 9: Producción de DHA en semillas T2 del acontecimiento de colza 10
Sesenta semillas T1 procedentes del acontecimiento de colza 5197[13]-010.001 (que contiene dos copias del gen pat, tal como se muestra en la figura 11) se plantaron en el invernadero. Unos ensayos con sondas de hidrólisis del gen pat identificaron cinco clases diferenciadas de segregantes, que se corresponden con 0-4 copias del gen pat.
Los dos loci que se corresponden con las inserciones transgénicas pueden distinguirse mediante un análisis de la transferencia Southern (denominados locus A y B). Se analizó el ADN procedentes de todas las plantas que contenían dos copias de pat mediante transferencia Southern para determinar su genotipo (homocigótico para el locus A o el locus B, o hemicigótico para ambos loci). También se analizaron cuatro plantas de una sola copia y dos plantas control nulas como controles. Todas las plantas T1 se cultivaron hasta la madurez en el invernadero. Las semillas se recolectaron y se analizaron con análisis de semillas en masa para determinar el contenido en LC-PUFA (tabla 14).
101.001 (los promedios se compararon mediante el ensayo de HSD de Tukey-Kramer, y los niveles no conectados con la misma letra son significativamente diferentes):

Tabla 14 -Contenido en LC-PUFA de semillas T2 procedentes de segregantes T1 del acontecimiento 5197[13]
Genotipo
n.º de copias dePAT n.º de plantas T1 analizadas Promedio del contenido de LC-PUFA % del total de FAME EE Significancia estadística
Nulo
0 5 0,00 0,07 d
Hemicigótico en el locus A
1 2 0,47 0,11 ab
Hemicigótico en el locus B
1 2 0,02 0,11 bcd
Hemicigótico en el locus A y B
2 13 0,15 0,04 bcd
Homocigótico en el locus A
2 4 0,65 0,08 a
Homocigótico en el locus B
2 5 0,00 0,07 cd
Homocigótico en un locus, hemicigótico en el otro
3 13 0,03 0,04 d
Homocigótico en el locus A y B
4 5 0,00 0,07 d
Estos datos demuestran que las plantas que son homocigóticas en el locus A del acontecimiento 5197[13]-010.001 dirigen la producción de LC-PUFA, mientras que los homocigotos del locus B no lo hacen. Además, el locus B interfiere con la producción de LC-PUFA, puesto que los homocigotos dobles de cuatro copias producen niveles muy bajos de DHA, así como las plantas de tres copias. De modo similar, las plantas de locus A de una sola copia hemicigóticas producen 0,47% de LC-PUFA, mientras que las plantas de locus B de una sola copia hemicigóticas producen niveles muy bajos de LC-PUFA (0,02%).
La composición de grasas completa determinada mediante análisis de GC-FAME de la masa de semillas T2 procedentes de plantas derivadas del acontecimiento 5197[13]-010.001 que eran homocigóticas en el locus A (y nulas en el locus B) se muestra en la tabla 15.

Tabla 14 -Composición de ácidos grasos de semillas T2 procedentes del acontecimiento 5197[13]-010.001 homocigóticas en el locus A
ID de la línea
C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0 C22:1 C20:5 C24:0 C22:5 C22:6
5197[13]-010.Sx001.008
0,05 3,46 0,23 0,57 79,40 10,23 3,09 0,65 1,28 0,38 0,02 0,04 0,20 0,12 0,28
5197[13]-010.Sx001.015
0,05 3,53 0,25 1,42 78,36 10,57 3,17 0,61 1,07 0,32 0,02 0,04 0,16 0,12 0,31
5197[13]-010.Sx001.050
0,05 3,60 0,24 1,72 77,40 10,73 3,15 0,59 0,99 0,28 0,03 0,05 0,13 0,33 0,70
5197[13]-010.Sx001.051
0,05 3,63 0,26 1,48 78,41 10,32 3,01 0,58 1,11 0,34 0,02 0,04 0,15 0,18 0,41
Ejemplo 10: Producción en campo de DHA en colza
Las semillas T2 procedentes de diez líneas homocigóticas de 5197[14]-032.002 que contenían los niveles más altos de DHA se reunieron para producir 60 g de semillas. También se reunieron las semillas de 10 líneas segregantes nulas para obtener 47 g de semillas para su uso como control negativo. Las semillas se plantaron en dos 5 localizaciones en Dakota del Norte en mayo del 2009, con 8 parcelas de semillas que contienen transgenes, 6 parcelas de semillas de segregantes nulos y dos parcelas de un control del mercado (Nexera 845CL) en cada localización. Todas las parcelas de plantas transgénicas y cuatro de las parcelas de segregantes nulos se cubrieron con jaulas de aislamiento durante la floración. Las dos parcelas de nulos restantes y las parcelas de Nexera 845CL se dejaron sin cubrir. Las parcelas se segaron y se recolectaron en septiembre según la práctica normal. En el sitio
10 1, se obtuvo un promedio por parcela de 0,95 kg de semillas procedentes de las plantas transgénicas y de 0,99 kg procedentes de las plantas nulas. En el sitio 2, el promedio por parcela fue de 0,64 kg procedentes de las plantas transgénicas y de 0,73 kg procedentes de las plantas nulas. Se realizó un análisis de GC-FAME de lípidos de cada parcela para determinar los niveles de LC-PUFA en semillas cultivadas en el campo (tabla 16).
Tabla 16 -Contenido en DHA de semillas T3 mediante un análisis en masa de 10 semillas procedentes de plantas T2 15 cultivadas en el campo de 5197[14]-032.002
Sitio
Parcela Contenido promedio de DHA (% de FAME totales) Contenido promedio de LC-PUFA (% de FAME totales)
Sitio 1
1-11 (homo) 0,01% 0,02%
Sitio 1
1-12 (homo) 0,18% 0,27%
Sitio 1
1-17 (homo) 0,13% 0,19%
Sitio 1
1-18 (homo) 0,21% 0,33%
Sitio 1
1-21 (homo) 0,17% 0,26%
Sitio 1
1-23 (homo) 0,21% 0,32%
Sitio 1
1-27 (homo) 0,30% 0,44%
Sitio 1
1-28 (homo) 0,15% 0,23%
Sitio 1
1-13 (herm nulo) 0,00% 0,00%
Sitio 1
1-15 (herm nulo) 0,00% 0,00%
Sitio 1
1-16 (herm nulo) 0,00% 0,00%
Sitio 1
1-22 (herm nulo) 0,00% 0,00%
Sitio 1
1-24 (herm nulo) 0,00% 0,00%
Sitio 1
1-26 (herm nulo) 0,00% 0,00%
Sitio 1
1-25_Nexera845 0,00% 0,00%
Sitio 2
2-11 (homo) 0,24% 0,37%
Sitio 2
2-13 (homo) 0,19% 0,27%
Sitio 2
2-17 (homo) 0,23% 0,36%
Sitio 2
2-18 (homo) 0,32% 0,48%
Sitio 2
2-21 (homo) 0,38% 0,56%
Sitio 2
2-23 (homo) 0,27% 0,41%
Sitio 2
2-26 (homo) 0,33% 0,47%
Sitio 2
2-28 (homo) 0,16% 0,24%
Sitio 2
2-12 (herm nulo) 0,00% 0,00%
Sitio 2
2-14 (herm nulo) 0,00% 0,00%
Sitio 2
2-16 (herm nulo) 0,00% 0,00%
Sitio 2
2-22 (herm nulo) 0,00% 0,00%
Sitio 2
2-25 (herm nulo) 0,00% 0,00%
Sitio 2
2-27 (herm nulo) 0,00% 0,00%
Sitio 2
2-15_Nexera845 0,00% 0,00%
Los resultados de la tabla 16 representan el análisis de tres muestras de cada parcela. Las semillas de la parcela 111 contenían niveles más bajos de 18:1 (65,5%) y niveles más altos de 18:3 (7,6%) comparadas con las parcelas del sitio 1 (promedio de 76,7% de 18:1 y de 2,9% de 18:3) y, por tanto, se consideró que estaban muy contaminadas por colza convencional. Esta parcela se excluyó de posteriores análisis. El contenido promedio en DHA del análisis en masa de 10 semillas T3 procedentes de las plantas transgénicas procedentes del sitio 1 fue de 0,19% y del sitio 2 de 0,26%. El mayor contenido en DHA fue de 0,38% (con 0,03% de EPA). El porcentaje promedio de la proporción de n-3 LC-PUFA/PUFA totales fue de 73%.
También se cultivaron en el invernadero muestras de cada línea T2 utilizada en el ensayo de campo. El contenido promedio en DHA del análisis en masa de 10 semillas T3 del invernadero fue de 0,22% y las plantas individuales contenían hasta 0,8% de DHA. Esto se correlaciona con la cantidad de DHA producida en el campo.
Estos datos demuestran que este juego de genes de PUFA sintasa puede dirigir la producción de DHA en condiciones de campo.
Ejemplo 11: Análisis de la expresión de genes de DHA empleando la tecnología de micromatrices
Se recogieron semillas de colza en desarrollo a partir de la línea del acontecimiento homocigótico transgénico 5197[14]-032.002 y plantas nulas no transformadas a los 15, 20, 25, 30, 35 y 42 días después de la polinización ("days after pollination", DAP). Se empleó un diseño de perfiles de expresión de genes global de un único color para determinar los niveles de expresión de cada uno de los genes recién introducidos en la línea transformada homocigótica con relación a la línea nula no transformada para cada uno de los momentos del tiempo definidos durante el desarrollo de las semillas. Se amplificaron tres duplicados técnicos idénticos de matrices de oligonucleótidos 60-meros individuales (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) con un ARNc marcado con Cy3 amplificado de cada muestra. Se empleó una matriz de oligonucleótidos de colza de amplitud del transcriptoma completo de 60-meros (eArray, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA), diseñada especialmente, para realizar las hibridaciones previamente descritas. Esta matriz contiene más de 37.000 transcripciones de colza diferentes (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) obtenidas de fuentes de datos públicas. Para medir con eficacia los niveles de expresión de cada transcripción, los oligonucleótidos presentes en la matriz se diseñaron para que fueran exclusivos y específicos para cada diana para hibridarse de modo eficaz con la secuencia diana predicha. Los oligonucleótidos que forman un dúplex con más de una transcripción se eliminaron de la matriz. Cada oligonucleótido también satisface las propiedades químicas y físicas requeridas para una actuación óptima a lo largo del procesamiento de la micromatriz. Además, en la matriz de oligonucleótidos de colza diseñada especialmente también estaban representados oligonucleótidos específicos y exclusivos que representan los genes recién introducidos, así como varios otros genes de interés. Los oligonucleótidos 60-meros se sintetizaron in situ empleando la tecnología Sure-Print del fabricante.
Aislamiento y purificación del ARN
Se congelaron muestras de semillas en desarrollo procedentes del acontecimiento 5197[14]-032.002 y una planta control nula y se reunieron para ser utilizadas como material de partida para el aislamiento y la purificación del ARN. Un total de 500 mg de tejido de semillas por muestra reunida se trituró con nitrógeno líquido empleando un mortero y una mano de mortero y se resuspendieron aproximadamente 50 mg del tejido triturado en 450 l de tampón de extracción RLT del kit RNeasy Kit para la extracción del ARN (Qiagen, Valencia, CA). Las muestras se agitaron en vórtice brevemente para romper los tejidos antes de continuar con el protocolo de extracción. El ARN total se purificó siguiendo las instrucciones del kit RNeasy para la extracción del ARN (Qiagen, Valencia, CA). Después el ARN total purificado se cuantificó empleando un espectrofotómetro NanoQuant (TECAN, Research Triangle Park, NC) y se visualizó con una electroforesis en gel de agarosa al 1% convencional.
Para el marcaje, un total de 1,0 g del ARN total purificado de cada muestra se sometió a una transcripción inversa, se amplificó y se marcó con Cy3-CTP siguiendo el protocolo de marcaje de QuickAmp de expresión de genes basada en micromatrices de un único color de Agilent (Santa Clara, CA). Puesto que cada matriz de colza contiene más de 1300 controles internos sembrados, también se marcó un kit de siembra de ARN de un único color (Agilent, Santa Clara, CA) según las instrucciones del fabricante. Las muestras se sometieron a una transcripción inversa
empleando la transcriptasa inversa de MMLV y se amplificaron empleando la ARN polimerasa de T7. Después de la amplificación, el ARNc se purificó empleando columnas de minicentrifugación RNeasy de Qiagen y se cuantificó empleando un espectrofotómetro NanoQuant (TECAN, Research Triangle Park, NC). Se determinó la actividad específica de Cy3 mediante la siguiente fórmula: (concentración de Cy3/(concentración de ARNc) * 1000 = pmol de Cy3 por g de ARNc. Las muestras para la hibridación se normalizaron a 1,65 g con una actividad específica > 9,0 pmol de Cy3 por g de ARNc.
Hibridación, selección y extracción de características
Las matrices de expresión de genes oligonucleotídicas se hibridaron empleando el kit de hibridación de expresión de genes y el kit de tampón de lavado de Agilent Technologies (Santa Clara, CA). Las hibridaciones se realizaron en una estación de hibridación TECAN HS4800 PRO (TECAN, Research Triangle Park, NC) totalmente automática. La mezcla de hibridación se inyectó a 65 °C y se incubó con agitación durante 17 hr después de realizar una etapa de prehibridación de los portaobjetos a 65 °C durante 30 segundos. Después los portaobjetos se lavaron a 37 °C durante 1 minuto empleando el lavado n.º 1 de Agilent GE, seguido de un segundo lavado a 30 °C con lavado n.º 2 de Agilent GE durante 1 minuto y una etapa de secado final empleando nitrógeno gaseoso durante 2 minutos y 30 segundos a 30 °C. Los portaobjetos se escanearon inmediatamente para minimizar el impacto de los oxidantes ambientales sobre las intensidades de las señales.
Las matrices se escanearon empleando un escáner de micromatrices Agilent G2565CA con la tecnología de alta resolución SureScan (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). El protocolo para escanear cada matriz define parámetros para el canal de tinte, la región y resolución del escaneado, el intervalo dinámico del archivo TIFF, la ganancia PMT y los ajustes para el resultado de la imagen final. Tras haber escaneado la matriz, se sigue un protocolo de extracción de características ("feature extraction", FE), empleando parámetros definidos para la colocación y la optimización del ajuste de matriz, el descubrimiento de las manchas, el marcaje de los valores extraños, el cálculo del sesgo de fondo, el error y las proporciones, y el cálculo de la métrica del control de calidad. Después de completar los protocolos de escaneado y de extracción de características se genera un archivo TIFF que contiene la imagen de Cy3, junto con el informe de la métrica de control de calidad y un archivo final (TXT) que contiene todos los datos brutos. Los archivos de imágenes (TIFF) se emplearon para estudiar la calidad general de los portaobjetos, la presencia de controles sembrados en las posiciones correctas (las cuatro esquinas) y sus intensidades, así como para confirmar que los procesos de hibridación, lavado, escaneado y extracción de características se habían realizado con éxito. El informe de control de calidad (QC) de FE proporciona los valores del coeficiente de variación, que permiten medir la dispersión de los datos basándose en controles sembrados positivos y negativos (genes procariotas y secuencias artificiales) proporcionados y diseñados por Agilent Technologies (Santa Clara, CA). Este informe también proporciona información acerca de la distribución de los datos, la uniformidad, el fondo, la reproducibilidad, la sensibilidad y la calidad general de los datos. El archivo TXT que contiene todos los datos brutos se carga en GeneSpring (Agilent, Santa Clara, CA) para su posterior análisis.
Normalización de los datos y análisis estadístico
Después del escaneado y de la extracción de características, los archivos de datos brutos se cargan en GeneSpring GX versión 10.0.2 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y se crea un proyecto que define cada archivo de datos de matrices como una muestra y que asigna los valores apropiados de los parámetros. Las muestras con los mismos valores de parámetros se tratan como duplicados. Se crearon interpretaciones para especificar el modo en que se agrupan las muestras en condiciones experimentales, y estas se emplearon para visualizar y analizar los datos. Se realizó un control de calidad en muestras basado en controles sembrados, parámetros e interpretaciones previamente definidas, para asegurar la calidad de los datos antes de comenzar el análisis, y GeneSpring generó un informe de la métrica de control de calidad.
Los datos se normalizaron empleando un método de normalización de desplazamiento de percentiles global para minimizar las diferencias no biológicas sistemáticas y para estandarizar las matrices para comparaciones cruzadas. Este algoritmo transforma intensidades de señales en logaritmos de base 2 y los dispone en orden creciente, calculando el rango del 75º percentil y restando este valor de cada una de las intensidades de señal transformadas logarítmicamente para generar el valor de intensidad normalizado. Los datos se filtraron seleccionando las entidades que estaban marcadas como presentes en cada muestra individual estudiada y eliminando las entidades marcadas como marginales o ausentes. La lista de entidades filtradas y normalizadas se empleó como entrada para el análisis estadístico empleando un método ANOVA de dos vías con un valor de corte p corregido de p < 0,05 que define DAP y genotipo como parámetros. Se determinó el perfil de expresión para cada uno de los genes recién introducidos.
Resultados
Los valores obtenidos para la concentración del ARN total, así como del ARNc marcado y amplificado, fueron óptimos. Además, los valores para la concentración después de la amplificación, la eficacia del marcaje con Cy3 y la actividad específica necesaria para obtener unos resultados constantes y fiables fueron excelentes. El informe de control de calidad (QC) proporcionado por el protocolo de extracción de características para cada matriz individual después del escaneado proporciona los valores del coeficiente de variación que se emplean para medir la dispersión de los datos basándose en los controles sembrados positivos y negativos. Todos los valores obtenidos a partir de los
informes muestran una calidad óptima de los datos, la distribución, la uniformidad, el fondo y la sensibilidad. El informe de la métrica de control de calidad de GeneSpring (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) empleado durante este estudio proporciona unos valores estadísticos significativos que ayudan a la evaluación de la reproducibilidad y la fiabilidad de los datos obtenidos. Los valores indicados para los grupos de matrices
5 técnicamente duplicadas (3 por muestra) están dentro de rango e indican que los datos obtenidos son fiables (los datos no se muestran).
Los valores brutos indicados para cada uno de los seis momentos del tiempo definidos durante el desarrollo de las semillas para las líneas homocigóticas (tabla 17) ("DAP" representa los días después de la polinización) y nulas (tabla 18) representan los valores de intensidad de señal que quedan después de haber completado todas las
10 etapas de procesamiento de extracción de características (FE), que incluyen la sustracción del fondo y la eliminación de tendencias multiplicativa cuando fue necesario. Por otra parte, los valores normalizados para las líneas homocigóticas (tabla 19) y nulas (tabla 20) se han procesado empleando un método de normalización de desplazamiento de percentiles global que toma en cuenta la variación técnica, minimiza las diferencias no biológicas sistemáticas y estandariza las matrices para comparaciones cruzadas.
57 58

Tabla 17 -Valores brutos de intensidad de la expresión para cada uno de los genes recién introducidos en el acontecimiento homocigótico 5197[14]-032.002
ID del oligonucleótido
Contig_ID 15 DAP 20 DAP 25 DAP 30 DAP 35 DAP 42 DAP
BnOL1037472
SzPUFA_OrfA_v2 550,5884 1555,393 10616,878 55336,754 53827,918 168238,69
BnOL1037031
SzACS-2_ v3 735,7014 7502,7305 53598,45 160619,44 125797,09 149734,28
BnOL1037030
hSzThPUFA_ OrfC_ v3 278,55338 6337,2075 41672,094 101111,23 65916,695 79815,85
BnOL1037032
NoHetl_v3 438,25513 2608,736 22412,197 84830,35 72039,04 81936,24
BnOL1037029
SzPUFA_OrfB_ v3 20,972246 319,27515 3329,6416 8812,985 4742,8223 9504,665
BnOL1037034
PAT_v5 1433,2236 3672,4446 6221,7075 6744,2925 1784,8667 5964,65
Tabla 18 -Valores brutos de intensidad de la expresión para cada uno de los genes recién introducidos en la línea Omega-9 Nexera 710 no transformada nula
ID del oligonucleótido
Contig_ID 15 DAP 20 DAP 25 DAP 30 DAP 35 DAP 42 DAP
BnOL1037472
SzPUFA_OrfA_v2 24,637857 13,909026 18,128113 17,591684 21,86625 22,927202
BnOL1037031
SzACS-2_ v3 4,892006 1,9428447 4,488978 33,388905 4,234072 5,6000123
BnOL1037030
hSzThPUFA_ OrfC_ v3 19,027159 14,894593 24,208069 20,789322 20,698792 16,794432
BnOL1037032
NoHetl_v3 3,1428213 1,9340261 4,188954 3,1923647 17,189857 4,665717
BnOL1037029
SzPUFA_OrfB_ v3 2,3353922 3,9272563 6,6409183 3,3479385 3,8365993 32,812595
BnOL1037034
PAT_v5 3,3936017 2,7436378 4,193728 35,491924 11,871919 27,160715

Tabla 20 -Valores de intensidad normalizados de la expresión para cada uno de los genes recién introducidos en el acontecimiento homocigótico 5197[14]-032.002
ID del oligonucleótido
Contig_ID 15 DAP 20 DAP 25 DAP 30 DAP 35 DAP 42 DAP
BnOL1037472
SzPUFA_OrfA_v2 1,7016697 3,3545377 6,0190024 8,880801 9,054455 11,272922
BnOL1037031
SzACS-2_ v3 1,8789514 5,3857155 8,116115 10,176245 10,039913 10,870583
BnOL1037030
hSzThPUFA_ OrfC_ v3 1,4449383 6,1070085 8,718198 10,475076 10,072738 10,922383
BnOL1037032
NoHetl_v3 1,887683 4,618933 7,613214 10,01268 9,989469 10,756434
BnOL1037029
SzPUFA_OrfB_ v3 -0,7546156 3,3309612 6,6095963 8,492256 7,811666 9,391258
BnOL1037034
PAT_v5 1,9656178 3,4748821 4,1320724 4,72564 3,0201833 5,337647
Tabla 21 -Valores de intensidad normalizados de la expresión para cada uno de los genes recién introducidos en la línea Omega-9 Nexera 710 no transformada nula
ID del oligonucleótido
Contig_ID 15 DAP 20 DAP 25 DAP 30 DAP 35 DAP 42 DAP
BnOL1037472
SzPUFA_OrfA_v2 -2,6522558 -3,253315 -3,0071614 -2,8780248 -2,3888729 -2,038585
BnOL1037031
SzACS-2_ v3 -5,3231525 -6,39583 -5,3554688 -5,8499255 -1,9909037 -4,2954717
BnOL1037030
hSzThPUFA_ OrfC_ v3 -2,3083773 -2,42181 -1,8761693 -1,9263924 -1,7606672 -1,6746639
BnOL1037032
NoHetl_v3 -5,2632127 -5,647943 -4,671536 -5,151732 -2,2263987 -3,93217
BnOL1037029
SzPUFA_OrfB_ v3 -3,8752975 -2,9589367 -2,3685415 -3,026766 -2,905297 0,8310469
BnOL1037034
PAT_v5 -6,7221875 -6,835022 -6,305078 -3,753248 -4,357948 -2,8239324
La representación esquemática de los valores brutos (figura 12) y normalizados (figura 13) obtenidos para la línea nula en todos los momentos del tiempo durante el desarrollo de las semillas confirma que estos genes no están presentes en la línea no transformada Omega-9 Nexera 710 y, por tanto, no se detecta una expresión significativa. En la línea del acontecimiento 5197[14]-032.002, tal como se muestra en la figura 14 (brutos) y figura 15 (normalizados), puede observarse una tendencia general a un aumento de la acumulación de transcripciones de todos los genes a medida que avanza el desarrollo de las semillas. El aumento inicial significativo de la acumulación de las transcripciones se produce durante 15 y 30 DAP y alcanza unos niveles máximos en DAP 42. Las curvas brutas mostradas en la figura 14 proporcionan una visualización de los valores de intensidad de hibridación relativos obtenidos para cada uno de los genes estudiados, mientras que las curvas normalizadas resumidas en la figura 15 representan la tendencia general de los perfiles de expresión de genes con la variación no biológica sistemática minimizada y comparaciones estandarizadas a través de matrices.
Ejemplo 12: Expresión del juego de genes de PUFA sintasa de algas empleando promotores alternativos
El uso de otros elementos reguladores de la transcripción para expresar el gen o genes que codifican las proteínas de OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico, acil-CoA sintetasa y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI puede aumentar aún más el contenido en DHA en colza. La identificación y el uso de elementos reguladores de la transcripción que se expresan en una etapa más temprana del desarrollo y durante periodos largos de tiempo puede aumentar los niveles de DHA en las semillas de colza por medio de la estimulación de la transcripción de un gen heterólogo en etapas más tempranas del desarrollo de las semillas (por ejemplo, de 15 a 25 DAP) y, por tanto, se extiende el tiempo de producción de DHA. Los ejemplos de dichas regiones reguladoras de la transcripción incluyen, pero no se limitan al promotor LfKCS3 (patente de EE. UU. n.º 7.253.337), el promotor FAE 1 (patente de EE. UU. n.º 6.784.342) y el promotor ACP (documento WO 1992/18634). Estos promotores se emplean de modo individual o en combinación para dirigir la expresión de los módulos de expresión de OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico, acil-CoA sintetasa y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI, que previamente se han descrito en los siguientes plásmidos: pDAB7361, pDAB7362, y pDAB7363. Los métodos para reemplazar regiones reguladoras de la transcripción dentro de un plásmido son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, un fragmento de polinucleótido que comprende el promotor v2 de PvDlec2 se retira de pDAB7361, pDAB7362, o pDAB7363 (o los plásmidos anteriores utilizados para construir pDAB7361, pDAB7362, o pDAB7363) y se reemplaza por las regiones de los promotores LfKCS3 o FAE 1. Los plásmidos recién construidos se emplean para transformar plantas de colza de modo estable. Las plantas de colza transgénicas se aíslan y se caracterizan molecularmente. Se determina la acumulación de LC-PUFA resultante y se identifican las plantas de colza que producen de 0,01% a 15% de DHA o de 0,01% a 10% de EPA.
Construcción de pDAB9166
Se construyó el plásmido pDAB9166 (figura 26; SEQ ID NO:46) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB9166 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v1 de LfKCS3, SzPUFA OrfA v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v1 de LfKCS3, SzPUFA OrfB v3 y AtuOrf23 3’ UTR v1. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v1 de LfKCS3, hSzThPUFA OrfC v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v1 de LfKCS3, NoHetI v3 y AtuORF23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB9161, pDAB9162, pDAB9163, pDAB101484 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB9166. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB9167
Se construyó el plásmido pDAB9167 (figura 27; SEQ ID NO:47) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB9167 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v1 de LfKCS3, SzPUFA OrfA v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v1 de BoACP, BoACP 5’ UTR v1, SzPUFA OrfB v3 y AtuOrf23 3’ UTR v1. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v1 de LfKCS3, hSzThPUFA OrfC v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v1 de BoACP, BoACP 5’ UTR v1, NoHetI v3 y AtuORF23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB9161, pDAB9165, pDAB9163, pDAB101485 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB9167. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB7379
El plásmido pDAB7379 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones reconstruidas con codones optimizados de SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC, y NoHetI. La secuencia del gen SzACS-2 no se incluyó en esta construcción. Se construyó el plásmido pDAB7379 (figura 28; SEQ ID NO:48) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios.
El pDAB7379 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v3 y AtuORF23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB7371, pDAB7372, pDAB7373, pDAB7374 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB7379. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB7380
El plásmido pDAB7380 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones reconstruidas con codones optimizados de SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC, y NoHetI. La secuencia del gen SzACS-2 no se incluyó en esta construcción. La versión del promotor de faseolina empleada en esta construcción fue modificada fundamentalmente como se describe en Bustos et al., 1989 (The Plant Cell, vol. 1, 839-853), en la que la porción 5’ del promotor está truncada y la región no traducida 5’ de faseolina se deja intacta. Se construyó el plásmido pDAB7380 (figura 29; SEQ ID NO:49) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios.
El pDAB7380 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v5 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v3 y AtuORF23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB7375, pDAB7376, pDAB7377, pDAB7378 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB7380. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB9323
El pDAB9323 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones nativas con codones no optimizados de SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC, SzACS-2, y NoHetI. Se construyó el plásmido pDAB9323 (figura 30; SEQ ID NO:50) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios.
El pDAB9323 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de acil-CoA sintetasa, una PTU de fosfopanteteinilo
transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfA v2, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v2, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfC v2, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La PTU de acil-CoA sintetasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, el gen SzACS-2 v2, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v2, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido).
Los plásmidos pDAB9307, pDAB9311, pDAB9315, pDAB9322 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB9323. De modo específico, las cinco PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v2, SzPUFA OrfB v2, SzPUFA OrfC v2, NoHetI v2. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las seis PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las seis PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB9330
El pDAB9330 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones reconstruidas con codones optimizados de SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC, SzACS-2, y NoHetI. Se construyó el plásmido pDAB9330 (figura 31; SEQ ID NO:51) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB9330 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de acil-CoA sintetasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3’ UTR y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La PTU de acil-CoA sintetasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, el gen SzACS-2 v3, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v3, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido).
Los plásmidos pDAB9324, pDAB9325, pDAB9326, pDAB9329 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB9330. De modo específico, las cinco PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las seis PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las seis PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB9337
El pDAB9337 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones reconstruidas con codones optimizados de SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC, y NoHetI, cuya expresión está dirigida por el promotor de faseolina. Se construyó el plásmido pDAB9337 (figura 32; SEQ ID NO:52) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios.
El pDAB9337 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v3, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido).
Los plásmidos pDAB9324, pDAB9325, pDAB9326, pDAB9328 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB9337. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB9338
El pDAB9338 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones reconstruidas con codones optimizados de SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC, y NoHetI. Se empleó el promotor de faseolina para dirigir la expresión de SzPUFA OrfA, y se empleó el promotor PvDlec2 para dirigir a los otros transgenes. Se construyó el plásmido pDAB9338 (figura 33; SEQ ID NO:53) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios.
El pDAB9338 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, NoHetI v3 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB9324, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7338 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB9338. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB9344
El pDAB9344 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones reconstruidas con codones optimizados de SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC, y NoHetI, todos los cuales contienen la cadena pequeña 1A de ribulosa bifosfato carboxilasa (indicada como SSU-TP v1) que está condensada al amino-terminal de la secuencia codificadora. Se empleó el promotor de faseolina para dirigir la expresión de SzPUFA OrfA, y se empleó el promotor PvDlec2 para dirigir a los otros transgenes.
Se construyó el plásmido pDAB9344 (figura 34; SEQ ID NO:54) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB9344 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfA v4, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v4, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v4, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v4, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido).
Los plásmidos pDAB9343, pDAB9342, pDAB9340, pDAB9331 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB9344. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v4, SzPUFA OrfB v4, hSzThPUFA OrfC v4, NoHetI v4. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las seis PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB9396
El pDAB9396 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones reconstruidas con codones optimizados de SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC, SzACS-2, y NoHetI. Se empleó el promotor de faseolina para dirigir la expresión de SzPUFA OrfA y SzPUFA OrfB. Se empleó el promotor PvDlec2 para dirigir a los otros transgenes: hSzThPUFA OrfC, SzACS-2, y NoHetI.
Se construyó el plásmido pDAB9396 (figura 35; SEQ ID NO:55) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB9396 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de acil-CoA sintetasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, el gen SzACS-2 v3, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, NoHetI v3 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB9324, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7339 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB9338. De modo específico, las cinco PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las seis PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB101412
El pDAB101412 es un plásmido binario que se construyó para que contuviese las versiones reconstruidas con codones optimizados de SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC, SzACS-2, y NoHetI. La versión del promotor de faseolina empleada en esta construcción fue modificada fundamentalmente como se describe en Bustos et al., 1989 (The Plant Cell, vol. 1, 839-853), en la que la porción 5’ del promotor está truncada y la región no traducida 5’ de faseolina se deja intacta. Las secuencias del promotor de faseolina truncado se identifican a lo través de esta solicitud como la versión 4 (v4), versión 5 (v5), y versión 6 (v6). Se construyó el plásmido pDAB101412 (figura 36; SEQ ID NO:56) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios.
El pDAB101412 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de acil-CoA sintetasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La PTU de acil-CoA sintetasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, 2S 5’ UTR, el gen SzACS-2 v3 y AtuORF23 5’ UTR v1. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v5 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v3 y AtuORF23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB7375, pDAB7376, pDAB7377, pDAB7398 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB101412. De modo específico, las cinco PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las seis PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Transformación de colza con promotores que se expresan de forma temprana en el desarrollo de las semillas
Los plásmidos se emplean para transformar plantas de colza de modo estable empleando los protocoles descritos anteriormente. Las plantas de colza transgénicas se aíslan y se caracterizan molecularmente. El uso de construcciones alternativas produce plantas de colza que contienen cantidades mayores de DHA y LC-PUFA. Se determina la acumulación de LC-PUFA resultante y se identifican las plantas de colza que producen de 0,01% a 15% de DHA o de 0,01% a 15% de LC-PUFA.
Ejemplo 13: Coexpresión de DGAT2 o ACCasa con el juego de genes de PUFA sintasa de algas dentro de la colza
El contenido en aceite dentro de las plantas de colza se modifica aún más mediante la transformación de moléculas de ADN quimérico que codifican y expresan una acetil CoA carboxilasa (ACCasa) o una diacilglicerol aciltransferasa de tipo 2 (DGAT2). Estos genes se coexpresan con los genes de PUFA sintasa de algas descritos anteriormente, a través del cruzamiento de plantas de colza que contiene el módulo de expresión de ACCasa o DGAT2 con plantas de colza que contienen los genes de PUFA sintasa; o transformado plantas de colza con un apilamiento de genes que contienen los genes de ACCasa o DGAT2 y de PUFA sintasa. Los elementos reguladores necesarios para la expresión de una secuencia codificadora de ACCasa o DGAT2 pueden incluir los descritos anteriormente. También pueden emplearse otros elementos reguladores de la expresión de secuencias conocidos en la técnica. Los módulos de expresión de ACCasa y DGAT2 se transforman en colza empleando los protocolos de transformación descritos anteriormente. La transformación puede producirse en forma de apilamientos moleculares del módulo de expresión de ACCasa o DGAT2, combinado con los módulos de expresión de OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa, acil-CoA sintetasa y 4' fosfopanteteinilo transferasa HetI; o como módulos de expresión de ACCasa o DGAT2 independientes unidos a un marcador seleccionable y después cruzados con plantas de colza que contienen los módulos de expresión de OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa, acil-CoA sintetasa y 4' fosfopanteteinilo transferasa HetI. Los transformantes positivos se aíslan y se caracterizan molecularmente. Se identifican las plantas de colza que contiene una mayor acumulación de concentraciones de LC-PUFA en la planta, en las semillas de la planta o en el aceite de la planta, comparado con las plantas de colza control no transformadas. Estos aumentos pueden variar de un aumento de 1,2 a 20 veces.
La sobreexpresión de ACCasa en el citoplasma puede producir niveles mayores de malonil-CoA. Las plantas o semillas de colza que contienen mayores niveles de malonil-CoA citoplásmica pueden producir posteriormente unos niveles mayores de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA) cuando los genes de PUFA sintasa de algas están presentes y se expresan. Los genes DGAT2 que se expresan dentro de las plantas de colza pueden incorporar preferentemente cantidades significativas de ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido eicosapentaenoico (EPA) en el triacilglicerol. Los genes DGAT2 con preferencia de sustrato por LC-PUFA (véase, por ejemplo, el documento WO 2009/085169) pueden aumentar la incorporación de estos ácidos grasos en el triacilglicerol (TAG). Estos genes DGAT son útiles para dirigir la incorporación de LC-PUFA, en particular DHA, en el TAG, y para aumentar la producción de TAG en plantas y otros organismos.
Ejemplo 14: Uso de la secuencia del gen de acil-CoA sintetasa nativo para lograr unos niveles mayores de expresión de acil-CoA sintetasa dentro de plantas
Se creó una versión alternativa del gen de acil-CoA sintetasa de Schizochytrium sp. modificando la secuencia del gen nativo para eliminar los marcos de lectura abiertos superfluos. Esta versión se identifica como "SzACS-2 v4" y se lista como SEQ ID NO:34. La secuencia fue sintetizada por el proveedor de servicios, DNA 2.0 (Menlo Park, CA). La secuencia codificadora se incorpora en un módulo de expresión en plantas que contiene un promotor y una región no traducida 3’, que se han descrito en estos ejemplos. El módulo de expresión resultante se empleó para reemplazar al módulo de expresión de acil-CoA sintetasa descrito anteriormente como "SzACS-2 v3”, SEQ ID NO:9, que se combinó con los módulos de expresión del OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico y 4' fosfopanteteinilo transferasa HetI para construir pDAB7361, pDAB7362 y pDAB7363. Los nuevos plásmidos que contienen el módulo de expresión "SzACS-2 v4" reciben denominaciones de identificación exclusivas. Los plásmidos recién construidos pueden emplearse para transformar plantas de colza de modo estable. Las plantas de colza transgénicas se aíslan y se caracterizan molecularmente. La versión alternativa del gen, "SzACS-2 v4”, puede producir plantas de colza que contienen cantidades mayores de DHA y LC-PUFA. Se determina la acumulación de LC-PUFA resultante y se identifican las plantas de colza que producen de 0,01% a 15% de DHA o de 0,01% a 10% de EPA.
Ejemplo 15: Actividad PUFA sintasa en semillas de colza transgénica maduras
Se detectó la actividad PUFA sintasa en extractos de semillas de colza transgénicas T1 maduras procedentes de plantas generadas empleando el vector pDAB7361 de Agrobacterium (acontecimiento 5197[14]-032). Las semillas se sumergieron en agua durante 3-4 horas antes de retirar las envueltas de las semillas y triturar en hielo seco en tampón de extracción (fosfato 200 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, NaCl 50 mM, glicerol al 5%, PVPP al 1%, antipaína 0,52 g/ml, leupeptina 0,58 g/ml, pepstatina A 0,83 g/ml, TLCK 12 g/ml, TPCK 12 mg/l, e inhibidor de tripsina de soja 6 g/ml) y microcentrifugando a 4 °C durante 10 min. Se retiró la almohadilla de grasa y el sedimento resultante se incubó con un tampón de mayor fuerza iónica antes de una recentrifugación. La almohadilla de grasa y la capa lipídica se retiraron de la muestra, y el sobrenadante acuoso se hizo pasar a través de columnas de desalación Zeba preequilibradas con fosfato 50 mM, pH 7,2, DTT 1 mM, glicerol al 10%, y EDTA 1 mM. Se procesaron en paralelo semillas de Nexera 710 no transformadas como control negativo. Se ensayaron muestras de ambos conjuntos de semillas empleando el método de extracción de HIP y TLC descrito en Metz et al., Plant Physiol. Biochem., 47:6 (2009) (figura 16). Se modificaron las condiciones de ensayo para incluir NADH 2 mM, un sistema de regeneración de NADH (glucosa + glucosa deshidrogenasa), con agitación continua y una concentración final de malonil-CoA de 100 mM (0,064 Ci/100 ml por ensayo). Los ensayos de los sobrenadantes resultantes se normalizaron en volumen e indicaron que puede detectarse la formación de FFA después de 60 min. Esto no se observó en el control de Nexera 710, lo cual indica que la formación de FFA se produjo a partir de la formación de DHA mediante la PUFA sintasa.
Ejemplo 16: Panteteinilación de OrfA producido en colza por HetI coexpresado
El OrfA contiene nueve dominios de proteínas portadoras de acilo que requieren, cada uno, una derivatización con un grupo fosfopanteteína mediante una fosfopanteteinilo transferasa (PPTasa) para que sean funcionales. Se evaluó el grado de panteteinilación de OrfA por la PPTasa HetI en semillas de colza transgénicas mediante una evaluación con cromatografía nanolíquida-espectrometría de masas (nanoLC-MS) de los péptidos trípticos que contenían el sitio de panteteinilación de diversas muestras de OrfA.
Se produjeron patrones de polipéptidos de holo y apo Orf A recombinantes en E. coli mediante la coexpresión con o sin HetI. La expresión de OrfA en ausencia de HetI genera una proteína no funcional, porque las PPTasas endógenas de E. coli no pueden añadir el grupo fosfopanteteína (Hauvermale et al., Lipids, 41:739-747, 2006). Por contraste, la expresión con HetI produce una proteína de OrfA que tiene un alto grado de panteteinilación. Para extraer el OrfA expresado en E. coli, se resuspendieron células congeladas procedentes de 0,5 l de un cultivo de células recombinantes en 20 ml de tampón de extracción: Tris 20 mM, pH 7,0, lisozima 1 mg/ml, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, DTT 1 mM, antipaína 0,52 g/ml, leupeptina 0,58 g/ml, pepstatina A 0,83 g/ml, TLCK 12 g/ml, TPCK 12 g/ml, inhibidor de tripsina de soja 6 g/ml. Después de la lisis, el extracto se trató con ADNasa y MgCl2 4 mM, se aclaró mediante centrifugación y el sobrenadante se congeló a -80 °C.
El OrfA producido por la planta se aisló de semillas de colza maduras rehidratadas del acontecimiento 5197[14]
032.002 empleando el método de extracción previamente descrito para el ensayo in vitro de PUFA sintasa producida en colza. Las proteínas de OrfA procedentes de los patrones de E. coli y de la muestra de colza se digirieron de modo enzimático y se analizaron mediante nanoLC-MS empleando una entrada de nanocromatografía Agilent ChipCube con análisis de MS mediante un espectrómetro de masas Agilent QTOF (modelo 6530). El QTOF se programó para que realizara un análisis de MS2 automático para generar datos de secuencias de péptidos durante la cromatografía. La característica fundamental del método es que el espectrómetro de masa se programa para realizar un barrido completo de MS, seguido de la MS2 automática de los tres iones más abundantes para generar espectros de secuencias de MS2. Posteriormente los iones fueron excluidos de la MS2 después de 2 apariciones, durante un periodo de exclusión de 30 sg. Una referencia interna fue continuamente infusionada durante la nanopulverización para generar iones de referencia para la calibración interna del QTOF (a m/z 299,29446 y 1221,99064). Los iones que se encuentran habitualmente por el remanente de la disolución madre de calibración se definieron como iones excluidos para evitar barridos de MS2 falsos de estos iones. Los barridos de MS se realizaron a través del intervalo de m/z 295-2400. Los barridos de MS2 se realizaron a través del intervalo de m/z 59-3000. Se realizó una MS2 automática, dando preferencia a los estados cargados en el siguiente orden: +2 > +3 > (> +3) > desconocido > +1.
Los espectros de masas en tándem fueron extraídos por Mascot Distiller (Matrix Science, Londres, Reino Unido; versión 2.3.2). No se realizó la deconvolución del estado de carga ni la desisotopización. Todos los espectros de MS/MS se analizaron empleando Mascot (Matrix Science, Londres, Reino Unido; versión 2.2.06) y X! Tandem (www.thegpm.org; versión 2007.01.01.1). Mascot y X! Tandem fueron ambos ajustados para buscar en una base de datos de secuencias de proteínas que contiene la secuencia de longitud completa de la proteína OrfA, suponiendo una especificidad de digestión de la tripsina. Mascot y X! Tandem se sometieron a la selección con una tolerancia de masa de fragmento de ion de 0,30 Da y una tolerancia de ion de origen de 10,0 ppm. Se especificó la oxidación de la metionina y la fosfopanteteína de la serina en Mascot y X! Tandem como modificaciones variables.
Se empleó Scaffold (versión Scaffold_2_05_02, Proteome Software Inc., Portland, OR) para validar las identificaciones de proteínas y péptidos basadas en MS/MS. Las identificaciones de péptidos se aceptaron si se podía establecer una probabilidad mayor que 95,0%, según especifica el algoritmo Peptide Prophet (Keller et al., Anal. Chem., 74:5383-5392 (2002)). Las identificaciones de proteínas se aceptaron si se podía establecer una probabilidad mayor que 99,0% y si contenían al menos 2 péptidos identificados. Las probabilidades de las proteínas fueron asignadas por el algoritmo Protein Prophet (Nesvizhskii, Anal Chem., 75:4646-4658 (2003)). Las proteínas que contenían péptidos similares y que no podían diferenciarse basándose solo en un análisis de MS/MS fueron agrupadas para cumplir los principios de parsimonia. Las búsquedas en bases de datos identificaron péptidos trípticos que se corresponden a las forma apo del sitio de panteteinilación 1 (SEQ ID NO:78 TGYETDMIEADMELETELGIDSIK) y los sitios de panteteinilación 2-9 (SEQ ID NO:77 TGYETDMIESDMELETELGIDSIK). No se observó evidencia directa de péptidos panteteinilados.
Para calcular el grado de panteteinilación de los sitios 2-9 en OrfA aislado de colza, se midió la cantidad del péptido apo2-9 con relación a seis péptidos de referencia diferentes identificados a partir de otras regiones de la molécula de Orf A (tabla 21).

Tabla 21 -Péptidos empleados para calcular la cantidad relativa del péptido apo2-9 en digestiones de OrfA. “Inicio” se refiere a la posición de inicio del péptido indicado en la proteína de longitud completa. La posición de inicio para apo2-9 se refiere a la primera aparición del péptido en la secuencia de proteína. La abreviatura “z” indica la carga, y la abreviatura m/z indica la masa frente a la carga.
SEQ ID NO:
Péptido Posición de inicio del aminoácido z m/z
SEQ ID NO:71
[LNYWVEK] 148 2 482,279
SEQ ID NO:72
[FGALGGFISQQAER] 2200 2 740,880
SEQ ID NO:73
[AEIAGGSAPAPAAAAPAPAAAAPAPAAPAPAVSSELLEK] 1416 4 851,452
SEQ ID NO:74
[AAPAAAAPAVSNELLEK] 1216 2 811,940
SEQ ID NO:75
[IVQHRPVPQDKPFYITLR] 2854 5 442,255
SEQ ID NO:76
[IFVEFGPK] 880 2 468,770
SEQ ID NO:77
[TGYETDMIESDMELETELGIDSIK] 1245 3 907,079
Se tomó la proporción interna del péptido apo2-9 a los péptidos de referencia en la proteína derivada de E. coli (sin HetI) como un cálculo de la no panteteinilación, mientras que la proporción interna en la proteína derivada de E. coli expresada con HetI se tomó como un cálculo de un alto grado de panteteinilación. Estas proporciones internas suponen que la abundancia molar de los péptidos de referencia es equivalente, independientemente de la fuente de la proteína de OrfA (figura 17). La proporción del péptido apo2-9 a cada uno de los seis péptidos de referencia se calculó y se promedió (se calcularon tres proporciones para los seis péptidos de referencia). Además, se calcularon tres proporciones de seis péptidos de referencia entre sí (ref1/ref2, ref3/ref4 y ref5/ref6) para demostrar que los péptidos de referencia no varían significativamente entre las tres muestras de OrfA (figura 17) y que son adecuados para calcular la cantidad relativa del péptido apo2-9 presente.
Por contraste con las proporciones calculadas de los péptidos de referencia, la proporción de apo2-9 a cada uno de los péptidos de referencia demuestra que existían unos niveles notablemente más bajos del péptido apo2-9 en las muestras de OrfA/HetI y colza, en comparación con el patrón de OrfA sin HetI (figura 18). La explicación más sencilla de estos resultados es que el sitio de panteteinilación en el péptido apo2-9 está sustancialmente ocupado por grupos fosfopanteteinilo, con lo cual disminuye significativamente la abundancia molar de los péptidos apo2-9. Esto indica que la PPTasa expresada en colza, HetI, es funcionalmente capaz de activar el OrfA en semillas de colza transgénica, y que las unidades de ACP de OrfA expresadas en colza son funcionalmente competentes.
Ejemplo 17: Otras construcciones
Introducción de diversidad en los promotores para reducir la duplicación de elementos reguladores
El silenciamiento de genes es un fenómeno que se ha observado en generaciones de progenie de acontecimientos de colza transgénica. Varios artículos de revistas analizan el silencio de genes transcripcional ("Transcriptional Gene Silencing", TGS) y el silencio de genes postranscripcional ("Post Transcriptional Gene Silencing", PTGS), tales como los de Waterhouse et al., 2001 (Nature, 411:834-842), Vaucheret y Fagard, 2001 (Trends in Genetics, 17(1):29-35, y Okamoto y Hirochika, 2001 (Trends in Plant Sci., 6(11):527-534). En plantas, el silenciamiento de genes puede activarse mediante la duplicación de secuencias polinucleotídicas transgénicas (secuencias de transgenes de repetición en tándem, secuencias de transgenes de repeticiones invertidas, o múltiples inserciones en el cromosoma) o cuando una secuencia homóloga a las secuencias de los genes diana es portada por un virus que infecta a plantas o por el ADN-T de Agrobacterium tumefaciens.
Además, la duplicación de secuencias polinucleotídicas de transgenes puede actuar como activador para la inestabilidad de la construcción. Múltiples secuencias de transgenes que comparten niveles elevados de similitud de secuencia pueden plegarse entre sí. Pueden producirse redisposiciones mediante recombinación homóloga, en la que se cortan secuencias intermedias de ADN. Como resultado, se cortan fragmentos de ADN que están localizados entre secuencias polinucleotídicas de transgenes repetidas.
Una estrategia para diseñar vectores plasmídicos consiste en introducir diversidad de promotores en una construcción incorporando múltiples promotores específicos de semilla exclusivos que mantienen un alto nivel de expresión de cada transgén. La introducción de diversidad de secuencias de promotores en los vectores plasmídicos puede reducir el silenciamiento de genes y mejorar la estabilidad del plásmido. Los múltiples promotores específicos de semilla incluyen PvDlec2, faseolina y napina (patente de EE. UU. n.º 5.608.152). Estos promotores son relativamente comparables con respecto a la actividad de promotor, tal como la especificidad de tejido, los niveles de expresión, la duración de la expresión, etc.
Construcción de pDAB7733
Se construyó el plásmido binario pDAB7733 (figura 37; SEQ ID NO:57) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB7733 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v1 de BnaNapinC, BnaNapinC 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y BnaNapinC 3’ UTR v1. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v5 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v3 y AtuOrf23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB7375, pDAB7731, pDAB7336, pDAB7378 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB7733. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB7734
Se construyó el plásmido binario pDAB7734 (figura 38; SEQ ID NO:58) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB7734 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v1 de BnaNapinC, BnaNapinC 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y BnaNapinC 3’ UTR v1. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, NoHetI v3 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB7334, pDAB7376, pDAB7732, pDAB7338 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB7734. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB101493
Se construyó el plásmido binario pDAB101493 (figura 39; SEQ ID NO:59) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB101493 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v5 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v3 y AtuOrf23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB7334, pDAB7376, pDAB7336, pDAB7378 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB101493. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB109507
Se construyó el plásmido pDAB109507 (figura 40; SEQ ID NO:60) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB109507 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v1 de BnaNapinC, BnaNapinC 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y BnaNapinC 3’ UTR v1. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor BoACP/5’ UTR v1, NoHetI v3 y AtuOrf23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB9324, pDAB7731, pDAB7336, pDAB101485 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB109507. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB109508
Se construyó el plásmido pDAB109508 (figura 41; SEQ ID NO:61) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB109508 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v1 de BnaNapinC, BnaNapinC 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y BnaNapinC 3’ UTR v1. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, NoHetI v3 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB9324, pDAB7731, pDAB7336, pDAB7338 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB109508. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB109509
Se construyó el plásmido pDAB109509 (figura 42; SEQ ID NO:62) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB109509 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor BoACP/5’ UTR v1, NoHetI v3 y AtuOrf23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB7334, pDAB7335, pDAB7336, pDAB101485 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB109509. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Redisposición del orden de las PTU de construcciones binarias para reducir la fragmentación de secuencias de genes largas
La PTU de OrfA de SzPUFA se colocó en el extremo 3’ de la construcción binara para ensayar si el orden de los módulos de PTU puede reducir la fragmentación y las redisposiciones en acontecimientos transgénicos aislados. El OrfA de SzPUFA es un marco de lectura abierto grande (aproximadamente 8.700 p.b.) que contiene nueve repeticiones de proteína portadora de acilo en tándem. En la primera serie de construcciones completadas, la PTU de OrfA de SzPUFA se colocó de modo que se integraba primero en el cromosoma de la planta. A la PTU de OrfA de SzPUFA posteriormente le sigue el resto de las PTU de genes relacionados con la síntesis de PUFA a medida que disminuye su peso molecular. El análisis molecular de la región codificadora del OrfA de SzPUFA indica que algunos acontecimientos de colza transgénica y Arabidopsis thaliana contenían inserciones fragmentadas. Se describen diseños de construcciones alternativas, en las que el orden de las PTU de PUFA sintasa ha cambiado a las siguientes configuraciones: hSzThPUFA OrfC PTU, SzPUFA OrfB PTU, NoHetI PTU, SzPUFA OrfA PTU, y PAT PTU. El cambio de la localización de la PTU de OrfA de SzPUFA en la construcción binaria se completa para reducir la fragmentación y la redisposición en acontecimientos transgénicos aislados.
Construcción de pDAB9151
Se construyó el plásmido pDAB9151 (figura 43; SEQ ID NO:63) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB9151 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, NoHetI v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de PUFA sintasa final contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB9148, pDAB7335, pDAB9149, pDAB9150 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB9151. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3, NoHetI v3, SzPUFA OrfA v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Cambio en la dirección transcripcional de las PTU de la construcción binaria para introducir diversidad en la construcción
Un diseño de construcción alternativo incluye cambiar el orden de las PTU de PUFA sintasa y la dirección transcripcional de los módulos de expresión de genes. En la primera serie de construcciones completadas, cada módulo de expresión de genes se coloca en la misma dirección ("de cabeza a cola”, en la que el promotor de un módulo de expresión de genes se localiza adyacente a la 3’UTR de un segundo módulo de expresión de genes). Las siguientes construcciones describen una estrategia en la que los módulos de expresión de genes se colocan en diferentes direcciones y utilizan promotores alternativos. En estos ejemplos, el módulo de expresión de genes se localiza en posición trans con respecto a un segundo módulo de expresión de genes, de modo que los promotores de ambos módulos de expresión de genes están colocados adyacentes entre sí. Esta configuración se describe como una configuración "de cabeza a cabeza". En los ejemplos se describen otras configuraciones, en las que un módulo de expresión de genes está localizado en posición trans con respecto a un segundo módulo de expresión de genes, de modo que las 3’UTR de ambos módulos de expresión de genes están colocadas adyacentes entre sí. Esta configuración se describe como una configuración "de cola a cola". Para mitigar la translectura potencial de este diseño, se coloca el terminador Orf 23/24 bidireccional entre estas dos PTU. Se proponen estas configuraciones para aumentar la expresión de los transgenes, produciendo con ello mayores concentraciones y mayor contenido en ácidos grasos LC-PUFA y DHA.
Construcción de pDAB108207
Se construyó el plásmido pDAB108207 (figura 44; SEQ ID NO:64) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB108207 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v6 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v3, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido). La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3, el terminador v1 de At2S SSP y AtuORF23 3’ UTR v1. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v6 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3’ UTR y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido) y AtuORF23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB7334, pDAB101489, pDAB108205, pDAB108206 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB108207. De modo específico, SzPUFA OrfA v3 y NoHetI v3 se colocaron en una orientación de cola a cola; NoHetI v3 y hSzThPUFA OrfC v3 se colocaron en una orientación de cabeza a cabeza; hSzThPUFA OrfC v3 y SzPUFA OrfB se colocaron en una orientación de cola a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, NoHetI v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB108208
Se construyó el plásmido pDAB108208 (figura 45; SEQ ID NO:65) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB108208 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v5 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3’ UTR, PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido) y AtuORF23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB108200, pDAB101490, pDAB108201, pDAB108202 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB108208. De modo específico, SzPUFA OrfA v3 y NoHetI v3 se colocaron en una orientación de cabeza a cabeza; NoHetI v3 y hSzThPUFA OrfC v3 se colocaron en una orientación de cola a cola; hSzThPUFA OrfC v3 y SzPUFA OrfB se colocaron en una orientación de cabeza a cabeza dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, NoHetI v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB108209
Se construyó el plásmido pDAB108209 (figura 46; SEQ ID NO:66) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB108209 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v3 y AtuORF23 3’ UTR v1. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v5 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3’ UTR y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido) y un espaciador de ADN aleatorio.
Los plásmidos pDAB108200, pDAB108204, pDAB108201, pDAB108202 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB108209. De modo específico, SzPUFA OrfA v3 y NoHetI v3 se colocaron en una orientación de cabeza a cabeza; NoHetI v3 y hSzThPUFA OrfC v3 se colocaron en una orientación de cola a cola; hSzThPUFA OrfC v3 y SzPUFA OrfB se colocaron en una orientación de cabeza a cabeza dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, NoHetI v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Duplicación de 3’UTR e inclusión de ADN espaciador para minimizar la interferencia transcripcional
La interferencia transcripcional puede producirse cuando múltiples genes se apilan en una serie, dando como resultado una menor expresión de los genes cadena abajo. Este fenómeno surge de la translectura transcripcional de la 3’UTR y del terminador hacia la siguiente unidad de transcripción-promotor. Se describen diseños de construcciones alternativas que consisten en dos estrategias para minimizar la interferencia transcripcional y la propia interferencia transcripcional. La primera estrategia despliega el uso de dos terminadores/3’UTR que se apilan entre módulos de expresión del gen de DHA individuales para limitar la translectura hacia el siguiente módulo de expresión de genes. La segunda estrategia inserta aproximadamente mil pares de bases de un ADN espaciador entre los módulos de expresión de genes, minimizando con ello la interferencia transcripcional.
Construcción de pDAB108207
Se construyó el plásmido pDAB108207 (figura 44; SEQ ID NO:64) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB108207 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3’ UTR, PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido) y AtuORF23 3’ UTR v1. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3, el terminador v1 de At2S SSP y AtuORF23 3’ UTR v1. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v6 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v3, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido).
Los plásmidos pDAB7334, pDAB101489, pDAB108205, pDAB108206 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB108207. De modo específico, SzPUFA OrfA v3 y NoHetI v3 se colocaron en una orientación de cola a cola, y se coloca una AtuORF23 3’UTR entre las dos PTU; NoHetI v3 y hSzThPUFA OrfC v3 se colocaron en una orientación de cabeza a cabeza; hSzThPUFA OrfC v3 y SzPUFA OrfB se colocaron en una orientación de cabeza a cabeza, y se coloca una AtuORF23 3’UTR entre las dos PTU dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, NoHetI v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB108208
Se construyó el plásmido pDAB108208 (figura 45; SEQ ID NO:65) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB108208 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de acil-CoA sintetasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v5 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3’ UTR, PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido) u AtuORF23 3’ UTR v1. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v3 y AtuORF23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB108200, pDAB101490, pDAB108201, pDAB108202 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB108208. De modo específico, SzPUFA OrfA v3 y NoHetI v3 se colocaron en una orientación de cabeza a cabeza; NoHetI v3 y hSzThPUFA OrfC v3 se colocaron en una orientación de cola a cola, y se colocó una AtuORF23 3’UTR entre las dos PTU; hSzThPUFA OrfC v3 y SzPUFA OrfB se colocaron en una orientación de cabeza a cabeza dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, NoHetI v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB108209
Se construyó el plásmido pDAB108209 (figura 46; SEQ ID NO:66) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB108209 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de acil-CoA sintetasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v5 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3’ UTR, PvPhas 3’ MAR v2 (no indicado en el mapa de plásmido) y un espaciador de ADN aleatorio. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v3 y AtuORF23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB108200, pDAB108204, pDAB108201, pDAB108202 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB108209. De modo específico, SzPUFA OrfA v3 y NoHetI v3 se colocaron en una orientación de cabeza a cabeza; NoHetI v3 y hSzThPUFA OrfC v3 se colocaron en una orientación de cola a cola, y se colocó un espaciador de mil pares de bases entre las dos PTU; hSzThPUFA OrfC v3 y SzPUFA OrfB se colocaron en una orientación de cabeza a cabeza dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, NoHetI v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Empleo de 3’UTR-terminadores alternativos para limitar la translectura transcripcional
Debido al número limitado de 3’UTR-terminadores patentados de Agrobacterium, se emplea principalmente el 3’UTR-terminador de ORF 23 para terminar la transcripción. Se ha demostrado recientemente que el 3’UTRterminador de ZmLipasa es más eficaz para terminar la translectura transcripcional en Arabidopsis thaliana. Así, una versión de las construcciones utiliza el 3’UTR-terminador de ZmLipasa en combinación con el promotor PvDlec2 para determinar si esta 3’UTR puede reducir la translectura transcripcional de genes cadena arriba, reduciendo con ello la interferencia transcripcional.
Construcción de pDAB9159
Se construyó el plásmido pDAB9159 (figura 47; SEQ ID NO:67) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB9159 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y ZmLip 3’ UTR v1. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y ZmLip 3’ UTR v1. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y ZmLip 3’ UTR v1. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v3 and ZmLip 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB9152, pDAB9153, pDAB9154, pDAB9155 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB9159. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB9147
Se construyó el plásmido pDAB9147 (figura 48; SEQ ID NO:68) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB9147 contiene tres PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3, el terminador v1 de At2S SSP y ZmLip 3’ UTR v1. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La tercera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, NoHetI v3 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB9146, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7338 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB9147. De modo específico, las cuatro PTU descritas anteriormente se colocaron en una orientación de cabeza a cola dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las cinco PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Transporte de genes de DHA en dos ADN-T distintos
Un diseño de construcción alternativo consiste en la construcción de dos vectores binarios distintos, en los que el primer vector contiene un subconjunto de genes de PUFA sintasa en un ADN-T, y el segundo vector binario contiene el resto de los genes de PUFA sintasa en un segundo ADN-T. Estos vectores binarios se emplean individualmente para transformar plantas que se cruzan sexualmente, produciendo con ello una progenie que contiene todas las construcciones de expresión de genes de PUFA sintasa. Un método alternativo para producir plantas transgénicas sería cotransformar ambos vectores binarios en tejido de colza, y seleccionar una sola planta que contenga ambas hebras T.
Construcción de pDAB108224
Se construyó el plásmido pDAB108224 (figura 49; SEQ ID NO:69) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB108224 contiene una PTU de PUFA sintasa, una PTU de fosfopanteteinilo transferasa, y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La PTU de fosfopanteteinilo transferasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetI v3 y AtuORF23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB108216, pDAB108221 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB108224. De modo específico, SzPUFA OrfA v3 y NoHetI v3 se colocaron en una orientación de cabeza a cabeza dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, NoHetI v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las tres PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Construcción de pDAB108225
Se construyó el plásmido pDAB108225 (figura 50; SEQ ID NO:70) empleando una reacción de recombinación L-R Gateway de múltiples sitios. El pDAB108225 contiene dos PTU de PUFA sintasa y una PTU de fosfinotricín acetil transferasa. De modo específico, la primera PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v3 y el terminador v1 de At2S SSP. La segunda PTU de PUFA sintasa contiene el promotor v4 de PvPhas, SzPUFA OrfB v3 y Atu ORF23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB108217, pDAB108222 y pDAB7333 se recombinaron para formar pDAB108225. De modo específico, SzPUFA OrfB v3 y hSzThPUFA OrfC v3 se colocaron en una orientación de cabeza a cabeza dentro de las regiones límite de la hebra T del ADN del plásmido binario de transformación de plantas pDAB7333. El orden de los genes es: SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3. El pDAB7333 también contiene la PTU de fosfinotricín acetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF1 3’ UTR v4 además de otros elementos reguladores, tales como Overdrive y secuencias de límite de la hebra T (límite A de ADN-T y límite B de ADN-T). Después los plásmidos recombinantes que contienen las cinco PTU se aislaron y se ensayaron para la incorporación de las tres PTU con digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Transformación de colza con construcciones que contienen diseños alternativos
Estos plásmidos se emplean para transformar plantas de colza de modo estable empleando los protocolos descritos anteriormente. Las plantas de colza transgénicas se aíslan y se caracterizan molecularmente. El uso de construcciones alternativas produce plantas de colza que contienen cantidades mayores de DHA y LC-PUFA. Se determina la acumulación de LC-PUFA resultante y se identifican las plantas de colza que producen de 0,01% a 15% de DHA o de 0,01% a 15% de LC-PUFA.
Ejemplo 18: Diseños de construcciones alternativas empleados para la transformación de Arabidopsisthaliana y posterior producción de LC-PUFA y DHA
Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana con cepas de Agrobacterium tumefaciens que contenían los vectores binarios pDAB101493, pDAB7362, pDAB7369, pDAB101412, o pDAB7380. Se empleó un protocolo de transformación de inmersión floral descrito por Clough y Bent (1998) para la transformación (Clough y Bent, "Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana”, Plant J., 16:735-743, 1998). Se obtuvieron plantas de Arabidopsis transformadas y se completó la confirmación molecular de la presencia de los transgenes. Se cultivaron hasta la madurez plantas T1 procedentes de los acontecimientos de Arabidopsis transgénico en el invernadero. Estas plantas se autopolinizaron y las semillas T2 resultantes se recolectaron en la madurez. Se analizaron semillas individuales mediante FAME GC-FID para determinar el contenido en LC-PUFA y DHA en las semillas T2 de Arabidopsis. El tejido se analizó mediante el método FAME GC-FID según se describió en los ejemplos previos. Las semillas T2 individuales procedentes de una planta T1 de Arabidopsis contenían de 0,00% a 0,95% de DHA y de 0,00% a 1,50% de LC-PUFA totales. El contenido en LC-PUFA y DHA de cada semilla T2 procedente de plantas T1 individuales se muestra en la figura 51.
Ejemplo 19: Transformación de una variedad de colza "sin alto contenido en ácido oleico" (DH12075) con el conjunto de genes de PUFA sintasa
La variedad DH12075 de Brassica napus se transformó mediante el método de transformación del hipocotilo fundamentalmente como se describe en el ejemplo 4 empleando el plásmido que porta Agrobacterium tumefaciens pDAB7362. A diferencia del trasfondo genético de Nexera 710, DH12075 no es una variedad "con alto contenido en ácido oleico". Se recuperaron las plantas T0 de DH12075 que resultaron positivas para la presencia del gen pat y se analizaron para determinar la presencia de los cinco genes del conjunto de genes de DHA (OrfA de PUFA sintasa, OrfB de PUFA sintasa, OrfC de PUFA sintasa quimérico, acil-CoA sintetasa y 4’ fosfopanteteinilo transferasa HetI) mediante los métodos de análisis molecular descritos en el ejemplo 5. El acontecimiento 001-2009-006DH (acontecimiento 006) se identificó como una planta T0 que contenía los cinco genes de DHA. Se cultivó hasta la madurez en una cámara de crecimiento y se recolectaron las semillas T1. El análisis de semillas T1 individuales del acontecimiento 006 mediante los métodos descritos en el ejemplo 6 demuestra que 31 de las 48 semillas analizadas contienen DHA en unos niveles de entre 0,19% y 0,86% de DHA. Se plantaron 113 semillas T1, se cultivaron en una cámara de crecimiento y se analizaron muestras de tejido foliar mediante los métodos descritos en el ejemplo 4 para determinar la cigosidad de las plantas individuales. Mediante un análisis de qPCR se determinó que 23 plantas eran homocigóticas para el gen PAT y que también mostraban cosegregación de los cinco genes de DHA, lo cual indica la presencia de un único locus. Un análisis de la transferencia Southern de tejido de la planta T1 del acontecimiento 006 empleando sondas de pat y OrfA indica que existía una copia adicional del gen OrfA. Las plantas homocigóticas se cultivaron hasta la madurez y se recogieron las semillas. Un análisis FAME de muestras de semillas T2 en masa procedentes de cada una de estas plantas demuestra que 17 de las 23 plantas T2 homocigóticas producían unos LC-PUFA con un contenido en DHA de entre 0,17% y 0,72%. Cinco muestras de semillas T2 contenían EPA entre 0,08% y 0,16%, y los LC-PUFA totales (DHA+EPA+DPA[n-6]) de los acontecimientos productores de LC-PUFA fueron de entre 0,33% y 1,35%. La tabla 22a muestra el perfil de ácidos grasos completo de dos de las muestras de T2 en masa que contienen DHA del acontecimiento 006. Se realizaron análisis de semillas individuales en 48 semillas T2 individuales procedentes de ocho de las líneas T1 homocigóticas, y en la tabla 23 se muestra el contenido promedio en DHA de estas semillas. Se detectaron semillas T2 individuales con un contenido en DHA de hasta 1,31%. La tabla 22b muestra el perfil de ácidos grasos completo de cuatro semillas T2 que contienen DHA. Estos datos demuestran que puede producirse DHA en colza con trasfondos genéticos que tienen un contenido en ácido oleico menor que 72% a través de una transformación con el conjunto de genes de PUFA sintasa.

Tabla 22 -Perfiles de FAME completos de semillas T2 procedentes del acontecimiento 006 con un trasfondo genético de DH12075
a. Análisis de semillas T2 en masa
C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:1 (n-7) C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0 C22:1 C20:5 C24:0 C22:5 (n-6) C22:6
Acontecimiento 006-033
0,08 3,51 0,14 2,49 70,21 1,27 11,39 6,36 0,81 1,31 0,40 0,23 0,15 0,32 0,64 0,70
Acontecimiento 006-002
0,08 3,99 0,16 2,10 69,52 1,28 12,56 5,85 0,85 1,35 0,52 0,00 0,00 0,39 0,63 0,72
b. Análisis de semillas T2 individuales
Acontecimiento 006-019 n.º 32
0,00 3,88 0,28 2,42 68,75 0,00 13,43 5,88 0,93 1,19 0,61 0,00 0,00 0,72 0,77 1,15
Acontecimiento 006-012 n.º 7
0,00 3,53 0,18 3,55 68,41 2,24 11,04 5,11 1,05 1,43 0,41 0,25 0,00 0,49 1,00 1,31
Acontecimiento 006-033 n.º 43
0,00 3,22 0,31 3,17 71,02 1,69 8,57 5,25 1,00 1,26 0,62 0,00 0,00 1,44 1,15 1,31
Acontecimiento 006-004 n.º 20
0,00 4,02 0,26 0,95 46,04 3,13 27,43 12,75 0,72 1,23 0,49 0,00 0,00 0,87 0,80 1,30

Tabla 23 -Contenido promedio de DHA en semillas T2 procedentes de ocho plantas de colza T1 del acontecimiento 006 homocigóticas con el trasfondo genétido de DH12075 (se analizaron 48 semillas por planta)
ID de la planta T1
Contenido promedio en DHA Contenido promedio en LC-PUFA totales Contenido mínimo en DHA Contenido máximo en DHA
Acontecimiento 006-002
0,68% 1,26% 0,00% 1,01%
Acontecimiento 006-004
0,52% 0,91% 0,00% 1,30%
Acontecimiento 006-019
0,55% 0,96% 0,00% 1,15%
Acontecimiento 006-012
0,32% 0,57% 0,00% 1,31%
Acontecimiento 006-014
0,68% 1,28% 0,00% 0,91%
Acontecimiento 006-026
0,00% 0,00% 0,00% 0,00%
Acontecimiento 006-033
0,78% 1,39% 0,00% 1,31%
Acontecimiento 006-037
0,47% 0,85% 0,00% 1,01%

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una planta de Brassica napus genéticamente modificada, sus descendientes, células, tejidos, semillas o partes, que comprende:
    (i)
    una secuencia de ácido nucleico que codifica un sistema de ácido graso poliinsaturado (PUFA) sintasa que produce al menos un PUFA, en la que el sistema de PUFA sintasa comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:1-3;
    (ii)
    una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfopanteteinilo transferasa (PPTasa) que transfiere un cofactor de fosfopanteteinilo a un dominio ACP del sistema de PUFA sintasa, en la que la PPTasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; and
    (iii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una acil-CoA sintetasa (ACoAS) que cataliza la conversión de ácidos grasos libres (FFA) PUFA de cadena larga a acil-CoA, en la que la ACoAS comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4;
    en la que las secuencias de ácidos nucleicos (i), (ii) y (iii) están contenidas en un único vector de expresión recombinante y las secuencias de ácidos nucleicos (i), (ii) y (iii) están unidas operablemente a un promotor PvDlec2, en la que el vector de expresión recombinante comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:35,
    y en la que la planta, sus descendientes, células, tejidos, semillas o partes comprenden DHA (ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3)) en una cantidad entre 0,01% y 15%, DPA (C22:5, n-6 o n-3) en una cantidad entre 0,01% y 5%, o EPA (ácido eicosapentaenoico (C20:5, n-3)) en una cantidad entre 0,01% y 5%.
  2. 2.
    La planta de Brassica napus genéticamente modificada, sus descendientes, células, tejidos, semillas o partes de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una acetil CoA carboxilasa (ACCasa) y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica una diacilglicerol aciltransferasa de tipo 2 (DGAT2).
  3. 3.
    Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID NO:7-10.
  4. 4.
    Un vector de expresión recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:35.
  5. 5.
    Un método para producir la planta de Brassica napus genéticamente modificada, sus descendientes, células, tejidos, semillas o partes de la reivindicación 1 o 2, que comprende transformar una planta o una célula de una planta de Brassica napus con un módulo de expresión que comprende:
    (i)
    una secuencia de ácido nucleico que codifica un sistema de PUFA sintasa que produce al menos un ácido graso poliinsaturado (PUFA), en el que el sistema de PUFA sintasa comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:1-3;
    (ii)
    una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfopanteteinilo transferasa (PPTasa) que activa un dominio ACP del sistema de PUFA sintasa, en el que la PPTasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; y
    (iii) una secuencia de ácido nucleico que codifica una acil-CoA sintetasa (ACoAS) que cataliza la conversión de ácidos grasos libres (FFA) PUFA de cadena larga a acil-CoA, en la que la ACoAS comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4;
    en el que las secuencias de ácidos nucleicos (i), (ii) y (iii) están contenidas en un único vector de expresión recombinante y las secuencias de ácidos nucleicos (i), (ii) y (iii) están unidas operablemente a un promotor PvDlec2, en el que el vector de expresión recombinante comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:35.
    86 87
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