ES2314988T3 - Enzima beta-cetoacil-acp-sintetasa ii y gen que la codifica. - Google Patents
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Abstract
Una proteína aislada de cianobacterias seleccionadas del grupo formado por: a) el cual tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2; b) el cual tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 en donde un aminoácido está substituido, suprimido, insertado o añadido, y tiene la actividad de la enzima Beta-cetoacil-ACP sintetasa II; c) el cual es codificado por un nucleótido que comprende un mutante degenerado de la secuencia representada por SEQ ID NO: 1 y codifica una proteína de SEQ ID NO: 2; d) el cual es codificado por un nucleótido que comprende una secuencia representada por SEQ ID NO: 1, en donde dicho nucleótido codifica un polipéptido que tiene la actividad de la enzima Beta-cetoacil-ACP sintetasa II; e) el cual es codificado por un nucleótido capaz de hibridar con la secuencia de c) ó d) en una solución de hibridación que comprende 10xDenhardt, 5 x SSC, 10 mM de EDTA, 250 mug/ml de ADN de esperma de salmón a 60ºC durante 16 horas, seguido por un lavado con una solución con 5xSSC, 0,1% de SDS a 45ºC durante 15 minutos, en donde dicho nucleótido tiene una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la actividad de la enzima Beta-cetoacil- ACP sintetasa II.
Description
Enzima
\beta-cetoacil-ACP-sintetasa
II y gen que la codifica.
La presente invención se refiere a la secuencia
de aminoácidos de una sintetasa responsable de la síntesis de
ácidos grasos en los vegetales y la estructura de un ADN
relacionada con los mismos, es decir, una proteína de enzima que
sintetiza un ácido graso, que tiene una secuencia específica de
aminoácidos, y un gen que la codifica. Las células pueden ser
transformadas con dicho gen y genes quimera en los cuales ha sido
insertada una secuencia reguladora apropiada (gen regulador), para
controlar las cantidades de ácidos grasos saturados y no saturados
en la célula.
Las ácido graso sintasas son conocidas por estar
clasificadas en dos tipos: las enzimas en animales y levaduras son
complejos de ácido graso sintetasas (FAS) en los cuales, varias
enzimas están completamente unidas como un complejo que tiene una
función única (tipo I), mientras que las de las células de
vegetales superiores y procariotas son del tipo en que cada una de
las enzimas está independientemente desconectada del exterior de
los organismos (tipo II). Una proteína acilo soporte (ACP) la cual
es una proteína soluble, es necesaria para la síntesis de un ácido
graso con la enzima tipo II, y los ácidos grasos son sintetizados
como un acilo-ACP. El producto final del sistema de
síntesis es el palmitoil-ACP. El
palmitoil-ACP se convierte posteriormente en
estearoil-ACP por alargamiento de la cadena antes
de la desaturación con un ácido graso desaturasa soluble
(estearoil-ACP desaturasa) para dar
oleil-ACP. Se incorporan ácido palmítico y ácido
oleico en un lípido polar, y a continuación este último es además
desaturado (J. Ohlrogge y J. Browse (1995) Lipid Biosynthesis. The
Plant Cell ("Biosíntesis de lípidos. La célula vegetal"), 7,
págs 957-970).
La enzima del alargamiento de la cadena, que
cataliza el alargamiento de la cadena del
palmitoil-ACP al estearoil-ACP,
produce estearoil-ACP a partir del
palmitoil-ACP, malonil-ACP y NADPH
(J. Ohlrogge y J. Browse (1995) Lipid Biosynthesis. The Plant Cell
("Biosíntesis de lípidos. La célula vegetal"), 7 págs.
957-970). Estas reacciones describen el esquema
total de una serie de reacciones enzimáticas para la producción de
un estearoil-tioéster mediante la
reducción, deshidratación y posterior reducción del producto de condensación de un palmitoil-tioéster y la unidad C2.
reducción, deshidratación y posterior reducción del producto de condensación de un palmitoil-tioéster y la unidad C2.
La biosíntesis de lípidos en los vegetales ha
sido extensamente estudiada (Browse et al., Annu. Rev. Plant
Physiol. Mol. Biol. (1991) 42: 467-506). Se ha
aclarado en estas investigaciones que la producción de ácido
esteárico a partir de ácido palmítico en las células vegetales es
una reacción catalizada por la enzima
\beta-cetoacil-ACP sintetasa II
(KASII). Sin embargo no está descrito en la publicación antes
mencionada el aislamiento ni de la enzima KASII ni de su gen, por
lo cual sus secuencias permanecen desconocidas.
Se han descubierto tres isozimas de KAS en el
cloroplasto de las plantas. Entre las dos isoenzimas distintas de
la KASII, la isozima KASIII cataliza la iniciación de la síntesis
de una cadena acilo, mientras la isozima KASI cataliza la reacción
de alargamiento de una cadena acilo en el
palmitoilo-ACP con 16 átomos de carbono. Han sido
aislados del Arabidopsis una variedad de mutantes de enzimas
implicadas en la síntesis de lípidos de vegetales, entre las cuales
han sido estudiadas extensamente las enzimas responsables de la
reacción de desaturación. También han sido descritas para la KASII,
el mutante de la cual se ha denominado fabl. En este mutante, la
actividad de la enzima KASII ha disminuido al 65%, y de esta forma
el contenido en ácido palmítico ha aumentado el 7% en las hojas y
el 3% en las raíces (Wu et al., Plant Physiol. (1994) 106:
143-150). En vistas a la completa purificación de
la enzima KASII, se han clonado genes de semillas de ricino
(Ricinus communis; publicación abierta de la patente
japonesa nº 500234/1994) y de habas de soja (Glycine max;
publicación abierta de la patente japonesa nº 501446/1995) sobre la
base de las secuencias de aminoácidos del péptido limitadamente
degradado de la enzima purificada. En las publicaciones descritas
más arriba, con respecto a los cambios de ácidos grasos por
transformación con estos genes, el contenido en ácido graso C16 de
la expresión del gen de semillas de ricino en E. coli,
disminuyó aproximadamente un 20%, correspondiendo así a poco más
del 30% del contenido total de ácido graso, mientras que después de
introducir el gen de habas de soja en la canola, el contenido de
ácido palmítico en las semillas disminuyó un 0,8% y después de
introducir el gen en el tabaco, el contenido de ácido palmítico en
las hojas disminuyó aproximadamente un 2%. En conexión con esto, no
se ha encontrado curiosamente ninguna secuencia que presente una
homología distinta, entre los genes de las semillas de ricino y de
soja.
A propósito, se ha observado que en los lípidos
de la membrana que constituyen la biomembrana, la temperatura de
transición de la fase varía primordialmente en función de los
grados de insaturación del ácido graso unido al lípido, y como
resultado también varía la resistencia al frío del organismo. Se
cree que el grado de insaturación del lípido de la membrana aumenta
efectivamente con una enzima tal como la ácido graso
aciltransferasa (PCT/JP 92/00024 (PCT/WO 92/13082)), ácido graso
desaturasa (PCT/JP 94/02288 (PCT/WO 95/18222)).
En consideración a los hechos descritos más
arriba, el objeto de la presente invención es el de proporcionar un
gen de una proteína que tenga una actividad enzimática que haga
posible regular o controlar el contenido de ácidos grasos saturados
y ácidos grasos no saturados en células vegetales o células de
microorganismos y una proteína de enzima como producto de
expresión.
Se cree que si existe una proteína que tiene una
tal actividad enzimática que la disminución de dicha actividad
enzimática, responsable de la síntesis de ácidos grasos, conduce al
aumento del contenido en ácido palmítico en los lípidos de las
células, mientras que el aumento de dicha actividad enzimática
conduce al aumento del contenido de ácidos grasos con 18 ó más
átomos de carbono, el contenido en ácidos grasos no saturados en
los lípidos está posiblemente aumentado, por ejemplo como resultado
del aumento del contenido de ácidos grasos con 18 ó más átomos de
carbono debido al aumento de la actividad enzimática.
Los presentes inventores han efectuado serias
investigaciones con el fin de solucionar los problemas descritos
más arriba, y como resultado han aislado con éxito un gen que
codifica una enzima
\beta-cetoacil-ACP sintetasa II
(KASII) de la cianobacteria (Anacystis nidulans), y han
descubierto que la introducción del gen en el E. coli
confiere la capacidad de producir KASII por lo cual los ácidos
grasos que se han extendido a lo largo de la cadena, aumentan. La
presente invención ha sido lograda sobre la base de este
descubrimiento.
Es decir, la presente invención se refiere a la
proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada por
SEQ ID NO. 2, ó substancialmente la misma secuencia de aminoácidos
que la representada por SEQ ID NO. 2, y presenta la actividad de la
enzima KASII, como se define en las reivindicaciones.
La presente invención se refiere también al gen
de la enzima KASII que codifica la proteína que tiene una secuencia
de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 2 ó substancialmente la
misma secuencia de aminoácidos que la representada por SEQ ID NO. 2
y presenta la actividad de la enzima KASII, como se define en las
reivindicaciones.
Además, la presente invención se refiere al
vector recombinante que contiene el gen, y las células en las
cuales el gen ha sido introducido.
La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos
representada por códigos de una sola letra, que corresponde a la
SEQ ID NO. 2 (código de aminoácidos de tres letras).
La figura 2 ilustra el cuadro comparativo de la
secuencia de aminoácidos de la enzima KASI (registro nº P23902 en
la base de datos SWISS-PROT), con la secuencia de
aminoácidos esperada de la secuencia de ADN de la enzima KASII de
las semillas de ricino (GENBANK registro número L13241).
La figura 3 ilustra el cuadro comparativo de la
secuencia de aminoácidos de la enzima KASII (denominada KASII en el
dibujo), derivada del Anacystis nidulans en la presente
invención con la secuencia de aminoácidos (denominada Fab) de fabF
ó J (código S11 1069) del Synechocystis sp. cepa
PCC6803.
La presente invención se describe ahora en
detalle, como sigue.
Como se ha descrito más arriba, la proteína de
la presente invención que tiene la actividad de la enzima KASII,
tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 2
(que corresponde a la secuencia de aminoácidos (código de una sola
letra) en la figura 1), o substancialmente la misma secuencia de
aminoácidos que la representada por SEQ ID NO. 2, y el gen de la
proteína activa de la enzima KASII de acuerdo con la presente
invención codifica la proteína descrita más arriba que tiene la
secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 2 ó
substancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la
representada por SEQ ID NO. 2. La expresión "proteína que tiene
la actividad de la enzima KASII" o "proteína activa de la
enzima KASII" en la presente invención, significa la proteína
que tiene una actividad enzimática la cual produce un ácido graso
más largo (particularmente ácido esteárico) mediante la
prolongación de la longitud de la cadena de un ácido graso
(particularmente ácido palmítico).
Como las proteínas activas de la enzima KASII
descritas más arriba, pueden emplearse en la presente invención
unos productos génicos apropiados que se encuentran en la
naturaleza, así como también productos génicos mutantes en los
cuales una parte de las secuencias de aminoácidos de las proteínas
ha sido mutada, con la condición de que las proteínas tengan la
actividad de la enzima KASII descrita más arriba. A título de
ejemplo, el producto del gen de la proteína activa de la enzima
KASII incluye típicamente la enzima KASII derivada de la
cianobacteria como un microorganismo (SEQ ID NO. 2).
La frase "substancialmente la misma secuencia
de aminoácidos" en la presente invención, significa que la
secuencia del mutante descrito más arriba está también incluida,
tal como típicamente la secuencia de aminoácidos de la proteína de
la enzima derivada de la cianobacteria representada por SEQ ID NO.
2 (SEQ ID NO. 2, figura 1) ó la secuencia en la cual un aminoácido
ha sido sustituido, suprimido, insertado, o añadido.
Por lo tanto, el término "sustancialmente"
en el caso de "el gen que codifica ... substancialmente la misma
secuencia de aminoácidos" en la presente invención, se pretende
incluir no solamente el gen de una secuencia de ADN que codifica la
proteína que se encuentra en la naturaleza, que tiene la actividad
de la enzima KASII definida más arriba, sino también el gen de la
secuencia de ADN que codifica la proteína activa de la enzima KASII
mutante descrita más arriba, típicamente el gen de la secuencia de
ADN que codifica la secuencia de aminoácidos representada por SEQ
ID NO. 2 ó la secuencia de aminoácidos en la cual un aminoácido ha
sido sustituido, suprimido, insertado, o añadido. Asimismo, ni que
decir tiene que, cuando una cadena de ADN codifica en general un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos, están presentes
códigos de genes plurales (codones) que corresponden a un
aminoácido (mutantes degenerados), y así puede emplearse cualquier
código de genes también en la cadena de ADN que codifica la
proteína activa de la enzima KASII de la presente invención, y está
definida en las reivindicaciones.
La proteína activa de la enzima KASII codificada
por el gen de la presente invención, tiene una función de enzima de
alargamiento de la cadena para la síntesis de ácidos grasos la
cual está originalmente presente en los vegetales y
micro-organismos como se ha descrito más arriba, y
así en la siguiente función específica, tiene una actividad
enzimática para producir un ácido graso más largo (particularmente,
ácido esteárico) que la longitud de la cadena de un ácido graso
(particularmente, ácido palmítico) ha sido prolongada. El ejemplo
típico de la proteína de acuerdo con la presente invención, es la
que deriva de la cianobacteria. La estructura química de la enzima
KASII derivada de la cianobacteria es localmente similar a la
proteína codificada por el gen KASI de E. coli y cebada, y
es también similar a la enzima derivada de las semillas de ricino
entre las publicaciones de patente con respecto a la KASII descrita
más arriba. La proteína activa de la enzima KASII de acuerdo con la
presente invención tiene, como se ha descrito más arriba, la
secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 2, ó
substancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la descrita
más arriba, y una actividad enzimática marcadamente alta para la
producción de un ácido graso más largo (particularmente, ácido
esteárico) en el cual la longitud de la cadena de un ácido graso
(particularmente, ácido palmítico) ha sido prolongada.
Mientras uno de los medios para la obtención del
gen que codifica la proteína de la presente invención es la
síntesis química de por lo menos una parte de la cadena de acuerdo
con el método de la síntesis del ácido nucleico, se prefiere, en
consideración al número de aminoácidos que han de ser unidos para
emplear el método, más que la síntesis química, en la cual el ADNc
se sintetiza a partir del ARNm aislado de un material que se
encuentra en la naturaleza, en particular la cianobacteria como
bacteria, y el gen se obtiene a partir de la biblioteca de genes,
por el método empleado habitualmente en el campo de la ingeniería
genética.
El gen de la enzima KASSII puede obtenerse por
ejemplo como sigue.
En primer lugar, la enzima de una planta
superior o de un microorganismo, particularmente la cianobacteria,
se purifica por el método conocido, y se fragmenta con peptidasa
para determinar las secuencias de aminoácidos de los fragmentos.
Los oligonucleótidos correspondientes a los péptidos fragmentados
cuya secuencia de aminoácidos ha sido determinada, se sintetizan a
continuación. El ARN total se extrae separadamente del vegetal o
del microorganismo, y el ADN complementario al ARN (ADNc) se
sintetiza. El ADNc se une a un vector apropiado tal como el fago
\lambdagt11 para construir la biblioteca de ADNc. A este
respecto, como método para la selección del gen, pueden emplearse
los métodos convencionales, por ejemplo los métodos inmunológicos
tales como el método de hibridación de la placa con un anticuerpo o
el método de hibridación de la colonia, o el método de hibridación
con una sonda de nucleótidos o similares.
También es posible obtener la secuencia diana
mediante el diseño de cebadores correspondientes a las secuencias
cortas de ADN posicionadas en ambos extremos de la secuencia
reivindicada sobre la base de la secuencia de consenso de una
enzima KASII conocida o de la otra isozima relativa a la misma, y
efectuando la PCR con ADN obtenido de un material empleado para la
determinación de la secuencia total como un molde. En este caso, la
actividad puede ser identificada por ejemplo mediante la expresión
del gen KAS en E. coli con el fin de diferenciar la isozima
del gen.
La secuencia de ADN del gen de acuerdo con la
presente invención en el clon así seleccionado, puede determinarse
y confirmarse generalmente mediante los métodos ya conocidos tales
como el método de terminación de la cadena de dideoxinucleótido con
el fago M13 (Sambrook et al., Molecular Cloning
("Clonación molecular"), segunda edición (1989)).
El presente gen del cual se ha determinado la
secuencia de ADN como se ha descrito más arriba, puede también
sintetizarse generalmente mediante medios ya conocidos, como por
ejemplo un sintetizador de ADN comercialmente adquirible, mediante
el método del fosfito.
También, para la expresión de una cadena de ADN
o su fragmento, para producir una proteína o un polipéptido
codificado por el mismo, es necesaria una secuencia reguladora de
la expresión además de la secuencia de ADN (región de codificación)
correspondiente a la secuencia de aminoácidos. Así, la cadena de
ADN de la presente invención incluye la secuencia de ADN que
comprende dicha secuencia reguladora de la expresión. Como región
reguladora de la expresión, una importante, en particular para la
expresión en un vegetal superior es la secuencia promotora
corriente arriba de la región de codificación (por ejemplo,
derivada del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor), y
la señal de adición poli A corriente abajo (por ejemplo, derivada
del terminador de la enzima de síntesis de la nopalina). Cuando el
ADN obtenido es un gen del genoma de un vegetal superior, puede
emplearse también directamente a condición de que la secuencia de
ADN comprenda una región reguladora de la expresión.
Como se ha descrito más arriba, la presente
invención se refiere también al vector recombinante que comprende
la cadena de ADN descrita más arriba o su fragmento, y a las
células dentro de las cuales ha sido introducido el gen.
El vector recombinante es un vector al cual se
ha unido la cadena de ADN descrita más arriba o su fragmento, y
puede emplearse un vector conocido tal como un plásmido (por
ejemplo pETl7b), fago (por ejemplo \lambdaZAPII).
La enzima KASII puede producirse en un anfitrión
tal como por ejemplo una célula de un vegetal o un microorganismo
apropiados como se ha descrito más arriba, mediante la introducción
del vector recombinante de ADN dentro del anfitrión para la
expresión.
A este respecto, aunque las células pueden ser o
bien células de un microorganismo o bien células de un vegetal,
independientemente de la clase de organismos, las células de
microorganismos incluyen el E. coli y similares, y las
células de vegetales incluyen plantas sensibles al frío tales como
el tabaco y similares. El gen puede ser introducido dentro de las
plantas generalmente con los métodos ya conocidos tales como los
descritos en "Plant Molecular Biology Manual ("Manual de
biología molecular de los vegetales"), segunda edición; S.G.
Gelvin, y R.A. Schilperoort eds, Kluwer Academic editores,
1995". A título de ejemplo, pueden mencionarse los métodos
biológicos que incluyen un método con un virus, o un método con
Agrobacterium, y los métodos fisicoquímicos que incluyen el
método de electroporación, el método del polietilenglicol, el
método del cañón de partículas, y similares.
También, la enzima KASII es una proteína que
está presente en la envoltura de los cloroplastos de los
vegetales, de manera que es necesario sujetar la cadena de ADN que
codifica el péptido de tránsito al cloroplasto, corriente arriba de
la enzima KASII. A título de ejemplo, puede emplearse el gen de la
pequeña subunidad de
ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa
de guisante, como un gen que codifica el péptido de tránsito.
La proteína activa de la enzima KASII de la
presente invención, típicamente el gen que codifica la proteína
activa de la enzima KASII (SEQ ID NO. 2 de aminoácidos) derivado de
la cianobacteria Anacystis nidulans (la secuencia de ADN del
gen derivado de la cianobacteria está representada por la SEQ ID
NO. 1), es útil para mejorar la composición de lípidos en los
vegetales y microorganismos por transformación, particularmente el
control del ratio de cantidad entre los ácidos grasos con 16 y 18
átomos de carbono.
La expresión de la proteína de la enzima KASII
de la presente invención como una proteína externa en un organismo,
conduce al alargamiento de la longitud de la cadena de los ácidos
grasos de 16 átomos de carbono (ácido palmítico) a 18 átomos de
carbono (ácido esteárico), el ácido esteárico se desatura en un
organismo, y el contenido de ácidos grasos no saturados aumenta. Se
cree que la resistencia al frío está potenciada en los vegetales en
los cuales los ácidos grasos no saturados han sido aumentados
(PCT/WO 92/13082, PCT/WO 95/18222), y se espera que la resistencia
al esfuerzo del cultivo se potencie en los microorganismos
(levadura, E. coli y similar) en los cuales los ácidos
grasos no saturados han sido aumentados.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se describe a continuación
en detalle con referencia a los ejemplos, sin que la misma esté
limitada por dichos ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
A. nidulans (catálogo nº IAM
M-6: es posible obtenerlo en el Instituto de
Citología Molecular de la Universidad de Tokio), el cual se cultiva
en aproximadamente 100 ml del medio de cultivo
BG-11 preparado de acuerdo con el método descrito
en la página 279 de ``Plant Molecular Biology ("Biología
molecular de los vegetales"), por Shaw (IRL PRESS, 1988). Las
células bacterianas se cultivaron suficientemente agitando a 120
veces/minuto con luz fluorescente de 1000 lux a 25ºC. Las células
se separaron por centrifugación a 5000 g durante 10 minutos a
temperatura ambiente.
Con el fin de aislar el ADN, las células
precipitadas se suspendieron en 50 ml de 50 mM de Tris Cl (pH 8,0),
1 mM de EDTA (solución A) y se lavaron de nuevo por centrifugación.
A continuación las células se resuspendieron de nuevo en 15 ml
(solución) de 50 mM de Tris Cl (pH 8,0), 20 mM de EDTA, 50 mM de
NaCl, 0,25 M de sacarosa (solución B), a la cual se añadieron 40 mg
de isozima (Sigma) disueltos en solución B, y la mezcla se sacudió
lentamente a 37ºC. Después de 1 hora, se añadieron 15 mg de
proteinasa K y SDS a una concentración final de un 1%, y la mezcla
se sacudió lentamente durante la noche a 37ºC. Al día siguiente se
ajustó NaClO_{4} a una concentración de 1 M, se añadieron 20 ml
de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1), la mezcla se sacudió
lentamente durante 10 minutos, y la capa acuosa se separó por
centrifugación. Después de repetir una vez más la extracción con
cloroformo/alcohol isoamilico, se añadieron 50 ml de etanol, y el
ADN se separó enroscándolo alrededor de una varilla de vidrio. El
ADN se disolvió en 20 ml de solución A, se ajustó NaCl a una
concentración de 0,1 M, se añadió ARNasa a una concentración de 50
mg/ml, y la reacción se efectuó a 37ºC durante 1 hora. A
continuación, la mezcla de reacción se sometió dos veces a una
extracción con una cantidad equivalente de fenol saturado con
solución A. Después de separar el ADN en la capa acuosa mediante la
adición de etanol y lavado con etanol al 70%, se disolvió en 1 ml
de solución A para preparar la solución de ADN.
Después de la digestión parcial de
aproximadamente 100 g de ADN con Sau 3A I, con el fin de preparar
una biblioteca de ADN genómico a partir del ADN así obtenido, se
recogió el ADN de aproximadamente 9-23 kb mediante
ultracentrifugación sobre un gradiente de densidad de sacarosa de
acuerdo con el método descrito por Sambrook et al.. Se clonó
en el DASH II (kit de Stratagene), y se escindió con BamHI y
HindIII.
Se sintetizaron varias cadenas cortas de ADN por
comparación de la enzima KASI de cebada con la enzima KASII de
semillas de ricino prestando atención a las regiones que tenían una
alta homología entre estas enzimas (figura 2). Entre estas cadenas,
se observaron distintas bandas de acuerdo con tamaños esperados, en
reacciones efectuadas con la siguiente combinación.
| 1: | 5' -CC (ACGT) CC (AG) AA (ACGT) CC (AG) AA (ACGT) GA (AG) TT-3' | (SEQ ID NO. 3) |
| 2: | 5' -GA (AG) GA (AG) GT (ACGT) AA (CT) TA (CT) AT (ACT) AA (CT) GC-3' | (SEQ ID NO. 4) |
De estas secuencias, la SEQ ID NO. 4 es un
cebador con sentido, que corresponde a la secuencia de aminoácidos
EEVNYINA, y la SEQ ID NO. 3 es un cebador que codifica la cadena
anti-sentido que corresponde a la secuencia de
aminoácidos NSFGFGG. Las reacciones de la PCR se efectuaron con
cebadores sentido y anti-sentido. La reacción se
efectuó con la condición de emplear un kit GeneAmp^{TM}PCR
(Takara Shuzo Co., Ltd.) añadiendo en 100 litros de solución de
reacción 20 \muM de los cebadores, respectivamente, y 1 \mug de
ADN derivado del A. nidulans. El programa de reacción de 35
ciclos se efectuó comprendiendo cada ciclo la reacción a 95ºC (1
minuto), 50ºC (1 minuto) y 72ºC (2 minutos), con la condición de
que solamente en el primer ciclo, la reacción a 95ºC se prolongó a
3 minutos y la temperatura de la reacción a 50ºC se cambió por
35ºC. Una vez terminada la reacción, la mezcla de reacción se
sometió a una extracción con 100 \mulitros de cloroformo para
separar la capa acuosa y a continuación se separó el cloroformo con
100 \mulitros de éter para dar una capa acuosa, de la cual una
porción de 10 \mulitros se analizó mediante electroforesis sobre
gel de agarosa al 2%.
Como resultado, se detectó el ADN que tenía el
mismo tamaño que el esperado (aproximadamente 330 bp). El fragmento
de ADN se clonó dentro de un vector pCRII (Invitrogen Co.). La
secuencia de ADN se determinó mediante el método del dideoxi
mediante el empleo de un secuenciador fluorescente (fabricado por
Applied Biosystem Co.). El ADN se marcó con
32P-dCTP empleando el kit de marcado de ADN,
Multiprime (Amersham Co.) para preparar una sonda, y se empleó para
el siguiente experimento de hibridación.
Se infectó E. coli P2392 con un fago en
la biblioteca de ADN y se formaron aproximadamente 10.000 placas
sobre una placa que tenía aproximadamente un diámetro de 15 cm, y
que contenía un medio NZYM, los cuales fueron transferidos sobre
una membrana de nylon. La hibridación se efectuó por el método
descrito por Sambrook et al. (Molecular Cloning
("Clonación molecular"); segunda edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989) bajo la condición de una solución
consistente en 5 X SSC (1 X SSC comprendiendo 0,15 M NaCl y 15 mM
de citrato de sodio), 10 mM de EDTA, 10 X solución Denhardt (50 x
solución Denhardt comprendiendo Ficoll (tipo 400, Pharmacia Co.),
polivinil pirrolidona, albúmina de suero bovino (fracción V, Sigma
Co.), respectivamente, en una cantidad de 10 g/litro), y 250
\mug/ml de ADN de esperma de salmón a 60ºC durante 16 horas. A
continuación se lavó la membrana dos veces con el 5 x SSC y 0,1% de
solución de SDS a 45ºC durante 15 minutos y se sometió a
autoradiografía. Se purificaron diez clones positivos para obtener
los ADN del fago, los cuales fueron escindidos con algunas enzimas
de restricción, se sometieron a la electroforesis sobre gel de
agarosa seguido de un Southern blot sobre una membrana de nylon de
acuerdo con el método convencional. La membrana se hibridó en las
mismas condiciones que la hibridación de la placa descrita más
arriba para comparar las fuerzas de hibridación y las longitudes de
los fragmentos de ADN. Como resultado, se creyó que los dos clones
de las mismas (\lambdaB, F) eran satisfactorios desde el punto de
vista tanto de la fuerza como de la longitud del fragmento, y por
lo tanto se escindieron posteriormente con algunas enzimas de
restricción para efectuar la hibridación Southern. Como resultado,
se detectó un fragmento de hibridación con una longitud de
aproximadamente 5 kbp al escindir con Sal I, de manera que se
subclonó en el sitio Sal I de pUC 19 (Takara Shuzo Co.,
Ltd.)(designados pB y pF, respectivamente). Cuando cada clon se
sometió con más detalle al mapeado con enzimas de restricción, se
juzgó que los pB y pF tenían el ADN idéntico. De esta forma, se
preparó un plásmido de supresión sobre este último con una enzima
de restricción de acuerdo con el método convencional, y la
secuencia base de la cadena de ADN durante aproximadamente un
fragmento de 2 kbp que comprendía el fragmento de ADN de
hibridación, fue determinado con un secuenciador fluorescente (SEQ
ID NO. 1). Se descubrió en él, un marco de lectura abierto (ORF)
que constaba de 1251 bp, y se sospechó una secuencia de aminoácidos
con 417 residuos (SEQ ID NO. 2). Comparando la secuencia de
aminoácidos con la de proteínas registradas en la base de datos
para determinar una homología, se encontró que presentaba una
significativa homología con una ácido graso sintasa. En particular
tenía la más alta homología del 74% con la proteína, la cual se
pensó que era la fabF ó J en la secuencia genómica total del
Synechocystis sp. cepa PCC6803 preparada por KAZUSA DNA
Institute (base de datos DDBJ registro nº D90905, PID; g1652389)
(figura 3). Con respecto a otras proteínas, presentaba homologías
del 43 - 46% con el gen de la KASII derivada de la semilla de
ricino y el gen de la KASI derivada de la cebada, y el 35% con la
KASI derivada del E. coli. Estas
homologías de genes sin embargo no podían distinguirse de KASI, II ó III correspondientes a la función del ORF.
homologías de genes sin embargo no podían distinguirse de KASI, II ó III correspondientes a la función del ORF.
Con el fin de especificar la función del gen
descrito más arriba, se escogió la expresión en E. coli. En
primer lugar, con el fin de eliminar el exceso de secuencias de ADN
corriente arriba y corriente abajo del ORF, se preparó un ADN en
el cual se introdujo en el terminal N, un sitio NdeI en el lado 5'
del codon de partida (ATG) mediante la síntesis del ADN (Applied
Biosystem Co.), mientras el sitio HindIII se introdujo
inmediatamente corriente abajo del ORF.
| 1: | 5'-CGCACATATGACTGAAACCGGACGCC | (SEQ ID NO. 5) |
| 2: | 5'-CCGCAAGCTTGCAGCAGCGCGTACTGC | (SEQ ID NO. 6) |
La reacción de la PCR se efectuó tanto con los
DNA sintéticos como con un cebador en presencia de pF como un ADN
molde. Con respecto a las condiciones de la reacción, la reacción
se repitió 30 ciclos de acuerdo con el manual de Perkin Elmer Co.,
comprendiendo cada ciclo la reacción a 94ºC (1 minuto), 60ºC (un
minuto) y 72ºC (2 minutos). El producto de reacción se escindió con
NdeI y HindIII, seguido por la clonación con pETl7b escindido
previamente con el mismo juego de enzimas de restricción como se ha
descrito más arriba en el E. coli cepa DH5, la cual se clonó
a continuación en una cepa BL21 (DE3)pLysS (Novagen).
El recombinante de la última cepa de E.
coli, se cultivó (32ºC) hasta que la turbidez de la solución
del cultivo alcanzó 0,5 OD a una longitud de onda de 600 nm en 75
ml de medio LB al cual se habían añadido 100 \mug/ml de
ampicilina y 30 \mug/ml de cloranfenicol. A continuación se
añadió IPTG a una concentración final de 0,4 mM, y el cultivo se
continuó durante 2 horas más. El E. coli se separó del medio
de cultivo por centrifugación a 10.000 X durante 10 minutos, y las
células se lavaron con 50 mM de Tris HC1 (pH 7,4) y se congelaron a
-20ºC. Las células se descongelaron en hielo con una solución
formada por 20 mM de Tris HC1 (pH 8,0), 20 mM de ditiotreitol, 10
mM de MgCl_{2} y 1 \mug/ml de ADNasa I. La mezcla se centrifugó
a 100.000 X g a 4ºC durante 1 hora, y la solución de proteína del
sobrenadante fue sometida a electroforesis de SDS sobre un gel
"slab" con un gradiente de concentración de poliacrilamida de
10 a 20%, seguido de la tintura con azul brillante Coomassie. Como
resultado, se detectó la proteína derivada del Anacystis
nidulans, como una proteína con un peso molecular de
aproximadamente 50 kDa.
Como para la composición de los ácidos grasos
del E. coli, los ácidos grasos se separaron por análisis
como los ésteres de metilo de las células cultivadas como se ha
descrito más arriba. La metilación se efectuó calentando
aproximadamente 5 mg de lípido juntamente con 1 ml de ácido
clorhídrico al 5% en metanol anhidro en un tubo sellado en agua
hirviendo durante 4 horas, la mezcla de reacción se enfrió por
reposo, seguido de la extracción de los ésteres metílicos de los
ácidos grasos con hexano. Los ésteres metilados de los ácidos
grasos se analizaron en una columna capilar (fase líquida de
poliéster; 10% de EGSS-X, 175ºC) con un detector de
ionización de llama de hidrógeno. Los ácidos grasos se determinaron
por comparación de los tiempos de retención relativos con los de
los ácidos grasos metilados estándar. Los resultados figuran en la
lista de la siguiente tabla.
Composiciones de ácidos grasos en el E.
coli
- 1
- muestra
- 2
- control
- 3
- recombinante #1
- 4
- recombinante #2
Como resultado, se encontró que los ácidos
grasos con 16 átomos de carbono (16:0 y 16:1), disminuyeron,
mientras que el ratio de los ácidos grasos con 18 átomos de carbono
(18:0 y 18:1) aumentó substancialmente.
La cadena de ADN que codifica la proteína que
tiene una actividad enzimática
\beta-cetoacil-ACP sintetasa II
representada por la enzima KASII derivada del Anacystis
nidulans, ha sido proporcionada por la presente invención. El
gen que codifica la proteína de enzima de la presente invención,
como se describe más arriba, es un gen de la enzima KASII el cual
tiene una actividad notablemente alta para convertir un ácido graso
(en particular, ácido palmítico con 16ºC) en un ácido graso más
largo (en particular, el ácido esteárico con 18ºC), y es útil,
empleando la transformación, para el aumento de lípidos de los
vegetales, el aumento de lípidos de los microorganismos,
particularmente para el control del ratio entre los ácidos grasos
de 16 y 18 átomos de carbono o para aumentar el contenido de ácidos
grasos no saturados.
| Solicitante: Kirin Beer Kabushiki Kaisha |
| Título de la invención: Enzimas \beta-cetoacil-ACP-sintetasa II y genes que codifican las mismas |
| Certificado nº: 113702-432 |
| Fecha de Registro: 20 de Enero de 1998 |
| Número de Secuencias: 6 |
| SEQ ID No.: 1 |
| LONGITUD: 1251 pares de bases |
| TIPO: ácido nucleico (ADN) |
| TIPO DE CADENA: doble |
| TOPOLOGIA: lineal |
| TIPO DE MOLECULA: ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: |
| ORGANISMO: Anacystis nidulans |
| CEPA: IAM M-6 |
| DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: |
\newpage
| SEQ ID No.: 2 |
| LONGITUD: 417 aminoácidos |
| TIPO: proteína |
| TOPOLOGIA: lineal |
| TIPO DE MOLECULA: péptido |
| FUENTE ORIGINAL: |
| ORGANISMO: Anacystis nidulans |
| CEPA: IAM M-6 |
| NOMBRE/CLAVE: CDS |
| METODO DE IDENTIFICACION:.P |
| DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: |
\vskip1.000000\baselineskip
| SEQ ID No.: 3 |
| LONGITUD: 20 pares de bases |
| TIPO: ácido nucleico (ADN) |
| TIPO DE CADENA: doble |
| TOPOLOGIA: lineal |
| TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico (ADN sintético) |
| DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| SEQ ID No.: 4 |
| LONGITUD: 23 pares de bases |
| TIPO: ácido nucleico (ADN) |
| TOPOLOGIA: lineal |
| TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico (ADN sintético) |
| DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| SEQ ID No.: 5 |
| LONGITUD: 26 pares de bases |
| TIPO: ácido nucleico (ADN) |
| TOPOLOGIA: lineal |
| TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico (ADN sintético) |
| DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| SEQ ID No.: 6 |
| LONGITUD: 27 pares de bases |
| TIPO: ácido nucleico (ADN) |
| TOPOLOGIA: lineal |
| TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico (ADN sintético) |
| DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Kirin Beer Kabushiki Kaisha
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Enzimas
\beta-cetoacil-ACP sintetasa II y
genes que codifican las mismas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 78952m3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 98900438.7-2105
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1998-01-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 1143097
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-01-24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 2.1
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Kirin Beer Kabushiki Kaisha
\vskip1.000000\baselineskip
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<120> Enzimas
\beta-cetoacil-ACP sintetasa II y
genes que codifican las mismas
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<130> 78952m3
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<140> 98900438.7-2105
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<141>
1998-01-20
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<150> JP 1143097
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<151>
1997-01-24
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<170> PatentIn versión 2.1
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> anacystis nidulans
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<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 417
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> anacystis nidulans
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccnccraanc craangartt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgargargtna aytayathaan ygc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcacatatg actgaaaccg gacgcc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgcaagctt gcagcagcgc gtactgc
\hfill27
Claims (4)
1. Una proteína aislada de cianobacterias
seleccionadas del grupo formado por:
a) el cual tiene la secuencia de aminoácidos
representada por SEQ ID NO: 2;
b) el cual tiene la secuencia de aminoácidos
representada por SEQ ID NO: 2 en donde un aminoácido está
substituido, suprimido, insertado o añadido, y tiene la actividad
de la enzima \beta-cetoacil-ACP
sintetasa II;
c) el cual es codificado por un nucleótido que
comprende un mutante degenerado de la secuencia representada por
SEQ ID NO: 1 y codifica una proteína de SEQ ID NO: 2;
d) el cual es codificado por un nucleótido que
comprende una secuencia representada por SEQ ID NO: 1, en donde
dicho nucleótido codifica un polipéptido que tiene la actividad de
la enzima \beta-cetoacil-ACP
sintetasa II;
e) el cual es codificado por un nucleótido capaz
de hibridar con la secuencia de c) ó d) en una solución de
hibridación que comprende 10xDenhardt, 5 x SSC, 10 mM de EDTA, 250
\mug/ml de ADN de esperma de salmón a 60ºC durante 16 horas,
seguido por un lavado con una solución con 5xSSC, 0,1% de SDS a
45ºC durante 15 minutos, en donde dicho nucleótido tiene una
secuencia que codifica un polipéptido que tiene la actividad de la
enzima \beta-cetoacil-ACP
sintetasa II.
2. Un nucleótido que codifica la proteína de
acuerdo con la reivindicación 1.
3. Un vector recombinante que comprende el
nucleótido de acuerdo con la reivindicación 2.
4. Una célula en la cual se ha introducido el
vector de acuerdo con la reivindicación 3.
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