ES2222462T3 - Gen que codifica acido graso-desaturasa, vector que contiene dicho gen, planta que contiene dicho gen transferido a ella y procedimiento para crear dicha planta. - Google Patents

Abstract

UN GEN QUE CODIFICA UNA PROTEINA QUE TIENE UNA ACTIVIDAD DE DESATURACION DE LA POSICION {DE}9 DE UN ENLACE DE ACIDO GRASO A UN LIPIDO; UN VECTOR QUE CONTIENE UN POLINUCLEOTIDO QUE CONTIENE LA TOTALIDAD O PARTE DE DICHO GEN; UNA CELULA DE PLANTA QUE CONTIENE, TRANSFERIDO A LA MISMA, UN POLINUCLEOTIDO QUE CONTIENE LA TOTALIDAD O PARTE DE UN GEN QUE CODIFICA UNA PROTEINA QUE TIENE LA ACTIVIDAD DE DESATURACION DE LA POSICION {DE}9 DE UN ENLACE DE ACIDO GRASO A UN LIPIDO; UN PROCESO PARA CREAR UNA PLANTA QUE INCLUYE LA DIFERENCIACION DE DICHAS CELULAS DE PLANTA Y LA REGENERACION DEL CUERPO DE LA PLANTA; UNA PLANTA QUE CONTIENE, TRANSFERIDO EN LA MISMA, UN POLINUCLEOTIDO QUE CONTIENE LA TOTALIDAD O PARTE DE UN GEN QUE CODIFICA UNA PROTEINA QUE POSEE LA ACTIVIDAD DE DESATURACION DE LA POSICION {DE}9 DE UN ENLACE DE ACIDO GRASO A UN LIPIDO.

Description

Gen que codifica ácido graso-desaturasa, vector que contiene dicho gen, planta que contiene dicho gen transferido a ella y procedimiento para crear dicha planta.

Campo técnico

La presente invención se refiere a genes que codifican proteínas que tienen una actividad de desaturación de ácidos grasos unidos a lípidos en la posición \Delta-9 (en lo sucesivo denominadas "\Delta-9-desaturasas"), a vectores que contienen dichos genes, a plantas transformadas con dichos genes y a procedimientos para crear dichas plantas.

Antecedentes de la técnica

El estado de los lípidos de membrana que componen las biomembranas de los organismos cambia de cristal líquido a sólido de acuerdo con la disminución de las temperaturas exteriores. Este cambio se llama "separación de fase". La separación de fase implica el cambio de propiedades de las biomembranas. Se cree que los lípidos de membrana pierden la selectividad de permeabilidad de masa en estado sólido, haciendo imposible que las biomembranas lleven a cabo sus funciones esenciales y que, como resultado, las células se lesionen (lesión por baja temperatura).

Las temperaturas de transición de fase de los lípidos de membrana, a las cuales el estado de los lípidos de membrana cambia de cristal líquido a sólido, dependen principalmente del grado de insaturación (el número de dobles enlaces en las cadenas de carbono) de los grupos acilo de los ácidos grasos unidos a los lípidos. Una especie molecular lipídica en la que dos grupos acilo de los ácidos grasos unidos sean ambos restos de ácidos grasos saturados, tiene una temperatura de transición de fase mayor que la temperatura ambiente, mientras que una especie molecular lipídica que tenga al menos un doble enlace en los grupos acilo de los ácidos grasos unidos, tiene una temperatura de transición de fase inferior a aproximadamente 0ºC (Santaren, J.F. et al., Biochem. Biophys. Acta, 687:231, 1982).

En general, la posición de un doble enlace en un ácido graso se indica después del símbolo "\Delta" por el número de carbonos desde el extremo carboxilo al carbono que tiene el doble enlace. El número total de dobles enlaces se indica después de dos puntos después del número total de átomos de carbono. Por ejemplo, el ácido linoleico se designa 18:2 \Delta 9,12, el cual se representa por la siguiente fórmula estructural:

CH_{3}(CH_{2})_{4}CH=CHCH_{2}CH=CH(CH_{2})_{7}COOH

En algunos casos, la posición de un doble enlace se indica después del símbolo "\omega" por el número de carbonos desde el extremo metilo de un ácido graso al carbono que tiene el doble enlace.

Entre los lípidos de membrana de las plantas superiores, sólo el fosfatidilglicerol (PG) contiene un número relativamente grande de especies moleculares saturadas, y se ha sugerido enérgicamente que la transición de fase del PG es responsable de la lesión por bajas temperaturas en las plantas (Murata, N. et al., Plant Cell Physiol., 23:1071, 1982; Roughan, P.G., Plant Physiol., 77:740, 1985), y que la composición de las especies moleculares del PG viene determinada por la especificidad de sustrato de la glicerol-3-fosfato-acil-transferasa (en lo sucesivo denominada "ATasa") presente en los cloroplastos (Frentzen, M. et al., Eur. J. Biochem., 129:629, 1983; Murata, N., Plant Cell Physiol., 24:81, 1983; Frentzen, M. et al., Plant Cell Physiol., 28:1195, 1988).

Nishizawa et al. mostraron que si un gen de Atasa obtenido de Arabidopsis thaliana Heynhold, una planta resistente al frío, se introducía y expresaba en el tabaco, el contenido de especies moleculares saturadas del PG disminuía, impartiendo así una mayor resistencia al frío al tabaco que cuando era de tipo silvestre (documento PCT/JP92/00024, 1992). Sin embargo, la ATasa existe originalmente en plantas, e incluso si se expresa en plantas una gran cantidad de ATasa exógena competirá inevitablemente con la ATasa endógena, y por los tanto su efecto es probable que se diluya. Por ejemplo, el contenido de especies moleculares saturadas del PG era aproximadamente 28% en la hoja de un clon que expresaba la mayor cantidad de ATasa de Arabidopsis thaliana Heynhold a parte de los transformantes de tabaco creados, cuyo contenido era menor en aproximadamente 8% que en el tabaco de tipo silvestre y mayor en aproximadamente 8% que en Arabidopsis thaliana Heynhold de tipo silvestre (documento PCT/JP92/00024,
1992).

En general, la mayor parte del acil-ACP producido en plástidos, consiste en 16:0-ACP y 18:1-ACP, y se cree que sus proporciones son iguales. En algunos tejidos, las proporciones de 16:0-ACP y 18:0-ACP pueden ser mayores que las de 18:1-ACP (Toriyama, S. et al., Plant Cell Physiol., 29:615, 1988). En estos tejidos, puede ser difícil reducir satisfactoriamente el contenido de especies moleculares saturadas usando una ATasa exógena.

La composición de los lípidos de membrana en cianobacterias fotosintéticas (algas azul-verdes) es similar a la de los lípidos en sistemas de membrana que componen los cloroplastos de las plantas superiores (Murata, N., et al., en "The Biochemistry of Plants", Academic Press, 1987). En algas azul-verdes, el grado de insaturación de los ácidos grasos unidos a los lípidos de membrana es controlado por enzimas capaces de desaturar ácidos grasos unidos a lípidos. Se sabe que Anacystis nidulans (Synechococcus PCC 7942) que puede introducir sólo un doble enlace en los ácidos grasos unidos a lípidos es sensible al frío (Ono, T. et al., Plant Physiol., 67:176, 1981), mientras que Synechocystis PCC6803 que puede introducir al menos dos dobles enlaces es resistente al frío (Wada, H. et al., Plant Cell Physiol., 30:971, 1989).

Todas las desaturasas de ácidos grasos en las algas azul-verdes reaccionan con lípidos como sustratos para introducir un doble enlace en los ácidos grasos unidos a lípidos. Por lo tanto, se puede introducir un doble enlace de tipo cis en ácidos grasos tales como PG, SQDG, MGDG y DGDG en lípidos de membrana de algas azul-verdes, que están compuestas de especies moleculares saturadas 16:0/16:0 y 18:0/16:0 (Murata, N. et al., en "The Biochemistry of Plants" Academic Press, 1987). En relación con esto, las algas azul-verdes son muy diferentes a las plantas superiores que tienen desaturasas de ácidos grasos capaces de introducir un doble enlace en el estearoil-ACP (18:0-ACP) en la posición \Delta-9, y las cuales nunca introducen un doble enlace de tipo cis en el PG o SQDG después de la síntesis de estos lípidos que están compuestos de 16:0/16:0 (y una cantidad pequeña de 18:0/16:0) como especies moleculares saturadas.

Actualmente se sabe que la introducción y expresión de genes de \Delta-12-desaturasa de Synechocystis PCC6803 en Anacystis nidulans permite la producción de 16:2 \Delta 9,12 que no está inherentemente presente en Anacystis nidulans, impartiendo así una resistencia al frío a Anacystis nidulans, que es esencialmente sensible al frío (Wada, H. et al., Nature, 347:200, 1990).

Entre los genes obtenidos hasta ahora para las desaturasas de las algas azul-verdes se incluyen el gen de la \Delta-6-desaturasa (Reddy, A.S. et al., Plant Mol. Biol. 27:293, 1993) y un gen de la \Delta-12-desaturasa (Wada, H. et al., Nature, 347:200, 1990). Sin embargo, las \Delta-6 y \Delta-12-desaturasas no pueden desaturar ácidos grasos en las posiciones \Delta-6 y \Delta-12, respectivamente, salvo que se introduzca un doble enlace en la posición \Delta-9. Además, la \Delta-15-desaturasa no puede desaturar ácidos grasos en la posición \Delta-15 salvo que los ácidos grasos estén desaturados tanto en la posición \Delta-9 como \Delta-12. Por lo tanto, si se introducen y expresan los genes para las enzimas capaces de desaturar ácidos grasos en la posición \Delta-9 en plantas superiores, deben poder reducir el contenido de especies moleculares saturadas en las plantas superiores e impartir así resistencia al frío a las plantas superiores. Sin embargo, hasta ahora no se obtenido ningún gen para enzimas capaces de desaturar ácidos grasos en la posición \Delta-9.

El documento WO 91/13972 describe el aislamiento de una \Delta-9-desaturasa de planta obtenida de C. tinctorius, y su uso para la transformación de plantas. También describe genes que codifican \Delta-9-desaturasas de plantas superiores adicionales tales como R. communities and B. campestris. Dicha transformación puede dar como resultado tolerancia al frío.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar genes adicionales para enzimas capaces de desaturar ácidos grasos en la posición \Delta-9 y polinucleótidos que contienen parte de dichos genes.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar vectores que contienen dichos genes para enzimas capaces de desaturar ácidos grasos en la posición \Delta-9 o polinucléotidos que contienen parte de los genes.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar células de plantas y plantas que son transformadas con dichos genes, por enzimas capaces de desaturar ácidos grasos en la posición \Delta-9 o polinucleótidos que contienen parte de los genes.

Descripción de la invención

Como resultado de diferentes estudios llevados a cabo para lograr los objetivos anteriores, los autores de la invención lograron clonar un gen que codifica una desaturasa \Delta-9 de ADN genómico de alga azul-verde que pertenece al género Anacystis, obtener el vector de ADN que incorpora el gen, transformar una célula de planta con el vector de ADN, diferenciar la célula para regenerar la planta, impartiendo de esta forma resistencia al frío a la planta. La presente invención se llevó a cabo basándose en estos descubrimientos. Los temas objetivo de la presente invención son los siguientes:

(1) Genes que codifican proteínas que tienen una actividad de desaturación de ácidos grasos unidos a lípidos en la posición \Delta-9.

(2) Los genes de (1) o polinucléotidos que contienen parte de ellos, en los que las proteínas que tienen una actividad de desaturación de ácidos grasos unidos a lípidos en la posición \Delta-9, contienen la secuencia de aminoácidos sustancialmente mostrada en el SEQ ID NO: 4.

(3) Los genes de (1) o polinucleótidos que contienen parte de ellos, en los que los genes que codifican proteínas que tienen una actividad de desaturación de ácidos grasos unidos a lípidos en la posición \Delta-9 son cadenas de ADN que contienen la secuencia de bases del SEQ ID NO: 3.

(4) Vectores que contienen los genes o polinucleótidos que contienen parte de ellos, de acuerdo con uno cualquiera de (1)-(3).

(5) Células de plantas transformadas con los genes o polinucléotidos que contienen parte de ellos, de acuerdo con uno cualquiera de (1)-(3).

(6) Un método para crear plantas por diferenciación de las células de la planta de (5) para regenerar las plantas.

(7) Plantas transformadas con los genes o polinucléotidos que contienen parte de ellos de acuerdo con uno cualquiera de (1)-(3).

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos codificada por el fragmento des 9 var, comparada con la secuencia de aminoácidos de la estearoil-CoA-desaturasa de ratón (MSCD2). En la Figura 1, : indica que las dos secuencias tienen los mismos aminoácidos y \cdot indica que las dos secuencias tienen aminoácidos que tienen propiedades similares. X muestra un intervalo de alta homología.

La Figura 2 es un electroferograma que muestra un autorradiograma en un análisis Southern de un ADN genómico de Anacystis nidulans con el fragmento des 9 var usado como sonda.

La Figura 3 muestra la relación entre los fragmentos de ADN insertados, \lambda 5, \lambda 15 y p15X. Las flechas gruesas muestran las posiciones en las que es codificada una proteína y sus direcciones. Las flechas finas muestran las posiciones en que eran secuenciadas y sus direcciones.

La Figura 4 muestra las secuencias de aminoácidos de des 9 nid comparadas con la secuencia de aminoácidos de estearoil-CoA-desaturasa de ratón (MSCD2). La comparación se hizo de la misma forma que en la Figura 1.

La Figura 5 son un par de fotografías que muestran la influencia en la morfología biológica de un tratamiento a baja temperatura de plantas de tabaco transformadas. La foto de la izquierda muestra el resultado del tratamiento a baja temperatura del tabaco transformado con un gen de desaturasa, y la foto de la derecha muestra el resultado del tratamiento a baja temperatura del tabaco transformado con pBI121.

Realizaciones preferidas para llevar a cabo la invención

La \Delta-9-desaturasa de la presente invención es una enzima que está inherentemente presente en las algas azul-verdes como se ha descrito antes en "la técnica anterior". La estructura química de la \Delta-9-desaturasa tiene similitudes locales con la de las estearoil-CoA-desaturasas de ratón (Kaestner, K.H. et al., J. Biol. Chem., 264:14755, 1989), rata (Mihara, K., J. Biochem., 108:1022, 1990) y levadura (Stukey, J.E. et al., J. Biol. Chem., 265:20144, 1990), pero es muy distinta considerada en conjunto. Además, es completamente distinta de las estructuras químicas de enzimas de algas azul-verdes conocidas capaces de desaturar ácidos grasos unidos a lípidos en las posiciones \Delta-6 y \Delta-12, y de las de una enzima de planta superior capaz de desaturar ácidos grasos unidos a lípidos en la posición \omega-3 (Yadav, N.S. et al., Plant. Physiol., 103:467, 1993). En el caso en el que se produzcan los genes de la presente invención a partir de materiales naturales, se pueden usar algas azul-verdes como materias primas. Las algas azul-verdes que se van a usar incluyen, pero no se limitan, las que pertenecen a los géneros Anacystis, Synechocystis, Anabaena y similares. Con el fin de desaturar especies moleculares saturadas en plantas superiores, se prefiere la \Delta-9-desaturasa de tipo Anacystis (Murata, N. et al., Plant Cell Physiol., 33:933, 1992, Grupo de algas azul-verdes de tipo 1 que pertenecen al género Anacystis) a las de tipos Anabaena y Synechocystis por la siguiente razón.

Las posiciones sn-1 y sn-2 de casi todos los lípidos de membrana de Synechocystis PCC6803 y Anabaena variabilis, están ocupadas por ácidos grasos de 18 átomos de carbono (C18) y 16 átomos de carbono (C16), respectivamente (Sato, N. et al., Biochim. Biophys. Acta, 710:279, 1982; Wada, H. et al, Plant Cell Physiol., 30:971, 1989). Por otra parte, tanto las posiciones sn-1 como sn-2 de casi todos los lípidos de membrana de Anacystis nidulans están ocupadas por C16 (Bishop, D.G. et al., Plant Cell Physiol., 27:1593, 1986). Por lo tanto, se cree que las \Delta-9-desaturasas de Anabaena y Synechocystis tienen la actividad de reaccionar con el sustrato de la especie molecular 18:0/16:0 para desaturar 18:0 en la posición sn-1 a 18:1 \Delta-9, mientras que la \Delta-9-desaturasa de Anacystis tiene la actividad de reaccionar con el sustrato de la especie molecular 16:0/16:0 para desaturar 16:0 en la posición de sn-1 a 16:1 \Delta-9. Considerando el hecho de que las plantas superiores contienen una cantidad mayor de especies moleculares saturadas 16:0/16:0, la \Delta-9-desaturasa de tipo Anacystis es más adecuada que las enzimas de tipo Anabaena y Synechocystis para el propósito de desaturar especies moleculares saturadas en plantas superiores.

Como se mostrará a continuación en los Ejemplos, los genes de la presente invención incluyen genes que codifican la \Delta-9-desaturasa que contiene la secuencia de aminoácidos sustancialmente mostrada en el SEQ ID NO: 4 y sus isómeros degenerados capaces de codificar el mismo polipéptido excepto por los codones degenerados. Los genes de la presente invención están predominantemente en forma de cadenas de ADN. La "secuencia de aminoácidos sustancialmente mostrada en el SEQ ID NO: 4" incluye no sólo la secuencia de amino-ácidos mostrada en el SEQ ID NO: 4, sino también las secuencias de aminoácidos en las que se puede modificar parte de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4 por eliminaciones, sustituciones y/o adiciones, con la condición de que se retenga la actividad de \Delta-9-desaturasa.

Los genes de la presente invención se pueden preparar por cualquier técnica convencional a partir de las células de algas azul-verdes mencionadas.

Brevemente, los genes de la presente invención se pueden preparar por cultivo de células de algas azul-verde, recolección de éstas, preparación del ADN genómico a partir de las células de algas azul-verdes por una técnica convencional conocida, tal como precipitación en etanol o similar, preparación de una biblioteca génica basada en el ADN genómico, selección de los clones que contienen el gen deseado de la biblioteca y amplificación del ADN clónico.

Los vectores que se van a usar para preparar la biblioteca génica, incluyen cualesquiera vectores convencionales y los ejemplos específicos incluyen fagos tales como \lambda DASH II (Stratagene), cósmidos tales como pWE15 (Stratagene), fagémidos tales como pBluescript II (Stratagene) y similares. Los genes de la presente invención se pueden introducir en estos vectores por un método convencional conocido seleccionado para una clase específica de vectores.

Los clones en los que se ha introducido el gen de la presente invención, se seleccionan de los preparados en la biblioteca génica.

Los métodos para seleccionar el clon incluyen cualquier método de selección convencional conocido, por ejemplo, métodos inmunológicos tales como hibridación en placa e hibridación de colonia en los que se usan anticuerpos, así como hibridación en placa e hibridación de colonia en los que se usan sondas de nucleótidos. Un criterio preferido para la selección de la sonda de nucleótidos es usar como una sonda parte de secuencias de bases que se cree que son similares a los genes de la presente invención (por ejemplo, secuencias de bases que codifican parte de la secuencia de aminoácidos 260-295 de MSCD2 en la Figura 1).

La secuencia de bases del gen de la presente invención en el clon seleccionado se puede determinar y confirmar por cualesquiera métodos convencionales conocidos tal como el método de Maxam-Gilbert (Maxam-Gilbert, Methods Enzymol., 65:499, 1980), la técnica del terminador de cadena didesoxinucleótido usando el fago M13 (Messing, J. et al., Gene, 19:269, 1982) y similares.

La expresión real de la \Delta-9-desaturasa se puede confirmar, por ejemplo, por el método de Wada et al. (J. Bacteriol., 175:6056, 1993).

Una vez que se han secuenciado los genes de la presente invención, se pueden sintetizar por cualquier método convencional conocido, tal como un método de fosfito usando un sintetizador de ADN disponible en el comercio.

El gen de la presente invención o un polinucleótido que contiene parte del gen y que tiene la actividad de \Delta-9-desaturasa se separa de los clones seleccionados, se incorpora en un vector para introducir el gen en un hospedante de planta, introduciendo el vector en una célula de planta y expresando la \Delta-9-desaturasa en la planta, impartiendo así a la planta resistencia al frío.

La clase de plantas en la que se pueden introducir los genes no está particularmente limitada.

Los vectores para introducir el gen se deben construir de modo que el gen de la \Delta-9-desaturasa pueda ser expresado establemente en plantas. Más específicamente, se deben incorporar en posiciones adecuadas un promotor, una cadena de ADN que codifica una región de control de la traducción, una cadena de ADN que codifica un péptido para transferir a cloroplastos, el gen de la presente invención o un polinucleótido que contiene parte del gen y que tiene la actividad de \Delta-9-desaturasa, y una cadena de ADN que codifica un codón de terminación y un terminador. Como elementos de construcción para introducir genes distintos del gen de la presente invención, se puede usar cualquier elemento conocido convencional. Entre los ejemplos preferidos de la cadena de ADN que codifica un péptido para transferir a cloroplastos se incluye un gen para la subunidad pequeña de la ribulosa-1,5-bifosfato-carboxilasa de guisante. Entre los ejemplos de promotores se incluyen un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor. Entre los ejemplos del terminador se incluyen un terminador de nopalina-sintasa.

Entre los métodos para introducir los genes en las células de las plantas se incluye cualquier método convencional conocido tal como los métodos descritos en "Plant genetic transformation and gene expression; a laboratory manual", Draper, J. et al., eds., Blackwell Scientific Publications, 1988. Entre los métodos de ejemplo se incluyen métodos biológicos que usan virus y Agrobacterium, métodos fisicoquímicos tales como electroporación, un método de polietilenglicol y microinyección, y similares. Entre estos, se prefiere el de Agrobacterium para plantas dicotiledóneas tales como el tabaco puesto que asegura la transformación estable. Entre los métodos que usan Agrobacterium se incluyen un método de vector intermedio que usa un plásmido de tumor silvestre (Nature, 287 (1980) p. 654; Cell, 32 (1983) p. 1033; EMBO J., 3 (1984) p. 1525), un método de vector intermedio que usa un vector deficiente de una región génica de formación del tumor en T-ADN (EMBO J., 2 (1983) p.2143; Bio/Technology, 3 (1985) p. 629), un método de vector binario (Bio/Tecnology, 1 (1983) p. 262; Nature, 303 (1983) p. 179; Nucl. Acids Res., 12 (1984) p. 8711) y similares. Se puede usar cualquiera de estos métodos. Entre los ejemplos de los métodos en los que las plantas se infectan con Agrobacterium se incluyen la inoculación directa en células cultivadas, co-cultivo de protoplastos, un método de disco de hoja y similares. Se prefiere un método de disco de hoja en términos de la capacidad de producir un gran número de plantas transformadas de una forma directa y fácil.

Con el fin de regenerar plantas, las células de plantas transformadas se pueden cultivar en medios conocidos tales como medio de Murashige-Skoog que están complementados con antibióticos seleccionados, hormonas de crecimiento de plantas y cualesquiera otros agentes. Los plantones arraigados se transplantan al suelo y se cultivan para crecer hasta plantas completas.

Se puede ensayar en las plantas transformadas que se han hecho crecer hasta plantas maduras la resistencia al frió mediante el siguiente procedimiento:

Se cultiva una planta de ensayo a una temperatura (por ejemplo, 25ºC) a la cual no recibe una lesión por baja temperatura, y después se cultiva temporalmente (por ejemplo, durante una semana) a una temperatura baja (por ejemplo, 4ºC). Se miden la lesión de la planta, por ejemplo, clorosis, y la reducción de fertilidad. Alternativamente, la cantidad de crecimiento de la planta se puede comparar con el de una planta testigo.

Ahora se explicará la presente invención con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos que no se pretende que limiten el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Clonación de un fragmento de ADN del marco de lectura abierto que flanquea el lado corriente arriba del gen de la \Delta-12-desaturasa (des A) de Anabaena variabilis

Se cultivó Anabaena variabilis IAM M-3 proporcionado por el Instituto de Biociencias molecular y celular, Universidad de Tokio, en aproximadamente 100 ml de un medio BG-11 ("Plant Molecular Biology", Shaw, C.H. ed., p.279, IRL PRESS, 1988). El cultivo se agitó a 25ºC con luz fluorescente de 1.000 lux con una velocidad de agitación de 120 rpm para hacer crecer las bacterias completamente. La solución de cultivo se centrifugó a temperatura ambiente a 5.000 g durante 10 minutos para recoger las células precipitadas.

Para el propósito de preparar el ADN genómico, las células se suspendieron en 50 ml de solución A (Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), se lavaron y centrifugaron para recoger las células precipitadas. Posteriormente, las células resultantes se suspendieron en 15 ml de solución B (Tris-HCl 50 mM, EDTA 20 mM, NaCl 50 mM, sacarosa 0,25 M, pH 8,0). A la suspensión, se añadieron 40 mg de lisozima (Sigma) disueltos en solución B, y la mezcla se agitó a 37ºC durante 1 hora. Al cultivo agitado se añadieron proteinasa K (15 mg) y SDS (concentración final al 1%) y la mezcla se agitó a 37ºC toda la noche. Al cultivo agitado, se añadió NaClO_{4} hasta una concentración final de 1 M, y también se añadieron 20 ml de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). La mezcla resultante se agitó durante 10 minutos y después se centrifugó para recoger la capa acuosa. Después de volver a extraer con cloroformo/alcohol isoamílico (24:1), se añadieron 50 ml de etanol a la capa acuosa, y se recogió una preparación de ADN genómico enrollando el ADN en una varilla de vidrio. La preparación de ADN se disolvió en 20 ml de solución A y se añadió NaCl a una concentración final de 0,1 M. Se añadió ARNasa a una concentración final de 50 mg/ml, y la mezcla resultante se incubó a 37ºC durante 1 hora. Posteriormente, se llevó a cabo dos veces la extracción con una cantidad igual de fenol saturado con solución A, y después se añadió etanol a la capa acuosa, recogiendo así el ADN genómico precipitado. El ADN genómico se lavó con etanol al 70% y se disolvió en 1 ml de solución A para preparar una solución de ADN genómico de Anabaena variabilis.

Sakamoto et al., que describieron la presencia de un marco de lectura abierto (ORF) que flanquea el lado corriente arriba del gen de la \Delta-12-desaturasa, sugirieron que se podía hacer algo con la desaturasa, cuando dieron la conferencia sobre clonación de un gen de la \Delta-12-desaturasa de ácido graso unido a lípidos de membrana obtenido de Anabaena variabilis (Lecture Abstract No. 3aF04 en el encuentro anual de 1993 de la Sociedad Japonesa de fisiólogos de plantas). Sin embargo, no se identificó la función del ORF. Los autores de la invención tenían interés por el ORF y su función. Por lo tanto, sintetizaron cuatro cebadores (SEQ ID NO: 5-8) prestando atención a tres secuencias de bases en la cadena de ADN del ORF y usaron los cebadores en la PCR con ADN genómico de Anabaena variabilis como molde.

De los cuatro cebadores, los que tenían las secuencias de bases de los SEQ ID NO: 5 y 6 codifican hebras homosentido y los que tienen las secuencias de bases de los SEQ ID NO: 7 y 8 codifican hebras antisentido. Las secuencias de bases de los SEQ ID NO: 6 y 7 se obtienen de la misma secuencia de aminoácidos. Se seleccionó un grupo de cebadores de cada una de las hebras homosentido y antisentido y se llevó a cabo la PCR con 4 combinaciones de cebadores en total. Se añadieron los cebadores (20 \muM, cada uno) y el ADN genómico de Anabaena variabilis (1 \mug) a la solución de la reacción (100 \mul) y la reacción se llevó a cabo con un kit de PCR GeneAmp (TAKARA SHUZO CO., LTD.). Se llevaron a cabo 35 ciclos de la PCR, consistiendo cada ciclo en 95ºC (1 minuto), 45ºC (1 minuto) y 72ºC (2 minutos). En el primer ciclo, la temperatura de 95ºC se mantuvo durante 3 minutos. Después del final de la reacción, la solución de la reacción (10 \mul) se trató por electroforesis en un gel de agarosa al 2% para separar el ADN sintetizado para el análisis. Como resultado del análisis, se detectó un fragmento de ADN que tenía un tamaño esperado (aproximadamente 190 pb) como banda principal en los ADN sintetizados usando una combinación de cebadores que tienen las secuencias de bases de los SEQ ID NO: 6 y 8. El fragmento de ADN (en lo sucesivo denominado "des 9 var") se trató con un fragmento Klenow para hacer extremos romos, y después se clonó en el plásmido pTZ18R (Pharmacia) en un sitio de restricción SmaI, seguido de la determinación de la secuencia de bases con un secuenciador de ADN fluorescente (Applied Biosystems). La secuencia de bases determinada se muestra en el SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) deducida a partir de esta secuencia de bases tenía una homología significativa con la estearoil-CoA-desaturasa de ratón (véase la Figura 1, que muestra la secuencia de aminoácidos codificada por el fragmento des 9 var, comparada con la de la estearoil-CoA-desaturasa de ratón (MSCD2)).

Posteriormente, se analizó el ADN genómico de Anacystis nidulans por técnica de transferencia Southern con el fragmento des 9 var usado como sonda. Las enzimas de restricción XhoI, PstI y BamHI se usaron individualmente para escindir el ADN genómico de Anacystis nidulans (aproximadamente 0,1 \mug). Los fragmentos de ADN resultantes se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% y después se transfirieron a una membrana de nailon (Hybond-N^{+}; Amersham). Los ADN de las sondas se marcaron con [\alpha-^{32}P]dCTP usando un kit de marcaje de ADN Multiprime (Amersham). Los ADN de las sondas se hicieron reaccionar con la membrana por incubación en una solución que consistía en 6xSSPE [1xSSPE era una mezcla de tampón de fosfato 10 mM (pH 7,0), EDTA 1 mM y NaCl 0,15 M], SDS al 0,2% y ADN de esperma de arenque 100 \mug/ml a 55ºC durante 16 horas. Después se lavó la membrana resultante agitándola dos veces en 2XSSC [1xSSC era una mezcla de NaCl 0,15 M, y citrato sódico 15 mM] a temperatura ambiente durante 15 minutos, y dos veces en 0,1xSSC a 40ºC durante 15 minutos y se analizó por autorradiografía. Como resultado, sólo se detectó un fragmento de ADN en el caso en el que el ADN genómico se había escindido con cualquiera de las enzimas de restricción (véase la Figura 2. En la Figura 2, "Non" significa que el ADN genómico no se había escindido con ninguna enzima de restricción).

Ejemplo 2 Clonación de una cadena de ADN en un ADN genómico de Anacystis nidulans que tiene alta homología con el fragmento des 9 var

El cultivo de Anacystis nidulans R2-SPc proporcionado por el Instituto de Biociencias Molecular y Celular, Universidad de Tokio, y la preparación del ADN genómico se llevaron a cabo por el mismo método que en el caso de Anabaena variabilis. El ADN genómico (aproximadamente 100 \mug) se hizo digerir parcialmente con Sau3AI y después se recogieron los fragmentos de ADN de aproximadamente 9-23 kpb por ultracentrifugación en un gradiente de densidad de sacarosa de acuerdo con el método descrito en "Molecular Cloning", 2nd edition, pp. 2.85-2.87 (Sambrook, J. et al., eds. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Los fragmentos de ADN recogidos se clonaron en el vector de fago lambda \lambda DASH II (Stratagene) escindido con BamHI y HindIII, y después se empaquetaron en partículas de fago para dar una biblioteca de ADN genómico de Anacystis nidulans. Se infectaron células de E. coli P2392 con la biblioteca de fagos y se cultivaron en placas de agar NZYM de aproximadamente 15 cm de diámetro. Se formaron un total de aproximadamente 100.000 placas y después se transfirieron a membranas de nailon (Hybond-N^{+}; Amersham). De la misma forma que en el análisis Southern anterior, el fragmento des 9 var marcado con [\alpha-^{32}P]dCTP se hizo reaccionar con las membranas resultantes y se cribaron los fagos positivos detectados por autorradiografía para dar aproximadamente 30 clones de fagos que tenían diferentes intensidades de señales, de los cuales se seleccionaron 12 clones. Se obtuvo el ADN de fago de cada clon por un método convencional. El ADN de fago obtenido se escindió con varios tipos de enzimas de restricción y se separaron por eletroforesis en un gel de agarosa al 0,8%, seguido de transferencia a una membrana de nailon. La membrana resultante se analizó por técnica de transferencia Southern en las mismas condiciones que en el cribado anterior, y se compararon las longitudes e intensidades de las señales de los fragmentos de ADN que hibridaban con los ADN de las sondas. Como resultado, 2 clones, \lambda 5 y \lambda 15, mostraron las señales más fuertes. Puesto que estos dos clones tenían insertos de ADN de 11 y 15 kps, se estimó que eran suficientemente largos para contener la región entera del ORF deseada. El inserto de ADN de cada uno de los dos clones se escindió con varias enzimas de restricción y se analizó por técnica de transferencia Southern. Como resultado, se detectó un fragmento de ADN de aproximadamente 5 kpb en ambos clones, cuando se escindieron con XhoI y se hibridaron. Este fragmento de ADN se subclonó en pBluescript SK-(Stratagene) en un sitio de restricción XhoI para dar los plásmidos p5X y p15X que contenían los fragmentos de ADN obtenidos de \lambda 5 y \lambda 15, respectivamente, Se prepararon y compararon los mapas de restricción detallados de p5X y p15X. Estos mapas muestran que tanto p5X como p15X contienen el mismo fragmento de ADN genómico (véase la Figura 3 que muestra la correlación entre los insertos de ADN de \lambda 5 y \lambda 15. Los rectángulos sombreados muestran fragmentos de ADN que hibridan con el fragmento des 9 var de la sonda en el procedimiento de cribado. Las flechas gruesas muestran la región de des 9 nid (se describe a continuación) y la dirección de una hebra monosentido. Las flechas finas muestran la dirección de secuenciación de una región que contiene des 9 nid. Las barras de 5 kpb, 1,25 kpb y 0,5 kpb muestran marcadores de tamaño para los mapas de la izquierda. Las abreviaturas de las enzimas de restricción tienen los siguientes significados: B, BamHI; H, HindIII; N, NotI; Hp, HpaI; RI, EcoRI; RV, EcoRV; S, SalI; P, PstI; y X, XhoI).

Los plásmidos de deleción se prepararon a partir de p15X con enzimas de restricción o ExoIII, y se determinó la secuencia de bases de un fragmento de ADN de aproximadamente 2 kpb que contenía una región que hibridaba con el fragmento des 9 var, con un secuenciador de ADN fluorescente (véase la Figura 3). Como resultado, se estimó que el fragmento de ADN contendría el ORF (des 9 nid) de 834 pb (SEQ ID NO: 3) que codificaría 278 aminoácidos (SEQ ID NO: 4). La secuencia de aminoácidos tenía aproximadamente 80% de homología con la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) del fragmento des 9 var previamente clonado obtenido de Anabaena variabilis. Se llevó a cabo una búsqueda de secuencias de aminoácidos altamente homólogas con el software de análisis de secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos GENETYX (Software Development) y las bases de datos de secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos EMBL y DDBJ. Los resultados de la búsqueda pusieron de manifiesto que des 9 nid tenía aproximadamente 30% de homología general con la estearoil-Co-A-desaturasa de ratón, pero que parte de des 9 nid tenía una homología muy alta con la desaturasa de ratón (véase la Figura 4 que muestra la secuencia de aminoácidos de des 9 nid comparada con la de la estearoil-Co-A-desaturasa de ratón (MSCD2)), que sugiere que el des 9 nid obtenido codificaría una enzima capaz de desaturar ácidos grasos.

Ejemplo 3 Determinación de la actividad por expresión del gen des 9 nid en E. coli

La desaturasa de Anacystis nidulans sólo tiene una actividad de \Delta-9-desaturasa o capacidad de desaturar ácidos grasos saturados unidos a lípidos en la posición 9 (Bishop, D.G. et al., Plant Cell Physiol., 27:1593, 1986). Por esta razón, se hizo un intento de expresar el polipéptido codificado por des 9 nid en E. coli y se midió su actividad.

Puesto que la expresión directa a partir de p15X es difícil, se preparó un vector para la expresión en E. coli. Específicamente, se seleccionó pET3a (Novagen) como vector y se clonó des 9 nid en pET3a entre los sitios de restricción NdeI y BamHI, de modo que no se añadieran aminoácidos extra al extremo amino del polipéptido codificado por des 9 nid, mediante el siguiente procedimiento:

Con el fin de insertar un sitio de restricción BamHI justo corriente abajo del extremo C de la proteína codificada por des 9 nid, se llevó a cabo la PCR con las secuencias de bases de dos partes que tenían el extremo C entre ellas. Específicamente, la PCR se llevó a cabo con los dos siguientes cebadores y usando p15X como molde para dar un producto de aproximadamente 140 pb.

Cebador homosentido: 5'-ACGTCATGGCCTGCAGT (está subrayado un sitio de restricción PstI) (SEQ ID NO: 9)

Cebador antisentido: 5'-CGC\underline{GGATCC\underline{TTA}}GTTGTTTGGAGACG (se ha dibujado una sola línea bajo un sitio de restricción BamHI y se ha dibujado una línea doble bajo un codón de parada) (SEQ ID NO: 10).

El producto se subclonó en pUC19 en un sitio de restricción SmaI y se confirmó la precisión de la secuencia de bases. Como resultado, se creó un sitio de restricción EcoRI corriente abajo del sitio de restricción BamHI en el plásmido resultante. El plásmido se escindió secuencialmente con EcoRI y PstI. Mientras tanto, se escindió p15X con las mismas enzimas de restricción para introducir un sitio de restricción BamHI justo corriente abajo del codón de parada. El plásmido se escindió con SalI y después se llevó a cabo una reacción de relleno con un fragmento Klenow de ADN-polimerasa en presencia de cuatro clases de dNTP, seguido de escisión con HindIII. Se insertó el adaptador que consistía en los dos ADN siguientes sintetizados en el plásmido resultante, introduciendo así un sitio de restricción NdeI en el extremo amino. El adaptador era una mezcla de cantidades equimolares de los dos siguientes ADN.

5'-CATATGACCCTTGCTATCCGACCCA (está subrayado un sitio de restricción NdeI) (SEQ ID NO: 11) y

5'-\underline{\underline{AGCTT}}GGGTCGGATAGCAAGGGTCATATG (se ha dibujado una sola línea bajo un sitio de restricción NdeI y se ha dibujado una línea doble bajo parte de un sitio de restricción HindIII) (SEQ ID NO: 12).

El plásmido resultante (pDes9Nde) se introdujo en células competentes de la cepa de E. coli BL21 (DE3) (Novagen) que se prepararon por un método convencional (Molecular Cloning, pp.250-251, 1982). Se obtuvo la cepa transformada BLDES1 por selección por resistencia a la ampicilina.

La cepa BLDES1 y la cepa BL21 (BL1) que contenía pET3a se inocularon en 100 ml de medio M9 (que contenía ampicilina 200 \mug/ml, glucosa 4 mg/ml, FeCl_{3} 10 \muM, vitamina B1 0,5 \mug/ml, ácidos Casamino 1 mg/ml) y se cultivaron a 37ºC. Se continuó cultivando hasta que la turbidez de la solución del cultivo alcanzó D.O. 0,5 a una longitud de onda de 600 nm. Se añadió isopropiltiogalactósido (IPTG) hasta una concentración final de 1 mM a la solución de cultivo. Las células se cultivaron durante 1 hora adicional para inducir la expresión del gen de la \Delta-9-desaturasa. Los sedimentos de E. coli se recogieron y lavaron con NaCl al 1,2%, seguido de extracción de lípidos. Los lípidos se extrajeron por el método de Bligh and Dyer (Can J. Biochem. Physiol., 37:911, 1959) y se hicieron reaccionar con hidrocloruro en metanol al 5% (2,5 ml) a 85ºC durante 2,5 horas en condiciones completamente cerradas para dar ácidos grasos metilados. Los ésteres de metilo de los ácidos grasos producidos se extrajeron 4 veces con hexano (2,5 ml) y se concentraron eliminando el disolvente con nitrógeno gaseoso. Los ésteres de metilo de los ácidos grasos se analizaron por cromatografía de gases. Los ácidos grasos se identificaron por comparación de los tiempos de retención con los ésteres de metilo de los ácidos grasos patrón. El análisis cuantitativo se llevó a cabo con un Chromatopack C-R7A plus (Shimadzu Corp.). Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 1.

TABLA 1 Composición de ácidos grasos en E. coli

1

Las horas indican el tiempo de inducción de la proteína con IPTG.

Los resultados pusieron de manifiesto que 16:1 aumentaban en la cepa BLDES1, mostrando que el gen de la presente invención tiene actividad de desaturación de 16:0

Las dos cepas se cultivaron en un medio M9 complementado con ácido esteárico 0,1 mM y se hizo una comparación de la misma forma que antes. En contraste con la cepa BL, la cepa BLDES1 produjo no sólo 16:1 sino también 18:1 \Delta 9. Esto indica que el polipéptido codificado por des 9 nid puede usar como sustrato no sólo 16:0 sino también 18:0 para producir ácidos grasos insaturados.

Ejemplo 4 Introducción del gen des 9 nid en plantas de tabaco

Se incorporó el gen des 9 nid obtenido de Anacystis nidulans en plantas de tabaco como sigue:

(1) Construcción del plásmido vector para la expresión en plantas

Se escindió el plásmido pDes9Nde con SacI y SalI para dar un fragmento de gen des 9 nid mantenido entre los sitios de las dos enzimas de restricción. Se cortó una secuencia de tránsito de cloroplasto del clon pSNIP9 que contenía un gen RuBisCo de guisante (Schreicher et al., EMBO J. 4, 25 (1985)) con HindIII y SphI y se clonó en pUC118 escindido con las mismas enzimas de restricción, dando de este modo el plásmido pTRA3 que contenía un sitio de multiclonación corriente abajo de la secuencia de tránsito. El sitio de restricción HindIII de este plásmido se escindió y se rellenó con una enzima Klenow, seguido de inserción de un conector XbaI (pTRA3X). El plásmido pTRA3X se escindió con SalI y SacI y se insertó el fragmento de des 9 nid que se había obtenido por escisión con las mismas enzimas de restricción (pTRA3Xdes9). En pTRA3Xdes9, el gen des 9 nid se traduciría, después de la secuencia de tránsito de RuBisCO, en el mismo marco de lectura. El plásmido se escindió con SacI y XbaI y se insertó en el siguiente vector para plantas. El plásmido de tipo binario pBI121 (Clonetech) para expresión en plantas se escindió con SacI y XbaI para dar el plásmido sin gen de la \beta-glucuronidasa (gen GUS) pBI(-GUS). El transgén antes preparado se insertó en el plásmido pBI(-GUS) entre el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y el terminador de la nopalina-sintasa (NOS) para dar un vector (pBI121(-GUS)Rbsc-des9) para introducir en plantas.

(2) Introducción de pBI121(-GUS)Rbsc-des9 en Agrobacterium

Se inoculó Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clonetech) en 50 ml de un medio YEB (5 g de extracto de vaca, 1 g de extracto de levadura, 1 g de peptona, y 5 g de sacarosa por litro, complementado con MgSO_{4} 2 mM (pH 7,4)) y se cultivó a 28ºC durante 24 horas. La solución cultivada se centrifugó a 3.000 rpm a 4ºC durante 20 minutos para recoger las células. Las células se lavaron 3 veces con 10 ml de Hepes-KOH 1 mM (pH 7,4) y una vez con glicerol al 10%. Las células se suspendieron en 3 ml de glicerol al 10% para preparar células de Agrobacterium para introducir el ADN.

La solución de células así obtenida (50 \mul) y el plásmido pBI121(-GUS)Rbsc-des9 (1 \mug) se pusieron en una cubeta y se trataron con pulsos eléctricos usando un aparato de electroporación Gene Pulser (BioRad) en las condiciones de 25 \muf, 2500 V y 200 \Omega, introduciendo así el ADN plasmídico en Agrobacterium. La solución de células se transfirió a un tubo Eppendorf y se añadieron 800 \mul de un medio SOC (20 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, y 0,5 g de NaCl por litro complementado con KCl 2,5 mM, MgSO_{4} 10 mM, MgCl_{2} 10 mM, y glucosa 20 mM (pH 7,0)). Las células se cultivaron de forma estática a 28ºC durante 1,5 horas. La solución del cultivo (50 \mul) se inoculó en un medio de agar YEB (agar al 1,2%) complementado con 100 ppm de kanamicina y se cultivo a 28ºC durante 2 días.

Se seleccionaron las colonias bien separadas de las colonias resultantes y se preparó el ADN plasmídico a partir de las colonias seleccionadas por un método alcalino. El ADN plasmídico se hizo digerir con enzimas de restricción adecuadas. Después, los fragmentos de ADN resultantes se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se analizaron por la técnica de transferencia Southern usando el fragmento del gen des 9 nid marcado con ^{32}P como sonda; se confirmó que las células de Agrobacterium contenían el plásmido pBI121(-GUS)Rbsc-des9. Esta línea celular de Agrobacterium tumefaciens se abrevia "ALBBSDES".

(3) Transformación del tabaco

Se cultivó la línea celular ALBBSDES con agitación en un medio líquido LB complementado con 50 ppm de kanamicina a 28ºC durante 2 días. La solución del cultivo (1,5 ml) se centrifugó a 10.000 rpm durante 3 minutos para recoger las células. Después las células se lavaron con 1 ml de medio LB para separar la kanamicina. Adicionalmente, la solución de células se centrifugó a 10.000 rpm durante 3 minutos para recoger las células. Después las células se volvieron a suspender en 1,5 ml de medio LB para preparar una solución de células para la infección.

Para infectar el tabaco, se cogió una hoja joven de tabaco y se sumergió en una solución de hipoclorito sódico en agua al 0,5% durante 10 minutos. Posteriormente, la hoja se lavó 3 veces con agua esterilizada y se secó con papel de filtro esterilizado para preparar una muestra de hoja para infectar. La hoja se cortó asépticamente con un cuchillo en trozos de 1 cm^{2} cada uno. Los trozos se pusieron en la solución de Agrobacterium de modo que el reverso de cada trozo estuviera hacia arriba, y se agitó suavemente durante 2 minutos. Después los trozos se pusieron sobre un papel de filtro esterilizado para separar el exceso de Agrobacterium. Se puso papel de filtro Whatman No. 1 (\diameter 7,0 cm) en un medio MS-B5 (que contenía 1,0 ppm de benciladenina, 0,1 ppm de ácido naftalenacético, y agar al 0,8%) (Murashige, T. and Skoog, F. Plant. Physiol., 15:473 (1962)) en una placa, y cada trozo de las hojas de muestra se puso en un papel de filtro de modo que el reverso de la hoja estuviera hacia arriba. La placa se cerró con un parafilm y la hoja se cultivó a lo largo de ciclos de 16 horas con luz y 8 horas en la oscuridad a 25ºC durante 2 días. Posteriormente, la hoja se transfirió a un medio MS-B5 complementado con 250 ppm de Calforan y se cultivó en las mismas condiciones para separar el Agrobacterium. Adicionalmente, la hoja se puso en un medio MS-B5 complementado con 250 ppm de Calforan y 100 ppm de kanamicina en la parte inferior de una placa, y se cultivó en las mismas condiciones durante 7 días. Mientras tanto, se formaron los callos alrededor de la hoja y empezaron los brotes. Después de cultivar durante 10 días adicionales, los brotes desarrollados se pusieron en un medio MS-HF (medio MS-B5 sin benciladenina y ácido naftalenacético) complementado con 250 ppm de Calforan y 100 ppm de kanamicina. Después de cultivar durante 10 días, los brotes arraigados se seleccionaron como un transformante tolerante a la kanamicina y se transplantaron en un medio MS-HF complementado con 250 ppm de Calforan en una caja para cultivo de plantas.

Ejemplo 5 Análisis Southern y Northern del genoma de tabaco transformado

Se extrajo ADN del tabaco que tolera la kanamicina y se analizó por técnicas de transferencia Southern y Northern para confirmar la introducción y la expresión del gen deseado. La extracción del ADN genómico se llevó a cabo por un método CTAB de acuerdo con un manual (Rogers, S.O. & Bendich, A.J.: Plant Molecular Biology Manual A6; 1 (1988)). Brevemente, se trituraron en nitrógeno líquido hojas de tabaco (2 g) y se extrajo el ADN genómico con un tampón de extracción CTAB. El ADN (10 \mug) se escindió con EcoRI y XbaI y después se trató por electroforesis en un gel de agarosa al 0,7%, seguido de transferencia de los fragmentos de ADN separados con NaOH 0,4 N a una membrana de nailon (Hybond N+; Amersham). El gen de la desaturasa que contenía el tránsito obtenido de pTRA3Xdes9 se usó como una sonda para la hibridación con la membrana a 65ºC durante 16 horas, confirmando así que el gen deseado se introdujo en el genoma del tabaco.

Se extrajo el ARN de las hojas de tabaco (aproximadamente 2 g) y se analizó para confirmar la expresión del transgén. El procedimiento consistía en extraer poli(A)+ARN con ácido guanidino-tiociánico (Nagy, F., et al., Plant Molecular Biology Manual B4; 1 (1988)) y se trató por electroforesis en un gel de agarosa que contenía formaldehído. El ARN se transfirió a una membrana de nailon (Hybond N; Amersham) y se analizó en las mismas condiciones de hibridación que en el método Southern. Entre los transformantes que expresaban diferentes cantidades de ARN, se seleccionaron los que expresaban grandes cantidades de ARN y se analizaron los ácidos grasos.

Ejemplo 6 Análisis de los ácidos grasos de los lípidos en las plantas de tabaco transformadas

Se prepararon lípidos tales como fosfatidilglicerol (PG) y sulfoquinovosildiacilglicerol (SQDG) por el siguiente método, a partir de hojas de las plantas de tabaco transformadas en las cuales se verificó la alta expresión de ARN en el Ejemplo 5 y la de las plantas de tabaco patrón transformadas con pBI121. Se analizaron sus composiciones de ácidos grasos. Se analizaron también los lípidos de la raíz respecto a parte de los transformantes y no transformantes.

(1) Extracción de los lípidos totales

Se extrajeron los lípidos por el método de Bligh-Dyer (Can J. Biochem. Physiol. 37:911, 1959). Se cortaron dos gramos en peso húmedo de hojas (1 g, cuando se usó parte de la raíz como muestra) con un cuchillo, y se añadieron 20 ml de cloroformo/metanol (1:2, relación en volumen). Las hojas se rompieron con un homogeneizador y se dejaron reposar durante 15 minutos. Se añadieron cloroformo (12 ml) y agua destilada (12 ml) a las hojas rotas y la mezcla se agitó vigorosamente. La mezcla se centrifugó a 3.000 rpm a 4ºC durante 30 minutos para separar las capas acuosa y orgánica. La capa orgánica (inferior) se recogió y se añadió una cantidad adecuada de etanol. Los disolventes se destilaron a 30ºC a presión reducida con un rotavapor. El residuo se disolvió en 2 ml de cloroformo/metanol (relación en volumen, 1:4) para preparar un extracto de los lípidos totales. Parte del extracto de los lípidos totales se trató con ácido clorhídrico en metanol al 5% por el siguiente método, para dar los ácidos grasos metilados.

(2) Fraccionamiento de los lípidos

Una suspensión (2,5 ml) de DEAE-Toyopearl 650C (TOSOH) se mezcló con 25 ml de una solución de acetato sódico en agua 1 M (pH 7,0) para preparar una forma de ácido acético. La suspensión resultante se lavó secuencialmente con agua destilada y metanol y se suspendió en metanol. La suspensión resultante se empaquetó en una columna (d.i. 2 cm) hasta 1,5 cm de altura y se lavó con 50 ml de cloroformo/metanol (1:4, relación en volumen).

Posteriormente, el extracto de los lípidos totales se aplicó a la columna. Se eluyeron monogalactosil-diacilglicerol (MGDG), digalactosildiacilglicerol (DGDG), fosfatidiletanolamina (PE) y fosfatidilcolina (PC) con 50 ml de cloroformo/metanol(1:4, relación en volumen) para preparar las fracciones de los lípidos neutros (MGDG, DGDG, PE y PC). Después se eluyó la fosfatidilserina (PS) con 5 ml de ácido acético, y el ácido acético se lavó con 20 ml de cloroformo/metanol (1:4, relación en volumen). Se obtuvo una fracción que contenía PG, SQDG y fosfatidilinositol (PI) por extracción con 50 ml de una solución acuosa de cloroformo, metanol y acetato amónico 10 M (20:80:0,2, relación en volumen). Se añadió etanol (15 ml) a esta fracción y los disolventes se destilaron a presión reducida. El residuo se disolvió en 0,2 ml de cloroformo/metanol (2:1, relación en volumen) para preparar las fracciones de lípidos ácidos (PG, SQDG y PI).

Las fracciones de MGDG, DGDG, PE y PC se volvieron a fraccionar por cromatografía en columna de ácido salicílico (Iatrobeads, Iatron Laboratories Inc.). Más específicamente, las muestras disueltas en cloroformo (1 ml) se aplicaron a una columna equilibrada con cloroformo y eluida secuencialmente con cloroformo/acetona (4:1), acetona y metanol, de modo que se eluyeron los glicolípidos (MGDG y DGDG) con acetona y los fosfolípidos (PC y PE) con metanol.

(3) Aislamiento y purificación de PG por cromatografía en capa fina (TLC) y análisis de ácidos grasos

Las fracciones obtenidas en la etapa (2) se separaron con una placa de TLC-gel de sílice #5721 (Merck). Como disolventes para el desarrollo se usaron cloroformo/acetona/metanol/ácido acético/agua (50:20:10:15:5, relación en volumen) para separar los lípidos ácidos, y se usó cloroformo/metanol/agua (70:21:3, relación en volumen) para separar los lípidos neutros. Después de separación por TLC se pulverizó primulina (solución en acetona al 80%) para desarrollar fluorescencia con luz ultravioleta. Se valoraron las diferentes clases de fracciones de lípidos por comparación de la movilidad con lípidos patrón. Los lípidos que desarrollaron fluorescencia se descartaron junto con el gel de sílice y se pusieron en tubos de ensayo equipados con tapones de rosca. Cuando se iban a calcular las composiciones de ácidos grasos de los lípidos, se añadieron 3 ml de ácido clorhídrico en metanol al 5% a los lípidos, y las mezclas se hicieron reaccionar a 85ºC durante 2 horas en condiciones completamente cerradas para dar ácidos grasos metilados. Mientras tanto, con el fin de determinar las composiciones de ácidos grasos en sn-1 y sn-2, los lípidos se recogieron del gel de sílice descartado con 5 ml de una solución mezclada de cloroformo/metanol (2:1) y se secaron. Se añadieron a los lípidos 1 ml de TrisCl 50 mM (pH 7,2) y Triton X-100 al 0,05%, y la mezcla se agitó vigorosamente para dispersar los lípidos. Se añadió lipasa obtenida de Rhizopus delemar (2500 U; Boehringer) a la dispersión y la mezcla se mantuvo a 37ºC durante 30 minutos para liberar los ácidos grasos selectivamente de la posición sn-1. Después de concentrar los productos de reacción, los lípidos sin reaccionar, lisolípidos y ácidos grasos libres se separaron por TLC usando cloroformo/acetona/metanol/ácido acético/agua (10:4:2:3:1) como disolvente para el desarrollo. Estas sustancias se recogieron del gel y se hicieron reaccionar con ácido clorhídrico en metanol por el mismo método descrito antes para dar los ácidos grasos metilados. Los ésteres de metilo de los ácidos grasos producidos se extrajeron 4 veces con 3 ml de hexano y se concentraron por destilación del disolvente a presión reducida. Los ésteres de metilo de los ácidos grasos se analizaron por cromatografía de gases. Los ácidos grasos se identificaron por comparación del tiempo de retención con los ésteres de metilo de ácidos grasos patrón. El análisis cuantitativo se llevó a cabo en un Chromatopack C-R7A plus (Shimadzu Corp.). Los resultados para los lípidos totales, PG y otros lípidos representativos se muestran en las Tablas 2, 3 y 4, respectivamente. Estas tablas muestran los valores analíticos promedio para 2 testigos y 2 ó 3 transformantes independientes.

TABLA 2 Resultados del análisis de ácidos grasos en los lípidos totales en las hojas

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TABLA 3 Resultados del análisis de ácidos grasos en PG

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TABLA 4 Resultados del análisis de ácidos grasos en otros lípidos

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Los resultados de los análisis de ácidos grasos unidos a PG pusieron de manifiesto que en las plantas de tabaco transformadas que expresaban desaturasa de ácidos grasos obtenida de Anacystis nidulans, 16:0 (ácido palmítico) disminuía mucho mientras que 16:1 cis aumentaba y 18:0 se hacía casi cero (había una pequeña cantidad de 18:0 presente en el testigo), mientras que 18:0 aumentaba. Por lo tanto, el contenido de ácidos grasos saturados (16:0+16:1trans+18:0 (ácido esteárico)) era 70% en las plantas de tabaco testigo, mientras que se reducía significativamente al 55% en las plantas de tabaco transformadas con el gen de desaturasa. Los resultados de los análisis respectivos en PG en las posiciones sn-1 y sn-2 pusieron de manifiesto que más de 98% de la posición sn-2 estaba ocupada por ácidos grasos saturados (16:0 ó 16:1trans), y que todo el 16:1 recién producido por la introducción del gen estaba presente en la posición sn-1. Por lo tanto, es evidente que la cantidad de ácidos grasos saturados en la posición sn-1 de PG se hace muy pequeña en el tabaco transformado con el gen de desaturasa. Como conclusión, se encontró que la cantidad de especies moleculares saturadas que consistían en ácidos grasos saturados tanto en las posiciones sn-1 como sn-2 disminuía mucho, y que por lo tanto, las plantas de tabaco cambiaban a un tipo significativamente resistentes al frío, valorado a partir de la composición de las especies moleculares de los lípidos.

En relación con los otros lípidos, MGDG, DGDG, SQDG, PC, PE y PC, es evidente que 16:0 disminuía con un correspondiente aumento de aproximadamente 10% de 16:1 y que se potenciaba la desaturación de 18:0. En MGDG y DGDG, 16:1 se producía principalmente en la posición sn-1 pero también se detectó la producción de una pequeña cantidad de 16:1 en la posición sn-2. Se encontró que la desaturación de MGDG, DGDG, SQDG y PG, que eran lípidos presentes predominantemente en cloroplastos, se potenciaba sorprendentemente expresando la desaturasa de un alga azul-verde Anacystis nidulans en los cloroplastos de las plantas superiores. Había una alta posibilidad de que estos cuatro tipos de lípidos que estaban presentes en las membranas de Anacystis nidulans se pudieran usar como sustratos para la desaturasa. Es bastante sorprendente que el ácido palmítico y ácido esteárico se desaturaran en PC, PE y PI, porque estos lípidos están ausentes en las membranas de Anacystis nidulans pero estaban presentes predominantemente fuera de los cloroplastos en plantas superiores.

En este Ejemplo, los resultados de los análisis de lípidos de las plantas de tabaco transformadas, demostraron que la desaturasa de ácidos grasos obtenida de Anacystis nidulans podía desaturar 16:0 y 18:0 en casi todos los lípidos con una eficacia extremadamente alta en el tabaco transformado que es una planta superior.

Los resultados de los análisis de ácidos grasos en los lípidos totales de la raíz se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5 Resultados del análisis de ácidos grasos en los lípidos totales de la raíz

5

Los resultados pusieron de manifiesto que bastante sorprendentemente, la desaturasa de ácidos grasos obtenida de Anacystis nidulans catalizaba la desaturación de 16:0 y 18:0 no sólo en las hojas sino también en las raíces, sugiriendo que el gen de la desaturasa de ácidos grasos de la presente invención, podría tener no sólo la posibilidad de mejorar la resistencia al frío de las plantas sino también la posibilidad de aumentar el contenido de ácidos grasos insaturados, y que esto es útil en las industrias en las que se usan plantas como materias primas para la producción de aceite.

Ejemplo 7 Ensayo de la resistencia al frío de las plantas de tabaco transformadas

Los transformantes que se creyó que eran prometedores en el ensayo de expresión del ARN y los análisis de lípidos, se autopolinizaron y se recogieron las semillas de la siguiente generación. Parte de las semillas se plantaron en un medio MS-HF complementado con 800 ppm de kanamicina, y se cultivaron a 25ºC durante 2 semanas en condiciones de 16 horas con luz y 8 horas en la oscuridad. Se recogieron los plantones tolerantes a la kanamicina. Los plantones se transplantaron a cajas para cultivo de plantas, y se cultivaron durante 4 semanas adicionales. En relación con la planta transformada con pBI121, se repitió el procedimiento anterior (testigo).

Las plantas se sometieron a un tratamiento de baja temperatura a 4ºC en condiciones continuas de luz durante 11 días, y después se cultivaron a 25ºC durante 2 días. Como resultado, se observó notable ondulación de las hojas y clorosis en las plantas testigo (la planta transformada con pBI121) pero no se observó lesión en las plantas transformadas. Por lo tanto, se supuso que la resistencia al frío había mejorado por la introducción del gen de la desaturasa.

Aplicabilidad industrial

Se puede impartir resistencia al frío a las plantas, y se puede aumentar su contenido de ácidos grasos insaturados introduciendo el gen de la presente invención que codifica la \Delta-9-desaturasa.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 13-5, Fukura 1-chome, Kanazawa-ku

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Yokohama-shi

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Kanagawa 236

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAIS: Japón

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): Ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Gen para la desaturasa de ácidos grasos, vector que contiene dicho gen, planta que contiene dicho gen transferido a ésta, y procedimiento para crear dicha planta

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 12

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMATO DE LECTURA EN EL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.800000\baselineskip

NÚMERO DE SOLICITUD: EP 95904020.5-2105

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 196 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Anabaena variabilis

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: IAM M-3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 65 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Anabaena variabilis

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: IAM M-3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 837 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Anacystis nidulans

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: R2-SPc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 278 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Anacystis nidulans

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: R2-SPc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGACAATTG CTACTTCA

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCTGGGGT TGTTG

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAACAACCCC AGAGC

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTGTTTTTG CCA

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGTCATGGC CTGCAGT

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGATCCT TAGTTGTTTG GAGACG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATATGACCC TTGCTATCCG ACCCA

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTTGGGTC GGATAGCAAG GGTCATATG

\hfill

29

Claims (9)

1. Una molécula de polinucleótido que codifica una proteína que tiene los siguientes (1) a (4):

(1)

que tiene actividad de desaturación de ácidos grasos unidos a lípidos en la posición \Delta-9,

(2)

que reacciona con especies moleculares saturadas 16:0 y 18:0,

(3)

que reacciona en la posición de sn-1 y sn-2,

(4)

y que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 en la que parte de la secuencia de aminoácidos se ha eliminado, sustituido y/o añadido.

2. La molécula de polinucleótido de la reivindicación 1, en la que dicha molécula de polinucleótido está presente en el género Anacystis.

3. La molécula de polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:4.

4. La molécula de polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que dicha molécula de polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3.

5. Un vector que contiene el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Una célula de planta transformada con la molécula de polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

7. Un método para crear una planta por regeneración de la célula de planta de la reivindicación 6, para producir una planta madura.

8. Una planta transformada con la molécula de polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

9. Un método para crear una planta que tiene una resistencia al frío mejorada, que comprende introducir una molécula de polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.