ES2305313T5

ES2305313T5 - Bacterias que producen ácido láctico para el uso como organismos probióticos en la vagina humana

Info

Publication number: ES2305313T5
Application number: ES02780211.5T
Authority: ES
Inventors: Carolina Samuelsson; Endre Kvanta; Anna Weiner Jiffer
Original assignee: Ellen AB
Current assignee: Ellen AB
Priority date: 2001-09-20
Filing date: 2002-09-19
Publication date: 2017-11-13
Anticipated expiration: 2022-09-19
Also published as: US20040253217A1; JP4223955B2; ZA200401315B; SE521022C2; ATE393211T2; IL160937A0; IL160937A; US7312067B2; US20080057046A1; AU2002343282B2; CA2459178C; CN1556852A; EP1427808B1; CN1308436C; PL369201A1; DE60226254T3; DE60226254T2; ES2305313T3; PL206760B1; JP2005507256A

Description

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DESCRIPCION

Bacterias que producen acido lactico para el uso como organismos probioticos en la vagina humana Campo Tecnico

La presente invencion se refiere a bacterias que producen acido lactico y a su uso.

Antecedentes tecnicos

La flora microbiana normal de la vagina humana comprende bacterias que producen acido lactico, que tradicionalmente se han denominado Bacilos de Doderlein.

Tales bacterias productoras de acido lactico se refieren a bacterias que no forman esporas, Gram positivo y que producen acido lactico mediante la fermentacion de varios azucares, tales como glucogeno y/o glucosa.

Las bacterias que producen acido lactico comprenden, por ejemplo, bacterias de los generos Lactobacilo, Leuconostoc, Pediococo, Estreptococo, Lactococo y Enterococo.

Las bacterias que producen acido lactico pueden dividirse en bacterias homofermentativas y heterofermentativas, dependiendo de sus rutas metabolicas. Las bacterias homofermentativas (por ejemplo Lactobacillus acidophilus) producen simplemente acido lactico, mientras que las bacterias heterofermentativas tambien producen, por ejemplo, oxido de carbono, etanol y acido acetico.

El genero Lactobacilo es un grupo fenotipicamente heterogeneo de bacterias anaerobias desde el punto de vista facultativo, catalasa-negativa, con forma de huso y que producen acido lactico. Se reconocen alrededor de 50 especies distintas, y generalmente estas especies poseen un ADN con bajo contenido en guanina (G) y citosina (C), aproximadamente de 33-53%. El contenido G-C es constante dentro de las especies. Algunas especies de Lactobacilo se encuentran en humanos, por ejemplo en la cavidad bucal, tracto intestinal y en la vagina. Las especies de Lactobacilo que se encuentran presentes en la vagina son, por ejemplo, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus casei (subespecie rhamnosus) y Lactobacillus jensenii.

El genero Pediococo es, desde el punto de vista fenotipico, un grupo de bacterias Gram-positivo, catalasa-negativa, facultativamente anaerobias, oxigeno-tolerantes, con forma de huso (diametro de alrededor de 0,6-1,0 pm), no patogenas y productoras de acido lactico.

Las mujeres sanas y fertiles (de edad entre 15 y 60 anos) presentan un pH de alrededor de 3,8-4,2 en la vagina entre menstruaciones, principalmente como resultado de la produccion de dicho acido lactico. El medio acido evita que bacterias que estan presentes en el colon, tales como Gardnerella vaginalis, Mobiluncus Bacteroides, Prevotella y Eschericha coli, se instalen en la vagina.

La piel del tracto urogenital y las membranas mucosas urogenitales de mujeres sanas albergan una flora especifica de microorganismos comensales y/o beneficiosos, tales como varias especies de Lactobacilo. No obstante, el tracto urogenital tambien puede estar colonizado por microorganismos causantes de enfermedades. La colonizacion por microorganismos no deseados puede ser el resultado de transmision sexual, puede tener lugar de forma espontanea o puede ser el resultado de la perturbacion de una flora microbiana normal. Se sabe que esto ultimo ocurre, por ejemplo, tras determinadas terapias antibioticas.

De esta forma, la flora microbiana del tracto urogenital femenino, tal como la vagina, puede sufrir perturbacion o alteracion provocada por una infeccion microbiana, tal como una levadura (Candida albinancs), Tricomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis, vaginosis bacteriana (caracterizada por una mayor prevalencia de Gardnerella vaginalis y Mobiluncus) y tratamiento antibiotico u otras causas a menudo complejas.

Durante la menstruacion y el coito, aumenta el pH de la vagina por la adicion de sangre y esperma, respectivamente. Estos fluidos contienen muchas proteinas, que pueden ser digeridas por bacterias (por ejemplo Gardnerella vaginalis y Mobiluncus) que, como se ha descrito anteriormente, pueden alojarse en la vagina en condiciones de pH elevado. A continuacion, se generan productos de degradacion, tales como aminas (por ejemplo putrescina y cadaverina). A pH elevado, estas aminas se vuelven volatiles y presentan un olor “a pescado”. De manera adicional, estas mujeres presentan sintomas de elevado flujo vaginal e irritacion. Esta afeccion se denomina vaginosis bacteriana (BV) y constituye la afeccion mas comun asociada a irritacion vaginal y elevada cantidad de flujo vaginal de fuerte olor (vease Morris, M; Nicoll, A; Simas, I; Wilson, J; Catchpole, M, Bacterial vaginosis: A public health review, British Jornal of Obstetrics and Gynaecology, 108(5): 439-450, Mayo 2001).

Se piensa que la vaginosis bacteriana es el resultado de la sustitucion de bacterias vaginales productoras de acido lactico por una variedad de especies no deseadas tales como Gardnerella vaginalis, Bacteroides, Mobiluncus,

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Prevotella bivia y Micoplasma hominis.

Un metodo para diagnosticar la vaginosis bacteriana (BV) es el descrito por Amsel Criteria. En primer lugar, se mide el pH del flujo vaginal. Se eleva el pH de alrededor de 90% de mujeres con BV por encima de 4,5. En segundo lugar, si se anade KOH al 10% al flujo vaginal, se libera un olor “a pescado” en alrededor de 70% de las mujeres con BV. En tercer lugar, se observa la presencia de una preparacion humeda de celulas de epitelio pavimentoso cubiertas con pequenos cocobacilos (“celulas con indicios”). Otro ensayo fiable para la BV es la tincion Gram directa del fluido vaginal. Nugent y col. presentan un metodo estandar para la interpretacion de tinciones Gram para BV (vease Ejemplo 1).

Se sabe que las bacterias productoras de acido lactico presentan capacidad para inhibir la proliferacion y/o para reducir la patogenicidad de muchos microorganismos asociados a infecciones urogenitales (vease por ejemplo, Redondo-Lopez, V; Cook, R.L.; Sobel, J.D., Emerging role of lactobacillus in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora, Reviews of infectious diseases, vol 12, N°. 5, Sept-Oct 1990, y Boris, S; Barbes, C, Role placed by lactobacilli in controlling the population of vaginal pathogens, Microbes and infection, vol 2, pp 543-546, 2000).

Tambien se sabe que las propiedades antagonistas de las bacterias que producen acido lactico frente a dichos patogenos se denotan, al menos parcialmente, por su capacidad para producir distintas sustancias antagonistas, tales como acido lactico, peroxido de hidrogeno, bacteriocinas, etc.

Se estima que una vagina sana alberga entre 108-109 cfu (= unidades formadoras de colonia) de bacterias productoras de acido lactico. La composicion de esta flora es el resultado de las cepas especificas que la mujer ha heredado de su madre y/o de las cepas que han migrado desde su tracto digestivo hasta su tracto urogenital.

La tecnica anterior describe formulaciones, tales como suspensiones, supositorios y capsulas de gelatina, que comprenden bacterias viables productoras de acido lactico. Tales formulaciones se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N°. 5.466.463 y en el documento WO 9.309.793.

Ademas, se sabe como impregnar productos absorbentes, tales como tampones y compresas, con bacterias productoras de acido lactico con el fin de conservar una flora microbiana normal en el tracto urogenital femenino, evitando de esta forma infecciones urogenitales, o de regenerar una flora microbiana normal en el tracto urogenital femenino. Dicho producto se describe en la patente europea 0 594 628 y en la solicitud de patente sueca 0003544-4.

La patente de EE.UU. N°. 6.180.100 describe un metodo para el tratamiento o la prevencion de infecciones del tracto urinario que comprende administrar a la vagina bacterias aisladas de acido lactico del genero Lactobacilo. Dichos Lactobacilos son capaces de colonizar la vagina durante 5 semanas tras una unica instilacion.

No obstante, para obtener el efecto descrito anteriormente resulta crucial que las bacterias productoras de acido lactico que inhiben los uropatogenos colonicen y se establezcan in vivo, y que tras la administracion a la vagina permanezcan en la misma durante un periodo de tiempo superior al de un ciclo menstrual.

El hecho de que una cepa bacteriana colonice o no la vagina depende de las propiedades adhesivas de la cepa bacteriana especifica, asi como de las condiciones hormonales, nutricionales y de acidez de la vagina. El desarrollo de una infeccion genital o el tratamiento con antibioticos tambien influyen en la capacidad de la cepa introducida para colonizar la vagina.

El ciclo menstrual tambien afecta a la adherencia, teniendo lugar la maxima adherencia antes de la ovulacion y antes del flujo menstrual (patente de EE.UU. N°. 6.180.100 y Chan y col., Journal of Urology, Marzo 1984). De esta forma, el periodo mas dificil para que se produzca la colonizacion y el establecimiento en la vagina de las bacterias productoras de acido lactico administradas es durante el flujo menstrual.

Con respecto a la colonizacion y al establecimiento de las bacterias productoras de acido lactico in vivo, existe disparidad entre los resultados clinicos y el supuesto comportamiento bacteriano derivado de la interpretacion de los resultados de los analisis in vitro. Las interacciones entre especies bacterianas diferentes en la vagina resultan frecuentes, y este patron de interaccion es complicado de recrear en el laboratorio. De este modo, incluso si unas especies bacterianas exhiben resultados in vitro prometedores, podrian no establecerse in vivo y por tanto no proporcionar el efecto terapeutico deseado, es decir, evitar o aliviar los efectos de, y/o el tratamiento de, infecciones microbianas en el tracto urogenital.

Ademas, resulta de vital importancia que la bacteria muestre estabilidad de perfil genetico por un lado tras cultivos repetidos en produccion a gran escala y por otro, durante periodos de tiempo largos in vivo.

Otro criterio que debe satisfacer la generacion de un producto de consumo aceptable que proporcione el efecto terapeutico deseado es la conservacion de la viabilidad bacteriana tras liofilizacion de la bacteria y tras almacenamiento de la bacteria liofilizada (es decir, vida util de almacenaje).

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Sumario de la invencion

La presente invencion describe nuevas cepas bacterianas aisladas del genero Lactobacilo, que presentan la capacidad de colonizar y establecerse en la vagina humana, mostrando una perturbacion de la flora vaginal de microorganismos, tras administracion vaginal, incluso durante el flujo menstrual, de al menos una de las cepas bacterianas. Se considera que las bacterias se han establecido si se encuentran presentes en la vagina tras al menos dos ciclos menstruales desde el momento de la administracion.

Es una ventaja que las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion muestren capacidad para establecerse durante el flujo menstrual, ya que la bacteria puede administrarse de forma facil mediante el empleo, por ejemplo, de un tampon impregnado con dicha bacteria.

Las bacterias productoras de acido lactico establecidas pertenecientes a dichas cepas evitan, alivian los efectos y/o tratan las infecciones microbianas del tracto urogenital, en particular la vaginosis bacteriana. Para obtener los efectos terapeuticos deseados, resulta esencial que las bacterias se establezcan tras la administracion, y de este modo, esten presentes en la vagina incluso despues de varios flujos menstruales.

Dichas cepas bacterianas han sido depositadas de acuerdo con el Acuerdo de Budapest en el BCCM/LMG (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/Laboratorium loor Microbioligie-Bacterienverzammeling, Universiteit Gent) en Belgica el 14 de Junio de 2001, y comprenden la cepa de Lactobacillus casei subsp rhamnosus, denominada por el solicitante LN 113, depositada con el nombre de LMG P-20562, y la cepa de Lactobacillus fermentum, denominada por el solicitante LN 99, o sus variantes que presentan las correspondientes caracteristicas fenotipicas.

Ademas, la presente invencion describe un metodo para el aislamiento de una cepa bacteriana del genero Lactobacilo o Pedicoco que presenta la capacidad de colonizar y establecerse en la vagina humana, incluso durante el flujo menstrual, en la que

a) se toma una muestra bacteriana, tal como fluido vaginal, del tracto vaginal de una mujer con flora vaginal de microorganismos sana y normal,

b) se escogen bacterias productoras de acido lactico a partir de la muestra vaginal de la etapa a),

c) se lleva a cabo un cultivo puro de las bacterias productoras de acido lactico de la etapa b), in vitro, en un medio de nutrientes apropiado proporcionando al menos una cepa bacteriana aislada,

d) se evalua la capacidad de colonizacion y establecimiento en la vagina de al menos una cepa bacteriana cultivada de forma pura de la etapa c) y/o una combinacion de al menos dos cepas bacterianas de la etapa c), tras administracion vaginal de la cepa bacteriana a una mujer durante el flujo menstrual, presentando dicha mujer una flora vaginal de microorganismos alterada, en el que dicha cepa o cepas bacterianas se considera/consideran establecidas si la cepa/cepas bacteriana se encuentra presente en la vagina despues de al menos dos ciclos menstruales desde el momento de la administracion, y

e) se escoge al menos una cepa bacteriana de la etapa d) que muestre dicha capacidad para colonizar y establecerse en la vagina.

Preferiblemente, al menos una cepa bacteriana cultivada de forma pura de la etapa c) y/o una combinacion de al menos dos cepas bacterianas de la etapa c) se encuentra liofilizada.

Ademas, preferiblemente, esta/estas cepa/cepas se evalua/evaluan y se escoge/escogen de forma que se garantice la estabilidad de la viabilidad bacteriana tras liofilizacion asi como la viabilidad de las bacterias liofilizadas durante largos periodos de almacenaje, en el que dicha viabilidad bacteriana se considera estable si al menos 40% de las bacterias presentan viabilidad tras la liofilizacion y tras el almacenamiento de las bacterias liofilizadas a -18 °C aproximadamente durante al menos 12 meses.

La presente invencion tambien describe una cepa bacteriana del genero Lactobacilo o Pedicoco que presenta la capacidad de colonizar y establecerse en la vagina humana durante el flujo menstrual, en el que la cepa puede aislarse de acuerdo con el metodo anteriormente descrito. Preferiblemente, dichas cepas bacterianas son la cepa Lactobacillus gasseri, denominada por el solicitante como LN 40, depositada con el nombre de LMG P-20560, la cepa de Lactobacillus casei subsp rhamnosus, denominada por el solicitante LN 113, depositada con el nombre de LMG P-20562, la cepa de Lactobacillus fermentum, denominada por el solicitante LN 99, depositada con el nombre de LMG P-20561, la cepa de Lactobacillus crispatus, denominada por el solicitante LN 01, depositada con el nombre de LMG P-20558 y la cepa de Pediococcus acidilactici, denominada por el solicitante LN 23, depositada con el nombre de LGM P-20559, o sus variantes que presentan las correspondientes caracteristicas fenotipicas y/o genotipicas.

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Ademas, la presente invencion describe una composicion para el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, que comprende al menos una de dichas cepas (LN 113 y LN 99).

Preferiblemente, la composicion comprende todas las cepas mencionadas, es decir la cepa LN 113 y la cepa LN 99.

Se sabe en la tecnica que una combinacion de bacterias distintas reduce el tiempo de generacion de una bacteria, dando lugar a un crecimiento bacteriano mas rapido. Ademas, dado que las diferentes especies de bacterias productoras de acido lactico presentan diferentes caracteristicas y patrones de fermentacion, es preferible emplear una combinacion de diferentes especies bacterianas.

Una combinacion de todas las cepas de acuerdo con la invencion, es decir, LN 113 y LN 99, muestra incluso una inhibicion de uropatogenos mayor que cada una de dichas cepas por separado.

Preferiblemente, la composicion se formula para administracion vaginal, en forma de supositorio, capsula, pildora, comprimido, suspension, pulverizacion, gel, crema, polvo o cualquier otra forma de insercion vaginal.

De manera adicional, la presente invencion describe un producto higienico, tal como un producto absorbente femenino (por ejemplo un tampon, compresa o salvaslip), un panal y un articulo de proteccion frente a incontinencias, para el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, que comprende al menos una de dichas cepas bacterianas (LN 113 y LN 99).

Preferiblemente, el producto higienico comprende todas las cepas mencionadas, es decir la cepa LN 113 y la cepa LN 99, por las mismas razones sugeridas anteriormente en cuanto a la composicion.

Preferiblemente, el producto higienico es un tampon.

Ademas, la presente invencion describe el uso de al menos una de dichas cepas bacterianas (LN 113 y LN 99) para la produccion de una composicion o de un producto higienico para el tratamiento de las infecciones del tracto urogenital, preferiblemente vaginosis bacteriana o cualquier otro trastorno bacteriano de la vagina.

Otras caracteristicas y ventajas de la presente invencion resultaran claras a partir de la siguiente descripcion detallada del mismo.

Breve descripcion de los dibujos

Las Fig. 1a y 1b muestran el proceso de crecimiento de las cepas bacterianas LN 40, LN 99, LN 113 y LN 23, respectivamente.

La Fig. 2 muestra un dibujo de un gel con productos especificos de tincion generados empleando RAPD y electroforesis de gel. Se comparan las cepas LN 40, LN 99, LN 113, LN 01 y LN 23, respectivamente, con cepas tipo de las respectivas especies bacterianas.

Las Fig. 3 y 4 muestran la configuracion experimental empleada en el Ejemplo 6.

Descripcion detallada de la invencion

Segun se emplea en la presente memoria, la expresion “bacterias productoras de acido lactico” significa bacterias que producen acido lactico mediante fermentacion.

Segun se emplea en la presente memoria, la expresion “cantidad eficaz terapeuticamente” significa una cantidad que conduce al efecto terapeutico deseado.

El efecto terapeutico deseado es la profilaxis y/o el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, tal como vaginosis bacteriana o cualquier otro trastorno bacteriano de la vagina.

Segun se emplea en la presente memoria, la expresion “cepa bacteriana aislada” significa que la cepa podria cultivarse in vitro en un cultivo que comprende dicha cepa.

Segun se emplea en la presente memoria, la expresion “muestra bacteriana” significa una muestra que comprende bacterias. Por ejemplo, la muestra podria ser fluido/flujo vaginal.

Segun se emplea en la presente memoria, la expresion “flora vaginal de microorganismos sana y normal” significa que la mujer no presenta enfermedades vaginales, y que la tincion Gram de la muestra vaginal proporciona un valor total de 0-3 de acuerdo con el metodo presentado por Nugent y col. (vease Ejemplo 1).

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Segun se emplea en la presente memoria, la expresion “flora vaginal de microorganismos alterada” significa que la mujer presenta alguna enfermedad vaginal, tal como elevado flujo vaginal y/o olor vaginal “a pescado”. Ademas, la tincion Gram de la muestra vaginal proporciona un valor total de al menos 4, en particular > 7, de acuerdo con el metodo presentado por Nugent y col. (vease Ejemplo 1).

Segun se emplea en la presente memoria, la expresion “medio de nutrientes apropiado” significa un medio, tal como caldo LAB o caldo MRS, en el que puede llevarse a cabo el cultivo de las bacterias.

Segun se emplea en la presente memoria, la expresion “producto higienico” significa tampones (tanto tampones digitales como tampones con aplicador), compresas, salvaslips, panales, articulos de proteccion frente a incontinencias y similares.

La presente invencion describe nuevas cepas aisladas de bacterias productoras de acido lactico del genero Lactobacilo, que presentan la capacidad de colonizar y establecerse en una vagina humana, mostrando una perturbacion de la flora vaginal de microorganismos, tras administracion vaginal, incluso durante el flujo menstrual, de al menos una de las cepas bacterianas. Se considera que las bacterias se han establecido si estan presentes en la vagina despues de al menos dos ciclos menstruales desde el momento de la administracion.

Dichas cepas bacterianas han sido depositadas de acuerdo con el Acuerdo de Budapest en el BCCM (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms) en Belgica el 14 de Junio de 2001, y comprenden la cepa de Lactobacillus casei subsp rhamnosus, denominada por el solicitante LN 113, depositada con el nombre de LMG P20562, y la cepa de Lactobacillus fermentum, denominada por el solicitante LN 99, depositada con el nombre de LMG P-20561, o sus variantes que presentan las correspondientes caracteristicas fenotipicas y/o genotipicas.

Ademas, la presente invencion describe un metodo para el aislamiento de una cepa bacteriana del genero Lactobacilo o Pedicoco que presenta la capacidad de colonizar y establecerse en la vagina humana, en la que

d) se evalua la capacidad de colonizacion y establecimiento en la vagina de al menos una cepa bacteriana cultivada de forma pura de la etapa c) y/o una combinacion de al menos dos cepas bacterianas de la etapa c), tras administracion vaginal de la cepa bacteriana a una mujer durante el flujo menstrual, presentando dicha mujer una flora vaginal de microorganismos alterada, en el que dicha cepa/cepas bacteriana se considera establecida si la cepa/cepas bacteriana se encuentra presente en la vagina despues de al menos dos ciclos menstruales desde el momento de la administracion, y

Preferiblemente, al menos una cepa bacteriana cultivada de forma pura de la etapa c), y/o una combinacion de al menos dos cepas bacterianas de la etapa c) se encuentra liofilizada.

Una cantidad esencial de las bacterias deberia ser viable tras la liofilizacion y posteriormente conservar la viabilidad durante el almacenaje. Ademas, una cantidad esencial de las bacterias liofilizadas formuladas en, por ejemplo, composiciones y/o productos higienicos a escala comercial deberia conservar la viabilidad tras almacenaje a temperatura ambiente.

De esta forma, preferiblemente, esta/estas cepa/cepas se evalua/evaluan y se escoge/escogen de forma que se garantice la estabilidad de la viabilidad bacteriana tras liofilizacion asi como la viabilidad de las bacterias liofilizadas durante largos periodos de almacenaje, en la que dicha viabilidad bacteriana se considera estable si al menos 40% de las bacterias presentan viabilidad tras la liofilizacion y tras el almacenaje de las bacterias liofilizadas a -18 °C aproximadamente durante al menos 12 meses.

Ademas, al menos 1% de las bacterias liofilizadas formuladas en algun tipo de matriz de conservacion, tal como un aceite, e incluidas en una composicion y/o en un producto higienico deben conservar la viabilidad durante al menos 12 meses a temperatura ambiente.

Ademas, una caracteristica importante es la estabilidad del perfil genetico bacteriano tras cultivos repetidos en produccion a gran escala, y durante los procesos de preparacion de, por ejemplo, composiciones y productos higienicos. Preferiblemente, las bacterias deben conservar su perfil genetico despues de al menos 10 cultivos

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repetidos. Ademas, las bacterias deben mostrar estabilidad genetica in vivo durante largos periodos de tiempo despues de la administracion, tal como al menos 12 meses. De esta forma, preferiblemente, dicha cepa/cepas se evalua/evaluan y se escoge/escogen para garantizar la estabilidad genetica in vivo despues de la administracion, de forma que dichas bacterias se consideran geneticamente estables si conservan su perfil genetico in vivo durante al menos 12 meses. Ademas, el crecimiento bacteriano y el tiempo de generacion tambien son esenciales. Las bacterias liofilizadas administradas por via vaginal deben comenzar a crecer al menos durante las 4 horas posteriores a la administracion. El tiempo de generacion debe ser menor que 2 h.

La presente invencion tambien describe una cepa bacteriana del genero Lactobacilo o Pedicoco que presenta capacidad para colonizar y establecerse en la vagina humana durante el flujo menstrual, en el que la cepa puede aislarse de acuerdo con el metodo descrito anteriormente. Preferiblemente, dichas cepas bacterianas son la cepa de Lactobacillus gasseri, denominada por el solicitante como LN 40, depositada con el nombre de LMG P-20560, la cepa de Lactobacillus casei subsp rhamnosus, denominada por el solicitante LN 113, depositada con el nombre de LMG P-20562, la cepa de Lactobacillus fermentum, denominada por el solicitante LN 99, depositada con el nombre de LMG P-20561, la cepa de Lactobacillus crispatus, denominada por el solicitante LN 01, depositada con el nombre de LMG P-20558 y la cepa de Pediococcus acidilactici, denominada por el solicitante LN 23, depositada con el nombre de LGM P-20559, o sus variantes que presentan las correspondientes caracteristicas fenotipicas y/o genotipicas.

Aislamiento y evaluacion de cepas de Lactobacilo y Pediococo

Se aislaron cepas bacterianas del genero Lactobacilo y Pedicoco que presentaban la capacidad de colonizar y establecerse en la vagina humana, de acuerdo con las siguientes etapas:

- se recogio fluido vaginal a partir del tracto vaginal de una mujer con flora vaginal de microorganismos sana y normal,

- se escogieron bacterias productoras de acido lactico (alrededor de 25 cepas distintas) a partir del fluido vaginal, colocando un frotis de dicho fluido sobre agar MRS selectivo para bacterias productoras de acido lactico (se escogieron colonias individuales y se colocaron sobre una placa de agar MRS puro para controlar la pureza),

- a continuacion, se cultivaron de forma pura bacterias productoras de acido lactico in vitro en un medio de nutrientes apropiado, y bajo condiciones apropiadas (pH, temperatura, etc), proporcionando cepas bacterianas aisladas, y

- posteriormente se evaluaron las cepas bacterianas cultivadas de forma pura en cuanto a su capacidad para colonizar y establecerse en la vagina, tras administracion vaginal de las cepas bacterianas a una mujer durante el flujo menstrual, presentando dicha mujer una flora vaginal de microorganismos alterada.

Se cultivo de forma pura LN 40 en un caldo LAB (alrededor de pH 6,5) micro-aerofilo a alrededor de 37 °C.

Se cultivo de forma pura LN 113 en un caldo MRS (alrededor de pH 6,5) micro-aerofilo a alrededor de 37 °C.

Se cultivo de forma pura LN 99 en un caldo LAB (alrededor de pH 6,5) micro-aerofilo a alrededor de 37 °C.

Se cultivo de forma pura LN 01 en un caldo MRS (alrededor de pH 6,5) micro-aerofilo a alrededor de 37 °C.

Se cultivo de forma pura LN 23 en un caldo MRS (alrededor de pH 6,5) micro-aerofilo a alrededor de 37 °C.

En primer lugar, se evaluo el tiempo de generacion de las cepas bacterianas cultivadas de forma pura. Se escogieron las cepas bacterianas (alrededor de 15 cepas distintas) que mostraron un tiempo de generacion < 30 minutos. Se registro la capacidad de estas cepas seleccionadas para inhibir el crecimiento de algunos microorganismos in vivo (datos no mostrados). En primer lugar, se evaluo la capacidad para inhibir el crecimiento de Staphilococcus epidemidis (dos cepas distintas), Enterococcus cloace, Escherichia coli, Serratia marcesus, Micrococcus lysodeicticus y Candida albicans. Ocho cepas bacterianas distintas (7 cepas del genero Lactobacilo y 1 del genero Pediococo) mostraron capacidad y, por tanto, fueron escogidas. Ademas, se evaluaron estas 8 cepas en cuanto a su capacidad para inhibir el crecimiento del uropatogeno Gardnerella vaginalis.

Las mejores cepas (es decir, las cepas que presentan mejora potencial para colonizar una flora vaginal de microorganismos alterada) fueron LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23.

Ademas, se evaluaron estas cepas mediante estudios clinicos, considerando que las bacterias se han establecido en la vagina si se encuentran presentes en la misma despues de al menos dos ciclos menstruales desde el momento de la administracion (la administracion de las bacterias comienza durante el primer flujo menstrual). Se escogieron aquellas cepas bacterianas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23) que mostraron dicha capacidad para colonizar y establecerse en la vagina.

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De manera adicional, se evaluo la estabilidad de la viabilidad bacteriana tras liofilizacion y la viabilidad de las bacterias liofilizadas durante largos penodos de almacenaje (duracion util de almacenaje), la conservacion del perfil genetico tras cultivos repetidos in vivo y el proceso de crecimiento bacteriano.

Ejemplo 1: Colonizacion y establecimiento de bacterias productoras de acido lactico tras administracion vaginal

Se estudiaron 15 pacientes con BV (mujeres a las que se las habfa diagnosticado vaginosis bacteriana). Las 15 pacientes fueron tratadas con ovulos de clindamicina (Dalacin® 2% ovule, de Pharmacia) durante 3 dfas. Posteriormente, el tratamiento continuo con una parte controlada con un placebo con ocultacion doble, en la que 6 pacientes emplearon tampones formados aproximadamente por 103 cfu de bacterias liofilizadas de las cepas LN 01, LN 23, LN 99, LN 113 y LN 40, durante el primer perfodo menstrual despues del tratamiento con antibioticos. Las otras 9 pacientes emplearon tampones convencionales sin bacterias productoras de acido lactico. Durante el segundo perfodo menstrual, las 15 pacientes emplearon tampones convencionales sin bacterias productoras de acido lactico, y se tomo una muestra vaginal a los pocos dfas de esta menstruacion.

Las muestras vaginales se sometieron a tincion de Gram. En el metodo estandar de tincion Gram presentado por Nugent y col., se analizo la presencia o ausencia de determinados morfotipos bacterianos. Los morfotipos son grandes, bacilos Gram-positivo del morfotipo Lactobacilo; pequenos bacilos de Gram variable denominado morfotipo Gardnerella y con forma de huso curvado. Se cuantificaron los organismos presentes en el fluido vaginal y se les asigno una puntuacion (vease Tabla 1).

Tabla 1

Codigo

Morfotipo Lactobacilo: Morfotipos Gardnerella y Bacteroides Huso curvado de Gram variable Puntuacion

4+: 0 0 0

3+: 1+ 1+ o 2+ 1

2+
2+: 3+ o 4+ 2

1+: 3+ 3

0: 4+ 4

Las puntuaciones de 0 a 4+ estan basadas en el numero medio de organismos con ese morfotipo por campo de inmersion en aceite; 1+, < 1 presente: 2+, 1-4 presentes; 3+, 5-30 presentes; 4+ > 30 presentes. La puntuacion total se obtiene sumando las puntuaciones de los tres morfotipos. La puntuacion total se interpreta como se muestra a continuacion: 0-3, normal; 4-6, intermedia; y > 7, BV.

Tabla 2

N°. de paciente: Tincion Gram antes del comienzo del estudio Tampones (L= bacterias productoras de acido lactico) Tincion Gram despues del segundo perfodo menstrual

1: 7 L 0

2: 8 L 0

3: 9 7

4: 5
4

5: 10 0

6: 8 4

7: 8 L 0

8: 9 4

9: 4 L 0

10: 8 4

11: 8 4

12: 8 0

13: 8 L 1

14: 0 5

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15: 9 L 0

No se detecto vaginosis bacteriana en las 6 pacientes que emplearon el tampon con las bacterias productoras de acido lactico. Ademas, los resultados mostraron que las bacterias productoras de acido lactico se encontraban presentes en la vagina despues del segundo ciclo menstrual.

Ademas, estos resultados mostraron que un numero relativamente pequeno de bacterias administradas (aproximadamente 103 cfu) resulta suficiente para lograr una colonizacion vaginal completa asi como el establecimiento durante el flujo menstrual de las cepas bacterianas de acuerdo con la presente invencion.

De manera adicional, las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion presentan excelentes propiedades de adhesion a las membranas de la mucosa vaginal.

Ejemplo 2: Colonizacion y establecimiento de bacterias productoras de acido lactico tras administracion vaginal

Cuatro mujeres sanas sin enfermedades de tipo vaginal emplearon tampones que comprendian aproximadamente 103 cfu de bacterias liofilizadas de las cepas LN 01, LN 23, LN 99, lN 113 y LN 40, durante su flujo menstrual mensual, durante un periodo de 12-18 meses.

Despues de dicho periodo de ensayo, se evaluaron las muestras vaginales de cada mujer. Se identificaron las cepas de Lactobacilo y Pediococo encontradas en las muestras mediante RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) como se describe en el Ejemplo 10.

Se identificaron LN 01 y LN 113 en dos de las muestras vaginales de dichas mujeres.

Se identifico LN 40 en una de las muestras vaginales de dichas mujeres.

No se identificaron LN 23 ni LN 99 en ninguna de las muestras vaginales de dichas mujeres.

Como explicacion a estos resultados puede decirse que, cuando se administra dicho agrupamiento bacteriano a una mujer con flora vaginal sana, con pH vaginal normal, LN 23 no crece de forma considerable. No obstante, cuando dicho agrupamiento bacteriano se administra a una mujer que muestra una flora vaginal de microorganismos alterada, LN 23 se establece inicialmente y proporciona un entorno favorable para que crezcan las otras cepas bacterianas (LN 01, LN 113, LN 40 y LN 99).

Debe notarse tambien que, a nivel individual, existen diferencias con respecto a la adecuacion de una cepa especifica, y/o combinaciones de cepas especificas, en lo que se refiere al establecimiento y crecimiento en la vagina de la mujer.

En cada muestra vaginal, al menos se identifico una de dichas cepas bacterianas de acuerdo con la invencion.

Ejemplo 3: Estabilidady viabilidad tras liofilizacion y durante largos periodos de tiempo de almacenaje (duracion util de almacenaje) de cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99 y LN 23

Se evaluo la estabilidad de viabilidad durante largos periodos de tiempo de almacenaje (es decir la duracion util de almacenaje) a alrededor de -18 °C de cepas bacterianas liofilizadas LN 40, LN 113, LN 99 y LN 23.

Tabla 3

Tiempo tras liofilizacion [meses]: Bacterias viables [cfu/g]

: LN 40 LN 113 LN 99 LN 23 LN 01

0: 83 x 109 224 x 1010 33 x 109 290x 109 20 x 109

12: 47 x 109 (~ 57%) 192 x 1010 (~ 86%) 14 x 109 (~ 42%) 272x 109 (~ 94%) 19 x 109 (~ 95%)

78: 22 x 109 (~ 27%) 46 x 109 (~ 21%) 6 x 109 (~ 18%) 155 x 109 (~ 53%) 2 x 109 (~ 10%)

Los resultados de la Tabla 3 muestran que al menos 40% de las bacterias todavia son viables despues de 12 meses a -18 °C. Ademas, al menos alrededor de 10-20% de las bacterias todavia son viables tras 78 meses a -18 °C.

Ademas, tambien se analizaron estas bacterias de acuerdo con API 50CH, y los resultados obtenidos para este analisis indicaron que las cepas LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01 conservan su perfil genetico durante al menos

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78 meses durante el almacenaje en forma liofilizada a -18 °C.

Se dispersaron las bacterias liofilizadas (LN 40, LN 113, LN 99 y LN 23) en Akosoft® 36 (de Karlshamns AG) y se evaluo su estabilidad de viabilidad durante largos periodos de tiempo de almacenaje (es decir, duracion util de almacenaje) a alrededor de 8°C y 22°C, respectivamente.

Tabla 4

Tiempo despues de preparacion [semana/meses]: Bacterias viables [cfu/g]

: +8 °C +22 °C

0: 3,5 x 1010 3,5 x 1010

1 semana: 2,7 x 1010 (~ 75%) 1,9 x 1010 (~ 53%)

1: 2,5 x 1010 (~ 71%) 1,3 x 1010 (~ 37%)

3,5: 2,0 x 1010 (~ 55%) 6 x 109 (~ 17%)

6: 2,4 x 1010 (~ 68%) 3,9 x 109 (~ 11%)

9: 1,8 x 1010 (~ 50%) 1,0 x 109 (~ 2,8%)

12: 1,7 x 1010 (~ 49%) 1,3 x 109 (~ 3,7%)

Los resultados de la Tabla 4 muestran que alrededor de 45-50% de las bacterias estan todavia viables despues de 12 meses a 8 °C. Ademas, alrededor de 4% de las bacterias estan todavia viables despues de 12 meses a temperatura ambiente, es decir 22 °C.

Se obtuvieron resultados similares para el agrupamiento de bacterias liofilizadas que comprendia las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion, incluyendo LN 01.

Ejemplo 4: Conservation del perfil genetico tras cultivos repetidos de las cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23

Se cultivaron de forma repetida durante 10 veces las cepas bacterianas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23) y posteriormente se sometieron a evaluacion con API 50CH. Se conservo el patron de fermentacion de cada cepa bacteriana (vease ejemplo 9) tras el cultivo repetido. De esta forma, los resultados indicaron que dichas cepas bacterianas conservan su perfil genetico tras cultivos repetidos.

Ejemplo 5: Proceso de crecimiento bacteriano para las cepas bacterianas LN 40, LN 99, LN 113, LN23 y LN 01

Para proporcionar dicho efecto terapeutico deseado, las bacterias liofilizadas administradas vaginalmente deberian comenzar el crecimiento en la vagina durante al menos 4 horas desde el momento de la administracion.

Se midio la absorbancia (densidad optica, OD) a 620 nm de las bacterias liofilizadas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01) anadidas al caldo MRS esteril. Se llevaron a cabo dos tipos de experimentos (vease Fig. 1a y 1b):

a) se anadieron 0,01 g de bacterias liofilizadas a 3 ml de caldo MRS, y se diluyeron 100 pl de esta dispersion con 3 ml de caldo MRS adicional, y

b) se anadieron bacterias liofilizadas al caldo MRS en una cantidad que dio lugar a una absorbancia de aproximadamente 0,100.

Se colocaron las cubetas que contenian las dispersiones de las bacterias anteriores a 37 °C y se midio la absorbancia cada 15 minutos durante 10,5 h.

Como puede observarse en la Fig. 1a y 1b, el crecimiento bacteriano para cada cepa (LN 40, LN 113, LN 99, LN23 y LN 01, respectivamente) es rapido, y todas las cepas bacterianas comienzan a crecer en un periodo de al menos 2 horas.

Ademas, el tiempo de generacion de cada cepa bacteriana es de alrededor de 20-25 min. De esta forma, las bacterias crecen mas rapido que los uropatogenos, lo que resulta muy favorable a la vista del uso de bacterias descrita en la presente memoria.

Ademas, se sabe en la tecnica que una combinacion de bacterias diferentes puede acortar el tiempo de generacion de la bacteria, dando lugar a un crecimiento bacteriano incluso mas rapido. Ademas, dado que las diferentes especies de bacterias productoras de acido lactico presentan patrones de fermentacion y caracteristicas diferentes,

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es preferible utilizar una combinacion de diferentes especies bacterianas.

Debe notarse que una combinacion de LN 40, LN 99, LN 113, LN 23 y LN 01 secada por congelacion comienza a crecer en 1,5 h, esto es al menos 25% mas rapido que el tiempo necesario para cada una de las cepas bacterianas.

Ejemplo 6: Capacidadpara inhibir el crecimiento de uropatogenos

La finalidad de esta invencion es mostrar que el agrupamiento bacteriano de LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01 es incluso mas eficaz, a la hora de inhibir el crecimiento bacteriano de uropatogenos, que cada una de las cepas bacterianas por separado.

Las bacterias productoras de acido lactico objeto de ensayo se anadieron de forma homogenea a un medio de agar, tamponado, esteril y fundido, tal como agar MRS. La mezcla obtenida se introdujo en una placa de Petri (de 90 mm de diametro) 1 y la placa se inclino de forma que la mezcla de agar 2 unicamente alcanzara alrededor de 1 mm desde la parte inferior de la placa en un lado de la misma, y alrededor de 11 mm en el lado opuesto de la placa, como se muestra en la Fig. 3.

Se anadio el uropatogeno de forma homogenea a un medio de agar, tamponado, esteril y fundido, tal como agar VRB (Violet Red Bile). La mezcla se introdujo en la parte superior del agar solidificado descrito anteriormente, que comprendia dichas bacterias productoras de acido lactico, como se muestra en la Fig. 3, y tambien se dejo solidificar esta mezcla de agar 3.

Posteriormente, se incubaron a 37 °C durante alrededor de 24 h las bacterias productoras de acido lactico y el uropatogeno. Como se muestra en la Fig. 4, se observaron dos zonas distintas 4 y 5 en la placa 1. En la primera zona 4, el uropatogeno habia sido capaz de crecer. En la segunda zona 5, las bacterias productoras de acido lactico habian inhibido el crecimiento del uropatogeno.

Es posible cuantificar la capacidad de las bacterias productoras de acido lactico para inhibir el uropatogeno midiendo la longitud L de la segunda zona 5, es decir, la zona 5 de crecimiento inhibido.

En este experimento se empleo un enteropatogeno de cepa E coli (EPEC).

La longitud L de la zona de crecimiento inhibido estaba dentro del intervalo de 8 a 22 mm para cada una de las cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23.

No obstante, el agrupamiento bacteriano que comprendia LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23 dio lugar a una longitud L de la zona de crecimiento inhibido de 32-34 mm.

De esta forma, el agrupamiento bacteriano formado por todas las cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23 es incluso mas eficaz que cada una de las cepas bacterianas tomadas por separado a la hora de inhibir el crecimiento de uropatogenos, tales como E coli. Ademas, es preferible emplear la combinacion de dichas cepas bacterianas de acuerdo con la invencion.

Caracterizacion de cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23 Se caracterizaron las bacterias por medio de los metodos fenotipico y genotipico.

Ejemplo 7: Caracterizacion microbiologica de las cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23

Se caracterizaron las cepas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01) con respecto a morfologia celular, tincion de Gram, reaccion de oxidasa y reaccion de catalasa.

La cepa LN 40 comprendia bacterias Gram-positivo, catalasa-negativo, oxidasa-negativo, no formadoras de esporas, con forma de huso (alrededor de 0,9 pm x 3-10 pm), que aparecieron como celulas individuales o en pares.

La cepa LN 99 comprendia bacterias Gram-positivo, catalasa-negativo, oxidasa-negativo, no formadoras de esporas, con forma de huso (alrededor de 0,9 pm x 1,5-2,0 pm), que aparecieron como celulas individuales.

La cepa LN 113 comprendia bacterias Gram-positivo, catalasa-negativo, oxidasa-negativo, no formadoras de esporas, con forma de huso (alrededor de 0,9 pm x 2 pm), que aparecieron como celulas individuales o en pares.

La cepa LN 01 comprendia bacterias Gram-positivo, catalasa-negativo, oxidasa-negativo, no formadoras de esporas, con forma de huso recto o ligeramente curvado (alrededor de 0,8-1,6 pm x 2,3-11 pm), que aparecieron como celulas individuales o en cadenas.

La cepa LN 23 comprendia bacterias Gram-positivo, catalasa-negativo, oxidasa-negativo, no formadoras de esporas,

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con forma redondeada (alrededor de 1 pm de diametro), que aparecieron como celulas individuales o en pares.

Ejemplo 8: SDS-PAGE y analisis tipologico de las cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23

Se sometieron a crecimiento cultivos en agar MRS (Oxoid CM361) durante 24 h a 37 °C en condiciones anaerobias. La preparacion de los extractos celulares y la eletroforesis de gel de proteinas (SDS-PAGE) se llevo a cabo en BCCmtm/LMG, de conformidad con el protocolo establecido por el Research Group of Laboratory for Microbiology, University Ghent (Pot, B, Banadme, P, Kersters, K, Analisis of electrophoretic whole-organism protein fingerprints, Chemical Methods in Prokaryotic Systematics, M, Goodfellow, y A G, O'Donell (eds), J Wiley & Sons, Chichester (1994)).

Se analizaron numericamente los patrones de proteinas normalizados y digitalizados y se agruparon con respecto a los perfiles de referencia de la base de datos BCCM (Diciembre 1999) para LN 40, LN 113, LN 99 y LN 23. Se analizo LN 01 y se agrupo con respecto a los perfiles de referencia de la base de datos CCUG (Enero 2001).

Se encontro que la cepa LN 40 pertenecia a la especie Lactobacillus johnsonii o Lactobacillus gasseri.

Se encontro que la cepa LN 99 pertenecia a la especie Lactobacillus fermentum.

Se encontro que la cepa LN 113 pertenecia a la especie Lactobacillus casei subs. rhamnosus.

Se encontro que la cepa LN 23 pertenecia a la especie Pediococcus acidilactici.

Se encontro que la cepa LN 01 pertenecia a la especie Lactobacillus crispatus.

Ejemplo 9: Caracterizacion de cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01 empleando API 50CH y strep ID32 rapido

La Tabla 5 muestra la capacidad de las cepas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01) para fermentar distintos carbohidratos. Los ensayos se llevaron a cabo por medio de API 50CH y API strep ID32 rapido a 37 °C, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para los resultados que difieren entre API 50CH API y strep ID32 rapido, el resultado de API 50CH se considera el mas fiable.

Se buscaron los patrones de fermentacion resultantes en la base de datos CCUG. La puntuacion mas alta de la base de datos obtenida para cada cepa confirmo los resultados de los analisis anteriormente descritos (SDS- PAGE/analisis tipologico), con respecto a que especies bacterianas corresponden respectivamente dichas cepas.

Ademas, la reaccion con ramnosa confirmo que la cepa LN 113 pertenece a la especie Lactobacillus casei subs rhamnosus.

No obstante, las comparaciones entre LN 40, LN 99, LN 113, LN 23 y LN 01 respectivamente, y las cepas tipo de

rT ™hoot ^ .. CCUG 4411 7t,

cada especie bacteriana (CCUG 31451, CCUG 301381, CCUG 214521, CCUG 322351 y respectivamente), mostraron diferencias importantes para todas las cepas (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01) con respecto a los patrones de fermentacion.

En la Tabla 5, 1 indica que no tiene lugar reaccion, 2 indica que tiene lugar una leve reaccion, 3 indica la presencia de reaccion, 4 indica la presencia de una reaccion energica y 5 indica la presencia de una reaccion muy energica.

Tabla 5

: LN 40 LN 99 LN 113 LN 23 LN 01

API 50CH

Control: 1 1 1 1 1

Glicerol: 1 1 1 1 1

Eritritol: 1 1 1 1 1

D-arabinosa: 1 1 1 1 1

L-arabinosa: 1 1 1 5 1

Ribosa: 1 5 5 5 1

D-xilosa: 1 5 1 5 1

L-xilosa: 1 1 1 1 1

Adonitol: 1 1 1 1 1

P-metil-D-xilosido: 1 1 1 1 1

Galactosa: 4 5 5 5 3

Glucosa: 5 5 5 5 5

Fructosa: 5 4 5 5 5

Manosa: 4 3 5 5 4

Sorbosa: 1 1 5 1 1

Ramnosa: 1 1 3 1 1

Dulcitol: 1 1 1 1 1

Inositol: 1 1 3 1 1

Manitol: 1 1 5 1 1

Sorbitol: 1 1 5 1 1

a-metil-D-manosido: 1 1 1 1 1

a-metil-D-glucosido: 1 1 5 1 1

N-acetil-glucosamina: 5 1 4 4 3

Amigdalina: 3 1 4 2 3

Arbutin: 1 1 4 4 3

Aesculin: 5 1 5 5 3

Salicina: 2 1 4 4 3

Celobiosa: 5 1 5 5 3

Maltosa: 5 4 3 1 5

Lactosa: 3 4 5 1 3

Melibiosa: 5 4 1 1 1

Sacarosa: 5 4 3 1 5

Trehalosa: 1 4 5 1 3

Inulina: 1 1 1 1 1

Melecitosa: 1 1 5 1 1

D-rafinosa: 5 4 1 1 3

Almidon: 1 1 1 1 4

Glucogeno: 1 1 1 1 4

Xilitol: 1 1 1 1 1

P-gentiobiosa: 4 1 3 3 2

D-turanosa: 1 1 5 1 3

D-lixosa: 1 1 3 1 1

D-tagarosa: 2 1 5 4 1

D-fucosa: 1 1 1 1 1

L-fucosa: 1 1 1 1 1

D-arabitol: 1 1 1 1 1

L-arabitol: 1 1 1 1 1

Gluconato: 1 3 2 1 1

2-ceto-gluconato: 1 1 1 1 1

5-ceto-gluconato: 1 1 1 1 1

API sID32 rapido

Arginina dihidrolasa: 1 5 1 5 1

P-glucosidasa: 5 1 5 3 1

P-galactosidasa (1): 1 5 1 1 5

P-glucuronidasa: 1 1 1 1 1

a-galactosidasa: 5 3 1 1 1

Fosfatasa alcalina: 1 1 1 1 2

Ribosa: 1 5 5 1 1

Manitol: 1 1 5 1 1

Sorbitol: 1 1 1 1 1

Lactosa: 1 5 1 1 1

Trealosa: 1 5 5 1 3

Rafinosa: 5 1 1 1 2

Acetoina: 5 5 5 5 1

Alanin-fenilalanin-prolin arilamidasa: 5 1 4 3 5

P-galactosidasa (2): 1 5 5 1 5

Piroglutamato: 4 1 5 1 1

N-acetil-p-glucosamina: 1 1 2 1 1

Glicil-triptofano: 1 1 1 1 1

Hipurato: 1 1 5 4 1

Glucogeno: 1 1 1 1 1

Pululan: 1 1 1 1 1

Maltosa: 2 5 1 1 5

Melibiosa: 5 1 1 1 1

Melecitosa: 1 1 2 1 1

Sacarosa: 5 5 1 1 5

L-arabinosa: 1 1 1 1 1

D-arabitol: 1 1 1 1 1

Metil-p-D-glucopiranosido: 2 1 1 1 1

Tagatosa: 3 1 3 1 1

P-manosidasa: 1 1 1 1 1

Ciclodextrina: 1 1 1 1 1

Ureasa: 1 1 1 1 1

Hemolisis: 3 1 3 3 3

Ejemplo 10: Caracterizacion de cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01 empleando ADN Poliformico Amplificado de forma aleatoria

5 Ademas, se analizaron las cepas bacterianas por RAPD (ADN Poliformico Amplificado de forma Aleatoria). Por ejemplo, esta tecnica ha sido descrita por Willians, J G y col., Nucl Acid Res, 18:6531 (1990) y se ha utilizado previamente no solo para detectar la diversidad de cepas sino tambien para llevar a cabo mapas geneticos, analisis de poblacion, epidemiologia y para analizar relaciones taxonomicas y filogeneticas (Welsh, J, y col., PCR 2: Practical Approach, McPherson, MJ, Hames, BD y Taylor, GR, eds Capitulo 11, IRL Press (1995).

10

Se generaron series reproducibles de productos especificos de cepas empleando un iniciador de oligonucleotido (5'ACGCGCAAC 3') bajo condiciones de baja escasez en PCR (Reaccion en Cadena de Polimerasa). Posteriormente, se analizaron las series resultantes mediante electroforesis de gel, y se compararon con cepas tipo de cada una de las especies bacterianas que habian sido sometidas al mismo tratamiento.

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La Fig. 2 muestra los resultados de este analisis.

La linea 1 es L fermentum, ATCC 1493T La linea 2 es LN 99

La linea 3 es L crispatus, CCUG 44117T La linea 4 es LN 01

La linea 5 es un marcador de peso 100 bp molar,

La linea 6 es LN 23,

La linea 7 es LN 40,

La linea 8 es L gasseri, ATCC 19992T

La linea 9 es LN 113, y

La linea 10 es L casei ATCC 4646T

En la Fig. 2, pueden observarse importantes diferencias entre las cepas bacterianas de acuerdo con el presente invencion (LN 40, LN 113, LN 99, LN 23 y LN 01) y las respectivas cepas tipo.

El presente invencion tambien se refiere a una composicion para el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, que comprende al menos una de dichas cepas bacterianas (LN 113 y LN 99).

Preferiblemente, la composicion comprende todas las mencionadas cepas, es decir la cepa LN 113 y la cepa LN 99.

Preferiblemente, la composicion se formula para administracion vaginal, tal como supositorio, capsula, pastillas, comprimidos, suspension, pulverizacion, gel, crema, polvo o cualquier otra forma de insercion vaginal, que puede comprender excipientes farmaceuticos convencionales empleados en la tecnica. De manera adicional, el presente invencion describe un producto higienico, tal como productos absorbentes femeninos (por ejemplo tampones, compresas, salvaslips, etc), panales, y articulos de proteccion frente a incontinencias, para el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, que comprende al menos una de dichas cepas bacterianas (LN 113 y LN 99).

Preferiblemente, el producto higienico comprende todas las cepas mencionadas, es decir la cepa LN 113 y la cepa LN 99.

Preferiblemente, el producto higienico es un tampon.

Ademas, la presente invencion describe el uso de al menos una de dichas cepas bacterianas (LN 113 y LN 99) para la produccion de una composicion o un producto higienico para el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, preferiblemente vaginosis bacteriana o cualquier otro trastorno bacteriano de la vagina.

En resumen, las cepas bacterianas LN 40, LN 113, LN 99, LN 01 y LN 23 mostraron excelentes propiedades con respecto a:

- capacidad para inhibir el crecimiento de uropatogenos (incluyendo un crecimiento bacteriano rapido)

- capacidad para colonizar y establecerse in vivo tras administracion vaginal, incluso durante el flujo menstrual,

- estabilidad de viabilidad bacteriana tras liofilizacion y durante largos periodos de almacenaje (duracion util de almacenaje), y

- conservacion del perfil genetico tras cultivos repetidos in vivo.

Ademas, estas cepas bacterianas tambien son favorables desde el punto de vista economico.

Igualmente, estas propiedades implican que las cepas bacterianas de acuerdo con el presente invencion resultan muy apropiadas para la produccion industrial a gran escala de un articulo de consumo (tal como una composicion o un producto higienico) que comprende dichas cepas bacterianas para evitar, aliviar los efectos y/o tratar infecciones microbianas del tracto urogenital.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Una cepa bacteriana aislada del genero Lactobacilo que se caracteriza porque se escoge en el grupo formado por la cepa de Lactobacillus casei subsp rhamnosus, LN 113, depositada con el nombre de LMG P-20562, y la cepa de Lactobacillus fermentum, LN 99, depositada con el nombre de LMG P-20561, y que tiene la capacidad de colonizar y de establecerse en la vagina humana, mostrando una perturbacion de la flora vaginal de microorganismos, tras administracion vaginal, incluso durante el flujo menstrual, en el que dicha/s cepa/s bacteriana/s se considera/n establecida/s si la/s cepa/s bacteriana/s esta/n presente/s en una vagina despues de al menos dos ciclos menstruales desde el momento de la administracion, habiendo sido depositadas dichas cepas bacterianas en Belgian Coordinated Collections of Microorganisms el 14 de Junio de 2001.
2. Un metodo para el aislamiento de una cepa bacteriana del genero Lactobacilo o Pediococo que tiene la capacidad de colonizar y establecerse en la vagina humana, incluso durante el flujo menstrual, que comprende las siguientes etapas:

a) se toma una muestra bacteriana del tracto vaginal de una mujer con flora vaginal de microorganismos normal y sana,

b) se escogen bacterias productoras de acido lactico a partir de la muestra vaginal de la etapa a),

c) se cultivan in vitro de forma pura las bacterias productoras de acido lactico de la etapa b) en un medio de nutrientes apropiado proporcionando al menos una cepa bacteriana aislada,

d) se evalua al menos una cepa bacteriana cultivada de forma pura de la etapa c) y/o una combinacion de al menos dos cepas bacterianas de la etapa c) con respecto a su capacidad para colonizar y establecerse en la vagina tras administracion vaginal de la cepa bacteriana a una mujer durante el flujo menstrual, presentando dicha mujer una flora vaginal de microorganismos alterada, en el que se considera que dicha cepa/s bacteriana/s esta/n establecida si la cepa/s esta/n presente/s en la vagina despues de al menos dos ciclos menstruales desde el momento de la administracion, y

e) se escoge al menos una cepa bacteriana de la etapa d) que muestra la citada capacidad para colonizar y establecerse en la vagina.
3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, que comprende otra etapa en la que al menos una cepa bacteriana cultivada de forma pura de la etapa c) y/o una combinacion de al menos dos cepas bacterianas de la etapa c) se encuentra liofilizada.
4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 3, que comprende otra etapa en la que al menos se evalua y se escoge una cepa bacteriana liofilizada y cultivada de forma pura de la etapa c) y/o una combinacion de al menos dos cepas bacterianas liofilizadas de la etapa c), de forma que se garantice la estabilidad de la viabilidad bacteriana tras liofilizacion y la viabilidad de las bacterias liofilizadas durante largos periodos de almacenaje, en el que dicha viabilidad bacteriana se considera estable si al menos 40% de las bacterias presentan una viabilidad conservada tras liofilizacion y almacenaje de las bacterias liofilizadas a -18 °C durante al menos 12 meses.
5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 3 o 4, que comprende otra etapa en la que se evalua y se escoge al menos una cepa bacteriana liofilizada y cultivada de forma pura de la etapa c) y/o una combinacion de al menos dos cepas bacterianas liofilizadas de la etapa c), de forma que se garantice la estabilidad genetica tras cultivos repetidos.
6. Una composicion para el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, que comprende al menos una de las cepas bacterianas de acuerdo con la reivindicacion 1.
7. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 6 formulada para administracion vaginal.
8. Un producto higienico para el tratamiento de infecciones del tracto urogenital, que comprende al menos una de las cepas bacterianas de acuerdo con la reivindicacion 1.
9. El producto higienico de acuerdo con la reivindicacion 8, en la forma de tampon.
10. Uso de al menos una de las cepas bacterianas de acuerdo con la reivindicacion 1, para la produccion de una composicion o un producto sanitario para el tratamiento de infecciones del tracto urogenital.
11. Uso de acuerdo con la reivindicacion 10, para el tratamiento de vaginosis bacteriana o de cualquier otro trastorno bacteriano de la vagina.