ES2302927T3 - Sensor desechable con orificio de entrada a muestras mejorado. - Google Patents

Abstract

Biosensor desechable que comprende: una tira (100) laminada que tiene un primer extremo (110) de tira, un segundo extremo (120) de tira y una abertura (52) de ventilación separada de dicho primer extremo de tira, comprendiendo dicha tira laminada una capa (20) de base con un recubrimiento (21) conductor dispuesto sobre ella, teniendo dicha capa (20) de base al menos dos electrodos (22, 24, 26) definidos sobre ella, un capa (30) que contiene reactivo soportada sobre dicha capa (20) de base, teniendo dicha capa que contiene reactivo al menos dos cortes (32, 34, 36), una capa (40) de formación de canal soportada sobre dicha capa (30) que contiene reactivo, y una cubierta (50) que tiene una muesca (54) en dicho primer extremo (110) de tira; un canal (112) encerrado entre dicho primer extremo (110) de tira y dicha abertura (52) de ventilación, conteniendo dicho canal (112) encerrado dichos al menos dos cortes (32, 34, 36); un reactivo dispuesto en dichos al menos dos cortes que forman un primer electrodo de trabajo y un electrodo de referencia, conteniendo dicho reactivo una enzima; y contactos (122, 124, 126) conductores en dicho segundo extremo (120) de tira y aislados de dicho canal encerrado, caracterizado porque dicha muesca (54) tiene una forma semicircular.

Description

Sensor desechable con orificio de entrada de muestras mejorado.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a sensores electroquímicos que pueden usarse para la cuantificación de un analito o componente específico en una muestra líquida. Particularmente, esta invención se refiere a un sensor electroquímico nuevo y mejorado y a un método de fabricación de sensores electroquímicos nuevo y mejorado. Más particularmente, esta invención se refiere a un sensor electroquímico desechable que resulta económico de fabricar. Incluso más particularmente, esta invención se refiere a un sensor electroquímico desechable que facilita lecturas exactas en presencia de glóbulos rojos (hematocrito) variables e interferentes. Todavía incluso más particularmente, esta invención se refiere a sensores electroquímicos desechables que se usan para realizar ensayos electroquímicos para la determinación exacta de analitos en fluidos fisiológicos.

2. Descripción de la técnica anterior

Los biosensores se conocen desde hace más de tres décadas. Se usan para determinar concentraciones de diversos analitos en fluidos. Es de particular interés la medición de la glucosa en sangre. Se sabe bien que la concentración de glucosa en sangre es extremadamente importante para el mantenimiento de la homeostasis. Los productos que miden las fluctuaciones en la glucemia o los niveles de glucosa de una persona se han convertido en una necesidad diaria para muchos de los millones de diabéticos del país. Dado que este trastorno puede producir anomalías peligrosas en la bioquímica de la sangre y que se cree que es un factor que contribuye a la pérdida de visión y a la insuficiencia renal, la mayoría de los diabéticos necesitan realizarse análisis a sí mismos periódicamente y ajustar su nivel de glucosa en consecuencia, normalmente con inyecciones de insulina. Si la concentración de glucosa en sangre es inferior al intervalo normal, los pacientes pueden padecer pérdida del conocimiento y disminución de la tensión arterial, lo que incluso puede dar como resultado la muerte. Si la concentración de glucosa en sangre en ayunas es superior al intervalo normal, puede dar como resultado pérdida de visión, insuficiencia renal y enfermedad vascular. Por tanto, la medición de los niveles de glucosa en sangre se ha convertido en una necesidad diaria para los individuos diabéticos que controlan su nivel de glucosa en sangre mediante tratamiento con insulina.

Los médicos instruyen a los pacientes que son insulinodependientes para que comprueben sus niveles de glucemia con tanta frecuencia como cuatro veces al día. Para adaptar un estilo de vida normal a la necesidad de monitorización frecuente de los niveles de glucosa, se hicieron disponibles análisis de glucosa en sangre en el domicilio con el desarrollo de tiras reactivas para análisis de sangre completa.

Un tipo de biosensor de glucosa en sangre es un electrodo enzimático combinado con un compuesto mediador, que transporta electrones entre la enzima y el electrodo dando como resultado una señal de corriente que puede medirse cuando está presente glucosa. Los mediadores usados lo más comúnmente son ferricianuro de potasio, ferroceno y sus derivados, así como otros complejos metálicos. Se han dado a conocer muchos sensores basados en este segundo tipo de electrodo. El documento US 6 287 451 describe una tira de electrodo desechable de este tipo para someter a prueba una muestra de fluido.

Sin embargo, los dispositivos de la técnica anterior adolecen de diversas deficiencias. Una de estas deficiencias es la interferencia con las lecturas del biosensor producida por otras sustancias en el fluido de muestra, que pueden oxidarse al mismo potencial. Entre éstas son frecuentes el ácido ascórbico, ácido úrico y paracetamol. Cuando se oxidan estas y otras sustancias que interfieren, la corriente que resulta de su oxidación se añade a y es indistinguible de la corriente que resulta de la oxidación del analito de la sangre que se está midiendo. Por consiguiente, da como resultado un error en la cuantificación del analito de la sangre.

Otra deficiencia es la interferencia producida por los glóbulos rojos (el efecto del hematocrito). Esta interferencia tiende a producir una tasa de respuesta artificialmente alta para bajos niveles de hematocrito y, a la inversa, una tasa de respuesta artificialmente baja para altos niveles de hematocrito.

Deficiencias adicionales de los dispositivos de la técnica anterior son que tienen un intervalo lineal más limitado y requieren una cantidad relativamente grande de volumen de muestra. Además, requieren un tiempo de espera relativamente mayor para el desarrollo de una respuesta en el estado estacionario antes de que pueda obtenerse una lectura. Otra deficiencia de los biosensores que tienen una entrada lateral o de extremo para la introducción directa de la muestra de sangre en la cámara de muestra desde la fuente de la gota de sangre es el bloqueo involuntario o el bloqueo parcial de la entrada por la fuente de sangre. Los usuarios tienden a apretar fuertemente el biosensor contra el punto de toma de muestras de sangre tal como en el dedo o el brazo. Dado que la entrada al canal capilar del biosensor es pequeña, una acción de este tipo normalmente bloquea o bloquea parcialmente la entrada. El resultado es que (1) la sangre no entra en el canal capilar en absoluto, o (2) la sangre entra parcialmente en el canal pero no lo llena suficientemente, o (3) la sangre llena el canal capilar muy lentamente. En la situación (1), puede que no se active el medidor y, por tanto, no se realice la lectura. En las situaciones (2) y (3), puede que no se active el medidor o puede que se active pero que dé resultados de prueba inexactos debido a la muestra insuficiente o a la lentitud de la acción de llenado capilar.

Cada una de estas deficiencias puede contribuir, o bien individualmente o bien cuando se combinan con una o más de las otras deficiencias, a lecturas de medición erróneas durante el análisis.

Debido a la importancia de obtener lecturas de glucosa exactas, sería muy deseable desarrollar un sensor electroquímico fiable y de uso fácil, que no tiene uno o más de los inconvenientes mencionados anteriormente.

Por consiguiente, lo que se necesita es un sensor electroquímico que incorpore un electrodo de corrección de interferencias para minimizar la interferencia producida por las sustancias oxidables presentes en el fluido de muestra. Lo que se necesita además es un sensor electroquímico cuya respuesta sea sustancialmente independiente del hematocrito del fluido de muestra. Lo que todavía se necesita además es un sensor electroquímico que requiera menos volumen de muestra del que se requería anteriormente en la técnica anterior.

Aun, lo que todavía se necesita además es un sensor electroquímico que tenga un amplio intervalo de medición lineal; es decir, un sensor que tenga un efecto de interferencia reducido o insignificante y que pueda usarse con una concentración de glucosa más amplia. Lo que también se necesita es un sensor electroquímico con un orificio de entrada modificado para facilitar la introducción de la muestra en la cámara de muestra del sensor electroquí-
mico.

El documento US-A-5.997.817 da a conocer una tira de electrodo para someter a prueba una muestra de fluido que comprende una muesca en la cubierta. La muesca es de forma triangular.

Es un objeto de la presente invención proporcionar una tira de electrodo desechable para someter a prueba una muestra de fluido con adquisición de muestras mejorada.

La tira de electrodo desechable según la presente invención se define en la reivindicación 1.

Las realizaciones preferidas de esa tira de electrodo desechable se describen en las reivindicaciones dependientes 2 a 17. La reivindicación 18 describe un método para fabricar una tira de electrodo desechable de este tipo.

El cuerpo laminado tiene una capa aislante de base compuesta por un material de plástico. Varios conductos conductores están definidos en la capa aislante de base.

Los conductos conductores pueden depositarse sobre la capa aislante mediante serigrafía, mediante deposición en fase de vapor o mediante cualquier método que proporcione una capa conductora que se adhiere a la capa aislante de base. Los conductos conductores pueden disponerse individualmente sobre la capa aislante, o puede disponerse una capa conductora sobre la capa aislante tras grabar con ácido/grabar el número requerido de conductos conductores. El procedimiento de grabado con ácido puede llevarse a cabo químicamente, grabando mecánicamente líneas en la capa conductora, usando un láser para grabar la capa conductora para dar conductos conductores separados, o mediante cualquier medio que produzca una rotura entre los conductos conductores separados requerida por la presente invención. Los recubrimientos conductores preferidos son película de oro o una composición de película de oro/óxido de estaño. Debe señalarse que aunque se usa la misma sustancia eléctricamente conductora (película de oro o película de oro/óxido de estaño), tras el marcado, como material conductor tanto para los electrodos de trabajo como para el electrodo de referencia, este material no puede actuar por sí mismo como un electrodo de referencia. Para hacer que el electrodo de referencia actúe, debe haber una reacción redox (por ejemplo, Fe(CN)_{6}^{3-} + e^{-} \Pi Fe(CN)_{6}^{4-}) en el material eléctricamente conductor cuando se aplica un potencial. Por consiguiente, debe estar presente un mediador o par redox en el material conductor usado para el electrodo de referencia.

Por encima de la capa aislante de base y los conductos conductores, el cuerpo laminado tiene una primera capa aislante intermedia o una capa que contiene reactivo que contiene cortes para al menos un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia. Si se incluye un segundo electrodo de trabajo, él y el electrodo de referencia pueden compartir el mismo corte. Cuando se usan tres cortes, cada corte corresponde a y deja al descubierto una pequeña parte de un único conducto conductor. Los cortes para los electrodos de trabajo pueden ser de igual tamaño o diferente. El corte para el electrodo de referencia puede ser de igual tamaño o diferente que los cortes para los electrodos de trabajo. La ubicación de todos los cortes es tal que todos coexistirán dentro del canal de fluido de muestra descrito anteriormente. Esta capa que contiene reactivo también está compuesta por un material dieléctrico aislante, preferiblemente plástico, y puede obtenerse mediante el troquelado del material mecánicamente o con un láser y después fijando el material a la capa de base. Puede usarse un adhesivo, tal como un adhesivo sensible a la presión, para sujetar la capa que contiene reactivo a la capa de base. La adhesión también puede llevarse a cabo uniendo mediante ultrasonidos la capa que contiene reactivo a la capa de base. La capa que contiene reactivo también puede obtenerse mediante la serigrafía de la primera capa aislante intermedia sobre la capa de base.

El espesor de la capa que contiene reactivo debe ser de espesor suficiente para cargar una cantidad suficiente del material de electrodo para su uso como sensor electroquímico. Cada corte contiene material de electrodo. El material de electrodo tiene un mediador redox con al menos uno de un estabilizador, un aglutinante, un tensioactivo y un tampón. Al menos uno de los cortes también contiene una enzima que puede catalizar una reacción que implica un sustrato para la enzima. El mediador redox puede transferir electrones entre la reacción catalizada por la enzima y el electrodo de trabajo.

El cuerpo laminado también tiene una segunda capa aislante intermedia, o capa de formación de canal, por encima de la capa que contiene reactivo. La segunda capa intermedia también está compuesta por un material aislante de plástico y crea un canal de fluido de muestra del cuerpo laminado. Contiene un corte con forma de U en un extremo que reviste los cortes en la capa que contiene reactivo con el extremo abierto correspondiente al extremo abierto del cuerpo laminado descrito anteriormente.

El cuerpo laminado de la presente invención tiene una capa superior con una abertura de ventilación y una muesca de entrada. La abertura de ventilación está situada de manera que al menos una parte de la abertura de ventilación reviste el fondo del corte con forma de U de la capa de formación de canal. La ventilación permite que el aire dentro del canal de fluido de muestra escape cuando el fluido de muestra entra en el extremo abierto del cuerpo laminado. La muesca de entrada facilita la introducción de la muestra a través de la entrada mediante la creación de una abertura de entrada superior, que está en comunicación con la entrada de extremo del sensor. En el caso de que el orificio de entrada de la muestra se bloquee involuntariamente por la fuente de la muestra de sangre tal como un dedo, la muesca de entrada sigue abierta para alojar el fluido de muestra.

El fluido de muestra generalmente llena el canal de fluido de muestra por acción capilar. En situaciones de volumen pequeño, el grado de la acción capilar depende de la naturaleza hidrófoba/hidrófila de las superficies en contacto con el fluido que experimenta la acción capilar. Esto también se conoce como la humectabilidad del material. Las fuerzas capilares resultan mejoradas o bien mediante el uso de un material aislante hidrófilo para formar la capa superior, o bien mediante el recubrimiento de al menos una parte de un lado de un material aislante hidrófobo con una sustancia hidrófila en la zona de la capa superior que está orientada hacia el canal de fluido de muestra entre el extremo abierto del cuerpo laminado y la abertura de ventilación de la capa superior. Debe entenderse que puede recubrirse un lado entero de la capa superior con la sustancia hidrófila y luego unirse a la segunda capa intermedia.

El número de cortes en la capa que contiene reactivo puede ser de uno, dos y tres o más. Para usar sólo un corte, el único corte debe dejar al descubierto parte de al menos dos conductos conductores. Una disposición de este tipo permite someter a prueba un volumen de muestra menor en comparación con una realización de dos o tres cortes. Sin embargo, esta realización carece de las características de corrección de interferencias de las otras realizaciones.

Una realización que tiene dos cortes es una alternativa a la versión de un único corte. Tiene un corte que sirve como el electrodo de trabajo y el otro que sirve como electrodo de referencia. Otra realización de la versión de dos cortes combina las características de obtener el único corte con las de la versión de dos cortes. Uno de los cortes que contiene material de electrodo está marcado para definir dos partes, sirviendo una parte como un primer electrodo de trabajo y sirviendo la segunda parte como el electrodo de referencia. El segundo corte sirve como un segundo electrodo de trabajo. Un diseño de este tipo es una realización alternativa de la realización preferida de la presente invención. Esta versión de la realización de dos cortes tiene las características de corrección de interferencias y hematocrito, pero también permite la medición de un volumen de muestra incluso menor que el de la realización de tres cortes.

En la realización de tres cortes, dos cortes contienen material para los electrodos de trabajo (W1 y W2) y uno para el electrodo de referencia (R). W2 contiene además la enzima que puede catalizar un sustrato de la enzima. Los tres electrodos están colocados y dimensionados de tal manera que puede medirse con precisión la resistencia de la muestra de fluido y se minimiza el posible remanente de W2. Las posibles disposiciones de electrodos dentro del canal de fluido de muestra pueden ser W1-W2-R, W1-R-W2, R-W1-W2, W2-W1-R, W2-R-W1 o R-W2-W1 con las disposiciones enumeradas ya que las disposiciones de los electrodos aparecerían desde el extremo abierto del cuerpo laminado hasta la abertura de ventilación. Se encontró que la posición preferida era W1-W2-R; es decir, cuando el fluido de muestra entraba en el extremo abierto del cuerpo laminado, el fluido cubriría W1 en primer lugar, luego W2, después R. La posición preferida permite la medición precisa de la resistencia de la muestra de sangre. Esto es necesario para una buena correlación entre la resistencia y el nivel de hematocrito en la muestra de sangre. La posición preferida también obvia los problemas de fiabilidad y exactitud debidos a un tamaño insuficiente del fluido de muestra. El medidor no se accionará hasta que la muestra alcanza R. Una disposición de este tipo también obvia los posibles problemas de remanente del electrodo de trabajo cargado con enzima (W2) al electrodo de trabajo no cargado con enzima (W1).

Tal como se mencionó anteriormente, interferentes oxidables tales como el ácido ascórbico, ácido úrico y paracetamol, por nombrar algunos, producen lecturas inexactas en la salida de un biosensor electroquímico. La presente invención invalida este efecto mediante la resta de la respuesta de corriente en W1 (primer electrodo de trabajo) de la respuesta de corriente de W2 (segundo electrodo de trabajo) para calcular la concentración de analito en el fluido de muestra. Esto se logra manteniendo el área superficial de W1 sustancialmente igual al área superficial de W2. También es importante la composición de los reactivos dispuestos en W1 y W2. Los reactivos están diseñados para tener un efecto mínimo sobre la respuesta de las interferencias, lo que también contribuye a la exactitud de la medición del analito.

La interferencia del hematocrito se reduce mediante el uso de un procedimiento de dos etapas. En primer lugar, se mide la resistencia (valor de r) entre dos electrodos cualesquiera. Entonces se usa el valor de r para estimar el nivel de hematocrito en el fluido de muestra. La siguiente ecuación representa esta relación:

Ec. (1)r = k_{1}/(1-H)

\newpage

en la que

r es el valor de la resistencia medido en ohmios o kiloohmios

H es el nivel de hematocrito

k_{1} es una constante

En segundo lugar, el valor del nivel de hematocrito se usa entonces para corregir matemáticamente la lectura de la concentración de la enzima obtenida a partir de lo anterior. La siguiente ecuación representa el cálculo realizado usando el nivel de hematocrito calculado a partir de la Ec. (1):

Ec. (2)Ccorr = Cmed/(k_{2}+k_{3}Cmed+(k_{4}+k_{5}Cmed)(1-H))

en la que

Ccorr es la concentración de analito corregida

Cmed es la concentración de analito medida

k_{2}-k_{5} son constantes

H es el nivel de hematocrito calculado a partir de la Ec. (1)

Las constantes k_{1}-k_{5} se derivan de datos empíricos.

Todas las ventajas de la presente invención se aclararán con la revisión de la descripción detallada, los dibujos y las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una vista en perspectiva de la presente invención que muestra el extremo abierto, la ventilación y los puntos de contacto eléctrico del cuerpo laminado.

La figura 2 es una vista en perspectiva en despiece ordenado de la presente invención que muestra las diversas capas del cuerpo laminado.

Las figuras 3A, 3B, 3C y 3D son vistas desde arriba de una tira da cada capa de la presente invención que muestra los patrones para obtener múltiples sensores de la presente invención.

La figura 3E es una vista desde arriba de un segmento de la tira laminada de la presente invención que muestra los patrones para obtener múltiples sensores de la presente invención.

Descripción detallada de la realización preferida

La realización preferida de la presente invención se ilustra en las figuras 1-3. La figura 1 muestra un sensor 10 de la presente invención. El sensor 10 tiene un cuerpo 100 laminado, un extremo 110 de toma de muestras de fluido, un extremo 120 de contacto eléctrico y una abertura 52 de ventilación. El extremo 110 de toma de muestras de fluido incluye un canal 112 de fluido de muestra entre una abertura 114 de extremo de toma de muestras y la abertura 52 de ventilación. El extremo 110 de toma de muestras también incluye una muesca 54 de entrada. El extremo 120 de contacto eléctrico tiene al menos tres contactos 122, 124 y 126 conductores diferenciados.

En referencia ahora a la figura 2, el cuerpo 100 laminado se compone de una capa 20 aislante de base, una primera capa intermedia o capa 30 que contiene reactivo, una segunda capa intermedia o capa 40 de formación de canal, y una capa 50 superior. Todas las capas están compuestas por un material dieléctrico, preferiblemente plástico. Ejemplos de un material dieléctrico preferido son poli(cloruro de vinilo), policarbonato, polisulfona, nylon, poliuretano, nitrato de celulosa, propionato de celulosa, acetato de celulosa, acetato-butirato de celulosa, poliéster, acrílico y poliestireno. La capa 20 aislante de base tiene una capa 21 conductora en la que están definidos un primer conducto 22 conductor, un segundo conducto 24 conductor y un tercer conducto 26 conductor. Los conductos 22, 24 y 26 conductores pueden formarse mediante el grabado o el marcado de la capa 21 conductora tal como se ilustra en la figura 2 o mediante el serigrafiado de los conductos 22, 24 y 26 conductores sobre la capa 20 de base. El grabado o marcado de la capa 21 conductora puede realizarse grabando mecánicamente la capa 21 conductora suficientemente como para crear los tres conductos 22, 24 y 26 conductores independientes. El método preferido de grabado o marcado de la presente invención se realiza mediante el uso de un láser de dióxido de carbono (CO2), un láser YAG o un láser de excímero. Puede realizarse una línea 28 de marcado adicional (ampliada y no a escala; únicamente para fines ilustrativos), pero no es necesario para la funcionalidad del sensor 10, a lo largo del borde exterior de la capa 20 de base con el fin de evitar posibles problemas estáticos que podrían dar lugar a una señal con ruido. La capa 21 conductora puede estar compuesta por cualquier material eléctricamente conductor, preferiblemente oro u óxido de estaño/oro. Un material que puede utilizarse para la capa 20 de base es una película de poliéster-oro/óxido de estaño (No. de cat. FM-1) o una película de poliéster-oro (No. de cat. FM-2) vendida por Courtaulds Performance Films, Canoga Park, California.

La primera capa 30 intermedia tiene un primer corte 32 de electrodo que deja al descubierto una parte del primer conducto 22 conductor, un segundo corte 34 de electrodo que deja al descubierto una parte del segundo conducto 24 conductor y un tercer corte 36 de electrodo que deja al descubierto una parte del tercer conducto 26 conductor. La primera capa 30 está compuesta por un material de plástico, preferiblemente una cinta adhesiva por un lado de calidad para medicina disponible de Adhesive Research, Inc., de Glen Rock, Pensilvania. Los espesores aceptables de la cinta adhesiva para su uso en la presente invención están en el intervalo de aproximadamente 0,002 pulgadas (0,051 mm) a aproximadamente 0,005 pulgadas (0,127 mm). Se prefiere una cinta adhesiva de este tipo, Arcare® 7815, debido a su facilidad de manejo y muestra buen rendimiento en cuanto a su capacidad para contener una cantidad suficiente de reactivos químicos y para potenciar una velocidad de saturación con sangre favorable (acción capilar) a través del canal 112 de fluido de muestra del sensor 10. Debe entenderse que no se requiere el uso de una cinta adhesiva. Una capa aislante de plástico puede estar recubierta con un adhesivo sensible a la presión, o puede unirse mediante ultrasonidos a la capa 20 de base, o puede serigrafiarse sobre la capa 20 de base para lograr los mismos resultados que con el uso de la cinta adhesiva de poliéster mencionada anteriormente.

Los tres cortes 32, 34 y 36 definen zonas W1, W2 y R de electrodo, respectivamente, y contienen reactivos químicos que forman dos electrodos de trabajo y un electrodo de referencia. Normalmente, la zona R de electrodo debe cargarse con un mediador o reactivo redox para obtener la función del electrodo de referencia. Si R no está cargada con un mediador o reactivo redox, los electrodos W1 y W2 de trabajo no actuarán apropiadamente. Los reactivos contienen preferiblemente una forma oxidada de un mediador redox, un estabilizador, un aglutinante, un tensioactivo y un tampón. Normalmente, el mediador redox puede ser al menos uno de ferroceno, ferricianuro de potasio y otros derivados de ferroceno. El estabilizador preferido es polietilenglicol, el aglutinante preferido es metilcelulosa, el tensioactivo preferido es t-octilfenoxipolietoxietanol y el tampón preferido es un tampón citrato. La zona W2 de electrodo se carga preferiblemente con los mismos reactivos químicos cargados en las zonas W1 y R de electrodo, pero con la adición de una enzima que puede catalizar una reacción que implica un sustrato para la enzima o un sustrato catalíticamente reactivo con una enzima y un mediador que puede transferir los electrones transferidos entre la reacción catalizada por la enzima y el electrodo de trabajo para crear una corriente representativa de la actividad de la enzima o el sustrato y representativa del compuesto. Debe señalarse que R también puede cargarse con el mismo compuesto químico que W2. La enzima podría ser glucosa oxidasa, lactato oxidasa, colesterol oxidasa y creatinina aminohidrolasa.

Los cortes y zonas de electrodo de la primera capa 30 están situados unos con respecto a los otros y con respecto al flujo del fluido de muestra en el canal 112 de fluido de muestra de manera que puede medirse con precisión la resistencia del fluido de muestra y podría minimizarse el posible remanente de la zona W2 de electrodo a la zona W1 de electrodo. Mediante el uso del extremo 110 de muestra de fluido del sensor 10 como punto de referencia, las disposiciones de las zonas de electrodo podrían ser W1-W2-R, W1-R-W2 o R-W1-W2. Se encontró que la posición preferida era W1-W2-R.

La segunda capa 40 intermedia tiene cortes 42 de canal con forma de U situados en el extremo 41 de sensor de la segunda capa. La longitud del corte 42 de canal es de tal que cuando la segunda capa 40 intermedia está estratificada por encima de la primera capa 30 intermedia, las zonas W1, W2 y R de electrodo están dentro del espacio definido por el corte 42 de canal. Se encontró que el espesor de la segunda capa 40 intermedia era crítico para el volumen del canal capilar y para la velocidad del flujo de fluido de muestra hacia el canal 112 de fluido de muestra, que se llena mediante la acción capilar del fluido de muestra.

La capa 50 superior, que está ubicada sobre la segunda capa 40 intermedia, tiene una abertura 52 de ventilación separa del extremo 110 de muestra de fluido del sensor 10 para garantizar que el fluido de muestra en el canal 112 de fluido cubrirá completamente las zonas W1, W2 y R de electrodo. La abertura 52 de ventilación está ubicada en la capa 50 superior de modo que al menos una parte de abertura 52 de ventilación deja al descubierto una parte del fondo del corte 42 de canal de la segunda capa 40 intermedia. Preferiblemente, la abertura 52 de ventilación dejará al descubierto una parte de y revestirá parcialmente una parte del corte 42 con forma de U de la segunda capa 40 intermedia que está más alejada del extremo 110 de toma de muestras de fluido del sensor 10.

La capa 50 superior también incluye una muesca 54 de entrada en el extremo 110 de muestra de fluido del sensor 10. Se incluye la muesca 54 de entrada para facilitar la carga de la muestra en el canal 112 de fluido en el que la abertura 114 de extremo de toma de muestras podría bloquearse involuntariamente si la muesca 54 de muestras estuviera ausente. La muesca 54 de muestras puede tener cualquier forma y no está limitada a la forma semicircular mostrada.

Preparación de los reactivos 1 y 2

Los reactivos 1 y 2 comprenden la forma oxidada de un mediador redox, un estabilizador, un aglutinante, un tensioactivo y un tampón. El reactivo 2, además, contiene una enzima. Se encontró que la forma oxidada del mediador redox, ferricianuro de potasio, es estable en las matrices. La cantidad usada en la formulación debe ser suficiente para lograr un intervalo lineal con el que se pueda trabajar. La enzima también debe tener actividad, pureza y estabilidad suficientes. Puede obtenerse una glucosa oxidasa disponible comercialmente de Biozyme, San Diego, California con nº de cat. G03A, de aproximadamente 270 U/mg. El estabilizador debe ser suficientemente soluble en agua y debe poder estabilizar tanto el mediador como la enzima. El aglutinante también debe poder unir todos los demás productos químicos en los reactivos en las zonas W1, W2 y R de electrodo a la capa 21/superficie conductora de la capa 20 de base. El estabilizador preferido es polietilenglicol (nº de cat. P4338, Sigma Chemicals, St. Louis, MO). El aglutinante preferido es Methocel 60 HG (nº de cat. 64655, Fluka Chemical, Milwaukee, WI). La disolución tampón debe tener un valor de pH y una capacidad tamponante suficientes para optimizar la reacción enzimática. Se prefiere un tampón citrato 0,05 M. El tensioactivo es necesario para facilitar la dispensación de los reactivos 1 y 2 en los cortes 32, 34 y 36 de la capa 30 intermedia, así como para disolver rápidamente los reactivos químicos secos. La cantidad y el tipo de tensioactivo se seleccionan para garantizar las funciones mencionadas anteriormente y para evitar un efecto de desnaturalización en la enzima. El tensioactivo preferido es Triton X-100. Los reactivos se preparan tal como sigue:

\vskip1.000000\baselineskip

Reactivo 1

Etapa 1:

Preparar tampón citrato 50 mM (pH 5,7) disolviendo 0,1512 gramos de ácido cítrico y 1,2580 gramos de citrato de sodio en 100 ml de agua desionizada.

Etapa 2:

Preparar una disolución de Methocel 60HG al 1% agitando 1 gramo de Methocel en 100 ml del tampón citrato de la etapa 1 durante 12 horas.

Etapa 3:

Añadir 0,3 ml de Triton X-100 al 10% a la disolución de Methocel.

Etapa 4:

Añadir 2,5 gramos de polietilenglicol a la disolución de la etapa 3.

Etapa 5:

Mientras se agita, añadir 1 gramo de ferricianuro de potasio a la disolución de la etapa 4.

\vskip1.000000\baselineskip

Reactivo 2

Etapa 1 - Etapa 4:

mismas etapas que para el reactivo 1.

Etapa 5:

Mientras se agita, añadir 6,5 gramos de ferricianuro de potasio a la disolución de la etapa 4.

Etapa 6:

Añadir 1,0 gramo de glucosa oxidasa a la disolución de la etapa 5 y agitar durante 10 minutos o hasta que se hayan disuelto completamente todos los materiales sólidos.

Construcción de electrodos

Se corta un trozo de una película de poliéster-oro/óxido de estaño u oro disponible de Courtaulds Performance Films hasta obtener la forma adecuada, tal como se ilustra en la figura 2, formando la capa 20 de base del sensor 10. Se usa un láser de CO2 para marcar la película de poliéster-oro/óxido de estaño u oro. Tal como se ilustra en la figura 2, la película se marca mediante el láser de manera que se forman tres electrodos en el extremo 110 de fluido de muestra y tres puntos 122, 124 y 126 de contacto en el extremo 120 de contacto eléctrico. La línea de marcado es muy fina pero suficiente para crear tres conductores eléctricos separados. Puede realizarse una línea 28 de marcado, aunque esto no es necesario, a lo largo del borde exterior de la capa 20 de base para evitar posibles problemas estáticos que podrían producir una señal con ruido procedente del sensor 10 terminado.

Entonces se corta un trozo de una cinta adhesiva por un lado hasta obtener la forma y el tamaño adecuados para formar la primera capa 30 intermedia de modo que cubrirá la mayoría de la capa 21 conductora de la capa 20 de base excepto porque deja al descubierto una pequeña zona de contacto eléctrico ilustrada en la figura 1. Se perforan tres cortes 32, 34 y 36 rectangulares, cuadrados o circulares de tamaño sustancialmente igual mediante láser de CO2 (láser de 25 W disponible de Synrad, Inc., San Diego, CA). Los cortes 32, 34 y 36 definen las zonas W1, W2 y R de electrodo que contienen reactivos químicos. Se prefiere que el tamaño de los cortes se realice lo más pequeño posible con el fin de obtener el canal 112 de muestra de fluido del sensor 10 lo más corto posible mientras que todavía puede contener suficiente reactivo químico para que los electrodos funcionen apropiadamente. El tamaño de agujero preferido para la presente invención tiene unas dimensiones típicas de aproximadamente 0,033 pulgadas (0,84 mm) por aproximadamente 0,043 pulgadas (1,09 mm). Tal como se ilustra en la figura 2, los cortes 32, 34 y 36 están alineados entre sí y tienen una separación de aproximadamente 0,028 pulgadas (0,71 mm) entre ellos. Los cortes rectangulares son únicamente para fines ilustrativos. Debe entenderse que la forma de los cortes no es crítica, siempre que el tamaño de los cortes sea lo suficientemente grande como para contener suficientes reactivos químicos para que los electrodos funcionen apropiadamente, pero lo suficientemente pequeño como para permitir un canal de muestra suficientemente pequeño. Tal como se observó anteriormente, el cambio en la forma de los cortes o del área superficial de los cortes puede requerir el cambio de los valores de las constantes k_{1}-k_{5} para las Ec. 1 y Ec. 2. Tal como se estableció anteriormente, la disposición preferida de los electrodos formados en los cortes 32, 34 y 36 es W1 (electrodo de trabajo 1), W2 (electrodo de trabajo 2) y R (electrodo de referencia).

Se dispensan 0,4 microlitros del reactivo 1 en cada zona W1 y R de reactivo. El reactivo 1 es una mezcla de un mediador redox, un estabilizador, un aglutinante, un tensioactivo y un tampón. Se prepara la mezcla preferida para el reactivo 1 mezclando los siguientes componentes en los porcentajes descritos: aproximadamente el 1% en peso de ferricianuro de potasio, aproximadamente el 2,5% en peso de polietilenglicol, aproximadamente el 1% en peso de Methocel 60 HG, aproximadamente el 0,03% en peso de Triton X-100 y tampón citrato aproximadamente 0,05 M (pH 5,7). Se dispensan 0,4 microlitros del reactivo 2 en la zona W2 de electrodo.

El reactivo 2 es una mezcla similar a la del reactivo 1 pero con la adición de una enzima que puede catalizar una reacción que implica un sustrato de la enzima. La enzima preferida es glucosa oxidasa. Se prepara la mezcla preferida para el reactivo 2 mezclando los siguientes porcentajes de los siguientes componentes: aproximadamente el 6,5% en peso de ferricianuro de potasio, aproximadamente el 2,5% en peso de polietilenglicol, aproximadamente el 1% en peso de Methocel 60 HG, aproximadamente el 0,03% en peso de Triton X-100, tampón citrato aproximadamente 0,05 M (pH 5,7) y aproximadamente el 1% en peso de glucosa oxidasa. Tras la adición de los reactivos, se secó el dispositivo durante aproximadamente 2 minutos a 55ºC en un horno. Tras el secado, se dio forma a un trozo de una cinta adhesiva por las dos caras disponible de Adhesive Research para dar una segunda capa 40 intermedia con el canal 42 con forma de U. La segunda capa 40 intermedia se estratificó entonces sobre la primera capa 30 intermedia. Tal como se mencionó anteriormente, esta segunda capa 40 intermedia sirve como espaciador y define el tamaño del canal 112 de muestra de fluido. Se optimizan su anchura y longitud para proporcionar una muestra de fluido que se mueve relativamente rápido. El tamaño preferido del canal 42 con forma de U es de aproximadamente 0,063 pulgadas (1,60 mm) de ancho por aproximadamente 0,248 pulgadas (6,30 mm) de largo.

Se da forma a un trozo de película transparente (nº de cat. PP2200 o PP2500 disponible de 3M) para dar la capa 50 superior. Se practican un agujero 52 de ventilación rectangular y una muesca 54 semicircular usando el láser de CO2 mencionado anteriormente. El tamaño preferido del agujero 52 de ventilación es de aproximadamente 0,075 pulgadas (1,91 mm) por aproximadamente 0,059 pulgadas (1,50 mm). El agujero 52 de ventilación está situado aproximadamente a 0,130 pulgadas (3,3 mm) desde el extremo 110 de fluido del sensor 10. La muesca 54 semicircular tiene un radio de aproximadamente 0,030 pulgadas (0,75 mm) y está rebajada desde el extremo 110 de fluido del sensor 10. La capa 50 superior está alineada y estratificada sobre la segunda capa 40 intermedia para completar el conjunto del sensor 10, tal como se ilustra en la figura 1.

Aunque la descripción de la construcción de electrodos anterior describe la construcción de un único sensor, el diseño y los materiales usados son ideales para obtener múltiples sensores a partir de un trozo, o una tira continua, de cada material de capa, tal como se muestra en las figuras 3A-3E. Esto se llevaría a cabo comenzando con un trozo relativamente grande de la capa 20 de base que tiene la capa 21 conductora sobre ella. Se practica una pluralidad de líneas marcadas en la capa 21 conductora, de manera que se crea un patrón repetitivo, tal como se ilustra en la figura 3A, usando el método de grabado preferido descrito anteriormente, mediante el cual cada patrón definirá finalmente las tres trayectorias 22, 24 y 26 conductoras para cada sensor. De manera similar, se dimensiona un gran trozo de la primera capa 30 intermedia, que se ilustra en la figura 3B y que tiene también una pluralidad de cortes 32, 34, y 36 en un patrón repetitivo, para ajustarse sobre la capa 20 de base de una manera tal que se dispondrá de una pluralidad de sensores 10 cuando se complete. El tamaño de cada corte y el material de electrodo dispuesto en la pluralidad de zonas W1, R y W2 de electrodo son similares a los dados a conocer anteriormente. Tras disponer los reactivos 1 y 2 en sus respectivos cortes y tras secar, se estratifica un gran trozo de la segunda capa 40 intermedia que tiene una pluralidad de cortes 42 alargados y que se ilustra en la figura 3C, sobre la primera capa 30 intermedia de manera que cada corte 42 alargado de la segunda capa 40 intermedia contiene cortes 32, 34 y 36 correspondientes de la primera capa 30 intermedia. Se estratifica una capa 50 superior de tamaño comparable que tiene una pluralidad de aberturas 52 de ventilación y aberturas 54' de formación de muescas en un patrón repetitivo, tal como se muestra en la figura 3D, sobre la segunda capa 40 intermedia. La figura 3E es una vista desde arriba de las capas combinadas. La tira laminada creada mediante las cuatro capas 20, 30, 40 y 50 tiene una pluralidad de sensores 10 que pueden cortarse a partir de la tira laminada. La tira laminada se corta longitudinalmente a lo largo de la línea A-A' en el extremo 210 de toma de muestras de fluido para formar una pluralidad de aberturas 114 de toma de muestras con las muescas 54 de muestra y longitudinalmente a lo largo de la línea B-B' en el extremo 220 de contacto eléctrico para formar una pluralidad de contactos 122, 124 y 126 conductores. La tira laminada también se corta a intervalos predeterminados a lo largo de la línea C-C' formando una pluralidad de sensores 10 individuales. Si se desea, puede realizarse la conformación del extremo 120 de toma de muestras de fluido de cada sensor 10, tal como se ilustra en la figura 1. Los expertos en la técnica deben entender que el orden en el que puede cortarse la tira laminada no es importante. Por ejemplo, la tira laminada puede cortarse en los intervalos predeterminados (C-C') y después pueden realizarse los cortes a lo largo de A-A' y B-B' para completar el procedimiento.

En la patente estadounidense número 6.287.451 se proporciona una descripción más global de las características de compensación de la presente invención junto con ejemplos y parámetros de prueba adicionales.

Aunque en el presente documento se han descrito las realizaciones preferidas de la presente invención, la descripción anterior es meramente ilustrativa. A los expertos en las técnicas respectivas se les ocurrirán modificaciones adicionales de la invención dada a conocer en el presente documento y se considera que todas estas modificaciones están dentro del alcance de la invención tal como se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Claims (18)

1. Biosensor desechable que comprende:

una tira (100) laminada que tiene un primer extremo (110) de tira, un segundo extremo (120) de tira y una abertura (52) de ventilación separada de dicho primer extremo de tira, comprendiendo dicha tira laminada una capa (20) de base con un recubrimiento (21) conductor dispuesto sobre ella, teniendo dicha capa (20) de base al menos dos electrodos (22, 24, 26) definidos sobre ella, un capa (30) que contiene reactivo soportada sobre dicha capa (20) de base, teniendo dicha capa que contiene reactivo al menos dos cortes (32, 34, 36), una capa (40) de formación de canal soportada sobre dicha capa (30) que contiene reactivo, y una cubierta (50) que tiene una muesca (54) en dicho primer extremo (110) de tira;

un canal (112) encerrado entre dicho primer extremo (110) de tira y dicha abertura (52) de ventilación, conteniendo dicho canal (112) encerrado dichos al menos dos cortes (32, 34, 36);

un reactivo dispuesto en dichos al menos dos cortes que forman un primer electrodo de trabajo y un electrodo de referencia, conteniendo dicho reactivo una enzima; y

contactos (122, 124, 126) conductores en dicho segundo extremo (120) de tira y aislados de dicho canal encerrado, caracterizado porque dicha muesca (54) tiene una forma semicircular.

2. Biosensor según la reivindicación 1, en el que dicha enzima se selecciona del grupo que consiste en glucosa oxidasa, lactato oxidasa, colesterol oxidasa y creatinina aminohidrolasa.

3. Biosensor según la reivindicación 1, en el que dicha capa que contiene reactivo tiene un tercer corte que tiene dicho reactivo sin dicha enzima dispuesta en él y que forma un segundo electrodo de trabajo.

4. Biosensor según la reivindicación 1, en el que dicho reactivo contiene además al menos uno de un mediador redox, un estabilizador, un aglutinante, un tensioactivo y un tampón.

5. Biosensor según la reivindicación 4, en el que dicho estabilizador es un polialquilenglicol, dicho aglutinante es un material de celulosa y dicho tensioactivo es un éter de polioxietileno.

6. Biosensor según la reivindicación 5, en el que dicho estabilizador es polietilenglicol, dicho aglutinante es metilcelulosa, dicho tensioactivo es t-octilfenoxipolietoxietanol y dicho tampón es un tampón citrato.

7. Biosensor según la reivindicación 6, en el que dicho reactivo está compuesto por una mezcla que tiene componentes de partida que comprenden de aproximadamente el 1% en peso a aproximadamente el 6,5% en peso de dicho mediador redox, aproximadamente el 2,5% en peso de dicho estabilizador, aproximadamente el 1% en peso de dicho aglutinante y aproximadamente el 0,3% en peso de dicho tensioactivo en dicho tampón.

8. Biosensor según la reivindicación 7, en el que dicho tampón citrato es aproximadamente 0,05 M.

9. Biosensor según la reivindicación 4, en el que dicho mediador redox es al menos uno de ferricianuro de potasio y otros mediadores redox orgánicos e inorgánicos.

10. Biosensor según la reivindicación 1, en el que dicho recubrimiento conductor es oro o una mezcla de óxido de estaño y oro.

11. Biosensor según la reivindicación 1, en el que dicha capa de base, dicha capa que contiene reactivo, dicha capa de formación de canal y dicha cubierta están compuestos por un material dieléctrico de plástico.

12. Biosensor según la reivindicación 1, en el que dicha capa de formación de canal tiene un espesor suficiente para optimizar el flujo de dicha muestra de fluido a lo largo de dicha trayectoria abierta.

13. Biosensor según la reivindicación 7, en el que dicho reactivo que forma dicho electrodo de referencia está compuesto por una mezcla que tiene componentes de partida que comprenden aproximadamente el 1% en peso de dicho ferricianuro de potasio, aproximadamente el 2,5% en peso de dicho polietilenglicol, aproximadamente el 1% en peso de dicha metilcelulosa, aproximadamente el 0,3% en peso de dicho t-octilfenoxipolietoxietanol y dicho tampón citrato es aproximadamente 0,05 M.

14. Biosensor según la reivindicación 9, en el que dicho reactivo de dicho primer electrodo de trabajo está compuesto por una mezcla que tiene componentes de partida que comprenden aproximadamente el 6,5% en peso de dicho ferricianuro de potasio, aproximadamente el 2,5% en peso de dicho polietilenglicol, aproximadamente el 1% en peso de dicha metilcelulosa, aproximadamente el 0,3% en peso de dicho t-octilfenoxipolietoxietanol y dicho tampón de pH es aproximadamente un tampón citrato 0,05 M, y aproximadamente el 1% en peso de dicha enzima.

15. Biosensor según la reivindicación 14, en el que dicha enzima es glucosa oxidasa.

16. Biosensor según la reivindicación 3, en el que el área superficial de dicho primer electrodo de trabajo es sustancialmente igual que el área superficial de dicho segundo electrodo de trabajo.

17. Biosensor según la reivindicación 3, en el que dicho reactivo que forma dicho segundo electrodo de trabajo es sustancialmente similar a dicho reactivo que forma dicho electrodo de referencia.

18. Método de fabricación de un biosensor desechable que comprende:

grabar un recubrimiento (21) conductor dispuesto en un lado de una capa (20) de base alargada que tiene un extremo de electrodo y un extremo (120) de contacto eléctrico que forman al menos dos conductos (22, 24, 26) eléctricos alargados a lo largo de la longitud de dicha capa (20) de base en el que un primer conducto de dichos al menos dos conductos eléctricos tiene una forma de L en el que la parte con forma de L de dicho primer conducto es adyacente a dicho segundo conducto en el que dicho extremo con forma de L de dicho primer conducto y una parte de dicho segundo conducto están situados cerca de dicho extremo de electrodo;

adherir un capa (30) que contiene reactivo sobre dicha capa (20) de base que es más corta que la longitud de dicha capa de base de manera que una parte de cada uno de dichos al menos dos conductos (22, 24, 26) alargados está al descubierto en dicho extremo (120) de contacto eléctrico, teniendo dicha capa (30) que contiene reactivo al menos dos cortes que contienen reactivo separados de dicho extremo de electrodo en el que un primer corte deja al descubierto una parte de dicho primer conducto y un segundo corte deja al descubierto una parte de dicho segundo conducto;

añadir una mezcla de reactivos a dicho primer corte que forma un electrodo de referencia y dicho segundo corte que forma un primer electrodo de trabajo, teniendo dicha mezcla de reactivos en al menos dicho primer electrodo de trabajo una enzima que puede catalizar una reacción que implica un sustrato para la enzima; secar dicha mezcla de reactivos que forma una matriz de reactivos;

disponer una capa (40) de formación de canal sobre dicha capa (30) que contiene reactivo, teniendo dicha capa (40) de formación de canal una parte de extremo con forma de U que define un canal alargado central dimensionado para dejar al descubierto dichos al menos dos cortes de reactivo de dicha capa (30) que contiene reactivo; y

disponer una capa (50) superior sobre dicha capa (40) de formación de canal, teniendo dicha capa (50) superior una abertura (52) de ventilación separada de dicho extremo de electrodo y una muesca (54) en dicho extremo de electrodo, formando dicha capa superior una entrada y un espacio capilar con dicha parte de extremo con forma de U en el que dicha ventilación deja al descubierto una parte de dicho canal central en el extremo de dicho espacio capilar opuesto a dicha entrada y dicha muesca deja al descubierto una parte de dicho canal central en dicha entrada, caracterizado porque dicha muesca (54) tiene forma semicircular.